CN1206356C - 甲肝病毒中国株和减毒株的培育及互补脱氧核糖核酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及甲型肝炎病毒中国株和减毒株的分离培育及其互补脱氧核糖核酸序列，特别是甲型肝炎病毒中国流行株Gkm的分离纯化，系列减毒株的培育，及其独特的cDNA序列。该系列cDNA序列可为进一步了解甲肝病毒毒株的遗传特性和遗传稳定性，阐明HAV减毒的分子机理提供基础资料，为研制快速生长、高滴度、高抗原性的新型甲肝疫苗创造条件，为基因工程多肽疫苗的研制提供科学依据。

Description

甲肝病毒中国株和减毒株的培育及互补脱氧核糖核酸序列

                          技术领域

本发明涉及甲型肝炎病毒(HAV)，特别是HAV中国流行株Gkm及其减毒株的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，以及减毒株的培育方法、过程和条件。

                          背景技术

甲型肝炎是世界性传染病，它是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的全世界约40亿人受到威胁。在中国，35岁以上的成年人中，甲肝受染率达90％，常引起季节性流行。由于该病的高发病率及较长的病程，给人民健康及经济发展带来严重影响。根据我国现实情况，控制甲肝流行的有效和根本措施在于发展疫苗，而疫苗的关键是良好的减毒株。

美国MERCK公司Provost等人于1986年曾报告获得HAV F’减毒株，美国NIH的Purcell等人也于1987年报告获得甲肝病毒HM175/7MK-5减毒株，并搞清了其cDNA全序列，但人试结果证明，免疫效果很差，故至今未有进一步扩大人试的工作。

浙江省医学科学院经过多年努力，成功地研制出甲肝病毒减毒活疫苗株(H2)，并经大量人群接种证明可有效预防甲肝的传染，为控制该病流行提供最有效的措施。但至今尚未有该毒株的原株病毒及相关毒株的序列报道。本发明将填补这一空白，搞清HAV中国株及其减毒株和疫苗株的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，从而进一步了解毒株的遗传特性和遗传稳定性，阐明HAV减毒的分子机理，并为研制快速生长、高滴度、高抗原性的新型甲肝疫苗创造条件，为基因工程多肽疫苗的研制提供科学依据。

                           发明内容

发明概述

本发明涉及分离的和基本纯化的人甲型肝炎病毒中国株Gkm的制剂、Gkm基因组RNA的制剂及Gkm的cDNA。

本发明还涉及人甲型肝炎病毒中国株Gkm的cDNA核苷酸序列及其变异体。

本发明还涉及分离的和基本纯化的人甲型肝炎病毒细胞培养适应株H2K5的制剂、H2K5基因组RNA的制剂及H2K5的cDNA。

本发明还涉及人甲型肝炎病毒细胞培养适应株H2K5的cDNA核苷酸序列及其变异体，特别是HAV基因组5’非编码区(NCR)、2A区和2C区的cDNA序列。

本发明还涉及分离的和基本纯化的人甲型肝炎病毒细胞培养适应株H2K20的制剂、H2K20基因组RNA的制剂及H2K20的cDNA。

本发明还涉及人甲型肝炎病毒细胞培养适应株H2K20的cDNA核苷酸序列及其变异体。

本发明还涉及分离的和基本纯化的人甲型肝炎病毒减毒株H2K25的制剂、H2K25基因组RNA的制剂及H2K25的cDNA。

本发明还涉及人甲型肝炎病毒减毒株H2K25的cDNA核苷酸序列及其变异体，特别是HAV基因组5’非编码区(NCR)、2A区和2C区的cDNA序列。

本发明还涉及分离的和基本纯化的人甲型肝炎病毒减毒株H2M20K5的制剂、H2M20K5基因组RNA的制剂及H2M20K5的cDNA。

本发明还涉及人甲型肝炎病毒减毒株H2M20K5的cDNA核苷酸序列及其变异体，特别是HAV基因组5’非编码区(NCR)、2A区和2C区的cDNA序列。

本发明还涉及基于上述所有cDNA序列，设计引物而选择性扩增甲型肝炎基因片段，从而在甲型肝炎病毒的遗传稳定性检测、毒性检测和细胞适应性检测及生物样品检测中应用。

本发明还涉及基于上述所有cDNA序列，应用基因工程技术制造的任何甲肝病毒减毒株。

本发明还涉及基于上述所有cDNA序列，应用基因工程技术制造的任何甲肝病毒多肽疫苗。

发明详述

本发明涉及分离的和基本纯化的人甲型肝炎病毒(HAV)中国流行株Gkm。该病毒株是直接从杭州近郊的甲型肝炎病人粪便中分离的，并经F113和PEG沉淀及差速离心和超速离心纯化的毒株。

本发明还涉及人HAV Gkm株的互补脱氧核糖核酸(cDNA)序列，它能够指导产生HAV蛋白质或与HAV蛋白质基本同源的蛋白质。该核酸序列被称为Gkm，它作为Gkm NO.1示于下面：

AAGTCCATGG TGAGGGGACT TGATACCTCA CCGCCGTTTG CCTAGGCTAT    90

AGGCTAAATT TCCCTTTCCC TGTCCTTCCC CTATTTCCTT TTGTTTTGTT    140

TGTAAATATT AATTCCTACA GGTTCAGGGT TCTTTAATCT GTTTCTCTAT    190

AAGAACACTC AATTTTCACG CTTTCTGTCT TCTTTCTTCC AGGGCTCTCC    240

CCTTGCCCTA GGCTCTGGCC GTTGCGCCCG GCGGGGTCAA CTCCATGAGT    290

AGCATGGAGC TGTAGGAGTC TAAATTGGGG ACGCAGATGT TTGGGACGTC    340

ACCTTGCAGT GTTAACTTGG CTCTCATGAA CCTCTTTGAT CTTCCACAAG    390

GGGTATTCTA CGGGTGAAAC CTCTTAGGCT AATACTTCTA TGAAGAGATG    440

CCTTGGATAG GGTAACAGCG GCGGATATTG GTGAGTTGTT AAGACAAAAA    490

CCATTCAACG CCGGAGGACT GGCTCTCATC CAGTGGATGC ATTGAGTGAA    540

TTGATTGTCA GGGCTGTCTC TAGGTTTAAT CTCAGACCTC TCTGTGCTTA    590

GGGCAAACAC TATTTGGCCT TAAATGGGAT CCTGTGAGAG GGGGTCCCTC    640

CATTGACAGC TGGACTGTTC TTTGGGGCCT TATGTGGTGA TTGCCTCTGA    690

GGTACTCAGG GGCATTTAGG TTTTTCCTCA TTCTTAAACA ATAATGAATA    740

TGTCCAAACA AGGAATTTTC CAGACTGTTG GGAGTCGCCT TGACCACATC    790

CTGTCTCTGG CAGATATTGA GGAAGAACAA ATGATTCAGT CCGTTGATAG    840

GACTGCAGTG ACTGGTGCTT CTTATTTGAC TTCTGTTGAC CAATCTTCAG    890

TTCACACTGC TGAAGTTGGC TCACATCAAA TTGAACCTTT GAAAACCTCT    940

GTTGATAAAC CTGGTTCTAA GAAGACTCAG GGGGAGAAGT TTTTCCTGAT    990

TCATTCTGCT GATTGGCTCA CTACACATGC TCTTTTTCAT GAAGTTGCAA    1040

AGTTGGATGT GGTGAAATTA CTGTATAATG AGCAGTTTGC TGTCCAAGGT    1090

TTGTTGAGAT ACCATACACA TGCAAGATTT GGCATTGAGA TTCAAGTTCA    1140

GATAAACCCC ACACCCTTTC AGCAAGGGGG ACTAATTTGT GCCATGGTTC    1190

CTGGTGACCA AAGTTATGGT TCGATAGCAT CCTTGACTGT TTATCCCCAT    1240

GGTCTGTTAA ATTGTAACAT CAACAATGTA GTTAGAATAA AGGTTCCATT    1290

TATTTATACT AGAGGTGCTT ACCATTTTAA AGATCCACAA TACCCAGTTT    1340

GGGAATTGAC AATCAGAGTT TGGTCAGAGT TGAATATTGG AACAGGAACT    1390

TCAGCTTACA CTTCACTTAA TGTTTTAGCT AGGTTTACAG ATTTGGAGTT    1440

GCATGGATTA ACTCCTCTTT CTACACAAAT GATGAGAAAT GAATTTAGAG    1490

TTAGTACTAC TGAAAATGTT GTGAATTTGT CAAATTATGA AGATGCAAGG    1540

GCAAAAATGT CTTTTGCTTT GGATCAGGAA GATTGGAAGT CTGATCCCTC    1590

TCAAGGTGGT GGAATTAAGG TCACTCATTTT TACTACTTGG ACATCCATTC   1640

CAACCTTAGC TGCACAGTTT CCATTTAATG CTTCAGACTC GGTTGGACAA    1690

CAAATTAAAG TTATTCCAGT CGACCCATAT TTTTTCCAGA TGACAAATAC    1740

TAATCCTGAT CAAAAATGTA TAACTGCCCT GGCTTCTATT TGTCAAATGT    1790

TTTGCTTTTG GAGGGGAGAT CTTGTTTTTG ATTTTCAAGG TTTTCCCACC    1840

AAATATCATT CAGGTAGATT ATTGTTTTGT TTTGTTCCTG GCAATGAGTT    1890

AATAGATGTT TCTGGAATTA CATTGAAGCA AGCAACTACT GCTCCTTGTG    1940

CAGTAATGGA CATTACAGGA GTGCAATCAA CCTTGAGATT TCGTGTTCCT    1990

TGGATTTCTG ATACACCCAA TCGAGTAAAT AGGTACACGA AGTCAGCACA    2040

TCAAAAAGGT GAGTACACTG CCATTGGGAA GCTTATTGTG TATTGTTATA    2090

ATAGACTGAC TTCTCCTTCA AATGTTGCTT CTCATGTTAG AGTTAATGTT    2140

TATCTTTCAG CAATTAATTT GGAATGTTTT GCTCCTCTTT ATCATGCTAT    2190

GGATGTTACT ACACAGGTTG GAGATGATTC AGGAGGTTTT TCAACAACAG    2240

TTTCTACAGA GCAGAATGTT CCTGATCCCC AAGTTGGCAT AACAACCATG    2290

AGGGACCTAA AAGGGAAAGC CAATAGGGGA AAGATGGATG TTTCAGGCGT    2340

GCAAGCACCT GTGGGAGCTA TTACAACAAT TGAGGATCCA GTTTTAGCAA    2390

AGAAAGTGCC TGAGACATTT CCTGAATTGA AGCCTGGAGA GTCCAGACAT    2440

ACATCAGATC ATATGTCTAT TTATAAGTTC ATGGGAAGGT CTCATTTCTT    2490

GTGTACTTTT ACCTTCAATT CAAATAATAA AGAGTACACA TTTCCTATAA    2540

CCTTGTCTTC AACCTCTAAT CCTCCTCATG GTTTGCCATC AACACTGAGG    2590

TGGTTTTTCA ACTTGTTTCA GTTGTATAGA GGGCCTTTAG ATCTGACAAT    2640

TATTATTACA GGAGCAACTG ATGTAGATGG CATGGCCTGG TTCACTCCAG    2690

TAGGTCTTGC CGTTGATACT CCTCGGGTAG AGAAGGAGTC AGCTTTCTCT    2740

ATTGACTACA AAACTGCCCT TGGAGCTGTT AGGTTTAATA CAAGAAGAAC    2790

AGGGAACATT CAGATTAGAT TGCCATGGTA TTCTTATTTG TATCCTGTGT    2840

CTGGAGCACT GGATGGTTTG GGAGATAAGA CAGATTCTAC ATTTGGATTG    2890

GTTTCTATTC AGATTGCAAA TTACAATCAT TCTGATGAAT ATTTGTCCTT    2940

TAGTTGTTAT TTGTCTGTCA CAGAGCAATC AGAGTTCTAT TTTCCTAGAG    2990

CTCCATTAAA TTCAAATGCT ATGTTGTCCA CTGAGTCCAT GATGAGTAGA    3040

ATTGCAGCTG GAGACTTGGA GTCATCGGTG GATGATCCTA GATCAGAGGA    3090

GGACAGAAGA TTTGAGAGTC ATATAGAATG TAGGAAACCA TACAAGGAAT    3140

TGAGATTGGA GGTTGGCAAA CAAAGACTCA AATATGCTCA GGAAGAGTTG    3190

TCAAATGAAG TGCTTCCACC TCCTTGGGAG ATGAAGGGAC TATTTTCACA    3240

AGCTAAGATT TCTCTTTTTT ATACTGAGGA GCATGAAATA ATGAAATTTT    3290

CTTGGAGAGG AGTGACTGCT GATACTAGGG CTTTGAGAAG ATTTGGATTC    3340

TCTATGGCTG CTGGAAGAAG TGTGTGGACT CTTGAGATGG ATGCTGGAGT    3390

TCTTACTGGA AGATTGATCA GATTGAATGA TGAGAAATGG ACAGAAATGA    3440

AGGATGATAA AATTGTCTCA TTAATCGAAA AGTTCACAAG CAATAAATAC    3490

TGGTCTAAAG TGAGTTTTCC ACATGGAATG TTGGATCTTG AAGAAATTGC    3540

TGCTAACTCT ACAGATTTTC CAAATATGTC TGAGACAGAT TTGTGTTTCC    3590

TGTTGCATTG GCTAAATCCA AAGAAAATTA ATTTAGCAGA TAGAATGCTT    3640

GGATTGTCTG GGGTTCAGGA AATTAAAGAC CAAGGTGTTG GATTGATAGC    3690

AGAGTGCAGA ACTTTCTTAG ATTCTATTGC TGGAACTCTA AAATCTATGA    3740

TGTTTGGATT TCATCATTCT GTGACTGTTG AAATTATAAA CACTGTACTT    3790

TCTTTTGTTA AGAGTGGAAT CCTGCTTTAT GTTATACAAC AATTGAATCA    3840

AGATGAGCAC TCTCACATAA TTGGTTTGTT GAGAGTTATG AATTATGCAG    3890

ATATTGGCTG CTCAGTTATT TCATGTGGCA AAGTTTTTTC TAAAATGTTA    3940

GAAACAGTTT TTAATTGGCA GATGGATTCC AGAATGATGG AGCTGAGAAC    3990

TCAGAGCTTT TCCAATTGGT TAAGAGATAT TTGTTCAGGA ATTACTATTT    4040

TTAAAAGTTT TAAGGATGCC ATATATTGGC TATATACAAA ATTGAAGGAT    4090

TTTTATGAAG TAAACTATGG CAAGAAGAAG GATATTCTTA ATATTCTTAA    4140

GGCCAACCAA CAAAAAATAG AAAAAGCCAT TGAAGAAGCA GACCAATTTT    4190

GCATTTTGCA ATTCCAAGAT GTAGAGAAAT TTGATCAGTA TCAGAAAGGG    4240

GTTGATTTAA TACAAAAGCT GAGAACTGTC CAATCAATGG CTCAAGTTGA    4290

CCCTAACCTT GGGGTTCATT TGTCACCTCT CAGAGATTGC ATAGCCAGAG    4340

TCCATCAAAA GCTCAAGAAT CTTGGATCTA TAAATCAGGC CATGGTGACA    4390

AGATGTGAGC CAGTTGTTTG CTATTTATAT GGCAAAAGAG GGGGAGGGAA    4440

AAGTTTGACT TCAATTGCAT TGGCAACCAA AATCTGTAAA CACTATGGTG    4490

TTGAACCGGA GAAAAATATT TACACTAAAC CTGTGGCCTC AGATTATTGG    4540

GATGGTTACA GTGGACAATT GGTTTGCATT ATTGATGATA TTGGCCAAAA    4590

CACAACAGAT GAAGATTGGT CAGATTTTTG TCAATTAGTG TCAGGATGCC    4640

CAATGAGATT GAATATGGCT TCTCTTGAGG AGAAGGGCAG ACATTTTTCC    4690

TCTCCTTTTA TAATAGCAAC TTCAAACTGG TCAAATCCAA GTCCAAAAAC    4740

AGTTTATGTT AAGGAAGCAA TTGATCGTAG GCTTCATTTT AAGGTTGAAG    4790

TTAAACCTGC TTCATTTTTT AAAAATCCTC ACAATGATAT GTTGAATGTT    4840

AATTTGGCTA AAACAAATGA TGCAATTAAG GACATGTCTT GTGTTGATTT    4890

AATAATGGAT GGACATAATA TTTCATTGAT GGATTTACTT AGTTCCTTAG    4940

TGATGACAGT TGAAATTAGG AAACAAAATA TGAGTGAATT CATGGAGTTG    4990

TGGTCTCAGG GAATTTCAGA TGATGACAAT GATAGTGCAG TAGCTGAGTT    5040

TTTCCGGTCT TTTCCATCTG GAGAACCATC AAATTCCAAA TTATCTAGTT    5090

TTTTCCAATC TGTTACTAAT CACAAGTGGG TTGCTGTGGG AGCTGCAGTT    5140

GGCATTCTTG GAGTGCTTGT GGGAGGATGG TTCGTGTATA AGCATTTCTC    5190

CCGCAAAGAG GAAGAACCAA TTCCAGCTGA AGGGGTTTAC CATGGCGTGA    5240

CTAAGCCTAA ACAAGTGATT AAATTGGATG CAGATCCAGT GGAGTCTCAG    5290

TCAACTTTGG AAATAGCTGG ATTAGTTAGG AAAAATTTGG TCCAGTTTGG    5340

AGTTGGGGAG AAAAATGGAT GTGTGAGATG GGTCATGAAT GCCTTAGGAG    5390

TGAAGGATGA TTGGCTGTTA GTACCTTCTC ATGCTTATAA ATTTGAAAAG    5440

GATTATGAAA TGATGGAGTT TTATTTCAAT AGAGGTGGAA CTTACTATCC    5490

AATTTCAGCA GGCAATGTTG TTATTCAATC CTTAGATGTG GGGTTTCAAG    5540

ATGTTGTTCT AATGAAAGTT CCTACAATTC CCAAGTTTAG AGATATTACT    5590

CAACATTTTA TCAAGAAAGG AGATGTGCCT AGAGCTTTGA ATCGCTTGGC    5640

AACATTAGTG ACAACTGTTA ATGGAACCCC TATGTTAATT TCTGAGGGAC    5690

CATTAAAGAT GGAGGAAAAA GCCACTTATG TTCATAAGAA GAATGATGGT    5740

ACTACAGTTG ATTTGACTGT TGATCAGGCA TGGAGAGGAA AAGGTGAAGG    5790

CCTTCCTGGA ATGTGTGGTG GGGCCCTGGT GTCATCAAAT CAGTCTATAC    5840

AAAATGCAAT TTTGGGTATT CATGTTGCTG GAGGAAATTC AATTCTTGTG    5890

GCAAAGTTGG TTACTCAAGA GATGTTTCAA AACATTGATA AGAAAATTGA    5940

AAGTCAGAGA ATAATGAAAG TGGAATTTAC TCAGTGTTCA ATGAATGTAG    5990

TCTCCAAAAC GATTTTTAGA AAGAGTCCCA TTCATCACCA CATTGATAAA    6040

ACCATGATTA ATTTTCCTGC AGTTATGCCT TTTTCTAAAG CTGAAGTTGA    6090

TCCAATGGCT GTGATGTTAT CCAAATATTC ATTACCTATT GTGGAAGAAC    6140

CAGAGGATTA CAAAGAGGCT TCAATTTTTT ATCAAAACAA AATAGTAGGC    6190

AAGACTCAGT TAGTTGATGA CTTTCTAGAT CTTGATATGG CCATTACAGG    6240

GGCTCCAGGC ATTGATGCTA TCAATATGGA TTCATCTCCT GGGTTTCCTT    6290

ATGTTCAAGA AAAATTGACC AAAAGAGATT TAATTTGGTT GGATGAAAAT    6340

GGTTTGTTGC TAGGAGTTCA TCCAAGATTG GCTCAGAGAA TTTTATTTAA    6390

TACTGTCATG ATGGAAAATT GTTCTGACCT AGATGTTGTT TTTACAACTT    6440

GTCCAAAAGA TGAATTGAGA CCATTAGAGA AAGTTTTGGA ATCAAAAACA    6490

AGAGCAATTG ATGCTTGGCC TTTGGATTAT ACAATTCTAT GTCGAATGTA    6540

TTGGGGTCCA GCTATTAGTT ATTTTCATTT GAATCCAGGG TTTCACACAG    6590

GTGTTGCTAT TGGCATAGAT CCTGATAGAC AATGGGATGA ATTATTTAAA    6640

ACAATGATAA GATTTGGAGA TGTTGGTCTT GATTTAGATT TTTCTGCCTT    6690

TGATGCTAGT CTTAGTCCAT TTATGATTAG AGAAGCAGGT AGAATTATGA    6740

GTGAATTATC TGGAACTCCA TCTCATTTTG GAACAGCTCT TATCAATACT    6790

ATCATTTATT CTAAACATTT GTTGTACAAT TGTTGTTATC ATGTCTGTGG    6840

TTCAATGCCT TCTGGGTCTC CTTGTACAGC TTTGTTGAAT TCAATTATCA    6890

ACAATATCAA TTTGTATTAT GTATTTTCTA AAATATTTGG AAAGTCTCCA    6940

GTTTTCTTTT GTCAAGCTCT GAGGATCCTT TGTTATGGAG ATGATGTTTT    6990

GATAGTATTT TCCAGAGATG TTCAAATTGA CAATCTTGAT TTGATTGGAC    7040

AGAAAATTGT GGATGAGTTC AAAAAACTTG GCATGACAGC TACCTCAGCT    7090

GACAAAAATG TGCCTCAACT GAAGCCAATT TCAGAATTGA CTTTTCTCAA    7140

AAGATCCTTT AATTTGGTGG AGGATAGAAT TAGACCTGCA ATTTCAGAGA    7190

AGACGATTTG GTCTTTGATA GCTTGGCAGA GATGCAACGC TGAGTTTGAG    7240

CAGAATTTAG AAAATGCTCA GTGGTTTGCT TTTATGCATG GCTATGAGTT    7290

TTATCAGAAA TTTTATTATT TTGTTCAGTC CTATTTGGAG AAAGAGATGA    7340

TAGAATATAG GCTTAAATCT TATGATTGGT GGAGAATGAG ATTTTATGAC    7390

CAGTGTTTCA TTTGTGACCT TTCATGATTT GTTTAAACAA ATTTTCTTAA    7440

AATTTCTGAG GTTTGTTTAT TTCTTTTATC AGTAAATAAA               7480

本发明涉及经细胞培养适应的人HAV H2K5株。该病毒株是HAV Gkm株在人胚肺二倍体细胞KMB17中，经35℃培育5代后获得的病毒株。

本发明还涉及HAV H2K5的cDNA序列，特别是HAV基因组5’非编码区(NCR)、2A区和2C区的cDNA序列。该组核苷酸序列分别作为SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3示于下面。

SEQ NO.1(HAV H2K5 5’NCR区，101bp-200bp)

5’TTCCCTTTCC CCTTCCCCTT CCTTGTTTTG ATTGTAAATA

   TAAATTCCTG CAGGTTCAGG GTTCTT GAA TTGGCATTAA

   ATTTGTTTCT CTATAAGAAC              3’

SEQ NO.2(HAV H2K5 2A区，3011bp-3110bp)

5’TATGTTATCC ACTGAATCAA TGATGAGCAG AATTGCGGCT

   GGAGACTTGG AGTCATCAGT GGATGATCCT AGATCAGAGG

   AGGATAAAAG ATTTGAGAGT              3’

SEQ NO.3(HAV H2K5 2C区，3986bp-4085bp)

5’CACAGAGTTT TTCCAACTGG TTAAGAGATA TCTGTTCAGG

   GATCACTATT TTTAAAAACT TCAAGGATGC AATTTATTGG

   CTCTATACAA AATTGAAGGA              3’

本发明涉及经低温细胞培养的人HAV H2K20株。该病毒株是HAV Gkm株在人胚肺二倍体细胞KMB17中，经35℃培育15代，32℃培育5代后获得的病毒株。

本发明还涉及HAV H2K20涉及cDNA序列，它能够指导产生HAV蛋白质或与HAV蛋白质基本同源的蛋白质。该核酸序列被称为H2K20，它作为H2K20NO.1示于下面：

TTCAAGAGGG GTCTCCGGGA ATTTCCGGAG TCCCTCTTGG AAGTCCATGG    130

TGAGGGGACT TGATACCTCA CCGCCGTTTG GTTCTTTAAA TTGGCATTGA    180

ATTTGTTTCT CTATAAGAAC ACTCATTTTC ACGCTTTCTG TCTTCTTTCT    230

TCCAGGGCTC TCCCCTTGCC CTAGGCTCTG GCCGTTGCGC CCGGCGGGGT    280

CAACTCCATG ATTAGCATGG AGCTGTAGGA GTCTAAATTG GGGACACAGA    330

TGTTTGGAAC GTCACCTTGC AGTGTTAACT TGGCTTTCAT GAATCTCTTT    380

GATCTTCCAC AAGAGGTAGG CTACGGGTGA AACCTCTTAG GCTAATACTT    430

CTATGAAGAG ATGCTTTGGA TAGGGTAACA GCGGCGGATA TTGGTGAGTT    480

GTTAAGACAA AAACCATTCA ACGCCGGAGG ACTGACTCTC ATCCAGTGGA    530

TGCATTGAGT GGATTGACTG TCAGGGCTGT CTCTAGGCTT AATTCCAGAC    580

CTCTCTGTGC TTAGGGCAAA CATCATTTGG CCTTAAAAGG GGTTCTGTGA    630

GAGGGGATCC CTCCATTAAC AGCTGGACTG TTCTTTGGGG CCTTATGTGG    680

TGTTTGCCGC TGAGGTACTC AGGGGCATTT AGGTTTTTCC TCATTCTCAA    730

ATAATAATGA ATATGTCTAG ACAGGGTATT TTTCAGACTG TTGGGAGTGG    780

TCTTGACCAC ATCCTGTCTC TGGCAGATAT TGAGGMGAG  CAAATGATTC    830

AGTCAGTTGA TAGGACTGCA GTGACTGGAG CTTCTTATTT TACTTCTGTG    880

GATCAATCTT CAGTTCATAC TGCTGAGGTT GGATCACATC AGGTTGAACC    930

TTTGAGAACC TCTGTTGATA AACCTGGATC AAAGAAGACT CAAGGAGAGA    980

AATTTTTTCT GATTCATTCT GCAGATTGGC TTACTACACA TGCTCTTTTC    1030

CATGAAGTTG CAAAATTGGA TGTGGTGAAA TTATTGTATA ATGAACAGTT    1080

TGCTGTTCAA GGTTTGTTGA GATATCATAC ATATGCAAGA TTTGGCATTG    1130

AAATTCAAGT TCAGATAAAC CCTACGCCTT TTCAACAAGG GGGATTGATC    1180

TGTGCTATGG TTCCTGGTGA TCAGAGCTAT GGTTCTATAG CATCATTGAC    1230

TGTTTATCCT CATGGTTTGC TGAATTGCAA TATCAACAAT GTGGTGAGAA    1280

TAAAGGTTCC ATTTATTTAC ACAAGGGGTG CTTACCATTT TAAAGATCCC    1330

CAATACCCAG TCTGGGGATT GACAATTAGA GTTTGGTCAG AATTAAATAT    1380

TGGACCAGGA ACTTCAGCTT ATACTTCACT CAATGTTTTA GCTAGATTTT    1430

CAGTTTTGGA GTTGCATGGA TTAACTCCTC TTTCCACACA AATGATGAGG    1480

AATGAATTTA GGGTCAGTAC CTCTGAAAAT GTGGTGAATT TGTCAAATTA    1530

TGAAGATGCA AGAGCAAAGA TGTCTTTTGC TTTAGATCAG GAAGATTGGA    1580

AATCTGATCC ATCCCAAGGT GGCGGAATTA AAATTACTCA TTTCACTACT    1630

TGGACATCTA TCCCAACTTT GGCTGCTCAG TTTCCATTTA ATGCTTCAGA    1680

TTCAGTTGGT CAGCAAATTA AAGTTATTCC AGTTGATCCA TATTTTTTCC    1730

AAATGACAAA CACAAACCCT GACCAAAAAT GTATAACTGC TTTGGCTTCT    1780

ATTTGTCAGA TGTTTTGTTT TTGGAGAGGA GATCTTGTCT TTGATTTTCA    1830

GGTTTTCCCG ACCAAATATC ATTCAGGTAG ATTACTATTT TGTTTTGTTC    1880

CTGGTAATGA GCTAATAGAT GTTTCTGGAA TCACATTAAA ACAGGCAACT    1930

ACTGCTCCTT GTGCAGTGAT GGACATTACA GGAGTGCAGT CAACTTTGAG    1980

ATTTCGTGTT CCCTGGATTT CTGATACACC CTATCGGGTA AACAGATATA    2030

CAAAGTCAGC ACATCAGAAA GGTGAGTACA CTGCCATTGG GAAGCTTATT    2080

GTGTACTGTT ATAACAGATT GACTTCTCCT TCTAACGTTG CTTCCCATGT    2130

TAGAGTGAAT GTTTATCTTT CAGCAATTAA TTTGGAATGC TTTGCTCCTC    2180

TTTATCATGC CATGGATGTT ACCACACAGG TTGGAGATGA TTCTGGGGGT    2230

TTTTCAACAA CAGTTTCTAC AGAGCAGAAT GTTCCAGATC CCCAAGTTGG    2280

TATAACAACC ATGAAGGATT TAAAAGGTAA AGCTAATAAG GGAAAAATGG    2330

ATGTTTCAGG AGTGCAAGCA CCTGTGGGAG CTATTACAAC AATTGAGGAT    2380

CCTGTTTTAG CAAAGAAAGT ACCTGAGACA TTCCCTGAAT TGAAACCTGG    2430

AGAGTCTAGG CATACATCAG ATCATATGTC TATTTACAAG TTTATGGGAA    2480

GGTCTCATTT TTTGTGCACT TTTACTTTTA ATTCAAACAA TAAAGAGTAC    2530

ACATTTCCTA TAACCTTGTC TTCAACCTCC AATCCTCCTC ATGGTTTACC    2580

ATCAACATTG AGGTGGTTTT TCAATTTGTT TCAATTGTAT AGAGGACCTT    2630

TAGATCTGAC AATTATCATC ACTGGAGCAA CTGATGTAGA TGGCATGGCT    2680

TGGTTTACAC CAGTAGGTCT TGCCGTTGAT ACTCCCTGGG TAGAAAAGGA    2730

GTCAGCCCTG TCTATTGACT ACAAAACTGC TCTTGGAGCT GTCAGATTCA    2780

ATACAAGGAG AACAGGGAAC ATTCAGATTA GGTTACCATG GTATTCTTAT    2830

TTATATGCTG TGTCTGGAGC ACTGGATGGT TTGGGAGATA AGACAGATTC    2880

TACATTCGGA TTGGTTTCTA TTCAGATTGC AAATTATAAT CATTCTGATG    2930

AATATTTGTC TTTTAGTTGC TATTTGTCTG TCACAGAACA ATCAGAATTT    2980

TATTTTCCCA GAGCTCCATT GAATTCATAT GCTATGTTAT CCACTGAATC    3030

AATGATGAGC AGAATTGCGG CTGGAGACTT GGAGTCATCA GTGGATGATC    3080

CTAGATCAGA GGAGGACAAA AGATTTGAGA GTCATATAGA ATGCAGGAAA    3130

CCCTATAAAG AATTGAGATT GGAAGTTGGG AAACAAAGAC TCAAGTATGC    3180

TCAGGAAGAA TTGTCAAATG AAGTGCTCCC ACCCGCTAGG AAAATGAAGG    3230

GGTTGTTTTC ACAAGCTAAA ATTTCTCTTT TTTACACTGA GGAGCATGAA    3280

ATAATGAAAT TTTCTTGGAG AGGAGTGACT GCAGATACTA GAGCTTTAAG    3330

GAGGTTTGGA TTTTCTTTGG CTGCTGGCAG AAGTGTGTGG ACTCTTGAAA    3380

TGGATGCTGG GGTTCTAACT GGGAGATTGA TTAGACTGAA TGATGAAAAA    3430

TGGACAGAAA TGAAGGATGA CAAAATTGTT TCATTGATTG AAAAGTTTAC    3480

AAGCAACAAA TATTGGTCCA AAGTGAATTT CCCACATGGG ATGTTGGATC    3530

TTGAAGAAAT TGCTGCCAAT TCCAAAGATT TTCCTAACAT GTCTGAGACT    3580

GATCTGTGTT TCTTGCTGCA TTGGTTAAAT CCAAAGAAAA TAAATTTAGC    3630

AGATAGAATG CTTGGATTGT CTGGAGTTCA GGAAATTAAA GAACAAGGTG    3680

TTGGATTAAT AGCAGAATGT AGAACTTTCT TAGATTCTAT TACTGGAGCT    3730

TTAAAATCTA TGATGTTTGG ATTTCATCAA TCTGTGACTG TTGAAATTAT    3780

AAATACTGTG CTTTGTTTTG TTAAGAGTGG AATTTTGCTT TATGTTATAC    3830

AACAATTGAA TCAGGATGAA CACTCTCACA TAATTGGTTT GTTGAGAGTT    3880

ATGAATTATG TAGATATTGG TTGTTCAGTT ATTTCATGTG GCAAAGTTTT    3930

CTCCAAAATG CTGGAAACAG TCTTTAATTG GCAGATGGAC TCTAGAATGA    3980

TGGAGTTGAG AACACAGAGT TTTTCCAACT GGTTAAGAGA TATCTGTTCA    4030

GGGATCACTA TTTTTAAAAA CTTCAAGGAT GCAATTTATT GGTTCTATAC    4080

AAAATTGAAG GATTTTTATG AAGTGAATTA TGGTAAGAAG AGGGATATTT    4130

TAAATATCCT TAAAGACAAC CAACAAAAAA TAGAGAAAGC CATTGAGGAA    4180

GCAGATAAAT TTTGCATTTT GCAAATCCAA GATGTGGAAA AATCTGAACA    4230

GTATCAGAAA GGGGTTGACT TGATACAAAA ATTGAGGACT GTTCATTCAA    4280

TGGCTCAGGT TGATCCTAAT CTGATGGTTC ATTTGTCACC TTTGAGAGAC    4330

TGCATAGCAA GAGTTCATCA GAAGCTCAAA AACCTTGGAT CTATAAATCA    4380

GGCAATGGTA ACAAGATGTG AGCCAGTTGT TTGCTATTTG TATGGCAAAA    4430

GAGGAGGAGG AAAGAGTTTG ACGTCAATTG CATTGGCAAC TAAAATTTGT    4480

AAACATTATG GTGTTGTACC TGAGAAGAAC ATCTATACTA AACCTGTGGC    4530

TTCAGATTAT TGGGATGGGT ATAGTGGACA GTTAGTTTGC ATCATTGATG    4580

ATATCGGTCA AAATACAACA GATGAGGATT GGTCAGACTT TTGTCAGTTG    4630

GTGTCAGGAT GCCCAATGAG ATTAAATATG GCCTCTCTTG AAGAGAAGGG    4680

TAGGCATTTT TCTTCTCCTT TCATAATAGC AACTTCAAAT TGGTCAAATC    4730

CAAGTCCAAA AACAGTTTAT GTTAAGGAAG CCATTGATCG TAGACTCCAT    4780

TTTAAGGTTG AAGTTGAACC TGCTTCATTT TTTAAAAATC CTCACAATGA    4830

TACGTTGAAT GTCAATTTAG CTAAAACAGG TGATGCAATC AAGGATATGT    4880

CTTGTGTTGA TCTGATAATG GATGGACATA ATGTTTCATT GATGGACTTG    4930

CTCAGTTCCC TAGTTATGAC AGTAGAAATC AGGAAACAAA ACATGACTGA    4980

ATTTATGGAG TTGTGGTCTC AGCGAATTTC AGATGATGAT AGTGCAGTGG    5030

CAGAGTTTTT CCAGTCTTTT CCATCTGGTG AACCATCGAA TTCCAAATTA    5080

TCTGGCTTTT TCCAATCTGT TAGTAATCAC AAGTGGGTTG CTGTGGGAGC    5130

TGCAGTTGGT ATTCTTGGAG TGCTCGTTGG GGGATGGTTT GTGTATAAGC    5180

ATTTCACCCG AAAGGAGGAA GAGCCAATTC CAACTGAAGG GGTATATCAT    5230

GGTGTAACTA AGCCTAAGCA AGTGATTAAA TTAGATGCAG ATCCAGCAGA    5280

ATCTCAGTCA ACTTTGGAAA TAGCAGGACT GGTTAGGAAG AATTTGGTTC    5330

AGTTTGGAGT TGGAGAGAAG AATGGATGTG TGAGATGGGT TACGAATGCC    5380

TTAGGGGTGA AAGATGATTG GTTGCTTGTA CCTTCTCATG CTTACAAATT    5430

TGAGAAAGGT TATGAAATGA TGGAGTTTTA TTTTAATAGA GGTGGAACTT    5480

ACTACTCAAT TTCAGCTGGT AATGTTGTCA TTCAATCTTT GGATGTGGGA    5530

TTTCAGGATG TTGTTCTGAT GAAGGTTCCT ACAATTCCTA AGTTTAGAGA    5580

TATTACCCAA CATTTTGTTA AGAAGGGAGA TGTGCCTAGA GCTTTGAATC    5630

GTCTGGCAAC ATTAGTGACA ACTGTGAATG GAACTCCTAT GTTAATTTCT    5680

GAGGGCCCAT TAAAGATGGA AGAGAAAGCT TCTTATGTTC ATAAGAAAAA    5730

TGATGGTACA ACAGTTGATT TAATTGTGGA CCAGGCATGG AGAGGAAAAG    5780

GCGAGGGTCT TCCTGGAATG TGTGGTGGGG CCTTGGTTTC ATCAAATCAG    5830

TCTATACAGA ATGCAATTTT GGGTATTCAT GTTGCTGGAG GAAATTCAAT    5880

TCTTGTTGCA AAATTGGTTA CTCAAGAAAT GTTCCAAAAT ATTGATAAGA    5930

AAATTGAAAG TCAGAGAATC ATGAAAGTGG ATTTTACTCA GTGTTCAATG    5980

AATGTAGTCT CCAAAACGCT TTTTAGAAAG AGTCCCATTC ATCATCACAT    6030

TGATAAAACC ATGATTAATT TTCCTGCAGC TATGCCTTTT TCTAAAGCCG    6080

AAATTGATCC AATGGCTATG ATGTTATCCA AGTATTCATT ACCCATTGTA    6130

GAAGAGCCAG AAGATTATAA AGAAGCTTCA ATTTTTTATC AAAATAAAAT    6180

AGTAGGCAAG ACTCAGCTAG CTGATGATTT TCTAGATCTT GATATGGCCA    6230

TTACAGGGGC CCCAGGAATT GATGCTATTA ATATGGATTC ATCTCCTGGA    6280

TTTCCTTATG TTCAAGAGAG GCTGACCAAA AGAGATTTAA TTTGGTTAGA    6330

TGAGAATGGT TTATTGCTGG GAATTCATCC AAGATTGGCT CAGAGAATTT    6380

TGTTCAATAC TGTCATGATG GAAAATTGTT CTGATTTGGA TGTTGTTTTT    6430

ACTACTTGCC CAAAAGATGA ATTGAGACCA TTGGAGAAGG TGTTGGAATC    6480

AAAAACAAGA GCTATTGATG CTTGTCCTCT GGATTACACA ATTTTGTGTC    6530

GAATGTACTG GGGTCCAGCT ATTAGTTATT TTCATTTGAA TCCAGGGTTC    6580

CATACAGGTG TTGCTATTGG CGTAGATCCT GACAAACAGT GGGATGAATT    6630

ATTTAAAACA ATGATAAGAT TTGGAGATGT CGGTCTTGAT TTGGATTTTT    6680

CTGCTTTTGA TGCTAGTCTT AGTCCATTTA TGATTAGGGA AGCAGGTAGT    6730

ATTATGAGTG AATTATCTGG AACTCCATCC GATTTTGGAA CAGCTCTTAT    6780

CAATACTATC ATTTATTCTA AGCATCTGCT GTACAACTGT TGTTATCATG    6830

TTTATGGTTC AATGCCTTCT GGGTCTCCTT GCACAGCTTT GCTGAATTCA    6880

ATTACCAATA ATGTCAATTT GTATTATGTG TTTTCCAAGA TATTTGGAAA    6930

GTCTCCAGTT TTCTTTTGTC AGGCTTTGAA GATTCTCTGT TATGGAGATG    6980

ATGTTCTTAT AGTTTTTTCC CGAGATGTTC AGATTGATAA TCTTGATTTG    7030

ATTGGACAAA AAATTGTAGA TGAGTTTAAG AAACTTGGCA TGACAGCTAC    7080

TTCTGCTGAC AAAAATGTAC CTCAGCTGAA GCCAGTTTCA GAATTGACTT    7130

TTCTCAAGAG ATCTTTCAAT TTGGTAGAAG ATAGGATCAG ACCTGCAATT    7180

TCGGAAAAAA CCATTTGGTC TTTGATAGCA TGGCAGAGAA GTAACGCTGA    7230

GTTCGAGCAG AATTTGGAAA ATGCTCAGTG GTTTGCTTTT ATGCATGGTT    7280

ATGGGTTTTA TCAGAAATTC TATTATTTTG TTCAGTCCTG TTTGGAGAAA    7330

GAGATGATAG AATACAGACT TAAATCTTAT GATTGGTGGA GAATGAGATT    7380

TTATGACCAG TGTTTCATTT GTGACCTTTC ATGATTTGTT TAAACGAATT    7430

TTCTTAAAAT TTCTGAGGTT TGTTTATTTC TTTTTATCAG TAAATAAAAA    7480

本发明涉及经低温细胞培养减毒的人HAV H2K25株。该减毒株是HAV Gkm株在人胚肺二倍体细胞KMB17中，经35℃培育15代，32℃培育5代，35℃培育5代后获得的病毒株。

本发明还涉及HAV H2K25的cDNA序列，特别是HAV基因组5’NCR区、2A区和2C区的cDNA序列。该组核苷酸序列分别作为SEQ NO.7、SEQ NO.8和SEQ NO.9示于下面。

SEQ NO.7(HAV H2K25 5’NCR区，101bp-200bp)

5’TTCCCTTTCC CCTTCCCCTT CCTTGTTTTG ATTGTAAATA

   TAAATTCCTG CAGGTTCAGG GTTCTTTAAA TTGGCATTGA

   ATTTGTTTCT CTATAAGAAC             3’

SEQ NO.8(HAV H2K25 2A区，3011bp-3110bp)

5’TATGTTATCC ACTGAATCAA TGATGAGCAG AATTGCGGCT

   GGAGACTTGG AGTCATCAGT GGATGATCCT AGATCAGAGG

   AGGATAAAAG ATTTGAGAGT             3’

SEQ NO.9(HAV H2K25 2C区，3986bp-4085bp)

5’CACAGAGTTT TTCCAACTGG TTAAGAGATA TCTGTTCAGG

   GATCACTATT TTTAAAAACT TCAAGGATGC AATTTATTGG

   CTCTATACAA AATTGAAGGA

本发明涉及经低温细胞培养减毒的人HAV H2M20K5株。该减毒株是HAVGkm株在原代猴肾细胞中，经35℃培育15代，32℃培育5代，再在KMB17细胞于32℃培育5代后获得的病毒株。

本发明还涉及HAV H2M20K5的cDNA序列，特别是HAV基因组5’NCR区、2A区和2C区的cDNA序列。该组核苷酸序列分别作为SEQ NO.10、SEQNO.11和SEQ NO.12示于下面。

SEQ NO.10(HAV H2M20K5 5’NCR区，101bp-200bp)

5’TTCCCTTTCC CCTTCCCCTT CCTTGTTTTG ATTGTAAATA

   TAAATTCCTG CAGGTTCAGG GTTCTTTAAA TTGGCATTGA

   ATTTGTTTCT CTATAAGAAC            3’

SEQ NO.11(HAV H2M20K5 2A区，3011bp-3110bp)

5’TATGTTATCC ACTGAATCAA TGATGAGCAG AATTGCGGCT

   GGAGACTTGG AGTCATCAGT GGATGATCCT AGATCAGAGG

   AGGATAAAAG ATTTGAGAGT            3’

SEQ NO.12(HAV H2M20K5 2C区，3986bp-4085bp)

5’CTCAGAGTTT TTCCAACTGG TTAAGAGATA TCTGTTCAGG

   GATCACTATT TTTAAAAACT TCAAGGATGC AATTTATTGG

   CTCTATACAA AATTGAAGGA            3’

本发明还涉及上述所有cDNA核苷酸序列的变异体，因为以上给出的DNA序列仅代表了本发明的优选例子。由于遗传密码的简并性，所以可以制备许多核苷酸，它们都是能够指导合成该病毒蛋白质或其类似物的DNA序列。因此，功能上与上述序列等价的DNA序列都被包括在本发明之内。

本发明还涉及基于上述所有cDNA序列，设计引物而选择性扩增甲型肝炎基因片段，从而在甲型肝炎病毒的遗传稳定性检测、毒性检测和细胞适应性检测及生物样品检测中应用。

本发明还涉及基于上述所有cDNA序列，应用基因工程技术制造的任何甲肝病毒减毒株。

本发明还涉及基于上述所有cDNA序列，应用基因工程技术制造的任何甲肝病毒多肽疫苗。

                          具体实施方式

实施例1

甲型肝炎病毒Gkm株的分离及其cDNA序列

采集杭州近郊甲肝急性期病人粪便标本，用PBS(pH7.0)制成20％(V/V)悬浮液，以F113～PEG沉淀及差速离心进行抽提，抽提物经超速离心沉淀，以免疫电镜检测观察到含27nm大小的甲肝病毒颗粒，此即为初步纯化的HAVGkm株。

HAY Gkm株病毒经胍盐/热酚法提取病毒核糖核酸(RNA)，用cDNA合成药盒配合高保真多聚酶链反应(PCR)技术，以及分子克隆技术，获得HAV Gkm株的cDNA基因文库，最后用DNA序列分析药盒，用双脱氧末端终止法对已有的cDNA克隆进行序列分析，再通过拼接，从而获得HAV Gkm株的cDNA序列。该序列以Gkm NO.1示于文中。

实施例2

甲型肝炎病毒H2K5株的分离及其部分cDNA序列

HAV Gkm株毒种接种人胚肺二倍体细胞KMB17单层细胞，35℃吸附2小时，用新生牛血清的Eagles及乳蛋白维持液，置35℃培养，每周换维持液一次，至第6周，去原维持液，用胰蛋白-EDTA液消化，收集细胞，用冻融、超声处理抽提HAY，再以该HAV为毒种进行下一轮传代。以上述方法在KMB17细胞中连续传5代，每代用直接免疫荧光或ELISA监视病毒的增殖，从而获得HAV H2K5株。

参考HAV Gkm株cDNA序列，合成位于HAV 5’NCR区、2A区和2C区的3对逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)引物，引物的序列如下，从SEQ PrimerNO.1一直到SEQ Primer NO.6。

1.SEQ Primer NO.1(HAV 5’NCR forward)

  5′GGACTTGATACCTCACCG 3′

2.SEQ Primer NO.2(HAV 5’NCR reverse)

  5′CTAATCATGGAGTTGACC 3′

3.SEQ Primer NO.3(HAV 2A forward)

  5′GTCACAGAGCAATCAGAGT 3′

4.SEQ Primer NO.4(HAV 2A reverse)

  5′AGCTTGTGAAAATAGTCC 3′

5.SEQ Primer NO.5(HAV 2C forward)

  5′CCAGAATGATGGAGCTG 3′

6.SEQ Primer NO.6(HAV 2C reverse)

  5′GGGTCAACTTGAGCCATT 3′

HAV H2K5株病毒经胍盐/热酚法提取病毒RNA，利用上述3对引物，用cDNA合成药盒配合高保真PCR技术，获得HAV H2K5株5’NCR区、2A区和2C区基因片段，用DNA序列分析试剂盒对纯化的PCR片段进行直接测序，获得HAV H2K5株5’NCR区、2A区和2C区的部分cDNA序列，序列分别示于文中，为SEQ NO.1、SEQ NO.2和SEQ NO.3。

实施例3

甲型肝炎病毒H2K20株的分离及其部分cDNA序列

HAV Gkm株毒种接种人胚肺二倍体细胞KMB17单层细胞，35℃吸附2小时，用新生牛血清的Eagles及乳蛋白维持液，置35℃培养，每周换维持液一次，至第6周，去原维持液，用胰蛋白-EDTA液消化，收集细胞，用冻融、超声处理抽提HAV，再以该HAV为毒种进行下一轮传代。以上述方法在KMB17细胞中连续传代，其中35℃传15代，32℃传5代，每代用直接免疫荧光或ELISA监视病毒的增殖，从而获得HAV H2K20株。

参考HAV Gkm株cDNA序列，HAV H2K20株病毒经胍盐/热酚法提取病毒核糖核酸(RNA)，用cDNA合成药盒配合高保真多聚酶链反应(PCR)技术，获得一系列HAV H2K20株的cDNA片段，最后用DNA序列分析药盒，用双脱氧末端终止法对已有的cDNA片段进行直接序列分析，再通过拼接，从而获得HAV H2K20株的cDNA序列。该序列以H2K20 NO.1示于文中。

实施例4

甲型肝炎病毒H2K25减毒株的分离及其部分cDNA序列

HAV Gkm株毒种接种人胚肺二倍体细胞KMB17单层细胞，35℃吸附2小时，用新生牛血清的Eagles及乳蛋白维持液，置35℃培养，每周换维持液一次，至第6周，去原维持液，用胰蛋白-EDTA液消化，收集细胞，用冻融、超声处理抽提HAV，再以该HAV为毒种进行下一轮传代。以上述方法在KMB17细胞中连续传代，其中35℃传15代，32℃传5代，35℃再传5代。每代用直接免疫荧光或ELISA监视病毒的增殖，从而获得HAV H2K25减毒株。

参考HAV Gkm株cDNA序列，合成位于HAV 5’NCR区、2A区和2C区的3对RT-PCR引物，引物的序列见附录，从SEQ Primer NO.1一直到SEQPrimer NO.6。HAV H2K5株病毒经胍盐/热酚法提取病毒RNA，利用上述3对引物，用cDNA合成药盒配合高保真PCR技术，获得HAV H2K25株5’NCR区、2A区和2C区基因片段，用DNA序列分析试剂盒对纯化的PCR片段进行直接测序，获得HAV H2K25株5’NCR区、2A区和2C区的部分cDNA序列，序列分别示于文中，为SEQ NO.4、SEQ NO.5和SEQ NO.6。

实施例5

甲型肝炎病毒H2M20K5减毒株的分离及其部分cDNA序列

HAV Gkm株毒种接种单层细胞，35℃吸附2小时，用新生牛血清的Eagles及乳蛋白维持液，置35℃培养，每周换维持液一次，至第6周，去原维持液，用胰蛋白-EDTA液消化，收集细胞，用冻融、超声处理抽提HAV，再以该HAV为毒种进行下一轮传代。以上述方法在原代猴肾细胞中连续传20代，其中35℃传15代，32℃传5代，然后在KMB17细胞中，32℃再传5代。每代用直接免疫荧光或ELISA监视病毒的增殖，从而获得HAV H2M20K5减毒株。

参考HAV Gkm株cDNA序列，合成位于HAV 5’NCR区、2A区和2C区的3对RT-PCR引物，引物的序列见附录，从SEQ Primer NO.1一直到SEQPrimer NO.6。HAV H2M20K5株病毒经胍盐/热酚法提取病毒RNA，利用上述3对引物，用cDNA合成药盒配合高保真PCR技术，获得HAV H2K25株5’NCR区、2A区和2C区基因片段，用DNA序列分析试剂盒对纯化的PCR片段进行直接测序，获得HAV H2K25株5’NCR区、2A区和2C区的部分cDNA序列，序列分别示于文中，为SEQ NO.4、SEQ NO.5和SEQ NO.6。

与原来的强毒株Gkm株相比，H2M20K5减毒株对人和猴科动物呈弱毒株反应，是甲型肝炎减毒活疫苗(H2)的毒种。

Claims (2)

1.一种甲肝病毒中国株的片段cDNA序列，其特征在于其5′NCR区具有SEQID NO：1的序列。

2.一种甲肝病毒中国株的片段cDNA序列，其特征在于其5′NCR区具有SEQID NO：7或SEQ ID NO：10的序列。