CN101036790A - 变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法。本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有本发明疫苗以及药学上可以接受的载体和赋形剂。功效实验也证明了本发明基因疫苗能够持续高水平的诱导针对变形链球菌表面蛋白的免疫反应，对龋病等变形链球菌相关疾病具有明显的疗效，并且经检测不会整合进宿主细胞的基因组，也不会对受试者造成体重降低等其他不良影响，具有很好的安全性，符合用药要求，具有很好的市场前景。

Description

变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说是涉及到一种变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法。

背景技术

龋病(Caries)是危害人类健康的主要口腔疾病，被WHO列为三大严重危害人类健康的疾病之一。目前在我国龋病发生率有上升的趋势，儿童和老年人发病率甚至高达80％以上，因此找出控制龋病的有效措施是当前的紧迫任务。

由于龋病是一种细菌性疾病，变形链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)是龋病的主要致龋菌，它在牙面的粘附和集聚是龋病发生的先决条件。分子量为190KDa的表面蛋白(surface protein，PAc)是变链菌的主要粘附毒力因子之一，介导变形链球菌细胞对牙面的蔗糖非依赖性黏附或蔗糖依赖性黏附，在龋病的发生发展中起着关键作用。目前已成功地克隆了PAc编码基因，并对其蛋白与基因序列进行了分析。PAc编码基因pac全长4695bp，编码合成具1565个氨基酸残基的蛋白质。

免疫防治是控制龋病的有效手段之一(Childers NK，Tong G.Michalek SM.Nasalimmunization of humans with dehydrated liposomes containing Streptococcus mutans antigen.Oral Microbiol Immunol，1997，12(6)：329-335)。国外在曾尝试用主要致龋菌变链菌的减毒全菌疫苗进行免疫，结果发现变形链球菌全菌多价疫苗可降低龋病发生率，但变形链球菌某些抗原成分可诱发抗体与人类心脏组织发生交叉反应。近年来，先后采用了亚单位疫苗、多肽疫苗等手段进行免疫防龋，但仍存在疫苗制备困难、成本高、免疫原性弱、免疫效力短等缺点。

目前，急需开发出能克服现有疫苗缺点的新型变形链球菌疫苗。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种治疗和预防变形链球菌相关疾病的疫苗。该疫苗含有如序列SEQ ID No.3所示的的变形链球菌表面蛋白编码基因。

进一步的，上述变形链球菌表面蛋白编码基因装载于表达载体上。

优选的，所述的表达载体是真核表达载体。

进一步优选的，所述的真核表达载体是质粒。

其中，上述的变形链球菌相关疾病为龋病。

本发明的第二个目的在于提供一种制备上述疫苗的方法。该方法包括以下步骤：

a、设计合成如SEQ ID No.1所示的特异性上游引物5’-GGCGGTACCATGAAGGTCAAAAAAACTTA-3’和如SEQ ID No.2所示的特异性下游引物5’-CGCCTCGAGTTAATCTTTCTTAGCCTTTA-3’，用这对引物从变链菌基因组DNA中扩增制备变形链球菌表面蛋白编码基因；

b、将所得变形链球菌表面蛋白编码基因装载在表达载体上。

本发明的第三个目的在于提供一种药物组合物。该药物组合物：含有上述的疫苗以及药学上可以接受的载体和赋形剂。

进一步的，上述药物组合物还含有免疫佐剂。

优选的，上述的免疫佐剂是氢氧化铝、脂质体或霍乱毒素B亚单位。

其中，上述药物组合物是口服制剂、口含制剂或注射剂。

用于制备本发明基因疫苗的载体是本领域已知的，如：重组噬菌体、质粒、腺病毒载体和其他的经加工后可以装载变形链球菌表面蛋白编码基因的表达载体，尤其是真核表达载体。同时，需要说明的是：以上生产和操作本发明公开的重组载体和药物组合物的具体技术方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的技术完成。

本发明的有益效果在于：本发明基因疫苗具有制备方法简便、成本低廉、抗原在细胞内的表达与病原体自然感染过程相似、能够持续高水平的诱导针对变形链球菌表面蛋白的免疫反应、安全性高等优点，可以弥补现有药物昂贵、体内稳定性差等缺陷，能增大给药时间的间隔、大大减少给药量、减轻使用者经济负担并提高患者的生活质量。动物实验也证明了本发明基因疫苗对龋病具有明显的疗效，并且经检测该基因疫苗不会整合进宿主细胞的基因组，也不会对使用者造成体重降低等其他不良影响，具有很好的安全性，符合用药要求，具有很好的市场前景。

附图说明

图1为PCR扩增出的pac全片段的1％琼脂糖电泳图，其中M为λ：DNA/HindIII分子量Marker，1和2都为扩增所得的pac基因全片段(4.7Kb)。

图2为重组质粒pcDNA3-gtfB的构建流程图。

图3为重组质粒pcDNA3-PAc酶切鉴定图，其中：M1为λDNA/HindIII酶切，M2为λDNA/HindIII+EcoRI双酶切；1为XhoI酶切，2为KpnI酶切，3为BamHI酶切，4为KpnI+XhoI双酶切，5为HindIII酶切，6为HindIII+XhoI双酶切，7为PstI酶切。

图4为点免疫印迹检测pac基因表达产物结果图，其中：1与2皆为pcDNA3-PAc转染COS-7细胞的培养液，3为标准抗原Pac，4为pcDNA3空载体转染COS-7细胞培养液。

以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

具体实施方式：

实施例一 表面蛋白P1编码基因pac的获取

并合成PCR扩增所用引物：

上游引物(SEQ ID No.1)5’-GGCGGTACCATGAAGGTCAAAAAAACTTA-3’

下游引物(SEQ ID No.2)5’-CGCCTCGAGTTAATCTTTCTTAGCCTTTA-3’

在上、下游引物的5’端分别加入KpnI和XhoI限制性内切酶酶切位点。在酶切位点的5’端各加4个保护性碱基。上游引物在编码基因的上游加入启始密码子ATG，下游引物在编码基因的下游加入终止密码子TTA。

用上述引物从变链菌组DNA中扩增目的基因pac并纯化。

将扩增得到的目的基因pac用1％琼脂糖电泳检测，检测结果为单一条带，扩增特异性高，分子量为与4.7Kb(见图1)，序列与预计相同(变形链球菌表面蛋白基因的核苷酸序列见SEQ ID No.3，其编码的氨基酸序列见SEQ ID No.4)。

实施例二 重组质粒pcDNA3-pac的构建

1、重组质粒pcDNA3-pac的构建(构建流程见图2)：

将真核表达载体pcDNA3和目的基因pac分别在KpnI和XhoI酶的通用缓冲液中，于37℃用KpnI和XhoI双酶切2hr，双酶切产物经1％低熔点琼脂糖凝胶(TakaRa，大连)电泳后，用小量胶回收试剂盒纯化双酶切产物。用DNA连接试剂盒(TakaRa，大连)，将目的基因pac与真核表达载体pcDNA3在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接3hr。连接产物立即转化感受态细胞大肠肝菌JM109，筛选出转化子。

2、重组质粒的酶切鉴定

重组质粒pcDNA3-pac经XhoI、KpnI、BamHI酶切为10.1kb的单一片段，KpnI+XhoI酶切为4.7kb和5.4kb两段，其中4.7kb片段为插入基因pac；HindIII酶切为3943bp，6129bp两段，HindIII+XhoI双酶切为765bp，3943bp，5346bp三段，PstI酶切为1233bp，1420bp，1559bp，5860bp四段。结果表明，重组质粒pcDNA3-pac构建成功(酶切结果见图3)。

经DNA测序结果显示重组质粒pcDNA3-pac中插入基因长度与预计的基因序列完全相同，且插入的方向正确，也没有改变pac基因的阅读框架，保证了编码氨基酸序列的正确性。

实施例三 本发明变形链球菌表面蛋白基因疫苗的制备

1、将实施例二所得的转化子接种于LB液体培养基中，置空气摇床箱内，37℃振摇培养(250rpm)过夜，用质粒抽取试剂盒提取重组质粒。

2、用常规方法提纯重组质粒pcDNA3-pac，并将其制备为基因疫苗。

实施例四 本发明基因疫苗注射剂的制备

该注射剂可以通过以下方法制备得到：无菌条件下取注射用水，再加入原料重组质粒pcDNA3-pac，在无菌条件下混合均匀，稀释到0.1mg/ml，并加缓冲液调节pH值至7.0后无菌过滤分装成注射剂，低温保存。

试验例一 本发明变形链球菌表面蛋白基因疫苗在真核细胞中的表达

用脂质体介导本发明变形链球菌表面蛋白基因疫苗转染COS-7细胞，培养一段时间后进行各项检测，以确定本发明基因疫苗转染真核细胞后具有转录和翻译活性。

1、用RT-PCR法检测插入基因pac的转录产物

在本发明基因疫苗稳定转染的COS-7细胞中提取总RNA，经RT-PCR扩增后进行电泳检测，在凝胶上可见分子量与pac一致的条带，表明有插入基因的转录产物。

2、用免疫组化LSAB法检测外源基因pac在细胞内的表达产物

实验结果显示，本发明基因疫苗稳定转染的COS-7细胞的胞浆呈棕色，pcDNA3空载体稳定转染的COS-7细胞的胞浆内未见明显棕色着色，表明本发明基因疫苗稳定转染的COS-7细胞的胞内有目的蛋白的表达。

3、用流式细胞仪检测外源基因在细胞膜上的表达产物，结果本发明基因疫苗稳定转染的COS-7细胞的细胞膜上有变形链球菌表面蛋白存在。

4、经点免疫印迹分析，pcDNA3-PAc转染COS-7细胞后，其细胞培养液和阳性对照均着蓝色，阴性对照不着色(结果见图4)。

本发明基因疫苗转染真核细胞后具有转录和翻译活性，表达的蛋白质在胞内、胞膜上及胞外均有分布，分子量与预计相同，并可与相应的抗体特异结合。

试验例二 本发明基因疫苗注射剂免疫效果的动物实验

实验分组及免疫：将体重合适的适龄健康大鼠24只随机均分为pcDNA3-pac注射剂组、变形链球菌JBP灭活全菌组、pcDNA3空载体组、PBS组，每组大鼠分别行双侧颌下腺周注射，每只每次100ul(1ug/ul)，共免疫3次。

随后，给各组分别接种变形链球菌，用致龋食物诱龋至实验结束(共90天)。

防龋作用检测指标：血清IgG和唾液S-IgA；唾液变形链球菌计数；牙面菌斑指数；龋齿计分(根据Keyes评分标准计分)。

实验结果：本发明变形链球菌表面蛋白基因疫苗经腺周注射免疫大鼠均产生了显著的的防龋效果(与pcDNA3空载体组和PBS组相比：P＜0.01)，并且应用效果与现有的灭菌全菌疫苗基本相当。

试验例三 本发明变形链球菌表面蛋白基因疫苗的安全性实验

1、本发明变形链球菌表面蛋白基因疫苗对受试大鼠的体重的影响

在试验例二的受试前后结束后，测量各组大鼠的体重。

灭活全菌组大鼠受试组的体重明显较其他组轻(P＜0.01)，而本发明基因疫苗组与pcDNA3空载体组和PBS组相比无明显差异，表明本发明基因疫苗基本无毒性，安全性明显优于现有的灭菌全菌疫苗。

2、本发明变形链球菌表面蛋白基因疫苗生物安全性验证实验

通过PCR实验对本发明基因疫苗整合进受试大鼠的基因组的可能性进行了检测。PCR实验结果表明，在10000个组织细胞核中就能检测出一个pcDNA3-Pac拷贝的检测水平下进行多次实验，免疫各组中均没有发现本发明基因疫苗整合进宿主细胞基因组，即其整合几率低于万分之一。表明本发明基因疫苗具有很好的生物安全性。

由以上实例可见，本发明变形链球菌表面蛋白基因疫苗制备简便、成本低廉、免疫效果好、使用安全，具有很好的市场前景。

以上的较优的具体实施方式是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。

变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>四川大学

<120>变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法

<130>A060037

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR引物1

<400>1

ggcggtacca tgaaggtcaa aaaaactta                                      29

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR引物2

<400>2

cgcctcgagt taatctttct tagccttta                                      29

<210>3

<211>4865

<212>DNA

<213>Streptococcus mutans

<400>3

atttcagcaa aaattgacaa atcaaatcaa ttatattaca attttttaac gtatattaca     60

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变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法.ST25

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变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法.ST25

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tgatt                                                                4865

<210>4

<211>1561

<212>PRT

<213>Streptococcus mutans

<400>4

 Met Lys Val Lys Lys Thr Tyr Gly Phe Arg Lys Ser Lys Ile Ser Lys

 1               5                   10                  15

 Thr Leu Cys Gly Ala Val Leu Gly Thr Val Ala Ala Val Ser Val Ala

             20                  25                  30

 Gly Gln Lys Val Phe Ala Asp Glu Thr Thr Thr Thr Ser Asp Val Asp

         35                  40                  45

变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法.ST25

Thr Lys Val Val Gly Thr Gln Thr Gly Asn Pro Ala Thr Asn Leu Pro

    50                  55                  60

Glu Ala Gln Gly Ser Ala Ser Lys Gln Ala Glu Gln Ser Gln Thr Lys

65                  70                  75                  80

Leu Glu Arg Gln Met Val His Thr Ile Glu Val Pro Lys Thr Asp Leu

                85                  90                  95

Asp Gln Ala Ala Lys Asp Ala Lys Ser Ala Gly Val Asn Val Val Gln

            100                 105                 110

Asp Ala Asp Val Asn Lys Gly Thr Val Lys Thr Ala Glu Glu Ala Val

        115                 120                 125

Gln Lys Glu Thr Glu Ile Lys Glu Asp Tyr Thr Lys Gln Ala Glu Asp

    130                 135                 140

Ile Lys Lys Thr Thr Asp Gln Tyr Lys Ser Asp Val Ala Ala His Glu

145                 150                 155                 160

Ala Glu Val Ala Lys Ile Lys Ala Lys Asn Gln Ala Thr Lys Glu Gln

                165                 170                 175

Tyr Gly Lys Asp Met Val Ala His Lys Ala Glu Val Glu Arg Ile Asn

            180                 185                 190

Ala Ala Asn Ala Ala Ser Lys Thr Ala Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gln

        195                 200                 205

Tyr Gln Ala Asp Leu Ala Ala Val Gln Lys Thr Asn Ala Ala Asn Gln

    210                 215                 220

Ala Ser Tyr Gln Lys Ala Leu Ala Ala Tyr Gln Ala Glu Leu Lys Arg

225                 230                 235                 240

Val Gln Glu Ala Asn Ala Ala Ala Lys Ala Ala Tyr Asp Thr Ala Val

                245                 250                 255

Ala Ala Asn Asn Ala Lys Asn Thr Glu Ile Ala Ala Ala Asn Glu Glu

            260                 265                 270

Ile Arg Lys Arg Asn Ala Thr Ala Lys Ala Glu Tyr Glu Thr Lys Leu

        275                 280                 285

Ala Gln Tyr Gln Ala Glu Leu Lys Arg Val Gln Glu Ala Asn Ala Ala

    290                 295                 300

Asn Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln Thr Glu Leu

305                 310                 315                 320

Ala Arg Val Gln Lys Ala Asn Ala Asp Ala Lys Ala Ala Tyr Glu Ala

                325                 330                 335

Ala Val Ala Ala Asn Asn Ala Lys Asn Ala Ala Leu Thr Ala Glu Asn

            340                 345                 350

变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法.ST25

Thr Ala Ile Lys Gln Arg Asn Glu Asn Ala Lys Ala Thr Tyr Glu Ala

        355                 360                 365

Ala Leu Lys Gln Tyr Glu Ala Asp Leu Ala Ala Val Lys Lys Ala Asn

    370                 375                 380

Ala Ala Asn Glu Ala Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Thr Ala Tyr Gln Thr

385                 390                 395                 400

Glu Leu Ala Arg Val Gln Lys Ala Asn Ala Asp Ala Lys Ala Ala Tyr

                405                 410                 415

Glu Ala Ala Val Ala Ala Asn Asn Ala Ala Asn Ala Ala Leu Thr Ala

            420                 425                 430

Glu Asn Thr Ala Ile Lys Lys Arg Asn Ala Asp Ala Lys Ala Asp Tyr

        435                 440                 445

Glu Ala Lys Leu Ala Lys Tyr Gln Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Gln Lys

    450                 455                 460

Asp Leu Ala Asp Tyr Pro Val Lys Leu Lys Ala Tyr Glu Asp Glu Gln

465                 470                 475                 480

Ala Ser Ile Lys Ala Ala Leu Ala Glu Leu Glu Lys His Lys Asn Glu

                485                 490                 495

Asp Gly Asn Leu Thr Glu Pro Ser Ala Gln Asn Leu Val Tyr Asp Leu

            500                 505                 510

Glu Pro Asn Ala Asn Leu Ser Leu Thr Thr Asp Gly Lys Phe Leu Lys

        515                 520                 525

Ala Ser Ala Val Asp Asp Ala Phe Ser Lys Ser Thr Ser Lys Ala Lys

    530                 535                 540

Tyr Asp Gln Lys Ile Leu Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ile Thr Asn Leu

545                 550                 555                 560

Glu Gln Ser Asn Asp Val Ala Ser Ser Met Glu Leu Tyr Gly Asn Phe

                565                 570                 575

Gly Asp Lys Ala Gly Trp Ser Thr Thr Val Ser Asn Asn Ser Gln Val

            580                 585                 590

Lys Trp Gly Ser Val Leu Leu Glu Arg Gly Gln Ser Ala Thr Ala Thr

        595                 600                 605

Tyr Thr Asn Leu Gln Asn Ser Tyr Tyr Asn Gly Lys Lys Ile Ser Lys

    610                 615                 620

Ile Val Tyr Lys Tyr Thr Val Asp Pro Lys Ser Lys Phe Gln Gly Gln

625                 630                 635                 640

Lys Val Trp Leu Gly Ile Phe Thr Asp Pro Thr Leu Gly Val Phe Ala

变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法.ST25

                645                 650                 655

Ser Ala Tyr Thr Gly Gln Val Glu Lys Asn Thr Ser Ile Phe Ile Lys

            660                 665                 670

Asn Glu Phe Thr Phe Tyr Asp Glu Asp Gly Lys Pro Ile Asn Phe Asp

        675                 680                 685

Asn Ala Leu Leu Ser Val Ala Ser Leu Asn Arg Glu Asn Asn Ser Ile

    690                 695                 700

Glu Met Ala Lys Asp Tyr Thr Gly Lys Phe Val Lys Ile Ser Gly Ser

705                 710                 715                 720

Ser Ile Gly Glu Lys Asn Gly Met Ile Tyr Ala Thr Asp Thr Leu Asn

                725                 730                 735

Phe Arg Gln Gly Gln Gly Gly Ala Arg Trp Thr Met Tyr Thr Arg Ala

            740                 745                 750

Ser Glu Pro Gly Ser Gly Trp Asp Ser Ser Asp Ala Pro Asn Ser Trp

        755                 760                 765

Tyr Gly Ala Gly Ala Ile Arg Met Ser Gly Pro Asn Asn Ser Val Thr

    770                 775                 780

Leu Gly Ala Ile Ser Ser Thr Leu Val Val Pro Ala Asp Pro Thr Met

785             790                     795                 800

Ala Ile Glu Thr Gly Lys Lys Pro Asn Ile Trp Tyr Ser Leu Asn Gly

                805                 810                 815

Lys Ile Arg Ala Val Asn Leu Pro Lys Val Thr Lys Glu Lys Pro Thr

            820                 825                 830

Pro Pro Val Lys Pro Thr Ala Pro Thr Lys Pro Thr Tyr Glu Thr Glu

        835                 840                 845

Lys Pro Leu Lys Pro Ala Pro Val Ala Pro Asn Tyr Glu Lys Glu Pro

    850                 855                 860

Thr Pro Pro Thr Arg Thr Pro Asp Gln Ala Glu Pro Lys Lys Pro Thr

865                 870                 875                 880

Pro Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys Pro Leu Glu Pro Ala Pro Val Glu

                885                 890                 895

Pro Ser Tyr Glu Ala Glu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Thr Pro Asp Gln

            900                 905                 910

Ala Glu Pro Asn Lys Pro Thr Pro Pro Thr Tyr Glu Thr Glu Lys Pro

        915                 920                 925

Leu Glu Pro Ala Pro Val Glu Pro Ser Tyr Glu Ala Glu Pro Thr Pro

    930                 935                 940

变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法.ST25

Pro Thr Pro Thr Pro Asp Gln Pro Glu Pro Asn Lys Pro Val Glu Pro

945                 950                 955                 960

Thr Tyr Glu Val Ile Pro Thr Pro Pro Thr Asp Pro Val Tyr Gln Asp

                965                 970                 975

Leu Pro Thr Pro Pro Ser Ile Pro Thr Val His Phe His Tyr Phe Lys

            980                 985                 990

Leu Ala Val Gln Pro Gln Val Asn Lys Glu Ile Arg Asn Asn Asn Asp

        995                 1000                1005

Val Asn Ile Asp Arg Thr Leu Val Ala Lys Gln Ser Val Val Lys

    1010                1015                1020

Phe Gln Leu Lys Thr Ala Asp Leu Pro Ala Gly Arg Asp Glu Thr

    1025                1030                1035

Thr Ser Phe Val Leu Val Asp Pro Leu Pro Ser Gly Tyr Gln Phe

    1040                1045                1050

Asn Pro Glu Ala Thr Lys Ala Ala Ser Pro Gly Phe Asp Val Ala

    1055                1060                1065

Tyr Asp Asn Ala Thr Asn Thr Val Thr Phe Lys Ala Thr Ala Ala

    1070                1075                1080

Thr Leu Ala Thr Phe Asn Ala Asp Leu Thr Lys Ser Val Ala Thr

    1085                1090                1095

Ile Tyr Pro Thr Val Val Gly Gln Val Leu Asn Asp Gly Ala Thr

    1100                1105                1110

Tyr Lys Asn Asn Phe Ser Leu Thr Val Asn Asp Ala Tyr Gly Ile

    1115                1120                1125

Lys Ser Asn Val Val Arg Val Thr Thr Pro Gly Lys Pro Asn Asp

    1130                1135                1140

Pro Asp Asn Pro Asn Asn Asn Tyr Ile Lys Pro Thr Lys Val Asn

    1145                1150                1155

Lys Asn Glu Asn Gly Val Val Ile Asp Gly Lys Thr Val Leu Ala

    1160                1165                1170

Gly Ser Thr Asn Tyr Tyr Glu Leu Thr Trp Asp Leu Asp Gln Tyr

    1175                1180                1185

Lys Asn Asp Arg Ser Ser Ala Asp Thr Ile Gln Gln Gly Phe Tyr

    1190                1195                1200

Tyr Val Asp Asp Tyr Pro Glu Glu Ala Leu Glu Leu Arg Gln Asp

    1205                1210                1215

Leu Val Lys Ile Thr Asp Ala Asn Gly Asn Glu Val Thr Gly Val

    1220                1225                1230

变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法.ST25

Ser Val Asp Asn Tyr Thr Ser Leu Glu Ala Ala Pro Gln Glu Ile

    1235                1240                1245

Arg Asp Val Leu Ser Lys Ala Gly Ile Arg Pro Lys Gly Ala Phe

    1250                1255                1260

Gln Ile Phe Arg Ala Asp Asn Pro Arg Glu Phe Tyr Asp Thr Tyr

    1265                1270                1275

Val Lys Thr Gly Ile Asp Leu Lys Ile Val Ser Pro Met Val Val

    1280                1285                1290

Lys Lys Gln Met Gly Gln Thr Gly Gly Ser Tyr Glu Asp Gln Ala

    1295                1300                1305

Tyr Gln Ile Asp Phe Gly Asn Gly Tyr Ala Ser Asn Ile Val Ile

    1310                1315                1320

Asn Asn Val Pro Lys Ile Asn Pro Lys Lys Asp Val Thr Leu Thr

    1325                1330                1335

Leu Asp Pro Ala Asp Thr Asn Asn Val Asp Gly Gln Thr Ile Pro

    1340                1345                1350

Leu Asn Thr Val Phe Asn Tyr Arg Leu Ile Gly Gly Ile Ile Pro

    1355                1360                1365

Ala Asn His Ser Glu Glu Leu Phe Glu Tyr Asn Phe Tyr Asp Asp

    1370                1375                1380

Tyr Asp Gln Thr Gly Asp His Tyr Thr Gly Gln Tyr Lys Val Phe

    1385                1390                1395

Ala Lys Val Asp Ile Thr Leu Lys Asn Gly Val Ile Ile Lys Ser

    1400                1405                1410

Gly Thr Glu Leu Thr Gln Tyr Thr Thr Ala Glu Val Asp Thr Thr

    1415                1420                1425

Lys Gly Ala Ile Thr Ile Lys Phe Lys Glu Ala Phe Leu Arg Ser

    1430                1435                1440

Val Ser Ile Asp Ser Ala Phe Gln Ala Glu Ser Tyr Ile Gln Met

    1445                1450                1455

Lys Arg Ile Ala Val Gly Thr Phe Glu Asn Thr Tyr Ile Asn Thr

    1460                1465                1470

Val Asn Gly Val Thr Tyr Ser Ser Asn Thr Val Lys Thr Thr Thr

    1475                1480                1485

Pro Glu Asp Pro Ala Asp Pro Thr Asp Pro Gln Asp Pro Ser Ser

    1490                1495                1500

Pro Arg Thr Ser Thr Val Ile Ile Tyr Lys Pro Gln Ser Thr Ala

    1505                1510                1515

变形链球菌表面蛋白基因疫苗及其制备方法.ST25

Tyr Gln Pro Ser Ser Val Gln Lys Thr Leu Pro Asn Thr Gly Val

    1520                1525                1530

Thr Asn Asn Ala Tyr Met Pro Leu Leu Gly Ile Ile Gly Leu Val

    1535                1540                1545

Thr Ser Phe Ser Leu Leu Gly Leu Lys Ala Lys Lys Asp

    1550                1555                1560

Claims (10)

1、一种治疗和预防变形链球菌相关疾病的疫苗，其特征在于：含有序列SEQ No.3所示的的变形链球菌表面蛋白编码基因。

2、根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述的变形链球菌表面蛋白编码基因装载于表达载体上。

3、根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于：所述的表达载体为真核表达载体。

4、根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述的真核表达载体为质粒。

5、根据权利要求1～4任一项所述的疫苗，其特征在于：所述的变形链球菌相关疾病为龋病。

6、一种制备权利要求2所述的疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、合成SEQ ID No.1所示的特异性上游引物和SEQ ID No.2所示的特异性下游引物，用这对引物从变链菌基因组DNA中扩增制备变形链球菌表面蛋白编码基因；

b、将所得变形链球菌表面蛋白编码基因转载在表达载体上。

7、一种药物组合物，其特征在于：含有权利要求1～5任一项所述的疫苗以及药学上可以接受的载体和赋形剂。

8、根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于还含有免疫佐剂。

9、根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于所述的免疫佐剂是氢氧化铝、脂质体或霍乱毒素B亚单位。

10、根据权利要求7～9任一项所述的药物组合物，其特征在于该药物组合物是口服制剂、口含制剂或注射剂。

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