CN1656116A - 包含hpv－16病毒的突变e7蛋白的非免疫抑制免疫原性组合物或疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诱导针对HPV－16乳头瘤病毒天然E7蛋白的免疫应答而同时不诱导免疫抑制的免疫原性组合物或疫苗组合物，所述组合物包含作为活性成分的非免疫抑制的突变E7蛋白，该突变蛋白从N－末端到C－末端包含的氨基酸序列如下：i.序列SEQ ID No.3的1－19位氨基酸序列；ii.具有(a)与序列SEQ ID No.3的相应20－29位氢基酸序列相比至少一个氨基酸替代的氨基酸序列或者(b)与序列SEQ ID No.3的相应20－29位氨基酸序列相比至少4个连续氨基酸缺失的氨基酸序列；和iii.序列SEQ ID No.3的30－98位氨基酸序列。

Description

包含HPV-16病毒的突变E7蛋白的 非免疫抑制免疫原性组合物或疫苗组合物
发明领域
本发明涉及与通过HPV-16型乳头瘤病毒感染相关的一些癌症的预防或治疗的领域。
现有技术
现今认为一些人乳头瘤病毒或者HPV是癌症的致病原。具体地，16、18、31、33和51型HPV经常与肛门和生殖器癌症，包括妇女宫颈癌相关。
宫颈中50％以上的鳞状癌与HPV-16型乳头瘤病毒相关。
HPV E6和E7病毒癌蛋白强烈参与这些病毒导致发生此类癌症的分子机理。这两种癌蛋白使p53蛋白和成视网膜细胞瘤蛋白形成的细胞周期调节子失活，由此导致启动癌症的多步发展事件。
通常，恶性肿瘤存在于具有相关抗原(TAA)或特异抗原(TSA)的癌细胞和特定基质微环境，其特征是过度血管形成，或者新血管生成，其通常与免疫细胞的麻痹，即处于免疫抑制状态相关联。最初，免疫抑制的存在仅限于肿瘤水平，因为个体仍然能够保护自身抵抗其他侵入如感染。
然而，随着转移性扩散，免疫抑制可扩散并全身化，这可通过患有终末期癌的癌症患者易受感染来证明。这种免疫抑制包括癌性细胞或来自它们所在环境的细胞产生的麻痹因子。免疫系统细胞的局部麻痹，或者免疫抑制，因此代表使得癌性细胞逃避宿主免疫系统的一种主要武器。
在由HPV-16感染导致的癌中也观察到这种免疫抑制状况。这种免疫抑制是现今抗HPV-16感染导致的癌症的预防性或治疗性疫苗组合物的开发中一个主要的技术障碍。实际上，当今抗HPV-16疫苗策略支持当HPV-16产生的一些抗原，尤其是E6和E7蛋白与受感染癌性细胞膜表面的主要组织相容性复合物(MHC)I类抗原结合时，诱导特异识别HPV-16产生的这些抗原的细胞毒性T细胞的增殖。
一些作者将在HPV-16导致的癌中观察到的免疫抑制与宫颈的癌性细胞表面MHC I类分子的表达水平降低(Cruz等，1999)，或者与表现出前肿瘤发育异常的患者中T细胞受体(TCR)δ链的表达减少联系起来(Muderspach等，2000)。其他作者将免疫抑制状况与T细胞对由肿瘤细胞产生并被传送到免疫细胞的可能信号的应答缺乏，由此导致它们的凋亡(例如，因为Fas/Fas配体相互作用)联系起来(Schoell等，1999)。
其他作者观察到与HPV感染导致的癌症相关的免疫抑制伴随着IL-10增加(EI Sherif等，2001；Giannini等1998；Giannini等2002)和TGF-β-1增加(Giannini等1998)，以及上皮下IFN-γ的减少(EI Sherif等，2001)。
在国际申请WO 00/03732中公开的发明人的已有工作表明对于HPV导致的宫颈癌，乳头瘤病毒E7蛋白参与肿瘤或被感染的细胞水平上的局部免疫抑制。
E7蛋白诱导的免疫抑制的特征在于抑制PPD或破伤风类毒素刺激的T细胞增殖、抑制同种异体细胞刺激的T细胞增殖、抗原呈递细胞(APC)的α-IFN(免疫抑制细胞因子)过量产生。为了减小或阻断HPV的可溶E7蛋白诱导的免疫抑制，已经建议使用E7蛋白的非毒性衍生物作为抗原以诱导特异抗胞外E7蛋白的抗体。为了产生没有天然蛋白毒性作用的E7衍生的免疫原性化合物，已经建议通过化学修饰或者遗传修饰，包括通过产生氨基酸残基的插入、缺失或替换以减小或抑制天然蛋白的毒性功能位点来修饰天然E7蛋白。在这种背景下，已经公开了通过戊二醛处理天然E7蛋白得到的经化学修饰E7蛋白，其缺少免疫抑制活性。
如在文献陈述中公开的被建议降低或阻断天然E7蛋白的免疫抑制性质的化学修饰的目标是通过用醛、氨甲酰或马来酰亚胺官能团偶联这种蛋白的氨基酸之一的反应性官能团将化学基团加入到天然E7蛋白的碳骨架，而不改变这种天然蛋白的氨基酸序列，即不对E7蛋白的一级结构带来任何明显的修饰。
实际上，如在文献的陈述中公开的各种抗E7免疫原性组合物，为了产生抗由HPV-16感染引起的癌症的预防或治疗性疫苗制剂，主要旨在通过产生针对受感染的细胞表面表达的E7蛋白的特异细胞毒性淋巴细胞(CTL)来诱导免疫应答，这些组合物含有作为抗原的完整E7蛋白，任选地为经化学修饰的(Gerard等，2001)，或含有衍生自E7蛋白的肽(Muderspach等，2000；Schoell，1999-见上面)。在所有情况下，包括当使用衍生自天然E7蛋白的肽时，在天然蛋白的氨基酸序列中没有导入修饰，因此，对氨基酸的最初一级结构没有修饰。这可简单地解释为希望保持天然E7蛋白中目标表位的完整以便有利于诱导免疫应答，尤其是产生能够特异并有效地识别受感染细胞产生的天然E7蛋白的CTL细胞。
甚至当考虑重排E7蛋白的一级氨基酸结构，以期产生具有减小的致癌性或转化性质的免疫原性蛋白时，所关注的是在重排的免疫原性化合物中保持E7蛋白序列的至少一份完整拷贝，以便在所述免疫原性化合物中存在所有天然E7蛋白的潜在表位。
从而，Osen等(2001)已经公开了产生编码免疫原性化合物的DNA，该免疫原性化合物易于诱导特异识别在HPV-16感染的癌性细胞表面表达的天然E7蛋白的细胞毒性淋巴细胞(CTL)的产生，该方法使用DNA的抗HPV疫苗策略，而不是直接使用肽免疫原性化合物。为了避免可导致天然E7蛋白被过表达的重组事件，或者至少具有天然E7蛋白的致癌性质的重组蛋白，这些作者构建了编码这样的免疫原性蛋白的DNA，其中天然E7蛋白的所有表位都被表现，尽管分别为(i)结构域1-10，(ii)结构域11-40，(iii)结构域41-70和(iv)结构域71-98的肽结构域的每一个都已经被颠倒到最终的免疫原性肽化合物中。所述作者坚持认为需要产生保持天然E7蛋白的所有潜在CTL表位而同时丧失其细胞癌性转化性质的免疫原性肽化合物。最后这些作者进一步建议鉴于其致癌能力，应增加重排的免疫原性肽化合物的无毒性，从而抑制天然E7蛋白与成视网膜细胞瘤pRB蛋白的结合结构域，该结构域从E7的21号氨基酸到26号氨基酸，负责天然E7蛋白的致癌活性。然而，非致癌性免疫原性肽化合物的这种实施方案还没有被具体地实现。
发明描述
令人惊奇地，现在根据本发明表明可通过对编码天然E7蛋白的DNA的定向诱变得到具有诱导对天然E7蛋白的特异免疫应答的相同能力，甚至更高的能力的突变蛋白，并且其中天然E7蛋白的免疫抑制性质已经被阻断。
从而第一次根据本发明表明，令人惊奇地，位于HPV-16乳头瘤病毒的天然E7蛋白的氨基酸位置20(Thr或T)至氨基酸位置29(Asn或N)的区域中的肽片段负责所述蛋白的免疫抑制活性。
为了本发明公开的目的，当氨基酸中一个或几个氨基酸的不同之处位于序列SEQ ID No.3的天然E7蛋白的相应20-29肽区域中时，与具有SEQID No.3的HPV-16天然E7蛋白相比至少一个氨基酸不同的蛋白被称为根据本发明的“突变的”E7蛋白。
具体地，根据本发明已经表明与天然E7蛋白的序列SEQ ID No.3相比含有至少一个氨基酸，优选至少2个氨基酸替代的突变E7蛋白已经丧失了诱导以前关于天然E7蛋白所报导的免疫抑制的性质。从而已经表明与天然的E7蛋白的序列SEQ ID No.3相比24位半胱氨酸残基被甘氨酸残基替代(CYS24GLY)和26位谷氨酸残基被谷氨酰胺残基替代(GLU26GLN)的突变E7蛋白已经丧失了天然E7蛋白的免疫抑制性质。同样，已经表明与天然的E7蛋白的序列SEQ ID No.3相比24位半胱氨酸残基被丝氨酸残基替代(CYS24SER)和26位谷氨酸残基被谷氨酰胺残基替代(GLU26GLN)的突变E7蛋白已经丧失了天然E7蛋白免疫抑制性质。
根据本发明已经表明含有与天然E7蛋白的SEQ ID No.3氨基酸序列相比，根据序列SEQ ID No.3的编号，在序列SEQ ID No.3氨基酸位置20到氨基酸位置29的相应多肽区域中至少4个，优选4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸缺失的突变E7蛋白已经丧失了对天然E7蛋白所观察到的免疫抑制性质。
具体地，已经表明含有根据序列SEQ ID No.3的编号，肽片段21(Asp或D)到26(Glu或E)缺失的突变E7蛋白已经丧失了为天然E7蛋白观察到的免疫抑制性质。其相应于天然E7蛋白的21号氨基酸到26号氨基酸缺失的突变E7蛋白为了本说明书的目的被称为E7Δ21-26。
同样，D’Anna等(2001，J.Natl.Cancer Inst.卷93(24)：1843-1851)公开了通过遗传重组产生的E7Δ21-26蛋白。
类似地，已表明根据序列SEQ ID No.3的编号，含有肽片段21(Asp或D)到25(Tyr或Y)缺失的突变E7蛋白已经丧失了为天然E7蛋白观察到的免疫抑制性质。其相应于天然E7蛋白的21到25号氨基酸区域缺失的突变E7蛋白为了本说明书的目的被称为E7Δ21-25。
从而根据本发明表明天然E7蛋白的20-29肽区域中氨基酸的简单替代使得可能阻断为该天然蛋白观察到的免疫抑制活性。从而，天然E7蛋白一级结构的小改变(20-29号肽区域)破坏了天然E7蛋白的典型的免疫抑制性质。
根据本发明，当蛋白对来自接种了抗破伤风(破伤风类毒素抗原)和/或白喉(“结核菌素纯化的蛋白衍生物”或“PPD”型)疫苗的个体的人外周血单核细胞体外增殖抑制至少60％，优选至少70％时，该蛋白是“免疫抑制的”，所述单核细胞增殖通过将所述细胞与(I)PPD抗原，(ii)类毒素破伤风抗原，(iii)PPD抗原和类毒素破伤风抗原的结合或者以及(iv)与相对于所述单核细胞为同种异体的细胞孵育进行诱导。在这种试验中，潜在免疫抑制蛋白使用的浓度为根据效果-剂量曲线诱导最大增殖抑制值的浓度。实施例6给出了这种试验的阐述。
而且，当这种蛋白诱导免疫抑制细胞因子的异常体外产生水平时是“免疫抑制的”，这些免疫抑制细胞因子分别是外周血单核细胞产生的IL-10和具有抗原的细胞(APC)产生的α-IFN或IL-10。
此外，如将在该公开的下文中进一步详述的和如在实施例中阐明的，上面的突变E7蛋白除了它们的非抑制性质之外还共有刺激产生针对天然E7蛋白的“中和”抗体，即产生识别天然E7蛋白并阻断对免疫系统的细胞有害的天然E7蛋白的免疫抑制活性的能力。根据本发明，包括根据实施例1中进一步描述的试验，当抗-E7抗体阻断天然E7蛋白刺激通过γ-IFN预处理的人巨噬细胞产生α-TNF时，该抗-E7抗体称为“中和的”抗体。
这些结果使得可定义突变E7蛋白家族，这些蛋白与天然E7蛋白的氨基酸序列相比都具有氨基酸突变、替代或缺失。
一般来说，根据本发明的非免疫抑制的“突变E7”蛋白含有以下氨基酸序列(从N末端到C末端)：
i.序列SEQ ID No.3的1-19位氨基酸序列；
ii.具有(a)与SEQ ID No.3的相应20-29位氨基酸序列相比至少一个，优选至少2个氨基酸替代的氨基酸序列或者(b)与SEQ ID No.3的相应20-29位氨基酸序列相比至少4个连续氨基酸缺失的氨基酸序列；和
iii.SEQ ID No.3的30-98位氨基酸序列。
根据本发明，“含有”如上定义的氨基酸序列的突变E7蛋白为这样的蛋白，其氨基酸序列“基本在于”上面提到的氨基酸序列。换句话说，根据本发明的突变E7蛋白可除了上面提到的氨基酸序列，还含有至多20个，优选至多15个，优选至多10个，最优选至多6个氨基酸的一段或两段额外的氨基酸序列，该额外的氨基酸序列分别位于区域(i)的N-末端或区域(ii)的C末端，并且在一些情况下位于区域(i)的N-末端和区域(ii)的C-末端。对于后一情况，位于区域(i)N末端的额外序列可以与位于C末端的额外序列不同，或者为相反情况，即两个额外的序列可以是相同的。通常，根据本发明的突变E7蛋白含有与对其定义的上面的氨基酸序列相比，单个额外的氨基酸序列，如多(组氨酸)氨基酸序列，例如含有6个组氨酸残基聚合物的序列。
从上面提到的定义得到根据本发明的突变E7蛋白具有与序列SEQ IDNo.3的相应肽区域相同的2个氨基酸区域，它们分别是与序列SEQ ID No.3的天然E7蛋白中1到19号肽区域相同的氨基酸区域(i)和与序列SEQ IDNo.3的天然E7蛋白中30到98号肽区域相同的氨基酸区域(iii)。突变E7蛋白的中心氨基酸区(ii)与序列SEQ ID No.3的相应20-29号肽区域相比，含有氨基酸的一处或多处替代，或另外地含有一个至少4个氨基酸的缺失。
根据第一个可变方案，突变E7蛋白的氨基酸区域(ii)与天然蛋白序列SEQ ID No.3的相应20-29号肽区域相比，优选含有至少2个氨基酸替代，并且可含有3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸替代。在其中突变E7蛋白的氨基酸区域(ii)含有10个氨基酸替代的实施方案中，突变E7蛋白的氨基酸区域(ii)与序列SEQ ID No.3的天然E7蛋白中20到29号肽区域完全不同。
为了得到根据本发明的突变E7蛋白，优选进行天然E7蛋白中20到29号肽区域中氨基酸的每个替代，从而突变E7蛋白中被替代的氨基酸属于与相应于天然E7蛋白的氨基酸不同的“类别”，其中分别为芳香族、疏水的、极性的、碱性的、酸性氨基酸类别或者小氨基酸，优选如下：
-20位的Thr残基被非Ala、Ser、Met和Gly的残基替代；
-21位的Asp残基被非Glu的残基替代；
-22位的Leu残基被非Ile和Val残基替代；
-23位的Tyr残基被非Phe和Trp残基替代；
-24位的Cys残基被任何不同的氨基酸残基替代；
-25位的Tyr残基被非Phe和Trp的残基替代；
-26位的Glu残基被非Asp的残基替代；
-27位的Gln残基被非Asn残基替代；
-28位的Leu残基被非Ile和Val的残基替代；和
-29位的Asn残基被非Gln的残基替代。
该氨基酸组由下面的氨基酸形成：Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val，以及对它们一个或多个如下化学基团进行化学修饰的衍生物，所述化学基团不参与结合本发明的突变E7蛋白序列中的另一个氨基酸。
优选的突变E7蛋白质家族包括在它们的24位Cys残基和26位Glu被取代的蛋白质家族。
第一个尤其优选的含有两个单核苷酸替代的突变E7蛋白是这样的E7蛋白(CYS24GLY，GLU26GLN)。
第二个尤其优选的含有两个单核苷酸替代的突变E7蛋白是这样的E7蛋白(CYS24SER，GLU26GLN)。
根据第二个可变方案，氨基酸区(ii)与序列SEQ ID No.3的相应20-29号氨基酸序列相比含有5、6、7、8、9或10个连续氨基酸缺失。当氨基酸区(ii)含有10个氨基酸缺失时，所述区域(ii)不含有任何氨基酸并且所得突变E7蛋白从N末端到C末端含有序列SEQ ID No.3的1-19区(i)，其通过肽结合直接与序列SEQ ID No.3的30-98区(iii)相连。
根据上面提到的第二个可变方案第一优选的突变E7蛋白质家族为与序列SEQ ID No.3的20-29号氨基酸相应的序列相比含有区域(ii)中6个连续氨基酸缺失的蛋白质家族。
根据本发明第三个优选的突变E7蛋白在于在蛋白中其氨基酸序列含有天然E7蛋白中序列SEQ ID No.3的21到26号氨基酸缺失。这种突变E7蛋白，也称作E7Δ21-26，具有氨基酸序列SEQ ID No.1并被序列SEQID No.2的核酸所编码。E7Δ21-26蛋白的区域(ii)与序列SEQ ID No.3的20-29号氨基酸相应的序列相比含有区域(ii)中6个连续氨基酸缺失。
根据上面提到的第二个可变方案第二优选的突变E7蛋白质家族为与序列SEQ ID No.3的20-29号氨基酸相应的序列相比含有区域(ii)中5个连续氨基酸缺失的蛋白质家族。
根据本发明第四个优选的突变E7蛋白在于该蛋白具有其中氨基酸序列含有天然E7蛋白中序列SEQ ID No.3的相应21-25号氨基酸缺失。这种突变的E7蛋白在本公开中也被称作E7Δ21-25。E7Δ21-25蛋白的区域(ii)与序列SEQ ID No.3的20-29号氨基酸相应的序列相比具有5个连续氨基酸缺失。
根据本发明已经表明编码HPV-16突变E7蛋白(如上面定义的)的DNA的表达产物，当与合适的免疫佐剂组合时，能够在小鼠中产生特异体液和细胞应答，由此允许诱导可与通过天然E7蛋白诱导的相当的(如果不是更高的话)保护性抗肿瘤免疫。
如此处所用的，编码突变E7蛋白的DNA的“表达产物”指宿主细胞中从编码如此处上面定义的突变E7蛋白的DNA翻译(或者相应的RNA信使的翻译)导致的蛋白。
此外，还表明编码本发明HPV-16的突变E7蛋白的表达产物具有等于或高于天然E7蛋白的抗肿瘤治疗活性。
而且，编码本发明突变E7蛋白的DNA的表达产物一方面在于缺乏其直接的免疫抑制活性，另一方面在于诱导对癌性细胞分泌的天然E7蛋白所诱导的免疫抑制阻断。
本发明的一个目的是提供诱导抗HPV-16乳头瘤病毒的天然E7蛋白的免疫应答而同时不诱导免疫抑制的免疫原性组合物，该组合物含有作为活性成分的如在本公开的上文中定义的非免疫抑制性突变E7蛋白，如果需要，与一种或多种赋形剂或佐剂组合在一起以得到生理可相容的免疫。
本发明还涉及对乳头瘤病毒感染导致的癌症没有任何预防性或治疗性免疫抑制性质的疫苗组合物，其特征是该组合物含有与一种或多种生理可相容的免疫佐剂结合的如在本公开的上文中定义的作为活性成分的非免疫抑制性突变E7蛋白。
本发明还涉及如上文定义的非免疫抑制性突变E7蛋白的用途，用于制备免疫原性组合物或非免疫抑制的疫苗组合物和诱导产生中和天然E7蛋白的免疫抑制活性的抗体。
如在实施例中所阐明的，根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物诱导针对表达天然E7蛋白的细胞，或者表达衍生自天然E7蛋白的肽的细胞产生细胞毒性细胞免疫应答。具体地，在实施例中表明根据本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物诱导针对表达天然E7蛋白或者衍生自天然E7蛋白的肽的肿瘤细胞产生细胞毒性细胞免疫应答。
HPV-16天然E7蛋白的参考氨基酸序列为例如，Seedorf等(1985)公开的序列，其在Swissprot数据库中的登录号为P03129，并且其在本公开中被复制为序列SEQ ID No.3。编码HPV-16天然E7蛋白的核酸含有核苷酸序列SEQ ID No.4。
突变E7蛋白(如在本公开中定义的)可通过本领域技术人员熟知的蛋白质合成常规技术制备。
例如，可通过重组DNA技术，例如，通过在重组细菌细胞系统，如重组大肠杆菌(E.coli)细胞中过表达编码突变E7蛋白的核酸来制备该突变E7蛋白，如Kieder等(1996)和Tucker等(1996)所述。
也可通过化学合成，在均匀溶液中或者在固相中制备突变的E7蛋白。合适的化学合成技术的第一个例证是例如Houben Weyl所公开的(1974)。
而且，可通过化学合成技术在溶液或固相中通过连续偶联将要被掺入的不同氨基酸残基(在液相中从N末端到C末端，或者在固相中从C末端到N末端)来制备突变的E7蛋白，一种合成技术在于其中氨基酸残基N末端和侧链被事先通过合适的保护性化学基团封闭。可用于合成突变E7蛋白的这种技术的一个例证是如Merrifield(1965a；1965b)所公开的。
本发明所使用的核酸
根据本发明，可通过翻译编码所述突变E7蛋白的核酸，例如，编码SEQ ID No.1的突变E7蛋白的核酸来产生突变E7蛋白。
优选地，根据本发明的任何核酸和任何多肽都是分离的或纯化的形式。
术语“纯化的”不需要物质以绝对纯的形式，排除任何其他化合物的存在而存在。其是相对定义。当起始材料或者天然材料被纯化至少1个数量级，优选2或3个，优选4或5个数量级时，那么多核苷酸或多肽处于纯化的状态。
表述“核酸”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”以及“核苷酸序列”包括处于单链形式或双链体形式的RNA、DNA、cDNA序列以及至少两种核苷酸的RNA/DNA杂交序列。
术语“核苷酸”指天然核苷酸(A、T、G、C)以及含有至少一种修饰，如(i)嘌呤类似物，(ii)嘧啶类似物或(iii)糖类似物的经修饰核苷酸，这种经修饰核苷酸在例如PCT申请WO 95/04064中公开。
为了本发明的目的，当第一核苷酸的每一碱基与方向相反的第二多核苷酸的互补碱基偶联时，认为第一核苷酸与第二多核苷酸是“互补的”。互补碱基为A和T(或A和U)，C和G。
根据一个优选的实施方案，编码序列SEQ ID No.1的突变E7蛋白的核酸含有核苷酸序列SEQ ID No.2。
如上定义的核酸主要用于实现产生相应的表达产物。
因此，编码突变E7蛋白的核酸优选地含有控制原核或真核宿主细胞中突变E7蛋白表达的调节性多核苷酸。
该调节性多核苷酸含有至少一个能够启动编码突变E7蛋白的DNA在所选择的宿主细胞中转录的启动子序列。这种调节性多核苷酸也可以含有支持编码突变E7蛋白的DNA表达的其他核苷酸序列，例如，本领域技术人员熟知的转录活化序列。
优选地，选择所谓的“可诱导的”启动子，即对诱导剂存在应答的启动子，仅在存在诱导化合物时所述启动子管理处于其控制下的DNA的转录。
LacZ启动子是这种可诱导的启动子的一个例证性实例。
根据本发明，可使用本领域技术人员熟知的任何分子生物学、微生物学和重组DNA常规技术以制备如下文定义的核酸。这种技术由例如Sambrook等(1989)，Glover(1985)、Gait(1984)和Ausubel等(1989)公开。
置于如上定义的调节性多核苷酸控制下的含有编码本发明突变E7蛋白的DNA的核酸包括在表达盒中。
表达盒
这种表达盒除了含有调节编码突变E7蛋白的DNA的多核苷酸外，还可含有能够增加表达产物翻译的位于可读框5’侧的非翻译序列，即所谓的“前导”序列，或者本领域技术人员熟知的所谓“终止子”序列。
最优选地，如上文定义的表达盒还含有编码信号肽的序列，为了产生包含所述信号肽和突变E7蛋白的融合蛋白，例如，为了所述信号肽和E7Δ21-26蛋白的融合蛋白的产生，以便有利于编码突变E7蛋白的DNA表达产物的分泌和发现突变E7蛋白主要在细胞外，例如在细胞培养上清液中。优选地，编码信号肽的核苷酸序列位于紧挨编码突变E7蛋白的核苷酸序列的5’侧。
通常，如下文定义的表达盒还含有选择性标记多核苷酸，例如，his基因，以便确实地选择被该多核苷酸转化的宿主细胞。
重组载体
编码突变E7蛋白的核酸(如在本公开中所定义的)如果需要，在被插入表达盒后，优选被导入克隆和/或表达重组载体，该载体含有所述核酸或所述表达盒，如上面定义的表达盒。
如此处所用的，术语“载体”指处于单链形式或双链形式的环状或线性DNA或RNA分子。
重组载体可以为克隆载体或表达载体。
其可以是来自细菌或病毒的载体。
本发明优选的细菌载体为例如pBR322载体(ATCC37017)或者如PAA233-3(Pharmacia，Uppsala，瑞典)和pGEM1(Promega Biotech，Madison，WI，USA)的载体。
已上市的载体的其他实例包括pQE70、pQE60、pWE9(Qiagen)、psiX174、pBluescript SA、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTI、pSG(Stratagene)载体。
根据第一个实施方案，使用如上文定义的重组载体在转化或者转染目的细胞宿主后用于扩增被插入其中的核酸或表达盒。
根据第二个实施方案，其可以是含有如上面定义的核酸或表达盒的表达载体，目的是转化所选择的宿主细胞以产生编码本发明突变E7蛋白的DNA的表达产物。
如上面定义的重组载体还有利地含有具有适宜转录的启动和中止序列。
如上面定义的表达盒是本发明重组载体的一个特定实施方案。
为了允许编码本发明突变E7蛋白的核酸表达，如上面定义的核酸、表达盒或重组载体应该被导入宿主细胞。
重组宿主细胞
为了实现如在本公开中定义的突变E7蛋白的一些产生模式，优选使用被如上面定义的核酸、表达盒或重组载体转化的宿主细胞。
被转化的宿主细胞有利地为细菌细胞，如大肠杆菌细胞，或者酵母细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
被转化的宿主细胞有利地为真核细胞。
一类优选的重组宿主细胞为被根据本发明的核酸、表达盒以及重组载体转化的哺乳动物细胞如小鼠细胞。
得到编码E7Δ21-26蛋白的核酸的方法
本发明公开了产生如在本公开中定义的编码突变E7蛋白的核酸的方法，所示方法包括下面的步骤：
(a)对编码天然E7蛋白的核酸进行定向诱变，这通过分别将第一核苷酸引物和第二核苷酸引物与编码天然E7蛋白的DNA的3’末端杂交而扩增所述核酸实现；和
(b)回收所扩增的DNA。
第一核苷酸引物在其序列中含有编码将要被插入起始天然E7蛋白氨基酸序列中的突变的密码子序列。
从而，如果考虑制备其区域(ii)含有一个或多个单氨基酸替代的突变E7蛋白，那么第一引物的序列含有编码将要被替代的一个或多个氨基酸的适宜密码子。
根据另一个备选方案，如果考虑制备与序列SEQ ID No.3的20-29号氨基酸相应序列相比，其区域(ii)含有4、5、6、8、9或10个连续氨基酸缺失的突变E7蛋白，那么第一引物在其序列中含有编码紧挨将要被缺失的肽片段的N-末端氨基酸的第一个密码子，所述第一个密码子紧靠第二个密码子前，所述第二个密码子编码紧挨将要被缺失的肽片段N末端氨基酸。
第一引物的使用使得可以扩增将要被产生的最终产物，其中期望的密码子已经被修饰，所述扩增终产物编码目的突变E7蛋白。
扩增步骤(a)中使用的第二核苷酸引物除了含有与编码天然E7蛋白的DNA的3’端杂交的序列外，还含有一个或多个内切酶识别位点。
在例如通过限制性内切酶，优选在多克隆位点处进行核苷酸切割事先打开宿主载体后，将编码突变E7蛋白的核酸在预定的插入位点插入到克隆载体或者表达载体，例如通过将所述核酸与载体的核酸连接。
本发明的一个目标是提供含有突变E7蛋白(如在本公开中所定义的)的组合物，优选含有所述突变E7蛋白的免疫原性组合物或者疫苗组合物。
含有本发明非免疫抑制性突变E7蛋白的组合物
本发明的一个目的是提供含有本发明非免疫抑制性突变E7蛋白的组合物，如含有序列SEQ ID No.1的氨基酸序列的突变E7蛋白的组合物。
本发明的另一个目的是含有编码本发明突变E7蛋白的DNA的表达产物，如SEQ ID No.2的E7Δ21-26蛋白的组合物。
根据本发明已经表明如在本公开中定义的突变E7蛋白缺乏免疫抑制性质，如在实施例中所阐明的。
具体地，已经表明E7Δ21-26蛋白当与适宜的免疫佐剂结合被施用于哺乳动物时不诱导任何免疫抑制。
已经表明突变的E7蛋白—分别为E7蛋白(CYS24GLY，GLU26GLN)和E7蛋白(CYS24SER，GLU26GLN)当与适宜的免疫佐剂结合被施用于哺乳动物时不诱导免疫抑制。
如前面已经简略解释的，编码序列SEQ ID No.1的突变E7蛋白的DNA的表达产物诱导与天然E7蛋白自身诱导的免疫应答至少相同数量级的针对天然E7蛋白的免疫应答，并且本发明的突变E7蛋白对人免疫细胞缺乏天然E7蛋白的免疫抑制性质。
因此本发明的另一个目的是提供HPV-16感染更特别是提供HPV-16诱导的癌症的预防性或治疗性药物组合物，其特征在于其包含作为主要活性成分的编码如上面定义的突变E7蛋白的DNA的表达产物，如果需要，其与一种或多种生理可相容的赋形剂结合。
优选地，所述药物组合物以适于每周施用用量为10到1000μg突变E7蛋白，或者编码该突变E7蛋白的DNA的表达产物的形式存在。
根据本发明表明编码序列SEQ ID No.1的突变E7蛋白的表达产物当与适宜的免疫佐剂组合施用时，能够产生针对天然E7蛋白的体液和细胞免疫应答，从而允许诱导针对肿瘤的预防性免疫性。此外，通过施用编码突变E7蛋白的DNA的表达产物而导致的诱导抗肿瘤抗性状况的保护性免疫等于或高于以前施用天然E7蛋白后得到的保护性免疫。
还表明编码序列SEQ ID No.1的突变E7蛋白的DNA的表达产物在这种蛋白与适宜的免疫佐剂结合施用于已经患有肿瘤的个体时能够诱导治疗性抗肿瘤免疫。由编码突变E7蛋白的DNA的表达产物诱导的治疗性抗肿瘤免疫应答明显高于施用天然E7蛋白后可以得到的治疗性抗肿瘤免疫应答。
这些结果在实施例3中阐明，其中在鼠模型中表明，与施用天然E7蛋白动物的平均寿命相比较，通过编码突变E7蛋白的DNA的表达产物诱导的抗肿瘤治疗性免疫使得可以延长动物的平均寿命1.5倍。
还表明通过编码突变E7蛋白的DNA的表达产物诱导的治疗性抗肿瘤免疫是由于对特异体液和细胞免疫应答的同时诱导。
从而，实施例的结果表明如在本公开中定义的突变E7蛋白能够诱导针对天然E7蛋白的全身性体液应答。更具体地还表明产生了高水平的IgG同种型抗E7抗体，主要是IgG2b和IgG1同种型抗体。
此外，在适宜的条件下，将本发明的突变E7蛋白施用于个体也使得可能诱导粘膜免疫性，如通过在实施例3中给出的IgA同种型抗体应答的高水平所证明的。
此外，根据突变E7蛋白的基本特征，这种本身缺乏天然E7蛋白的任何直接免疫抑制活性的蛋白也允许通过用所述突变E7蛋白免疫后所产生抗体的中和特性阻断癌细胞分泌的可溶E7蛋白的免疫抑制活性，如通过实施例2中的结果所证明的。
实施例的结果还表明本发明的突变E7蛋白允许特异识别天然E7蛋白的CD4+和CD8+T细胞的增殖，这种细胞增殖伴随着γ-IFN细胞因子的过量产生。
本发明还涉及诱导针对HPV-16乳头瘤病毒天然E7蛋白的免疫应答，而不同时诱导免疫抑制的免疫原性组合物，所述组合物含有与一种或多种生理可相容的免疫赋形剂或佐剂结合的作为活性成分的非免疫抑制的突变E7蛋白，其氨基酸序列从N末端到C末端含有：
i.序列SEQ ID No.3的1-19号氨基酸序列；
ii.(a)与序列SEQ ID No.3的20-29号相应氨基酸相比具有至少一个氨基酸替代或者(b)与序列SEQ ID No.3的20-29号相应氨基酸相比具有至少4个连续氨基酸缺失的氨基酸序列；和
iii.序列SEQ ID No.3的30-98号氨基酸序列。
这种免疫原性组合物可以预防性使用，其目的是诱导针对HPV-16感染的保护性抗肿瘤免疫。
这种免疫原性组合物也可以用于治疗或者治愈HPV-16感染，尤其是HPV-16感染导致的癌症。
本发明还涉及如在本公开中定义的突变E7蛋白的用途，用于制备药物组合物，或者用于制备如上文描述的免疫原性组合物。
本发明的另一个目的是旨在诱导抗HPV-16感染导致的癌症的预防性保护性免疫或者治疗性免疫，而阻断天然E7蛋白诱导的免疫抑制状况的药物组合物或者免疫原性组合物的制备方法，其特征是其包括其中如上文定义的突变E7蛋白与一种或多种生理可相容的免疫佐剂组合的步骤。
本发明还涉及乳头瘤病毒感染导致的癌症的预防性或治疗性疫苗组合物，其特征在于其包含与一种或多种生理可相容的免疫佐剂结合的作为活性成分的非免疫抑制性突变E7蛋白，其氨基酸序列从N末端到C末端含有：
i.序列SEQ ID No.3的1-19号氨基酸序列；
ii.(a)与序列SEQ ID No.3的20-29号相应氨基酸相比具有至少一个氨基酸替代或者(b)与序列SEQ ID No.3的20-29号相应氨基酸相比具有至少4个连续氨基酸缺失的氨基酸序列；和
iii.序列SEQ ID No.3的30-98号氨基酸序列。
为了抵抗胞外E7蛋白诱导的对HPV-16感染的癌性细胞水平上局部免疫抑制，然后刺激针对这些癌性细胞的有效免疫应答(这些癌性细胞的膜表面具有与MHC I类抗原结合的天然E7蛋白，或者胞内成熟后衍生自天然E7蛋白的肽)，重要的是诱导能够中和HPV-16病毒感染的癌性细胞所分泌的可溶E7蛋白产生的免疫抑制作用的抗体，特别是IgG同种型抗体的产生。此外，必须同时诱导能够特异识别暴露于癌性细胞膜表面的天然E7蛋白或者由其衍生的的肽的细胞毒性淋巴细胞(CTL)保护，以便破坏这些细胞。为了实现这些目的，需要诱导全身性免疫应答。
此外，由于人乳头瘤病毒主要在粘膜癌，尤其是在肛门与生殖器癌，包括妇女的宫颈癌中被检测到，因此重要的是通过在粘膜上诱导粘膜型免疫应答，更特别地在局部水平刺激IgA同种型抗体的产生以实现全身性免疫应答诱导的预防性或治疗性效果。
根据所要达到的目的，使用能够使应答指向全身免疫或粘膜免疫的免疫佐剂。
在全身免疫性佐剂中，优选使用IFA型佐剂(不完全弗氏佐剂)、磷酸钙或氢氧化铝。也可使用丹麦Brenntay Biosector上市的QuilA佐剂。在粘膜免疫佐剂中，优选使用本领域技术人员熟知的如霍乱毒素B(CTB)以及LT毒素突变体(LTμ)佐剂。
诱导全身型和/或粘膜型免疫应答也受到本发明疫苗组合物的施用途径影响。
从而，通过肠胃外、皮下或皮内施用疫苗组合物将有助于诱导全身性免疫途径，如果需要也伴随着粘膜免疫反应。
从而，局部水平上的本发明疫苗组合物的施用(例如通过鼻灌注，以及通过在粘膜表面的局部应用)将有助于粘膜型免疫应答的诱导。
本发明的另一个目的是HPV-16感染导致的癌症的预防性或治疗性治疗的方法，其特征在于包括其中患者被施用免疫有效量的如在本说明书中定义的疫苗组合物的步骤。
优选地，患者被施用适于全身性和/或粘膜施用形式的针对需要该治疗的受试者的预防或治疗有效量的本发明疫苗组合物。突变E7蛋白或编码突变E7蛋白的DNA的表达产物的施用剂量可以是10到1000μg，通过肠胃外途径，每周一次，持续2个月，然后根据诱导的细胞或体液应答的水平周期性地施用，例如每2到6个月施用。
根据第一个方面，本发明的疫苗组合物的特征在于其包含至少一种能够优选将免疫应答导向产生中和野生型E7蛋白的免疫抑制活性的抗体的佐剂。
根据第一个特定实施方案，所述疫苗组合物的特征在于其包含至少一种能够优选将免疫应答导向产生IgA同种型抗体的佐剂。
根据第二个优选的实施方案，所述疫苗组合物的特征在于其包含至少一种能够优选将免疫应答导向产生IgG同种型抗体的佐剂。
根据另一个优选的实施方案，所述疫苗组合物的特征在于其包含(i)能够优选将免疫应答导向产生IgA同种型抗体的佐剂和(ii)能够优选将免疫应答导向产生IgG同种型抗体的佐剂的组合。
优选地，根据本发明的疫苗组合物的特征在于其包含至少一种能够诱导体液和细胞免疫应答这两者的免疫佐剂。
优选地，将寻找细胞应答的诱导，其特征尤其在于表达CD8抗原并特异识别野生E7蛋白，如在癌性细胞表明与MHC I类抗原结合的野生E7蛋白的T淋巴细胞的增殖。
根据本发明疫苗组合物的另一个特定实施方案，这种疫苗组合物可含有一种或多种其他HPV抗原性或免疫原性化合物。例如，在本发明的疫苗组合物中，编码突变E7蛋白的DNA的表达产物可以与一种或多种HPV-16衣壳蛋白或者从此类衣壳蛋白得到的肽，尤其是本领域技术人员熟知的HPV-16的L1和L2蛋白结合。
根据另一个特定实施方案，本发明的疫苗组合物可以含有能够诱导针对与HPV-16不同的HPV型，优选针对导致癌症的HPV型，如HPV-18、31、33和51的细胞免疫应答或体液免疫应答的一种或多种抗原性或免疫原性化合物。
在本发明疫苗制剂的另一个特定实施方案中，编码突变E7蛋白的DNA的表达产物可以与能够诱导针对具有免疫抑制或血管生成性质的可溶因子，如αIFN、βTGF、αTNF或甚至VEGF产生抗体的一种或多种抗原性或免疫原性化合物组合。优选地，此类抗原性或免疫原性化合物分别为经化学修饰的αIFN、βTGF、αTNF或VEGF以便诱导它们的免疫抑制性质和/或稳定它们。这种化学修饰(例如通过羧甲基化)是本领域技术人员熟知的。这些化学修饰由Frankel等(1988)更具体地描述。
根据本发明疫苗组合物的这种特定实施方案的一个优选方面，编码突变E7蛋白的DNA的表达产物和至少一种抗原性或免疫原性化合物被化学相连以形成超级免疫原性化合物，如在以NEOVACS公司的名义在2001年8月10日提交的法国专利申请No.01/10751中所公开的。
复合超免疫原
这种复合超免疫原含有物理上相互连接的两个不同的免疫原性多肽，两个多肽分别在于：
(a)第一免疫原性多肽，其诱导抗HPV-16细胞病原性抗原结构的细胞免疫反应或细胞和体液免疫反应；
(b)第二免疫原性多肽，其诱导产生抗基质局部循环蛋白的中和或阻断抗体，所述基质局部循环蛋白为细胞因子或者具有免疫毒性或血管生成性质的细胞调节因子，此类因子由癌性细胞或基质细胞，包括T淋巴细胞和具有抗原的细胞(APC)产生。
根据本发明使用的复合超免疫原被称为“双功能的”，因为两种多肽(a)和(b)(它们是构造该超免疫原的两个基本部分)使得可以同时诱导针对两种不同靶标—病原性抗原性结构和基质的局部循环蛋白—的免疫反应。然而，本发明的双功能复合超免疫原在其结构中可分别地含有多肽(a)和/或多肽(b)的许多拷贝。
构成本发明复合超免疫原性化合物的多肽(a)和多肽(b)之所以被称为相互“物理连接的”是因为它们在所有情况下均包括在相同物理结构、分子或颗粒(微粒或纳粒)中，其中它们在一定程度上相互分开。由于它们在复合超免疫原中被物理相互连接，多肽(a)和多肽(b)被一起呈递给相同的具有免疫能力的细胞以及巨噬细胞、T或B淋巴细胞。
根据复合超免疫原的第一个优选的实施方案，多肽(a)和(b)分别选自：
-多肽(a)：HPV-16乳头瘤病毒的L1和L2蛋白，如果需要被脱毒或稳定化，这些蛋白的免疫原性片段，或者从中衍生的免疫原性蛋白(LeBuanec等，1999)。
-多肽(b)：本发明的突变E7蛋白，例如，序列SEQ ID No.1的突变E7蛋白。
根据复合超免疫原的第二个优选的实施方案，多肽(a)和(b)分别选自：
-多肽(a)：本发明的突变E7蛋白，例如，序列SEQ ID No.1的突变E7蛋白。
-多肽(b)：IFNα、TGFβ、TNFα和VEGF蛋白，如果需要被脱毒或稳定化，这些蛋白的免疫原性片段，或者从中衍生的免疫原性蛋白。
根据一个有利的实施方案，本发明还涉及含有通过突变E7蛋白的身份区别的几种复合超免疫原(多肽(a)或多肽(b)，依赖于复合超免疫原的类型)的组合物。
为了制备根据本发明的复合超免疫原，通过化学途径或者通过遗传重组在多肽(a)和多肽(b)之间产生偶联。
在本发明的免疫原性肽偶联物的一个特定实施方案中，多肽(a)和(b)相互之间直接共价相连，例如通过肽-CO-NH连接相连。
然而，为了在免疫原性肽偶联物的结构中产生一些弹性，更尤其为了允许免疫原性肽偶联物中关于相互的多肽(a)和(b)的空间具有一定的可动性，优选其中多肽(a)和(b)在所述偶联物中通过间隔链相互分开的肽偶联物。
根据免疫原性肽偶联物的第一个优选的实施方案，多肽(a)和(b)在所述偶联物中通过选自SMCC或SIAB(两种都是双功能化合物)的间隔链相互分开。
SIAB化合物由HermansonG.T.(1996，Bioconjugate techniques，SanDiego：Academic Press，239-242页)描述，其是具有下式(I)的化合物：
Figure A0381178600251
SIAB化合物含有两个反应基团，分别是碘代乙酸基团和硫代-NHS酯基团，这些基团分别与氨基和巯基反应。
SMCC化合物由Samoszuk M.K.等(1989，Antibody，Immunoconjugates Radiopharm.， 2(1)：37-46)描述，是具有下式(II)的化合物：
SMCC化合物含有两个反应基团，分别是硫代-NHS酯基团和马来酰亚胺基团，分别与氨基和巯基基团反应。
根据第二个优选的实施方案，复合超免疫原含有包含线性间隔肽的间隔链。优选地所选的线性间隔肽长3到30个氨基酸，优选5到20个氨基酸，最优选7到15个氨基酸。
优选地，线性间隔肽基本上甚至唯一地由带正电或负电的氨基酸组成，pH等于7以增加所述复合超免疫原的总亲水性。应该理解应避免施用含有疏水氨基酸的间隔肽。优选地，间隔肽的特征是其由3到30个赖氨酸残基，优选5到20，最优选7到15个赖氨酸残基长的聚(赖氨酸)链组成。
根据本发明复合超免疫原的另一个实施方案，在所述肽偶联物中，多肽(a)和(b)通过由一个分枝的间隔肽，优选聚(赖氨酸)寡树枝状结构(如Basak等(1995)所描述的)组成的间隔链相互分开。
在本发明复合超免疫原的后一个实施方案中，所述肽偶联物中每个偶联物分子可含有多肽(a)和(b)的几份拷贝，有利地，多肽(a)和(b)的2到8份拷贝，优选地，每个偶联物分子中的每个多肽(a)和(b)具有不超过4份的拷贝。
多肽(a)和(b)也可以被包括在单个物理结构中，例如直径10到500纳米，优选10到200纳米，最优选10到100纳米的纳颗粒上，例如如Aucouturier等(2001)描述的IMS的纳颗粒，如Skaugrud等(1999)描述的脱乙酰壳多糖的纳颗粒，脂质体或生物可降解颗粒(如Baras等(1999)描述的酸性聚交酯(PLA)、聚-ε-己内酯(PLC)或聚(丙交酯-共-乙醇酸交酯))的纳颗粒。
根据本发明的另一个实施方案，多肽(a)和(b)在单个载体结构中被物理相连，使得它们可同时被呈递到免疫系统的细胞上。在这个特定实施方案中，多肽(a)和(b)被固定在纳颗粒，例如脱乙酰壳多糖、由直径100到300纳米的脂质纳颗粒组成的IMS(可从法国的Seppic公司得到的免疫调节剂)或脂质体上。
优选地，这种纳颗粒具有小的尺寸，从而同时将多肽(a)和(b)呈递到细胞，就像这些多肽在相同的分子中被共价连接一样。有利地，纳颗粒的直径为10到1000nm，优选10到500nm，更优选10到300nm，最优选10到200nm。
含有编码本发明突变E7蛋白的核酸的疫苗组合物
本发明的另一个目的是提供没有预防性或治疗性免疫抑制性质的用于乳头瘤病毒感染导致癌症的免疫原性组合物或者疫苗组合物，其特征是该组合物含有免疫有效量的编码如在本公开中定义的突变E7蛋白的核酸、如在本公开中定义的表达盒或者重组载体。
为了实现上面提到的疫苗组合物，逆转录病毒载体或者腺伴随病毒载体(AAV)被优选作为表达载体。这种腺伴随病毒载体为例如Flotte等(1992)，Samulski等(1989)或者McLaughlin等(1996)描述的腺伴随病毒载体。为了将核酸、表达盒或载体导入宿主细胞，本领域技术人员可以有利地利用各种技术，如磷酸钙沉淀技术(Graham等，1973，Chen等，1987)、葡聚糖DEAE(Gopal，1985)、电穿孔(Turkaspa，1986，Potter等1984)、直接微注射(Harland等，1985)或者装载DNA的脂质体(Nicolau等，1987；Fraley等，1980)。
根据一个特定实施方案，将本发明的核酸或表达盒体内导入宿主细胞，尤其是来自哺乳动物的宿主细胞的方法包括将含有在药学可接受载体中的核酸或表达盒的制剂通过对所选组织，例如平滑肌组织或粘膜组织进行局部注射导入，核酸和表达盒被这种组织的细胞吸收。
体外或体内使用含有“裸”核酸或表达盒的组合物为，例如，在PCT申请WO 95/11307以及Tacson等(1996)和Huygen等(1996)的文章中公开的组合物。
其也可以是腺病毒载体，如2或5型人腺病毒载体。
注射到所选宿主生物体的载体量依赖于注射部位。作为说明，在患者身体中可注射约10μg到1000μg编码本发明突变E7蛋白的核酸或表达盒。
适用于抗肿瘤被动接种的组合物
如在本公开中清除地阐明的，为了阻断HPV-16感染的癌性细胞分泌的E7蛋白的免疫抑制性质，全身性抗体或粘膜抗体的产生是必需的。
对于含有本发明突变E7蛋白的疫苗组合物或者含有编码突变E7蛋白的核酸、表达盒或重组载体的疫苗组合物被治疗性地使用，即HPV-16感染之后使用这一情况，有利地是快速阻断癌性细胞产生并分泌的E7蛋白的免疫抑制作用以便有助于通过所述疫苗组合物快速诱导体液和细胞免疫应答，其目的是进一步增加其效率。
通过使用与一种或多种免疫佐剂结合的作为抗原性或免疫原性化合物的本发明突变E7蛋白对人或动物免疫后得到的有效量针对天然E7蛋白的中和抗体施用于患者可以实现对受感染细胞所产生的E7蛋白的免疫抑制作用进行早期阻断。
本发明还涉及分离可中和HPV-16天然E7蛋白的免疫抑制作用的抗体的方法，特征在于其包括使用本发明的突变E7蛋白免疫哺乳动物(包括人)，然后回收所得抗体的步骤。
本发明还涉及抗本发明的突变E7蛋白的抗体。这种抗体更具体的特征在于它们是中和性的，即它们中和天然E7蛋白的免疫抑制作用。
本发明的另一个目的是含有中和HPV-16天然E7蛋白尤其是中和受HPV-16感染的细胞分泌的E7蛋白的免疫抑制作用的抗体的药物组合物，所述抗体抗本发明的突变E7蛋白。
还涉及用于抗HPV-16感染，包括抗HPV-16感染导致的癌症的被动接种组合物，其为含有如上定义的抗体的组合物。
为了检查本发明抗体的中和能力，本领域技术人员可有利地参考实施例1中描述的试验，其包括定量暴露于天然E7蛋白的人巨噬细胞产生的α-IFN或α-TNF的抑制百分数。
本发明的另一个目的是阻断HPV-16病毒感染的细胞所产生E7蛋白的免疫抑制作用的方法，其特征是患者被施用中和量的用如在本公开中定义的突变E7蛋白免疫人或动物后得到的抗体。
待施用于患者的抗体的“中和量”依赖于HPV感染程度。通常，在实施例1中描述的免疫抑制试验中，患者被施用的中和抗体的量对应于需要阻断免疫抑制量的天然E7蛋白的中和抗体的量，为从100ng到1mg。
抗体可以是IgA同种型或IgG同种型抗体。它们可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
根据本发明的抗体也包括F(ab’)2或F(ab)片段。
含有用本发明的突变E7蛋白处理的树突状细胞的疫苗组合物
树突状细胞是在T细胞免疫启动中特化的抗原呈递细胞(APC)。T细胞免疫应答的诱导需要树突状细胞和T细胞的物理接触。树突状细胞通过两个信号步骤活化给定抗原的特异免疫应答。第一个信号步骤涉及抗原性肽-MHC/T细胞受体(TCR)相互作用。第二个信号步骤涉及共-刺激分子，如细胞表面标记或细胞因子。
树突状细胞当呈递抗原到T细胞时产生各种细胞因子，影响细胞因子微环境，然后导致免疫应答。
更特别地，公知用树突状细胞接种使得可以打破针对肿瘤细胞的免疫系统耐受性和通过Th1型T细胞免疫应答的刺激在宿主生物体中诱导肿瘤的裂解，至少随着肿瘤发展没有相伴的免疫抑制情况。
根据本发明已经表明个体的树突状细胞群体与适量的突变E7蛋白(如在本公开中定义的)的体外孵育使树突状细胞能够随后将所述的突变E7蛋白呈递到从同一个体得到的自体单核细胞群体中的T细胞，并且诱导E7蛋白的特异T细胞的活化，这可通过这种T细胞的增殖来显现。可通过例如在实施例中阐明的[3H]胸苷的胞内掺入量来测定T细胞的活化。
在类似的但是其中树突状细胞事先与天然E7蛋白体外孵育的实验中，没有观察到T细胞活化，如在缺乏外来抗原时孵育的对照树突状细胞的群体中一样。在这种系统中，可再一次观察到天然E7蛋白的免疫抑制活性。
相反，本发明的突变E7蛋白缺乏任何免疫抑制活性并允许诱导抗天然E7蛋白的有效特异T细胞免疫应答。
本发明的另一个目的是提供缺乏对乳头瘤病毒导致的癌症产生预防性或治疗性免疫抑制性质的疫苗组合物，其特征在于其包含适宜量的作为活性成分的针对所要治疗个体的自体或同种异体的树突状细胞，所述自体树突状细胞已经被与如在本发明中定义的突变E7蛋白孵育，从而使得能够将该所述突变E7蛋白呈递给特异识别该蛋白的T细胞。
本发明的另一个目的是预防或治疗乳头瘤病毒感染导致的癌症的方法，其特征是其包括以下步骤：个体被施用合适量针对所要治疗的个体的自体(等基因的)或同种异体的树突状细胞，所述自体(等基因的)或同种异体的树突状细胞在被施用于个体前已经与如在本公开中定义的突变E7蛋白孵育，从而使得能够将该所述突变的E7蛋白呈递给特异识别该蛋白的T细胞。
优选地，通过对从人外周血淘洗制备的单核细胞进行分化得到树突状细胞，该人外周血是患者的血液或者来自与患者共有主要组织相容性复合体的单倍型，如HLA-A2单倍型的个体的血液。
优选地，树突状细胞一旦从患者得到，就被培养在用于培养哺乳动物细胞的适宜培养基，如HL1培养基(Bio Whittaker)中，如果需要培养基被加入谷氨酰胺，任选一种或多种抗生素如链霉素，并在37℃培养箱的湿润空气中以5％(V/V)CO2进行培养。
然后将培养物中树突状细胞与选择量的，优选5到50μg/ml突变E7蛋白一起孵育。
优选地，树突状细胞与突变的E7蛋白孵育，与每106个树突状细胞孵育的突变E7蛋白的量为1到50μg。
优选地，将要被治疗的患者被施用101到500×106个用本发明的突变E7蛋白处理的树突状细胞。
有利地，通过经过肠胃外途径的注射将用突变E7蛋白处理的树突状细胞单次施用于患者。如果需要，根据导致的抗E7免疫应答的强度，可以对患者施用多次注射，例如，每月、每两个月、每季度或每年两次施用被处理的树突状细胞。
还通过下面的附图和实施例进一步阐明本发明而对本发明没有限制。
图1是E7Δ21-26制剂免疫之前和之后小鼠血清抗E7 IgG抗体滴度图；
图2是E7Δ21-26制剂免疫之前和之后小鼠血清抗E7 IgG抗体的中和百分率图；
图3是未免疫小鼠脾细胞和用E7Δ21-26制剂免疫后的小鼠脾细胞在存在天然E7蛋白培养时的Ip增殖指数图；
图4是未免疫小鼠脾细胞和用E7Δ21-26制剂免疫后的小鼠脾细胞在存在天然E7蛋白培养时的γ-IFN图；
图5到8显示了E7Δ21-26制剂免疫之前和之后小鼠血清抗E7 IgG抗体的滴度图和小鼠血清抗E7 IgG抗体的中和百分率图；
图9到10显示了E7Δ21-26制剂免疫之前和之后小鼠血清抗E7 IgG抗体的滴度图和小鼠血清抗E7 IgG抗体的中和百分率图；
图11是显示E7Δ21-26制剂免疫之前和之后小鼠阴道分泌物中存在的IgA图。
图12和13显示了E7Δ21-26制剂免疫之前和之后小鼠血清抗E7 IgG抗体的滴度图和小鼠血清抗E7 IgG抗体的中和百分率图；
图14是显示E7Δ21-26制剂免疫之前和之后小鼠阴道分泌物中存在的IgA图。
图15是显示将C3细胞注射到用或不用E7Δ21-26制剂免疫的小鼠中的肿瘤生长图。
图16阐明了显示在接受7×103个表达HPV-16 E7的C3细胞的小鼠中C3肿瘤的发育图；图16A代表对照小鼠，而图B代表用E7Δ21-26处理的小鼠；横坐标代表注射C3细胞后的天数；纵坐标代表肿瘤表面；
图17阐明了显示在接受“9×103”个表达HPV-16 E7的C3细胞的小鼠中C3肿瘤的发育的图；
图18是显示了混合淋巴反应水平的图，该反应水平通过用对照树突状细胞(空菱形)、用天然E7蛋白预处理(满圆形)或用E7Δ21-26蛋白预处理(阴影线的正方形)的树突状细胞刺激效应者单核细胞的增殖水平来测量。纵坐标给出了通过[3H]胸苷的掺入显现的效应者单核细胞的增殖，而横坐标给出了刺激细胞数(树突状细胞)与效应细胞数(T细胞)之间的比。
实施例1：全身性(体液和细胞)免疫应答
实施例1.1：存在弗氏完全(ACF)和不完全(AIF)佐剂时E7Δ21-26蛋白的免疫原活性
存在ACF和AIF时对购自Charles River的6周龄C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究E7Δ21-26制剂的免疫原性(体液和细胞)活性。
A.材料与方法
在第0天，一组6只小鼠通过肌内途径接受0.2ml(50μg)ACF乳液注射。在第21天和60天进行AIF 5μg加强注射。
在第一次注射前2天和在最后一次免疫后12天从每只小鼠眼球后采集血样。
8只对照小鼠接受相同的无免疫原制剂。
3只小鼠接受100μg制剂并在注射后的7天期间研究疾病症状的缺乏。
将小鼠在最后一次免疫12天后用C3细胞刺激。C3细胞是来自C57BL/6，用完整HPV16基因组和ras癌基因转化的胚胎细胞(Feltkamp，M.C.，H.L.Smits，M.P.Vierboom，R.P.Minnaar，B.M.de Jongh，J.W.Drijhout，J.terSchegget，C.J.Melief和W.M.Kast.1993.用含有细胞毒性T淋巴细胞表位的肽接种保护免受人乳头瘤病毒16型转化的细胞诱导的肿瘤，Eur.J.Immunol.23：2242-2249)。它们在含有7％CO2的湿润空气中于37℃下在加入10％FCS、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素和250ng/ml两性霉素B的DMEM培养基(Bio-Whittaker)中培养。将欲注射到小鼠的细胞在从使用胰蛋白酶的塑料制品移走后用无血清的培养基洗涤。
制剂毒性的缺乏通过缺乏临床迹象(行为、头发、体重)和通过尸检后的解剖学研究来测量。
B.结果
在存在ACF和AIF时通过E7Δ21-26制剂免疫的小鼠没有显示出任何临床迹象并且无解剖学损伤。
用100μg制剂免疫的三只小鼠中没有一只在注射7天后显示出任何疾病症状。
通过体液应答和细胞应答测量免疫应答：
1.体液应答
血清中抗天然E7重组蛋白的IgG型抗体的存在通过ELISA测定并以滴度(给出高于0.3的光密度的稀释度的倒数)表达。
                           图1
在存在ACF和AIF时通过E7Δ21-26制剂免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗体滴度。
使用下面的免疫抑制试验测量这种抗体的中和活性。在-2天和72天采集的血清的1/50稀释液与50ng/ml天然E7孵育2小时。然后将这些稀释液应用于用γ-IFN预处理16小时的人巨噬细胞。培养24小时后，回收培养上清液并通过ELISA试验、DTA50 DuoSet(R&D)测量产生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白诱导α-TNF的表达，而非中和血清允许该细胞因子的合成。
结果以中和％给出。
                             图2
存在ACF然后是AIF时通过E7Δ21-26制剂诱导的抗体具有非常高的中和能力。
2.细胞应答
2.1细胞增殖
将来自免疫小鼠和对照小鼠的脾细胞分离然后以100,000个细胞/孔培养于存在天然E7的微培养板的圆底孔中。细胞培养在37℃装有5％CO2的湿润空气中继续6小时。孵育结束前18小时，加入0.5μCi氚化的胸苷/孔。免疫应答的强度与Ip增殖指数成比例。
Ip＝给定抗原的spm(脉冲(strokes)/分钟)/对照smp
                             图3
从存在ACF和AIF时用E7Δ21-26制剂免疫的小鼠得到的脾细胞当体外用天然E7蛋白活化时增殖。
2.2.γ-IFN的产生
使用ELISA试验(LO-IMEX，比利时)，在培养72小时后确定存在10μg/ml天然E7时培养的脾细胞的培养上清液中γIFN的存在，如以前描述的进行(De Smedt，T.，B.Pajak，E.Muraille，L.Lespagnard，E.Heinen，P.De Baetselier，J.Urbain，O.Leo和M.Moser.1996.通过脂多糖体内调节树突状细胞数及成熟.J.Ex.Med.184：1413-1424)。这些结果以IU/ml表达。
                           图4
从存在ACF然后是AIF时用E7Δ21-26制剂免疫的小鼠得到的脾细胞当体外用天然E7蛋白活化时产生大量γIFN。
实施例1.2：存在弗氏不完全佐剂(AIF)时E7Δ21-26蛋白的免疫原性活性
存在AIF时对从Charles River购买的6周龄C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究E7Δ21-26制剂的免疫原性(体液)活性。
A.材料与方法
在第0天，一组6只小鼠通过肌内途径接受存在1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml(50μg)AIF乳液注射。在第21天和60天进行AIF5μg加强注射。
在第一次注射前2天和在最后一次免疫后12天从每只小鼠眼球后采集血样。
6只对照小鼠接受相同的无免疫原制剂。
3只小鼠接受100μg制剂并在注射后的7天期间研究疾病症状的缺乏。
制剂毒性的缺乏通过缺乏临床迹象(行为、头发、体重)和通过尸检后的解剖学研究来测量。
B.结果
在存在AIF时通过E7Δ21-26制剂免疫的小鼠没有显示出任何临床迹象并且无解剖学损伤。
用100μg制剂免疫的三只小鼠中没有一只在注射后7天期间显示出任何疾病症状。
通过体液应答和细胞应答测量免疫应答：
1.体液应答
血清中抗天然E7重组蛋白的IgG型抗体的存在通过ELISA测定并以滴度(给出高于0.3的光密度的稀释度的倒数)表示。
                               图5
在存在AIF时通过E7Δ21-26制剂免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗体滴度。
使用下面的免疫抑制试验测量这种抗体的中和活性。在-2天和72天采集的血清的1/50稀释液与50ng/ml天然E7孵育2小时。然后将这些稀释液应用于用γ-IFN预处理16小时的人巨噬细胞。培养24小时后，回收培养上清液并通过ELISA试验、DTA50 DuoSet(R&D)测量产生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白诱导α-TNF的表达，而非中和血清允许该细胞因子的合成。
结果以中和％给出。
                          图6
存在AIF时通过E7Δ21-26制剂诱导的抗体具有非常高的中和能力。
实施例1.3：存在弗氏不完全佐剂(AIF)时包埋于脱乙酰壳多糖纳颗粒中的E7Δ21-26的免疫原活性
存在AIF时对从Charles River购买的6周龄C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究包埋于脱乙酰壳多糖纳颗粒中的E7Δ21-26制剂的免疫原(体液)活性。
A.材料与方法
在第0天，一组6只小鼠通过肌内途径接受存在1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml(50μg)AIF乳液注射。在第21天和60天进行AIF5μg加强注射。
在第一次注射前2天和在最后一次免疫后12天从每只小鼠眼球后采集血样。
6只对照小鼠接受相同的无免疫原制剂。
3只小鼠接受100μg制剂并在注射后的7天期间研究疾病症状的缺乏。
制剂毒性的缺乏通过缺乏临床迹象(行为、头发、体重)和通过尸检后的解剖学研究来测量。
B.结果
存在AIF时通过包埋于脱乙酰壳多糖纳颗粒中的E7Δ21-26制剂免疫的小鼠没有显示出任何临床迹象并且无解剖学损伤。
用100μg制剂免疫的三只小鼠中没有一只在注射后7天显示出任何疾病症状。
通过体液应答和细胞应答测量免疫应答：
1.体液应答
血清中抗天然E7重组蛋白的IgG型抗体的存在通过ELISA测定并以滴度(给出高于0.3的光密度的稀释度的倒数)表示。
                              图7
存在AIF时通过包埋于脱乙酰壳多糖纳颗粒中E7Δ21-26制剂免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗体滴度。
使用下面的免疫抑制试验测量这种抗体的中和活性。在-2天和72天采集的血清的1/50稀释液与50ng/ml天然E7孵育2小时。然后将这些稀释液应用于用γ-IFN预处理16小时的人巨噬细胞。培养24小时后，回收培养上清液并通过ELISA试验、DTA50 DuoSet(R&D)测量产生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白诱导α-TNF的表达，而非中和血清允许该细胞因子的合成。
结果以中和％给出。
                               图8
存在AIF时通过包埋于脱乙酰壳多糖纳颗粒中的E7Δ21-26制剂诱导的抗体具有非常高的中和能力。
实施例2：全身性和粘膜免疫应答
实施例2.1：存在IMS 1113(SEPPIC)时E7Δ21-26蛋白的免疫原活性
存在IMS 1113(SEPPIC)时对从Charles River购买的6周龄C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究E7Δ21-26制剂的免疫原(体液)活性。
A.材料与方法
在第0天，一组6只小鼠通过肌内途径注射存在IMS 1113和1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml含有50μg E7Δ21-26，以及通过鼻内途径给予的20μg相同制剂。
在第7、14和21天，这些小鼠通过鼻内途径接受20μl，即20μg IMS1113制剂。
在第60天，这些小鼠接受0.2ml含有5μg IMS 1113制剂的注射和通过鼻内途径的20μl含有20μg的相同制剂。
在第一次注射前2天和在最后一次免疫后12天从每只小鼠眼球后采集血样。
6只对照小鼠接受相同的无免疫原制剂。
3只小鼠接受100μg制剂并在注射后的7天中研究疾病症状的缺乏。
制剂毒性的缺乏通过缺乏临床迹象(行为、头发、体重)和通过尸检后的解剖学研究来测量。
B.结果
存在IMS 1113时用E7Δ21-26制剂免疫的小鼠没有显示出任何临床迹象并且无解剖学损伤。
用100μg制剂免疫的三只小鼠中没有一只在注射后7天显示出任何疾病症状。
通过体液应答和细胞应答测定免疫应答：
1.体液应答
1.1.血清中IgG同种型抗体的产生
血清中抗天然E7重组蛋白的IgG型抗体的存在通过ELISA测定并以滴度(给出高于0.3的光密度的稀释度的倒数)表示。
                             图9
存在IMS 1113时用E7Δ21-26制剂免疫的小鼠具有非常高的抗E7IgG型抗体滴度。
使用下面的免疫抑制试验测量这种抗体的中和活性。在-2天和72天采集的血清的1/50稀释液与50ng/ml天然E7孵育2小时。然后将这些稀释液应用于用γ-IFN预处理16小时的人巨噬细胞。培养24小时后，回收培养上清液并通过ELISA试验、DTA50 DuoSet(R&D)测量产生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白诱导α-TNF的表达，而非中和血清允许该细胞因子的合成。
结果以中和％给出。
                           图10
1.2.阴道分泌物中同种型IgA抗体的产生
血清中抗天然E7重组蛋白的IgA型抗体的存在通过ELISA测量并以滴度(给出高于0.3的光密度的稀释度的倒数)表示。
                           图11
存在IMS 1113时用E7Δ21-26制剂免疫的小鼠具有非常高的抗E7IgA型抗体滴度。
实施例2.2：存在AIF(全身途径)或者存在PBS(鼻途径)时包埋于脱乙酰壳多糖中的E7Δ21-26制剂的免疫原活性
对从Charles River购买的6周龄C57BL/6(H-2b)雌性小鼠研究包埋于脱乙酰壳多糖中的E7Δ21-26制剂的免疫原(体液)活性。
A.材料与方法
在第0天，一组6只小鼠通过肌内途径接受存在AIF和1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的0.2ml含有50μg E7Δ21-26的注射，以及通过鼻内途径的存在PBS加入1μg鼠GM-CSF和1.5μg鼠IL-2的20μg相同制剂。
在第7、14和21天，这些小鼠通过鼻内途径接受20μl，即20μg存在PBS时包埋于脱乙酰壳多糖中的E7Δ21-26。
在第60天，这些小鼠接受0.2ml含有5μg AIF制剂的注射和通过鼻内途径接受存在PBS的20μl含有20μg的相同制剂。
在第一次注射前2天和在最后一次免疫后12天从每只小鼠眼球后采集血样以及阴道分泌物样品。
6只对照小鼠接受相同的无免疫原制剂。
3只小鼠接受100μg制剂并在注射后的7天期间研究疾病症状的缺乏。
制剂毒性的缺乏通过缺乏临床迹象(行为、头发、体重)和通过尸检后的解剖学研究来测量。
B.结果
通过包埋于脱乙酰壳多糖中的E7Δ21-26制剂免疫的小鼠没有显示出任何临床迹象并且无解剖学损伤。
用100μg制剂免疫的三只小鼠中没有一只在注射后7天显示出任何疾病症状。
通过体液应答和细胞应答测量免疫应答：
1.体液应答
1.1.血清中G同种型抗体的产生
血清中抗天然E7重组蛋白的IgG型抗体的存在通过ELISA测量并以滴度(给出高于0.3的光密度的稀释度的倒数)表示。
                             图12
用包埋于脱乙酰壳多糖中的E7Δ21-26制剂免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgG型抗体滴度。
使用下面的免疫抑制试验测量这种抗体的中和活性。在-2天和72天采集的血清的1/50稀释液与50ng/ml天然E7孵育2小时。然后将这些稀释液应用于用γ-IFN预处理16小时的人巨噬细胞。培养24小时后，回收培养上清液并通过ELISA试验、DTA50 DuoSet(R&D)测量产生的α-TNF的量。中和血清防止E7蛋白诱导α-TNF的表达，而非中和血清允许该细胞因子的合成。
结果以中和％给出。
                             图13
1.2.阴道分泌物中同种型A抗体的产生
血清中抗天然E7重组蛋白的IgA型抗体的存在通过ELISA测量并以滴度(给出高于0.3的光密度的稀释度的倒数)表示。
                         图14
用包埋于脱乙酰壳多糖中的E7Δ21-26制剂免疫的小鼠具有非常高的抗E7 IgA型抗体滴度。
实施例3：保护性抗肿瘤应答
实施例3.1：存在ACF然后存在AIF时E7Δ21-26蛋白的注射产生抗肿瘤抗性
如下测试了存在ACF然后存在AIF时用E7Δ21-26制剂免疫的小鼠(实施例1.1)保护性抗肿瘤应答。
最后一次免疫后12天，通过皮下途径(s-c)在侧腹中用500,000个C3细胞注射小鼠。C3细胞是源自C57BL/6、用完整HPV16基因组和ras癌基因转化的胚胎细胞。
                             图15
肿瘤在所有仅用佐剂治疗的对照小鼠中生长。在存在ACF然后AIF时用E7Δ21-26制剂免疫的6只小鼠中：
4只小鼠不长肿瘤，
在1只小鼠中，肿瘤生长，然后稳定，
在1只小鼠中，肿瘤生长。
存在ACF和AIF时，E7Δ21-26在小鼠中产生特异抗16型人乳头瘤病毒诱导的肿瘤的特异性免疫应答。
实施例4：治疗性抗肿瘤应答
存在AIF时E7Δ21-26诱导对预先植入的C3肿瘤的排斥已经如下在C57BL/6(H-2b)小鼠中检验。
实施例4.1：治疗模型的制备
A.材料与方法
小鼠(8只一组)被用数量增加：0；5×102；5×103；5×104和5×105的C3细胞皮下注射入侧腹。通过测量肿瘤表面每周一次评价肿瘤生长。
B.结果
表I
通过测量肿瘤表面评价肿瘤生长*
  注射细胞的数目   第0天   第12天   第17天   第24天   第31天
    0e+05e+25e+35e+45e+5     00000     000025     0000202     00.1010死亡     00.90.86.9死亡
*以mm2表示的表面代表从测量8个肿瘤的表面得到的平均值。
已经接受5×105个细胞的小鼠在细胞注射后12天都生长肿瘤(8/8)。
在接受5×104个细胞的小鼠中，8只中的4只小鼠在细胞注射后21天长肿瘤，8只中的4只在注射后28天后长肿瘤。
在接受5×103个细胞的小鼠中，8只中的1只小鼠在细胞注射后35天长出肿瘤，8只中的3只在注射后42-60天后长肿瘤，并且另外4只仍然没有显示任何肿瘤。
在接受5×102个细胞的小鼠中，8只中的1只小鼠在细胞注射后35天长肿瘤，其他7只仍然没有长肿瘤。
实施例4.2：在接受7×103和9×103剂量的表达E7蛋白的C3细胞的小鼠中抗肿瘤应答
A.材料与方法
将小鼠首先从侧腹皮下注射7,000或9,000个C3细胞(第0天)。在第2、9、16和23天，小鼠接受AIF和1μg GM-CSF和鼠IL2中的10μg E7Δ21-26制剂的肌内注射。在第9、16、23和60天，小鼠接受AIF中的10μgE7Δ21-26制剂的肌内注射。
如上面实施例4.1中所描述的每周两次测量肿瘤的大小。
B.结果
图16和17显示了所得结果。
对照小鼠在注射C3细胞后10到20天都长肿瘤(8/8)而80％(注射7,000个细胞-图16)和75％(注射9,000个细胞-图17)免疫的小鼠不长肿瘤。
实施例5：用E7Δ21-26突变的E7蛋白预处理的树突状细胞刺激混合淋巴细胞反应
单向自体混合淋巴细胞反应包括在携带抗原的树突状细胞(刺激细胞)上共培养个体的单核细胞(效应细胞或应答细胞)。具有对刺激细胞携带的抗原特异的受体的效应细胞增殖。通过氚化的胸苷掺入试验测量增殖。
树突状细胞来自通过从供体的外周血PBMCs淘析的单核细胞的分化(Sallusto等，Journal of Experimental Medicine，1994，179，1109-18)。单核细胞(2.5×106个细胞/ml)被培养于富含SAB(10％)、GMC-SF(50ng/ml)和IL4(1,000单位/ml)的RPMI 1640中的特氟隆小瓶中。培养6天后，那些细胞显示出分化的树突状细胞的表型。
从而将这些所得的树突状细胞用3μg/ml剂量的天然E7、或E7Δ21-26和/或培养基处理，然后在圆底96孔板中与同一供体的PBMCs共培养，PBMCs的比例为：1/10；3/10和10/10。反应结束前18小时，加入0.5μCi氚化的胸苷/孔。结果(以每分钟的脉冲给出)在图18中给出。
当树突状细胞与天然E7蛋白预孵育，然后与应答细胞培养时，没有观察到增殖(因为天然E7蛋白的免疫抑制活性)。当树突状细胞与突变的E7蛋白(缺少天然蛋白的免疫抑制活性)预孵育时，观察到刺激细胞的增殖。
实施例6：突变的E7蛋白缺乏免疫抑制活性
使用细胞增殖试验测定体外免疫抑制活性的缺乏。将人外周血单核细胞分离，然后在存在3μg/ml不同天然E7蛋白和它们的各自突变体或者存在E7 HPV 16(Δ21-25)疫苗培养物(MP Kieny，Transgene赠送)的培养上清液(SN)时和存在加强抗原(PPD+TT)时将这些单核细胞以150,000个细胞/孔培养于圆底孔中。细胞培养在37℃下装有5％CO2的湿润空气中持续6天。通过氚化的胸苷掺入试验测量细胞增殖。结果(以每分钟脉冲给出)总结于后面的表II中。
表II
对照培养基   25,000   40,000  33,000   45,000
PD1/3-HPV16-E7   5,000
PD1/3-HPV16-E7突变体(C24G；E26Q)   20,000
His-HPV16-E7   10,000
His-HPV16-E7突变体(C24S；E26Q)   35,000
His-HPV16-E7  7,500
His-HPV16-E7突变体(Δ21-26)  30,000
SN-牛痘E7 HPV16(Δ21-25)   40,000
所得结果表明突变体被脱毒(丧失天然蛋白的免疫抑制活性)。
参考文献
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                               序列表
<110>尼奥瓦克斯公司
<120>包含HPV-16病毒的突变E7蛋白的非免疫抑制免疫原性组合物或疫苗组合物
<130>尼奥瓦克斯公司-N729-PCT
<140>
<141>
<150>FR0205173
<151>2002-04-24
<160>4
<170>PatentIn版本2.1
<210>1
<211>92
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：E7Δ21-26
<400>1
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
  1               5                  10                  15
Pro Glu Thr Thr Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile
             20                  25                  30
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
         35                  40                  45
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
     50                  55                  60
Ser Thr His Val Asp Ile Cys Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
 65                  70                  75                  80
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Arg Lys Pro
                 85                  90
<210>2
<211>276
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：E7Δ21-26
<400>2
catggagata cacctacatt gcatgaatat atgttagatt tgcaaccaga gacaactcaa 60
ttaaatgaca gctcagagga ggaggatgaa atagatggtc cagctggaca agcagaaccg 120
gacagagccc attacaatat tgtaaccttt tgttgcaagt gtgactctac gcttcggttg 180
tgcgtacaaa gcacacacgt agacattcgt actttggaag acctgttaat gggcacacta 240
ggaattgtgt gccccatctg ttctcagaaa ccataa                           276
<210>3
<211>98
<212>PRT
<213>人乳头瘤病毒16型
<400>3
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
  1               5                  10                  15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
             20                  25                  30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
         35                  40                  45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
     50                  55                  60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Cys Thr Leu Glu
 65                  70                  75                  80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Arg
                 85                  90                  95
Lys Pro
<210>4
<211>294
<212>DNA
<213>人乳头瘤病毒16型
<400>4
catggagata cacctacatt gcatgaatat atgttagat ttgcaaccaga gacaactgat 60
ctctactgtt atgagcaatt aaatgacagc tcagaggagg aggatgaaat agatggtcca 120
gctggacaag cagaaccgga cagagcccat tacaatattg taaccttttg ttgcaagtgt 180
gactctacgc ttcggttgtg cgtacaaagc acacacgtag acattcgtac tttggaagac 240
ctgttaatgg gcacactagg aattgtgtgc cccatctgtt ctcagaaacc ataa       294

Claims (23)

1.缺乏针对乳头瘤病毒感染所致癌症的预防性或治疗性免疫抑制特性的疫苗组合物，其特征在于其包含与一种或多种生理可相容的免疫佐剂结合的作为活性成分的非免疫抑制性突变E7蛋白，该突变E7蛋白从N-末端到C-末端含有下列氨基酸序列：
i.序列SEQ ID No.3的1-19位氨基酸序列；
ii.具有(a)与序列SEQ ID No.3的相应20-29位氨基酸序列相比至少一个氨基酸替代的氨基酸序列或者(b)与序列SEQ ID No.3的相应20-29位氨基酸序列相比至少4个连续氨基酸缺失的氨基酸序列；和
iii.序列SEQ ID No.3的30-98位氨基酸序列。
2.根据权利要求1的疫苗组合物，其中突变的E7蛋白的特征在于所述突变的E7蛋白的氨基酸区域(ii)与天然蛋白的序列SEQ ID No.3的氨基酸对应的20-29位肽区域相比包含至少2个氨基酸替代。
3.根据权利要求2的疫苗组合物，其中突变的E7蛋白的特征在于所述突变的E7蛋白的氨基酸区域(ii)与天然蛋白的序列SEQ ID No.3的氨基酸对应的20-29位肽区域相比包含3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸替代。
4.根据权利要求2的疫苗组合物，其中突变的E7蛋白的特征在于24位的Cys残基和26位的Glu已经用不同的氨基酸残基替代。
5.根据权利要求4的疫苗组合物，其中突变的E7蛋白是(CYS24GLY，GLU26GLN)E7蛋白。
6.根据权利要求4的疫苗组合物，其中突变的E7蛋白是(CYS24SER，GLU26GLN)E7蛋白。
7.根据权利要求1的疫苗组合物，其中突变的E7蛋白的特征在于所述突变的E7蛋白的氨基酸区域(ii)与SEQ ID No.3的相应20-29位氨基酸序列相比包含5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的缺失。
8.根据权利要求7的疫苗组合物，其中突变的E7蛋白的特征在于所述突变的E7蛋白的氨基酸区域(ii)与SEQ ID No.3的相应20-29位氨基酸序列相比包含6个连续氨基酸的缺失。
9.根据权利要求8的疫苗组合物，其中突变的E7蛋白在于该突变的E7蛋白具有包含对天然E7蛋白的SEQ ID No.3序列的相应氨基酸21-26位缺失的氨基酸序列。
10.根据权利要求7的疫苗组合物，其中突变的E7蛋白的特征在于所述突变的E7蛋白的氨基酸区域(ii)与SEQ ID No.3的相应20-29位氨基酸序列相比包含5个连续氨基酸的缺失。
11.根据权利要求10的疫苗组合物，其中突变的E7蛋白在于该突变的E7蛋白具有包含对天然E7蛋白的SEQ ID No.3序列的相应氨基酸21-25位缺失的氨基酸序列。
12.根据权利要求1到11中任意一项所述的疫苗组合物，其特征在于其包含至少一种能够优选地将免疫应答定向到产生中和天然E7蛋白免疫抑制活性的抗体的佐剂。
13.根据权利要求12的疫苗组合物，其特征在于其包含至少一种能够优选地将免疫应答定向到产生IgA同种型抗体的佐剂。
14.根据权利要求12的疫苗组合物，其特征在于其包含至少一种能够优选地将免疫应答定向到产生IgG同种型抗体的佐剂。
15.根据权利要求12的疫苗组合物，其特征在于其包含(i)能够优选地将免疫应答定向到产生IgA同种型抗体的佐剂和(ii)能够优选地将免疫应答定向到产生IgG同种型抗体的佐剂的组合。
16.根据权利要求15的疫苗组合物，其特征在于其包含至少一种能够诱导体液和细胞免疫应答的免疫佐剂。
17.根据权利要求7的疫苗组合物，其特征在于细胞应答更特别地通过表达CD8抗原并特异识别野生型E7蛋白的淋巴细胞的增殖而表征。
18.诱导针对HPV-16乳头瘤病毒天然E7蛋白的免疫应答而不同时诱导免疫抑制的免疫原性组合物，所述组合物包含与一种或多种生理学上可相容的赋形剂或免疫佐剂结合的作为活性成分的非免疫抑制的突变E7蛋白，该突变蛋白从N-末端到C-末端包含以下氨基酸序列：
i.序列SEQ ID No.3的1-19位氨基酸序列；
ii.具有(a)与序列SEQ ID No.3的相应20-29位氨基酸序列相比至少一个氨基酸替代的氨基酸序列或者(b)与序列SEQ ID No.3的相应20-29位氨基酸序列相比至少4个连续氨基酸缺失的氨基酸序列；和
iii.序列SEQ ID No.3的30-98位氨基酸序列。
19.用于HPV-16感染所致癌症的预防性或治疗性疫苗组合物，其特征在于其包含免疫有效量的编码如在权利要求1到11之一中定义的突变E7蛋白的核酸、含有所述核酸的表达盒或含有所述表达盒的重组载体。
20.如在权利要求1到11中任意一项所定义的非免疫抑制性突变E7蛋白的用途，用于制备非免疫抑制的免疫原性组合物或疫苗组合物，其中所述组合物诱导产生中和天然E7蛋白免疫抑制活性的抗体。
21.中和抗体，其抗编码如根据权利要求1到11之一中定义的突变E7蛋白的DNA的表达产物。
22.用于针对HPV-16感染的被动接种的组合物，其包含根据权利要求21的抗体。
23.缺乏针对乳头瘤病毒感染所致癌症的任何预防性或治疗性免疫抑制特性的疫苗组合物，其特征在于其包含适宜量的对待治疗个体而言为自体或同种异体树突状细胞作为活性成分，所述自体树突状细胞已经与如在权利要求1到11之一定义的突变E7蛋白孵育，从而使得能够将所述突变的E7蛋白呈递给T细胞。
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