CN1533284A - 生物活性 H I V － 1 T a t、其片段或衍生物用于预防或治疗性免疫接种和/或治疗其它疾病中靶向和/或激活抗原呈递细胞、和/或运送货物分子的用途 - Google Patents

生物活性 H I V － 1 T a t、其片段或衍生物用于预防或治疗性免疫接种和/或治疗其它疾病中靶向和/或激活抗原呈递细胞、和/或运送货物分子的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1533284A
CN1533284A CNA028146581A CN02814658A CN1533284A CN 1533284 A CN1533284 A CN 1533284A CN A028146581 A CNA028146581 A CN A028146581A CN 02814658 A CN02814658 A CN 02814658A CN 1533284 A CN1533284 A CN 1533284A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tat
cell
antigen
purposes
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA028146581A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1318091C (zh
Inventor
Bi
B·恩瑟里
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Advanced Health Research Institute
Original Assignee
Advanced Health Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Advanced Health Research Institute filed Critical Advanced Health Research Institute
Publication of CN1533284A publication Critical patent/CN1533284A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1318091C publication Critical patent/CN1318091C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55516—Proteins; Peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

本发明涉及一种使用具有以下一或多种特征的生物活性HIV－1Tat蛋白质、片段或其衍生物对HIV/AIDS、其它传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的预防性和/或治疗性免疫接种和/或治疗和/或诊断的方法：抗原、佐剂和向特异抗原呈递细胞包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞的靶向运送系统。特别地，由于Tat靶向这些APC和刺激它们的成熟及功能和作为佐剂增强Th－1型免疫应答的能力，请求保护其只有在其活性形式下才能与一或多种其它抗原联合而用作抗原，以初次刺激或再次刺激产生抵御其自身以及其它抗原的免疫应答和/或选择性向树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞运送这些抗原以及活性化合物。因此，由于这些特征以及这些细胞在体内的分布(在生理和病理失调期间)，生物活性Tat、其含有RGD区域的片段或衍生物可以被用于预防、治疗和/或诊断HIV/AIDS、其它传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的目的。

Description

生物活性HIV-1 Tat、其片段或衍生物用于预防或 治疗性免疫接种和/或治疗其它疾病中靶向 和/或激活抗原呈递细胞、和/或运送货物分子的用途
发明领域
本发明基于对小量(皮摩尔-纳摩尔)天然、基本上是单体的生物活性HIV-1 Tat、其片段或衍生物的新的意外发现，其(i)通过RGD结构域特异结合选择性表达于抗原呈递细胞(以下称为APC)，例如树突细胞、巨噬细胞和由细胞因子激活的内皮细胞上的α5β1及整合素，(ii)有效进入APC，(iii)促进树突细胞和内皮细胞成熟和激活，及(iv)进入I类和II类主要组织相容性复合物限制性抗原呈递途径。因此，本发明试图将这些对生物活性HIV-1 Tat、其片段或衍生物的前述固有和相互关联特性的新发现开发为用于治疗某些人类疾病的抗原性和治疗性(以下统称为“货物”)分子的运送系统，所述疾病例如但不限于传染病、炎症及血管生成疾病和肿瘤，以及用作预防和治疗性免疫接种应用中的单一或多抗原疫苗中的佐剂和免疫调节剂，通过下列方式实现：1)在本发明第一实施方式中选择性对APC靶向、结合并运送货物分子，2)在本发明第二实施方式中选择性靶向和结合于树突细胞和内皮细胞促进它们的成熟和激活，以及诱导对抗其自身、更重要的是其它抗原的Th-1型免疫应答。
本发明特别涉及，1)为抵御传染病、炎症及血管生成疾病或肿瘤免疫和治疗人而特异向APC靶向和运送货物分子的方法，2)在为抵御一或多种病原体感染而对人进行的预防和治疗性免疫接种中，提高其它抗原免疫活性的方法。
本发明特定、明确的涉及天然、基本上是单体的具生物活性HIV-1Tat蛋白、其片段或衍生物的应用，在本发明的药物或抗原运送实施方案中特异靶向APC、穿过外部细胞和核膜运送货物分子；在本发明的疫苗佐剂和免疫调节实施方案中特异靶向树突细胞和内皮细胞以促进它们的成熟、激活和诱导Th-1型免疫应答。
发明背景
Tat是1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的一种调控蛋白，其在感染后极早即产生并主要影响病毒基因表达、复制和感染力(Arya 1985；Fisher 1986；Chang 1995)。在HIV对T细胞的急性感染中，Tat也被释放至胞外环境并被相邻细胞摄取(Frankel 1988；Ensoli 1990；Ensoli1993；Chang 1997)，在这些细胞中根据其浓度Tat可以提高病毒感染力。特别的，通过摄取，Tat可以在感染细胞中增强病毒基因的表达和复制(Frankel 1988；Ensoli 1993；Chang 1997)，在非感染细胞中增强促进巨噬细胞和T淋巴细胞向性HIV-1病毒株传播的β-趋化因子受体CCR5和CXCR4的表达(Huang 1998；Secchiero 1999)。细胞外HIV-1 Tat也引起卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)(KS)(一种尤其经常发生于HIV感染个体中的血管肿瘤)频率和侵占性的提高(Friedman-Kien 1981；Safai 1985)。尤其，我们和其它小组以前的工作表明，在诱导新血管形成(血管发生)、以及内皮细胞起源(KS细胞)和激活的内皮细胞中纺锤形细胞的移动和生长中，Tat与在KS病人(Samaniego 1998；Ensoli 1994)中高度表达的血管生成和炎症细胞因子协作(Barillari 1992；Albini 1995；Ensoli 1994)。此外，包含HIV-1 BH-10 Tat蛋白中介于残基21和40(核心结构域)之间的序列显示出，作为一种反式激活蛋白诱导HIV复制和触发血管生成(国际专利号WO00/78969A1)。尤其，我们的资料已经表明，生物活性Tat通过其RGD区域结合整合素受体α5β1和αvβ3，并且它们之间的相互作用介导由Tat诱导的在KS细胞和由炎症细胞因子激活的内皮细胞上的附着、生长和移动(Barillari 1993；Barillari 1999a和1999b)。此外，Tat也作为这些细胞类型以及单核细胞和树突细胞(DC)的趋化因子(Albini 1995；Benelli 1998；Lafrenie 1996；Mitola 1997)。最后，我们的资料证明，KS和HUVE细胞的迁移和入侵是朝向Tat蛋白的，这由Tat RGD区域与α5β1和αvβ3整合素的结合介导(Barillari，1999b)。
与这些发现一致，已表明对Tat的免疫应答在控制AIDS以及AIDS关联疾病的进展中发挥重要作用。事实上，Tat-特异免疫应答存在于HIV-1感染的受试者和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)感染的猴子体内，并与感染症状阶段的进展反向相关(Reiss 1990；Venet 1992；Rodman1993；Froebel 1994；Re 1995；Van Baalen 1997；Zagury 1998；Addo2001)。此外，用生物活性Tat蛋白或tat DNA进行的免疫接种诱发与包括特异细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的Th-1应答存在相关的、对SHIV89.6P病毒复制和疾病开始的防护(Cafaro 1999；Cafaro 2000；Cafaro 2001，和PCTW099/27958)。近期通过用同病毒载体运送的tat-rev疫苗在猕猴体内也观察到同样的保护信息(Osterhaus 2001)。相反，在用失活的Tat或Tat肽接种的猴子中观察到了对感染的有限遏制，这些猴子体内特异产生了抗体和T辅助细胞应答但是没有诱导产生CTLs和Th-1应答(Goldstein 2000；Pauza 2000)。单独用天然有活性的Tat蛋白(不含任何佐剂)以低剂量(5-6μg)对猴子进行反复皮内(i.d.)接种选择性诱发无任何显著抗体产生的Th-1应答和特异CTLs(Cafaro 1999和PCT W099/27958)。这些免疫结果近期在一个新的免疫接种方案——单独用天然Tat对4只猴子进行反复皮内接种(未发表资料)中得到了证实，并与在一项发表的(Cafaro 2001和PCTWO99/27958)和一项正在进行的研究中用tat DNA i.m.接种诱导的结果相当。类似地，近期用感染SIV的猕猴完成的工作表明，抗Tat的CTLs是在初次感染后控制早期病毒复制的关键，且对病毒施加了选择性免疫压力导致缓慢复制、出现更少致病逃逸突变体(pathogenicescape mutants)(Allen 2000)。
最后，Tat被呈递至I类主要组织相容性复合物(MHC)抗原(Moy1996；Kim 1997)，从而诱导抗-Tat CTL(Cafaro 1999)。
微摩尔浓度的重组Tat蛋白(常具有未知的生物学活性)包含Tat碱性区域(basic region)的肽已经显示进入许多不同的细胞类型(Frankel 1988；Mann 1991；Ensoli 1993；Chang 1997；Fawell 1994；Moy 1996；Kim 1997)。事实上，Tat残基48-57的高碱性电荷使得蛋白质可以结合存在于所有细胞类型表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)(Chang 1997；Rusnati 1998)。在从急性感染细胞中释放后，一小部分细胞外Tat通过它的碱性残基与HSPG结合(Chang 1997)。这保护了细胞外Tat，使其免于象以前发现的几种生长因子一样被蛋白水解酶降解(reviewed in Raines和Ross，1992)。其碱性区域与细胞表面的HSPG结合后，Tat通过一条受体依赖途径被内化(Frankel 1988；Rusnati 1998；Tyagi 2001)。实际上，Tat残基49-57(在BH-10 Tat序列中)已经被指明可以将OVA肽转移到DC的细胞溶质中并使得CD8+T细胞对该肽敏感(Kim，1997)。此外，Tat 47-57序列(源于BH-10变体)，与几个效应蛋白融合后，已经显示可以将它们运送至细胞中(国际专利号WO 01/19393 A1)。然而，这种内化机制需要高(微摩尔)浓度的Tat，发生于任意细胞类型中，而且它不是序列特异的。事实上，该区域的突变，不改变其碱性电荷，并不影响Tat碱性区域的特性(Barillari 1999b)。类似地，用HIV rev或其它基因对Tat碱性区域的替换不改变Tat的特性。在这点上，Tat碱性区域表现得与以穿透肽(penetratin)为人所知的蛋白质小家族成员具有的精氨酸富集区十分相似，它们全部都可以进入许多细胞类型(Derossi 1998)。实际上，精氨酸均聚物表现得可以比Tat碱性区域更有效的进入细胞(Derossi1998)。
Tat碱性区域的被细胞内化的特性已经被开发用于向大量细胞类型运送外源蛋白(Fawel 1994；Wender2000；和WO 0119393)。为此，外源蛋白与作为被转导蛋白载体的Tat碱性区域缀合或融合(Fawel1994；Wender 2000；和WO 0119393)。然而，发明人认为由于HSPG的遍在表达，Tat碱性区域不能被用于由特异初级细胞类型，包括抗原呈递细胞(APC)，对Tat的选择性靶向、运送和/或摄取。
APC根据所遭遇的外源分子引发和驱动免疫应答的类型(Bancherau 1998；Bell 1999)。典型的APC包括单核细胞衍生的DC(MDDC)、T细胞母细胞(TCB)、B类淋巴母细胞细胞系(BLCL)和单核细胞-巨噬细胞(Bancherau 1998；Bell 1999)。另外，当内皮细胞被炎症细胞因子激活它也可以获得APC的功能(Pober 1988)。在这些炎症细胞因子当中，白细胞介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)γ是内皮细胞激活的关键(Pober 1988)。使内皮细胞暴露于这些细胞因子可以提高其α5β1和αvβ3的表达，它们是几个结合Tat的细胞表面受体中的两个(Barillari 1993；Fiorelli 1999；Benelli1998；Kolson 1993；Sabatier 1991；Vogel 1993；Boykins 1999；Ganju1998；Milani 1996；Mitola 1997和2000；Weeks 1993；Albini 1996和1998；Chang 1997；Lafrenie 1996；Morini 2000；Rusnati 1998)。在所有的APC中，DC是最有效的APC，并且是诱导针对感染和肿瘤免疫应答的关键(Banchereau 1998；Bell 1999)。它们的功能与MHC和协同刺激分子(CD40，CD80，CD86)的高表达以及β-趋化因子和已知激活T淋巴细胞的细胞因子的产生有关。在遭遇抗原后，DC经历以协同刺激分子表达增加以及它们吞噬和胞饮能力的减弱为特征的成熟过程(Banchereau 1998；Bell 1999)。此外，由于归巢受体CCR7的上调，和CCR5的下调，成熟的DC迁移至淋巴结，在此它们将抗原呈递给T淋巴细胞(Banchereau 1998；Bell 1999)。
现有技术表明，向DC添加Tat蛋白阻断这些细胞的胞外钙流入、白细胞介素12的产生以及对凋亡小体的摄取(Zocchi 1997；Rubartelli-1997)。结果预计将会对重要的DC功能，包括抗原摄取、加工和呈递以及Th-1应答的诱导，产生很大损伤。
此外，已经报道了由于暴露于Tat在外周血单核细胞中的吞噬溶酶体融合的损伤，暗示在这种细胞类型中的杀灭微生物和抗原加工(和呈递)功能的损伤(Pittis 1996)。此外，有报道Tat诱导单核细胞/巨噬细胞和淋巴细胞分泌IL-10(Masood 1994；Badou 2000)，尽管在单核细胞中抑制IL-12的产生(Ito 1998)。最后，有报道将APC暴露于Tat会损伤它们组织细胞团以及正常激活T细胞的能力(Mei 1997)。此外，现有技术表明Tat也极大的损伤T细胞的功能，包括对促细胞分裂原抗-CD3或特异抗原的应答的抑制(Viscidi 1989；Benjouad 1993；Subramanyam 1993；Chirmule 1995；Wrenger 1996；Wrenger 1997；Zagury 1998)、T细胞超活化(Ott 1997；Li1997)和T细胞程序性死亡(Westendorp 1995；Li 1995；McCloskey 1997)。此外，有报道，具生物活性Tat的接种是体内免疫抑制的(Cohen 1999)。Tat对免疫系统的部分效应与Tat对趋化因子受体CCR5和CXCR4(Huang 1998；Secchiero 1999)的上调、或Tat与由免疫细胞以及内皮细胞表达的趋化因子受体CCR2和CCR3(Albini 1998a)或其它受体包括CD26(Gutheil 1994)、Flt-1(Mitola 1997)、KDR(Albini 1996；Morini 2000)的直接相互作用有关。因此，根据现有技术Tat被认为驱动Th-2型免疫应答和/或干扰或废除正常的APC功能和T细胞活化。
相反，我们的得到本申请中展示的试验证明支持的、新的意外发现表明，(i)APC由在皮-纳摩尔浓度下选择性识别并进入细胞的Tat特异靶向，但是这需要天然、基本上是单体的具生物活性Tat通过TatRGD序列与α5β1、αvβ3整合素之间的相互作用；(ii)且天然、基本上是单体的具生物活性Tat激活，而不是抑制，APC的功能并诱导，而不是抑制，针对其自身、更重要的是其它抗原的Th-1型免疫应答。特别的，我们的数据显示，Tat不仅作为抗原也作为具有潜在免疫调节特性的佐剂起作用。Tat的这些特性，即在皮摩尔-纳摩尔浓度下被APC作为具生物活性蛋白质而选择性内化并作为佐剂，确实彼此相关。尤其，我们发现，Tat RGD序列是活性Tat通过α5β1和αvβ3整合素受体被这些细胞内化的关键。实际上，阻断这些整合素的抗体或竞争剂配体各自完全废除或极大的降低了对皮摩尔-纳摩尔浓度下的Tat的摄取。这种摄取是很迅速的，是剂量-、细胞成熟/分化-和时间-依赖的。甚至更意想不到的是，我们用其它APC，包括单核细胞、T细胞母细胞、或B细胞母细胞或未激活内皮细胞，没有获得相似的结果。因此，这些发现是全新的，因为现有技术表明Tat只在非常高的浓度(微摩尔范围)下通过其碱性区域、经非受体介导的途径被摄取(Frankel 1988；Mann1991；Rusnati 1998；Tyagi 2001)。这一内化途径发生于任意细胞类型，而且不是细胞成熟/分化-依赖的。
此外，我们发现为观察到上述所有新效果Tat处于其天然、基本上是单体并具生物活性的形式是绝对需要的，当Tat被氧化或失活时这些效果不会发生。实际上，Tat有7个半胱氨酸而且对氧化作用非常敏感，发生氧化将导致天然蛋白构象的丧失以及随之发生的生物活性的丧失(Frankel 1989)。因此，如果用不是为保持该蛋白的天然形式而特别设计的程序进行纯化时，Tat可能会失去天然构象和活性。尽管本领域既定概念声明具生物活性Tat是有毒性的(Gallo 1999；Sabatier 1991；Kolson 1993；Westendrop 1995；Purvis 1995)，相反，本发明人使用的高度纯化、具生物活性重组Tat制品对内皮细胞、DC、巨噬细胞、其它被测试的细胞类型既无毒性也没有前凋亡效应，在小鼠和猴子体内也没有(Ensoli 1994；Barillari 1999a；Zauli 1993，1995a和1995b；Cafaro 1999，2000和2001)。
因此，本发明人认为，包含RGD区域的、源于任一HIV变体的、全长、野生型、天然、基本上是单体的具生物活性Tat或其片段或衍生物可以被用作对表达被Tat RGD区域识别的整合素的特异细胞类型选择性靶向并运送分子的高效系统(Barillari 1993，1999a和199b；Ensoli1994)。本发明人相信，如果DC、巨噬细胞和内皮细胞在人体内有非常大量且遍在的分布，包含RGD序列、具生物活性Tat或其片段或衍生物的靶向这些APC并驱动Th-1型细胞应答的能力将提供独一无二的机会，以1)在本发明的运送系统实施方式中，向具有Tat的特异靶物质、并在传染病、病理血管发生、炎症疾病和肿瘤中被招募和激活的这些细胞类型运送货物分子；2)在本发明的疫苗-佐剂和免疫调的实施方式中诱发不仅针对Tat还针对被或和Tat运送的其它抗原的潜在的免疫应答。这一想法得到本发明人先前成功将具生物活性Tat用作控制HIV复制和阻断疾病发生的疫苗的工作(Cafaro 1999；Cafaro 2000；Cafaro2001，和PCT WO99/27958)的强有力支持，与失活的Tat蛋白相对(Goldstein 2000；Pauza 2000)。
本专利申请与我们以前的专利申请WO 99/27958相比，在许多方面都是具有本质不同且创新的。实际上，以上述及的申请请求保护用作针对HIV/AIDS有效的疫苗的生物活性Tat或Tat编码DNA。在所述专利申请提交之时以下对我们来说是未知的：小(皮摩尔-纳摩尔)量包含RGD区域、具生物活性Tat或其片段或衍生物，(i)特异靶向APC，并且因此我们可能没有请求保护其作为载体向它们选择性运送货物分子的用途；(ii)导致EC和DC细胞成熟和活化并诱导针对不同抗原的Th-1型免疫应答，并且因此我们可能没有请求保护其作为佐剂和免疫调节剂的用途。
因此，本发明中具生物活性Tat，在第一实施方式中，被用作运送系统，向APC运送(i)用于针对不同传染病(不仅是HIV/AIDS)和肿瘤的免疫接种、或针对一或多种传染病的多价免疫接种的不同抗原或抗原组合，和(ii)用于治疗传染性的、炎症及血管生成疾病和肿瘤生长和转移的治疗性分子；和在第二实施方式中，具生物活性Tat被用作佐剂以驱动T-细胞介导的、针对不同抗原的免疫应答，特别是通过将具有弱免疫原性的抗原(例如那些由某些细胞内病原体以及肿瘤细胞表达的抗原)与包含RGD区域、具生物活性Tat或其片段或衍生物结合或融合来增强它们的免疫原性。
总之，使之与现有技术存在差别的最重要的创新方面是，在此天然、基本上是单体的具生物活性Tat请求被保护作为一种发挥不同功能的分子，即它是向APC选择性运送抗原或向特异组织运送活性化合物的分子以及是其它抗原刺激免疫应答的佐剂。这一预想不到的特性使得天然、基本上是单体的具生物活性Tat适合在不同的传染病(不仅是AIDS)、炎症及血管生成疾病和肿瘤中的不同应用。
因此，本发明人相信天然、基本上是单体、包含RGD区域的具生物活性Tat、其片段或衍生物，具有以下至少一种作用：作为向特异APC的运送系统或作为佐剂，并请求其可以被开发用于预防和治疗性免疫接种和/或预防和治疗HIV/AIDS、其它传染病、炎症及血管生成疾病的药物运送。
发明概述
本发明的一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性HIV-1Tat、其片段或衍生物选择性靶向表达α5β1和αvβ3整合素的抗原呈递细胞的用途。
本发明的另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性HIV-1Tat、其片段或衍生物选择性靶向由抗原呈递细胞(包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞)表达的α5β1和αvβ3整合素以由这些细胞摄取Tat、片段或其衍生物的用途。
本发明的另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性HIV-1Tat、其片段或衍生物选择性靶向表达α5β1和αvβ3整合素的抗原呈递细胞(包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞)，以通过Tat、其片段或衍生物诱导这些细胞的成熟和/或抗原抗原呈递功能的用途。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性HIV-1 Tat、其片段或衍生物结合一个或多个治疗抗原，包括但不限于以多肽、蛋白质或编码它们的DNA的形式的来源于细胞内病原体(例如病毒、结核分枝杆菌，念珠菌属，疟疾)和肿瘤细胞的抗原(例如那些源于自肺、结肠、乳腺、前列腺癌的抗原)，在体外和体内选择性靶向表达α5β1和αvβ3整合素的抗原呈递细胞(包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞)，用于预防和治疗性免疫接种或传染性疾病和肿瘤的的用途。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性Tat、其片段或衍生物在体外和体内向表达α5β1和αvβ3整合素的抗原呈递细胞(包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞)，选择性运送一个或多个抗原，以诱导对预防和治疗性免疫接种或对传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的治疗的免疫应答的用途。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性Tat、其片段或衍生物，在细胞间或向细胞膜，在体外和体内，向表达α5β1和αvβ3整合素的抗原呈递细胞(包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞)，选择性运送带或不带支持物颗粒(例如但不限于，微米颗粒、纳米颗粒、脂质体和其它颗粒化的运送系统，例如在Speiser 1991和Takeuchi 2001中描述的)的一个或多个抗原或治疗性化合物(例如但不限于，抗病毒化合物，抗-炎症药物、抗-血管生成分子、细胞毒性抗-肿瘤药物或免疫调节分子例如趋化因子或细胞因子、或抗体)，用于预防和治疗性免疫接种或对传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的治疗的用途。
另一个目的是，与其它蛋白质或多肽或支持物颗粒(如上所述)融合的、天然、基本上是单体的具生物活性Tat、其片段或衍生物，在体外和体内向表达α5β1和αvβ3整合素的抗原呈递细胞(包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞)，选择性运送抗原或治疗性化合物(如上所述)，用于结合预防和治疗性免疫接种或对传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的治疗的用途。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性Tat、其片段或衍生物，在体外和体内选择性靶向表达RGD-结合的整合素受体的细胞，例如抗原呈递细胞和其它能经由整合素介导的途径和/或其它基于与整合素受体结合的途径来摄取Tat的细胞类型，以运送抗原或治疗性分子(如上所述)，用于预防和治疗性免疫接种或对传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的治疗的用途。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性Tat、其片段或衍生物，与抗原、佐剂(例如但不限于Alum，RIBI，ISCOMS，CpG序列，脂肽)或治疗性分子或支持物颗粒(如上所述)组合，通过非胃肠道(皮下、肌内、皮内)或粘膜(阴道、直肠、口、鼻)或局部给药，用于预防和治疗性免疫接种或对传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的治疗的用途。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性Tat、其片段或衍生物，在体外和体内选择性向表达RGD-结合的整合素受体的抗原呈递细胞(包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞)，运送在支持物颗粒(如上所述)内或与之附着的抗原或治疗性分子(如上所述)，用于预防和治疗性免疫接种或对传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的治疗的用途。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性Tat、其片段或衍生物，在体外和体内选择性向表达RGD-结合的整合素受体的抗原呈递细胞(包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞)，在有或没有支持物颗粒(如上所述)存在下运送表达载体，包括表达一或多个抗原的质粒DNA和细菌或病毒载体，用于预防和治疗性免疫接种或对传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的治疗的用途。
另一个目的是，tat DNA或天然、基本上是单体的具生物活性Tat蛋白、其片段或衍生物，与编码抗原的DNA融合或结合，带或不带支持物颗粒(如上所述)，用于联合预防和治疗性免疫接种或对传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的治疗的用途。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性HIV Tat或tatDNA、其片段或衍生物，其与抗原、治疗性分子(如上所述)、佐剂(如上所述)、或支持物颗粒(如上所述)组合或融合，这样的组合或融合被定义为通过化学或物理的相互作用、或其它任意相互作用的联合，以任意组合，例如但不限于，Tat和DNA质粒在纳米颗粒上吸附；在同一药物制剂中包含Tat和合成药物；通过化学交联或其它方式的Tat、其片段或衍生物与一种肽的结合；在细菌或真核细胞中表达嵌合DNA实现的Tat、其片段或衍生物与另一种蛋白质或另一种肽的融合，其中编码上述多肽的DNA序列已经通过重组DNA技术融合到一起。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性HIV-1 Tat、其片段或衍生物作为在体外和体内激活或增强体外和体内表达RGD-结合的整合素受体的细胞(包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞)的抗原呈递功能的佐剂以诱导针对HIV/AIDS或其它传染性疾病和肿瘤的Th-1型免疫应答的用途。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性Tat蛋白、tatDNA、其片段或衍生物如上所述通过非胃肠道(皮内、皮下、肌内)或粘膜(阴道、直肠、口、鼻)或局部给药，在免疫接种或治疗性处理中的用途。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性Tat的片段，其定义为、源自任一HIV变体(HIV-1、HIV-2和其它类型或亚型)的Tat肽，包含单独或联合的RGD结构域(HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa73至86；aa74至84；aa75至83；aa76至82；aa77至81；aa77至82；aa77至83；aa76至83)、半胱氨酸富集结构域(HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa 22至37)、碱性结构域(HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa 48至61)，结合了或未结合其它包括核心结构域(HTLV-IIB，克隆BH-10中的aa38至47)和/或氨基末端区域(HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa1至20)的HIV-1 Tat肽。
另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性Tat的片段，被定义为源自任一HIV变体(HIV-1、HIV-2和其它类型和亚型)的核苷酸序列，包含单独或联合的RGD结构域(编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa73至86的序列；编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa74至84的序列；编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa75至83的序列；编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa76至82的序列；编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa77至81的序列；编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa77至82的序列；编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa77至83的序列；编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa76至83的序列)、半胱氨酸富集结构域(编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa22至37的序列)、碱性结构域(编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa48至61的序列)，结合了或未结合其它包括核心结构域(编码HTLV-IIB，克隆BH-10中的aa38至47的序列)和/或氨基末端区域(编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中的aa1至20的序列)的HIV-1 Tat肽。
另一个目的是，在其氨基酸序列(HTLV-IIIB，克隆BH-10或89.6)中包含一或多个T-细胞表位的源自任一HIV变体(HIV-1、HIV-2和其它HIV类型和亚型)的Tat片段。
另一个目的是，在其核苷酸序列(HTLV-IIIB，克隆BH-10或89.6)中包含一或多个T-细胞表位的源自任一HIV变体(HIV-1、HIV-2和其它HIV类型和亚型)的Tat片段。
另一个目的是Tat衍生物其包含变体HTLV-IIIB，克隆BH-10的Tat突变体，选自具有以下核苷酸序列或其部分的衍生物：cys22突变的核苷酸序列和lys41的核苷酸序列。
另一个目的是Tat衍生物包含变体HTLV-IIIB，克隆BH-10的Tat突变体，选自具有以下氨基酸序列或其部分的衍生物：cys22突变的氨基酸序列和lys41的氨基酸序列。
本发明的另一个目的是，天然、基本上是单体的具生物活性Tat蛋白如上所述起作用并组合以用于生产治疗在传染性疾病、炎症及血管生成疾病、肿瘤这一组中的疾病的药物的用途。
根据发明详述进一步的目的将是明显的。
附图简要说明
附图1.天然、基本上是单体的具生物活性Tat以剂量-和时间-依赖的形式被MDDC有效的选择性摄取，但是不被BLCL或TCB摄取，如附图1A、附图1B、附图1C′和附图1C″所示。
附图2.MDDC对天然、基本上是单体的具生物活性Tat的摄取随着细胞成熟而增加，并且该摄取由于蛋白质的氧化/失活而消失，如附图2A和附图2B所示。
附图3.抗-α5β1和抗-αvβ3抗体阻断MDDC对天然、基本上是单体的具生物活性Tat的摄取，如附图3A和附图3B中所示。
附图4.纤连蛋白和玻连蛋白阻断MDDC对天然、基本上是单体的具生物活性Tat的摄取，如附图4A和附图4B中所示。
附图5.天然、基本上是单体的具生物活性Tat以剂量-和时间-依赖的形式被巨噬细胞有效的摄取，但是不被单核细胞摄取，如附图5A、附图5B和附图5C中所示。
附图6.所使用的HIV-1 Tat蛋白及其功能结构域和Tat肽序列的示意图，如附图6A，附图6B和附图6C中所示。
附图7.具有RGD或碱性区域的Tat肽对天然、基本上是单体的具生物活性Tat的摄取具有不同的影响，如附图7A、附图7B、附图7C和附图7D中所示。
附图8.罗丹明染色的Tat被已由细胞因子激活的内皮细胞以剂量-依赖的形式摄取，但是不被未激活细胞摄取，如附图8A、附图8B、附图8C和附图8D中所示。
附图9.已被细胞因子激活的内皮细胞摄取100ng/ml罗丹明染色的Tat的时程，如附图9A、附图9B、附图9C和附图9D中所示。
附图10.已被细胞因子激活的内皮细胞摄取1μg/ml罗丹明染色的Tat的时程，，如附图10A、附图10B、附图10C和附图10D中所示。
附图11.被细胞因子激活的内皮细胞与未激活细胞对天然、基本上是单体的具生物活性Tat蛋白的摄取的剂量-应答分析。
附图12.已被细胞因子激活的内皮细胞对天然、基本上是单体的具生物活性Tat的摄取的剂量和时程分析。
附图13.用未标记Tat蛋白对已被细胞因子激活的内皮细胞对10ng/ml罗丹明染色Tat摄取的抑制，如附图13A、附图13B和附图13C中所示。
附图14.用α5β1和αvβ3-整合素受体的抗体对已被细胞因子激活的内皮细胞对10ng/ml罗丹明染色Tat摄取的抑制，如附图14A、附图14B、附图14C、附图14D和附图14E中所示。
附图15.用α5β1和αvβ3-整合素受体的抗体对已被细胞因子激活的内皮细胞对100ng/ml罗丹明染色Tat摄取的抑制，如附图15A、附图15B、附图15C、附图15D和附图15E中所示。
附图16.当细胞与Tat温育15分钟时，对1μg/ml罗丹明染色的Tat的摄取被抗-α5β1和抗-αvβ3的抗体部分抑制，如附图16A、附图16B、附图16C和附图16D中所示。
附图17.当细胞与Tat温育60分钟时，对1μg/ml罗丹明染色的Tat的摄取不被抗-整合素抗体抑制，如附图17A、附图17B和附图17C中所示。
附图18.天然、基本上是单体的具生物活性Tat增强MDDC的细胞因子IL-12及TNF-α和β-趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES的产生，如附图18A、附图18B、附图18C和附图18D中所示。
附图19.天然、基本上是单体的具生物活性Tat增强MDDC的同种并型抗原呈递。
附图20.天然、基本上是单体的具生物活性Tat提高MDDC将破伤风毒素(TT)，特异呈递至经初次免疫刺激的PBL从而增强特异T细胞应答，如附图20A、附图20B和附图20C中所示。
附图21.用于评估天然、基本上是单体的具生物活性Tat作为佐剂作用的初次免疫刺激-再次刺激(prime-boost)疫苗方案的示意图。
附图22.与单独用Gag接种的小鼠相比，用Gag和Tat对小鼠进行免疫接种诱导更高水平的针对Gag的抗体应答。
附图23.与单独用Gag接种的小鼠相比，用Gag和Tat对小鼠进行免疫接种诱导更高水平的抗-Gag细胞溶解活性。
发明详述
根据WO 99/27958具生物活性HIV-1 Tat被定义为一种能：1)进入激活的内皮细胞或DC中并定位在其核上；2)激活KS细胞和被细胞因子激活的内皮细胞的增殖、迁移和入侵；3)当被加入感染细胞时激活病毒复制，通过测定a)加入外源蛋白质后Tat缺陷的前病毒在HLM-1细胞中的拯救(rescue)和/或b)用HIV-1启动子-报告基因质粒转染的细胞中HIV-1基因表达的反式激活；和4)在血管生成因子或炎症因子存在下在小鼠中诱导KS样损伤(KS-like lesions)的发展的蛋白质。
如在此所使用的，术语“天然的”特定的确定Tat为处于其天然状态，即非变性构象和指通过常规重组DNA技术在利用Tat可以结合肝素的能力的这一技术在非变性条件下纯化获得的一种分离的Tat蛋白(在现有技术中已知并在说明书中被详细讨论)。
如在此所使用的，术语“基本上是单体的”是指这样一个事实，HPLC分析测定如上所述获得的Tat蛋白主要(＞95％)是单体形式的，相对于聚合形式。
如在此所使用的，术语“具生物活性”是指如上所述获得的Tat蛋白并能够1)在高于10nM浓度下进入激活的内皮细胞或树突细胞，和2)起至少一种以下作用：i)激活卡波西肉瘤(KS)细胞和被细胞因子激活的内皮细胞的增殖、迁移和入侵；ii)当被加入感染细胞时激活病毒复制，通过测定a)加入外源蛋白质后Tat缺陷的前病毒在HLM-1细胞中的拯救和/或b)用HIV-1启动子-报告基因质粒转染的细胞中HIV-1基因表达的反式激活；和iii)在血管生成因子或炎症因子存在下在小鼠中诱导KS样损伤的发展。
如在此所使用的，术语“DC成熟”是指一种导致DC的胞饮/吞噬作用活性和抗原摄取进行性减少、及伴随的DC加工和呈递抗原能力增加的过程，该过程伴随着DC成熟标志分子的表达[(HLA)-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD86和CD83]和细胞因子及趋化因子的产生(IL-12和TNF-α、RANTES、MIP-1α、MIP-1)。
如在此所使用的，术语“抗原呈递细胞的激活”是指导致免疫应答的初次免疫刺激-和再次刺激(priming-and boosting)增强的摄取、加工和/或呈递抗原能力的诱导或提高，该过程伴随着协同刺激分子[(HLA)-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD86和CD83，ICAM-1]的表达和细胞因子及趋化因子的产生(IL-12和TNF-α、RANTES、MIP-1α、MIP-1)。
如在此所使用的，术语“佐剂”是指当与抗原一起被导入宿主后通过几种机制(包括例如，如上述定义的DC成熟的诱导和/或APC的激活)增强针对抗原的免疫应答的任何物质。
基于与以前的技术相比被认为是新颖且预料不到的新资料，简要描述如下，我们请求保护使用具生物活性Tat、其片段或衍生物作为一种系统，其凭借其固有的及相关的新特性可以表现以下至少一种或两者特征：运送系统和佐剂。
如果Tat蛋白被氧化和/或失活，则其不适合用作本发明目的。事实上，只有具生物活性、而非氧化的或失活的Tat蛋白被MDDC、巨噬细胞和被细胞因子激活的内皮细胞以剂量-、时间-和成熟/分化-依赖的方式有效、迅速和选择性的摄取。对Tat的摄取依赖蛋白质浓度通过至少两种途径发生。在皮摩尔-纳摩尔(0.01-1000ng/ml)Tat浓度下，对Tat的摄取主要由α5β1和αvβ3受体通过与蛋白质RGD序列的相互作用介导，而在更高的Tat浓度下一条由Tat碱性区域与HSPG结合介导的整合素-非依赖的途径占主导地位。只有用这些APC，而不是TCB、BLCL、单核细胞或未激活的内皮细胞，才观察到对Tat的有效摄取。摄取之后Tat诱导MDDC的成熟和激活，包括MHC和协同刺激分子表达的提高，以及Th-1细胞因子(TNF-α、IL-12)和β-趋化因子[Rantes，巨噬细胞炎症蛋白质(MIP)-1α，MIP-1β]的产生。当Tat被氧化和失活时所有这些效果都丧失了。进一步，活性Tat，而不是其氧化等同物，增强MDDC的同种异型呈递和抗原特异呈递，提高针对异种抗原的T细胞-特异免疫应答。因此，由于其靶向及有效进入特异抗原呈递细胞、增强它们的功能及驱动Th-1特异免疫应答的能力，活性Tat促进其自身及其它抗原的呈递和特异免疫应答的诱导，并且也可以被用于向这些细胞选择性运送活性分子。
基于这些新资料以及Tat具有下文所述的活性(i)至(vi)，我们请求保护，活性Tat作为能够向包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞的抗原呈递细胞选择性运送抗原或其它活性分子的运送系统，以及作为能够通过对最有效的抗原呈递细胞的特异靶向和提供驱动特异免疫应答来诱导针对抗原的Th-1免疫应答的佐剂起作用。因此，具生物活性Tat不仅可以被用作抗原，还可以被用作其它抗原的Th-1型佐剂以诱导针对病原体或肿瘤的免疫应答，以及作为DC、巨噬细胞和激活的内皮细胞的运送系统用于针对感染、血管发生、炎症疾病和肿瘤的治疗性干涉。
根据本发明，Tat被用作向特异抗原呈递细胞(包括DC、巨噬细胞和细胞因子激活的内皮细胞)选择性运送抗原和其它活性分子的运送系统以诱导针对抗原的免疫应答、辅助针对抗原的免疫应答以预防性或治疗性免疫接种或对传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤的治疗。为便于介绍本发明的几个方面将在下面分别描述。
发明人首先发现MDDC具有特异有效摄取溶解的皮摩尔-纳摩尔浓度下的活性Tat的能力，并发现这是一个依赖于向细胞添加的Tat浓度而在5至10分钟后出现峰值的非常迅速的过程。相反，TCB或BLCL对活性Tat的摄取却很弱，需要微摩尔浓度的Tat(10μg/ml)及更长的温育时间，而且甚至在这些条件下大部分Tat仍保持在细胞表面而不进入细胞。进一步，温育30分钟后细胞内染色的减少表明，活性Tat也被MDDC迅速加工。
与用1或10μg/ml的Tat与未成熟细胞观察到的值相比，用低浓度的Tat(100ng/ml)观察到的细胞内染色值表明成熟的MDDC能比未成熟细胞有效10至100倍的摄取。此外，Tat摄取需要蛋白质的活性构象和完全具生物活性。事实上，由暴露于光和空气造成的Tat的氧化和失活废除或显著降低(大约100倍)了观察到的MDDC对活性Tat的摄取。有趣的是，用氧化的Tat观察到的MDDC的摄取类型与TCB和BLCL对活性Tat的摄取类型相似或相一致。
综合这些资料表明，活性Tat靶向MDDC，而且MDDC对Tat的选择性和有效摄取不是由这些细胞的高胞饮/吞噬作用活性介导的，但是它需要由未成熟MDDC表达的以及成熟MDDC以更高水平表达的特别的摄取途径。进一步，用MDDC在低与高Tat浓度下观察到的不同的摄取表明至少存在两种不同摄取途径，第一种非常有效的出现在皮摩尔-纳摩尔的Tat浓度下，而另一种在更高(微摩尔)的Tat浓度下。事实上，发明人发现对低浓度Tat的摄取是由特异结合Tat的RGD区域的整合素(α5β1，αvβ3)通过受体-介导的内化途径介导的，而在高Tat浓度下摄取是由结合HSPG的Tat碱性区域介导的。单核细胞摄取Tat不是有效的，而巨噬细胞以与DC更接近的剂量和时间动力学更有效摄取Tat，表明单核细胞向DC或巨噬细胞的分化诱导选择性的和有效的Tat摄取机制。类似地，发明人发现被IFNγ、IL-1β和TNF-α激活的内皮细胞，而不是未激活细胞，非常有效的结合和摄取活性Tat，并且是以与MDDC相似的方式。激活的内皮细胞对Tat的摄取也经由结合α5β1和αvβ3整合素[玻连蛋白(VN)和纤连蛋白的(FN)典型受体]的Tat RGD结构域发生，而在高Tat浓度下经由结合细胞表面和细胞外基质的HSPG Tat的碱性区域发生。整合素拮抗剂也阻断内皮细胞对皮-纳摩尔但是不是更高浓度的Tat的摄取。类似地，对皮-纳摩尔浓度Tat的摄取被含有RGD序列的Tat肽抑制，然而对更高浓度的Tat的摄取被含有蛋白质的碱性区的肽抑制。
因此，至少存在两种Tat摄取途径：第一种经由RGD区域与整合素的结合，其被用于皮-纳摩尔浓度的活性Tat并被整合素竞争剂阻断；而摄取Tat的第二种途径是一种相对较低的亲和性途径，它不被整合素拮抗剂阻断，只有在高外源Tat的浓度下和/或细胞与Tat的温育时间延长时才占主导地位，它被Tat碱性肽阻断并出现在所有细胞类型中。第二种途径通过与一个低亲和性位点结合，例如Tat碱性区域与细胞表面HSPG的相互作用，可能与以前观察到的受体-非依赖途径一致(Allen2000；Barillari 1999b)。因此，Tat RGD区域选择性靶向表达RGD-结合整合素受体的细胞，例如DC、内皮细胞和巨噬细胞。进一步，活性Tat通过这一特异途径被非常有效的摄取。
对这一特异途径本发明人是指需要1)至少一个(RGD)或两个Tat结构域(碱性和RGD)、2)蛋白质的生物活性、3)蛋白质的天然构象，基本处于单体形式、及4)整合素膜受体的途径。相反，用TCB、BLCL和单核细胞或未激活内皮细胞观察到极少或没有摄取，表明Tat可以靶向特异细胞类型并向它们选择性运送抗原或货物，其在针对病原体和肿瘤的免疫应答或对炎症及血管生成疾病和肿瘤的治疗中是关键。
本发明人强调，具生物活性Tat，而非氧化Tat，与特异整合素受体结合后进入DC、内皮细胞和巨噬细胞，且甚至更重要的是，促进MDDC成熟和发挥功能。事实上，活性Tat诱导MDDC上的人白细胞抗原(HLA)-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD86和CD83表面表达剂另依赖性增加。用活性Tat观察到了这种效应，但是氧化的或失活的Tat没有。此外，活性Tat诱导驱动Th-1型应答必需的细胞因子IL-12和TNF-α(Romagnani 1997)，以及淋巴细胞应答效应器阶段的重要活动者(Moser 2001)β-趋化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β的生成剂量-依赖性增加。重要的是，在两种情况中这些水平都是与那些由已知的激活剂LPS诱导的水平相当。而且，氧化的和未激活的Tat未诱导这些效应。活性Tat也提高MDDC的抗原呈递功能，其加强T细胞对同种异型和回忆抗原的增殖反应。组合这些特性表明，活性Tat不仅是抗原也是一种潜在的T细胞佐剂和针对特异细胞的运送系统。本发明人相信，这一特征在诱导免疫应答的特异类型(Th-1)和提高针对异种抗原的应答中具有重要作用。这也解释了为什么用未激活Tat进行的免疫接种在体内诱导不同的、无保护性的免疫应答。由于Th-1应答和CTL的诱导控制细胞内病原体的感染和肿瘤生长，呈现的资料显示，天然Tat蛋白或tat DNA可以被开发用于驱动或增强Th-1免疫应答和也能针对其它HIV抗原或非HIV抗原的CTL活性，以支持有效且长时间持续的免疫性，用于预防或治疗性免疫接种以及向DC、激活的内皮细胞和巨噬细胞选择性运送活性分子，用于传染性疾病、炎症和血管生成疾病或肿瘤治疗。实际上，被激活的内皮细胞以及巨噬细胞和DC出现在炎症和血管增生疾病、肿瘤和传染性疾病中，它们具有能够向它们选择性运送抗原、抑制化合物或任何对预防或治疗性免疫接种或治疗或诊断目的有用的分子的Tat的特异靶位。
因此根据本发明人，与其它分子(包括蛋白质、肽、核酸或支持物颗粒)联合的具生物活性HIV-1 Tat及其衍生物或片段可以被用于：
●在体外和体内向表达α5β1和αvβ3整合素的抗原呈递细胞(包括DC、内皮细胞和巨噬细胞)选择性运送抗原或活性化合物，目的是诱导预防和治疗性免疫接种或对传染性疾病、炎症及血管生成疾病和肿瘤治疗的免疫应答。
●作为佐剂，以在体外和体内激活或增强表达α5β1和αvβ3整合素的细胞(包括DC、激活的内皮细胞和巨噬细胞)的抗原呈递功能，并诱导针对HIV/AIDS、其它传染性疾病和肿瘤的Th-1型免疫应答。
根据本发明，生物活性形式的HIV-1 Tat蛋白具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO.2)：
NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTA CTNCYCKKCCFHCQVCFITKALGISY
GR KKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQS RGDPTGPKE-COOH
生物活性形式的HIV-2 Tat蛋白具有以下氨基酸序列，其中已经插入RGD序列，例如但不限于，在原始序列的氨基酸92和93之间的位置(SEQ ID NO.100)：
NH2-METPLKAPESSLKSCNEPFSRTSEQDVATQELARQGEEILSQLYRPLET C
NNSCYCKRCCYHCQMCFLNKGLGICYE RKGRRRRTPKKTKTH RGDPSPTPDKS
ISTRTGDSQPTKKQKKTVEATVETDTGPGR-COOH
或第105位的苏氨酸被去除(SEQ ID NO.102)：
NH2-METPLKAPESSLKSCNEPFSRTSEQDVATQELARQGEEILSQLYRPLET C
NNSCYCKRCCYHCQMCFLNKGLGICY ERKGRRRRTPKKTKTHPSPTPDKSISTR
GDSQPTKKQKKTVEATVETDTGPGR-COOH
和任一HIV-1和HIV-2亚型的、任何其它具有与SEQ ID NO.2、100或102的同源性大于50％(优选大于60％，更优选大于70％，更优选大于80％，更优选大于90％)的序列的Tat变体；
并处于基本上是单体的形式，能够在皮摩尔至纳摩尔浓度(从0.01ng/ml至1μg/ml，优选0.1ng/ml至100ng/ml)下并符合至少一种以下标准：
(i)在皮摩尔-纳摩尔浓度(0.01至1000ng/ml)下并暴露于细胞5-10分钟可以被抗原呈递细胞(包括DC、内皮细胞和巨噬细胞)选择性和有效的摄取。
(ii)在皮摩尔-纳摩尔浓度下促进被细胞因子激活的内皮细胞的迁移(招募)、入侵和生长。
(iii)在纳摩尔浓度下反式激活HIV基因表达或拯救Tat-缺陷的HIV前病毒。
(iv)激活DC的成熟和抗原呈递功能。
(v)被添加至抗原呈递细胞后，提高T-细胞介导的免疫应答，包括T-辅助细胞和/或针对其自身或异种抗原的细胞毒性活性。
(vi)通过添加至效应细胞来提高T-细胞介导的免疫应答，包括T-辅助细胞和/或针对其自身或异种抗原的细胞毒性活性。
优选应当符合标准(i)或(ii)，优选两者，更优选应当符合标准(i)或(ii)或两者与标准(iii)a)和/或(iii)b)组合。当符合所有的标准(i)至(vi)时可以得到最好的结果。
根据本发明，HIV-1 tat DNA是指以下核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTC
AGCCTAAAACTGCT TGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCC
AAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGG AAGAAGCG
GAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTA
TCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCC CGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAA
TGA3’
且HIV-2 tat DNA是指以下核苷酸序列，其中插入了编码RGD的序列，例如但不限于，在原始序列的核苷酸276和277之间的位置(SEQID NO.99)：
5’ATGGAGACACCCTTGAAGGCGCCAGAGAGCTCATTAAAGTCCTGCAACG
AGCCCTTTTCACGCACTTCAGAGCAGGATGTGGCCACTCAAGAATTGGCCAG
ACAAGGGGAGGAAATCCTCTCTCAGCTATACCGACCCCTAGAAACA TGCAAT
AACTCATGCTATTGTAAGCGATGCTGCTACCATTGTCAGATGTGTTTTCTAAA
CAAGGGGCTCGGGATATGTTATGAA CGAAAGGGCAGACGAAGAAGGACTCC
AAAGAAAACTAAGACTCAT CGAGGGGACCCGTCTCCTACACCAGACAAATCC
ATATCCACAAGGACCGGGGACAGCCAGCCAACGAAGAAACAGAAGAAGACG
GTGGAAGCAACGGTGGAGACAGATACTGGCCCTGGCCGATAG 3’
或在位置322-324处编码苏氨酸的序列ACC已经被去除(SEQ IDNO.101)：
5’ATGGAGACACCCTTGAAGGCGCCAGAGAGCTCATTAAAGTCCTGCAACGA
GCCCTTTTCACGCACTTCAGAGCAGGATGTGGCCACTCAAGAATTGGCCAGA
CAAGGGGAGGAAATCCTCTCTCAGCTATACCGACCCCTAGAAACA TGCAATA
ACTCATGCTATTGTAAGCGATGCTGCTACCATTGTCAGATGTGTTTTCTAAAC
AAGGGGCTCGGGATATGTTATGAA CGAAAGGGCAGACGAAGAAGGACTCCA
AAGAAAACTAAGACTCATCCGTCTCCTACACCAGACAAATCCATATCCACA AG
GGGGGACAGCCAGCCAACGAAGAAACAGAAGAAGACGGTGGAAGCAACGGT
GGAGACAGATACTGGCCCTGGCCGATAG 3’
和任一HIV型和亚型的、任何其它具有与SEQ ID NO.1、99或101的同源性大于40％(优选大于50％，优选大于60％，更优选大于70％，更优选大于80％，更优选大于90％)的序列的Tat变体。
根据本发明，“具生物活性Tat的片段”被定义为Tat肽，其与DNA序列对应，源自仅包含RGD结构域或联合半胱氨酸富集结构域和/或碱性结构域和/或其它包括核心结构域和/或氨基末端区域的其它HIV-1Tat肽的任一HIV变体(HIV-1、HIV-2和其它型和亚型)，此处RGD结构域对应于编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中aa73至86的序列，作为参考，SEQ ID NO.3和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.4；编码aa74至84的序列，SEQ ID NO.5和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.6；编码aa75至83的序列，SEQ ID NO.7和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.8；编码aa76至82的序列，SEQ ID NO.9和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.10；编码aa77至81的序列，SEQ ID NO.11和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.12；编码aa77至82的序列，SEQ ID NO.13和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.14；编码aa77至83的序列，SEQ ID NO.15和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.16；编码aa76至83的序列，SEQ ID NO.17和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.18；半胱氨酸富集结构域对应于编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中aa22至37的序列，作为参考，SEQ ID NO.19和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.20；碱性结构域对应于编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中aa48至61的序列，作为参考，SEQ ID NO.21和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.22，核心结构域对应于编码HTLV-IIB，克隆BH-10中aa38至47的序列，作为参考，SEQ ID NO.23和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQ ID NO.24和氨基末端区域对应于编码HTLV-IIIB，克隆BH-10中aa1至20的序列，作为参考，SEQ ID NO.25和对应的氨基酸序列，作为参考，SEQID NO.26。
SEQ ID NO.3
5’CCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAA 3’
SEQ ID NO.4
PTSQSRGDPTGPKE
SEQ ID NO.5
5’ACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCG 3’
SEQ ID NO.6
TSQSRGDPTGP
SEQ ID NO.7
5’TCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGC 3’
SEQ ID NO.8
SQSRGDPTG
SEQ ID NO.9
5’CAATCCCGAGGGGACCCGACA 3’
SEQ ID NO.10
QSRGDPT
SEQ ID NO.11
5’ TCCCGAGGGG ACCCG3’
SEQ ID NO.12
SRGDP
SEQ ID NO.13
5’TCCCGAGGGGACCCGACA 3’
SEQ ID NO.14
SRGDPT
SEQ ID NO.15
5’TCCCGAGGGGACCCGACAGGC 3’
SEQ ID NO.16
SRGDPTG
SEQ ID NO.17
5’CAATCCCGAGGGGACCCGACAGGC 3’
SEQ ID NO.18
QSRGDPTG
SEQ ID NO.19
5’TGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGT 3’
SEQ ID NO.20
CTNCYCKKCCFHCQVC
SEQ ID NO.21
5’GGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGC 3’
SEQ ID NO.22
GRKKRRQRRRPPQG
SEQ ID NO.23
5’TTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTAT 3’
SEQ ID NO.24
FITKALGISY
SEQ ID NO.25
5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAG
TCAGCCTAAAACT 3’
SEQ ID NO.26
MEPVDPRLEPWKHPGSQPKT
根据本发明T-细胞表位优选为如下所列，在它们的核苷酸序列和对应的氨基酸序列中(HTLV-IIIB，克隆BH-10或89.6，作为参考)：
表位1(aa 1-20)：
5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCT
GGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACT 3’                       SEQ ID NO.27，
MEPVDPRLEPWKHPGSQPKT                       SEQ ID NO.28，
表位2(aa 11-24)：
5’TGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACT
GCTTGTACCAAT 3’                                                         SEQ ID NO.29，
WKHPGSQPKTACTN                             SEQ ID NO.30，
表位3(aa 21-40)：
5’GCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTG
TTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACA 3’             SEQ ID NO.31，
ACTNCYCKKCCFHCQVCFIT                    SEQ ID NO.32，
表位4(aa 36-50)：
5’GTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCAT
CTCCTATGGCAGGAAG 3’                                           SEQ ID NO.33，
VCFITKALGISYGRK                         SEQ ID NO.34，
表位5(aa 83-102)：
5’GGCCCGAAGGAACAGAAGAAGAAGGTGGA
GAGAGAGACAGAGACAGATCCGGTCCATCAG 3’            SEQ ID NO.35，
5GPKEQKKKVERETETDPVHQ                   SEQ ID NO.36，
表位6(aa 1-15)：
5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTG
GAAGCATCCAGGA 3’                                                 SEQ ID NO.37，
MEPVDPRLEPWKHPG                         SEQ ID NO.38，
表位7(aa 6-20)：
5’CCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAG
TCAGCCTAAAACT 3’                                                 SEQ ID NO.39，
PRLEPWKHPGSQPKT                         SEQ ID NO.40，
表位8(aa 11-25)：
5’TGGAAGCATCCAGGAAGTCAGCCTAAAACTG
CTTGTACCAATTGC 3’                                               SEQ ID NO.41，
WKHPGSQPKTACTNC                         SEQ ID NO.42，
表位9(aa 16-30)：
5’AGTCAGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTAT
TGTAAAAAGTGT 3’                                                   SEQ ID NO.43，
SQPKTACTNCYCKKC                         SEQ ID NO.44，
表位10(aa 21-35)：
5’GCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTG
CTTTCATTGCCAA 3’                                                       SEQ ID NO.45，
ACTNCYCKKCCFHCQ                            SEQ ID NO.46，
表位11(aa 26-40)：
5’TATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGT
TTGTTTCATAACA 3’                                                       SEQ ID NO.47，
YCKKCCFHCQVCFIT                            SEQ ID NO.48，
表位12(aa 31-45)：
5’TGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATAACAAAA
GCCTTAGGCATC 3’                                                         SEQ ID NO.49，
CFHCQVCFITKALGI                            SEQ ID NO.50，
表位13(aa 36-50)：
5’GTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTC
CTATGGCAGGAAG 3’                                                       SEQ ID NO.51，
VC FITKALGISYGRK                           SEQ ID NO.52，
表位14(aa 41-55)：
5’AAAGCCTTAGGCATCTCCTATGG CAG GAAGA
AGCGGAGACAGCGA 3’                                                     SEQ ID NO.53，
KALGISYGRKKRRQR                            SEQ ID NO.54，
表位15(aa 46-60)：
5’TCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGAC
GAAGACCTCCTCAA 3’                                                     SEQ ID NO.55，
SYGRKKRRQRRRPPQ                            SEQ ID NO.56，
表位16(aa 51-65)：
5’AAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAG
GCAGTCAGACTCAT 3’                                                     SEQ ID NO.57，
KRRQRRRPPQGSQTH                            SEQ ID NO.58，
表位17(aa 56-70)：
5’CGAAGACCTCCTGAAGGCAGTCAGACTCATCA
AGTTTCTCTATCA 3’                                                   SEQ ID NO.59，
RRPPQGSQTHQVSLS                          SEQ ID NO.60，
表位18(aa 61-75)：
5’GGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTATCAAAG
CAGCCCACCTCC 3’                                                     SEQ ID NO.61，
GSQTHQVSLSKQPTS                          SEQ ID NO.62，
表位19(aa66-80)：
5’CAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACCTCCCAA
TCCCGAGGGGAC 3’                                                     SEQ ID NO.63，
QVSLSKQPTSQSRGD                          SEQ ID NO.64，
表位20(aa 71-85)：
5’AAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCC
GACAGGCCCGAAG 3’                                                   SEQ ID NO.65，
KQPTSQSRGDPTGPK                          SEQ ID NO.66，
表位21(aa 76-90)：
5’CAGTCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGA
ACAGAAGAAGAAG 3’                                                   SEQ ID NO.67，
QSRGDPTGPKEQKKK                          SEQ ID NO.168，
表位22(aa 21-29)：
5’GCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAG 3’                 SEQ ID NO.69，
ACTNCYCKK                                SEQ ID NO.70，
表位23(aa 26-34)：
5’TATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGC 3’                 SEQ ID NO.71，
YCKKCCFHC                                SEQ ID NO.72，
表位24(aa 31-39)：
5’TGCTTTCATTGCCAAGTTTGTTTCATA 3’                 SEQ ID NO.73，
CFHCQVCFI                                SEQ ID NO.74，
表位25(aa 36-44)：
5’GTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGC 3’           SEQ ID NO.75，
VCFITKALG                             SEQ ID NO.76，
表位26(aa 41-49)：
5’AAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGG 3’           SEQ ID NO.77，
KALGISYGR                             SEQ ID NO.78，
表位27(aa 46-54)：
5’TCCTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAG 3’           SEQ ID NO.79，
SYGRKKRRQ                             SEQ ID NO.80，
表位28(aa 51-59)：
5’AAGCGGAGACAGCGACGAAGACCTCCT 3’           SEQ ID NO.81，
KRRQRRRPP                             SEQ ID NO.82，
表位29(aa 56-64)：
5’CGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACT 3’           SEQ ID NO.83，
RRPPQGSQT                             SEQ ID NO.84，
表位30(aa 61-69)：
5’GGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTA 3’           SEQ ID NO.85，
GSQTHQVSL                             SEQ ID NO.86，
表位31(aa 66-74)：
5’CAAGTTTCTCTATCAAAGCAGCCCACC 3’           SEQ ID NO.87，
QVSLSKQPT                             SEQ ID NO.88，
表位32(aa 71-79)：
5’AAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGG 3’           SEQ ID NO.89，
KQPTSQSRG                             SEQ ID NO.90，
表位33(aa 76-84)：
QSRGDPTGP                             SEQ ID NO.91，
5’CAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCG 3’           SEQ ID NO.92，
表位34(aa 81-89)：
5’CCGACAGGCCCGAAGGAACAGAAGAAG 3’           SEQ ID NO.93.
PTGPKEQKK                             SEQ ID NO.94.
根据本发明，“Tat的衍生物”包括HTLV-IIIB、克隆BH-10变体的Tat突变体，选自如下的突变：
核苷酸序列：
cys22突变的核苷酸序列(SEQ ID NO.95)：
5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGT
CAGCCTAAAACTGCTGGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTG
CCAAGTTTGTTTCATAACAAAAGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGC
GGAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCT
ATCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGA
ATGA 3’
cys22突变的氨基酸序列(SEQ ID NO.96)：
NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTAGTNCYCKKCCFHCQVCFITKALG
ISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
lys41的核苷酸序列(SEQ ID NO.97)：
5’ATGGAGCCAGTAGATCCTAGACTAGAGCCCTGGAAGCATCCAGGAAGTC
AGCCTAAAACTGCTTGTACCAATTGCTATTGTAAAAAGTGTTGCTTTCATTGCC
AAGTTTGTTTCATAACAAACGCCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCG
GAGACAGCGACGAAGACCTCCTCAAGGCAGTCAGACTCATCAAGTTTCTCTA
TCAAAGCAGCCCACCTCCCAATCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAA
TGA3’.
lys41的氨基酸序列(SEQ ID NO.98)：
NH2-MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTNCYCKKCCFHCQVCFITTA
LGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTHQVSLSKQPTSQSRGDPTGPKE-COOH
以下被视为在本发明范围之内：
-具有与如以上所描述的DNA序列至少60％的同源性(优选具有至少70％的同源性，更优选至少80％，更优选至少90％)的DNA序列。
-具有与如以上所描述的氨基酸序列至少40％的同源性(优选具有至少50％的同源性，优选具有至少60％的同源性，优选具有至少70％的同源性，更优选至少80％，更优选至少90％)的氨基酸序列。
根据本发明，“传染性疾病”包括那些由人或动物疱疹病毒(herpesviruses)、肝炎病毒(hepatitis viruses)、结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)、疟疾疟原虫(Malaria plasmodia)、念珠菌属(Candida)、利斯特氏菌属(Lysteria)、流感病毒(Influenzavirus)引起的传染性疾病和由其它细胞内或细胞外病原体在人或动物体内引起的感染，包括但不限于，性传染性疾病、心内膜炎、尿道感染、骨髓炎、皮肤感染、或链球菌(streptococcus)和葡萄球菌(staphylococcus)感染、肺炎球菌(pneumococcus)感染、破伤风、脑膜炎双球菌(meningococcus)感染、结核、疟疾、念珠菌病、螺杆菌(Helicobacter)引起的感染、沙门氏菌(salmonella)引起的感染、梅毒(syphilis)、疱疹感染(包括水痘、单核细胞增多症EB病毒衍生的(Epstein-Barr-derived)感染、人疱疹病毒-8(herpesvirus-8)感染、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、唇疱疹和生殖器疱疹)、肝炎病毒感染(A、B、C、D、G)、乳头瘤病毒(papilloma virus)衍生的感染、流感、利斯特氏菌(lysteria)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)。
根据本发明，“炎症疾病”被定义为与病毒、细菌或寄生虫感染有关或无关的变态反应或炎症，包括但不限于，免疫介导的皮肤疾病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性硬化症、皮肌炎、肖格伦综合征(Sj_gren syndrome)、肾小球肾炎咯血综合征、脉管炎、肉样瘤病、骨关节病、传染性关节炎、牛皮癣、Chron病、溃疡性直肠结肠炎、tyroiditis、硬皮病、变应性疾病。
根据本发明，“血管生成疾病”被定义为非瘤血管增生疾病包括，糖尿病性视网膜病变、晶状体后纤维组织增生、粒性结膜炎、血管性青光眼(vascular glaucoma)、牛皮癣、免疫炎症、非免疫炎症、动脉粥样硬化、过度伤口愈合、皮血管炎、结肠血管发育不良、血管性水肿和血管纤维瘤。
根据本发明，“肿瘤”被定义为包括软组织、骨、软骨和血液的肿瘤良性和恶性肿瘤，例如但不限于，卡波西肉瘤和其它的皮肤、肺、乳腺、消化道、肝脏、胰腺、内分泌系统、子宫、卵巢的瘤形成、肉瘤、急性和慢性白血病以及淋巴细胞的瘤形成。
根据本发明，“治疗性化合物”被定义为被定义为其它抗原(蛋白质、肽或DNA)或活性分子。
根据本发明，“支持物颗粒”被定义为，但不限于，微米颗粒、纳米颗粒、脂质体和其它颗粒化的运送系统。
根据本发明，“非HIV抗原或其它抗原”包括除HIV抗原HIV-1 Tat、Rev、Nef、Gag之外、任何被免疫细胞识别的分子或部分。
根据本发明，Tat可以被用于治疗传染性疾病、炎症疾病、血管生成疾病、肿瘤。
如上述的Tat组合体可以与佐剂、稀释剂、赋形剂、载体和其它本领域已知的物质混合用于制备表述的范围的药物。这样的药物可以为片剂、丸剂、喷剂、注射溶液、悬液、粉剂、霜剂、软膏，用于非胃肠道(皮下、肌内、皮内)或粘膜(阴道、直肠、口、鼻)或局部给药，给药途径依赖疾病种类和药物剂型。
附图详述
附图1.生物活性Tat以剂量-和时间-依赖的形式被MDDC有效的选择性摄取，但是不被BLCL或TCB摄取。A，MDDC采用已知方法(Fanales Belasio 1997)取自14名不同的健康人供体外周血单核细胞。简言之，外周血单核细胞(PBMC)由密度梯度离心分离(Ficoll PaqueResearch Grade，Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。进一步通过与抗-CD14包被的微珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)温育纯化单核细胞，之后根据生产商的说明用一磁性装置(MiniMacs Separation Unit，Miltenyi)分选。用流式细胞仪(FACScan，Becton Dickinson，S.Jose，CA)测定，单核细胞的纯度始终＞95％。在添加有GM-CSF(200ng/ml)(Leucomax，Novartis，Origgio，Italy)和IL-4(100ng/ml)(Peprotech，London，UK)的完全培养基中培养6天诱导单核细胞向DC(MDDC)分化。通过形态学观察和用流式细胞仪对特异表面标志(HLA-DR，CD86，CD83，CD40，CD80)的检测测定向DC的分化。随后，在添加了一系列浓度(0.1至10,000ng/ml)的活性HIV-1 Tat的完全培养基中或用重建缓冲液或仅含培养基(阴性对照)中，以2×105每ml的密度、37℃下、黑暗培养MDDC 5、10、30或60分钟。Tat蛋白由E.coli表达，并根据以前的描述(Ensoli 1993；Chang 1997；Ensoli 1994)进行纯化，以及在使用前根据(Ensoli 1993；Chang 1997；Ensoli 1994)所述的通过细胞生长检测和HIV-LTR反式激活进行测试。将Tat蛋白重新悬浮于脱气磷酸缓冲盐溶液、0.1％牛血清清蛋白(PBS-BSA)。根据(Ensoli1993；Chang 1997；Ensoli 1994)描述的采取预防措施以避免Tat的氧化和活性丧失。细胞随后用冷培养基洗涤并用胰蛋白酶-EDTA(Life-Technologies，Paisley，UK)在37℃下处理10分钟以除去任何结合在表面的蛋白质。固定和透化之后，用亲和纯化的兔多克隆抗-Tat IgG抗体(Ensoli 1993；Chang 1997；Ensoli 1994)或兔IgG对照抗体(ICNBiomedicals，Opera，Italy)和随后的FITC缀合的抗-兔Ig(Pierce，Rockford，IL)对MDDC染色。用流式细胞仪分析荧光，以与同型-染色的样品比较的阳性细胞百分数表示结果。为证明蛋白质的特异胞质内定位，也始终用抗-Tat抗体对未透化的MDDC进行染色。将阳性细胞百分数(与同型-染色的样品比较)在数据框(boxes)中报告。列出的数据来自14个被检者中的一个典型供体，其Tat摄取水平分别在10分钟(0.1、1、10、100、1000和10,000ng/ml下的阳性细胞分别为49％、52％、49％、70％、94％、98％)和30分钟(0.1、1、10、100、1000和10,000ng/ml下的阳性细胞分别为49％、45％、54％、65％、95％、98％)都最接近从所有被测试供体观察到的中值。B，如上所述将MDDC与活性Tat蛋白(10至1000ng/ml)温育10或30分钟，且透化或未透化的细胞都用FACS分析以证明对Tat的特异摄取。C，BLCL(圆圈)通过在制备EB病毒的B95-8狨猴T细胞系上清液存在下、培养来自2名健康人供体的PBMC 2小时产生BLCL(圆圈)，并根据以前描述的(Micheletti 1999)进一步扩增至少4星期。TCB(三角形)通过用植物凝集素(PHA)1μg/ml(Murex Diagnostics，Chatillon，France)刺激来自4名健康供体的人PBMC 3天获得，进一步在添加了rIL-210IU/ml(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)的完全培养基中扩增2星期，如以前所述(Micheletti，1999)。BLCL和TCB在添加了浓度范围从100-10,000 ng/ml的活性Tat的完全培养基中、重建缓冲液或仅含培养基中，以5×105/ml的密度、37℃下、黑暗培养30或60分钟，并染色以进行如上所述的细胞内Tat检测。数据与用相同蛋白质剂量、培养相同时间的MDDC(方形)的数据比较，其由于该供体的Tat摄取水平与11个被测试的不同供体的中值(Tat浓度为10、100和1,000ng/ml，培养30分钟后，阳性细胞分别为54％，范围为17-91％，65％，范围为27-91％，和95％，范围为83-99％)非常接近而被选作为代表性例子。
附图2.MDDC对天然、基本上是单体的具生物活性Tat的摄取随着细胞成熟而增加，并且该摄取由于蛋白质的氧化/失活而消失。A，用LPS诱导18小时诱导MDDC成熟或未成熟，随后如上所述在活性Tat蛋白(1至1000ng/ml)存在下温育10和30分钟。列出的数据来自一名摄取水平低于所有被检测供体中值的供体，选择该供体是因为可以很好的证明由细胞成熟诱导的Tat摄取的增长。B，在活性或氧化的(暴露于空气或光照18小时)Tat蛋白(10至1000ng/ml)存在下如上所述温育MDDC10分钟并如上所述处理。试验中所使用的天然的与氧化的Tat的生物学活性列于表I。
附图3.抗-α5β1和抗-αvβ3抗体阻断MDDC对活性Tat的摄取。在单独或联合添加了针对α5β1和αvβ3整合素单克隆抗体(10μg/ml，Chemicon，Temecula，CA)的完全培养基[RPMI 15％胎牛血清(FBS)]中、4℃下培养MDDC(5×105/ml)2小时。随后，以0.1至1000ng/ml的剂量添加活性Tat蛋白，37℃下黑暗培养10分钟。用冷完全培养基洗涤之后，如附图1所述处理并染色细胞。列出的数据来自三名供体中具有代表性的一名。A，对抗-Tat抗体染色的MDDC的流式细胞仪分析。将阳性细胞百分数(与同型-染色的样品比较)在数据框中报告。在所有蛋白质剂量下检测到Tat摄取(1000ng/ml下达到99％)，而被细胞与抗-α5β1或抗-αvβ3抗体的预温育抑制。两种抗体的存在都完全废除对皮摩尔浓度Tat的摄取，并将其强烈降低至所检测的最高剂量(21％)。B，同样的数据以点图列出以更好的理解α5β1或αvβ3整合素抗体对MDDC摄取Tat的抑制效应。
附图4.纤连蛋白和玻连蛋白阻断MDDC对活性Tat的摄取。在添加了源自人血浆的FN或VN(25μg/ml，Sigma-Aldrich，Stenheim，Germany)的完全培养基(RPMI 15％FBS)中4℃下培养MDDC(5×105/ml)2小时。随后，以10至1000ng/ml的剂量添加Tat蛋白，37℃下黑暗培养10分钟。用冷完全培养基洗涤之后，如附图1所述处理并染色细胞。列出的数据来自三名供体中具有代表性的一名。A，对抗-Tat抗体染色的MDDC的流式细胞术分析。将阳性细胞百分数(与同型-染色的样品比较)在数据框中报告。在所有蛋白质剂量下检测到Tat摄取(1000ng/ml下达到99％)。若细胞与FN或VN预温育，摄取被大大降低并在最低Tat剂量下被完全废除(10ng/ml下分别为1％和2％)。B，同样的数据以点图列出以更好的理解FN和VN对MDDC摄取Tat的抑制效应。
附图5.活性Tat以剂量-和时间-依赖的形式被巨噬细胞有效的摄取，但不被单核细胞摄取。A，富集自PBMC黏附于塑料板孔2小时的外周血单核细胞与剂量为0.1至10,000ng/ml的Tat在37℃下于黑暗中温育60分钟，并如附图1中所述的对MDDC进行处理和染色。A，显示对抗-Tat抗体染色的细胞的流式细胞仪分析。将阳性细胞百分数(与同型-染色的样品比较)在数据框中报告。仅在最高剂量(1000和10,000ng/ml下分别为45％和67％)下检测到对Tat的显著摄取，伴随着蛋白质在细胞表面附着的几个水平(1000和10,000ng/ml下在未透化细胞表面分别为19％和33％)。B，由六日龄单核细胞衍生的巨噬细胞(MDM)与剂量为0.1至10,000ng/ml的Tat在37℃下于黑暗中温育60分钟，并如附图1中所述对MDDC进行处理和染色。在10至10,000ng/ml范围内检测Tat的摄取，阳性细胞的比例分别为32％至72％。然而，对未透化MDM的30％染色证实在最高剂量(10,000ng/ml)下相当大量的Tat蛋白定位于细胞表面。C，来自同一供体的六日龄MDDC与剂量为0.1至1000ng/ml的Tat在37℃下于黑暗中温育10和30分钟，并如附图1中所述处理和染色。在所有蛋白质浓度下都检测到以高于来自同一供体的单核细胞和巨噬细胞水平(在剂量1000ng/ml下培养10和30分钟后分别为80％和73％)的Tat摄取，并且未在细胞表面检测到任何结合。
附图6.HIV-1 Tat蛋白及其功能结构域和Tat肽。所使用的HIV-1Tat蛋白，两个自然发生的、长86和102个氨基酸的变体，以及功能结构域(A)、长15和38个氨基酸的肽(分别在B和C图中指示为15mers(15聚体)和38mers)的序列(基于进化枝B共有序列)示意图。
附图7.Tat的摄取受到具有RGD或碱性区域的Tat肽的不同影响。A，将MDDC在4℃下与下列跨蛋白质不同区域的成对15-mer Tat肽(见附图6，B图)温育2小时：N末端(1-15加6-20)、半胱氨酸富集(21-35加26-40)，碱性(46-60加51-65)或RGD序列(66-80加71-85)，然后添加Tat(0.1至1,000ng/ml)、37℃下与MDDC温育30分钟。B和C，单独或联合用15-mer Tat肽46-60和66-80以剂量400至50,000ng/ml 37℃下预处理MDDC，然后添加10(B)或1000ng/ml(C)的Tat 37℃10分钟。D，将MDDC在4℃下与覆盖蛋白质(见附图6，图C)不同区域的38/46-mer Tat肽(1-38，21-58，47-86，57-102)存在下温育2小时，然后添加Tat(0.1至1,000ng/ml)、37℃下与MDDC温育10分钟。所有这些情况中如上所述进行Tat细胞内染色。表示的数据是来自3个不同供体的Tat-阳性细胞百分数平均值(及SEM)。
附图8.罗丹明染色的活性Tat被已由细胞因子激活的内皮细胞以剂量-依赖的形式摄取。根据以前的描述(Ensoli 1990；Barillari 1992和1993；Fiorelli 1999)，在人T-嗜淋巴细胞性病毒型-II(HTLV-II)转化的或用PHA刺激的CD4+细胞的条件培养基存在下培养5-6天以激活人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。这些条件培养基包含与炎症或修复过程中激活内皮细胞的相同的炎症细胞因子(IC)，包括IL-1、TNF和干扰素γ(IFNγ)。尤其是，IL-1、TNF和/或IFNγ诱导内皮细胞中整合素受体α5β1和αvβ3的表达(Barillari 1993；Fiorelli 1999)。
培养5-6天后，HUVEC经胰蛋白酶消化悬浮，用胰蛋白酶抑制剂洗涤，以5×104细胞/孔置于8孔细胞培养板(champer slides)(Nunc Inc.Naperville，IL)，在含有15％FBS的RPMI培养基(Life Technologies，Eragny，France)中培养18小时，不含条件培养基。之后，用不含RPMI的血清洗涤细胞，随之将细胞在CO2培养箱中、37℃下、于含有一系列稀释度的具生物活性Tat蛋白的不含RPMI的血清中培养15′，其中Tat基本根据所述(Mann 1991)在赖氨酸残基处用罗丹明染色。简言之，添加2.5μl 1M Na2CO3将50μg重组Tat(2mg/ml)调至pH9.0。随后添加2.5μl 1mg/ml二甲基亚砜(DMSO)中的四甲基罗丹明异硫氰酸(TRITC，Chemical Co.，St.Louis，MO)，反应在4℃下持续8小时。添加2.5μl 0.5M NH4Cl淬灭未反应的TRITC，用1M HCl将pH调低至7.0，用50nM Tris-HCl，pH7.0，1mM二硫苏糖醇(DTT)对罗丹明染色的Tat透析两次以去除淬灭的TRITC。以同样方式对BSA或PBS罗丹明染色并作为阴性对照。根据(Ensoli，1990)描述的，用罗丹明染色的Tat检测KS细胞生长活力以确保其仍然保持生物学活性。检测同样方式对Tat重悬浮缓冲液(PBS-0.1％BSA)进行罗丹明染色，并将其作为阴性对照。随后将HUVEC固定于冰冷的丙酮-甲醇(1∶1)。用荧光显微术观察Tat摄取和细胞内分布并拍照。通过将样品的荧光与阴性对照比较评估结果，并在不知道样品编号的情况下根据摄取量将结果按-(阴性)至++++(高度阳性)记分。
温育于：缓冲液(PBS-0.1％BSA)，图A；Tat 10ng/ml，图B；Tat 100ng/ml，图C；Tat 1μg/ml，图D。
附图9.被细胞因子激活的内皮细胞摄取100ng/ml罗丹明染色的Tat的时程分析。激活HUVEC并据附图8图注铺板培养于8孔细胞培养板。将细胞暴露于100ng/ml罗丹明染色的Tat，维持下列所述时间。以同样方式对BSA(fraction V，Sigma)染色并作为阴性对照。温育于：Tat 100ng/ml，暴露15′，图A；BSA，暴露15′，图B；Tat 100ng/ml，暴露60′，图C；BSA，暴露60′，图D。
附图10.被细胞因子激活的内皮细胞摄取1μg/ml罗丹明染色的Tat的时程分析。如附图8所述处理细胞因子-激活的HUVEC，随后与1μg/ml罗丹明染色的Tat温育15分钟，图A；30分钟，图B；60分钟，图C；120分钟，图D。
附图11.被细胞因子激活的内皮细胞与未激活细胞对活性Tat蛋白摄取的剂量-应答分析。HUVEC(胶化6孔板中，密度为7×104细胞/孔)如上述(附图8图注)生长于完全培养基，并加(IC-EC)或不加(EC)联合的重组炎症细胞因子(IFNγ10U/ml，IL-1β5ng/ml，TNF-α2ng/ml)温育5天。细胞洗涤两次，37℃下暗温育于1ml含15％FCS的RPMI 1640 10分钟，含有或不含系列稀释度的活性Tat蛋白(0.01至1000ng/ml)或Tat稀释缓冲液(含0.1％BSA的PBS)。随后细胞用冷RPMI 1640洗涤，胰蛋白酶消化，用FACES裂解液(Becton Dickinson)4℃下固定10′，4℃下暴露于透化液(Becton Dickinson)30分钟，用兔抗-Tat抗体或兔IgG对照抗体染色，并用FACS分析，与处理MDDC一样进行(附图1图注)。与未激活细胞相比，细胞因子激活的细胞中天然Tat摄取提高。列出了完成的3个试验中具代表性之一的与浓度递增的天然Tat蛋白温育10′后阳性细胞百分数。
附图12.被细胞因子激活的内皮细胞对活性Tat的摄取的剂量和时程分析。激活细胞，如附图11所述进行摄取试验。温育5′、10′、30′或60′。此外为证明蛋白质的特异胞质内的定位，还对未透化HUVEC用抗-Tat抗体染色。已激活内皮细胞的天然Tat摄取是时间和剂量依赖的，并已在低至0.01ng/ml浓度下检测到。将阳性细胞百分数(与同型-抗体染色的样品比较)在数据框中列出。所示数据来自进行的4个试验中具代表性的一个。
附图13.用未标记Tat蛋白对已被细胞因子激活的内皮细胞对10ng/ml罗丹明染色的活性Tat摄取的抑制。如附图8所述处理细胞因子-激活的HUVEC，预温育于含有缓冲液或1μg/ml未标记Tat的无血清培养基中，随后在37℃下与10ng/ml罗丹明染色Tat或罗丹明染色BSA温育15分钟。
图A，与缓冲液预温育，与BSA温育。
图B，与缓冲液预温育，与Tat温育。
图C，与1μg/ml未标记Tat预温育，与Tat温育。
附图14.用抗α5β1和抗αvβ3-整合素受体的抗体对已被细胞因子激活的内皮细胞对10ng/ml罗丹明染色的活性Tat摄取的抑制。如附图8图注所述用PHA刺激或HTLV II转化的T细胞(IC-HUVEC)的条件培养基激活HUVEC，并将其接种于8孔细胞培养板。然后在旋转设备上4℃培养IC-HUVEC于含有针对α5β1受体α链(抗-CD49wE，ChemiconInc.Temecula，CA)和α5β1受体β链(抗-CD29，Chemicon)、或αvβ3受体α链(抗-CD51，Chemicon)和αvβ3受体β链(抗-CD61，Chemicon)的单克隆抗体的无血清培养基中2小时。以针对内皮细胞标志因子VIII相关抗原(抗-FVIIIRA，Chemicon)的单克隆抗体作为特异性对照。所有抗体浓度均为5μg/ml。以抗体稀释缓冲液(含有0.1％BSA的PBS)为阴性对照。与抗体预温育后，添加10ng/ml罗丹明染色的Tat于细胞。以罗丹明染色的BSA为阴性对照。将IC-HUVEC于CO2培养箱37℃下保持15′，随后固定于冰冷的丙酮-甲醇(1∶1)。用荧光显微术观察Tat摄取和细胞内分布并拍照。通过将样品的荧光与阴性对照比较评估结果，并在不知道样品编号的情况下根据摄取量将结果按-(阴性)至++++(高度阳性)记分。
图A，与缓冲液预温育，与BSA温育。
图B，与缓冲液预温育，与Tat温育。
图C，与抗-α5和抗-β1单克隆抗体预温育，与Tat温育。
图D，与抗-αv和抗-β3单克隆抗体预温育，与Tat温育。
图E，与抗-FVIII抗体(对照抗体)预温育，与Tat温育。
附图15.用抗α5β1和抗αvβ3抗体对已被细胞因子激活的内皮细胞对100ng/ml罗丹明染色的活性Tat摄取的抑制。
如附图8所述处理IC-HUVEC，随后将其预温育于含有缓冲液或抗体的无血清培养基中，之后在37℃下与100ng/ml罗丹明染色Tat或罗丹明染色BSA温育15分钟。
图A，与缓冲液预温育，与BSA温育。
图B，与缓冲液预温育，与Tat温育。
图C，与针对α5β1整合素α和β链的单克隆抗体预温育，与Tat温育。
图D，与针对αvβ3整合素α和β链的单克隆抗体预温育，与Tat温育。
图E，与抗-人因子VIII抗体(对照抗体)预温育，与Tat温育。
附图16.当细胞与Tat温育15分钟时，对1μg/ml罗丹明染色Tat的摄取被抗-α5β1和抗-αvβ3的抗体部分抑制。如附图8所述激活HUVEC，与抗-α5和抗-β1或抗-αv和抗-β3单克隆抗体、或缓冲液预温育，随后与1μg/ml罗丹明染色的Tat或罗丹明染色的BSA 37℃温育15分钟。
图A，与缓冲液预温育，与BSA温育。
图B，与缓冲液预温育，与Tat温育。
图C，与抗-α5和抗-β1单克隆抗体预温育，与Tat温育。
图D，与抗-αv和抗-β3单克隆抗体预温育，与Tat温育。
附图17.当细胞与Tat温育60分钟时，对1μg/ml罗丹明染色的活性Tat的摄取不被抗-整合素抗体抑制。如附图8所述激活HUVEC，与抗-α5和抗-β1或抗-αv和抗-β3单克隆抗体、或缓冲液预温育，随后与1μg/ml罗丹明染色的Tat 37℃温育60分钟。
图A，与缓冲液预温育，与Tat温育。
图B，与抗-α5和抗-β1单克隆抗体预温育，与Tat温育。
图C，与抗-αv和抗-β3单克隆抗体预温育，与Tat温育。
附图18.活性Tat增强MDDC的细胞因子IL-12及TNF-α和β-趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES产生。将来自8名供体的MDDC以密度2×105每ml在不含或含系列浓度(20至20,000ng/ml)的天然或氧化Tat的完全培养基中培养18小时。以Tat重建缓冲液为阴性对照。以E.coli的LPS，血清型055:B5(10μg/ml，Sigma-Aldrich，Milano，Italy)，作为阳性对照。18小时后收集细胞上清，并根据生产商的说明用商业可获得的试剂盒(Cytoscreen TNF-α和IL-12 ELISA试剂盒，BiosourceEurope，Nivelle，Belgium；Quantikine RANTES，MIP-1α和MIP-1βR&D Systems Europe，Abingdon，UK)检测存在的TNF-α、IL-12、RANTES、MIP-1α和MIP-1β。灰色、空和黑色标记分别表示用Tat、缓冲液或LPS处理细胞的数值。报道的数据是8名不同供体的平均值(±SEM)，以pg/ml表示。氧化-失活的Tat蛋白诱导极弱的细胞因子或B-趋化因子生成。
附图19.活性Tat增强MDDC的同种异型抗原呈递。将MDDC(2×105细胞/ml)与LPS(阳性对照)(实心圆)、活性Tat蛋白(10μg/ml)(实心三角形)、重建缓冲液(空心三角形)或培养基(空心圆)温育18小时。之后洗涤细胞，并在96孔板中将其以1∶10至1∶640的比例与排除单核细胞的同种异型PBL(2×105/孔)一起培养于培养基(含有5％FBS)。为评估淋巴细胞增殖，6天后向板孔中添加3[H]-胸腺嘧啶再培养16小时，收集样品于玻璃纤维过滤器(Printed Filtermat A，Wallac，Turku，Finland)，用Betaplate(Wallac)计数，数值以cpm表示。数字取自一个代表性试验并已用其它3名供体重复。报道了平均值和和SEM。
附图20.活性Tat提高MDDC向经初次免疫刺激的PBL的TT-特异呈递从而增强特异T细胞应答。将来自3名健康个体的MDDC(2×105细胞/ml)，其中有两个(B16和B42)在增殖检测中与TT反应、一个(B45)不反应，与活性Tat蛋白(10μg/ml)、重建缓冲液或培养基一起温育18小时，之后与自体PBL(2×105/孔)以1∶20的比例在不加(空心圆柱)或加(灰色圆柱)5μg/ml TT(Connaught，Willowdale，Canada)的完全培养基(含有5％FBS)中培养。为评估淋巴细胞增殖，6天后向板孔中添加3[H]-胸腺嘧啶再培养16小时，如上所述进行样品收集和cpm计数。以刺激指数(S.I.)表示数据，它表示DC-PBL共培养计数与PBL单独计数之间的比率。
附图21.用于评估具生物活性Tat蛋白佐剂活力的初次免疫刺激-再次刺激疫苗方案。使用了两组Balb/c小鼠。第一组(arm1)单独用Gag皮内免疫两次(初次免疫刺激)，随后用Gag联合粘膜佐剂Malp-2鼻内免疫两次(再次刺激)。第二组(arm2)用Gag和Tat混合后皮内免疫两次(初次免疫刺激)，随后用与Tat混合的Gag联合粘膜佐剂Malp-2鼻内免疫两次(再次刺激)。在指示的时间完成免疫接种。
附图22.对Gag的抗体应答。根据生产商的说明用商业Elisa(ELAVIA AB HIV2，BIO-RAD Laboratories Srl，MI，Italy)对两个臂的小鼠都检测血清中抗-Gag抗体。测试前以1∶100稀释血清。截止值为光学密度0.3。
附图23.抗-Gag细胞溶解活性。来自两个arm的小鼠脾细胞在体外在IL-2(效应物)存在下用Gag肽刺激6天，之后按指示的比率与经51Cr(靶)标记、Gag肽激活的p815细胞温育。用标准方法检测特异裂解。自发51Cr释放不超过最大释放量的10％。高于10％的特异51Cr释放被视为是阳性。
以下实施例用于更好的阐述本发明而不应视为对本发明范围的限制。
实施例1
活性Tat被MDDC但非TCB和BLCL有效摄取
用透化细胞上的特异亲和纯化多克隆抗体，根据流式细胞术中的细胞内免疫荧光评估MDDC、TCB和BLCL对活性Tat的摄取。附图1显示一个代表性供体的结果，其Tat摄取水平代表从14名被测试供体获得的中值。MDDC的Tat摄取是非常有效的并且以剂量和时间依赖的方式发生(附图1A)。使用最低剂量(0.1ng/ml)的Tat其摄取就已经明显。无论所测试的Tat浓度如何，染色水平总是在温育5分钟后达到峰值，并在60分钟后减弱，可能是由于蛋白质的加工。然而，在所用最高Tat剂量(10μg/ml)下保持高水平(98％)Tat摄取长达温育60分钟。未观察到对单独用培养基或重建缓冲液温育细胞的染色(附图1A)。此外，由于用未透化细胞在与Tat培养10或30分钟后未观察到染色，因此检测到的Tat几乎全是在细胞内的(附图1B)。用不同量的蛋白质重复观察到类似的MDDC对Tat摄取的剂量和时间动力学。
与MDDC相反，TCB和BLCL对Tat摄取的有效性非常低。实际上，在Tat浓度高至10μg/ml并温育30或60分钟后对两种细胞类型都极少甚至没有观察到特异细胞内染色，其数值在最高Tat剂量下远远低于用MDDC获得的数值(BLCL和TCB分别为0-15％和3-10％，相对98％)(附图1C)。
因此，对活性Tat的有效摄取是MDDC的一个选择性特征。
实施例2
MDDC对活性Tat的摄取随细胞成熟而提高并由于蛋白质的氧化和失活而丧失。
未成熟MDDC通过吞噬作用和胞饮作用摄取抗原(Bankereau1998；Bell 1999)。成熟DC丧失这些活性尽管其获得强抗原呈递能力。为验证细胞成熟是否影响对天然Tat的摄取，用LPS诱导MDDC成熟。与未成熟MDDC相比，成熟MDDC更高水平表达表面标志HLA-DR、CD83和CD86。未成熟或成熟细胞随后都被用于摄取试验。在全部被测试的蛋白质浓度下Tat摄取都被MDDC成熟大大提高(附图2A)。实际上，用低Tat浓度对成熟MDDC的培养显示出与最高Tat剂量下从未成熟细胞观察到的相似的细胞内染色水平(附图1A和2A)。
Tat包含7个半胱氨酸而且对导致构象变化和活力丧失的氧化作用及其敏感。为证实Tat的构象和生物学活性在MDCC摄取过程中的作用，将蛋白质暴露于空气和光照并检测生物学活性的丧失(表I)，之后在摄取试验中比较活性或失活Tat蛋白。
如附图2B所示，在高至1μg/ml的蛋白质浓度下用氧化Tat未观察到染色，而且，在该浓度下，与天然Tat相比仅检测到极低的特异染色。因此，为被MDDC有效摄取Tat必须具有天然构象及生物学活性。
由于与胞饮/吞噬活性降低有关的MDDC成熟提高Tat摄取，而蛋白质的氧化和失活却将其极大的降低至相当于与由BLCL和TCB观察到的水平，可以想象MDDC对天然Tat的摄取是由特异受体及与细胞胞饮/吞噬活性无关的进入机制介导、但在MDDC成熟后得到提高的。
表I.Tat的氧化废除其生物活性
                          Tat(ng/ml)
细胞系   缓冲液    500    1,000    2,500    5,000   10,000
HLM-1    14        434    491      971      1507    5028    天然
         19        21     22       40       34      117     氧化
HL3T1    0         29     34       79       81      187     天然
         0         3      2        2        4       6       氧化
Tat经暴露于空气和光照18小时而被氧化。之后，通过测定其在HLM-1细胞系(Ensoli 1993；Chang 1997)中拯救Tat-缺陷HIV前病毒复制或在含有LTR-CAT构建体的HL3T1细胞系中诱导CAT活性的能力(Felber 1988)检测活性和氧化蛋白质的生物学活性(在500至10,000ng/ml的剂量下)。报道了HLM-1细胞培养上清的p24值(pg/ml)和HL3T1细胞提取物的CAT活力(％乙酰化作用/100μg蛋白质)。
实施例3
用抗-α5β1和抗-αvβ3单克隆抗体或它们的天然配体FN或VN对MDDC摄取活性Tat的阻断。
为验证MDDC对Tat的摄取是否服从特异受体介导的内吞途径，用针对整合素受体α5β1和αvβ3的特异单克隆抗体或竞争剂配体进行了试验。这些受体选自几个在不同的细胞类型上结合Tat的受体，因为它们被激活的内皮细胞和KS细胞高度表达，这些细胞在Tat存在下进行增殖、迁移和黏附而且这是由TatRGD区域与α5β1和αvβ3整合素的结合介导的。如附图3A、B所示，抗-α5β1和抗-αvβ3单克隆抗体都抑制MDDC对Tat的摄取，而且在两种抗体都存在时这一阻断是完全的(附图3A，B)。这些受体的天然配体，即FN和VN，以相似的方式阻断Tat摄取(附图4A、B)。因此，α5β1和αvβ3整合素介导Tat进入MDDC。这一摄取途径在皮摩尔-纳摩尔蛋白质浓度占主导地位，而在更高的Tat浓度下对Tat进入的阻断仍然是明显的但是不完全(附图3A和B)。这表明MDDC对Tat摄取利用至少两条途径，出现于低Tat浓度(皮摩尔-纳摩尔)下的第一条是一条整合素介导的内吞作用，而在更高的Tat浓度下出现低亲和力细胞表面相互作用。
实施例4
活性Tat以剂量和时间依赖的方式被MDM和MDDC但非单核细胞有效摄取。
由于MDDC源自单核细胞且单核细胞和MDM已知可以有效的呈递抗原至淋巴细胞，因而分析了这些细胞对活性Tat的摄取并与来自同一供体的MDDC进行比较。单核细胞纯化自外周血并被诱导分化为MDDC或MDM(如附图1和附图5所述)。如附图5所示，单核细胞仅在最高剂量下摄取活性Tat(在1,000和10,000ng/ml下分别为45％和67％)并明显结合蛋白质于细胞表面(未透化细胞上分别为19％和33％)。MDM比单核细胞更有效地摄取Tat，具有相对低Tat剂量下(10ng/ml和100ng/ml下分别为32％和43％)至所检测的最高Tat剂量(10,000ng/ml下为72％)下的可检测染色，此时观察到蛋白质的表面结合(未透化细胞上为30％)，的可检测染色。来自同一供体的MDDC比单核细胞和MDM更有效地摄取Tat，其在所检测的最低剂量下(0.1ng/ml)10分钟和30分钟(分别为22％和13％)时都已经检测到特异染色。最高剂量下(1000ng/ml)暴露于Tat 10和30分钟后分别有80％和73％的MDDC呈阳性。在所有蛋白质剂量下MDDC和MDM都显著比单核细胞更有效地摄取Tat。由于MDDC和MDM都分化自单核细胞，这些数据表明细胞分化为细胞提供特异Tat蛋白靶向和摄取机制。
实施例5
具HIV-1 Tat蛋白碱性区域和RGD结构域肽对活性Tat摄取的抑制。
为验证Tat哪个区域负责对具生物活性蛋白质的摄取，通过将MDDC与跨N末端区域(1-15加6-20)、半胱氨酸富集区(21-35加26-40)、碱性区域(46-60加51-65)、RGD区域(66-80加71-85)的Tat肽(15mers)一起预温育进行阻断试验(附图6，图A和B)。跨N末端区域和半胱氨酸富集区的肽在检测的任何剂量下(0.1-1,000ng/ml)都不影响对Tat的摄取(附图7，图A)。跨碱性区域的肽在高剂量下(100和1000ng/ml)显著降低对Tat的摄取，但是在较低浓度(0.1-10ng/ml)下不影响对具生物活性Tat蛋白的摄取。相反，跨RGD区域的肽在高至10ng/ml的剂量就废除对Tat的摄取，并在100和1000ng/ml下将其显著降低。值得注意的是，Tat肽46-60与66-80的联合在10和1000ng/ml剂量下都废除对具生物活性Tat的摄取(附图7，图B和C)。在相同试验条件下，一段同时跨N末端和半胱氨酸区域(1-38)的较长的Tat肽(附图6，图C)不影响对具生物活性Tat的摄取，然而同时跨半胱氨酸和碱性区域的Tat肽21-58在100和1000ng/ml下显著降低Tat摄取，跨RGD区域的Tat肽57-102在低于100ng/ml剂量下废除Tat摄取(附图7，图D)。同时跨碱性区域和RGD区域的Tat肽47-86在低于100ng/ml的剂量下废除对Tat的摄取并在1000ng/ml下将其强烈降低(附图7，图D)。因此，用具RGD基序的肽对α5β1和αvβ3整合素的阻断废除对皮摩尔-纳摩尔(0.1-10ng/ml)浓度下具生物活性Tat的摄取，而更高(纳-微摩尔，10-1,000ng/ml)浓度下的Tat的摄取是由Tat碱性区域经与肝素结合的蛋白聚糖的相互作用介导的。与之相关的是，具碱性和RGD区域肽的联合通过同时干扰具生物活性Tat蛋白的结合和内化途径决定了Tat摄取在任何所检测剂量下的完全废除。因此，尽管这些数据证明这两个结构域都是最佳Tat摄取所需要的，它们也表明RGD区域是有效(即低浓度下)和选择性{(即.，表达α5β1和αvβ3整合素的细胞类型，例如MDDC和激活的EC(参见下文))摄取Tat的关键，而碱性区域只在高Tat浓度下参与摄取，并由于其发生于任何细胞类型而缺少靶向特异性。
实施例6
用炎症细胞因子进行细胞活化之前和之后初级内皮细胞对活性Tat的摄取。
为分析内皮细胞对活性Tat的摄取，HUVEC用炎症细胞因子激活或否，并用于罗丹明染色Tat蛋白的摄取研究。Tat在罗丹明染色后是具有活性的因为它仍然能够与未标记Tat一样在相同浓度范围内促进KS细胞增殖。这表明荧光标记的附着并不危害其生物学功能。将细胞暴露于一个宽的Tat浓度范围。此外，为了与摄取抑制试验一致(参见下文)，将细胞在4℃下用不含胎牛血清的培养基预温育2小时。该预温育不影响随后对罗丹明染色Tat的摄取。用罗丹明染色的Tat，蛋白质向激活HUVEC(IC-HUVEC)的细胞核及核仁的摄取和移位在与10ng/ml的罗丹明染色的Tat培养15分钟后变得可以被检测(附图8)。细胞内Tat活性以剂量依赖和(附图8)和时间依赖的方式(附图9和10)提高。罗丹明染色的BSA或缓冲液(阴性对照)表现出极少甚至无摄取(附图8，9，10)。
为确证这些数据，用冷活性Tat通过细胞内染色FACS分析(附图11，12)重复试验。IC-HUVEC对天然Tat的摄取比未激活细胞有效得多(附图11)，且剂量低至0.01ng/ml的Tat被这些细胞以剂量和时间依赖的方式，具有与MDDC相似或一致的动力学，非常迅速地摄取(附图12)。用未透化细胞未观察到染色，说明所有或大部分Tat被这些细胞摄取。因此，MDDC、IC-HUVEC和MDM具有特异的机制来非常有效地摄取Tat。
实施例7
用未标记蛋白质对摄取活性Tat的抑制。
为证实IC-HUVEC对罗丹明染色Tat蛋白的摄取是否经过特异及可饱和的途径，将IC-HUVEC在与浓度为10ng/ml至1μg/ml的罗丹明染色Tat温育之前先与1μg/ml未标记Tat温育。这一过程几乎完全抑制对罗丹明染色Tat的摄取(附图13和表II)，其具有与阴性对照(BSA)相当的荧光水平。这表明IC-HUVEC对Tat蛋白的摄取是特异的及可饱和的，暗示有受体参于该过程。
表H用1μg/ml未标记Tat与细胞预温育后IC-HUVEC对100ng/ml和1μg/ml罗丹明染色活性Tat的摄取的抑制
预温育 与罗丹明染色的Tat温育 对罗丹明染色Tat的摄取
无血清培养基 100ng/ml +++
1μg/ml未标记Tat 100ng/ml +/-
无血清培养基 1μg/ml ++++
1μg/ml未标记Tat 1μg/ml +/-
将IC-HUVEC在加或未加1μg/ml未标记活性Tat的无血清培养基中预温育2小时，之后与100ng/ml或1μg/ml罗丹明染色的Tat温育60分钟。据附图6图注中所述用荧光显微术观察到Tat摄取。阴性对照(+/-摄取)与无血清培养基预温育后与罗丹明染色的BSA温育。
实施例8
用针对α5β1和αvβ3整合素的单克隆抗体或它们的配体FN和VN对摄取皮摩尔浓度(10至100ng/ml)活性Tat的抑制
为检测IC-HUVEC对Tat的摄取是否由与MDDC相同的整合素介导，通过将IC-HUVEC与这些受体的生理配体FN或VN、或与针对α5β1和αvβ3受体RGD结合区域的单克隆抗体预温育来进行抑制试验。之后将细胞与浓度为10ng/ml至1μg/ml的罗丹明染色Tat温育。
10ng/ml罗丹明染色Tat的摄取和核定位被用均为100ng/ml的FN或VN对细胞的预先处理抑制(表III)。类似地，10至100ng/ml Tat的摄取被用针对FN受体α5β1、VN受体αvβ3的RGD结合区域的单克隆抗体对细胞的预先处理抑制(附图14、15)。细胞内荧光强度降低至阴性对照的水平(附图12、13)。这些结果表明，对皮摩尔浓度Tat的摄取是由与MDDC相同的整合素介导的。相反，将IC-HUVEC与针对因子VIII的单克隆抗体预温育，作为阴性对照，未观察到抑制(附图14，15)，因此表明抗-整合素抗体对Tat摄取的抑制是特异的。
表III.用过量FN或VN与细胞的预温育对IC-HUVEC摄取10ng/ml罗丹明染色活性Tat的抑制。
预温育 对罗丹明染色Tat的摄取
无血清培养基 ++++
100ng/ml FN +/-
100ng/ml VN +/-
将IC-HUVEC在加或未加人FN或VN(Roche，Monza，Italy)的无血清培养基中预温衣2小时，之后与10ng/ml罗丹明染色Tat温育60分钟。Tat摄取根据附图8图注所述用荧光显微术观察。阴性对照(+/-摄取)与无血清培养基预温育，之后与罗丹明染色的BSA温育。
实施例9
对1μg/ml活性Tat的摄取仅由整合素受体部分介导。
为确定整合素在更高(纳摩尔-微摩尔)浓度活性Tat摄取中的涉入，将IC-HUVEC与1μg/ml罗丹明染色的Tat温育。15分钟内在细胞内见到强烈的荧光信号(附图8图D，附图10图A和附图16图B)。温育时，用针对α5β1(附图16图C)或αvβ3(附图16图D)的单克隆抗体对细胞的预先处理显示出对Tat摄取的一些抑制，但是要比用10或100ng/mlTat观察到的低。当将IC-HUVEC与1μg/ml罗丹明染色的Tat温育更长时间(60分钟)，用抗α5β1或抗αvβ3的单克隆抗体对细胞的预先处理不抑制对Tat的摄取(附图17)。这些结果表明，在温育Tat的该浓度和时间段下，整合素-依赖的摄取被饱和而另一条Tat摄取途径占主导地位。
实施例10
介导对活性Tat摄取的Tat结构域
为证实Tat的哪个结构域负责对皮摩尔-纳摩尔与微摩尔浓度蛋白质的摄取，通过将IC-HUVEC与跨RGD区域(Tat 65-80)和碱性区域(Tat 46-60)的Tat肽一起预温育进行阻断试验(表IV)。以Tat肽11-24作为阴性对照。当添加罗丹明染色Tat于细胞时，对皮摩尔浓度Tat的摄取被Tat肽65-80但非Tat 46-60或11-24抑制(表IV)。相反，在高浓度细胞外Tat(1μg/ml)下摄取不被Tat肽65-80抑制而Tat46-60却具有一定抑制效应。这证实，对皮摩尔-纳摩尔浓度Tat的摄取是由Tat RGD区域通过与α5β1和αvβ3整合素相互作用介导的。相反，对高(纳-微摩尔)浓度Tat的摄取是由Tat碱性区域通过与肝素结合的蛋白聚糖之间的相互作用介导的。因此，RGD区域是有效摄取Tat的关键，而碱性区域在高Tat浓度下参与摄取，然而它由于出现于任何细胞类型而缺乏靶向特异性。
表IV.介导对活性Tat摄取的Tat结构域
竞争剂         罗丹明染色的Tat(ng/ml)    荧光强度
缓冲液         0                         -
缓冲液         10                        ++
(11-24)Tat     10                        ++
(46-60)Tat     10                        ++
(65-80)Tat     10                        -
缓冲液         100                       +++
(11-24)Tat     100                       +++
(46-60)Tat     100                       +++
(65-80)Tat     100                       -/+
缓冲液         1000                      ++++
(11-24)Tat     1000                      ++++
(46-60)Tat     1000                      ++
(65-80)Tat     1000                      +++
将IC-HUVEC于旋转设备上4℃下在添加有过量(10μg/ml)(11-24)Tat、(46-60)Tat或(65-80)Tat的无血清培养基中的温育2小时。以肽重悬缓冲液(PBS-0.1％BSA)为阴性对照。与竞争肽预温育后，添加10、100和1000ng/ml的罗丹明染色Tat至细胞并将细胞在于CO2培养箱中37℃下保持15′。随后将细胞固定于冰冷的丙酮-甲醇(1∶1)。根据附图8图注所述，用荧光显微术观察Tat的摄取和细胞内分布并拍照。
实施例11
具活性的而非氧化的和失活的Tat诱导MDDC活化和成熟。
为评估活性Tat蛋白对MDDC活化和成熟的效应，用流式细胞术分析了培养于添加了蛋白质、完全培养基、重建缓冲液、或LPS(阳性对照)中18小时的细胞的MHC、HLA-ABC和HLA-DR以及协同刺激分子CD40、CD80、CD86和CD83的表面表达。用10名不同供体获得的数据表明，在无任何细胞内毒性时(表V，表A)，Tat诱导MHC和协同刺激分子的表达的剂量依赖式增强。观察到HLA-ABC(3/6供体，平均37％)、HLA-DR(10/10，平均49％)、CD40(6/10，平均35％)、CD80(8/8，平均50％)、CD83(9/10，平均164％)及CD86(10/10，平均140％)荧光密度平均值(MFI)的显著增加。重建缓冲液或单独培养基未改变所分析分子的表达水平。值得注意的是，Tat的氧化和失活(表I)显著降低蛋白质上调MDDC表面的MHC和协同刺激分子的能力(表V，表B)。因此，只有活性Tat促进MDDC的活化和成熟。
表V.具活性的(A)而非氧化的和失活的(B)Tat增强HLA和协同刺激分子在MDDC表面的表达。
A.
                                        ％增长与对照
         供体号    培养基    缓冲液     Tat μg/ml                         LPS
                   (MFI)    (MFI)       1            5          20
HLA-ABC  B 19      392      332         55.4         55.7       78.3       74.0
         B 24      291      309         6.1          49.2       49.2       140.9
         B 26      304      297        -4.0         -4.7        15.8       32.6
         B 38      130      127         31.5         54.3       63.8       168.5
         B 53      276      272        -8.5         -6.3        2.2        48.9
         B 55      251      259         2.7          11.2       13.9       9.2
HLA-DR   B 19      145      192         1.0         -1.0        27.1       84.8
         B 24      164      143         11.9         60.8       10.5       48.8
         B 26      175      177         15.8         23.2       60.5       60.6
         B 38      464      366         62.3         98.1       94.5       85.6
         B 40      1040     1127        27.9         38.9       34.6       58.9
         B 43      415      408         18.6         27.7       ND         ND
         B 44      687      692         5.1          11.3       31.4       ND
         B 45      847      797         14.3         23.7       40.4       ND
         B 53      471      493         11.0         30.8       94.7       94.5
         B 55      313      303         38.6         47.2       46.9       30.7
CD40     B 19      53       51          23.5         21.6       19.6       77.4
         B 24      60       58          19.0         36.2       41.4       103.3
         B 26      42       43          4.7          11.6       16.3       45.2
         B 38      70       62          45.2         62.9       95.2       64.3
         B 40      85       76          38.2         59.2       60.5       76.5
         B 43      48       48         -2.1         -4.2       -6.3        ND
         B 44      69       68          2.9          16.2       14.7       ND
         B 45      87       76          1.3          15.8       18.4       ND
         B 53      82       80          20.0         38.8       52.5       75.6
         B 55      34       36          5.6          22.2       38.9       14.7
CD80     B 19      8        8           62.5         50.0       37.5       350.0
         B 24      16       16          12.5         37.5       43.8       143.8
         B 26      10       9           44.4         22.2       44.4       90.0
         B 38      21       19          68.4         84.2       100.0      109.5
         B 40      27       23          43.5         73.9       69.6       63.0
         B 43      9        8           12.5         25.0       25.0       ND
         B 44      18       18          0.0          11.1       27.8       ND
         B 45      21       21          0.0          23.8       52.4       ND
CD83     B 19      7        6           66.7         100.0      166.7      442.9
         B 24      9        7           57.1         257.1      128.6      200.0
         B 26      8        9           0.0         -11.1       55.6       62.5
         B 38      5        6           33.3         150.0      233.3      520.0
         B 40      12       10          100.0        190.0      310.0      233.3
         B 43      8        9           0.0          11.1       22.2       ND
         B 44      9        13         -23.1        -38.5       7.7        ND
         B 45      7        10         -30.0         0.0        90.0       ND
         B 53      3        6           0.0          33.3       150.0      433.3
         B 55      6        5           40.0         180.0      480.0      ND
CD86     B 19      81       76          82.9         76.3       69.7       133.3
         B 24      35       41          17.1         48.8       7.3        77.1
         B 26      128      129         4.7          25.6       48.1       55.5
         B 38      95       103         129.2        220.8      266.7      288.0
         B 40      25       24          68.0         95.1       88.3       144.0
         B 43      75       74          16.2         35.1       41.9       ND
         B 44      70       75         -4.0          26.7       80.0       ND
         B 45      51       50          44.0         70.0       166.0      ND
         B 53      15       14          35.7         85.7       535.7      693.3
         B 55      37       40          72.5         80.0       97.5       32.4
B.
               培养基    缓冲液     Tat
               (MFI)     (MFI)      (％增长与对照)
HLA-DR         313       303        46.9                   天然
                                    10.6                   氧化
CD40           34        36         38.9                   天然
                                    8.3                    氧化
CD83           6         5          480.0                  天然
                                    40.0                   氧化
CD86           37        40         97.5                   天然
                                    15.0                   氧化
与缓冲液或培养基相比分别由Tat或LPS诱导的HLA-DR或CD抗原的增长％。
将细胞暴露于天然或氧化的和失活的Tat、重建缓冲液、完全培养基或LPS(10μg/ml)中18小时，用以下荧光染料缀合的单克隆抗体染色：FITC-或PE-缀合的IgG同型、FITC-缀合的抗-CD14和-HLA-DR(Becton-Dickinson)、FITC-缀合的抗-CD40、-CD80、-CD83、PE-缀合的抗-CD86(Pharmingen，San Diego，CA)，并用流式细胞术分析。在表A中报道了来自10名不同供体的MDDC上表面分子的表达，以与来自用Tat培养缓冲液(对Tat)或培养基(对LPS)温育细胞的MFI比较得到的荧光强度平均值(MFI)增长百分数表示。
表B显示来自一名代表性供体用氧化的与天然Tat(20μg/ml)处理的数据。以用LPS培养的MDDC为诱导HLA和协同刺激分子的阳性对照。
在天然或氧化Tat存在下培养的MDDC始终是有活力的，与那些用培养基或重建缓冲液处理的没有区别(数据未列出)。
实施例12
天然而非氧化和失活的Tat激活MDDC并增强MDDC的Th-1型细胞因子和β-趋化因子的产生。
为评估活性Tat对DC活化的效应，通过ELISA法评估与蛋白质、重建缓冲液(阴性对照)或LPS(阳性对照)培养18小时的细胞上清中已知可以激活免疫细胞并诱导Th-1型应答(Romagnani 1997)的细胞因子IL-12和TNF-α以及已知介导免疫应答(Moser 2001)的β-趋化因子RANTES、MIP-1α和MIP-1β的生成(附图18)。与活性Tat的温育诱导IL-12和TNF-α的水平剂量依赖式增长，与单独用缓冲液处理的细胞相比在最高Tat剂量下IL-12达到23倍(p＜0.02)、TNF-α达到20倍(p＜0.03)增长。类似地，Tat以剂量依赖方式显著增强RANTES(10倍，p＜0.02)、MIP-1α(97倍，p＜0.005)及MIP-1β(15倍，p＜0.01)的生成。重建缓冲液无效应，而LPS(阳性对照)显著增强细胞因子及β趋化因子两者的生成。
与天然Tat蛋白相反，氧化的和失活的Tat不提高IL-12或TNF-α的产生。因此，仅天然和活性Tat提高MDDC产生和分泌Th-1细胞因子和β-趋化因子。
实施例13
活性Tat提高MDDC对同种异型的呈递
为评估Tat对MDDC呈递抗原能力的影响，将细胞暴露于Tat蛋白、重建缓冲液、完全培养基或LPS(阳性对照)，并以一系列细胞-细胞比率与同种异型PBL培养(附图19)。之所以选择这一检测是因为，尽管对某一抗原来说不是特异的，但它可以提供有关MDDC整体抗原呈递功能的信息。未处理的MDDC诱导一定水平的同种异型的淋巴细胞增殖，依赖于所用的APC的数量。然而，用Tat脉冲的MDDC显著增强对同种异型PBL的增殖反应(在最高DC/PBL比率下为3.3倍，p＜0.01，)，达到与用LPS所诱导的类似水平(以同样的细胞-细胞比率下为3.8倍，p＜0.005)。相反，用重建缓冲液处理MDDC未观察到对同种异型淋巴细胞增殖的增强(附图19)。因此，天然Tat增强DC的呈递功能。
实施例14
活性Tat MDDC对异种抗原的呈递和特异T细胞应答
通过用蛋白质、重建缓冲液或完全培养基短暂处理细胞、并将其与自体淋巴细胞在回忆抗原TT存在下共培养来评价活性Tat对MDDC抗原-特异呈递能力的影响。如附图20所示，未经处理的MDDC诱导所分析的三名供体中的两名中自体淋巴细胞的TT-特异增殖(S.I.分别为15.4和7.3)，并且这一效应被用活性Tat处理而增强(S.I.分别为27.9和12.5)，但不被用重建缓冲液处理(S.I.分别为13和5.9)增强。Tat处理的MDDC在对TT不应答受试者中不诱导对TT的淋巴细胞增殖。因此，Tat可以加强针对其它抗原的特异T细胞应答。
实施例15
与Gag+MALP-2接种相比，用联合了SIV Gag+MALP-2粘膜佐剂的具生物活性Tat对小鼠的免疫诱导更强的抗-Gag体液和细胞内免疫应答。
由于其潜在的佐剂活性，如其对MDDC活性的影响所指示的，预料具生物活性Tat与一标称(nominal)抗原通过粘膜共给药时可以提高针该标称抗原的粘膜和系统免疫应答。为此目的，对Balb/c小鼠(附图21 arm2)用10μg混合了具生物活性Tat(10μg)的SIV Gag蛋白质皮内初次免疫刺激两次及之后用Tat+Gag+Malp-2鼻内加强两次。这些动物体内诱导的抗-Gag抗体水平，用ELISA检测，高于(附图22arm2)单独用Gag免疫的动物(附图21和22 arm1)。更重要的是，根据用于测定对加入效应细胞(在外源IL-2存在下用Gag肽混合物培养6天的脾细胞)前已用Gag肽混合物(靶)脉冲3-4小时的p815鼠肥大细胞瘤细胞的杀伤的典型5小时51铬释放检测的结果，包括CTL应答的Th-1型T细胞免疫应答被诱导。体液和细胞免疫应答都强于经如上述但是不加Tat免疫的对照组(附图23)。因此，与仅用标称抗原免疫小鼠相比，用标称抗原与具生物活性Tat一起进行的免疫产生更好的免疫应答。尤其是，发现了更高的血清IgG滴度和对标称抗原的CTL应答。类似地，可以预见具生物活性Tat对粘膜免疫应答(即，肺腔和阴道灌洗液中的分泌型IgA)的增强。
预言性实施例16
单独用由载体DNA表达的具生物活性Tat或与表达其它HIV抗原的DNA联用对猴进行的系统免疫会提高针对其它抗原的Th-1应答并可更好地控制病毒感染。
与用不含Tat的其它抗原实施的免疫接种相比，预计单独用Tat-DNA表达载体或与表达其它抗原的DNA联用对猴实施的系统免疫将诱导针对其自身的T细胞免疫应答和IFNγ Elispot(Th-1型)，并提高针对其它抗原的Th-1应答。此外，预计Tat与其它HIV抗原例如Env、Gag和Pol的联合将比单独使用Tat提供更好的针对致病SHIV89.6P的保护。
特别地，单独用HIV-1 tat DNA(0.5mg)或与HIV-1 env和SIVmac239gag DNA(各0.5mg)联用对幼年恒河猴(Macaca mulatta)进行肌内免疫接种(6周内接种3次)，其后是或者单独用具生物活性Tat蛋白(25μg)与ISCOMs或与25μgHIV-1 Env和25μg SIVmac239 Gag蛋白质联用实施两次肌内加强免疫，预计将产生仅针对具生物活性Tat蛋白质和/或其肽、或针对具生物活性Tat蛋白质和/或其肽和HIV-1 Env和SIVmac239Gag蛋白质和/或其肽的特异性Th-1免疫应答，包括对特异抗体的诱导、淋巴增殖应答和CTL，用对IFNγ、IL-2和IL-4的检测评估的。
进一步，因为Env和Gag/Pol抗原相对Tat Elispot的免疫优势和Tat自身固有的佐剂性，预计为获得对所有免疫原的相当的免疫应答，在用前者抗原初始接种之前至少要用后者实施两次免疫接种。因此预计，单独用HIV-1 tat DNA(0.5mg)或与各为0.5mg的HIV-1 env和SIVmac239gag/pol DNA联用(从第3次接种开始)(30周内接种7次)对幼年恒河猴的免疫接种(36周内接种9次)，其后是或者单独用具生物活性Tat蛋白质(25μg)和ISCOMs或者与各为25μg的HIV-1 Env和SIVmac239 Gag/Pol蛋白质和ISCOMs联用实施的两次肌内加强免疫，将产生更强和更宽的(与以前的更短的免疫方案相比)针对所有疫苗抗原的特异免疫应答，特别是根据用Elispot对IFNγ、IL-2和IL-4的检测评估的仅针对具生物活性Tat蛋白质和/或其肽、或针对具生物活性Tat蛋白质和/或其肽和HIV-1 Env和SIVmac239 Gag蛋白质和/或其肽的CTL应答。
最后预计，与单独用Tat或Gag/Pol免疫的动物相比，针对Tat、Env和Gag/Pol实施的免疫接种能更好的控制SHIV 89.6P静脉内感染。
参考文献
Addo，M. M.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1781，2001.
Albini，A.，et al.Proc.Natl. Acad.Sci.USA 92：4838，1995.
Albini，A.，et al.Nat.Med.2：1371，1996.
Albini，A.，et al.Proc. Natl.Ac ad. Sci. USA 95：13153，1998a.
Albini，A.，et al.J.Biol.Chem. 273：15895，998b.
Allen，T. M.，et al. Nature 407：386，2000.
Arya，S. K.，et al. Science 229：69，1985.
Badou，A.，et al.J.Virol.74：10551，2000.
Banchereau，J.，and R.M.Steinman.Nature 392：245，1998.
Barillari，G.，et al.J.Immunol.149：3727，1992.
Barillari，G.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7941，1993.
Barillari，G.，et al.J.Immunol.163：1929，1999a.
Barillari，G.，et al.Blood 94：663，1999b.
Bell，D.，et al.Adv.Immunol.72：255，1999.
Benelli，R.，et al. AIDS 12：261，1998.
Benjouad，A.，et al.FEBS Lett.319：119，1993.
Boykins，R.A.，et al.J.Immunol.163：15，1999.
Cafaro，A.，et al.Nat.Med.5：643，1999.
Cafaro，A.，et al.J.Med.Primatol.29：193，2000.
Cafaro，A.，et al.Vaccine 19：2862，2001.
Chang，H.C.，et al.AIDS 11：1421，1997.
Chang，H-K.，et al.J.Biomed.Sci.2：189，1995.
Chirmule，N.，et al.J.Virol.69：492，1995.
Cohen，S.S.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：10842，1999.
Derossi，D.，et al.Trends Cell.Biol.8：84，1998.
Ensoli，B.，et al.Nature 345：84，1990.
Ensoli，B.，et al.J.Virol.67：277，1993.
Ensoli，B.，et al.Nature 371：674，1994.
Fanales-Belasio，E.，et al.J.Immunol.159：2203，1997.
Fawell，S.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：664，1994.
Felber，B.K.，and G.N.Pavlakis.Science 239：184，1988.
Fiorelli，V.，et al.J.Immunol.162：1165，1999.
Fisher，A.G.，et al.Nature 320：367，1986.
Frankel，A.D.，and C.O.Pabo.Cell 55：1189，1988.
Frankel，A.D.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7397，1989.
Friedman-Kien，A.E.J.Am.Acad.Dermatol.5：468，1981.
Froebel，K.S.，et al.AIDS Res.Hum.Retroviruses 10 suppl.2：S83，1994.
Gallo，R.C.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8324，1999.
Ganju，R.K.，et al.J.Virol.72：6131，1998.
Goldstein，G.，et al.Vaccine 18：2789，2000.
Gutheil，W.G.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：6594，1994.
Huang，L.，et al.J.Virol.72：8952，1998.
Ito，M.，et al.AIDS Res.Hum.Retroviruses 14：845，1998.
Kim，D.T.，et al.J.Immunol.159：1666，1997.
Kolson，D.L.，et al.AIDS Res.Hum.Retroviruses 9：677，1993.
Lafrenie，R.M.，et al.J.Immunol.157：974，1996.
Li，C.J.，et al.Science 268：429，1995.
Li，C.J.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：8116，1997.
Mann，D.A.，and A.D.Frankel.EMBO J.10：1733，1991.
Masood，R.，et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.202：374，1994.
McCloskey，T.W.，et al.J.Immunol.158：1014，1997.
Micheletti，F.，et al.Eur.J.Immunol.29：2579，1999.
Milani，D.，et al.J.Biol.Chem.271：22961，1996.
Mitola，S.，et al.J. Virol.74：344，2000.
Mitola，S.，et al.Blood 90：1365，1997.
Morini，M.，et al.Biochem.Biophys.Res.Commun.273：267，2000.
Moser，B.，and P.Loetscher.Nat.Immunol.2：123，2001.
Moy，P.，et al.Mol.Biotechnol.6：105，1996.
Osterhaus，A.D.，et al.Vaccine 17：2713，1999.
Ott，M.，et al.Science 275：1481，1997.
Pauza，C.D.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：3515，2000.
Pittis，M.G.，et al.Viral.Immunol.9：169，1996.
Pober，J.S.In《Endothelial cell》，Una S.Ryan(ed.)C.R.C.Press Inc.，Boca
Raton，Florida，1998.
Poggi，A.，et al.J.Biol.Chem.273：7205，1998.
Purvis，S.F.，et al.AIDS Res.Hum.Retroviruses 11：443，1995.
Raines，E.W.，and R.Ross.J.Cell.Biol.116：533，1992.
Re，M.C.，et al.J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.10：408，1995.
Reiss，P.，et al.J.Med.Virol.30：163，1990.
Rodman，T.C.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7719，1993.
Romagnani，S.Immunol.Today 18：263，1997.
Rubartelli，A.，et al.Eur.J.Immunol.27：1893，1997.
Rusnati，M.，et al.J.Biol.Chem.273：16027，1998.
Sabatier，J.M.，et al.J.Virol.65：961，1991.
Safai，B.，et al.Ann.Intern.Med.103：744，1985.
Samaniego，F.，et al.Am.J.Pathol.152：433，1998.
Secchiero，P.，et al.J.Immunol.162：2427，1999.
Speiser，P.P.Methods Find Exp.Clin.Pharmacol.13：337，1991
Subramanyarm，M.，et al.J.Immunol.150：2544，1993.
Takeuchi，H.，et al.Adv.Drug Deliv.Rev.47：39，2001
Tyagi，M.，et al.J.Biol.Chem.276：3254，2001.
van Baalen，C.A.，et al.J.Gen.Virol.78：1913，1997.
Venet，A.，et al.J.Immunol.148：2899，1992.
Viscidi，R.P.，et al.Science 246：1606，1989.
Vogel，B.E.，et al.J.Cell.Biol.121：461，1993.
Weeks，B.S.，et al.J.Biol.Chem.268：5279，1993.
Wender，P.A.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：13003，2000.
Westendorp，M.O.，et al.Nature 375：497，1995.
Wrenger，S.，et al.FEBS Lett.383：145，1996.
Wrenger，S.，et al.J.Biol.Chem.272：30283，1997.
Wu，M.X.and S.F.Schlossman.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：13832，1997.
Zagury，D.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3851，1998.
Zagury，J.F.，et al.J.Hum.Virol.1：282，1998.
Zauli，G.，et al.Cancer Res.53：4481，1993.
Zauli， G.，et al.J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.10：306，1995a.
Zauli，G.，et al.Blood 86：3823，1995b.
Zocchi，M.R.，et al.AIDS 11：1227，1997.
                                 序列表
<110>Istituto Superiore di Sanità
<120>生物活性HIV-1 Tat、其片段或衍生物用于预防或治疗性免疫接种和/或治疗其
     它疾病中的靶向和/或激活抗原呈递细胞、和/或运送货物分子的用途
<130>2909PTWO
<150>EP01118114.6
<151>2001-07-26
<160>102
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>260
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>1
atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact      60
gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca     120
aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa     180
ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcagccca cctcccaatc ccgaggggac     240
ccgacaggcc gaaggaatga                                                 260
<210>2
<211>86
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>2
Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe
            20                  25                  30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
        35                  40                  45
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
    50                  55                  60
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp
65                  70                  75                  80
Pro Thr Gly Pro Lys Glu
                85
<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>3
cccacctccc aatcccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aa                        42
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>4
Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro Lys Glu
1               5                   10
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>5
acctcccaat cccgagggga cccgacaggc ccg                                  33
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>6
Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro
1               5                   10
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>7
tcccaatccc gaggggaccc gacaggc                                         27
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>8
Ser Gln Ser Arg Gly Asp Pro Thr Gly
1               5
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>9
caatcccgag gggacccgac a                                               21
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>10
Gln Ser Arg Gly Asp Pro Thr
1               5
<210>11
<211>15
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>11
tcccgagggg acccg                                                      15
<210>12
<211>5
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>12
Ser Arg Gly Asp Pro
1               5
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>13
tcccgagggg acccgaca                                                   18
<210>14
<211>6
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>14
Ser Arg Gly Asp Pro Thr
1               5
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>15
tcccgagggg acccgacagg c                                               21
<210>16
<211>7
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>16
Ser Arg Gly Asp Pro Thr Gly
1               5
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>17
caatcccgag gggacccgac aggc                                            24
<210>18
<211>8
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>18
Gln Ser Arg Gly Asp Pro Thr Gly
1               5
<210>19
<211>48
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>19
tgtaccaatt gctattgtaa aaagtgttgc tttcattgcc aagtttgt                  48
<210>20
<211>16
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>20
Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys
1               5                   10                  15
<210>21
<211>42
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>21
ggcaggaaga agcggagaca gcgacgaaga cctcctcaag gc                        42
<210>22
<211>14
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>22
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro  Pro Gln Gly
1               5                   10
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>23
ttcataacaa aagccttagg catctcctat                                      30
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>24
Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr
1               5                   10
<210>25
<211>60
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>25
atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact    60
<210>26
<211>20
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>26
Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Gln Pro Lys Thr
            20
<210>27
<211>60
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>27
atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact     60
<210>28
<211>20
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>28
Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Gln Pro Lys Thr
            20
<210>29
<211>42
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>29
tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact gcttgtacca at                        42
<210>30
<211>14
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>30
Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn
1               5                   10
<210>31
<211>60
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>31
gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca     60
<210>32
<211>20
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>32
Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val
1               5                   10                  15
Cys Phe Ile Thr
            20
<210>33
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>33
gtttgtttca taacaaaagc cttaggcatc tcctatggca ggaag                     45
<210>34
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>34
Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys
1               5                   10                  15
<210>35
<211>60
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>35
ggcccgaagg aacagaagaa gaaggtggag agagagacag agacagatcc ggtccatcag     60
<210>36
<211>20
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>36
Gly Pro Lys Glu Gln Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu Thr Asp
1               5                   10                  15
Pro Val His Gln
            20
<210>37
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>37
atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc cagga                     45
<210>38
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>38
Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly
1               5                   10                  15
<210>39
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>39
cctagactag agccctggaa gcatccagga agtcagccta aaact                     45
<210>40
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>40
Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln ProLys Thr
1               5                   10                 15
<210>41
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>41
tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact gcttgtacca attgc                     45
<210>42
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>42
Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys
1               5                   10                  15
<210>43
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>43
agtcagccta aaactgcttg taccaattgc tattgtaaaa agtgt                     45
<210>44
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>44
Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys
1               5                   10                  15
<210>45
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>45
gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaa                     45
<210>46
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>46
Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln
1               5                   10                  15
<210>47
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>47
tattgtaaaa agtgttgctt tcattgccaa gtttgtttca taaca                     45
<210>48
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>48
Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr
1               5                   10                  15
<210>49
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>49
tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca aaagccttag gcatc                     45
<210>50
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>50
Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile
1               5                   10                  15
<210>51
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>51
gtttgtttca taacaaaagc cttaggcatc tcctatggca ggaag                   45
<210>52
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>52
Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys
1               5                   10                  15
<210>53
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>53
aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcga                   45
<210>54
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>54
Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg
1               5                   10                  15
<210>55
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>55
tcctatggca ggaagaagcg gagacagcga cgaagacctc ctcaa                     45
<210>56
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>56
Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg  Pro Pro Gln
1               5                   10                   15
<210>57
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>57
aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa ggcagtcaga ctcat                     45
<210>58
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>58
Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His
1               5                   10                  15
<210>59
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>59
cgaagacctc ctcaaggcag tcagactcat caagtttctc tatca                     45
<210>60
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>60
Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
<210>61
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>61
ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcagccca cctcc                     45
<210>62
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>62
Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser
1               5                   10                  15
<210>63
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>63
caagtttctc tatcaaagca gcccacctcc caatcccgag gggac                     45
<210>64
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>64
Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp
1               5                   10                  15
<210>65
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>65
aagcagccca cctcccaatc ccgaggggac ccgacaggcc cgaag                     45
<210>66
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>66
Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro Lys
1               5                   10                  15
<210>67
<211>45
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>67
cagcctcgag gggacccgac aggcccgaag gaacagaaga agaag                     45
<210>68
<211>15
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>68
Gln Pro Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro Lys Glu Gln Lys  Lys  Lys
1               5                   10                    15
<210>69
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>69
gcttgtacca attgctattg taaaaag                                         27
<210>70
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>70
Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys
1               5
<210>71
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>71
tattgtaaaa agtgttgctt tcattgc                                         27
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>72
Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys
1               5
<210>73
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>73
tgctttcattgccaagtttg tttcata                                          27
<210>74
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>74
Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe Ile
1               5
<210>75
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>75
gtttgtttca taacaaaagc cttaggc                                         27
<210>76
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>76
Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly
1               5
<210>77
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>77
aaagccttag gcatctccta tggcagg                                         27
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>78
Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg
1               5
<210>79
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>79
tcctatggca ggaagaagcg gagacag                                         27
<210>80
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>80
Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln
1               5
<210>81
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>81
aagcggagac agcgacgaag acctcct                                         27
<210>82
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>82
Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro
1               5
<210>83
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>83
cgaagacctc ctcaaggcag tcagact                                         27
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>84
Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
1               5
<210>85
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>85
ggcagtcaga ctcatcaagt ttctcta                                         27
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>86
Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu
1               5
<210>87
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>87
caagtttctc tatcaaagca gcccacc                                         27
<210>88
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>88
Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr
1               5
<210>89
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>89
aagcagccca cctcccaatc ccgaggg                                         27
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>90
Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly
1               5
<210>91
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>91
caatcccgag gggacccgac aggcccg                                         27
<210>92
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>92
Gln Ser Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro
1               5
<210>93
<211>27
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>93
ccgacaggcc cgaaggaaca gaagaag                                         27
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>94
Pro Thr Gly Pro Lys Glu Gln Lys Lys
1               5
<210>95
<211>261
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>95
atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact     60
gctggtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca    120
aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa    180
ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcagccca cctcccaatc ccgaggggac    240
ccgacaggcc cgaaggaatg a                                              261
<210>96
<211>86
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>96
Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Gln Pro Lys Thr Ala Gly Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe
            20                  25                  30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
        35                  40                  45
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
    50                  55                  60
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp
65                  70                  75                  80
Pro Thr Gly Pro Lys Glu
                85
<210>97
<211>261
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>97
atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact      60
gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca     120
aacgccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa     180
ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcagccca cctcccaatc ccgaggggac     240
ccgacaggcc cgaaggaatg a                                               261
<210>98
<211>86
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>98
Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe
            20                  25                  30
His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Thr Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
        35                  40                  45
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr
    50                  55                  60
His Gln Val Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp
65                  70                  75                  80
Pro Thr Gly Pro Lys Glu
                85
<210>99
<211>402
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>99
atggagacac ccttgaaggc gccagagagc tcattaaagt cctgcaacga gcccttttca      60
cgcacttcag agcaggatgt ggccactcaa gaattggcca gacaagggga ggaaatcctc     120
tctcagctat accgacccct agaaacatgc aataactcat gctattgtaa gcgatgctgc     180
taccattgtc agatgtgttt tctaaacaag gggctcggga tatgttatga acgaaagggc     240
agacgaagaa ggactccaaa gaaaactaag actcatcgag gggacccgtc tcctacacca     300
gacaaatcca tatccacaag gaccggggac agccagccaa cgaagaaaca gaagaagacg     360
gtggaagcaa cggtggagac agatactggc cctggccgat ag                        402
<210>100
<211>133
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>100
Met Glu Thr Pro Leu Lys Ala Pro Glu Ser Ser Leu Lys Ser Cys Asn
1               5                   10                  15
Glu Pro Phe Ser Arg Thr Ser Glu Gln Asp Val Ala Thr Gln Glu Leu
            20                  25                  30
Ala Arg Gln Gly Glu Glu Ile Leu Ser Gln Leu Tyr Arg Pro Leu Glu
        35                  40                  45
Thr Cys Asn Asn Ser Cys Tyr Cys Lys Arg Cys Cys Tyr His Cys Gln
    50                  55                  60
Met Cys Phe Leu Asn Lys Gly Leu Gly Ile Cys Tyr Glu Arg Lys Gly
65                  70                  75                  80
Arg Arg Arg Arg Thr Pro Lys Lys Thr Lys Thr His Arg Gly Asp Pro
                85                  90                  95
Ser Pro Thr Pro Asp Lys Ser Ile Ser Thr Arg Thr Gly Asp Ser Gln
            100                 105                 110
Pro Thr Lys Lys Gln Lys Lys Thr Val Glu Ala Thr Val Glu Thr Asp
        115                 120                 125
Thr Gly Pro Gly Arg
    130
<210>101
<211>390
<212>DNA
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>101
atggagacac ccttgaaggc gccagagagc tcattaaagt cctgcaacga gcccttttca      60
cgcacttcag agcaggatgt ggccactcaa gaattggcca gacaagggga ggaaatcctc     120
tctcagctat accgacccct agaaacatgc aataactcat gctattgtaa gcgatgctgc     180
taccattgtc agatgtgttt tctaaacaag gggctcggga tatgttatga acgaaagggc     240
agacgaagaa ggactccaaa gaaaactaag actcatccgt ctcctacacc agacaaatcc     300
atatccacaa ggggggacag ccagccaacg aagaaacaga agaagacggt ggaagcaacg     360
gtggagacag atactggccc tggccgatag                                      390
<210>102
<211>129
<212>PRT
<213>艾滋病相关逆转录病毒
<400>102
Met Glu Thr Pro Leu Lys Ala Pro Glu Ser Ser Leu Lys Ser Cys Asn
1               5                   10                  15
Glu Pro Phe Ser Arg Thr Ser Glu Gln Asp Val Ala Thr Gln Glu Leu
            20                  25                  30
Ala Arg Gln Gly Glu Glu Ile Leu Ser Gln Leu Tyr Arg Pro Leu Glu
        35                  40                  45
Thr Cys Asn Asn Ser Cys Tyr Cys Lys Arg Cys Cys Tyr His Cys Gln
    50                  55                  60
Met Cys Phe Leu Asn Lys Gly Leu Gly Ile Cys Tyr Glu Arg Lys Gly
65                  70                  75                  80
Arg Arg Arg Arg Thr Pro Lys Lys Thr Lys Thr His Pro Ser Pro Thr
                85                  90                  95
Pro Asp Lys Ser Ile Ser Thr Arg Gly Asp Ser Gln Pro Thr Lys Lys
            100                 105                 110
Gln Lys Lys Thr Val Glu Ala Thr Val Glu Thr Asp Thr Gly Pro Gly
        115                 120                 125
Arg

Claims (55)

1、分离的天然、基本上是单体的具生物活性HIV-1 Tat、其片段或衍生物用于选择性靶向表达α5β1和/或αvβ3整合素的抗原呈递细胞，包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞，运送货物分子穿过细胞膜和/或核膜及诱导它们的成熟和/或它们的抗原呈递功能的用途。
2、根据权利要求1的用途，其中分离的天然、基本上是单体的具生物活性HIV-1 Tat、其片段或衍生物将选择性靶向表达α5β1和αvβ3整合素的抗原呈递细胞，包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞，以摄取选择性结合于这些细胞的Tat、片段、其衍生物以及结合于Tat、片段、其衍生物的货物分子。
3、根据权利要求1的用途，其中分离的天然、基本上是单体的具生物活性HIV-1 Tat、其片段或衍生物将选择性靶向、结合并进入表达α5β1和αvβ3整合素的抗原呈递细胞，包括树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞，以诱导它们的成熟和/或它们的抗原呈递功能。
4、根据权利要求2的用途，用于选择性靶向表达α5β1和αvβ3整合素或其它整合素的抗原呈递细胞，包括但不限于能够通过整合素介导的途径和/或其它带来选择性摄取的摄取途径摄取Tat的树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞，以运送抗原和/或治疗性化合物。
5、根据权利要求4的用途，其中Tat运送肽、蛋白质或编码它们的DNA的形式的抗原。
6、根据权利要求5的用途，其中Tat运送一种或多种抗原以诱导免疫应答。
7、根据权利要求6的用途，其中抗原选自来自细胞内病原体，例如，病毒、结核分枝杆菌、念珠菌属、疟疾，或来自肿瘤细胞例如那些源自肺、结肠、乳腺、前列腺癌的肿瘤细胞的抗原，但特别排除HIV抗原Gag、Nef、Rev。
8、根据权利要求4的用途，其中Tat与一种或多种选自蛋白质、肽或编码它们的DNA的化合物融合以在体外和体内、细胞间或向细胞膜运送这样的化合物。
9、根据权利要求8的用途，其中化合物是一种或多种抗原，所述抗原选自源自细胞内病原体例如病毒、结核分枝杆菌、念珠菌属、疟疾，或源自肿瘤细胞例如那些源自肺、结肠、乳腺、前列腺癌肿瘤细胞的抗原，但是特别排除HIV抗原Gag、Nef、Rev。
10、根据权利要求8的用途，其中用于与Tat融合的化合物是一种或多种治疗性分子，选自抗病毒化合物、抗炎症药物、抗-血管生成分子、细胞毒性抗肿瘤药物、免疫调节分子例如趋化因子或细胞因子、抗体及相应混合物。
11、根据权利要求2的用途，其中Tat，单独或与其它蛋白质、肽或编码它们的DNA形式的化合物一起，结合于颗粒上，例如微米颗粒、纳米颗粒、脂质体和其它颗粒化的惰性载体及其混合物。
12、根据权利要求11的用途，其中化合物是一种或多种抗原，该抗原选自源自细胞内病原体例如病毒、结核分枝杆菌、念珠菌属、疟疾，或源自肿瘤细胞例如那些肺、结肠、乳腺、前列腺癌肿瘤细胞的抗原，但是特别排除HIV抗原Gag、Nef、Rev。
13、根据权利要求11的用途，其中化合物是一种或多种治疗性分子，选自抗病毒化合物、抗炎症药物、抗-血管生成分子、细胞毒性抗肿瘤药物、免疫调节分子例如趋化因子或细胞因子、抗体及相应混合物。
14、根据权利要求2和11的用途，其中化合物是一种或多种表达载体。
15、根据权利要求14的用途，其中的表达载体选自表达一种或多种抗原的质粒DNA、细菌或病毒载体。
16、根据权利要求3的用途，用于为运送一种或多种抗原以增强免疫应答并诱导针对传染性疾病和肿瘤的Th-1型免疫应答而选择性靶向表达α5β1和αvβ3整合素或其它整合素的抗原呈递细胞，包括但不限于能够通过整合素介导的途径和/或其它带来选择性摄取的摄取途径摄取Tat的树突细胞、内皮细胞和巨噬细胞。
17、根据权利要求16的用途，其中Tat运送肽、蛋白质或编码它们的DNA的形式的抗原。
18、根据权利要求17的用途，其中Tat运送一种或多种抗原以诱导免疫应答。
19、根据权利要求16的用途，其中Tat与一种或多种选自蛋白质、肽或编码它们的DNA的化合物融合以在体外和体内、细胞间或向细胞膜运送这样的化合物。
20、根据权利要求19的用途，其中化合物是一种或多种免疫调节分子例如趋化因子或细胞因子、抗体及相应的混合物。
21、根据权利要求19的用途，其中化合物是一种或多种抗原，所述抗原选自源自细胞内病原体例如病毒、结核分枝杆菌、念珠菌属、疟疾，或源自肿瘤细胞例如那些肺、结肠、乳腺、前列腺癌肿瘤细胞的抗原，但是特别排除HIV抗原Gag、Nef、Rev。
22、根据权利要求3的用途，其中Tat，单独或与其它蛋白质、肽或编码它们的DNA形式的化合物一起，结合于颗粒上，例如微米颗粒、纳米颗粒、脂质体和其它颗粒化的惰性载体及其混合物。
23、根据权利要求22的用途，其中化合物是一种或多种抗原，所述抗原选自源自细胞内病原体例如病毒、结核分枝杆菌、念珠菌属、疟疾，或源自肿瘤细胞例如那些肺、结肠、乳腺、前列腺癌肿瘤细胞的抗原，但是特别排除HIV抗原Gag、Nef、Rev。
24、根据权利要求22的用途，其中化合物是一种或多种免疫调节分子，例如趋化因子或细胞因子、抗体及相应的混合物。
25、根据权利要求3和22的用途，其中化合物是一种或多种表达载体。
26、根据权利要求25的用途，其中的表达载体选自表达一种或多种抗原的质粒DNA、细菌或病毒载体。
27、根据前述权利要求的用途，用于制备针对传染性疾病的预防性和治疗性免疫接种的疫苗。
28、根据前述权利要求的用途，用于制备针对肿瘤的预防性和治疗性免疫接种的疫苗。
29、根据前述权利要求的用途，用于制备治疗传染性疾病的药物。
30、根据前述权利要求的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。
31、根据前述权利要求的用途，用于制备治疗炎症和血管生成疾病的药物。
32、tat DNA、片段或其衍生物的用途，用于制备针对传染性疾病或肿瘤的预防性和治疗性免疫接种的疫苗。
33、tat DNA、片段或其衍生物的用途，用于制备治疗选自传染性疾病、炎症疾病、血管生成疾病、肿瘤的疾病的药物。
34、与编码其它抗原的DNA融合或组合的tat DNA、其片段或衍生物的用途，用于制备针对传染性疾病和肿瘤的预防性和治疗性免疫接种的疫苗。
35、根据权利要求32-34的用途，其中tat DNA与选自下列的抗原组合：源自细胞内病原体例如病毒、结核分枝杆菌、念珠菌属、疟疾，或源自肿瘤细胞例如那些肺、结肠、乳腺、前列腺癌肿瘤细胞的抗原，但是特别排除HIV抗原Gag、Nef、Rev。
36、根据权利要求32-35的用途，其中tat DNA，单独或与其它抗原DNA或治疗性化合物组合，结合于颗粒例如微米颗粒、纳米颗粒、脂质体和其它颗粒化的惰性载体及其混合物。
37、根据前述权利要求的用途，其中tat DNA包含SEQ ID NO 1、99、或101所示序列。
38、根据前述权利要求的用途，其中Tat包含SEQ ID NO 2、100、或102所示氨基酸序列。
39、根据前述权利要求的用途，其中具生物活性Tat或tat DNA的片段选自单独或联合包含RGD结构域、半胱氨酸富集区、碱性结构域的Tat肽或相应的tat DNA。
40、根据权利要求39的用途，其中片段与其它包含核心区域：HTLV-IIIB，克隆BH-10，中的aa38至47和/或氨基末端区域：HTLV-IIIB，克隆BH-10，中的aa1至20的HIV-1 Tat肽或相应的tatDNA结合。
41、根据权利要求39-40的用途，其中RGD结构域包含：HTLV-IIIB，克隆BH-10，中的aa73至86，aa74至84，aa75至83，aa76至82，aa77至81，aa77至82，aa77至83，aa76至83；半胱氨酸富集区包含：HTLV-IIIB，克隆BH-10，中的aa22至37；碱性结构域包含：HTLV-IIIB，克隆BH-10，中的aa48至61，以及所有它们相应的核苷酸序列。
42、根据权利要求1-38的用途，其中具生物活性Tat或tat DNA的片段选自任一在它们的氨基酸序列或相应的核苷酸序列HTLV-IIIB，克隆BH-10或89.6，中含有一个或多个T-细胞表位的HIV变体(HIV-1、HIV-2和其它HIV类型和亚型)。
43、根据权利要求1-38的用途，其中Tat或tat DNA衍生物包含变体HTLV-IIIB，克隆BH-10的Tat突变体，其选自包含具半胱氨酸22和/或赖氨酸41的氨基酸序列或对应的核苷酸序列。
44、药物组合物，包含作为活性组分的有效量的与下列至少一种组合或融合的具生物活性HIV Tat或tat DNA、其片段及衍生物：抗原、治疗性化合物、佐剂、支持物颗粒，用于针对传染性疾病和肿瘤的预防性和治疗性免疫接种或治疗选自传染性疾病、炎症和血管生成疾病、肿瘤。
45、根据权利要求44的药物组合物，其中抗原选自源自细胞内病原体例如病毒、结核分枝杆菌、念珠菌属、疟疾，或源自肿瘤细胞例如那些肺、结肠、乳腺、前列腺癌肿瘤细胞的抗原，但是特别排除HIV抗原Gag、Nef、Rev。
46、根据权利要求44的药物组合物，其中治疗性化合物选自抗病毒化合物、抗炎症药物、抗-血管生成分子、细胞毒性抗肿瘤药物、免疫调节分子例如趋化因子或细胞因子、抗体及相应混合物。
47、根据权利要求44的药物组合物，其中支持物颗粒选自微米颗粒、纳米颗粒、脂质体和其它颗粒化的运送系统及其混合物。
48、根据权利要求44的药物组合物，其中佐剂选自Alum、RIBI、ISCOMS、CpG序列、脂肽及相应混合物。
49、根据权利要求44的药物组合物，其中传染性疾病选自：那些由人或动物病毒、细菌或其它细胞内和细胞外病原体引起的感染，包括性传染性疾病、心内膜炎、尿道感染、骨髓炎、皮肤感染、或链球菌和葡萄球菌感染、肺炎球菌感染、破伤风、脑膜炎双球菌感染、结核、疟疾、念珠菌病、螺杆菌引起的感染、沙门氏菌引起的感染、梅毒、疱疹感染，包括水痘、单核细胞增多症和EB病毒源性感染、人疱疹病毒-8感染、巨细胞病毒、唇疱疹和生殖器疱疹，肝炎病毒感染(A、B、C、D、G)、乳头瘤病毒源性感染、流感、利斯特氏菌、霍乱弧菌。
50、根据权利要求44的药物组合物，其中炎症疾病是与病毒、细菌或寄生虫感染有关或无关的变态反应或炎症，包括免疫介导的皮肤疾病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性硬化症、皮肌炎、肖格伦综合征(Sj_gren syndrome)、肾小球肾炎咯血综合征、脉管炎、肉样瘤病、骨关节病、传染性关节炎、牛皮癣、Chron病、溃疡性直肠结肠炎、tvroiditis、硬皮病、变应性疾病。
51、根据权利要求44的药物组合物，其中血管生成疾病选自非瘤血管增生疾病包括糖尿病性视网膜病变、晶状体后纤维组织增生、粒性结膜炎、血管性青光眼、免疫炎症、非免疫炎症、动脉粥样硬化、过度伤口愈合、皮血管炎、结肠血管发育不良、血管性水肿和血管纤维瘤。
52、根据权利要求44的药物组合物，其中肿瘤选自包括软组织、骨、软骨和血液肿瘤的良性和恶性肿瘤，例如但不限于，卡波西肉瘤和其它的皮肤、肺、乳腺、消化道、肝脏、胰腺、内分泌系统、子宫、卵巢的瘤形成、肉瘤、急性和慢性白血病以及淋巴细胞的瘤形成。
53、根据权利要求44-52的药物组合物，进一步包括佐剂、稀释剂、赋形剂、载体。
54、根据权利要求44-52的药物组合物，为片剂、丸剂、喷剂、注射溶液、悬液、粉剂、霜剂、软膏形式。
55、根据权利要求44-52的药物组合物，通过非胃肠道：皮下、肌肉、皮内或粘膜：阴道、直肠、口、鼻或局部途径给药。
CNB028146581A 2001-07-26 2002-07-26 生物活性HIV－1Tat、其片段或衍生物用于预防或治疗性免疫接种和/或治疗其它疾病中靶向和/或激活抗原呈递细胞、和/或运送货物分子的用途 Expired - Fee Related CN1318091C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01118114.6 2001-07-26
EP01118114A EP1279404A1 (en) 2001-07-26 2001-07-26 Use of HIV-1 tat, fragments or derivatives thereof, to target or to activate antigen-presenting cells, to deliver cargo molecules for vaccination or to treat other diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1533284A true CN1533284A (zh) 2004-09-29
CN1318091C CN1318091C (zh) 2007-05-30

Family

ID=8178141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028146581A Expired - Fee Related CN1318091C (zh) 2001-07-26 2002-07-26 生物活性HIV－1Tat、其片段或衍生物用于预防或治疗性免疫接种和/或治疗其它疾病中靶向和/或激活抗原呈递细胞、和/或运送货物分子的用途

Country Status (19)

Country Link
US (1) US7811573B2 (zh)
EP (2) EP1279404A1 (zh)
JP (1) JP5134183B2 (zh)
CN (1) CN1318091C (zh)
AP (1) AP2004002986A0 (zh)
AT (1) ATE510558T1 (zh)
AU (1) AU2002331350B2 (zh)
BR (1) BR0211474A (zh)
CA (1) CA2455227C (zh)
DK (1) DK1425035T3 (zh)
EA (1) EA006850B1 (zh)
ES (1) ES2367255T3 (zh)
HU (1) HUP0400660A2 (zh)
IL (1) IL160015A0 (zh)
MX (1) MXPA04000287A (zh)
NZ (1) NZ531364A (zh)
OA (1) OA12701A (zh)
PL (1) PL368243A1 (zh)
WO (1) WO2003009867A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100429228C (zh) * 2005-06-17 2008-10-29 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 重组人a20蛋白及其用途
CN103880961A (zh) * 2012-12-19 2014-06-25 邱书奇 一种诱导免疫耐受融合肽构建
CN105535937A (zh) * 2016-03-11 2016-05-04 刘红 一种用于治疗类风湿性关节炎的皮下注射用原位凝胶
CN110225760A (zh) * 2016-09-15 2019-09-10 威瑞斯公司 T细胞免疫疗法
CN111295393A (zh) * 2017-10-31 2020-06-16 康沃斯制药公司 靶向干细胞因子及半乳糖凝集素-1的双重靶向抗体及其用途
CN113287013A (zh) * 2019-01-04 2021-08-20 国立大学法人京都大学 溃疡性大肠炎以及原发性硬化性胆管炎的检查方法
CN113939313A (zh) * 2019-06-06 2022-01-14 电化株式会社 以肽核酸为基础的佐剂

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0323840D0 (en) * 2003-10-10 2003-11-12 Ist Superiore Sanita Vaccines
GB0405480D0 (en) 2004-03-11 2004-04-21 Istituto Superiore Di Sanito Novel tat complexes,and vaccines comprising them
US7927580B2 (en) 2004-03-16 2011-04-19 Nanirx, Inc. Tat-based immunomodulatory compositions and methods of their discovery and use
WO2007001448A2 (en) 2004-11-04 2007-01-04 Massachusetts Institute Of Technology Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals
WO2007070682A2 (en) 2005-12-15 2007-06-21 Massachusetts Institute Of Technology System for screening particles
WO2008105773A2 (en) 2006-03-31 2008-09-04 Massachusetts Institute Of Technology System for targeted delivery of therapeutic agents
CA2652280C (en) 2006-05-15 2014-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Polymers for functional particles
WO2007150030A2 (en) 2006-06-23 2007-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic synthesis of organic nanoparticles
CA2660830A1 (en) * 2006-08-14 2008-02-21 Gideon Goldstein Compositions and methods for the treatment and prophylaxis of multiple strains and subtypes of hiv-1
US9217129B2 (en) 2007-02-09 2015-12-22 Massachusetts Institute Of Technology Oscillating cell culture bioreactor
US20090074828A1 (en) 2007-04-04 2009-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Poly(amino acid) targeting moieties
MX350501B (es) 2007-10-12 2017-09-07 Massachusetts Inst Technology Nanotecnologia de vacuna.
GB0802224D0 (en) * 2008-02-06 2008-03-12 Inst Superiore Di Sanito Process for the production of vaccine components
ES2648196T3 (es) 2008-02-07 2017-12-29 The University Of Washington Dispositivo aerosol circunferencial
EP2106803A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-07 Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor Method to design and uses of overlapping peptides for monitoring T-cell responses in HIV patients
US9439922B2 (en) 2008-05-14 2016-09-13 Jawaharlal Nehru Centre For Advanced Scientific Research Tat DNA sequences, gene constructs, vaccine and processes thereof
US8591905B2 (en) 2008-10-12 2013-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nicotine immunonanotherapeutics
US8343498B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 Massachusetts Institute Of Technology Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics
US8277812B2 (en) 2008-10-12 2012-10-02 Massachusetts Institute Of Technology Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen
US8343497B2 (en) * 2008-10-12 2013-01-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeting of antigen presenting cells with immunonanotherapeutics
AU2010230073B2 (en) 2009-03-23 2016-05-26 Pin Pharma, Inc. Treatment of cancer with immunostimulatory HIV Tat derivative polypeptides
US20130078276A1 (en) * 2010-02-18 2013-03-28 Harriet L. Robinson Vectors expressing hiv antigens and gm-csf and related methods of generating an immune response
US20110287045A1 (en) * 2010-05-20 2011-11-24 Zongdong Li Enhanced immune response against infections
BR112013022249B8 (pt) 2011-03-03 2022-10-25 Impel Neuropharma Inc Dispositivo de distribuição de droga nasal
CN103619485B (zh) 2011-05-09 2017-08-08 英倍尔药业股份有限公司 用于鼻腔药物递送的喷嘴
CA2884677C (en) * 2012-09-13 2020-06-23 Universite De Geneve Cell penetrating peptides derived from the epstein barr virus, compositions and methods thereof
WO2014179228A1 (en) 2013-04-28 2014-11-06 Impel Neuropharma Inc. Medical unit dose container
AU2014329393B2 (en) 2013-10-04 2020-04-30 Pin Pharma, Inc. Immunostimulatory HIV Tat derivative polypeptides for use in cancer treatment
US20170044218A1 (en) 2014-04-24 2017-02-16 Janssen Sciences Ireland Uc Use of a HIV derived accessory protein for the reactivation of latent HIV
JP6753927B2 (ja) 2015-09-10 2020-09-09 インペル ニューロファーマ インコーポレイテッド 直列形経鼻送達デバイス
US11278607B2 (en) 2016-01-08 2022-03-22 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
WO2019104192A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Impel Neuropharma, Inc. Intranasal device with inlet interface
WO2019104205A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Impel Neuropharma, Inc. Intranasal device with dip tube
AU2019205318B2 (en) 2018-01-05 2022-02-03 Impel Pharmaceuticals Inc. Intranasal delivery of dihydroergotamine by precision olfactory device
JP2021509677A (ja) 2018-01-05 2021-04-01 インペル ニューロファーマ インコーポレイテッド 精密嗅覚装置によるオランザピンの鼻孔間送達
CN112955134A (zh) 2018-07-19 2021-06-11 英倍尔药业股份有限公司 用于治疗帕金森氏病的左旋多巴和多巴脱羧酶抑制剂的呼吸道递送
KR20210109007A (ko) 2019-01-03 2021-09-03 임펠 뉴로파마 인코포레이티드 비강 약물 전달 장치
EP3969085A4 (en) 2019-05-17 2023-06-21 Impel Pharmaceuticals Inc. DISPOSABLE NASAL DELIVERY DEVICE
CN111450082A (zh) * 2020-04-26 2020-07-28 天津大学 一种系统性红斑狼疮治疗纳米颗粒的合成方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9720585D0 (en) * 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
IT1297090B1 (it) * 1997-12-01 1999-08-03 Barbara Ensoli Tat di hiv-1 o suoi derivati, da soli od in combinazione, a scopo vaccinale, profilattico e terapeutico, contro l'aids i tumori e le
FI105105B (fi) * 1998-02-27 2000-06-15 Finnish Immunotechnology Ltd O Itsereplikoiva DNA-vektori immunisoimiseksi HIV:ta vastaan
WO2000078969A1 (en) * 1999-06-21 2000-12-28 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv tat peptides and multiple peptide conjugate system
ES2250151T3 (es) 1999-06-29 2006-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Uso de cpg como adyuvante de vacuna contra vih.
US6667151B1 (en) 1999-08-12 2003-12-23 Inist, Inc. Vaccines and immunotherapeutics derived from the human immunodeficiency virus (HIV) trans-activator of transcription protein for the treatment and prevention of HIV disease
AU7577600A (en) * 1999-09-13 2001-04-17 Cornell Research Foundation Inc. Delivering to eucaryotic cells bacterial proteins that are secreted via type iiisecretion systems
NZ520327A (en) 2000-01-31 2004-06-25 Smithkline Beecham Biolog S Use of human immunodeficiency virus proteins in vaccines
WO2001054717A1 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Vic Jira Vaccine composition, process and methods
US6544780B1 (en) 2000-06-02 2003-04-08 Genphar, Inc. Adenovirus vector with multiple expression cassettes
AT410635B (de) 2000-10-18 2003-06-25 Cistem Biotechnologies Gmbh Vakzin-zusammensetzung

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100429228C (zh) * 2005-06-17 2008-10-29 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 重组人a20蛋白及其用途
CN103880961A (zh) * 2012-12-19 2014-06-25 邱书奇 一种诱导免疫耐受融合肽构建
CN105535937A (zh) * 2016-03-11 2016-05-04 刘红 一种用于治疗类风湿性关节炎的皮下注射用原位凝胶
CN105535937B (zh) * 2016-03-11 2018-03-13 刘红 一种用于治疗类风湿性关节炎的皮下注射用原位凝胶
CN110225760A (zh) * 2016-09-15 2019-09-10 威瑞斯公司 T细胞免疫疗法
CN110225760B (zh) * 2016-09-15 2023-11-07 埃里西拉医疗公司 T细胞免疫疗法
CN111295393A (zh) * 2017-10-31 2020-06-16 康沃斯制药公司 靶向干细胞因子及半乳糖凝集素-1的双重靶向抗体及其用途
CN111295393B (zh) * 2017-10-31 2023-09-26 新奇贵族公司 靶向干细胞因子及半乳糖凝集素-1的双重靶向抗体及其用途
CN113287013A (zh) * 2019-01-04 2021-08-20 国立大学法人京都大学 溃疡性大肠炎以及原发性硬化性胆管炎的检查方法
CN113939313A (zh) * 2019-06-06 2022-01-14 电化株式会社 以肽核酸为基础的佐剂
US12016920B2 (en) 2019-06-06 2024-06-25 Denka Company Limited Adjuvant based on peptide nucleic acid

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0400660A2 (hu) 2005-01-28
JP2005505520A (ja) 2005-02-24
DK1425035T3 (da) 2011-08-29
CN1318091C (zh) 2007-05-30
US7811573B2 (en) 2010-10-12
PL368243A1 (en) 2005-03-21
AU2002331350B2 (en) 2008-06-12
EP1279404A1 (en) 2003-01-29
BR0211474A (pt) 2004-07-13
MXPA04000287A (es) 2005-03-07
WO2003009867A1 (en) 2003-02-06
US20050036985A1 (en) 2005-02-17
EP1425035A1 (en) 2004-06-09
EP1425035B1 (en) 2011-05-25
NZ531364A (en) 2005-12-23
CA2455227A1 (en) 2003-02-06
OA12701A (en) 2006-06-23
EA200400227A1 (ru) 2004-06-24
AP2004002986A0 (en) 2004-03-31
IL160015A0 (en) 2004-06-20
EA006850B1 (ru) 2006-04-28
ATE510558T1 (de) 2011-06-15
JP5134183B2 (ja) 2013-01-30
CA2455227C (en) 2012-01-24
ES2367255T3 (es) 2011-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1533284A (zh) 生物活性 H I V － 1 T a t、其片段或衍生物用于预防或治疗性免疫接种和/或治疗其它疾病中靶向和/或激活抗原呈递细胞、和/或运送货物分子的用途
CN1283121A (zh) 用于预防和治疗接种的hiv－1tat或其衍生物
CN1460111A (zh) 来自gagp17和p24保守区域的HIV肽以及它们在例如疫苗中的应用
CN1659187A (zh) 融合铁蛋白在疫苗和其他方面的应用
CN1446102A (zh) 模仿天然病毒感染并诱导对病原体的持久免疫力的遗传疫苗
CN1561389A (zh) 糖基神经酰胺作为用于抗传染病和癌症的疫苗的佐剂的用途
CN1606624A (zh) 疫苗
CN1411512A (zh) 嵌合的免疫原性组合物及其编码核酸
CN1868545A (zh) 改良疫苗
CN1762490A (zh) 基于癌抑制基因wt1的产物的癌抗原
CN1845995A (zh) 用于破坏宿主对外来抗原的耐受性的嵌合抗原
CN1244807A (zh) 改良疫苗
CN1950106A (zh) 用作肿瘤特异性疫苗的合成蛋白质
CN1929860A (zh) HIV gp41衍生肽的位点特异性化学修饰
CN1079166A (zh) 用白细胞介素-10抑制移植物抗宿主病
CN101048178A (zh) 作为疫苗的重组分枝杆菌和生物活性剂的组合
CN1602202A (zh) 鉴定和开发治疗剂的方法
CN101062952A (zh) 由人血清白蛋白和干扰素组成的融合蛋白及其编码基因与应用
CN1684972A (zh) 由聚合物和HIVgp41衍生肽组成的共轭物以及他们在治疗中的应用
CN101057975A (zh) 一种抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的鸡尾酒疫苗及其应用
CN1656116A (zh) 包含hpv－16病毒的突变e7蛋白的非免疫抑制免疫原性组合物或疫苗组合物
CN1639569A (zh) 诱导免疫应答的方法和组合物
CN1930184A (zh) 新型tat复合物，及包含其的疫苗
CN1626669A (zh) 完全人源化抗体的制备
CN1948333A (zh) 一种新的hPEBP4蛋白来源的HLA－A2限制性表位多肽及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20070530

Termination date: 20180726

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee