CN110225760A - T细胞免疫疗法 - Google Patents

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Abstract

在T细胞免疫疗法中有用的T细胞包含CAR、TCR和/或编码CAR和/或TCR的一个或多个核酸序列。该T细胞还包含HP‑NAP、其免疫学等效片段和/或编码HAP‑NAP和/或其免疫学等效片段的一个或多个核酸序列。该T细胞在免疫疗法中具有改善的效果，包括改善的细胞毒性、刺激趋化因子和细胞因子分泌、促进树突状细胞成熟和先天免疫细胞的招募和激活。

Description

T细胞免疫疗法
技术领域
本实施方式总体上涉及T细胞，尤其涉及适用于T细胞免疫疗法的此类T细胞。
背景技术
免疫疗法目前正面临着癌症的管理方面的重大突破。使用针对乳腺癌的(抗Her2)和针对B细胞恶性肿瘤的(抗CD20)的单克隆抗体疗法的成功案例为更复杂的免疫疗法铺平了道路，例如其为一种用于转移性前列腺癌的树突状细胞(DC)疫苗。最近，使用靶向免疫系统而非肿瘤细胞的单克隆抗体的免疫疗法已被证明是成功的。单克隆抗CTLA4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)抗体和抗PD1(程序性细胞死亡蛋白1)抗体有效释放用于T细胞的断裂，从而使它们附着于肿瘤细胞。治疗性T细胞在单次注射后运送至疾病位点、扩增并且驻留的潜力仍然是其相对于单克隆抗体的主要优势。事实上，使用肿瘤浸润性T细胞(TIL)的继承性转移的癌症免疫疗法在许多案例中可以获得治愈[1]。可替代地，如果肿瘤相关抗原(TAA)是已知的，则可以从癌症患者的外周血中分离出大量T细胞，用于使用识别肿瘤相关抗原的分子进行基因工程化，此后将它们重新输注给患者。
可以改造T细胞以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)，其识别肿瘤相关抗原。来自正在进行的试验的最新出版物证明，这种设计的T细胞可以诱导患有难治性癌症的患者的完全缓解[2-4]。
在患有晚期B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)的患者中观察到针对CD19的CAR的成功尝试，其中CAR T细胞在继承性转移时极好地增殖[2、4、5]。
在较低程度上，也观察到针对难治性B细胞淋巴瘤的临床成功。淋巴瘤的成功率低于白血病，可以被归因于与主要发现在癌症患者的血液中循环的白血病肿瘤细胞相比较，淋巴瘤在淋巴结和器官中的块状结构[6,7]。
尽管结果令人鼓舞，但肿瘤微环境(TME)的几种免疫学特征限制了有效的CAR T细胞免疫疗法，特别是在实体瘤的情况下。实体瘤的结果尤其受到肿瘤的复杂结构及其免疫抑制微环境的限制。除恶性细胞外，大多数实体瘤还由多个非恶性细胞的群体组成：成纤维细胞、间充质细胞和各种免疫细胞，以及细胞外基质和炎症介质。在许多情况下，恶性细胞在肿瘤内是少数。肿瘤床中的内皮细胞也可以通过阻断效应T细胞进入的同时让调节性T细胞穿过而起到屏障的作用。人类癌细胞可以通过下调TAA进化并逃避免疫识别，并且大多数肿瘤是异种的。此外，在实体瘤中存在免疫抑制细胞、细胞因子和抑制分子，它们可以干扰CAR T细胞免疫疗法的成功。
因此，到目前为止，CAR T细胞免疫疗法主要在血源性(blood-borne)癌症如白血病中是有效的。存在对改进的T细胞免疫疗法的需求，该疗法对于实体瘤也是有效的。
发明内容
本实施方式的目的是提供适用于T细胞免疫疗法的T细胞。
通过本文公开的实施方式满足了该目的和其他目的。
本实施方式的一个方面涉及一种载体，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列和/或编码T细胞受体(TCR)的核酸序列。载体还包含编码幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)的核酸序列和/或编码HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列。
本实施方式的另一方面涉及一种T细胞，其包含CAR、TCR、编码CAR的核酸序列和/或编码TCR的核酸序列。该T细胞还包含HP-NAP、HP-NAP的免疫学等效片段、编码HP-NAP的核酸序列和/或编码HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列。
本实施方式的进一步方面涉及一种药物组合物，其包含上述的T细胞和树突状细胞，优选未成熟的树突状细胞。
本实施方式的另外的方面涉及上述的T细胞或上述的药物组合物用于作为药物使用、用于在T细胞免疫疗法中使用或用于在治疗、消退和/或预防癌症中使用。
本实施方式的进一步的方面涉及一种诱导未成熟的树突状细胞的成熟的方法。该方法包括优选在体外使未成熟的树突状细胞与上述的T细胞接触。
本实施方式的T细胞具有改善的细胞毒性并且刺激趋化因子和细胞因子分泌并且促进树突状细胞成熟。T细胞进一步诱导Th1极化并且招募和激活先天免疫细胞。
附图说明
通过参考以下描述并结合附图，可以最好地理解本实施方式及其进一步的目的和优点，其中：
除非在每个章节中特别指出，否则所有实验均使用由六个不同健康血液供体产生的CAR T细胞进行六次。误差条表示SEM并且由符号表示统计显著性(ns：没有统计学显著性，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001)。
图1.用于转导T细胞的慢病毒构建体的示意图。
图2.靶细胞识别后，NFAT-IL-2启动子激活和转基因表达的示意图。
图3.用LV(nLuc-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。24小时后，通过纳米萤光素酶释放评估仅转导的T细胞或用Daudi靶细胞以5:1的比例刺激的转导的T细胞。
图4.用LV(nLuc-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。在第0天将T细胞与CD19+Daudi或CD19-BC-3以2:1的比例一起静脉注射到NOD-SCID小鼠(3只小鼠/组)中。在第3天和第5天监测Nano-Luc表达。
图5.用LV(CD19CAR)或LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。使用流式细胞术分析来自与Daudi细胞以5:1的比例共培养的NAP-CD19CART细胞的NAP表达。将数据作为总CD3+细胞中的双重NAP+CD19CAR+阳性T细胞示出。
图6.用LV(CD19CAR)或LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。代表性直方图显示了来自CD19CAR+T细胞的NAP表达。
图7.如图8至图11所示的实验的示意图。
图8.分别用LV(模拟)、LV(CD19CAR)、LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。通过与萤火虫荧光素酶标记的Daudi靶细胞以5:1的比例共培养或通过与自体同源imDC和萤火虫荧光素酶标记的Daudi细胞以5:1:1的比例共培养4天后，评估转导和扩增的T细胞的细胞毒性能力。通过发光测量靶细胞的相对活力并且与仅来自靶细胞的信号相关联。
图9.分别用LV(模拟)、LV(CD19CAR)、LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。将CD19CAR T细胞与Daudi细胞以5:1的比例共培养或与imDC和Daudi细胞以5:1:1的比例共培养20至24小时。使用ELISA分析上清液中IFN-γ的产生。
图10.分别用LV(模拟)、LV(CD19CAR)、LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。将CD19CAR T细胞与Daudi细胞以5:1的比例共培养或与imDC和Daudi细胞以5:1:1的比例共培养20至24小时。使用流式细胞术分析CD19CAR+T细胞(CD3+)上的CD107a表达。
图11.分别用LV(模拟)、LV(CD19CAR)、LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。用CellTrance Violet染料标记T细胞并且与Daudi细胞以1:1的比例共培养4天。通过流式细胞术分析T细胞增殖。
图12.如图13至图14所示的实验的示意图。
图13.分别用LV(模拟)、LV(CD19CAR)、LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。将转导并扩增的T细胞与Daudi靶细胞以5:1的比例共培养4天。收集上清液并直接添加到单核细胞衍生的imDC上48小时以研究它是否可以使imDC成熟。并行地，使用成熟混合物(R848、聚(I:C)和IFN-γ)处理imDC并且在所有实验中将其用作mDC阳性对照。通过流式细胞术评估DC的表型分析为CD83、CD86、CD80、CD40和CD70。以5:1:1的比例建立转导并扩增的T细胞、Daudi靶细胞和自体imDC的4天共培养物。使用ELISA分析从共培养物收集的上清液中的IL-12产生。
图14.以5:1:1的比例建立转导并扩增的T细胞、Daudi靶细胞和自体imDC的4天共培养物。从收集自共培养物的上清液测量人类趋化因子和细胞因子阵列。将该数据显示为热图并且与LV(模拟)转导的T细胞的共培养物检测的水平相关联。
图15.图16中示出的实验的示意图。
图16.分别用LV(模拟)、LV(CD19CAR)、LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。将转导并扩增的T细胞与Daudi靶细胞以5:1的比例共培养或者与Daudi靶细胞和imDC以5:1:1的比例共培养4天。通过流式细胞术在CD4+CD3+T细胞上评估GATA3和T-bet表达。示出了T-bet/GATA3(Th1/Th2)的比例。通过流式细胞术评估T细胞耗尽标志物PD-1和Tim3(双重阳性)的表达。通过流式细胞术评估免疫检查点受体标志物LAG3的MFI。从共培养物中收集上清液，并且使用ELISA分析来自T细胞的IL-2产生。
图17.分别用LV(模拟)、LV(CD19CAR)、LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。将从T细胞与靶Daudi细胞以5:1的比例共培养4天的共培养物采集的上清液加入到孔的底部，并且将新鲜分离的中性粒细胞、单核细胞、NK细胞或imDC接种在膜的顶部并置于孔中。在37℃温育1.5-2小时后评估细胞的迁移。将百分比迁移细胞测量为(RLUT细胞+Daudi–RLU仅T细胞)/(RLU总迁移细胞)×100％。
图18.如图19至图20所示实验的示意图。
图19.分别使用LV(模拟)、LV(CD19CAR)、LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。将转导并扩增的T细胞与新鲜分离的自体中性粒细胞共培养48小时并且通过流式细胞术测量CD15+中性粒细胞上的表面标志物。
图20.分别使用LV(模拟)、LV(CD19CAR)、LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。将转导并扩增的T细胞与新鲜分离的自体中性粒细胞共培养48小时。使用ELISA测量从T细胞、中性粒细胞和Daudi靶细胞的共培养上清液中释放的细胞因子。
图21.分别使用LV(模拟)、LV(CD19CAR)、LV(NAP-CD19CAR)转导T细胞并且扩增两周。a)单核细胞(CD14+)(底部)以及T细胞与Daudi靶细胞(顶部)的跨孔培养的图示。b至d)通过流式细胞术测量单核细胞的表型为CD14、CD1a、CD83、CD80、CD86、CD40和CD70。
图22.用于转导小鼠T细胞的逆转录病毒构建体的示意图。
图23.实验进程的草图。雌性5-6周龄BALB/c小鼠被皮下(s.c)注射1×105个同基因A20(CD19+)肿瘤细胞。在第15天和第18天通过静脉注射5×106个CD19CAR T细胞或者NAP-CD19CAR T细胞和30IU/mL人类IL-2对它们进行全身治疗。
图24.给出每组中每个单个小鼠的肿瘤生长。给出了每组的平均肿瘤生长。Kaplan-Meier生存曲线显示了生存数据。
图25.NAP-CD19CAR T细胞在体内表现出更多激活。激活的T细胞的存在表现为脾脏和血液中％CD3+引流淋巴结的PD-1+CD8+。
图26.处死小鼠并提取肿瘤并且通过流式细胞术分析免疫细胞浸润。将肿瘤中的T细胞耗尽分析为CD8+CD3+T细胞的％PD-1+Tim3+。将肿瘤中的DC分析为CD11C高。将肿瘤中的中性粒细胞分析为CD11b+细胞的Gr1+。每组包含至少4只小鼠。
图27.NAP-CD19CAR T细胞在癌症免疫疗法中的预期机制的图示。当通过靶细胞的接合激活CAR T细胞时，从诱导型NFAT-IL-2启动子诱导NAP表达。NAP在肿瘤部位的表达引起趋化因子表达并以局部受限的方式招募先天免疫细胞(中性粒细胞、单核细胞和NK细胞)，以引发对肿瘤细胞(包括不能被CAR T细胞杀死的CAR抗原阴性肿瘤细胞)的免疫攻击。被杀死的肿瘤细胞可释放新抗原(neo-antigen)，其可被驻留的未成熟树突状细胞摄取。NAP还诱导大量Th1细胞因子分泌(IL-12、IFN-γ、IL-1β)，以用于DC成熟和迁移至引流淋巴结并且激活细胞溶解性T淋巴细胞。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献[11至16]提供了本发明中使用的许多术语的一般定义。为清楚起见，本文使用以下定义。
术语“核酸序列”或“核苷酸序列”是指通过磷酸二酯键、相关的天然存在的结构变体和/或其合成的非天然存在的类似物连接的核苷酸(如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关的天然存在的结构变体和/或其合成的非天然存在的类似物)组成的聚合物。这种核酸或核苷酸序列的实例是脱氧核糖核酸(DNA)序列和核糖核酸(RNA)序列。
术语“编码序列”是指这样的核酸序列，其具有能够转录成核苷酸的确定序列(tRNA、rRNA和mRNA)并且在mRNA转录的情况下进一步翻译成多肽的性质。编码序列可以是基因、cDNA或重组核酸序列。因此，编码多肽的核酸序列是这种编码序列的实例。
“启动子”是指导转录所需的最小核酸序列。启动子可包括使启动子-依赖性基因表达可被外部信号或药剂细胞类型或组织特异性控制或诱导的元件。
可以基于亲和力(affinity)和/或亲合力(avidity)来确定嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)的特异性。由抗原与CAR和/或TCR解离的平衡常数(Kd)表示的亲和力是抗原决定簇与CAR和/或TCR上的抗原结合位点之间的结合强度的量度。Kd的值越小，抗原决定簇与CAR和/或TCR之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和常数(Ka)，其为1/Kd。如本领域技术人员所清楚的，亲和力可以以本身已知的方式确定，这取决于具体的目标抗原。
亲合力是CAR和/或TCR与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力与抗原决定簇和CAR和/或TCR上的其抗原结合位点之间的亲和力以及CAR和/或TCR上存在的相关结合位点的数量有关。
通常，大于10-4M的任何Kd值(或低于104M-1的任何Ka值)一般认为表示非特异性结合。
可以以本身已知的任何合适的方式确定CAR和/或TCR与抗原或抗原决定簇的特异性结合，方式包括例如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定以及本领域本身已知的其不同变体。
词语“一个(a)”或“一种(an)”不应被解释为排除复数，即提及例如“一个分子”的使用不排除使用多个分子。
本实施方式通常涉及T细胞，也称为T淋巴细胞，特别是有用于T细胞免疫疗法的T细胞。
本实施方式的T细胞有用于T细胞免疫疗法，例如用于癌症的治疗。对本实施方式的T细胞进行遗传修饰，以便在增强的细胞毒性和增强的免疫调节能力等方面具有显着改善的效果。由本实施方式的T细胞实现的改善意味着T细胞在T细胞免疫疗法中对于实体瘤也是有效的。
本实施方式的第一方面涉及一种载体。该载体可用于遗传修饰本实施方式的T细胞，例如在转导过程中。根据本实施方式的载体包含编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列和/或编码T细胞受体(TCR)的核酸序列。该载体还包含编码幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)的核酸序列和/或编码HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列。
通常通过将来自单克隆抗体(如鼠单克隆抗体)的单链可变片段(scFv)作为抗原识别结构域与T细胞信号结构域融合来设计CAR，从而在抗原识别时实现下游信号。CAR可以以不依赖于主要组织相容性复合物(MHC)的方式识别抗原。这可能是有利的，因为肿瘤通常可以通过下调其表面上的人类白细胞抗原(HLA)(在人类中，MHC通常表示为HLA)来逃避宿主T细胞识别。此外，CAR还可以识别非蛋白质表面分子，例如糖类和糖脂。因此，CAR包含特异性结合抗原(如肿瘤相关抗原(TAA))的细胞外抗体来源的scFv、跨膜结构域和配置成在结合抗原(如TAA)时向scFv传递激活信号的细胞内信号结构域。
本文使用的CAR还包含功能性变体及其等同物。此类CAR变体具有与抗原(如TAA)结合的细胞外抗原结合结构域，优选是抗体来源的抗原结合结构域。CAR变体还具有跨膜结构域以及配置成在抗原与抗原结合结构域结合后传递激活信号的细胞内信号结构域。这种激活信号反过来优选地诱导或激活控制HP-NAP或其免疫学相效片段的表达的诱导型启动子，如本文进一步描述的。
TCR是在T细胞表面上发现的分子，其负责识别作为与MHC分子结合的肽的抗原的片段。当TCR与抗原肽和MHC接合(engage)时，通过信号转导激活T细胞，信号转导是由相关的酶、共同受体、特化衔接分子(adaptor molecule)和激活的或释放的转录因子介导的一系列生化事件。
可以使用的TCR的非限制性实例包括CMVpp65TCR和TARP-TCR。
在一个实施方式中，载体包含编码一个或多个(即至少两个)CAR的核酸序列。在另一实施方式中，载体包含编码一个或多个TCR的核酸序列。在进一步的实施方式中，载体包含编码一个或多个CAR的核酸序列和编码一个或多个TCR的核酸序列。
在具有多个CAR、多个TCR或者至少一个CAR与至少一个TCR的组合的实施方式中，CAR、TCR或者CAR和TCR优选地特异性地结合不同的抗原，如不同的TAA。
幽门螺杆菌(HP)中性粒细胞激活蛋白(NAP)是一种在幽门螺杆菌细菌感染中用作毒力因子的十二聚体蛋白质。它是由12个单体亚基组成的，并且每个亚基是由4个α-螺旋组成的。NAP的表面是高度带正电荷的并且具有与人类白血细胞(WBC)(也称为白细胞)相互作用并将其激活的能力。
HP-NAP在幽门螺杆菌感染期间在中性粒细胞向发炎组织的迁移中起关键作用。HP-NAP通过上调β2整联蛋白的表面表达，促进中性粒细胞与单核细胞结合内皮细胞和外渗物的强结合。其还可以激活中性粒细胞以产生反应性氧物质(ROS)和髓过氧化物酶。HP-NAP还激活其他促炎细胞因子的分泌，例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素8(IL-8)(也称为趋化因子(C-X-C基序)配体8(CXCL8))，这反过来诱导粘附分子表达如血管细胞粘附分子(V-CAM)、细胞间粘附分子(I-CAM)以及通过内皮细胞的IL-8分泌。此外，HP-NAP还可诱导中性粒细胞分泌多种细胞因子和趋化因子的表达，如IL-8、巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)和MIP-1β，也称为趋化因子(C-C基序)配体4(CCL4)。这些细胞因子和趋化因子又通过趋化性将中性粒细胞吸引到炎症部位。
HP-NAP是一种toll样受体2(TLR-2)激动剂，对于中性粒细胞、单核细胞是趋化性的并且可以在体外和体内使树突状细胞成熟。它还可以刺激IL-12和IL-23的分泌，IL-12和IL-23是Th-1极化细胞因子。HP-NAP通过上调HLA-抗原D相关的(HLA-DR)分化抗原80(CD80)和CD86的簇的表达而刺激单核细胞分化并成熟为树突状细胞(DC)。其还在协助细胞毒性T细胞和自然杀伤(NK)细胞激活方面具有关键的免疫调节功能。HP-NAP可以诱导T细胞分泌高水平的干扰素γ(IFN-γ)和低水平的IL-4，也表明了Th1极化响应。这与幽门螺杆菌感染的人类显示出强烈的Th1极化响应的报道是一致的。
在一个实施方式中，HP-NAP优选包含或具有选自任何以下序列的氨基酸序列：
HP-NAP的免疫学等效片段是包括HP-NAP的至少20-40个氨基酸残基的活性多肽结构域的片段。HP-NAP的免疫学等效片段的非限制性但示例性的实例包括：
EILKHLQADAIVLFMKVHNFHWNVKGTDFFNVHKAT(SEQ ID NO：9)，对应于SEQ ID NO：1-8的第5-40号氨基酸
NTAEKEGDKVTVTYADDQLAKLQKSIWMLQAHLA(SEQ ID NO：10)对应于SEQ ID NO：1-8的第110-144号氨基酸
ATEEIYEEFADMFDDLAERIVQLGHHPLVTLSEALK(SEQ ID NO：11)，对应于SEQ ID NO：3-4的第39-74号氨基酸
LTRVKEETKTSFHSKDIFKEILEDYKHLEKEFKELS(SEQ ID NO：12)，对应于SEQ ID NO：3、8的第75-110号氨基酸
有关HP-NAP的免疫学等效片段的更多信息请参见[17]，其在第32段“Definitionof the dominant T-cell epitopes of HP-NAP recognized by HP-NAP-specific T-cells derived from the gastric infiltrates induced by H.pylori”中公开的关于HP-NAP的免疫学等效片段的教导在此通过引用并入。
在一个实施方式中，载体包含编码一个或多个HP-NAP的核酸序列。在另一个实施方式中，载体包含编码一个或多个HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列。在进一步的实施方式中，载体包含编码一个或多个HP-NAP的核酸序列以及编码一个或多个HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列。
在HP-NAP的多个免疫学等效片段的情况下，至少一个片段优选地来自HP-NAP的N末端部分，如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11，而至少一个其他片段优选地来自HP-NAP的C末端部分，如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12。
编码HP-NAP或其免疫学等效片段的核酸序列可以编码HP-NAP或其免疫学等效片段与至少一种其他肽或蛋白质的融合蛋白。例如，融合蛋白可以是HP-NAP或免疫学等效片段与用于分泌的信号肽之间的融合蛋白。在此种情况下，当在T细胞中表达时，由于信号肽的存在，会从T细胞分泌融合蛋白。可以使用的此种信号肽的非限制性但说明性的实例包括Igκ链V-IV区B17信号肽(如序列MVLQTQVFISLLLWISGAYG(SEQ ID NO:13))、IL-2的前导序列(也称为IL-2信号序列(ss)，如序列MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:14))、CD33的信号肽序列(如序列MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:15))或者人工信号肽MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA(SEQ ID NO:16)。
载体可以包含单个核酸分子，该单个核酸分子包含编码一个或多个CAR和/或一个或多个TCR的核酸序列以及编码一个或多个HP-NAP和/或一个或多个HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列。在另一个实施方式中，载体包含多个核酸分子。在这种情况下，在载体的第一核酸分子中存在用于CAR、TCR、HP-NAP和HP-NAP的免疫学等效片段的编码序列中的至少一种并且在载体的至少另一个核酸分子中存在编码序列中的至少另一种。
载体优选为表达载体，即包含至少一种这样的核酸分子的载体：该核酸分子包含可以在包含该表达载体的宿主细胞(如宿主T细胞)中表达(如转录和翻译)的编码序列。在一个实施方式中，表达载体选自DNA分子、RNA分子、质粒、附加体质粒(episomal plasmid)和病毒载体。
在一个实施方式中，载体是病毒载体。在特定的实施方式中，病毒载体选自由以下各项组成的组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和杂合病毒载体(hybrid vector)。
慢病毒是逆转录病毒的亚类。它们适合作为基因传递媒介物(载体)，这归功于它们整合到非分裂细胞的基因组中的能力，这是慢病毒的独特特征，因为其他逆转录病毒只能感染正在分裂的细胞。当病毒进入细胞(例如T细胞)时，RNA形式的病毒基因组被逆转录产生DNA，然后通过病毒整合酶将该DNA插入基因组的一定位置中。现在称为原病毒的载体保留在基因组中，并且如果细胞分裂则传递给细胞的后代。出于安全原因，慢病毒载体通常不携带其复制所需的基因。为了产生慢病毒，将多种质粒转染到所谓的包装细胞系中，通常是HEK 293。一种或多种质粒(通常称为包装质粒)编码病毒体(virion)蛋白，如衣壳和逆转录酶。另一种质粒含有要由载体递送的遗传物质。其被转录以产生单链RNA病毒基因组并且通过ψ(psi)序列的存在来标记。该序列用于将基因组包装到病毒体中。
逆转录病毒是当前基因治疗方法的主要支柱之一。重组逆转录病毒，如莫洛尼鼠白血病病毒，具有以稳定的方式整合到宿主基因组中的能力。它们含有逆转录酶，其容许整合到宿主基因组中。逆转录病毒载体可以是复制型的或复制缺陷型的。复制缺陷型载体是最常见的选择，因为病毒具有用于额外轮次的病毒体复制和以其他基因替换或缺失包装所需的基因的编码区。这些病毒能够感染T细胞并递送其病毒载量，但随后无法继续导致细胞溶解和死亡的典型细胞溶解途径。
如果载体是慢病毒或逆转录病毒载体，那么编码CAR和/或TCR以及HP-NAP和/或HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列优选是一个或多个RNA序列。
本文使用的腺病毒载体包括腺病毒载体和腺病毒来源的病毒载体。
腺病毒DNA不整合到基因组中并且在细胞分裂过程中不复制。腺源性(adeno-derived)病毒载体基于腺病毒，但其中已经进行了各种修饰，例如涉及编码复制蛋白、调节蛋白、病毒表面蛋白等的核苷酸序列的各种修饰。
腺相关病毒(AAV)是一种感染人类和一些其他灵长类动物物种的小病毒。AAV可以感染分裂中和非分裂中的细胞，并且可以将其基因组整合到宿主细胞的基因组中。此外，AAV大部分保持为附加体(游离基因，episomal)，表现出长而稳定的表达。虽然AAV包装单链的DNA并需要第二链合成的过程，但自身互补腺相关病毒(scAAV)包装两条链，该两条链一起退火以形成双链DNA。通过跳过第二链合成，scAAV允许在细胞中快速表达。
如果载体是腺病毒载体，那么编码CAR和/或TCR以及HP-NAP和/或HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列优选为一个或多个DNA序列。
杂合病毒载体是一种载体病毒，其经遗传工程改造以具有多于一种载体的品质。例如，杂合病毒载体可以是腺病毒和慢病毒的组合。
在特定的实施方式中，载体是慢病毒载体。在另一特定的实施方式中，载体是自失活(SIN)慢病毒载体。
在一个实施方式中，编码HP-NAP的核酸序列和/或编码HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列受到诱导型启动子的转录控制。根据这一实施方式，就减少或最小化在使用组成型启动子控制HP-NAP和/或其免疫学等效片段的转录时可能发生的任何不希望的毒性而言，HP-NAP和/或其免疫学等效片段的诱导型表达优于组成型表达。
因此，用具有组成型表达HP-NAP和/或其免疫学等效片段的载体转导T细胞可能对T细胞产生不希望的毒性作用。如本文所示的实验数据表明，HP-NAP的诱导型表达不会对T细胞功能产生负面影响。
在一个实施方式中，诱导型启动子在抗原(优选TAA)与CAR和/或TCR结合后被激活。因此，抗原与CAR和/或TCR的细胞外结构域的结合通过CAR和/或TCR的细胞内信号结构域激活诱导型启动子。
此种诱导型启动子的非限制性但示例性的实例是N个激活的T细胞核因子(NFAT)结合基序后接最小的人类IL-2启动子。在本实例中，N为1至10，优选是4至8并且更优选是6。因此，在优选的实施方式中，编码HP-NAP和/或其免疫学等效片段的核酸序列受到诱导型NFAT-IL-2启动子的转录控制。NFAT-IL-2启动子优选包含六个重复的NFAT元件和最小的人类IL-2启动子，或更优选由其组成。这种启动子是选择性的并且CAR/TCR抗原并且可通过CAR/TCR–抗原啮合而诱导。
尽管如上所述，在一些应用中优选诱导型启动子，但实施方式不限于此。因此，编码HP-NAP的核酸序列和/或编码HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列可以受组成型启动子的转录控制。在特定的实施方式中，组成型启动子选自由以下各项组成的组：人类延伸因子1α(EF1a)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和CAG启动子，优选是EF1a启动子。
在一个实施方式中，编码CAR和/或TCR的核酸序列受选自由以下各项组成的组的启动子的转录控制：人类EF1a启动子、CMV启动子和CAG启动子，优选受EF1a启动子的转录控制。
在一个实施方式中，载体包含编码CAR并且受EF1a启动子的转录控制的核酸序列，所述CAR具有特异性结合B淋巴细胞抗原CD19(CD19)的细胞外抗体来源的scFv。载体还包含编码具有用于分泌的信号肽的HP-NAP并且受诱导型NFAT-IL-2启动子的转录控制的核酸序列。在特定的实施方式中，载体是慢病毒载体，例如SIN慢病毒载体。载体优选地包含含有EF1a启动子、编码CAR的核酸序列、诱导型NFAT-IL-2启动子和编码HP-NAP的核酸序列的核酸分子。
本实施方式的另一方面涉及T细胞。T细胞包含CAR、TCR、编码CAR的核酸序列和/或编码TCR的核酸序列。T细胞还包含HP-NAP、其免疫学等效片段、编码HP-NAP的核酸序列和/或编码HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列。
编码CAR、TCR、HP-NAP或HP-NAP的免疫学等效片段的一个或多个核酸序列可以在T细胞中被转录以在该T细胞中产生CAR蛋白、TCR蛋白、HP-NAP蛋白或HP-NAP的免疫学等效片段。
T细胞的CAR和/或TCR特异性地结合抗原，优选TAA。在一个实施方式中，TAA选自由以下各项组成的组：CD19、CD20、粘蛋白1(MUC1)、间皮素(MSLN)、NY-ESO-1、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、肿瘤蛋白p53(p53)、Ras蛋白(RAS)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)，优选CD19。
CD19由B细胞表达并呈递于B细胞上。由于CD19是B细胞的标志(hallmark)，因此该蛋白质已被用于诊断由此类细胞引起的癌症-特别是B细胞淋巴瘤。CD19也与自身免疫疾病有关，并且可能是一种有用的治疗靶标。
CD20在B细胞发育的除了第一个和最后一个阶段外的所有阶段表达；它存在于从晚期祖B细胞(pro-B-cell)到记忆细胞上，但不存在于早期祖B细胞或浆母细胞和浆细胞上。在B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞性白血病和黑色素瘤癌干细胞上发现了CD20。CD20是多种疾病的靶标，这些疾病包括B细胞淋巴瘤和白血病，如慢性淋巴细胞性白血病、系统性红斑狼疮(SLE)、肌痛性脑脊髓炎、滤泡性淋巴瘤、类风湿性关节炎、多发性硬化、非霍奇金淋巴瘤和免疫性血小板减少症。
间皮素是一种存在于正常间皮细胞上的40kDa蛋白，并且在包括间皮瘤和卵巢和胰腺癌等多种人类肿瘤中过表达。
NY-ESO-1是癌症/睾丸家族的人类肿瘤抗原。其在许多预后不良的黑色素瘤中高度表达。
AFP是人类胎儿中发现的最丰富的血浆蛋白。AFP在各种疾病中升高，包括脐膨出、肝细胞癌/肝癌、神经管缺陷、非精原细胞生殖细胞肿瘤、卵黄囊肿瘤、共济失调性毛细血管扩张症、肝细胞癌、生殖细胞肿瘤和肝脏的转移性癌症。
CEA通常在胎儿发育期间在胃肠组织中产生，但是在出生前停止产生。因此，CEA在健康成人的血液中通常仅以非常低的水平存在。然而，在某些类型的癌症中血清水平升高(如结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌和甲状腺髓样癌)以及一些非肿瘤性疾病(如溃疡性结肠炎、胰腺炎、肝硬化、COPD、克罗恩病和甲状腺功能减退症)。
HER2是人类表皮生长因子受体家族的成员。已显示，该癌基因的扩增或过表达在乳腺癌的发展和进展中起重要作用。已知在卵巢癌、胃癌、涎腺导管癌中发生过表达，引起肺腺癌和侵袭性子宫癌，如子宫浆液性子宫内膜癌。
p53在多细胞生物中很重要，它可以防止癌症形成，因此作为肿瘤抑制剂发挥作用。TP53基因是人类癌症中最常见的突变基因。如果TP53基因受损，则肿瘤抑制严重受损。
RAS中的突变是非常常见的，在所有人类肿瘤的20％至30％中被发现。激活Ras蛋白的突变和Ras蛋白的上游元件可能在超过三分之二的人类癌症中发挥作用，包括大多数转移性疾病。
MAGE基因家族在正常成人组织中通常是完全沉默的，但排除雄性生殖细胞并且它们中的一些(胎盘)。相比之下，这些MAGE基因在各种肿瘤中表达。
在一个实施方式中，在将抗原(优选TAA)与CAR和/或TCR结合后由T细胞表达并分泌HP-NAP。在此种实施方式中，编码HP-NAP的核酸序列优选地还编码用于分泌的信号肽。编码HP-NAP和/或HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列优选地被密码子优化以在人类T细胞中表达。
在一个实施方式中，T细胞包含编码HP-NAP的核酸序列和/或编码HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列，该核酸序列受诱导型启动子的转录控制。
在一个实施方式中，在抗原(优选TAA)与CAR和/或TCR结合后激活诱导型启动子。在特定的实施方式中，诱导型启动子是N个NFAT结合基序，接着是最小的人类IL-2启动子，N是1至10，优选是4至8，更优选是6。
在另一实施方式中，T细胞包含编码HP-NAP的核酸序列和/或编码HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列，该核酸序列受组成型启动子(如EF1a启动子、CMV启动子或CAG启动子)的转录控制。
在一个实施方式中，T细胞包含编码CAR的核酸序列和/或编码TCR的核酸序列，该核酸序列受从选自由以下各项组成的组中选择的启动子的转录控制：EF1a启动子、CMV启动子和CAG启动子，优选受EF1a启动子的转录控制。
编码CAR、TCR、HP-NAP或HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列可以存在于T细胞的基因组中。可替代地，该核酸序列中的至少一些可以存在于一个或多个附加体核酸分子中，即不存在于T细胞的染色体中。
在一个实施方式中，根据第二方面的T细胞包含本文先前描述的第一方面所述的载体。该载体可以整合到T细胞的基因组中或者是非整合的染色体外载体。
本技术通过在CAR/TCR T细胞识别靶细胞时局部表达HP-NAP蛋白，将免疫抑制性肿瘤免疫微环境(TME)转换为更具促炎性的TME，从而在T细胞免疫疗法中采用了一种新方法。实验数据显示，HP-NAP的诱导性表达在自体DC存在下改善了CAR T细胞的细胞毒性，它吸引了先天免疫细胞并且增加了促炎细胞因子和趋化因子的分泌，从而增强了CAR T细胞的体外功能。
当引入到CAR T细胞并且由CAR T细胞产生时，HP-NAP获得DC的成熟和激活，Th1极化细胞因子IL-12的促进的分泌，并且充当免疫细胞的化学引诱物，所有这些都可以积极调节TIME并增强CAR T细胞的功能。
为了在肿瘤中局部控制HP-NAP的表达并避免全身毒性，在一个实施方式中，HP-NAP被工程化为由诱导型NFAT-IL-2启动子表达，该启动子仅在体外和体内CAR T细胞的抗原识别时被激活。
当在体外与自体imDC共培养时，NAP-CD19CAR T细胞，即由包含受EF1a启动子控制的编码CD19CAR的序列和受诱导型NFAT-IL-2启动子控制的HP-NAP编码序列的慢病毒载体转导的T细胞具有增强的细胞毒性。NAP诱导的DC的成熟和激活，引起DC表达T细胞共刺激分子如CD80/86和CD40并且分泌IL-12，这反过来可以帮助T细胞启动(prime)和刺激。
TME中的DC具有受损的功能并且通常与免疫抑制相关。然而，根据各实施方式由激活的CAR T细胞的HP-NAP的局部表达可以协助逆转免疫抑制，并且除了辅助注入的CAR T细胞外，还启动旁观者肿瘤特异性T细胞。此外，我们观察到，当与NAP-CD19CART细胞共培养时，DC上CD70的表达增加(图4)。CD70通过许可的DC启动有效的CD8T细胞响应。其结合CD8T细胞上的CD27并且改善T细胞活力、对氧化应激的持久性和耐性。
T细胞耗尽是限制体内CAR T细胞抗肿瘤功效的主要因素，T细胞耗尽主要归因于T细胞的慢性抗原刺激。当与DC共培养时，NAP-CD19CAR T细胞具有增加的细胞毒性，但重要的是，HP-NAP在体外在PD1/Tim3双重表达、LAG3表达和IL-2分泌方面不会导致增加的T细胞耗尽。因此，HP-NAP不会负面影响T细胞功能。
HP-NAP不仅是Th1极化的，而且已知还可以将辅助T细胞的Th2极性恢复为Th1型辅助细胞。当与自体DC和抗原阳性靶细胞共培养时，NAP-CD19CART细胞具有更高的T-bet:GATA3比(Th1:Th2类型转录因子表达)和更高的IFN-γ和IL-2表达。HP-NAP还在非CAR-抗原特异性的旁观者T细胞上诱导Th1极化。存在于TME中的T细胞通常无反应性，因此拯救它们的活性对于产生有效的抗肿瘤免疫应答是重要的。
通常，有效免疫治疗实体瘤的关键限制因素之一是缺乏浸润性免疫细胞。能够局部HP-NAP分泌的本实施方式的T细胞不但促进中性粒细胞的浸润，而且充当单核细胞、NK细胞和imDC的化学引诱物。我们还在来自HP-NAP激活的CART细胞:DC:靶细胞共培养物的上清液中检测到重要的趋化因子，如CCL-1、CCl-2、MIP-1α/β。这些趋化因子可以进一步促进TME中促炎免疫细胞的浸润。例如，CCL-1可以吸引单核细胞、NK细胞和DC，CCL-2可以招募单核细胞、记忆T细胞和DC，而MIP-1α(CCL-3)和MIP-1β(CCL-4)是NK细胞和单核细胞的化学引诱物，从而促进免疫细胞浸润向肿瘤的流入。
因此，如本文给出的实验数据表明，与未成熟的树突状细胞(imDC)一起培养的NAP-CD19CAR T细胞，即，由包含受EF1a启动子控制的编码CD19CAR的序列和受诱导型NFAT-IL-2启动子控制的HP-NAP编码序列的慢病毒载体转导的T细胞，与对照CD19CAR T细胞相比表现出更高的CD19+靶细胞的细胞毒性。由NAP-CD19CAR T细胞分泌的HP-NAP使得共培养的imDC成熟并且刺激它们分泌关键细胞因子(如IL-12、IL-1α/β)和趋化因子(如CXCL11、CXCL12)。此外，由NAP-CD19CAR T细胞分泌的HP-NAP还诱导单核细胞、中性粒细胞和NK细胞的招募。
在NAP-CD19CAR T细胞中实现的改善对T细胞功能没有负面影响，并且没有导致任何T细胞耗尽。此外，NAP-CD19CAR T细胞在imDC存在下诱导Th1极化。
由此，本实施方式的第三方面涉及一种药物组合物，其包含根据本实施方式所述的T细胞以及树突状细胞，优选未成熟的树突状细胞。
药物组合物的T细胞和DC可以是相同来源的，如要施用到与它们先前分离的同一患者的自体T细胞和自体DC。也可以在药物组合物中使用自体T细胞和同种异体DC、同种异体T细胞和自体DC或同种异体T细胞和同种异体DC。在同种异体T细胞和/或DC的情况下，细胞分离自与药物组合物要施用的当前患者相同物种的另一个体。
药物组合物可以另外地包含一种或多种药学上可接受的载体、媒介物和/或赋形剂。此处药学上可接受的载体、媒介物和赋形剂的非限制性实例包括注射溶液，例如盐水或缓冲注射溶液。
本实施方式的进一步方面涉及根据本实施方式所述的T细胞或根据本实施方式所述的药物组合物用作药物、用于T细胞免疫疗法或用于治疗、减轻和/或预防癌症。在后一方面，在一个实施方式中癌症可以是血液学癌症。然而，对本实施方式的T细胞的改善意味着它们可以在治疗、减轻和/或预防实体瘤方面具有积极作用。
本实施方式的T细胞和药物组合物还可以用来预防、减轻和/或治疗肿瘤，如良性肿瘤、原位肿瘤、恶性肿瘤、增生和疣。
本实施方式的T细胞或本实施方式的药物组合物可以与传统上用于T细胞免疫疗法或癌症疗法的其他疗法组合使用。例如，T细胞或药物组合物可以与癌症疾病的化疗、手术和/或放射治疗组合。
药物组合物优选包含有效量的T细胞和DC。如本文使用的，“有效量”表示在所需的剂量和时间段内有效于达到所需结果的量。例如，在抑制肿瘤生长的背景下，有效量是与不施用细胞获得的应答相比，例如诱导、缓解、减轻肿瘤负荷和/或防止肿瘤扩散或生长的量。有效量可根据如疾病状态、年龄、性别、患者体重等因素而变化。
如本文所使用的并且本领域中完全被理解的“治疗(treating)”或“处置(treatment)”是指获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。有益或所需的临床结果可包括例如缓解或改善一种或多种症状或病症、减小疾病程度、稳定疾病状态，即防止恶化、防止疾病传播、延缓或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、减少疾病的复发、和缓解。与如果不接受任何治疗的预期存活相比，“治疗”或“处置”也可延长存活。
如本文所用的且在本领域中完全理解的“预防(Preventing)”或“预防医疗(prophylaxis)”是指减少或防止发生疾病或病症的风险的方法，包括延长或延迟疾病发展。例如，倾向于发展疾病的患者(例如由于遗传或遗传易感性)，可以受益于施用本实施方式的T细胞或药物组合物，以预防患病、降低患病的风险、延缓和/或减缓疾病的发展。
所述患者优选为人类患者。然而，本实施方式还可以应用于兽医应用，即非人类患者，如非人类哺乳动物，包括灵长类动物、猴子、猿、牛、羊、猪、山羊、马、猫、狗、小鼠、大鼠和豚鼠。
可以根据各种途径向患者施用T细胞或药物组合物，包括例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内或瘤内施用。
本实施方式还涉及一种诱导未成熟的树突状细胞成熟的方法。方法包括使未成熟的树突状细胞与根据本实施方式所述的T细胞接触，优选在体外。
进一步的实施方式涉及一种在患者中治疗、减轻和/或预防癌症的方法。该方法包括向所述患者施用有效量的根据本实施方式所述的T细胞或根据本实施方式所述的药物组合物。
实施例
靶向泛B细胞标志物CD19的嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞在急性和慢性B细胞白血病的临床研究中取得了显著进展。观察到的对B细胞淋巴瘤的结果比白血病的差。原因可能是淋巴瘤的半固体结构导致穿透障碍和这些肿瘤内的免疫抑制微环境。为了改善用于淋巴瘤的CAR T细胞疗法，已经用幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(NAP)对CD19CAR T细胞进行了工程化，该蛋白是在CAR识别CD19抗原阳性肿瘤细胞时表达并分泌的。实验结果显示，与自体未成熟的树突状细胞(DC)一起培养的NAP-CD19CAR T细胞比常规CD19CAR T细胞表现出更高的体外CD19+靶细胞的细胞毒性。由激活的NAP-CD19CAR T细胞分泌的NAP使共培养的DC成熟并且刺激它们分泌关键细胞因子(白细胞介素12(IL-12),IL-1α/β)和趋化因子(C-X-C基序趋化因子11(CXCL11),CXCL12)。此外，分泌的NAP还诱导单核细胞、中性粒细胞和自然杀伤(NK)细胞的招募。
材料和方法
原代细胞分离和产生以及细胞系培养
使用Ficoll-Paque分离(GE Healthcare Life Science,Uppsala,Sweden)从从乌普萨拉大学医院(Uppsala University Hospital)的血液中心获得的新鲜血沉棕黄层(fresh buffy coats)分离外周血单核细胞(PBMC)。在补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS)、1mM丙酮酸钠、100IU青霉素/mL和100μg链霉素/mL(1％PeSt)的RPMI-1640培养基中培养PBMC。
通过CD14+珠分离(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)从PBMC获得人类单核细胞来源的DC，并且使用50ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Gentaur,Brussels,Belgium,)和25ng/mL IL-4(Gentaur)历经5天分化为不成熟的DC(imDC)。每两天替换补充有细胞因子的新鲜培养基。还使用与PBMC相同的培养基培养人类T细胞。在补充有10％热灭活的FBS和1％PeSt的RPMI-1640中培养人类B细胞淋巴母细胞系Daudi(CD19+，ATCC CCL-213)。在补充有20％热灭活的FBS和1％PeSt的RPMI-1640中培养BC-3(CD19-，ATCC CRL-2277)。除非另有说明，否则所有培养基补充剂和培养基均购自Invitrogen(Carlsbad,CA)。所有细胞均在37℃在具有5％CO2气氛的加湿培养箱中培养。
慢病毒构建和生产
如先前所述设计CD19CAR的序列[8]。在延伸因子-1α(EF1a)启动子的控制下，将编码CD19CAR的序列克隆到第三代自灭活(SIN)慢病毒载体(SBI,System Biosciences,Mountain View,CA)中以构建LV(CD19CAR)。将用人工信号肽标记的用于分泌的人类密码子优化的NAP转基因序列置于如前所述设计[9]的诱导型NFAT-IL-2启动子的控制下。NFAT-IL-2启动子由6个重复的激活T细胞核因子(NFAT)和最小的人类IL-2启动子组成。将NAP序列连同NFAT-IL-2启动子克隆到慢病毒载体中以构建LV(NAP-CD19CAR)。用编码纳米荧光素酶的序列替换NAP基因以构建LV(nanoLuc-CD19CAR)。用空的慢病毒载体制成LV(模似品)。所有序列均购自GeneScript(Piscataway,NJ)。
流式细胞术分析
用于荧光激活细胞分选(FACS)染色的所有抗体均购自Biolegend,San Diego,CA。在BDCANTOII流式细胞仪(BD Biosciences)中分析染色的细胞。
T细胞工程化、扩增和NAP表达的验证
在培养基中使用在第1天提供的OKT-3(100ng/mL,BioLegend,San Diego,CA)和在第2天提供的IL-2(100IU/mL,Proleukin,Novartis,Basel,Switzerland)将PBMC(5×106个细胞)激活3天。将激活的T细胞(1×106个细胞)再悬浮于体积为20μL的2×107IU浓缩慢病毒连同10mg/ml硫酸鱼精蛋白(Sigma-Aldrich,St Louis,Mo)和IL-2(100IU)中并且培育4小时。第二天以相同方式再次转导T细胞并且在补充有IL-2(100IU/mL)的1ml培养基中培养7天，然后测量转基因表达。如先前描述的[10]使用快速扩增协议(REP)扩增T细胞。将NAP-CD19CART细胞与Daudi(CD19+)以5:1比例共培养，并且通过添加Brefeldin A(BDGolgiPlugTM,Frankline Lakes,NJ)阻断NAP分泌12小时，之后使用一级α-NAP抗体(来自Dr.Marinade Bernard,University of Padova,Italy的亲切礼物)和二级Alexa Fluor488兔抗小鼠IgG抗体(Invitrogen)进行细胞间染色，评估NAP表达。通过用别藻蓝蛋白缀合的(APC-缀合的)兔抗小鼠Ig(H+L)Fab片段(Invitrogen)染色验证了CD19CAR表达。通过用太平洋蓝缀合的抗人CD3抗体染色鉴定T细胞。
来自T细胞的体外和体内纳米荧光素酶表达
如上所述生成并且扩增LV(nanoLuc-CD19CAR)转导的T细胞。测量在以5:1的比例用Daudi靶细胞共培养了24h的nanoLuc-CD19CAR T细胞和nanoLuc-CD19CAR T细胞中的纳米荧光素酶表达。通过将来自荧光素酶测定试剂盒(Promega,Madison,WI)的底物直接添加到细胞中来测量纳米荧光素酶表达。在第0天，向雌性5周龄NOD-SCID小鼠(Janvier Labs,France)静脉注射总体积为200μL的比例为2:1的1×107个nanoLuc-CD19CAR T细胞与Daudi(CD19+)靶细胞或BC-3(CD19-)靶细胞(3只小鼠/组)。在第3天、第5天通过静脉注射底物(荧光素酶测定,Promega)并且通过NightOWL体内成像系统(Berthold Technologies GmbH&Co.Kg,Germany)监测来测量纳米荧光素酶表达。
T细胞细胞毒性测定
在用于功能测定前，在低剂量的IL-2(20IU/mL)中REP扩增后使T细胞静置3天。通过CD14+磁珠分离(Miltenyi Biotec)从PBMC中分离单核细胞。通过在补充有20ng/mL人类IL-4(Gentaur,Brussels,Belgium)和100ng/mL GM-CSF(Gentaur)的DC培养基中培养5天以将单核细胞分化为不成熟的DC(imDC)。在100μL的总体积中，以5:1:1的比例将慢病毒转导的T细胞与萤火虫荧光素酶标记的靶细胞(Daudi)和与或不与自体imDC共培养4天。如先前描述的[10]测量荧光素酶的表达和活性(作为靶细胞活力的指标)。通过将来自共培养样品的相对光单位(RLU)相对于来自仅有靶细胞的RLU归一化来计算相对细胞活力。
细胞因子分泌、表面标志物表达和T细胞增殖
将转导的T细胞与Daudi靶细胞以1:1的比例或者与Daudi靶细胞和imDC以5:1:1的比例共培养20至24小时。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)(Mabtech,Nacka Strand,Sweden)测量来自共培养物的上清液中的T细胞的干扰素γ(IFN-γ)和IL-2分泌和DC的IL-12分泌。使用FITC-CD107抗体(Biolegend)对T细胞进行染色以表达脱粒标志物CD107a。将转导的T细胞与Daudi靶细胞以5:1的比例共培养4天并且通过使用FITC-PD1、PE-Tim3和FITC-LAG3抗体进行染色以表达耗尽标志物。
在另一个实施方式中，使用CellTrace Violet染料(Invitrogen)将转导的T细胞染色并且使用Daudi靶细胞以1:1的比例培养4天。然后通过流式细胞术分析T细胞以测量紫色染料的稀释度作为细胞增殖的指示。
DC成熟表型分析和细胞因子阵列
将转导的T细胞与Daudi靶细胞以5:1的比例共培养4天以刺激NAP表达。收集上清液并且直接添加到imDC上，保持48小时。
使用以下荧光团标记的小鼠单克隆抗体(成熟DC表型面板)进行DC的表型分析：PECy7-CD14、BV510-CD1a、APC-CD83,PE-CD80、BV421-CD86、FITC-CD40和APC-Cy7-CD70以及匹配的小鼠IgG同种型对照。还在含有1000IU/ml IFN-γ(Shenandoah Biotechnology,Warwick,PA),20μg/ml聚肌苷:聚胞苷酸(聚(I:C),Sigma-Aldrich)和2.5μg/ml R848(InvivoGen,San Diego,CA)的培养基中将imDC成熟24小时并且用作DC成熟(mDC)的阳性对照。使用Proteome Profiler TM人类细胞因子阵列试剂盒面板A(R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN)，分析从T细胞、自体imDC和Daudi靶细胞以5:1:1的比例共培养4天的共培养物收集的上清液中存在的细胞因子。
具有T细胞及靶细胞的人类单核细胞跨孔培养物
使用抗CD14+珠(Miltenyi Biotec)从PBMC分离CD14+单核细胞。将单核细胞保持在24孔板和插入有0.45μm孔径膜(Corning)并且含有T细胞以及Daudi细胞(5:1比例)的底部并且培养4天。使用如上所述的成熟DC表型面板进行由来自T细胞和靶细胞的上清液导致的单核细胞的表型分析。
迁移试验
使用含有聚碳酸酯膜过滤器(3μm孔径)的96-孔一次性趋化性系统(Neuro Probe,Gaithersburg,MD)评估细胞迁移。将获自T细胞与Daudi靶细胞以5:1的比例共培养4天的共培养物的上清液置于底部并且将2×105个新分离的中性粒细胞、CD14+单核细胞、CD56+NK细胞和由人类单核细胞分化的imDC接种在所述跨孔模的顶部。在37℃下温育1.5至2h后评估细胞的迁移并且通过CellTiter-发光细胞活力测定(Promega)进行定量。将细胞迁移百分比测量为(RLUT细胞+Daudi–RLU仅T细胞)/(RLU总迁移细胞)×100％。
Th1/Th2的多色FACS染色
用病毒转导T细胞并且培养7天后，与自体imDC和Daudi靶细胞比5:1:1的比例共培养4天。T细胞用表面标志物染色：太平洋蓝CD3、Percp-CD4和FITC-CD8。使用真核转录因子缓冲液集(Biolegend)将T细胞透化1小时。然后将透化的T细胞用PE-Cy7-T-bet和PE-GATA3染色。计算CD3+CD4+T细胞群的Tbet/GATA3的比率。
中性粒细胞激活测定
在低剂量IL-2(20IU/mL)扩增后使转导的T细胞静置3天，然后与新分离的自体中性粒细胞和Daudi靶细胞以比率5:1:1在100μL的总体积中共培养48小时。将中性粒细胞门控为CD15+细胞，并通过用以下荧光标记的抗体染色分析激活标志物：PECy7-CD11b、PE-HLA-DR、太平洋蓝-CD54和APC-CD66b。通过ELISA(Mabtech)测量共培养物的细胞因子(IL-12、IL-1β、IFN-γ和IL-2)。
体内动物实验
在第0天，以1×105个处于dPBS中的A20细胞(Invitrogen)皮下注射到雌性5-6周龄BALB/c小鼠(Janvier Labs)的后腿中。在第12天和第15天肿瘤出现后，使小鼠接收静脉注射存在30IU/mL人类IL-2的5×106个T细胞。在肿瘤接种后第16天，处死小鼠并收集来自肿瘤、脾脏、血液和淋巴结的细胞并且酶促消化成单细胞悬浮液。使用Pe/Cy7-PD-1、AF647-Tim3、FITC-CD3、PerCP-CD4、BV421-CD8、BV510-CD45将细胞染色以评估肿瘤中T细胞的耗尽；用APC/Cy7-B220、PE/Cy7-Gr1、BV421-Ly6C、FITC-Ly6G、PE-CD11c、PerCP-CD11b染色以评估肿瘤微环境。所有抗体均购自Biolegend。用卡尺测量肿瘤，并按以下公式计算肿瘤大小：体积＝(长度)×(宽)2×π/6。当肿瘤体积超过1cm3时，处死小鼠。
统计分析
数据报告为均值以及均值的标准误差(SEM)。通过GraphPad prism软件版本6.01(LaJolla,CA,USA)进行统计分析。使用参数ANOVA检验(多于2个数据组)和非参数T检测(如果只有2个数据组)进行所有数据的数据分析。P<0.05的值被认为是统计学显著的。
结果
在CAR T细胞中引入的诱导型NFAT-IL-2启动子在体外和体内识别靶细胞后被特异性地激活
为了尽量减少由NAP的组成型表达引起的不必要的毒性，构建了具有诱导型重组启动子的慢病毒载体。其由六个重复的NFAT结合基序之后是最小的人类IL-2启动子组成。该重组启动子在TCR与靶抗原结合后激活的T细胞中驱动报告基因表达。为了验证我们系统中的启动子，构建(图1)并示出了(图2)慢病毒载体NFAT-IL-2启动子控制的纳米荧光素酶。该载体还含有受人类延伸因子1α(EF1a)启动子转录控制的CD19CAR。
仅在与CD19+Daudi靶细胞共培养时，nanoLuc-CD19CAR T细胞才表达纳米荧光素酶报告基因(图3)。还通过共注射nanoLuc-CD19CAR T细胞与CD19-BC-3细胞或CD19+Daudi细胞来评价了诱导型启动子的激活。在注射5天之后注射褪色信号的3天后，仅在共注射CD19+Daudi细胞的小鼠中检测到强荧光素酶信号(图4)。当小鼠共注射CD19-BC-3细胞时未检测到信号(图4)。这些数据表明，NFAT-IL-2启动子是选择性的并且可由CAR-抗原啮合来诱导。我们还验证了在Daudi靶细胞刺激后，与CD19CAR慢病毒载体相比，用LV(NAP-CD19CAR)慢病毒载体工程改造的T细胞中的特异性NAP表达(图5和图6)。
NAP的表达在自体未成熟DC的存在下改善了CAR T细胞的细胞毒性而未影响T细胞功能
评价了NAP蛋白质对CD19CAR T细胞的潜在毒性以确认NAP不会对T细胞功能产生负面影响。如图7所示，基于对CD19+靶细胞的细胞毒性、IFN-γ释放、CD107的表面表达和增殖能力来分析在靶细胞识别后转导的T细胞的功能。用LV(CD19CAR)或LV(NAP-CD19CAR)转导的T细胞表现出相似的对靶细胞的细胞毒性。然而，当与自体未成熟DC(imDC)共培养时，NAP-CD19CAR T细胞表现出比CD19CART细胞显著更好的细胞毒性(图8)。在IFN-γ分泌和CD107a表达方面，CD19CAR T细胞和NAP-CD19CAR T细胞之间没有差异，但在自体imDC存在下，NAPCD19CART细胞比CD19CAR T细胞分泌了显著更多的IFN-γ并且表现出更高程度的脱粒(CD107a表达)(图9和图10)。此外，用LV(CD19CAR)或LV(NAP-CD1C9AR)转导的T细胞在靶细胞识别后表现出类似的T细胞增殖(图11)。
由激活的NAP-CD19CART细胞分泌的NAP刺激趋化因子和细胞因子分泌并且促进DC成熟
由于我们观察到当与imDC共培养时NAP-CD19CAR T细胞显示出增强的细胞毒性，这促使我们进一步研究NAP分泌对单核细胞来源的imDC的影响。如图12所示，检查从靶细胞与模拟T细胞、NAP-CD19CAR T细胞或CD19CAR T细胞的共培养物收集的上清液以确定DC成熟能力。与用来自模拟T细胞或CD19CAR T细胞的上清液温育的imDC相比，用来自NAP-CD19CAR T细胞共培养物的上清液温育的imDC表达了更高水平的成熟标志物CD83(图13)。令人惊讶的是，NAP成熟的imDC具有与使用由IFN-γ、聚I:C和R848组成的成熟混合物成熟的DC(阳性对照)相似的成熟和激活表型。另外，我们还分析了来自T细胞:imDC:Daudi共培养物的上清液中存在的趋化因子和细胞因子，因为据报道NAP具有Th1极化特性。用归一化为模拟T细胞的聚集的分析数据表示热图(图14)。与从CD19CAR T细胞共培养物获得的上清液相比，来自NAP-CD19CAR T细胞共培养物的上清液具有更高量的先天免疫细胞化学引诱物CCL-1、CCL-2、IL-8；Th1激活细胞因子IL-12、IL-16、IL-1α/β和中性粒细胞激活细胞因子IL-8、MIP-1α/β(图14)。还通过ELISA确认并定量了上清液中关键Th1极化细胞因子IL-12的存在(图13)。
NAP未促进T细胞耗尽，但在自体imDC存在下诱导Th1极化
通过转录因子T-bet和Gata-3测定了在自体imDC存在下激活的模拟T细胞、CD19CAR T细胞和NAP-CD19CAR T细胞的表型。初始(未致敏的，)T辅助细胞向Th1或Th2细胞的分化受T细胞中表达的转录因子T-box(T-bet)和GATA结合蛋白-3(GATA-3)的严格控制。通过多色流式细胞术检查了T-bet和GATA3的表达(图15)。在imDC的存在下，与在CD19CAR T细胞上相比，NAP-CD19CAR T细胞上的GATA3+细胞略有下降而T-bet+细胞略有增加，导致作为Th1/Th2极化的指示的CD3+CD4+-细胞上的T-bet/GATA3比，在NAP-CD19CAR T细胞中的比CD19CAR T细胞中的显著更高(图16)。该结果证实了NAP的Th1极化特性并且与图13中的细胞因子和趋化因子特征一致。
T细胞上高表面表达的抑制性受体如PD-1、Tim3和LAG3是T细胞耗尽的标志和抑制性标志物，其是限制CAR T细胞抗肿瘤功效的主要因素。如通过评价PD1+Tim3+(双阳性)CART细胞群(图16)和LAG3的CAR T细胞表达(图16)所观察到的，诱导的NAP表达不会促进T细胞耗尽。耗尽的T细胞减少IL-2的产生，表明T细胞功能障碍。我们发现，在有和没有自体imDC的条件下，T细胞的NAP表达增加了IL-2分泌，因为分泌显著高于CD19CAR T细胞(图16)。总之，数据显示自体imDC的存在不影响NAPCD19CAR T细胞耗尽及其分泌IL-2的能力。
通过由激活的NAP-CD19CAR T细胞表达的NAP招募并激活先天免疫细胞
NAP是中性粒细胞和单核细胞的有效化学引诱物。我们还观察到来自NAP-CD19CART细胞共培养物的上清液是中性粒细胞和单核细胞的化学引诱物(图17)。此外，我们还观察到NAP可以吸引NK细胞和imDC(图17)。在与模拟T细胞、CD19CAR T细胞以及NAP-CD19CAR T细胞和Daudi靶细胞(中性粒细胞:T细胞:Daudi)一起共培养时监测中性粒细胞(CD15+)的激活(图18)。与CD19CAR T细胞相比，NAP-CD19CAR T细胞共培养物中中性粒细胞上激活的CD11b和HLA-DR的表达显著更高(图19)。在NAP-CD19CAR T细胞共培养物中，中性粒细胞上CD66b和CD54的表达也增加(图19)。激活依赖于抗原啮合(T细胞:Daudi)时表达的NAP，由于模拟T细胞共培养物或单独的肿瘤细胞都没有提高激活标志物的表达。中性粒细胞在适当刺激后可以产生大量细胞因子。当中性粒细胞被NAP激活时，IL-12和促炎性细胞因子IL-1β的分泌显著更高(图20)。和来自与CD19CAR T细胞的共培养物的分泌相比，来自NAP-CD19CAR T细胞共培养物的IFN-γ和IL-2分泌也略高(图20)。
我们还研究了NAP对跨孔共培养测定中单核细胞分化的影响，如图21a所示。在T细胞和靶细胞之间经过5天的跨孔共培养后，单核细胞表现出更分化的DC样表型(CD14-CD1a高)(图21b至图21c)。进一步评估了这些DC样细胞的成熟状态。从NAP-CD19CAR T细胞:Daudi上清液分化的单核细胞表现出更激活和成熟的DC表型，具有更高水平的共刺激分子，包括CD80、CD86、CD40和CD70，而CD83的表达水平与从CD19CAR T细胞:Daudi上清液分化的单核细胞相似(图21d)。
NAP-CAR T细胞用于治疗目的的用途
如上所示，从T细胞分泌的NAP对免疫细胞具有多种作用，因此，在体内检测治疗功效也很重要。体内使用的逆转录病毒构建体和实验时间线示于图22和图23中。与用CD19CART细胞治疗的小鼠相比，用NAP-CD19CAR T细胞治疗的具有皮下淋巴瘤的小鼠稍微延迟了肿瘤生长(图24)并略微延长了小鼠的存活(图24)。与CD19CAR T细胞相比，当静脉注射NAP-CD19CAR T细胞时，激活的CD8+T细胞(PD1+)的量在引流淋巴结、脾脏中稍高而在血液中显著更高(图25)。还通过流式细胞术从切除的肿瘤中检查肿瘤微环境中的免疫细胞。来自NAP-CD19CAR T细胞治疗组的浸润性T细胞显示与来自CD19CAR T细胞组的T细胞相同的耗尽水平(图26)。在肿瘤微环境中检测到更高量的DC(图26)和中性粒细胞(图26)。当分析肿瘤中的髓源性抑制细胞(MDSC)群体时，我们发现粒细胞(Gr)-MDSC和单核细胞(Mo)-MDSC之间的比例在NAP-CD19CAR T细胞治疗组中更高(图26)，表明肿瘤微环境中单核细胞抑制性MDSC较少。图27中简要概述了NAP-T细胞在治疗环境中的整体机制。
从这些结果，我们提出了一种NAP-CAR T细胞作用模式背后的机制的假设(图27)。NAP似乎是一种有前途的免疫调节因子，以被引入CAR T细胞以改变TME并增强抗肿瘤活性。
上述实施方式应理解为本发明的一些说明性示例。本领域技术人员可以理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对所述实施方式进行各种修改、组合和改变。特别地，在技术上可行的情况下，不同实施方式中的不同部分的解决方案可以组合在其他配置中。然而，本发明的范围由所附权利要求限定。
参考文献
1.Rosenberg，S.A.，et al.，Adoptive cell transfer：a clinical path toefiective cancer immunotherapy.NatRev Cancer，2008.8(4)：p.299-308.
2.Grupp，SA，et al.，Chimeric antigen receptor-modified T cells foracute lymphoid leukemia.N Engl JMed，2013.368(16)：p.1509-18.
3.Morgan，R.A.，et al.，Cancer regression in patients after transfer ofgenetically engineered lymphocytes.Scierce，2006.314(5796)：p.126-9.
4.Porter，D.L.，et al.，Chimeric antigen receptor-modified T cells inchronic lymphoid leukemia.N Engl J Med，2011365(8)：p.725-33.
5.Savoldo，B.，et al.，CD28 costimulation improves expansion andpersistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphomapatients.J Clin lnvest，2011.121(5)：p.1822-6.
6.Kakarla，S.and Gottschalk，S.，CAR T cells for solid tumors：armed andready to go？.Cancer J，2014.20(2)：p.151-5.
7.Klebnoff，C.A.，et al.，Prospeds for gene-engineered T cellimmunotherapy for solid cancers.Nat Med，2016.22(1)：p.26-36.
8.Milone，M.C.，et al.，Chimeric receptors containing CD137 signaltransduction domains mediate enhanced survival of T cells and increasedantileukemic efficacy in vivo.Mol Ther，2009.17(8)：p.1453-64.
9.Fiering，S.，et al.，Single cell assay of a transcription factorreveals a threshold in transcription activated by signals emanating from theT-cell antigen receptor.Genes Dev，1990.4(10)：p.1823-34.
10.Jin，C.，et al.，Allogeneic lymphocyte-licensed DCs expand T cellswith improved antitumor activity and resistance to oxidative stress andimmunosuppressive factors.Mol Ther Methods Clin Dev，2014.1：p.14001.
11Singleton et al.，Dictionary of microbiology and molecularbiology.3rd ed，Revised，2007，ISBN：9780470035450.
12.Walker，The Cambridge dictionary of science and technology.1990，ISBN：9780521394413.
13.Rieger et al.，Glossary of Genetics：Classical and Molecular.5thed.，1991，ISBN：9783540520542.
14.Hale，HarperCollins dictionary of biology.1991，ISBN：9780064610155.
15.Lewin，Gene Ⅸ.2007，ISBN：9780763740634.
16.Knipe et al.，Field′s Virology.5thed.，2007，ISBN：9780781760607.
17.EP 1 767 214 B1。
序列表
<110> 郁笛(Yu, Di)
芒努斯·埃桑德(Essand, Magnus)
靳川(Jin, Chuan)
莫汉拉伊·拉马钱德兰(Ramachandran, Mohanraj)
马静(Ma, Jing)
<120> T细胞免疫疗法（T-CELL IMMUNOTHERAPY）
<130> P1359PC00
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 144
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
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<211> 144
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 2
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Glu Asp Tyr Lys Tyr Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr
100 105 110
Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln
115 120 125
Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu Ala
130 135 140
<210> 4
<211> 144
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 4
Met Lys Thr Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val
1 5 10 15
Leu Phe Met Lys Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp
20 25 30
Phe Phe Asn Val His Lys Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Glu Phe Ala
35 40 45
Asp Met Phe Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His His
50 55 60
Pro Leu Val Thr Leu Ser Glu Ala Leu Lys Leu Thr Arg Val Lys Glu
65 70 75 80
Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys Asp Ile Phe Lys Glu Ile Leu
85 90 95
Glu Asp Tyr Lys His Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr
100 105 110
Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln
115 120 125
Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu Ala
130 135 140
<210> 5
<211> 144
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 5
Met Lys Thr Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val
1 5 10 15
Leu Phe Met Lys Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp
20 25 30
Phe Phe Asn Val His Lys Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Gly Phe Ala
35 40 45
Asp Met Phe Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His His
50 55 60
Pro Leu Val Thr Leu Ser Glu Ala Ile Lys Leu Thr Arg Val Lys Glu
65 70 75 80
Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys Asp Ile Phe Lys Glu Ile Leu
85 90 95
Glu Asp Tyr Lys Tyr Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr
100 105 110
Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln
115 120 125
Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu Ala
130 135 140
<210> 6
<211> 144
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 6
Met Lys Thr Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val
1 5 10 15
Leu Phe Met Lys Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp
20 25 30
Phe Phe Asn Val His Lys Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Gly Phe Ala
35 40 45
Asp Met Phe Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His His
50 55 60
Pro Leu Val Thr Leu Ser Glu Ala Leu Lys Leu Thr Arg Val Lys Glu
65 70 75 80
Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys Asp Ile Phe Lys Glu Ile Leu
85 90 95
Glu Asp Tyr Lys Tyr Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr
100 105 110
Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln
115 120 125
Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu Ala
130 135 140
<210> 7
<211> 144
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 7
Met Lys Thr Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val
1 5 10 15
Leu Phe Met Lys Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp
20 25 30
Phe Phe Asn Val His Lys Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Gly Phe Ala
35 40 45
Asp Met Phe Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His His
50 55 60
Pro Leu Val Thr Leu Ser Glu Ala Ile Lys Leu Thr Arg Val Lys Glu
65 70 75 80
Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys Asp Ile Phe Lys Glu Ile Leu
85 90 95
Glu Asp Tyr Lys His Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr
100 105 110
Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln
115 120 125
Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu Ala
130 135 140
<210> 8
<211> 144
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 8
Met Lys Thr Phe Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val
1 5 10 15
Leu Phe Met Lys Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp
20 25 30
Phe Phe Asn Val His Lys Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Gly Phe Ala
35 40 45
Asp Met Phe Asp Asp Leu Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His His
50 55 60
Pro Leu Val Thr Leu Ser Glu Ala Leu Lys Leu Thr Arg Val Lys Glu
65 70 75 80
Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys Asp Ile Phe Lys Glu Ile Leu
85 90 95
Glu Asp Tyr Lys His Leu Glu Lys Glu Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr
100 105 110
Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln
115 120 125
Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His Leu Ala
130 135 140
<210> 9
<211> 36
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 9
Glu Ile Leu Lys His Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val Leu Phe Met Lys
1 5 10 15
Val His Asn Phe His Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp Phe Phe Asn Val
20 25 30
His Lys Ala Thr
35
<210> 10
<211> 34
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 10
Asn Thr Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr Val Thr Tyr Ala Asp
1 5 10 15
Asp Gln Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp Met Leu Gln Ala His
20 25 30
Leu Ala
<210> 11
<211> 36
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 11
Ala Thr Glu Glu Ile Tyr Glu Glu Phe Ala Asp Met Phe Asp Asp Leu
1 5 10 15
Ala Glu Arg Ile Val Gln Leu Gly His His Pro Leu Val Thr Leu Ser
20 25 30
Glu Ala Leu Lys
35
<210> 12
<211> 36
<212> PRT
<213> 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)
<400> 12
Leu Thr Arg Val Lys Glu Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys Asp
1 5 10 15
Ile Phe Lys Glu Ile Leu Glu Asp Tyr Lys His Leu Glu Lys Glu Phe
20 25 30
Lys Glu Leu Ser
35
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly
20
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 用于分泌的人工信号肽
<400> 16
Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Pro Met Val Trp Ala
20

Claims (23)

1.一种载体，包含：
编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列和/或编码T细胞受体(TCR)的核酸序列；和
编码幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)的核酸序列和/或编码所述HP-NAP的免疫学等效片段的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的载体，其中，所述载体是病毒载体，优选地选自由以下各项组成的组：杂合病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体，更优选慢病毒载体。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其中，编码所述HP-NAP的所述核酸序列和/或编码所述HP-NAP的所述免疫学等效片段的所述核酸序列受诱导型启动子的转录控制。
4.根据权利要求3所述的载体，其中，所述诱导型启动子在抗原结合至所述CAR和/或所述TCR时被激活，所述抗原优选是肿瘤相关抗原(TAA)。
5.根据权利要求4所述的载体，其中，所述诱导型启动子是N个激活的T细胞核因子(NFAT)结合基序后接最小的人类白细胞介素2(IL-2)启动子，N是1至10，优选是4至8，更优选是6。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的载体，其中，编码所述CAR的所述核酸序列和/或编码所述TCR的所述核酸序列受选自由以下各项组成的组的启动子的转录控制：人类延伸因子1α(EF1a)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和CAG启动子，优选受EF1a启动子的转录控制。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的载体，包含：
编码具有特异性结合B淋巴细胞抗原CD19(CD19)的细胞外抗体来源的单链可变片段(scFv)的所述CAR并且受人类延伸因子1α(EF1a)启动子的转录控制的核酸序列，和
编码具有用于分泌的人工信号肽的所述HP-NAP并且受诱导型NFAT-IL-2启动子的转录控制的核酸序列，所述诱导型NFAT-IL-2启动子包含6个重复的激活的T细胞核因子(NFAT)结合基序。
8.一种T细胞，包含：
i)嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、编码所述CAR的核酸序列和/或编码所述TCR的核酸序列；和
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)、所述HP-NAP的所述免疫学等效片段、编码所述HP-NAP的核酸序列和/或编码所述HP-NAP的所述免疫学等效片段的核酸序列。
9.根据权利要求8所述的T细胞，其中，所述CAR和/或所述TCR特异性地结合抗原，优选肿瘤相关抗原(TAA)。
10.根据权利要求8或9所述的T细胞，其中，所述TAA选自由以下各项组成的组：B淋巴细胞抗原CD19(CD19)、CD20、粘蛋白1(MUC1)、间皮素(MSLN)、NY-ESO-1、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、肿瘤蛋白p53(p53)、Ras蛋白(RAS)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)，优选CD19。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的T细胞，其中，所述HP-NAP在抗原结合至所述CAR和/或所述TCR时由所述T细胞表达和分泌，所述抗原优选肿瘤相关抗原(TAA)。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的T细胞，其中，所述T细胞包含ii)受诱导型启动子的转录控制的编码所述HP-NAP的所述核酸序列和/或编码所述HP-NAP的所述免疫学等效片段的所述核酸序列。
13.根据权利要求12所述的T细胞，其中，所述诱导型启动子在抗原结合至所述CAR和/或所述TCR时被激活，所述抗原优选肿瘤相关抗原(TAA)。
14.根据权利要求13所述的T细胞，其中所述诱导型启动子是N个激活的T细胞核因子(NFAT)结合基序后接最小的人类白细胞介素2(IL-2)启动子，N是1至10，优选是4至8，更优选是6。
15.根据权利要求8至14中任一项所述的T细胞，其中，所述T细胞包含i)受选自由以下各项组成的组的启动子的转录控制的编码所述CAR的所述核酸序列和/或编码所述TCR的所述核酸序列：人类延伸因子1α(EF1a)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和CAG启动子，优选受EF1a启动子的转录控制。
16.根据权利要求8至15中任一项所述的T细胞，包含根据权利要求1至7中任一项所述的载体。
17.一种药物组合物，包含：
根据权利要求8至16中任一项所述的T细胞；和
树突状细胞，优选未成熟的树突状细胞。
18.根据权利要求8至16中任一项所述的T细胞或根据权利要求17所述的药物组合物，用于作为药物使用。
19.根据权利要求8至16中任一项所述的T细胞或根据权利要求17所述的药物组合物，用于在T细胞免疫疗法中使用。
20.根据权利要求8至16中任一项所述的T细胞或根据权利要求17所述的药物组合物，用于在治疗、减轻和/或预防癌症中使用。
21.根据权利要求20所述用于使用的T细胞或药物组合物，其中，所述癌症是实体瘤癌症。
22.根据权利要求18至21中任一项所述用于使用的T细胞或药物组合物，其中，所述T细胞是同种异体T细胞或自体T细胞。
23.一种诱导未成熟的树突状细胞成熟的方法，所述方法包括在体外使所述未成熟的树突状细胞与根据权利要求8至16中任一项所述的T细胞接触。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112226408A (zh) * 2020-09-30 2021-01-15 西北农林科技大学 一种猪病原或外源性蛋白特异性抗原肽筛选和鉴定的方法
CN112285347A (zh) * 2020-09-30 2021-01-29 西北农林科技大学 一种猪血清样中病原抗体elisa检测试剂盒
CN113402620A (zh) * 2021-07-30 2021-09-17 中山大学 细胞因子联合嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用
CN113402621A (zh) * 2021-08-02 2021-09-17 中山大学 含有嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用
CN115980345A (zh) * 2022-08-30 2023-04-18 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种检测幽门螺旋杆菌的方法与应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201713078D0 (en) 2017-08-15 2017-09-27 Adaptimmune Ltd T Cell Modification
EP3781176A4 (en) * 2018-04-09 2022-05-25 The Trustees of the University of Pennsylvania METHODS AND COMPOSITIONS USING A VIRAL VECTOR FOR THE EXPRESSION OF A TRANSGENE AND AN EFFECTOR
WO2023010118A1 (en) * 2021-07-29 2023-02-02 Vor Biopharma Inc. Nfat-responsive reporter systems for assessing chimeric antigen receptor activation and methods of making and using the same

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1533284A (zh) * 2001-07-26 2004-09-29 ��������ͨ���о�Ժ 生物活性 H I V － 1 T a t、其片段或衍生物用于预防或治疗性免疫接种和/或治疗其它疾病中靶向和/或激活抗原呈递细胞、和/或运送货物分子的用途
CN1899610A (zh) * 2006-07-20 2007-01-24 中国人民解放军第三军医大学 幽门螺杆菌抗原重组疫苗
WO2007039451A1 (en) * 2005-09-23 2007-04-12 Gianfranco Del Prete Use of the neutrophil activating protein of helicobacter pylori (hp-nap) and/or of its portions as adjuvants for the development of t helper type 1 (th1) immune responses
CN103923935A (zh) * 2014-04-22 2014-07-16 郑州大学 sIL-4R-NAP融合基因
CN103990121A (zh) * 2013-12-06 2014-08-20 上海联合赛尔生物工程有限公司 抗原嵌合体、抗原组合物、疫苗及其制备方法和试剂盒
CN104114705A (zh) * 2012-02-15 2014-10-22 库瑞瓦格有限责任公司 用于增加编码的治疗性蛋白表达的包含或编码组蛋白茎环和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号的核酸
WO2016113203A1 (en) * 2015-01-12 2016-07-21 Pieris Ag Engineered t cells and uses therefor
WO2020219843A1 (en) * 2019-04-26 2020-10-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric antigen receptor constructs and their use in car-t cells

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7500195B2 (ja) * 2016-08-23 2024-06-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア タンパク質分解により切断可能なキメラポリペプチド及びそれらの使用方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1533284A (zh) * 2001-07-26 2004-09-29 ��������ͨ���о�Ժ 生物活性 H I V － 1 T a t、其片段或衍生物用于预防或治疗性免疫接种和/或治疗其它疾病中靶向和/或激活抗原呈递细胞、和/或运送货物分子的用途
WO2007039451A1 (en) * 2005-09-23 2007-04-12 Gianfranco Del Prete Use of the neutrophil activating protein of helicobacter pylori (hp-nap) and/or of its portions as adjuvants for the development of t helper type 1 (th1) immune responses
CN1899610A (zh) * 2006-07-20 2007-01-24 中国人民解放军第三军医大学 幽门螺杆菌抗原重组疫苗
CN104114705A (zh) * 2012-02-15 2014-10-22 库瑞瓦格有限责任公司 用于增加编码的治疗性蛋白表达的包含或编码组蛋白茎环和聚腺苷酸序列或聚腺苷酸化信号的核酸
US20150057340A1 (en) * 2012-02-15 2015-02-26 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
CN103990121A (zh) * 2013-12-06 2014-08-20 上海联合赛尔生物工程有限公司 抗原嵌合体、抗原组合物、疫苗及其制备方法和试剂盒
CN103923935A (zh) * 2014-04-22 2014-07-16 郑州大学 sIL-4R-NAP融合基因
WO2016113203A1 (en) * 2015-01-12 2016-07-21 Pieris Ag Engineered t cells and uses therefor
WO2020219843A1 (en) * 2019-04-26 2020-10-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric antigen receptor constructs and their use in car-t cells
CN114269777A (zh) * 2019-04-26 2022-04-01 北卡罗来纳大学教堂山分校 嵌合抗原受体构建体及其在car-t细胞中的用途

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUAN JIN等: "CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers", 《NATURE BIOMEDICAL ENGINEERING》 *
CHUAN JIN等: "CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers", 《NATURE BIOMEDICAL ENGINEERING》, vol. 6, no. 7, 4 April 2022 (2022-04-04), pages 830 - 841, XP037904587, DOI: 10.1038/s41551-022-00875-5 *
MOHANRAJ RAMACHANDRAN等: "An infection-enhanced oncolytic adenovirus secreting H. pylori neutrophil-activating protein with therapeutic effects on neuroendocrine tumors", 《MOLECULAR THERAPY》 *
MOHANRAJ RAMACHANDRAN等: "An infection-enhanced oncolytic adenovirus secreting H. pylori neutrophil-activating protein with therapeutic effects on neuroendocrine tumors", 《MOLECULAR THERAPY》, vol. 21, no. 11, 2 July 2013 (2013-07-02), pages 2008 - 2018, XP055316355, DOI: 10.1038/mt.2013.153 *
MOHANRAJ RAMACHANDRAN等: "Vector-encoded Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes maturation of dendritic cells with Th1 polarization and improved migration", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGY》 *
MOHANRAJ RAMACHANDRAN等: "Vector-encoded Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes maturation of dendritic cells with Th1 polarization and improved migration", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGY》, vol. 193, no. 5, 21 July 2014 (2014-07-21), pages 2287 - 2296, XP055316375, DOI: 10.4049/jimmunol.1400339 *
高原等: "HP中性粒细胞激活蛋白研究进展", 《免疫学杂志》 *
高原等: "HP中性粒细胞激活蛋白研究进展", 《免疫学杂志》, vol. 22, no. 1, 31 December 2006 (2006-12-31), pages 64 - 67 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112226408A (zh) * 2020-09-30 2021-01-15 西北农林科技大学 一种猪病原或外源性蛋白特异性抗原肽筛选和鉴定的方法
CN112285347A (zh) * 2020-09-30 2021-01-29 西北农林科技大学 一种猪血清样中病原抗体elisa检测试剂盒
CN112285347B (zh) * 2020-09-30 2023-12-22 西北农林科技大学 一种猪血清样中病原抗体elisa检测试剂盒
CN112226408B (zh) * 2020-09-30 2024-04-02 西北农林科技大学 一种猪病原或外源性蛋白特异性抗原肽筛选和鉴定的方法
CN113402620A (zh) * 2021-07-30 2021-09-17 中山大学 细胞因子联合嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用
CN113402621A (zh) * 2021-08-02 2021-09-17 中山大学 含有嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用
CN113402621B (zh) * 2021-08-02 2021-12-10 中山大学 含有嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用
CN115980345A (zh) * 2022-08-30 2023-04-18 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种检测幽门螺旋杆菌的方法与应用

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