ES2964694T3 - Inmunoterapia de células T - Google Patents
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Abstract
Las células T útiles en la inmunoterapia de células T comprenden un CAR, TCR y/o secuencia(s) de ácido nucleico que codifican un CAR y/o un TCR. Las células T también comprenden HP-NAP, un fragmento inmunológico equivalente de la misma y/o secuencia(s) de ácido nucleico que codifican HAP-NAP y/o un fragmento inmunológico equivalente de la misma. Las células T tienen efectos mejorados en la inmunoterapia, incluida una citotoxicidad mejorada, estimulación de la secreción de quimiocinas y citocinas, promoción de la maduración de las células dendríticas y reclutamiento y activación de células inmunes innatas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
In m u n o te ra p ia de cé lu la s T
C a m p o té cn ico
Las p rese n te s re a liza c io n e s g e n e ra lm e n te se re fie ren a v e c to re s y cé lu la s T, y en p a rticu la r a d ich a s cé lu la s T ú tiles en in m u n o te ra p ia de c é lu la s T y en el tra ta m ie n to del cáncer.
A n te c e d e n te s
La in m u n o te ra p ia a fro n ta a c tu a lm e n te g ra n d e s a va n ce s en el tra ta m ie n to de l cáncer. Los ca so s de é x ito de la te ra p ia con a n ticu e rp o s m o n o c lo n a le s con H E R C E P T IN ® (a n ti-H e r2 ) para el c á n c e r de m a m a y M abThera® (a n ti-C D 20 ) para las n e o p la s ia s m a lig n a s de cé lu la s B han a lla n a d o el ca m in o para in m u n o te ra p ia s m ás so fis tica d a s , ta le s com o PR O V E N G E ® , una va cu n a de cé lu la s d e n d rítica s (D C ) p ara el c á n c e r de p rós ta ta m e ta s tá s ico . R e c ie n te m e n te , la in m u n o te ra p ia con a n ticu e rp o s m o n o c lo n a le s d ir ig id o s al s is te m a in m u n ita rio en lu g a r de a las cé lu las tu m o ra le s ha d e m o s tra d o se r e x itosa . Los a n ticu e rp o s m o n o c lo n a le s a n ti-C T L A 4 (p ro te ín a 4 a so c ia d a a lin fo c ito s T c ito tó x ico s ) y los a n ticu e rp o s an ti-P D 1 (p ro te ín a 1 de m u erte c e lu la r p ro g ra m a d a ) son e fe c tivo s en la lib e ra c ió n de la ro tu ra para las cé lu las T para de e sta m a n e ra h a ce r q ue se unan a las cé lu la s tu m o ra le s . El p o te n c ia l de las cé lu la s T te ra p é u tica s para d e sp la za rse a los s itio s de la e n fe rm e d a d , e xp a n d irse y p e rs is tir d e sp u é s de una ú n ica inye cc ió n s igu e s ie n d o una ve n ta ja im p o rta n te fre n te a los a n ticu e rp o s m o no c lo n a le s . De hecho , la in m u n o te ra p ia con tra el c á n c e r con tra n s fe re n c ia a do p tiva de cé lu la s T in filtra n te s de tu m o r (T IL ) en m u ch o s ca so s p ue de c o n d u c ir a la cu rac ión [1 ]. A lte rn a tiva m e n te , si se co n o ce el a n tíg e n o a so c ia d o al tu m o r (T A A ), las cé lu las T v o lu m in o s a s p ueden a is la rse de la sa n g re p e rifé rica de p ac ie n te s con c á n c e r para la m o d ifica c ió n g e n é tica con m o lé cu la s que re con oce n el a n tíg e n o a so c ia d o al tum o r, d on de d e sp u é s se re in fu n d e n a l pac ien te .
Las cé lu la s T se p ueden m o d ifica r para e xp re sa r un re ce p to r de cé lu la s T (T C R ) o un re ce p to r de a n tíg e n o q u im é rico (C A R ), re co n o c ie n d o un a n tíg e n o a so c ia d o a tum o r. P u b lica c io n e s re c ie n te s de e n sa yo s en cu rso d e m u e s tra n que ta le s c é lu la s T d ise ñ a d a s p ueden in d u c ir re m is ión co m p le ta en p ac ie n te s con c á n c e r p o r lo d e m á s re fra c ta rio [2-4].
S e o b se rvó un in te n to sa tis fa c to rio con un C A R co n tra C D 19 en p ac ie n te s con le u ce m ia lin fo c ítica c ró n ica de cé lu la s B a va n za d a (C L L ) y le u ce m ia lin fo c ítica a gu da de cé lu la s B (A LL), p ro life ra n d o las cé lu las T C A R e x tre m a d a m e n te b ien tra s la tra n s fe re n c ia a d o p tiva [2, 4, 5].
T a m b ié n se ha o b se rva d o é x ito c lín ico en m e n o r g rad o para lin fo m as de cé lu la s B re fra c ta rio s . El m e n o r éxito p ara los lin fo m a s q ue para la le u ce m ia p uede a tr ib u irse a la e s tru c tu ra a b u lta d a de los lin fo m a s en los g a n g lio s lin fá tico s y ó rg a n o s en co m p a ra c ió n con las cé lu la s tu m o ra le s le u cé m ica s q ue se e n cu e n tra n p rin c ip a lm e n te c ircu la n d o en la sa n g re de p a c ie n te s con c á n c e r [6, 7].
A p e s a r de los re su lta d o s a le n ta d o re s , v a r ia s ca ra c te rís tica s in m u n o ló g ica s de l m ic ro a m b ie n te tu m o ra l (T M E ) re s tr in g e n la in m u n o te ra p ia de cé lu la s T C A R e ficaz, e sp e c ia lm e n te en el caso de tu m o re s só lid os . El re su ltado en tu m o re s só lid o s e stá lim itado , e n tre o tros , p o r la e s tru c tu ra co m p le ja de los tu m o re s y su m ic ro a m b ie n te in m u n o su p re so r. A d e m á s de las c é lu la s m a lign as , la m a yo ría de los tu m o re s só lid o s ta m b ié n co n s is te n en v a r ia s p o b la c io n e s de cé lu la s no m a lign as : fib ro b la s to s , cé lu las m e se n q u im a le s y d ive rsa s cé lu las inm un ita ria s , ju n to con m a triz e x tra c e lu la r y m e d ia d o re s in fla m a to rio s . En m u ch o s casos, las cé lu la s m a lig n a s son m in o rita ria s d en tro de un tum o r. Las cé lu la s e n d o te lia le s en el lecho tu m o ra l ta m b ié n p ueden a c tu a r com o una b a rre ra al b lo q u e a r la e n tra d a de cé lu la s T e fe c to ra s m ie n tra s d e jan p a sa r las cé lu la s T re gu lad o ras . Las cé lu las ca n c e ro s a s h um a n a s p ueden e vo lu c io n a r y e s c a p a r del re co n o c im ie n to in m u n ita rio re gu lan d o p o r d ism in u c ió n el T A A y la m a yo ría de los tu m o re s son h e te ro g é n e o s . A d e m á s, en los tu m o re s só lid o s h ay cé lu las in m u n o su p re so ra s , c ito c in a s y m o lé cu la s in h ib id o ra s q ue p ue de n in te rfe r ir con el é x ito de la in m u n o te ra p ia de cé lu la s T CAR.
P o r con s ig u ie n te , la in m u n o te ra p ia de cé lu la s T C A R ha sido, h as ta ahora , p rin c ip a lm e n te e fica z en cá n ce re s tra n s m itid o s p o r la san gre , ta le s com o leu cem ia . P o r lo tan to , e x is te la n eces id ad de una in m u n o te ra p ia de cé lu la s T m e jo ra d a q ue sea e fica z ta m b ié n para tu m o re s só lidos .
C o m p e n d io
Un o b je tivo de las re a liza c io n e s es p ro p o rc io n a r cé lu la s T ú tiles en in m u n o te ra p ia de cé lu la s T.
E ste y o tros o b je tivo s se cu m p le n m e d ia n te las re a liza c io n e s q ue se d e sc rib e n en el p re se n te d ocum e n to .
La p re se n te inve n c ió n se d e fine en las re iv in d ica c io n e s in d e p e n d ie n te s . R e a liza c io n e s a d ic io n a le s de la p re se n te inve n c ió n se d e fin e n en las re iv in d ica c io n e s d ep e n d ie n te s .
Un a sp e c to de las re a liza c io n e s se re fie re a un v e c to r q ue co m p re n d e una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico que co d ifica un re ce p to r de a n tíg e n o q u im é rico (C A R ) y /o una se cu e n c ia de á c ido n u c le ico q ue co d ifica un re ce p to r de cé lu las T (T C R ). El v e c to r ta m b ié n co m p re n d e una se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica una p ro te ína a c tiva d o ra de n e u tró filo s deH e lic o b a c te rp y lo r i(H P -N A P ) y /o una se cu e n c ia de á c ido n u c le ico q ue co d ifica un fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P . El fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de la H P -N A P es un fra g m e n to q ue inc lu ye d o m in io s p o lip e p tíd ico s a c tivo s de al m e no s 20 -40 res tos de a m in o á c id o s de la H P -N A P , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o s de l g ru p o que co n s is te en las S E Q ID NO: 9 a 12.
O tro a sp e c to de las re a liza c io n e s se re fie re a una cé lu la T q ue co m p re n d e un C A R , un TC R , una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico que co d ifica C A R y /o una s e cu e n c ia de á c ido n u c le ico q ue co d ifica TC R . La cé lu la T ta m b ié n co m p re n d e una H P -N A P , un fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P , una se cu e n c ia de á c ido n u c le ico q ue co d ifica H P -N A P y /o una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico que co d ifica un fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P . El fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de la H P -N A P es un fra g m e n to q ue inc lu ye d o m in io s p o lip e p tíd ico s a c tivo s de al m e no s 20 -40 re s to s de a m in o á c id o s de la H P -NAP, p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o s de l g rup o que c o n s is te en las S E Q ID NO: 9 a 12.
Un a sp e c to a d ic io n a l de las re a liza c io n e s se re fie re a una co m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a que co m p re n d e una cé lu la T de a cu e rd o con lo a n te r io r y una cé lu la den d rítica , p re fe rib le m e n te una cé lu la d e n d rítica inm adura .
A s p e c to s a d ic io n a le s de las re a liza c io n e s se re fie ren a una cé lu la T de a cu e rd o con lo a n te r io r o una co m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a de a cu e rd o con lo a n te r io r para u sa r com o un m e d ica m e n to , para u sa r en in m u n o te ra p ia de cé lu la s T o para u sa r en el tra ta m ie n to , re du cc ió n y /o p re ve n c ió n de l cáncer.
Un a sp e c to a d ic io n a l de las re a liza c io n e s se re fie re a un m é to d o para in d u c ir la m a du ra c ió n de cé lu las d e n d rítica s inm ad uras . El m é to do co m p re n d e p o n e r en con tac to , p re fe rib le m e n tein v itro,las cé lu la s d e n d rítica s in m a d u ra s con una cé lu la T de a cu e rd o con lo a n te rio r.
Las cé lu la s T de las p rese n te s re a liza c io n e s tie n e n c ito to x ic id a d m e jo ra d a y e s tim u la n la sec re c ión de q u im io c in a s y c ito c in a s y p rom ue ve n la m a d u ra c ió n de cé lu la s d e n d rítica s . Las cé lu la s T ind u cía n a d e m á s p o la riza c ió n de Th1 y re c lu tab a n y a c tiva b a n cé lu la s in m u n ita ria s inna tas.
B re ve d e sc rip c ió n de los d ib u jos
Las re a liza c io n e s , ju n to con o tro s o b je to s y v e n ta ja s de las m ism as, p ueden e n te n d e rse m e jo r h ac ien do re fe re n c ia a la s ig u ie n te d e sc rip c ió n ju n to con los d ib u jo s a d ju n tos , en los que:
S a lvo q ue se ind iq ue lo co n tra rio e sp e c ífica m e n te en ca d a secc ión , to d o s los e xp e rim e n to s se re a liza ro n se is v e ce s con cé lu la s T C A R p ro d u c id a s de se is d o n a n te s de sa n g re san os d ife re n te s . Las b a rras de e rro r re p re se n ta n S E M y la s ig n ifica c ió n e s ta d ís tica se re p re se n ta m e d ia n te s ím b o lo s (ns, s in s ig n ifica c ió n e sta d ís tica , *: P <0 ,05 , **: P <0 ,01 , ***: P <0 ,001).
F ig u ra 1. Ilus tra c ió n e sq u e m á tica de la co n s tru cc ió n len tiv ira l u sa da para tra n s d u c ir cé lu la s T.
F ig u ra 2. Ilus tra c ió n e sq u e m á tica de la a c tiva c ió n de l p ro m o to r de N F A T -IL -2 y e xp re s ió n tra n s g é n ica tra s el re co n o c im ie n to de cé lu la s d iana.
F ig u ra 3. Las cé lu la s T se tra n s d u je ro n con LV (n L u c -C D 19 C A R ) y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . Las cé lu la s T tra n s d u c id a s so la s o las cé lu la s T tra n s d u c id a s e s tim u la d a s con cé lu la s d ia n a D au d i en una re lac ión de 5:1 se e va lu a ro n m e d ia n te lib e ra c ió n de n a n o lu c ife ra sa d e sp u é s de 24 horas.
F ig u ra 4. Las cé lu la s T se tra n s d u je ro n con LV (n L u c -C D 19 C A R ) y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . Las cé lu la s T se inye cta ro n p o r v ía in tra ve n o sa ju n to con D au d i C D 19+ o B C -3 C D 19 en una re lac ió n 2:1 en ra ton es N O D -S C ID (3 ra to n e s /g ru p o ) el d ía 0. La e xp re s ió n de N a n o -L u c se v ig iló los d ías 3 y 5.
F ig u ra 5. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con L V (C D 19 C A R ) o L V (N A P -C D 19 C A R ) y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . Se usó c ito m e tría de flu jo p ara a n a liza r la e xp re s ió n de N A P de cé lu la s T N A P -C D 19 C A R c o cu ltiva d a s con cé lu la s D aud i en una re lac ió n de 5:1. Los d a tos se m u es tra n com o cé lu la s T p o s itiva s N A P C D 19C A R d o b le s de l to ta l de cé lu la s T CD3+.
F ig u ra 6. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con L V (C D 19 C A R ) o L V (N A P -C D 19 C A R ) y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a n a s . H is to g ra m a s re p re se n ta tivo s q ue d e m u e s tra n la e xp re s ió n de N A P a p a rtir de cé lu la s T C D 19C AR .
F ig u ra 7. Ilus tra c ió n e sq u e m á tica de los e xp e rim e n to s com o se p rese n ta n en las F ig u ras 8 -11.
F ig u ra 8. Las cé lu la s T se tra n s d u je ro n con L V (S im u la d o ), L V (C D 19 C A R ), L V (N A P -C D 19 C A R ) re sp e c tiva m e n te y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . La ca p a c id a d c ito tó x ica de las cé lu las T tra n sd u c id a s y e xp a n d id a s se e va luó c o cu ltivá n d o la s con cé lu la s d ia n a D aud i m a rca d a s con luc ife ra sa de lu c ié rn a g a en una re lac ió n de 5:1 o c o cu ltivá n d o la s con im D C a u tó lo g a s y cé lu la s D au d i m a rca d a s con lu c ife ra sa de lu c ié rn a g a en una re lac ió n de 5:1:1 d e sp u é s de 4 d ías. La v ia b ilid a d re la tiva de las cé lu las d ia n a se m id ió p o r lu m in isce n c ia y se re la c io n ó con se ñ a le s de cé lu la s d ia n a so las.
F ig u ra 9. Las cé lu la s T se tra n s d u je ro n con L V (S im u la d o ), L V (C D 19 C A R ), L V (N A P -C D 19 C A R ) re sp e c tiva m e n te y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . Las cé lu la s T C D 19 C A R se co cu ltiva ro n con cé lu las D au d i en una re lac ió n de 5:1 o se co cu ltiva ro n con im D C y cé lu la s D aud i en una re lac ió n de 5:1:1 d u ra n te 20 24 horas. Se usó E L IS A para a n a liza r la p ro d u cc ió n de IFN - y de l líqu ido sob re n a d a n te .
F ig u ra 10. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con L V (S im u la d o ), L V (C D 19 C A R ), L V (N A P -C D 19 C A R ) re sp e c tiva m e n te y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . Las cé lu las T C D 19 C A R se co cu ltiva ro n con cé lu las D au d i en una re lac ió n de 5:1 o se co cu ltiva ro n con im D C y cé lu la s D au d i en una re lac ió n de 5:1:1 d u ra n te 20 24 horas. Se usó c ito m e tría de flu jo para a n a liza r la e xp re s ió n de C D 107 a en cé lu la s T C D 19 C A R<+>(C D 3<+>).
F ig u ra 11. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con L V (S im u la d o ), L V (C D 19 C A R ), L V (N A P -C D 19 C A R ) re sp e c tiva m e n te y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . Las cé lu la s T se m a rca ron con C e llT ra n ce V io le t el d ía y se co cu ltiva ro n con cé lu las D au d i en una re lac ión de 1:1 d u ra n te 4 días. La p ro life ra c ió n de cé lu la s T se a n a lizó p o r c ito m e tría de flu jo .
F ig u ra 12. Ilus tra c ió n e sq u e m á tica de los e xp e rim e n to s co m o se p rese n ta n en las F ig u ras 13-14.
F ig u ra 13. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con L V (S im u la d o ), L V (C D 19 C A R ), L V (N A P -C D 19 C A R ) re sp e c tiva m e n te y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . Las cé lu la s T tra n s d u c id a s y e xp a n d id a s se co cu ltiva ro n con cé lu la s d ia n a D au d i en una re lac ió n de 5:1 d u ra n te 4 días. S e re cog ió el líqu ido so b re n a d a n te y se a ña d ió d ire c ta m e n te a las im D C d e riva d a s de m o n o c ito s d u ra n te 48 hora s para in v e s tig a r si pod ía m a d u ra r las im D C . En para le lo , las im D C se tra ta ro n con un cóc te l de m a d u ra c ió n (R 848 , p o li(I:C ) e IF N -y ) y se usa ron com o co n tro l p os itivo de m D C en to d o s los e xp e rim e n to s . El a n á lis is fe n o típ ico de las DC se e va lu ó m e d ia n te c ito m e tría de flu jo com o C D 83, C D 86, C D 80, C D 40 y C D 70. S e e s ta b le c ie ro n co cu ltivo s de cu a tro d ía s de cé lu la s T tra n s d u c id a s y e xp an d id as , cé lu la s d ia n a D au d i y im D C a u tó lo g a s en una re lac ió n de 5 :1 :1. Se usó E L IS A para a n a liza r la p ro d u cc ió n de IL -12 a p a rtir de l líqu ido so b re n a d a n te re co g id o de los cocu ltivos .
F ig u ra 14. Se e s ta b le c ie ro n co cu ltivo s de cua tro d ías de cé lu la s T tra n s d u c id a s y e xp a n d id a s , cé lu la s d iana D au d i y im D C a u tó lo g a s en una re lac ió n de 5 :1 :1. La q u im io c in a h u m a n a y la m a triz de c ito c in a s se m id ie ron a p a rtir de l líqu ido s o b re n a d a n te re co g id o de los cocu ltivo s . Los d a to s se m o stra ro n co m o m a pa té rm ic o y se re la c io n a ro n con los n ive les d e te c ta d o s para co cu ltivo s de cé lu la s T tra n s d u c id a s con L V (S im u la d o ).
F ig u ra 15. Ilus tra c ió n e sq u e m á tica de los e xp e rim e n to s p re se n ta d o s en la F ig ura 16.
F ig u ra 16. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con L V (S im u la d o ), L V (C D 19 C A R ), L V (N A P -C D 19 C A R ) re sp e c tiva m e n te y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . Las cé lu la s T tra n s d u c id a s y e xp a n d id a s se co cu ltiva ro n con cé lu la s d ia n a D au d i en una re lac ió n de 5:1 o se co cu ltiva ro n con cé lu la s d ia n a D aud i e im D C en una re lac ió n de 5:1:1 d u ra n te 4 d ías. La e xp re s ió n de G A T A 3 y T -b e t se e va lu ó en cé lu la s T C D 4<+>C D 3<+>p or c ito m e tría de flu jo . Se m u e s tra la re lac ión de T -b e t/G A T A 3 (T h1 /T h2 ). La e xp re s ió n de l m a rc a d o r de a g o ta m ie n to de cé lu la s T PD-1 y T im 3 (d o b le p o s itiv id a d ) se e va lu ó m e d ia n te c ito m e tría de flu jo . La M FI del m a rc a d o r de l re ce p to r de l pun to de con tro l in m u n ita rio LA G 3 se e va lu ó m e d ia n te c ito m e tría de flu jo . El líqu ido so b re n a d a n te se re cog ió de l co cu ltivo y se usó E L IS A para a n a liza r la p ro d u cc ió n de IL -2 a p a rtir de cé lu las T.
F ig u ra 17. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con L V (S im u la d o ), L V (C D 19 C A R ), L V (N A P -C D 19 C A R ) re sp e c tiva m e n te y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . El líqu ido so b re n a d a n te sa lva d o del co cu ltivo de cé lu la s T y cé lu la s D aud i d ia n a en una re lac ió n 5:1 d u ra n te 4 d ía s se a ña d ió al fo n d o de los p oc illos y se se m b ra ro n neu tró filo s , m o no c ito s , cé lu la s N K o im D C rec ién a is la d o s en la p arte s u p e r io r de la m e m b ra n a y se p us ie ron en los poc illos . La m ig ra c ió n de las cé lu la s se e va lu ó d e sp u é s de 1 ,5 -2 h de incu ba c ió n a 37°C. El p o rce n ta je de cé lu la s q ue m ig ra ba n se m id ió com o (R L U<células-T+Daudi>- R L U<solo células-T>) / (R L U<células de migración totales>) X 100 %.
F ig u ra 18. Ilus tra c ió n e sq u e m á tica de los e xp e rim e n to s co m o se p rese n ta n en las F ig u ras 19-20.
F ig u ra 19. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con L V (S im u la d o ), L V (C D 19 C A R ), L V (N A P -C D 19 C A R ) re sp e c tiva m e n te y se e xp a n d ie ro n d u ra n te dos sem a na s . Las cé lu la s T tra n s d u c id a s y e xp a n d id a s se co cu ltiva ro n con n e u tró filo s a u tó lo g o s rec ién a is la d o s d u ra n te 48 hora s y se m id ie ro n los m a rca d o re s de s u p e rfic ie en los n e u tró filo s C D 15<+>p o r c ito m e tría de flu jo .
F ig u ra 20. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con L V (S im u la d o ), L V (C D 19 C A R ), L V (N A P -C D 19 C A R ) re sp e c tiva m e n te y se e xp a n d ie ro n d u ra n te d os sem a na s . Las cé lu la s T tra n s d u c id a s y e xp a n d id a s se co cu ltiva ro n con n e u tró filo s a u tó lo g o s rec ién a is la d o s d u ra n te 48 horas. Se usó E L IS A para m e d ir las c ito c in a s q ue se libe ra n de l líqu ido so b re n a d a n te de l co cu ltivo de cé lu la s T, n e u tró filo s y cé lu la s d ia n a D audi.
F ig u ra 21. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con L V (S im u la d o ), L V (C D 19 C A R ), L V (N A P -C D 19 C A R ) re sp e c tiva m e n te y se e xp a n d ie ro n d u ra n te dos sem a na s . a) Ilus tra c ió n de cu ltivo T ra n sw e ll de m o no c ito s (c D 14+) ( in fe r io r) y cé lu la s T con cé lu la s d ia n a D aud i (su p e rio r). b -d ) El fe n o tip o de m o n o c ito s se m id ió p or c ito m e tría de flu jo com o C D 14, C D 1a, C D 83, C D 80, C D 86, C D 40 y C D 70.
F ig u ra 22. Ilus tra c ió n e sq u e m á tica de las c o n s tru cc io n e s de re tro v iru s u sa d a s para tra n s d u c ir cé lu las T de ra tón.
F ig u ra 23. E sq u e m a de l p ro g ra m a del e xp e rim e n to . R a to n e s B A L B /c h em b ra de 5 -6 se m a n a s de edad re c ib ie ro n inye cc ió n s.c. de 1 x105 cé lu la s tu m o ra le s A 20 s in g é n ica s (CD19+). Se tra ta ro n s is té m ica m e n te los d ía s 15 y 18 m e d ia n te in ye cc io n e s i.v. de 5 x 106 cé lu la s T C D 19 C A R o cé lu la s T N A P -C D 19 C A R y 30 U I/m L de IL -2 hum ana.
F ig u ra 24. El c re c im ie n to tu m o ra l para cada ra tón ind iv idu a l se p rese n ta para cad a g rup o . S e p re se n ta el c re c im ie n to tu m o ra l p ro m e d io de cada g rupo . La cu rva de s u p e rv ive n c ia de K a p la n -M e ie r d e m u e s tra d a tos de sup e rv ive n c ia .
F ig u ra 25. Los lin fo c ito s T N A P -C D 19 C A R p re se n ta b a n m ás a c tiva c ió nin vivo.La p re se n c ia de cé lu la s T a c tiva d a s se p re se n tó com o % de PD-1+CD8+ de las CD3+, en g a n g lio lin fá tico d re n a n te , bazo y sangre .
F ig u ra 26. Los ra to n e s se sa c rifica ro n y los tu m o re s se e x tra je ro n y se a n a lizó la in filtra c ión de cé lu las in m u n ita ria s p o r c ito m e tría de flu jo . El a g o ta m ie n to de cé lu la s T en los tu m o re s se a n a lizó com o % de cé lu las T PD-1+Tim 3+ de las CD8+CD3+. C alto. Los n e u tró filo s en el tu m o r se a n a liza ro n co m o cé lu las G r1+ de las C D 11 b+. C ad a g rup o co n te n ía al m e no s 4 ra tones.
F ig u ra 27. Ilus tra c ió n de l m e ca n ism o e sp e ra d o para cé lu las T N A P -C D 19 C A R en in m u n o te ra p ia co n tra el cán ce r. La e xp re s ió n de N A P es ind u c id a a p a rtir de l p ro m o to r de N F A T -IL -2 ind u c ib le cua nd o las cé lu la s T C A R se a c tivan m e d ia n te el a co p la m ie n to de las cé lu la s d iana. La e xp re s ió n de N A P en el s itio de l tu m o r co n d u ce a la e xp re s ió n de q u im io c in a s y al re c lu ta m ie n to de cé lu la s in m u n ita ria s inn a ta s (n eu tró filo s , m o no c ito s y cé lu la s N K ) de una m a ne ra lo ca lm e n te re s tr in g id a para in ic ia r un a ta q u e in m u n ita rio sob re las cé lu las tu m o ra le s , in c lu ye n d o cé lu la s tu m o ra le s n eg a tiva s para a n tíg e n o C A R q ue no p ueden s e r d e s tru id a s p o r las cé lu la s T C A R . Las cé lu la s tu m o ra le s m u e rta s p ueden lib e ra r n eo a n tíg e n o s , que p ueden s e r a b so rb id o s p or cé lu la s d e n d rítica s in m a d u ra s re s ide n te s . N A P ta m b ié n in d u ce una a b u n d a n te se c re c ió n de c ito c in a s Th1 (IL -12, IFN -y , IL-1 p) para la m a d u ra c ió n de C D y m ig ra c ió n a g an g lio s lin fá tico s d re n a n te s y a c tiva c ió n de lin fo c ito s T c ito lítico s
D e sc rip c ió n d e ta lla d a
A m e no s que se d e fina lo con tra rio , to d o s los té rm in o s té c n ico s y c ie n tífico s u sa do s en el p re se n te d o cu m e n to t ie n e n el s ig n ifica d o c o m ú n m e n te e n te n d id o p o r un e xp e rto en la té c n ica a la q ue p e rte ne ce la p rese n te inve nc ión . Las s ig u ie n te s re fe re n c ia s [11 -16 ] p ro p o rc io n a n una d e fin ic ió n g en e ra l de m u ch o s de los té rm in o s u tiliza d o s en e sta inve nc ión . P ara m a yo r c la rida d , se usan las s ig u ie n te s d e fin ic io n e s en el p rese n te d ocum e n to .
Las e xp re s io n e s "s e cu e n c ia de á c id o n u c le ico " o "s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s" se re fie ren a un po lím ero c o m p u e s to de nuc leó tido s , ta le s co m o rib o n u c le ó tid o s , d e so x irr ib o n u c le ó tid o s , va r ia n te s e s tru c tu ra le s re la c io n a d a s de o rige n natura l, y /o a n á lo g o s s in té tico s de o rigen no n a tu ra l de las m ism as, u n id os a tra vé s de e n la ce s fo s fo d ié s te r, va r ia n te s e s tru c tu ra le s re la c io n a d a s de o rige n n a tu ra l, y /o a n á lo g o s s in té tico s de o rigen no n a tu ra l de las m ism as . E je m p lo s de ta le s se cu e n c ia s de á c id o n u c le ico o n u c le ó tid o s son se cu e n c ia s de á c id o d e s o x irr ib o n u c le ic o (A D N ) y s e cu e n c ia s de á c id o rib o n u c le ico (A R N ).
La e xp re s ió n "s e cu e n c ia co d ifica n te " se re fie re a una se cu e n c ia de á c id o n uc le ico con las p ro p ie d a d e s de se r ca p a z de s e r tra n s c rita en una se cu e n c ia d e fin id a de n u c le ó tid o s (A R N t, A R N r y A R N m ) y, en el caso de la tra n s c rip c ió n de A R N m , s e r tra d u c id a a d e m á s en un p o lip ép tid o . La se cu e n c ia co d ific a n te p ue de se r un gen, un A D N c o una se cu e n c ia de á c id o n uc le ico re co m b in a n te . P o r con s ig u ie n te , una se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica un p o lip é p tid o es un e je m p lo de d ich a se cu e n c ia cod ifica n te .
"P ro m o to r" es la se cu e n c ia de á c id o n u c le ico m ín im a re q u e rid a p ara d ir ig ir la tra n sc rip c ió n . El p ro m o to r puede in c lu ir e le m e n to s q ue hacen que el tip o de cé lu la o te jid o de e xp re s ió n g é n ica d e p e n d ie n te de l p ro m o to r sea e sp e c ífica m e n te co n tro la b le o in d u c ib le p or se ñ a le s o a g e n te s e x te rnos .
La e sp e c ific id a d de un re ce p to r de a n tíg e n o q u im é rico (C A R ) y /o un re ce p to r de cé lu la s T (T C R ) se p uede d e te rm in a r b a sá n d o se en la a fin ida d y /o la a v id ez . La a fin ida d , re p re se n ta d a p o r la co n s ta n te de e q u ilib r io para la d iso c ia c ió n de un a n tíg e n o con el C A R y /o T C R (K<d>), es una m e d id a de la fu e rza de un ión e n tre un d e te rm in a n te a n tig é n ico y un s itio de un ión a a n tíg e n o en el C A R y /o TC R . C u a n to m e n o r sea el v a lo r de K<d>, m ás fu e rte se rá la fu e rza de u n ión e n tre el d e te rm in a n te a n tig é n ico y el C A R y /o TC R . A lte rn a tiva m e n te , la a fin id a d ta m b ié n se p ue de e xp re sa r com o la co n s ta n te de a fin id a d (K<a>), q ue es 1 /K<d>. C om o q u e d a rá c la ro para el e xp e rto en la té cn ica , la a fin id a d se p uede d e te rm in a r de una m a n e ra co n o c id a p e r se, d e p e n d ie n d o del a n tíg e n o e sp e c ífico de in te rés.
La a v id ez es la m e d id a de la fu e rza de un ión e n tre un C A R y /o T C R y el a n tíg e n o pe rtin en te . La a v id ez se re fie re ta n to a la a fin id a d e n tre un d e te rm in a n te a n tig é n ico y su s itio de un ión al a n tíg e n o en el C A R y/o T C R com o al n úm e ro de s itio s de un ión p e rtin e n te s p re se n te s en el C A R y /o TC R .
En g en era l, se co n s id e ra q ue cu a lq u ie r v a lo r de K<d>s u p e r io r a 10<-4>M (o cu a lq u ie r v a lo r de K<a>in fe rio r a 10<4>M<-1>) ind ica una unión no e sp ec ífica .
La un ión e sp e c ífica de un C A R y /o T C R a un d e te rm in a n te a n tig é n ico p uede d e te rm in a rs e de cu a lq u ie r m a ne ra co n o c id a p e r se, inc lu ye nd o , p o r e je m p lo , a n á lis is de S ca tch a rd y /o e n sa yo s de un ión com p e titiva , ta le s com o ra d io in m u n o e n sa yo s (R IA ), in m u n o e n sa yo s e n z im á tico s (E IA ) y e n sa yo s de co m p e tic ió n tip o sán dw ich , y las d ife re n te s v a r ia n te s de los m ism o s co n o c id a s p e r se en la técn ica .
La p a la b ra "u n " o "u n a " no se in te rp re ta rá com o e xc lu ye n te de l p lu ra l, es dec ir, la re fe re n c ia a, p. ej., el uso de "u n a m o lé cu la " no e xc lu ye el uso de m o lé cu la s p lu ra les.
Las p re se n te s re a liza c io n e s se re fie ren g e n e ra lm e n te a cé lu la s T, ta m b ié n d e n o m in a d o s lin fo c ito s T, y en p a rtic u la r a ta le s cé lu la s T ú tiles en in m u n o te ra p ia de cé lu la s T.
Las cé lu la s T de las p rese n te s re a liza c io n e s son ú tiles en la in m u n o te ra p ia de cé lu la s T, p o r e je m p lo , en el tra ta m ie n to de l cán cer. Las cé lu las T de la re a liza c ió n se m o d ifica n g e n é tica m e n te para te n e r un e fec to s ig n ifica tiva m e n te m e jo rad o en té rm in o s de, e n tre o tros, c ito to x ic id a d m e jo ra d a y ca p a c id a d de in m u n o m o d u la c ió n m e jo rad a . Las m e jo ra s lo g ra d a s p o r las cé lu la s T de las re a liza c io n e s im p lica n que las cé lu la s T son e fe c tiva s en la in m u n o te ra p ia de cé lu la s T ta m b ié n para tu m o re s só lidos .
Un p rim e r a sp e c to de las re a liza c io n e s se re fie re a un vec to r. E s te v e c to r se p ue de u tiliz a r para m o d ifica r g e n é tic a m e n te una cé lu la T de las re a liza c io ne s , ta l com o en un p roce so de tra n sd u cc ió n . El v e c to r seg ún las re a liza c io n e s co m p re n d e una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica un re ce p to r de a n tíg e n o q u im é rico (C A R ) y /o una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica un re ce p to r de cé lu la s T (T C R ). El v e c to r ta m b ié n co m p re n d e una se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica una p ro te ín a a c tiva d o ra de n e u tró filo s deH e lic o b a c te r p y lo r i(H P -N A P ) y /o una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica un fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P . El fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de la H P -N A P es un fra g m e n to q ue inc lu ye d o m in io s p o lip e p tíd ico s a c tivo s de al m enos 20 -40 re s to s de a m in o á c id o s de la H P -N A P , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o s de l g rup o q ue co n s is te en las S E Q ID NO: 9 a 12.
Un C A R se d ise ña g e n e ra lm e n te fu s io n a n d o un fra g m e n to v a r ia b le de ca d e n a s e n c illa (scF v ) de un a n ticue rp o m o no c lo na l, ta l com o un a n ticu e rp o m o n o c lo n a l m urino , com o el d o m in io de re co n o c im ie n to de a n tíg e n o con d o m in io s de se ñ a liza c ió n de c é lu la s T para lo g ra r la se ñ a liza c ió n s e cu e n c ia a ba jo tra s el re co n o c im ie n to de an tíge no . Los C A R p ueden re co n o ce r a n tíg e n o s de una m a ne ra in d e p e n d ie n te de l co m p le jo p rin c ip a l de h is to co m p a tib ilid a d (M H C ). Esto p ue de s e r v e n ta jo so ya q ue los tu m o re s p ueden e v a d ir n o rm a lm e n te el re co n o c im ie n to de cé lu la s T del h o sp e d a n te re g u la n d o p or d ism in u c ió n el a n tíg e n o le u co c ita rio h u m a n o (H L A ) (en se res hum a no s , el M H C a m e n u d o se ind ica H LA ) en su sup e rfic ie . A d e m á s, los C A R ta m b ié n pueden re c o n o c e r m o lé cu la s de su p e rfic ie no p ro te icas , ta le s com o c a rb o h id ra to s y g lico líp ido s . P o r lo tan to , un C A R co m p re n d e un scF v d e riva d o de a n ticu e rp o e x tra c e lu la r q ue se une e sp e c ífica m e n te a un an tíge no , ta l com o un a n tíg e n o a so c ia d o a tu m o r (T A A ), un d o m in io tra n s m e m b ra n a y un d o m in io de se ñ a liza c ió n in tra ce lu la r c o n fig u ra d o para tra n s m it ir una señ a l de a c tiva c ió n tra s la un ión del an tíge no , ta l com o TAA , al scFv.
El C A R co m o se usa en el p re se n te d o cu m e n to ta m b ié n a b a rca v a r ia n te s fu n c io n a le s y e q u iva le n te s de las m ism as. T a le s va r ia n te s de C A R tie n e n un d o m in io de un ión a a n tíg e n o e x tra ce lu la r, p re fe rib le m e n te un d o m in io de un ión a a n tíg e n o d e riva d o de a n ticue rp o , q ue se une a un an tíge no , ta l com o TA A . Las v a r ia n te s de C A R ta m b ié n tie n e n un d o m in io tra n s m e m b ra n a y un d o m in io de se ñ a liza c ió n in tra c e lu la r co n fig u ra d o para tra n s m it ir una se ñ a l de a c tivac ión tra s la un ión de un a n tíg e n o al d o m in io de un ión al an tíge no . E sta se ñ a l de a ctiva c ió n , a su vez , ind u ce o a c tiva p re fe rib le m e n te un p ro m o to r ind u c ib le que co n tro la la e xp re s ió n de H P -N A P o un fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te del m ism o com o se d e sc rib e a d ic io n a lm e n te en el p re se n te d ocum e n to .
Un T C R es una m o lé cu la q ue se e n cu e n tra en la s u p e rfic ie de las cé lu la s T q ue es re sp o n sa b le de re co n o ce r fra g m e n to s de a n tíg e n o com o p é p tid o s u n id os a m o lé cu la s de M H C. C u a n d o el T C R se a co p la con un pép tid o a n tig é n ico y el M H C, la cé lu la T se a c tiva a tra vé s de la tra n s d u c c ió n de señ a le s , es dec ir, una se rie de e ve n to s b io q u ím ico s m e d ia d o s p o r e n z im a s a so c ia d a s , co rre ce p to re s , m o lé cu la s a d a p ta d o ra s e sp e c ia liza d a s y fa c to re s de tra n s c rip c ió n a c tiva d o s o libe rados.
Los e je m p lo s no lim ita n te s de T C R q ue se p ueden u sa r inc lu ye n T C R C M V p p 65 y T A R P -T C R .
En una re a liza c ió n , el v e c to r co m p re n d e se c u e n c ia (s ) de á c ido n u c le ico q ue c o d ific a (n ) una o va rias , es decir, al m e no s d os C A R . En o tra re a liza c ió n , el v e c to r co m p re n d e se cu e n c ia (s ) de á c id o n u c le ico q ue c o d ifica (n ) uno o m ú ltip le s TC R . En una re a liza c ió n a d ic ion a l, el v e c to r co m p re n d e se cu e n c ia (s ) de á c id o n u c le ico que cod ifica n uno o m ú ltip le s C A R y se cu e n c ia (s ) de á c id o n u c le ico que cod ifica n uno o m ú ltip le s TC R .
En las re a liza c io n e s con m ú ltip le s C A R , m ú ltip le s T C R o una co m b in a c ió n de al m e no s un C A R y al m e no s un TC R , los C A R , los T C R o e l( lo s ) C A R y e l( lo s ) T C R se unen p re fe rib le m e n te e sp e c ífica m e n te a d ife re n te s a n tíg e n o s, ta le s com o d ife re n te s TAA .
La p ro te ína a c tiva d o ra de n e u tró filo s (N A P ) deH e lic o b a c te r p y lo r i(H P ) es una p ro te ín a d o d e ca m é rica que a c tú a com o un fa c to r de v iru le n c ia en la in fe cc ió n b a c te ria n a p o rH. p y lo ri.E s tá h echa de 12 su b u n id a d e s m o n o m é rica s y cada su b u n id a d e stá c o m p u e s ta de cua tro h é lices a. La su p e rfic ie de la N AP tie n e a lta ca rga p os itiva y tie n e ca p a c id a d de in te ra cc io n a r con y a c tiv a r los g ló b u lo s b la n co s h u m a n o s (W B C ), ta m b ié n d e n o m in a d o s leu coc itos .
La H P -N A P ju e g a un pape l c rítico en la m ig ra c ió n de n e u tró filo s al te jid o in fla m a d o d u ra n te la in fe cc ió n p o rH. p ylo ri.La H P -N A P p ro m u e ve la fu e rte un ión de n e u tró filo s y m o n o c ito s al e n d o te lio y la e x tra va sa c ió n re gu lan d o p o r a u m e n to la e xp re s ió n de s u p e rfic ie de in te g rin a p2. T a m b ié n p uede a c tiv a r n e u tró filo s en la p ro d u cc ió n de e sp e c ie s re a c tiva s de o x íg e n o (R O S ) y m ie lo p e ro x id a sa s . La H P -N A P ta m b ié n a c tiva la se c re c ió n de o tras c ito c in a s p ro in fla m a to ria s , ta le s co m o fa c to r de n e c ro s is tu m o ra l a lfa (T N F -a ) e in te rle u c in a 8 (IL -8 ), ta m b ié n d e n o m in a d a s liga n do 8 de q u im io c in a (m o tivo C -X -C ) (C X C L8 ), q ue a su ve z ind u ce n la e xp re s ió n de m o lécu la s de a d h e s ió n com o la m o lé cu la de a d h e s ió n de cé lu la s va s c u la re s (V -C A M ), m o lé cu la de a d h e s ió n in te rc e lu la r (I-C A M ) y se c re c ió n de IL-8 p o r cé lu la s e n d o te lia le s . A d e m á s, la H P -N A P ta m b ié n p uede in d u c ir la sec re c ió n de n e u tró filo s de e xp re s ió n de v a r ia s c ito c in a s y q u im io c in a s , ta le s com o IL-8, p ro te ína in fla m a to ria de m a cró fa g o s 1 a lfa (M IP -1 a ) y M IP-1 p, ta m b ié n d e n o m in a d a liga n do 4 de q u im io c in a (m o tivo C -C ) (C C L4 ). E s tas c ito c in a s y q u im io c in a s a trae n a su vez, p o r q u im io ta x is , n e u tró filo s al s itio de in fla m ac ió n .
La H P -N A P es un a g o n is ta de l re c e p to r 2 tip o to ll (T LR -2 ), es q u im io tá c tica p ara n eu tró filo s , m o n o c ito s y puede m a d u ra r cé lu la s d e n d rítica s ta n toin v itrocom oin vivo.T a m b ié n p ue de e s tim u la r la sec re c ió n de IL -12 e IL-23, q ue son c ito c in a s p o la riza n te s de T h -1. La H P -N A P e s tim u la a los m o n o c ito s para d ife re n c ia rse y m a d u ra r a cé lu la s d e n d rítica s (D C ) re g u la n d o p o r a u m e n to la e xp re s ió n de l H L A - a n tíg e n o D re la c io n a d o (H L A -D R ), el g rup o de d ife re n c ia c ió n 80 (C D 80 ) y C D 86. T a m b ié n tie n e fu n c io n e s in m u n o rre g u la d o ra s c ru c ia le s para a yu d a r a la a c tiva c ió n de cé lu la s T c ito tó x ica s y lin fo c ito s c ito lítico s n a tu ra le s (N K). La H P -N A P p ue de in d u c ir a las cé lu la s T a s e c re ta r un n ive l a lto de in te rfe ró n g a m m a ( IF N -y ) y un n ive l ba jo de IL-4, lo que ta m b ié n sug ie re una re sp u e s ta p o la riza n te de Th1. E sto co in c id e con el in fo rm e de q ue los se res h um a n o s in fe c ta d o s con H.p y lo r iind ican una fu e rte re spu es ta p o la riza n te de Th1.
En una re a liza c ió n , la H P -N A P p re fe rib le m e n te co m p re n d e , o tien e , una se cu e n c ia de a m in o á c id o s s e le cc io n a d a de c u a lq u ie ra de las s ig u ie n te s secu en c ia s :
MKTFEILKHLQADAIVLFMKVHNFHWNVKGTDFFNVHKATEEIYEEFADMFDDLAERIVQLGHHPLVTLS
EAIKLTRVKEETKTSFHSKDIFKEILEDYKYLEKEFKELSNTAEKEGDKVTVTYADDQLAKLQKSIWMLQ
AHLA(SEQ ID NO: 1)
MKTFEILKHLQADAIVLFMKVHNFHWNVKGTDFFNVHKATEEIYEEFADMFDDLAERIVQLGHHPLVTLS
EAIKLTRVKEETKTSFHSKDIFKEILEDYKHLEKEFKELSNTAEKEGDKVTVTYADDQLAKLQKSIWMLQ
AH LA (SEQ ID NO: 2)
MKTFEILKHLQADAIVLFMKVHNFHWNVKGTDFFNVHKATEEIYEEFADMFDDLAERIVQLGHHPLVTLS
EALKLTRVKEETKTSFHSKDIFKEILEDYKYLEKEFKELSNTAEKEGDKVTVTYADDQLAKLQKSIWMLQ
AH LA (SEQ ID NO: 3)
MKTFEILKHLQADAIVLFMKVHNFHWNVKGTDFFNVHKATEEIYEEFADMFDDLAERIVQLGHHPLVTLS
EALKLTRVKEETKTSFHSKDIFKEILEDYKHLEKEFKELSNTAEKEGDKVTVTYADDQLAKLQKSIWMLG
AHLA(SEQ ID NO: 4)
MKTFEILKHLQADAIVLFMKVHNFHWNVKGTDFFNVHKATEEIYEGFADMFDDLAERIVQLGHHPLVTL
SEAIKLTRVKEETKTSFHSKDIFKEILEDYKYLEKEFKELSNTAEKEGDKVTVTYADDQLAKLQKSIWML
QAFILA (SEQ ID NO: 5)
MKTFEILKHLQADAIVLFMKVHNFHWNVKGTDFFNVHKATEEIYEGFADI<v>IFDDLAERIVQLGHHPLVTL
SEALKLTRVKEETKTSFHSKDIFKEILEDYKYLEKEFKELSNTAEKEGDKVTVTYADDQLAKLQKSIWML
QAHLA(SEQ ID NO: 6)
MKTFEILKHLQADAIVLFMKVHNFHWNVKGTDFFNVHKATEEIYEGFADMFDDLAERIVQLGHHPLVTL
SEAIKLTRVKEETKTSFHSKDIFKEILEDYKHLEKEFKELSNTAEKEGDKVTVTYADDQLAKLQKSIWML
QAFILA (SEQ ID NO: 7)
MKTFEILKHLQADAIVLFMKVHNFHWNVKGTDFFNVHKATEEIYEGFADMFDDLAERIVQLGHHPLVTL
SEALKLTRVKEETKTSFHSKDIFKEILEDYKHLEKEFKELSNTAEKEGDKVTVTYADDQLAKLQKSIWML
QAFILA (SEQ ID NO: 8)
Un fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P es un fra g m e n to q ue inc lu ye d o m in io s p o lip e p tíd ico s a c tivo s de al m e no s 20 -40 res tos de a m in o á c id o s de H P -N A P . Los e je m p lo s no lim ita n te s p ero ilu s tra tivo s de fra g m e n to s in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te s de H P -N A P inc luyen:
E IL K H L Q A D A IV L F M K V H N F H W N V K G T D F F N V H K A T (S E Q ID NO: 9) co rre sp o n d ie n te a los a m in o á c id o s n.° 5 -40 de la S E Q ID NO: 1-8
N T A E K E G D K V T V T Y A D D Q L A K L Q K S IW M L Q A H L A (S E Q ID NO: 10) co rre sp o n d ie n te a los a m in o á c id o s n.° 110 -144 de la S E Q ID NO: 1-8
A T E E IY E E F A D M F D D L A E R IV Q L G H H P L V T L S E A L K (S E Q ID NO: 11) co rre sp o n d ie n te a los a m in o á c id o s n.° 39 -74 de la S E Q ID NO: 3-4
L T R V K E E T K T S F H S K D IF K E IL E D Y K H L E K E F K E L S (S E Q ID NO: 12) c o rre sp o n d ie n te s a los a m in o á c id o s n.° 75 -110 de la S E Q ID NO: 3, 8
S e p uede e n c o n tra r m ás in fo rm a c ió n de fra g m e n to s in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te s de H P -N A P en [17], cuya e n se ñ a n za con re spe cto a los fra g m e n to s in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te s de H P -N A P se d e sc rib e en el p á rra fo 32, "D e fin ic ió n de los e p íto p o s de cé lu la s T d o m in a n te s de H P -N A P re co n o c id o s p o r cé lu la s T e sp e c ífica s de H P -N A P d e riva d a s de los in filtra d o s g á s trico s in d u c id o s p o rH. p y lo ri".
El v e c to r co m p re n d e , en una re a liza c ió n , se cu e n c ia (s ) de á c id o n u c le ico q ue c o d ifica (n ) uno o m ú ltip le s H P -NAP. En o tra re a liza c ió n , el v e c to r co m p re n d e se c u e n c ia (s ) de á c id o n u c le ico q ue c o d ifica (n ) uno o m ú ltip le s fra g m e n to s in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te s de H P -N A P . En una re a liza c ió n a d ic ion a l, el v e c to r co m p re n d e se cu e n c ia (s ) de á c id o n uc le ico q ue c o d ifica (n ) uno o m ú ltip le s H P -N A P y se cu e n c ia (s ) de á c id o n u c le ico que co d ifica (n ) uno o m ú ltip le s fra g m e n to s in m u n o ló g ic a m e n te e q u iva le n te s de H P -N A P .
En el caso de m ú ltip le s fra g m e n to s in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te s de H P -N A P , al m e no s un fra g m e n to es p re fe rib le m e n te de la p arte N -te rm in a l de H P -N A P , ta l com o la S E Q ID NO: 9 o 11, y al m e no s o tro fra g m e n to es p re fe rib le m e n te de la p arte C -te rm in a l de H P -N A P , ta l com o la S E Q ID NO: 10 o 12.
La se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica la H P -N A P o su fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te p uede c o d ific a r una p ro te ín a de fus ió n de H P -N A P o el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te y al m enos o tro p ép tid o o p ro te ína . P o r e je m p lo , la p ro te ín a de fus ió n pod ría se r una p ro te ín a de fu s ió n e n tre H P -N A P o el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te y un p ép tido señ a l para la sec re c ión . En ta l caso, la p ro te ín a de fus ió n , cu a n d o se e xp re sa en cé lu la s T, se rá se c re ta d a de las cé lu la s T d e b id o a la p re se n c ia de l p é p tid o señal. Los e je m p lo s no lim itan tes , pero ilus tra tivo s , de ta le s p é p tid o s señ a l q ue se p ueden u sa r inc luyen el p é p tid o se ñ a l B 17 de la reg ión V -IV de la ca d e n a kap pa de Ig, ta l co m o la se cu e n c ia M -V L Q T Q V F IS L L L W IS G A Y G (S E Q ID NO: 13), se cu e n c ia líd e r de IL-2, ta m b ié n d e n o m in a d a se cu e n c ia se ñ a l (ss ) de IL-2, ta l com o la se cu e n c ia M Y R M Q L L S C IA L S L A L V T N S (S E Q ID NO: 14), se cu e n c ia de p é p tid o señ a l de C D 33, ta l com o la se cu e n c ia M P L L L L L P L L W A G A L A (S E Q ID NO: 15), o un p ép tid o señ a l a rtific ia l M W W R L W W L L L L L L L L W P M V W A (S E Q ID NO: 16).
El v e c to r p ue de c o m p re n d e r una ú n ica m o lé cu la de á c id o n u c le ico q ue co m p re n d e se cu e n c ia (s ) de ácido n u c le ico q ue c o d ifica (n ) uno o m ás C A R y /o uno o m ás T C R y se cu e n c ia (s ) de á c id o n u c le ico q ue co d ifica (n ) una o m ás H P -N A P y /o uno o m ás fra g m e n to s in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te s de H P -N A P . En o tra re a liza c ió n , el v e c to r co m p re n d e m ú ltip le s m o lé cu la s de á c ido nuc le ico . En ta l caso , al m e no s una de las s e cu e n c ia s que co d ifica e l( lo s ) C A R , t C r , H P -N A P y fra g m e n to (s ) in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te (s ) de H P -N A P e stá p re se n te en una p rim e ra m o lé cu la de á c id o n uc le ico del v e c to r y a l m e no s o tra de las se cu e n c ia s co d ifica n te s e stá p re se n te en al m e no s o tra m o lé cu la de á c id o n uc le ico del vec to r.
El v e c to r es p re fe rib le m e n te un v e c to r de e xp re s ió n , es dec ir, un v e c to r que co m p re n d e al m e no s una m o lécu la de á c id o n uc le ico q ue co m p re n d e se cu e n c ia s co d ifica n te s que p ue de n s e r e xp re sa d a s , ta l com o tra n s c rita s y tra d u c id a s , en una cé lu la hospe da n te , ta l com o una cé lu la T h ospe da n te , que co m p re n d e el v e c to r de e xp re s ió n . El v e c to r de e xp re s ió n en una re a liza c ió n se s e le cc io n a e n tre m o lé cu la s de A D N , m o lé cu la s de a R n , p lá sm ido s , p lá sm id o s e p iso m a le s y v e c to re s de v irus.
En una re a liza c ió n , el v e c to r es un v e c to r de v iru s . En una re a liza c ió n p articu la r, el v e c to r de v iru s se se le cc io n a de un g rup o que co n s is te en un v e c to r len tiv ira l, un v e c to r a de n o v ira l, un v e c to r v ira l a d e n o a so c ia d o , un v e c to r re tro v ira l y un v e c to r h íb rido .
Los le n tiv iru s son una su b c la se de re tro v irus . Se a d a p ta n com o v e h ícu lo s de su m in is tro g é n ico (ve c to re s ) g ra c ia s a su ca p a c id a d para in te g ra rse en el g e n o m a de cé lu la s q ue no se d iv iden , q ue es la ca ra c te rís tica ú n ica de los le n tiv iru s ya que o tro s re tro v iru s p ueden in fe c ta r so lo cé lu la s que se d iv id en . El g e n o m a v ira l en fo rm a de A R N se tra n s c rib e de fo rm a in ve rsa cu a n d o el v iru s e n tra en una cé lu la , ta l com o u n a cé lu la T, para p ro d u c ir A D N , q ue luego es in se rta d o en el g e n o m a en una p os ic ió n p o r la e n z im a de in te g ra sa v ira l. El vec to r, a ho ra d e n o m in a d o p rov irus , p e rm a n e ce en el g e n o m a y se tra n s m ite a la d e sce n d e n c ia de la cé lu la si se d iv ide. P o r ra zon es de seg u rid a d , los v e c to re s le n tiv ira le s n o rm a lm e n te nun ca p ortan los g e n e s re qu e rid o s para su re p lica c ió n . P ara p ro d u c ir un len tiv irus , se tra n s fe c ta n va r io s p lá sm id o s en una d e n o m in a d a línea ce lu la r de e m p a q u e ta m ie n to , n o rm a lm e n te H E K 293. U no o m ás p lá sm ido s , g e n e ra lm e n te d e n o m in a d o s p lá sm id o s de e m p a q u e ta m ie n to , cod ifica n las p ro te ín a s de v irió n , ta le s com o la cá p s id e y la tra n s c rip ta s a inve rsa . O tro p lá sm id o co n tie n e el m a te ria l g e n é tico q ue va a s u m in is tra r el vec to r. Se tra n s c rib e para p ro d u c ir el g e n o m a v ira l de A R N m o n o ca te n a rio y está m a rca d o p o r la p re se n c ia de la se cu e n c ia ^ (ps i). Esta se cu e n c ia se usa p ara e m p a q u e ta r el g e n o m a en el v irió n .
Los re tro v iru s son uno de los p ila re s de los e n fo q u e s de la te ra p ia g én ica a c tu a le s . Los re tro v irus re co m b in a n te s , ta le s com o el v iru s de la le u ce m ia m u rin a de M o loney, t ie n e n la ca p a c id a d de in te g ra rse en el g e n o m a del h o sp e d a n te de fo rm a e sta b le . C o n tie n e n una tra n s c rip ta s a in ve rsa q ue p e rm ite la in te g ra c ió n en el g e n o m a del h ospe da n te . Los v e c to re s re tro v ira le s pueden s e r c o m p e te n te s en re p lica c ió n o d e fe c tu o so s en re p lica c ió n . Los v e c to re s d e fe c tu o so s en re p lica c ió n son la e le cc ió n m ás com ún p o rq u e los v iru s han e lim in a d o o su s titu id o las re g io ne s co d ifica n te s para los g e n e s n e ce sa ria s para rondas a d ic io n a le s de re p lica c ió n y e m p a q u e ta m ie n to de v ir io n e s p o r o tro s g enes . E s to s v iru s son ca p a ce s de in fe c ta r cé lu la s T y s u m in is tra r su ca rga v ira l, pero luego fa llan en c o n tin u a r la ru ta lítica típ ica q ue co n d u ce a la lis is c e lu la r y la m uerte .
Si el v e c to r es un v e c to r le n tiv ira l o re tro v ira l, e n to n ce s la (s ) se cu e n c ia (s ) de á c ido n u c le ico que c o d ifica (n ) C A R y /o T C R y H P -N A P y /o el fra g m e n to e q u iva le n te in m u n o ló g ico de H P -N A P e s/son p re fe rib le m e n te se cu e n c ia (s ) de A R N .
El v e c to r a d e n o v ira l com o se usa en el p rese n te d o cu m e n to inc lu ye v e c to re s de a d e n o v iru s y ve c to re s de v iru s d e riva d o s de a de no v irus .
El A D N a d e n o v ira l no se in tegra en el g e n o m a y no se re p lica d u ra n te la d iv is ión ce lu la r. Un v e c to r de v iru s a d e n o d e riva d o se basa en un a d e n o v iru s pero en el que se han re a liza d o d ive rsa s m o d ifica c io n e s , ta le s com o re la c io n a d a s con las se cu e n c ia s de n u c le ó tid o s que co d ifica n p ro te ína s de re p lica c ió n , p ro te ín a s de re gu lac ió n , p ro te ín a s de s u p e rfic ie v ír ica , etc.
El v iru s a d e n o a s o c ia d o (A A V ) es un v iru s p e q u e ñ o q ue in fe c ta a los se res h um a n o s y a lg u n a s o tras e sp e c ie s de p rim a tes . El A A V p uede in fe c ta r ta n to cé lu la s q ue se d iv id en com o que no se d iv id en y p ue de in co rp o ra r su g e n o m a en el de la cé lu la h ospe da n te . A d e m á s, el A A V p e rm a n e ce p rin c ip a lm e n te com o e p iso m a l, re a liza nd o una e xp re s ió n la rga y estab le . M ie n tra s que el A A V e m p a q u e ta una heb ra se n c illa de A D N y re q u ie re el p roce so de s ín te s is de la se g u n d a hebra , el v iru s a d e n o a so c ia d o a u to c o m p le m e n ta r io (s cA A V ) e m p a q u e ta a m bas h e b ra s q ue se h ib rid an e n tre s í para fo rm a r A D N b ica ten a rio . A l o m itir la s ín te s is de la se g u n d a hebra , el s cA A V p e rm ite la e xp re s ió n rá p id a en la cé lu la .
Si el v e c to r es un v e c to r a d e n o v ira l, e n to n ce s la (s) se c u e n c ia (s ) de á c id o n uc le ico que c o d ifica (n ) C A R y/o T C R y H P -N A P y /o el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P e s/son p re fe rib le m e n te se cu e n c ia (s ) de<a>D<n>.
Un v e c to r h íb rid o es un v iru s de v e c to re s q ue e stá g e n é tica m e n te m o d ifica d o para te n e r cu a lid a d e s de m ás de un vec to r. P o r e je m p lo , un v e c to r h íb rid o p ue de s e r una co m b in a c ió n de un a d e n o v iru s y un len tiv irus .
En una re a liza c ió n p articu la r, el v e c to r es un v e c to r len tiv ira l. En o tra re a liza c ió n p articu la r, el v e c to r es un v e c to r len tiv ira l a u to in a c tiva n te (S IN ).
En una re a liza c ió n , la se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica la H P -N A P y /o la se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P e stá ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r ind u c ib le . De a cu e rd o con e sta re a liza c ió n , se p re fie re la e xp re s ió n ind u c ib le de H P -N A P y /o el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de la m ism a fre n te a la e xp re s ió n c o n s titu tiva en té rm in o s de re d u c ir o m in im iza r c u a lq u ie r to x ic id a d no d e se a d a q ue p ue da o cu rr ir cu a n d o se usa un p ro m o to r co n s titu tivo para c o n tro la r la tra n s c rip c ió n de H P -N A P y /o el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de la m ism a.
P o r lo tan to , la tra n sd u cc ió n de cé lu la s T con un v e c to r con e xp re s ió n co n s titu tivo de H P -N A P y /o el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de la m ism a p od ría c a u s a r e fe c to s de to x ic id a d no d e se a d o s a las cé lu la s T. Los d a tos e xp e rim e n ta le s com o se p rese n ta n en el p re se n te d o cu m e n to ind ican q ue la e xp re s ió n ind u c ib le de H P -N A P no a fe c ta b a n e g a tiva m e n te a la fu n c ió n de las cé lu la s T.
En una re a liza c ió n , el p ro m o to r in d u c ib le se a c tiva tra s la un ión de un a n tígeno , p re fe rib le m e n te un TA A , al C A R y /o TC R . P o r lo tan to , la un ión de l a n tíg e n o al d o m in io e x tra c e lu la r de C A R y /o T C R a ctiva el p ro m o to r ind u c ib le a tra vé s de l d o m in io de se ñ a liza c ió n in tra c e lu la r de C A R y /o TC R .
Un e je m p lo no lim ita n te pero ilu s tra tivo de ta l p ro m o to r ind u c ib le es N m o tivo s de un ión d e l fa c to r n u c le a r de cé lu la s T a c tiva d a s (N F A T ) se g u id o p o r el p ro m o to r m ín im o de IL-2 hum a na . En e ste e je m p lo N es 1-10, p re fe rib le m e n te 4 -8 y m ás p re fe rib le m e n te 6. P o r lo tan to , en una re a liza c ió n p re fe rida , la s e cu e n c ia de á c ido n u c le ico q ue co d ifica H P -N A P y /o el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de la m ism a e stá ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r de N F A T -IL -2 ind u cib le . El p ro m o to r de N F A T -IL -2 p re fe rib le m e n te com p re nd e , o m ás p re fe rib le m e n te co n s is te en, se is re p e tic io n e s de l e le m e n to de N F A T y el p ro m o to r m ín im o de IL-2 hum a na . E ste p ro m o to r es s e le c tivo e ind u c ib le p o r a co p la m ie n to de a n tíg e n o - C A R /T C R .
A un q u e , en a lg u n a s a p lica c io n e s se p re fie re un p ro m o to r ind u c ib le com o se ha ind icad o a n te rio rm e n te , las re a liza c io n e s no se lim itan al m ism o. P o r lo tan to , la se cu e n c ia de á c ido n uc le ico q ue co d ifica H P -N A P y /o la se cu e n c ia de á c id o n u c le ico que co d ifica el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P p od ría e s ta r b a jo co n tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r co n s titu tivo . En una re a liza c ió n p a rticu la r, el p ro m o to r co n s titu tivo se se le cc io n a de un g rup o q ue co n s is te en el p ro m o to r del fa c to r de e lo n g a c ió n 1 a lfa h u m a n o (E F 1a), el p ro m o to r de c ito m e g a lo v iru s (C M V ) y el p ro m o to r C A G , p re fe rib le m e n te el p ro m o to r de EF1a.
En una re a liza c ió n , la (s) se cu e n c ia (s ) de á c id o n uc le ico que c o d ifica (n ) C A R y /o T C R e s tá (n ) ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r s e le cc io n a d o de un g rup o q ue co n s is te en el p ro m o to r de E F 1a hum ano , el p ro m o to r de C M V y el p ro m o to r C A G , p re fe rib le m e n te el p ro m o to r de EF1a.
En una re a liza c ió n , el v e c to r co m p re n d e una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica C A R q ue tie n e un scF v d e riva d o de a n ticu e rp o e x tra c e lu la r que se une e sp e c ífica m e n te al a n tíg e n o de lin fo c ito s B C D 19 (C D 19 ) y bajo con tro l tra n s c rip c io n a l de l p ro m o to r de EF1a. El v e c to r ta m b ié n co m p re n d e una se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica H P -N A P con un p é p tid o señ a l para la sec re c ió n y ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r de N F A T -IL -2 ind u cib le . En una re a liza c ió n p a rticu la r, el v e c to r es un v e c to r len tiv ira l, ta l com o un v e c to r len tiv ira l S IN . El v e c to r p re fe rib le m e n te co m p re n d e una m o lé cu la de á c id o n uc le ico que co m p re n d e el p ro m o to r de E F1a, la se cu e n c ia de á c ido n uc le ico q ue co d ifica C A R , el p ro m o to r de N F A T -IL -2 ind u c ib le y la se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica H P -N A P .
O tro a sp e c to de las re a liza c io n e s se re fie re a una cé lu la T. La cé lu la T co m p re n d e un C A R , un TC R , una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico que co d ifica un C A R y /o una se cu e n c ia de á c ido n u c le ico q ue co d ifica un TC R . La cé lu la T ta m b ié n co m p re n d e H P -N A P , un fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de la m ism a, una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica H P -N A P y /o una se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica un fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P . El fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de la H P -N A P es un fra g m e n to q ue inc lu ye d o m in io s p o lip e p tíd ico s a c tivos de al m e no s 20 -40 res tos de a m in o á c id o s de la H P -N A P , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o s de l g ru p o que co n s is te en las S E Q ID NO: 9 a 12.
Las se cu e n c ia s de á c id o n uc le ico q ue cod ifica n C A R , TC R , H P -N A P o el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P se p ueden tra n s c r ib ir en la cé lu la T p ara p ro d u c ir la p ro te ín a C A R , la p ro te ín a TC R , la p ro te ín a H P -N A P o el fra g m e n to in m u n o ló g ic a m e n te e q u iva le n te de H P -N A P en la cé lu la T.
El C A R y /o T C R de la cé lu la T se une e sp e c ífica m e n te a un a n tíg e n o , p re fe rib le m e n te un TA A . En una re a liza c ió n , el T A A se se le cc io n a de un g rup o q ue co n s is te en C D 19, C D 20, m u cin a 1 (M U C 1), m e so te lin a (M S L N ), N Y -E S O -1 , a lfa -fe to p ro te ín a (A F P ), a n tíg e n o ca rc in o e m b rio n a rio (C E A ), re ce p to r 2 de l fa c to r de c re c im ie n to e p id é rm ico h u m a n o (H E R 2), p ro te ín a tu m o ra l p53 (p53), p ro te ína R as (R A S ), a n tíg e n o a so c ia d o a m e la n o m a (M A G E ), p re fe rib le m e n te C D 19.
C D 19 es e xp re sa d o p o r y e stá p re se n te en cé lu la s B. P ues to q ue C D 19 es una ca ra c te rís tica d is tin tiva de las cé lu la s B, la p ro te ín a se ha u tiliza d o para d ia g n o s tic a r cá n ce re s que su rge n de e ste tip o de cé lu las , en p a rticu la r lin fo m a s de cé lu la s B. C D 19 ta m b ié n se ha im p lica d o en e n fe rm e d a d e s a u to in m u n ita r ia s y p ue de s e r un o b je tivo de tra ta m ie n to útil.
C D 20 se e xp re sa en to d a s las e ta p a s de l d e sa rro llo de cé lu la s B e xce p to la p rim e ra y la ú ltim a ; e stá p rese n te a p a rtir de las p ro -cé lu la s B ta rd ía s a tra vé s de las cé lu la s de m e m oria , pero no en las p ro -cé lu la s B te m p ra n a s ni en los b la s tos p la sm á tico s y las cé lu la s p la sm á ticas . Se e n c u e n tra en lin fo m as de cé lu la s B, le u ce m ia de cé lu la s p ilosas, le u ce m ia lin fo c ítica c ró n ica de cé lu la s B, y cé lu la s m adre de c á n c e r de m e lan om a . C D 20 es una d ia n a en va r ia s e n fe rm e d a d e s q ue inc lu ye n lin fo m a s de cé lu la s B y leu cem ia s , ta le s com o le u ce m ia lin fo c ítica c ró n ica , lupus e rite m a to so s is té m ico (S LE ), e n ce fa lo m ie litis m iá lg ica , lin fo m a fo licu la r, a rtritis re um ato id e , e sc le ro s is m ú ltip le , para lin fo m a no H od gk in y tro m b o c ito p e n ia inm un ita ria .
La m e so te lin a es una p ro te ín a de 40 kD a p re se n te en cé lu la s m e so te lia le s n o rm a le s y so b re e xp re sa d a en v a r io s tu m o re s h um a no s , inc lu ye nd o m e so te lio m a y a d e n o ca rc in o m a de o va rio y páncreas.
N Y -E S O -1 es un a n tíg e n o tu m o ra l h um a no de la fa m ilia de cá n ce re s /te s tícu lo . Se e xp re sa a lta m e n te en m u ch o s m e la n o m a s de m al p ronóstico .
A F P es la p ro te ína p la sm á tica m ás a b u n d a n te e n co n tra d a en el fe to hum a no . La A F P es e le va d a en d ive rsa s e n fe rm e d a d e s , in c lu ye n d o o n fa lo ce le , ca rc in o m a /h e p a to m a h ep a to ce lu la r, d e fe c to s de l tu b o neura l, tu m o re s de cé lu la s g e rm in a le s no se m in o m a to so s , tu m o r de l sa co v ite lin o , a ta x ia te la n g ie c ta s ia , ca rc in o m a h ep a to ce lu la r, tu m o re s de cé lu la s g e rm in a le s y cá n ce re s m e ta s tá s ico s de l h ígado.
C E A se p rod u ce n o rm a lm e n te en el te jid o g a s tro in te s tin a l d u ra n te el d e sa rro llo fe ta l, pero la p rod u cc ió n se d e tie n e a n te s del n ac im ien to . P o r lo tan to , el C E A sue le e s ta r p re se n te so lo en c o n c e n tra c io n e s m u y b a jas en la san g re de a d u lto s sanos. S in e m b a rg o , los n ive les sé rico s son e le va d o s en a lg u n o s tip o s de cán ce r, ta le s com o c a rc in o m a de co lon, ca rc in o m a g ás trico , ca rc in o m a p an creá tico , ca rc in o m a de pu lm ón, ca rc in o m a de m a m a y c a rc in o m a m e d u la r de tiro id e s , a s í com o a lg u n a s a fe cc io n e s no n e o p lá s ica s com o co litis u lce rosa , p an crea titis , c irro s is , E P O C , e n fe rm e d a d de C rohn e h ip o tiro id ism o .
H E R 2 es un m ie m b ro de la fa m ilia de re ce p to re s de l fa c to r de c re c im ie n to e p id é rm ico hum ano . S e ha d e m o s tra d o q ue la a m p lifica c ió n o s o b re e xp re s ió n de e ste o n co g é n d e se m p e ñ a un pape l im p o rta n te en el d e sa rro llo y la p ro g re s ió n del c á n c e r de m am a. T a m b ié n se sabe q ue la so b re e x p re s ió n se p ro d u ce en c á n ce r de ovario , c á n c e r g ás trico , ca rc in o m a s de los c o n d u c to s sa liva le s , cau sa a d e n o ca rc in o m a de p u lm ón y fo rm a s a g re s iva s de c á n c e r u te rino , ta l com o ca rc in o m a e n d o m e tria l se roso u terino.
p53 es im p o rta n te en o rg a n ism o s m u ltice lu la re s , d on de p rev ie ne la fo rm a c ió n de cán ce r, p o r lo tan to , fu n c io n a com o un s u p re so r de tu m o re s . El genT P 53es el gen m u ta do con m a yo r fre cu e n c ia en el c á n c e r hum ano . Si el gen T P 53 e stá d añ ad o , la sup re s ió n tu m o ra l e stá g ra ve m e n te co m p ro m e tid a .
Las m u ta c io n e s en R A S son m u y com u ne s , e n co n trá n d o se en 20 % a 30 % de to d o s los tu m o re s hum anos. Las m u ta c io n e s a c tiva d o ra s de la p ro te ín a R as y los e le m e n to s se cu e n c ia a rrib a de la p ro te ín a R as p ueden ju g a r un pape l en m ás de d os te rc io s de to d o s los cá n ce re s h um a no s , in c lu ye n d o la m a yo ría de las e n fe rm e d a d e s m e ta s tá s ica s .
La fa m ilia de g en es M A G E es típ ic a m e n te co m p le ta m e n te s ile n c io sa en te jid o s a d u lto s n orm a le s, con la e xce p c ió n de cé lu la s g e rm in a le s m a scu lin a s y, para a lg u n o s de e llos, la p lacen ta . P o r el co n tra rio , e s to s g en es M A G E se e xp re sa n en v a r io s tip o s de tum o re s .
En una re a liza c ió n , la H P -N A P es e xp re sa d a y se c re ta d a p o r las cé lu la s T tra s la un ión de un a n tígeno , p re fe rib le m e n te un TA A , al C A R y /o el TC R . En d ich a re a liza c ió n , la se cu e n c ia de á c id o n u c le ico co d ifica H P -N A P y p re fe rib le m e n te ta m b ié n co d ifica un p é p tid o señ a l para la sec re c ión . La se cu e n c ia de á c ido n uc le ico q ue co d ifica H P -N A P y/o el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P p re fe rib le m e n te está o p tim iza d o en co d o n e s p ara la e xp re s ió n en cé lu la s T hum anas.
En una re a liza c ió n , la cé lu la T co m p re n d e la se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica la H P -N A P y /o la se cu e n c ia de á c ido n u c le ico que co d ifica el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r inducib le .
En una re a liza c ió n , el p ro m o to r in d u c ib le se a c tiva tra s la un ión de un an tíge no , p re fe rib le m e n te un TAA , al C A R y /o T C R . En una re a liza c ió n p a rticu la r, el p ro m o to r ind u c ib le sonNm o tivo s de un ión a N F A T se g u id o s p o r el p ro m o to r m ín im o de IL-2 hum ana , N es 1-10, p re fe rib le m e n te 4 -8 , m ás p re fe rib le m e n te 6.
En o tra re a liza c ió n , la cé lu la T co m p re n d e la se cu e n c ia de á c ido n uc le ico q ue co d ifica H P -N A P y /o la se cu e n c ia de á c ido n u c le ico que co d ifica el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r co n s titu tivo , ta l com o el p ro m o to r de EF1a, el p ro m o to r de C M V o el p ro m o to r C AG .
En una re a liza c ió n , la cé lu la T co m p re n d e la se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica C A R y /o la se cu e n c ia de á c ido n u c le ico q ue co d ifica T C R ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r se le cc io n a d o de un g rup o que co n s is te en el p ro m o to r de EF1a, el p ro m o to r de C M V y el p ro m o to r C A G , p re fe rib le m e n te el p ro m o to r de EF1a.
Las s e cu e n c ia s de á c id o s n u c le ico s q ue co d ifica n C A R , TC R , H P -N A P o el fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de H P -N A P p ueden e s ta r p rese n te s en el g e n o m a de la cé lu la T. A lte rn a tiva m e n te , al m e no s a lg u n a s de las se cu e n c ia s de á c id o s n uc le ico s p ueden e s ta r p rese n te s en una o m ás m o lécu la s de á c id os n u c le ico s e p iso m a le s , es dec ir, no p re se n te s en los c ro m o so m a s de las cé lu la s T.
En una re a liza c ió n , la cé lu la T de a cu e rd o con el se g u n d o a sp e c to co m p re n d e el v e c to r de a cu e rd o con el p rim e r a sp e c to d e sc rito a n te r io rm e n te en el p re se n te d ocum e n to . El v e c to r p od ría e s ta r in te g ra d o en el g en om a de la cé lu la T o s e r un v e c to r e x tra c ro m o só m ico no in te grad o .
La p re se n te te c n o lo g ía a d o p ta un n uevo e n fo q u e en la in m u n o te ra p ia de cé lu la s T al c a m b ia r el m ic ro a m b ie n te in m u n ita rio tu m o ra l in m u n o s u p re s o r (T M E ) a un T M E m ás p ro in fla m a to r io m e d ia n te la e xp re s ió n loca l de la p ro te ín a H P -N A P tra s el re co n o c im ie n to p o r cé lu las T C A R /T C R de cé lu las d iana. Los d a tos e xp e rim e n ta le s m o stra ro n que la e xp re s ió n in d u c ib le de H P -N A P m e jo ró la c ito to x ic id a d de las cé lu las T C A R en p re se n c ia de DC au tó lo ga s , q ue a tra jo cé lu la s in m u n ita ria s inn a ta s y a u m e n tó la se c re c ió n de c ito c in a s y q u im io c in a s p ro in fla m a to ria s , lo q ue m e jo ró la fu n c ió n de las cé lu la s T C A Rin vitro.
H P -N A P , cu a n d o se in tro d u ce en y es p ro d u c id a p o r cé lu la s T C A R , con d u ce a la m a d u ra c ió n y a c tiva c ió n de CD, p ro m u e ve la sec re c ió n de la c ito c in a p o la riza n te de Th1 IL -12 y a ctúa com o un q u im io a tra c to r p a ra cé lu las inm un ita ria s , to d a s las cua les p ueden m o d u la r p o s itiva m e n te la T M E y m e jo ra r la fu n c ió n de las cé lu las T CAR.
P ara c o n tro la r la e xp re s ió n de H P -N A P lo ca lm e n te en el tu m o r y e v ita r la to x ic id a d s is té m ica , en una re a liza c ió n , H P -N A P se m o d ificó para s e r e xp re sa d a p o r el p ro m o to r de N F A T -IL -2 ind u c ib le , que se a c tivab a so lo tra s e l re co n o c im ie n to de a n tíg e n o p o r cé lu la s T C A R ta n toin v itrocom oin vivo.
Las cé lu la s T N A P -C D 19 C A R , es dec ir, las cé lu la s T tra n s d u c id a s con un v e c to r le n tiv ira l q ue co m p re n d e la se cu e n c ia que co d ifica C D 19 C A R ba jo el co n tro l de l p ro m o to r de E F 1a y la se cu e n c ia que co d ifica H P -N A P b a jo el con tro l de l p ro m o to r in d u c ib le de N F A T -IL -2 , tie n e n c ito to x ic id a d m e jo rad a , cu a n d o se co cu ltiva n con im D C a u tó lo g a sin v itro.La m a d u ra c ió n ind u c id a p o r N A P y la a c tiva c ió n de DC, h ic ie ro n q ue las DC e xp re sa ra n m o lé cu la s co e s tim u la d o ra s de cé lu la s T com o C D 80 /86 y C D 40 y se c re ta ra n IL-12, que a su v e z p ue de n a yu d a r a la e s tim u la c ió n y ce b a d o de cé lu la s T.
Las DC en el T M E tie n e n una fu n c ió n d e te r io ra d a y n o rm a lm e n te se a so c ia n con in m u n o su p re s ió n . Sin e m ba rg o , la e xp re s ió n loca l de H P -N A P p o r lin fo c ito s T C A R a c tiva d o s de a cu e rd o con las re a liza c io n e s pod ría a yu d a r a re v e rtir la sup re s ió n inm un ita ria , y ce b a r lin fo c ito s T e sp e c ífico s de tu m o r p o r ve c in d a d a p a rte de a yu d a r a los lin fo c ito s T C A R in fu nd ido s . A d ic io n a lm e n te , se o b se rvó un a u m e n to de la e xp re s ió n de C D 70 en DC cu a n d o se co cu ltiva ro n con cé lu la s T N A P -C D 19 C A R (F ig u ra 4). C D 70 ceb a la re spu es ta e fe c tiva de las cé lu la s T C D 8 p o r las DC a u to riza d a s . Se une a C D 27 en lin fo c ito s T C D 8 y m e jo ra la v ia b ilid a d , p e rs is te n c ia y re s is te n c ia de lin fo c ito s T al e stré s o x id a tivo .
El a g o ta m ie n to de las cé lu la s T es un fa c to r p rinc ip a l q ue lim ita la e fica c ia a n titu m o ra l de las cé lu la s T C A Rin vivo,y el a g o ta m ie n to de las cé lu la s T se a tr ib u ye p rin c ip a lm e n te a la e s tim u la c ió n a n tig é n ica c ró n ica de las cé lu la s T. Los lin fo c ito s T N A P -C D 19 C A R te n ía n cap ac id ad c ito tó x ica in c re m e n ta d a cu a n d o se cocu ltiva b a n con DC, pero de m a ne ra im p o rta n te H P -N A P no co n d u c ía a un a g o ta m ie n to in c re m e n ta d o de lin fo c ito s T en té rm in o s de e xp re s ió n d ob le de P D 1 /T im 3 , e xp re s ió n de LA G 3 y sec re c ión de IL -2in v itro.P o r lo tan to , H P -N A P no a fe c ta b a n e g a tiva m e n te a la fu n c ió n de las cé lu la s T.
La H P -N A P no so lo es p o la riza n te de Th1, s ino que ta m b ié n se sab e q ue re v ie rte la p o la rida d de T h 2 de las cé lu la s T a u x ilia re s en cé lu la s a u x ilia re s de tip o Th 1. Las cé lu la s T N A P -C D 19 C A R te n ía n una re lac ión m ás a lta de T -b e t:G A T A 3 (e xp re s ió n de l fa c to r de tra n sc rip c ió n de tip o T h 1 :T h 2 ) y una e xp re s ió n m ás a lta de IF N -Y e IL-2 cu a n d o se co cu ltiva b a n con DC a u tó lo g a s y cé lu la s d ia n a p os itiva s p ara a n tígeno . H P -N A P ta m b ié n ind u cía la p o la riza c ió n de Th1 en cé lu la s T p o r v e c in d a d que no son e sp e c ífica s de a n tíg e n o -C A R . Las cé lu las T p rese n te s en el T M E sue len se r a né rg ico s , p o r lo que el re sca te de su a c tiv id a d es im p o rta n te para m o n ta r una re sp u e s ta in m u n ita ria a n titu m o ra l e ficaz.
En g en era l, uno de los fa c to re s lim ita n te s c lave para la in m u n o te ra p ia e fica z de tu m o re s só lid o s es la fa lta de cé lu la s in m u n ita ria s in filtra n te s . Las cé lu la s T de la re a liza c ió n ca p a ce s de se c re c ió n loca l de H P -N A P p rom o v ía n la in filtra c ión de n e u tró filo s p ero ta m b ié n a c tu a b a n com o un q u im io a tra c to r para m o no c ito s , cé lu las N K e im D C . T a m b ié n se d e te c ta ro n q u im io c in a s im p o rta n te s com o C C L -1 , C C I-2 , M IP -1 a /p en líqu ido s s o b re n a d a n te s de co cu ltivo s de cé lu la s T C A R :D C :cé lu la s d ia n a a c tiva d a s p o r H P -N A P . E s ta s q u im io c in a s p ueden p ro m o v e r a d e m á s la in filtra c ión de cé lu la s in m u n ita ria s p ro in fla m a to r ia s en el TM E . P o r e je m p lo , C C L -1 p ue de a tra e r m o no c ito s , c é lu la s N K y DC, C C L -2 p uede re c lu ta r m o no c ito s , cé lu la s T de m e m o ria y DC, m ie n tra s q ue M IP -1 a (C C L -3 ) y M IP-1 p (C C L -4 ) son q u im io a tra c to re s para cé lu la s NK, y m o no cito s, p ro m o v ie n d o a s í un flu jo de in filtra c ión de cé lu la s in m u n ita ria s al tum o r.
P o r lo tan to , los d a tos e xp e rim e n ta le s co m o se p rese n ta n en el p re se n te d o cu m e n to ind ican q ue las cé lu la s T N A P -C D 19 C A R , es dec ir, las cé lu la s T tra n s d u c id a s con un v e c to r le n tiv ira l q ue co m p re n d e la se cu e n c ia que co d ifica C D 19 C A R ba jo el con tro l del p ro m o to r de E F1a y la se cu e n c ia q ue co d ifica H P -N A P ba jo el con tro l del p ro m o to r de N F A T -IL -2 inducib le , cu ltiva d a s ju n to con cé lu la s d e n d rítica s in m a d u ra s (im D C ), m o s tra ro n una c ito to x ic id a d m a yo r de las cé lu la s d ia n a C D19+ q ue las cé lu la s T C D 19 C A R de con tro l. La H P -N A P se c re ta d a p o r las cé lu la s T N A P -C D 19 C A R m a d u ra ro n las im D C c o cu ltiva d a s y las e s tim u la ro n para s e c re ta r c ito c in a s c lave , ta le s com o IL-12, IL-1 a /p , y q u im io c in a s , ta le s com o C X C L 11 , C X C L 12. A d e m á s, la H P -N A P se c re ta d a de las cé lu las T N A P -C D 19 C A R ta m b ié n indu jo el re c lu ta m ie n to de m o no c ito s , n e u tró filo s y cé lu la s NK.
La m e jo ra c o n se g u id a en las cé lu la s T N A P -C D 19 C A R no a fe c tó n e g a tiva m e n te a la fu n c ió n de las cé lu la s T y no d io com o re su lta d o n ingún a g o ta m ie n to de las cé lu la s T. A d e m á s, las cé lu la s T N A P -C D 19 C A R ind u je ro n la p o la riza c ió n de Th1 en p rese nc ia de las im DC.
Un te rc e r a sp e c to de la re a liza c ió n se re fie re p o r lo ta n to a una co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica q ue co m p re n d e una cé lu la T según la re a liza c ió n y una cé lu la d en d rítica , p re fe rib le m e n te una cé lu la d e n d rítica inm adura .
Las cé lu la s T y las D C de la co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica p ue de n s e r de la m ism a fu e n te , ta l com o cé lu la s T a u tó lo g a s y DC a u tó lo g a s para a d m in is tra rs e a un m ism o p a c ie n te de l que se han a is la d o p rev ia m en te . T a m b ié n p ue de s e r p os ib le u sa r cé lu la s T a u tó lo g a s y DC a lo g é n ica s , cé lu la s T a lo g é n ica s y DC a u tó lo g a s o cé lu la s T a lo g é n ica s y DC a lo g é n ica s en la co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica . En el caso de cé lu la s T y /o DC a lo g én ica s , las cé lu la s se a ís lan de o tro ind iv id u o de la m ism a e sp e c ie q ue el p a c ie n te a c tu a l al que se va a a d m in is tra r la co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica .
La co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica p u e d e c o m p re n d e r a d e m á s uno o m ás p o rta do re s , v e h ícu lo s y /o e xc ip ie n te s fa rm a c é u tic a m e n te a ce p ta b le s . Los e je m p lo s no lim ita n te s de ta le s p o rta d o re s , v e h ícu lo s y e xc ip ie n te s fa rm a c é u tic a m e n te a ce p ta b le s inc lu ye n so lu c io n e s p ara inye cc ió n , ta le s com o so lu c io n e s sa lin a s o so lu c io n e s p ara inye cc ió n ta m p o n a d a s .
O tros a sp e c to s de las re a liza c io n e s se re fie ren a una cé lu la T seg ún las re a liza c io n e s o una co m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a seg ún las re a liza c io n e s para su uso com o m e d ica m e n to , para su uso en in m u n o te ra p ia de cé lu las T o para su uso en el tra ta m ie n to , re du cc ió n y /o p re ve n c ió n de l cán cer. En e ste ú ltim o a sp ec to , el c á n c e r p uede ser, en una re a liza c ió n , un c á n c e r h em a to ló g ico . S in e m ba rg o , las m e jo ras a las cé lu la s T de las re a liza c io n e s im p lica n q ue p ueden te n e r e fe c to s p o s itivo s en el tra ta m ie n to , re du cc ió n y /o p re ve n c ió n de tu m o re s só lidos .
Las cé lu las T y la co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica de las re a liza c io n e s ta m b ié n se p ueden u sa r para p reve n ir, re d u c ir y /o tra ta r neo p la s ia s , ta le s com o n e o p la s ia s b en ign as , n e o p la s ia sin situ,n e o p la s ia s m a lign as , h ip e rp la s ia y ve rru g a s .
Las cé lu las T de las re a liza c io n e s o la co m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a de las re a liza c io n e s se p ueden u sa r en co m b in a c ió n con o tra s te ra p ia s u tiliz a d a s tra d ic io n a lm e n te en in m u n o te ra p ia de cé lu la s T o te ra p ia co n tra el cán ce r. P o r e je m p lo , las cé lu las T o la co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica p ueden co m b in a rse con tra ta m ie n to de q u im io te ra p ia , c iru g ía y /o ra d io te ra p ia en el ca so de e n fe rm e d a d e s de cáncer.
La co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica p re fe rib le m e n te co m p re n d e una can tid a d e fica z de las cé lu la s T y DC m e n c io n a d a s . C om o se usa en el p re se n te d o cu m e n to , "ca n tid a d e fica z" ind ica una can tid a d e ficaz, en dos is y d u ra n te los p e rio d o s de tie m p o n e ce sa rio s para lo g ra r un re su lta d o d esea do . P o r e je m p lo , en el co n te x to de la inh ib ic ió n de l c re c im ie n to de un tum o r, una ca n tid a d e fica z es una can tid a d que, p o r e je m p lo , induce , rem ite , re du ce la ca rga tu m o ra l y /o e v ita la d ise m in a c ió n o el c re c im ie n to del tu m o r en co m p a ra c ió n con la re spu es ta o b te n id a s in la a d m in is tra c ió n de las cé lu las . Las ca n tid a d e s e fe c tiva s p ueden v a r ia r de a cu e rd o con fac to res , ta le s com o el e s ta d o de e n fe rm ed ad , edad, sexo , p eso del pac ien te .
"T ra ta r" o "tra ta m ie n to " com o se usa en el p re se n te d o cu m e n to y se e n tie n d e b ien en la té cn ica , s ig n ifica un e n fo q u e para o b te n e r re su lta d o s b e n e fic io so s o d esea do s , in c lu ye n d o re su lta d o s c lín icos . Los re su ltad o s c lín ico s b e n e fic io so s o d e se a d o s p od rían inc lu ir, p o r e je m p lo , a liv io o m e jo ra de uno o m ás s ín to m a s o a fe cc io ne s , d ism in u c ió n de la e x te n s ió n de la e n fe rm e d a d , e s ta d o e s ta b iliza d o de la e n fe rm e d a d , es decir, p re ve n ir el e m p e o ra m ie n to , p re ve n ir la p ro p a g a c ió n de la e n fe rm e d a d , re tra sa r o ra le n tiza r la p ro g re s ió n de la e n fe rm e d a d , m e jo ra o p a liac ión de l e s ta d o de la e n fe rm e d a d , d ism in u c ió n de la re ap a ric ión de la e n fe rm e d a d , y rem is ión . "T ra ta r" o el " tra ta m ie n to " ta m b ié n p uede p ro lo n g a r la s u p e rv ive n c ia en co m p a ra c ió n con la s u p e rv ive n c ia e sp e ra d a si no se rec ibe n in g ún tra ta m ie n to .
"P re v e n c ió n " o "p ro fila x is " com o se usa en el p re se n te d o cu m e n to y se e n tie n d e b ien en la té cn ica , s ig n ifica un e n fo q u e en el q ue se re du ce o p re v ie n e el r iesgo de d e s a rro lla r una e n fe rm e d a d o a fe cc ió n , inc lu ye nd o p ro lo n g a r o re tra sa r el d e sa rro llo de la e n fe rm ed ad . P o r e je m p lo , un p ac ien te p re d isp u e s to a d e s a rro lla r una e n fe rm e d a d , ta l com o d e b id o a p re d isp o s ic ió n g e n é tica o h e re d ita ria , p od ría b e n e fic ia rse de la a d m in is tra c ió n de las cé lu la s T o co m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a de las re a liza c io n e s para p reve n ir, re d u c ir el r iesgo de, re tra sa r y /o ra le n tiza r el d e sa rro llo de la e n fe rm e d a d .
El p ac ien te es p re fe rib le m e n te un p ac ie n te hum ano . Las re a liza c io ne s , s in e m b a rg o , ta m b ié n p ueden a p lica rse en a p lica c io n e s v e te rin a ria s , es dec ir, p a c ie n te s no h um anos , ta le s com o m a m ífe ro s no h um a n o s que inc luyen, p o r e je m p lo , p rim a te s , m onos, s im ios , g a n a d o vacu no , ove jas , ce rdos, cab ra s, cab a llo s , gatos, pe rros , ra tones, ra tas y cob aya s.
Las cé lu la s T o la co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica p ueden a d m in is tra rs e al p a c ie n te de a cu e rd o con v a r ia s v ía s que inc lu ye n , p o r e je m p lo , a d m in is tra c ió n in traven o sa , su b cu tá n e a , in tra p e rito n e a l, in tra m u s cu la r o in tra tum ora l.
Las p re se n te s re a liza c io n e s ta m b ié n se re fie ren a un m é to do para in d u c ir la m a d u ra c ió n de cé lu la s d e n d rítica s inm ad uras . El m é to do co m p re n d e p o n e r en con tac to , p re fe rib le m e n tein v itro,las cé lu la s d e n d rítica s inm a d u ra s con una cé lu la T de las re a liza c io n e s
E jem p lo s
Las cé lu la s T m o d ifica d a s p o r ing e n ie ría g e n é tica con el re ce p to r de a n tíg e n o q u im é rico (C A R ), q ue se d irigen al m a rc a d o r de cé lu la s p an -B C D 19, han h echo un p ro g re so n o tab le en e s tu d io s c lín ico s p ara le u ce m ia s de cé lu la s B ta n to a g u d a s com o c ró n icas . Los re su lta d o s o b se rva d o s para los lin fo m as de cé lu la s B han s ido p e o re s q ue para las leu cem ia s . La razón p ue de s e r q ue la e s tru c tu ra se m isó lid a de los lin fo m a s co n d u ce a o b s tá cu lo s en la p e n e tra c ió n y a un m ic ro a m b ie n te de su p re s ió n in m u n ita ria d e n tro de e s to s tu m o re s . C on el fin de m e jo ra r la te ra p ia de cé lu la s T C A R para lin fo m as , se han m o d ifica d o p o r in g e n ie ría g e n é tica cé lu la s T C D 19 C A R con p ro te ína a c tiva d o ra de n e u tró filo s (N A P ) deH e lic o b a c te r p y lo r iq ue se e xp re sa y es se c re ta d a tra s el re co n o c im ie n to de C A R de cé lu la s tu m o ra le s p os itiva s p ara a n tíg e n o c D 19. Los re su ltad o s e xp e rim e n ta le s m u e s tra n que las cé lu la s T N A P -C D 19 C A R , cu ltiva d a s ju n to con cé lu la s d e n d rítica s in m a d u ra s a u tó lo g a s (D C ), m o stra b a n una c ito to x ic id a d m a yo r de las cé lu las d ia n a C D19+in v itro,q ue las cé lu la s T C D 19 C A R co n ve n c io n a le s . La N A P se c re ta d a p o r los lin fo c ito s T N A P -C D 19 C A R a c tiva d o s m a d u ra b a las DC c o cu ltiva d a s y las e s tim u la b a p ara s e c re ta r c ito c in a s c lave ( in te r le u c in a 12 (IL -12 ), IL -1 a /p ) y q u im io c in a s (q u im io c in a 11 con m o tivo C -X -C (C X C L11), C X C L 12 ). A d e m á s, la N A P se c re ta d a ta m b ié n ind u jo el re c lu ta m ie n to de m o no c ito s , n e u tró filo s y cé lu la s c ito lítica s n a tu ra le s (N K).
M a te ria le s y m é to do s
A is la m ie n to y g e n e ra c ió n de cé lu la s p rim a ria s y cu ltivo s de líne as ce lu la re s
S e a is la ro n cé lu la s m o n o n u c le a re s de sa n g re p e rifé rica (P B M C ) u sa nd o se p a ra c ió n con F ico ll-P a q u e (G E H e a lth ca re L ife S c ien ce , U pp sa la , S u e c ia ) de ca p a s le u co c ita r ia s re c ie n te s o b te n id a s de l C en tro de S a n g re en el H osp ita l U n ive rs ita rio de U ppsa la . Las P B M C se cu ltiva ro n en m e d io R P M I-1640 su p le m e n ta d o con sue ro b ov ino fe ta l (F B S ) in a c tiva d o p o r c a lo r al 10 %, p iruva to só d ico 1 mM , 100 UI de p e n ic ilin a /m L y 100 |jg de e s tre p to m ic in a /m L (P e S t al 1 %).
S e o b tu v ie ro n DC d e riva d a s de m o n o c ito s h um a n o s p o r a is la m ie n to de p erla s CD14+ (M ilte n y i B io tec, B erg isch G la d ba ch , A le m a n ia ) de P B M C y se d ife re n c ia ro n d u ra n te 5 d ías en D C in m a d u ra s (im D C ) con fa c to r e s tim u la d o r de co lo n ia s de g ra n u lo c ito s -m a c ró fa g o s 50 n g /m L (G M -C S F ) (G en tau r, B ru se la s , B é lg ica ) e IL-4 25 n g /m L (G en tau r). Se re pu so m e d io n ue vo su p le m e n ta d o con c ito c in a s cad a d os días. Las cé lu la s T h um a n a s ta m b ié n se cu ltiva ro n con el m ism o m e d io q ue las P B M C . La línea c e lu la r de lin fo b la s to s de cé lu la s B h um a na s D au d i (CD19+, A T C C C C L -213 ) se cu ltivó en R P M I-1640 su p le m e n ta d o con FB S in a c tiva d o p o r c a lo r al 10 % y P e S t al 1 %. Se cu ltiva ron B C -3 (C D 19 -, A T C C C R L -2277 ) en R P M I-1640 su p le m e n ta d o con FB S ina c tiva do p o r c a lo r al 20 % y P e S t al 1%. T o d o s los s u p le m e n to s de m e d io s y m e d io s de cu ltivo se a d q u irie ro n de Inv itro ge n (C a rlsb a d , C A), a m enos q ue se m e nc ion e en o tra parte . T o da s las cé lu la s se cu ltiva ro n en una in cu b a d o ra h u m id ifica d a con una a tm ó s fe ra de C O<2>al 5 % a 37°C.
C o n s tru cc ió n y p rod u cc ió n de len tiv irus
La se cu e n c ia de C D 19 C A R se d ise ñ ó co m o se d e sc rib ió a n te r io rm e n te [8]. La se cu e n c ia q ue co d ifica C D 19 C A R se c lon ó en un v e c to r len tiv ira l a u to in a c tiva n te (S IN ) de te rce ra g e n e ra c ió n (SB I, S ys te m B iosc ien ces , M o un ta in V iew , C A ) ba jo el con tro l de l p ro m o to r de l fa c to r de e lo n ga c ió n -1 a lfa (E F 1 a ) para c o n s tru ir el L V (C D 19 C A R ). La se cu e n c ia tra n s g é n ica de N A P o p tim iza d a en co d o n e s h um a n o s m a rca d a con un p ép tid o señ a l a rtific ia l para la se c re c ió n se puso ba jo el con tro l de un p ro m o to r de N F A T -IL -2 ind u c ib le d ise ñ a d o com o se d e sc rib ió a n te r io rm e n te [9]. El p ro m o to r de N F A T -IL -2 co n s is tía en 6 re p e tic io n e s del e le m e n to del fa c to r n u c le a r de cé lu la s T a c tiva d a s (N F A T ) y el p ro m o to r m ín im o de IL-2 hum a na . La se cu e n c ia de N A P ju n to con el p ro m o to r de N F A T -IL -2 se c lonó en un v e c to r len tiv ira l para c o n s tru ir el L V (N A P -C D 19 C A R ). El gen de N A P se re e m p la zó p o r la se cu e n c ia q ue co d ifica la n a n o -lu c ife ra sa para c o n s tru ir el L V (n a n o L u c -C D 19 C A R ). El L V (S im u la d o ) se p rep a ró con un v e c to r len tiv ira l vac ío . T o d a s las se cu e n c ia s se a d q u irie ro n en G e n e S c rip t (P isca ta w a y , NJ).
A n á lis is de c ito m e tría de flu jo
T o d o s los a n ticu e rp o s p ara la tin c ió n de la se p a ra c ió n c e lu la r a c tiva d a p o r flu o re sc e n c ia (F A C S ) se a d q u irie ro n de B io le ge n d , San D iego, CA. Las cé lu la s te ñ id a s se a n a liza ro n en un c itó m e tro de flu jo BD C A N T O II (B D B iosc ien ces ).
M o d ifica c ió n p o r ing e n ie ría g e n é tica de cé lu la s T, e xp an s ión y va lid a c ió n de la e xp re s ió n de N AP
S e a c tiva ro n P B M C (5 x106 cé lu la s ) con O K T -3 (100 ng/m L, B ioL e ge nd , S an D iego, C A ) p ro p o rc io n a d o el d ía 1 e IL-2 (100 U I/m L , P ro leuk in , N ova rtis , B ase l, S u iza ) p ro p o rc io n a d a el d ía 2 en m e d io de cu ltivo d u ra n te 3 d ías. Las cé lu la s T a c tiva d a s (1 x 106 cé lu la s ) se re su sp e n d ie ro n en 2 x 107 UI de le n tiv iru s co n ce n tra d o ju n to con su lfa to de p ro ta m in a 10 m g /m L (S ig m a -A ld rich , S t Lou is, M o) e IL-2 (100 U I) en un v o lu m e n de 20 pl y se incu ba ro n d u ra n te 4 horas. Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n de n ue vo el d ía d e sp u é s de la m ism a m a ne ra y se cu ltiva ro n en 1 m L de m e d io de cu ltivo s u m in is tra d o con IL-2 (100 U I/m L ) d u ra n te 7 d ía s a n te s de m e d ir la e xp re s ió n tra n sg é n ica . Las cé lu la s T se e xp a n d ie ro n d e sp u é s u sa nd o el p ro to co lo de e xp a n s ió n rá p ida (R E P ) com o se ha d e sc rito p re v ia m e n te [10]. La e xp re s ió n de N A P se e va lu ó d e sp u é s de c o c u ltiv a r cé lu las T N A P -C D 19 C A R con D au d i (C D 19+) en una re lac ió n 5:1 y b lo q u e a r la sec re c ió n de N A P m e d ia n te la a d ic ión de B re fe ld in a A (B D G o lg iP lu g™ , F ra n k lin e Lakes, N J) d u ra n te 12 h se g u id o de tin c ió n in te rc e lu la r con un a n ticu e rp o p ara a -N A P p rim a rio (re g a lo de la Dra. M a rina de B erna rd , U n ive rs id a d de P adova , Ita lia ) y un a n ticu e rp o de co n e jo a n ti- Ig G de ra tó n -A le xa F lu o r 488 s e cu n d a rio (In v itro g e n ). La e xp re s ió n de C D 19 C A R se ve r ific ó m e d ia n te tin c ió n con un fra g m e n to Fab de co n e jo a n ti-Ig de ra tón (H L ) (In v itro g e n ) co n ju g a d o con a lo fico c ia n in a (c o n ju g a d o con A P C ). Las cé lu la s T se id e n tifica ro n m e d ia n te tin c ió n con a n ticu e rp o a n ti-C D 3 h u m a n o co n ju g a d o con a zu l P acífico .
E xp re s ió n de n a n o lu c ife ra sa de cé lu la s T in v itro e in v ivo
S e g e n e ra ro n cé lu la s T tra n s d u c id a s con LV (n a n o L u c -C D 19 C A R ) y se e xp a n d ie ro n com o se d e sc rib ió a n te rio rm e n te . La e xp re s ió n de n a n o lu c ife ra sa se m id ió en cé lu las T n a n o L u c -C D 19 C A R y cé lu la s T n a n o L u c -C D 19 C A R c o cu ltiva d a s con cé lu la s d ia n a D aud i en una re lac ió n 5:1 d u ra n te 24 h. La e xp re s ió n de n a n o lu c ife ra sa se m id ió a ñ a d ie n d o d ire c ta m e n te su s tra to de l k it de e n sa yo de lu c ife ra sa nano-G lo® (P rom e ga , M a d ison , W I) a las cé lu las . S e inye cta ro n p o r v ía in tra ve n o sa a ra ton es N O D -S C ID h e m b ra de 5 se m a n a s de e dad (J a n v ie r Labs, F ran c ia ) 1 x107 cé lu la s T n a n o L u c -C D 19 C A R ju n to con cé lu la s d ia n a D au d i (C D 19+) o cé lu la s d ia n a B C -3 (C D 19 -) (3 ra ton es p o r g ru p o ) en una re lac ió n de 2:1 en un v o lu m e n to ta l de 200 pl el d ía 0. La e xp re s ió n de n a n o lu c ife ra sa se m id ió m e d ia n te inye cc ió n in tra ve n o sa de su s tra to (E n sa yo de luc ife rasa N ano-G lo® , P ro m e g a ) el d ía 3, d ía 5 y se v ig iló m e d ia n te el s is te m a de fo rm a c ió n de im á ge ne sin v ivoN ig h tO W L (B e rth o ld T e ch n o lo g ie s G m bH & Co. Kg, A lem a n ia ).
E n sa yo de c ito to x ic id a d de cé lu la s T
Las cé lu la s T se p us ie ron en re po so d u ra n te 3 d ía s d e sp u é s de la e xp an s ión R E P en dos is b a jas de IL-2 (20 U l/m L ) a n tes de que se u sa ran p ara e n sa yo s fu n c io n a le s . Los m o n o c ito s se se p a ra ro n de las P B M C m e d ia n te a is la m ie n to de las p erlas m a g n é tica s CD14+ (M ilte n y i B io tec). Los m o n o c ito s se d ife re n c ia ro n en DC inm a d u ra s (im D C ) c u ltivá n d o lo s en m e d io de cu ltivo de D C su p le m e n ta d o con IL-4 h um a na 20 n g /m L (G en tau r, B ruse las, B é lg ica ) y G M -C S F 100 n g /m L (G e n ta u r) d u ra n te 5 d ías. Las cé lu la s T tra n s d u c id a s con le n tiv iru s se co cu ltiva ro n con cé lu la s d iana m a rca d a s con lu c ife ra sa de lu c ié rn a g a (D a u d i) y con o sin im D C a u tó lo g a s en re la c io n e s 5:1:1 d u ra n te 4 d ía s en un v o lu m e n to ta l de 100 pl. La e xp re s ió n y a c tiv id a d de la lu c ife ra sa (com o in d ic a d o r de v ia b ilid a d de la cé lu la d ia n a ) se m id ie ron com o se m e nc ion ó a n te r io rm e n te [10]. La v ia b ilid a d c e lu la r re la tiva se ca lcu ló n o rm a liza n d o las u n id a d e s de luz re la tiva s (R L U ) de m u e s tra s c o cu ltiva d a s fre n te a las R LU de so lo las cé lu la s d iana.
S e c re c ió n de c ito c ina s , e xp re s ió n de m a rca d o re s de su p e rfic ie y p ro life ra c ió n de cé lu la s T
Las cé lu la s T tra n s d u c id a s se co cu ltiva ro n con cé lu la s d iana D au d i en una re lac ión de 1:1 o se cocu ltiva ron con cé lu la s d iana D au d i e im D C en una re lac ió n de 5:1:1 d u ra n te 20 -24 horas. Se m id ió la se c re c ió n de in te rfe ró n g a m m a (IF N -y ) e IL-2 de lin fo c ito s T y la se c re c ió n de IL -12 de DC en los líqu ido s s o b re n a d a n te s de los co cu ltivo s p o r e n sa yo de in m u n o a b so rc ió n ligado a e n z im a s (E L IS A ) (M ab te ch , N acka S trand , S uec ia ). Las cé lu la s T se tiñ e ro n para d e te rm in a r la e xp re s ió n de l m a rc a d o r de d e sg ra n u la c ió n C D 107 a u sa nd o un a n ticu e rp o F IT C -C D 107 (B io le g e n d ). Las cé lu la s T tra n s d u c id a s se co cu ltiva ro n con cé lu la s d ia n a D aud i en una re lac ión de 5:1 d u ra n te 4 d ía s y se t iñ e ro n para d e te rm in a r la e xp re s ió n de los m a rca d o re s de a g o ta m ie n to u sa nd o a n ticu e rp o s F IT C -P D 1 , P E -T im 3 y F IT C -L A G 3.
En o tro e xp e rim e n to , las cé lu las T tra n s d u c id a s se t iñ e ro n con co lo ra n te C e llT ra c e r V io le t (In v itro g e n ) y se cu ltiva ro n con cé lu la s d ia n a D aud i en una re lac ió n de 1:1 d u ra n te 4 días. Las cé lu la s T se a n a liza ro n d e sp u é s p o r c ito m e tría de flu jo para m e d ir la d ilu c ión de l co lo ra n te v io le ta com o una ind icac ión de p ro life ra c ió n ce lu la r.
A n á lis is del fe n o tip o de m a d u ra c ió n de DC y m a triz de c ito c in a s
Las cé lu la s T tra n s d u c id a s se co cu ltiva ro n con cé lu la s d ia n a D au d i en una re lac ió n de 5:1 d u ra n te 4 d ía s para e s tim u la r la e xp re s ió n de NAP. Se re cog ió el líqu ido so b re n a d a n te y se a ñ a d ió d ire c ta m e n te a las im D C d u ra n te 48 horas.
El a n á lis is fe n o típ ico de las DC se rea lizó u sa nd o los s ig u ie n te s a n ticu e rp o s m o n o c lo n a le s de ra tón m a rca d o s con f lu o ró fo ro (p an e l de fe n o tip o s de DC de m a d u ra c ió n ): P E C y7 -C D 14 , B V 510 -C D 1 a , A P C -C D 83 , P E -C D 80 , B V 421 -C D 86 , F IT C -C D 40 y A P C -C y7 -C D 70 y ju n to con co n tro le s de iso tipo de IgG de ra tón co in c id e n te s . Las im D C ta m b ié n se m a du ra ro n d u ra n te 24 hora s en m e d io de cu ltivo que co n te n ía IF N -<y>1000 U I/m L (S h e n a n d o a h B io te ch n o lo g y , W arw ick , PA), á c ido p o liin o s ín ico :p o lic itid ílico 20 p g /m L (p o li(I:C ), S ig m a -A ld rich ) y R 848 2 ,5 p g /m L (In v ivo G e n , S an D iego, C A ) y se u sa ron co m o co n tro l p o s itivo para la m a d u ra c ió n de DC (m D C ). El líqu ido so b re n a d a n te re co g id o de los co cu ltivo s de c é lu la s T, im D C a u tó lo g a s y cé lu la s d ia n a D aud i en re lac ió n 5:1:1 d u ra n te 4 d ía s se a n a lizó para d e te rm in a r la p re se n c ia de c ito c in a s u sa nd o P ro teo m e P ro file rT M H um a n C y to k in e A rra y Kit, P ane l A (<r>& D S ys te m s, Inc., M in n e a p o lis , M N).
C u ltivo T ra n sw e ll de m o n o c ito s h u m a n o s con cé lu la s T con cé lu la s d iana
S e a is la ro n m o n o c ito s C D 14<+>de P B M C u sa nd o p erla s a n ti-C D 14<+>(M ilte n y i B io tec). Los m o n o c ito s se m a n tu v ie ro n en el fo n d o de la p laca de 24 p oc illos e inse rtos T ra n sw e ll con m e m b ra n a de ta m a ñ o de poro s de 0 ,45 |jm (C o rn in g ) q ue co n te n ía cé lu la s T ju n to con cé lu la s D au d i (re la c ió n 5 :1 ) y se cu ltiva ro n d u ra n te 4 días. El a ná lis is fe n o típ ico de los m o no c ito s , p ro d u c id o p o r el líqu ido so b re n a d a n te de las cé lu la s T y las cé lu las d iana, se re a lizó u sa nd o el pane l de fe n o tip o s de DC de m a d u ra c ió n co m o se d e sc rib ió a n te rio rm e n te .
E n sa yo de m ig ra c ió n
La m ig ra c ió n c e lu la r se e va luó usa nd o un s is te m a de q u im io ta x is d e se ch a b le C h e m o T x<®>de 96 p oc illos (N e u ro P robe , G a ith e rsb u rg , M D ) q ue co n te n ía un filtro de m e m b ra n a de p o lica rb o n a to (ta m a ñ o de poro s de 3 jm ) . El líqu ido so b re n a d a n te co n se rva d o del c o cu ltivo de cé lu la s T con c é lu la s d ia n a D au d i en una re lac ió n 5:1 d u ra n te 4 d ía s se p uso en el fo n d o y se se m b ra ro n 2 x 10<5>n e u tró filo s rec ién a is la do s, m o n o c ito s C D 14<+>, c é lu la s N K C D 56<+>e im D C d ife re n c ia d a s de m o n o c ito s h u m a n o s en la p arte s u p e rio r de la m e m b ra n a T ra n sw e ll. La m ig ra c ió n de las cé lu las se e va luó d e sp u é s de 1 ,5 -2 h de incu ba c ió n a 37°C y se cu a n tificó m e d ia n te el e n sayo de v ia b ilid a d c e lu la r lu m in isce n te C e llT ite r-G lo<®>(P ro m e g a ). El p o rce n ta je de m ig ra c ió n de cé lu la s se m id ió com o (R L U<células-T+Daudi>- R L U<solo células-T>) / (R L U<células de migración totales>) x 100 %.
T in c ió n m u ltic o lo r de F A C S de T h 1 /T h 2
Las cé lu la s T se tra n sd u je ro n con v iru s y d e sp u é s de 7 d ías de cu ltivo , se co cu ltiva ro n con im D C a u tó lo g a s y cé lu la s d ia n a D au d i en re lac ió n 5:1:1 d u ra n te 4 d ías. Las c é lu la s T se tiñ e ro n con m a rca d o re s de sup erfic ie : a zu l P ac ífico -C D 3 , P e rcp -C D 4 y F IT C -C D 8. Las cé lu la s T ta m b ié n se p e rm e a b iliza ro n u sa nd o un co n ju n to de ta m p ó n de fa c to r de tra n sc rip c ió n T ru e -N u c le a r (B io le g e n d ) d u ra n te 1 hora. Las cé lu la s T p e rm e a b iliza d a s se tiñ e ro n e n to n ce s con P E -C y 7 -T -b e t y P E -G A T A 3. La re lac ió n de T b e t/G A T A 3 se ca lcu ló para la p ob lac ión de lin fo c ito s T C D 3 C D 4 .
E n sa yo de a c tiva c ió n de n eu tró filo s
Las cé lu la s T tra n s d u c id a s se p u s ie ro n en reposo d u ra n te 3 d ías d e sp u é s de la e xp a n s ió n en dos is b a jas de IL-2 (20 U l/m L ) y luego se co cu ltiva ro n con n eu tró filo s a u tó lo g o s rec ién a is la d o s y cé lu la s d ia n a D aud i en una re lac ió n de 5:1:1 d u ra n te 48 horas en un v o lu m e n to ta l de 100 j l . Los n e u tró filo s se se le cc io n a ro n com o cé lu las CD15+ y el m a rc a d o r de a c tiva c ió n se a n a lizó m e d ia n te tin c ió n con los s ig u ie n te s a n ticu e rp o s m a rcad os flu o re sce n te s : P E C y7 -C D 11 b , P E -H LA -D R , a zu l P a c ífico -C D 54 y A P C -C D 66 b . Las c ito c in a s (IL -12, IL-1 p, IFN -Y e IL -2) se m id ie ron de l co cu ltivo p o r E L IS A (M ab te ch ).
E xp e rim e n to in v ivo con a n im a le s
S e inye cta ro n p o r v ía s.c. en ra ton es B A L B /c h e m b ra de 5 -6 se m a n a s de e dad (T he J a n v ie r L a b s) en el f lan co p o s te rio r 1 x105 cé lu las A 20 en d P B S (In v itro g e n ) el d ía 0. D e sp u é s de la a pa ric ió n de l tu m o r los d ía s 12 y 15, los ra ton es re c ib ie ro n in ye cc io n e s i.v. de 5 x106 cé lu la s T en p re se n c ia de IL-2 h u m a n a 30 U I/m L. El d ía 16 d e sp u é s de la in o cu la c ió n tu m o ra l, los ra ton es se s a c rifica ro n y se re cog ie ron cé lu la s de tu m o re s , bazo, sangre y g a n g lio s lin fá tico s y se d ig irie ro n e n z im á tica m e n te en su sp e n s io n e s de una so la cé lu la . Las cé lu la s se tiñ e ro n con: P e /C y7 -P D -1 , A F 647 -T im 3 , F IT C -C D 3 , P e rC P -C D 4 , B V 421 -C D 8 , B V 510 -C D 45 con el fin de e va lu a r el a g o ta m ie n to de las cé lu la s T en el tum o r; A P C /C y7 -B 220 , P E /C y7 -G r1 , B V 421 -L y6 C , F IT C -L y6 G , P E -C D 11 c, P e rC P -C D 11 b con el fin de e va lu a r el m ic ro a m b ie n te de l tum o r. T o d o s los a n ticu e rp o s se a d q u irie ro n de B io le ge n d . Los tu m o re s se m id ie ro n con un ca lib re y el ta m a ñ o del tu m o r se ca lcu ló com o la fó rm u la : V o lu m e n = (lo n g itu d ) * (a n c h u ra )2 * n /6. Los ra to n e s se s a c rifica ro n cu a n d o el v o lu m e n del tu m o r su p e ró 1 c m 3.
A n á lis is e s ta d ís tico
Los d a to s se p rese n ta n com o m e d ia s y e rro r e s tá n d a r de la m e d ia (S E M ). El a n á lis is e s ta d ís tico se rea lizó m e d ia n te el so ftw a re P rism de G ra p h P a d ve rs ió n 6.01 (La Jo lla , CA, EE. UU .). Los a n á lis is e s ta d ís tico s en to d a s las fig u ra s se re a liza ro n u sa n d o c o m p a ra c io n e s m ú ltip le s de la p rue b a A N O V A p a ra m é trica (m ás de 2 g ru p o s de d a to s ) y p rue b as T no p a ra m é tr ica s si so lo 2 g ru p o s de datos . Los va lo re s con P < 0 ,05 se co n s id e ra ro n e s ta d ís tic a m e n te s ign ifica tivo s .
R esu lta do
El p ro m o to r in d u c ib le de N F A T -IL -2 in tro d u c id o en cé lu la s T C A R , se a c tivó e sp e c ífica m e n te tra s el re co n o c im ie n to de cé lu la s d ia n a ta n toin v itrocom oin v ivo
P ara m in im iza r la to x ic id a d no d e se a d a ca u sa d a p o r la e xp re s ió n co n s titu tiva de NAP, se co n s tru yó un v e c to r len tiv ira l con un p ro m o to r re co m b in a n te ind u c ib le . C o n s is tía en se is re p e tic io n e s de m o tivo s de un ión a N F A T se g u id a s del p ro m o to r m ín im o de IL-2 hum ana . El p ro m o to r re co m b in a n te d ir ige la e xp re s ió n de l gen in d ica d o r en cé lu la s T a c tiva d a s tra s el a co p la m ie n to de T C R con el a n tíg e n o d iana. P ara v a lid a r el p ro m o to r en el s is te m a de los a u to re s de la inve nc ión , se co n s tru yó un v e c to r len tiv ira l de n a n o lu c ife ra sa co n tro la d a p o r el p ro m o to r de N F A T -IL -2 (F igu ra 1) y se ilus tró (F igu ra 2). El v e c to r ta m b ié n co n te n ía el C D 19 C A R bajo con tro l tra n s c rip c io n a l de l p ro m o to r de l fa c to r de e lo n g a c ió n 1 a lfa (EF1 a) hum ano .
Las cé lu la s T N a n o L u c -C D 19 C A R e xp re sa ro n el gen in d ica d o r de n a n o lu c ife ra sa so lo cu a n d o se co cu ltiva ro n con cé lu la s d ia n a D au d i C D19+ (F ig u ra 3). La a c tiva c ió n de l p ro m o to r ind u c ib le ta m b ié n se e va lu óin v ivom e d ia n te la c o in ye cc ió n de cé lu las T n a n o L u c -C D 19 C A R con cé lu las B C -3 C D 19 - o cé lu la s D aud i CD19+. La se ñ a l de luc ife ra sa fu e rte se d e te c tó so lo en ra ton es a los que se co n in ye c ta ro n cé lu la s D au d i C D 19+ 3 d ías d e sp u é s de la inye cc ió n con se ñ a le s q ue se d e sva n e ce n 5 d ías d e sp u é s de la inye cc ió n (F igu ra 4). Las señ a le s no se d e te c ta ro n cu a n d o a los ra to n e s se les co in ye c tó cé lu la s B C -3 C D 19 - (F ig u ra 4). E s tos d a to s sug ie ren q ue el p ro m o to r de N F A T -IL -2 e ra se le c tivo e ind u c ib le p o r el a co p la m ie n to C A R -a n tíg e n o . T a m b ié n se v e r ificó la e xp re s ió n e sp e c ífica de N A P en cé lu la s T m o d ifica d a s p o r ing e n ie ría g e n é tica con v e c to r len tiv ira l L V (N A P -C D 19 C A R ) en co m p a ra c ió n con el v e c to r len tiv ira l C D 19 C A R tra s la e s tim u la c ió n de cé lu la s d ia n a D aud i (F ig u ra s 5 y 6).
La e xp re s ió n de N A P m e jo ró la c ito to x ic id a d de las cé lu las T C A R en p re se n c ia de DC in m a d u ra s a u tó lo g a s s in a fe c ta r a la fun c ión de las cé lu la s T
S e e va luó la to x ic id a d p o ten c ia l de la p ro te ína N A P para las cé lu la s T C D 19 C A R para c o n firm a r q ue N A P no a fe c ta b a n e g a tiva m e n te a la fu n c ió n de las cé lu la s T. La fu n c ió n de las cé lu las T tra n s d u c id a s tra s el re co n o c im ie n to de las cé lu la s d ia n a se a n a lizó b a sá n d o se en la c ito to x ic id a d para las cé lu las d iana CD19+, la lib e ra c ió n de IF N -<y>, la e xp re s ió n su p e rfic ia l de C D 107 y la ca p a c id a d de p ro life ra c ió n com o se ilus tra en la F ig u ra 7. Las cé lu la s T tra n s d u c id a s con L V (C D 19 C A R ) o L V (N A P -C D 19 c A r ) m o stra ro n c ito to x ic id a d s im ila r p a ra las cé lu la s d iana. S in e m ba rg o , cu a n d o se co cu ltiva ro n con DC in m a d u ra s a u tó lo g a s (im D C ), las cé lu las T N A P -C D 19 C A R p re se n ta ro n una c ito to x ic id a d s ig n ifica tiva m e n te m e jo r q ue las cé lu la s T C D 19 C A R (F ig u ra 8). No hab ía d ife re n c ia en té rm in o s de se c re c ió n de IF N -<y>y e xp re s ió n de C D 107 a e n tre cé lu la s T C D 19 C A R y cé lu la s T N A P -C D 19 C A R , m ie n tra s que en p re se n c ia de im D C au tó lo ga s , las cé lu la s T N A P C D 19 C A R se c re ta ro n s ig n ifica tiva m e n te m ás IF N -<y>y p rese n ta ron un m a yo r g rad o de d e sg ra n u la c ió n (e xp re s ió n de C D 107 a ) q ue las cé lu la s T C D 19 C A R (F ig u ra s 9 y 10). A d e m á s, los lin fo c ito s T tra n s d u c id o s con L V (C d 19C A R ) o L V (N A P -C D 1 C 9 A R ) p rese n ta ron una ca p a c id a d de p ro life ra c ió n de cé lu la s T s im ila r tra s el re co n o c im ie n to de las cé lu las d ia n a (F ig u ra 11).
La N A P se c re ta d a de cé lu la s T N A P -C D 19 C A R a c tiva d a s e s tim u ló la sec re c ió n de q u im io c in a s y c ito c in a s y p ro m o v ió la m a d u ra c ió n de DC
La o b se rva c ió n de una c ito to x ic id a d m e jo ra d a m o s tra d a p o r cé lu la s T N A P -C D 19 C A R cu a n d o se co cu ltiva ro n con im D C , m o tivó a los a u to re s de la inve nc ión a in v e s tig a r m á s a fo n d o el im p ac to de la se c re c ió n de N A P en im D C d e riva d a s de m o no c ito s . Los líqu ido s s o b re n a d a n te s re co g id o s de co cu ltivo s de cé lu la s d ia n a y cé lu las T s im u la da s , cé lu las T N A P -C D 19 C A R o cé lu la s T C D 19 C A R se e xa m in a ro n para d e te rm in a r la ca p a c id a d de m a d u ra c ió n de DC com o se ilus tra en la F ig ura 12. Las im D C in cu b a d a s con líqu ido s s o b re n a d a n te s de co cu ltivo s de cé lu la s T N A P -C D 19 C A R e xp re sa ro n m a yo re s n ive les de m a rc a d o r de m a du ra c ió n C D 83 en co m p a ra c ió n con im D C in cu b a d a s con líqu ido so b re n a d a n te de cé lu la s T s im u la d a s o cé lu la s T C D 19 C A R (F ig u ra 13). S o rp re n d e n te m e n te , las im D C m a d u ra d a s con N AP te n ía n un fe n o tip o de m a du ra c ió n y a c tiva c ió n s im ila r al de las DC m a d u ra d a s con un cóc te l de m a d u ra c ió n q ue con s is tía en IF N -<y>, poli I:C y<r>848 (co n tro l p os itivo ). A d e m á s, ta m b ié n se p e rfila ro n las q u im io c in a s y c ito c in a s p re se n te s en los líq u id o s so b re n a d a n te s de los co cu ltivo s de cé lu la s T :im D C :D a u d i, ya q ue se ha d e sc rito N A P con la p rop ied a d p o la riza n te de Th1. Se re p re se n ta un m a pa té rm ico con d a tos de p e rfila d o a g ru p a d o s q ue se n o rm a liza ro n re sp e c to a cé lu la s T s im u la d a s (F igu ra 14). Los líqu ido s s o b re n a d a n te s de co cu ltivo s de cé lu la s T N A P -C D 19 C A R te n ía n m a yo re s c a n tid a d e s de q u im io a tra c to re s de cé lu la s in m u n ita ria s inna tas C C L -1 , C C L-2 , IL-8; c ito c in a s a c tiva d o ra s de Th1 IL-12, IL-16, IL-1 a /p y c ito c in a s a c tiva d o ra s de n e u tró filo s IL-8, M IP -1 a /p q ue en los líq u id o s so b re n a d a n te s o b te n id o s de co cu ltivo s de cé lu las T C D 19 C A R (F ig u ra 14). La p re se n c ia de la c ito c in a p o la riza n te de Th1 c lave IL -12 en los líq u id o s s o b re n a d a n te s ta m b ié n se co n firm ó y cu a n tificó p o r E L IS A (F ig u ra 13).
N A P no p ro m o v ió el a g o ta m ie n to de las cé lu la s T, pero ind u jo Th1 p o la riza d a s en p re se n c ia de im D C a u tó lo g a s
El fe n o tip o de cé lu la s T s im u la d a s ac tivad as , cé lu la s T C D 19 C A R y cé lu la s T N A P -C D 19 C A R en p re se n c ia de im D C a u tó lo g a s se d e te rm in ó p o r los fa c to re s de tra n sc rip c ió n T -b e t y G a ta -3. La d ife re n c ia c ió n de cé lu la s T a u x ilia re s v írg e n e s h ac ia cé lu las Th1 o T h 2 e stá e s tre ch a m e n te co n tro la d a p or los fa c to re s de tra n sc rip c ió n T -b ox e xp re sa d o s en cé lu la s T (T -b e t) y la p ro te ín a 3 de un ión a G A T A (G A T A -3 ). La e xp re s ió n de T -b e t y G A T A 3 se c o m p ro b ó m e d ia n te c ito m e tría de flu jo m u ltic o lo r (F ig u ra 15). En p re se n c ia de las im D C , las cé lu la s G ATA3+ d ism in u ye ro n lig e ra m e n te m ie n tra s q ue las cé lu la s T-bet+ a u m e n ta ro n lig e ra m e n te en las cé lu las T N A P -C D 19 C A R en co m p a ra c ió n con las cé lu la s T C D 19 C A R , lo que llevó a q ue la re lac ió n de T -b e t/G A T A 3 en las cé lu la s T CD3+CD4+, que es una ind ica c ió n de p o la rizac ión T h 1 /T h 2 , fue ra s ig n ifica tiva m e n te m a yo r en las cé lu la s T N A P -C D 19 C A R que en las cé lu la s T C D 19 C A R (F ig u ra 16). E s te re su lta d o co n firm ó la p rop ied a d de p o la riza c ió n de Th1 de N A P y es co n s is te n te con el perfil de c ito c in a s y q u im io c in a s en la F igura 13.
La e xp re s ió n de s u p e rfic ie a lta de re ce p to re s in h ib id o re s en cé lu la s T, ta le s com o P D -1 , T im 3 y LAG 3 es una ca ra c te rís tica d is tin tiva de l a g o ta m ie n to de cé lu la s T y m a rca d o re s inh ib id o res , q ue es un fa c to r p rim a rio que lim ita la e fica c ia a n titu m o ra l de las cé lu la s T C A R . La e xp re s ió n de N A P in d u c id a no p ro m o v ió el a go ta m ie n to de las cé lu las T com o se o b se rvó a tra vé s de la e va lu a c ió n de la p ob lac ión de cé lu la s T C A R PD1 Tim3+ (d ob le p o s itivo ) (F ig u ra 16) y la e xp re s ió n en cé lu la s T C A R de LA G 3 (F ig u ra 16). Las cé lu la s T a g o ta d a s re du cen la p ro d u cc ió n de IL-2, lo q ue ind ica la d is fu n c ió n de las cé lu la s T. S e e n co n tró que la e xp re s ió n de N A P p o r las cé lu la s T a u m e n ta b a la sec re c ión de IL-2 ta n to con im D C a u tó lo g a s cóm o s in e llas, ya que la se c re c ió n era s ig n ifica tiva m e n te m a yo r q ue para las cé lu la s T C D 19 C A R (F ig u ra 16). Jun tos , los da tos m u es tra n que la p re se n c ia de im D C a u tó lo g a s no a fe c ta b a al a g o ta m ie n to de las cé lu la s T N A P C D 19 C A R y su ca p a c id a d para s e c re ta r IL-2.
S e re c lu ta ron cé lu la s in m u n ita ria s inna tas y se a c tiva ro n m e d ia n te N A P e xp re sa d a a p a rtir de cé lu las T N A P -C D 19 C A R a c tiva d a s
N A P es un p o te n te q u im io a tra c to r para n e u tró filo s y m o no c ito s . T a m b ié n se o b se rvó que los líqu ido s s o b re n a d a n te s de los co cu ltivo s de c é lu la s T N A P -C D 19 C A R e ran q u im io a tra c to re s p ara n e u tró filo s y m o n o c ito s (F ig u ra 17). A d e m á s, ta m b ié n se o b se rvó que N AP p uede a tra e r cé lu la s N K e im D C (F ig u ra 17). Se v ig iló la a c tiva c ió n de los n e u tró filo s (C D 15+) cu a n d o se co cu ltiva ro n ju n to con cé lu la s T s im u la da s , cé lu la s T C D 19 C A R y cé lu la s T N A P -C D 19 C A R y las cé lu la s d iana D au d i (n e u tró filo s :cé lu la s T :D a u d i) (F igu ra 18). La e xp re s ió n de C D 11 b y H L A -D R a c tiva d a s en n e u tró filo s fue s ig n ifica tiva m e n te m a yo r en el co cu ltivo de cé lu las T N A P -C D 19 C A R q ue la de cé lu las T C D 19 C A R (F ig u ra 19). T a m b ié n hubo un a u m e n to de la e xp re s ió n de C D 66 b y C D 54 en n e u tró filo s en el co cu ltivo de cé lu la s T N A P -C D 19 C A R (F ig u ra 19). La a c tiva c ió n se basó en la<n>A<p>e xp re sa d a tra s el a co p la m ie n to del a n tíg e n o (cé lu la s T :D a u d i), ya q ue ni el c o cu ltivo de cé lu la s T s im u la d a s ni la cé lu la tu m o ra l so la e le va ro n la e xp re s ió n de los m a rca d o re s de a c tivac ión . Los n eu tró filo s p ueden p ro d u c ir n u m e ro sa s c ito c in a s d e sp u é s de una e s tim u la c ió n a pro p ia d a . La se c re c ió n de IL -12 y c ito c ina p ro in fla m a to r ia IL-1 p fu e s ig n ifica tiva m e n te m a yo r cu a n d o los n e u tró filo s fu e ro n a c tiva d o s p or N A P (F ig u ra 20). La sec re c ió n de IF N -y e IL-2 de l co cu ltivo de cé lu la s T N A P -C D 19 C A R ta m b ié n fue lig e ra m e n te m a yo r en co m p a ra c ió n con la sec re c ió n de co cu ltivo s con c é lu la s T C D 19 C A R (F ig u ra 20).
T a m b ié n se inve s tig ó el e fe c to de N A P en la d ife re n c ia c ió n de m o n o c ito s en un e n sa yo de co cu ltivo T ra n sw e ll com o se ilus tra en la F ig ura 21a. D e sp u é s de 5 d ía s de co cu ltivo T ra n sw e ll e n tre cé lu la s T y cé lu la s d iana, los m o n o c ito s p re se n ta b a n un fe n o tip o de tip o DC m ás d ife re n c ia d o (C D 14 -C D 1 a alto) (F ig u ra s 21b -21 c ). Se e va luó a d e m á s en e stas cé lu la s de tip o D C su e s ta do de m a du ra c ió n . Los m o n o c ito s d ife re n c ia d o s de l líqu ido so b re n a d a n te de cé lu la s T N A P -C D 19 C A R :D a u d i m o stra ro n un fe n o tip o de DC m ás a c tiva d o y m a du ro con n ive les m ás a lto s de m o lé cu la s co e s tim u la d o ra s q ue inc lu ye n C D 80, C D 86, C D 40 y C D 70, m ie n tra s que C D 83 se e xp re só en n ive les s im ila re s a los de los m o n o c ito s d ife re n c ia d o s de l líqu ido so b re n a d a n te de cé lu las T C D 19 C A R :D a u d i (F ig u ra 21 d).
El uso de cé lu la s T N A P -C A R p ara fin e s te ra p é u tico s
C o m o se ha in d ica d o a n te rio rm e n te , la N A P se c re ta d a de cé lu la s T tie n e m ú ltip le s e fe c to s sob re las cé lu las inm un ita ria s , p o r lo tan to , es im p o rta n te e xa m in a r la e fica c ia te ra p é u tica ta m b ié nin vivo.Las c o n s tru cc io n e s de re tro v iru s u sa da sin v ivoy la línea te m p o ra l de l e xp e rim e n to se ilus tra n en las F ig uras 22 y 23. Los ra ton es q ue te n ía n lin fo m a su b cu tá n e o tra ta d o s con cé lu la s T N A P -C D 19 C A R tu v ie ro n un c re c im ie n to tu m o ra l a lgo re ta rd a d o (F ig u ra 24 ) y una s u p e rv ive n c ia lig e ra m e n te p ro lo n g a d a de los ra ton es (F ig u ra 24 ) en co m p a ra c ió n con los ra ton es tra ta d o s con lin fo c ito s T C D 19 C A R . La can tid a d de cé lu la s T CD8+ a c tiva d a s (PD1+) era a lgo m a yo r en g a n g lio s lin fá tico s d ren a n te s , bazo y s ig n ific a tiv a m e n te m a yo r en la sa n g re cu a n d o se usó la inye cc ió n i.v. con cé lu las T N A P -C D 19 C A R en co m p a ra c ió n con las cé lu la s T C D 19 C A R (F ig u ra 25). T a m b ié n se e xa m in a ro n p or c ito m e tría de flu jo las cé lu la s in m u n ita ria s en el m ic ro a m b ie n te tu m o ra l de tu m o re s re secad o s. Las cé lu la s T in filtra n te s de l g rup o tra ta d o con cé lu la s T N A P -C D 19 C A R m o stra ro n el m ism o n ive l de a g o ta m ie n to que las cé lu la s T de l g rup o de cé lu la s T C D 19 C A R (F ig u ra 26). S e d e te c ta ro n m a yo re s c a n tid a d e s de DC (F ig u ra 26 ) y n e u tró filo s (F ig u ra 26 ) en el m ic ro a m b ie n te tu m o ra l. C u a n d o se a n a lizó la p ob la c ió n de cé lu la s s u p re so ra s d e riva d a s de m ie lo id e s (M D S C ) en los tu m o re s , se e n co n tró q ue la re lac ión e n tre las M D S C g ra n u lo c ítica s (G r) y M D S C m o n o c ítica s (M o) fue m a yo r en el g rup o tra ta d o con cé lu las T N A P -C D 19 C A R (F ig u ra 26), lo q ue ind ica m enos M D S C su p re so ra s m o n o c ítica s en el m ic ro a m b ie n te tum o ra l. S e e sb oza b re ve m e n te un m e ca n ism o g lo b a l de cé lu la T -N A P en un m a rco te ra p é u tico en la F ig u ra 27. A p a rtir de los re su ltad o s, se p ro p o n e una h ip ó te s is para el m e ca n ism o d e trá s del m odo de a cc ión de las cé lu las T N A P -C A R (F ig u ra 27). N A P p a re ce s e r un fa c to r in m u n o m o d u la d o r p ro m e te d o r para in tro d u c ir en las cé lu las T C A R con el fin de a lte ra r el T M E y p o te n c ia r la a c tiv id a d a n titum o ra l.
R e fe re n c ia s
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17. EP 1767 214 B1
19
Claims (15)
1. Un v e c to r que com p re nd e :
una se cu e n c ia de á c ido n u c le ico q ue co d ifica un re ce p to r de a n tíg e n o q u im é rico (C A R ) y /o una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica un re ce p to r de cé lu la s T (T C R ); y
una se cu e n c ia de á c ido n u c le ico q ue co d ifica una p ro te ína a c tiva d o ra de n e u tró filo s deH e lic o b a c te r p y lo r i(H P -N A P ) y /o una se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica un fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de d icha H P -N A P , en d on de d ich o fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de d ich a H P -N A P es un fra g m e n to que inc lu ye d o m in io s p o lip e p tíd ico s a c tivo s de al m e no s 20 -40 res tos de a m in o á c id o s de d ich a H P -N A p , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o s de l g rup o q ue co n s is te en las S E Q ID NO: 9 a 12.
2. El v e c to r seg ún la re iv in d ica c ió n 1, en d on de d icho v e c to r es un v e c to r v ira l, p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o de un g rup o q ue co n s is te en un v e c to r h íb rido , un v e c to r len tiv ira l, un v e c to r a de no v ira l, un v e c to r v ira l a d e n o a s o c ia d o y un v e c to r re trov ira l, m ás p re fe rib le m e n te un v e c to r len tiv ira l.
3. El v e c to r seg ún la re iv in d ica c ió n 1 o 2, en d on de d ich a se cu e n c ia de á c id o n u c le ico que co d ifica d ich a H P -N A P y /o d icha se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica d icho fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de d ich a H P -N A P está ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r ind u c ib le , p re fe rib le m e n te a c tiva d o tra s la unión de un an tíge no , p re fe rib le m e n te un a n tíg e n o a so c ia d o a tu m o r (T A A ), a d ich o C A R y /o d ich o TC R , y m ás p re fe rib le m e n te que esNm o tivo s de un ión del fa c to r n u c le a r de cé lu la s T a c tiva d a s (N F A T ) se g u id o p o r el p ro m o to r m ín im o de in te rle u c in a 2 h u m a n a (IL -2 ),Nes 1-10, p re fe rib le m e n te 4-8, m ás p re fe rib le m e n te 6.
4. El v e c to r seg ún cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 3, en d on de d ich a se cu e n c ia de á c id o n u c le ico que co d ifica d ich o C A R y /o d ich a se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica d ich o T C R e stá ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r s e le cc io n a d o de un g rup o q ue co n s is te en el p ro m o to r de l fa c to r de e lo n ga c ió n 1 a lfa (E F 1 a ) hum ano , el p ro m o to r de c ito m e g a lo v iru s (C M V ) y el p ro m o to r C A G , p re fe rib le m e n te el p ro m o to r de EF1a.
5. El v e c to r según cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 4, q ue com p re nd e :
una se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica d icho C A R q ue tie n e un fra g m e n to v a r ia b le de ca d e n a se n c illa d e riva d o de a n ticu e rp o e x tra c e lu la r (s cF v ) q ue se une e sp e c ífica m e n te al a n tíg e n o de lin fo c ito s B C D 19 (C D 19 ) y ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de l p ro m o to r de l fa c to r de e lo n g a c ió n 1 a lfa (E F 1 a ) hum a no ; y
una se cu e n c ia de á c id o n uc le ico q ue co d ifica d ich a H P -N A P con un p ép tid o de señ a l a rtific ia l para la sec re c ión y ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r de N F A T -IL -2 in d u c ib le q ue co m p re n d e se is re p e tic io n e s de m o tivo s de un ión de fa c to r n u c le a r de cé lu la s T a c tiva d a s (N F A T ).
6. U na cé lu la T que com p re nd e :
i) un re ce p to r de a n tíg e n o q u im é rico (C A R ), un re ce p to r de cé lu la s T (T C R ), una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica d icho C A R y /o una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica d ich o TC R ; y
una p ro te ína a c tiva d o ra de n e u tró filo s deH e lic o b a c te r p y lo r i(H P -N A P ), un fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de d ich a H P -N A P , una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica d icha H P -N A P y /o una se cu e n c ia de á c id o n u c le ico que co d ifica d ich o fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de d ich a H P -N A P , en d on de d ich o fra g m e n to in m u n o ló g ica m e n te e q u iva le n te de d ich a H P -N A P es un fra g m e n to q ue inc lu ye d om in ios p o lip e p tíd ico s a c tivo s de al m e no s 20 -40 res tos de a m in o á c id o s de d ich a H P -N A P , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o s de l g rup o q ue co n s is te en las S E Q ID NO: 9 a 12.
7. La cé lu la T según la re iv in d ica c ió n 6, en d on de d icho C A R y /o d ich o T C R se unen e sp e c ífica m e n te a un an tíge no , p re fe rib le m e n te un a n tíg e n o a so c ia d o a tu m o r (T A A ), y m ás p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o de un g rup o q ue co n s is te en a n tíg e n o de lin fo c ito s B C D 19 (C d 19), C d 20, m u c in a 1 (M U C 1), m e so te lin a (M S LN ), N Y -E S O -1 , a lfa -fe to p ro te ín a (A F P ), a n tíg e n o ca rc in o e m b rio n a rio (C E A ), re ce p to r 2 de l fa c to r de c re c im ie n to e p id é rm ico h um a no (H E R 2), p ro te ín a tu m o ra l p53 (p 53 ), p ro te ín a R as (R A S ), a n tíg e n o a so c ia d o a m e la n o m a (M a G E), p re fe rib le m e n te C D19.
8. La cé lu la T según la re iv in d ica c ió n 6 o 7, en d on de d ich a H P -N A P es e xp re sa d a y se c re ta d a p o r d ich a cé lu la T tra s la un ión de un an tíge no , p re fe rib le m e n te un a n tíg e n o a so c ia d o a tu m o r (T A A ), a d icho C A R y /o d icho TC R .
9. La cé lu la T seg ún cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 6 a 8, en d on de d ich a cé lu la T co m p re n d e ii) d icha se cu e n c ia de á c id o n u c le ico q ue co d ifica d ich a H P -N A P y /o d ich a se cu e n c ia de á c id o n uc le ico que co d ifica d ich o fra g m e n to in m u n o ló g ic a m e n te e q u iva le n te de d icha H P -N A P b a jo co n tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r ind u c ib le , p re fe rib le m e n te a c tiva d o tra s la un ión de un an tíge no , p re fe rib le m e n te un a n tíg e n o a so c ia d o a tu m o r (T A A ), a d ich o C A R y /o d ich o TC R , y s ie n d o m ás p re fe rib le m e n te N m o tivo s de un ión de l fa c to r n u c le a r de cé lu la s T a c tiva d a s (N F A T ) se g u id o p o r el p ro m o to r m ín im o de in te rle u c in a 2 h u m a n a (IL -2 ),Nes 1-10, p re fe rib le m e n te 4 -8 , m ás p re fe rib le m e n te 6.
10. La cé lu la T según cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 6 a 9, en d on de d ich a cé lu la T co m p re n d e i) d icha se cu e n c ia de á c id o n u c le ico que co d ifica d ich o C A R y /o d icha se cu e n c ia de á c ido n u c le ico q ue co d ifica d icho T C R ba jo con tro l tra n s c rip c io n a l de un p ro m o to r se le cc io n a d o de un g rup o q ue co n s is te en el p ro m o to r del fa c to r de e lo n g a c ió n 1 a lfa (E F 1 a ) hum a no , el p ro m o to r de c ito m e g a lo v iru s (C M V ) y el p ro m o to r C AG , p re fe rib le m e n te el p ro m o to r de EF1a.
11. U na co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica , que com p re nd e :
una cé lu la T seg ún c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 6 a 10; y
una cé lu la den d rítica , p re fe rib le m e n te una cé lu la d e n d rítica inm adura .
12. U na cé lu la T seg ún cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 6 a 10 o una co m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a seg ún la re iv in d ica c ió n 11, para su uso com o m e d icam en to .
13. U na cé lu la T seg ún cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 6 a 10 o una co m p o s ic ió n fa rm a cé u tica según la re iv in d ica c ió n 11, para su uso en in m u n o te ra p ia de cé lu la s T.
14. U na cé lu la T seg ún cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 6 a 10 o una co m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a seg ún la re iv in d ica c ió n 11, p a ra su uso en el tra ta m ie n to , re du cc ió n y /o p re ve n c ió n del cáncer, p re fe rib le m e n te un c á n c e r de tu m o r só lido .
15. Un m é to d o para in d u c ir la m a d u ra c ió n de cé lu las d e n d rítica s inm ad uras , c o m p re n d ie n d o d icho m é to do p o n e r en co n ta c toin v itrod ich as cé lu las d e n d rítica s in m a d u ra s con una cé lu la T seg ún c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 6 a 10.
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