KR20240024048A - Nk 세포와 her2 표적 항체를 이용한 암 치료 방법 - Google Patents

Nk 세포와 her2 표적 항체를 이용한 암 치료 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20240024048A
KR20240024048A KR1020237038625A KR20237038625A KR20240024048A KR 20240024048 A KR20240024048 A KR 20240024048A KR 1020237038625 A KR1020237038625 A KR 1020237038625A KR 20237038625 A KR20237038625 A KR 20237038625A KR 20240024048 A KR20240024048 A KR 20240024048A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
natural killer
billion
population
less
Prior art date
Application number
KR1020237038625A
Other languages
English (en)
Inventor
민보경
김유선
양빛나
김효진
피터 플린
제이슨 비. 리튼
토마스 제임스 파렐
존 킨 추안 림
밀리 만달
Original Assignee
아티바 바이오테라퓨틱스, 인크.
주식회사 지씨셀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아티바 바이오테라퓨틱스, 인크., 주식회사 지씨셀 filed Critical 아티바 바이오테라퓨틱스, 인크.
Publication of KR20240024048A publication Critical patent/KR20240024048A/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/664—Amides of phosphorus acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/51—Stomach
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 특히 HER2+ 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

NK 세포와 HER2 표적 항체를 이용한 암 치료 방법
우선권 주장
본 출원은 2021년 12월 16일자 미국 가출원 번호 63/290,359 및 2021년 4월 8일자 미국 가출원 번호 63/172,414에 대해 우선권을 주장한다. 이들 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본원에 통합된다.
항체 요법을 비롯한 표적 요법이 암 치료에 혁신을 일으켰다. 항체 요법이 세포독성을 유발하는 한가지 작용 기전은 항체 의존적인 세포-매개 세포독성 (ADCC)에 의한 것이다. 많은 암 환자들이 강건한 ADCC 반응을 일으키지 못할 수 있다. ADCC 반응의 저하는 임의의 지정된 단일클론 항체 치료제가 이들 환자에서 상당히 덜 효과적이게 만들어, 이들 환자는 반응하지 못하거나 또는 재발할 수 있다. 그래서, ADCC 반응의 저하는 임상적인 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
최근 수종의 항암제 발굴과 개발에도 불구하고, HER2+ 암 등의 다수 유형의 암들에서 예후 불량으로 인해 개선된 방법과 치료학적 물질이 여전히 요구되고 있다.
본 발명은 당해 기술 분야에서 이러한 문제와 기타 문제들을 해결한다.
NK 세포는 그 세포 표면 수용체들의 복합 어레이를 통해서뿐 아니라 항체-의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)을 통해 종양 세포와 인게이징 (engaging)할 수 있는 면역 세포이다. NK 세포는 ADCC를 개시하기 위해 자신의 표면 CD16 수용체를 통해 항체와 인게이징할 수 있다. NK 세포는 CAR-T 세포 요법 및 기타 세포 요법에 이용되는 T 세포와 같은 다른 면역 세포를 능가하는 이점이 있을 수 있다. 한가지 예시적인 이점으로, NK 세포는 동종이계 요법으로 이용할 수 있는데, 한 공여체로부터 유래한 NK 세포를 HLA 매칭, 유전자 편집 또는 기타 유전자 조작 없이, 환자 한명 또는 여러 명에 안전하게 사용할 수 있다. 항-종양 활성을 가진 동종이계 NK 세포는 중증 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 및 신경 독성 또는 이식편대숙주 질환 (GvHD)과 같은 T 세포 요법과 관련한 많은 위험성 없이 환자에게 안전하게 투여할 수 있다.
동종이계 NK 세포는 암 환자에 중대한 치료 옵션을 제공할 수 있다. 한가지 예시적인 이점으로, NK 세포는 다른 세포-기반 요법과 관련한 이식편대숙주 질환, 신경독성 또는 사이토카인 방출 증후군의 발병 없이 내약성 (tolerability)이 우수하다. 다른 예시적인 이점으로, NK 세포는 종양 세포를 식별하여 용해하는데 사전 항원 노출이나 또는 특이적인 항원의 발현을 요구하지 않는다. 다른 예시적인 이점으로, NK 세포는 선천적인 면역을 연결하고 다중-클론성 적응 면역 반응을 불러 일으켜 장기간의 항암 면역 기억을 구축하는 고유한 능력을 가지고 있다. 이러한 특징들 모두 암 치료 옵션으로서 잠재적인 NK 세포 효과에 기여한다.
예를 들어, NK 세포는 면역 시스템의 다른 구성요소들을 동원해 활성화할 수 있다. 활성화된 NK 세포는 사이토카인 및 케모카인, 예를 들어 인터페론 γ (IFNγ); 종양 괴사 인자 α (TNFα); 및 신호를 전달하여 T 세포를 종양으로 동원하는 대식세포 염증성 단백질 1 (MIP1)을 분비한다. NK 세포는 또한 종양 세포의 직접 살상을 통해 적응 면역 시스템에 의해 인지되도록 종양 항원을 노출한다.
아울러, 다양한 제대혈 은행을 NK 세포 공급원으로 이용함으로써, 임상 활성을 강화하는데 바람직한 특징 (예를 들어, 고-친화성 CD16 및 살상 세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR) B-일배체형)을 가진 제대혈을 선별할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 동종이계 NK 세포를 투여해 환자의 ADCC 반응을, 예를 들어 단일클론 항체 요법을 시술하는 중에 강화할 수 있다. 한가지 예시적인 이점으로, 본원에 기술된 동종이계 NK 세포는 항체에 대해 완전한 또는 일부 내성이 생긴 환자에도 이용할 수 있다. 예를 들어, HER2 경로는 전형적으로 세포 생장 및 분열을 촉진한다. 일부 암에서는 HER2 발현이 상향 조절되어, 지속적인 증식 및 종양 형성이 촉진된다. HER2 경로는 MAP 키나제 및 PI3 키나제/AKT 경로를 개시시킨다. 트라스투주맙 (trastuzumab)은 HER2의 이량체 형성을 방해해, HER2 활성화 및 하류 신호전달을 저해할 수 있다. 그러나, 이들 경로에 돌연변이는 HER2 신호전달이 없는 경우에도 구성적인 활성화를 유발할 수 있으며, 그래서 트라스투주맙 내성 기전을 제공할 수 있다. 한가지 예시적인 이점으로, 본원에 기술된 NK 세포는, ADCC를 매개하여 HER2 신호전달과는 독립적으로 종양 세포를 살상할 수 있으므로, 일부 트라스투주맙-내성 암과도 조합하여 여전히 이용할 수 있다. 이러한 경우에, NK 세포는 세포 표면 상의 HER2에 결합된 트라스투주맙 항체에 여전히 결합해, 세포 사멸을 매개할 수 있다.
본 발명은 무엇보다도 HER2+ 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 자연살해세포 (NK 세포) 집단과 인간 HER2를 표적으로 하는 항체를 투여하는 단계를 포함하고, NK 세포가 환자에 대해 동종이계이고, KIR-B 일배체형 (KIR-B haplotype)이며, CD16 158V 다형성에 대해 동형접합성 (homozygous for a CD16 158V polymorphism)인, HER2+ 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 암은 유방암, 위암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 암은 유방암이다.
일부 구현예에서, 암은 위암이다.
일부 구현예에서, 암은 난소암이다.
일부 구현예에서, 환자는 항-HER2 항체를 이용한 치료 후 재발한 적 있다.
일부 구현예에서, 환자는 자가 줄기 세포 이식 또는 키메라 항원 수용체 T-세포 요법 (CAR-T)을 이용한 치료 후 질환 진행을 겪은 적 있다.
일부 구현예에서, 환자에 NK 세포를 1 x 108 내지 1 x 1010개 투여한다.
일부 구현예에서, 환자에 NK 세포를 1 x 109 내지 8 x 109개 투여한다.
일부 구현예에서, 환자에 NK 세포를 4 x 108, 1 x 109, 4 x 109 또는 8 x 109개 투여한다.
일부 구현예에서, 항체는 트라스투주맙이다.
일부 구현예에서, 환자는 치료하기 전 림프구 제거 화학요법을 받는다.
일부 구현예에서, 림프구 제거 화학요법은 비-골수파괴성 화학요법이다.
일부 구현예에서, 림프구 제거 화학요법은 사이클로포스파미드 및 플루다라빈 중 하나 이상을 이용한 치료를 포함한다.
일부 구현예에서, 림프구 제거 화학요법은 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 이용한 치료를 포함한다.
일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 100-500 ㎎/㎡/day로 투여된다.
일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 250 ㎎/㎡/day로 투여된다.
일부 구현예에서, 사이클로포스파미드는 500 ㎎/㎡/day로 투여된다.
일부 구현예에서, 플루다라빈은 10-50 ㎎/㎡/day로 투여된다.
일부 구현예에서, 플루다라빈은 30 ㎎/㎡/day로 투여된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 IL-2의 투여를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, IL-2는 환자에게 1 x 106 IU/㎡로 투여된다.
일부 구현예에서, IL-2는 환자에게 6,000,000 IU로 투여된다.
일부 구현예에서, IL-2 투여는 NK 세포 투여 시점으로부터 1-4시간 이내에 이루어진다.
일부 구현예에서, NK 세포 및 인간 HER2를 표적으로 하는 항체의 투여는 매주 이루어진다.
일부 구현예에서, NK 세포 및 인간 HER2를 표적으로 하는 항체는 4-8주 동안 매주 투여한다.
일부 구현예에서, NK 세포 투여는 매주 이루어지고, 인간 HER2를 표적으로 하는 항체의 투여는 격주로 이루어진다.
일부 구현예에서, NK 세포는 유전자 변형되지 않는다.
일부 구현예에서, NK 세포 중 적어도 70%가 CD56+ 및 CD16+이다.
일부 구현예에서, NK 세포 중 적어도 85%가 CD56+ 및 CD3-이다.
일부 구현예에서, NK 세포 중 1% 이하가 CD3+이고, NK 세포 중 1% 이하가 CD19+이고, NK 세포 중 1% 이하가 CD14+이다.
일부 구현예에서, NK 세포의 각 투여는 NK 세포 1 x 109 내지 5 x 109개를 투여하는 것이다.
일부 구현예에서, NK 세포를 1차 투여하기 전 HER2 표적 항체의 용량이 환자에 투여된다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포는 증폭된 제대혈 자연살해세포이다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 CD16+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 NKG2D+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 NKp46+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 NKp30+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 DNAM-1+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 NKp44+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 20% 미만, 예를 들어 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하 또는 0%로 CD3+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 20% 미만, 예를 들어 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하 또는 0%로 CD14+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 20% 미만, 예를 들어 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하 또는 0%로 CD19+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 20% 미만, 예를 들어 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하 또는 0%로 CD38+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 자연살해세포는 CD16 전이유전자를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 자연살해세포는 외인성 CD16 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포는 유전자 조작되지 않는다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포들은 동일한 제대혈 공여체로부터 유래한다.
일부 구현예에서, NK 세포 집단은 증폭된 자연살해세포를 적어도 1억개 포함하고, 예를 들어, 2억, 2억5천만, 3억, 4억, 5억, 6억, 7억, 7억5천만, 8억, 9억, 10억, 20억, 30억, 40억, 50억, 60억, 70억, 80억, 90억, 100억, 150억, 200억, 250억, 500억, 750억, 800억, 900억, 1000억, 2000억, 2500억, 3000억, 4000억, 5000억, 6000억, 7000억, 8000억, 9000억, 1조, 2조, 3조, 4조, 5조, 6조, 7조, 8조, 9조 또는 10조개 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 집단은 (a) 제대혈로부터 자연살해세포를 포함하는 시드 세포 (seed cell)를 수득하는 단계; (b) 시드 세포에서 CD3+ 세포를 고갈 처리하는 단계; (c) 고갈 처리된 시드 세포를 막 결합형 IL-21, TNFα 돌연변이 및 4-1BBL 유전자를 발현하도록 조작된 제1의 복수의 Hut78 세포와 함께 배양함으로써 자연살해세포를 증폭시켜 증폭된 자연살해세포를 생산하고, 이로써 증폭된 자연살해세포의 집단을 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다.
일부 구현예에서, NK 세포 집단은 (a) 제대혈로부터 자연살해세포를 포함하는 시드 세포를 수득하는 단계; (b) 시드 세포에서 CD3+ 세포를 고갈 처리하는 단계; (c) 고갈 처리된 시드 세포를 막 결합형 IL-21, TNFα 돌연변이 및 4-1BBL 유전자를 발현하도록 조작된 제1의 복수의 Hut78 세포와 함께 배양함으로써 자연살해세포를 증폭시켜 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단을 생산하는 단계; 및 (d) 막 결합형 IL-21, TNFα 돌연변이 및 4-1BBL 유전자를 발현하도록 조작된 제2의 복수의 Hut78 세포와 함께 배양함으로써 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단을 증폭시켜, 증폭된 자연살해세포를 생산하고; 이로써 증폭된 자연살해세포의 집단을 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다.
일부 구현예에서, NK 세포의 집단은 단계 (c) 이후에, (i) 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단을 복수의 용기에서 냉동하는 단계; 및 (ii) 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단의 분액이 수용된 용기를 해동하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 생산되며, 여기서 단계 (d)에서 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단의 증폭은 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단의 분액을 증폭시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 제대혈은 KIR-B 일배체형이고 CD16 158V 다형성에 대해 동형접합성인 공여체로부터 유래한다.
일부 구현예에서, NK 세포의 집단은 제대혈로부터 자연살해세포를 적어도 10,000배, 예를 들어, 15,000배, 20,000배, 25,000배, 30,000배, 35,000배, 40,000배, 45,000배, 50,000배, 55,000배, 60,000배, 65,000배 또는 70,000배 증폭시키는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단은 증폭 후 농화 또는 분류하지 않는다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단 내 CD16을 발현하는 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단 내 NKG2D를 발현하는 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단 내 NKp30을 발현하는 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단 내 NKp44를 발현하는 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단 내 NKp46을 발현하는 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
일부 구현예에서, 증폭된 자연살해세포의 집단 내 DNAM-1을 발현하는 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
달리 정의되지 않은 한, 본 발명에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상적인 당업자가 공통적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본 발명에서 이용하기 위한 방법 및 재료들이 본원에 기술되며; 당해 기술 분야에서 공지된 다른 적절한 방법 및 재료 역시 이용할 수 있다. 재료, 방법 및 예들은 예시한 것일 뿐, 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리 및 기타 참조문헌은 그 전체가 원용에 의해 본원에 통합된다. 상충하는 경우 정의를 비롯한 본 명세서를 우선으로 할 것이다.
하기 상세한 설명 및 도면으로부터, 그리고 청구항으로부터, 본 발명의 다른 특징 및 이점들이 명확해질 것이다.
원용에 의한 통합
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원들은, 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 통합되는 것으로 의도하는 바와 동일한 수준으로 원용에 의해 본원에 통합된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구항에서 특이성을 들어 기술된다. 특허 또는 출원 파일에는 유색으로 작성된 하나 이상의 도면이 수록되어 있다. 유색 도면(들)이 수록된 본 특허 또는 특허 출원 공개 공보의 사본은 요구서와 필요한 수수료를 지불할 경우 사무청에서 제공받을 수 있을 것이다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 적용된 예시적인 구현예들이 기술된 하기 상세한 설명과 하기 첨부된 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다:
도 1은 NK 세포 증폭 및 자극 방법에 대한 예시적인 구현예를 도시한 것이다.
도 2는 전임상 실험에서 제대혈-유래 NK 세포 (CB-NK)가 말초혈-유래 NK 세포 (PB-NK)에 비해 배양 증폭력이 약 10배 높음을 나타낸 것이다.
도 3은 제대혈-유래 의약품에서 종양-인게이징 NK 활성화 면역 수용체의 발현이 말초혈 기원과 비교해 더 높고 일정함을 보여준다.
도 4는 증폭 및 자극된 NK 세포 집단의 표현형을 나타낸 것이다.
도 5는 제대혈-유래 NK 세포 증폭 집단의 일 예로서 AB-101 의약품을 제조하는 핵심적인 단계들을 나타낸 것이다.
도 6은 AB-101의 순도 (n=9)를 나타낸 것이다.
도 7은 GMP 조건에서 제조한 CD3-고갈 세포, MCB 및 DP의 순도를 나타낸 것이다.
도 8은 GMP 조건에서 제조한 CD3-고갈 세포, MCB 및 DP에서의 NK 세포 수용체의 발현을 나타낸 것이다.
도 9는 유세포 측정에 의한 NK 순도 (CD56+/CD3-)를 나타낸 것이다.
도 10은 제대혈 공여체 3종으로부터 유래한 증폭된 NK 세포의 CD38+ 발현을 나타낸 것이다.
도 11은 제대혈 공여체 3종으로부터 유래한 CD38+ NK 세포의 CD38+ 평균 형광 강도를 나타낸 것이다.
도 12는 출발 물질로서 NK 세포 공급원에서의 차별적인 표면 단백질 발현을 AB-101 세포와 비교하여 나타낸 것이다.
도 13은 AB-101과 항-HER2 단일클론 항체 트라스투주맙의 조합이 HER2+ 세포주 NCI-N87에 대해 실질적인 세포독성 활성을 나타냄을 보여주는 것이다. 작동자:표적 비율 (E:T 1:1).
도 14는 AB-101 + 트라스투주맙의 시험관내 특징을 나타낸 것이다.
도 15는 AB-101 + 트라스투주맙의 생체내 특징을 나타낸 것이다.
도 16은 AB-101 + 트라스투주맙의 생체내 특징을 나타낸 것이다.
본 발명은 특히 자연살해 (NK) 세포, 예를 들어, 증폭 및 자극된 NK 세포, NK 세포 생산 방법, NK 세포를 포함하는 약학적 조성물, 및 예를 들어 암을 앓고 있는 환자를 NK 세포를 이용해 치료하는 방법을 제공한다.
I. 자연살해세포의 증폭 및 자극
일부 구현예에서, 자연살해세포는, 예를 들어, 지지 세포 (feeder cell)를 이용한 배양 및 자극에 의해, 증폭 및 자극한다.
NK 세포는, 예를 들어, US 2020/0108096 또는 WO 2020/101361에 기술된 바와 같이, 증폭 및 자극할 수 있으며, 이들 문헌 둘다 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 통합된다. 간략하게는, 공급원 세포 (source cell)는, US 2020/0108096에 기술된 바와 같이, 4-1BBL, 막 결합형 IL-21 및 돌연변이 TNFα를 발현하도록 조작된, 변형된 HuT-78 (ATCC® TIB-161™) 세포 상에서 배양할 수 있다.
적절한 NK 세포는 또한 본원에 기술된 바와 같이 증폭 및 자극할 수 있다.
일부 구현예에서, NK 세포는, (a) NK 세포, 예를 들어, NK 세포를 포함하는 조성물, 예를 들어, CD3(-) 고갈된 세포를 제공하는 단계; 및 (b) 지지 세포 및/또는 자극 인자를 포함하는 배지에서 배양하여, 증폭 및 자극된 NK 세포의 집단을 생산하는 단계를 포함하는 방법에 의해, 증폭 및 자극한다.
A. 자연살해세포 공급원
일부 구현예에서, NK 세포 공급원은 말초혈, 말초혈 림프구 (PBL), 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 골수, 제대혈 (umbilical cord blood 또는 cord blood), 단리된 NK 세포, 유도된 만능성 줄기 세포로부터 유래한 NK 세포, 배아 줄기 세포로부터 유래한 NK 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원은 제대혈 단일 유닛 (single unit)이다.
일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛은 전체 유핵 세포 (total nucleated cell)를 1 x 107 또는 약 1 x 107 내지 1 x 109 또는 약 1 x 109개 포함한다. 일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛은 전체 유핵 세포를 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 1.5 x 108 또는 약 1.5 x 108개 포함한다. 일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛은 전체 유핵 세포를 1 x 108개 포함한다. 일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛은 전체 유핵 세포를 약 1 x 108개 포함한다. 일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛은 전체 유핵 세포를 1 x 109개 포함한다. 일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛은 전체 유핵 세포를 약 1 x 109개 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 CD16+ 세포를 약 20% 내지 약 80%로 포함한다. 일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 CD16+ 세포를 20% 또는 약 20% 내지 80% 또는 약 80%, 약 20% 내지 70% 또는 약 70%, 약 20% 내지 60% 또는 약 60%, 약 20% 내지 50% 또는 약 50%, 약 20% 내지 40% 또는 약 40%, 약 20% 내지 30% 또는 약 30%, 약 30% 내지 80% 또는 약 80%, 약 30% 내지 70% 또는 약 70%, 약 30% 내지 60% 또는 약 60%, 약 30% 내지 50% 또는 약 50%, 약 30% 내지 40% 또는 약 40%, 약 40% 내지 80% 또는 약 80%, 약 40% 내지 70% 또는 약 70%, 약 40% 내지 60% 또는 약 60%, 약 40% 내지 50% 또는 약 50%, 약 50% 내지 80% 또는 약 80%, 약 50% 내지 70% 또는 약 70%, 약 50% 내지 60% 또는 약 60%, 약 60% 내지 80% 또는 약 80%, 약 60% 내지 70% 또는 약 70% 또는 약 70% 내지 80% 또는 약 80%로 포함한다. 일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 CD16+ 세포를 80% 이하로 포함한다. 대안적으로, 일부 NK 세포 공급원은 CD16+ 세포를 80%보다 높은 농도로 포함할 수도 있다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 MLG2A+ 세포를 40% 이하, 예를 들어 30% 이하, 예를 들어 20% 이하, 예를 들어 10% 이하, 예를 들어 5% 이하로 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 NKG2C+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 NKG2D+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 NKp46+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 NKp30+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 DNAM-1+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 NKp44+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 CD25+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 CD62L+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 CD69+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 CXCR3+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 유닛은 40% 이하, 예를 들어, 30% 이하, 예를 들어, 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 예를 들어, 5% 이하로 CD57+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, NK 공급원 내 NK 세포는 KIR 수용체 계열의 KIR B 대립유전자를 포함한다. 예를 들어, Hsu et al., "The Killer Cell Immunoglobulin-Like Receptor (KIR) Genomic Region: Gene-Order, Haplotypes and Allelic Polymorphism", Immunological Review 190:40-52 (2002); 및 Pyo et al., "Different Patterns of Evolution in the Centromeric and Telomeric Regions of Group A and B Haplotypes of the Human Killer Cell Ig-like Receptor Locus", PLoS One 5:e15115 (2010)를 참조한다.
일부 구현예에서, NK 공급원 내 NK 세포는 CD16의 158 V/V 변이체 (즉, 동형접합성 CD16 15V 다형성)를 포함한다. 예를 들어, Koene et al., "FcγRIIIa-158V/F Polymorphism Influences the Binding of IgG by Natural Killer Cell FcgammaRIIIa, Independently of the FcgammaRIIIa-48L/R/H Phenotype", Blood 90:1109-14 (1997)를 참조한다.
일부 구현예에서, 세포 공급원 내 NK 세포는 KIR 수용체 계열의 KIR B 대립유전자 및 CD16의 158 V/V 변이체를 둘다 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 공급원 내 NK 세포는 유전자 조작되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포 공급원 내 NK 세포는 CD16 전이유전자 (transgene)를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 세포 공급원 내 NK 세포는 외인성 CD16 단백질을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원은 CD3(+) 고갈된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 NK 세포 공급원에서 CD3(+) 세포를 고갈 처리하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, NK 세포 공급원에서 CD3(+) 세포의 고갈 처리는 NK 세포 공급원을 CD3 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 OKT3, UCHT1 및 HIT3a, 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD3 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 OKT3 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비드, 예를 들어 자석 비드에 부착된다. 일부 구현예에서, 조성물에서 CD3(+) 세포의 고갈은 조성물을 비드에 부착된 CD3 표적 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시켜 비드-결합된 CD3(+) 세포를 조성물에서 제거하는 것을 포함한다. 조성물은 면역자기 선별 (immunomagnetic selection)에 의해, 예를 들어 CliniMACS T 세포 고갈 세트 (LS Depletion set (162-01) Miltenyi Biotec)를 이용해 CD3를 고갈 처리할 수 있다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원은 예를 들어 CD56 발현에 대한 게이팅 (gating)에 의해 CD56+ 농화된다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원은 예를 들어 CD56+CD3- 발현 세포를 선별함으로써 CD56+ 농화 및 CD3(+) 고갈이 이루어진다.
일부 구현예에서, NK 세포 공급원은 KIR 수용체 계열의 KIR B 대립유전자 및 CD16의 158 V/V 변이체를 둘다 포함하고, 예를 들어 CD56+CD3- 발현 세포를 선별함으로써 CD56+ 농화 및 CD3(+) 고갈이 달성된다.
B. 지지 세포
본 발명은 NK 세포를 증폭시키기 위한 지지 세포를 개시한다. 이들 지지 세포는 유익하게는 NK 세포를 본원에 기술된 약학적 조성물을 제조하기에 적합한 개수로 증폭시킬 수 있게 한다. 일부 경우에, 지지 세포는 CD16의 발현 감소 없이, 흔히 다른 타입의 지지 세포 상에서 세포 증폭을 수반하여 또는 다른 방법을 이용해 NK 세포의 증폭을 허용한다. 일부 경우에, 지지 세포는 냉동/해동 사이클 후 NK 세포가 더 높은 비율로 생존가능한 상태로 남아있도록, 또는 세포가 동결 중에 더 장기간 생존가능한 상태로 남아있도록, 증폭된 NK 세포를 냉동에 더 잘 견딜 수 있게 만든다. 일부 경우에, 지지 세포는 NK 세포가 ADCC 등의 세포독성을 높은 수준으로 유지하고, 생존을 연장하고, 존속성을 높이고, CD16을 높은 수준으로 강화 또는 유지할 수 있도록 허용한다. 일부 경우에, 지지 세포는 탈진 (exhaustion) 또는 노화를 유의한 수준으로 유발하지 않으면서 NK 세포를 증폭할 수 있도록 허용한다.
지지 세포는 NK 세포를 자극하고, 이 세포가 더 빨리 증폭하도록, 예를 들어, 기질, 성장인자 및/또는 사이토카인을 공급함으로써 돕기 위해 이용할 수 있다.
NK 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 엡스타인-바 바이러스-형질전환된 B-림프모구 세포 (예를 들어, EBV-LCL), 골수성 백혈병 세포 (예를 들어, K562) 및 CD4(+) T 세포 (예를 들어, HuT), 및 이들의 파생물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는, 다양한 유형의 지지 세포를 이용해 자극할 수 있다.
일부 구현예에서, 지지 세포는 예를 들어, γ-방사선 조사 또는 미토마이신-c 처리에 의해 불활성화된다.
본원에 기술된 방법에 이용하기 적합한 지지 세포는, 예를 들어, US 2020/0108096에 기술되어 있으며, 이 문헌은 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 통합된다.
일부 구현예에서, 지지 세포(들)는 불활성화된 CD4(+) T 세포(들)이다. 일부 구현예에서, 불활성화된 CD4(+) T 세포(들)는 HuT-78 세포 (ATCC® TIB-161™) 또는 이의 변이체 또는 파생물이다. 일부 구현예에서, HuT-78 유도체는 H9 (ATCC® HTB-176™)이다.
일부 구현예에서, 불활성화된 CD4(+) T 세포(들)는 OX40L을 발현한다. 일부 구현예에서, 불활성화된 CD4(+) T 세포(들)는 OX40L (서열번호 4) 또는 이의 변이체를 발현하는 HuT-78 세포 또는 이의 변이체 또는 파생물이다.
일부 구현예에서, 지지 세포는 4-1BBL (UniProtKB P41273, 서열번호 1), 막-결합형 IL-21 (서열번호 2) 및 돌연변이 TNFα (서열번호 3)("eHut-78 세포"), 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 하나 이상을 발현하도록 조작된 HuT-78 세포이다.
일부 구현예에서, 불활성화된 CD4(+) T 세포(들)는 HuT-78 (ATCC® TIB-161™) 세포 또는 OX40L의 동원체 (ortholog) 또는 이의 변이체를 발현하는 변이체 또는 파생물이다. 일부 구현예에서, 지지 세포는 4-1BBL 동원체 또는 이의 변이체, 막-결합형 IL-21 동원체 또는 이의 변이체, 및 돌연변이 TNFα 동원체 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 하나 이상을 발현하도록 조작된 HuT-78 세포이다.
일부 구현예에서, 지지 세포는 OX40L (서열번호 4)을 발현하고; 4-1BBL (서열번호 1), 막-결합형 IL-21 (서열번호 2) 및 돌연변이 TNFα (서열번호 3)("eHut-78 세포") 또는 이들의 변이체 또는 파생물을 발현하도록 조작된, HuT-78 세포(들)이다.
일부 구현예에서, 지지 세포는 예를 들어 실시예 2에 기술된 바와 같이, NK 세포와 함께 배양하기 전, 예를 들어 냉동 원액으로부터 증폭한다.
C. 자극 인자
NK 세포는 또한 지지 세포와 더불어 또는 지지 세포 대신, 지지 세포 이외의 다른 하나 이상의 자극 인자, 예를 들어 신호전달 인자를 이용해 자극할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 인자, 예를 들어, 신호전달 인자는 본원에 기술된 바와 같이 배양 배지의 구성성분이다. 일부 구현예에서, 자극 인자, 예를 들어, 신호전달 인자는 본원에 기술된 바와 같이 배양 배지에 대한 보충제이다.
일부 구현예에서, 자극 인자(들)는 사이토카인(들)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인(들)은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-27, IFN-α, IFN-β 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2이다.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2와 IL-15의 조합이다.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IL-15 및 IL-18의 조합이다.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IL-18 및 IL-21의 조합이다.
D. 배양
NK 세포는 NK 세포 공급원을 지지 세포 및/또는 기타 자극 인자와 공-배양함으로써 증폭 및 자극할 수 있다. 적합한 NK 세포 공급원, 지지 세포 및 자극 인자는 본원에 기술되어 있다.
일부 경우에, 수득한 증폭된 자연살해세포의 집단은 증폭 후 농화하거나 및/또는 분류한다. 일부 경우에, 수득한 증폭된 자연살해세포의 집단은 증폭 후 농화 및/또는 분류하지 않는다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 다양한 배양 조성물을 포함하는, 예를 들어 NK 세포를 포함하는, 조성물을 기술한다. 예를 들어, KIR-B 일배체형 및 CD16 158V 다형성에 대한 동형접합체를 포함하는 증폭된 제대혈-유래 자연살해세포의 집단과 복수의 조작된 HuT78 세포를 포함하는 조성물을 기술한다.
또한, 본 발명은 수득한 증폭된 자연살해세포의 집단이 수용된 용기 (vessel), 예를 들어 바이얼, 크라이오백 등을 기술한다. 일부 경우에, 복수개의 용기는 수득한 증폭된 자연살해세포의 집단의 일부를 포함하고, 용기를 적어도 10개, 예를 들어, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1100개 또는 1200개 포함한다.
1. 배양 배지
본 발명은 NK 세포를 증폭하기 위한 배양 배지를 개시한다. 이들 배양 배지는 유익하게는 NK 세포가 본원에 기술된 약학적 조성물을 제조하기에 적합한 세포수로 증폭 가능하게 한다. 일부 경우에, 배양 배지는 흔히 다른 헬퍼 세포 상에서 또는 다른 배지 중에 세포 증폭을 수반하여, CD16 발현의 저하 없이, NK 세포를 증폭시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 기본 배양 배지 (basal culture medium)이며, 선택적으로 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 추가적인 구성성분이 첨가된 기본 배양 배지이다.
일부 구현예에서, 배양 배지, 예를 들어, 기본 배양 배지는 무-혈청 배양 배지이다. 일부 구현예에서, 배양 배지, 예를 들어, 기본 배양 배지는 인간 혈장 및/또는 혈청이 첨가된 무혈청 배양 배지이다.
적절한 기본 배양 배지로는 DMEM, RPMI 1640, MEM, DMEM/F12, SCGM (CellGenix®, 20802-0500 또는 20806-0500), LGM-3™ (Lonza, CC-3211), TexMACS™ (Miltenyi Biotec, 130-097-196), ALyS™ 505NK-AC (Cell Science and Technology Institute, Inc., 01600P02), ALyS™ 505NK-EX (Cell Science and Technology Institute, Inc., 01400P10), CTS™ AIM-V™ SFM (ThermoFisher Scientific, A3830801), CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher Scientific, A1048501, ABS-001, StemXxVivo 및 이들의 조합 등이 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
배양 배지는 추가적인 구성성분들을 포함할 수 있거나, 또는 성장인자, 신호전달 인자, 영양분, 항원 결합제 등과 같은 추가적인 구성성분이 첨가될 수 있다. 배양 배지에 대한 첨가는, 배지를 배양 용기에 투입하기 전에, 투입과 동시에 또는 투입한 후, 각각의 추가적인 구성성분 또는 구성성분들을 배양 용기에 투입함으로써, 이루어질 수 있다. 추가적인 구성성분 또는 구성성분들은 함께 또는 분리하여 첨가될 수 있다. 분리하여 첨가하는 경우, 추가적인 구성성분들을 동시에 첨가해야 하는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 혈장, 예를 들어 인간 혈장을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지에 혈장, 예를 들어 인간 혈장을 첨가한다. 일부 구현예에서, 혈장, 예를 들어, 인간 혈장은 항-응고제, 예를 들어, 트리소듐 사이트레이트를 함유한다.
일부 구현예에서, 배지는 혈장, 예를 들어, 인간 혈장을 0.5% 또는 약 0.5 % 내지 10% 또는 약 10 % v/v로 포함하거나, 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배지는 0.5% 또는 약 0.5% 내지 9% 또는 약 9%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 8% 또는 약 8%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 7% 또는 약 7%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 6% 또는 약 6%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 5% 또는 약 5%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 4% 또는 약 4%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 3% 또는 약 3%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 2% 또는 약 2%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 1% 또는 약 1%, 1% 또는 약 1% 내지 10% 또는 약 10%, 1% 또는 약 1% 내지 9% 또는 약 9%, 1% 또는 약 1% 내지 8% 또는 약 8%, 1% 또는 약 1% 내지 7% 또는 약 7%, 1% 또는 약 1% 내지 6% 또는 약 6%, 1% 또는 약 1% 내지 5% 또는 약 5%, 1% 또는 약 1% 내지 4% 또는 약 4%, 1% 또는 약 1% 내지 3% 또는 약 3%, 1% 또는 약 1% 내지 2% 또는 약 2%, 2% 또는 약 2% 내지 10% 또는 약 10%, 2% 또는 약 2% 내지 9% 또는 약 9%, 2% 또는 약 2% 내지 8% 또는 약 8%, 2% 또는 약 2% 내지 7% 또는 약 7%, 2% 또는 약 2% 내지 6% 또는 약 6%, 2% 또는 약 2% 내지 5% 또는 약 5%, 2% 또는 약 2% 내지 4% 또는 약 4%, 2% 또는 약 2% 내지 3% 또는 약 3%, 3% 또는 약 3% 내지 10% 또는 약 10%, 3% 또는 약 3% 내지 9% 또는 약 9%, 3% 또는 약 3% 내지 8% 또는 약 8%, 3% 또는 약 3% 내지 7% 또는 약 7%, 3% 또는 약 3% 내지 6% 또는 약 6%, 3% 또는 약 3% 내지 5% 또는 약 5%, 3% 또는 약 3% 내지 4% 또는 약 4%, 4% 또는 약 4% 내지 10% 또는 약 10%, 4% 또는 약 4% 내지 9% 또는 약 9%, 4% 또는 약 4% 내지 8% 또는 약 8%, 4% 또는 약 4% 내지 7% 또는 약 7%, 4% 또는 약 4% 내지 6% 또는 약 6%, 4% 또는 약 4% 내지 5% 또는 약 5%, 5% 또는 약 5% 내지 10% 또는 약 10%, 5% 또는 약 5% 내지 9% 또는 약 9%, 4% 또는 약 4% 내지 8% 또는 약 8%, 5% 또는 약 5% 내지 7% 또는 약 7%, 5% 또는 약 5% 내지 6% 또는 약 6%, 6% 또는 약 6% 내지 10% 또는 약 10%, 6% 또는 약 6% 내지 9% 또는 약 9%, 6% 또는 약 6% 내지 8% 또는 약 8%, 6% 또는 약 6% 내지 7% 또는 약 7%, 7% 또는 약 7% 내지 10% 또는 약 10%, 7% 또는 약 7% 내지 9% 또는 약 9%, 7% 또는 약 7% 내지 8% 또는 약 8%, 8% 또는 약 8% 내지 10% 또는 약 10%, 8% 또는 약 8% 내지 9% 또는 약 9%, 또는 9% 또는 약 9% 내지 10% 또는 약 10% v/v로 혈장, 예를 들어, 인간 혈장으로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 인간 혈장을 0.8% 내지 1.2% v/v로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 인간 혈장을 1.0 % v/v로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 인간 혈장을 약 1.0 % v/v로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 혈청, 예를 들어, 인간 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 혈청, 예를 들어, 인간 혈청으로 보충된다. 일부 구현예에서, 혈청은 불활성화되고, 예를 들어, 열에 의해 불활성화된다. 일부 구현예에서, 혈청은 여과하고, 예를 들어, 멸균-여과 (sterile-filtered) 한다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 글루타민을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 글루타민으로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 글루타민을 2.0 또는 약 2.0 내지 6.0 또는 약 6.0 mM로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 글루타민을 2.0 또는 약 2.0 내지 5.5 또는 약 5.5, 2.0 또는 약 2.0 내지 5.0 또는 약 5.0, 2.0 또는 약 2.0 내지 4.5 또는 약 4.5, 2.0 또는 약 2.0 내지 4.0 또는 약 4.0, 2.0 또는 약 2.0 내지 3.5 또는 약 3.5, 2.0 또는 약 2.0 내지 3.0 또는 약 3.0, 2.0 또는 약 2.0 내지 2.5 또는 약 2.5, 2.5 또는 약 2.5 내지 6.0 또는 약 6.0, 2.5 또는 약 2.5 내지 5.5 또는 약 5.5, 2.5 또는 약 2.5 내지 5.0 또는 약 5.0, 2.5 또는 약 2.5 내지 4.5 또는 약 4.5, 2.5 또는 약 2.5 내지 4.0 또는 약 4.0, 2.5 또는 약 2.5 내지 3.5 또는 약 3.5, 2.5 또는 약 2.5 내지 3.0 또는 약 3.0, 3.0 또는 약 3.0 내지 6.0 또는 약 6.0, 3.0 또는 약 3.0 내지 5.5 또는 약 5.5, 3.0 또는 약 3.0 내지 5.0 또는 약 5.0, 3.0 또는 약 3.0 내지 4.5 또는 약 4.5, 3.0 또는 약 3.0 내지 4.0 또는 약 4.0, 3.0 또는 약 3.0 내지 3.5 또는 약 3.5, 3.5 또는 약 3.5 내지 6.0 또는 약 6.0, 3.5 또는 약 3.5 내지 5.5 또는 약 5.5, 3.5 또는 약 3.5 내지 5.0 또는 약 5.0, 3.5 또는 약 3.5 내지 4.5 또는 약 4.5, 3.5 또는 약 3.5 내지 4.0 또는 약 4.0, 4.0 또는 약 4.0 내지 6.0 또는 약 6.0, 4.0 또는 약 4.0 내지 5.5 또는 약 5.5, 4.0 또는 약 4.0 내지 5.0 또는 약 5.0, 4.0 또는 약 4.0 내지 4.5 또는 약 4.5, 4.5 또는 약 4.5 내지 6.0 또는 약 6.0, 4.5 또는 약 4.5 내지 5.5 또는 약 5.5, 4.5 또는 약 4.5 내지 5.0 또는 약 5.0, 5.0 또는 약 5.0 내지 6.0 또는 약 6.0, 5.0 또는 약 5.0 내지 5.5 또는 약 5.5, 또는 5.5 또는 약 5.5 내지 6.0 또는 약 6.0 mM로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 글루타민을 3.2 mM 내지 4.8 mM로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 글루타민을 4.0 mM로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 글루타민을 약 4.0 mM로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 하나 이상의 사이토카인으로 보충된다.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 IL-2를 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 IL-2를 150 또는 약 150 내지 2,500 또는 약 2,500 IU/㎖로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 IL-2를 200 또는 약 200 내지 2,250 또는 약 2,250, 200 또는 약 200 내지 2,000 또는 약 2,000, 200 또는 약 200 내지 1,750 또는 약 1,750, 200 또는 약 200 내지 1,500 또는 약 1,500, 200 또는 약 200 내지 1,250 또는 약 1,250, 200 또는 약 200 내지 1,000 또는 약 1,000, 200 또는 약 200 내지 750 또는 약 750, 200 또는 약 200 내지 500 또는 약 500, 200 또는 약 200 내지 250 또는 약 250, 250 또는 약 250 내지 2,500 내지 약 2,500, 250 또는 약 250 내지 2,250 또는 약 2,250, 250 또는 약 250 내지 2,000 또는 약 2,000, 250 또는 약 250 내지 1,750 또는 약 1,750, 250 또는 약 250 내지 1,500 또는 약 1,500, 250 또는 약 250 내지 1,250 또는 약 1,250, 250 또는 약 250 내지 1,000 또는 약 1,000, 250 또는 약 250 내지 750 또는 약 750, 250 또는 약 250 내지 500 또는 약 500, 500 또는 약 500 내지 2,500 내지 약 2,500, 500 또는 약 500 내지 2,250 또는 약 2,250, 500 또는 약 500 내지 2,000 또는 약 2,000, 500 또는 약 500 내지 1,750 또는 약 1,750, 500 또는 약 500 내지 1,500 또는 약 1,500, 500 또는 약 500 내지 1,250 또는 약 1,250, 500 또는 약 500 내지 1,000 또는 약 1,000, 500 또는 약 500 내지 750 또는 약 750, 750 또는 약 750 내지 2,250 또는 약 2,250, 750 또는 약 750 내지 2,000 또는 약 2,000, 750 또는 약 750 내지 1,750 또는 약 1,750, 750 또는 약 750 내지 1,500 또는 약 1,500, 750 또는 약 750 내지 1,250 또는 약 1,250, 750 또는 약 750 내지 1,000 또는 약 1,000, 1,000 또는 약 1,000 내지 2,500 내지 약 2,500, 1,000 또는 약 1,000 내지 2,250 또는 약 2,250, 1,000 또는 약 1,000 내지 2,000 또는 약 2,000, 1,000 또는 약 1,000 내지 1,750 또는 약 1,750, 1,000 또는 약 1,000 내지 1,500 또는 약 1,500, 1,000 또는 약 1,000 내지 1,250 또는 약 1,250, 1,250 또는 약 1,250 내지 2,500 내지 약 2,500, 1,250 또는 약 1,250 내지 2,250 또는 약 2,250, 1,250 또는 약 1,250 내지 2,000 또는 약 2,000, 1,250 또는 약 1,250 내지 1,750 또는 약 1,750, 1,250 또는 약 1,250 내지 1,500 또는 약 1,500, 1,500 또는 약 1,500 내지 2,500 내지 약 2,500, 1,500 또는 약 1,500 내지 2,250 또는 약 2,250, 1,500 또는 약 1,500 내지 2,000 또는 약 2,000, 1,500 또는 약 1,500 내지 1,750 또는 약 1,750, 1,750 또는 약 1,750 내지 2,500 내지 약 2,500, 1,750 또는 약 1,750 내지 2,250 또는 약 2,250, 1,750 또는 약 1,750 내지 2,000 또는 약 2,000, 2,000 또는 약 2,000 내지 2,500 내지 약 2,500, 2,000 또는 약 2,000 내지 2,250 또는 약 2,250, 또는 2,250 또는 약 2,250 내지 2,500 또는 약 2,500 IU/㎖로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 IL-2를 64 ㎍/ℓ 내지 96 ㎍/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 IL-2를 80 ㎍/ℓ (대략 1,333 IU/㎖)로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 IL-2를 약 80 ㎍/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 IL-2 및 IL-15의 조합을 포함하거나 및/또는 이로 보충된다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 IL-2, IL-15 및 IL-18의 조합을 포함하거나 및/또는 이로 보충된다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 IL-2, IL-18 및 IL-21의 조합을 포함하거나 및/또는 이로 보충된다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 글루코스를 포함하거나 및/또는 글루코스로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 글루코스를 0.5 또는 약 0.5 내지 3.5 g/ℓ 또는 약 3.5 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 0.5 또는 약 0.5 내지 3.0 또는 약 3.0, 0.5 또는 약 0.5 내지 2.5 또는 약 2.5, 0.5 또는 약 0.5 내지 2.0 또는 약 2.0, 0.5 또는 약 0.5 내지 1.5 또는 약 1.5, 0.5 또는 약 0.5 내지 1.0 또는 약 1.0, 1.0 또는 약 1.0 내지 3.0 또는 약 3.0, 1.0 또는 약 1.0 내지 2.5 또는 약 2.5, 1.0 또는 약 1.0 내지 2.0 또는 약 2.0, 1.0 또는 약 1.0 내지 1.5 또는 약 1.5, 1.5 또는 약 1.5 내지 3.0 또는 약 3.0, 1.5 또는 약 1.5 내지 2.5 또는 약 2.5, 1.5 또는 약 1.5 내지 2.0 또는 약 2.0, 2.0 또는 약 2.0 내지 3.0 또는 약 3.0, 2.0 또는 약 2.0 내지 2.5 또는 약 2.5, 또는 2.5 또는 약 2.5 내지 3.0 또는 약 3.0 g/ℓ로 글루코스를 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 글루코스를 1.6 내지 2.4 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 글루코스를 2.0 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 글루코스를 약 2.0 g/ℓ로 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 소듐 피루베이트를 포함하거나 및/또는 소듐 피루베이트로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 소듐 피루베이트를 0.1 또는 약 0.1 내지 2.0 또는 약 2.0 mM로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 0.1 또는 약 0.1 내지 1.8 또는 약 1.8, 0.1 또는 약 0.1 내지 1.6 또는 약 1.6, 0.1 또는 약 0.1 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.1 또는 약 0.1 내지 1.2 또는 약 1.2, 0.1 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 약 1.0, 0.1 또는 약 0.1 내지 0.8 또는 약 0.8, 0.1 또는 약 0.1 내지 0.6 또는 약 0.6, 0.1 또는 약 0.1 내지 0.4 또는 약 0.4, 0.1 또는 약 0.1 내지 0.2 또는 약 0.2, 0.2 또는 약 0.2 내지 2.0 또는 약 2.0, 0.2 또는 약 0.2 내지 1.8 또는 약 1.8, 0.2 또는 약 0.2 내지 1.6 또는 약 1.6, 0.2 또는 약 0.2 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.2 또는 약 0.2 내지 1.2 또는 약 1.2, 0.2 또는 약 0.2 내지 1.0 또는 약 1.0, 0.2 또는 약 0.2 내지 0.8 또는 약 0.8, 0.2 또는 약 0.2 내지 0.6 또는 약 0.6, 0.2 또는 약 0.2 내지 0.4 또는 약 0.4, 0.4 또는 약 0.4 내지 2.0 또는 약 2.0, 0.4 또는 약 0.4 내지 1.8 또는 약 1.8, 0.4 또는 약 0.4 내지 1.6 또는 약 1.6, 0.4 또는 약 0.4 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.4 또는 약 0.4 내지 1.2 또는 약 1.2, 0.4 또는 약 0.4 내지 1.0 또는 약 1.0, 0.4 또는 약 0.4 내지 0.8 또는 약 0.8, 0.4 또는 약 0.4 내지 0.6 또는 약 0.6, 0.6 또는 약 0.6 내지 2.0 또는 약 2.0, 0.6 또는 약 0.6 내지 1.8 또는 약 1.8, 0.6 또는 약 0.6 내지 1.6 또는 약 1.6, 0.6 또는 약 0.6 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.6 또는 약 0.6 내지 1.2 또는 약 1.2, 0.6 또는 약 0.6 내지 1.0 또는 약 1.0, 0.6 내지 약 0.6 내지 0.8 또는 약 0.8, 0.8 또는 약 0.8 내지 2.0 또는 약 2.0, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.8 또는 약 1.8, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.6 또는 약 1.6, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.2 또는 약 1.2, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.0 또는 약 1.0, 1.0 또는 약 1.0 내지 2.0 또는 약 2.0, 1.0 또는 약 1.0 내지 1.8 또는 약 1.8, 1.0 또는 약 1.0 내지 1.6 또는 약 1.6, 1.0 또는 약 1.0 내지 1.4 또는 약 1.4, 1.0 또는 약 1.0 내지 1.2 또는 약 1.2, 1.2 또는 약 1.2 내지 2.0 또는 약 2.0, 1.2 또는 약 1.2 내지 1.8 또는 약 1.8, 1.2 또는 약 1.2 내지 1.6 또는 약 1.6, 1.2 또는 약 1.2 내지 1.4 또는 약 1.4, 1.4 또는 약 1.4 내지 2.0 또는 약 2.0, 1.4 또는 약 1.4 내지 1.8 또는 약 1.8, 1.4 또는 약 1.4 내지 1.6 또는 약 1.6, 1.6 또는 약 1.6 내지 2.0 또는 약 2.0, 1.6 또는 약 1.6 내지 1.8 또는 약 1.8, 또는 1.8 또는 약 1.8 내지 2.0 또는 약 2.0 mM로 소듐 피루베이트를 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 소듐 피루베이트를 0.8 내지 1.2 mM로 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 소듐 피루베이트를 1.0 mM로 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 소듐 피루베이트를 약 1.0 mM로 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 탄산수소나트륨을 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 탄산수소나트륨을 0.5 또는 약 0.5 내지 3.5 또는 약 3.5 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 0.5 또는 약 0.5 내지 3.0 또는 약 3.0, 0.5 또는 약 0.5 내지 2.5 또는 약 2.5, 0.5 또는 약 0.5 내지 2.0 또는 약 2.0, 0.5 또는 약 0.5 내지 1.5 또는 약 1.5, 0.5 또는 약 0.5 내지 1.0 또는 약 1.0, 1.0 또는 약 1.0 내지 3.0 또는 약 3.0, 1.0 또는 약 1.0 내지 2.5 또는 약 2.5, 1.0 또는 약 1.0 내지 2.0 또는 약 2.0, 1.0 또는 약 1.0 내지 1.5 또는 약 1.5, 1.5 또는 약 1.5 내지 3.0 또는 약 3.0, 1.5 또는 약 1.5 내지 2.5 또는 약 2.5, 1.5 또는 약 1.5 내지 2.0 또는 약 2.0, 2.0 또는 약 2.0 내지 3.0 또는 약 3.0, 2.0 또는 약 2.0 내지 2.5 또는 약 2.5, 또는 2.5 또는 약 2.5 내지 3.0 또는 약 3.0 g/ℓ로 탄산수소나트륨을 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 탄산수소나트륨을 1.6 내지 2.4 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 탄산수소나트륨을 2.0 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 탄산수소나트륨을 약 2.0 g/ℓ로 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 알부민, 예를 들어, 인간 알부민, 예를 들어, 본원에 기술된 인간 알부민 용액을 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 20% 알부민 용액, 예를 들어 20% 인간 알부민 용액을 0.5% 또는 약 0.5% 내지 3.5% 또는 약 3.5% v/v로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 20% 알부민 용액, 예를 들어 20% 인간 알부민 용액을 0.5 또는 약 0.5% 내지 3.0 또는 약 3.0%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 2.5 또는 약 2.5%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 2.0 또는 약 2.0%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 1.5 또는 약 1.5%, 0.5% 또는 약 0.5% 내지 1.0 또는 약 1.0%, 1.0 또는 약 1.0% 내지 3.0 또는 약 3.0%, 1.0 또는 약 1.0% 내지 2.5 또는 약 2.5%, 1.0 또는 약 1.0% 내지 2.0 또는 약 2.0%, 1.0 또는 약 1.0% 내지 1.5 또는 약 1.5%, 1.5 또는 약 1.5% 내지 3.0 또는 약 3.0%, 1.5 또는 약 1.5% 내지 2.5 또는 약 2.5%, 1.5 또는 약 1.5% 내지 2.0 또는 약 2.0%, 2.0% 내지 약 2.0% 내지 3.0 또는 약 3.0%, 2.0% 내지 약 2.0% 내지 2.5 또는 약 2.5%, 또는 2.5% 내지 약 2.5% 내지 3.0 또는 약 3.0% v/v로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 20% 알부민 용액, 예를 들어 20% 인간 알부민 용액을 1.6% 내지 2.4% v/v로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 20% 알부민 용액, 예를 들어 20% 인간 알부민 용액을 2.0% v/v로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 20% 알부민 용액, 예를 들어 20% 인간 알부민 용액을 약 2.0% v/v로 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 2 또는 약 2 내지 6 또는 약 6 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 2 또는 약 2 내지 5.5 또는 약 5.5, 2 또는 약 2 내지 5.0 또는 약 5.0, 2 또는 약 2 내지 4.5 또는 약 4.5, 2 또는 약 2 내지 4 또는 약 4, 2 또는 약 2 내지 3.5 또는 약 3.5, 2 또는 약 2 내지 3 또는 약 3, 2 또는 약 2 내지 2.5 또는 약 2.5, 2.5 또는 약 2.5 내지 6 또는 약 6, 2.5 또는 약 2.5 내지 5.5 또는 약 5.5, 2.5 또는 약 2.5 내지 5.5 또는 약 5.5, 2.5 또는 약 2.5 내지 5.0 또는 약 5.0, 2.5 또는 약 2.5 내지 4.5 또는 약 4.5, 2.5 또는 약 2.5 내지 4.0 또는 약 4.0, 2.5 또는 약 2.5 내지 3.5 또는 약 3.5, 2.5 또는 약 2.5 내지 3.0 또는 약 3.0, 3 또는 약 3 내지 6 또는 약 6, 3 또는 약 3 내지 5.5 또는 약 5.5, 3 또는 약 3 내지 5 또는 약 5, 3 또는 약 3 내지 4.5 또는 약 4.5, 3 또는 약 3 내지 4 또는 약 4, 3 또는 약 3 내지 3.5 또는 약 3.5, 3.5 또는 약 3.5 내지 6 또는 약 6, 3.5 또는 약 3.5 내지 5.5 또는 약 5.5, 3.5 또는 약 3.5 내지 5 또는 약 5, 3.5 또는 약 3.5 내지 4.5 또는 약 4.5, 3.5 또는 약 3.5 내지 4 또는 약 4, 4 또는 약 4 내지 6 또는 약 6, 4 또는 약 4 내지 5.5 또는 약 5.5, 4 또는 약 4 내지 5 또는 약 5, 4 또는 약 4 내지 4.5 또는 약 4.5, 4.5 또는 약 4.5 내지 6 또는 약 6, 4.5 또는 약 4.5 내지 5.5 또는 약 5.5, 4.5 또는 약 4.5 내지 5 또는 약 5, 5 또는 약 5 내지 6 또는 약 6, 5 또는 약 5 내지 5.5 또는 약 5.5, 또는 5.5 또는 약 5.5 내지 6 또는 약 6 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 3.2 내지 4.8 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 4 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 약 4 g/ℓ로 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 Poloxamer 188로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 Poloxamer 188을 0.1 또는 약 0.1 내지 2.0 또는 약 2.0 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 Poloxamer 188을 0.1 또는 약 0.1 내지 1.8 또는 약 1.8, 0.1 또는 약 0.1 내지 1.6 또는 약 1.6, 0.1 또는 약 0.1 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.1 또는 약 0.1 내지 1.2 또는 약 1.2, 0.1 또는 약 0.1 내지 1.0 또는 약 1.0, 0.1 또는 약 0.1 내지 0.8 또는 약 0.8, 0.1 또는 약 0.1 내지 0.6 또는 약 0.6, 0.1 또는 약 0.1 내지 0.4 또는 약 0.4, 0.1 또는 약 0.1 내지 0.2 또는 약 0.2, 0.2 또는 약 0.2 내지 2.0 또는 약 2.0, 0.2 또는 약 0.2 내지 1.8 또는 약 1.8, 0.2 또는 약 0.2 내지 1.6 또는 약 1.6, 0.2 또는 약 0.2 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.2 또는 약 0.2 내지 1.2 또는 약 1.2, 0.2 또는 약 0.2 내지 1.0 또는 약 1.0, 0.2 또는 약 0.2 내지 0.8 또는 약 0.8, 0.2 또는 약 0.2 내지 0.6 또는 약 0.6, 0.2 또는 약 0.2 내지 0.4 또는 약 0.4, 0.4 또는 약 0.4 내지 2.0 또는 약 2.0, 0.4 또는 약 0.4 내지 1.8 또는 약 1.8, 0.4 또는 약 0.4 내지 1.6 또는 약 1.6, 0.4 또는 약 0.4 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.4 또는 약 0.4 내지 1.2 또는 약 1.2, 0.4 또는 약 0.4 내지 1.0 또는 약 1.0, 0.4 또는 약 0.4 내지 0.8 또는 약 0.8, 0.4 또는 약 0.4 내지 0.6 또는 약 0.6, 0.6 또는 약 0.6 내지 2.0 또는 약 2.0, 0.6 또는 약 0.6 내지 1.8 또는 약 1.8, 0.6 또는 약 0.6 내지 1.6 또는 약 1.6, 0.6 또는 약 0.6 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.6 또는 약 0.6 내지 1.2 또는 약 1.2, 0.6 또는 약 0.6 내지 1.0 또는 약 1.0, 0.6 내지 약 0.6 내지 0.8 또는 약 0.8, 0.8 또는 약 0.8 내지 2.0 또는 약 2.0, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.8 또는 약 1.8, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.6 또는 약 1.6, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.4 또는 약 1.4, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.2 또는 약 1.2, 0.8 또는 약 0.8 내지 1.0 또는 약 1.0, 1.0 또는 약 1.0 내지 2.0 또는 약 2.0, 1.0 또는 약 1.0 내지 1.8 또는 약 1.8, 1.0 또는 약 1.0 내지 1.6 또는 약 1.6, 1.0 또는 약 1.0 내지 1.4 또는 약 1.4, 1.0 또는 약 1.0 내지 1.2 또는 약 1.2, 1.2 또는 약 1.2 내지 2.0 또는 약 2.0, 1.2 또는 약 1.2 내지 1.8 또는 약 1.8, 1.2 또는 약 1.2 내지 1.6 또는 약 1.6, 1.2 또는 약 1.2 내지 1.4 또는 약 1.4, 1.4 또는 약 1.4 내지 2.0 또는 약 2.0, 1.4 또는 약 1.4 내지 1.8 또는 약 1.8, 1.4 또는 약 1.4 내지 1.6 또는 약 1.6, 1.6 또는 약 1.6 내지 2.0 또는 약 2.0, 1.6 또는 약 1.6 내지 1.8 또는 약 1.8, 또는 1.8 또는 약 1.8 내지 2.0 또는 약 2.0 g/ℓ로 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 Poloxamer 188을 0.8 내지 1.2 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 Poloxamer 188을 1.0 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 Poloxamer 188을 약 1.0 g/ℓ로 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 하나 이상의 항생제를 포함하거나 및/또는 이로 보충된다.
예시적인 제1 배양 배지를 표 1에 나타낸다.
배양 배지 예 #1
구성성분 농도 범위 예 농도 예
CellgroSCGM 액체 배지 비-희석 비-희석
인간 혈장 0.8 - 1.2 % (v/v) 1.0 % v/v
글루타민 3.2 - 4.8 mM 4.0 mM
IL-2 64 - 96 ㎍/ℓ 80 ㎍/ℓ
예시적인 제2 배양 배지를 표 2에 언급한다.
배양 배지 예 #2
구성성분 농도 범위 예 농도 예
RPMI1640 7.6 - 13.2 g/ℓ 10.4 g/ℓ
인간 혈장 0.8 - 1.2 % (v/v) 1.0 % v/v
글루코스 1.6 - 2.4 g/ℓ 2.0 g/ℓ
글루타민 3.2 - 4.8 mM 4.0 mM
소듐 피루베이트 0.8 - 1.2 mM 1.0 mM
탄산수소나트륨 1.6 - 2.4 g/ℓ 2.0 g/ℓ
IL-2 64 - 96 ㎍/ℓ 80 ㎍/ℓ
알부민 20% 용액 1.6 - 2.5 % v/v (3.2 - 4.8 g/ℓ) 2.0 % v/v (4.0 g/ℓ)
Poloxamer 188 0.8 - 1.2 g/ℓ 1.0 g/ℓ
2. CD3 결합 항체
일부 구현예에서, 배양 배지는 CD3 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, CD3 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 OKT3, UCHT1 및 HIT3a, 또는 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, CD3 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 OKT3 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 구현예에서, CD3 결합 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 지지 세포는 NK 세포 및/또는 배양 배지를 첨가하기 전에 배양 용기에 투입된다.
일부 구현예에서, 배양 배지는 5 또는 약 5 ng/㎖ 내지 15 또는 약 15 ng/㎖로 OKT3을 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 5 또는 약 5 내지 12.5 또는 약 12.5, 5 또는 약 5 내지 10 또는 약 10, 5 또는 약 5 내지 7.5 또는 약 7.5, 7.5 또는 약 7.5 내지 15 또는 약 15, 7.5 또는 약 7.5 내지 12.5 또는 약 12.5, 7.5 또는 약 7.5 내지 10 또는 약 10, 10 또는 약 10 내지 15 또는 약 15, 10 또는 약 10 내지 12.5 또는 약 12.5, 또는 12.5 또는 약 12.5 내지 15 또는 약 15 ng/㎖로 OKT3를 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 10 ng/㎖ OKT3을 포함하거나 및/또는 이로 보충된다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 약 10 ng/㎖로 OKT3를 포함하거나 및/또는 이로 보충된다.
3. 배양 용기
여러가지 용기들이 본 발명의 내용에 부합된다. 일부 구현예에서, 배양 용기는 플라스크, 바틀, 디쉬, 멀티웰 플레이트, 롤러 바틀, 백 및 생물반응기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 배양 용기는 친수성이 되도록 처리된다. 일부 구현예에서, 배양 용기는 부착 및/또는 증식을 촉진하도록 처리된다. 일부 구현예에서, 배양 용기 표면은 혈청, 콜라겐, 라미닌 (laminin), 젤라틴, 폴리-L-라이신, 파이브로넥틴, 세포외 매트릭스 단백질 및 이들의 조합으로 코팅된다.
일부 구현예에서, 여러 배양 단계들에 여러가지 유형의 배양 용기들이 이용된다.
일부 구현예에서, 배양 용기는 100 ㎖ 또는 약 100 ㎖ 내지 1,000 ℓ 또는 약 1,000 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 배양 용기는 125 ㎖ 또는 약 125 ㎖, 250 ㎖ 또는 약 250 ㎖, 500 ㎖ 또는 약 500 ㎖, 1 ℓ 또는 약 1 ℓ, 5 ℓ 또는 약 5 ℓ, 10 ℓ 또는 약 10 ℓ, 또는 20 ℓ 또는 약 20 ℓ의 부피를 가진다.
일부 구현예에서, 배양 용기는 생물반응기이다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 로킹 베드 (rocking bed)(파동 움직임) 생물반응기이다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 교반형 탱크 생물반응기 (stirred tank bioreactor)이다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 회전벽 용기 (rotating wall vessel)이다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 관류 생물반응기 (perfusion bioreactor)이다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 단리/증폭 자동 시스템 (isolation/expansion automated system)이다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 자동 또는 반자동 생물반응기이다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 일회용 백 생물반응기이다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 약 100 ㎖ 내지 약 1,000 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 약 10 ℓ 내지 약 1,000 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 약 100 ℓ 내지 약 900 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 약 10 ℓ 내지 약 800 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 약 10 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 200 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 100 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 90 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 80 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 70 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 60 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 50 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 40 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 30 ℓ, 약 10 ℓ 내지 약 20 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 200 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 100 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 90 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 80 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 70 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 60 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 50 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 40 ℓ, 약 20 ℓ 내지 약 30 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 200 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 100 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 90 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 80 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 70 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 60 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 50 ℓ, 약 30 ℓ 내지 약 40 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 200 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 100 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 90 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 80 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 70 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 60 ℓ, 약 40 ℓ 내지 약 50 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 200 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 100 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 90 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 80 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 70 ℓ, 약 50 ℓ 내지 약 60 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 200 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 100 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 90 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 80 ℓ, 약 60 ℓ 내지 약 70 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 200 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 100 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 90 ℓ, 약 70 ℓ 내지 약 80 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 200 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 100 ℓ, 약 80 ℓ 내지 약 90 ℓ, 약 90 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 90 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 90 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 90 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 90 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 90 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 90 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 90 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 90 ℓ 내지 약 200 ℓ, 약 90 ℓ 내지 약 100 ℓ, 약 100 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 100 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 100 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 100 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 100 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 100 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 100 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 100 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 100 ℓ 내지 약 200 ℓ, 약 200 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 200 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 200 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 200 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 200 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 200 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 200 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 200 ℓ 내지 약 300 ℓ, 약 300 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 300 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 300 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 300 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 300 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 300 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 300 ℓ 내지 약 400 ℓ, 약 400 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 400 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 400 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 400 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 400 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 400 ℓ 내지 약 500 ℓ, 약 500 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 500 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 500 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 500 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 500 ℓ 내지 약 600 ℓ, 약 600 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 600 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 600 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 600 ℓ 내지 약 700 ℓ, 약 700 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 700 ℓ 내지 약 900 ℓ, 약 700 ℓ 내지 약 800 ℓ, 약 800 ℓ 내지 약 1,000 ℓ, 약 800 ℓ 내지 약 900 ℓ, 또는 약 900 ℓ 내지 약 1,000 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 약 50 ℓ의 부피를 가진다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 100 ㎖ 내지 1,000 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 10 ℓ 내지 1,000 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 100 ℓ 내지 900 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 10 ℓ 내지 800 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 10 ℓ 내지 700 ℓ, 10 ℓ 내지 600 ℓ, 10 ℓ 내지 500 ℓ, 10 ℓ 내지 400 ℓ, 10 ℓ 내지 300 ℓ, 10 ℓ 내지 200 ℓ, 10 ℓ 내지 100 ℓ, 10 ℓ 내지 90 ℓ, 10 ℓ 내지 80 ℓ, 10 ℓ 내지 70 ℓ, 10 ℓ 내지 60 ℓ, 10 ℓ 내지 50 ℓ, 10 ℓ 내지 40 ℓ, 10 ℓ 내지 30 ℓ, 10 ℓ 내지 20 ℓ, 20 ℓ 내지 1,000 ℓ, 20 ℓ 내지 900 ℓ, 20 ℓ 내지 800 ℓ, 20 ℓ 내지 700 ℓ, 20 ℓ 내지 600 ℓ, 20 ℓ 내지 500 ℓ, 20 ℓ 내지 400 ℓ, 20 ℓ 내지 300 ℓ, 20 ℓ 내지 200 ℓ, 20 ℓ 내지 100 ℓ, 20 ℓ 내지 90 ℓ, 20 ℓ 내지 80 ℓ, 20 ℓ 내지 70 ℓ, 20 ℓ 내지 60 ℓ, 20 ℓ 내지 50 ℓ, 20 ℓ 내지 40 ℓ, 20 ℓ 내지 30 ℓ, 30 ℓ 내지 1,000 ℓ, 30 ℓ 내지 900 ℓ, 30 ℓ 내지 800 ℓ, 30 ℓ 내지 700 ℓ, 30 ℓ 내지 600 ℓ, 30 ℓ 내지 500 ℓ, 30 ℓ 내지 400 ℓ, 30 ℓ 내지 300 ℓ, 30 ℓ 내지 200 ℓ, 30 ℓ 내지 100 ℓ, 30 ℓ 내지 90 ℓ, 30 ℓ 내지 80 ℓ, 30 ℓ 내지 70 ℓ, 30 ℓ 내지 60 ℓ, 30 ℓ 내지 50 ℓ, 30 ℓ 내지 40 ℓ, 40 ℓ 내지 1,000 ℓ, 40 ℓ 내지 900 ℓ, 40 ℓ 내지 800 ℓ, 40 ℓ 내지 700 ℓ, 40 ℓ 내지 600 ℓ, 40 ℓ 내지 500 ℓ, 40 ℓ 내지 400 ℓ, 40 ℓ 내지 300 ℓ, 40 ℓ 내지 200 ℓ, 40 ℓ 내지 100 ℓ, 40 ℓ 내지 90 ℓ, 40 ℓ 내지 80 ℓ, 40 ℓ 내지 70 ℓ, 40 ℓ 내지 60 ℓ, 40 ℓ 내지 50 ℓ, 50 ℓ 내지 1,000 ℓ, 50 ℓ 내지 900 ℓ, 50 ℓ 내지 800 ℓ, 50 ℓ 내지 700 ℓ, 50 ℓ 내지 600 ℓ, 50 ℓ 내지 500 ℓ, 50 ℓ 내지 400 ℓ, 50 ℓ 내지 300 ℓ, 50 ℓ 내지 200 ℓ, 50 ℓ 내지 100 ℓ, 50 ℓ 내지 90 ℓ, 50 ℓ 내지 80 ℓ, 50 ℓ 내지 70 ℓ, 50 ℓ 내지 60 ℓ, 60 ℓ 내지 1,000 ℓ, 60 ℓ 내지 900 ℓ, 60 ℓ 내지 800 ℓ, 60 ℓ 내지 700 ℓ, 60 ℓ 내지 600 ℓ, 60 ℓ 내지 500 ℓ, 60 ℓ 내지 400 ℓ, 60 ℓ 내지 300 ℓ, 60 ℓ 내지 200 ℓ, 60 ℓ 내지 100 ℓ, 60 ℓ 내지 90 ℓ, 60 ℓ 내지 80 ℓ, 60 ℓ 내지 70 ℓ, 70 ℓ 내지 1,000 ℓ, 70 ℓ 내지 900 ℓ, 70 ℓ 내지 800 ℓ, 70 ℓ 내지 700 ℓ, 70 ℓ 내지 600 ℓ, 70 ℓ 내지 500 ℓ, 70 ℓ 내지 400 ℓ, 70 ℓ 내지 300 ℓ, 70 ℓ 내지 200 ℓ, 70 ℓ 내지 100 ℓ, 70 ℓ 내지 90 ℓ, 70 ℓ 내지 80 ℓ, 80 ℓ 내지 1,000 ℓ, 80 ℓ 내지 900 ℓ, 80 ℓ 내지 800 ℓ, 80 ℓ 내지 700 ℓ, 80 ℓ 내지 600 ℓ, 80 ℓ 내지 500 ℓ, 80 ℓ 내지 400 ℓ, 80 ℓ 내지 300 ℓ, 80 ℓ 내지 200 ℓ, 80 ℓ 내지 100 ℓ, 80 ℓ 내지 90 ℓ, 90 ℓ 내지 1,000 ℓ, 90 ℓ 내지 900 ℓ, 90 ℓ 내지 800 ℓ, 90 ℓ 내지 700 ℓ, 90 ℓ 내지 600 ℓ, 90 ℓ 내지 500 ℓ, 90 ℓ 내지 400 ℓ, 90 ℓ 내지 300 ℓ, 90 ℓ 내지 200 ℓ, 90 ℓ 내지 100 ℓ, 100 ℓ 내지 1,000 ℓ, 100 ℓ 내지 900 ℓ, 100 ℓ 내지 800 ℓ, 100 ℓ 내지 700 ℓ, 100 ℓ 내지 600 ℓ, 100 ℓ 내지 500 ℓ, 100 ℓ 내지 400 ℓ, 100 ℓ 내지 300 ℓ, 100 ℓ 내지 200 ℓ, 200 ℓ 내지 1,000 ℓ, 200 ℓ 내지 900 ℓ, 200 ℓ 내지 800 ℓ, 200 ℓ 내지 700 ℓ, 200 ℓ 내지 600 ℓ, 200 ℓ 내지 500 ℓ, 200 ℓ 내지 400 ℓ, 200 ℓ 내지 300 ℓ, 300 ℓ 내지 1,000 ℓ, 300 ℓ 내지 900 ℓ, 300 ℓ 내지 800 ℓ, 300 ℓ 내지 700 ℓ, 300 ℓ 내지 600 ℓ, 300 ℓ 내지 500 ℓ, 300 ℓ 내지 400 ℓ, 400 ℓ 내지 1,000 ℓ, 400 ℓ 내지 900 ℓ, 400 ℓ 내지 800 ℓ, 400 ℓ 내지 700 ℓ, 400 ℓ 내지 600 ℓ, 400 ℓ 내지 500 ℓ, 500 ℓ 내지 1,000 ℓ, 500 ℓ 내지 900 ℓ, 500 ℓ 내지 800 ℓ, 500 ℓ 내지 700 ℓ, 500 ℓ 내지 600 ℓ, 600 ℓ 내지 1,000 ℓ, 600 ℓ 내지 900 ℓ, 600 ℓ 내지 800 ℓ, 600 ℓ 내지 700 ℓ, 700 ℓ 내지 1,000 ℓ, 700 ℓ 내지 900 ℓ, 700 ℓ 내지 800 ℓ, 800 ℓ 내지 1,000 ℓ, 800 ℓ 내지 900 ℓ, 또는 900 ℓ 내지 1,000 ℓ의 부피를 가진다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 50 ℓ의 부피를 가진다.
4. 세포 증폭 및 자극
일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛을 지지 세포와 공-배양하여, 증폭 및 자극된 NK 세포를 생산한다.
일부 구현예에서, 공-배양은 본원에 기술된 배양 배지, 예를 들어, 배양 배지 예 #1 (표 1) 또는 배양 배지 예 #2 (표 2)에서 이루어진다.
일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛은 증폭하기 전 전체 유핵 세포를 1 x 107 또는 약 1 x 107 내지 1 x 109 또는 약 1 x 109개 포함한다. 일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어 제대혈 단일 유닛은 증폭하기 전 전체 유핵 세포를 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 1.5 x 108 또는 약 1.5 x 108개 포함한다. 일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛은 증폭하기 전 전체 유핵 세포를 1 x 108개 포함한다. 일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어 제대혈 단일 유닛은 증폭하기 전 전체 유핵 세포를 약 1 x 108개 포함한다. 일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어 제대혈 단일 유닛은 증폭하기 전 전체 유핵 세포를 1 x 109개 포함한다. 일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어 제대혈 단일 유닛은 증폭하기 전 전체 유핵 세포를 약 1 x 109개 포함한다.
일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛과 지지 세포의 공-배양으로부터 유래한 세포는 회수 및 냉동하며, 예를 들어, 본원에 기술된 냉동보존 조성물 중에 회수 및 냉동한다. 일부 구현예에서, 공-배양물로부터 유래한 냉동 세포는 주입용-완제 의약품 (infusion-ready drug product)이다. 일부 구현예에서, 공-배양물로부터 유래한 냉동 세포는 주입용-완제 의약품을 생산하기 위한, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, 추가적인 공-배양 단계 하나 이상을 통해 생산하기 위한 마스터 세포 은행 (MCB)으로 이용된다. 이에, 예를 들어, 자연살해세포 공급원은 본원에 기술된 바와 같이 증폭 및 자극하여, 주입용-완제 의약품에 이용하기 적합한 증폭 및 자극된 NK 세포를 어떠한 중간산물도 만들지 않으면서 생산할 수 있다. 자연살해세포 공급원은 또한 본원에 기술된 바와 같이 증폭 및 자극하여, 중간산물, 예를 들어 1차 마스터 세포 은행 (MCB)을 생산할 수 있다. 1차 MCB는 주입용-완제 의약품으로 이용하기 적합한 증폭 및 자극된 NK 세포를 생산하거나, 또는 대안적으로 다른 중간산물, 예를 들어 2차 MCB를 생산하는데 이용할 수 있다. 2차 MCB는 주입용-완제 의약품으로 이용하기 적합한 증폭 및 자극된 NK 세포를 생산하거나, 또는 대안적으로 다른 중간산물, 예를 들어 3차 MCB 등을 생산하는데 이용할 수 있다.
일부 구현예에서, 공-배양물에 접종되는 지지 세포 : 자연살해세포 공급원 또는 MCB 세포의 비율은 1:1 또는 약 1:1 내지 4:1 또는 약 4:1이다. 일부 구현예에서, 지지 세포 : 자연살해세포 공급원 또는 MCB 세포의 비율은 1:1 또는 약 1:1 내지 3.5:1 또는 약 3.5:1, 1:1 또는 약 1:1 내지 3:1 또는 약 3:1, 1:1 또는 약 1:1 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1, 1:1 또는 약 1:1 내지 2:1 또는 약 2:1, 1:1 또는 약 1:1 내지 1.5 또는 약 1.5:1, 1.5:1 또는 약 1.5:1 내지 4:1 또는 약 4:1, 1.5:1 또는 약 1.5:1 내지 3.5:1 또는 약 3.5:1, 1.5:1 또는 약 1.5:1 내지 3:1 또는 약 3:1, 1.5:1 또는 약 1.5:1 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1, 1.5:1 또는 약 1.5:1 내지 2:1 또는 약 2:1, 2:1 또는 약 2:1 내지 4:1 또는 약 4:1, 2:1 또는 약 2:1 내지 3.5:1 또는 약 3.5:1, 2:1 또는 약 2:1 내지 3:1 또는 약 3:1, 2:1 또는 약 2:1 내지 2.5:1 또는 약 2.5:1, 2.5:1 또는 약 2.5:1 내지 4:1 또는 약 4:1, 2.5:1 또는 약 2.5:1 내지 3.5:1 또는 약 3.5:1, 2.5:1 또는 약 2.5:1 내지 3:1 또는 약 3:1, 3:1 또는 약 3:1 내지 4:1 또는 약 4:1, 3:1 또는 약 3:1 내지 3.5:1 또는 약 3.5:1, 또는 3.5:1 또는 약 3.5:1 내지 4:1 또는 약 4:1이다. 일부 구현예에서, 공-배양물에 접종되는 지지 세포 : 자연살해세포 공급원 또는 MCB 세포의 비율은 2.5:1이다. 일부 구현예에서, 공-배양물에 접종되는 지지 세포 : 자연살해세포 공급원 또는 MCB 세포의 비율은 약 2.5:1이다.
일부 구현예에서, 공-배양은 일회용 배양 백에서, 예를 들어 1 ℓ 일회용 배양 백에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 공-배양은 생물반응기에서, 예를 들어, 50 ℓ 생물반응기에서 이루어진다. 일부 구현예에서, 1차 접종한 후 공-배양물에 배양 배지를 첨가한다.
일부 구현예에서, 공-배양은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일 또는 그보다 장기간 수행한다. 일부 구현예에서, 공-배양은 최대 16일 동안 수행한다.
일부 구현예에서, 공-배양은 37℃ 또는 약 37℃에서 이루어진다.
일부 구현예에서, 공-배양은 pH 7.9 또는 약 pH 7.9에서 이루어진다.
일부 구현예에서, 공-배양은 50% 이상의 용존 산소 (DO) 수준에서 이루어진다.
일부 구현예에서, 예시적인 배양 배지 #1 (표 1)은 MCB를 생산하기 위해 사용되고, 배양 배지 #2 (표 2)는 주입용-완제 의약품에 적합한 세포를 생산하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 예를 들어, 제대혈 단일 유닛과 지지 세포의 공-배양으로 세포, 예를 들어, MCB 세포 또는 주입용-완제 의약품 세포 50 x 108 또는 약 50 x 108 내지 50 x 1012 또는 약 50 x 1012개가 만들어진다. 일부 구현예에서, 이러한 증폭으로 세포, 예를 들어, MCB 세포 또는 주입용-완제 의약품 세포 50 x 108 또는 약 50 x 108 내지 25 x 1010 또는 약 25 x 1010, 10 x 108 또는 약 10 x 108 내지 1 x 1010 또는 약 1 x 1010, 50 x 108 또는 약 50 x 108 내지 75 x 109 또는 약 75 x 109, 50 x 108 또는 약 50 x 108 내지 50 x 109 또는 약 50 x 109, 50 x 108 또는 약 50 x 108 내지 25 x 109 또는 약 25 x 109, 50 x 108 또는 약 50 x 108 내지 1 x 109 또는 약 1 x 109, 50 x 108 또는 약 50 x 108 내지 75 x 108 또는 약 75 x 108, 75 x 108 또는 약 75 x 108 내지 50 x 1010 또는 약 50 x 1010, 75 x 108 또는 약 75 x 108 내지 25 x 1010 또는 약 25 x 1010, 75 x 108 또는 약 75 x 108 내지 1 x 1010 또는 약 1 x 1010, 75 x 108 또는 약 75 x 108 내지 75 x 109 또는 약 75 x 109, 75 x 108 또는 약 75 x 108 내지 50 x 109 또는 약 50 x 109, 75 x 108 또는 약 75 x 108 내지 25 x 109 또는 약 25 x 109, 75 x 108 또는 약 75 x 108 내지 1 x 109 또는 약 1 x 109, 1 x 109 또는 약 1 x 109 내지 50 x 1010 또는 약 50 x 1010, 1 x 109 또는 약 1 x 109 내지 25 x 1010 또는 약 25 x 1010, 1 x 109 또는 약 1 x 109 내지 1 x 1010 또는 약 1 x 1010, 1 x 109 또는 약 1 x 109 내지 75 x 109 또는 약 75 x 109, 1 x 109 또는 약 1 x 109 내지 50 x 109 또는 약 50 x 109, 1 x 109 또는 약 1 x 109 내지 25 x 109 또는 약 25 x 109, 25 x 109 또는 약 25 x 109 내지 50 x 1010 또는 약 50 x 1010, 25 x 109 또는 약 25 x 109 내지 25 x 1010 또는 약 25 x 1010, 25 x 109 또는 약 25 x 109 내지 1 x 1010 또는 약 1 x 1010, 25 x 109 또는 약 25 x 109 내지 75 x 109 또는 약 75 x 109, 25 x 109 또는 약 25 x 109 내지 50 x 109 또는 약 50 x 109, 50 x 109 또는 약 50 x 109 내지 50 x 1010 또는 약 50 x 1010, 50 x 109 또는 약 50 x 109 내지 25 x 1010 또는 약 25 x 1010, 50 x 109 또는 약 50 x 109 내지 1 x 1010 또는 약 1 x 1010, 50 x 109 또는 약 50 x 109 내지 75 x 109 또는 약 75 x 109, 75 x 109 또는 약 75 x 109 내지 50 x 1010 또는 약 50 x 1010, 75 x 109 또는 약 75 x 109 내지 25 x 1010 또는 약 25 x 1010, 75 x 109 또는 약 75 x 109 내지 1 x 1010 또는 약 1 x 1010, 1 x 1010 또는 약 1 x 1010 내지 50 x 1010 또는 약 50 x 1010, 1 x 1010 또는 약 1 x 1010 내지 25 x 1010 또는 약 25 x 1010, 또는 25 x 1010 또는 약 25 x 1010 내지 50 x 1010 또는 약 50 x 1010개가 생산된다.
일부 구현예에서, 증폭으로, 세포, 예를 들어, MCB 세포 또는 주입용-완제 의약품 세포를 각각 6억 또는 약 6억 내지 10억 또는 약 10억개씩 수용하는, 바이얼 60 또는 약 60 내지 100 또는 약 100개가 만들어진다. 일부 구현예에서, 증폭으로 세포, 예를 들어, MCB 세포 또는 주입용-완제 의약품 세포를 각각 8억 또는 약 8억개 포함하거나 또는 이로 구성된, 바이얼 80 또는 약 80개가 생산된다.
일부 구현예에서, 증폭은 자연살해세포 공급원 내 세포, 예를 들어 NK 세포의 세포수에 대하여 세포, 예를 들어, MCB 세포의 세포수를 100배 또는 약 100배 내지 500배 또는 약 500배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 증폭은 자연살해세포 공급원 내 세포, 예를 들어 NK 세포의 세포수에 대하여 세포수, 예를 들어, MCB 세포의 세포수를 100배 또는 약 100배 내지 500배 또는 약 500배, 100배 또는 약 100배 내지 400배 또는 약 400배, 100배 또는 약 100배 내지 300배 또는 약 300배, 100배 또는 약 100배 내지 200배 또는 약 200배, 200배 또는 약 200배 내지 450배 또는 약 450배, 200배 또는 약 200배 내지 400배 또는 약 400배, 100배 또는 약 100배 내지 350배 또는 약 350배, 200배 또는 약 200배 내지 300배 또는 약 300배, 200배 또는 약 200배 내지 250배 또는 약 250배, 250배 또는 약 250배 내지 500배 또는 약 500배, 250배 또는 약 250배 내지 450배 또는 약 450배, 200배 또는 약 200배 내지 400배 또는 약 400배, 250배 또는 약 250배 내지 350배 또는 약 350배, 250배 또는 약 250배 내지 300배 또는 약 300배, 300배 또는 약 300배 내지 500배 또는 약 500배, 300배 또는 약 300배 내지 450배 또는 약 450배, 300배 또는 약 300배 내지 400배 또는 약 400배, 300배 또는 약 300배 내지 350배 또는 약 350배, 350배 또는 약 350배 내지 500배 또는 약 500배, 350배 또는 약 350배 내지 450배 또는 약 450배, 또는 350배 또는 약 350배 내지 400배 또는 약 400배 증가시킨다.
일부 구현예에서, 증폭은 자연살해세포 공급원 내 세포, 예를 들어 NK 세포의 세포수에 대하여 세포, 예를 들어, MCB 세포의 세포수를 100배 또는 약 100배 내지 70,000배 또는 약 70,000배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 증폭은 자연살해세포 공급원 내 세포, 예를 들어 NK 세포의 세포수에 대하여 세포, 예를 들어, MCB 세포의 세포수를 적어도 10,000배, 예를 들어, 15,000배, 20,000배, 25,000배, 30,000배, 35,000배, 40,000배, 45,000배, 50,000배, 55,000배, 60,000배, 65,000배 또는 70,000배 증가시킨다.
일부 구현예에서, MCB 세포와 지지 세포의 공-배양은 세포를, 예를 들어 MCB 및/또는 주입용-완제 의약품에 이용하기 적합한 NK 세포를 5억 또는 약 5억 내지 15억 또는 약 15억개 생산한다. 일부 구현예에서, MCB 세포와 지지 세포의 공-배양은 세포를, 예를 들어 MCB 및/또는 주입용-완제 의약품에 이용하기 적합한 NK 세포를 5억 또는 약 5억 내지 15억 또는 약 15억, 5억 또는 약 5억 내지 12억5천 또는 약 12억5천, 5억 또는 약 5억 내지 10억 또는 약 10억, 5억 또는 약 5억 내지 7억5천 또는 약 7억5천, 7억5천 또는 약 7억5천 내지 15억 또는 약 15억, 5억 또는 약 5억 내지 12억5천 또는 약 12억5천, 7억5천 또는 약 7억5천 내지 10억 또는 약 10억, 10억 또는 약 10억 내지 15억 또는 약 15억, 10억 또는 약 10억 내지 12억5천 또는 약 12억5천, 또는 12억5천 또는 약 12억5천 내지 15억 또는 약 15억개 생산한다.
일부 구현예에서, MCB 세포와 지지 세포의 공-배양은 세포를, 예를 들어, MCB 및/또는 주입용-완제 의약품에 이용하기 적합한 NK 세포를 각각 7억5천 또는 약 7억5천 내지 12억5천 또는 약 12억5천개씩 포함하는, 세포, 예를 들어 주입형-완제 의약품 세포의 바이얼을 50 또는 약 50 내지 150 또는 약 150개 생산한다. 일부 구현예에서, MCB 세포와 지지 세포의 공-배양은 세포를, 예를 들어 MCB 및/또는 주입용-완제 의약품에 이용하기 적합한 NK 세포를 각각 10억 또는 약 10억개 포함하거나 또는 이로 구성된, 바이얼 100개 또는 약 100개를 생산한다.
일부 구현예에서, 증폭은 초기 MCB 세포수와 비교해 MCB 및/또는 주입용-완제 의약품에 이용하기 적합한 세포수, 예를 들어 NK 세포수를 100배 또는 약 100배 내지 500배 또는 약 500배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 증폭은 초기 MCB 세포수와 비교해 세포수를, 예를 들어 MCB 및/또는 주입용-완제 의약품에 이용하기 적합한 NK 세포의 세포수를 100배 또는 약 100배 내지 500배 또는 약 500배, 100배 또는 약 100배 내지 400배 또는 약 400배, 100배 또는 약 100배 내지 300배 또는 약 300배, 100배 또는 약 100배 내지 200배 또는 약 200배, 200배 또는 약 200배 내지 450배 또는 약 450배, 200배 또는 약 200배 내지 400배 또는 약 400배, 100배 또는 약 100배 내지 350배 또는 약 350배, 200배 또는 약 200배 내지 300배 또는 약 300배, 200배 또는 약 200배 내지 250배 또는 약 250배, 250배 또는 약 250배 내지 500배 또는 약 500배, 250배 또는 약 250배 내지 450배 또는 약 450배, 200배 또는 약 200배 내지 400배 또는 약 400배, 250배 또는 약 250배 내지 350배 또는 약 350배, 250배 또는 약 250배 내지 300배 또는 약 300배, 300배 또는 약 300배 내지 500배 또는 약 500배, 300배 또는 약 300배 내지 450배 또는 약 450배, 300배 또는 약 300배 내지 400배 또는 약 400배, 300배 또는 약 300배 내지 350배 또는 약 350배, 350배 또는 약 350배 내지 500배 또는 약 500배, 350배 또는 약 350배 내지 450배 또는 약 450배, 350배 또는 약 350배 내지 400배 또는 약 400배 증가시킨다.
일부 구현예에서, 증폭은 초기 MCB 세포수와 비교해 세포수를, 예를 들어 MCB 및/또는 주입용-완제 의약품에 이용하기 적합한 NK 세포의 세포수를 100 또는 약 100 내지 70,000 내지 약 70,000배 증가시킨다. 일부 구현예에서, 증폭은 초기 MCB 세포수와 비교해 세포수를, 예를 들어 MCB 및/또는 주입용-완제 의약품에 이용하기 적합한 NK 세포의 세포수를 적어도 10,000배, 예를 들어, 15,000배, 20,000배, 25,000배, 30,000배, 35,000배, 40,000배, 45,000배, 50,000배, 55,000배, 60,000배, 65,000배 또는 70,000배 증가시킨다.
본원에 기술된 바와 같이 증폭 및 자극 중에 세포를 조작하는 구현예에서, 증폭 및 자극된 모든 세포가 반드시 성공적으로 조작되는 것은 아닐 것이며, 예를 들어 성공적으로 형질도입되는 것은 아닐 것이며, 예를 들어, 이종의 단백질, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 CAR 및/또는 IL-15를 포함하는 이종의 단백질을 포함하는 벡터로 성공적으로 형질도입된 것은 아닐 것이다. 이에, 본원에 기술된 방법은 조작된 세포, 예를 들어 본원에 기술된 조작된 세포를 비-조작 세포로부터 분류하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예를 들어, 형질도입된 세포는 조작된 세포의 항원에 특이적인 시약, 예를 들어 조작된 세포의 항원을 표적화 하지만 비-조작 세포를 표적화하지 않는 항체를 이용해, 비-조작 세포, 예를 들어, 비-형질도입 세포로부터 분류한다. 일부 구현예에서, 조작된 세포의 항원은 CAR의 구성성분, 예를 들어 본원에 기술된 CAR의 구성성분이다.
세포를 항원에 기반하여 세포 분리하기 위한 시스템은 상업적으로 입수가능하며, 예를 들어, CliniMACS® 분류 시스템 (Miltenyi Biotec)이 있다.
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예를 들어, 형질도입된 세포는 유세포 측정을 이용해 비-조작 세포, 예를 들어, 비-형질도입 세포로부터 분류한다.
일부 구현예에서, 분류한 조작된 세포는 MCB로서 이용된다. 일부 구현예에서, 분류한 조작된 세포는 주입용-완제 의약품의 구성성분으로서 이용된다.
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예를 들어, 형질도입된 세포는 미세유체 세포 분류 방법을 이용해 비-조작 세포, 예를 들어, 비-형질도입 세포로부터 분류한다. 미세유체 세포 분류 방법은, 예를 들어, Dalili et al., "A Review of Sorting, Separation and Isolation of Cells and Microbeads for Biomedical Applications: Microfluidic Approaches", Analyst 144:87 (2019)에 언급되어 있다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 세포의 1% 또는 약 1% 내지 99% 또는 약 99%가 성공적으로 조작되고, 예를 들어 성공적으로 형질도입되고, 예를 들어 이종의 단백질, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 CAR 및/또는 IL-15를 포함하는 이종의 단백질을 포함하는 벡터로 성공적으로 형질도입된다. 일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 세포의 1% 또는 약 1% 내지 90% 또는 약 90%, 1% 또는 약 1% 내지 80% 또는 약 80%, 1% 또는 약 1% 내지 70% 또는 약 70%, 1% 또는 약 1% 내지 60% 또는 약 60%, 1% 또는 약 1% 내지 50% 또는 약 50%, 1% 또는 약 1% 내지 40% 또는 약 40%, 1% 또는 약 1% 내지 30% 또는 약 30%, 1% 또는 약 1% 내지 20% 또는 약 20%, 1% 또는 약 1% 내지 10% 또는 약 10%, 1% 또는 약 1% 내지 5% 또는 약 5%, 5% 또는 약 5% 내지 99% 또는 약 99%, 5% 또는 약 5% 내지 90% 또는 약 90%, 5% 또는 약 5% 내지 80% 또는 약 80%, 5% 또는 약 5% 내지 70% 또는 약 70%, 5% 또는 약 5% 내지 60% 또는 약 60%, 5% 또는 약 5% 내지 50% 또는 약 50%, 5% 또는 약 5% 내지 40% 또는 약 40%, 5% 또는 약 5% 내지 30% 또는 약 30%, 5% 또는 약 5% 내지 20% 또는 약 20%, 5% 또는 약 5% 내지 10% 또는 약 10%, 10% 또는 약 10% 내지 99% 또는 약 99%, 10% 또는 약 10% 내지 90% 또는 약 90%, 10% 또는 약 10% 내지 80% 또는 약 80%, 10% 또는 약 10% 내지 70% 또는 약 70%, 10% 또는 약 10% 내지 60% 또는 약 60%, 10% 또는 약 10% 내지 50% 또는 약 50%, 10% 또는 약 10% 내지 40% 또는 약 40%, 10% 또는 약 10% 내지 30% 또는 약 30%, 10% 또는 약 10% 내지 20% 또는 약 20%, 20% 또는 약 20% 내지 99% 또는 약 99%, 20% 또는 약 20% 내지 90% 또는 약 90%, 20% 또는 약 20% 내지 80% 또는 약 80%, 20% 또는 약 20% 내지 70% 또는 약 70%, 20% 또는 약 20% 내지 60% 또는 약 60%, 20% 또는 약 20% 내지 50% 또는 약 50%, 20% 또는 약 20% 내지 40% 또는 약 40%, 20% 또는 약 20% 내지 30% 또는 약 30%, 30% 또는 약 30% 내지 99% 또는 약 99%, 30% 또는 약 30% 내지 90% 또는 약 90%, 30% 또는 약 30% 내지 80% 또는 약 80%, 30% 또는 약 30% 내지 70% 또는 약 70%, 30% 또는 약 30% 내지 60% 또는 약 60%, 30% 또는 약 30% 내지 50% 또는 약 50%, 30% 또는 약 30% 내지 40% 또는 약 40%, 40% 또는 약 40% 내지 99% 또는 약 99%, 40% 또는 약 40% 내지 90% 또는 약 90%, 40% 또는 약 40% 내지 80% 또는 약 80%, 40% 또는 약 40% 내지 70% 또는 약 70%, 40% 또는 약 40% 내지 70% 또는 약 70%, 40% 또는 약 40% 내지 60% 또는 약 60%, 40% 또는 약 40% 내지 50% 또는 약 50%, 50% 또는 약 50% 내지 99% 또는 약 99%, 50% 또는 약 50% 내지 90% 또는 약 90%, 50% 또는 약 50% 내지 80% 또는 약 80%, 50% 또는 약 50% 내지 70% 또는 약 70%, 50% 또는 약 50% 내지 60% 또는 약 60%, 60% 또는 약 60% 내지 99% 또는 약 99%, 60% 또는 약 60% 내지 90% 또는 약 90%, 60% 또는 약 60% 내지 80% 또는 약 80%, 60% 또는 약 60% 내지 70% 또는 약 70%, 70% 또는 약 70% 내지 99% 또는 약 99%, 70% 또는 약 70% 내지 90% 또는 약 90%, 70% 또는 약 70% 내지 80% 또는 약 80%, 80% 또는 약 80% 내지 99% 또는 약 99%, 80% 또는 약 80% 내지 90% 또는 약 90% 또는 90% 또는 약 90% 내지 99% 또는 약 99%가 성공적으로 조작되고, 예를 들어 성공적으로 형질도입되고, 예를 들어 이종의 단백질, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 CAR 및/또는 IL-15를 포함하는 이종의 단백질을 포함하는 벡터로 성공적으로 형질도입된다.
일부 구현예에서, 1차 MCB 또는 2차 MCB의 냉동 세포를 해동하여 배양한다. 일부 구현예에서, 1차 MCB 또는 2차 MCB의 냉동 세포 바이얼 하나, 예를 들어 세포, 예를 들어 1차 MCB 또는 2차 MCB 세포를 8억 또는 약 8억개씩 포함하는 바이얼 하나를 해동하여 배양한다. 일부 구현예에서, 냉동한 1차 또는 2차 MCB 세포는 추가적인 지지 세포와 함께 배양하여, 2차 또는 3차 MCB로서 또는 주입형-완제 의약품에 이용하기 적합한 세포를 생산한다. 일부 구현예에서, 1차 또는 2차 MCB의 공-배양물로부터 세포를 회수하여 냉동한다.
일부 구현예에서, 자연살해세포 공급원, 1차 MCB 또는 2차 MCB의 공-배양물로부터 세포를 회수하고, 냉동보존 조성물, 예를 들어 본원에 기술된 냉동보존 조성물 중에 냉동한다. 일부 구현예에서, 세포는 수확한 후 세척한다. 즉, 본 발명은 활성화되고 자극된 NK 세포를 포함하는, 예를 들어 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 활성화되고 자극된 NK 세포를 포함하는, 예를 들어 본원에 기술된 방법에 의해 생산된 수확 및 세척한 활성화되고 자극된 NK 세포를 포함하는, 약학적 조성물, 및 냉동보존 조성물, 예를 들어 본원에 기술된 냉동보존 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 세포는 냉동보존 조성물과, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 냉동하기 전에, 혼합한다. 일부 구현예에서, 세포는 크라이오백 (cryobag)에서 냉동한다. 일부 구현예에서, 세포는 크라이오바이얼 (cryovial)에서 냉동한다.
일부 구현예에서, 본 방법은 증폭 및 자극한 NK 세포의 집단으로부터 NK 세포를 단리하는 것을 추가로 포함한다.
NK 세포를 증폭 및 자극하는 공정의 일 예를 도 1에 도시한다.
5. 조작
일부 구현예에서, 본 방법은 NK 세포(들)를, 예를 들어, 이종의 단백질, 예를 들어, 본원에 기술된 이종의 단백질, 예를 들어, CAR 및/또는 IL-15를 포함하는 이종의 단백질을 발현하도록 조작하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포(들)를 본원에 기술된 이종의 단백질을 발현하도록 조작하는 것은 NK 세포를 본원에 기술된 이종의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레익산을 포함하는 벡터로 형질전환, 예를 들어 안정적으로 형질전환하는 것을 포함한다. 적절한 벡터는 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, NK 세포(들)를 본원에 기술된 이종의 단백질을 발현하도록 조작하는 것은 이종의 단백질을 유전자 편집 (예, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 유전자 편집, ARCUS 유전자 편집, CRISPR-Cas9 유전자 편집 또는 megaTAL 유전자 편집)을 통해 아데노-부속 바이러스 (AAV) 기술과 조합하여 도입하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포(들)는 본원에 기술된 이종의 단백질을 발현하도록, 예를 들어, 지지 세포를 포함하는 배지에서 조성물을 배양하는 동안 또는 배양한 이후에, 조작된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 NK 세포(들)를, 예를 들어 유전자(들) 또는 유전자 산물(들)을 발현하거나, 과다-발현하거나, 넉-아웃하거나 또는 넉-다운하도록 조작하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 자연살해세포는 유전자 조작되지 않는다.
E. 증폭 및 자극된 NK 세포의 특성
예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 생체외 증폭 및 자극한 후, 증폭 및 자극된 NK 세포 집단은 인체에서 자연적으로 생길 수 없는 수/밀도 (예, 전술한 바와 같음)를 가질 뿐 아니라 이의 표현형 특징 (예, 유전자 발현 및/또는 표면 단백질 발현)도 출발 공급 물질 또는 기타 NK 세포의 자연 생성 집단과는 다르다.
일부 경우에, 출발 NK 세포 공급원은 단 하나의 개체, 예를 들어, 생체외 증폭하지 않은 단일한 제대혈 유닛으로부터 유래한 샘플이다. 이에, 일부 경우에, 증폭 및 자극된 NK 세포들은 공통 계통을 공유하며, 즉 이들 모두 출발 NK 세포 공급원의 증폭으로부터 생성되며, 따라서 그 자체가 단일 유기체로부터 유래한 세포 집단의 클론 증폭을 통해 유전자형을 공유한다. 그러나, 이들 세포는 자연적으로는 생체외 증폭으로 달성되는 밀도로 발생할 수 없으며, 또한 출발 NK 세포 공급원과는 표현형 특징에 차이가 존재한다.
일부 경우에, 증폭 및 자극된 NK 세포의 집단은 증폭된 자연살해세포를 적어도 1억, 예를 들어, 2억, 2억5천만, 3억, 4억, 5억, 6억, 7억, 7억5천만, 8억, 9억, 10억, 20억, 30억, 40억, 50억, 60억, 70억, 80억, 90억, 100억, 150억, 200억, 250억, 500억, 750억, 800억, 900억, 1000억, 2000억, 2500억, 3000억, 4000억, 5000억, 6000억, 7000억, 8000억, 9000억, 1조, 2조, 3조, 4조, 5조, 6조, 7조, 8조, 9조 또는 10조개 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는 CD56+CD3- 세포를 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는 유전자 조작되지 않는다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는 CD16 전이유전자를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는 외인성 CD16 단백질을 발현하지 않는다.
증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 표면 발현을, 예를 들어, CD16, CD56, CD3, CD38, CD14, CD19, NKG2D, NKp46, NKp30, DNAM-1 및 NKp44 중 하나 이상의 표면 발현을 특징으로 할 수 있다.
본원에서 언급되는 표면 단백질 발현 수준은, 일부 경우에, 언급된 특정 단백질에 대해 양성 선별하지 않고도, 달성된다. 예를 들어, 일부 경우에, NK 세포 공급원, 예를 들어, 단일 제대혈 유닛은 KIR 수용체 계열의 KIR B 대립유전자 및 CD16의 158 V/V 변이체를 둘다 포함하고, 예를 들어, CD56+CD3- 발현에 대해 게이팅함으로써 CD56+ 농화 및 CD3(+) 고갈 처리되지만, 증폭 및 자극을 수행하는 중에 다른 표면 단백질 발현에 대한 선별은 수행하지 않는다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 NKG2D+ 세포를 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 NKp46+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 NKp30+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 DNAM-1+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 NKp44+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 CD94+ (KLRD1) 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 0%로 CD3+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 0%로 CD14+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 0%로 CD19+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 0%로 CXCR+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 0%로 CD122+ (IL2RB) 세포를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은, 놀랍게도, 본원에 기술된 방법에 따라 증폭 및 자극한 NK 세포가 증폭 및 자극 공정을 통해 CD16을 높은 수준으로 발현하여, CD16 발현 수준이 높은 세포 집단이 구축됨을 알게 되었다. CD16의 고 발현은 증폭된 세포가 ADCC를 개시하는데 중요한 CD16을 발현하도록 조작할 필요성을 생략하며, 이는 본원에 기술된 증폭 및 자극 방법의 놀랍고 예측하지 못한 이점이다. 이에, 일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 CD16+ NK 세포를 50% 이상, 예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%로 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 KIR 수용체 계열의 KIR B 대립유전자 및 CD16의 158 V/V 변이체를 둘다 포함하고, CD16+ NK 세포를 50% 이상, 예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%로 포함한다.
일부 구현예에서, CD16을 발현하는, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예컨대 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
일부 구현예에서, NKG2D를 발현하는, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예컨대 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
일부 구현예에서, NKp30을 발현하는, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예컨대 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
일부 구현예에서, DNAM-1을 발현하는, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예컨대 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
일부 구현예에서, NKp44를 발현하는, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예컨대 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
일부 구현예에서, NKp46을 발현하는, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예컨대 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한, 증폭 및 자극된 NK 세포의 백분율은 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자들은 본원에 기술된 방법에 의해 증폭 및 자극된 NK 세포가 CD38을 낮은 수준으로 발현한다는 것을 놀랍게도 알게 되었다. CD38은 특정 암 요법에서 (예를 들어, 다발성 골수종 및 급성 골수성 백혈병) 유효한 표적이다. 예를 들어, Jiao et al., "CD38: Targeted Therapy in Multiple Myeloma and Therapeutic Potential for Solid Cancerrs", Expert Opinion on Investigational Drugs 29(11):1295-1308 ((2020)을 참조한다. 하지만, 항-CD38 항체를 NK 세포와 함께 투여할 경우에는, NK 세포가 천연적으로 CD38을 발현하므로, 동족살해 (fratricide)가 높아질 위험이 있다. 그러나, 본원에 기술된 방법에 의해 증폭 및 자극된 NK 세포는 CD38을 낮은 수준으로 발현하므로, 따라서 예상한 동족살해가 해소된다. 다른 그룹에서는 CD38 발현을 낮추기 위해 게놈 편집과 같은 조작 방법에 의존하지만 (예, Gurney et al., "CD38 Knockout Natural Killer Cells Expressing an Affinity Optimized CD38 Chimeric Antigen Receptor Successfully Target Acute Myeloid Leukemia with Reduced Effector Cell Fratricide", Haematologica doi:10.3324/haematol.2020.271908 (2020) 참조), 본원에 기술된 방법에 의해 증폭 및 자극된 NK 세포는 유전자 조작하지 않고도 CD38을 낮은 수준으로 발현하며, 이는 본원에 기술된 바와 같이 증폭 및 자극된 NK 세포를, 예를 들어 CD38 항체와 조합하여 이용해, 예를 들어 CD38+ 암을 치료하는데, 놀랍고 예상치 못한 이점을 제공한다.
이에, 일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 80% 이하로 CD38+ 세포를, 예를 들어 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하 또는 20% 이하로 CD38+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 KIR 수용체 계열의 KIR B 대립유전자 및 CD16의 158 V/V 변이체를 둘다 포함하고, 80% 이하로 CD38+ 세포를, 예를 들어 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하 또는 20% 이하로 CD38+ 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 KIR 수용체 계열의 KIR B 대립유전자 및 CD16의 158 V/V 변이체를 둘다 포함하고, CD38+ 세포를 80% 이하로, 예를 들어 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하 또는 20% 이하로, CD16+ NK 세포를 50% 이상, 예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%로 포함한다.
일부 구현예에서, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 전술한 바와 같이, 예를 들어, 단 하나의 제대혈 유닛의 증폭 및 자극으로부터 유래한 증폭 및 자극된 NK 세포는 KIR 수용체 계열의 KIR B 대립유전자 및 CD16의 158 V/V 변이체를 둘다 포함하고, 다음을 포함한다: i) 50% 이상, 예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 CD16+ NK 세포; 및/또는 ii) 80% 이하의 CD38+ 세포, 예를 들어 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하 또는 20% 이하의 CD38+ 세포; 및/또는 iii) 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%의 NKG2D+ 세포; 및/또는 iv) 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%의 NKp46+ 세포; 및/또는 v) 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%의 NKp30+ 세포; 및/또는 vi) 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%의 DNAM-1+ 세포; 및/또는 vii) 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% NKp44+ 세포; 및/또는 viii) 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%의 CD94+ (KLRD1) 세포; 및/또는 ix) 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 0%의 CD3+ 세포; 및/또는 x) 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 0%의 CD14+ 세포; 및/또는 xi) 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 0%의 CD19+ 세포; 및/또는 xii) 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 0%의 CXCR+ 세포; 및/또는 xiii) 20% 이하, 예를 들어, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하 또는 0%의 CD122+ (IL2RB) 세포.
일부 구현예에서, 지지 세포의 잔류 시그니처 (residual signature)가 예를 들어 잔류 세포의 존재에 의해 (예를 들어, 특정 표면 단백질 발현을 보이는 세포를 검출함으로써) 또는 지지 세포에 의해 발현된 잔류 핵산 및/또는 단백질에 의해 검출될 수도 있지만, 지지 세포가 증폭 및 자극된 NK 세포에 존속하는 것은 아니다.
예를 들어, 일부 경우에, 본원에 기술된 방법은 조작된 지지 세포, 예를 들어, 자연살해세포 등의 자연살해세포 공급원 내 세포에 의해 발현되지 않는 서열을 발현하도록 조작된, 전술한 eHuT-78 지지 세포를 이용해, 자연살해세포를 증폭 및 자극하는 것을 포함한다. 예를 들어, 조작된 지지 세포는 4-1BBL (UniProtKB P41273, 서열번호 1), 막-결합형 IL-21 (서열번호 2) 및 돌연변이 TNFα (서열번호 3)("eHut-78 세포"), 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 하나 이상을 발현하도록 조작될 수 있다.
이들 지지 세포가 증폭 및 자극된 NK 세포에서 존속하지 않을 수 있지만, 증폭 및 자극된 NK 세포는 지지 세포로부터 유래한 세포, 단백질 및/또는 핵산을 검출가능한 잔류량으로 보유할 수 있다. 따라서, 증폭 및 자극된 NK 세포에서 이러한 잔류물의 존재는, 예를 들어 세포 자체 (예를 들어, 유세포 측정에 의해), 이들 세포에 의해 발현된 단백질, 및/또는 이들 세포에 의해 발현된 핵산을 검출함으로써, 검출할 수 있다.
이에, 본 발명은 또한 잔류 지지 세포 (생존 세포 또는 사멸 세포) 또는 잔류 지지 세포의 세포성 불순물 (예를 들어, 잔류 지지 세포의 단백질 또는 이의 일부, 및/또는 핵산과 같은 유전 물질 또는 이의 일부)을 함유하는 증폭 및 자극된 NK 세포의 집단을 기술한다. 일부 경우에, 증폭 및 자극된 NK 세포는 잔류 지지 세포, 예를 들어, eHuT-78 지지 세포를 0%보다는 높지만 0.3% 이하의 수준으로 포함한다.
일부 경우에, 증폭 및 자극된 NK 세포는 예를 들어, 잔류 4-1BBL (UniProtKB P41273, 서열번호 1), 막-결합형 IL-21 (서열번호 2), 및/또는 돌연변이 TNFα (서열번호 3) 또는 이들의 일부(들)를 암호화하는 잔류 지지 세포를 포함한다. 일부 경우에, 막-결합형 IL-21은 CD8 막관통 도메인을 포함한다.
일부 경우에, 증폭 및 자극된 NK 세포는, 예를 들어, 샘플에서 지지 세포 특이적인 단백질 또는 핵산 서열 (즉, 자연살해세포에 의해 발현되지 않는 단백질 또는 핵산 서열)의 상대적인 비율에 의해, 예를 들어, qPCR에 의해, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 측정한 바에 따라, 0% 초과 및 0.2% 이하의 지지 세포 잔류율 %를 포함한다.
일부 구현예에서, 잔류 지지 세포는 CD4(+) T 세포이다. 일부 구현예에서, 잔류 지지 세포는 조작된 CD4(+) T 세포이다. 일부 구현예에서, 잔류 지지 세포는 4-1BBL (UniProtKB P41273, 서열번호 1), 막-결합형 IL-21 (서열번호 2) 및 돌연변이 TNFα (서열번호 3)("eHut-78 세포"), 또는 이들의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 하나 이상을 발현하도록 조작된다. 이에, 일부 경우에, 지지 세포 특이적인 단백질은 4-1BBL (UniProtKB P41273, 서열번호 1), 막-결합형 IL-21 (서열번호 2) 및/또는 돌연변이 TNFα (서열번호 3)이다. 따라서, 지지 세포 특이적인 핵산은 4-1BBL (UniProtKB P41273, 서열번호 1), 막-결합형 IL-21 (서열번호 2) 및/또는 돌연변이 TNFα (서열번호 3), 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산이다. 일부 경우에, 막-결합형 IL-21은 CD8 막관통 도메인을 포함한다.
매우 다양한 여러가지 방법들을 이용해, 생물학적 샘플에서 핵산 또는 단백질 유전자 산물의 존재를 분석 및 검출할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "검출"은 화합물 및/또는 기질 (예, 세포, 단백질 및/또는 핵산)의 공존 또는 존재를 발견, 확인 또는 검증하기 위해 사용하는 방법을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출 방법을 이용해 단백질을 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출은 화학발광 또는 형광 기법을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출은, 항체를 이용해 단백질 전체 또는 단백질의 특이적인 에피토프와 특이적으로 반응하는 면역학에 기반한 방법 (예를 들어, 정량적인 효소-연결된 면역흡착 분석 (ELISA), 웨스턴 블롯팅 또는 도트 블롯팅)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출은 단백질의 면역침강을 포함할 수 있다 (Jungblut et al., J Biotechnol.31;41(2-3):111-20 (1995); Franco et al., Eur J Morphol. 39(1):3-25 (2001)). 일부 구현예에서, 검출 방법을 이용해 핵산 (예를 들어, DNA 및/또는 RNA)을 검출할 수 있다. 일부 구현예에서, 검출은 노던 블롯 분석, 뉴클레아제 보호 분석 (NPA), 인 시추 혼성화 또는 역전사-중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 포함할 수 있다 (Raj et al., Nat. Methods 5, 877-879 (2008); Jin et al., J Clin Lab Anal. 11(1):2-9 (1997); Ahmed, J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev. 20(2):77-116 (2002)).
이에, 본 발명은 또한 조작된 지지 세포, 예를 들어 본원에 기술된 eHuT-78 지지 세포와 공-배양한, 증폭 및 자극된 NK 세포의 집단, 예를 들어, 본원에 기술된 방법을 이용해 증폭 및 자극된 NK 세포의 집단을 검출하는 방법을 기술한다.
II. 자연살해세포 조작
일부 구현예에서, 자연살해세포는 CAR-NK(들) 및/또는 IL-15를 발현하는 NK(들)를 생산하도록 조작된다.
일부 구현예에서, 자연살해세포는 증폭 및 자극하는 중에, 예를 들어 본원에 기술된 증폭 및 자극하는 중에 조작, 예를 들어 형질도입된다. 일부 구현예에서, 자연살해세포는 증폭 및 자극하는 중에, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 MCB를 생산하는 중에, 조작된다. 일부 구현예에서, 자연살해세포는 증폭 및 자극하는 중에, 예를 들어 주사-완제 의약품에 이용하기 적합한 NK 세포를 생산하는 중에 및/또는 전술한 바와 같이 MCB를 생산하는 중에, 조작된다. 이에, 일부 구현예에서, NK 세포(들)는 숙주 세포이고, 본 발명은 이종의 단백질, 예를 들어, 전술한 바와 같은 이종의 단백질을 발현하는 NK 숙주 세포(들)를 제공한다.
일부 구현예에서, 자연살해세포는 증폭 및 자극하기 전 조작된다. 일부 구현예에서, 자연살해세포는 증폭 및 자극한 후 조작된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 벡터를 이용한 형질도입에 의해 조작된다. 적합한 벡터는 본원에 기술되어 있으며, 예를 들어 렌티바이러스 벡터, 예를 들어, 이종의 단백질, 예를 들어 본원에 기술된 이종의 단백질을 포함하는 렌티바이러스 벡터가 있다. 일부 구현예에서, NK 세포는 본원에 기술된 바와 같이 제1 MCB를 생산하는 중에 형질도입된다.
일부 구현예에서, NK 세포(들)는 감염 다중도 (multiplicity of infection) 1 또는 약 1 내지 40 또는 약 40 바이러스 입자수/세포로 형질도입된다. 일부 구현예에서, NK 세포(들)는 1 또는 약 1, 5 또는 약 5, 10 또는 약 10, 15 또는 약 15, 20 또는 약 20, 25 또는 약 25, 30 또는 약 30, 35 또는 약 35, 또는 40 또는 약 40 바이러스 입자수/세포의 감염 다중도로 형질도입된다.
A. 키메라 항원 수용체
일부 구현예에서, 이종의 단백질은 융합 단백질이고, 예를 들어 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 융합 단백질은 NK 세포에, 예를 들어, 증폭 및 자극 공정 중에 도입된다.
일부 구현예에서, CAR은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 신호 서열, 세포외 도메인, 힌지, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 서열. 일부 구현예에서, CAR은 스페이서 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 신호 서열, 세포외 도메인, 힌지, 스페이서, 막관통 도메인, 제1 신호전달 도메인 서열, 제2 신호전달 도메인 서열 및 제3 신호전달 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 (N-말단에서 C-말단 방향으로) 신호 서열, 세포외 도메인, 힌지, 막관통 도메인, 제1 신호전달 도메인 서열, 제2 신호전달 도메인 서열 및 제3 신호전달 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인 서열(들) 하나 이상은 CD28 세포내 신호전달 서열이다. 일부 구현예에서, CD28 세포내 신호전달 서열은 서열번호 5를 포함하거나 또는 서열번호 5로 구성된다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인 서열(들) 하나 이상은 OX40L 신호전달 서열이다. 일부 구현예에서, OX40L 신호전달 서열은 서열번호 8을 포함하거나 또는 서열번호 8로 구성된다.
일부 구현예에서, 세포내 신호전달 도메인 서열(들) 하나 이상은 CD3ζ 세포내 신호전달 도메인 서열이다. 일부 구현예에서, CD3ζ 세포내 신호전달 서열은 서열번호 11을 포함하거나 또는 서열번호 11로 구성된다.
일부 구현예에서, CAR은 CD28 세포내 신호전달 서열 (서열번호 5), OX40L 세포내 신호전달 서열 (서열번호 8) 및 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 (서열번호 11)을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 서열번호 19를 포함하거나 또는 서열번호 19로 구성된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 OX40L 세포내 신호전달 도메인 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, CAR은 CD28 세포내 신호전달 서열 (서열번호 5)과 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 (서열번호 11)을 포함하지만, OX40L 세포내 신호전달 도메인 서열은 포함하지 않는다.
B. IL-15
일부 구현예에서, NK 세포는 IL-15, 예를 들어, 인간 IL-15 (UniProtKB # P40933; NCBI Gene ID #3600), 예를 들어, 용해성 인간 IL-15 또는 이의 동원체, 또는 전술한 임의의 것의 변이체를 발현하도록 조작된다. 일부 구현예에서, IL-15는 절단 부위를 추가로 포함하는 융합 단백질의 일부로서 발현된다. 일부 구현예에서, IL-15는 T2A 리보솜 스킵 서열 부위 (때때로 자가-절단 부위로 언급됨)를 포함하는 폴리단백질의 일부로서 발현된다.
일부 구현예에서, IL-15는 서열번호 16을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
일부 구현예에서, T2A 절단부는 서열번호 14를 포함하거나 또는 서열번호 14로 구성된다.
일부 구현예에서, IL-15는 CAR, 예를 들어, 본원에 기술된 CAR을 포함하는 융합 단백질의 일부로서 발현된다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 (N-말단에서 C-말단 방향으로) CAR, 절단 부위 및 IL-15을 포함한다.
일부 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 20을 포함한다.
C. 저해성 수용체
일부 구현예에서, NK 세포는 하나 이상의 저해성 수용체 유전자 하나 이상의 발현을 변경하도록, 예를 들어 낮추도록 조작된다.
일부 구현예에서, 저해성 수용체 유전자는 HLA-특이적인 저해성 수용체이다. 일부 구현예에서, 저해성 수용체 유전자는 HLA-비특이적인 저해성 수용체이다.
일부 구현예에서, 저해성 수용체 유전자는 KIR, CD94/NKG2A, LILRB1, PD-1, IRp60, Siglec-7, LAIR-1 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
D. 폴리뉴클레익산, 벡터 및 숙주 세포
또한, 본 발명은 융합 단백질(들) 또는 그 일부를 암호화하는 폴리뉴클레익산, 예를 들어 본원에 제공된 서열 표에 나타낸 바와 같이, 본원에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레익산을 포함하는 벡터(들), 및 이러한 벡터(들)를 포함하는 세포, 예를 들어, NK 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 예를 들어, Milone et al., "Clinical Use of Lentiviral Vectors", Leukemia 32:1529-41 (2018)을 참조한다. 일부 구현예에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 감마 레트로바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 벡터는 비-바이러성 벡터, 예를 들어, 피기백 비-바이러스 벡터 (PB 트랜스포존, 예를 들어, Wu et al., "piggyback is a Flexible and Highly Active Transposon as Compared to Sleeping Beauty, Tol2, and Mos1 in Mammalian Cells", PNAS 103(41):15008-13 (2006)), 슬리핑 뷰티 비-바이러스성 벡터 (SB transposon, 예를 들어, Hudecek et al., "Going Non-Viral: the Sleeping Beauty Transposon System Breaks on Through to the Clinical Side", Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 52(4):355-380 (2017) 참조), 또는 mRNA 벡터이다.
III. 냉동보존
A. 냉동보존 조성물
본 발명은 냉동보존 조성물, 예를 들어 정맥내 투여에, 예를 들어 NK 세포, 예를 들어 본원에 기술된 NK 세포를 정맥내 투여하기에 적합한 냉동보존 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 냉동보존 조성물 및 세포, 예를 들어 본원에 기술된 NK 세포를 포함한다.
1. 알부민
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 알부민 단백질, 예를 들어, 인간 알부민 단백질 (UniProtKB Accession P0278, 서열번호 21) 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 알부민 단백질, 예를 들어, 인간 알부민 단백질의 동원체, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 알부민 단백질, 예를 들어, 인간 알부민의 생물학적 활성 부분, 또는 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 알부민, 예를 들어, 인간 알부민은 용액으로서 제공되며, 이는 또한 본원에서 알부민 용액 또는 인간 알부민 용액으로 지칭된다. 이에 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 알부민 용액, 예를 들어 인간 알부민 용액이거나 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 용액은 무혈청 알부민 용액이다.
일부 구현예에서, 알부민 용액은 정맥내 이용하기 적합하다.
일부 구현예에서, 알부민 용액은 알부민을 40 또는 약 40 내지 200 또는 약 200 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 용액은 알부민, 예를 들어 인간 알부민을 40 또는 약 40 내지 50 또는 약 50 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 용액은 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 약 200 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 용액은 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 200 g/ℓ로 포함한다.
일부 구현예에서, 알부민 용액은 95% 이상이 알부민 단백질, 예를 들어, 인간 알부민 단백질인 단백질 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질의 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상이 알부민, 예를 들어, 인간 알부민이다.
일부 구현예에서, 알부민 용액은 소듐을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 용액은 소듐을 100 또는 약 100 내지 200 또는 약 200 mmol로 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 용액은 소듐을 130 또는 약 130 내지 160 또는 약 160 mmol로 포함한다.
일부 구현예에서, 알부민 용액은 포타슘을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 용액은 포타슘을 3 mmol 이하로 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 용액은 포타슘을 2 mmol 이하로 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 알부민 용액은 하나 이상의 안정화제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제(들)는 소듐 카프릴레이트, 카프릴산, (2S)-2-아세트아미도-3-(1H-인돌-3-일)프로판산 (본원에서 또한 다음과 같이 지칭됨: 아세틸 트립토판, N-아세틸-L-트립토판 및 아세틸-L-트립토판), 2-아세트아미도-3-(1H-인돌-3-일)프로판산 (또한 다음과 같이 지칭됨: N-아세틸트립토판, DL-아세틸트립토판 및 N-아세틸-DL-트립토판)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 용액은 용액 내 단백질 g 당 하나 이상의 안정화제를 각각 0.1 mmol 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 용액 내 단백질 g 당 안정화제를 각각 0.05 또는 약 0.05 내지 0.1 또는 내지 약 0.1, 예를 들어, 0.064 또는 약 0.064 내지 0.096 또는 약 0.096 mmol로 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 용액 내 단백질 g 당 전체 안정화제를 0.1 mmol 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 용액은 용액 내 단백질 g 당 전체 안정화제를 0.05 또는 약 0.05 내지 0.1 또는 약 0.1, 예를 들어, 0.064 또는 약 0.064 내지 0.096 또는 약 0.096 mmol로 포함한다.
일부 구현예에서, 알부민 용액은 수 중의, 알부민 단백질이 95% 이상인 단백질 조성물, 소듐, 포타슘 및 소듐 카프릴레이트, 카프릴산, (2S)-2-아세트아미도-3-(1H-인돌-3-일)프로판산 (본원에서 또한 다음과 같이 지칭됨: 아세틸 트립토판, N-아세틸-L-트립토판 및 아세틸-L-트립토판), 2-아세트아미도-3-(1H-인돌-3-일)프로판산 (또한 다음과 같이 지칭됨: N-아세틸트립토판, DL-아세틸트립토판 및 N-아세틸-DL-트립토판)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 안정화제로 구성된다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 알부민 용액, 예를 들어 본원에 기술된 알부민 용액을 10% v/v 또는 약 10% v/v 내지 50% 또는 약 50% v/v로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 10% 또는 약 10% 내지 50% 또는 약 50%, 10% 또는 약 10% 내지 45% 또는 약 45%, 10% 또는 약 10% 내지 40% 또는 약 40%, 10% 또는 약 10% 내지 35% 또는 약 35%, 10% 또는 약 10% 내지 30% 또는 약 30%, 10% 또는 약 10% 내지 25% 또는 약 25%, 10% 또는 약 10% 내지 20% 또는 약 20%, 10% 또는 약 10% 내지 15 또는 약 15%, 15% 또는 약 15% 내지 50% 또는 약 50%, 15% 또는 약 15% 내지 45% 또는 약 45%, 15% 또는 약 15% 내지 40% 또는 약 40%, 15% 또는 약 15% 내지 35% 또는 약 35%, 15% 또는 약 15% 내지 30% 또는 약 30%, 15% 또는 약 15% 내지 25% 또는 약 25%, 15% 또는 약 15% 내지 20% 또는 약 20%, 20% 또는 약 20% 내지 50% 또는 약 50%, 20% 또는 약 20% 내지 45% 또는 약 45%, 20% 또는 약 20% 내지 40% 또는 약 40%, 20% 또는 약 20% 내지 35% 또는 약 35%, 20% 또는 약 20% 내지 30% 또는 약 30%, 20% 또는 약 20% 내지 25% 또는 약 25%, 25% 또는 약 25% 내지 50% 또는 약 50%, 25% 또는 약 25% 내지 45% 또는 약 45%, 25% 또는 약 25% 내지 40% 또는 약 40%, 25% 또는 약 25% 내지 35% 또는 약 35%, 25% 또는 약 25% 내지 30% 또는 약 30%, 30% 또는 약 30% 내지 50% 또는 약 50%, 30% 또는 약 30% 내지 45% 또는 약 45%, 30% 또는 약 30% 내지 40% 또는 약 40%, 30% 또는 약 30% 내지 35% 또는 약 35%, 35% 또는 약 35% 내지 50% 또는 약 50%, 35% 또는 약 35% 내지 45% 또는 약 45%, 35% 또는 약 35% 내지 40% 또는 약 40%, 40% 또는 약 40% 내지 50% 또는 약 50%, 40% 또는 약 40% 내지 45% 또는 약 45%, 또는 45% 또는 약 45% 내지 50% 또는 약 50% v/v로 본원에 기술된 알부민 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% v/v로 본원에 기술된 알부민 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% v/v로 본원에 기술된 알부민 용액을 포함한다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 20 또는 약 20 내지 100 또는 약 100 g/ℓ로 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 20 또는 약 20 내지 100 또는 약 100, 20 또는 약 20 내지 90 또는 약 90, 20 또는 약 20 내지 80 또는 약 80, 20 또는 약 20 내지 70 또는 약 70, 20 또는 약 20 내지 60 또는 약 60, 20 또는 약 20 내지 50 또는 약 50, 20 또는 약 20 내지 40 또는 약 40, 20 또는 약 20 내지 30 또는 약 30, 30 또는 약 30 내지 100 또는 약 100, 30 또는 약 30 내지 90 또는 약 90, 30 또는 약 30 내지 80 또는 약 80, 30 또는 약 30 내지 70 또는 약 70, 30 또는 약 30 내지 60 또는 약 60, 30 또는 약 30 내지 50 또는 약 50, 30 또는 약 30 내지 40 또는 약 40, 40 또는 약 40 내지 100 또는 약 100, 40 또는 약 40 내지 90 또는 약 90, 40 또는 약 40 내지 80 또는 약 80, 40 또는 약 40 내지 70 또는 약 70, 40 또는 약 40 내지 60 또는 약 60, 40 또는 약 40 내지 50 또는 약 50, 50 또는 약 50 내지 100 또는 약 100, 50 또는 약 50 내지 90 또는 약 90, 50 또는 약 50 내지 80 또는 약 80, 50 또는 약 50 내지 70 또는 약 70, 50 또는 약 50 내지 60 또는 약 60, 60 또는 약 60 내지 100 또는 약 100, 60 또는 약 60 내지 90 또는 약 90, 60 또는 약 60 내지 80 또는 약 80, 60 또는 약 60 내지 70 또는 약 70, 70 또는 약 70 내지 100 또는 약 100, 70 또는 약 70 내지 90 또는 약 90, 70 또는 약 70 내지 80 또는 약 80, 80 또는 약 80 내지 100 또는 약 100, 80 또는 약 80 내지 90 또는 약 90, 또는 90 또는 약 90 내지 100 또는 약 100 g/ℓ로 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 포함한다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 20 g/ℓ로 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 40 g/ℓ로 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 70 g/ℓ로 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 100 g/ℓ로 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 포함한다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 약 20 g/ℓ로 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 약 40 g/ℓ로 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 약 70 g/ℓ로 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 약 100 g/ℓ로 알부민, 예를 들어, 인간 알부민을 포함한다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 안정화제, 예를 들어, 알부민 안정화제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화제(들)는 소듐 카프릴레이트, 카프릴산, (2S)-2-아세트아미도-3-(1H-인돌-3-일)프로판산 (본원에서 또한 다음과 같이 지칭됨: 아세틸 트립토판, N-아세틸-L-트립토판 및 아세틸-L-트립토판), 2-아세트아미도-3-(1H-인돌-3-일)프로판산 (또한 다음과 같이 지칭됨: N-아세틸트립토판, DL-아세틸트립토판 및 N-아세틸-DL-트립토판)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 조성물 내 단백질, 예를 들어 알부민 단백질 g 당 하나 이상의 안정화제를 각각 0.1 mmol 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 조성물 내 단백질, 예를 들어 알부민 단백질 g 당 안정화제를 각각 0.05 또는 약 0.05 내지 0.1 또는 약 0.1, 예를 들어, 0.064 또는 약 0.064 내지 0.096 또는 약 0.096 mmol로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 냉동보존 조성물 내 단백질, 예를 들어 알부민 단백질 g 당 전체 안정화제를 0.1 mmol 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 냉동보존 조성물 내 단백질, 예를 들어 알부민 단백질 g 당 전체 안정화제를 0.05 또는 약 0.05 내지 0.1 또는 약 0.1, 예를 들어, 0.064 또는 약 0.064 내지 0.096 또는 약 0.096 mmol로 포함한다.
2. 덱스트란
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 덱스트란 또는 그 유도체를 포함한다.
덱스트란은 대략 95%가 α-D-(1-6) 연결로 구성된 안하이드로글루코스 폴리머((C6H10O5)n으로 명명됨)이다. 덱스트란 분획은 분자량 약 1,000 달톤 내지 약 2,000,000 달톤으로 제공된다. 이는 번호 (덱스트란 X)로, 예를 들어, 덱스트란 1, 덱스트란 10, 덱스트란 40, 덱스트란 70 등으로 표시하며, 여기서 X는 평균 분자량을 1,000 달톤으로 나눈 것이다. 그래서, 예를 들어, 덱스트란 40은 평균 분자량이 40,000 달톤 또는 약 40,000 달톤이다.
일부 구현예에서, 덱스트란의 평균 분자량은 1,000 달톤 또는 약 1,000 달톤 내지 2,000 또는 약 2,000,000 달톤이다. 일부 구현예에서, 덱스트란의 평균 분자량은 40,000 달톤 또는 약 40,000 달톤이다. 일부 구현예에서, 덱스트란의 평균 분자량은 70,000 달톤 또는 약 70,000 달톤이다.
일부 구현예에서, 덱스트란은 덱스트란 40, 덱스트란 70, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 덱스트란은 덱스트란 40이다.
일부 구현예에서, 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40은 용액으로서, 또한 본원에서 언급되는 바와 같이 덱스트란 용액으로서 또는 덱스트란 40 용액으로서 제공된다. 따라서, 일부 구현예에서, 조성물은 덱스트란 용액, 예를 들어 덱스트란 40 용액을 포함한다.
일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 정맥내 이용하기 적합하다.
일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 약 5% 내지 약 50% w/w로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 5% 또는 약 5% 내지 50% 또는 약 50%, 5% 또는 약 5% 내지 45% 또는 약 45%, 5% 또는 약 5% 내지 40% 또는 약 40%, 5% 또는 약 5% 내지 35% 또는 약 35%, 5% 또는 약 5% 내지 30% 또는 약 30%, 5% 또는 약 5% 내지 25% 또는 약 25%, 5% 또는 약 5% 내지 20% 또는 약 20%, 5% 또는 약 5% 내지 15 또는 약 15%, 5% 또는 약 5% 내지 10% 또는 약 10%, 10% 또는 약 10% 내지 50% 또는 약 50%, 10% 또는 약 10% 내지 45% 또는 약 45%, 10% 또는 약 10% 내지 40% 또는 약 40%, 10% 또는 약 10% 내지 35% 또는 약 35%, 10% 또는 약 10% 내지 30% 또는 약 30%, 10% 또는 약 10% 내지 25% 또는 약 25%, 10% 또는 약 10% 내지 20% 또는 약 20%, 10% 또는 약 10% 내지 15 또는 약 15%, 15% 또는 약 15% 내지 50% 또는 약 50%, 15% 또는 약 15% 내지 45% 또는 약 45%, 15% 또는 약 15% 내지 40% 또는 약 40%, 15% 또는 약 15% 내지 35% 또는 약 35%, 15% 또는 약 15% 내지 30% 또는 약 30%, 15% 또는 약 15% 내지 25% 또는 약 25%, 15% 또는 약 15% 내지 20% 또는 약 20%, 20% 또는 약 20% 내지 50% 또는 약 50%, 20% 또는 약 20% 내지 45% 또는 약 45%, 20% 또는 약 20% 내지 40% 또는 약 40%, 20% 또는 약 20% 내지 35% 또는 약 35%, 20% 또는 약 20% 내지 30% 또는 약 30%, 20% 또는 약 20% 내지 25% 또는 약 25%, 25% 또는 약 25% 내지 50% 또는 약 50%, 25% 또는 약 25% 내지 45% 또는 약 45%, 25% 또는 약 25% 내지 40% 또는 약 40%, 25% 또는 약 25% 내지 35% 또는 약 35%, 25% 또는 약 25% 내지 30% 또는 약 30%, 30% 또는 약 30% 내지 50% 또는 약 50%, 30% 또는 약 30% 내지 45% 또는 약 45%, 30% 또는 약 30% 내지 40% 또는 약 40%, 30% 또는 약 30% 내지 35% 또는 약 35%, 35% 또는 약 35% 내지 50% 또는 약 50%, 35% 또는 약 35% 내지 45% 또는 약 45%, 35% 또는 약 35% 내지 40% 또는 약 40%, 40% 또는 약 40% 내지 50% 또는 약 50%, 40% 또는 약 40% 내지 45% 또는 약 45%, 또는 45% 또는 약 45% 내지 50% 또는 약 50% w/w로 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% w/w로 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% w/w로 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 포함한다.
일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 25 또는 약 25 g/ℓ 내지 200 또는 약 200 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 덱스트란, 예를 들어 덱스트란 40을 35 또는 약 35 내지 200 또는 약 200, 25 또는 약 25 내지 175 또는 약 175, 25 또는 약 25 내지 150 또는 약 150, 25 또는 약 25 내지 125 또는 약 125, 25 또는 약 25 내지 100 또는 약 100, 25 또는 약 25 내지 75 또는 약 75, 25 또는 약 25 내지 50 또는 약 50, 50 또는 약 50 내지 200 또는 약 200, 50 또는 약 50 내지 175 또는 약 175, 50 또는 약 50 내지 150 또는 약 150, 50 또는 약 50 내지 125 또는 약 125, 50 또는 약 50 내지 100 또는 약 100, 50 또는 약 50 내지 75 또는 약 75, 75 또는 약 75 내지 200 또는 약 200, 75 또는 약 75 내지 175 또는 약 175, 75 또는 약 75 내지 150 또는 약 150, 75 또는 약 75 내지 125 또는 약 125, 75 또는 약 75 내지 100 또는 약 100, 100 또는 약 100 내지 200 또는 약 200, 100 또는 약 100 내지 175 또는 약 175, 100 또는 약 100 내지 150 또는 약 150, 100 또는 약 100 내지 125 또는 약 125, 125 또는 약 125 내지 200 또는 약 200, 125 또는 약 125 내지 175 또는 약 175, 125 또는 약 125 내지 150 또는 약 150, 150 또는 약 150 내지 200 또는 약 200, 150 또는 약 150 내지 175 또는 약 175, 또는 175 또는 약 175 내지 200 또는 약 200 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 또는 200 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 100 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 약 25, 약 50, 약 75, 약 100, 약 125, 약 150, 약 175, 또는 약 200 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 약 100 g/ℓ로 포함한다.
일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 글루코스 (또한 다음과 같이 지칭됨: 덱스트로스)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 글루코스를 10 또는 약 10 g/ℓ 내지 100 또는 약 100 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 글루코스를 10 또는 약 10 내지 100 또는 약 100, 10 또는 약 10 내지 90 또는 약 90, 10 또는 약 10 내지 80 또는 약 80, 10 또는 약 10 내지 70 또는 약 70, 10 또는 약 10 내지 60 또는 약 60, 10 또는 약 10 내지 50 또는 약 50, 10 또는 약 10 내지 40 또는 약 40, 10 또는 약 10 내지 30 또는 약 30, 10 또는 약 10 내지 20 또는 약 20, 20 또는 약 20 내지 100 또는 약 100, 20 또는 약 20 내지 90 또는 약 90, 20 또는 약 20 내지 80 또는 약 80, 20 또는 약 20 내지 70 또는 약 70, 20 또는 약 20 내지 60 또는 약 60, 20 또는 약 20 내지 50 또는 약 50, 20 또는 약 20 내지 40 또는 약 40, 20 또는 약 20 내지 30 또는 약 30, 30 또는 약 30 내지 100 또는 약 100, 30 또는 약 30 내지 90 또는 약 90, 30 또는 약 30 내지 80 또는 약 80, 30 또는 약 30 내지 70 또는 약 70, 30 또는 약 30 내지 60 또는 약 60, 30 또는 약 30 내지 50 또는 약 50, 30 또는 약 30 내지 40 또는 약 40, 40 또는 약 40 내지 100 또는 약 100, 40 또는 약 40 내지 90 또는 약 90, 40 또는 약 40 내지 80 또는 약 80, 40 또는 약 40 내지 70 또는 약 70, 40 또는 약 40 내지 60 또는 약 60, 40 또는 약 40 내지 50 또는 약 50, 50 또는 약 50 내지 100 또는 약 100, 50 또는 약 50 내지 90 또는 약 90, 50 또는 약 50 내지 80 또는 약 80, 50 또는 약 50 내지 70 또는 약 70, 50 또는 약 50 내지 60 또는 약 60, 60 또는 약 60 내지 100 또는 약 100, 60 또는 약 60 내지 90 또는 약 90, 60 또는 약 60 내지 80 또는 약 80, 60 또는 약 60 내지 70 또는 약 70, 70 또는 약 70 내지 100 또는 약 100, 70 또는 약 70 내지 90 또는 약 90, 70 또는 약 70 내지 80 또는 약 80, 80 또는 약 80 내지 90 또는 약 90, 80 또는 약 80 내지 100 또는 약 100, 80 또는 약 80 내지 90 또는 약 90, 또는 90 또는 약 90 내지 100 또는 약 100 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 글루코스를 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 글루코스를 50 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 글루코스를 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 또는 약 100 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 글루코스를 50 g/ℓ로 포함한다.
일부 구현예에서, 덱스트란 용액은 수 중의 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40, 및 글루코스로 구성된다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 본원에 기술된 덱스트란 용액을 10% 또는 약 10% v/v 내지 50% 또는 약 50% v/v로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 덱스트란 용액, 예를 들어 본원에 기술된 덱스트란 용액을 10% 또는 약 10% 내지 50%, 10% 또는 약 10% 내지 45% 또는 약 45%, 10% 또는 약 10% 내지 40% 또는 약 40%, 10% 또는 약 10% 내지 35% 또는 약 35%, 10% 또는 약 10% 내지 30% 또는 약 30%, 10% 또는 약 10% 내지 25% 또는 약 25%, 10% 또는 약 10% 내지 20% 또는 약 20%, 10% 또는 약 10% 내지 15 또는 약 15%, 15% 또는 약 15% 내지 50% 또는 약 50%, 15% 또는 약 15% 내지 45% 또는 약 45%, 15% 또는 약 15% 내지 40% 또는 약 40%, 15% 또는 약 15% 내지 35% 또는 약 35%, 15% 또는 약 15% 내지 30% 또는 약 30%, 15% 또는 약 15% 내지 25% 또는 약 25%, 15% 또는 약 15% 내지 20% 또는 약 20%, 20% 또는 약 20% 내지 50% 또는 약 50%, 20% 또는 약 20% 내지 45% 또는 약 45%, 20% 또는 약 20% 내지 40% 또는 약 40%, 20% 또는 약 20% 내지 35% 또는 약 35%, 20% 또는 약 20% 내지 30% 또는 약 30%, 20% 또는 약 20% 내지 25% 또는 약 25%, 25% 또는 약 25% 내지 50% 또는 약 50%, 25% 또는 약 25% 내지 45% 또는 약 45%, 25% 또는 약 25% 내지 40% 또는 약 40%, 25% 또는 약 25% 내지 35% 또는 약 35%, 25% 또는 약 25% 내지 30% 또는 약 30%, 30% 또는 약 30% 내지 50% 또는 약 50%, 30% 또는 약 30% 내지 45% 또는 약 45%, 30% 또는 약 30% 내지 40% 또는 약 40%, 30% 또는 약 30% 내지 35% 또는 약 35%, 35% 또는 약 35% 내지 50% 또는 약 50%, 35% 또는 약 35% 내지 45% 또는 약 45%, 35% 또는 약 35% 내지 40% 또는 약 40%, 40% 또는 약 40% 내지 50% 또는 약 50%, 40% 또는 약 40% 내지 45% 또는 약 45%, 또는 45% 또는 약 45% 내지 50% 또는 약 50% v/v로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 덱스트란 용액, 예를 들어 본원에 기술된 덱스트란 용액을 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% v/v로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 덱스트란 용액, 예를 들어 본원에 기술된 덱스트란 용액을 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% v/v로 포함한다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 10 또는 약 10 내지 50 또는 약 50 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 10 또는 약 10 내지 50 또는 약 50, 10 또는 약 10 내지 45 또는 약 45, 10 또는 약 10 내지 40 또는 약 40, 10 또는 약 10 내지 35 또는 약 35, 10 또는 약 10 내지 30 또는 약 30, 10 또는 약 10 내지 25 또는 약 25, 10 또는 약 10 내지 20 또는 약 20, 10 또는 약 10 내지 15 또는 약 15, 15 또는 약 15 내지 50 또는 약 50, 15 또는 약 15 내지 45 또는 약 45, 15 또는 약 15 내지 40 또는 약 40, 15 또는 약 15 내지 35 또는 약 35, 15 또는 약 15 내지 30 또는 약 30, 15 또는 약 15 내지 25 또는 약 25, 15 또는 약 15 내지 20 또는 약 20, 20 또는 약 20 내지 50 또는 약 50, 20 또는 약 20 내지 45 또는 약 45, 20 또는 약 20 내지 40 또는 약 40, 20 또는 약 20 내지 30 또는 약 30, 20 또는 약 20 내지 25 또는 약 25, 25 또는 약 25 내지 50 또는 약 50, 25 또는 약 25 내지 45 또는 약 45, 25 또는 약 25 내지 40 또는 약 40, 25 또는 약 25 내지 35 또는 약 35, 25 또는 약 25 내지 30 또는 약 30, 30 또는 약 30 내지 50 또는 약 50, 30 또는 약 30 내지 45 또는 약 45, 30 또는 약 30 내지 40 또는 약 40, 30 또는 약 30 내지 35 또는 약 35, 35 또는 약 35 내지 50 또는 약 50, 35 또는 약 35 내지 45 또는 약 45, 35 또는 약 35 내지 40 또는 약 40, 40 또는 약 40 내지 50 또는 약 50, 40 또는 약 40 내지 45 또는 약 45, 또는 45 또는 약 45 내지 50 또는 약 50 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 10, 15, 20, 25, 30, 30, 35, 40, 45 또는 50 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40을 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50 g/ℓ로 포함한다.
3. 글루코스
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같이, 냉동보존 조성물은 글루코스를 포함하는 덱스트란 용액을 포함한다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 포함하지 않는 덱스트란 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 덱스트란 용액에 글루코스가 포함되지 않을 경우, 냉동보존 조성물에 글루코스는 별도로 첨가된다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 5 또는 약 5 내지 25 또는 약 25 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 5 또는 약 5 내지 25 또는 약 25, 5 또는 약 5 내지 20 또는 약 20, 5 또는 약 5 내지 15 또는 약 15, 5 또는 약 5 내지 10 또는 약 10, 10 또는 약 10 내지 25 또는 약 25, 10 또는 약 10 내지 20 또는 약 20, 10 또는 약 10 내지 15 또는 약 15, 15 또는 약 15 내지 25 또는 약 25, 15 또는 약 15 내지 20 또는 약 20, 또는 20 또는 약 20 내지 25 또는 약 25 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 5, 7.5, 10, 12.5, 15, 17.5, 20, 22.5 또는 25 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 12.5 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 약 5, 약 7.5, 약 10, 약 12.5, 약 15, 약 17.5, 약 20, 약 22.5, 또는 약 25 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 약 12.5 g/ℓ로 포함한다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 2.75% w/v 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 27.5 g/ℓ 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 2% w/v 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 1.5% w/v 미만으로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 약 1.25% w/v 이하로 포함한다.
4. 다이메틸 설폭사이드
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 다이메틸 설폭사이드 (DMSO, 메틸 설폭사이드 및 메틸설피닐메탄이라고도 함)를 포함한다.
일부 구현예에서, DMSO는 본원에서 DMSO 용액으로도 언급되는 용액으로 제공된다. 이에, 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO 용액을 포함한다.
일부 구현예에서, DMSO 용액은 정맥내 이용하기 적합하다.
일부 구현예에서, DMSO 용액은 DMSO를 1.1 g/㎖로 포함한다. 일부 구현예에서, DMSO 용액은 DMSO를 약 1.1 g/㎖로 포함한다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO 용액을 1% 또는 약 1% 내지 10% 또는 약 10% v/v로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO 용액을 1% 또는 약 1% 내지 10% 또는 약 10%, 1% 또는 약 1% 내지 9% 또는 약 9%, 1% 또는 약 1% 내지 8% 또는 약 8%, 1% 또는 약 1% 내지 7% 또는 약 7%, 1% 또는 약 1% 내지 6% 또는 약 6%, 1% 또는 약 1% 내지 5% 또는 약 5%, 1% 또는 약 1% 내지 4% 또는 약 4%, 1% 또는 약 1% 내지 3% 또는 약 3%, 1% 또는 약 1% 내지 2% 또는 약 2%, 2% 또는 약 2% 내지 10% 또는 약 10%, 2% 또는 약 2% 내지 9% 또는 약 9%, 8% 또는 약 8%, 2% 또는 약 2% 내지 7% 또는 약 7%, 2% 또는 약 2% 내지 6% 또는 약 6%, 2% 또는 약 2% 내지 5% 또는 약 5%, 2% 또는 약 2% 내지 4% 또는 약 4%, 2% 또는 약 2% 내지 3% 또는 약 3%, 3% 또는 약 3% 내지 10% 또는 약 10%, 3% 또는 약 3% 내지 9% 또는 약 9%, 3% 또는 약 3% 내지 8% 또는 약 8%, 3% 또는 약 3% 내지 7% 또는 약 7%, 3% 또는 약 3% 내지 6% 또는 약 6%, 3% 또는 약 3% 내지 5% 또는 약 5%, 3% 또는 약 3% 내지 4% 또는 약 4%, 4% 또는 약 4% 내지 10% 또는 약 10%, 4% 또는 약 4% 내지 9% 또는 약 9%, 4% 또는 약 4% 내지 8% 또는 약 8%, 4% 또는 약 4% 내지 7% 또는 약 7%, 4% 또는 약 4% 내지 6% 또는 약 6%, 4% 또는 약 4% 내지 5% 또는 약 5%, 5% 또는 약 5% 내지 10% 또는 약 10%, 5% 또는 약 5% 내지 9% 또는 약 9%, 5% 또는 약 5% 내지 8% 또는 약 8%, 5% 또는 약 5% 내지 7% 또는 약 7%, 5% 또는 약 5% 내지 6% 또는 약 6%, 6% 또는 약 6% 내지 10% 또는 약 10%, 6% 또는 약 6% 내지 9% 또는 약 9%, 6% 또는 약 6% 내지 8% 또는 약 8%, 6% 또는 약 6% 내지 7% 또는 약 7%, 7% 또는 약 7% 내지 10% 또는 약 10%, 7% 또는 약 7% 내지 9% 또는 약 9%, 7% 또는 약 7% 내지 8% 또는 약 8%, 8% 또는 약 8% 내지 10% 또는 약 10%, 8% 또는 약 8% 내지 9% 또는 약 9% 또는 9% 또는 약 9% 내지 10% 또는 약 10% v/v로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO 용액을 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% v/v로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO 용액을 5%로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO 용액을 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 또는 약 10% v/v로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO 용액을 약 5%로 포함한다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO를 11 또는 약 11 내지 110 또는 약 110 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO를 11 또는 약 11 내지 110 또는 약 110, 11 또는 약 11 내지 99 또는 약 99, 11 또는 약 11 내지 88 또는 약 88, 11 또는 약 11 내지 77 또는 약 77, 11 또는 약 11 내지 66 또는 약 66, 11 또는 약 11 내지 55 또는 약 55, 11 또는 약 11 내지 44 또는 약 44, 11 또는 약 11 내지 33 또는 약 33, 11 또는 약 11 내지 22 또는 약 22, 22 또는 약 22 내지 110 또는 약 110, 22 또는 약 22 내지 99 또는 약 99, 22 또는 약 22 내지 88 또는 약 88, 22 또는 약 22 내지 77 또는 약 77, 22 또는 약 22 내지 77 또는 약 77, 22 또는 약 22 내지 66 또는 약 66, 22 또는 약 22 내지 55 또는 약 55, 22 또는 약 22 내지 44 또는 약 44, 22 또는 약 22 내지 33 또는 약 33, 33 또는 약 33 내지 110 또는 약 110, 33 또는 약 33 내지 99 또는 약 99, 33 또는 약 33 내지 88 또는 약 88, 33 또는 약 33 내지 77 또는 약 77, 33 또는 약 33 내지 66 또는 약 66, 33 또는 약 33 내지 55 또는 약 55, 33 또는 약 33 내지 44 또는 약 44, 44 또는 약 44 내지 110 또는 약 110, 44 또는 약 44 내지 99 또는 약 99, 44 또는 약 44 내지 88 또는 약 88, 44 또는 약 44 내지 77 또는 약 77, 44 또는 약 44 내지 66 또는 약 66, 44 또는 약 44 내지 55 또는 약 55, 55 또는 약 55 내지 110 또는 약 110, 55 또는 약 55 내지 99 또는 약 99, 55 또는 약 55 내지 88 또는 약 88, 55 또는 약 55 내지 77 또는 약 77, 55 또는 약 55 내지 66 또는 약 66, 66 또는 약 66 내지 110 또는 약 110, 66 또는 약 66 내지 99 또는 약 99, 66 또는 약 66 내지 88 또는 약 88, 66 또는 약 66 내지 77 또는 약 77, 77 또는 약 77 내지 119 또는 약 119, 77 또는 약 77 내지 88 또는 약 88, 88 또는 약 88 내지 110 또는 약 110, 88 또는 약 88 내지 99 또는 약 99, 또는 99 또는 약 99 내지 110 또는 약 110 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO를 11, 22, 33, 44, 55, 66, 77, 88, 99 또는 110 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO를 55 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO를 약 11, 약 22, 약 33, 약 44, 약 55, 약 66, 약 77, 약 88, 약 99, 또는 약 110 g/ℓ로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 DMSO를 약 55 g/ℓ로 포함한다.
5. 완충제
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 완충제 용액, 예를 들어 정맥내 투여하기에 적합한 완충제 용액을 포함한다.
완충제 용액으로는 포스페이트 완충화된 염수 (PBS), 링거액, Tyrode의 완충제, Hank의 균형된 염 용액 (Hank's balanced salt solution), Earle의 균형 염 용액, 염수 및 트리스 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 완충제 용액은 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)이다.
6. 예시적인 냉동보존 조성물
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 다음 구성성분들을 포함하거나 또는 이로 구성된다: 1) 알부민, 예를 들어, 인간 알부민, 2) 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40, 3) DMSO, 및 4) 완충제 용액. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 글루코스를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 1) 알부민, 예를 들어, 인간 알부민, 2) 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40, 3) 글루코스, 4) DMSO, 및 5) 완충제 용액으로 구성된다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 1) 본원에 기술된 알부민 용액, 2) 본원에 기술된 덱스트란 용액, 3) 본원에 기술된 DMSO 용액 및 4) 완충제 용액을 포함한다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 1) 본원에 기술된 알부민 용액, 2) 본원에 기술된 덱스트란 용액, 3) 본원에 기술된 DMSO 용액 및 4) 완충제 용액으로 구성된다.
일부 구현예에서, 냉동보존 조성물은 세포 배양 배지를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 냉동보존 조성물은 약 40 ㎎/㎖ 인간 알부민, 25 ㎎/㎖ 덱스트란 40, 12.5 ㎎/㎖ 글루코스 및 55 ㎎/㎖ DMSO를 포함한다.
일 구현예에서, 냉동보존 조성물은 수 중의 약 40 ㎎/㎖ 인간 알부민, 25 ㎎/㎖ 덱스트란 40, 12.5 ㎎/㎖ 글루코스, 55 ㎎/㎖ DMSO, 및 0.5 ㎖/㎖ 100% 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
일 구현예에서, 냉동보존 조성물은 약 32 ㎎/㎖ 인간 알부민, 25 ㎎/㎖ 덱스트란 40, 12.5 ㎎/㎖ 글루코스 및 55 ㎎/㎖ DMSO를 포함한다.
일 구현예에서, 냉동보존 조성물은 수 중의 약 32 ㎎/㎖ 인간 알부민, 25 ㎎/㎖ 덱스트란 40, 12.5 ㎎/㎖ 글루코스, 55 ㎎/㎖ DMSO, 및 0.54 ㎖/㎖ 100% 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)를 포함하거나 또는 이들로 구성된다.
냉동보존 조성물의 예들을 표 3에 나타낸다.
예시적인 냉동보존 조성물
부형제 용액 용액의 농도 범위 용액 농도 예 냉동보존 조성물에서의 v/ v% 범위 예
알부민 용액 40-200 g/ℓ 알부민 수용액 200 g/ℓ 알부민 10%-50%
덱스트란 40 용액 25-200 g/ℓ 덱스트란 40; 0-100 g/ℓ 글루코스; 물 100 g/ℓ 덱스트란 40; 50 g/ℓ 글루코스 10%-50%
DMSO 11-110 g/ℓ DMSO / 물 1,100 g/ℓ DMSO 1%-10%
완충제 소정의 부피까지 소정의 부피까지 소정의 부피까지
냉동보존 조성물 예 #1
부형제 용액 용액 조성물 냉동보존 조성물 #1에서의 v/ v% 예 냉동보존 조성물 #1에서의 최종 농도
알부민 용액 200 g/ℓ 알부민 수용액 20% 40 ㎎/㎖ 알부민
덱스트란 40 용액 100 g/ℓ 덱스트란 40; 50 g/ℓ 글루코스; 물 25% 25 ㎎/㎖ 덱스트란 40;
12.5 ㎎/㎖ 글루코스
DMSO 100% DMSO (1,100 g/ℓ) 5% 55 ㎎/㎖
완충제 100% 포스페이트 완충화된 염수 (PBS) 50% 0.5 ㎖/㎖
냉동보존 조성물 예 #2
부형제 용액 용액 조성물 냉동보존 조성물 #2에서의 v/ v% 예 냉동보존 조성물 #2에서의 최종 농도
알부민 용액 200 g/ℓ 알부민 수용액 16% 32 ㎎/㎖ 알부민
덱스트란 40 용액 100 g/ℓ 덱스트란 40; 50 g/ℓ 글루코스; 물 25% 25 ㎎/㎖ 덱스트란 40;
12.5 ㎎/㎖ 글루코스
DMSO 100% DMSO (1,100 g/ℓ) 5% 55 ㎎/㎖
완충제 100% 포스페이트 완충화된 염수 (PBS) 54% 0.54 ㎖/㎖
B. 냉동보존법
본원에 기술된 냉동보존 조성물은 세포(들), 예를 들어, 치료학적 세포, 예를 들어, 자연살해 (NK) 세포(들), 예를 들어 본원에 기술된 NK 세포(들)를 냉동보존하기 위해 이용할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포(들)는 동물 세포(들)이다. 일부 구현예에서, 세포(들)는 인간 세포(들)이다.
일부 구현예에서, 세포(들)는 면역 세포(들)이다. 일부 구현예에서, 면역 세포(들)는 호염구, 호산구, 호중구, 비만 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 자연살해세포, B 세포, T 세포 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 세포(들)는 자연살해 (NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 자연살해세포(들)는 본원에 기술된 방법에 의해 증폭 및 자극된다.
일부 구현예에서, 세포(들)의 냉동보존은 세포(들)를 본원에 기술된 냉동보존 조성물 또는 이의 구성성분과 혼합해 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 제조하는 단계; 및 혼합물을 냉동하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포(들)의 냉동보존은 세포(들)를 포함하는 조성물을 본원에 기술된 냉동보존 조성물 또는 이의 구성성분과 혼합해 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 제조하는 단계; 혼합물을 냉동하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포(들)를 포함하는 조성물은 세포(들) 및 완충제를 포함한다. 적합한 완충제에 본원에 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 세포(들)의 냉동보존은 세포(들) 및 완충제, 예를 들어, PBS를 포함하는 조성물을 알부민, 덱스트란 및 DMSO를 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 포함하는 조성물과 혼합하는 단계; 혼합물을 냉동하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포(들)의 냉동보존은 세포(들) 및 완충제, 예를 들어, PBS를 1:1로 포함하는 조성물을 40 ㎎/㎖ 알부민, 예를 들어, 인간 알부민, 25 ㎎/㎖ 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40, 12.5 ㎎/㎖ 글루코스 및 55 ㎎/㎖ DMSO를 포함하는 조성물과 혼합하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포(들) 및 완충제, 예를 들어, PBS를 포함하는 조성물은 세포를 2x107 또는 약 2x107 내지 2x109 또는 약 2x109 세포/㎖로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포(들) 및 완충제, 예를 들어, PBS를 포함하는 조성물은 2x108 세포/㎖을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포(들) 및 완충제, 예를 들어, PBS를 포함하는 조성물은 약 2x108 세포/㎖을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 냉동보존은 세포(들), 완충제, 예를 들어, PBS, 알부민, 예를 들어, 인간 알부민, 덱스트란, 예를 들어, 덱스트란 40 및 DMSO를 혼합하는 단계; 혼합물을 냉동하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 혼합물은 1x107 또는 약 1x107 내지 1x109 또는 약 1x109 세포/㎖을 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합물은 1x108 세포/㎖을 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합물은 약 1x108 세포/㎖을 포함한다.
적절한 알부민, 덱스트란 및 DMSO 범위는 상기에 기술된다.
일부 구현예에서, 조성물은 -135℃ 이하에서 냉동한다.
일부 구현예에서, 조성물은 제어된 속도로 냉동한다.
IV. 항체
일부 구현예에서, HER2 표적 항체는 표 6으로부터 선택되는 EGFR 표적 항체 또는 이들의 조합이다.
HER2 표적 항체 예
명칭 국내 명칭 항원 회사 참고문헌
트라스투주맙 Herceptin, RG597, anti-p185-HER2, huMAb4D5-8, rhuMAb HER2 HER2/neu Genentech,　Roche Nemeth et al., Br J Pharmacol. 2017 Nov;174(21):3727-3748
마르게툭시맙 MARGENZA, MGAH22, 4D5 HER2/neu MacroGenics,　Zai Lab Catenacci et al., Lancet Oncol. 2020 Aug;21(8):1066-1076
퍼투주맙 Perjeta, rhuMAb 2C4, RG1273 HER2/neu Genentech Gianni et al., Lancet Oncol. 2012 Jan;13(1):25-32
트라스투주맙 엠탄신 Kadcyla, PRO132365, trastuzumab-MCC-DM1, Trastuzumab-DM1, T-DM1, RG3502 HER2/neu Genentech,　ImmunoGen,　PDL,　Roche Minckwitz et al., N Engl J Med. 2019 Feb 14;380(7):617-628
PF-05280014 Trazimera, Trastuzumab-Pfizer HER2/neu Pfizer Pegram et al., Br J Cancer. 2019 Jan;120(2):172-182
트라스투주맙-anns Kanjinti, ABP 980 HER2/neu Allergan,　Amgen Trial ID: NCT04644406
HLX02 Zercepac, Han Quyou HER2/neu Shanghai Henlius Zhu et al. Cancer Chemother Pharmacol. 2021 Mar;87(3):349-359,
트라스투주맙-dkst Ogivri, Hercules, Myl1401O, Myl-1401O, Bmab-200, CANMAb HER2/neu Biocon,　Mylan Waller et al., Br J Clin Pharmacol. 2018 Oct;84(10):2336-2343
Hervycta HER2/neu Dr. Reddy's
ARX788 HER2/neu Ambrx,　Zhejiang Medicine Trial ID: NCT04829604
ADCT-502 ADC Therapeutics patent anti-Her2 HER2/neu ADC Therapeutics,　Medimmune Trial ID: NCT03125200
FS102 Fcab H10-03-6 HER2/neu BMS,　f-star Trial ID: NCT02286219
GBR1302 Glenmark patent anti-Her2 CD3,　HER2/neu Glenmark / Ichnos,　Harbour Biomed Ltd. Trial ID: NCT02829372
M802 CD3,　HER2/neu Wuhan YZY Biopharma Yu et al., J Exp Clin Cancer Res. 2019 Aug 14;38(1):355
트라스투주맙-TCMC TCMC-trastuzumab HER2/neu NCI Milenic et al., Pharmaceuticals (Basel). 2015 Jul 29;8(3):435-54
자니다타맙 조보도틴 MEDI4276, Medimmune patent anti-Her2 Bispecific HER2/neu Medimmune Trial ID: NCT02576548
ALT-P7 HM2-MMAE HER2/neu 3SBio,　Alteogen Trial ID: NCT03281824
XMT-1522 HT-19 HER2/neu Adimab,　Mersana,　Takeda Trial ID: NCT02952729
KN026 HER2/neu Alphamab Trial ID: NCT04521179
Baylor Coll.Med. anti-Her2 CAR HER2-CAR HER2/neu Baylor Coll.Med. Trial ID: NCT02442297
King's College anti-Her2 CAR T1E28z HER2/neu King's College Trial ID: NCT01818323
DMB-3111 DMB3111 HER2/neu Meiji Seika Trial ID: NCT02100917
티미구투주맙 TrasGEX, TrastuzuMab-GEX, GT-Mab 7.3-GEX HER2/neu Glycotope Fiedler et al., ESMO Open. 2018 Jun 23;3(4):e000381
UB-921 HER2/neu United Biopharma Trial ID: NCT03013881
ZW49 HER2/neu Zymeworks Trial ID: NCT03821233
IBI315 IBI-315 HER2/neu,　PD-1 Beijing Hanmi,　Innovent Trial ID: NCT04162327
RG6194 BTRC4017A HER2/neu Genentech Trial ID: NCT03448042
RG6148 DHES0815A HER2/neu Genentech Trial ID: NCT03451162
U.Virginia anti-Her2 / CD3 Her2Bi CD3,　HER2/neu U.Virginia Trial ID: NCT03661424
NJH395 HER2/neu Novartis Trial ID: NCT03696771
BCD-147 BDC-147 HER2/neu Biocad Trial ID: NCT03912441
B003 HER2/neu Shanghai Pharma Holdings Trial ID: NCT03953833
FS-1502　 Trastuzumab Monomethyl Auristatin F HER2/neu Fosun Pharma Trial ID: NCT03944499
DP303c HER2/neu CSPC Pharma Trial ID: NCT04146610
BAY2701439 BAY2701438 HER2/neu Bayer Trial ID: NCT04147819
BDC-1001 HER2/neu Bolt Bio Trial ID: NCT04278144
SBT6050 HER2/neu Silverback Trial ID: NCT04460456
B002　 HER2/neu Shanghai Pharma Holdings Trial ID: NCT04382352
GQ1001 HER2/neu GeneQuantum Trial ID: NCT04450732
NM-02 HER2/neu Suzhou Nanomab Trial ID: NCT04674722
Vrije Universiteit Brussel patent anti-Her2 131 I-GMIB-Anti-HER2-VHH1 HER2/neu Vrije Universiteit Brussel Trial ID: NCT04467515
Chinese PLA Gen.Hosp. anti-Her2 CAR CART-HER-2 HER2/neu Chinese PLA Gen.Hosp. Trial ID: NCT01935843
Sym013 Pan-Her EGFR,　HER2/neu,　HER3 Symphogen Trial ID: NCT02906670
A166 Sichuan Kelun Pharma patent anti-Her2 HER2/neu Klus Pharma,　Sichuan Kelun Pharma Trial ID: NCT03602079
에르투막소맙 Rexomun, 2502A/TP- A-02/TPBs03 CD3,　HER2/neu Fresenius Trial ID: NCT01569412
MM-111　 HER2/neu,　HER3 Merrimack Trial ID: NCT01774851
자니다타맙 ZW25, ZW-25 HER2/neu Zymeworks Trial ID: NCT04466891
MBS301　 HER2/neu Beijing Mabworks Trial ID: NCT03842085
제노쿠투주맙 MCLA-128, MF3958, MF3178 HER2/neu,　HER3 Merus Trial ID: NCT03321981
MRG002 HER2/neu Shanghai Miracogen Trial ID: NCT04742153
간코타맙 MM-302, MM-001 HER2/neu Merrimack Trial ID: NCT02213744
트라스투주맙-pkrb　 Herzuma, CT-P06, CT-P6 HER2/neu Celltrion Stebbing et al: Lancet Oncol. 2017 Jul;18(7):917-928
SB3 ONTRUZANT HER2/neu Merck (MSD),　Samsung Bioepis Trial ID: NCT03766607
CMAB302　 Cipterbin, Saiputing HER2/neu Shanghai CP Guojian Trial ID: NCT01291667
트라스투주맙 두오카르마진 SYD985, trastuzumab vc-seco-DUBA HER2/neu Synthon Banerji et al., Lancet Oncol. 2019 Aug;20(8):1124-1135
코프렐로타맙 GB221, GB235-019 HER2/neu Genor Trial ID: NCT04164615
BCD-022　 HERtiCAD HER2/neu Biocad Trial ID: NCT01764022
BAT8001 HER2/neu Bio-Thera Solutions Hong et al., Cancer Commun (Lond). 2021 Feb;41(2):171-182
트라스투주맙 데룩테칸 ENHERTU, DS-8201a, DS8201a HER2/neu AstraZeneca,　Daiichi Sankyo Shitara et al., Lancet Oncol. 2019 Jun;20(6):827-836
HD201 HER2/neu Prestige BioPharma Trial ID: NCT03776240
HLX22 AC101, HLX 22, 1E11 HER2/neu Abclon,　Shanghai Henlius Trial ID: NCT03916094
디시타맙 베도틴 Remegen RC48, RC48-ADC, Hertuzumab-vc-MMAE HER2/neu RemeGen Sheng et al., Clin Cancer Res. 2021 Jan 1;27(1):43-51
SIBP-01 HER2/neu Shanghai Inst.Bio. Products Trial ID: NCT03989037
TX05　 HER2/neu Tanvex Trial ID: NCT04109391
QL1209 HER2/neu Qilu Pharma,　Sound Biologics Trial ID: NCT04629846
일부 구현예에서, HER2 표적 항체는 트라스투주맙 (trastuzumab)(또는 이의 바이오시밀러), 마르게툭시맙 (margetuximab)(또는 이의 바이오시밀러), 퍼투주맙 (pertuzumab)(또는 이의 바이오시밀러), 트라스투주맙 엠탄신 (trastuzumab emtansine)(또는 이의 바이오시밀러), PF-05280014 (또는 이의 바이오시밀러), 트라스투주맙-anns (또는 이의 바이오시밀러), HLX02 (또는 이의 바이오시밀러), 트라스투주맙-dkst (또는 이의 바이오시밀러), Hervycta (또는 이의 바이오시밀러), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, HER2 표적 항체는 트라스투주맙 또는 이의 바이오시밀러이다. 일부 구현예에서, HER2 표적 항체는 트라스투주맙이다.
V. 약학적 조성물
본 발명은 본원에 기술된 자연살해세포를 포함하는 약학적 조성물 및 본원에 기술된 약학적 조성물의 투약 단위 (dosage unit)를 제공한다.
일부 경우에, 투약 단위는 세포를 1억 내지 15억, 예를 들어, 1억, 2억, 3억, 4억, 5억, 6억, 7억, 8억, 9억, 10억, 11억, 12억, 13억, 14억 또는 15억개 포함한다.
약학적 조성물은 전형적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 투여에 적합한, 식염수, 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제, 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등이 있다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 a) 본원에 기술된 자연살해세포(들); 및 b) 냉동보존 조성물을 포함한다.
적합한 냉동보존 조성물을 본원에 기술한다.
일부 구현예에서, 조성물은 냉동한다. 일부 구현예에서, 조성물은 적어도 3개월간, 예를 들어 적어도 6개월간, 적어도 9개월간, 적어도 12개월간, 적어도 15개월간, 적어도 18개월간, 적어도 24개월간 또는 적어도 36개월간 냉동 보존한다.
일부 구현예에서, 자연살해세포의 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%가 해동 후 생존한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 a) 본원에 기술된 냉동보존 조성물; 및 b) 치료학적 세포(들)를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료학적 세포(들)는 동물 세포(들)이다. 일부 구현예에서, 치료학적 세포(들)는 인간 세포(들)이다.
일부 구현예에서, 치료학적 세포(들)는 면역 세포(들)이다. 일부 구현예에서, 면역 세포(들)는 호염구, 호산구, 호중구, 비만 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 자연살해세포, B 세포, T 세포, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 세포(들)는 자연살해 (NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 자연살해세포(들)는 본원에 기술된 방법에 의해 증폭 및 자극한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 c) 완충제 용액을 추가로 포함한다. 적절한 완충제 용액은 예를 들어 냉동보존 조성물에 대해서와 같이 본원에 기술된다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 세포를 1x107 세포/㎖ 또는 약 1x107 내지 1x109 세포/㎖ 또는 약 1x109 세포/㎖로 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 세포를 1x108 세포/㎖로 포함한다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 세포를 약 1x108 세포/㎖로 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, 본원에 기술된 항체를 추가로 포함한다.
약학적 조성물은 전형적으로 의도한 투여 경로에 맞게 제형화 된다. 투여 경로의 예로는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 진피내, 피하, 경구 (예를 들어, 흡입), 경피 (국소), 경점막 및 직장 투여 등이 있다.
적절한 약학적 조성물을 제형화하는 방법들이 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005; 및 the books in the series Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)를 참조한다. 예를 들어, 비경구, 진피내 또는 피하 용도로 사용되는 용액제 또는 현탁제는 다음과 같은 성분을 함유할 수 있다: 무균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항세균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨; 킬레이트제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 사이트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장도 조절제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기를 사용해 pH를 적정할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제작된 앰플, 일회용 시린지 또는 다중 투약 바이얼 안에 봉입할 수 있다.
주사 용도로 적합한 약학적 조성물은 무균 주사 용액제 또는 분산제를 즉석 제조하기 위한 무균 산제 및 무균 수성 용액 (수용성인 경우) 또는 분산액을 망라할 수 있다. 정맥내 투여하는 경우, 적절한 담체로는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) 또는 포스페이트 완충화된 염수 (PBS) 등이 있다. 모든 경우에, 조성물은 무균성이어야 하며, 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건에서 안정적이어야 하며, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물을 함유한, 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 이용함으로써, 분산제의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써, 그리고 계면활성제를 이용함으로써, 유지할 수 있다. 미생물 작용 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 다수 경우들에서, 등장화제, 예를 들어, 당류, 폴리알코올, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 첨가하는 것이 바람직할 것이다. 조성물에, 흡수를 지연하는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 함유시킴으로써, 주사용 조성물의 연장된 흡수를 달성할 수 있다.
무균 주사용 용액은 활성 화합물을 필요한 양으로 적절한 용매에 상기 열거한 성분 하나 또는 성분 조합들과 함께 투입하고, 필요에 따라 여과 멸균을 수행함으로써, 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산제는 활성 화합물을 기본 분산 매질과 상기 열거된 것으로부터 유래한 다른 필수 성분을 함유한 무균 비히클에 투입함으로써 제조한다. 무균 주사용 용액제를 제조하기 위한 무균 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결건조이며, 이로써 활성 성분과 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 유래한 임의의 추가적인 요망되는 성분의 분말이 수득된다.
VI. 치료 방법
본원에 기술된 NK 세포는 암 또는 기타 증식성 장애를 치료하는데 용도를 가진다.
이에, 또한, 본 발명은 NK 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 NK 세포, 및 HER2 표적 항체, 예를 들어 본원에 기술된 항체를 투여하는 것을 포함하는, 장애, 예를 들어 암 관련 장애, 예를 들어 HER2+ 암을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 NK 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 NK 세포, 및 HER2 표적 항체, 예를 들어, 본원에 기술된 항체를 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 암 세포 또는 암 세포 집단의 재발, 생장, 증식, 이동 및/또는 전이를 방지, 감소 및/또는 저해하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 NK 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 NK 세포, 및 HER2 표적 항체, 예를 들어, 본원에 기술된 항체를 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 항암 요법에 대한 반응을 강화, 개선 및/또는 높이는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 NK 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 NK 세포, 및 HER2 표적 항체, 예를 들어, 본원에 기술된 항체를 투여하는 것을 포함하는, 필요한 개체에서 면역 시스템을 유발하는 방법을 제공한다.
본원에 기술된 방법은 비-정상적인 세포자살 공정 또는 분화 공정과 관련한 장애, 예를 들어, 세포 증식성 장애 또는 세포성 분화 장애, 예를 들어, 고형 종양 및 조혈 암과 같은 암을 치료하는 방법을 포함한다. 일반적으로, 본 방법은 본원에 기술된 바와 같은 치료제를 치료학적 유효량으로 필요한 개체 또는 치료가 필요한 것으로 결정된 개체에 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 NK 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 NK 세포 및 XX 표적 항체, 예를 들어 본원에 기술된 항체를 포함하는 치료제를 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료한다" 및 "치료하는"은 비-정상적인 세포자살 공정 또는 분화 공정과 관련한 장애의 퇴행, 완화, 개시 지연 또는 진행 저해를 의미한다. 예를 들어, 치료는 종양 크기 또는 생장 속도 감소를 달성할 수 있다. 본원에 기술된 화합물을 비-정상적인 세포자살 공정 또는 분화 공정과 관련한 병태를 치료하기 위해 치료학적 유효량으로 투여하면, 특히 종양 크기 저하 또는 생장 속도 감소, 재발 위험 또는 빈도 감소, 재발 지연, 전이 감소, 생존성 증가 및/또는 이환율 및 사망율의 감소가 달성될 것이다. 일부 구현예에서, 치료제는 증상 하나 이상이 발현된 이후에 투여할 수 있다. 다른 구현예에서, 치료제는 증상이 없는 상태에서 투여할 수 있다. 예를 들어, 치료제는 증상이 개시되기 전에 (예를 들어, 증상의 병력에 비추어 및/또는 유전학적 또는 기타 감수성 요인에 비추어) 감수성 개체에 투여할 수 있다. 치료제는 또한 증상이 해소된 이후에도, 예를 들어 재발을 방지하거나 또는 지연하기 위해 계속 투여할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "저해"는 암 및/또는 암 세포 증식과 관련하여, 세포독성, 영양분 고갈 또는 세포자살의 유도에 의해, 개별적으로 또는 다른 암 세포와 집합적으로 암 세포의 생장, 분열, 성숙 또는 생존성의 저해 및/또는 암 세포의 사멸 유발을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증상의 진행 "지연"은 질환, 장애 또는 이의 증상의 발생을 늦추거나, 방해하거나, 느리게 하거나, 지체시키거나, 안정화하거나 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 지연은 질환의 병력 및/또는 치료 중인 개체에 따라 다양한 시간 길이일 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 충분한 또는 현저한 지연은, 사실상, 개체에서 질환, 장애 또는 이의 증상이 발생하지 않는다는 점에서, 예방을 포괄한다. 예를 들어, 암 발생을 "지연하는" 방법은, 해당 방법을 이용하지 않은 경우와 비교해, 소정의 시간 범위 동안 질환 발생 확률을 낮추거나 및/또는 소정의 시간 범위 동안 질환의 정도를 낮추는 방법이다. 이러한 비교는 통계학적으로 유의한 개체 수를 이용한 임상 실험에 기반할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "예방" 또는 "예방하는"은 질환의 임상 증상이 발생하지 않도록 질환 또는 장애가 개시되지 않게 방지하는 용법을 지칭한다. 따라서, "예방"은 질환의 징후가 개체에서 검출 가능해지기 전에 및/또는 질환의 특정 병기에 도달하기 전에 (예를 들어, 암이 아직 전이되지 않은 환자에 치료학적 물질의 투여) 개체에 요법 (예를 들어, 치료학적 물질의 투여)을 실시하는 것과 관련 있다. 개체는 질환 또는 장애 발생 위험이 있거나, 또는 질환 진행 위험이 있는, 예를 들어 암 전이 위험이 있는 개체, 예를 들어, 질환 또는 장애의 발생 또는 개시와 관련 있는 것으로 알려진 하나 이상의 위험 인자를 가진 개체일 수 있다. 예를 들어, 개체는 암의 발생 또는 진행과 관련한 돌연변이를 보유할 수 있다. 나아가, 예방은 질환 또는 장애의 개시에 대해 완벽한 방지가 달성되지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 일부 경우에, 예방은 질환 또는 장애의 발병 위험 저하를 포함한다. 위험 저하는 질환 또는 장애의 발병 위험의 완벽한 소멸을 달성하지 않을 수도 있다.
(예를 들어, 항종양 반응, 암 세포의 전이와 관련하여) "증가된" 또는 "강화된" 정도는, 본원에 언급된 양 또는 수준에 대해 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 이보다 높은 배수 (예를 들어, 100배, 500배, 1000배)의 증가를 지칭한다 (언급된 정수들 사이의 1보다 큰 모든 정수 및 소수 값들을 망라함, 예를 들어, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 등). 이는 또한 본원에 언급된 양 또는 수준에 대한 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 500% 또는 적어도 1000% 증가를 망라할 수 있다.
(예를 들어, 종양 크기, 암 세포의 증식 또는 생장과 관련하여) "감소된" 또는 "저하된" 또는 "더 적은" 양은 본원에 언급된 양 또는 수준에 대해 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배 또는 이보다 높은 배수 (예를 들어, 100배, 500배, 1000배)의 감소를 지칭한다 (언급된 정수들 사이의 1보다 큰 모든 정수 및 소수 값들을 망라함, 예를 들어 1.5, 1.6, 1.7. 1.8 등). 이는 또한 본원에 언급된 양 또는 수준에 대한 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 500% 또는 적어도 1000% 감소를 망라할 수 있다.
A. 장애
본원에 개시된 방법 및 제조된 조성물은 세포 증식성 장애와 같은 다수 장애를 표적화 하는 용도를 가진다. 본 발명에서 이러한 접근 방식의 이점은, 동종이계 세포를, 외인성 항체에 의해 표적화되는 특정한 증식성 세포를 표적으로 하기 위해 외인성 항체 투여와 조합하여 이용한다는 것이다. 본 발명의 이러한 접근 방식 및 약학적 조성물을 이용함으로써, 화학요법 또는 방사선 요법과 같은 기존 요법과는 달리, 증식성 세포에 무차별적으로 영향을 미치는 전신 약물 또는 독소를 투여하지 않고도, 잠재적으로 유해한 증식 활성을 보이는 세포를 특이적으로 표적으로 할 수 있다.
세포 증식성 장애 및/또는 분화 장애의 예로는 암, 예를 들어, 암종, 육종, 전이성 장애 또는 조혈 신생물 장애, 예를 들어, 백혈병 등이 있다. 전이성 종양은 비-제한적으로 전립선, 결장, 폐, 유방 및 간 기원 등의 다양한 원발성 종양 타입으로부터 기원할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암", "과증식성" 및 "신생물"은 자율적인 생장 능력, 즉 빠르게 증식하는 세포 생장을 특징으로 하는 비-정상적인 상태 또는 병태를 가진 세포를 지칭한다. 과증식성 및 신생물 질환 상태는 병적으로, 즉 질환 상태가 특징적이거나 또는 질환 상태인 것으로 분류할 수 있거나, 또는 비-병적으로서, 즉 정상적인 상태는 아니지만 질환 상태와는 관련 없는 것으로 분류할 수 있다. 이 용어는 조직병리학적 유형 또는 침습 단계와 상관없이, 모든 유형의 암성 생장 또는 발암 과정, 전이성 조직 또는 악성으로 전환된 세포, 조직, 또는 장기를 망라하는 것을 의미한다. "병적 과증식성" 세포는 악성 종양 생장을 특징으로 하는 질환 상태에서 생긴다. 비-병적 과증식성 세포에 대한 예로는 상처 회복과 관련한 세포 증식을 포함한다.
용어 "암" 또는 "신생물"은 폐, 유방, 갑상선, 림프계, 위장 및 비뇨생식기에서 발생하는 등의 다양한 장기 시스템의 악성뿐 아니라 선암종, 예를 들어, 대부분의 대장암, 신장 세포 암종, 전립선암 및/또는 고환 종양, 비-소 세포성 폐 암종, 소장암 및 식도암과 같은 악성을 망라한다.
용어 "암종"은 당해 기술 분야에서 이해되며, 호흡계 암종, 위장계 암종, 비뇨생식기계 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종 및 흑색종 등의 상피 또는 내분비 조직의 악성 종양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 질환은 신장암 또는 흑색종이다. 암종의 예로는 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장 및 난소의 조직으로부터 기인한 암종 등이 있다. 이 용어는 또한 예를 들어 암종 조직 및 육종 조직으로 구성된 악성 종양을 포함하는, 암육종증을 망라한다. "선암종"은 샘 조직으로부터 유래하거나 또는 종양 세포가 인지가능한 샘 구조로부터 기원하는 암종을 지칭한다.
용어 "육종"은 당해 기술 분야에서 이해되며, 중간엽 유래 악성 종양을 지칭한다.
증식성 장애에 대한 추가적인 예로는 조혈 신생물 장애가 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조혈 신생물 장애"는 조혈 기원의, 예를 들어 골수, 림프계 또는 적혈구 계통 또는 이들의 전구 세포로부터 기원하는, 과형성/신생물 세포를 수반하는 질병을 포함한다. 바람직하게는, 질환은 거의 미-분화된 급성 백혈병 (poorly differentiated acute leukemias), 예를 들어, 적혈구모구성 백혈병 및 급성 거대핵모세포성 백혈병으로부터 발생한다. 부가적인 골수성 장애의 예로는 급성 전골수성 백혈병 (APML), 급성 골수성 백혈병 (AML) 및 만성 골수성 백혈병 (CML)이 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니며 (Vaickus, L. (1991) Crit Rev. in Oncol./Hemotol. 11:267-97); 림프계 악성으로는 B-계통 급성 림프모구성 백혈병 (ALL) 및 T-계통 ALL을 비롯한 ALL, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 전림프구성 백혈병 (PLL), 모발상세포 백혈병 (HLL) 및 발덴스트롬의 마크로글로불린혈증 (WM)이 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 악성 림프종의 추가적인 형태로는 비-호지킨 림프종 및 이의 변형 형태, 말초 T 세포 림프종, 성인 T 세포 백혈병/림프종 (ATL), 피부 T 세포 림프종 (CTCL), 거대 과립 림프구성 백혈병 (LGF), 호지킨 질환 및 리드-슈테른베르크 질환이 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 부신피질 암종, 카포시 육종, AIDS-관련 림프종, 원발성 CNS 림프종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 전형적인 기형종/간상 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 유암종, 심장 종양, 수모세포종, 생식세포종, 원발성 CNS 림프종, 자궁경부암, 담관암, 척색종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 신생물, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T 세포 림프종, 유관 제자리암, 배아성 종양, 자궁내막암, 상의세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 유잉육종, 두개외 생식세포종, 고환외 생식세포종, 안구암 (예를 들어, 안내 흑색종 또는 망막모세포종), 자궁관 암, 뼈의 섬유성 조직구종, 골육종, 담낭암, 위암, 위장계 유암종, 위장 기질 종양 (GIST), 생식세포종, 임신성 융모성 질환, 모발상세포 백혈병, 두경부암, 심장 종양, 간세포성 암, 조직구증, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 섬세포 종양, 췌장 신경내분비 종양, 신장 (신세포) 암종, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 입술 및 구강의 암, 간암, 폐암 (예를 들어, 비-소 세포성 폐암, 소 세포성 폐암, 가슴막폐 모세포종 및 기관기관지 종양), 림프종, 남성 유방암, 뼈의 악성 섬유성 조직구종, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이암, 전이성 편평 목 암, 중심관 암종 (midline tract carcinoma), 구강암, 다발성 내분비 종양증 증후군, 다발성 골수종/형질세포 신생물, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수형성이상성/골수증식성 신생물, 골수증식성 신생물, 비강 및 코곁굴 암, 비인두암, 신경모세포종, 비-호지킨 림프종, 구강암, 입술 및 구강 암, 구인두암, 골육종, 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 췌장암, 췌장 신경내분비 종양, 유두종증, 부신경절종, 코곁굴 및 비강 암, 부갑상선 암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 뇌하수체 종양, 형질세포 신생물, 다발성 골수종, 가슴막폐 모세포종, 임신성 유방암 (pregnancy and breast cancer), 원발성 중추 신경계 림프종, 원발성 복막암, 전립선암, 직장암, 재발 암, 신장 세포 암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종 (예를 들어, 소아 횡문근육종, 소아 혈관 종양, 유잉육종, 카포시 육종, 골육종, 연조직 육종, 자궁 육종), 세자리 증후군, 피부암, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 편평 목 암, 위암, T-세포 림프종, 고환암, 인후암, 비인두암, 구인두암, 하인두암, 가슴샘종 및 흉선암, 갑상선암, 기관기관지 종양, 신우 및 요관의 이행 세포 암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 혈관 종양, 외음부암 및 윌름스 종양.
일부 구현예에서, 암은 고형 종양이다.
일부 구현예에서, 암은 전이성이다.
일부 구현예에서, 암은 HER2+ 암이다.
일부 구현예에서, HER2+ 암은 방광암, 유방 선암종, 결장직장 선암종, 비-소 세포성 폐암, 식도암, 자궁경부 편평세포암, 위 선암종, 담관암, 난소암, 유두상 신장 세포 암종, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, HER2+ 암은 유방암, 위암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, HER2+ 암은 유방암이다. 일부 구현예에서, HER2+ 암은 위암이다. 일부 구현예에서, HER2+ 암은 난소암이다.
B. 환자
본 발명에서 조성물 및 방법에 적합한 환자는 세포 증식성 및/또는 분화성 장애, 예를 들어 암을 앓고 있거나, 진단되었거나 또는 앓고 있는 것으로 의심되는 환자를 포함한다. 본 발명에 언급된 시술을 받은 환자는 일반적으로 본 발명의 방법 및 조성물에 더 잘 반응하는데, 그 이유는 부분적으로 약학적 조성물이 동종이계이고 일반적으로 증식하는 세포를 표적화 하기보다는 항체에 의해 표적 세포를 식별하기 때문이다. 그래서, 오프-표적 효과가 거의 없으며, 환자는 실질적으로 유해한 오프-표적 효과 없이 치료 용법을 완료할 가능성이 더 크다.
일부 구현예에서, 본 발명에 제공된 치료 방법을 이용해, 세포 증식성 장애 및/또는 분화 장애, 예를 들어 암으로 진단되었거나 또는 앓고 있는 것으로 의심되는 개체 (예를 들어, 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스)를 치료할 수 있다. 일부 구현예에서, 개체는 포유류이다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, 개체는 예를 들어 인간을 비롯한 포유류를 지칭한다.
일부 구현예에서, 포유류는 아르마딜로, 당나귀, 박쥐, 곰, 비버, 고양이, 침팬지, 소, 코요테, 사슴, 개, 돌고래, 코끼리, 여우, 팬더, 긴팔원숭이, 기린, 염소, 땅다람쥐, 고슴도치, 하마, 말, 혹등고래, 재규어, 캥거루, 코알라, 표범, 사자, 라마, 스라소니, 두더지, 원숭이, 쥐, 일각고래, 오랑우탄, 범고래, 수달, 황소, 돼지, 북극곰, 고슴도치, 퓨마, 토끼, 너구리, 생쥐, 코뿔소, 양, 다람쥐, 호랑이, 해마, 족제비, 늑대, 얼룩말, 염소, 말 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 포유류는 인간이다.
개체, 예를 들어, 인간 개체는 어린이, 예를 들어 0세 또는 약 0세 내지 14세 또는 약 14세일 수 있다. 개체는 청년, 예를 들어 15세 또는 약 15세 내지 24세 또는 약 24세일 수 있다. 개체는 성인, 예를 들어 25세 또는 약 25세 내지 64세 또는 약 64세일 수 있다. 개체는 노인, 예를 들어 65세 이상일 수 있다.
일부 구현예에서, 개체는 세포 증식성 장애 및/또는 분화 장애, 예를 들어, 암, 예를 들어, 종양과 관련한 증상이 한가지 이상 발생한 인간일 수 있다. 본 발명에 제공된 임의의 치료 방법을 이용해 다양한 병기의 암을 치료할 수 있다. 예를 들어, 암 병기는 초기, 진행된, 국소 진행, 관해, 불응성, 관해 후 재발 및 진행성 (progressive)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 개체는 암의 초기 병기이다. 다른 구현예에서, 개체는 암의 진행된 병기이다. 다양한 구현예에서, 개체는 1기, 2기, 3기 또는 4기 암을 앓고 있다. 본 발명에 기술된 치료 방법은 종양의 감소 또는 축소를 촉진하거나, 종양 생장 또는 암 세포 증식을 감소 또는 저해하거나, 및/또는 종양 세포 살상을 유도, 증가 또는 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, 개체는 암 관해 상태이다. 본 발명에 기술된 치료 방법은 암의 전이 또는 재발을 방지하거나 또는 지연할 수 있다.
일부 구현예에서, 개체는 진단되었거나 또는 진단되지 않은 세포 증식성 장애 및/또는 분화 장애, 예를 들어, 암의 발병 위험이 있거나, 또는 유전학적으로 또는 달리 성향이 (예를 들어, 위험 인자) 존재한다.
본원에 사용된 바와 같이, "위험이 있는" 개체는 치료할 병태, 예를 들어, 세포 증식성 장애 및/또는 분화 장애, 예를 들어, 암의 발병 위험이 있는 개체이다. 일반적으로, "위험이 있는" 개체는 검출가능한 질환이 있거나 또는 검출가능한 질환이 있지 않을 수 있으며, 본 발명에 기술된 치료 방법 이전에 검출가능한 질환이 발현되었거나 또는 발현되지 않았을 수 있다. "위험이 있는"은 개체가, 질환 또는 병태의 발병과 연관성이 있는 측정가능한 매개변수 및 당해 기술 분야에 공지된 이른바 위험 인자 하나 이상을 가진 것을 의미한다. 예를 들어, 위험이 있는 개체는 암 발병과 관련있는 측정가능한 매개변수인 하나 이상의 위험 인자를 가질 수 있다. 이러한 위험 인자 하나 이상을 가진 개체는 이러한 위험 인자(들)가 없는 개체보다 암 발병 확률이 더 높다. 일반적으로, 위험 인자는 예를 들어 나이, 성별, 인종, 식이, 이전 질환의 병력, 전구 질환의 존재, 유전학적 (예, 유전성) 고려 사항 및 환경 노출을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 암 발병 위험이 있는 개체는, 예를 들어 친적 중 질환을 앓은 적 있는 개체, 및 유전자 또는 생화학 마커 분석을 통해 결정된 위험을 가진 개체를 망라한다.
아울러, 개체는 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 수술 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 표준 요법을 시술 중일 수 있다. 이에, 화학요법, 방사선요법, 면역요법, 수술 또는 이들의 조합을 시술하기 전, 시술하는 중에 또는 시술한 이후에 하나 이상의 키나제 저해제를 투여받을 수 있다.
특정 구현예에서, 개체는 (i) 하나 이상의 화학요법 치료제에 대해 실질적으로 불응성이거나, 또는 (ii) 화학요법으로 치료받은 후 재발된 상태이거나, 또는 (i) 및 (ii) 둘다인 인간일 수 있다. 일부 구현예에서, 개체는 (표준 또는 실험적 화학요법을 비롯한) 화학요법 치료제 2종 이상, 3종 이상 또는 4종 이상에 대해 불응성이다.
일부 구현예에서, 환자는 HER2+ 암으로 진단되거나 또는 HER2+ 암으로 진단된 적 있다.
일부 구현예에서, 환자는 암의 생검 또는 외과적 샘플에 대한 면역조직화학적 염색에 의해 HER2+ 암으로 진단된 적 있거나 또는 HER2+ 암으로 진단된다. 일부 구현예에서, 환자는 암의 생검 또는 외과적 샘플에 대한 형광 인 시추 혼성화에 의해 HER2+ 암으로 진단된 적 있거나 또는 HER2+ 암으로 진단된다.
일부 구현예에서, 환자는 ASCO® 가이드라인, 예를 들어, 2018 ASCO® 가이드라인, 예를 들어, Wolff et al., "Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Testing in Breast Cancer", Arch Pathol Lab Med 142:1364-82 (2018)에 기술된 바에 따라 HER2+ 암으로 진단된 적 있거나 또는 HER2+ 암으로 진단되며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 통합된다.
일부 구현예에서, 환자는 유전자 분석에 의해, 예를 들어, HER2 돌연변이 암, 예를 들어, HER2 (ERBB2) 유전자 내 체세포 돌연변이의 식별에 의해 HER2+ 암으로 진단된 적 있거나 또는 HER2+ 암으로 진단된다.
일부 구현예에서, 환자는 표 7에 기술된 하나 이상의 돌연변이 세트, HER2 유전자에서의 삽입 또는 결손 다형성, HER2 유전자의 카피수 변이, HER2 유전자의 메틸화 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 암을 가지고 있다.
일부 구현예에서, 환자는 암, 예를 들어, HER2+ 암과 관련한 염색체 전좌를 가지고 있다. 일부 구현예에서, 환자는 암, 예를 들어, HER2+ 암과 관련한 융합 유전자를 가지고 있다.
HER2 (ERBB2)돌연변이 (인간 게놈 어셈블리 레퍼런스 빌드 GRCh38.p13 (ncbi.nlm.nih.gov/assembly/88331)
돌연변이 ( GRCh38 ) 단백질 위치 결과
17:39711955:C>T 310 미스센스 변이체
17:39723405:G>A 678 미스센스 변이체
17:39723967:T>C 755 미스센스 변이체
17:39725079:G>A 842 미스센스 변이체
17:39711955:C>A 310 미스센스 변이체
17:39724747:G>T 777 미스센스 변이체
17:39724008:G>T 769 미스센스 변이체
17:39724004:C>G 767 미스센스 변이체
17:39725139:A>G 862 미스센스 변이체
17:39724745:G>T 776 미스센스 변이체
17:39723650:C>T 733 미스센스 변이체
17:39724008:G>C 769 미스센스 변이체
17:39724747:G>C 777 미스센스 변이체
17:39725161:T>G 869 미스센스 변이체
17:39710410:A>G 277 미스센스 변이체
17:39710414:G>A 278 동의 변이체
17:39711963:C>G 313 미스센스 변이체
17:39723966:T>C 755 동의 변이체
17:39724008:G>A 769 미스센스 변이체
17:39726610:C>T 974 미스센스 변이체
17:39727303:T>G 1056 동의 변이체
17:39727784:C>G 1170 미스센스 변이체
17:39706987:C>T - 스플라이스 영역 변이체
17:39708375:G>A 94 미스센스 변이체
17:39708497:A>T 134 동의 변이체
17:39708530:C>T 145 동의 변이체
17:39709376:G>A 166 동의 변이체
17:39709810:C>T - 스플라이스 영역 변이체
17:39710106:G>T 222 미스센스 변이체
17:39710164:C>T 241 미스센스 변이체
17:39710409:G>T 277 미스센스 변이체
17:39710418:G>C 280 미스센스 변이체
17:39712319:C>T - 스플라이스 영역 변이체
17:39712429:C>T 377 동의 변이체
17:39715854:C>T 476 동의 변이체
17:39716421:G>A 545 미스센스 변이체
17:39716586:C>T 573 미스센스 변이체
17:39717397:A>C 605 미스센스 변이체
17:39717446:G>A 622 미스센스 변이체
17:39719819:C>T 644 미스센스 변이체
17:39719827:A>C 647 동의 변이체
17:39723330:C>G 653 미스센스 변이체
17:39723339:C>T 656 미스센스 변이체
17:39723530:C>T - 스플라이스 영역 변이체
17:39724734:C>T 772 동의 변이체
17:39724902:G>A 828 동의 변이체
17:39725057:C>T 834 동의 변이체
17:39725096:C>T 847 동의 변이체
17:39725139:A>T 862 미스센스 변이체
17:39725347:G>A 890 동의 변이체
17:39725357:A>C 894 미스센스 변이체
17:39725750:C>T 923 동의 변이체
17:39726573:G>A 962 미스센스 변이체
17:39726860:C>T 1006 미스센스 변이체
17:39726905:G>C 1021 미스센스 변이체
17:39727000:C>G 1052 동의 변이체
17:39727847:G>A 1191 미스센스 변이체
17:39727973:C>T 1233 미스센스 변이체
17:39700256:G>T 6 미스센스 변이체
17:39700298:C>T 20 동의 변이체
17:39706995:A>T 27 미스센스 변이체
17:39707022:C>T 36 미스센스 변이체
17:39707032:C>T 39 미스센스 변이체
17:39707033:C>T 39 동의 변이체
17:39707063:C>T 49 동의 변이체
17:39707070:G>A 52 미스센스 변이체
17:39707076:C>T 54 정지 획득
17:39707093:C>A 59 미스센스 변이체
17:39707114:C>A 66 동의 변이체
17:39708350:C>G 85 동의 변이체
17:39708354:G>A 87 미스센스 변이체
17:39708386:G>A 97 동의 변이체
17:39708397:T>G 101 미스센스 변이체
17:39708403:G>A 103 미스센스 변이체
17:39708406:G>A 104 미스센스 변이체
17:39708459:C>T 122 미스센스 변이체
17:39708460:C>T 122 미스센스 변이체
17:39708507:C>T 138 미스센스 변이체
17:39708508:G>A 138 미스센스 변이체
17:39708510:G>A 139 미스센스 변이체
17:39709322:C>A 148 동의 변이체
17:39709326:A>G 150 미스센스 변이체
17:39709340:G>C 154 미스센스 변이체
17:39709343:C>T 155 동의 변이체
17:39709352:C>T 158 동의 변이체
17:39709375:C>T 166 미스센스 변이체
17:39709391:C>T 171 동의 변이체
17:39709394:C>G 172 미스센스 변이체
17:39709419:C>T 181 미스센스 변이체
17:39709421:C>G 181 동의 변이체
17:39709423:C>T 182 미스센스 변이체
17:39709427:G>C 183 동의 변이체
17:39709447:G>A 190 미스센스 변이체
17:39709449:G>A 191 미스센스 변이체
17:39709824:T>C 196 미스센스 변이체
17:39709825:C>T 196 미스센스 변이체
17:39709845:C>T 203 미스센스 변이체
17:39709850:C>A 204 정지 획득
17:39710087:G>T 215 스플라이스 영역 변이체
17:39710097:G>A 219 미스센스 변이체
17:39710099:C>A 219 동의 변이체
17:39710103:G>A 221 미스센스 변이체
17:39710111:C>A 223 동의 변이체
17:39710120:C>T 226 동의 변이체
17:39710154:G>A 238 미스센스 변이체
17:39710182:C>T 247 미스센스 변이체
17:39710184:A>G 248 미스센스 변이체
17:39710191:C>T 250 미스센스 변이체
17:39710209:C>T - 스플라이스 영역 변이체
17:39710418:G>A 280 미스센스 변이체
17:39710433:C>T 285 미스센스 변이체
17:39710454:G>C 292 미스센스 변이체
17:39710458:C>T 293 미스센스 변이체
17:39710480:C>T 300 스플라이스 영역 변이체
17:39711940:C>G 305 미스센스 변이체
17:39711950:G>A 308 동의 변이체
17:39711952:G>C 309 미스센스 변이체
17:39711954:T>G 310 미스센스 변이체
17:39711962:C>G 312 동의 변이체
17:39711981:A>T 319 미스센스 변이체
17:39712006:G>A 327 미스센스 변이체
17:39712012:A>T 329 미스센스 변이체
17:39712014:C>T 330 미스센스 변이체
17:39712044:C>G 340 미스센스 변이체
17:39712323:G>T 341 스플라이스 영역 변이체
17:39712361:G>- 354 프래임쉬프트 변이체
17:39712431:G>A 377 동의 변이체
17:39715322:G>C 395 미스센스 변이체
17:39715328:C>T 397 동의 변이체
17:39715340:G>A 401 동의 변이체
17:39715344:C>T 403 동의 변이체
17:39715352:G>C 405 미스센스 변이체
17:39715445:G>T - 스플라이스 어셉터 변이체
17:39715461:C>T 413 미스센스 변이체
17:39715476:G>C 418 미스센스 변이체
17:39715478:C>T 419 동의 변이체
17:39715519:G>A 432 동의 변이체
17:39715519:G>T 432 동의 변이체
17:39715738:A>T - 스플라이스 어셉터 변이체
17:39715744:G>A 440 미스센스 변이체
17:39715766:G>C 447 미스센스 변이체
17:39715783:C>A 453 미스센스 변이체
17:39715804:G>A 460 미스센스 변이체
17:39715830:C>T 468 동의 변이체
17:39715836:T>G 470 미스센스 변이체
17:39715844:A>T 473 미스센스 변이체
17:39715867:C>- 481 프래임쉬프트 변이체
17:39716306:G>A 507 미스센스 변이체
17:39716354:C>T 523 미스센스 변이체
17:39716365:C>G 526 동의 변이체
17:39716377:C>T 530 동의 변이체
17:39716393:C>T 536 미스센스 변이체
17:39716401:G>A 538 동의 변이체
17:39716418:G>T 544 미스센스 변이체
17:39716552:C>T 562 미스센스 변이체
17:39716592:C>T 575 미스센스 변이체
17:39717326:G>A 582 미스센스 변이체
17:39717351:A>G 590 미스센스 변이체
17:39717358:C>T 592 동의 변이체
17:39717367:C>A 595 미스센스 변이체
17:39717376:C>T 598 동의 변이체
17:39717406:C>T 608 동의 변이체
17:39717439:G>A 619 동의 변이체
17:39717442:G>- 620 프래임쉬프트 변이체
17:39717466:C>G 628 미스센스 변이체
17:39717480:C>T 633 미스센스 변이체
17:39719785:A>T - 스플라이스 어셉터 변이체
17:39719786:G>C - 스플라이스 어셉터 변이체
17:39719799:G>A 637 동의 변이체
17:39719811:C>T 641 동의 변이체
17:39719820:C>T 644 동의 변이체
17:39719834:G>C 649 미스센스 변이체
17:39723323:C>G 651 미스센스 변이체
17:39723328:G>T 652 동의 변이체
17:39723334:C>A 654 동의 변이체
17:39723335:A>G 655 미스센스 변이체
17:39723350:G>C 660 미스센스 변이체
17:39723351:G>A 660 미스센스 변이체
17:39723356:C>G 662 미스센스 변이체
17:39723356:C>T 662 동의 변이체
17:39723357:T>A 662 미스센스 변이체
17:39723360:T>C 663 미스센스 변이체
17:39723368:G>T 666 미스센스 변이체
17:39723373:G>C 667 미스센스 변이체
17:39723376:G>T 668 동의 변이체
17:39723397:C>G 675 미스센스 변이체
17:39723402:G>A 677 미스센스 변이체
17:39723412:G>A 680 동의 변이체
17:39723449:G>A 693 미스센스 변이체
17:39723541:G>T 697 미스센스 변이체
17:39723562:G>A 704 미스센스 변이체
17:39723567:G>A 705 동의 변이체
17:39723577:C>G 709 미스센스 변이체
17:39723582:G>A 710 동의 변이체
17:39723594:C>T 714 동의 변이체
17:39723597:G>T 715 동의 변이체
17:39723603:G>C 717 미스센스 변이체
17:39723908:C>T - 스플라이스 영역 변이체
17:39723909:C>T - 스플라이스 영역 변이체
17:39723916:T>A 738 미스센스 변이체
17:39723941:G>A 746 동의 변이체
17:39723966:T>A 755 미스센스 변이체
17:39723967:T>G 755 미스센스 변이체
17:39723970:G>A 756 미스센스 변이체
17:39723974:A>C 757 미스센스 변이체
17:39724002:A>T 767 미스센스 변이체
17:39724010:C>T 769 스플라이스 영역 변이체
17:39724743:G>ATCT 775 인프레임-삽입
17:39724744:G>A 776 미스센스 변이체
17:39724761:T>C 781 동의 변이체
17:39724768:C>T 784 미스센스 변이체
17:39724774:C>T 786 동의 변이체
17:39724780:A>T 788 미스센스 변이체
17:39724784:G>A 789 미스센스 변이체
17:39724822:C>T 802 미스센스 변이체
17:39724874:C>T 819 미스센스 변이체
17:39724879:G>C 821 미스센스 변이체
17:39724882:C>T 822 동의 변이체
17:39725070:G>A 839 미스센스 변이체
17:39725088:G>A 845 미스센스 변이체
17:39725122:C>G 856 미스센스 변이체
17:39725172:G>A 873 미스센스 변이체
17:39725174:C>T 873 동의 변이체
17:39725177:G>A 874 동의 변이체
17:39725187:C>T 878 미스센스 변이체
17:39725192:A>G 879 동의 변이체
17:39725344:G>A 889 미스센스 변이체
17:39725363:C>T 896 미스센스 변이체
17:39725374:C>A 899 미스센스 변이체
17:39725374:C>G 899 미스센스 변이체
17:39725400:A>G 908 미스센스 변이체
17:39725726:G>C 915 동의 변이체
17:39725729:G>A 916 미스센스 변이체
17:39725756:G>A 925 동의 변이체
17:39725769:G>A 930 미스센스 변이체
17:39725797:A>G 939 미스센스 변이체
17:39725808:C>T 943 정지 획득
17:39725825:C>A 948 동의 변이체
17:39725857:C>T - 스플라이스 영역 변이체
17:39726577:C>G 963 미스센스 변이체
17:39726594:T>C 969 미스센스 변이체
17:39726596:C>G 969 미스센스 변이체
17:39726633:G>T 982 미스센스 변이체
17:39726651:G>A 988 미스센스 변이체
17:39726821:G>A 993 미스센스 변이체
17:39726829:C>T 995 동의 변이체
17:39726881:G>C 1013 미스센스 변이체
17:39726933:T>G 1030 미스센스 변이체
17:39726941:C>- 1033 프래임쉬프트 변이체
17:39726941:C>G 1033 미스센스 변이체
17:39726958:C>T 1038 동의 변이체
17:39726959:G>A 1039 미스센스 변이체
17:39726980:A>T 1046 미스센스 변이체
17:39726987:G>A 1048 미스센스 변이체
17:39727294:G>A - 스플라이스 어셉터 변이체
17:39727294:G>C - 스플라이스 어셉터 변이체
17:39727305:G>T 1057 미스센스 변이체
17:39727308:A>C 1058 미스센스 변이체
17:39727344:C>T 1070 미스센스 변이체
17:39727366:C>T 1077 동의 변이체
17:39727370:G>A 1079 미스센스 변이체
17:39727373:G>T 1080 미스센스 변이체
17:39727450:C>- 1105 프래임쉬프트 변이체
17:39727466:C>T 1111 미스센스 변이체
17:39727475:G>C 1114 미스센스 변이체
17:39727492:C>T 1119 동의 변이체
17:39727533:G>C 1133 미스센스 변이체
17:39727542:A>G 1136 미스센스 변이체
17:39727728:C>T 1151 미스센스 변이체
17:39727732:C>T 1152 동의 변이체
17:39727752:C>T 1159 미스센스 변이체
17:39727755:C>T 1160 미스센스 변이체
17:39727805:A>G 1177 미스센스 변이체
17:39727825:C>T 1183 동의 변이체
17:39727838:G>A 1188 미스센스 변이체
17:39727839:G>A 1188 미스센스 변이체
17:39727846:C>T 1190 동의 변이체
17:39727867:G>C 1197 미스센스 변이체
17:39727871:C>A 1199 미스센스 변이체
17:39727892:C>T 1206 정지 획득
17:39727898:C>T 1208 미스센스 변이체
17:39727904:C>T 1210 미스센스 변이체
17:39727965:G>- 1230 프래임쉬프트 변이체
17:39727974:C>T 1233 미스센스 변이체
17:39727976:C>T 1234 미스센스 변이체
17:39728002:G>A 1242 동의 변이체
17:39728006:G>C 1244 미스센스 변이체
17:39728023:G>C 1249 동의 변이체
17:39728032:C>T 1252 동의 변이체
일부 구현예에서, 환자는 치료 후, 예를 들어 트라스투주맙 또는 이의 바이오시밀러를 이용한 치료 후 HER2+ 암에 대해 불응성이거나 또는 재발된 것이다.
일부 구현예에서, 환자는 퍼투수맙 (pertuxumab)(또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러), 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 도세탁셀 (docetaxel)(또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)으로 치료한 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 퍼투주맙 (pertuzumab)(또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 840 mg IV로 투여한 후 420 mg IV로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 7 ㎎/kg IV로 투여한 후 1일에 6 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투수맙 (trastuxumab)(또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)은 피하 투여하기 위한 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 히알루로니다제-oysk 주사제로서 투여한다. 일부 구현예에서, 도세탁셀 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 1일에 75-100 ㎎/㎡ IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 퍼투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러), 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러), 및 파클리탁셀 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 퍼투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 840 mg IV로 투여한 후 420 mg IV로 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 4 ㎎/kg IV로 1일에 투여한 다음 2 ㎎/kg IV로 매주 투여하거나, 또는 8 ㎎/kg IV로 1일에 투여한 다음 6 ㎎/kg IV로 1일에, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)은 피하 투여하기 위한 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 히알루로니다제-oysk 주사제로서 투여한다. 일부 구현예에서, 파클리탁셀 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 80 ㎎/㎡ IV로 1일에 매주 간격으로 또는 1일에 175 ㎎/㎡로, 21일 간격의 주기로 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 투카티닙 (tucatinib)(또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염), 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러), 및 카페시타빈 (capecitabine)(또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 투카티닙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1-21일에 매일 300 mg씩 경구로 2회 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 8 ㎎/kg IV로 투여한 다음 1일에 6 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)은 피하 투여하기 위한 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 히알루로니다제-oysk 주사제로서 투여한다. 일부 구현예에서, 카페시타빈 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1000 ㎎/㎡씩 경구로 매일 2회로 1-14일에 투여한다. 일부 구현예에서, 투카티닙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러), 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 카페시타빈 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)의 투여는 21일 간격의 주기로 이루어진다.
일부 구현예에서, 환자는 ado-트라스투주맙 엠탄신 (T-DM1)(또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, ado-트라스투주맙 엠탄신 (T-DM1)(또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 3.6 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 fam-트라스투주맙 데툭테칸 (trastuzumab deruxtecan)-nxki (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, fam-트라스투주맙 데툭테칸-nxki (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 5.4 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 파클리탁셀/카보플라틴 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염) 및 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 카보플라틴/파클리탁셀 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)은, 1일에 카보플라틴을 AUC 6 IV로, 그리고 1일에 파클리탁셀을 175 ㎎/㎡ IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 4 ㎎/kg IV로 투여한 다음 2 ㎎/kg IV로 매주 투여하거나, 또는 1일에 8 ㎎/kg IV로 투여한 다음 1일에 6 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)은 피하 투여하기 위한 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 히알루로니다제-oysk 주사제로서 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 파클리탁셀/카보플라틴 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염) 및 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 카보플라틴/파클리탁셀 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)은, 1일에 카보플라틴을 AUC 2 IV로, 그리고 1일에 파클리탁셀을 80 ㎎/㎡ IV로, 1일, 8일 및 15일에 투여하고, 28일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 4 ㎎/kg IV로 투여한 다음 2 ㎎/kg IV로 매주 투여하거나, 또는 1일에 8 ㎎/kg IV로 투여한 다음 1일에 6 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)은 피하 투여하기 위한 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 히알루로니다제-oysk 주사제로서 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 파클리탁셀 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 파클리탁셀 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 1일에 175 ㎎/㎡ IV로, 21일 간격의 주기로 투여하거나, 또는 1일에 80-90 ㎎/㎡ IV로 매주 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 4 ㎎/kg IV로 투여한 다음 2 ㎎/kg IV로 매주 투여하거나, 또는 1일에 8 ㎎/kg IV로 투여한 다음 1일에 6 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)은 피하 투여하기 위한 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 히알루로니다제-oysk 주사제로서 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 도세탁셀 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 도세탁셀 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 1일에 80-100 ㎎/㎡ IV로 21일 간격의 주기로 투여하거나, 또는 1, 8 및 15일에 매주 35 ㎎/㎡ IV로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 4 ㎎/kg IV로 투여한 다음 2 ㎎/kg IV로 매주 투여하거나, 또는 1일에 8 ㎎/kg IV로 투여한 다음 1일에 6 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)은 피하 투여하기 위한 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 히알루로니다제-oysk 주사제로서 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 비노렐빈 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 비노렐빈 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 1일에 25 ㎎/㎡ IV로 매주 또는 1일 및 8일에 20-35 ㎎/㎡ IV로, 21일 간격의 주기로 투여하거나, 또는 1, 8 및 15일에 25-30 ㎎/㎡ IV로, 28일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 4 ㎎/kg IV로 투여한 다음 2 ㎎/kg IV로 매주 투여하거나, 또는 1일에 8 ㎎/kg IV로 투여한 다음 1일에 6 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)은 피하 투여하기 위한 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 히알루로니다제-oysk 주사제로서 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 카페시타빈 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 카페시타빈 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 1000-1250 ㎎/㎡ PO로 1-14일에 매일 2회로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 4 ㎎/kg IV로 투여한 다음 2 ㎎/kg IV로 매주 투여하거나, 또는 1일에 8 ㎎/kg IV로 투여한 다음 1일에 6 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)은 피하 투여하기 위한 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 히알루로니다제-oysk 주사제로서 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 라파티닙 (lapatinib) (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염) 및 카페시타빈 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 라파티닙 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 1250 ㎎/㎡ PO로 1-21일에 매일 투여한다. 일부 구현예에서, 카페시타빈 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 1000 ㎎/㎡ PO로 1-14일에 매일 2회로, 21일 간격의 주기로 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 라파티닙 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 1000 ㎎/㎡ PO로 매일 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)을 1일에 4 ㎎/kg IV로 투여한 다음 2 ㎎/kg IV로 매주 투여하거나, 또는 1일에 8 ㎎/kg IV로 투여한 다음 1일에 6 ㎎/kg IV로, 21일 간격의 주기로 투여한다. 일부 구현예에서, 트라스투수맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러)은 피하 투여하기 위한 트라스투주맙 (또는 FDA 허가된 이의 바이오시밀러) 및 히알루로니다제-oysk 주사제로서 투여한다.
일부 구현예에서, 환자는 네라티닙 (neratinib) (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염) 및 카페시타빈 (또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염)을 이용한 치료 후 불응성이거나 또는 재발된 것이다. 일부 구현예에서, 네라티닙은 240 ㎎/㎡ PO로 매일 1-21일에 투여한다. 일부 구현예에서, 카페시타빈을 750 ㎎/㎡ PO로 1-14일에 매일 2회로, 21일 간격의 주기로 투여한다.
C. 림프구 제거
일부 구현예에서, 환자는 치료하기 전 림프구 제거된다.
예시적인 림프구 제거성 화학요법 용법은 관련 있는 유용한 바이오마커와 더불어 WO 2016/191756 및 WO 2019/079564에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 통합된다. 특정 구현예에서, 림프구 제거 화학요법 용법은 환자에게 사이클로포스파미드 투여 (200 ㎎/㎡/day 내지 2000 ㎎/㎡/day) 및 플루다라빈 투여 (20 ㎎/㎡/day 내지 900 ㎎/㎡/day)를 포함한다.
일부 구현예에서, 림프구 제거는 사이클로포스파미드 250 또는 약 250 내지 500 또는 약 500 ㎎/㎡ 투여, 예를 들어, 사이클로포스파미드 250 또는 약 250 내지 500 또는 약 500, 250, 400, 500, 약 250, 약 400 또는 약 500 ㎎/㎡ 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 림프구 제거는 플루다라빈 20 또는 약 20 ㎎/㎡/day 내지 40 또는 약 40 ㎎/㎡/day, 예를 들어, 30 또는 약 30 ㎎/㎡/day 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 림프구 제거는 사이클로포스파미드와 플루다라빈 둘다의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 환자는 사이클로포스파미드 (250 ㎎/㎡/day) 및 플루다라빈 (30 ㎎/㎡/day)의 정맥내 투여에 의해 림프구 제거 처리된다.
일부 구현예에서, 환자는 사이클로포스파미드 (500 ㎎/㎡/day) 및 플루다라빈 (30 ㎎/㎡/day)의 정맥내 투여에 의해 림프구 제거 처리된다.
일부 구현예에서, 림프구 제거는 NK 세포를 1차 투여하기 전 최대 5일 이내에 이루어진다. 일부 구현예에서, 림프구 제거는 NK 세포를 1차 투여하기 전 최대 7일 이내에 이루어진다.
일부 구현예에서, 림프구 제거는 NK 세포를 1차 투여하기 전 5일부터 시작해 연속 3일간 매일 (즉, -5일부터 -3일) 수행된다.
일부 구현예에서, 림프구 제거는 -5일, -4일 및 -3일차에 이루어진다.
D. 투여
1. NK 세포
일부 구현예에서, NK 세포는 약학적 조성물, 예를 들어 본원에 기술된 약학적 조성물의 일부로서 투여된다. 세포는 해동한 후, 일부 경우에는 이의 동결 방지제가 즉석 투여에 적합한 경우에는 어떠한 추가적인 조작 없이, 투여한다. 소정의 개체에 대해, 치료 용법은 흔히 공통 배치 또는 공여체로부터 유래한 NK 세포의 분액 또는 용량을 여러 개 경시적으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, NK 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 NK 세포는 투여 당 NK 세포 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 8 x 109 또는 약 8 x 109개로 투여된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 투여 당 세포 1 x 108 또는 약 1 x 108, 1 x 109 또는 약 1 x 109, 4 x 109 또는 약 4 x 109, 또는 8 x 109 또는 약 8 x 109개로 투여된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 매주 투여된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 1주 또는 약 1주간 투여된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 8주간 또는 약 8주간 투여된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 주입-레디 매질 (infusion-ready media), 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이, 정맥내 투여에 적합한 냉동보존 조성물 중에 냉동보존된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 바이얼 당 세포가 1 x 108 또는 약 1 x 108 내지 8 x 109 또는 약 8 x 109개 수용된 바이얼에서 냉동 보존된다. 일부 구현예에서, NK 세포는 1회 용량을 수용하는 바이얼에서 냉동 보존된다.
일부 구현예에서, 세포는 투여하기 전, 예를 들어 37℃ 수조에서 해동한다.
일부 구현예에서, 해동한 바이얼(들)의 NK 세포는 1회 투여 용기, 예를 들어 투여 백으로, 예를 들어 바이얼 어댑터 및 무균 시린지를 이용해 무균적으로 옮긴다. NK 세포는 용기로부터 Y형 혈액/용액 세트 필터를 통해 IV 주입으로서, 중력에 의해 환자에 투여할 수 있다.
일부 구현예에서, NK 세포는 해동 후 가능한 빨리, 바람직하게는 90분 이내에, 예를 들어 80분 이내, 70분 이내, 60분 이내, 50분 이내, 40분 이내, 30분 이내, 20분 이내 또는 10분 이내에 투여한다. 일부 구현예에서, NK 세포는 해동 후 30분 이내에 투여한다.
일부 구현예에서, 약학적 조성물은 시린지를 통해 정맥내 투여한다.
일부 구현예에서, 환자에게 의약품 1 ㎖, 4 ㎖ 또는 10 ㎖을 시린지를 통해 정맥내 투여한다.
2. 항체
일부 구현예에서, 본원에 기술된 NK 세포(들), 예를 들어 본원에 언급된 NK 세포(들)를 포함하는 약학적 조성물은 항체, 예를 들어, 본원에 기술된 항체, 예를 들어, HER2 항체와 조합하여 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 약학적 조성물의 일부로서 NK 세포와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 NK 세포와 분리하여, 예를 들어 개별 약학적 조성물의 일부로서 투여된다. 항체는 NK 세포를 투여하기 전, 투여한 후 또는 투여와 동시에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 NK 세포를 투여하기 전 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 NK 세포를 투여한 후 투여된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 항체 투여를 완료한 후 적어도 30분, 60분, 90분, 120분, 150분, 180분, 210분 또는 240분에 투여된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 항체를 투여한 후 다음날 투여된다.
일부 구현예에서, NK 세포는 각 투여시 투여되고, 항체는 투여들 중 일부에서만 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, NK 세포는 1주당 1회로 투여되고, 항체는 1개월당 1회로 투여된다.
일부 구현예에서, 항체는 8주간 매주 투여된다. 일부 구현예에서, 항체는 8주간 2주마다 투여된다.
일부 구현예에서, 항체의 용량은 세포를 1차 투여하기 전에 제공된다. 일부 구현예에서, 항체의 감량된 용량이 세포를 1차 투여하기 전에 제공된다.
3. 사이토카인
일부 구현예에서, 사이토카인을 환자에 투여한다.
일부 구현예에서, 사이토카인은 약학적 조성물의 일부로서 NK 세포와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 NK 세포와 별도로, 예를 들어 별도의 약학적 조성물의 일부로서 투여된다.
일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2이다.
일부 구현예에서, IL-2는 피하로 투여한다.
일부 구현예에서, IL-2는 NK 세포의 투여를 종료한 후 1-4시간 또는 약 1 내지 약 4시간에 투여한다. 일부 구현예에서, IL-2는 NK 세포 투여를 완료한 후 적어도 1시간 시점에 투여한다. 일부 구현예에서, IL-2는 NK 세포 투여를 완료한 후 최대 4시간 이내에 투여한다. 일부 구현예에서, IL-2는 NK 세포 투여를 완료한 후 최소 1시간 경과시에서 최대 4시간 이내에 투여한다.
일부 구현예에서, IL-2는 최대 10,000,000 IU/㎡, 예를 들어, 최대 1,000,000, 2,000,000, 3,000,000, 4,000,000, 5,000,000, 6,000,000, 7,000,000, 8,000,000, 9,000,000 또는 10,000,000 IU/㎡로 투여된다.
일부 구현예에서, IL-2는 1,000,000 또는 약 1,000,000, 2,000,000 또는 약 2,000,000, 또는 3,000,000 또는 약 3,000,000, 또는 4,000,000 또는 약 4,000,000, 또는 5,000,000 또는 약 5,000,000, 또는 6,000,000 또는 약 6,000,000, 또는 7,000,000 또는 약 7,000,000, 또는 8,000,000 또는 약 8,000,000, 또는 9,000,000 또는 약 9,000,000, 또는 10,000,000 또는 약 10,000,000 IU/㎡로 투여된다.
일부 구현예에서, IL-2는 1 x 106 IU/㎡ 또는 약 1 x 106 IU/㎡로 투여된다. 일부 구현예에서, IL-2는 2 x 106 IU/㎡ 또는 약 2 x 106 IU/㎡로 투여된다.
일부 구현예에서, IL-2는 환자에게 1 x 106 IU/㎡ 미만으로 투여된다.
일부 구현예에서, IL-2는 균일 용량 (flat dose)으로 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 균일 용량 6,000,000 IU 또는 약 6,000,000 IU이 환자에게 투여된다.
일부 구현예에서, IL-2는 환자에 투여하지 않는다.
E. 투여
"유효량"은 유익한 또는 요망한 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 예를 들어, 치료학적 함량은 요망하는 치료학적 효과를 달성하는 양이다. 이러한 양은 질환 또는 질환 증상의 개시를 방지하는데 필요한 양, 즉 예방학적 유효량과 동일하거나 또는 다를 수 있다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있다. 치료학적 화합물의 치료학적 유효량 (즉, 유효한 투여량)은 선택한 치료학적 화합물에 따라 결정된다. 조성물은 2일 간격으로 1회를 비롯하여 1일 당 1회 이상 내지 1주일 당 1회 이상으로 투여할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면, 비-제한적으로 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 개체의 일반적인 건강 상태 및/또는 나이 및 존재하는 기타 질환을 비롯하여 일부 인자가 개체를 효과적으로 치료하는데 요구되는 투여량 및 시간에 영향을 미칠 수 있음을 알 것이다. 아울러, 본 발명에 기술된 치료학적 화합물을 치료학적 유효량으로 이용해 개체를 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
치료학적 화합물의 투여량, 독성 및 치료학적 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서, 예를 들어 LD50 (집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)을 결정하기 위한 표준 약학적 절차에 의해 결정할 수 있다. 독성과 치료학적 효과 간의 용량 비율이 치료 지수이고, 이는 LD50/ED50 비율로 표현할 수 있다. 치료 지수가 높은 화합물이 바람직하다. 독성 부작용이 있는 화합물을 사용할 수도 있지만, 비-감염 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하여 부작용을 줄이기 위해 이러한 화합물이 발병한 조직 부위로 표적 전달하는 시스템을 설계하는데 주의를 기울여야 한다.
인간에 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는데 세포 배양 분석 및 동물 실험으로부터 수득한 데이터를 이용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내일 수 있다. 투여량은 채택된 투약 형태 및 활용된 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에 이용되는 임의 화합물의 경우, 치료학적 유효량은 먼저 세포 배양 분석으로 추정할 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50 (즉, 증상의 최대 저해의 1/2을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환성 혈장 농도 범위를 달성하도록 동물 모델에서 공식화할 수 있다. 이러한 정보를 이용해 인간에 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내 수준은, 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다.
F. 조합 요법
일부 구현예에서, 본 방법은 본원에 기술된 NK 세포 및 HER2 표적 항체를 다른 요법, 예를 들어, 부가적인 항체, NK 세포 인게이저 (engager), 항체 약물 접합체 (ADC), 화학요법 약물, 예를 들어, 소분자 약물, 면역 체크포인트 저해제 및 이들의 조합과 조합 투여하는 것을 포함한다.
1. 소형 분자 / 화학요법 약물
일부 구현예에서, 추가적인 요법은 소분자 약물이다. 일부 구현예에서, 추가적인 요법은 화학요법 약물이다. 일부 구현예에서, 추가적인 요법은 소분자 화학요법 약물이다. 이러한 소분자 약물은 적응 NK 세포 요법이 추가되는 현행 표준 관리 치료 용법을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 NK 세포의 사용은, 원하는 효과를 달성하는데 필요한 소분자 약물의 효능을 강화하거나, 소분자 약물의 양을 줄이거나, 또는 소분자 약물의 독성 감소 등에 의해, 소분자 약물의 효과를 강화할 수 있다.
일부 구현예에서, 약물은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
일부 구현예에서, 약물은 [(1S,2S,3R,4S,7R,9S,10S,12R,15S)-4-아세틸옥시-1,9,12-트리하이드록시-15-[(2R,3S)-2-하이드록시-3-[(2-메틸프로판-2-일)옥시카르보닐아미노]-3-페닐프로파노일]옥시-10,14,17,17-테트라메틸-11-옥소-6-옥사테트라사이클로[11.3.1.03,10.04,7]헵타데스-13-엔-2-일]벤조에이트 (도세탁셀) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 [(1S,2S,3R,4S,7R,9S,10S,12R,15S)-4,12-다이아세틸옥시-15-[(2R,3S)-3-벤즈아미도-2-하이드록시-3-페닐프로파노일]옥시-1,9-다이하이드록시-10,14,17,17-테트라메틸-11-옥소-6-옥사테트라사이클로[11.3.1.03,10.04,7]헵타데스-13-엔-2-일]벤조에이트 (파클리탁셀) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 6-N-(4,4-다이메틸-5H-1,3-옥사졸-2-일)-4-N-[3-메틸-4-([1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피리딘-7-일옥시)페닐]퀴나졸린-4,6-다이아민 (투카티닙) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 펜틸 N-[1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-다이하이드록시-5-메틸옥솔란-2-일]-5-플루오로-2-옥소피리미딘-4-일]카바메이트 (카페시타빈) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 아자니드; 사이클로부탄-1,1-다이카르복시산;플라티늄(2+)(카보플라틴) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 메틸 (1R,9R,10S,11R,12R,19R)-11-아세틸옥시-12-에틸-4-[(12S,14R)-16-에틸-12-메톡시카르보닐-1,10-다이아자테트라사이클로[12.3.1.03,11.04,9]옥타데카-3(11),4,6,8,15-펜타엔-12-일]-10-하이드록시-5-메톡시-8-메틸-8,16-다이아자펜타사이클로[10.6.1.01,9.02,7.016,19]노나데카-2,4,6,13-테트라엔-10-카르복실레이트 (비노렐빈) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 N-[3-클로로-4-[(3-플루오로페닐)메톡시]페닐]-6-[5-[(2-메틸설포닐에틸아미노)메틸]푸란-2-일]퀴나졸린-4-아민 (라파티닙) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (E)-N-[4-[3-클로로-4-(피리딘-2-일메톡시)아닐리노]-3-시아노-7-에톡시퀴놀린-6-일]-4-(다이메틸아미노)but-2-엔아미드 (네라티닙) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 6-아세틸-8-사이클로펜틸-5-메틸-2-[(5-피페라진-1-일피리딘-2-일)아미노]피리도[2,3-d]피리미딘-7-온 (팔보시클립) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 7-사이클로펜틸-N,N-다이메틸-2-[(5-피페라진-1-일피리딘-2-일)아미노]피롤로[2,3-d]피리미딘-6-카르복사미드 (리보시클립) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 N-[5-[(4-에틸피페라진-1-일)메틸]피리딘-2-일]-5-플루오로-4-(7-플루오로-2-메틸-3-프로판-2-일벤즈이미다졸-5-일)피리미딘-2-아민 (아베마시클립) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-다이하이드록시-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-(2-하이드록시에톡시)-3-메톡시사이클로헥실]프로판-2-일]-19,30-다이메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-다이옥사-4-아자트리사이클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜톤 (에베롤리무스) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (2S)-1-N-[4-메틸-5-[2-(1,1,1-트리플루오로-2-메틸프로판-2-일)피리딘-4-일]-1,3-티아졸-2-일]피롤리딘-1,2-다이카르복사미드 (알펠리십) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 4-[[3-[4-(사이클로프로판카르보닐)피페라진-1-카르보닐]-4-플루오로페닐]메틸]-2H-프탈라진-1-온 (올라파립) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (11S,12R)-7-플루오로-11-(4-플루오로페닐)-12-(2-메틸-1,2,4-트리아졸-3-일)-2,3,10-트리아자트리사이클로[7.3.1.05,13]트리데카-1,5(13),6,8-테트라엔-4-온 (탈라조파립) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 N-[2-[2-(다이메틸아미노)에틸-메틸아미노]-4-메톡시-5-[[4-(1-메틸인돌-3-일)피리미딘-2-일]아미노]페닐]프로프-2-엔아미드 (오시메르티닙) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴린-4-일프로폭시)퀴나졸린-4-아민 (게피티닙) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 (에를로티닙) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (E)-N-[4-(3-클로로-4-플루오로아닐리노)-7-[(3S)-옥솔란-3-일]옥시퀴나졸린-6-일]-4-(다이메틸아미노)but-2-엔아미드 (아파티닙) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 아잔 (azane); 다이클로로플라티늄 (시스플라틴, 플라티놀) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 아자니드; 사이클로부탄-1,1-다이카르복시산; 플라티늄(2+) (카보플라틴) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다
일부 구현예에서, 약물은 4-아미노-1-[(2R,4R,5R)-3,3-다이플루오로-4-하이드록시-5-(하이드록시메틸)옥솔란-2-일]피리미딘-2-온 (겜시타빈) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (2S)-2-[[4-[2-(2-아미노-4-옥소-3,7-다이하이드로피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)에틸]벤조일]아미노]펜탄다이오익산 (페메트렉세드) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 N,N-비스(2-클로로에틸)-2-옥소-1,3,2λ5-옥사자포스피난-2-아민 (사이클로포스파미드) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (2R,3S,4S,5R)-2-(6-아미노-2-플루오로퓨린-9-일)-5-(하이드록시메틸)옥솔란-3,4-다이올 (플루다라빈) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (7S,9S)-7-[(2R,4S,5S,6S)-4-아미노-5-하이드록시-6-메틸옥산-2-일]옥시-6,9,11-트리하이드록시-9-(2-하이드록시아세틸)-4-메톡시-8,10-다이하이드로-7H-테트라센-5,12-다이온 (독소루비신) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 메틸 (1R,9R,10S,11R,12R,19R)-11-아세틸옥시-12-에틸-4-[(13S,15S,17S)-17-에틸-17-하이드록시-13-메톡시카르보닐-1,11-다이아자테트라사이클로[13.3.1.04,12.05,10]노나데카-4(12),5,7,9-테트라엔-13-일]-8-포르밀-10-하이드록시-5-메톡시-8,16-다이아자펜타사이클로[10.6.1.01,9.02,7.016,19]노나데카-2,4,6,13-테트라엔-10-카르복실레이트 (빈크리스틴) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (8S,9S,10R,13S,14S,17R)-17-하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13-다이메틸-6,7,8,9,12,14,15,16-옥타하이드로사이클로펜타[a]페난트렌-3,11-다이온 (프레드니손) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 N,3-비스(2-클로로에틸)-2-옥소-1,3,2λ5-옥사자포스피난-2-아민 (이포스파미드) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (5S,5aR,8aR,9R)-5-[[(2R,4aR,6R,7R,8R,8aS)-7,8-다이하이드록시-2-메틸-4,4a,6,7,8,8a-헥사하이드로피라노[3,2-d][1,3]다이옥신-6-일]옥시]-9-(4-하이드록시-3,5-다이메톡시페닐)-5a,6,8a,9-테트라하이드로-5H-[2]벤조푸로[6,5-f][1,3]벤조다이옥솔-8-온 (에토프시드) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-9-플루오로-11,17-다이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13,16-트리메틸-6,7,8,11,12,14,15,16-옥타하이드로사이클로펜타[a]페난트렌-3-온 (덱사메타손) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, 약물은 (8S,9R,10S,11S,13S,14S,16R,17R)-9-플루오로-11,17-다이하이드록시-17-(2-하이드록시아세틸)-10,13,16-트리메틸-6,7,8,11,12,14,15,16-옥타하이드로사이클로펜타[a]페난트렌-3-온 (시타라빈) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구현예에서, NK 세포, 예를 들어, 본원에 기술된 NK 세포, 예를 들어, AB-101 세포는 HER2 표적 항체뿐 아니라 항체-약물 접합체 (ADC), 키나제 저해제, CDK4/5 저해제, mTOR 저해제, PI3K 저해제, PARP 저해제 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 요법과 조합하여 투여된다.
일부 구현예에서, 항체-약물 접합체는 ado-트라스투수맙 엠탄신, fam-트라스투주맙 데룩테칸, 사시투주맙 고비테칸 (sacituzumab govitecan) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 키나제 저해제는 라파티닙, 네라티닙, 투카티닙 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CDK4/6 저해제는 팔보시클립 (palbociclib), 리보시클립 (ribociclib), 아베마시클립 (abemaciclib) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, mTOR 저해제는 에베롤리무스 (everolimus)이다.
일부 구현예에서, PI3K 저해제는 알펠리십 (alpelisib)이다.
일부 구현예에서, PARP 저해제는 올라파립 (olaparib), 탈라조파립 (talazoparib) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
2. NK 세포 인게이저
일부 구현예에서, 추가적인 요법은 NK 세포 인게이저 (NK cell engager), 예를 들어, 2중 특이성 또는 3중 특이성 항체이다.
일부 구현예에서, NK 세포 인게이저는 CD16과, 질환-관련 항원, 예를 들어, 암-관련 항원, 예를 들어, 본원에 기술된 암 항원, 예를 들어, HER2에 대한 2중 특이성 항체이다. 일부 구현예에서, NK 세포 인게이저는 CD16과, 질환-관련 항원 2종, 예를 들어, 암-관련 항원, 예를 들어, 본원에 기술된 항원들에 대한 3중 특이성 항체이다.
3. 체크포인트 저해제
일부 구현예에서, 추가적인 요법은 면역 체크포인트 저해제이다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제, VISTA 저해제, BTLA 저해제, TIM-3 저해제, KIR 저해제, LAG-3 저해제, TIGIT 저해제, CD-96 저해제, SIRPα 저해제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, CTLA-4 저해제, LAG-3 (CD223) 저해제, TIM-3 저해제, B7-H3 저해제, B7-H4 저해제, A2aR 저해제, CD73 저해제, NKG2A 저해제, PVRIG/PVRL2 저해제, CEACAM1 저해제, CEACAM 5 저해제, CEACAM 6 저해제, FAK 저해제, CCL2 저해제, CCR2 저해제, LIF 저해제, CD47 저해제, SIRPα 저해제, CSF-1 저해제, M-CSF 저해제, CSF-1R 저해제, IL-1 저해제, IL-1R3 저해제, IL-RAP 저해제, IL-8 저해제, SEMA4D 저해제, Ang-2 저해제, CELVER-1 저해제, Axl 저해제, 포스파티딜세린 저해제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 표 8에 열거된 물질 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
면역 체크포인트 저해제 예
표적 저해제
LAG-3 (CD223) LAG525 (IMP701), REGN3767 (R3767), BI 754,091, 텔보텔리맙 (MGD013), 에프틸라기모드 α (IMP321), FS118
TIM-3 MBG453, Sym023, TSR-022
B7-H3, B7-H4 MGC018, FPA150
A2aR EOS100850, AB928
CD73 CPI-006
NKG2A 모날리주맙
PVRIG/PVRL2 COM701
CEACAM1 CM24
CEACAM 5/6 NEO-201
FAK 데팍티닙
CCL2/CCR2 PF-04136309
LIF MSC-1
CD47/SIRPα Hu5F9-G4 (5F9), ALX148, TTI-662, RRx-001
CSF-1 라크노투주맙 (MCS110), LY3022855, SNDX-6352, 에마크투주맙 (RG7155), 펙시다르티닙 (PLX3397)
(M-CSF)/CSF-1R
IL-1 및 IL-1R3 CAN04, 카나키누맙 (ACZ885)
(IL-1RAP)
IL-8 BMS-986253
SEMA4D 페피네맙 (VX15/2503)
Ang-2 트레바나닙
CLEVER-1 FP-1305
Axl 에나포타맙 베도틴 (EnaV)
포스파티딜세린 바시툭시맙
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 항체이다.
일부 구현예에서, PD-1 펨브롤리주맙 (pembrolizumab), 니볼루맙 (nivolumab), 토리팔리맙 (toripalimab), 세미플리맙-rwlc (cemiplimab-rwlc), 신틸리맙 (sintilimab) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, PD-L1 저해제는 아테졸리주맙 (atezolizumab), 두르발루맙 (durvalumab), 아벨루맙 (avelumab) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CTLA-4 저해제는 이필리무맙 (ipilimumab)이다.
일부 구현예에서, PD-1 저해제는 표 9에 나타낸 저해제 군으로부터 선택된다.
PD-1 저해제 항체 예
명칭 국내 명칭 항원 회사
니볼루맙 Opdivo, ONO-4538, MDX-1106, BMS-936558, 5C4 PD-1 BMS, Medarex, Ono
펨브롤리주맙 Keytruda, MK-3475, SCH 900475, 람브롤리주맙 PD-1 Merck (MSD), Schering-Plough
토리팔리맙 JS001, JS-001, TAB001, 트리프리주맙 PD-1 Junmeng Biosciences, Shanghai Junshi, TopAlliance Bio
세미플리맙-rwlc Libtayo, 세미플리맙, REGN2810 PD-1 Regeneron, Sanofi
신틸리맙 Tyvyt, IBI308 PD-1 Adimab, Innovent, Lilly
MEDI0680 AMP-514 PD-1 Amplimmune, Medimmune
LZM009 PD-1 Livzon
부달리맙 XmAb20717 CTLA4, PD-1 Xencor
SI-B003 CTLA4, PD-1 Sichuan Baili Pharma, Systimmune
Sym021 심포겐 특허 항-PD-1 PD-1 Symphogen
LVGN3616 PD-1 Lyvgen Biopharma
MGD019 CTLA4, PD-1 MacroGenics
MEDI5752 CTLA4, PD-1 Medimmune
CS1003 PD-1 CStone Pharma
IBI319 IBI-319 PD-1, 비공개 Innovent, Lilly
IBI315 IBI-315 HER2/neu, PD-1 Beijing Hanmi, Innovent
부디갈리맙 ABBV-181, PR-1648817 PD-1 Abbvie
선샤인 권지언 특허 항-PD-1 609A PD-1 Sunshine Guojian Pharma
F520 PD-1 Shandong New Time Pharma
RO7247669 LAG-3, PD-1 Roche
이주랄리맙 XmAb23104 ICOS, PD-1 Xencor
LY3434172 PD-1, PD-L1 Lilly, Zymeworks
SG001 PD-1 CSPC Pharma
QL1706 PSB205 CTLA4, PD-1 Sound Biologics
AMG 404 AMG404 PD-1 Amgen
MW11 PD-1 Mabwell
GNR-051 PD-1 IBC Generium
닝보 암 병원. 항-PD-1 CAR HerinCAR-PD1 PD-1 Ningbo Cancer Hosp.
중국 PLA Gen.Hosp. 항-PD-1 PD-1 Chinese PLA Gen.Hosp.
세트렐리맙 JNJ-63723283 PD-1 Janssen Biotech
TY101 PD-1 Tayu Huaxia
AK112 PD-1, VEGF Akeso
EMB-02 LAG-3, PD-1 EpimAb
피딜리주맙 CT-011, hBat-1, MDV9300 PD-1 CureTech, Medivation, Teva
사산리맙 PF-06801591, RN-888 PD-1 Pfizer
발스틸리맙 AGEN2034, AGEN-2034 PD-1 Agenus, Ludwig Inst., Sloan-Kettering
겝타놀리맙 CBT-501, GB226, GB 226, 게놀림주맙, 게노르맙 PD-1 CBT Pharma, Genor
RO7121661 PD-1, TIM-3 Roche
AK104 CTLA4, PD-1 Akeso
피미발리맙 JTX-4014 PD-1 Jounce
IBI318 IBI-318 PD-1, PD-L1 Innovent, Lilly
BAT1306 PD-1 Bio-Thera 용액s
에자벤리맙 BI754091, BI 754091 PD-1 Boehringer
헤난 암 병원 항-PD-1 테리팔리맙 PD-1 Henan Cancer Hospital
텔보텔리맙 LAG-3, PD-1 MacroGenics
신델리주맙 PD-1 Nanjing Medical U.
도스타를리맙 ANB011, TSR-042, ABT1 PD-1 AnaptysBio, Tesaro
티슬렐리주맙 BGB-A317 PD-1 BeiGene, Celgene
스파르탈리주맙 PDR001, BAP049 PD-1 Dana-Farber, Novartis
레티판리맙 MGA012, INCMGA00012 PD-1 Incyte, MacroGenics
캄렐리주맙 SHR-1210 PD-1 Incyte, Jiangsu Hengrui, Shanghai Hengrui
짐베렐리맙 WBP3055, GLS-010, AB122 PD-1 Arcus, Guangzhou Gloria Bio, Harbin Gloria Pharma, WuXi Biologics
펜풀리맙 AK105 PD-1 Akeso, HanX Bio, Taizhou Hanzhong Bio
프롤골리맙 BCD-100 PD-1 Biocad
HX008 PD-1 Taizhou Hanzhong Bio, Taizhou HoudeAoke Bio
SCT-I10A PD-1 Sinocelltech
세르플룰리맙 HLX10 PD-1 Henlix
일부 구현예에서, PD-L1 저해제는 표 10에 나타낸 저해제 군으로부터 선택된다.
PD-L1 저해제 항체 예
명칭 국내 명칭 항원 회사
두르발루맙 Imfinzi, MEDI-4736, MEDI4736 PD-L1 AstraZeneca, Celgene, Medimmune
아테졸리주맙 Tecentriq, MPDL3280A, RG7446, YW243.55.S70, RO5541267 PD-L1 Genentech
아벨루맙 Bavencio, MSB0010718C, A09-246-2 PD-L1 Merck Serono, Pfizer
AMP-224 PD-L1 Amplimmune, GSK, Medimmune
코시벨리맙 CK-301, TG-1501 PD-L1 Checkpoint Therapeutics, Dana-Farber, Novartis, TG Therapeutics
로다폴리맙 LY3300054 PD-L1 Lilly
MCLA-145 4-1BB, PD-L1 Merus
FS118 LAG-3, PD-L1 f-star, Merck Serono
INBRX-105 ES101 4-1BB, PD-L1 Elpiscience, Inhibrx
쑤저우 나노맙 특허 항-PD-L1 PD-L1 Suzhou Nanomab
MSB2311 PD-L1 Mabspace
BCD-13 PD-L1 Biocad
오푸콜리맙 HLX20, HLX09 PD-L1 Henlix
IBI322 IBI-322 CD47, PD-L1 Innovent
LY3415244 PD-L1, TIM-3 Lilly, Zymeworks
GR1405 PD-L1 Genrix Biopharma
LY3434172 PD-1, PD-L1 Lilly, Zymeworks
CDX-527 CD27, PD-L1 Celldex
FS222 4-1BB, PD-L1 f-star
LDP PD-L1 Dragonboat Biopharma
ABL503 4-1BB, PD-L1 ABL Bio
HB0025 PD-L1, VEGF Huabo Biopharm
MDX-1105 BMS-936559, 12A4 PD-L1 Medarex
가리불리맙 BGB-A333 PD-L1 BeiGene
GEN1046 4-1BB, PD-L1 BioNTech, Genmab
NM21-1480 4-1BB, PD-L1, 혈청 알부민 Numab
빈트라푸스프 알파 M7824, MSB0011359C PD-L1, TGFβRII Merck Serono, NCI
파크밀리맙 CX-072 PD-L1 CytomX
A167 KL-A167 PD-L1 Harbour Biomed Ltd., Sichuan Kelun Pharma
IBI318 IBI-318 PD-1, PD-L1 Innovent, Lilly
KN046 CTLA4, PD-L1 Alphamab
STI-3031 IMC-001 PD-L1 Sorrento
SHR-1701 PD-L1 Jiangsu Hengrui
LP002 PD-L1 Taizhou HoudeAoke Bio
STI-1014 ZKAB001 PD-L1 Lee's Pharm, Sorrento
엔바폴리맙 KN035 PD-L1 Alphamab
아데브렐리맙 SHR-1316 PD-L1 Jiangsu Hengrui, Shanghai Hengrui
CS1001 PD-L1 CStone Pharma
TQB2450 CBT-502 PD-L1 CBT Pharma, Chia Tai Tianqing Pharma
일부 구현예에서, CTLA-4 저해제는 표 11에 나타낸 저해제 군으로부터 선택된다.
CTLA4 저해제 항체 예
명칭 국내 명칭 항원 회사
이필리무맙 Yervoy, MDX-010, MDX101, 10D1, BMS-734016 CTLA4 Medarex
ATOR-1015 ADC-1015 CTLA4, OX40 Alligator
부달리맙 XmAb20717 CTLA4, PD-1 Xencor
SI-B003 CTLA4, PD-1 Sichuan Baili Pharma, Systimmune
MGD019 CTLA4, PD-1 MacroGenics
MEDI5752 CTLA4, PD-1 Medimmune
ADU-1604 CTLA4 Aduro
BCD-145 Q3W CTLA4 Biocad
CS1002 CTLA4 CStone Pharma
REGN4659 CTLA4 Regeneron
파부날리맙 XmAb22841 CTLA4, LAG-3 Xencor
AGEN1181 CTLA4 Agenus
QL1706 PSB205 CTLA4, PD-1 Sound Biologics
ADG126 CTLA4 Adagene
KN044 CTLA4 Changchun Intelli-Crown
ONC-392 CTLA4 OncoImmune, Pfizer
BMS-986218 CTLA4 BMS
BMS-986249 CTLA4 BMS
BT-001 TG6030 CTLA4 BioInvent
쿠아본리맙 MK-1308 CTLA4 Merck (MSD)
잘리프렐리맙 AGEN1884 CTLA4 Agenus, Ludwig Inst., Sloan-Kettering
AK104 CTLA4, PD-1 Akeso
IBI310 IBI-310 CTLA4 Innovent
KN046 CTLA4, PD-L1 Alphamab
트레멜리무맙 티실리무맙, CP-675206, clone 11.2.1 CTLA4 Amgen, Medimmune, Pfizer
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 소분자 약물이다. 소분자 체크포인트 저해제는 예를 들어, WO2015/034820A1, WO2015/160641A2, WO2018/009505 A1, WO2017/066227 A1, WO2018/044963 A1, WO2018/026971 A1, WO2018/045142 A1, WO2018/005374 A1, WO2017/202275 A1, WO2017/202273 A1, WO2017/202276 A1, WO2018/006795 A1, WO2016/142852 A1, WO2016/142894 A1, WO2015/033301 A1, WO2015/033299 A1, WO2016/142886 A2, WO2016/142833 A1, WO2018/051255 A1, WO2018/051254 A1, WO2017/205464 A1, US2017/0107216 A1, WO2017/070089A1, WO2017/106634A1, US2017/0174679 A1, US2018/0057486 A1, WO2018/013789 A1, US2017/0362253 A1, WO2017/192961 A1, WO2017/118762 A1, US2014/199334 A1, WO2015/036927 A1, US2014/0294898 A1, US2016/0340391 A1, WO2016/039749 A1, WO2017/176608 A1, WO2016/077518 A1, WO2016/100608 A1, US2017/0252432 A1, WO2016/126646 A1, WO2015/044900 A1, US2015/0125491 A1, WO2015/033303 A1, WO2016/142835 A1, WO2019/008154 A1, WO2019/008152 A1 및 WO2019023575A1에 언급되어 있다.
일부 구현예에서, PD-1 저해제는 2-[[4-아미노-1-[5-(1-아미노-2-하이드록시프로필)-1,3,4-옥사다이아졸-2-일]-4-옥소부틸]카바모일아미노]-3-하이드록시프로판산 (CA-170)이다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 (S)-1-(3-브로모-4-((2-브로모-[1,1'-바이페닐]-3-일)메톡시)벤질)피페리딘-2-카르복시산이다.
일부 구현예에서, 면역 체크포인트 저해제는 펩타이드이다. 예를 들어, Sasikumar et al., "Peptide and Peptide-Inspired Checkpoint Inhibitors: Protein Fragments to Cancer Immunotherapy", Medicine in Drug Discovery 8:100073 (2020)을 참조한다.
VII. 변이체
일부 구현예에서, 본원에 기술된 융합 단백질(들) 또는 이의 구성요소들, 또는 본원에 기술된 NK 세포 유전자형은 (예, 본원에 제공된) 예시적인 서열의 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 동일하고, 예를 들어, 본원에 기술된 돌연변이를 포함하여 또는 이와 더불어, 예를 들어, 보존적인 돌연변이로 치환된 예시적인 서열의 잔기로서 최대 1%, 2%, 5%, 10%, 15% 또는 20%의 차이를 가진다. 바람직한 구현예에서, 변이체는 부모 서열의 요망되는 활성을 유지한다.
핵산 서열 2종의 서열 동일성을 확인하기 위해, 서열들을 최적 비교하기 위해 정렬한다 (예를 들어, 최적으로 정렬하기 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 어느 하나 또는 양쪽에 갭이 도입될 수 있으며, 비-상동적인 서열은 비교 목적에서는 무시될 수 있음). 비교 목적으로 정렬되는 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 80%이고, 일부 구현예에서, 적어도 90% 또는 100%이다. 그런 후, 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열의 한 위치에 제2 서열의 대응하는 위치에서와 동일한 뉴클레오티드가 존재한다면, 그 분자는 그 위치에서 동일한 것이다 (본원에 사용된 바와 같이, 핵산 "동일성"은 핵산 "상동성"과 동일임). 서열 2종 간의 동일성 %는 서열 2개를 최적으로 정렬하기 위해 도입되어야 하는 각 갭의 길이와 갭 개수를 고려한, 서열들에 공유된 동일한 위치 개수에 대한 함수이다.
대상 폴리펩타이드 또는 핵산 서열 (즉, 쿼리) 및 제2 폴리펩타이드 또는 핵산 서열 (즉, 표적) 간의 동일성 %는 당해 기술 분야의 기술 내에서 다양한 방식으로, 예를 들어 Smith Waterman 정렬 (Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7); GeneMatcher Plus™, Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-358에 통합된 바와 같은 "BestFit" (Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)); BLAST 프로그램 (Basic Local Alignment Search Tool; (Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10), BLAST-2, BLAST-P, BLAST-N, BLAST-X, WU-BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2, CLUSTAL 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같이 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 결정한다. 아울러, 당해 기술 분야의 당업자는 비교 중인 서열들의 길이 전체에 대해 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘 등의, 정렬을 결정하기 위한 적절한 매개변수를 정할 수 있다. 일반적으로, 표적 단백질 또는 핵산의 경우, 비교 길이는 표적의 임의 길이, 최대로, 및 표적의 전장 길이 등 (예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%)일 수 있다. 본 발명의 목적에서 동일성 %는 쿼리 서열의 전장 길이를 기준으로 한다.
본 발명의 목적에서, 서열 2종의 서열 비교 및 동일성 % 결정은 Blossum 62 스코링 매트릭스를 이용하고 갭 패널티 12, 갭 연장 패널티 4 및 프래임쉬프트 갭 패널티 5를 적용해 달성할 수 있다.
보존적인 치환은 전형적으로 하기 군내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루신, 루신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.
VIII. 정의
달리 정의되지 않은 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 기술 및 과학 용어 또는 용어법은 청구 내용이 속하는 기술 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미와 동일한 의미가 있는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 통상적으로 이해되는 의미를 가진 용어들이 명확하게 하거나 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되지만, 본 발명에서 이러한 정의의 포함이 반드시 당해 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 바와 실질적인 차이를 의미하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 출원 전체에서, 다양한 구현예들이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기술은 주로 편의성 및 간결성을 위한 것일 뿐 개시 내용의 범위에 변경할 수 없는 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 이에, 범위의 기술은 가능한 모든 하위 범위뿐 아니라 그 범위에 속하는 개개 수치 값들을 구체적으로 언급하는 것으로 간주하여야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같이 범위 기술은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위뿐 아니라 그 범위에 속하는 개개 수치, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 구체적으로 언급하는 것으로 간주하여야 한다. 이는 범위의 폭과는 무관하게 적용된다.
본 명세서 및 청구항에 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않은 한 복수의 참조를 포괄한다. 예를 들어, 용어 "샘플"은 샘플들의 혼합물을 비롯한 복수의 샘플을 포괄한다.
용어 "확인", "측정", "평가", "판정", "검정" 및 "분석"은 본 발명에서 상호 호환적으로 종종 측정 유형을 지칭하기 위해 사용된다. 이들 용어는 요소의 존재 또는 부재를 결정 (예, 검출)하는 것을 포함한다. 이들 용어는 정량적인, 정성적인 또는 정량 및 정성적인 결정을 망라할 수 있다. 평가는 상대적이거나 또는 절대적일 수 있다. "의 존재 검출"은 이것이 문맥에 따라 존재 여부를 확인하는 것 외에도 존재하는 어떤 것의 양을 결정하는 것을 포괄할 수 있다.
용어 "개체", "개인" 또는 "환자"는 본 발명에서 종종 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "생체내"는 개체의 신체에서 이루어지는 현상을 나타내기 위해 사용된다.
용어 "생체외"는 개체의 신체 외부에서 이루어지는 현상을 나타내기 위해 사용된다. 생체외 분석은 개체에서 수행되지 않는다. 오히려, 이는 개체로부터 분리된 샘플에 대해 수행된다. 샘플에 대해 수행되는 생체외 분석의 일 예가 "시험관내" 분석이다.
용어 "시험관내"는 물질이 수득되는 생물학적 공급원으로부터 분리되도록 실험 시약을 수용하기 위한 용기 안에서 이루어지는 현상을 지칭하기 위해 사용된다. 시험관내 분석은 살아있는 세포 또는 사멸 세포를 이용한 세포-기반의 분석을 망라할 수 있다. 또한, 시험관내 분석은 온전한 세포를 이용하지 않는 무-세포성 분석을 망라할 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 숫자에 대한 용어 "약"은 해당 숫자의 10%가 그 숫자로부터 추가 또는 공제되는 것을 의미한다. 범위에 대한 용어 "약"은 그 범위에서 최저 값의 10%를 뺀 값에서 최대 값의 10%를 더한 값까지를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "완충제 용액"은 약산과 이의 짝염기, 또는 그 반대로 구성된 혼합물로 이루어진 수성 용액을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 배양 배지"는 당, 아미노산, 다양한 영양분, 무기 물질 등과 같이 세포의 생장 및 증식에 필수적인 인자들을 함유한, 시험관내 세포 생장 및 증식을 위한 혼합물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 완충제 용액은 세포 배양 배지가 아니다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물반응기"는 용존 산소 농도, 용존 이산화탄소 농도, pH 및 온도 등의 세포 배양에 영향을 미치는 일련의 조건을 계속 통제할 수 있는 배양 장치를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 이에 연결된 다른 핵산을 증폭시킬 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 이 용어는 자가-복제성 핵산 구조로서 벡터뿐 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 통합되는 벡터를 망라한다. 일부 벡터는 본 발명의 핵산 분자(들) 또는 폴리뉴클레오티드(들)를 전달하는데 적합하다. 일부 벡터는 이에 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 발현 벡터로 언급된다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 2 이상의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드 요소들이 통상적으로 물리적으로 연결되어 있으며, 서로 기능적인 관계로 존재하는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현을 개시 또는 조절할 수 있다면, 그 프로모터는 코딩 서열에 작동하게 연결된 것이며, 이 경우 코딩 서열은 프로모터"의 통제 하"에 있는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은 상호 호환적으로 사용되며, 이러한 세포의 자손을 비롯하여 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 계대 배양 횟수와는 무관하게 일차 조작된 (예, 형질전환된) 세포 및 이로부터 유래한 자손을 망라하는, "조작된 세포", "형질전환체", 및 "형질전환된 세포"를 포괄한다. 자손은 부모 세포와 핵산 구성이 완전히 동일하지 않을 수 있으며, 돌연변이를 포함할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에서 선별 또는 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 가진 돌연변이 자손도 본 발명에 포함된다.
적절한 경우, 숙주 세포는 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염될 수 있다.
본 발명에 사용된 단락 제목은 단순히 구성상의 이유일 뿐이며, 기술한 발명의 내용을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
IX. 실시예
아래 실시예들은 단순 예시적인 목적으로 포함될 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도하는 것은 아니다.
실시예 1: 규격품 NK 세포 요법 플랫폼
NK 세포를 증폭 및 자극하는 방법의 일 예를 도 1에 도시한다. 수용체 CD16의 고 친화성 변이체 (158 V/V 변이체, 예를 들어 Koene et al., "FcγRIIIa-158V/F Polymorphism Influences the Binding of IgG by Natural Killer Cell FcgammaRIIIa, Independently of the FcgammaRIIIa-48L/R/H Phenotype", Blood 90:1109-14 (1997) 참조) 및 KIR-B 유전자형 (KIR 수용체 계열의 KIR B 대립유전자, 예를 들어 Hsu et al., "The Killer Cell Immunoglobulin-Like Receptor (KIR) Genomic Region: Gene-Order, Haplotypes and Allelic Polymorphism", Immunological Review 190:40-52 (2002); 및 Pyo et al., "Different Patterns of Evolution in the Centromeric and Telomeric Regions of Group A and B Haplotypes of the Human Killer Cell Ig-like Receptor Locus", PLoS One 5:e15115 (2010) 참조)을 가진 FDA-허가된 냉동 제대혈 단일 유닛을 NK 세포 공급원으로 선택하였다.
제대혈 유닛을 해동하고, 원심분리하여 냉동 매질을 제거하였다. 그 후, 세포 조제물에서 QuadroMACS 세포 선별 시스템 (Miltenyi) 및 CD3 (T 세포) MicroBeads를 이용해 T 세포를 고갈 처리하였다. 전체 유핵 세포 (TNC) 6 x 108개 집단을 MicroBeads로 표지하고, QuadroMACS 장치 및 완충제를 사용해 분리하였다. T 세포를 고갈 처리한 후, 주로 단핵구와 NK 세포인 남아있는 세포를 헹군 다음 항생제-비함유 매질 (CellgroSCGM) 중에 수집하였다. 세포 조제물은 이후 전체 유핵 세포 수, 생존성 및 CD3+ 세포 %에 대해 분석하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 제대혈 NK 세포는 CD3 고갈 처리되었다.
CD3- 세포 조제물을 증식 배지가 든 기체 투과성 세포 증폭 백에 접종하였다. 세포는 복제 불완전 조작된 HuT-78 (eHUT-78) 지지 세포와 공-배양해 마스터 세포 은행 (MCB) 집단에 대해 증폭을 강화하였다. CellgroSCGM 배양 배지를 먼저 항-CD3 항체 (OKT3), 인간 혈장, 글루타민 및 IL-2로 보충하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 공-배양 단계들 중 어느 단계 중에, 선택적으로 NK 세포를, 예를 들어 렌티바이러스 벡터를 이용해 NK 세포에 CAR을 도입하도록 조작하였다.
세포는 정지 배양으로서 5% CO2 밸런스 공기 분위기 하에 37℃에서 12-16일간, 2-4일 간격으로 배지를 추가로 교체하면서, 배양하였다. 배양물이 100배 이상으로 증폭되면, 배양된 세포를 회수한 다음 냉동 매질에 현탁하여 크라이오백에 충진하였다. 이 경우, 이러한 공 배양 중에 백 또는 바이얼 당 세포 108개인 백 또는 바이얼 80개가 만들어졌다. 크라이오백을 속도 제어형 동결기 (controlled rate freezer)를 사용해 -150℃ 이하의 기상 액체 질소 (LN2) 탱크에서 냉동하였다. FDA-허가된 제대형 유닛으로부터 유래한 이러한 냉동보존한 NK 세포를 마스터 세포 은행 (MCB)으로 이용하였다.
의약품을 제조하기 위해, MCB로부터 수득한 냉동 세포 백을 해동한 다음 냉동 매질을 제거하였다. 해동한 세포는 일회용 배양 백에 접종하고, 지지 세포, 예를 들어, eHUT78 지지 세포와 공-배양해 의약품을 생산하였다. 이 경우, 제대혈 유닛 하나 당 의약품 로트 수천개를 생산하기 위해 세포를 50 ℓ 생물반응기에서 배양하였으며 (예를 들어, 냉동 바이얼 4,000-8,000개, 각각 109 세포/바이얼), 이를 냉동보존 조성물과 혼합한 다음 냉동 바이얼과 같은 복수의 보관 용기에 넣어 냉동하였다. 이 의약품은 직접 주입용으로 이용할 수 있는 규격품 주입 레디 제품 (off-the-shelf infusion ready product)이다. 각 의약품 로트 하나는 환자 수백 내지 수천명에 주입할 수 있다 (예를 들어, 환자 100-1,000명, 예로, 표적 용량 4 x 109 세포).
실시예 2: 지지 세포 증폭
일 예로서, 적절한 지지 세포, 예를 들어, eHut-78 세포를 냉동 스톡으로부터 해동하고, 125 ㎖ 플라스크에서 RPMI1640 (Life Technologies) 89% v/v, 불활성화된 소 태아 혈청 (FBS)(Life Technologies)(10% v/v) 및 글루타민 (hyclone)(2 mM)을 포함하는 배양 배지 중에 37℃ 또는 약 37℃에서, 3-7% CO2 또는 약 3-7% CO2 하에 18-24일 또는 약 18-24일 동안 증폭 및 배양하였다. 세포는 2-3일마다 125 ㎖-2 ℓ 플라스크로 나누었다. 세포를 원심분리를 통해 회수하고, 감마선을 조사하였다. 회수 및 방사선 처리된 세포를 2 ㎖ 냉동 바이얼에서 냉동보존 매질 (Cryostor CS10)과 혼합한 다음 속도 제어형 동결기에서 5분당 약 15℃ 냉각 속도로 최종 온도 -90℃ 또는 약 -90℃까지 냉동하였으며, 이후 액체 질소 탱크 또는 냉동고로 옮겨 최종 온도 -150℃ 또는 약 -150℃까지 냉각하였다.
냉동한 후, 세포 생존율은 오리지널 세포수의 70% 이상이었으며 (여기서, 적어도 1.0 x 108 생존 세포/㎖), 세포 85% 이상이 mTNF-α를 발현하고, 세포 85% 이상이 mbIL-21+를 발현하고, 세포 85% 이상이 4-1BBL을 발현하였다.
실시예 3: NK 세포의 증폭 및 자극
일 예로서, 적합한 NK 세포는 4-1BBL, 막 결합형 IL-21 및 돌연변이 TNFα ("eHut-78P 세포")를 발현하도록 형질도입된 HuT-78 세포를 지지 세포로 이용해 제조할 수 있다. 지지 세포를 1% (v/v) CellGro 매질에 현탁하고, 감마선 방사선 장치에서 20,000 cGy로 조사하였다. 시드 세포 (예를 들어, CD3-고갈된 PBMC 또는 CD3-고갈된 제대혈 세포)를 지지 세포 상에서 인간 혈장, 글루타민, IL-2 및 OKT-3를 함유한 CellGro 배지 중에 정지 배양으로서 37℃에서 배양하였다. 2-4일 간격으로 세포를 나누었다. 총 배양 시간은 19일이다. NK 세포를 원심분리에 의해 회수해 냉동 보존하였다. 해동한 NK 세포를 다음으로 구성된 주입 매질 중에 환자에게 투여한다: 포스페이트 완충화된 염수 (PBS 1x, FujiFilm Irvine)(50% v/v), 알부민 (인간)(20% v/v OctaPharma 알부민 용액: 인간 알부민 ≥96%의 단백질 200 g/ℓ, 소듐 130-160 mmol; ≤2 mmol 포타슘, 0.064 - 0.096 mmol/g 단백질 N-아세틸-DL-트립토판, 0.064 - 0.096 mmol/g 단백질, 카프릴산, ad. 1000 ㎖ 물), 덱스트란 40/덱스트로스 (25% v/v Hospira 덱스트란 40 /덱스트로스 주사액, 다음을 함유한 USP: 10 g/100 ㎖ 덱스트란 40 및 5 g / 100 ㎖ 덱스트로스 하이드로스 (dextrose hydrous) 수용액) 및 다이메틸 설폭사이드 (DMSO)(5% v/v Avantor DMSL 용액, 밀도 1.101 g/cm3, 20℃).
어떤 경우에는 시드 세포는 CD3-고갈된 제대혈 세포이다. 세포 분획은, CliniMACS T 세포 고갈 세트 ((LS Depletion set (162-01) Miltenyi Biotec)를 이용한 면역자기 선별에 의해, CD3 세포를 고갈시킬 수 있다.
바람직하게는, 제대혈 시드 세포는 F158에서 V/V 다형성 (Fc gamma RIIIa-158 V/V 유전자형)(Musolino et al. 2008 J Clin Oncol 26:1789)을 가진 CD16을 발현하도록 선별한다. 바람직하게는, 제대혈 시드 세포는 KIR-B 일배체형이다.
실시예 4: NK 세포 공급원으로서 제대혈
NK 세포는 말초혈 림프구의 5-15%를 구성한다. 전통적으로, 말초혈은 치료학적 용도를 위한 NK 세포 공급원으로 이용되어 왔다. 그러나, 본원에 언급된 바와 같이, 제대혈 유래 NK 세포는 말초혈로부터 유래한 방법과 비교해 본원에 기술된 배양 시스템에서의 증폭 잠재성이 거의 10배 더 높으며, 세포의 조기 소진 또는 노화가 없다. 종양 세포의 인게이징에서 NK 세포의 활성화에 참여하는 수용체 등의 NK 세포 표면에서 대상 수용체의 발현은 말초혈 NK 세포에 비해 제대혈 NK 세포에서 공여체들간에 더 일정한 것으로 확인되었다. 본원에 기술된 제조 공정의 이용은 공여체 독립적인 방식으로 제대혈 내 NK 세포를 일정하게 활성화하여, 대규모로 활성형의 일정한 NK 세포 생산을 달성한다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 전임상 연구에서 제대혈-유래 NK 세포 (CB-NK)는 말초혈-유래 NK 세포 (PB-NK)보다 배양 증식력이 약 10배 더 높다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 종양-인게이징 NK 세포 활성화 면역 수용체의 발현은 말초혈의 인게이징 경우와 비교해 제대혈-유래 의약품에서 더 우수하고, 보다 일정하였다.
실시예 5: 증폭 및 자극된 NK -세포의 표현형
일 예로, 제대혈 유닛으로부터 유래한 NK 세포는 실시예 1에 기술된 증폭 및 자극 공정에 따라 eHut-78 세포를 이용해 증폭 및 자극하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 수득한 증폭 및 자극된 NK 세포 집단은 일관적으로 높은 CD16 (158V) 및 활성화 NK 세포 수용체 발현성을 나타내었다.
실시예 6: AB-101
AB-101은 환자, 예를 들어 단일클론 항체 또는 NK 세포 인게이저를 이용해 치료한 환자에서 ADCC 항-종양 반응을 강화하도록 고안된 생체외 증폭 및 활성화된 작동자 세포를 포함하는, 보편적이고, 규격품의, 냉동보존된, 동종이계 제대혈 유래 NK 세포 요법 제품이다. AB-101은 T 림프구의 고갈 처리에 의해 NK 세포에 대해 농화되고 IL-2 및 항-CD3 항체 (OKT3)가 보충된 조작된 복제 불완전성 T 세포 지지 세포를 이용해 공-배양된, 제대혈 유래 단핵 세포 (CBMC)로 구성된다.
AB-101은 FDA 허가된 제대혈로부터 유래한, 특히 치료학적 단일클론 항체 (mAb)와 조합 사용해 혈액 및 고형 종양을 치료하기 위해 고안된, 동종이계 NK-세포 제품이다. AB-101 제조 공정은 다음과 같은 속성을 가진 NK 세포 생산물을 제작한다:
· 일관성 있는 NK 세포 프로파일. 항체가 결합하는 CD16 및 종양 항원-결합성/활성화 수용체, 예를 들어 NKG2D, NKp46, Nkp30 및 NKp44와 같은 표면 수용체의 높은 발현성.
· KIR-B-일배체형. KIR-B 일배체형은 일배체동종 이식 상황 (haploidentical transplant setting)에서 임상 성과 개선 및 동종이계 상황에서 보다 높은 치료학적 잠재성과 연관성이 있다.
· CD16 F158V 다형성. mAb Fc-결합하는 고-친화성 CD16 F158V 변이체는 개선된 항체 의존적인 세포성 세포독성 (ADCC)을 촉진하는 것으로 보인다.
· 비-변형된 NK 세포. 유전자 강화 또는 유전자 편집은 AB-101 의약품에 필요하지 않거나, 또는 그 일부이다.
AB-101의 구성성분 및 조성물을 표 12에 열거한다. AB-101은 성숙한 NK 세포를 의미하는 자연 세포독성 수용체 NKp30 및 NKp46을 발현하는 NK 세포 (CD16+, CD56+)로 구성된다. AB-101은 T 세포, B 세포 및 대식세포 (≤0.2% CD3+, ≤1.0% CD19+, ≤1.0% CD14+)를 극소량 함유한다. AB-101 배양에 사용한 eHuT-78P 지지 세포의 잔류율은 이 의약품의 ≤0.2%이다.
AB-101의 구성성분 및 조성물
구성성분 용액 용액 조성물 농도 농도 양/Unit ( 충진물 11 ㎖ )
AB-101 의약품 물질 (생체외 증폭한 동종이계 자연살해세포) 생존 세포 약 1.1 x 109 50% v/v 0.5 ㎖/㎖ 5.5 ㎖
(PBS 5.27 - 6.23 ㎖ 중의, 0.9 x 109 - 1.3 x 109 생존 세포/바이얼)
PBS 100% 포스페이트 완충화된 염수 (PBS)
알부민 용액 200 g/ℓ 알부민 수용액 20% v/v 40 ㎎/㎖ 알부민 2.2 ㎖
(1.98 - 2.42 ㎖)
덱스트란 40 용액 100 g/ℓ 덱스트란 40; 50 g/ℓ 글루코스; 물 25% v/v 25 ㎎/㎖ 덱스트란 40; 12.5 ㎎/㎖ 글루코스 2.75 ㎖
(2.475-3.025 ㎖)
DMSO 100% DMSO (1,100 g/ℓ) 5% v/v 55 ㎎/㎖ 0.55 ㎖
(0.495 - 0.605 ㎖)
초기 안정성 실험은, AB-101이 기상 액체 질소 하에 최대 6개월간 안정적임을, 보여준다. 6개월 이후의 기간에 제품 안정성을 평가하기 위한 장기 안정성 실험은 진행 중이며, 최신 안정성 정보는 분석 인증서에 수록될 것이다.
AB-101 의약품의 제작은 다음과 같이 핵심적인 단계들로 구성된다 (도 5):
· FDA 허가된 제대혈 유닛 (Hemacord, BLA 125937) 해동.
· 제대혈 유닛 (CBU)에서 냉동-보존 매질의 제거
· FDA 허가된 Vario MACS 세포 선별 시스템 (Miltenyi)을 이용한 CD3 고갈
· 조작된 지지 세포 (eHuT-78 세포)를 이용한 백에서의 증폭 및 공-배양
· AB-101 마스터 세포 은행 (약 백 200개)에 대한 검사 및 냉동보존
· 해동 (백 1개), 증폭 및 조작된 HuT-78 세포를 이용한 공-배양
· 생물반응기에서 추가적인 증폭
· 회수 및 충진 (1x109 NK 세포/바이얼)
· AB-101 의약품의 냉동보존 (바이얼 약 150개)
· 농도, 순도, 효력 및 안전성을 확인하기 위한 광범위한 특성 규명.
표 13에 나타낸 바와 같이, 이러한 제작 공정은 고 순도 및 활성의 AB-101 의약품 NK 세포를 대량으로 재현 가능하게 생산한다. 데이터 포인트는 독립적인 제대혈 유닛 3개에서 수득한 결과를 나타낸다.
AB-101 제품 특성
검사 항목 허용 기준 조작 배치 임상 배치
1 2 3 1 2 3 4
세포수 (세포/바이얼) 0.9-1.3 x 109 1.3 x 109 1.1 x 109 1.0 x 109 1.3 x 109 1.2 x 109 1.2 x 109 1.0 x 109
세포 생존성 ≥70% 96% 95% 94% 93% 94% 94% 94%
내독소 (EU/㎖) ≤5 ≤1 ≤1 ≤1 ≤1 ≤1 ≤1 ≤1
동일성 CD3-, CD56+ % ≥85% 99.16% 99.79% 99.43% 99.53% 98.40% 97.87% 98.54%
CD56+, CD16+ % ≥70% 94.42% 94.20% 99.04% 93.24% 91.72% 95.22% 90.21%
순도 CD3+ % (CD3+) ≤0.20% ≤0.00% 0.00% 0.00% 0.06% 0.00% 0.00% 0.02%
CD14+ % (CD14+) ≤1.00% ≤0.02% 0.00% 0.00% 0.02% 0.03% 0.01% 0.10%
CD19+ % (CD19+) ≤1.00% ≤0.01% 0.01% 0.00% 0.00% 0.00% 0.05% 0.05%
효력 ≥50% 사멸, 4시간 69.00% 60.20% 64.10% 64.50% 67.10% 54.80% 67.40%
동일성 (CD3-, CD56+)
CD3-, CD56+ 세포의 빈도를 이용해 AB-101 의약품의 동일성을 분석한다. AB-101 의약품 샘플을 해동하여, 염색 완충제에 다시 현탁한다. CD3+ 및 CD56+ 표면 항원에 결합하는 형광단으로 표지된 항체에 재현탁한 샘플을 첨가한다. 유세포 측정을 이용해, CD3-, CD56+ 집단 %를 제품의 동일성 척도로서 확인한다.
동일성 (CD56+, CD16+)
CD56+, CD16+ 세포의 빈도를 이용해 AB-101 의약품의 동일성을 분석한다. AB-101 의약품 샘플을 해동하여, 염색 완충제에 다시 현탁한다. CD56+ 및 CD16+ 표면 항원에 결합하는 형광단으로 표지된 항체에 재현탁한 샘플을 첨가한다. 유세포 측정을 이용해, CD56+, CD16+ 집단 %를 제품의 동일성 척도로서 확인한다.
순도 (CD3+)
CD3+를 발현하는 세포의 측정 결과를 이용해 AB-101 의약품의 순도를 평가한다. 유세포 측정 방법을 이용해 의약품에서 CD3+를 발현하는 세포의 순도를 결정한다. CD3+ 세포 집단의 %를 제품의 순도 척도로 사용한다.
순도 (CD14+)
CD14+를 발현하는 세포의 측정 결과를 이용해 AB-101 의약품의 순도를 평가한다. 유세포 측정 방법을 이용해 의약품에서 CD14+를 발현하는 세포의 순도를 결정한다. CD14+ 세포 집단의 %를 제품의 순도 척도로 사용한다.
순도 (CD19+)
CD19+를 발현하는 세포의 측정 결과를 이용해 AB-101 의약품의 순도를 평가한다. 유세포 측정 방법을 이용해 의약품에서 CD19+를 발현하는 세포의 순도를 결정한다. CD19+ 세포 집단의 %를 제품의 순도 척도로 사용한다.
순도: eHuT-78P 잔류물 (eHuT-78P 세포 잔류물)
AB-101 의약품에서 eHuT-78P 세포 잔류물을 유세포 측정 (FACS)에 의해 측정한다. FACS를 이용해 살아있는 CD3+4-1BBLhigh+ eHuT-78P를 정량함으로써 AB-101 DP 내 eHuT-78 잔류물을 검출한다. eHuT-78은 피부 T 림프구로서 CD3을 발현하는 HuT-78 세포주로부터 유래한 것이므로, 순차적으로 싱글렛, 7-AAD 및 CD3+4-1BBL+를 게이팅하는 FACS 게이팅 전략 (도 1 참조)을 이용한다. HuT-78 세포주에 4-1BB 리간드 (4-1BBL), 막 종양 괴사 인자-α (mTNF-α) 및 막 결합형 IL-21 (mbIL-21)을 형질도입하였다. 유전자 3종을 강하게 발현하는 eHuT-78 단일 세포를 선별하고, 연구, 마스터 및 워킹 세포 은행을 순차적으로 확립하였다. 이들 유전자 3종 중, 4-1BBL이 AB-101 세포 은행 및 최종 의약품에서 가장 강하게 발현되는 것으로 확인된 바, FACS 게이팅 전략에 이를 이용하였다.
효력 (AB-101 DP 세포 : K562 세포 10:1에서 세포독성)
K562 종양 세포에 대한 세포성 세포독성 능력을 평가하여 AB-101 의약품의 효력을 결정한다. 의약품의 세포독성은 형광측정 분석으로 평가하게 될 것이다. K562 종양 세포를 30 μM 칼세인-AM (Molecular probe)으로 37℃에서 1시간 동안 염색한다. 의약품 샘플과 표지된 종양 세포를 96웰 플레이트에서 3세트로 37℃ 및 5% CO2 하에 4시간 동안 광 차단하에 공-배양한다. 자발적인 최대 방출을 제공하기 위해 표적에 10% FBS 또는 2% 트리톤-X100이 첨가된 RPMI1640 배지를 첨가한다. 백그라운드 형광을 결정하기 위해 각각의 웰에 10% FBS 또는 2% 트리톤-X100이 첨가된 RPMI1640 배지를 첨가한다. 형광 판독기를 사용해 여기 485 nm 및 방출 535 nm에서 형광을 측정한다. 특이적인 세포독성 %를 하기 식에 따라 계산한다.
Figure pct00001
효력 (AB-101 DP 세포 : Ramos 세포 10:1에서 세포독성)
전술한 동일한 방법 및 계산을 이용해 Ramos 종양 세포에 대한 세포성 세포독성 능력을 평가하여 AB-101 의약품의 효력을 결정한다. 이 검사에 대한 상세 사항은 확인 중이다.
실시예 7: AB-101 표현형 특성 규명
여러가지 AB-101 배치들에서 항체-인게이징 CD16 및 활성화, 저해성 및 케모카인 수용체들의 발현뿐 아니라 순도를 유세포 측정을 통해 결정하였다.
AB-101 순도는 세포 표면 마커를 이용해 측정하였다: AB-101 배치는 >99% CD3-CD56+ NK 세포와 <0.1% CD3+, CD14+ 및 CD19+ 세포를 포함한 것으로 관찰되었다. AB-101에서 CD16 발현을 측정하였다. AB-101 세포들 중 95.11 ± 2.51%가 CD16+였으며, CD16의 MFI 평균 및 중앙값은 각각 15311 ± 6186 및 13097 ± 5592이었다. NK 세포는 다양한 NK 특이적인 활성화 및 저해성 수용체들을 발현하는 것으로 알려져 있다. 검사한 다양한 AB-101 배치들에서, 세포의 >80%가 CD16, NKG2A, NKG2D, CD94, NKp30, 2B4, Tim-3, CD44를 발현하고, 세포의 40~70%는 NKp44, NKp46, DNAM-1을 발현하고, 세포의 약 30%는 CD161 및 CD96을 발현하고, 세포의 15%는 CXCR3를 발현하고, 세포의 5% 미만은 기타 활성화 저해 수용체들을 발현하였다.
제작 공정의 서로 다른 3가지 단계에서 세포의 표현형 특징을 평가하기 위해 본 실험에 AB-101의 GMP 배치 2개를 포함시켰다: CD3+ 세포 고갈 처리한 이후의 제대혈 세포; 중간 산물로서 마스터 세포 은행 (MCB), 및 AB-101 최종 의약품 (DP). CD3 고갈된 세포, MCB 및 DP 각각에서 순도 및 NK 세포 수용체를 측정하였다. 그 결과에 따르면, 먼저 CB로부터 유래한 NK 세포는 미성숙 NK 표현형을 보이는 것으로 확인되었다. NK 표현형은 제작 공정 중에 성숙되었다. MCB 단계에서는 세포의 90% 이상이 이미 성숙한 NK 세포에서 나타나는 표현형 특징을 발현하였으며, 기타 세포 타입 마커는 <0.1%였다. CD3 고갈된 세포로부터, MCB까지, 그리고 최종적으로 DP까지 제작 공정 내내 NK 세포-특이적인 수용체 대부분이 발현 수준이 증가하였다.
약어 목록: NK, 자연살해세포; mAb, 단일클론 항체; TNF-α, 종양 괴사 인자 α; CXCR, CXC 케모카인 수용체; DNAM-1, DNAX 액세서리 분자-1; CRACC, CD2-유사 수용체-활성화 세포독성 세포; ILT2, Ig-유사 전사체 2; Tim-3, T-세포 면역글로불린 뮤신-3; 7AAD, 7-아미노-액티노마이신 D; ULBP, UL16-결합 단백질; MICA / B, MHC 클래스 I 체인-관련 단백질 A 및 B; RAE1, 리보핵산 유출 1; H60, NKG2D는 클래스 I MHC 분자와 관련한 세포 표면 리간드 2종과 상호 작용한다; MULT1, 마우스 UL16-결합 단백질-유사 전사체 1; MHC, 주 조직적합성 복합체; HLA, 인간 백혈구 항원.
표현형 및 순도 염색 프로토콜: 1. NK 세포 농도를 차가운 FACS 완충제에서 2.0x106 세포/㎖로 조정한다. 2. 하기 표를 참조하여 항체 혼합물을 제조한다. 3. 5 ㎖ 둥근 바닥형 시험관에 항체 혼합물을 투입하여, 세포 희석물 100 ㎕와 혼합한다. 4. 세포를 광 차단 하에 4℃ 조건에서 30분간 염색한다. 5. 염색한 후, FACS 2 ㎖을 첨가한 다음 2000 rpm 및 4℃ 조건 하에 3분간 원심분리한다. 6. 상층액은 버리고, 세포 펠릿을 볼텍싱한다. 그 후, FACS 완충제 200 ㎕를 첨가한다. 7. 유세포 측정기 (LSR Fortessa)에서 세포를 분석한다. 8. Flow-Jo 소프트웨어를 사용해 각 마커의 발현 수준을 분석한다. 9. 다음과 같은 게이팅 옵션으로 표현형을 게이팅한다. a. FSC-A/ FSC-H 패널에서 싱글렛 게이팅. b. 7-AAD/ SSC-A 패널에서 살아있는 세포 게이팅 c. FSC-A/ SSC-A 패널에서 림프구 게이팅. d. CD3/CD56에서 NK 세포(CD3-CD56+) 게이팅. e. 이소형 대조군에 따라 사분면 (quadrant)을 작성한 다음 CD3/CD56, CD16/CD56, 및 CD14/CD19를 분석한다. f. NK 세포 게이팅에서의 FMO (Fluorescence Minus One)을 토대로, 각 마크의 PE 형광 발현 (표 1에서 1번 및 3-30번, 발현 %) 수치를 구한다. CD16의 경우, 비율 평균 및 중앙값 수치를 구한다.
NK 세포 표현형을 염색하기 위한 항체 조합물의 목록을 표 14에 나타낸다.
NK 세포 표현형을 염색하기 위한 항체 조합물의 목록
번호 FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트) PE (피코에리트린) PE - Cy7 (피코에리트린-시아닌7) PerCP - Cy5 .5 ( 페리디닌 -클로로필-단백질 복합체: CY5.5
1 CD3 CD16 CD56 7-AAD
2 CD14 CD19 CD3
3 CD3 NKG2A CD56
4 NKG2C
5 NKG2D
6 NKp30
7 NKp44
8 NKp46
9 NKp80
10 CXCR3
11 CXCR4
12 CXCR5
13 CXCR6
14 CD195
15 CD244
16 DNAM-1
17 CD44
18 CD57
19 CD62L
20 CD69
21 CD94
22 CD96
23 CD161
24 CRACC
25 ILT-2
26 OX40L
27 Tim-3
28 (FMO) mIgG1
29
(이소형)		 mIgG1 mIgG1 mIgG1
AB-101의 순도 (n=9)
AB-101의 순도는 NK 세포에 대해서는 CD3-CD56+ 세포로, T 세포에 대해서는 CD3+ 세포로, 단핵구에 대해서는 CD14+ 세포로, B 세포에 대해서는 CD19+ 세포로 표시한다. AB-101 배치 총 9개에서 순도를 측정하였다. 그 결과, CD3-CD56+ 세포는 99.27 ± 0.59% (평균 ± SD), CD3+ 세포는 0.02 ± 0.03%, CD14+ 세포는 0.10 ± 0.12%, 그리고 CD19+ 세포는 0.02 ± 0.04%이었다 (도 6). 따라서, AB-101은 고순도의 NK 세포로 구성되고, 불순물로서 다른 타입의 세포는 거의 존재하지 않는 것으로, 검증되었다.
GMP 조건에서 제작한 CD3 고갈된 세포, MCB 및 DP의 순도 비교.
AB-101의 GMP 배치 2개를 이용해 AB-101 출발 재료 (CD3 고갈된 세포), 중간산물 (마스터 세포 은행, MCB) 및 최종 의약품 (DP)의 순도를 분석하였다. CD3 고갈된 세포 분획에서 세포의 50~60%는 NK 세포였으며, 이의 백분율은 MCB 및 DP에서 90% 이상으로 증가하였다. CD3 고갈된 세포 분획의 20~30%는 CD14+ 세포 및 CD19+ 세포였으며, 이러한 세포 백분율은 MCB 및 DP에서 0.1% 미만으로 감소하였으며, 이는 AB-101 MCB 및 AB-101 최종 의약품의 순도를 나타낸다 (도 7, 표 15).
세포 순도
마커 GMP 배치 #1 GMP 배치 #2
CD3- 세포 (414855P) MCB (20AB101MG001) DP (20AB101PG001) CD3- 세포 (608631P) MCB (20AB101MG002) DP (20AB101PG002)
CD3-CD56+ (%) 58.0 99.43 99.80 56.70 93.14 97.98
CD3+ (%) 0.79 0.05 0.01 0.21 0.03 0.02
CD14+ (%) 15.01 0.02 0.01 28.00 0.03 0.02
CD19+ (%) 9.83 0.01 0.00 9.17 0.00 0.00
GMP 조건에서 제작한 CD3 고갈된 세포, MCB 및 DP에서 NK 세포 수용체 비교
AB-101의 GMP 배치를 또한 이용해, AB-101 출발 재료 (CD3 고갈된 세포), 중간산물 (마스터 세포 은행, MCB) 및 최종 의약품 (DP)에서 다양한 NK 세포 수용체의 발현을 분석하였다. AB-101 출발 재료 (CD3 고갈된 세포)와 비교하였을 경우, 몇가지 NK 세포 및 CD16, NKG2D, NKG2C, NKp30, NKp44, NKp46 및 DNAM-1과 같은 활성화 수용체들이 MCB 및 최종 의약품에서 더 높은 수준으로 발현된 것으로 관찰되었다. CD57 발현은 AB-101 출발 재료 (CD3 고갈된 세포)와 비교해 MCB 및 최종 의약품에서 더 낮았다 (도 8). 전반적으로, 데이터는 MCB 및 최종 의약품에서 NK 세포 활성화 수용체의 발현 증가를 나타내었으며, 이는 AB-101이 종양에 대해 효과적임을 의미한다.
세포 수용체 발현
마커 GMP 배치 #1 GMP 배치 #2
CD3- 세포 (414855P) MCB (20AB101MG001) DP (20AB101PG001) CD3- 세포 (608631P) MCB (20AB101MG002) DP (20AB101PG002)
Cd16 90.27 96.45 98.50 89.27 97.70 98.30
NKG2A 69.99 87.05 93.70 72.94 81.92 88.43
NKG2C 0.26 23.87 1.11 6.32 22.91 25.04
NKG2D 85.52 91.13 95.17 20.70 83.16 98.77
NKp30 76.29 91.55 94.64 12.61 85.19 85.22
NKp44 1.29 58.27 51.14 2.48 19.15 72.03
NKp46 35.12 71.83 67.77 7.64 70.54 54.46
CXCR3 9.10 28.39 14.40 1.79 33.13 7.01
2B4 93.66 99.75 99.20 82.63 98.29 99.46
DNAM-1 13.94 55.64 73.07 5.12 36.24 61.13
CD57 12.24 1.92 0.65 2.63 1.63 0.74
결론
표면 마커 분석의 사용으로, AB-101 제품의 동일성 및 순도와 배치간 일관성이 입증되었다. 나아가, NK-특이적인 활성화 및 저해 세포 표면 마커들에 대한 광범위한 평가를 통해 제작 증폭 공정 후 AB-101 제품의 일관된 프로파일이 확립되었다. CB 유래 NK 세포는 말초혈 (PB) 유래 NK 세포와 비교해, NKG2A 고 발현 및 NKG2C, CD62L, CD57, IL-2R, CD16, DNAM-1의 저 발현과 같은 미성숙 표현형을 가진 것으로, 또한, 미성숙 표현형을 가진 CB 유래 NK 세포는 종양 세포에 대해 세포독성이 낮은 것으로 알려져 있다. 본 실험의 데이터는, 동종이계 제대혈 (CB)로부터 유래한 NK 세포 제품, 즉 AB-101이 종양 세포에 대해 잠재적으로 더 우수한 세포독성을 의미하는 주요 활성화 수용체를 높은 수준으로 발현함을, 입증해준다.
실시예 8: AB-101 약동학 및 생체분포
NSG (NOD scid gamma) 마우스 모델을 이용해 AB-101의 생체분포 및 약동학 (PK)을 확인하였다. 비히클 (PBS, 덱스트란, 알부민 (인간) DMSO)과 AB-101 세포 (0.5x107 세포/마우스, 2x107 세포/마우스)를 정맥내 (0.25 ㎖/마우스)로 총 8회 투여하였다. 마지막 용량을 주입한 후 4시간, 1일, 3일, 7일, 14일 및 78일 (시점별, 마우스 수컷 n=3, 암컷 n= 3)에 비히클 군과 AB-101 군의 동물을 희생시켰다.
AB-101은 투여한 후 4시간부터 시작해 AB-101을 마지막으로 투여한 후 3일 (53일)까지, 주로 고도로 관류되는 조직 (폐, 비장, 심장 및 간)과 주사 부위에서 주로 검출되었다. 마지막 투여한 후 7일차 (57일)에, 폐 (샘플 6개 중 3개), 비장 (샘플 6개 중 5개) 및 주사 부위 (샘플 6개 중 5)에서 AB-101이 검출되었다. 마지막 투여한 후 14일 및 28일차 (각각 64일 및 78일)에, AB-101은 각각 주사 부위 샘플 2개 및 1개에서 검출되었다. 64일 및 78일에 주사 부위 샘플들에서 관찰된 산발적인 결과와 낮은 농도는 AB-101 검사물의 전신 지속성을 의미하지 않을 것이다.
생체분포 실험으로부터 입수한 결과는, 생체내 AB-101 분포가 정맥내 투여 경로와 일치하고, 세포가 7일 후 조직 클리어런스 (tissue clearance)를 보이고 영구 생착 증거가 없는, 장기 지속 가능성이 없음을, 보여준다.
실시예 9: AB-101 독성학
NSG 마우스의 GLP 실험에서 AB-101의 비-임상적인 독성을 평가하였다. 본 실험은 AB-101의 급성 및 지연성 독성 프로파일을 평가하도록 설계하였다. AB-101을 2가지 용량 수준, 즉 0.5x107 및 2x107 세포/동물로 본 실험에서 검사하였다. 제안된 검사 용량 범위는 최초 인간 실험 (4x109 세포/용량)에서 제공하기로 계획한 최고 등가 인간 용량보다 더 많이 노출되는 수준으로 제품을 제공하도록 설계하였다. 상대성장 스케일링 (Nair 2016)에 기초해, 0.5x107 세포/마우스는 14x109 세포/인간에 상응하고, 2x107 세포/마우스는 56x109 세포/인간에 상응하는데, 이는 체중 70 kg 환자에 대해 추정한 것이다. AB-101은 8주간 매주 1회로 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였다. 8차 (즉, 마지막 투여) 투여한 후 3일차에 AB-101의 급성 독성을 평가하였다. 8차 투여 후 28일 회복 기간 종료 시점에 지연성 독성을 평가하였다. 각 동물에서 생존성, 체중, 임상 관찰 결과 및 촉진 (palpation)을 본 실험의 생애 기간 동안 기록하였다. 모든 동물들에서 안락사 시점에 육안 검시하고, 혈액 분석을 위한 샘플 수집, 임상 화학 및 조직병리학적 분석을 수행하였다.
각 군은, 양쪽 성별에서 발견한 결과를 평가하고 통계적 검증력 분석 (powered statistical analysis)을 위해, 각 성별 당 10명씩 동물 총 20명으로 구성하였다. AB-101 처리 군과 비교하기 위해 비히클 처리 대조군도 포함하였다. 처치 편향을 최소화하기 위해, 동물은 컴퓨터-생성된 (체중순) 무작위 절차에 따라 용량 군으로 할당하였으며, 암컷 및 수컷을 별도로 무작위 배정하였다. 본 실험은 데이터 기록 등을 비롯하여 GLP 지침을 준수하였다.
평가한 용량 수준들 중 어떤 용량에서도 AB-101 투여와 관련한 사망 및 유해한 임상적인 관찰 결과는 기록되지 않았다. 나타난 모든 경미한 관찰 결과는 마우스들에서 흔한 결과였으며, AB-101 투여와는 관련 있는 것으로 간주되지 않았다. 체중 및 장기 무게 변화는 용량 군들 간에 비슷하였으며, 처치 후 평가한 일자들에서도 비슷하였다 (급성 독성 군의 경우 53일, 지연 독성 군의 경우 78일). 급성 또는 지연성 독성 군들에서 안락사 시점에 동물에서 확인된 혈액학 및 임상 화학 매개변수 또는 육안 검시 소견들에서 AB-101-관련 변화는 없었다. 통계적 유의성과 무관하게, 개체들 간 및 평균 임상 화학 수치들 간에 모든 변동은 산발적이고, 생물학적 및 절차-관련 편차와 일관성이 있으며, 및/또는 그 크기가 미미한 것으로 간주되었으며, 따라서 AB-101 투여와는 관련없는 것으로 간주되었다. AB-101-관련 현미경적 소견은 없었다. 결론적으로, GLP 독성 실험의 결과는, 최대 2 x 107 세포/투여/동물로 반복 투여한 NSG 마우스에서 AB-101이 충분히 내약성임을 시사한다.
실시예 10: NK 세포의 냉동보존
도 5에 도시된 공정에 따라 AB-101 세포를 준비하였다. 배양 기간 종료 시점에, Sartorius kSep® 400 1회용 자동 원심분리 시스템을 이용해 상대 원심력 (RCF): 800 - 1200 g 하에 유속 60 내지 120 ㎖/min으로 세포를 회수하였으며, 포스페이트 완충액 (PBS)으로 2회 헹구었다. 헹군 후, (1) 알부민 (인간); (2) 덱스트란 40; (3) DMSO; 및 (4) PBS를 사용해, 표적 농도 1 x 108 세포/㎖로, AB-101 세포를 제형화하였다 (냉동보존 조성물 예 #1, 표 4). 현탁물 제형을 10 ㎖ AT-Closed vial®에 목표 부피 11 ㎖로 충진한 다음, 표시하고, 속도 제어형 냉동고에서 넣어 ≤-135℃에서 냉동보존하였다.
초기 방출 검사 데이터로서 시간=0에 안정성 실험을 수행하였다. 안정성 저장 냉동고는 온도를 ≤-135℃로 유지하도록 설정된 검증된 기상 LN2 저장 냉동고이다. 무균성 시점에, 배치 크기의 10% 또는 바이얼 4개 중 더 큰 경우를 검사하였다. 검사물은 임상적인 해동 조건을 모방하기 위해 37℃에서 해동하였다.
표 17에 나타낸 바와 같이, 냉동보존한 AB-101의 생존성 및 활성이 적어도 9개월간 보존되는 것으로 확인되었다.
냉동보존한 AB-101의 장기 생존성 및 활성
검사 항목 허용 기준 냉동보존 (≤135℃), 샘플 시간 ( 개월수 )
0개월 3개월 6개월 9개월 12개월 18개월
세포수 (세포/ 바이얼 ) 0.9-1.3 x 109 1.3x109 1.3 x 109 1.4 x 109 1.4 x 109 1.3 x 109 세포/바이얼 1.4 x 109 세포/바이얼
세포 생존성 ≥70% 96% 93% 94% 93% 90% 87%
내독소 (EU/kg/hr) ≤5 ≤1 ≤1 ≤1 ≤1 < 1.0 < 1.0
동일성 CD3-, CD56+ % ≥85% 99.16% 99.39% 99.49% 99.41% 99.54% 99.36%
CD56+, CD16+ % ≥70% 94.42% 94.60% 94.44% 93.71% 94.85% 90.27%
순도 CD3+ % ≤0.20% 0.00% 0.00% 0.00% 0.04% 0.06% 0.00%
CD14+ % ≤1.00% 0.02% 0.00% 0.00% 0.02% 0.01% 0.00%
CD19+ % ≤1.00% 0.01% 0.00% 0.01% 0.02% 0.00% 0.00%
효력 (4시간 시점에 사멸) ≥50% 69.00% 66.90% 67.40% 61.80% 67.1 68.3
투여하기 직전까지 취급시 AB-101의 안정성 특징을 파악하기 위해, "병상 (bedside)" 단기 안정성 실험을 수행하였다. 샘플을 해동한 다음 10 ㎖ 시린지로 옮겨 여과하고, 내용물은 팔콘 시험관에서 보관하고, 표시된 지정된 시간 동안 소정의 온도에서 두었다. 채취한 산물을 분석하였다. AB-101 로트 2종에 대한 단기 안정성 데이터를 표 18에 나타낸다.
AB-101에 대한 단기 안정성 데이터
바이얼 4개의 평균 데이터 Lot 개봉 0분 5분 15분 30분 60분 90분 120분 플러시
PG001 세포수 (0.8 - 1.2x108 세포/㎖) 1.18 1.10 1.11 1.11 1.10 1.12 1.07 1.03 0.07
생존성 (%) 93 94 94 94.75 94 93.5 93.5 93.5 93.25
CD3-56+ (%) 99.53 99.53 NT NT NT 99.53 NT 97.58 NT
CD16+CD56 (%) 93.24 97.74 NT NT NT 97.74 NT 97.43 NT
PG002 세포수 (0.8 - 1.2x108 세포/㎖) 1.09 1.13 1.08 1.14 1.14 1.08 1.11 1.05 0.08
생존성 (%) 94 93.75 94.25 94.75 95.25 94.25 94.5 94 92.75
CD3-56+ (%) 98.40 99.30 NT NT NT 99.27 NT 99.53 NT
CD16+CD56 (%) 91.72 98.88 NT NT NT 99.55 NT 98.40 NT
실시예 11: AB-101은 트라스투주맙을 이용해 ADCC를 나타낸다
NK 세포의 세포독성은 NK 세포 (작동자) : 종양 세포 (표적) 비율 범위에서 정량적으로 측정할 수 있다. 한가지 실험으로, HER2+ 위 암종 종양 세포주 NCI-N87을 6일 동안 장기 배양으로 배양하였다. 종양 세포 밀집도에 대한 위상 차 분석을 활용해 장기 세포독성 분석을 수행하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 트라스투주맙은 종양 세포 증식을 저해하는 것으로 확인되었으며, AB-101은 종양 세포주를 살상하는 것으로 나타났으며, 트라스투주맙과 AB-101의 조합 (E:T 비율 1:1)이 종양 살상 세포독성 활성을 실질적으로 증가시켰다.
실시예 12: AB-101 + 트라스투주맙 시험관내 실험
도 14에 도시한 바와 같이, 인간 HER+ 위 암종 세포주, NCI-N87의 증식을 장기 배양 중에 세포 밀집도를 측정함으로써 모니터링하였다. 트라스투주맙은 배양물의 증식을 저해하는 것으로 확인되었으며, 트라스투주맙을 NK 제품 AB-101과 조합 (E:T 비율 0.3:1)하였을 경우, ADCC 세포 살상을 통해 세포 밀집도를 추가로 저하하였다.
실시예 13: AB-101 + 트라스투주맙 생체내 실험
AB-101 + 트라스투주맙의 생체내 효능을 HER2+ 종양을 가진 NOG 마우스 이종이식 모델에서 평가하였다. HER2+ 이종이식 모델은 복막내 SKOV-3, HCC1954 및 NCI-N87을 포함한다.
AB-101은 트라스투주맙과 조합해, 트라스투주맙 내성인 것으로 규명된 HCC1954 세포주를 이용한 마우스 유방암 이종이식 모델 (도 15)에서, 그리고 SKOV3 난소암 모델 (도 16)에서 종양 세포를 살상하였다. HCC1954-luc 종양 세포는 세포 배양으로 배양하여 회수한 후 PBS (포스페이트 완충화된 염수)를 사용해 5 x 106 세포/㎖로 농축하였다. 마우스에 세포를 1 x 106 세포/㎖로 복막내 (IP) 주사하였다. HCC1954-luc 접종 후 3일차에, 마우스를 4가지 군 (표 19) 중 하나로, 0일차 생발광성에 따라 할당하였다 (평균 생발광 신호는 2.49E+08 광자수/s임). AB101, AB201, TRZ 및 IL-2를 복막내 투여하였다.
군 투여 경로 부피 (㎕) 동물 수
1 냉동 매질 + IgG 5 mg/kg i.p + i.p 200 + 200 8
2 TRZ 5 mg/kg i.p 200 8
3 AB101 2 x 107 세포 + IL-2 i.p + i.p 200 + 100 8
4 AB101 + TRZ + IL-2 i.p + i.p + i.p 200 + 200 + 100 8
AB-101 + 트라스투주맙은 평균 생존 시간을 38.5일까지 증가시켰다 (도 15).
별도의 실험으로, 0일에 SKOV3-Luc 종양 세포 1x106개를 NSG 마우스에 투여하고 (IP), 11일에 AB-201을 1회 (IP) 주사하였다. SKOV3-Luc의 생발광 (BLI) 측정. AB-101 + 트라스투주맙은 중앙 생존 시간을 증가시켰다 (도 16).
실시예 14: AB-101의 표면 단백질 발현
실시예 6에 기술된 바와 같이 NK 세포를 증폭시켰다. 출발 물질로서 NK 세포 공급원 (CD56+/CD3- 발현에 대해 게이팅한 제대혈, n=3)의 표면 단백질 발현을, 증폭하여 수득한 NK 세포 (n=16)와 비교하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, CD16 발현은 수득한 세포에서 높았으며, 출발 세포에 비해 증가하였다. NKG2D, CD94, NKp30, NKp44 및 NKp46 발현 역시 증가한 반면, CXCR4 및 CD122의 발현은 감소하였다.
서열번호 및 설명 서열
서열번호 1
지지 세포에 의해 발현될 수 있는 4-1BBL 서열		 MEYASDASLDPEAPWPPAPRARACRVLPWALVAGLLLLLLLAAACAVFLACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE
서열번호 2
지지 세포에 의해 발현될 수 있는 막 결합형 IL-21 (mbIL-21) 서열		 MALPVTALLLPLALLLHAARPQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDSAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY
서열번호 3
지지 세포에 의해 발현될 수 있는 TNF α 돌연변이 (mTNF-α) 서열		 MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQPVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL
서열번호 4
지지 세포에 의해 발현될 수 있는 OX40L 서열		 MERVQPLEENVGNAARPRFERNKLLLVASVIQGLGLLLCFTYICLHFSALQVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL
서열번호 5
CD28 세포내 신호전달 도메인		 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
서열번호 6
CD28 세포내 신호전달 도메인		 AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
서열번호 7
코돈 최적화된 CD28 세포내 신호전달 도메인		 CGGAGCAAGAGGTCCCGCCTGCTGCACAGCGACTATATGAACATGACCCCACGGAGACCCGGCCCTACACGGAAACATTACCAGCCCTATGCTCCACCCCGGGACTTCGCAGCTTACAGAAGT
서열번호 8
OX40L 세포내 신호전달 도메인		 ERVQPLEENVGNAARPRFERNK
서열번호 9
OX40L 세포내 신호전달 도메인		 GAAAGGGTCCAACCCCTGGAAGAGAATGTGGGAAATGCAGCCAGGCCAAGATTCGAGAGGAACAAG
서열번호 10
코돈 최적화된 OX40L 세포내 신호전달 도메인		 GAAAGAGTGCAGCCCCTGGAAGAGAATGTCGGGAATGCCGCTCGCCCAAGATTTGAAAGGAACAAA
서열번호 11
CD3ζ 신호전달 도메인		 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
서열번호 12
CD3ζ 신호전달 도메인		 AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
서열번호 13
코돈 최적화된 CD3ζ 신호전달 도메인		 CGAGTGAAGTTCAGCAGGTCCGCCGACGCTCCTGCATACCAGCAGGGACAGAACCAGCTGTATAACGAGCTGAATCTGGGCCGGAGAGAGGAATACGACGTGCTGGACAAAAGGCGGGGCCGGGACCCCGAAATGGGAGGGAAGCCACGACGGAAAAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAGCTGCAAAAGGACAAAATGGCCGAGGCTTATTCTGAAATCGGGATGAAGGGAGAGAGAAGGCGCGGAAAAGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGGCTGAGCACCGCTACAAAGGACACCTATGATGCACTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGG
서열번호 14
T2A 절단부		 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
서열번호 15
T2A 절단부		 GGCTCAGGTGAGGGGCGCGGGAGCCTGCTGACTTGTGGGGATGTAGAGGAAAATCCTGGTCCT
서열번호 16
IL-15		 MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS-
서열번호 17
IL-15		 ATGAGAATCAGCAAACCACACCTCCGGAGCATATCAATCCAGTGTTACTTGTGCCTTCTTTTGAACTCCCATTTCCTCACCGAGGCAGGCATTCATGTGTTCATATTGGGGTGCTTTAGTGCTGGGCTTCCGAAAACGGAAGCTAACTGGGTAAACGTCATCAGTGACCTTAAAAAAATTGAGGATCTTATCCAATCAATGCACATCGACGCGACTCTCTACACAGAATCTGACGTACACCCGTCATGCAAAGTCACGGCAATGAAGTGTTTTCTTCTCGAGCTCCAAGTAATTTCCCTGGAGTCTGGCGATGCCTCCATCCACGATACGGTTGAAAATCTGATTATATTGGCCAACAATAGCCTCAGTTCTAACGGTAACGTGACTGAAAGTGGCTGCAAAGAGTGCGAAGAGCTCGAAGAAAAGAATATCAAGGAGTTCCTCCAATCATTTGTTCACATTGTGCAAATGTTTATCAACACCTCTTGA
서열번호 18
IL-15 		ATGCGCATAAGTAAGCCTCATCTGCGGTCCATTTCTATACAATGTTATCTGTGCTTGCTTTTGAACTCCCACTTTCTTACGGAAGCAGGCATTCATGTGTTCATTCTGGGTTGTTTTTCtGCCGGGCTGCCCAAAACCGAGGCCAACTGGGTCAACGTGATCAGCGACCTCAAGAAGATCGAGGATTTGATTCAAAGTATGCATATAGACGCCACACTCTATACTGAGTCCGACGTTCACCCGAGTTGTAAAGTTACGGCTATGAAGTGCTTTTTGTTGGAACTCCAGGTGATTTCCCTTGAATCCGGCGATGCGAGCATCCACGATACGGTAGAGAATCTTATTATTCTGGCGAATAATTCTCTGTCTTCAAATGGGAATGTAACTGAGAGCGGTTGTAAAGAATGCGAAGAACTTGAAGAAAAGAATATCAAGGAATTTCTTCAGAGTTTCGTGCATATTGTTCAAATGTTCATCAACACATCCTGA
서열번호 19
CD28/OX40L/CDζ		 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSERVQPLEENVGNAARPRFERNKRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
서열번호 20
CD28/OX40L/CDζ/T2A/IL1-5		 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSERVQPLEENVGNAARPRFERNKRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS-
서열번호 21
인간 알부민 		MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL
서열번호 22
푸로마이신 내성 유전자 		ATGGCCACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGA
기타 구현예
본 발명이 상세한 설명과 함께 기술되었지만, 전술한 설명은 예시하기 위한 것일 뿐 첨부된 청구 범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 다른 측면, 이점 및 수정도 첨부한 청구 범위에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> Artiva Biotherapeutics, Inc. GC Cell Corporation <120> TREATMENT OF CANCER WITH NK CELLS AND A HER2 TARGETED ANTIBODY <130> 49755-0032WO1 <140> PCT/US2022/023684 <141> 2022-04-06 <150> US 63/290,359 <151> 2021-12-16 <150> US 63/172,414 <151> 2021-04-08 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 35 40 45 Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 85 90 95 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 2 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu 20 25 30 Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro 35 40 45 Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser 50 55 60 Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly 65 70 75 80 Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys 85 90 95 Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys 100 105 110 Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu 115 120 125 Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser 130 135 140 Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala 145 150 155 160 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 165 170 175 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 180 185 190 Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 195 200 205 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr 210 215 220 <210> 3 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro 50 55 60 Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Pro Val Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 115 120 125 Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly 130 135 140 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 145 150 155 160 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 165 170 175 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 210 215 220 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 225 230 <210> 4 <211> 183 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg 1 5 10 15 Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln 20 25 30 Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser 35 40 45 Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val 50 55 60 Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln 65 70 75 80 Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn 85 90 95 Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu 100 105 110 Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln 115 120 125 Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr 130 135 140 Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu 145 150 155 160 Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn 165 170 175 Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu 180 <210> 5 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 6 <211> 123 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120 tcc 123 <210> 7 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized CD28 intracellular signaling domain <400> 7 cggagcaaga ggtcccgcct gctgcacagc gactatatga acatgacccc acggagaccc 60 ggccctacac ggaaacatta ccagccctat gctccacccc gggacttcgc agcttacaga 120 agt 123 <210> 8 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg Pro 1 5 10 15 Arg Phe Glu Arg Asn Lys 20 <210> 9 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gaaagggtcc aacccctgga agagaatgtg ggaaatgcag ccaggccaag attcgagagg 60 aacaag 66 <210> 10 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized OX40L intracellular signaling domain <400> 10 gaaagagtgc agcccctgga agagaatgtc gggaatgccg ctcgcccaag atttgaaagg 60 aacaaa 66 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 12 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336 <210> 13 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon optimized CD3zeta signaling domain <400> 13 cgagtgaagt tcagcaggtc cgccgacgct cctgcatacc agcagggaca gaaccagctg 60 tataacgagc tgaatctggg ccggagagag gaatacgacg tgctggacaa aaggcggggc 120 cgggaccccg aaatgggagg gaagccacga cggaaaaacc cccaggaggg cctgtacaat 180 gagctgcaaa aggacaaaat ggccgaggct tattctgaaa tcgggatgaa gggagagaga 240 aggcgcggaa aaggccacga tggcctgtac caggggctga gcaccgctac aaaggacacc 300 tatgatgcac tgcacatgca ggccctgccc cctcgg 336 <210> 14 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A cleavage site <400> 14 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 15 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A cleavage site <400> 15 ggctcaggtg aggggcgcgg gagcctgctg acttgtgggg atgtagagga aaatcctggt 60 cct 63 <210> 16 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 17 <211> 489 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 atgagaatca gcaaaccaca cctccggagc atatcaatcc agtgttactt gtgccttctt 60 ttgaactccc atttcctcac cgaggcaggc attcatgtgt tcatattggg gtgctttagt 120 gctgggcttc cgaaaacgga agctaactgg gtaaacgtca tcagtgacct taaaaaaatt 180 gaggatctta tccaatcaat gcacatcgac gcgactctct acacagaatc tgacgtacac 240 ccgtcatgca aagtcacggc aatgaagtgt tttcttctcg agctccaagt aatttccctg 300 gagtctggcg atgcctccat ccacgatacg gttgaaaatc tgattatatt ggccaacaat 360 agcctcagtt ctaacggtaa cgtgactgaa agtggctgca aagagtgcga agagctcgaa 420 gaaaagaata tcaaggagtt cctccaatca tttgttcaca ttgtgcaaat gtttatcaac 480 acctcttga 489 <210> 18 <211> 489 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 atgcgcataa gtaagcctca tctgcggtcc atttctatac aatgttatct gtgcttgctt 60 ttgaactccc actttcttac ggaagcaggc attcatgtgt tcattctggg ttgtttttct 120 gccgggctgc ccaaaaccga ggccaactgg gtcaacgtga tcagcgacct caagaagatc 180 gaggatttga ttcaaagtat gcatatagac gccacactct atactgagtc cgacgttcac 240 ccgagttgta aagttacggc tatgaagtgc tttttgttgg aactccaggt gatttccctt 300 gaatccggcg atgcgagcat ccacgatacg gtagagaatc ttattattct ggcgaataat 360 tctctgtctt caaatgggaa tgtaactgag agcggttgta aagaatgcga agaacttgaa 420 gaaaagaata tcaaggaatt tcttcagagt ttcgtgcata ttgttcaaat gttcatcaac 480 acatcctga 489 <210> 19 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28/OX40L/CD3zeta <400> 19 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu 35 40 45 Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Arg 50 55 60 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln 65 70 75 80 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 85 90 95 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro 100 105 110 Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp 115 120 125 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg 130 135 140 Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr 145 150 155 160 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 165 170 175 <210> 20 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28/OX40L/CD3zeta/T2A/IL1-5 <400> 20 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu 35 40 45 Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Arg 50 55 60 Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln 65 70 75 80 Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp 85 90 95 Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro 100 105 110 Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp 115 120 125 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg 130 135 140 Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr 145 150 155 160 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly 165 170 175 Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu 180 185 190 Asn Pro Gly Pro Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser 195 200 205 Ile Gln Cys Tyr Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu 210 215 220 Ala Gly Ile His Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro 225 230 235 240 Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile 245 250 255 Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu 260 265 270 Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu 275 280 285 Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His 290 295 300 Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser 305 310 315 320 Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu 325 330 335 Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln 340 345 350 Met Phe Ile Asn Thr Ser 355 <210> 21 <211> 609 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45 Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110 Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125 His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 145 150 155 160 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190 Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240 Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255 Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270 Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 275 280 285 Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315 320 Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 325 330 335 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 385 390 395 400 Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 405 410 415 Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430 Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445 Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460 Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 465 470 475 480 Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 495 Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510 Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525 Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540 Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560 Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575 Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590 Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605 Leu <210> 22 <211> 603 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Puromycin Resistance Gene <400> 22 atggccaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt cccccgggcc 60 gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac cgtcgatccg 120 gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc 180 gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg 240 gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc 300 ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag 360 gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg 420 ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc 480 ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc 540 gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc 600 tga 603

Claims (61)

  1. 자연살해세포 (NK 세포)의 집단 및 인간 HER2를 표적으로 하는 항체를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 NK 세포가 환자에 대해 동종이계이고, KIR-B 일배체형이며, CD16 158V 다형성에 대해 동형접합성인, HER2+ 암 환자를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암이 유방암, 위암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 암이 유방암인, 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 암이 위암인, 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 암이 난소암인, 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기 환자는 항-HER2 항체를 이용한 치료 후 재발한, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 자가 줄기 세포 이식 또는 키메라 항원 수용체 T-세포 요법 (CAR-T)을 이용한 치료 후 질환 진행으로 이행된, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 NK 세포 1 x 108 내지 1 x 1010개를 투여받는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 NK 세포 1 x 109 내지 8 x 109개를 투여받는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 NK 세포 4 x 108, 1 x 109, 4 x 109 또는 8 x 109개를 투여받는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 트라스투주맙 (trastuzumab)인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 치료하기 전 림프구 제거 화학요법을 시술받는, 방법.
  13. 제13항에 있어서, 상기 림프구 제거 화학요법이 비-골수파괴성 화학요법인, 방법.
  14. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 림프구 제거 화학요법이 사이클로포스파미드 및 플루다라빈 중 하나 이상을 이용한 치료를 포함하는, 방법.
  15. 제15항에 있어서, 상기 림프구 제거 화학요법이 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 이용한 치료를 포함하는, 방법.
  16. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 사이클로포스파미드는 100-500 ㎎/㎡/day로 투여되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 사이클로포스파미드는 250 ㎎/㎡/day로 투여되는, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 사이클로포스파미드는 500 ㎎/㎡/day로 투여되는, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플루다라빈은 10-50 ㎎/㎡/day로 투여되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 플루다라빈은 30 ㎎/㎡/day로 투여되는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, IL-2의 투여를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 환자는 IL-2를 1 x 106 IU/㎡로 투여받는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 환자는 IL-2를 6,000,000 IU로 투여받는, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-2 투여는 NK 세포 투여로부터 1-4시간 이내에 이루어지는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포와 인간 HER2를 표적으로 하는 항체의 투여가 매주 이루어지는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포와 인간 HER2를 표적으로 하는 항체는 4-8주 동안 매주 투여되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포는 매주 투여하고, 상기 인간 HER2를 표적으로 하는 항체는 격주로 투여하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포는 유전자 변형되지 않는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포는 적어도 70%가 CD56+ 및 CD16+인, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포는 적어도 85%가 CD56+ 및 CD3-인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포는 1% 이하가 CD3+이고, NK 세포는 1% 이하가 CD19+이고, NK 세포는 1% 이하가 CD14+인, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포의 각 투여가 NK 세포 1 x 109 내지 5 x 109개의 투여인, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 NK 세포를 1차 투여하기 전 HER2를 표적으로 하는 항체의 용량을 투여받는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포가 증폭된 제대혈 자연살해세포인, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단이 CD16+ 세포를 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 포함하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단이 NKG2D+ 세포를 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 포함하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단이 NKp46+ 세포를 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 포함하는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단이 NKp30+ 세포를 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 포함하는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단이 DNAM-1+ 세포를 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단이 NKp44+ 세포를 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100%로 포함하는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단이 20% 미만, 예를 들어 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하 또는 0%로 CD3+ 세포를 포함하는, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단이 CD14+ 세포를 20% 미만, 예를 들어 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하 또는 0%로 포함하는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단이 CD19+ 세포를 20% 미만, 예를 들어 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하 또는 0%로 포함하는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단이 CD38+ 세포를 20% 미만, 예를 들어 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하 또는 0%로 포함하는, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자연살해세포는 CD16 전이유전자를 포함하지 않는, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자연살해세포는 외인성 CD16 단백질을 발현하지 않는, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포는 유전자 조작되지 않는, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포는 동일한 제대혈 공여체로부터 유래한, 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포 집단이 증폭된 자연살해세포를 적어도 1억개 포함하고, 예를 들어 2억, 2억5천만, 3억, 4억, 5억, 6억, 7억, 7억5천만, 8억, 9억, 10억, 20억, 30억, 40억, 50억, 60억, 70억, 80억, 90억, 100억, 150억, 200억, 250억, 500억, 750억, 800억, 900억, 1000억, 2000억, 2500억, 3000억, 4000억, 5000억, 6000억, 7000억, 8000억, 9000억, 1조, 2조, 3조, 4조, 5조, 6조, 7조, 8조, 9조 또는 10조개 포함하는, 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포 집단이 다음을 포함하는 방법에 의해 생산된, 방법:
    (a) 제대혈로부터 자연살해세포를 포함하는 시드 세포 (seed cell)를 수득하는 단계;
    (b) 상기 시드 세포에서 CD3+ 세포를 고갈 처리하는 단계;
    (c) 고갈 처리된 시드 세포를 막 결합형 IL-21, TNFα 돌연변이 및 4-1BBL 유전자를 발현하도록 조작된 제1의 복수의 Hut78 세포와 함께 배양함으로써 자연살해세포를 증폭시켜 증폭된 자연살해세포를 생산하고;
    이로써 증폭된 자연살해세포의 집단을 생산하는 단계.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포 집단이 다음을 포함하는 방법에 의해 생산된, 방법:
    (a) 제대혈로부터 자연살해세포를 포함하는 시드 세포를 수득하는 단계;
    (b) 상기 시드 세포에서 CD3+ 세포를 고갈 처리하는 단계;
    (c) 고갈 처리된 시드 세포를 막 결합형 IL-21, TNFα 돌연변이 및 4-1BBL 유전자를 발현하도록 조작된 제1의 복수의 Hut78 세포와 함께 배양함으로써 자연살해세포를 증폭시켜 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단을 생산하는 단계; 및
    (d) 막 결합형 IL-21, TNFα 돌연변이 및 4-1BBL 유전자를 발현하도록 조작된 제2의 복수의 Hut78 세포와 함께 배양함으로써 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단을 증폭시켜, 증폭된 자연살해세포를 생산하고;
    이로써 증폭된 자연살해세포의 집단을 생산하는 단계.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 상기 NK 세포의 집단이 단계 (c) 다음에,
    (i) 상기 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단을 복수의 용기에서 냉동하는 단계; 및
    (ii) 상기 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단의 분액이 수용된 용기를 해동하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 의해 생산되고,
    단계 (d)에서, 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단의 증폭이, 증폭된 자연살해세포의 마스터 세포 은행 집단의 분액을 증폭시키는 것을 포함하는, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제대혈이 KIR-B 일배체형이고 CD16 158V 다형성에 대해 동형접합성인 공여체로부터 유래한, 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포의 집단이 제대혈로부터 자연살해세포를 적어도 10,000배, 예를 들어, 15,000배, 20,000배, 25,000배, 30,000배, 35,000배, 40,000배, 45,000배, 50,000배, 55,000배, 60,000배, 65,000배 또는 70,000배 증폭하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된, 방법.
  55. 제50항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단은 증폭 후 농화 또는 분류하지 않는, 방법.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단 내 CD16을 발현하는 NK 세포의 백분율이 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높은, 방법.
  57. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단 내 NKG2D를 발현하는 NK 세포의 백분율이 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높은, 방법.
  58. 제50항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단 내 NKp30을 발현하는 NK 세포의 백분율이 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높은, 방법.
  59. 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단 내 NKp44를 발현하는 NK 세포의 백분율이 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높은, 방법.
  60. 제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단 내 NKp46을 발현하는 NK 세포의 백분율이 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높은, 방법.
  61. 제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭된 자연살해세포의 집단 내 DNAM-1을 발현하는 NK 세포의 백분율이 제대혈로부터 유래한 시드 세포 내 자연살해세포의 백분율과 동일하거나 또는 그보다 높은, 방법.
KR1020237038625A 2021-04-08 2022-04-06 Nk 세포와 her2 표적 항체를 이용한 암 치료 방법 KR20240024048A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163172414P 2021-04-08 2021-04-08
US63/172,414 2021-04-08
US202163290359P 2021-12-16 2021-12-16
US63/290,359 2021-12-16
PCT/US2022/023684 WO2022216831A1 (en) 2021-04-08 2022-04-06 Treatment of cancer with nk cells and a her2 targeted antibody

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240024048A true KR20240024048A (ko) 2024-02-23

Family

ID=83545892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237038625A KR20240024048A (ko) 2021-04-08 2022-04-06 Nk 세포와 her2 표적 항체를 이용한 암 치료 방법

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240197778A1 (ko)
EP (1) EP4319771A1 (ko)
JP (1) JP2024513522A (ko)
KR (1) KR20240024048A (ko)
AU (1) AU2022254689A1 (ko)
WO (1) WO2022216831A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11649294B2 (en) 2017-11-14 2023-05-16 GC Cell Corporation Anti-HER2 antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor comprising same

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7171433B2 (ja) * 2015-10-30 2022-11-15 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ Ｈｅｒ－２発現固形腫瘍の処置のための組成物および方法
WO2017205843A1 (en) * 2016-05-27 2017-11-30 Tg Therapeutics, Inc. Combination of anti-cd20 antibody, p13 kinase-delta selective inhibitor, and btk inhibitor to treat b-cell proliferative disorders
US20190336533A1 (en) * 2016-12-28 2019-11-07 Green Cross Lab Cell Corporation Chimeric antigen receptor and natural killer cells expressing same
CN112839666A (zh) * 2018-05-14 2021-05-25 因达普塔治疗公司 具有增强的抗体导向免疫应答的人自然杀伤细胞亚群

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022254689A1 (en) 2023-11-16
JP2024513522A (ja) 2024-03-25
EP4319771A1 (en) 2024-02-14
US20240197778A1 (en) 2024-06-20
WO2022216831A1 (en) 2022-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20210013013A (ko) 종양 치료 방법 및 조성물
US20240000840A1 (en) Treatment of cancer with nk cells and a cd20 targeted antibody
KR20240024049A (ko) Nk 세포와 egfr 표적 항체를 이용한 암 치료 방법
US20240115704A1 (en) Treatment of cancer with nk cells and a cd38-targeted antibody
EP4319768A1 (en) Chimeric antigen receptor comprising an anti-her2 antibody or antigen-binding fragment thereof and natural killer cells comprising the same
US20240060046A1 (en) Expanded and stimulated natural killer cells
KR20240024048A (ko) Nk 세포와 her2 표적 항체를 이용한 암 치료 방법
KR20240024046A (ko) Nk 세포와 cd20 표적 항체를 이용한 암 치료 방법
KR20240107147A (ko) Nk 세포 및 다중특이적 인게이저를 이용한 암의 치료
KR20230167416A (ko) 키메라 항원 수용체 및 il-15를 포함하는 융합 단백질
WO2022216811A2 (en) Chimeric antigen receptor comprising an anti-cd19 antibody or antigen-binding fragment thereof and natural killer cells comprising the same
WO2024040135A2 (en) Methods of administering natural killer cells comprising an anti-human epidermal growth factor receptor 2 (her2) chimeric antigen receptor (car)
CN117545490A (zh) 用nk细胞和her2靶向抗体治疗癌症
CN118103048A (zh) 用nk细胞和靶向egfr的抗体治疗肿瘤
CN117715647A (zh) 用nk细胞和cd38靶向抗体治疗癌症