CN117545490A - 用nk细胞和her2靶向抗体治疗癌症 - Google Patents

用nk细胞和her2靶向抗体治疗癌症 Download PDF

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CN117545490A
CN117545490A CN202280041525.2A CN202280041525A CN117545490A CN 117545490 A CN117545490 A CN 117545490A CN 202280041525 A CN202280041525 A CN 202280041525A CN 117545490 A CN117545490 A CN 117545490A
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赵诚唯
黄琉炅
闵普庆
梁比特纳
金恩智
P·弗林
J·B·利顿
T·J·法瑞尔
J·K·C·里姆
M·曼达尔
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Abstract

本发明特别提供了用于治疗患有HER2+癌症的患者的方法。

Description

用NK细胞和HER2靶向抗体治疗癌症
优先权要求
本申请权利要求于2021年12月16日提交的美国临时申请号63/290359和于2021年4月8日提交的第63/172414号美国临时申请的权益。上述内容的全部内容通过引用合并于此。
背景技术
靶向治疗，包括抗体治疗，已经彻底改变了癌症治疗。抗体治疗诱导细胞毒性的一种作用机制是通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(antibody dependent cell-mediatedcytotoxicity,ADCC)。许多癌症患者无法产生强大的ADCC反应。ADCC反应的降低可能会使任何指示的单克隆抗体疗法对这些患者的疗效显著降低，这可能会阻碍这些患者的反应或导致复发。因此，ADCC反应降低可能会对其临床结果产生负面影响。
尽管最近发现并开发了几种抗癌药物，但由于包括HER2+癌症在内的许多类型癌症的预后不良，仍需改进的方法和治疗药物。
本发明解决了这些和现有技术中的其他不足。
概述
NK细胞是一种免疫细胞，可以通过细胞表面的复杂受体阵列以及抗体依赖的细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity,ADCC)与肿瘤细胞结合。为了启动ADCC，NK细胞通过其表面的CD16受体与抗体结合。NK细胞可能比其他免疫细胞具有优势，例如在CAR-T细胞治疗和其他细胞治疗中使用的T细胞。在一个示例性优点中，NK细胞可以用作同种异体疗法，这意味着来自同一供体的NK细胞可以安全地用于一个或多个患者，而不需要HLA匹配、基因编辑或其他遗传操作。具有抗肿瘤活性的同种异体NK细胞可以安全地给予患者，而没有许多与T细胞治疗相关的风险，如严重细胞因子释放综合征(CRS)、神经毒性或移植物抗宿主病(GvHD)。
同种异体NK细胞可以为癌症患者提供重要的治疗选择。在一个示例性优点中，NK细胞被良好耐受，没有其他基于细胞治疗相关的移植物抗宿主病、神经毒性或细胞因子释放综合征的证据。在另一个示例性优点中，NK细胞不需要先前的抗原暴露或用于鉴定和裂解肿瘤细胞的特异性抗原的表达。在另一个示例性优点中，NK细胞具有固有能力，在先天免疫和产生多克隆适应性免疫反应之间架起桥梁，从而产生长期抗癌免疫记忆。所有这些特征都有助于NK细胞作为癌症治疗选择的潜力。
例如，NK细胞可以募集和激活免疫系统的其他成分。活化的NK细胞分泌细胞因子和趋化因子，如干扰素γ；肿瘤坏死因子α；以及巨噬细胞炎症蛋白1(MIP1)，其向肿瘤发出信号并募集T细胞。通过直接杀伤肿瘤细胞，NK细胞也暴露出肿瘤抗原，用于适应性免疫系统识别。
此外，通过利用不同的脐带血库作为NK细胞的来源，可以选择具有增强临床活性的优选特征的脐带(例如，高亲和力CD16和杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)B单倍型)。
如本发明所述，施用同种异体NK细胞可以增强患者的ADCC反应，例如，在接受单克隆抗体治疗时。在一个示例性优点中，本发明所述的同种异体NK细胞甚至可以用于对抗体产生完全或部分耐药性的患者。例如，HER2通路通常促进细胞生长和分裂。在一些癌症中，HER2表达上调，从而促进持续增殖和肿瘤形成。HER2通路启动MAP激酶和PI3激酶/AKT通路。曲妥珠单抗可以阻断HER2的二聚化，从而抑制HER2的激活和下游信号传导。然而，即使在没有HER2信号传导的情况下，这些途径中的突变也可以引起组成性激活，从而提供了曲妥珠单抗耐药性的机制。在一个示例性优点中，本文所述的NK细胞仍然可以与一些曲妥珠单抗耐药性癌症组合使用，因为它们介导ADCC，所述ADCC可以独立于HER2信号传导杀死肿瘤细胞。在这种情况下，NK细胞仍然可以与细胞表面结合HER2的曲妥珠单抗抗体结合，并介导细胞杀伤。
本文特别提供了治疗患有HER2+癌症的患者的方法。
本文提供了治疗患有HER2+癌症的患者的方法，包括给予自然杀伤细胞(NK细胞)群和靶向人HER2的抗体，其中所述NK细胞对患者是同种异体的，是KIR-B单倍型的，并且对于CD16 158V多态性是纯合的。
在一些实施方式中，所述癌症选自乳腺癌、胃癌和卵巢癌。
在一些实施方式中，所述癌症为乳腺癌。
在一些实施方式中，所述癌症为胃癌。
在一些实施方式中，所述癌症为卵巢癌。
在一些实施方式中，所述患者在用抗HER2抗体治疗后复发。
在一些实施方式中，所述患者在用同源干细胞移植或嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)治疗后经历了疾病进展。
在一些实施方式中，所述患者被施用1×108到1×1010NK细胞。
在一些实施方式中，所述患者被施用1×109到8×109NK细胞。
在一些实施方式中，所述患者被施用4×108、1×109、4×109、或8×109NK细胞。
在一些实施方式中，所述抗体是曲妥珠单抗。
在一些实施方式中，所述患者在治疗前接受淋巴消耗化疗。
在一些实施方式中，所述淋巴消耗化疗是非清髓性化疗。
在一些实施方式中，所述淋巴消耗化疗包括用环磷酰胺和氟达拉滨中的至少一种进行治疗。
在一些实施方式中，所述淋巴消耗性化疗包括用环磷酰胺和氟达拉滨治疗。
在一些实施方式中，所述环磷酰胺的施用量为100-500mg/m2/天。
在一些实施方式中，所述环磷酰胺的施用量为250mg/m2/天。
在一些实施方式中，所述环磷酰胺的施用量为500mg/m2/天。
在一些实施方式中，所述氟达拉滨的施用量为10-50mg/m2/天。
在一些实施方式中，所述氟达拉滨的施用量为30mg/m2/天。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括施用IL-2。
在一些实施方式中，所述患者被施用1×106IU/m2的IL-2。
在一些实施方式中，所述患者被施用6000000IU的IL-2。
在一些实施方式中，施用IL-2在施用NK细胞的1-4小时内。
在一些实施方式中，每周施用NK细胞和靶向人HER2的抗体。
在一些实施方式中，所述每周施用NK细胞和靶向人HER2的抗体4-8周。
在一些实施方式中，所述NK细胞的使用每周一次和所述靶向人HER2的抗体每隔一周一次。
在一些实施方式中，所述NK细胞未经基因修饰。
在一些实施方式中，至少70％的NK细胞是CD56+和CD163+。
在一些实施方式中，至少80％的NK细胞是CD56+和CD3-。
在一些实施方式中，1％或更少的NK细胞是CD3+，1％或更少的NK细胞为CD19+，1％或更少的NK细胞则为CD14+。
在一些实施方式中，所述每次施用NK细胞为施用1×109到5×109NK细胞.
在一些实施方式中，所述患者在接受第一剂NK细胞之前先接受一定剂量的靶向HER2抗体。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞是扩增的脐带血自然杀伤细胞。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的CD16+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的NKG2D+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的NKp46+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的NKp30+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的DNAM-1+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含小于20％，例如10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.5％或更低或0％的NKp44+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含小于20％，例如10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.5％或更低或0％的CD3+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含小于20％，例如10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.5％或更低或0％的CD14+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含小于20％，例如10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.5％或更低或0％的CD19+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含小于20％，例如10％或更低、5％或更低、1％或更低、0.5％或更低或0％的CD38+细胞。
在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞不包括CD16转基因。
在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞不表达外源性CD16蛋白。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞不是基因工程化的。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞来源于同一脐带血供体。
在一些实施方式中，所述NK细胞群包括至少1亿个扩增的自然杀伤细胞，例如2亿、2.5亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、7.5亿、8亿、9亿、10亿、20亿、30亿、40亿、50亿、60亿、70亿、80亿、90亿、100亿、150亿、200亿、250亿，500亿、750亿、800亿、90亿、1000亿、2000亿、2500亿、3000亿、4000亿、5000亿、6000亿、7000亿、8000亿、9000亿、1万亿、2万亿、3万亿、4万亿、5万亿、6万亿、7万亿、8万亿、9万亿或10万亿扩增的自然杀伤细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞群通过包括以下步骤的方法：(a)从脐带血获得包含自然杀伤细胞的种子细胞；(b)耗竭种子细胞的CD3+细胞；(c)通过将所述耗竭的种子细胞与第一多个的Hut78细胞培养来扩增所述自然杀伤细胞，所述第一多个的Hut78细胞经改造以表达膜结合的IL-21、突变的TNFα和4-1BBL基因以产生扩增的自然杀伤细胞，从而产生扩增的自然杀伤细胞群。
在一些实施方式中，所述NK细胞群体通过包括以下步骤的方法产生：(a)从脐带血获得包含自然杀伤细胞的种子细胞；(b)耗竭种子细胞的CD3+细胞；(c)通过用第一多个Hut78细胞培养耗竭的种子细胞来扩增所述自然杀伤细胞，所述第一多个Hut78细胞被改造以表达膜结合的IL-21、突变的TNFα和4-1BBL基因，以产生扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群；和(d)通过与第二多个Hut78细胞培养来扩增已扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群，所述第二多个Hut78细胞经改造以表达膜结合的IL-21、突变的TNFα和4-1BBL基因，以产生扩增的自然杀伤细胞；从而产生扩增的自然杀伤细胞群。
在一些实施方式中，所述NK细胞群体通过这样的方法产生，所述方法在步骤(c)之后进一步包括，(i)将扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群冷冻在多个容器中；和(ii)解冻包含扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群的等分试样的容器，其中在步骤(d)中扩增已扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群，所述步骤(d)包括扩增已扩增的天然杀伤细胞的所述主细胞库群的等分试样。
在一些实施方式中，所述脐带血来自具有KIR-B单倍型和CD16 158V多态性纯合的供体。
在一些实施方式中，所述NK细胞群是通过包括以下步骤的方法产生，该方法包括将来自脐带血的自然杀伤细胞扩增至少10000倍，例如15000倍、20000倍、25000倍、30000倍、35000倍、40000倍、45000倍、50000倍、55000倍、60000倍、65000倍或70000倍。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群在扩增后不富集或分选。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达CD16的NK细胞的百分比与脐带血种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
在一些实施方式中，所述在扩增的自然杀伤细胞群中表达NKG2D的NK细胞的百分比与来自脐带血的种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达NKp30的NK细胞的百分比与脐带血种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达NKp44的NK细胞的百分比与脐带血种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达NKp46的NK细胞的百分比与脐带血种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
在一些实施方式中，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达DNAM-1的NK细胞的百分比与脐带血种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。所述材料、方法和实例是说明性的，而并非旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献以引用的方式全部并入本文。在发生冲突的情况下，将以包括定义在内的本说明书为准。
根据以下详细描述和附图以及权利要求书，本发明的其他特征和优点将显而易见。
参引合并
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地指示以引用的形式并入本文的程度相同。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求中作了特殊阐述。专利或申请文件包含至少一个以彩色绘制的图形。专利局应要求并支付必要费用后，将提供本专利或带有彩色图纸的专利申请出版物的副本。通过参考以下详细描述将获得对本发明的特征和优点的更好理解，该详细描述阐述了利用本发明原理的示例性实施例，以及附图：
图1显示了用于NK细胞扩增和刺激的方法的示例性实施方案。
图2显示源于脐带血的NK细胞(CB-NK)在培养中的扩增能力是临床前研究中源于外周血NK细胞(PB-NK)的大约十倍。
图3显示了与从外周血产生的药物相比，在脐带血衍生的药物产品中肿瘤参与的NK激活免疫受体的表达更高且更一致。
图4显示了已扩增和刺激的NK细胞群体的表型。
图5显示了生产AB-101药物产品的关键步骤，AB-101是脐带血衍生和扩增的NK细胞群体的一个例子。
图6显示了AB-101的纯度(n＝9)。
图7显示了在GMP条件下制造的CD3贫化细胞、MCB和DP的纯度。
图8显示了在GMP条件下制造CD3贫化细胞、MCB和DP上NK细胞受体的表达。
图9显示了通过流式细胞术显示NK纯度(CD56+/CD3-)。
图10显示了来自三种不同脐带血捐献者的扩增的NK细胞的CD38+表达。
图11显示了来自三种不同脐血捐献者的CD38+NK细胞的CD38+平均荧光强度。
图12显示了起始NK细胞源与AB-101细胞相比的不同表面蛋白表达。
图13显示了AB-101与抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗的组合产生了抗HER2+细胞系NCI-N87的大量细胞毒性活性。效应器与目标的比率(E:T 1:1)。
图14显示了AB-101+曲妥珠单抗的体外表征。
图15显示了AB-101+曲妥珠单抗的体内表征。
图16显示了AB-101+曲妥珠单抗的体内表征。
具体实施方式
本文提供了自然杀伤(NK)细胞，例如扩增和刺激的NK细胞，生产NK细胞的方法，包括NK细胞的药物组合物，以及用NK细胞治疗患有例如癌症的患者的方法。I.自然杀伤细胞的扩增和刺激
在一些实施方式中，自然杀伤细胞扩增和刺激，例如通过用饲养细胞培养和刺激。
NK细胞可以扩增和刺激，例如在US2020/0108096或WO 2020/10361中所描述的，这两个文献通过引用整体并入本文。简言之，源细胞可以在改良的HuT-78上培养，如US2020/0108096中所述，已被改造以表达4-1BBL、膜结合的IL-21和突变体TNFα的细胞。
合适的NK细胞也可以如本文所述扩增和刺激。
在一些实施方式中，NK细胞通过一种方法扩增和刺激，所述方法包括：(a)提供NK细胞，例如包含NK细胞的组合物，例如CD3(-)贫化细胞；和(b)在包含饲养细胞和/或刺激因子的培养基中培养，从而产生扩增和刺激的NK细胞群体。
A.自然杀伤细胞来源
在一些实施方式中，所述NK细胞源选自下组：外周血、外周血淋巴细胞(PBLs)、外周血单核细胞(PBMCs)、骨髓、脐带血(脐带血)、分离的NK细胞、来源于诱导多能干细胞的NK细胞，来源于胚胎干细胞的NK细胞及其组合。
在一些实施方式中，所述NK细胞源是单个脐带血单位。
在一些实施方式中，所述天然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，包含约1x107至约1x 109的总有核细胞。在一些实施方式中，自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，包括从或从约1×108至或至约1.5×108的总有核细胞。在一些实施方式中，自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，包括1x 108个总有核细胞。在一些实施方式中，自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，包括约1×108个总有核细胞。在一些实施方式中，自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，包括1x 109个总有核细胞。在一些实施方式中，自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，包括约1×109个总有核细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含约20％至约80％的CD16+细胞。在一些实施方式中，NK细胞源，例如脐带血单位，包含从或从约20％至或至约80％、从约20％至或至约70％、从约20％至或至约60％、从约20％至或至约50％、从约20至或至约40％、从约20至或至约30％、从约30％至或至约80％、从约30％至或至约70％、从约30％至或至60％，从约30％至约50％、从约30％至至约40％、从约40％至约至80％、从约40至约至70％、从约40％至约至60％、从约40％至约至50％、从约50％至约80％、从约50％至约至70％、从约50％至或至约60％、从约60％至或至约80％、从约60％至或至约70％、从或约70％至约80％的CD16+细胞。在一些实施方式中，NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于80％的CD16+细胞。或者，一些NK细胞源可以包含浓度大于80％的CD16+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％MLG2A+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％NKG2C+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％NKG2D+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％NKp46+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％NKp30+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％DNAM-1+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％NKp44+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％ CD25+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％CD62L+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％ CD69+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％CXCR3+细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源，例如脐带血单位，包含小于或等于40％，例如，小于或等于30％，例如，小于或等于20％，例如，小于或等于10％，例如小于或等于5％ CD57+细胞。
在一些实施方式中，NK细胞源中的NK细胞包含KIR受体家族的KIR B等位基因。参见，例如，Hsu等人，“杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因组区：基因序列、单倍型和等位基因多态性”，《免疫学评论》190:40-52(2002)；和Pyo等人，“人类杀伤细胞Ig样受体基因座的A和B组单倍型的中心和端粒区域的不同进化模式”，PLoS One 5:e15115(2010)。
在一些实施方式中，NK细胞源中的NK细胞包含CD16的158V/V变体(即纯合CD16158V多态性)。参见Koene等人，“FcγRIIIa-158V/F多态性影响自然杀伤细胞Fgam3月IIIa与IgG的结合，与Fgam3月iIIa-48L/R/H表型无关”，血液90:1109–14(1997)。
在一些实施方式中，细胞源中的NK细胞包含KIR受体家族的KIR B等位基因和CD16的158V/V变体。
在一些实施方式中，所述细胞源中的NK细胞不是基因工程化的。
在一些实施方式中，所述细胞源中的NK细胞不包含CD16转基因。
在一些实施方式中，所述细胞源中的NK细胞不表达外源性CD16蛋白。
在一些实施方式中，所述NK细胞源是CD3(+)耗竭的。在一些实施方式中，所述方法包括耗竭CD3(+)细胞的NK细胞源。在一些实施方式中，耗竭CD3(+)细胞的NK细胞源包括使NK细胞源与CD3结合抗体或其抗原结合片段接触。在一些实施方式中，所述CD3结合抗体或其抗原结合片段选自OKT3、UCHT1和HIT3a及其片段。在一些实施方式中，所述CD3结合抗体或其抗原结合片段是OKT3或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段连接到珠，例如磁珠。在一些实施方式中，所述耗竭CD3(+)细胞的组合物包括使所述组合物与附着在珠上的CD3靶向抗体或其抗原结合片段接触，并从所述组合物中去除珠结合的CD3(+)细胞。该组合物可以通过免疫磁性选择，例如使用CliniMACS T细胞耗竭装置(LS耗竭装置(162-01)Miltenyi Biotec)来耗竭CD3细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源CD56+富集，例如通过门控CD56表达。
在一些实施方式中，所述NK细胞源是富含CD56+和耗竭CD3(+)的，例如，通过选择具有CD56+CD3-表达的细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞源包括KIR受体家族的KIR B等位基因和CD16的158V/V变体，并且是+富集的和CD3(+)缺失的，例如，通过选择具有CD56+CD3-表达的细胞。
B.饲养细胞
本文公开了用于扩增NK细胞的饲养细胞。这些饲养细胞有利地允许NK细胞扩增到适合于制备本文所述的药物组合物的数量。在一些情况下，饲养细胞允许NK细胞的扩增而不损失CD16表达，这通常伴随着在其他类型的饲养细胞上或使用其他方法的细胞扩增。在一些情况下，所述饲养细胞使扩增的NK细胞更容易冷冻，使得更高比例的NK细胞在冷冻/解冻循环后保持存活，或者使得细胞在冷冻时保持存活更长时间。在一些情况下，所述饲养细胞允许NK细胞保留高水平的细胞毒性，包括ADCC，延长生存期，增加持久性，并增强或保留高水平CD16。在某些情况下，所述饲养细胞允许NK细胞扩增，而不会引起显著水平的衰竭或衰老。
饲养细胞可用于刺激NK细胞并帮助它们更快地扩增，例如通过提供底物、生长因子和/或细胞因子。
可以使用各种类型的饲养细胞刺激NK细胞，包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)、EB病毒转化的B淋巴细胞样细胞(例如，EBV-LCL)、髓性白血病细胞(例如K562)和CD4(+)T细胞(例如HuT)及其衍生物。
在一些实施方式中，所述饲养细胞被灭活，例如通过γ-辐射或丝裂霉素c处理。
描述用于本文所述方法的合适的饲养细胞，例如US2020/0108096中，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，所述饲养细胞是失活的CD4(+)T细胞。在一些实施方式中，所述失活的CD4(+)T细胞是HuT-78细胞或其变体或衍生物。在一些实施方式中，所述HuT-78衍生物是H9
在一些实施方式中，所述失活的CD4(+)T细胞表达OX40L。在一些实施方式中，所述失活的CD4(+)T细胞是HuT-78细胞或其变体或表达OX40L SEQ ID NO:4)的衍生物或其变体。
在一些实施方式中，所述饲养细胞是HuT-78细胞，所述HuT-78细胞经改造以表达选自4-1BBL(UniProtKB P41273，SEQ ID NO:1)、膜结合IL-21(SEQ ID NO:2)和突变体TNFalpha(SEQ ID NO：3)(“eHut-78细胞”)或其变体的至少一种基因。
在一些实施方式中，所述失活的CD4(+)T细胞是表达OX40L直系同源物或其变体的HuT-78细胞或其变体。在一些实施方式中，所述饲养细胞是HuT-78细胞，其经改造以表达选自由4-1BBL同源物或其变体、膜结合的IL-21同源物或其变体和突变体TNFα同源物或其变体组成的组中的至少一种基因。
在一些实施方式中，所述饲养细胞是HuT-78细胞，所述饲养细胞其表达OX40LSEQID NO:4)，并经改造以表达4-1BBL(SEQ ID NO:1)、膜结合的IL-21(SEQ ID NO：2)和突变体TNFα(SEQ ID NO:3)(“eHut-78细胞”)或其变体或衍生物。
在一些实施方式中，所述饲养细胞在与NK细胞培养之前扩增(例如，从冷冻原液中扩增)，例如，如实施例2中所述。
C.刺激因子
除了饲养细胞之外或代替饲养细胞，还可以使用除饲养细胞之外的一种或多种刺激因子来刺激NK细胞，例如信号因子。
在一些实施方式中，如本文所述，所述刺激因子是培养基的组分，例如信号因子。在一些实施方式中，如本文所述，所述刺激因子是培养基的添加物，例如信号因子。
在一些实施方式中，所述刺激因子是细胞因子。在一些实施方式中，所述细胞因子选自下组：IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-α、IFN-β及其组合。
在一些实施方式中，所述细胞因子是IL-2。
在一些实施方式中，所述细胞因子是IL-2和IL-15的组合。
在一些实施方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-15和IL-18的组合。
在一些实施方式中，所述细胞因子是IL-2、IL-18和IL-21的组合。
D.培养
可以通过共培养NK细胞源和饲养细胞和/或其他刺激因子来扩增和刺激NK细胞。本文描述了合适的NK细胞来源、饲养细胞和刺激因子。
在某些情况下，扩增的自然杀伤细胞群在扩增后富集和/或分选。在某些情况下，扩增的自然杀伤细胞群体在扩增后没有富集和/或分选。
本文还描述了包含本文所述的各种培养组合物的组合物，例如包含NK细胞。例如，包含扩增的脐带血来源的自然杀伤细胞群的组合物，所述扩增的脐带血源的自然杀伤细胞群体包含KIR-B单倍型和CD16 158V多态性纯合子以及多个转基因HuT78细胞。
本文还描述了容器，例如小瓶、冷冻袋等，其包括扩增的自然杀伤细胞的最终群体。在一些情况下，多个容器包括扩增的自然杀伤细胞的所得群体的部分，例如至少10个，例如20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或1200个容器。
1.培养基
本文公开了用于扩增NK细胞的培养基。这些培养基有利地允许NK细胞扩增到适合于制备本文所述的药物组合物的数量。在某些情况下，培养基允许NK细胞扩增而不损失CD16表达，所述CD16的表达通常伴随着其他辅助细胞或其他培养基中的细胞扩增而损失。
在一些实施方式中，所述培养基是基础培养基，任选地补充有附加组分，例如，如本文所述。
在一些实施方式中，所述培养基是无血清培养基，例如基础培养基。在一些实施方式中，所述培养基是补充有人血浆和/或血清的无血清培养基，例如基础培养基。
合适的基础培养基包括但不限于DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12、SCGM(斯奥詹斯20802-0500或20806-0500)、LGM-3TM(龙沙(Lonza)，CC-3211)、TexMASTM(美天旎生物技术，130-097-196)、ALySTM 505NK-AC(细胞科学技术股份有限公司，01600P02)、CTSTM AIM-VTM SFM(赛默飞世尔科技，A3830801)、CTSTM OpTmizerTM(赛默飞世尔科技，A1048501，ABS-001，StemXxVivo及其组合。
所述培养基可以包含附加的组分，或补充附加的组份，如生长因子、信号因子、营养素、抗原结合剂等。培养基的补充可以通过在将培养基添加到培养容器之前、同时或之后将一种或多种附加组分添加到培养器皿中来进行。附加的一个或多个组分可以一起添加或单独添加。单独添加时，不需要同时添加附加组分。
在一些实施方式中，所述培养基包括血浆，例如人血浆。在一些实施方式中，所述培养基补充有血浆，例如人血浆。在一些实施方式中，所述血浆，例如人血浆，包括抗凝剂，例如柠檬酸三钠。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充约0.5％至约10％v/v的血浆，例如人血浆。在一些实施方式中，培养基补充从或从约0.5％至或至约9％、从或从约0.5％至或至约8％、从或从约0.5％至或至约7％、从或从约0.5％至或至约6％、从或从约0.5％至或至约5％、从或从约0.5％至或至约4％、从或从约0.5％至或至约3％、从或从约0.5％至或至约2％、从或从约0.5％至或至约1％、从或从约1％至或至约10％、从或从约1％至或至约9％、从或从约1％至或至约8％、从或从约1％至或至约7％、从或从约1％至或至约6％、从或从约1％至或至约5％、从或从约1％至或至约4％、从或从约1％至或至约3％、从或从约1％至或至约2％、从或从约2％至或至约10％、从或从约2％至或至约9％、从或从约2％至或至约8％、从或从约2％至或至约7％、从或从约2％至或至约5％、从或从约2％至或至约4％、从或从约2％至或至约3％、从或从约3％至或至约10％、从或从约3％至或至约9％、从或从约3％至或至约8％、从或从约3％至或至约7％、从或从约3％至或至约6％、从或从约3％至或至约5％、从或从约3％至或至约4％、从或从约4％至或至约10％、从或从约4％至或至约9％、从或从约4％至或至约8％、从或从约4％至或至约7％、从或从约4％至或至约6％、从或从约4％至或至约5％、从或从约5％至或至约10％、从或从约5％至或至约9％、从或从约5％至或至约9％、从或从约4％至或至约8％、从或从约5％至或至约7％、从或从约5％至或至约6％、从或从约6％至或至约10％、从或从约6％至或至约9％、从或从约6％至或至约8％、从或从约6％至或至约7％、从或从约7％至或至约10％、从或从约7％至或至约9％、从或从约7％至或至约8％、从或从约8％至或至约10％、从或从约8％至或至约9％、或从或从约9％至或至约10％v/v血浆，例如人血浆。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从0.8％至1.2％v/v的人血浆。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有1.0％v/v人血浆。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充约1.0％v/v的人血浆。
在一些实施方式中，所述培养基包含血清，例如人血清。在一些实施方式中，所述培养基补充有血清，例如人血清。在一些实施方式中，所述血清被灭活，例如热灭活。在一些实施方式中，所述血清被过滤，例如无菌过滤。
在一些实施方式中，所述培养基包含谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述培养基补充有谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从或从约2.0至或至约6.0mM谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从或从约2.0至或至约5.5、从或从约2.0至或至约5.0、从或从约2.0至或至约4.5、从或从约2.0至或至约4.0、从或从约2.0至或至约3.5、从或从约2.0至或至约3.0、从或从约2.0至或至约2.5、从或从约2.5至或至约6.0、从或从约2.5至或至约5.5、从或从约2.5至或至约5.0、从或从约2.5至或至约4.5、从或从约2.5至或至约4.0、从或从约2.5或至约3.5、从或从约2.5至或至约3.0、从或从约3.0至或至约6.0、从或从约3.0至或至约5.5、从或从约3.0至或至约5.0、从或从约3.0至或至约4.5、从或从约3.0至或至约4.0、从或从约3.5至或至约6.0、从或从约3.5至或至约5.5、从或从约3.5至或至约5.0、从或从约3.5至或至约4.5、从或从约3.5至或至约4.0、从或从约4.0至或至约6.0、从或从约4.0至或至约5.5、从或从约4.0至或至约5.0、从或从约4.0至或至约4.5、从或从约4.5至或至约6.0、从或从约4.5至或至约5.5、从或从约4.5至或至约5.0、从或从约5.5至或至约6.0mM的谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充3.2mM谷氨酰胺至4.8mM谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充4.0mM谷氨酰胺。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充约4.0mM谷氨酰胺。
在一些实施方式中，所述培养基包含一种或多种细胞因子(cyotkins)。在一些实施方式中，所述培养基补充有一种或多种细胞因子(cyotkins)。
在一些实施方式中，所述细胞因子选自IL-2、IL-12、IL-15、IL-18及其组合。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有IL-2。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从或从约150至或至约2500IU/mL IL-2。在一些实施方案中、培养基包含和/或补充从或从约200至或至约2250、从或从约200至或至约2000、从或从约200至或至约1750、从或从约200至或至约1500、从或从约200至或至约1250、从或从约200至或至约1000、从或从约200至或至约750、从或从约200至或至约500、从或从约200至或至约250、从或从约250至或至约2500、从或从约250至或至约2250、从或从约250至或至约2000、从或从约250至或至约1750、从或从约1500至或至约1500、从或从约250至或至约1250、从或从约250至或至约1000、从或从约250至或至约750、从或从约250至或至约500、从或从约500至或至约500、从或从约500至或至约2250、从或从约500至或至约2000、从或从约500至或至约1750、从或从约500至或至约1500、从或从约500至或至约1250、从或从约500至或至约1000、从或从约500至或至约750、从或从约750至或至约2250、从或从约750至或至约2000、从或从约75至或至约1750、从或从约750至或至约1500、从或从约750至或至约1250、从或从约750至或至约1000、从或从约1000至或至约2500、从或从约1000至或至约2250、从或从约1000至或至约2000、从或从约1000至或至约1750、从或从约1000至或至约1500、从或从约1000至或至约1250、从或从约1250至或至约2500、从或从约1250至或至约2250、从或从约1250至或至约2000、从或从约1250至或至约1750、从或从约1250至或至约1500、从或从约1500至或至约2500、从或从约1500至或至约2250、从或从约1500至或至约2000、从或从约1500至或至约1750、从或从约1750至或至约2500、从或从约1750至或至约2250、从或从约1750至或至约2000、从或从约2000到或至约2500、从或从约2000至或至约2250、从或从约2250至或至约2500IU/mL的IL-2。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充64μg/L至96μg/L的IL-2。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有80μg/L的IL-2(约1333IU/mL)。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充约80μg/L。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有IL-2和IL-15的组合。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有IL-2、IL-15和IL-18的组合。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有IL-2、IL-18和IL-21的组合。
在一些实施方式中，所述培养基包含葡萄糖和/或补充有葡萄糖。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有从或从约0.5至或至约3.5g/L的葡萄糖。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从或从约0.5至或至约3.0、从或从约0.5至或至约2.5、从或从约0.5至或至约2.0、从或从约0.5至或至约1.5、从或从约0.5至或至约1.0、从或从约1.0至或至约3.0，从或从约1.0至或至约2.0、从或从约1.0至或至约1.5、从或从约1.5至或至约3.0、从或从约1.5至或至约2.5、从或从约1.5至或至约2.0、从或从约2.0至或至约3.0、从或从约2.0至或至约2.5，从或从约2.5至或至约3.0g/L葡萄糖。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充1.6至2.4g/L葡萄糖。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有2.0g/L葡萄糖。在一些实施方式中，所述培养基包含约2.0g/L葡萄糖。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充丙酮酸钠。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有从或从约0.1至或至约2.0mM丙酮酸钠。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从或从约0.1至或至约1.8、从或从约0.1至或至约1.6、从或约0.1至或约1.4、从或从约0.1至或至约1.2、从或从约0.1至或至约1.0、从或从约0.1至或至约0.8、从或从约0.1至或至约0.4，从或从约0.1至或至约0.2，从或从约0.2-或至2.0，从或从约0.2至或至约1.8，从或从约0.2至或至约1.6，从或从约0.2至或至约1.4，从或从约0.2至或至约1.2，从或从约0.2至或至约1.0，从或从约0.2至或至约0.8，从或从约0.2至或至约0.6，从或从约0.2至或至约0.4，从或从约0.4至或至约2.0，从或从约0.4至或至约1.8，从或约0.4至或至约1.6，从或从约0.4至或至约1.4，从或从约0.4至或至约1.2，从或从约0.4至或至约1.0，从或从约0.4至或至约0.8，从或从约0.4至或至约0.6，从或从约0.6至或至约2.0，从或从约0.6至或至约1.8，从或从约0.6至或至约1.6，从或从约0.6至或至约1.4，从或从约0.6至或至约1.2，从或从约0.6至或至约1.0，从或从约0.6至或至约0.8，从或从约0.8至或至约2.0、从或从约0.8至或至约1.8、从或从约0.8至或至约1.6、从或从约0.8至或至约1.4、从或从约0.8至或至约1.4，从或从约0.8至或至约1.2，从或从约0.8至或至约1.0，从或从约1.0至或至约2.0，从或从约1.0至或至约1.8，从或从约1.0至或至约1.6，从或从约1.0至或至约1.4，从或从约1.0至或至约1.2，从或从约1.2至或至约2.0，从或从约1.2至或至约1.8，从或从约1.2至或至约1.6，从或从约1.2至或至约1.4，从或从约1.4至或至约2.0，从或从约1.4至或至约1.8，从或从约1.4至或至约1.6，从或从约1.6至或至约2.0，从或从约1.6至或至约1.8，从或从约1.8至或至约2.0mM丙酮酸钠。在一些实施方式中，所述培养基包含0.8-1.2mM丙酮酸钠。在一些实施方式中，所述培养基包含1.0mM丙酮酸钠。在一些实施方式中，所述培养基包含约1.0mM丙酮酸钠(sodium pyuruvate)。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有碳酸氢钠。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从或从约0.5至或至约3.5g/L碳酸氢钠。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从或从约0.5至或至约3.0、从或从约0.5至或至约2.5、从或从约0.5至或至约2.0、从或从约0.5至或至约1.5、从或从约0.5至或至约1.0、从或从约1.0至或至约3.0，从或从约1.0至或至约2.0，从或从约1.0至或至约1.5，从或从约1.5至或至约3.0，从或从约1.5至或至约2.5，从或从约1.5至或至约2.0，从或从约2.0至或至约3.0，从或从约2.0至或至约2.5，从或从约2.5至或至约3.0g/L碳酸氢钠。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充1.6至2.4g/L的碳酸氢钠。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充2.0g/L碳酸氢钠。在一些实施方式中，所述培养基包含约2.0g/L的碳酸氢钠。
在一些实施方式中，所述培养基包含白蛋白和/或补充有白蛋白，例如人白蛋白，例如本文所述的人白蛋白溶液。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从或从约0.5％至或至约3.5％v/v的20％白蛋白溶液，例如20％人白蛋白溶液。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从或从约0.5％至或至约3.0％、从或从约0.5％至或至约2.5％、从或从约0.5％至或至约2.0％、从或从约0.5％至或至约1.5％、从或从约0.5％至或至约1.0％、从或从约1.0％至或至约3.0％、从或从约1.0％至或至约2.5％、从或从约1.0％至或至约2.0％、从或从约1.0％至或至约1.5％、从或从约1.5％至或至约3.0％、从或从约1.5％至或至约2.5％、从或从约1.5％至或至约2.0％、从或从约2.0％至或至约3.0％、从或从约2.0％至或至约2.5％、or从或从约2.5％至或至约3.0％v/v的20％白蛋白溶液，例如20％人白蛋白溶液。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充1.6％至2.4％v/v的20％白蛋白溶液，例如20％人白蛋白溶液。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有2.0％v/v的20％白蛋白溶液，例如20％人白蛋白溶液。在一些实施方式中，所述培养基包含约2.0％v/v的20％白蛋白溶液，例如20％人白蛋白溶液。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充约2至约6g/L白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，培养基包含和/或补充有从或从约2至或至约5.5、从或从约2至或至约5.0、从或从约2至或至约4.5、从或从约2至或至约4、从或从约2至或至约3.5、从或从约2至或至约3、从或从约2至或至约2.5、从或从约2.5至或至约6、从或从约2.5至或至约5.5、从或从约2.5至或至约5.5、从或从约2.5至或至约5.0、从或从约2.5至或至约4.5、从或从约2.5至或至约4.0、从或从约2.5至或至约3.5、从或从约2.5至或至约3.0、从或从约3至或至约6、从或从约3至或至约5.5、从或从约3至或至约5、从或从约3至或至约4.5、从或从约3至或至约4、从或从约3至或至约3.5、从或从约3.5至或至约6、从或从约3.5至或至约5.5、从或从约3.5至或至约5、从或从约3.5至或至约4.5、从或从约3.5至或至约4、从或从约4至或至约6、从或从约4至或至约5.5、从或从约4至或至约5、从或从约4至或至约4.5、从或从约4.5至或至约6、从或从约4.5至或至约5.5、从或从约4.5至或至约5、从或从约5至或至约6、从或从约5至或至约5.5、或从或从约5.5至或至约6g/L的白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充3.2至4.8g/L的白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述培养基包含4g/L白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述培养基包含约4g/L白蛋白，例如人白蛋白。
在一些实施方式中，所述培养基补充有泊洛沙姆188。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充从或从约0.1至或至约2.0g/L泊洛沙姆188。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有从或从约0.1至或至约1.8、从或从约0.1至或至约1.6、从或从约0.1至或至约1.4、从或从约0.1至或至约1.2、从或从约0.1至或至约1.0、从或从约0.1至或至约0.8、从或从约0.1至或至约0.6、从或从约0.1至或至约0.4、从或从约0.1至或至约0.2、从或从约0.2至或至约2.0、从或从约0.2至或至约1.8、从或从约0.2至或至约1.6、从或从约0.2至或至约1.4、从或从约0.2至或至约1.2、从或从约0.2至或至约1.0、从或从约0.2至或至约0.8、从或从约0.2至或至约0.6、从或从约0.2至或至约0.4、从或从约0.4至或至约2.0、从或从约0.4至或至约1.8、从或从约0.4至或至约1.6、从或从约0.4至或至约1.4、从或从约0.4至或至约1.2、从或从约0.4至或至约1.0、从或从约0.4至或至约0.8、从或从约0.4至或至约0.6、从或从约0.6至或至约2.0、从或从约0.6至或至约1.8、从或从约0.6至或至约1.6、从或从约0.6至或至约1.4、从或从约0.6至或至约1.2、从或从约0.6至或至约1.0、从或从约0.6至或至约0.8、从或从约0.8至或至约2.0、从或从约0.8至或至约1.8、从或从约0.8至或至约1.6、从或从约0.8至或至约1.4、从或从约0.8至或至约1.4、从或从约0.8至或至约1.2、从或从约0.8至或至约1.0、从或从约1.0至或至约2.0、从或从约1.0至或至约1.8、从或从约1.0至或至约1.6、从或从约1.0至或至约1.4、从或从约1.0至或至约1.2、从或从约1.2至或至约2.0、从或从约1.2至或至约1.8、从或从约1.2至或至约1.6、从或从约1.2至或至约1.4、从或从约1.4至或至约2.0、从或从约1.4至或至约1.8、从或从约1.4至或至约1.6、从或从约1.6至或至约2.0、从或从约1.6至或至约1.8、或从或从约1.8至或至约2.0 g/L的泊洛沙姆188。在一些实施方式中，所述培养基包含0.8-1.2g/L泊洛沙姆188。在一些实施方式中，所述培养基包含1.0g/L泊洛沙姆188。在一些实施方式中，所述培养基包含约1.0g/L泊洛沙姆188。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有一种或多种抗生素。
表1中列出了第一种示例性培养基。
表1示例性培养基#1
组分 示例性浓度范围 示例性浓度
CellgroSCGM液体培养基 未稀释的 未稀释的
人血浆 0.8–1.2％(v/v) 1.0％v/v
谷氨酰胺 3.2–4.8mM 4.0mM
IL-2 64-96μg/L 80μg/L
表2中列出了第二种示例性培养基。
表2示例性培养基#1
2.CD3结合抗体
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有CD3结合抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述CD3结合抗体或其抗原结合片段选自下组：OKT3、UCHT1和HIT3a或其变体。在一些实施方式中，所述CD3结合抗体或其抗原结合片段是OKT3或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，在添加NK细胞和/或培养基之前，将所述CD3结合抗体或其抗原结合片段和饲养细胞添加到培养容器中。
在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充约5ng/mL至约15ng/mL的OKT3。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充有从或从约5至或至约12.5、从或从约5至或至约10、从或从约5至或至约7.5、从或从约7.5至或至约15、从或从约7.5至或至约12.5、从或从约7.5至或至约10、从或从约10至或至约15、从或从约10至或至约12.5、或从或从约12.5至或至约15ng/mL的OKT3。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充10ng/mL的OKT3。在一些实施方式中，所述培养基包含和/或补充约10ng/mL的OKT3。
3.培养容器
许多容器与本文的公开内容一致。在一些实施方式中，所述培养容器选自烧瓶、瓶子、培养皿、多壁板、滚筒瓶、袋和生物反应器。
在一些实施方式中，对所述培养容器进行处理使其具有亲水性。在一些实施方式中，对所述培养容器进行处理以促进附着和/或增殖。在一些实施方式中，用血清、胶原蛋白、层粘连蛋白、明胶、聚赖氨酸、纤连蛋白、细胞外基质蛋白及其组合包被在所述培养容器表面。
在一些实施方式中，不同类型的培养容器用于不同的培养阶段。
在一些实施方式中，所述培养容器的体积为从或从约100mL至或至约1000L。在一些实施例中，所述培养器皿的体积为或约125mL、约250mL、约500mL、约1L、约5L、约10L或约20L。
在一些实施方式中，所述培养容器是生物反应器。
在一些实施方式中，所述生物反应器是摇摆床(波动)生物反应器。在一些实施方式中，所述生物反应器是搅拌槽式生物反应器。在一些实施方式中，所述生物反应器是旋转壁容器。在一些实施方式中，所述生物反应器是灌注生物反应器。在一些实施方式中，所述生物反应器是分离/膨胀自动化系统。在一些实施方式中，所述生物反应器是自动化或半自动化的生物反应器。在一些实施方式中，所述生物反应器是一次性袋式生物反应器。
在一些实施方式中，所述生物反应器的体积从约100mL至约1000L。在一些实施方式中，所述生物反应器的体积从约10L至约1000L。在一些实施方式中，所述生物反应器的体积从约100L至约900L。在一些实施方式中，所述生物反应器的体积从约10L至约800L。在一些实施方式中，所述生物反应器的体积从约10L至约700L、约10L至约600L、约10L至约500L、约10L至约400L、约10L至约300L、约10L至约200L、约10L至约100L、约10L至约90L、约10L至约80L、约10L至约70L、约10L至约60L、约10L至约50L、约10L至约40L、约10L至约30L、约10L至约20L、约20L至约1000L、约20L至约900L、约20L至约800L、约20L至约700L、约20L至约600L、约20L至约500L、约20L至约400L、约20L至约300L、约20L至约200L、约20L至约100L、约20L至约90L、约20L至约80L、约20L至约70L、约20L至约60L、约20L至约50L、约20L至约40L、约20L至约30L、约30L至约1、000L、约30L至约900L、约30L至约800L、约30L至约700L、约30L至约600L、约30L至约500L、约30L至约400L、约30L至约300L、约30L至约200L、约30L至约100L、约30L至约90L、约30L至约80L、约30L至约70L、约30L至约60L、约30L至约50L、约30L至约40L、约40L至约1000L、约40L至约900L、约40L至约800L、约40L至约700L、约40L至约600L、约40L至约500L、约40L至约400L、约40L至约300L、约40L至约200L、约40L至约100L、约40L至约90L、约40L至约80L、约40L至约70L、约40L至约60L、约40L至约50L、约50L至约1000L、约50L至约900L、约50L至约800L、约50L至约700L、约50L至约600L、约50L至约500L、约50L至约400L、约50L至约300L、约50L至约200L、约50L至约100L、约50L至约90L、约50L至约80L、约50L至约70L、约50L至约60L、约60L至约1000L、约60L至约900L、约60L至约800L、约60L至约700L、约60L至约600L、约60L至约500L、约60L至约400L、约60L至约300L、约60L至约200L、约60L至约100L、约60L至约90L、约60L至约80L、约60L至约70L、约70L至约1000L、约70L至约900L、约70L至约800L、约70L至约700L、约70L至约600L、约70L至约500L、约70L至约400L、约70L至约300L、约70L至约200L、约70L至约100L、约70L至约90L、约70L至约80L、约80L至约1000L、约80L至约900L、约80L至约800L、约80L至约700L、约80L至约600L、约80L至约500L、约80L至约400L、约80L至约300L、约80L至约200L、约80L至约100L、约80L至约90L、约90L至约1000L、约90L至约900L、约90L至约800L、约90L至约700L、约90L至约600L、约90L至约500L、约90L至约400L、约90L至约300L、约90L至约200L、约90L至约100L、约100L至约1000L、约100L至约900L、约100L至约800L、约100L至约700L、约100Ltoabout600L、约100L至约500L、约100L至约400L、约100L至约300L、约100L至约200L、约200L至约1000L、约200L至约900L、约200L至约800L、约200L至约700L、约200L至约600L、约200L至约500L、约200L至约400L、约200L至约300L、约300L至约1000L、约300L至约900L、约300L至约800L、约300L至约700L、约300L至约600L、约300L至约500L、约300L至约400L、约400L至约1000L、约400L至约900L、约400L至约800L、约400L至约700L、约400L至约600L、约400L至约500L、约500L至约1000L、约500L至约900L、约500L至约800L、约500L至约700L、约500L至约600L、约600L至约1000L、约600L至约900L、约600L至约800L、约600L至约700L、约700L至约1000L、约700L至约900L、约700L至约800L、约800L至约1000L、约800L至约900L、or约900L至约1000L。在一些实施方式中，所述生物反应器体积为50L。
在一些实施方式中，所述生物反应器体积从100mL至1000L。在一些实施方式中，所述生物反应器体积从10L至1000L。在一些实施方式中，所述生物反应器体积从100L至900L。在一些实施方式中，所述生物反应器体积从10L至800L。在一些实施方式中，所述生物反应器体积从10L至700L、10L至600L、10L至500L、10L至400L、10L至300L、10L至200L、10L至100L、10L至90L、10L至80L、10L至70L、10L至60L、10L至50L、10L至40L、10L至30L、10L至20L、20L至1000L、20L至900L、20L至800L、20L至700L、20L至600L、20L至500L、20L至400L、20L至300L、20L至200L、20L至100L、20L至90L、20L至80L、20L至70L、20L至60L、20L至50L、20L至40L、20L至30L、30L至1000L、30L至900L、30L至800L、30L至700L、30L至600L、30L至500L、30L至400L、30L至300L、30L至200L、30L至100L、30L至90L、30L至80L、30L至70L、30L至60L、30L至50L、30L至40L、40L至1000L、40L至900L、40L至800L、40L至700L、40L至600L、40L至500L、40L至400L、40L至300L、40L至200L、40L至100L、40L至90L、40L至80L、40L至70L、40L至60L、40L至50L、50L至1000L、50L至900L、50L至800L、50L至700L、50L至600L、50L至500L、50L至400L、50L至300L、50L至200L、50L至100L、50L至90L、50L至80L、50L至70L、50L至60L、60L至1000L、60L至900L、60L至800L、60L至700L、60L至600L、60L至500L、60L至400L、60L至300L、60L至200L、60L至100L、60L至90L、60L至80L、60L至70L、70L至1,000L、70L至900L、70L至800L、70L至700L、70L至600L、70L至500L、70L至400L、70L至300L、70L至200L、70L至100L、70L至90L、70L至80L、80L至1,000L、80L至900L、80L至800L、80L至700L、80L至600L、80L至500L、80L至400L、80L至300L、80L至200L、80L至100L、80L至90L、90L至1,000L、90L至900L、90L至800L、90L至700L、90L至600L、90L至500L、90L至400L、90L至300L、90L至200L、90L至100L、100L至1000L、100L至900L、100L至800L、100L至700L、100L至600L、100L至500L、100L至400L、100L至300L、100L至200L、200L至1,000L、200L至900L、200L至800L、200L至700L、200L至600L、200L至500L、200L至400L、200L至300L、300L至1,000L、300L至900L、300L至800L、300L至700L、300L至600L、300L至500L、300L至400L、400L至1000L、400L至900L、400L至800L、400L至700L、400L至600L、400L至500L、500L至1,000L、500L至900L、500L至800L、500L至700L、500L至600L、600L至1,000L、600L至900L、600L至800L、600L至700L、700L至1000L、700L至900L、700L至800L、800L至1,000L、800L至900L、或900L至1000L。在一些实施方式中，所述生物反应器体积为50L。
4.细胞扩增和刺激
在一些实施方式中，所述天然杀伤细胞源与饲养细胞共培养以产生扩增和刺激的NK细胞，例如单位脐带血。
在一些实施方式中，所述共培养在本文所述的培养基中进行，例如，示例性培养基#1(表1)或示例性培养基#2(表2)。
在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，在扩增前包含从或从约1×107至或至约1×109的总有核细胞。在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，在扩增之前包含从或从约1×108至或至约1.5×108的总有核细胞。在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，在扩增之前包含1×108个总有核细胞。在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，在扩增之前包含约1×108个总有核细胞。在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，在扩增之前包含1x 109个总有核细胞。在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞源，例如单个脐带血单位，在扩增之前包含约1×109个总有核细胞。
在一些实施方式中，来自自然杀伤细胞源共培养的细胞，例如收获并冷冻单个脐带血单位和饲养细胞，例如在本文所述的冷冻保存组合物中。在一些实施方式中，所述来自共培养的所述冷冻细胞是可输注的药物产品。在一些实施方式中，将来自共培养物的冷冻细胞用作主细胞库(MCB)，所述主细胞库用于生产输注准备药物产品，例如如本文所述，通过一个或多个额外的共培养步骤。因此，例如，可以如本文所述扩增和刺激自然杀伤细胞源，以产生适合用于输注制剂的扩增和刺激的NK细胞，而不产生任何中间产物。天然杀伤细胞源也可以如本文所述进行扩增和刺激以产生中间产物，例如第一主细胞库(MCB)。所述第一MCB可用于产生扩增和刺激的NK细胞，所述NK细胞适用于制备输注的药物产品，或者可替代地，可用于产生另一中间产品，例如第二MCB。所述第二MCB可用于产生适于输注药物产品的扩增和刺激的NK细胞，或者可替代地，可用于产生另一中间产品，例如第三MCB，等等。
在一些实施方式中，饲养细胞与接种到共培养物中的自然杀伤细胞源的细胞或MCB细胞的比例为从或从约1:1至或至约4:1。在一些实施方式中，饲养细胞与自然杀伤细胞源或MCB细胞的比例为从或从约1:1至或至约305:1、从或从约1:1至或至约3:1、从或从约1:1至或至约2.5:1、从或从约1.1至或至约2:1、从或从约1:1至或至约1.5:1、从或从约1.5:1至或至约4:1、从或从约1.5:1至或至约3.5:1、从或从约1.5:1至或至约3:1、从或从约1.5:1至或至约2.5:1、从或从约1.5:1至或至约2:1、从或从约2:1至或至约4:1、从或从约2:1至或至约3.5:1、从或从约2:1至或至约3:1、从或从约2:1至或至约2.5:1、从或从约2.5:1至或至约4:1、从或从约2.5:1至或至约3.5:1、从或从约2.5:1至或至约3:1、从或从约3:1至或至约4:1、从或从约3:1至或至约3.5:1、or从或从约3.5:1至或至约4:1。在一些实施方式中，饲养细胞与接种到共培养物中的自然杀伤细胞源或MCB的细胞的比例为2.5:1。在一些实施方式中，饲养细胞与接种到共培养物中的自然杀伤细胞源的细胞或MCB的细胞的比例为约2.5:1。
在一些实施方式中，所述共培养在一次性培养袋中进行，例如1L一次性培养袋。在一些实施方式中，所述共培养在生物反应器中进行，例如50L生物反应器。在一些实施方式中，在初始接种后将培养基添加到共培养物中。
在一些实施方式中，所述共培养进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24天或更长时间。在一些实施方式中，共培养最多进行16天。
在一些实施方式中，所述共培养在37℃或约37℃下进行。
在一些实施方式中，所述共培养在pH 7.9或约pH 7.9下进行。
在一些实施方式中，所述共培养在50％或更高的溶解氧(DO)水平下进行。
在一些实施方式中，示例性培养基#1(表1)用于生产MCB，示例性培养基#2(表2)用于生产适用于输注药物产品的细胞。
在一些实施方式中，所述天然杀伤细胞源(例如，单个脐带血单位)与饲养细胞的共培养产生约50x108至约50x1012个细胞，例如，MCB细胞或可输注的药物产物细胞。在一些实施方式中，所述扩增产生为从或从约50x 108至或至约25x 1010、从或从约10x 108至或至约1x 1010、从或从约50x 108至或至约75x 109、从或从约50x 108至或至约50x 109、从或从约50x 108至或至约25x 109、从或从约50x108至或至约1x 109、从或从约50x 108至或至约75x 108、从或从约75x 108至或至约50x 1010、从或从约75x 108至或至约25x 1010、从或从约75x 108至或至约1x 1010、从或从约75x 108至或至约75x 109、从或从约75x 108至或至约50x 109、从或从约75x 108至或至约25x 109、从或从约75x 108至或至约1x 109、从或从约1x109至或至约50x 1010、从或从约1x 109至或至约25x 1010、从或从约1x109至或至约1x 1010、从或从约1x 109至或至约75x 109、从或从约1x 109至或至约50x 109、从或从约1x 109至或至约25x 109、从或从约25x 109至或至约50x 1010、从或从约25x 109至或至约25x 1010、从或从约25x 109至或至约1x 1010、从或从约25x 109至或至约75x 109、从或从约25x 109至或至约50x 109、从或从约50x 109至或至约50x 1010、从或从约50x 109至或至约25x 1010、从或从约50x 109至或至约1x 1010、从或从约50x 109至或至约75x 109、从或从约75x 109至或至约50x 1010、从或从约75x 109至或至约25x 1010、从或从约75x 109至或至约1x 1010、从或从约1x 1010至或至约50x 1010、从或从约1x 1010至或至约25x1010、or从或从约25x 1010至或至约50x 1010个细胞,例如MCB细胞或可输注的药物产物细胞。
在一些实施方式中，所述扩增产生从或从约60至或至约100个小瓶，每个小瓶包含从或从约6亿至或至约10亿个细胞，例如MCB细胞或可输注的药物产物细胞。在一些实施方式中，所述扩增产量为80或约80个小瓶，每个小瓶包含或由8亿或约8亿个细胞组成，例如MCB细胞或可输注的药物产物细胞。
在一些实施方式中，所述扩增产生的细胞数量(例如MCB细胞的数量)增加约100倍至或至约500倍，相对于自然杀伤细胞源中的细胞(例如NK细胞)的数量。在一些实施方式中，所述扩增产生从或从约100至或至约500、从或从约100至或至约400、从或从约100至或至约300、从或从约100至或至约200、从或从约200至或至约450、从或从约200至或至约400、从或从约100至或至约350、从或从约200至或至约300、从或从约200至或至约250、从或从约250至或至约500、从或从约250至或至约450、从或从约200至或至约400、从或从约250至或至约350、从或从约250至或至约300、从或从约300至或至约500、从或从约300至或至约450、从或从约300至或至约400、从或从约300至或至约350、从或从约350至或至约500、从或从约350至或至约450、从或从约350至或至约400细胞数量增加数倍，例如MCB细胞的数量相对于自然杀伤细胞源中的细胞(例如NK细胞)的数量。
在一些实施方式中，所述扩增产生的细胞数量(例如MCB细胞的数量)增加从或从约100至或至约70000倍，相对于自然杀伤细胞源中的细胞(例如NK细胞)的数量。在一些实施方式中，所述扩增产生细胞数量(例如MCB细胞的数量)相对于自然杀伤细胞源中细胞(例如NK细胞)的数量至少增加10000倍，例如15000倍、20000倍、25000倍、30000倍、35000倍、40000倍、45000倍、50000倍、55000倍、60000倍、65000倍或70000倍。
在一些实施方式中，所述MCB细胞和饲养细胞的共培养产生从或从约5亿至或至约15亿个细胞，例如适用于MCB和/或输注的药物产品的NK细胞。在一些实施方式中，所述MCB细胞和饲养细胞的共培养产生从或从约5亿至或至约15亿、从或从约5亿至或至约12.5亿、从或从约5亿至或至约10亿、从或从约5亿至或至约7.5亿、从或从约7.5亿至或至约15亿、从或从约5亿至或至约12.5亿、从或从约7.5亿至或至约10亿、从或从约10亿至或至约15亿、从或从约10亿至或至约12.5亿、或从或从约12.5亿至或至约15亿细胞，例如适用于MCB和/或输注的药物产品的NK细胞。
在一些实施方式中，所述MCB细胞和饲养细胞的共培养产生从或从约50至或至约150瓶细胞，例如，可输注的药物产品细胞，每个细胞包含从或从约7.5亿至或至约12.5亿细胞，例如适合用于MCB和/或可输注的药物产品的NK细胞。在一些实施方式中，所述MCB细胞和饲养细胞的共培养产生100或约100个小瓶，每个小瓶包含或由10亿或约10亿个细胞组成，例如适用于MCB和/或输注制剂的NK细胞。
在一些实施方式中，所述扩增产生细胞数量增加从或从约100至或至约500倍，例如，相对于起始MCB细胞的数量，适合用于MCB和/或输注准备药物产品的NK细胞的数量增加。在一些实施方式中，所述扩增产生从或从约100至或至约500、从或从约100至或至约400、从或从约100至或至约300、从或从约100至或至约200、从或从约200至或至约450、从或从约200至或至约400、从或从约100至或至约350、从或从约200至或至约300、从或从约200至或至约250、从或从约250至或至约500、从或从约250至或至约450、从或从约200至或至约400、从或从约250至或至约350、从或从约250至或至约300、从或从约300至或至约500、从或从约300至或至约450、从或从约300至或至约400、从或从约300至或至约350、从或从约350至或至约500、从或从约350至或至约450、从或从约350至或至约400细胞数量的增加倍数，例如，相对于起始MCB细胞的数量，适合在MCB和/或输注的药物产品使用的NK细胞的数量。
在一些实施方式中，所述扩增产生的细胞数量增加从或从约100至或至约70000倍，例如，相对于起始MCB细胞的数量，适合用于MCB和/或输注的药物产品的NK细胞的数量。在一些实施方式中，所述扩增产生细胞数量增加至少10000倍，例如15000倍、20000倍、25000倍、30000倍、35000倍、40000倍、45000倍、50000倍、55000倍、60000倍、65000倍或70000倍，例如相对于起始MCB细胞的数量，适合在MCB和/或输注的药物产品使用的NK细胞的数量。
在如本文所述在扩增和刺激过程中对细胞进行工程化的实施方案中，并非所有扩增和刺激的细胞都必须成功地进行工程化，例如，成功转导，例如，用包含异源蛋白的载体成功转导，例如，包含本发明所述的CAR和/或IL-15的异源蛋白。因此，本文所述的方法可进一步包括将工程化细胞(例如本文所述工程化细胞)从非工程化细胞中分选出来。
在一些实施方式中，所述工程化细胞(例如转导的细胞)使用对工程化细胞的抗原特异性的试剂从非工程化的细胞(例如非转导的细胞)中分选，例如靶向工程化细胞但不靶向非工程化细胞抗原的抗体。在一些实施方式中，所述工程化细胞的抗原是CAR的组分，例如本文所述的CAR。
用于基于抗原的细胞分离的系统可商购，例如分选系统(MiltenyiBiotec)。
在一些实施方式中，使用流式细胞术从所述非工程化细胞(例如，非转导细胞)中分选所述工程化细胞(例如，转导细胞)。
在一些实施方式中，所述分选的工程化细胞用作MCB。在一些实施方式中，所述分选的工程化细胞被用作输注的药物产品中的组分。
在一些实施方式中，使用微流体细胞分选方法从所述非工程化细胞(例如，非转导细胞)分选所述工程化细胞(例如，转导细胞)。微流体细胞分选方法在Dalili等人的《生物医学应用细胞和微珠的分选、分离和分离综述：微流体方法》中有描述，分析144:87(2019)。
在一些实施方式中，从或从约1％至或至约99％的扩增和刺激的细胞被成功地工程化，例如，成功地转导，例如，用包含异源蛋白的载体成功转导，例如包含本文所述的CAR和/或IL-15的异源蛋白。在一些实施方式中，从或从约1％至或至约90％、从或从约1％至或至约80％、从或从约1％至或至约70％、从或从约1％至或至约60％、从或从约1％至或至约50％、从或从约1％至或至约40％、从或从约1％至或至约30％、从或从约1％至或至约20％、从或从约1％至或至约10％、从或从约1％至或至约5％、从或从约5％至或至约99％、从或从约5％至或至约90％、从或从约5％至或至约80％、从或从约5％至或至约70％、从或从约5％至或至约60％、从或从约5％至或至约50％、从或从约5％至或至约40％、从或从约5％至或至约30％、从或从约5％至或至约20％、从或从约5％至或至约10％、从或从约10％至或至约99％、从或从约10％至或至约90％、从或从约10％至或至约80％、从或从约10％至或至约70％、从或从约10％至或至约60％、从或从约10％至或至约50％、从或从约10％至或至约40％、从或从约10％至或至约30％、从或从约10％至或至约20％、从或从约20％至或至约99％、从或从约20％至或至约90％、从或从约20％至或至约80％、从或从约20％至或至约70％、从或从约20％至或至约60％、从或从约20％至或至约50％、从或从约20％至或至约40％、从或从约20％至或至约30％、从或从约30％至或至约99％、从或从约30％至或至约90％、从或从约30％至或至约80％、从或从约30％至或至约70％、从或从约30％至或至约60％、从或从约30％至或至约50％、从或从约30％至或至约40％、从或从约40％至或至约99％、从或从约40％至或至约90％、从或从约40％至或至约80％、从或从约40％至或至约70％、从或从约40％至或至约70％、从或从约40％至或至约60％、从或从约40％至或至约50％、从或从约50％至或至约99％、从或从约50％至或至约90％、从或从约50％至或至约80％、从或从约50％至或至约70％、从或从约50％至或至约60％、从或从约60％至或至约99％、从或从约60％至或至约90％、从或从约60％至或至约80％、从或从约60％至或至约70％、从或从约70％至或至约99％、从或从约70％至或至约90％、从或从约70％至或至约80％、从或从约80％至或至约99％、从或从约80％至或至约90％、或从或从约90％至或至约99％的扩增和刺激的细胞被成功工程化，例如成功转导，例如用包含异源蛋白的载体成功转导，例如本文所述的包含CAR和/或IL-15的异源蛋白。
在一些实施方式中，解冻并培养第一或第二MCB的冷冻细胞。在一些实施方式中，解冻并培养单个小瓶的第一或第二MCB的冷冻细胞，例如，包含800或约8亿个细胞的单个小瓶，例如，第一或第二MCB细胞。在一些实施方式中，冷冻的第一或第二MCB细胞与额外的饲养细胞一起培养，以产生适合用作第二或第三MCB或在输注的药物产品中使用的细胞。在一些实施方式中，收获并冷冻来自第一或第二MCB的共培养的细胞。
在一些实施方式中，收获来自自然杀伤细胞源、第一MCB或第二MCB的共培养物的细胞，并将其冷冻在冷冻保存组合物中，例如本发明所述的冷冻保存组合物。在一些实施方式中，细胞在收获后被洗涤。因此，本发明提供了一种药物组合物，其包含活化和刺激的NK细胞，例如，通过本发明所述方法产生的活化和刺激NK细胞，如，收获和洗涤通过本发明所描述的方法产生的激活和刺激的NK-细胞，以及冷冻存储组合物，例如，本发明所述的冷冻保存组合物。
在一些实施方式中，在冷冻之前，将所述细胞与冷冻保存组合物混合，例如，如本文所述。在一些实施方式中，所述细胞冷冻在冷冻袋中。在一些实施方式中，所述细胞冷冻在冷冻小瓶中。
在一些实施方式中，所述方法还包括从扩增和刺激的NK细胞群中分离NK细胞。
用于扩增和刺激NK细胞的示例性过程如图1所示。
5.工程化
在一些实施方式中，所述方法进一步包括工程NK细胞，例如，表达异源蛋白，例如，本文所述的异源蛋白质，例如，包含CAR和/或IL-15的异源蛋白。
在一些实施方式中，工程化所述NK细胞以表达本文所述的异源蛋白包括转化，例如用包含本文所述编码异源蛋白的多核苷酸的载体稳定地转化NK细胞。本文描述了合适的载体。
在一些实施方式中，工程化所述NK细胞以表达本文所述的异源蛋白包括通过基因编辑(例如锌指核酸酶(ZFN)基因编辑、ARCUS基因编辑、CRISPR-Cas9基因编辑或megaTAL基因编辑)结合腺相关病毒(AAV)技术引入异源蛋白。
在一些实施方式中，所述NK细胞被工程化以表达本文所述的异源蛋白，例如，在包含饲养细胞的培养基中培养组合物期间或之后。
在一些实施方式中，所述方法还包括NK细胞工程化，例如，表达、过表达、敲除或敲除基因或基因产物。
在一些实施方式中，所述自然杀伤细胞不是基因工程化的。
E.扩增和刺激的NK细胞的特性
在体外扩增和刺激后，例如，如本文所述，扩增和刺激的NK细胞群不仅具有不能在人体中自然发生的数量/密度(例如，如上所述)，而且它们的表型特征也与起始原料和其他天然存在的NK细胞群不同(例如基因表达和/或表面蛋白表达)。
在某些情况下，所述起始NK细胞源是来源于单个个体的样本，例如，尚未体外扩增的单个脐血单位。因此，在某些情况下，扩增和刺激的NK细胞共享一个共同的谱系，即它们都是由起始NK细胞源的扩增产生的，因此，通过细胞群体的克隆扩增共享基因型，这些细胞本身来自单个生物体。然而，它们不能自然发生以体外扩增达到的密度，并且在表型特征上也与起始NK细胞来源不同。
在一些情况下，所述扩增和刺激的NK细胞群体包括至少1亿个扩增的自然杀伤细胞，例如2亿、2.5亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、7.5亿、8亿、9亿、10亿、20亿、30亿、40亿、50亿、60亿、70亿、80亿、90亿、100亿、150亿，200亿、250亿、500亿、750亿、800亿、90亿、1000亿、2000亿、2500亿、3000亿、4000亿、5000亿、6000亿、7000亿、8000亿、9000亿、1万亿、2万亿、3万亿、4万亿、5万亿、6万亿、7万亿、8万亿、9万亿或10万亿扩增的自然杀伤细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞包含至少80％，例如至少90％、至少95％、至少99％或100％的CD56+CD3-细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞不是基因工程化的。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞不包含CD16转基因。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞不表达外源性CD16蛋白。
所述扩增和刺激的NK细胞可以通过表面表达来表征，例如CD16、CD56、CD3、CD38、CD14、CD19、NKG2D、NKp46、NKp30、DNAM-1和NKp44中的一种或多种。
在某些情况下，本文所述的表面蛋白表达水平是在没有对参考的特定表面蛋白进行阳性选择的情况下实现的。例如，在一些情况下，所述NK细胞源，例如单个单元脐带，包括KIR受体家族的KIR B等位基因和CD16的158V/V变体，并且是+富集的和CD3(+)缺失的，例如通过门控CD56+CD3-表达，但在扩增和刺激期间不进行其他表面蛋白表达选择。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含至少60％，例如，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％的NKG2D+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含至少60％，例如，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％的NKp46+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含至少60％，例如，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％的NKp30+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含至少60％，例如，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％的DNAM-1+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含至少60％，例如，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％的NKp44+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含至少60％，例如，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少99％，或100％的CD94+(KLRD1)细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含小于或等于20％，例如小于或等于10％，小于或等于5％，小于或相等1％或0％的CD3+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含小于或等于20％，例如小于或等于10％，小于或等于5％，小于或相等1％或0％的CD14+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含小于或等于20％，例如小于或等于10％，小于或等于5％，小于或相等1％或0％的CD19+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含小于或等于20％，例如小于或等于10％，小于或等于5％，小于或相等1％或0％的CXCR3+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含小于或等于20％，例如小于或等于10％，小于或等于5％，小于或相等1％或0％的CD122+(IL2RB)细胞。
如本文所述，发明人已经证明，令人惊讶的是，通过本文所述方法扩增和刺激的NK细胞在整个扩增和刺激过程中以高水平表达CD16，导致具有高CD16表达的细胞群体。CD16的高表达消除了工程化扩增细胞以表达CD16的需要，这对于启动ADCC是重要的，因此，本文所述的扩增和刺激方法具有令人惊讶和意想不到的益处。因此，在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如如上所述，包含50％或更多，例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CD16+NK细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如如上所述，包含KIR受体家族的KIR B等位基因和CD16的158V/V变体，和包含50％或更多，例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CD16+NK细胞。
在一些实施方式中，所述表达CD16扩增和刺激的NK细胞的百分比，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，与来自脐带血的种子细胞中的自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
在一些实施方式中，所述表达NKG2D扩增和刺激的NK细胞的百分比，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，与来自脐带血的种子细胞中的自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
在一些实施方式中，所述表达NKp30扩增和刺激的NK细胞的百分比，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，与来自脐带血的种子细胞中的自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
在一些实施方式中，所述表达DNAM-1扩增和刺激的NK细胞的百分比，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，与来自脐带血的种子细胞中的自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
在一些实施方式中，所述表达NKp44扩增和刺激的NK细胞的百分比，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，与来自脐带血的种子细胞中的自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
在一些实施方式中，所述表达NKp46扩增和刺激的NK细胞的百分比，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，与来自脐带血的种子细胞中的自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
如本文所述，发明人还证明，令人惊讶的是，通过本文所述方法扩增和刺激的NK细胞以低水平表达CD38。CD38是某些癌症治疗(例如多发性骨髓瘤和急性髓细胞白血病)的有效靶点。例如，见焦等人，“CD38：多发性骨髓瘤的靶向治疗和实体癌的治疗潜力”，《研究药物专家意见》29(11)：1295-1308(2020)。然而，当抗CD38抗体与NK细胞一起施用时，由于NK细胞自然表达CD38，它们存在自相残杀增加的风险。然而，通过本文所述方法扩增和刺激的NK细胞表达低水平的CD38，因此克服了可预期的自相残杀。虽然其他小组已经求助于工程化方法，如基因组编辑来减少CD38的表达(见，例如，Gurney等人，“表达亲和性优化的CD38嵌合抗原受体的CD38敲除自然杀伤细胞成功靶向具有减少效应细胞自相残杀的急性髓性白血病”，《血液学》(Haemologica)doi:10.3324/haematol.200.271908(2020)，通过本文所述方法扩增和刺激表达低水平的CD38的NK细胞，不需要基因工程，这提供了令人惊讶和意想不到的益处，例如，用本文所述扩增和刺激过的NK细胞治疗CD38+癌症，例如，与CD38抗体组合。
因此，在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如，来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含小于或等于80％的CD38+细胞，例如小于或等于75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的CD34+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包括KIR受体家族的KIR B等位基因和CD16的158V/V变体，并且包括小于或等于80％的CD38+细胞，例如小于或等于75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％，或20％CD38+细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包含KIR受体家族的KIR B等位基因和CD16的158V/V变体，并且包含小于或等于80％的CD38+细胞，例如小于或等于75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、，或20％的CD38+细胞，以及50％或更多，例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CD16+NK细胞。
在一些实施方式中，所述扩增和刺激的NK细胞，例如来自单个脐带血单位的扩增和刺激，例如，如上所述，包括KIR受体家族的KIR B等位基因和CD16的158V/V变体，并且包括：i)50％或更多，例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的CD16+NK细胞；和/或ii)小于或等于80％的CD38+细胞，例如，小于或等于75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的CD38+细胞；和/或iii)至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的NKG2D+细胞；和/或iv)至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的NKp46+细胞；和/或v)至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％、或100％NKp30+细胞；和/或vi)至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的DNAM-1+细胞；和/或vii)至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的NKp44+细胞；和/或viii)至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的CD94+(KLRD1)细胞；和/或ix)小于或等于20％，例如小于或等于10％，小于或等于5％、小于或等于1％或0％CD3+细胞；和/或x)小于或等于20％，例如小于或等于10％、小于或等于5％、小于或等于1％或0％CD14+细胞；和/或xi)小于或等于20％，例如，小于或等于10％、小于或等于5％、小于或大于1％或0％的CD19+细胞；和/或xii)小于或等于20％，例如小于或等于10％、小于或等于5％、小于或等于1％或0％CXCR+细胞；和/或xiii)小于或等于20％，例如小于或等于10％、小于或等于5％、小于或等于1％或0％CD122+(IL2RB)细胞。
在一些实施方式中，饲养细胞不存在于扩增和刺激的NK细胞中，然而，饲养细胞的残留特征可以通过例如残留细胞的存在(例如，通过检测具有特定表面蛋白表达的细胞)或由饲养细胞表达的残留核酸和/或蛋白质来检测。
例如，在一些情况下，本文所述的方法包括使用工程化饲养细胞扩增和刺激自然杀伤细胞，例如上述eHuT-78饲养细胞，其被工程化以表达自然杀伤细胞源(包括自然杀伤细胞)中的细胞不表达的序列。例如，所述工程化饲养细胞可被工程化以表达至少一种选自4-1BBL(UniProtKB P41273，SEQ ID NO:1)、膜结合IL-21(SEQ ID NO:2)和突变体TNFalpha(SEQ ID NO:3)(“eHut-78细胞”)或其变体的基因。
虽然这些饲养细胞可能不会在扩增和刺激的NK细胞中持续存在，但所述扩增和刺激的NK细胞可能保留可检测到的来自饲养细胞的细胞、蛋白质和/或核酸的残余量。因此，它们在扩增和刺激的NK细胞中的残留存在可以通过例如检测细胞本身(例如，通过流式细胞术)、它们表达的蛋白质和/或它们表达的核酸来检测。
因此，本文还描述了扩增和刺激的NK细胞群体，其包括残余的饲养细胞(活细胞或死细胞)或残余的饲养细胞细胞杂质(例如，残余的饲养单元蛋白质或其部分，和/或遗传物质，如核酸或其部分)。在一些情况下，所述扩增和刺激的NK细胞包含大于0％但0.3％或更少的残余饲养细胞，例如eHuT-78饲养细胞。
在一些情况下，所述扩增和刺激的NK细胞包含残余的饲养细胞核酸，例如编码残余的4-1BBL(UniProtKB P41273，SEQ ID NO:1)、膜结合的IL-21(SEQ ID NO:2)和/或突变体TNFalpha(SEQ ID NO:3)或其部分的核酸。在一些情况下，膜结合的IL-21包含CD8跨膜结构域。
在一些情况下，所述扩增和刺激的NK细胞包含大于0％且小于或等于0.2％的a％残余饲养细胞，例如通过样品中饲养细胞特异性蛋白质或核酸序列(即自然杀伤细胞所不表达的蛋白质或核酸序列)的相对比例来测量。例如，通过qPCR，例如，如本文所述。
在一些实施方式中，所述残余的饲养细胞是CD4(+)T细胞。在一些实施方式中，所述残余饲养细胞是工程化的CD4(+)T细胞。在一些实施方式中，所述残余饲养细胞被工程化以表达选自4-1BBL(UniProtKB P41273，SEQ ID NO:1)、膜结合的IL-21(SEQ ID NO:2)和突变体TNFalpha(SEQ ID NO：3)(“eHut-78细胞”)或其变体的至少一种基因。因此，在一些情况下，所述饲养细胞特异性蛋白是4-1BBL(UniProtKB P41273，SEQ ID NO:1)、膜结合的IL-21(SEQ ID NO:2)和/或突变体TNFalpha(SEQ ID NO:3)。因此，饲养细胞特异性核酸是编码4-1BBL(UniProtKB P41273，SEQ ID NO:1)、膜结合的IL-21(SEQ ID NO:2)和/或突变体TNFalpha(SEQ ID NO:3)或其部分的核酸。在一些情况下，所述膜结合的IL-21包含CD8跨膜结构域。
可以使用多种不同的方法来分析和检测生物样品中核酸或蛋白质基因产物的存在。如本文所用，“检测”可以指用于发现、确定或确认化合物和/或物质(例如细胞、蛋白质和/或核酸)的存在或存在的方法。在一些实施方式中，可以使用检测方法来检测蛋白质。在一些实施方式中，检测可以包括化学发光或荧光技术。在一些实施方式中，检测可以包括基于免疫学的方法(例如，定量酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹或点印迹)，其中抗体用于与整个蛋白质或蛋白质的特定表位特异性反应。在一些实施方式中，检测可以包括蛋白质的免疫沉淀(6月gblut等人，《生物技术杂志》31；41(2-3):111-20(1995)；Franco等人，《欧洲形态学杂志》39(1):3-25(2001))。在一些实施方式中，检测方法可用于检测核酸(例如，DNA和/或RNA)。在一些实施方式中，检测可以包括Northern印迹分析、核酸酶保护测定(NPA)、原位杂交或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)(Raj等人，《自然方法》5877-879(2008)；金等，《临床实验室分析杂志》11(1)：2-9(1997)；Ahmed，《环境科学与健康杂志》，《环境致癌生态毒理学》，第20版(2)：77-116(2002))。
因此，本文也描述了检测扩增和刺激的NK细胞群体的方法，例如，使用本文所述方法扩增和刺激，其已经与工程化饲养细胞(例如，本文所述的eHuT-78饲养细胞)共培养。
II.自然杀伤细胞工程化
在一些实施方式中，所述天然杀伤细胞被工程化，例如产生CAR-NK和/或表达IL-15的NK。
在一些实施方式中，所述天然杀伤细胞在扩增和刺激(例如本文所述的扩增和刺激)期间被工程化，例如转导。在一些实施方式中，在扩增和刺激期间对所述自然杀伤细胞进行工程化，例如，如本文所述在MCB的生产期间。在一些实施方式中，在扩增和刺激期间对自然杀伤细胞进行工程化，例如，如上所述，在生产适合用于注射制剂的NK细胞期间和/或在生产MCB期间。因此，在一些实施方式中，所述NK细胞是宿主细胞，并且本文提供的是表达异质蛋白质的NK宿主细胞，例如，如本文所述。
在一些实施方式中，在扩增和刺激之前对所述自然杀伤细胞进行工程化。在一些实施方式中，所述天然杀伤细胞在扩增和刺激后被工程化。
在一些实施方式中，通过用载体转导来改造所述NK细胞。本文描述了合适的载体，例如慢病毒载体，例如包含异源蛋白的慢病毒载体，例如如本文所述。在一些实施方式中，如本文所述，所述NK细胞在第一MCB的生产过程中被转导。
在一些实施方式中，所述NK细胞在每细胞从或从约1至或至约40个病毒颗粒的多重感染下转导。在一些实施方式中，在每细胞1个或约1个、5个或约5个、10个或约10个、15个或约15个、20个或约20个、25个或约25个、30个或约30个、35个或约35个或40个或约40个病毒颗粒的多重感染下转导NK细胞。
A.嵌合抗原受体
在一些实施方式中，所述异源蛋白是融合蛋白，例如，在扩增和刺激过程中，将包含嵌合抗原受体(CAR)的融合蛋白引入NK细胞。
在一些实施方式中，所述CAR包含信号序列、细胞外结构域、铰链、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号结构域序列中的一个或更多个。在一些实施例中，所述CAR进一步包括间隔物序列。
在一些实施方式中，所述CAR包括(从N-末端到C-末端)：信号序列、细胞外结构域、铰链、间隔区、跨膜结构域、第一信号结构域序列、第二信号结构域顺序和第三信号结构域序列。
在一些实施方式中，所述CAR包括(从N-末端到C-末端)：信号序列、细胞外结构域、铰链、跨膜结构域、第一信号结构域序列、第二信号结构域顺序和第三信号结构域序列。
在一些实施方式中，所述细胞外结构域包含抗体或其抗原结合部分。
在一些实施方式中，一个或多个细胞内信号结构域序列是CD28细胞内信号序列。在一些实施方式中，所述CD28细胞内信号序列包含SEQ ID NO:5或由SEQ ID NO:5组成。
在一些实施方式中，一个或多个细胞内信号传导结构域序列是OX40L信号序列。在一些实施方式中，所述OX40L信号序列包含SEQ ID NO:8或由SEQ ID NO:8组成。
在一些实施方式中，一个或多个细胞内信号序列是CD3ζ细胞内信号结构域序列。在一些实施方式中，所述CD3ζ细胞内信号序列由SEQ ID NO:11组成。
在一些实施方式中，所述CAR包含CD28细胞内信号序列(SEQ ID NO:5)、OX40L细胞内信号序列(SEQ ID NO:8)和CD3ζ细胞内信号序列(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方式中，所述CAR包含细胞内信号结构域序列，其包含或由SEQ ID NO:19组成。
在一些实施方式中，所述CAR不包含OX40L细胞内信号结构域序列。
在一些实施方式中，所述CAR包含CD28细胞内信号序列(SEQ ID NO:5)和CD3ζ细胞内信号序列(SEQ ID NO:11)，但不包含OX40L细胞内信号结构域序列。
B.IL-5
在一些实施方式中，所述NK细胞被工程化以表达IL-15，例如人IL-15(UniProtKB#P40933；NCBI基因ID#3600)，例如可溶性人IL-15或其直系同源物，或前述任一种的变体。在一些实施方式中，所述IL-15被表达为进一步包含切割位点的融合蛋白的一部分。在一些实施方式中，所述IL-15作为包含T2A核糖体跳跃序列位点(有时称为自切割位点)的多蛋白的一部分表达。
在一些实施方式中，所述IL-15包含或由SEQ ID NO:16组成。
在一些实施方式中，所述T2A切割位点包含或由SEQ ID NO:14组成。
在一些实施方式中，所述IL-15作为包含CAR的融合蛋白的一部分表达，例如本文所述的CAR。
在一些实施方式中，所述融合蛋白包含(从N-末端定向到C-末端)：包含切割位点的CAR和IL-15。
在一些实施方式中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:20。
C.抑制性受体
在一些实施方式中，所述NK细胞被工程化以改变，例如，减少一种或多种抑制剂受体基因的表达。
在一些实施方式中，所述抑制性受体基因是HLA特异性抑制性受体。在一些实施方式中，所述抑制性受体基因是非HLA特异性抑制性受体。
在一些实施方式中，所述抑制性受体基因选自下组：KIR、CD94/NKG2A、LILRB1、PD-1、IRp60、Siglec-7、LAIR-1及其组合。
D.多核酸、载体和宿主细胞
本文还提供了编码融合蛋白或其部分的多核苷酸，例如编码本文所述多肽的多核苷酸序列，如本文提供的序列表所示。
本文还提供了包含多核苷酸的载体和包含所述载体的细胞，例如NK细胞。
在一些实施方式中，所述载体是慢病毒载体。例如，参见Milone等人，“慢病毒载体的临床应用”，《白血病》32:1529-41(2018)。在一些实施方式中，所述载体是逆转录病毒载体。在一些实施方式中，所述载体是γ-逆转录病毒载体。在一些实施方式中，载体是非病毒载体，例如背负式非病毒载体(PB转座子，参见，例如，Wu等人，“与哺乳动物细胞中的睡美人、Tol2和Mos1相比，背负式是一种灵活且高活性的转座子”，PNAS103(41):15008-13(2006))，睡美人非病毒载体(SB转座子，参见例如Hudecek等人，“走向非病毒：睡美人转座子系统突破临床”，《生物化学和分子生物学评论》52(4)：355–380(2017))，或mRNA载体。
III.冷冻保存
A.冷冻保存组合物
本文提供了冷冻保存组合物，例如，适用于静脉内施用的冷冻保存组合物(例如，静脉内施用NK细胞，例如本文所述的NK细胞)。在一些实施方式中，药物组合物包括冷冻保存组合物和细胞，例如本文所述的NK细胞。
1.白蛋白
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含白蛋白，例如人白蛋白(UniProtKB登录号P0278，SEQ ID NO:21)或其变体。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含白蛋白的直系同源物，例如人白蛋白或其变体。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含白蛋白的生物活性部分或其变体，例如人白蛋白。
在一些实施方式中，所述白蛋白，例如人白蛋白，以溶液的形式提供，在本文中也称为白蛋白溶液或人白蛋白溶液。因此，在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物是或包括白蛋白溶液，例如人白蛋白溶液。在一些实施方式中，所述白蛋白溶液是无血清的白蛋白溶液。
在一些实施方式中，所述白蛋白溶液适合静脉内使用。
在一些实施方式中，所述白蛋白溶液包含从或从约40至或至约200g/L的白蛋白。在一些实施方式中，所述白蛋白溶液包含从或从约40至或至约50g/L的白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述白蛋白溶液包含约200g/L的白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述白蛋白溶液包括200g/L白蛋白，例如人白蛋白。
在一些实施方式中，所述白蛋白溶液包含蛋白质组合物，其中95％或更多是白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，96％、97％、98％或99％或更多的蛋白质是白蛋白，例如人白蛋白。
在一些实施方式中，所述白蛋白溶液进一步包含钠。在一些实施方式中，所述白蛋白溶液包含从或从约100至或至约200mmol的钠。在一些实施方式中，所述白蛋白溶液包含从或从或从约130至或至约160mmol的钠。
在一些实施方式中，所述白蛋白溶液进一步包含钾。在一些实施方式中，所述白蛋白溶液包含3mmol或更少的钾。在一些实施方式中，所述白蛋白溶液进一步包含2mmol或更少的钾。
在一些实施方式中，所述白蛋白溶液进一步包含一种或多种稳定剂。在一些实施方式中，所述稳定剂选自下组：辛酸钠、辛酸、(2S)-2-乙酰氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(也称为乙酰基色氨酸、N-乙酰基-L-色氨酸和乙酰基-L色氨酸)、2-乙酰氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(也称为N-乙酰色氨酸、DL-乙酰色氨酸和N-乙酰-DL-色氨酸)。在一些实施方式中，所述溶液中每克蛋白质包含小于.1mmol的一种或多种稳定剂。在一些实施方式中，所述溶液中每克蛋白质包含从或从约0.05至或至约0.1，例如从或从约0.064至或至约0.096mmol的每种稳定剂。在一些实施方式中，所述溶液中每克蛋白质包含小于0.1mmol的总稳定剂。在一些实施方式中，所述溶液中每克蛋白质包含从或从约0.05至或至约0.1，例如从或从约0.064至或至约0.096mmol的总稳定剂。
在一些实施方式中，所述白蛋白溶液由蛋白质组合物组成，其中95％或更多是白蛋白、钠、钾和一种或多种稳定剂，所述稳定剂选自辛酸钠、辛酸、(2S)-2-乙酰氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(也称为乙酰色氨酸、N-乙酰-L-色氨酸和乙酰-L-色氨酸)，2-乙酰氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(也称为N-乙酰色氨酸、DL-乙酰色氨酸和N-乙酰-DL-色氨酸)的水溶液。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含从或从约10％v/v至或至约50％v/v的白蛋白溶液，例如本文所述的白蛋白溶液。在一些实施方式中，冷冻保存组合物包括从或从约10％至或至约50％、从或从约10％至或至约45％、从或从约10％至或至约40％、从或从约10％至或至约35％、从或从约10％至或至约30％、从或从约10％至或至约25％、从或从约10％至或至约20％、从或从约10％至或至约15％、从或从约15％至或至约50％、从或从约15％至或至约45％、从或从约15％至或至约40％、从或从约15％至或至约35％、从或从约15％至或至约30％、从或从约15％至或至约25％、从或从约15％至或至约20％、从或从约20％至或至约50％、从或从约20％至或至约45％、从或从约20％至或至约40％、从或从约20％至或至约35％、从或从约20％至或至约30％、从或从约20％至或至约25％、从或从约25％至或至约50％、从或从约25％至或至约45％、从或从约25％至或至约40％、从或从约25％至或至约35％、从或从约25％至或至约30％、从或从约30％至或至约50％、从或从约30％至或至约45％、从或从约30％至或至约40％、从或从约30％至或至约35％、从或从约35％至或至约50％、从或从约35％至或至约45％、从或从约35％至或至约40％、从或从约40％至或至约50％、从或从约40％至或至约45％、或从或从约45％至或至约50％v/v的本文所述的白蛋白溶液。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含本文所述的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％v/v的白蛋白溶液。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含从或从约20至或至约100g/L的白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括从或从约20至或至约100、从或从约20至或至约90、从或从约20至或至约80、从或从约20至或至约70、从或从约20至或至约60、从或从约20至或至约50、从或从约20至或至约40、从或从约20至或至约30、从或从约30至或至约100、从或从约30至或至约90、从或从约30至或至约80、从或从约30至或至约70、从或从约30至或至约60、从或从约30至或至约50、从或从约30至或至约40、从或从约40至或至约100、从或从约40至或至约90、从或从约40至或至约80、从或从约40至或至约70、从或从约40至或至约60、从或从约40至或至约50、从或从约50至或至约100、从或从约50至或至约90、从或从约50至或至约80、从或从约50至或至约70、从或从约50至或至约60、从或从约60至或至约100、从或从约60至或至约90、从或从约60至或至约80、从或从约60至或至约70、从或从约70至或至约100、从或从约70至或至约90、从或从约70至或至约80、从或从约80至或至约100、从或从约80至或至约90、或从或从约90至或至约100g/L的白蛋白，例如人白蛋白。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含20g/L白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含40g/L白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含70g/L白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含100g/L白蛋白，例如人白蛋白。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约20g/L的白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约40g/L的白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约70g/L白蛋白，例如人白蛋白。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约100g/L的白蛋白，例如人白蛋白。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物还包括稳定剂，例如白蛋白稳定剂。在一些实施方式中，所述稳定剂选自下组：辛酸钠、辛酸、(2S)-2-乙酰氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(也称为乙酰基色氨酸、N-乙酰基-L-色氨酸和乙酰基-L色氨酸)、2-乙酰氨基-3-(1H-吲哚-3-基)丙酸(也称为N-乙酰色氨酸、DL-乙酰色氨酸和N-乙酰-DL-色氨酸)。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物在组合物中每克蛋白质包含小于.1mmol的一种或多种稳定剂，例如每克白蛋白蛋白质。在一些实施方式中，例如组合物中每克蛋白质，所述冷冻保存组合物包含从或从约0.05至或至约0.1，例如约0.064至约0.096mmol的每种稳定剂每克蛋白质。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含每克蛋白质小于0.1mmol的总稳定剂，例如冷冻保存组合物中的每克白蛋白。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物在冷冻保存组合物中每克蛋白质包含从或从约0.05至或至约0.1，例如从或从约0.064至或至约0.096mmol的总稳定剂，例如每克白蛋白蛋白质。
2.葡聚糖
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含葡聚糖或其衍生物。
葡聚糖是一种葡糖酐的聚合物，由大约95％的α-D-(1-6)键(命名为(C6H10O5)n)组成。葡聚糖分数以约1000道尔顿至约2000000道尔顿的分子量提供。它们由数字(葡聚糖X)表示，例如葡聚糖1、葡聚糖10、葡聚糖40、葡聚糖70等，其中X对应于平均分子量除以1000道尔顿。因此，例如，葡聚糖40的平均分子量为或约为40000道尔顿。
在一些实施方式中，所述葡聚糖的平均分子量为从或从约1000道尔顿至或至约2000000道尔顿。在一些实施方式中，所述葡聚糖的平均分子量为或为约40000道尔顿。在一些实施方式中，所述葡聚糖的平均分子量为或为约70000道尔顿。
在一些实施方式中，所述葡聚糖选自下组：葡聚糖40、葡聚糖70及其组合。在一些实施方式中，所述葡聚糖是葡聚糖40。
在一些实施方式中，所述葡聚糖，例如葡聚糖40，以溶液的形式提供，在本文中也称为葡聚糖溶液或葡聚糖40溶液。因此，在一些实施方式中，所述组合物包括葡聚糖溶液，例如葡聚糖40溶液。
在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液适合静脉内使用。
在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含约5％至约50％w/w的葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包括从或从约5％至或至约50％、从或从约5％至或至约45％、从或从约5％至或至约40％、从或从约5％至或至约35％、从或从约5％至或至约30％、从或从约5％至或至约25％、从或从约5％至或至约20％、从或从约5％至或至约15％、从或从约5％至或至约10％、从或从约10％至或至约50％、从或从约10％至或至约45％、从或从约10％至或至约40％、从或从约10％至或至约35％、从或从约10％至或至约30％、从或从约10％至或至约25％、从或从约10％至或至约20％、从或从约10％至或至约15％、从或从约15％至或至约50％、从或从约15％至或至约45％、从或从约15％至或至约40％、从或从约15％至或至约35％、从或从约15％至或至约30％、从或从约15％至或至约25％、从或从约15％至或至约20％、从或从约20％至或至约50％、从或从约20％至或至约45％、从或从约20％至或至约40％、从或从约20％至或至约35％、从或从约20％至或至约30％、从或从约20％至或至约25％、从或从约25％至或至约50％、从或从约25％至或至约45％、从或从约25％至或至约40％、从或从约25％至或至约35％、从或从约25％至或至约30％、从或从约30％至或至约50％、从或从约30％至或至约45％、从或从约30％至或至约40％、从或从约30％至或至约35％、从或从约35％至或至约50％、从或从约35％至或至约45％、从或从约35％至或至约40％、从或从约40％至或至约50％、从或从约40％至或至约45％、或从或从约45％至或至约50％w/w葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％w/w的葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％w/w的葡聚糖，例如葡聚糖40。
在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含从或从约25g/L至或至约200g/L的葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包括从或从约35至或至约200、从或从约25至或至约175、从或从约25至或至约150、从或从约25至或至约125、从或从约25至或至约100、从或从约25至或至约75、从或从约25至或至约50、从或从约50至或至约200、从或从约50至或至约175、从或从约50至或至约150、从或从约50至或至约125、从或从约50至或至约100、从或从约50至或至约75、从或从约75至或至约200、从或从约75至或至约175、从或从约75至或至约150、从或从约75至或至约125、从或从约75至或至约100、从或从约100至或至约200、从或从约100至或至约175、从或从约100至或至约150、从或从约100至或至约125、从或从约125至或至约200、从或从约125至或至约175、从或从约125至或至约150、从或从约150至或至约200、从或从约150至或至约175、或从或从约175至或至约200g/L葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含25、50、75、100、125、150、175或200g/L的葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含100g/L葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含约25、约50、约75、约100、约125、约150、约175或约200g/L的葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含约100g/L葡聚糖，例如葡聚糖40。
在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液进一步包含葡萄糖(也称为右旋糖)。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含从或从约10g/L至或至约100g/L的葡萄糖。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包括从或从约10至或至约100、从或从约10至或至约90、从或从约10至或至约80、从或从约10至或至约70、从或从约10至或至约60、从或从约10至或至约50、从或从约10至或至约40、从或从约10至或至约30、从或从约10至或至约20、从或从约20至或至约100、从或从约20至或至约90、从或从约20至或至约80、从或从约20至或至约70、从或从约20至或至约60、从或从约20至或至约50、从或从约20至或至约40、从或从约20至或至约30、从或从约30至或至约100、从或从约30至或至约90、从或从约30至或至约80、从或从约30至或至约70、从或从约30至或至约60、从或从约30至或至约50、从或从约30至或至约40、从或从约40至或至约100、从或从约40至或至约90、从或从约40至或至约80、从或从约40至或至约70、从或从约40至或至约60、从或从约40至或至约50、从或从约50至或至约100、从或从约50至或至约90、从或从约50至或至约80、从或从约50至或至约70、从或从约50至或至约60、从或从约60至或至约100、从或从约60至或至约90、从或从约60至或至约80、从或从约60至或至约70、从或从约70至或至约100、从或从约70至或至约90、从或从约70至或至约80、从或从约80至或至约90、从或从约80至或至约100、从或从约80至或至约90、或从或从约90至或至约100g/L葡萄糖。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含10、20、30、40、50、60、70、80、90或100g/L葡萄糖。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含50g/L葡萄糖。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90或约100g/L葡萄糖。在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液包含50g/L葡萄糖。
在一些实施方式中，所述葡聚糖溶液由右旋糖酐(例如右旋糖烷40)和水中的葡萄糖组成。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含从或从约10％v/v至或至约50％v/v的本文所述的葡聚糖溶液。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括从或从约10％to50％、从或从约10％至或至约45％、从或从约10％至或至约40％、从或从约10％至或至约35％、从或从约10％至或至约30％、从或从约10％至或至约25％、从或从约10％至或至约20％、从或从约10％至或至约15％、从或从约15％至或至约50％、从或从约15％至或至约45％、从或从约15％至或至约40％、从或从约15％至或至约35％、从或从约15％至或至约30％、从或从约15％至或至约25％、从或从约15％至或至约20％、从或从约20％至或至约50％、从或从约20％至或至约45％、从或从约20％至或至约40％、从或从约20％至或至约35％、从或从约20％至或至约30％、从或从约20％至或至约25％、从或从约25％至或至约50％、从或从约25％至或至约45％、从或从约25％至或至约40％、从或从约25％至或至约35％、从或从约25％至或至约30％、从或从约30％至或至约50％、从或从约30％至或至约45％、从或从约30％至或至约40％、从或从约30％至或至约35％、从或从约35％至或至约50％、从或从约35％至或至约45％、从或从约35％至或至约40％、从或从约40％至或至约50％、从或从约40％至或至约45％、或从或从约45％至或至约50％v/v的葡聚糖溶液，例如本文所述的葡聚糖溶液。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％v/v的葡聚糖溶液，例如本文所述的葡聚糖溶液。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％v/v的葡聚糖溶液，例如本文所述的葡聚糖溶液。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含从或从约10至或至约50g/L的葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括从或从约10至或至约50、从或从约10至或至约45、从或从约10至或至约40、从或从约10至或至约35、从或从约10至或至约30、从或从约10至或至约25、从或从约10至或至约20、从或从约10至或至约15、从或从约15至或至约50、从或从约15至或至约45、从或从约15至或至约40、从或从约15至或至约35、从或从约15至或至约30、从或从约15至或至约25、从或从约15至或至约20、从或从约20至或至约50、从或从约20至或至约45、从或从约20至或至约40、从或从约20至或至约30、从或从约20至或至约25、从或从约25至或至约50、从或从约25至或至约45、从或从约25至或至约40、从或从约25至或至约35、从或从约25至或至约30、从或从约30至或至约50、从或从约30至或至约45、从或从约30至或至约40、从或从约30至或至约35、从或从约35至或至约50、从或从约35至或至约45、从或从约35至或至约40、从或从约40至或至约50、从或从约40至或至约45、或从或从约45至或至约50g/L葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含10、15、20、25、30、30、35、40、45或50g/L葡聚糖，例如葡聚糖40。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约10、约15、约20、约25、约30、约30，约35、约40、约45或约50g/L葡聚糖，例如葡聚糖40。
3.葡萄糖
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括葡萄糖。
在一些实施方式中，如上所述，所述冷冻保存组合物包括含有葡萄糖的葡聚糖溶液。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含无葡萄糖的葡聚糖溶液。在一些实施方式中，例如，当葡聚糖溶液不包含葡萄糖时，将葡萄糖单独添加到所述冷冻保存组合物中。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含从或从约5至或至约25g/L的葡萄糖。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括从或从约5至或至约25、从或从约5至或至约20、从或从约5至或至约15、从或从约5至或至约10、从或从约10至或至约25、从或从约10至或至约20、从或从约10至或至约15、从或从约15至或至约25、从或从约15至或至约20、或从或从约20至或至约25g/L葡萄糖。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含5、7.5、10、12.5、15、17.5、20、22.5或25g/L葡萄糖。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含12.5g/L葡萄糖。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约5、约7.5、约10、约12.5、约15、约17.5、约20、约22.5或约25g/L的葡萄糖。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约12.5g/L的葡萄糖。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含小于2.75％w/v的葡萄糖。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含小于27.5g/L的葡萄糖。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含小于2％w/v的葡萄糖。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含小于1.5％w/v的葡萄糖。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约1.25％w/v或更少的葡萄糖。
4.二甲基亚砜
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括二甲基亚砜(DMSO，也称为甲基亚砜和甲基亚磺酰基甲烷)。
在一些实施方式中，所述DMSO以溶液的形式提供，在本文中也称为DMSO溶液。因此，在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括DMSO溶液。
在一些实施方式中，所述DMSO溶液适合静脉注射使用。
在一些实施方式中，所述DMSO溶液包含1.1g/mL DMSO。在一些实施方式中，所述DMSO溶液包含约1.1g/mL DMSO。
在一些实施方式中，冷冻保存组合物包含从或从约1％至或至约10％v/v的DMSO溶液。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括从或从约1％至或至约10％、从或从约1％至或至约9％、从或从约1％至或至约8％、从或从约1％至或至约7％、从或从约1％至或至约6％、从或从约1％至或至约5％、从或从约1％至或至约4％、从或从约1％至或至约3％、从或从约1％至或至约2％、从或从约2％至或至约10％、从或从约2％至或至约9％、从或从约8％、从或从约2％至或至约7％、从或从约2％至或至约6％、从或从约2％至或至约5％、从或从约2％至或至约4％、从或从约2％至或至约3％、从或从约3％至或至约10％、从或从约3％至或至约9％、从或从约3％至或至约8％、从或从约3％至或至约7％、从或从约3％至或至约6％、从或从约3％至或至约5％、从或从约3％至或至约4％、从或从约4％至或至约10％、从或从约4％至或至约9％、从或从约4％至或至约8％、从或从约4％至或至约7％、从或从约4％至或至约6％、从或从约4％至或至约5％、从或从约5％至或至约10％、从或从约5％至或至约9％、从或从约5％至或至约8％、从或从约5％至或至约7％、从或从约5％至或至约6％、从或从约6％至或至约10％、从或从约6％至或至约9％、从或从约6％至或至约8％、从或从约6％至或至约7％、从或从约7％至或至约10％、从或从约7％至或至约9％、从或从约7％至或至约8％、从或从约8％至或至约10％、从或从约8％至或至约9％、或从或从约9％至或至约10％v/v的DMSO溶液。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％v/v的DMSO溶液。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含5％的DMSO溶液。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％v/v的DMSO溶液。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约5％的DMSO溶液。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含从或从约11至或至约110g/L的DMSO。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括从或从约11至或至约110、从或从约11至或至约99、从或从约11至或至约88、从或从约11至或至约77、从或从约11至或至约66、从或从约11至或至约55、从或从约11至或至约44、从或从约11至或至约33、从或从约11至或至约22、从或从约22至或至约110、从或从约22至或至约99、从或从约22至或至约88、从或从约22至或至约77、从或从约22至或至约77、从或从约22至或至约66、从或从约22至或至约55、从或从约22至或至约44、从或从约22至或至约33、从或从约33至或至约110、从或从约33至或至约99、从或从约33至或至约88、从或从约33至或至约77、从或从约33至或至约66、从或从约33至或至约55、从或从约33至或至约44、从或从约44至或至约110、从或从约44至或至约99、从或从约44至或至约88、从或从约44至或至约77、从或从约44至或至约66、从或从约44至或至约55、从或从约55至或至约110、从或从约55至或至约99、从或从约55至或至约88、从或从约55至或至约77、从或从约55至或至约66、从或从约66至或至约110、从或从约66至或至约99、从或从约66至或至约88、从或从约66至或至约77、从或从约77至或至约119、从或从约77至或至约88、从或从约88至或至约110、从或从约88至或至约99、或从或从约99至或至约110g/L的DMSO。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含11、22、33、44、55、66、77、88、99或110g/L DMSO。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含55g/L DMSO。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约11、约22、约33、约44、约55、约66、约77、约88、约99或约110g/LDMSO。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含约55g/L DMSO。
5.缓冲液
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括缓冲溶液，例如适用于静脉注射施用的缓冲溶液。
缓冲溶液包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格溶液、酪胺缓冲液、Hank平衡盐溶液、厄尔平衡盐溶液、盐水和Tris。
在一些实施方式中，所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
6.示例性冷冻保存组合物
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包含或由以下组成：1)白蛋白，例如人白蛋白，2)葡聚糖，例如葡聚糖40，3)DMSO，和4)缓冲溶液。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物进一步包含葡萄糖。在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物由1)白蛋白，例如人白蛋白，2)葡聚糖，例如葡聚糖40，3)葡萄糖，4)DMSO，和5)缓冲溶液组成。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物包括：1)本文所述的白蛋白溶液，2)本文所描述的葡聚糖溶液，3)本文所述的DMSO溶液，和4)缓冲溶液。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物由：1)本文所述的白蛋白溶液，2)本文所描述的葡聚糖溶液，3)本文所介绍的DMSO溶液，和4)缓冲溶液组成。
在一些实施方式中，所述冷冻保存组合物不包含细胞培养基。
在一个实施方案中，所述冷冻保存组合物包含或包含约40mg/mL人白蛋白、25mg/mL葡聚糖40、12.5mg/mL葡萄糖和55mg/mL DMSO。
在一个实施方案中，所述冷冻保存组合物包含或包含约40mg/mL人白蛋白、25mg/mL葡聚糖40、12.5mg/mL葡萄糖、55mg/mL DMSO和0.5mL/mL 100％磷酸盐缓冲盐水(PBS)或由约40mg/mL人白蛋白、25mg/mL葡聚糖40、12.5mg/mL葡萄糖、55mg/mL DMSO和0.5mL/mL100％磷酸盐缓冲盐水(PBS)组成或约组成。
在一个实施方案中，所述冷冻保存组合物包含或包含约32mg/mL人白蛋白、25mg/mL葡聚糖40、12.5mg/mL葡萄糖和55mg/mL DMSO。
在一个实施方案中，所述冷冻保存组合物包含或包含约32mg/mL人白蛋白、25mg/mL葡聚糖40、12.5mg/mL葡萄糖、55mg/mL DMSO和0.54mg/mL 100％磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或由或约由32mg/mL人白蛋白、25mg/mL葡聚糖40，12.5mg/mL葡萄糖，55mg/mL DMSO和0.54mg/mL 100％磷酸盐缓冲盐水(PBS)组成。
示例性的冻保存组合物如表3所示。
表3.示例性冷冻保存组合物
表4.示例性冷冻保存组合物#1
表5.示例性冷冻保存组合物#2
B.冷冻保存方法
本文所述的冷冻保存组合物可用于冷冻保存细胞，例如治疗性细胞，例如自然杀伤(NK)细胞，例如本文所述NK细胞。
在一些实施方式中，所述细胞是动物细胞。在一些实施方式中，所述细胞是人细胞。
在一些实施方式中，所述细胞是免疫细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞选自嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性白细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、B细胞、T细胞及其组合。
在一些实施方式中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，通过本文所述的方法扩增和刺激所述自然杀伤细胞。
在一些实施方式中，冷冻保存细胞包括：将细胞与本文所述的冷冻保存组合物或其组分混合以产生组合物，例如药物组合物；并冷冻混合物。
在一些实施方式中，冷冻保存细胞包括：将包含细胞的组合物与本文所述的冷冻保存组合物或其组分混合以制备组合物，例如药物组合物；并冷冻混合物。在一些实施方式中，所述包含细胞的组合物包含细胞和缓冲剂。本文描述了合适的缓冲液。
在一些实施方式中，冷冻保存细胞包括：将包含细胞和缓冲液(例如PBS)的组合物与包含白蛋白、葡聚糖和DMSO(例如本文所述)的组合物混合；并冷冻混合物。
在一些实施方式中，冷冻保存细胞包括：将包含细胞和缓冲液(例如PBS)的组合物与包含40mg/mL白蛋白(例如人白蛋白)、25mg/mL葡聚糖(例如葡聚糖40)、12.5mg/mL葡萄糖和55mg/mL DMSO的组合物1:1混合。
在一些实施方式中，所述包含细胞和缓冲液(例如PBS)的组合物包含从或从约2x107至或至约2x109个细胞/mL。在一些实施方式中，所述包含细胞和缓冲液(例如PBS)的组合物包含2x108个细胞/mL。在一些实施方式中，所述包含细胞和缓冲剂的组合物包含约2x108个细胞/mL，例如PBS。
在一些实施方式中，冷冻保存细胞包括混合：细胞、缓冲液，例如PBS、白蛋白，例如人白蛋白、葡聚糖，例如葡聚糖40，和DMSO；并冷冻混合物。
在一些实施方式中，混合物包含从或从约1x107至或至约1x109个细胞/mL。在一些实施方式中，所述混合物包括1x108个细胞/mL。在一些实施方式中，所述混合物包含约1x108个细胞/mL。
白蛋白、葡聚糖和DMSO的合适范围如上所述。
在一些实施方式中，所述组合物在-135℃或以下冷冻。
在一些实施方式中，所述组合物以受控速率冷冻。
IV.抗体
在一些实施方式中，所述HER2靶向抗体是选自表6的EGFR靶向抗体，或其组合。
表6.示例性HER2靶向抗体
在一些实施方式中，所述HER2靶向抗体选自下组：曲妥珠单抗(或其生物类似物)、玛格妥昔单抗(或其生物类似物)、帕妥株单抗(或其生物类似物)、曲妥珠单抗emtansine(或其生物类似物)、PF-05280014(或其生物类似物)、曲妥珠单抗-anns(或其生物类似物)、HLX02(或其生物类似物)、曲妥珠单抗-dkst(或其生物类似物)、赫维奇塔(或其生物类似物)、马吉妥昔单抗(或其生物类似物)、Hervycta(或其生物类似物)及其组合。
在一些实施方式中，所述HER2靶向抗体是曲妥珠单抗或其生物类似物。在一些实施方式中，所述HER2靶向抗体是曲妥珠单抗。
V.药物组合物
本文提供了包含本文所述的自然杀伤细胞和本文所述药物组合物的剂量单位的药物组合物。
在一些情况下，所述剂量单位包括1亿至15亿个细胞，例如1亿、2亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、11亿、12亿、13亿、14亿或15亿。
药物组合物通常包括药学上可接受的载体。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗延迟剂和吸收延迟剂等。
在一些实施方式中，所述药物组合物包括：a)本文所述的自然杀伤细胞；和b)冷冻保存组合物。
本文描述了合适的冷冻保存组合物。
在一些实施方式中，所述组合物被冷冻。在一些实施方式中，所述组合物已冷冻至少三个月，例如至少六个月、至少九个月、至少12个月、至少15个月、至少18个月、至少24个月或至少36个月。
在一些实施方式中，至少60％，例如，至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的自然杀伤细胞在解冻后是活的。
在一些实施方式中，所述药物组合物包括：a)本文所述的冷冻保存组合物；和b)治疗细胞。
在一些实施方式中，所述治疗细胞是动物细胞。在一些实施方式中，所述治疗细胞是人细胞。
在一些实施方式中，所述治疗细胞是免疫细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞选自嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、B细胞、T细胞及其组合。
在一些实施方式中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方式中，通过本文所述的方法扩增和刺激所述自然杀伤细胞。
在一些实施方式中，所述药物组合物还包括：c)缓冲溶液。本文描述了合适的缓冲溶液，例如用于冷冻保存组合物。
在一些实施方式中，所述药物组合物包含从或从约1x107至或至约1x109个细胞/mL。在一些实施方式中，所述药物组合物包含1x108个细胞/mL。在一些实施方式中，所述药物组合物包含约1x108个细胞/mL。
在一些实施方式中，所述药物组合物进一步包含抗体或其抗原结合片段，例如本文所述的抗体。
药物组合物通常配制成与其预期给药途径相容。给药途径的实例包括胃肠外给药，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(局部)、透粘膜和直肠给药。
配制合适的药物组合物的方法是本领域已知的，参见例如雷明顿：药学的科学与实践，第21版，2005；以及《药物与药物科学：一系列教科书和专著》系列中的书籍(纽约州德克尔)。例如，用于胃肠外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可包括以下成分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节。肠胃外制剂可以装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
适用于注射用途的药物组合物可包括无菌水溶液(水溶性)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，帕西帕尼，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的，并且应该是流动的，以便于注射。它在制造和储存条件下应该是稳定的，并且必须保存以防止细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的涂层、在分散的情况下通过保持所需的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌和抗真菌剂来预防微生物的活动，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、聚醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来实现，例如单硬脂酸铝和明胶。
无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物与上述一种或多种成分的组合加入适当的溶剂中，然后根据需要进行过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体包含碱性分散介质和上述所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分的粉末加上任何额外的所需成分。
VI.治疗方法
本文所述的NK细胞发现用于治疗癌症或其他增殖性疾病。
因此，本文还提供了治疗患有病症(例如，与癌症相关的病症，例如，HER2+癌症)的患者的方法，包括施用NK细胞，例如，本文所述的NK细胞，和HER2靶向抗体，例如，文中所述的抗体。
本文还提供了在需要的受试者中预防、减少和/或抑制其复发、生长、增殖、迁移和/或转移癌症细胞或癌症细胞群的方法，包括施用NK细胞，例如本文所述的NK细胞，和HER2靶向抗体，例如本文描述的抗体。
本文还提供了对需要的受试者增强、改善和/或增加对抗癌治疗的反应的方法，包括施用所述NK细胞(例如本文所述的NK细胞)和HER2靶向抗体(例如本文所述的抗体)。
本文还提供了在有需要的受试者中诱导免疫系统的方法，包括施用所述NK细胞(例如本文所述的NK细胞)和HER2靶向抗体(例如本文所述的抗体)。
本文所述的方法包括治疗与异常凋亡或分化过程相关的疾病的方法，例如细胞增殖性疾病或细胞分化性疾病，例如癌症，包括实体瘤和造血系统癌。通常，所述方法包括向需要或已确定需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的如本文所述的治疗。在一些实施方式中，所述方法包括施用治疗有效量的治疗，所述治疗包括NK细胞，例如本文所述的NK细胞，和XX靶向抗体，例如本文描述的抗体。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”和“处理”是指逆转、减轻、延迟发作或抑制与异常凋亡或分化过程相关的疾病的进展。例如，治疗可以导致肿瘤大小或生长速率的降低。施用治疗有效量的本文所述的用于治疗与异常凋亡或分化过程相关的病症的化合物将导致肿瘤大小的减小或降低生长速率、降低复发风险或频率、延迟复发、减少转移、增加存活率，和/或降低发病率和死亡率。在一些实施方式中，可以在出现一种或多种症状之后施用治疗。在其他实施方案中，可以在没有症状的情况下施用治疗。例如，可以在症状出现之前对易感个体进行治疗(例如，根据症状史和/或遗传或其他易感因素)。症状缓解后也可以继续治疗，例如预防或延迟复发。
如本文所用，术语“抑制”涉及癌症和/或癌症细胞增殖，是指通过细胞毒性、营养物消耗或诱导凋亡来抑制癌症细胞的生长、分裂、成熟或存活力，和/或单独或与其他癌症细胞一起导致癌症细胞死亡。
如本文所用，“延缓”疾病或病症或其一种或多种症状的发展是指延缓、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疾病、病症或其症状的发展。这种延迟可以是不同的时间长度，这取决于疾病史和/或正在接受治疗的受试者。如本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟实际上可以包括预防，因为受试者不会发展出疾病、病症或其症状。例如，与不使用该方法相比，“延迟”癌症发展的方法是一种在给定时间范围内降低疾病发展概率和/或在给定时间框架内减少疾病程度的方法。这种比较可以基于临床研究，使用具有统计学意义的受试者数量。
如本文所用，“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指一种预防疾病或病症发作的方案，从而使疾病的临床症状不会发展。因此，“预防”涉及在受试者中检测到疾病迹象之前和/或在疾病的某个阶段之前对受试者给予治疗(例如，对患有尚未转移的癌症的受试者施用治疗物质)。所述受试者可以是有疾病或病症发展风险的个体，或者有疾病进展的风险，例如癌症转移的个体。例如具有一种或多种已知与疾病或病症的发展或发作相关的风险因素的个体。例如，可能具有与癌症的发展或进展相关的突变的个体。此外，可以理解的是，预防可能不会导致对疾病或病症发作的完全保护。在某些情况下，预防包括降低患上疾病或病症的风险。所述降低风险可能不会完全消除发展为疾病或病症的风险。
“增加”或“增强”的量(例如，关于抗肿瘤反应，癌症细胞转移)是指1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40，或50倍或50倍以上(例如，100、500、1000倍)(包括1之间和1以上的所有整数和小数点，例如，2.1、2.2、2.3、2.4等)本文所述的量或水平。它还可以包括本文所述的量或水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％，或至少1000％的增加。
“减少”或“减少”的或“较少”的量(例如，肿瘤大小、癌症细胞增殖或生长)是指约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40，或50次或50次以上(例如100、500、1000次)(包括1之间和1以上的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)本文所述的量或水平。它还可以包括本文所述的量或水平的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少500％，或至少1000％的减少。
A.疾病
本文公开的方法和制造的组合物可用于靶向多种疾病，例如细胞增殖性疾病。本文方法的优点是将同种异源细胞与外源性抗体结合施用，以通过靶向外源性抗体特异性靶向增殖细胞。不同于先前疗法(例如化疗或放疗)，使用本文的方法和药物组合物，能够特异性靶向表现出有害增殖活性的细胞，潜在地不施用不加区别地影响增殖细胞的系统性药物或毒素。
细胞增殖性和/或分化性疾病的实例包括癌症，例如癌、肉瘤、转移性疾病或造血肿瘤性疾病，例如白血病。转移性肿瘤可由多种原发性肿瘤类型引起，包括但不限于前列腺、结肠、肺、乳腺和肝脏来源的肿瘤。
如本文所用，术语“癌症”、“过度增殖性”和“肿瘤性”是指具有自主生长能力的细胞，即以快速增殖细胞生长为特征的异常状态或病症。过度增殖性和肿瘤性疾病状态可归类为病理性，即表征或构成疾病状态，或可归类为非病理性，如偏离正常但与疾病状态无关。该术语旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不考虑组织病理学类型或侵袭性阶段。“病理性过度增殖”细胞发生在以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态。非病理性过度增殖细胞的实例包括与伤口修复相关的细胞的增殖。
术语“癌症”或“肿瘤”包括各种器官系统的恶性肿瘤，如影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠和泌尿生殖道的恶性肿瘤，以及腺癌，其包括大多数例如结肠癌、肾癌、前列腺癌症和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。
术语“癌”是公认的，指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑色素瘤。在一些实施方式中，所述疾病是肾癌或黑色素瘤。示例性癌包括由宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈部、结肠和卵巢组织形成的癌。所述术语还包括癌肉瘤，例如，包括由癌组织和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指来源于腺组织或肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌症。
术语“肉瘤”是技术领域内公认的，指的是间充质来源的恶性肿瘤。
增殖性疾病的其他例子包括造血肿瘤性疾病。如本文所用，术语“造血肿瘤性疾病”包括涉及造血来源的增生性/肿瘤性细胞的疾病，例如，由髓系、淋巴系或红系谱系或其前体细胞引起的疾病。优选地，所述疾病由低分化的急性白血病引起，例如红细胞白血病和急性巨核细胞白血病。其他示例性髓系疾病包括但不限于急性早幼粒细胞白血病(APML)、急性髓性白血病(AML)和慢性髓细胞白血病(CML)(综述于Vaickus，L.(1991)Crit Rev.inOncol/Hemotol。11:267-97)；淋巴系统恶性肿瘤包括但不限于包括B系ALL和T系ALL的急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、前淋巴细胞白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和原发性巨球蛋白血症(WM)。其他形式的恶性淋巴瘤包括但不限于非霍奇金淋巴瘤及其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病和Reed-Sternberg病。
在一些实施方式中，所述癌症选自下组：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌症、阑尾癌症、星形细胞瘤、典型的畸胎瘤/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、类癌、心脏肿瘤、髓母细胞瘤、生殖细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、宫颈癌、胆管癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性骨髓增生性肿瘤、结直肠癌、颅咽管癌、T细胞淋巴癌、导管原位癌、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌症、室管膜瘤、食管癌、癌症、嗅神经母细胞瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、眼癌(如眼内黑色素瘤或视网膜母细胞瘤)、输卵管癌症、骨纤维组织细胞瘤、骨肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养层疾病、毛细胞白血病、头颈癌、心脏肿瘤、肝癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、肾脏(肾细胞)癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、白血病、唇口癌症、肝癌、肺癌(如非小细胞肺癌癌症、小细胞肺癌癌症、胸肺母细胞瘤和气管支气管肿瘤)、淋巴瘤、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、间皮瘤、转移性癌症、转移性鳞状癌症、中线束癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样霉菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、鼻腔和副鼻窦癌症、鼻咽癌症、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、唇口癌、口咽癌、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌症、胰腺神经内分泌瘤、乳头瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌症、甲状旁腺癌症、阴茎癌、鼻咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、妊娠和乳腺癌症、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发期腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、复发性癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(例如，儿童横纹肌肉瘤、儿童血管肿瘤、尤文肉瘤、卡波西肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤)、Sezary综合征、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌症、胃癌、T细胞淋巴瘤、睾丸癌症、喉咙癌症、鼻咽癌症、口咽癌症，下咽癌症、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌症、气管支气管肿瘤、肾盂和输尿管的移行细胞癌症、尿道癌症、子宫癌症、子宫肉瘤、阴道癌症、血管肿瘤、外阴癌症和威尔姆斯肿瘤。
在一些实施方式中，所述癌症是实体瘤。
在一些实施方式中，所述癌症是转移性的。
在一些实施方式中，所述癌症是HER2+癌症。
在一些实施方式中，所述HER2+癌症选自下组：膀胱癌症、乳腺腺癌、结肠腺癌、非小细胞肺癌、食管癌、宫颈鳞状癌、胃腺癌、胆管癌、卵巢癌症、肾乳头状细胞癌及其组合。
在一些实施方式中，所述HER2+癌症选自癌症乳腺癌、癌症胃癌和卵巢癌。
在一些实施方式中，所述HER2+癌症是癌症乳腺癌。在一些实施方式中，所述HER2+癌症是胃癌症。在一些实施方式中，所述HER2+癌症是卵巢癌症。
B.患者
适用于本文的组合物和方法的患者包括患有、诊断患有或怀疑患有细胞增殖性和/或分化性疾病，例如癌症。接受本文公开的技术的患者通常对本文的方法和组合物反应更好，部分原因是药物组合物是异基因的并且是由抗体鉴定的靶细胞，而不是通常靶向增殖细胞。因此，脱靶影响较小，患者更有可能在没有实质性有害脱靶影响的情况下完成治疗方案。
在一些实施方式中，本文提供的所述治疗方法可用于治疗被诊断患有或怀疑患有细胞增殖性和/或分化性疾病(例如癌症)的受试者(例如，人、猴、狗、猫、小鼠)。在一些实施方式中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述受试者是人。
如本文所用，所述受试者是指哺乳动物，包括例如人类。
在一些实施方式中，所述哺乳动物选自下组：犰狳、驴、蝙蝠、熊、海狸、猫、黑猩猩、牛、郊狼、鹿、狗、海豚、大象、狐狸、熊猫、长臂猿、长颈鹿、山羊、地鼠、刺猬、河马、马、座头鲸、美洲豹、袋鼠、考拉、豹子、狮子、美洲驼、猞猁、鼹鼠、猴子，老鼠、独角鲸、猩猩、虎鲸、水獭、牛、猪、北极熊、豪猪、美洲狮、兔子、浣熊、老鼠、犀牛、绵羊、松鼠、老虎、海象、黄鼠狼、斑马、山羊、马及其组合。
在一些实施方式中，所述哺乳动物是人类。
受试者，例如，所述人类受试者可以是儿童，例如，从或从约0岁至或至约14岁。所述受试者可以是青年，例如从或从约15岁至或至约24岁。所述受试者可以是成年人，例如年龄为从或从约25岁至或至约64岁。所述受试者可以是老年人，例如65岁以上。
在一些实施方式中，所述受试者可以是表现出与细胞增殖性和/或分化性疾病相关的一种或多种症状的人，例如癌症，例如肿瘤。本文提供的任何治疗方法可用于治疗处于不同阶段的癌症。举例来说，所述癌症阶段包括但不限于早期、晚期、局部晚期、缓解、难治性、缓解后复发和进行性。在一些实施方式中，所述受试者处于癌症的早期阶段。在其他实施方案中，所述受试者处于癌症的晚期。在各种实施方案中，所述受试者具有癌症I期、II期、III期或IV期。本文所述的治疗方法可以促进肿瘤的减少或回缩，减少或抑制肿瘤生长或癌症细胞增殖，和/或诱导、增加或促进肿瘤细胞杀伤。在一些实施方式中，所述受试者处于癌症缓解期。本文所述的治疗方法可以预防或延迟癌症的转移或复发。
在一些实施方式中，所述受试者有风险、或在遗传上或以其他方式易患(例如，风险因素)细胞增殖性和/或分化性疾病，例如癌症，该疾病已被诊断或未被诊断。
如本文所用，“有风险”个体是指有发展待治疗疾病的风险的个体，例如细胞增殖性和/或分化性疾病，例如癌症。一般来说，“有风险”的受试者可能患有或可能没有可检测的疾病，并且可能在本文所述的治疗方法之前表现出或可能没有表现出可检测疾病。“有风险”是指个体具有一个或多个所谓的风险因素，这些风险因素是与疾病或病症的发展相关的可测量参数，并且是本领域已知的。例如，例如，风险受试者可能有一个或多个风险因素，这些风险因素是与癌症发展相关的可测量参数。具有一个或多个这些风险因素的受试者比没有这些风险因素的个体患癌症的概率更高。一般来说，风险因素可能包括，例如，年龄、性别、种族、饮食、既往病史、前驱疾病的存在、遗传(如遗传)因素和环境暴露。在一些实施方式中，所述癌症风险受试者包括，例如，具有经历过该疾病的亲属的受试者，以及通过分析遗传或生物化学标志物来确定其风险的受试人。
此外，所述受试者可能正在接受一种或多种标准疗法，如化疗、放疗、免疫疗法、手术或其组合。因此，一种或多种激酶抑制剂可以在化疗、放疗、免疫疗法、手术或其组合给药之前、期间或之后施用。
在一些实施方案中，所述受试者可以是(i)对至少一种化学疗法基本上难治的人，或(ii)在化学疗法治疗后复发的人，或者(i)和(ii)两者。在一些实施方式中，所述受试者对至少两种、至少三种或至少四种化学疗法(包括标准或实验性化学疗法)是难治愈的。
在一些实施方式中，所述患者被诊断患有或已经被诊断患有HER2+癌症。
在一些实施方式中，所述患者被诊断患有或已经被诊断患有HER2+癌症，通过对癌症的活组织检查或外科样品进行免疫组织化学染色。在一些实施方式中，所述患者被诊断为或已经被诊断为HER2+癌症，通过癌症的活组织检查或外科样品的荧光原位杂交。
在一些实施方式中，所述患者被诊断患有或已被诊断患有HER2+癌症，根据指南，例如，2018指导方针，例如，如Wolff等人，“乳腺癌症中的人表皮生长因子受体2测试”，Arch Pathol Lab Med 142:1364-82(2018)中所述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，得到患者被诊断为或已经被诊断为HER2+癌症，通过基因分析，例如通过鉴定HER2突变的癌症，例如HER2(ERBB2)基因中的体细胞突变。
在一些实施方式中，所述患者患有癌症，其包括表7中所列的一种或多种突变、HER2基因的插入或缺失多态性、HER2基因组的拷贝数变异、HER2遗传基因的甲基化突变或其组合。
在一些实施方式中，所述患者具有与癌症相关的染色体易位，例如HER2+癌症。在一些实施方式中，患者具有与癌症相关的融合基因，例如HER+癌症。
表7.HER2(ERBB2)突变(相对于人类基因组组装参考构建GRCh38.p13(ncbi.nlm.nih.gov/Assembly/88331)
在一些实施方式中，所述患者是难治愈的或复发的对HER2+癌症，在治疗后例如用曲妥珠单抗或其生物类似物治疗后。
在一些实施方式中，所述患者在用帕妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)、曲妥珠单抗(或FDA认可的其生物相似物)和多西他赛(或其药学上可接受的盐)治疗后难治愈或复发。在一些实施方式中，所述帕妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)以840mg IV第1天施用，随后以420mg IV施用。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FAD批准的其生物类似物)以7mg/kg IV第1天施用，然后每21天施用6mg/kg IV第2天。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)作为曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)和透明质酸酶oysk注射液进行皮下施用。在一些实施方式中，所述多西他赛(或其药学上可接受的盐)以75-100mg/m2 IV第1天给药，每21天循环一次。
在一些实施方式中，所述患者在用帕妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)、曲妥珠单抗(或FDA认可的其生物相似物)和紫杉醇(或其药学上可接受的盐)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，所述帕妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)以840mg IV第1天施用，然后以420mg IV施用，每21天循环一次。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)以4mg/kg IV第1天施用，然后每周施用2mg/kg IV，或以8mg/kgIV第2天施用，随后每21天施用6mg/kg IV第3天。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)作为曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)和透明质酸酶oysk注射液进行皮下施用。在一些实施方式中，所述紫杉醇(或其药学上可接受的盐)以80mg/m2 IV第1天每周给药或175mg/m2第1天每21天循环给药。
在一些实施方式中，所述患者在用图卡替尼(或其药学上可接受的盐)、曲妥珠单抗(或其FDA批准的生物类似物)和卡培他滨(或其药理学上可接受盐)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，所述图卡替尼(或FDA批准的其生物类似物)在第1-21天以300mg口服给药，每天两次。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)以8mg/kg IV第1天给药，然后每21天给药6mg/kg IV第2天。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)作为曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)和透明质酸酶oysk注射液进行皮下施用。在一些实施方式中，所述卡培他滨(或FDA批准的其生物类似物)在第1-14天以1000mg/m2口服施用，每天两次。在一些实施方式中，所述图卡替尼(或其FDA批准的生物类似物)、曲妥珠单抗(或其FDA批准的生物相似物)和卡培他滨(或其药学上可接受的盐)的给药每21天循环一次。
在一些实施方式中，所述患者对ado-曲妥珠单抗emtansine(T-DM1)(或FDA批准的其生物类似物)治疗后难治愈或复发的。在一些实施方式中，所述ado-曲妥珠单抗emtansine(T-DM1)(或FDA批准的其生物类似物)以3.6mg/kg IV第1天施用，每21天循环一次。
在一些实施方式中，所述患者对德曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)治疗后难治愈或复发。在一些实施方式中，所述德曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)以5.4mg/kg IV第1天给药，每21天循环一次。
在一些实施方式中，所述患者在用紫杉醇/卡铂(或其药学上可接受的盐)和曲妥珠单抗(或其FDA批准的生物类似物)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，所述卡铂/紫杉醇(或其药学上可接受的盐)以AUC 6IV第1天卡铂和175mg/m2 IV第1天紫杉醇)施用，每21天循环一次。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)在第1天静脉施用4mg/kg，然后每周静脉施用2mg/kg，或在第1天静脉施用8mg/kg，然后每21天施用6mg/kg。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)作为曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)和透明质酸酶oysk注射液进行皮下施用。
在一些实施方式中，所述患者在用紫杉醇/卡铂(或其药学上可接受的盐)和曲妥珠单抗(或其FDA批准的生物类似物)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，所述卡铂/紫杉醇(或其药学上可接受的盐)以AUC 2IV卡铂和80mg/m2IV第1天紫杉醇)，第1、8和15天施用，每28天循环一次。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)在第1天静脉施用4mg/kg，然后每周静脉施用2mg/kg，或在第1天静脉施用8mg/kg，然后每21天施用6mg/kg。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)作为曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)和透明质酸酶oysk注射液进行皮下施用。
在一些实施方式中，所述患者在用曲妥珠单抗(或其FDA批准的生物类似物)和紫杉醇(或其药学上可接受的盐)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，所述紫杉醇(或其药学上可接受的盐)以175mg/m2 IV第1天给药，每21天循环一次或80-90mg/m2 IV第1周给药。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)在第1天静脉给药4mg/kg，然后每周静脉给药2mg/kg，或在第1天静脉给药8mg/kg，然后每21天给药6mg/kg。在一些实施方式中，曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)作为曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)和透明质酸酶oysk注射液进行皮下给药。
在一些实施方式中，所述患者在用曲妥珠单抗(或其FDA批准的生物类似物)和多西他赛(或其药学上可接受的盐)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，所述多西他赛(或其药学上可接受的盐)以80-100mg/m2的IV第1天给药，每21天循环一次，或每周给药35mg/m2 IV第1、8和15天。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)在第1天静脉给药4mg/kg，然后每周静脉给药2mg/kg，或在第1天静脉给药8mg/kg，然后每21天给药6mg/kg。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)作为曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)和透明质酸酶oysk注射液进行皮下给药。
在一些实施方式中，所述患者在用曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)和长春瑞滨(或其药学上可接受的盐)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，所述长春瑞滨(或其药学上可接受的盐)以25mg/m2 IV第1天每周给药，或20-35mg/m2 IV第1和第8天，每21天循环一次，或25-30mg/m2 IV第1、第8和第15天，每28天循环一周。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)在第1天静脉给药4mg/kg，然后每周静脉给药2mg/kg，或在第1天静脉给药8mg/kg，然后每21天给药6mg/kg。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)作为曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)和透明质酸酶oysk注射液进行皮下给药。
在一些实施方式中，所述患者在用曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)和卡培他滨(或其药学上可接受的盐)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，所述卡培他滨(或其药学上可接受的盐)以1000-1250mg/m2PO施用，每天两次，第1-14天，每21天循环一次。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)在第1天静脉给药4mg/kg，然后每周静脉给药2mg/kg，或在第1天静脉给药8mg/kg，然后每21天给药6mg/kg。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)作为曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)和透明质酸酶oysk注射液进行皮下给药。
在一些实施方式中，所述患者在用拉帕替尼(或其药学上可接受的盐)和卡培他滨(或其医学上可接受盐)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，所述拉帕替尼(或其药学上可接受的盐)以1250mg/m2 PO每天第1-21天给药。在一些实施方式中，所述卡培他滨(或其药学上可接受的盐)以1000mg/m2 PO施用，每天两次，第1-14天，每21天循环一次。
在一些实施方式中，所述患者在用曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)和拉帕替尼(或其药学上可接受的盐)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，所施用的(或其药学上可接受的盐)以1000mg/m2 PO每天施用。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)在第1天静脉给药4mg/kg，然后每周静脉给药2mg/kg，或在第1天静脉给药8mg/kg，然后每21天给药6mg/kg。在一些实施方式中，所述曲妥珠单抗(或FDA批准的其生物类似物)作为曲妥珠单抗(或者FDA批准的其生物学类似物)和透明质酸酶oysk注射液进行皮下给药。
在一些实施方式中，所述患者在用来那替尼(或其药学可接受的盐)和卡培他滨(或其医学可接受的盐类)治疗后是难治愈的或复发的。在一些实施方式中，在第1-21天每天以240mg/m2 PO施用来那替尼。在一些实施方式中，所述卡培他滨以750mg/m2PO在第1-14天每天给药两次，每21天循环一次。
C.淋巴耗竭
在一些实施方式中，所述患者在治疗前进行淋巴耗竭。
WO 2016/191756和WO 2019/079564中描述了说明性的淋巴消耗化疗方案以及相关的有益生物标志物，其全部内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，所述淋巴消耗化疗方案包括给所述患者施用剂量在200mg/m2/天和2000mg/m2/天之间的环磷酰胺和剂量在20mg/m2/天到900mg/m2/天的氟达拉滨。
在一些实施方式中，淋巴耗竭包括施用或施用约250至约500mg/m2的环磷酰胺，例如，从或从约250至或至约500、250、400、500、约250、约400或约500mg/m2环磷酰胺。
在一些实施方式中，淋巴耗竭包括施用或施用约20mg/m2/天至或至约40mg/m2/天的氟达拉滨，例如30或约30mg/m2/天。
在一些实施方式中，淋巴耗竭包括施用环磷酰胺和氟达拉滨。
在一些实施方式中，所述患者淋巴耗竭通过静脉注射环磷酰胺(250mg/m2/天)和氟达拉滨(30mg/m2/天)。
在一些实施方式中，所述患者淋巴耗竭通过静脉注射环磷酰胺(500mg/m2/天)和氟达拉滨(30mg/m2/天)。
在一些实施方式中，所述淋巴耗竭发生在第一剂NK细胞之前不超过5天。在一些实施方式中，所述淋巴耗竭发生在第一剂NK细胞之前不超过7天。
在一些实施方式中，从第一次给药NK细胞前5天(即，从第5天到第3天)开始，连续3天每天发生淋巴耗竭。
在一些实施方式中，所述淋巴耗竭发生在第5天、第4天和第3天。
D.施用
1.NK细胞
在一些实施方式中，所述NK细胞作为药物组合物的一部分施用，例如本文所述的药物组合物。细胞在解冻后施用，在某些情况下，在其冷冻保护剂与立即给药相容的情况下，不需要任何进一步的操作。对于给定的个体，治疗方案通常包括随着时间的推移给予来自共同批次或供体的多个等分试样或剂量的NK细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞，例如本文所述的NK细胞，以每剂量约1×108至或至约8×109个NK细胞的剂量给药。在一些实施方式中，所述NK细胞以每剂量约1×108、约1×109、约4×109、或约8×109NK细胞的剂量施用。
在一些实施方式中，每周施用所述NK细胞。在一些实施方式中，施用所述NK细胞持续或持续约数周。在一些实施方式中，每周施用所述NK细胞持续或持续约8周。
在一些实施方式中，将所述NK细胞冷冻保存在可输注的培养基中，例如适合静脉内给药的冷冻保存组合物，例如本文所述。
在一些实施方式中，将所述NK细胞冷冻保存在小瓶中，每个小瓶含有从或从约1×108至或至约8×109个细胞。在一些实施方式中，将所述NK细胞冷冻保存在含有单一剂量的小瓶中。
在一些实施方式中，所述细胞在施用前被解冻，例如在37℃水浴中。
在一些实施方式中，将解冻的NK细胞小瓶无菌转移到单个给药容器，例如给药袋，例如小瓶适配器和无菌注射器。所述NK细胞可以通过重力通过Y型血液/溶液组过滤器作为IV输注从血管给予患者。
在一些实施方式中，在解冻后尽快施用所述NK细胞，优选少于90分钟，例如少于解冻后80、70、60、50、40、30、20或10分钟。在一些实施方式中，所述NK细胞在解冻后30分钟内给药。
在一些实施方式中，所述药物组合物通过注射器静脉内给药。
在一些实施方式中，通过注射器向患者静脉内施用1mL、4mL或10mL药物产品。
2.抗体
在一些实施方式中，本文所述的NK细胞，例如，包含本文所述NK细胞的药物组合物，与抗体组合施用，例如本文所述抗体，例如HER2抗体。在一些实施方式中，抗体与NK细胞一起作为药物组合物的一部分施用。在一些实施方式中，抗体与NK细胞分开施用，例如作为单独的药物组合物的一部分。抗体可以在给予NK细胞之前、之后或同时施用。
在一些实施方式中，所述抗体在NK细胞之前施用。在一些实施方式中，所述抗体在NK细胞之后施用。
在一些实施方式中，所述在完成抗体施用至少30分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟、180分钟、210分钟或240分钟后施用NK细胞。
在一些实施方式中，所述NK细胞在施用抗体的第二天施用。
在一些实施方式中，所述NK细胞在每次施用时施用，而抗体在施用的组施用。例如，在一些实施方式中，所述NK细胞每周施用一次，抗体每月施用一次。
在一些实施方式中，所述抗体每周施用持续8周。在一些实施方式中，所述抗体每两周施用一次，持续8周。
在一些实施方式中，在第一剂细胞施用之前先施用一定剂量的抗体。在一些实施方式中，在第一剂量的细胞之前施用抗体的剂量。
3.细胞因子
在一些实施方式中，向患者施用细胞因子。
在一些实施方式中，所述细胞因子与NK细胞一起作为药物组合物的一部分施用。在一些实施方式中，所述细胞因子与NK细胞分开施用，例如作为单独的药物组合物的一部分。
在一些实施方式中，所述细胞因子是IL-2。
在一些实施方式中，所述IL-2是皮下施用的。
在一些实施方式中，所述IL-2在NK细胞施用结束后1至4小时或约1至约4小时给药。在一些实施方式中，在NK细胞施用结束后至少1小时施用所述IL-2。在一些实施方式中，在NK细胞施用结束后不超过4小时施用所述IL-2。在一些实施方式中，所述IL-2在NK细胞施用结束后至少1小时且不超过4小时施用。
在一些实施方式中，所述IL-2以高达1000万IU/M2施用，例如高达100万、200万、300万、400万、500万、600万、700万、800万、900万或1000万IUm2。
在一些实施方式中，所述IL-2以或以约100万、以或以约200万、以或以约300万、以或以约400万、以或以约500万、以或以约600万、以或以约700万、以或以约800万、以或以约900万、以或以约1000万IU/M2施用。
在一些实施方式中，所述IL-2以或以约1×106IU/M2以或以约1×106IU/M2施用。在一些实施方式中，所述IL-2以或以约2×106IU/M2施用。
在一些实施方式中，向患者施用小于1×106IU/M2的IL-2。
在一些实施方式中，向患者施用固定剂量的IL-2。在一些实施方式中，向患者施用600万IU或约6百万IU的固定剂量。
在一些实施方式中，不向患者施用IL-2。
E.剂量
“有效量”是指足以产生有益或期望结果的量。例如，治疗量是指达到所需治疗效果的量。该量可以与预防有效量相同或不同，预防有效量是预防疾病或疾病症状发作所必需的量。有效量可以在一次或多次施用、应用或剂量中给药。治疗化合物的治疗有效量(即有效剂量)取决于所选择的治疗化合物。该组合物可以每天一次或多次至每周一次或多次施用；包括每隔一天一次。本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前的治疗、受试者的总体健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，用本文所述的治疗有效量的治疗性化合物治疗受试者可以包括单一治疗或一系列治疗。
治疗性化合物的剂量、毒性和治疗效果可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如，用于确定LD50(对50％的群体致命的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为LD50/ED50的比率。优选表现出高治疗指数的化合物。虽然可以使用表现出有毒副作用的化合物，但应注意设计一种将此类化合物靶向受影响组织部位的递送系统，以最大限度地减少对未感染细胞的潜在损伤，从而减少副作用。
从细胞培养和动物研究中获得的数据可用于配制一系列用于人类的剂量。这种化合物的剂量可以在包括ED50的循环浓度范围内，该ED50几乎没有毒性或没有毒性。剂量可以在这个范围内变化，这取决于所使用的剂型和所使用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初从细胞培养测定中估计。可以在动物模型中配制剂量，以获得在细胞培养中确定的包括IC50(即，达到症状的一半最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这样的信息可以用于更准确地确定人类的有用剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱法来测量。
F.联合疗法
在一些实施方式中，所述方法包括施用本文所述的NK细胞和HER2靶向抗体与另一种疗法的组合，例如，额外的抗体、NK细胞接合剂、抗体-药物偶联物(ADC)、化疗药物(例如，小分子药物)、免疫检查点抑制剂及其组合。
1.小分子/化疗药物
在一些实施方式中，所述附加疗法是小分子药物。在一些实施方式中，所述附加治疗是化学疗法药物。在一些实施方式中，附加疗法是小分子化学疗法药物。这种小分子药物可以包括现有的标准护理治疗方案，其中添加了过继性NK细胞治疗。在一些情况下，使用本文所述的NK细胞可以增强小分子药物的效果，包括通过增强疗效、减少达到所需效果所需的小分子药物量或降低小分子药物毒性。
在一些实施方式中，所述药物选自下组：
在一些实施方式中，所述药物为[(1S，2S，3R，4S，7R，9S，10S，12R，15S)-4-乙酰氧基-1，9，12-三羟基-15-[(2R，3S)-2-羟基-3-[(2-甲基丙-2-基)氧羰基氨基]-3-苯基丙酰基]氧基-10,14,17,17-四甲基-11-氧-6-氧杂环[111.3.1.03,1004,7]十七碳-13-烯-2-基]苯甲酸酯(多西他赛)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是[(1S，2S，3R，4S，7R，9S，10S，12R，15S)-4,12-二乙酰氧基-15-[(2R，3S)-3-苯甲酰氨基-2-羟基-3-苯基丙酰基]氧基-1,9-二羟基-10,14,17,17-四甲基-11-氧代-6-氧杂四环[11.11.103,1004,7]十七碳-13-烯-2-基]苯甲酸酯(紫杉醇)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是6-N-(4,4-二甲基-5H-1-3-恶唑-2-基)-4-N-[3-甲基-4-([1，2，4]三唑并[1,5-a]吡啶-7-基氧基)苯基]喹唑啉-4，6-二胺(妥卡替尼)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物为戊基N-[1-[(2R，3R，4S，5R)-3,4-二羟基-5-甲基氧杂环戊烯-2-基]-5-氟-2-氧嘧啶-4-基]氨基甲酸酯(卡培他滨)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是阿扎奈(azanide)；环丁烷-1,1-二羧酸；铂(2+)(卡铂)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物为甲基(1R，9R，10S，11R，12R，19R)-11-乙酰氧基-12-乙基-4-[(12S，14R)-16-乙基-12-甲氧基羰基-1,10-二氮杂四环[112.3.1.03,11.04,9]十八碳-3(11)，4,6,8,15-戊烯12-基]-10-羟基-5-甲氧基-8-甲基-8,16-二氮杂五环[10.1.01,9.02,7.016,19]壬二烯-2,4,6,13-四烯-10-羧酸酯(长春瑞滨)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是N-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[(2-甲基磺酰基乙基氨基)甲基]呋喃-2-基]喹唑啉-4-胺(拉帕替尼)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是(E)-N-[4-[3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯胺基]-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺(奈拉替尼)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-[(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基)氨基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮(帕博西立布)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是7-环戊基-N，N-二甲基-2-[(5-哌嗪-1-基吡啶-2-基)氨基]吡咯并[2，3-d]嘧啶-6-甲酰胺(核糖环肽)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物为N-[5-[(4-乙基哌嗪-1-基)甲基]吡啶-2-基]-5-氟-4-(7-氟-2-甲基-3-丙-2-基苯并咪唑-5-基)嘧啶-2-胺(abemaciclib)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物为(1R，9S，12S，15R，16E，18R，19R，21R，23S，24E，26E，28E，30S，32S，35R)-1,18-二羟基-12-[(2R)-1-[(1S，3R，4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]丙-2-基]-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,23,35-六甲基-11,36-二氧基-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]六碳烯-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮(依维莫司)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是(2S)-1-N-[4-甲基-5-[2-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)吡啶-4-基]-1,3-噻唑-2-基]吡咯烷-1,2-二甲酰胺(阿培利司)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是4-[[3-[4-(环丙烷羰基)哌嗪-1-羰基]-4-氟苯基]甲基]-2H-邻苯二甲酸-1-酮(奥拉帕尼)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是(11S，12R)-7-氟-11-(4-氟苯基)-12-(2-甲基-1，2，4-三唑-3-基)-2，3，10-三氮杂三环[7.3.05,13]十三碳-1，5(13)，6，8-四烯-4-酮(塔拉佐帕尼)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是N-[2-[2-(二甲基氨基)乙基甲基氨基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]氨基]苯基]丙-2-烯酰胺(奥西替尼)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是(E)-N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-[(3S)-氧代普兰-3-基]氧基喹唑啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺(阿法替尼)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是氮杂环己烷；二氯铂(顺铂、铂醇)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是阿扎奈；环丁烷-1,1-二羧酸；铂(2+)(卡铂)或其药学上可接受的盐
在一些实施方式中，所述药物是4-氨基-1-[(2R，4R，5R)-3,3-二氟-4-羟基-5-(羟甲基)氧杂环戊烯-2-基]嘧啶-2-酮(吉西他滨)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是(2S)-2-[[4-[2-(2-氨基-4-氧代-3,7-二氢吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]氨基]戊二酸(培美曲塞)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是N，N-双(2-氯乙基)-2-氧代-1,3,2λ5-氧杂膦-2-胺(环磷酰胺)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是(2R，3S，4S，5R)-2-(6-氨基-2-氟嘌呤-9-基)-5-(羟甲基)氧代烷-3,4-二醇(氟达拉滨)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是(7S，9S)-7-[(2R，4S，5S，6S)-4-氨基-5-羟基-6-甲基氧杂环己烷-2-基]氧基-6,9,11-三羟基-9-(2-羟基乙酰基)-4-甲氧基-8,10-二氢-7H-四烯-5,12-酮(阿霉素)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是甲基(1R，9R，10S，11R，12R，19R)-11-乙酰氧基-12-乙基-4-[(13S，15S，17S)-17-乙基-17-羟基-13-甲氧基羰基-1,11-二氮杂四环[13.3.1.04,12.05,10]壬癸-4(12)，5,7,9-四烯13-基]-8-甲酰基-10-羟基-5-甲氧基-8,16-二氮杂五环[10.1.01,9.02,7.016,19]壬二酸-2,4,6,13-四烯-10-羧酸(长春新碱)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物为(8S，9S，10R，13S，14S，17R)-17-羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13-二甲基-6,7,8,9,12,14,15,16-八氢环戊[a]菲-3,11-二酮(强的松)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是N，3-双(2-氯乙基)-2-氧代-1,3,2λ5-氧杂膦-2-胺(异环磷酰胺)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物为(5S，5aR，8aR，9R)-5-[[(2R，4aR，6R，7R，8R，8aS)-7,8-二羟基-2-甲基-4,4a，6,7,8,8a-六氢吡喃[3,2-d][1,3]二氧杂环己烷-6-基]氧基]-9-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯基)-5a，6,8a，9-四氢-5H-[2]苯并呋喃并[6,5-f][1,3]苯并二氧唑-8-酮(埃托司胺)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是(8S，9R，10S，11S，13S，14S，16R，17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,11,12,14,15,16-八氢环戊[a]菲-3-酮(地塞米松)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述药物是(8S，9R，10S，11S，13S，14S，16R，17R)-9-氟-11,17-二羟基-17-(2-羟基乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,11,12,14,15,16-八氢环戊[a]菲-3-酮(阿糖胞苷)或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，所述NK细胞，例如本文所述的NK细胞，如AB-101细胞，与HER2靶向抗体以及选自下组：抗体-药物偶联物(ADC)、激酶抑制剂、CDK4/5抑制剂、mTOR抑制剂、PI3K抑制剂、PARP抑制剂或其组合的疗法组合施用。
在一些实施方式中，所述抗体-药物偶联物选自下组：Kadcyla恩美曲妥珠单抗、德曲妥珠单抗、戈沙妥珠单抗及其组合。
在一些实施方式中，所述激酶抑制剂选自下组：拉帕替尼、奈拉替尼、图卡替尼及其组合。
在一些实施方式中，所述CDK4/6抑制剂选自下组：帕博西尼、瑞博西尼、阿贝西利及其组合。
在一些实施方式中，所述mTOR抑制剂是依维莫司。
在一些实施方式中，所述PI3K抑制剂是阿培利司。
在一些实施方式中，所述PARP抑制剂选自下组：奥拉帕尼、他拉唑帕利及其组合。
2.NK细胞结合剂
在一些实施方式中，所述额外的治疗是NK细胞接合剂，例如双特异性或三特异性抗体。
在一些实施方式中，所述NK细胞接合剂是抗CD16和相关抗原疾病的双特异性抗体，例如癌症相关抗原，例如本文所述癌症的抗原，例如HER2。在一些实施方式中，所述NK细胞结合剂是抗CD16和两种相关抗原疾病的三特异性抗体，例如癌症相关抗原，例如本文所述的癌症抗原。
3.检查点抑制剂
在一些实施方式中，所述额外的治疗是免疫检查点抑制剂。
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂选自下组：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂及其组合。
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂选自下组：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、VISTA抑制剂、BTLA抑制剂、TIM-3抑制剂、KIR抑制剂、LAG-3抑制剂、TIGIT抑制剂、CD-96抑制剂、SIRPα抑制剂及其组合。
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂选自下组：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、LAG-3(CD223)抑制剂、TIM-3抑制剂、B7-H3抑制剂、B7-H4抑制剂、A2aR抑制剂、CD73抑制剂、NKG2A抑制剂、PVRIG/PVRL2抑制剂、CEACAM1抑制剂、CEACAM5抑制剂、CEACAM6抑制剂、FAK抑制剂、CCL2抑制剂、CCR2抑制剂、LIF抑制剂、CD47抑制剂、SIRPα抑制剂、CSF-1抑制剂、M-CSF抑制剂、CSF-1R抑制剂、IL-1抑制剂、IL-1R3抑制剂、IL-RAP抑制剂、IL-8抑制剂、SEMA4D抑制剂、Ang-2抑制剂、CELVER-1抑制剂、Axl抑制剂、磷脂酰丝氨酸抑制剂及其组合。
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂选自表8中所示的那些，或其组合。
表8.示例性免疫检查点抑制剂
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是抗体。
在一些实施方式中，所述PD-1抑制剂选自下组：培美布鲁珠单抗、纳武利尤单抗、特瑞普利单抗、西米普利单抗、信迪利单抗及其组合。
在一些实施方式中，所述PD-L1抑制剂选自下组：阿替唑单抗、德瓦鲁单抗、阿维单抗及其组合。
在一些实施方式中，所述CTLA-4抑制剂是伊普利单抗。
在一些实施方式中，所述PD-1抑制剂选自表9中所示的抑制剂组。
表9.示例性PD-1抑制剂抗体
在一些实施方式中，所述PD-L1抑制剂选自表10中所示的抑制剂组。
表10.示例性PD-L1抑制剂抗体
在一些实施方式中，所述CTLA-4抑制剂选自表11中所示的抑制剂组。
表11.示例性CTLA4抑制剂抗体
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是小分子药物。描述了小分子检查点抑制剂，例如，在WO2015/034820A1，WO2015/160641A2，WO2018/009505A1，WO2017/066227A1，WO2018/044963A1，WO2018/026971A1，WO2018/045142A1，WO2018/005374A1，WO2017/202275A1，WO2017/202273A1，WO2017/202276A1，WO2018/006795A1，WO2016/142852A1，WO2016/142894A1，WO2015/033301A1，WO2015/033299A1，WO2016/142886A2，WO2016/142833A1，WO2018/051255A1，WO2018/051254A1，WO2017/205464A1，US2017/0107216A1，WO2017/070089A1，WO2017/106634A1，US2017/0174679A1，US2018/0057486A1，WO2018/013789A1，US2017/0362253A1，WO2017/192961A1，WO2017/118762A1，US2014/199334A1，WO2015/036927A1，US2014/0294898A1，US2016/0340391A1，WO2016/039749A1，WO2017/176608A1，WO2016/077518A1，WO2016/100608A1，US2017/0252432A1，WO2016/126646A1，WO2015/044900A1，US2015/0125491A1，WO2015/033303A1，WO2016/142835A1，WO2019/008154A1，WO2019/008152A1,和WO2019023575A1中。
在一些实施方式中，所述PD-1抑制剂是2-[[4-氨基-1-[5-(1-氨基-2-羟丙基)-1,3,4-恶二唑-2-基]-4-氧代丁基]氨基甲酰基氨基]-3-羟基丙酸(CA-170)。
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是(S)-1-(3-溴-4-((2-溴-[1，1’-联苯]-3-基)甲氧基)苄基)哌啶-2-羧酸。
在一些实施方式中，所述免疫检查点抑制剂是肽。参见，例如Sasikumar等人，“肽和肽受损检查点抑制剂：癌症免疫治疗的蛋白质片段”，药物发现医学8:100073(2020)。
VII.变体
在一些实施方式中，本文所述的融合蛋白或其组分，或本文描述的NK细胞基因型，与示例性序列的氨基酸序列(例如，如本文提供的)至少80％，例如，至少85％、90％、95％、98％或100％相同，例如，与替换的示例性序列残基具有高达1％、2％、5％、10％、15％或20％差异，例如，具有保守突变，例如，包括或除了本文所述的突变之外。在优选的实施方案中，所述变体保留了亲本所需的活性。
为了确定两个核酸序列的同一性的百分比，为了进行最佳比对，对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入间隔，并且为了比对目的可以忽略非同源序列)。用于比对目的的参考序列的长度至少是参考序列长度的80％，并且在一些实施方案中是至少90％或100％。然后对比在相应的氨基酸位置或核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的一个位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，分子在该位置是相同的(如本文所用，核酸“同一性”等同于核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数量的函数，考虑到间隔的数量和每个间隔的长度，需要引入这些间隔来优化两个序列的比对。
以本领域技术范围内的各种方式，例如使用公开可用的计算机软件，如Smith，T.F.和M.S.Waterman(1981)J Mol Biol 147:195-7，确定受试多肽或核酸序列(即查询)与第二多肽或核酸序列(即靶标)之间的同一性百分比；“最佳拟合”(Smith和Waterman，应用数学进展，482-489(1981))，并入GeneMatcher PlusTM，Schwarz和Dayhof(1979)蛋白质序列和结构图谱，Dayhof，M.O.，Ed，第353-358页；BLAST程序(基于局部比对算法的搜索工具；(Altschul，S.F.，W.Gish，et al.(1990)JMol Biol 215:403-10)、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign(DNASTAR)软件。此外，本领域技术人员可以决定用于测量比对的适当参数，包括在被比对序列的长度上实现最大比对所需的任何算法。通常，对于靶蛋白或核酸，比对的长度可以是任何长度，直到并包括靶标的全长(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)。为了本公开的目的，同一性百分比是相对于查询序列的全长的。
为了本公开的目的，所述序列的比对和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用Blossum 62评分矩阵来完成，该矩阵具有12的空位罚分、4的空位扩展罚分和5的移帧间隙罚分。
保守取代通常包括以下基团内的取代：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、以及苯丙氨酸、酪氨酸。
VIII.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或术语应具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或便于参考，在本文中定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包含这样的定义不一定应被解释为表示与本领域中通常理解的内容的实质性差异。
在整个申请中，各种实施例可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应当被解释为对本公开的范围的不灵活的限制。因此，对范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对诸如1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。这适用于范围的宽度。
在说明书和权利要求书中使用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“一个(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“样品(a sample)”包括多个样品，包括它们的混合物。
术语“确定”、“测量”、“评估”、“评定”、“试验”和“分析”在本文中经常互换使用，以指代测量形式。这些术语包括确定元素是否存在(例如，检测)。这些术语可以包括定量、定性或定量和定性测定。评估可以是相对的，也可以是绝对的。“检测存在”可以包括确定存在的东西的数量，以及根据上下文确定它是否存在。
术语“受试者”、“个体”或“患者”在本文中经常互换使用。
术语“体内”用于描述发生在受试者体内的事件。
术语“离体”用于描述发生在受试者体外的事件。未对受试者进行离体测定。相反，它是在与受试者分离的样本上进行的。对样品进行的离体测定的一个例子是“体外”测定。
术语“体外”用于描述发生在容纳实验室试剂的容器中的事件，该容器与获得材料的生物源分离。体外测定可以包括基于细胞的测定，其中使用活细胞或死细胞。体外测定也可以包括不使用完整细胞的无细胞测定。
如本文所用，术语“约”一个数字是指该数字加上或减去该数字的10％。术语“约”一个范围是指该范围减去其最低值的10％，和加上其最大值的10％。
如本文所用，术语“缓冲溶液”是指由弱酸及其共轭碱的混合物组成的水溶液，反之亦然。
如本文所用，术语“细胞培养基”是指用于体外细胞生长和增殖的混合物，其含有细胞生长和增殖的必需元素，如糖、氨基酸、各种营养物质、无机物质等。
本文所用的缓冲溶液不是细胞培养基。
如本文所用，术语“生物反应器”是指能够连续控制影响细胞培养的一系列条件的培养设备，如溶解氧浓度、溶解二氧化碳浓度、pH和温度。
本文使用的术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自复制核酸结构的载体，以及被引入宿主细胞基因组的载体。一些载体适合于递送本申请的核酸分子或多核苷酸。某些载体能够指导与其操作性连接的核酸的表达。这种载体在本文中被称为表达载体。
术语“可操作连接”是指两个或多个核酸序列或多肽元件，它们通常物理连接并且彼此具有功能关系。例如，如果启动子能够启动或调节编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接，在这种情况下，编码序列应被理解为“在启动子的控制下”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指的是引入外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“工程化细胞”、“转化体”和“转化细胞”，包括原代工程化(如转化)细胞及其衍生的子代，而不考虑传代次数。子代的核酸含量可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
适当时，所述宿主细胞可以用编码融合蛋白的多核苷酸稳定或瞬时转染，如本文所述。
此处使用的章节标题仅用于组织目的，不得解释为限制所述主题。
IX.实施例
以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：现成的NK细胞治疗平台
一个扩增和刺激NK细胞方法的例子如图1所示。美国食品药品监督管理局许可的一个冷冻脐带血的单位，具有受体CD16的高亲和力变体(158V/V变体，参见例如Koene等人，“FcγRIIIa-158V/F多态性通过自然杀伤细胞Fgam3月IIIa影响与IgG的结合，与Fgam3月iIIa-48L/R/H表型无关”，血液90:1109–14(1997)。)和KIR-B基因型(KIR受体家族的KIR-B等位基因，参见，例如，Hsu等人，“杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因组区：基因顺序、单倍型和等位基因多态性”，《免疫学评论》190:40-52(2002)；和Pyo等人，“人类杀伤细胞Ig样受体基因座的A组和B组单倍型的中心和端粒区域的不同进化模式”，PLoS One 5:e15115(2010))被选为NK细胞的来源。
将脐带血单位解冻，并通过离心除去冷冻培养基。然后使用QuadroMACS细胞选择系统(Miltenyi)和CD3(T细胞)微珠来耗竭细胞制剂中的T细胞。用MicroBeads标记6×108个总有核细胞(TNC)群体，并使用QuadroMACS装置和缓冲液进行分离。在T细胞耗竭后，将剩余细胞(主要为单核细胞和NK细胞)洗涤并收集在无抗生素培养基(CellgroSCGM)中。然后评估细胞制剂的总有核细胞计数、活力和％CD3+细胞。如图1所示，脐带血NK细胞是CD3缺失的。
将CD3-细胞制剂接种到含有生长培养基的透气细胞扩增袋中。将细胞与复制无能的工程化HuT-78(eHUT-78)饲养细胞共培养，以增强主细胞库(MCB)生产的扩增。CellgroSCGM生长培养基最初补充有抗-CD3抗体(OKT3)、人血浆、谷氨酰胺和IL-2。
如图1所示，在一个共培养步骤中，任选地对NK细胞进行工程化，例如，将CAR引入NK细胞，例如，用慢病毒载体。
将细胞作为静态培养物在37℃、5％CO2平衡的空气环境中孵育12-16天，每2-4天进行一次额外的培养基交换。培养物扩增超过100倍后，收获培养的细胞，然后悬浮在冷冻培养基中并装入冷冻袋中。在该实施例中，在共培养过程中产生了80个袋或小瓶，每个袋或小瓶有108个细胞。冷冻袋使用可控速率的冷冻机冷冻，并储存在低于-150℃的气相液氮(LN2)罐中。这些来源于FDA许可的脐带血单位的冷冻保存的NK细胞用作主细胞库(MCB)。
为了生产药物产品，将MCB的冷冻细胞袋解冻，并取出冷冻培养基。将解冻的细胞接种到一次性培养袋中，并与饲养细胞(例如eHUT78饲养细胞)共培养以生产药物产物。在本实施例中，细胞在50升的生物反应器中培养，以产生每单位脐带血数千批药物产品(例如，4000–8000个冷冻瓶，109个细胞/瓶)，将其与冷冻保存组合物混合，并在多个储存容器(如冷冻瓶)中冷冻。该药品是一种现成的输注产品，可用于直接输注。每批药物产品可用于输注数百至数千名患者(例如100-1000名患者，例如4x 109个细胞的目标剂量)。
实施例2：饲养细胞扩增
作为一个实施例，将合适的饲养细胞(例如eHut-78细胞)从冷冻库中解冻，并在包含RPMI1640(Life Technologies)89％v/v、灭活胎牛血清(FBS)(Life Technology)(10％v/v)和谷氨酰胺(hyclone)(2mM)的生长培养基中的125mL烧瓶中，在或在约37℃和在或在约3-7％CO2下储存、扩增和培养约18-24天。每2-3天将细胞分裂到125mL–2L的烧瓶中。通过离心和γ射线照射来收获细胞。将所收获和辐照的细胞与冷冻保存培养基在2mL冷冻小瓶中的(Cryostor CS10)混合，并在可控速率的冷冻器中冷冻，每5分钟将降温约15℃直至-90℃或约-90℃的最终温度，之后将其转移至液氮罐或冷冻器至-150℃或约-150℃的最终温度。
冷冻后，细胞活力大于或等于原始细胞数的70％(此处为至少1.0x 108个活细胞/mL)，85％或更多的细胞表达mTNF-α，85％或更高的细胞表达mbIL-21+，85％或以上的细胞表达4-1BBL。
实施例3：NK细胞扩增和刺激
作为一个实施例，可以如下制备合适的NK细胞：转导以表达4-1BBL的HuT-78细胞、膜结合的IL-21和突变体TNFalpha(“eHut-78P细胞”)作为饲养细胞。所述饲养细胞悬浮在1％(v/v)CellGro培养基中，并在γ射线辐照器中用20000cGy辐照。种子细胞(例如，CD3耗竭的PBMC或CD3耗竭脐带血细胞)在含有人血浆、谷氨酰胺、IL-2和OKT-3的CellGro培养基中在37℃下静态培养饲养细胞上生长。细胞每2-4天分裂一次。总培养时间为19天。通过离心收获NK细胞并冷冻保存。将解冻的NK在由以下组成的注射介质中施用给患者：磷酸盐缓冲盐水(PBS1x、FujiFilm Irvine)(50％v/v)，白蛋白(人)(20％v/v的10月aPharma白蛋白溶液，含有：200g/L蛋白质，其中≥96％为人白蛋白，130–160mmol钠；≤2mmol钾，0.064–0.096mmol/g蛋白质N-乙酰-DL-色氨酸，0.064-0.096mmol/kg蛋白质，辛酸，约1000ml水)，葡聚糖中的葡聚糖40(25％v/v的Hospira葡聚糖40在葡聚糖注射液中，USP含有：10g/100mL葡聚糖40和5g/100mL葡萄糖水溶液)和二甲基亚砜(DMSO)(5％v/v的Avantor DMSL溶液，20℃下密度为1.101g/cm3)。
在某些情况下，所述种子细胞是CD3耗竭的脐带血细胞。可以通过免疫磁性选择，例如使用CliniMACS T细胞耗竭集(LS耗竭集(162-01)Miltenyi Biotec)，使细胞部分耗竭CD3细胞。
优选地，选择脐带血种子细胞以表达在F158具有V/V多态性的CD16(FcγRIIIa-158V/V基因型)(Musolino等人，2008临床肿瘤学杂志26:1789)。优选地，所述脐带血种子细胞是KIR-B单倍型。
实施例4：脐带血作为NK细胞来源
NK细胞占外周血淋巴细胞的5％至15％。传统上，外周血已被用作治疗用途的NK细胞的来源。然而，如本文所示，来源于脐带血的NK细胞在本文所述的培养系统中具有比来源于外周血的细胞大近十倍的扩增潜力，而不会使细胞过早衰竭或衰老。与外周血NK细胞相比，NK细胞表面感兴趣受体的表达，如那些参与肿瘤细胞结合时NK细胞活化的受体，被认为是脐带血NK细胞的供体对供体更一致。本文所述的制造工艺的使用以不依赖于供体的方式持续激活脐带血中的NK细胞，产生高度规模化、活性和一致的NK细胞产物。
如图2所示，在临床前研究中，脐带血来源的NK细胞(CB-NK)在培养中的扩增能力是外周血来源的NK细胞(PB-NK)的大约十倍。如图3所示，与从外周血产生的药物相比，在脐带血衍生的药物产品中，参与肿瘤的NK激活免疫受体的表达更高且更一致。
实施例5：扩增和刺激的NK细胞表型
在一个实施例中，根据实施例1中描述的扩增和刺激过程，用eHut-78细胞扩增和刺激来自脐带血单位的NK细胞。如图4所示，所得到的扩增和刺激的NK细胞群体具有持续高的CD16(158V)和活化的NK细胞受体表达。
实施例6：AB-101
AB-101是一种通用的、现成的、冷冻保存的异基因脐带血衍生的NK细胞治疗产品，包括体外扩增和活化的效应细胞，旨在增强患者(例如用单克隆抗体或NK细胞接合剂治疗的患者)的ADCC抗肿瘤反应。AB-101由脐带血来源的单核细胞(CBMCs)组成，其通过消耗T淋巴细胞富集NK细胞，并与补充有IL-2和抗CD3抗体(OKT3)的工程化、复制无能的T细胞饲养系共培养。
AB-101是一种来源于FDA许可的脐带血的异基因NK细胞产品，专门设计用于与治疗性单克隆抗体(mAb)联合治疗血液学和实体瘤。AB-101的制造过程产生了具有以下特性的NK细胞产品：
·一致的NK细胞图谱。抗体结合CD16和肿瘤抗原结合/激活受体如NKG2D、NKp46、Nkp30和NKp44的高表面受体表达。
·KIR-B单倍型。KIR-B单倍型与单倍体移植环境中的临床结果改善和异基因环境中更大的治疗潜力有关。
·CD16 F158V多态性。与mAb-Fc结构域结合的更高亲和力CD16 F158V变体被认为有助于增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
·未修饰的NK细胞。AB-101药物产品不需要基因增强或基因编辑，也不属于AB-101产品。
表12中列出了AB-101的成分和组成。AB-101由表达指示成熟NK细胞的天然细胞毒性受体NKp30和NKp46的NK细胞(CD16+、CD56+)组成。AB-101含有可忽略不计的T细胞、B细胞和巨噬细胞(≤0.2％CD3+，≤1.0％CD19+，≤1.0％CD 14+)。用于AB-101培养中的eHuT-78P饲养细胞残留量≤药品的0.2％。
表12.AB-101的成分和组成
初步稳定性研究表明，AB-101在液氮气相中可稳定长达六个月。评估六个月后产品稳定性的长期稳定性研究正在进行中，最新的稳定性信息将记录在分析证书上。
AB-101药物产品的制造包括以下关键步骤(图5)：
·解冻FDA许可的脐带血单位(脐带血，BLA 125937)。
·从脐带血单位(CBU)中取出冷冻保存介质
·使用FDA批准的Vario MACS细胞选择系统(Miltenyi)去除CD3
·与工程饲养细胞系(eHuT-78细胞)在袋中扩增和共培养
·AB-101主细胞库的测试和冷冻保存(约200袋)
●解冻(单袋)、扩增并与工程化HuT-78细胞共培养
●进一步在生物反应器中扩增
●采集和填充(每个小瓶1x109 NK细胞)
●AB-101药品的冷冻保存(约150瓶)
●广泛的表征，以确定一致性、纯度、效力和安全性。
如表13所示，该制造过程可重复地产生大量高纯度和活性的AB-101药物产物NK细胞。数据点代表由三个独立的脐带血单位产生的产品。
表13.AB-101产品特性
同一性(CD3-，CD56+)
CD3-、CD56+细胞的频率用于评估AB-101药物产品的同一性。将AB-101药品样品解冻并重悬于染色缓冲液中。将重悬的样品加入到结合CD3+和CD56+表面抗原的荧光染料标记的抗体中。流式细胞术用于测定CD3-、CD56+的百分比群体，作为产品同一性的测量。
同一性(CD56+，CD16+)
CD56+、CD16+细胞的频率用于评估AB-101药物产品的同一性。将AB-101药品样品解冻并重悬于染色缓冲液中。将重悬的样品加入到结合CD56+和CD16+表面抗原的荧光染料标记的抗体中。流式细胞术用于测定CD56+、CD16+的群体百分比，作为产物同一性的测量。
纯度(CD3+)
CD3+表达细胞的测量用于评估AB-101药物产品的纯度。流式细胞术方法用于测定CD3+表达细胞的药物产物的纯度。CD3+细胞的百分比群体被用作产品纯度的测量。
纯度(CD14+)
CD14+表达细胞的测量用于评估AB-101药物产品的纯度。流式细胞术方法用于测定CD14+表达细胞的药物产物的纯度。CD14+细胞的百分比群体被用作产品纯度的测量。
纯度(CD19+)
CD19+表达细胞的测量用于评估AB-101药物产品的纯度。流式细胞术方法用于测定CD19+表达细胞的药物产物的纯度。CD19+细胞的百分比群体被用作产品纯度的测量。
纯度：残留的eHuT-78P(残留的eHuT-78P细胞)
通过流式细胞术(FACS)测量AB-101药物产品中残留的eHuT-78P细胞。FACS用于通过定量活CD3+4-1BBLhigh+eHuT-78P来检测AB-101DP中的残留eHuT-78。使用FACS门控策略(见图1)，其顺序门控单线态、7-AAD和CD3+4-1BBL+，因为eHuT-78来源于HuT-78细胞系，该细胞系将CD3表达为皮肤T淋巴细胞。HuT-78细胞系被4-1BB配体(4-1BBL)、膜肿瘤坏死因子-a(mTNF-a)和膜结合IL-21(mbIL-21)转导。筛选出高表达这三个基因的eHuT-78单细胞，并相继建立了研究细胞库、主细胞库和工作细胞库。在这三个基因中，4-1BBL被用于FACS门控策略，因为它在AB-101细胞库和最终药物产物中表现出最高的表达。
药效(AB-101DP细胞:K562细胞为10:1的细胞毒性)
AB-101药物产品的药效通过评估抗K562肿瘤细胞的细胞毒性能力来确定。该药品的细胞毒性将通过荧光测定法进行评估。K562肿瘤细胞用30μM钙黄绿素AM(分子探针)在37℃下染色1小时。将药物产物样品和标记的肿瘤细胞在96孔板中在37℃和5％CO2的光保护下共培养4小时，一式三份。将含有10％FBS或2％曲拉通-X100的RPMI1640培养基加入靶中以提供自发和最大释放。将含有10％FBS或2％曲拉通-X100的RPMI1640培养基加入每个孔中以测定背景荧光。荧光的测量用荧光读取器在485nm的激发和535nm的发射下进行。特异性细胞毒性百分比通过以下公式计算。
药效(AB-101DP细胞:人B淋巴细胞瘤细胞为10:1的细胞毒性)
AB-101药物产品的药效也通过使用与上述相同的方法和计算评估抗人B淋巴细胞瘤肿瘤细胞的细胞毒性能力来确定。该测试的规格正在确定中。
实施例7：AB-101表型特征
通过流式细胞术测量多批AB-101的CD16和活化、抑制和趋化因子受体的抗体的纯度以及表达。
使用细胞表面标记物测量AB-101的纯度：AB-101批次包含>99％的CD3-CD56+NK细胞和<0.1％的CD3+、CD14+和CD19+细胞。测定AB-101的CD16表达。95.11±2.51％的AB-101细胞为CD16+，CD16平均和中值MFI分别为15311±6186和13097±5592。已知NK细胞表达各种NK特异性激活和抑制受体。对于测试的各种AB-101批次，>80％的细胞表达CD16、NKG2A、NKG2D、CD94、NKp30、2B4、Tim-3、CD44，40～70％的细胞表达NKp44、NKp46、DNAM-1，约30％的细胞表达CD 161和CD96，15％的细胞表达CXCR3，低于5％的细胞表达其他激活抑制受体。
本研究包括两批GMP的AB-101，以评估NK细胞在制造过程的三个不同阶段的表型特征：CD3+细胞耗竭后的脐带血细胞；作为中间体的主细胞库(MCB)和AB-101最终药物产物(DP)。测量CD3耗竭细胞、MCB和DP的纯度和NK细胞受体。基于这些结果，可以看出最初来源于CB的NK细胞显示出未成熟的NK表型。NK表型在制造过程中成熟。在MCB阶段，超过90％的细胞已经表达了成熟NK细胞中的表型特征，其他细胞类型的标记物＜0.1％。在整个制造过程中，从CD3耗竭细胞到MCB最终到DP，大多数NK细胞特异性受体的表达水平都增加了。
缩写列表：NK自然杀伤；mAb单克隆抗体；TNF-α肿瘤坏死因子-α；CXCR CXC趋化因子受体；DNAM-1DNAX辅助分子-1；CRACC CD2样受体激活细胞毒性细胞；ILT2 Ig样转录物2；Tim-3 T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3；7AAD7-氨基维甲酸霉素D；ULBP UL16结合蛋白；MICA/BMHC I类链相关蛋白A和B；RAE1核糖核酸出口1；H60 NKG2D与两个与类相关的细胞表面配体相互作用；I MHC分子；MULT1小鼠UL16结合蛋白样转录物1；MHC主要组织相容性复合体；HLA人类白细胞抗原。
表型和纯度染色方案：1.将冷FACS缓冲液中的NK细胞浓度调整为2.0x106个细胞/mL。2.参考下表，制作抗体混合物。3.在5mL圆底管中加入抗体混合物并将其与100μL稀释的细胞混合。4.在遮光和4℃条件下对细胞进行染色30分钟。5.染色后，加入2mL FACS，然后在2000rpm和4℃条件下离心3分钟。6.丢弃上清液并使细胞沉淀涡旋。然后加入200μL FACS缓冲液。7.在流式细胞仪(LSR Fortessa)上分析细胞。8.使用Flow Jo软件分析每个标记的表达水平。9.选通表型作为后续选通选项。a.FSC-a/FSC-H板中的门单线图。b.7-AAD/SSC-a板中的门活细胞。c.FSC-A/SSC-A面板中的门淋巴细胞。d.CD3/CD56中的门NK细胞(CD3-CD56+)。e.根据同种型对照绘制象限，然后分析CD3/CD56、CD16/CD56和CD14/CD19。f.基于NK细胞门控中的荧光减一对照(FMO)，计数标记物(表1中的1号和3-30，表达的％)的每个PE荧光表达。在CD16的情况下，计算平均比率和中位数。
用于NK细胞表型染色的抗体组合的列表如表14所示。
表14.NK细胞表型染色的抗体组合列表
AB-101的纯度(n＝9)
AB-101的纯度表示为用于NK细胞的CD3-CD56+细胞、用于T细胞的CD3+细胞、用于单核细胞的CD14+细胞和用于B细胞的CD19+细胞。共测量了9批AB-101的纯度。结果显示CD3-CD56+细胞为99.27±0.59％(平均值±SD)，CD3+细胞为0.02±0.03％，CD14+细胞为0.10±0.12％，CD19+细胞为0.02±0.04％(图6)。因此，证实AB-101由高纯度的NK细胞组成，而作为杂质的其他类型的细胞很少存在。
在GMP条件下生产的CD3贫化细胞、MCB和DP纯度的比较。
使用两批GMP批次的AB-101来评估AB-101起始材料(CD3贫化细胞)、中间体(主细胞库，MCB)和最终药物产物(DP)的纯度。CD3贫化细胞组分中有50～60％为NK细胞，这一比例在MCB和DP中增加到90％以上。CD14+细胞和CD19+细胞代表了20～30％的CD3贫化细胞部分，并且这些细胞百分比在MCB和DP中降低到小于0.1％，这表明AB-101MCB和AB-101最终药物产物的纯度(图7，表15)。
表15.细胞纯度
在GMP条件下生产的CD3贫化细胞、MCB和DP的NK细胞受体的比较
还使用两批GMP批次的AB-101来评估各种NK细胞受体在AB-101起始材料(CD3贫化细胞)、中间体(主细胞库，MCB)和最终药物产物(DP)上的表达。观察到，与AB-101起始材料(CD3贫化细胞)相比，最终药物产物MCB以更高水平表达了几种NK细胞和活化受体，如CD16、NKG2D、NKG2C、NKp30、NKp44、NKp46和DNAM-1。当与AB-101起始材料(CD3贫化细胞)相比时，在MCB和最终药物产物中CD57的表达较低(图8)。总体而言，数据显示MCB和DP中NK细胞激活受体的表达增加，表明AB-101抗肿瘤有效。
表16.细胞受体表达
结论
表面标记分析的使用支持AB-101产品的同一性、纯度和批次间的一致性。此外，对NK特异性激活和抑制细胞表面标记物的建立广泛评估AB-101产品生产后扩增过程的一致性。已知CB衍生的NK细胞具有未成熟表型，例如与外周血(PB)衍生的NK相比NKG2A的高表达和NKG2C、CD62L、CD57、IL-2R、CD16、DNAM-1的低表达，并且还已知具有未成熟表型的CB衍生的NK细胞抗肿瘤细胞表现出低细胞毒性。来自该报告的数据显示，AB-101，一种异基因脐带血(CB)衍生的NK细胞产物，表达高水平的主要激活受体，表明抗肿瘤细胞的潜在更高的细胞毒性。
实施例8：AB-101的药代动力学和生物分布
NOD scid gamma(NSG)小鼠模型用于确定AB-101的生物分布和药代动力学(PK)。载体(PBS、葡聚糖、白蛋白(人)DMSO)和AB-101细胞(0.5x107细胞/小鼠，2x107细胞/小鼠)静脉内给药(0.25mL/小鼠)，共8剂。在最后一次给药输注后4小时、1、3、7、14和78天的时间点处死载体组和AB-101组的动物(每个时间点n＝3只雄性小鼠，n＝3只雌性小鼠)。
AB-101主要在高灌注组织(肺、脾、心和肝)和从施用后4小时开始，直到施用最终剂量AB-101后3天(第53天)的注射部位检测到。在最后剂量施用后7天(第57天)，在肺(6个样本中的3个)、脾(6个样品中的5个)和注射部位(6个标本中的5个中)中检测到AB-101。在给药最终剂量后14天和28天(分别为第64天和第78天)，在两个和一个注射部位样本中分别检测到AB-101。在第64天和第78天从注射部位样品中观察到的偶发发病率和低浓度不表明AB-101供试品的系统持久性。
生物分布研究的结果表明，AB-101在体内的分布与静脉给药途径一致，给药后7天，细胞缺乏组织清除的长期持久性潜力，也没有永久移植的证据。
实施例9：AB-101毒理学
在NSG小鼠的GLP研究中评估了AB-101的非临床毒性。本研究旨在评估AB-101的急性和延迟毒性。在研究中测试了AB-101的两个剂量水平，0.5x107和2x107细胞/动物。拟议的测试剂量范围旨在提供比首次人体研究中计划的最高等效人体剂量(每剂量4x109个细胞)更大的产品暴露量。根据等位基因量表(Nair 2016)，假设患者体重70kg，0.5x107个细胞/小鼠相当于14x109个细胞/人，2x107个细胞/鼠相当于56x109个单元/人。AB-101通过尾静脉每周注射一次，持续8周。AB-101的急性毒性在第八次给药(即最后一次给药)后3天进行评估。在第八次给药后28天恢复期结束时评估延迟毒性。在研究的活体部分，记录每只动物的生存能力、体重、临床观察和触诊情况。安乐死时，对所有动物进行了大体尸检和血液学、临床化学和组织病理学分析样本采集。
每组共包含20只动物，每种性别10只，以评估两性的研究结果并进行有力的统计分析。包括载体处理的对照组，用于与AB-101处理的组进行比较。为了最小化治疗偏差，根据计算机生成(按重量排序)的随机程序将动物分为剂量组，雄性和雌性分别随机。该研究遵循GLP指南，包括数据报告指南。
在任何评估剂量水平下，均未记录到与AB-101给药相关的死亡和不良临床观察结果。注意到的所有次要临床观察结果都是小鼠的常见发现，不被认为与AB-101施用有关。不同剂量组和不同治疗天数后评估的体重和器官重量变化具有可比性(急性毒性组第53天，延迟毒性组第78天)。急性或延迟毒性组安乐死动物的血液学和临床化学参数或大体尸检结果均未发现AB-101相关变化。个体和平均临床化学值之间的所有波动，无论其统计学意义如何，都被认为是偶发的，与生物学和手术相关的变化一致，和/或幅度可忽略不计，因此被认为与AB-101施用无关。无AB-101相关的显微镜检查结果。总之，GLP毒性研究的结果表明，AB-101在NSG小鼠中具有良好的耐受性，重复给药高达2x 107个细胞/剂/只动物。
实施例10：NK细胞的冷冻保存
AB-101细胞是通过图5所示的方法制备的。在培养期结束时，通过使用Sartorius一次性自动离心系统在相对离心场(RCF)下收获细胞：800–1200g，流速为60至120mL/min，并用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤两次。洗涤后，将AB-101细胞配制成：(1)白蛋白(人)；(2)葡聚糖40；(3)DMSO和(4)PBS至1×108个细胞/mL的目标浓度(示例性冷冻保存组合物#1，表4)。然后将配制好的悬浮液以11mL的目标体积填充到10mL AT-Closed小瓶中。对装满的小瓶进行检查、标记，并在≤-135℃的可控速率的冷冻柜中冷冻保存。
以时间＝0作为初始释放测试数据进行稳定性研究。稳定性储存冷冻柜是一种经过验证的气相LN2储存冷冻柜，设置为保持≤-135℃的温度。对于无菌时间点，对批次大小的10％或4个小瓶(以较大者为准)进行测试。供试品在37℃下解冻，以模拟临床解冻条件。
如表17所示，冷冻保存的AB-101的活力和活性被证明可以保存至少9个月。
表17.冷冻保存AB-101的长期生存能力和活性
为了了解AB-101在给药前处理过程中的稳定性特征，进行了一项“床边”短期稳定性研究。将样品解冻，转移到10mL注射器中，过滤，将内容物储存在Falcon管中，并在该温度下保持所示规定的时间段。然后对收集的产品进行测试。两批AB-101的短期稳定性数据如表18所示。
表18.AB-101的短期稳定性数据
实施例11：AB-101用曲妥珠单抗证明ADCC
可以在一定范围的NK细胞(效应细胞)与肿瘤细胞(靶细胞)比率下定量测量NK细胞的细胞毒性。在一项研究中，HER2+胃癌肿瘤细胞系NCI-N87在长期培养中生长了六天。利用肿瘤细胞融合的相位对比分析进行长期细胞毒性测定。
如图13所示，曲妥珠单抗被显示为抑制肿瘤细胞生长，并且AB-101被显示为杀死肿瘤系，但是曲妥珠单抗和AB-101的组合(E:T比例为1:1)显著增加了肿瘤杀伤细胞毒性活性。
实施例12：AB-101+曲妥珠单抗体外研究
如图14所示，通过测量长期培养物中的细胞融合来监测人HER+胃癌细胞系NCI-N87的生长。曲妥珠单抗可抑制培养物的生长，而曲妥珠单抗与NK产物AB-101(E:T比为0.3:1)联合使用可通过ADCC细胞杀伤进一步耗竭细胞融合。
实施例13：AB-101+曲妥珠单抗体内研究
已经在携带HER2+肿瘤的NOG小鼠异种移植物模型中评估了AB-101+曲妥珠单抗的体内疗效。HER2+异种移植物模型包括腹膜内SKOV-3、HCC1954和NCI-N87。
AB-101与曲妥珠单抗的组合在使用HCC1954细胞系的乳腺癌小鼠异种移植物模型(表征为曲妥珠单抗耐药性)(图15)中和在SKOV3卵巢癌模型(图16)中杀死肿瘤细胞。HCC1954-luc肿瘤细胞在细胞培养物中生长，收获，并用PBS(磷酸盐缓冲盐水)浓缩至5x106细胞/mL。小鼠腹膜内注射(IP)1x 106细胞/只。HCC1954-luc接种三天后，根据第0天的生物发光(平均生物发光信号为2.49E+08光子/s)，将小鼠随机分为四组之一(表19)。腹腔内施用AB101、AB201、TRZ和IL-2。
表19
曲妥珠单抗使中位生存时间增加38.5天。(图15)。
在另一项实验中，NSG小鼠在第0天接受1x106 SKOV3-Luc肿瘤细胞(IP)，并在第11天单次注射AB-201(IP)。AB-101+曲妥珠单抗增加了中位生存时间。(图16)。
实施例14：AB-101表面蛋白的表达
如实施例6中所述，扩增NK细胞。将起始NK细胞源(脐带血门控的CD56+/CD3-表达，n＝3)的表面蛋白表达与所得扩增的NK细胞(n＝16)进行比较。如图12中所示，CD16的表达在所得细胞中是高的，相对于源细胞增加。NKG2D、CD94、NKp30、NKp44和NKp46的表达也增加，而CXCR4和CD122的表达减少。
序列
其他实施方式
应当理解，虽然已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改都在以下权利要求的范围内。

Claims (61)

1.一种用于治疗患有HER2+癌症的患者的方法，所述方法包括施用自然杀伤细胞(NK细胞)群和靶向人HER2的抗体，其中所述NK细胞与所述患者是同种异体的、是KIR-B单倍型的并且对于CD16 158V多态性是纯合的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症选自下组：乳腺癌、胃癌和卵巢癌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述癌症为乳腺癌。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述癌症为胃癌。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述癌症为卵巢癌。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述患者在用抗HER2抗体治疗后复发。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述患者在用自体干细胞移植或嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)治疗后经历了疾病进展。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述患者被施用1x108到1x1010的NK细胞。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述患者被施用1x109到8x109的NK细胞。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述患者被施用4x108、1x109、4x109、或8x109的NK细胞。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗体为曲妥珠单抗。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述患者在治疗之前接受淋巴消耗化学疗法。
13.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述淋巴消耗化学疗法是非清髓性化学疗法。
14.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述淋巴消耗化学疗法包括用环磷酰胺和氟达拉滨中的至少一种进行治疗。
15.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述淋巴消耗化学疗法包括用环磷酰胺和氟达拉滨治疗。
16.如权利要求15-16任一所述的方法，其特征在于，所述环磷酰胺的施用量在100至500mg/m2/天之间。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述环磷酰胺的施用量为250mg/m2/天。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述环磷酰胺的施用量为500mg/m2/天。
19.如权利要求15-18任一所述的方法，其特征在于，所述氟达拉滨的施用量在10至50mg/m2/天之间。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述氟达拉滨的施用量为30mg/m2/天。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括施用IL-2。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述患者被施用1x106IU/m2的IL-2。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述患者被施用6百万IU的IL-2。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其特征在于，IL-2的施用发生在NK细胞施用后1-4小时内。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述NK细胞和靶向人HER2的抗体的施用每周进行一次。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，每周施用NK细胞和靶向人HER2的抗体4至8周。
27.如前述权利要求中任一项的所述方法，其特征在于，NK细胞的施用每周进行一次，靶向人HER2的抗体的施用每隔一周进行一次。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述NK细胞未经基因修饰的。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少70％的NK细胞是CD56+和CD16+。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少85％的NK细胞是CD56+和CD3-。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，1％或更少的所述NK细胞是CD3+，1％或更少的所述NK细胞是CD19+和1％或更少的所述NK细胞是CD14+。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述每次施用NK细胞施用1x109到5x109的NK细胞。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述患者在所述第一剂量的NK细胞之前接受一定剂量的HER2靶向抗体。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞是扩增的脐带血自然杀伤细胞。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的CD16+细胞。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的NKG2D+细胞。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的NKp46+细胞。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的NKp30+细胞。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的DNAM-1+细胞。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群体包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的NKp44+细胞。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群包含小于20％，例如10％或更少、5％或更少、1％或更少、0.5％或更少或0％的CD3+细胞。
42.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群包含小于20％，例如10％或更少、5％或更少、1％或更少、0.5％或更少或0％的CD14+细胞。
43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群包含小于20％，例如10％或更少、5％或更少、1％或更少、0.5％或更少或0％的CD19+细胞。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群包含小于20％，例如10％或更少、5％或更少、1％或更少、0.5％或更少或0％的CD38+细胞。
45.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述自然杀伤细胞不包含CD16转基因。
46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述自然杀伤细胞不表达外源性CD16蛋白。
47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞不是基因工程化的。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞来源于同一脐带血供体。
49.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述NK细胞群包含至少1亿个扩增的自然杀伤细胞，例如2亿、2.5亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、7.5亿、8亿、9亿、10亿、20亿、30亿、40亿、50亿、60亿、70亿、80亿、90亿、100亿、150亿、200亿、250亿、500亿，750亿、800亿、90-亿、1000亿、2000亿、2500亿、3000亿、4000亿、5000亿、6000亿、7000亿、8000亿、9000亿、1万亿、2万亿、3万亿、4万亿、5万亿、6万亿、7万亿、8万亿、9万亿或10万亿个扩增的自然杀伤细胞。
50.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述NK细胞群通过包括以下步骤的方法产生：
(a)从脐带血获得包含自然杀伤细胞的种子细胞；
(b)耗竭种子细胞的CD3+细胞；
(c)通过将所述耗竭的种子细胞与第一多个Hut78细胞培养来扩增所述自然杀伤细胞，所述第一多个细胞经改造以表达膜结合的IL-21、突变的TNFα和4-1BBL基因，以产生扩增的自然杀伤细胞，
从而产生扩增的自然杀伤细胞群。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述NK细胞群通过包括以下步骤的方法产生：
(a)从脐带血获得包含自然杀伤细胞的种子细胞；
(b)耗竭种子细胞的CD3+细胞；
(c)通过将所述耗竭的种子细胞与第一多个Hut78细胞培养来扩增所述自然杀伤细胞，所述第一多个Hut78细胞被工程改造以表达膜结合的IL-21、突变的TNFα和4-1BBL基因，以产生扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群；和
(d)通过与第二多个Hut78细胞培养来扩增扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群体，所述第二多个Hut78被工程改造以表达膜结合的IL-21、突变的TNFα和4-1BBL基因以产生扩增的自然杀手细胞；
从而产生扩增的自然杀伤细胞群。
52.如权利要求50或51所述的方法，其特征在于，所述NK细胞群通过在步骤(c)之后进一步包括以下步骤的方法产生：
(i)在多个容器中冷冻扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群；和
(ii)解冻包含扩增的自然杀伤细胞的主细胞库群的等分试样的容器，
其中，在步骤(d)中扩增经扩增的天然杀伤细胞的主细胞库群包括扩增经扩增的自然杀伤细胞的所述主细胞库群的等分试样。
53.如权利要求50-52中任一项所述的方法，其特征在于，所述脐带血来自具有KIR-B单倍型和CD16 158V多态性纯合的供体。
54.如权利要求50-53中任一项所述的方法，其特征在于，所述NK细胞群通过以下方法产生，所述方法包括从脐带血扩增所述自然杀伤细胞至少10000倍，例如15000倍、20000倍、25000倍、30000倍、35000倍、40000倍、45000倍、50000倍、55000倍、60000倍、65000倍或70000倍。
55.如权利要求50-54中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群在扩增后不富集或分选。
56.如权利要求50-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达CD16的NK细胞的百分比与来自脐带血的种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
57.如权利要求50-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达NKG2D的NK细胞的百分比与来自脐带血的种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
58.如权利要求50-57中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达NKp30的NK细胞的百分比与来自脐带血的种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
59.如权利要求50-58中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达NKp44的NK细胞的百分比与来自脐带血的种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
60.如权利要求50-59中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达NKp46的NK细胞的百分比与来自脐带血的种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
61.如权利要求50-60中任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增的自然杀伤细胞群中表达DNAM-1的NK细胞的百分比与来自脐带血的种子细胞中自然杀伤细胞的百分比相同或更高。
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