CN103923935B - sIL-4R-NAP融合基因 - Google Patents

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本发明涉及基因领域,提供了一种融合基因,用于抗哮喘,该基因包含编码可溶性白介素4受体sIL-4R的片段a和编码中性粒细胞激活蛋白HP-NAP的片段b。该基因可连入载体,起到很好的抗哮喘效果。

Description

sIL-4R-NAP融合基因
技术领域
本发明涉及基因领域,尤其涉及一种融合基因。
背景技术
支气管哮喘,简称哮喘,是严重困扰人类健康的慢性疾病,全球哮喘患者已多达3亿多人,我国近10年来儿童哮喘发病率上升了60%,目前尚无根治办法。临床上常用吸入糖皮质激素(GC)和β2受体激动剂等缓解哮喘的临床症状,但价格昂贵而且长期使用易引起诸多不良反应,如生长迟缓、发声困难、骨密度降低等。哮喘是一种免疫失调性疾病,有较多治疗药物在开发,如可溶性白介素4受体(sIL-4R),可阻断IL-4信号、起到一定的抗哮喘作用。但哮喘受到一个复杂信号网络的调控,例如仅仅阻断IL-4信号但IL-13也能补偿IL-4的部分生理学功能,维持哮喘的病理学特征。
发明内容
本发明解决的技术问题是,提供了一种融合基因,给药的抗哮喘效果非常显著。
一种融合基因,其包含编码可溶性白介素4受体(sIL-4R)的片段a和编码幽门螺旋杆菌中性粒细胞激活蛋白(本文简称HP-NAP蛋白)的片段b。
优选的,所述片段a含有SEQIDNo:1所示片段。
优选的,所述片段b含有SEQIDNo:2所示片段。
优选的,所述基因还含有连接片段a和b的连接片段c,片段c不干扰片段a或b的功能,且片段c编码柔性肽(本领域又称连接肽、柔性连接肽,用以防止连在其两端的蛋白在空间构象上的相互干扰;以片段c为例,其可防止片段a表达的sIL-4R和片段b表达的HP-NAP在空间构象上的相互干扰,如防止sL-4R和HP-NAP形成空间高级结构而影响功能的发挥)。
优选的,所述片段c含有SEQIDNo:3所示片段。
优选的,所述基因的序列从5'端到3'端由SEQIDNo:1、SEQIDNo:3、SEQIDNo:2顺序连接而成(下文将该基因称为sIL-4R-NAP基因,其编码的蛋白为sIL-4R-NAP蛋白)。
重组载体,包含任一上述形式的融合基因。融合基因可转入任何可用的载体中,如pcDNA3.1(+)(invitrogen公司)。重组载体可制成核酸疫苗(如DNA疫苗)或药物组合物,通过在宿主内表达融合sIL-4R与HP-NAP的蛋白以调节代谢、治疗/预防疾病。
目前有较多抗哮喘药物在开发,本发明另辟蹊径,通过反复探索,惊奇地发现,包含编码可溶性白介素4受体(sIL-4R)的片段a和编码中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)的片段b的重组载体,通过OVA诱导的小鼠哮喘模型验证,至少在以下任一方面均有显著的效果:
减少气道周围炎症细胞的浸润、减少支气管肺泡灌洗液BALF中细胞总数、降低所述BALF中嗜酸性粒细胞数目、降低肺组织嗜酸性粒细胞趋化因子-2eotaxin-2的mRNA水平、上调肺组织中IFN-γ水平、降低肺组织中IL-4水平、降低肺组织中IL-5的mRNA水平、降低血浆中介导过敏反应的IgE水平。
另外,相比蛋白药物,DNA疫苗的构建变得相对容易,DNA疫苗避免了蛋白质纯化的复杂工艺,并且DNA疫苗在个体内的持续表达也优于传统的蛋白质给药方式。
附图说明
图1为三酶切鉴定质粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP的电泳图,泳道M:DNAmarkerDL10,000(Takara公司);泳道1或2:质粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP用HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ三酶切产物;泳道3:sIL-4R基因PCR产物;泳道4:Linker-HP-NAP基因PCR产物;
图2为BALF细胞计数比较,纵坐标表示细胞总数,单位为105/ml,横坐标对应于各实验组;
图3为BALF中的嗜酸性粒细胞计数比较,纵坐标表示嗜酸性粒细胞数目,单位为105/ml,横坐标对应于各实验组;
图4为肺组织切片H&E染色比较;
图5为IL-4比较图,纵坐标表示IL-4含量,单位为pg/ml,横坐标对应于各实验组;
图6为IFN-γ比较,纵坐标表示IFN-γ含量,单位为pg/ml,横坐标对应于各实验组;
图7为IgE水平比较,纵坐标表示IgE水平,单位为ng/ml,横坐标对应于各实验组;
图8为IL-5的mRNA表达水平比较,纵坐标表示IL-5的mRNA相对NS组的表达水平,横坐标对应于各实验组;
图9为eotaxin-2的mRNA水平比较,纵坐标表示eotaxin-2的相对NS组的mRNA水平,横坐标对应于各实验组;
图10为RT-PCR检测sIL-4R-NAP的mRNA表达;
图11为westernblot检测融合蛋白的表达。
注:上述各涉及数据的图中,*表示各组与OVA组相比,P<0.05即有显著性差异,**表示P<0.01,***表示P<0.001,**、***均为极显著性差异。
具体实施方式
融合基因sIL-4R-NAP可通过本领域常规方法制得,下面以其为例,分别说明用本发明的疫苗的构建、该疫苗的治疗效果、该融合基因sIL-4R-NAP的蛋白表达。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的%,如无特殊说明,均为质量百分含量。
部分材料或仪器:
真核表达载体pcDNA3.1(+)(invitrogen公司),SPF级BALB/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司),
限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ,T4连接酶,TaqDNA聚合酶,RNAisoPlus,质粒小提试剂盒,DNA胶回收试剂盒,PCR仪(均购自Takara公司),
明矾、V级OVA(Sigma公司),SYBRGreenqRT-PCRmix(Takara),实时荧光定量仪(罗氏),瑞氏染液(南京建成生物工程研究所),兔抗HP-NAP多抗(山东舟山同生生物公司制备),超声雾化器(402AI);
BALF支气管肺泡灌洗液:从颈下剪开老鼠皮毛,剖开组织分离出气管,用一次性注射器(5ml)吸取0.8ml预冷的PBS,剪掉针尖,插入气管,用细线双线结扎针头,缓缓推吸3次得到BALF。
部分缩写:
PBS:磷酸盐缓冲液
OVA:鸡卵清蛋白
一、构建DNA疫苗(亦称融合表达载体):
1.1构建DNA疫苗用材料或仪器:真核表达载体pcDNA3.1(+)(invitrogen公司),限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ,T4连接酶,TaqDNA聚合酶,RNAisoPlus,质粒小提试剂盒,DNA胶回收试剂盒,PCR仪(均购自Takara公司),
反转录试剂盒(Fermentas公司)
1.2PCR引物的设计
1.2.1融合表达载体HP-NAP区段的引物设计为SEQIDNo:4、5所示,本文简称该对引物为“HP-NAP引物”。
1.2.2融合表达载体sIL-4R区段的引物设计为SEQIDNo:6、7所示,本文简称该对引物为“sIL-4R引物”,设计思路为:
根据GenBank中C57BL/6小鼠IL-4R(NM_001008700.3)序列,结合UniProt蛋白质数据库预测的IL-4R(P16382)胞外段编码序列设计扩增sIL-4R的引物,正向引物5'端加入酶切位点HindⅢ,反向引物5'端加入酶切位点BamHⅠ,根据pcDNA3.1(+)载体说明的高表达要求,5'端起始密码子ATG序列之前加入ACC序列。
1.3pcDNA3.1-sIL-4R-NAPDNA疫苗的构建及鉴定
1.3.1以pMAL-c2X-NAP质粒(FusionexpressionofHelicobacterpylorineutrophil-activatingproteininE.coli.[J].WorldJGastroenterol,2005,11:454-456.)为模版,用上述HP-NAP引物扩增出携带部分柔性肽(linker)编码序列的Linker-HP-NAP基因,BamHⅠ、XhoI双酶切,连接到pcDNA3.1(+)载体中,酶切鉴定,得到pcDNA3.1-Linker-NAP重组质粒。
1.3.2取6周龄的BABL/c小鼠脾脏50mg,按照RNAisoPlus操作规范提取总mRNA并用反转录试剂盒逆转录为cDNA。以cDNA为模板用上述sIL-4R引物扩增出sIL-4R基因,HindⅢ、BamHⅠ双酶切PCR产物,连接到载体pcDNA3.1-Linker-NAP中,得到DNA疫苗pcDNA3.1-sIL-4R-NAP;该DNA疫苗用HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ三酶切鉴定如图1所示,其中泳道3、4设置为根据该疫苗构建过程、采用类似方法构建的对照,
泳道3:以上述小鼠脾脏cDNA为模版,用上述sIL-4R引物,扩增sIL-4R编码基因的PCR产物(463bp);
泳道4:以pMAL-c2X-NAP为模版,用上述HP-NAP引物,扩增Linker-HP-NAP编码基因的PCR产物(718bp)。
根据图1可知,疫苗构建正确。
二、OVA哮喘模型评估DNA疫苗的抗哮喘能力
a、给药实验:
1.4.1动物分组雌性SPF级BALB/c小鼠30只,6-8周龄,体重18~22g,分为4组:OVA、NS、vector、PSN,每组5只。
1.4.2OVA小鼠哮喘模型的建立及实验设置(表2)
小鼠于第0、7、14天:对OVA、vector、PSN组,腹腔注射100ulOVA致敏液(100ul生理盐水含Ⅴ级OVA20ug、明矾2mg),NS组用生理盐水代替。
第21天,vector、PSN组于双侧大腿肌肉注射50ul(1ug/ul)对应的质粒,OVA组、NS组用生理盐水代替(各组于第28天重复上述给药实验)。
从第42天开始,将各组小鼠放入5L自制密闭容器中,连续5天用1%OVA生理盐水溶液雾化30min,NS组用生理盐水代替。
注:(1)腹腔注射;(2)超声雾化吸入;(3)股四头肌注射
第47天将所有小鼠处死,进行下述b步的效果实验及对比:
b、效果实验及对比:
1.4.4支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数
移液枪吸取10ulBALF用血细胞计数板进行总细胞计数,结果如图2所示,与OVA组相比,PSN组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞总数显著降低。
1.4.5BALF白细胞分类计数BALF于4℃4000RPM离心5min,得到的细胞团用10ul血清重悬,取3.5ul进行涂片,加400ul瑞氏染液染色2min,后加800ul缓冲液用洗耳球吹匀,继续染色12min,用PBS(pH7.2)冲掉多余的染液,竖直放置晾干。于油镜下统计嗜酸性粒细胞数目,结果如图3所示,与OVA组相比,PSN组BALF中嗜酸性粒细胞数目有极显著降低。
1.4.6肺组织切片H&E染色从气管打入200ul中性甲醛固定液并结扎,剥离出完整的肺,放入中性甲醛固定液中固定1天以上。石蜡包埋,连续切片5um厚度,做H&E染色,图中圈周围的细胞越多(以黑白图显示时,颜色越深)表明肺组织气道周围炎症细胞浸润越严重,结果如图4所示,与OVA组相比,PSN组的肺组织气道周围炎症细胞浸润显著降低。
1.4.7ELISA检测细胞因子及IgE
处死小鼠后所得的BALF分装冻存于-80℃,按照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子IL-4(结果如图5所示)、IFN-γ(结果如图6所示):
与OVA组相比,PSN组BALF中Th2类型的细胞因子IL-4极显著地降低,而Th1类型的细胞因子IFN-γ有极显著上调。
小鼠麻醉后腹腔动脉取血,12000rpm-4℃离心5min,所得血浆冻存于-80℃,按照MouseOVAspecificIgEELISAkit(BioLegend公司)说明书步骤检测检测血浆中OVA特异性IgE水平。结果如图7所示,与OVA组相比,PSN组的IgE水平有极显著的下降。
1.4.8mRNA提取及realtimePCR
取肺组织65mg,剪碎加入0.75mltrizol,按照trizol试剂说明提取出总RNA,取1ug总RNA按照反转录试剂盒(Takara公司)说明书反转录为cDNA。
所得cDNA用于realtimePCR检测相关细胞因子、趋化因子的mRNA表达水平(采用罗氏SYBRGreen荧光染料法),具体条件如下:
表4反应体系配置
两步法PCR扩增标准程序:
Stage1:预变性
95℃30秒20℃/秒
1Cycle
Stage2:PCR反应
95℃5秒20℃/秒
60℃20秒20℃/秒40Cycles
Stage3:融解曲线分析
95℃0秒20℃/秒
65℃15秒20℃/秒
95℃0秒0.1℃/秒
IL-5的mRNA表达水平比较结果如图8所示,与OVA组相比,PSN组的肺组织中Th2类型细胞因子IL-5的mRNA水平有显著的下调。
eotaxin-2的mRNA水平比较如图9所示,与OVA组相比,PSN组肺组织中eotaxin-2的mRNA水平有显著降低。
综上所述,本发明的DNA疫苗从各个指标上均显著优于OVA等对照组,即起到了非常显著的抗哮喘效果。
三、融合蛋白的表达:
质粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP(即上述DNA疫苗)、pcDNA3.1(+)转染到非洲绿猴肾细胞系COS-7细胞中:
1、48小时候后收集细胞提取mRNA,设计引物(表5),RT-PCR(Fermentas公司)检测融合基因sIL-4R-NAP是否转录(图10),图中sIL-4R-NAP表示融合基因,β-actin(β-肌动蛋白)基因作为内参基因,泳道1表示pcDNA3.1-sIL-4R-NAP质粒转染COS-7细胞所得cDNA,泳道2表示pcDNA3.1(+)载体转染COS-7细胞所得cDNA,说明质粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP在mRNA水平有转录。
2、收集转染cos-7细胞后的培养基上清及细胞裂解物,用兔抗HP-NAP多抗做westernblot检测融合蛋白是否表达(图11),图中sIL-4R-NAP表示融合蛋白,GAPDH作为内参蛋白,泳道1、3表示pcDNA3.1-sIL-4R-NAP转染cos-7细胞裂解总蛋白或培养基上清,泳道2、4表示pcDNA3.1(+)转染cos-7细胞裂解总蛋白或培养基上清。说明质粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP在蛋白质水平有表达。

Claims (5)

1.融合基因,其特征在于:
所述基因的序列从5'端到3'端由SEQIDNo:1、SEQIDNo:3、SEQIDNo:2顺序连接而成。
2.重组载体,包含权利要求1所述的基因。
3.核酸疫苗,包含权利要求2所述的重组载体。
4.权利要求2所述的重组载体在制备预防或治疗哮喘的药物中的应用。
5.权利要求1所述的基因编码的蛋白。
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