CN103923935B - sIL-4R-NAP融合基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因领域，提供了一种融合基因，用于抗哮喘，该基因包含编码可溶性白介素4受体sIL-4R的片段a和编码中性粒细胞激活蛋白HP-NAP的片段b。该基因可连入载体，起到很好的抗哮喘效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因领域，尤其涉及一种融合基因。
背景技术
支气管哮喘，简称哮喘，是严重困扰人类健康的慢性疾病，全球哮喘患者已多达3亿多人，我国近10年来儿童哮喘发病率上升了60%，目前尚无根治办法。临床上常用吸入糖皮质激素（GC）和β2受体激动剂等缓解哮喘的临床症状，但价格昂贵而且长期使用易引起诸多不良反应，如生长迟缓、发声困难、骨密度降低等。哮喘是一种免疫失调性疾病，有较多治疗药物在开发，如可溶性白介素4受体（sIL-4R），可阻断IL-4信号、起到一定的抗哮喘作用。但哮喘受到一个复杂信号网络的调控，例如仅仅阻断IL-4信号但IL-13也能补偿IL-4的部分生理学功能，维持哮喘的病理学特征。
发明内容
本发明解决的技术问题是，提供了一种融合基因，给药的抗哮喘效果非常显著。
一种融合基因，其包含编码可溶性白介素4受体（sIL-4R）的片段a和编码幽门螺旋杆菌中性粒细胞激活蛋白（本文简称HP-NAP蛋白）的片段b。
优选的，所述片段a含有SEQIDNo：1所示片段。
优选的，所述片段b含有SEQIDNo：2所示片段。
优选的，所述基因还含有连接片段a和b的连接片段c，片段c不干扰片段a或b的功能,且片段c编码柔性肽（本领域又称连接肽、柔性连接肽，用以防止连在其两端的蛋白在空间构象上的相互干扰；以片段c为例，其可防止片段a表达的sIL-4R和片段b表达的HP-NAP在空间构象上的相互干扰，如防止sL-4R和HP-NAP形成空间高级结构而影响功能的发挥）。
优选的，所述片段c含有SEQIDNo：3所示片段。
优选的，所述基因的序列从5＇端到3＇端由SEQIDNo：1、SEQIDNo：3、SEQIDNo：2顺序连接而成（下文将该基因称为sIL-4R-NAP基因，其编码的蛋白为sIL-4R-NAP蛋白）。
重组载体，包含任一上述形式的融合基因。融合基因可转入任何可用的载体中，如pcDNA3.1(+)（invitrogen公司）。重组载体可制成核酸疫苗（如DNA疫苗）或药物组合物，通过在宿主内表达融合sIL-4R与HP-NAP的蛋白以调节代谢、治疗/预防疾病。
目前有较多抗哮喘药物在开发，本发明另辟蹊径，通过反复探索，惊奇地发现，包含编码可溶性白介素4受体（sIL-4R）的片段a和编码中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP）的片段b的重组载体，通过OVA诱导的小鼠哮喘模型验证，至少在以下任一方面均有显著的效果：
减少气道周围炎症细胞的浸润、减少支气管肺泡灌洗液BALF中细胞总数、降低所述BALF中嗜酸性粒细胞数目、降低肺组织嗜酸性粒细胞趋化因子-2eotaxin-2的mRNA水平、上调肺组织中IFN-γ水平、降低肺组织中IL-4水平、降低肺组织中IL-5的mRNA水平、降低血浆中介导过敏反应的IgE水平。
另外，相比蛋白药物，DNA疫苗的构建变得相对容易，DNA疫苗避免了蛋白质纯化的复杂工艺，并且DNA疫苗在个体内的持续表达也优于传统的蛋白质给药方式。
附图说明
图1为三酶切鉴定质粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP的电泳图，泳道M：DNAmarkerDL10,000(Takara公司）；泳道1或2：质粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP用HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ三酶切产物；泳道3：sIL-4R基因PCR产物；泳道4：Linker-HP-NAP基因PCR产物；
图2为BALF细胞计数比较，纵坐标表示细胞总数，单位为105/ml，横坐标对应于各实验组；
图3为BALF中的嗜酸性粒细胞计数比较，纵坐标表示嗜酸性粒细胞数目，单位为105/ml，横坐标对应于各实验组；
图4为肺组织切片H&E染色比较；
图5为IL-4比较图，纵坐标表示IL-4含量，单位为pg/ml，横坐标对应于各实验组；
图6为IFN-γ比较，纵坐标表示IFN-γ含量，单位为pg/ml，横坐标对应于各实验组；
图7为IgE水平比较，纵坐标表示IgE水平，单位为ng/ml，横坐标对应于各实验组；
图8为IL-5的mRNA表达水平比较，纵坐标表示IL-5的mRNA相对NS组的表达水平，横坐标对应于各实验组；
图9为eotaxin-2的mRNA水平比较，纵坐标表示eotaxin-2的相对NS组的mRNA水平，横坐标对应于各实验组；
图10为RT-PCR检测sIL-4R-NAP的mRNA表达；
图11为westernblot检测融合蛋白的表达。
注：上述各涉及数据的图中，*表示各组与OVA组相比，P＜0.05即有显著性差异，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，**、***均为极显著性差异。
具体实施方式
融合基因sIL-4R-NAP可通过本领域常规方法制得，下面以其为例，分别说明用本发明的疫苗的构建、该疫苗的治疗效果、该融合基因sIL-4R-NAP的蛋白表达。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。
部分材料或仪器：
真核表达载体pcDNA3.1(+)（invitrogen公司），SPF级BALB/c小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），
限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ，T4连接酶，TaqDNA聚合酶，RNAisoPlus，质粒小提试剂盒，DNA胶回收试剂盒，PCR仪（均购自Takara公司），
明矾、V级OVA(Sigma公司)，SYBRGreenqRT-PCRmix(Takara)，实时荧光定量仪（罗氏），瑞氏染液（南京建成生物工程研究所），兔抗HP-NAP多抗（山东舟山同生生物公司制备），超声雾化器（402AI）；
BALF支气管肺泡灌洗液：从颈下剪开老鼠皮毛，剖开组织分离出气管，用一次性注射器（5ml）吸取0.8ml预冷的PBS，剪掉针尖，插入气管，用细线双线结扎针头，缓缓推吸3次得到BALF。
部分缩写：
PBS：磷酸盐缓冲液
OVA:鸡卵清蛋白
一、构建DNA疫苗（亦称融合表达载体）：
1.1构建DNA疫苗用材料或仪器：真核表达载体pcDNA3.1(+)（invitrogen公司），限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ，T4连接酶，TaqDNA聚合酶，RNAisoPlus，质粒小提试剂盒，DNA胶回收试剂盒，PCR仪（均购自Takara公司），
反转录试剂盒（Fermentas公司）
1.2PCR引物的设计
1.2.1融合表达载体HP-NAP区段的引物设计为SEQIDNo：4、5所示，本文简称该对引物为“HP-NAP引物”。
1.2.2融合表达载体sIL-4R区段的引物设计为SEQIDNo：6、7所示，本文简称该对引物为“sIL-4R引物”，设计思路为：
根据GenBank中C57BL/6小鼠IL-4R(NM_001008700.3)序列，结合UniProt蛋白质数据库预测的IL-4R（P16382）胞外段编码序列设计扩增sIL-4R的引物，正向引物5＇端加入酶切位点HindⅢ，反向引物5＇端加入酶切位点BamHⅠ，根据pcDNA3.1(+)载体说明的高表达要求，5＇端起始密码子ATG序列之前加入ACC序列。
1.3pcDNA3.1-sIL-4R-NAPDNA疫苗的构建及鉴定
1.3.1以pMAL-c2X-NAP质粒（FusionexpressionofHelicobacterpylorineutrophil-activatingproteininE.coli.[J].WorldJGastroenterol,2005,11:454-456.）为模版，用上述HP-NAP引物扩增出携带部分柔性肽(linker)编码序列的Linker-HP-NAP基因，BamHⅠ、XhoI双酶切，连接到pcDNA3.1(+)载体中，酶切鉴定，得到pcDNA3.1-Linker-NAP重组质粒。
1.3.2取6周龄的BABL/c小鼠脾脏50mg，按照RNAisoPlus操作规范提取总mRNA并用反转录试剂盒逆转录为cDNA。以cDNA为模板用上述sIL-4R引物扩增出sIL-4R基因，HindⅢ、BamHⅠ双酶切PCR产物，连接到载体pcDNA3.1-Linker-NAP中，得到DNA疫苗pcDNA3.1-sIL-4R-NAP；该DNA疫苗用HindⅢ、BamHⅠ、XhoⅠ三酶切鉴定如图1所示，其中泳道3、4设置为根据该疫苗构建过程、采用类似方法构建的对照，
泳道3：以上述小鼠脾脏cDNA为模版，用上述sIL-4R引物，扩增sIL-4R编码基因的PCR产物（463bp）；
泳道4：以pMAL-c2X-NAP为模版，用上述HP-NAP引物，扩增Linker-HP-NAP编码基因的PCR产物（718bp）。
根据图1可知，疫苗构建正确。
二、OVA哮喘模型评估DNA疫苗的抗哮喘能力
a、给药实验：
1.4.1动物分组雌性SPF级BALB/c小鼠30只,6-8周龄,体重18～22g，分为4组：OVA、NS、vector、PSN，每组5只。
1.4.2OVA小鼠哮喘模型的建立及实验设置（表2）
小鼠于第0、7、14天：对OVA、vector、PSN组，腹腔注射100ulOVA致敏液（100ul生理盐水含Ⅴ级OVA20ug、明矾2mg），NS组用生理盐水代替。
第21天，vector、PSN组于双侧大腿肌肉注射50ul（1ug/ul）对应的质粒，OVA组、NS组用生理盐水代替（各组于第28天重复上述给药实验）。
从第42天开始，将各组小鼠放入5L自制密闭容器中，连续5天用1%OVA生理盐水溶液雾化30min，NS组用生理盐水代替。
注:(1)腹腔注射;(2)超声雾化吸入;(3)股四头肌注射
第47天将所有小鼠处死，进行下述b步的效果实验及对比：
b、效果实验及对比：
1.4.4支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数
移液枪吸取10ulBALF用血细胞计数板进行总细胞计数，结果如图2所示，与OVA组相比，PSN组小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞总数显著降低。
1.4.5BALF白细胞分类计数BALF于4℃4000RPM离心5min，得到的细胞团用10ul血清重悬，取3.5ul进行涂片，加400ul瑞氏染液染色2min，后加800ul缓冲液用洗耳球吹匀，继续染色12min，用PBS（pH7.2）冲掉多余的染液，竖直放置晾干。于油镜下统计嗜酸性粒细胞数目，结果如图3所示，与OVA组相比，PSN组BALF中嗜酸性粒细胞数目有极显著降低。
1.4.6肺组织切片H&E染色从气管打入200ul中性甲醛固定液并结扎，剥离出完整的肺，放入中性甲醛固定液中固定1天以上。石蜡包埋，连续切片5um厚度，做H&E染色，图中圈周围的细胞越多（以黑白图显示时，颜色越深）表明肺组织气道周围炎症细胞浸润越严重，结果如图4所示，与OVA组相比，PSN组的肺组织气道周围炎症细胞浸润显著降低。
1.4.7ELISA检测细胞因子及IgE
处死小鼠后所得的BALF分装冻存于-80℃，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子IL-4(结果如图5所示)、IFN-γ(结果如图6所示)：
与OVA组相比，PSN组BALF中Th2类型的细胞因子IL-4极显著地降低，而Th1类型的细胞因子IFN-γ有极显著上调。
小鼠麻醉后腹腔动脉取血，12000rpm-4℃离心5min，所得血浆冻存于-80℃，按照MouseOVAspecificIgEELISAkit（BioLegend公司）说明书步骤检测检测血浆中OVA特异性IgE水平。结果如图7所示，与OVA组相比，PSN组的IgE水平有极显著的下降。
1.4.8mRNA提取及realtimePCR
取肺组织65mg，剪碎加入0.75mltrizol，按照trizol试剂说明提取出总RNA，取1ug总RNA按照反转录试剂盒(Takara公司）说明书反转录为cDNA。
所得cDNA用于realtimePCR检测相关细胞因子、趋化因子的mRNA表达水平（采用罗氏SYBRGreen荧光染料法），具体条件如下：
表4反应体系配置
两步法PCR扩增标准程序：
Stage1：预变性
95℃30秒20℃/秒
1Cycle
Stage2：PCR反应
95℃5秒20℃/秒
60℃20秒20℃/秒40Cycles
Stage3：融解曲线分析
95℃0秒20℃/秒
65℃15秒20℃/秒
95℃0秒0.1℃/秒
IL-5的mRNA表达水平比较结果如图8所示，与OVA组相比，PSN组的肺组织中Th2类型细胞因子IL-5的mRNA水平有显著的下调。
eotaxin-2的mRNA水平比较如图9所示，与OVA组相比，PSN组肺组织中eotaxin-2的mRNA水平有显著降低。
综上所述，本发明的DNA疫苗从各个指标上均显著优于OVA等对照组，即起到了非常显著的抗哮喘效果。
三、融合蛋白的表达：
质粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP(即上述DNA疫苗)、pcDNA3.1(+)转染到非洲绿猴肾细胞系COS-7细胞中：
1、48小时候后收集细胞提取mRNA，设计引物（表5），RT-PCR（Fermentas公司）检测融合基因sIL-4R-NAP是否转录（图10），图中sIL-4R-NAP表示融合基因，β-actin（β-肌动蛋白）基因作为内参基因，泳道1表示pcDNA3.1-sIL-4R-NAP质粒转染COS-7细胞所得cDNA，泳道2表示pcDNA3.1(+)载体转染COS-7细胞所得cDNA，说明质粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP在mRNA水平有转录。
2、收集转染cos-7细胞后的培养基上清及细胞裂解物，用兔抗HP-NAP多抗做westernblot检测融合蛋白是否表达（图11），图中sIL-4R-NAP表示融合蛋白，GAPDH作为内参蛋白，泳道1、3表示pcDNA3.1-sIL-4R-NAP转染cos-7细胞裂解总蛋白或培养基上清，泳道2、4表示pcDNA3.1(+)转染cos-7细胞裂解总蛋白或培养基上清。说明质粒pcDNA3.1-sIL-4R-NAP在蛋白质水平有表达。
Claims (5)
1.融合基因，其特征在于：
所述基因的序列从5＇端到3＇端由SEQIDNo：1、SEQIDNo：3、SEQIDNo：2顺序连接而成。
2.重组载体，包含权利要求1所述的基因。
3.核酸疫苗，包含权利要求2所述的重组载体。
4.权利要求2所述的重组载体在制备预防或治疗哮喘的药物中的应用。
5.权利要求1所述的基因编码的蛋白。
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