CN102516366A

CN102516366A - Th1细胞因子免疫调节多肽及其应用

Info

Publication number: CN102516366A
Application number: CN2012100040993A
Authority: CN
Inventors: 康巧珍; 李黎; 刘鑫; 汲振余; 翟文杰; 李国栋; 高艳锋; 祁元明
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102516366B

Abstract

本发明公开了一种Th1细胞因子免疫调节多肽为16肽，其氨基酸序列为：Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp。本发明还公开了Th1细胞因子免疫调节多肽在制备Th1细胞因子免疫调节剂中的应用，所述免疫调节剂为恶性肿瘤、哮喘等多肽类免疫调节剂。本发明的优点在于采用免疫信息学手段，预测天然TLR2激动剂HP-NAP最小功能结构域，采用标准的Fmoc方案进行合成，经HPLC/MS鉴定后，用体外细胞模型验证其对Th1细胞因子免疫调节功能。鉴定出的Th1细胞因子免疫调节多肽序列未见文献与专利报道，为基于Th1细胞因子调节为机理的免疫调节药物研发提供了制备与筛选技术。

Description

Th1细胞因子免疫调节多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物化学中的多肽技术，尤其是涉及一种来源于天然TLR2激动剂HP-NAP的Th1细胞因子免疫调节多肽，本发明还涉及该多肽在开发Th1细胞因子免疫调节功能相关药物中的应用。

背景技术

人体免疫系统是机体防止病原体感染、清除肿瘤细胞和维持自身健康的重要防御体系，而CD4⁺T辅助性淋巴细胞是执行这一功能的重要环节。1986年Mosmann等在研究小鼠CD4⁺Th时发现了两种不同类型的细胞因子产生克隆；Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子。Th1细胞因子可以增强杀伤性细胞的细胞毒作用，介导免疫应答，与机体抗肿瘤抗病毒有关；Th2细胞因子促进抗体产生，增强体液免疫，与移植物耐受、抑制自身免疫疾病相关。

HP-NAP能上调中性白细胞及单核细胞表面β2整联素的表达，促进中性白细胞及单核细胞与血管内皮细胞的黏附及穿过内皮细胞向感染部位转移聚集。HP-NAP一旦从菌体中释放出来，还可以穿过胃上皮细胞到达黏膜下层并激活巨噬细胞，巨噬细胞释放的IL-6进一步趋化和激活中性白细胞及单核细胞。2010年，Andrea Cappon等研究证实HP-NAP可以通过促进机体释放一些内源性因子（IL-1β等）延长单核细胞的寿命，并且可以通过单核细胞依赖的方式延长中性粒细胞的寿命。2006年Amedeo等报道HP-NAP是一种TLR2（Toll-like receptor 2）激动剂，能够诱导人中性粒细胞和单核细胞产生IL-12和IL-23等细胞因子，使宿主抗原特异性CD4+T细胞由Th2向Th1免疫反应转变。因此HP-NAP可能成为逆转Th1/Th2漂移，增强Th1反应的免疫调节效应分子。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于天然TLR2激动剂HP-NAP的Th1细胞因子免疫调节多肽，本发明另一目的在于提供该多肽在开发Th1细胞因子免疫调节功能相关药物中的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的Th1细胞因子免疫调节多肽为16肽，其氨基酸序列为：

Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp。

本发明的Th1细胞因子免疫调节多肽在制备Th1细胞因子免疫调节剂中的应用。

所述免疫调节剂为恶性肿瘤、哮喘等多肽类免疫调节剂。

本发明的优点在于采用免疫信息学手段，预测天然TLR2激动剂HP-NAP最小功能结构域，采用标准的Fmoc方案进行合成，经HPLC/MS鉴定后，用体外细胞模型验证其对Th1细胞因子免疫调节功能。鉴定出的Th1细胞因子免疫调节多肽序列未见文献与专利报道，为基于Th1细胞因子调节为机理的免疫调节药物研发提供了制备与筛选技术。

附图说明

图1为本发明多肽的质谱分析图；

图2为RT-PCR鉴定本发明多肽napP102刺激PBMCs后IFN-γ表达结果。

图3为RT-PCR鉴定本发明多肽napP102刺激PBMCs后IL-4表达结果。

图4为本发明多肽napP102与MAGE-A3共同作用后的杀伤效果。

具体实施方式

本发明所述的Th1细胞因子免疫调节多肽为16肽，记为napP102，依据天然TLR2激动剂HP-NAP的第 102–117位的氨基酸序列进行Fmoc固相合成，HPLC分离纯化,MS进行鉴定，其氨基酸序列为：

Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp；分子量为1853.958。

本发明的Th1细胞因子免疫调节多肽在制备Th1细胞因子免疫调节剂（如恶性肿瘤、哮喘等多肽类免疫调节剂）中的应用。

本发明主要采用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、IEDB、NetMHC2.2数据库对HP-NAP的功能结构域进行预测分析，设计HP-NAP多肽序列。Kolaskar和Tongaonkar方法进行评价，筛选获得多肽序列采用标准的Fmoc方案进行合成，经HPLC纯化后，质谱鉴定。肽质谱鉴定图见图1。

本发明多肽napP102制备的基本流程为：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的肽。经HPLC纯化后，其纯度大于90%，质谱分析并证实其分子量符合理论值。（参见：①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。②.N.休厄德、H.D.贾库布克著，刘克良等译，肽：化学与生物学，科学出版社，2005年。）

人外周血单个核细胞（PBMCs）的分离诱导及RT-PCR实验和LDH实验检测：抽取健康供者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加白细胞介素2（IL-2，Peprotech公司）诱导分化CD4^＋T细胞，进一步在体外RT-PCR实验和LDH实验进行验证。

方法如下：

1. PBMCs的分离与诱导：（1）以40ml PBS（PH 7.2）稀释抗凝处理后的外周血40ml；（2）离心管中加入4ml Lymphoprep 分离液（Axis-Shield 公司）；（3）加8ml步骤（1）中稀释后的外周血于4ml Lymphoprep 分离液液面上；（4）20℃离心（2000rmp×20min）；（5）离心后，分为四层，弃去最上层，用玻璃吸管吸取第二层即白膜层（富含PBMCs）；（6）吸出的白膜层用PBS（pH 7.2）离心洗涤两次；（7）用24孔板铺板，细胞的浓度为1×10⁶/ml，每孔1ml；（8）第二天每孔加入50ug表位肽，同时设立PBS组作为阴性对照，PHA(10ug每孔)作为阳性对照。（9）第三天每孔加入50U IL-2，荷肽72h后收细胞进行RT-PCR检测IFN-γ和IL-4表达情况。

2. RT-PCR实验：

1）RNA的提取：（1）将离心后的 PBMCs，倒去培养液，室温下不洗涤细胞直接加入 1ml 裂解液，反复吹打使细胞完全裂解；（2）将悬液转入1.5 ml EP管，室温放置5 min，使核蛋白完全分离；（3）加入200μl氯仿，剧烈振荡15_~30s，室温静置5min后，12000g，15min 离心；（4）小心吸取上层水相移至新EP管中（共3层，避免吸取下面两层）；（5）加等体积异丙醇，静置10min，7500g，离心10min；（6）弃上清，用75%乙醇洗涤，振荡，混匀，12000g，离心5min；（7）弃上清，干燥10min，加入20_~30μl，0.01% DEPC水溶解，55_~60 ℃（10min），使之溶解。

2）反转录过程：

（1）在冰浴的试管中加入下列反应混合物：

总RNA: (1_~5μg) 5μl

引物：oligo(dT) (0.5μg/μl) 1μl

无 RNase 去离子水，定容至 12μl

（2）轻轻混匀后离心3_~5s；

（3）反应混合物在70 ℃水浴5min，然后离心3_~5s；

（4）将试管冰浴，再加入以下组分：

5xReaction Buffer 4μl

RNase In hibiter(20U/μl) 1μl

dNTP Mix (10 mmol/l) 2μl

M-MulvRT(20U/ul) 1μl 终体积为20μl

（5）反应混合物42℃，水浴 60 min；

（6）在70 ℃加热10min，终结反应，置冰上或冷冻保存（-20℃）。

3）以cDNA为模板，应用针对IFN-γ和IL-4的特异引物（引物见表1），进行PCR ，20ul反应体系：2XTaq PCR MasterMix 10μl；上、下游引物各0.5μl；cDNA 0.5μl；ddH₂O 8.5μl。PCR反应参数如下：

1.T=95.0℃ 0.5min

2.T=94.0℃ 30s

3.T=64.0℃ 40s

-0.7℃ ＋0:00

R=3.0℃/s ＋0.0

4.T=72.0℃ 1min

5.GCTC 2 REP 15

6.T=94.0℃ 30s

7.T=53.0℃ 0:00 40s

8.T=72.0℃ 1min

9.Go to 6 REP 20

10.T=72.0℃ 10min

11.Hold on 16℃

结果见图2与图3，RT-PCR实验结果显示，候选表位napP102能够诱导健康供者外周血IFN-γ的表达。

表1：IFN-γ和IL-4的特异引物

IFN-γ	F：5-ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTT-3
		R：5- GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT-3
IL-4	F：5-ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT-3
		R：5-CGAACACTTTGAATATTTCTCTCTC-3

3.LDH检测：使用CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay（细胞毒性检测试剂盒，Promega公司）进行LDH试验检测细胞毒活性。步骤如下（详见试剂盒说明书）：

1）设立检测板（100μl /孔）

（1）设立实验组：以肿瘤细胞EC-9706（ATCC公司）作为靶细胞（最优靶细胞数：5000）按不同效靶比12.5:1 、25:1、50:1加入MAGE-A3单独或者与活性肽共同刺激所诱导的效应细胞CTL ；

（2）设立效应细胞自发释放组；

（3）设立靶细胞自发释放组；

（4）设立靶细胞最大释放组；

（5）设立体积校正对照组；

（6）设立背景对照组。

2）细胞裂解及收获上清

（1）37℃、5%CO₂孵育检测板（5h）；

（2）靶细胞最大释放组和体积校正对照组中加入裂解液，每100μl培养基中加入10μl裂解液（10×），收获上清前45min加入裂解液；

（3）250g离心4min，收获上清。

3）LDH检测

（1）转移50μl上清至另一孔板；

（2）50μl /孔迅速添加稀释的底物混合液，室温避光孵育30min；

（3）添加50μl终止溶液；

（4）将孔中含有的气泡去除，一小时内检测490nm吸收值OD。

细胞杀伤率计算公式如下：

杀伤率(%) =［(OD实验组-OD效应细胞自发释放组-OD靶细胞自发释放组)/( OD靶细胞最大释放组-OD靶细胞自发释放组)］×100%

（注：所有实验组、效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组的吸收值均应减去背景平均吸收值；靶细胞最大释放组吸收值应减去体积校正对照组的平均吸收值）

结果见图4，本发明多肽可以加强MAGE-A3诱导的特异性CTL对肿瘤细胞SW480（HLA-A*0201-阳性，MAGE-A3-阳性）的杀伤效果。

本发明鉴定出的来源于天然TLR2激动剂HP-NAP的多肽napP102具有调节Th1细胞因子合成，提高机体Th1细胞免疫的功能，为研制针对Th1细胞免疫功能低下为适应症（如恶性肿瘤、哮喘等）的多肽类免疫调节剂提供了新方法。

Claims

1.一种Th1细胞因子免疫调节多肽，其特征在于：该多肽为16肽，其氨基酸序列为：

Glu-Lys-Glu-Phe-Lys-Glu-Leu-Ser-Asn-Thr-Ala-Glu-Lys-Glu-Gly-Asp。

2.根据权利要求1所述的Th1细胞因子免疫调节多肽在制备Th1细胞因子免疫调节剂中的应用。

3.根据权利要求1所述的Th1细胞因子免疫调节多肽在制备Th1细胞因子免疫调节剂中的应用，其特征在于：所述免疫调节剂为恶性肿瘤、哮喘等多肽类免疫调节剂。