CN102002106A - 融合蛋白mbp-nap及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种融合蛋白MBP-NAP，它的氨基酸序列如SEEQ ID NO.1所述。此外，本发明还公开了该融合蛋白MBP-NAP的制备方法，该方法具有操作简便、条件温和等特点，本发明所述融合蛋白MBP-NAP通过增强Th1细胞免疫，使其相关细胞因子IL-2和IFNγ的分泌量明显增高，从而增强Th1免疫。

Description

融合蛋白MBP-NAP及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞生物学和基因工程领域，具体涉及一种融合蛋白MBP-NAP，此外，还涉及该融合蛋白的制备方法以及其在增强Th1细胞免疫方面的应用。

背景技术

根据细胞因子分泌模式，CD4⁺T细胞可分为Th1和Th2亚群，Th1/Th2细胞平衡对整个免疫系统的调节起着关键性作用。Th1和Th2有拮抗作用，它们之间的不平衡会导致不同类型的疾病发生。研究发现，Th1/Th2平衡紊乱与肿瘤、自身免疫性疾病、微生物感染、移植排斥反应等多种疾病有关。自Yamamura和Kharkevitch最早发现肿瘤发生时免疫反应向Th2漂移后，许多研究均证实，进展期肿瘤病人外周血中往往呈Th2优势状态，在抗肿瘤免疫中起重要作用的Th1免疫却受到抑制，因而设法逆转Th1/Th2漂移方向，增强Th1免疫，将成为肿瘤免疫治疗的新手段。此外，在多数寄生虫病中，Th2优势应答可加重疾病，而Th1应答具有治疗作用；过敏性疾病的发生与抗原特异性Th2优势应答密切相关，因此有人提出治疗过敏性疾病用药物诱发Th1优势应答的途径；在自身免疫性疾病的发病机制及治疗中，Th1/Th2也有非常重要的作用。

微生物在进化中已经形成了若干免疫调节机制。研究发现幽门螺杆菌(H.Pylori，简称HP)感染胃粘膜常常伴随大量中性白细胞及单核细胞浸润。HP超声上清和水抽提物当中存在能趋化和激活中性白细胞及其它炎症细胞的成分，Doyle J等首先从H.pylori中纯化出150kDa的蛋白质分子，并证实这种分子及其15kDa的同源亚基能上调中性白细胞表面CD11b/CD18表达，促进中性白细胞对内皮细胞的黏附，这种可溶性蛋白成分被命名为幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白(H.pylori neutrophil-activating protein，HP-NAP)。HP-NAP是幽门螺杆菌重要致病因子及免疫保护性抗原之一。Rossi G等报道HP-NAP与幽门螺杆菌另外两种毒力因子空泡素VacA和毒力相关蛋白CagA联合使用能有效治疗实验感染H.pylori的比格狗，具有免疫治疗作用。发明者利用自己纯化的重组HP-NAP在小鼠和豚鼠中也获得了较高的抗H.pylori免疫保护效果。但利用HP-NAP改造融合蛋白增强Th1细胞免疫的专利国内外还未见报道。

研究表明HP-NAP是一种TLR2(Toll-like receptor 2)激动剂，能够诱导人类中性粒细胞和单核细胞产生IL-12和IL-23，使宿主抗原特异性T细胞由Th1/Th2向Th1漂移。在抗肿瘤免疫反应，过敏性疾病和寄生虫感染等疾病防治中具有广泛的应用前景。

H.pylori培养条件苛刻，通过病原菌培养大量分离纯化HP-NAP成本较高，HP-NAP的编码基因HP-napA存在于几乎所有的H.pylori分离菌株中而且高度保守，本发明以天然微生物毒力因子基因HP-napA为药物设计母本，利用生物信息技术对HP-napA进行功能预测和序列改造，DNA重组技术构建原核表达载体，在大肠杆菌(E.coli)TB1中实现重组蛋白的高效表达，筛选具有增强Th1细胞免疫活性的新型基因工程重组蛋白候选药物。为开发Th1/Th2漂移相关疾病免疫调节剂提供技术路线和制备方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种融合蛋白MBP-NAP。

本发明进一步目的是提供了该融合蛋白MBP-NAP的制备方法。

本发明另一目的在于提供了该融合蛋白在增强Th1细胞免疫方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

融合蛋白MBP-NAP，具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

上述融合蛋白MBP-NAP的制备方法，包括以下步骤：

(1)基因HP-napA的PCR扩增

根据H.pylori 26695和H.pylori J99全基因组序列设计一对PCR引物，所述引物序列如下：

上游引物P1：5′-GGAGAATTCATGAAAACATTTGAAAT-3′

下游引物P2：5′-AAGTCGACTTAAGCTAAATGGGCTTCTAG-3′

以MEL-HP27基因组DNA为模板，扩增包含基因HP-napA的DNA片段，PCR产物长度为435bp；

(2)重组质粒pNEB-napA的构建

PCR产物、质粒pNEB193经EcoR I和Sal I双酶切后，用Vitagene凝胶回收试剂盒分别回收双酶切片段，将两者的双酶切片段用T4DNA连接酶进行连接；用连接产物转化TB1感受态细胞，蓝白斑筛选，小提质粒，EcoR I和Sal I双酶切，特异PCR方法鉴定阳性克隆，得到含HP-napA的重组质粒pNEB-napA；

(3)重组质粒pMAL-c2X-napA的构建

重组质粒pNEB-napA、表达载体pMAL-c2X经EcoR I和Sal I双酶切后，用Qiaquick凝胶回收试剂盒分别回收napA基因片段、pMAL-c2X双酶切片段；然后将两片段以1∶6的摩尔比混合，用T4DNA连接酶进行连接；用连接产物转化TB1感受态细胞，得到E.coli TBlpMAL-c2X-napA；

(4)制备融合蛋白MBP-NAP

大量诱导E.coli TB1 pMAL-c2X-napA，超声破碎，取上清液，上清经硫酸铵沉淀得粗提物，粗提物脱盐，收集组分真空泵冻干保存即得。

所述融合蛋白MBP-NAP在增强Th1细胞免疫方面的应用。

本发明有益效果：

本发明构建的pMAL-c2X-napA表达质粒，实现了HP-NAP与麦芽糖结合蛋白MBP在大肠杆菌中的高效融合表达，经筛选基因工程菌表达效率高达43％，可溶性产物占总诱导表达蛋白的88％。融合蛋白MBP-NAP表达量高达43.31％，而且主要以可溶性形式存在于细胞质中。

将克隆化基因导入大肠杆菌malE基因下游用于表达融合蛋白的方法，对于病原菌新抗原的纯化、鉴定及功能分析都十分可取。由于转录和翻译的起始由大肠杆菌序列所控制，外源基因往往可以得到高效表达，且比天然蛋白更稳定。蛋白质MBP-NAP可以与直链淀粉树脂特异结合，通过亲合层析浓缩样品。MBP不仅可用于亲合层析，还有商品化的MBP抗血清，用于免疫反应跟踪鉴定实验结果。这对一种新的重组蛋白鉴定尤为重要。MBP与NAP之间有凝血因子Xa识别的四肽序列Ile-Glu-Gly-Arg，可以在精氨酸后特异性地将NAP切下，产生天然蛋白质分子，用于生物学功能研究。MBP-NAP比天然NAP分子更大，可以提高NAP的免疫原性，而且在SDS凝胶电泳中易于鉴定，可将融合蛋白条带切下，冻干后直接用作抗原，制备NAP抗体。

本发明制备的重组蛋白rHP-NAP作为幽门螺杆菌的抗原用于疫苗的研发已有所报道(见郑州大学2005年题目为幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白基因克隆表达及免疫评价的博士论文，作者康巧珍)，但MBP-NAP作为一种广谱基因工程Th1免疫增强剂国内未见同类专利报道。

附图说明

图1是本发明中PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图2是本发明中重组质粒pNEB-napA酶切鉴定图谱；

图3是本发明中重组质粒pMAL-c2X-napA酶切鉴定图谱；

图4是本发明中重组质粒pMAL-c2X-napA特异PCR鉴定图谱；

图5是本发明E.coli.TB1pMAL-c2-napA可溶性蛋白2D电泳图谱；

图6是本发明融合蛋白MBP-NAP的SDS-PAGE和Western blot鉴定图谱；

图7是本发明2D SDS-PAGE分离MBP-NAP的Western blot鉴定图谱；

图8是本发明增强Th1细胞因子分泌鉴定图谱。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。

一融合蛋白的制备：

(一)基因HP-napA的PCR扩增

根据美国国立生物技术信息中心(Naional Center for Biotechnology Information，简称NCBI)网站上公开发表的H.pylori 26695和H.pylori J99全基因组序列，设计PCR引物，并在上游引物5′端引入限制性内切酶EcoR I酶切位点(划线部分)和保护碱基GGA，保留起始密码子ATG；在下游引物5′端引入Sal I酶切位点(划线部分)和保护碱基AA，保留终止密码子TAA。所述引物序列如下：

上游引物P1：5′-GGAGAATTCATGAAAACATTTGAAAT-3′

下游引物P2：5′-AAGTCGACTTAAGCTAAATGGGCTTCTAG-3′

引物由大连TaKaRa公司合成(2个OD)。

以H.pylori临床分离株MEL-HP27基因组DNA为模板，扩增克隆包含HP-NAP编码基因HP-napA的DNA片段，PCR目的基因产物长度为435bp。

分离株MEL-HP27在题目为幽门螺杆菌中性白细胞激活蛋白基因克隆表达及免疫评价的博士论文中公开过，公众可通过郑州大学生物工程系获取该分离株。

PCR扩增体系：共50μl，其中Pyrobest高保真DNA聚合酶(TaKaRa生产)0.25μl(1.25U)，H.pylori DNA 2μl(1μg)，10×PCR Buffer5μl，dNTPs(TaKaRa生产)4μl(各200μM)，上、下游引物各1μl(0.5μM)，再用MilliQ-H₂O(超纯水)将反应体系补充至50μl。

PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃变性50s，50℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环，最后72℃延伸5min即得PCR产物。

(二)重组质粒pNEB-napA的构建

(1)PCR产物经EcoR I和Sal I双酶切后，用Vitagene凝胶回收试剂盒(杭州维特洁生化技术有限公司)回收双酶切片段。

(2)作为克隆载体的质粒pNEB193(英国NEB公司)经EcoR I和Sal I双酶切后，用Vitagene凝胶回收试剂盒回收双酶切片段。

(3)将上述的双酶切片段用T4DNA连接酶进行连接。用连接产物与25μlTB1感受态细胞混合，冰浴5min，加热到42℃保持2min，然后加入100μl LB液体培养基，置于37℃水浴中20min，玻棒涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12h，蓝白斑筛选，小提质粒、限制性内切酶酶切和特异PCR方法(引物与融合蛋白制备中，基因HP-napA的PCR扩增所使用的上、下游引物相同)鉴定阳性克隆，得到含HP-napA的重组质粒pNEB-napA。

所述LB液体培养基为：1g胰蛋白胨(OXOID公司)、1g氯化钠、0.5g酵母浸出粉(OXOID公司)，加入100ml蒸馏水中，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min即得。所述LB平板为：在100mlLB液体培养基中加入1.5g琼脂粉(OXOID公司)，121℃高压灭菌20min，冷却至60℃左右时倾倒平板即得。

(三)重组质粒pMAL-c2X-napA的构建

(1)重组质粒pNEB-napA经EcoR I和Sal I双酶切后，用Qiaquick凝胶回收试剂盒(Qiagen生产)回收napA基因片段；

(2)作为原核表达载体的质粒pMAL-c2X(英国NEB公司)经EcoRI和SalI双酶切后，用Qiaquick胶回收试剂盒回收pMAL-c2X双酶切片段；

(3)将napA基因片段和pMAL-c2X双酶切片段以1∶6的摩尔比混合，用T4DNA连接酶进行连接。将连接产物与25μlTB1感受态细胞混合，冰浴5min，加热到42℃保持2min，加入100μl LB液体培养基，置于37℃水浴中保持20min，然后玻棒涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12h。

(四)制备融合蛋白MBP-NAP

(1)E.coli TB1 pMAL-c2X-napA的大量诱导及超声破碎：

取上述37℃培养12h的菌液10ml，倒入1000ml含100μg/ml氨苄青霉素的培养基中(培养基中含0.02％葡萄糖)，37℃恒温摇床，230r/min培养至2×10⁸细胞/ml时，加入IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为0.3mM，37℃继续振荡培养3h。4℃条件下4000g/min离心20min收集细菌，弃去上清。将细菌重悬于50ml Column Buffer(含20mM pH值7.4的Tris-HCl缓冲溶液，200mM NaCl，1mM EDTA，10mM β-巯基乙醇)中。-20℃冻存12h后，在冷水中解冻，然后将样品置于冰水浴中，进行超声破碎。粉碎条件为：300W超声15s，间歇15s，超声30次至菌液清亮，9000g/min4℃离心30min。

(2)粗提物制备

取50ml上述离心后的上清液，将其放在磁力搅拌器上搅拌，并逐滴加入等体积过饱和硫酸铵溶液，4℃静置30min后，4000g/min离心30min，沉淀即为粗提物，-20℃冻存。

(3)脱盐

用Column Buffer重悬粗提物，浓度调为1mg/ml，HiPrep Desalt 5ml柱在FPLC系统控制下快速脱盐，上样量为每次2ml，流速设4ml/min，自动收集峰组分(2ml)，收集组分真空泵冻干保存，即得融合蛋白MBP-NAP。

二、实验测定：

1、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳实验

取5μl PCR产物与0.5μl 10×溴酚蓝上样缓冲液混合，于含有5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶中进行电泳，电压5V/cm，用100bp DNA ladder做分子量标记，电泳缓冲液为1×TAE，凝胶图像扫描仪分析实验结果见图1。图1中，带1：100bp的DNA ladder；带2～3：PCR产物HP-napA。图中显示出PCR产物为435bp，为目的产物HP-napA。

2、重组质粒pNEB-napA的测定实验

重组质粒pNEB-napA转化的TB1菌液在含40μl X-gal(20mg/ml)、4μl IPTG(200mg/ml)和100μg/ml氨卞青霉素的LB平板上培养12-16h，筛选白色单菌落，增菌培养，碱裂解法提取质粒，EcoR I和Sal I双酶切后，在1％琼脂糖凝胶中电泳，lkb DNA ladder(6μl)作相对分子量标记，重组质粒pNEB-napA酶切鉴定图谱见图2。

图2中，带1：1Kb DNA ladder，带2：pNEB-napA双酶切，带3：pNEB193双酶切，带4：PCR产物。重组质粒pNEB-napA经双酶切后，分别在435bp和2.7kb的位置出现特异条带，与PCR产物和质粒pNEB193的双酶切产物位置相对应(分别为435bp和2.7kb)，说明重组质粒pNEB-napA中已插入HP-napA片段。

3、重组质粒pMAL-c2X-napA的测定实验

将重组质粒pMAL-c2X-napA转化TB1感受态细胞后，涂布于含100μg/ml氨卞青霉素的LB平板上，37℃培养12h，筛选阳性克隆子，提取质粒，酶切鉴定图谱见图3。图3中，带1：IKbDNA Ladder；带2：pMAL-c2X-napA经E.coRI酶切；带3：pMAL-c2X-napA经EcoR I和Sal I双酶切；带4：pMAL-c2X经E.coRI酶切；带5：HP-napA PCR片段。pMAL-c2X-napA经EcoR I和Sal I双酶切后，1％琼脂糖电泳检测，分别在HP-napA和pMAL-c2X片段的位置出现特异条带，证明HP-napA已经以正确的阅读框架定向插入pMAL-c2X质粒的tac启动子下游。

以重组质粒pMAL-c2X-napA为模板，用HP-napA的特异性引物(即与融合蛋白制备中，基因HP-napA的PCR扩增所使用的上、下游引物)进行PCR扩增，重组质粒pMAL-c2X-napA的特异PCR鉴定图谱见图4。图4中，带1：100bp DNA Ladder；带2～4：以重组质粒pMAL-c2X-napA为模板，PCR扩增napA。结果表明所筛选的3个阳性克隆，在435bp位置均扩增出特异条带，进一步证实重组质粒中含有外源基因目的片段。

4、融合蛋白MBP-NAP的鉴定

E.coli.TB1pMAL-c2X-napA可溶性蛋白2D SDS-PAGE电泳图谱见图5。PDQuest7.32-D软件分析MBP-NAP分子量约为59000，pI值约为5.2与理论值一致。

以兔抗MBP血清为第一抗体(1∶1000)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为第二抗体(1∶5000)，分别对SDS-PAGE 1D和2D电泳分离的MBP-NAP进行Western blot鉴定，结果见图6、7。由试验结果可以看出诱导表达量最高的蛋白能被MBP特异抗血清识别，进一步证实融合表达载体构建成功，外源基因与MBP基因融合表达。

5、融合蛋白MBP-NAP增强小鼠Th1细胞免疫实验

使用ELISA试剂盒(BD Pharmingen生产)检测小鼠CD4⁺T淋巴细胞培养上清中IL-2和IFNγ的分泌情况。结果见图8。由图8可知，使用融合蛋白MBP-NAP刺激的Th1细胞相关因子IL-2和IFNγ分泌量明显增高，Th1阳性细胞由原来的23％上升至37％。因此，融合蛋白MBP-NAP可以增强Th1细胞免疫。

序列表

<110>郑州大学

<120>融合蛋白MBP-NAP及其制备方法和应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>535

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>1

Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys

1               5                   10                  15

Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr

            20                  25                  30

Gly Ile Vas Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe

        35                  40                  45

Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala

    50                  55                  60

His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile

65                   70                  75                  80

Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

                85                   90                 95

Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu

            100                 105                 110

Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys

        115                 120                 125

Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly

    130                 135                 140

Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

145                 150                 155                 160

Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

                165                 170                 175

Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly

            180                 185                 190

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp

        195                 200                 205

Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala

    210                 215                 220

Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys

225                 230                 235                 240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser

                245                 250                 255

Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro

            260                 265                 270

Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

        275                 280                 285

Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala

    290                 295                 300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala

305                 310                 315                 320

Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln

                325                 330                 335

Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala

            340                 345                 350

Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn

        355                 360                 365

Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile

    370                 375                 380

Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Met Lys Thr Phe Glu Ile Leu Lys His

385                 390                 395                 400

Leu Gln Ala Asp Ala Ile Val Leu Phe Met Lys Val His Asn Phe His

                405                 410                 415

Trp Asn Val Lys Gly Thr Asp Phe Phe Asn Val His Lys Ala Thr Glu

            420                 425                 430

Glu Ile Tyr Glu Glu Phe Ala Asp Met Phe Asp Asp Leu Ala Glu Arg

        435                 440                 445

Ile Val Gln Leu Gly His His Pro Leu Val Thr Leu Ser Glu Ala Ile

    450                 455                 460

Lys Leu Thr Arg Val Lys Glu Glu Thr Lys Thr Ser Phe His Ser Lys

465                 470                 475                 480

Asp Ile Phe Lys Glu Ile Leu Glu Asp Tyr Lys His Leu Glu Lys Glu

                485                 490                 495

Phe Lys Glu Leu Ser Asn Thr Ala Glu Lys Glu Gly Asp Lys Val Thr

            500                 505                 510

Val Thr Tyr Ala Asp Asp Gln Leu Ala Lys Leu Gln Lys Ser Ile Trp

        515                 520                 525

Met Leu Gln Ala His Leu Ala

    530                 535

Claims (3)

1.融合蛋白MBP-NAP，具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。

2.权利要求1所述融合蛋白MBP-NAP的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)基因HP-napA的PCR扩增

根据H.pylori J99全基因组序列设计一对PCR引物，所述引物序列如下：

上游引物P1：5′-GGAGAATTCATGAAAACATTTGAAAT-3′

下游引物P2：5′-AAGTCGACTTAAGCTAAATGGGCTTCTAG-3′

以MEL-HP27基因组DNA为模板，扩增包含目的基因HP-napA的DNA片段，HP-napA基因长度为435bp；

(2)重组质粒pNEB-napA的构建

PCR产物、质粒pNEB193经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后，用Vitagene凝胶回收试剂盒分别回收双酶切片段，将两者的双酶切片段用T4DNA连接酶进行连接；用连接产物转化TB1感受态细胞，蓝白斑筛选，小量提质粒，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，特异PCR方法鉴定阳性克隆，得到含HP-napA的重组质粒pNEB-napA；

(3)重组质粒pMAL-c2X-napA的构建

重组质粒pNEB-napA、表达载体pMAL-c2X经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后，用Qiaquick凝胶回收试剂盒分别回收双酶切片段；然后将两片段以1∶6的摩尔比混合，用T4DNA连接酶进行连接；用连接产物转化TB1感受态细胞，得到E.coli TB1 pMAL-c2X-napA；

(4)制备融合蛋白MBP-NAP

大量诱导E.coli TB 1pMAL-c2X-napA，超声破碎，取上清液，硫酸铵沉淀法得粗提物，粗提物脱盐，收集组分真空泵冻干保存即得。

3.权利要求1所述融合蛋白MBP-NAP在增强Th1细胞免疫方面的应用。

Images