CN107875375A - rMBP‑NAP调控巨噬细胞及直接抗肿瘤的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了rMBP‑NAP调控巨噬细胞的用途，本发明人意外发现，所述MBP‑NAP可促进巨噬细胞增殖和/或增强巨噬细胞吞饮能力和/或促进巨噬细胞向M1型极化。本发明还提供了MBP‑NAP融合蛋白直接抗肿瘤的应用。

Description

rMBP-NAP调控巨噬细胞及直接抗肿瘤的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域。
背景技术
巨噬细胞广泛分布在机体的组织和器官中，在病原体防御、炎症反应、稳态维持及损伤修复中发挥重要作用，还可作为专职抗原提呈细胞加工提呈抗原激活适应性免疫应答。根据激活方式的不同，巨噬细胞可被极化为M1和M2两种表型。由LPS或IFN-γ等活化的经典活化型巨噬细胞(M1型)，能够高表达iNOS，分泌NO、ROI等杀伤分子以及TNF-α、IL-6、IL-12等促炎因子。而由IL-4等活化的替代活化型巨噬细胞(M2型)，则大量分泌IL-10和TGF-β等抗炎因子，参与炎症的消解、组织重塑、血管生成，并能促进肿瘤的生长。巨噬细胞极化失衡与多种疾病发生发展相关。在脓毒血症、炎性肠炎等疾病病程中，巨噬细胞的M1型极化明显增强，促进了疾病过程中的免疫损伤；而在结核、HIV和多种肿瘤等疾病病程中，巨噬细胞的M2型极化明显增强，促进了细菌、病毒和肿瘤的增殖和逃逸。因此，寻找巨噬细胞极化调控靶点，研发新型巨噬细胞免疫调节剂对治疗急慢性炎症、病毒感染等多种疾病均有理论和现实意义。
幽门螺杆菌的毒力因子有HP-NAP、CagA、CagPAI、VacA、OipA、BabA等，均可引起炎症反应，经本课题组研究发现Hp-NAP是幽门螺杆菌的重要毒力因子。本实验室在中国第一个提交了HP-NAP的编码基因序列(Gnebank登录号AY366361)，构建了新型重组蛋白rMBP-NAP并围绕MBP-NAP序列申请了专利。目前，rMBP-NAP对于巨噬细胞的作用尚未见相关研究，也没有文献公开其直接抗肿瘤的用途。
发明内容
第1方面，本发明提供了MBP-NAP融合蛋白调控巨噬细胞的用途，所述用途为促进巨噬细胞增殖和/或增强巨噬细胞吞饮能力和/或促进巨噬细胞向M1型极化。
第2方面，本发明提供了促进巨噬细胞增殖的促进剂，该促进剂包括MBP-NAP融合蛋白，MBP-NAP的单位剂量可为10-100ug/mL，如10、25、50、100ug/mL。
第3方面，本发明提供了增强巨噬细胞吞饮能力的增强剂，包括MBP-NAP融合蛋白，MBP-NAP的单位剂量可为5-50ug/mL，如10、25、50ug/mL。
第4方面，本发明提供了促进巨噬细胞M1型极化的促进剂，包括MBP-NAP融合蛋白，MBP-NAP的单位剂量可为25-100ug/mL，如为25ug/mL、50ug/mL或100ug/mL。
前面1-4方面所提巨噬细胞可为未活化型巨噬细胞如RAW264.7巨噬细胞，或为M2型巨噬细胞，所述M2型巨噬细胞可由膀胱癌细胞培养上清液诱导未活化型巨噬细胞制得，膀胱癌细胞可为MB49膀胱癌细胞。
第5方面，本发明提供了MBP-NAP融合蛋白直接抗肿瘤的应用，如抗膀胱癌，应用形式可为药物或保健品。
有益效果：
本发明公开了MBP-NAP作为巨噬细胞免疫调节剂中的用途，比如促进巨噬细胞增殖、增强巨噬细胞吞饮能力和促进巨噬细胞向M1型极化，本发明还优化了对应用途的单位剂量。另外，文献报道HP-NAP不可以直接抑制肿瘤，而本发明人意外发现蛋白MBP-NAP则可直接抑制膀胱癌的增殖和迁移。
附图说明
图1为实验1RAW264.7细胞增殖结果对比图。
图2为实验2RAW264.7细胞吞饮能力对比图。
图3A为实验3.1RAW264.7细胞NO含量检测结果图；图3B为实验3.2RAW264.7细胞IL-10分泌量检测结果图；图3C为实验3.3PCR检测巨噬细胞极化相关基因mRNA水平对比图。
图4.2A为实验4.2PCR检测TCS诱导的RAW264.7细胞iNOS表达结果；
图4.2B为实验4.2PCR检测TCS诱导的RAW264.7细胞IL-10表达结果；图4.2C为实验4.2Griess法检测TCS诱导的RAW264.7细胞NO释放水平结果；图4.2D为实验4.2ELISA检测TCS诱导的RAW264.7细胞IL-10分泌水平结果；图4.2E为实验4.2Griess法检测TCS诱导的RAW264.7细胞与经MBP-NAP进一步处理的细胞，NO释放水平对比；图4.2F为实验4.2ELISA检测TCS诱导的RAW264.7细胞与经MBP-NAP进一步处理的细胞，IL-10分泌水平对比。
图4.3为实验4.3MB49细胞增殖检测结果。
图4.4A为实验4.4MB49细胞迁移显微镜图，其中18h时相对迁移率计算如图4.4B所示，24h计算如图4.4C所示。
以上各图涉及的图示的含义：ns P＞0.05,*P＜0.05,**P＜0.01，***p<0.001。
具体实施方式
实验1、rMBP-NAP促进RAW264.7巨噬细胞增殖
方法：CCK-8法检测RAW264.7细胞增殖
(1)收集生长状态良好RAW264.7的细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/mL，每孔100μL，铺于96孔板中，预培养一段时间使细胞贴壁。
(2)分别使用不同浓度rMBP-NAP(10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)对细胞进行处理，同时以PBS为阴性对照，LPS(1μg/mL)为阳性对照，每组设置5个复孔，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
(3)培养24h后，添加CCK-8溶液，10μL/孔，置于培养箱中孵育4h，测定450nm处的吸光度。
(4)细胞增殖率计算公式：细胞增殖率＝(实验组OD450-对照组OD450)/对照组OD450×100％。
检测结果如附图1所示。
实验2、rMBP-NAP增强RAW264.7巨噬细胞吞饮能力
方法：
(1)收集生长状态良好RAW264.7的细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×105/mL，每孔200μL，铺于96孔板中，预培养一段时间使细胞贴壁。
(2)分别使用不同浓度rMBP-NAP(10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)对细胞进行处理，同时以PBS为阴性对照，LPS(1μg/mL)为阳性对照，每组设置5个复孔，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
(3)培养24h后，吸去培养基，每孔加入200μL 0.1％中性红溶液，37℃孵育1h，吸去中性红溶液。
(4)每孔加入200μL PBS进行洗板并在吸水纸上吸干，重复3次，去除多余的染液。
(5)每孔加入200μL裂解液(醋酸：无水乙醇＝1:1)，4℃过夜。
(6)490nm测定吸光度。
结果：
rMBP-NAP作用RAW264.7细胞24h后，用0.1％中性红溶液评估巨噬细胞的吞饮能力。结果如附图2所示，与对照组(PBS处理)相比，5μg/mLrMBP-NAP刺激的RAW264.7细胞吞饮能力提升了30％，当rMBP-NAP作用浓度增大到25μg/mL时，RAW264.7细胞能提高61％吞饮能力。
实验3、rMBP-NAP诱导RAW264.7巨噬细胞向M1型极化
方法：
3.1Griess法检测RAW264.7细胞NO含量
(1)收集生长状态良好RAW264.7的细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/mL，每孔100μL，铺于96孔板中，预培养一段时间使细胞贴壁。
(2)分别使用不同浓度rMBP-NAP(10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)对细胞进行处理，同时以PBS为阴性对照，LPS(1μg/mL)为阳性对照，每组设置5个复孔，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
(3)培养24h后，收集细胞培养上清。
(4)用含10％FBS的DMEM培养基稀释标准品(1M NaNO2)，标准品的浓度为0,1,2,5,10,20,40,60,100μM。
(5)依次向96孔板中加入标准品及细胞培养上清(50μL/孔)，室温Griess ReagentI(50μL/孔)，室温Griess ReagentⅡ(50μL/孔)，混匀。
(6)540nm测定吸光度。
检测结果如附图3A所示。
3.2ELISA检测RAW264.7细胞IL-10分泌
按照Biolegend公司试剂盒说明书进行：
(1)按照前面3.1部分的实验方法处理细胞，收集细胞培养上清。
(2)实验前将所有所需试剂放置室温平衡，根据检测样品的数目，向96孔板中加入300μL/孔的1×Wash Buffer，浸泡后用吸水纸将孔板液体轻轻拍干，共洗涤4次。
(3)每孔加入50μL Assay Buffer A，接着向前7个孔分别加入50μL梯度稀释的标准品，剩余孔中加入待检测样品，封板，并在200rpm转速下，室温孵育2h。
(4)弃去板中剩余液体，按照步骤2的方法，用1×Wash Buffer洗板4次。
(5)每孔加入100μL Mouse Detection Antibody，封板，并在200rpm转速下，室温孵育1h。
(6)弃去板中剩余液体，用1×Wash Buffer洗板4次。
(7)每孔加入100μL Avidin-HRP D Solution，封板，并在200rpm转速下，室温孵育30min。
(8)弃去板中剩余液体，用1×Wash Buffer洗板5次，最后一次，将板浸泡1min。
(9)每孔加入100μL Substrate Solution F，避光室温孵育30min。
(10)每孔加入100μL Stop Solution。
(11)30min内，用酶标仪测定450nm处的吸光度。
检测结果如附图3B所示。
3.3荧光定量PCR检测巨噬细胞极化相关基因
1细胞处理及总RNA提取
(1)收集生长状态良好RAW264.7的细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106/mL，每孔2mL，铺于6孔板中，预培养一段时间使细胞贴壁。分别使用50μg/mL rMBP-NAP和等量PBS对细胞进行处理，每组设置3个复孔，处理6h后，分别收集各孔细胞至无菌离心管中。
(2)加入500μL RL Solution，用枪头反复吹打至全部细胞溶解，吸取全部裂解液于1.5mL离心管中。
(3)加入40μL氯仿，快速震荡混匀，12000rpm离心3min。
(4)吸取350μL上清于新的1.5mL离心管中，加入等体积无水乙醇，充分混匀。
(5)将混匀液吸入Spin Column管中，12000rpm离心1min，弃滤液。
(6)加入600μL Wash Buffer，弃滤液，重复1次。
(7)12000rpm离心1min，彻底去除滤液，将Spin Column放入新的无RNA酶的1.5mL离心管中。
(8)向滤膜中心加入50μLRNase-Free Water，室温静置1-2min，12000rpm离心1min，收集滤液，获得总RNA。
2反转录
(1)使用Nanodrop 2000测定RNA浓度。
(2)取0.2mL无菌无RNA酶离心管，加入下列成分：
(3)在42℃水浴锅中温浴2min，迅速置于冰上冷却，并加入下列成分：
(4)上述操作均在冰上进行，加样完成后，按照程序：37℃，15min→85℃，5s→4℃，∞在PCR仪中进行反转录。
(5)反转录结束后，使用Nanodrop 2000测定DNA浓度，用无菌超纯水调整样品DNA浓度为250ng/μL，按10μL/管进行分装，保存于-80℃备用。
3引物设计与合成
参考现有文献，使用如下引物：
4荧光定量PCR
(1)引物离心后，按照说明加入相应量无菌超纯水溶解引物至100μM，以5μL/管进行分装，-20℃储存。使用时，每管另加45μL无菌超纯水稀释引物至10μM。
(2)将保存于-80℃的DNA取出，置于冰上融化，每管另加40μL无菌超纯水稀释DNA至50ng/μL。
(3)于冰上配制如下反应体系(25μL)：
(4)PCR扩增条件：
预变性 95℃，10min
PCR反应(40个循环) 95℃，15s→60℃，60s
溶解 60℃→95℃，每5s升温1℃
各循环在60℃退火时获取
荧光。
(5)反应结束后，设定适当阈值(一般为0.1)，获取相应Ct值，根据2-△△Ct算法，计算基因的相对表达量。具体计算方式为：Relative mRNA level＝2-[待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值]-[对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值]。
结果如附图3C所示。
实验4、rMBP-NAP调节MB49膀胱癌细胞培养上清处理的巨噬细胞由M2型向M1型极化及抗癌实验
4.1MB49膀胱癌细胞培养上清的制备
(1)收集生长良好的MB49细胞，以1×106cells/孔铺于6孔板中，每孔2mL培养基。
(2)待细胞生长至90％融合时，弃去原有培养基，PBS润洗2次。
(3)更换新鲜完全培养基继续培养24h，收集培养上清。
(3)用0.22μm滤器过滤细胞培养上清(以下简称为TCS(tumor cell culturalsupernatants))，-80℃保存备用。
4.2MB49-TCS诱导RAW264.7细胞及极性鉴定
(1)收集生长良好的RAW264.7细胞，调整细胞浓度为1×106cells/mL，按2mL/孔铺于6孔板或100μL/孔铺于96孔板，预培养一段时间至细胞贴壁。
(2)弃去原有培养基，PBS润洗2次。
(3)更换含有40％TCS的完全培养基继续培养48h，收集细胞(6孔板)或培养上清(96孔板)。
(4)将收集的TCS诱导的RAW264.7细胞按1×106cells/mL，每孔100μL铺于96孔板中，50μg/mL rMBP-NAP处理24h后，收集细胞培养上清。
(5)qRT-PCR检测步骤3TCS诱导的RAW264.7细胞iNOS、IL-10表达情况：具体实验方法参考前面实验3的3.3部分，结果依次如图4.2A、4.2B所示。
(6)Griess法检测RAW264.7细胞NO释放水平：具体实验方法参考前面实验3的3.1部分，对TCS诱导的细胞的检测结果如图4.2C所示，与经MBP-NAP进一步处理后的细胞，检测结果对比如图4.2E所示。
(7)ELISA检测RAW264.7细胞IL-10分泌水平：具体实验方法参考前面实验3的3.2部分，对TCS诱导的细胞的检测结果如图4.2D所示，与经MBP-NAP处理进一步处理后的细胞，检测结果对比如图4.2F所示。
4.3CCK-8法检测MB49细胞增殖
(1)收集生长良好的MB49细胞，按1×104cells/mL，每孔100μL，铺于96孔板中，预培养一段时间使细胞贴壁。
(2)分别使用不同浓度rMBP-NAP(10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)对细胞进行处理，每组设置5个复孔，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
(3)在培养24h、48h、72h后，添加CCK-8溶液，10μL/孔，置于培养箱中孵育4h，测定450nm处的吸光度OD450，结果如图4.3所示。
4.4划痕实验检测MB49细胞迁移
(1)取新的无菌6孔板，用marker笔在6孔板的背面画直线标记，约0.5cm一道，每孔5条。
(2)收集生长良好的MB49细胞，调整细胞浓度为5×105cells/孔，培养至细胞汇合度达到80％以上，细胞铺板数量可根据具体情况调整，掌握为过夜能铺满。
(3)取无菌直尺，用枪头比着直尺垂直于背面标记横线划痕，划痕时，枪头保持垂直，动作果断。
(4)用预温的PBS润洗3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基培养。
(5)分别使用不同浓度rMBP-NAP(10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)对细胞进行处理，PBS处理作为对照，每组设置3个复孔，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
(6)从0h开始，每隔6h在显微镜下观察，拍照采集图像(以背面横线为参照，采集同一位置不同时刻图像)，每孔采集5个以上位点，结果如图4.4A所示。
(7)使用Image J图像分析软件计算划痕面积S。相对迁移率％＝(S0h-Sxh)/S0h×100％，18h时如图4.4B所示，24h时如图4.4C所示。
本文可能涉及的英文缩写的解释：

Claims (10)

1.MBP-NAP融合蛋白在制备抗肿瘤的药物或保健品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述肿瘤为膀胱癌。
3.MBP-NAP融合蛋白在制备巨噬细胞免疫调节剂中的用途，所述用途为促进巨噬细胞增殖和/或增强巨噬细胞吞饮能力和/或促进巨噬细胞向M1型极化。
4.如权利要求3所述的用途，其特征是，所述巨噬细胞为未活化型巨噬细胞或M2型巨噬细胞，所述M2型巨噬细胞可由膀胱癌细胞培养上清液诱导未活化型巨噬细胞制得。
5.促进巨噬细胞增殖的促进剂，包括MBP-NAP融合蛋白。
6.如权利要求5所述的促进剂，其特征是，所述MBP-NAP的单位剂量为10-100ug/mL。
7.增强巨噬细胞吞饮能力的增强剂，包括MBP-NAP融合蛋白。
8.如权利要求7所述的增强剂，其特征是，所述MBP-NAP的单位剂量为5-50ug/mL。
9.促进巨噬细胞M1型极化的促进剂，包括MBP-NAP融合蛋白。
10.如权利要求9所述的促进剂，其特征是，所述MBP-NAP的单位剂量为25-100ug/mL，如为25ug/mL、50ug/mL或100ug/mL。
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CN109771637A (zh) * 2019-01-30 2019-05-21 郑州大学 一种抗特应性皮炎的蛋白

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