CN104946758A - 白假丝酵母菌的lamp检测引物组、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

白假丝酵母菌的lamp检测引物组、检测试剂盒和检测方法 Download PDF

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郭建
李海鹏
陈旭
徐凌佳
孔继烈
方雪恩
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Fudan University
Shanghai East Hospital
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Abstract

本发明公开了一种白假丝酵母菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。检测引物组包括四条特异性引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；试剂盒还可以有显色剂或荧光指示剂；其检测方法是通过提取待检样品的DNA、采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝，其鉴定采用反应管内沉淀的浊度变化、加入显色剂观察反应管内颜色变化、利用实时荧光检测仪观察确定待检样品是否含有白假丝酵母菌。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。

Description

白假丝酵母菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法
技术领域
 本发明属于分子生物学技术领域，属于真菌品种的检测方法，具体的说是涉及白假丝酵母菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
近年来，随着人类环境、疾病等方面的改变，真菌类感染的发病率呈现逐年上升的趋势。假丝酵母属（Candida Berkhout）是酵母菌中最大的一个属，包括163个种，约占目前已知酵母菌种数的 1/3；白假丝酵母菌亦称白色念珠菌，是导致真菌感染的重要致病菌之一。白假丝酵母菌广泛分布于自然界，以及正常人体的皮肤、口腔、肠道、肛门、阴道等处，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，为条件致病菌。当机体抵抗力降低或菌群失调时，白假丝酵母菌就会繁殖并改变生长形式侵入人体细胞从而引起疾病。随着获得性免疫缺陷综合征、肿瘤等疾病发病率的上升，以及免疫抑制剂、抗生素及侵入性治疗的广泛应用，使白假丝酵母菌成为常见的感染病原菌。
白假丝酵母菌细胞呈卵圆形，致病性菌株细胞呈现假菌丝。该菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，以 37℃或室温孵育 2～3d 后，生成灰白乳酪样菌落；涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。若接种于4％玉蜀黍琼脂上，室温孵育3～5d可见假菌丝，芽生孢子，厚膜孢子。白假丝酵母菌对热的抵抗力不强，加热至 60℃，1h后即可死亡。但对干燥、日光、紫外线及化学制剂等抵抗力较强。
白假丝酵母菌引起浅表性感染和深部感染，引起的相关疾病有皮肤念珠菌病，包括指趾间糜烂，多见于长期从事潮湿作业的人、念珠菌性间擦疹多见于小儿和肥胖多汗者、丘疹形念珠菌病多见于肥胖儿童、念珠菌性甲沟炎、甲床炎等多见于指甲；粘膜念珠菌病，多见于婴幼儿患者的鹅口疮以及生殖器念珠菌病；而深部感染疾病则包括内脏念珠菌病，该感染可累及全身所有内脏器官，其中以肠念珠菌病及肺念珠菌病较常见。此外还可引起泌尿道炎、肾孟肾炎、心内膜炎及脑膜炎等，偶见其引发念珠菌性败血症。念珠菌疹，即念珠菌及其代谢产物引起的皮肤变态反应，主要损害为成群的无菌性水疱，多见于手指间；也可见到银屑病样、玫瑰糠疹样、脂溢性皮炎样、荨麻疹样、离心性环状红斑样损害。
由此可见，开展白假丝酵母菌快速检测方法的研究具有十分重要的意义。目前有关白假丝酵母菌快速检测的方法主要分为2种：
1）以微生物培养为主的传统检测方法。首先增菌培养，取供试液10ml直接或处理后接种至适量的沙氏葡萄糖液体培养基中，培养48～72h。然后取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24～48h，必要时延长至72h，根据菌落形态初步判定。
2）以定性PCR和实时定量PCR检测方法为基础的分析法。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，微量、特定的目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后很容易观察鉴别，具有快速、灵敏等优点。
然而，上述2种检测方法存在检测周期长、检测体系和操作过程比较复杂，难以实行现场检测等问题，且需要专业人员操作；PCR仪价格在5万元左右，扩增需要2～3小时，电泳检测需要1小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性。因此，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的检测方法。
环介导等温基因扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、容易普及、安全可靠的优点，可是目前尚未有将LAMP法应用于快速检测白假丝酵母菌的试剂盒。
发明内容
本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种白假丝酵母菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒以及一种基于上述检测引物组和检测试剂盒的白假丝酵母菌的恒温基因扩增检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：一种白假丝酵母菌的LAMP检测引物组，其包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物1：TAAGTATTTGGGAGAAGGGA（SEQ ID No：1）；
外引物2：AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA（SEQ ID No：2）；
内引物1：CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA（SEQ ID No：3）；
内引物2：GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG（SEQ ID No：4）。
一种白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒，其包括以下成分：
（1）引物液：含有权利要求1所述的白假丝酵母菌的LAMP检测引物组，所述引物液中各引物的浓度分别为48～52μM外引物1、48～52μM外引物2，48～52μM内引物1、48～52μM内引物2；
（2）反应液：含有12mM dNTP、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，所述dNTP、反应缓冲液和MgSO4水溶液的体积比是7～9：4～6：2；
（3）DNA聚合酶：DNA聚合酶的浓度为7～9U/μl；
（4）对照：阳性对照为白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
作为本发明的优选实施方案：引物液中含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2。DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μl。反应液中12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反应缓冲液：150mM MgSO4水溶液的体积比为8：5：2。
一种白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒检测白假丝酵母菌的检测方法，包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA；
2）恒温检测反应：在PCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；
3）结果判断：通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。
作为本发明进一步的方案：检测试剂盒还含有显色剂，显色剂为荧光染料Calcein。
一种白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒检测白假丝酵母菌的检测方法，包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA；
2）恒温检测反应：在200μl PCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液 15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；
3）结果判断：在上述PCR管中加入1～2μl显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。
作为本发明进一步的方案：检测试剂盒还含有荧光指示剂，荧光指示剂为SYTO-9。
一种白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒检测白假丝酵母菌的检测方法，包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA；
2）恒温检测反应：在200μl PCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液 15.2 μl，DNA聚合酶1μl，荧光指示剂SYTO-9 1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于实时荧光检测仪（如qPCR仪等）在60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；
3）结果判断：根据是否出现S型扩增曲线判断扩增结果。
本发明中采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA的方法为：（1）在待测样品中加入3倍体积的4%的NaOH或NALC-NaOH；（2）涡旋振荡混匀，室温下放置15 min，然后吸取1 ml加入带旋盖的离心管中；（3）12000 rpm离心10 min，去上清液；（4）加入0.9％的NaCl或生理盐水1 ml，混匀，12000 rpm离心10 min，去上清液；（5）加入100μl的DNA提取液；（6）100℃加热10 min，加热后迅速冷却（置于-20℃冰箱）10 min；（7）12000 rpm离心2 min，将上清转移至新的离心管中备用。
dNTP为脱氧核糖核苷三磷酸的缩写,是包括dATP, dGTP, dTTP, dCTP,等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种,在生物DNA合成中，以及各种PCR中起原料作用。10×Isothermal Amplification反应缓冲液为10倍等温扩增的反应缓冲液。荧光染料Calcein为荧光染料钙黄绿素。DNase/RNase-Free Distilled Water为DNA酶/酶的蒸馏水。
本发明的有益效果是：本发明基于环介导等温扩增技术LAMP法，根据靶基因设计的四条引物能特异性识别靶基因序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎－环DNA混合物。采用4条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在60～65℃对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行，反应时间依据模板DNA质量变化，一般为90min或更少，在45～90min的短时间内扩增效率可以达到109～1010个拷贝。加入模板DNA，在60～65℃反应45～90min后，在80℃保温2min，终止反应。在反应中，有核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中Mg离子结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。
与现有技术相比，本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果：
（1）快速高效：整个扩增只用45～90min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
（2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部实时荧光检测仪就能反应和检测，条件比较温和；
（3）高特异性：本发明根据白假丝酵母菌的特异内源基因处设计了四条特异性引物，应用上述四条引物，扩增靶序列的6个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
（4）高灵敏度：最低检测极限可达到100个拷贝；
（5）鉴定简便：可通过观察加入Calcein颜色变化、是否存在焦磷酸镁沉淀或是否出现“S”型扩增曲线来判断扩增与否，无需电泳等其它任何分析步骤，适合现场检测。
附图说明
图1是实施例1的显色检测结果图（1：阳性对照；2-5：待检样品； 6：阴性对照）；
图2是实施例1的扩增检测结果图（1：阳性对照；2-5：待检样品； 6：阴性对照）；
图3是实施例2的显色检测结果图（1：阳性对照；2-5：待检样品； 6：阴性对照）；
图4是实施例2的扩增检测结果图（1：阳性对照；2-5：待检样品； 6：阴性对照）；
图5是实施例3的扩增检测结果图（1：阳性对照；2-7依次为：105 cfu/ml、104 cfu/ml、103 cfu/ml、102 cfu/ml、101 cfu/ml、100 cfu/ml的样品DNA；8：阴性对照）；
图6是实施例3的电泳检测结果图（1：阳性对照；2-7依次为：105 cfu/ml、104 cfu/ml、103 cfu/ml、102 cfu/ml、101 cfu/ml、100 cfu/ml的菌体DNA；8：阴性对照）；
图7是实施例4的扩增检测结果图（1-20依次为：白假丝酵母菌（ATCC 66027）、热带假丝酵母（ATCC66029）、热带假丝酵母（分泌物）、热带假丝酵母（粪便）、热带假丝酵母（尿液）、克柔假丝酵母菌（ATCC6258）、克柔假丝酵母菌（痰液）、克柔假丝酵母菌（血液）、近平滑假丝酵母菌（ATCC22019）、近平滑假丝酵母菌（粪便）、近平滑假丝酵母菌（引流物）、近平滑假丝酵母菌（痰液）、光滑假丝酵母菌（ATCC MYA-2950）、光滑假丝酵母菌（血液）、光滑假丝酵母菌（尿液）、季也蒙假丝酵母菌（血液）、季也蒙假丝酵母菌（痰液）、挪威假丝酵母菌（尿液）、都柏林假丝酵母菌（分泌物）、红酵母菌（分泌物）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：含显色剂的试剂盒及检测方法：
一种白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和显色剂：
（1）引物液：含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2，四条引物为：
外引物1：TAAGTATTTGGGAGAAGGGA（SEQ ID No：1）；
外引物2：AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA（SEQ ID No：2）；
内引物1：CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA（SEQ ID No：3）；
内引物2：GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG（SEQ ID No：4）；
（2）反应液：含有12mM dNTP、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2；
（3）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；
（4）对照：含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
（5）显色剂：荧光染料Calcein。
用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取纯化待测样品DNA；
2）恒温检测反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物液1.8μl，反应液 15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃持续2min；
3）结果判断：在上述反应管中加入2μl显色剂，混匀，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。
本实施例中，阴性对照显现橙色，阳性对照显现绿色，待测样品1、2的PCR管显绿色（图1中管2，3），表明待测样品1、2中含有白假丝酵母菌，待测样品3、4的PCR管显橙色（图1中管4，5），表明待测样品3、4中不含白假丝酵母菌。
一种白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和荧光指示剂：
（1）引物液：含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2，四条引物为：
外引物1：TAAGTATTTGGGAGAAGGGA（SEQ ID No：1）；
外引物2：AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA（SEQ ID No：2）；
内引物1：CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA（SEQ ID No：3）；
内引物2：GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG（SEQ ID No：4）；
（2）反应液：含有12mM dNTP、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2；
（3）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；
（4）对照：含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
（5）荧光指示剂：SYTO-9。
用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取纯化待测样品DNA；
2）恒温检测反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物液1.8μl，反应液 15.2μl，DNA聚合酶1μl，SYTO-9 1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于LineGene 9640 qPCR仪上60～65℃反应45～90min，并在80℃持续2min；
3）结果判断：根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果，若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没显现“S”型扩增曲线则为阴性。
本实施例中，阴性对照显现“直线”扩增曲线，阳性对照显现“S”型扩增曲线，待测样品1、2的显现“S”型扩增曲线（图2中样品2，3），表明待测样品1、2中含有白假丝酵母菌，待测样品3、4显现“直线”扩增曲线（图2中样品4，5），表明待测样品3、4中不含白假丝酵母菌。
参照Claudia Schabereiter-Gurtner等《Development of Novel Real-Time PCR Assays for Detection and Differentiation of Eleven Medically Important Aspergillus and Candida Species in Clinical Specimens》中的引物Cand-F: TCCCGCTCTAGCGCTTCAAT（SEQ ID No.5），ITS-R: TCGAGCAGGACCTGCAGAA（SEQ ID No.6）和探针C.alb-S Probe: Cy5 -CATTGCTTGCGGCGGTA-biotin（SEQ ID No.7）进行荧光定量PCR检验，检验结果与上述LAMP方法结果相一致。
实施例2 ：不含显色剂的试剂盒及其检测方法：
试剂盒中除缺少实施例1中的显色剂和荧光指示剂外，其余同实施例1。
用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取纯化待测样品DNA；
2）恒温检测反应：在200ul PCR管配制反应体系：引物液1.8μl，反应液 15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃持续2min；
3）结果判断：将反应管放置在浊度仪中按2）中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化或是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果：如果出现沉淀则为阳性，无沉淀则为阴性；若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没显现“S”型扩增曲线则为阴性。
本实施例中，阴性对照无沉淀，阳性对照产生沉淀，待测样品1、2的PCR管出现沉淀（图3管2、3）、显现“S”型扩增曲线（图4线2、3），表明待检样品1、2中含有白假丝酵母菌，。待测样品3、4的PCR管没有出现沉淀（图3管4、5）、没有显现“S”型扩增曲线（图4线4、5），表明待检样品3、4中不含白假丝酵母菌。
参照Claudia Schabereiter-Gurtner等《Development of Novel Real-Time PCR Assays for Detection and Differentiation of Eleven Medically Important Aspergillus and Candida Species in Clinical Specimens》中的引物Cand-F: TCCCGCTCTAGCGCTTCAAT（SEQ ID No.5），ITS-R: TCGAGCAGGACCTGCAGAA（SEQ ID No.6）和探针C.alb-S Probe: Cy5 -CATTGCTTGCGGCGGTA-biotin（SEQ ID No.7）进行荧光定量PCR检验，检验结果与上述LAMP方法结果相一致。
实施例3：PCR反应与本发明检测方法灵敏度的比较：
按下列配方制备白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒：
（1）引物液：含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2，四条引物为：
外引物1：TAAGTATTTGGGAGAAGGGA（SEQ ID No：1）；
外引物2：AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA（SEQ ID No：2）；
内引物1：CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA（SEQ ID No：3）；
内引物2：GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG（SEQ ID No：4）；
（2）反应液：含有12mM dNTP、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2；
（3）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；
（4）对照：阳性对照为含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
（5）显色剂：荧光染料 Calcein。
用上述试剂盒按以下方法对确定为待测样品进行检测：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取纯化待测样品DNA，分别提取105 cfu/ml、104 cfu/ml、103 cfu/ml、102 cfu/ml、101 cfu/ml、100 cfu/ml菌体的DNA；
2）恒温检测反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物液1.8μl，反应液 15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63℃反应90 min，并在80℃持续2min；
3）结果判断：将反应管放置在浊度仪中按2）中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则有扩增，无沉淀则无扩增。也可以在2）中得到产物中加入1μl显色剂，混匀，肉眼观察。无扩增反应的管子呈现橙色，有扩增反应的管子变成绿色。
按下列配方制备白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒：
（1）引物液：含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2，四条引物为：
外引物1：TAAGTATTTGGGAGAAGGGA（SEQ ID No：1）；
外引物2：AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA（SEQ ID No：2）；
内引物1：CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA（SEQ ID No：3）；
内引物2：GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG（SEQ ID No：4）；
（2）反应液：含有12mM dNTP、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2；
（3）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；
（4）对照：阳性对照为含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
（5）荧光指示剂：SYTO-9。
用上述试剂盒按以下方法对确定为白假丝酵母菌的待测样品进行检测：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取纯化待测样品DNA，分别提取105 cfu/ml、104 cfu/ml、103 cfu/ml、102 cfu/ml、101 cfu/ml、100 cfu/ml菌体的DNA；
2）恒温检测反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物液1.8μl，反应液 15.2μl，DNA聚合酶1μl，SYTO-9 1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用浓度为3%的含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于LineGene 9640 qPCR仪上63℃反应90min（1 min设定为1个循环），并在80℃持续2min；
3）结果判断：根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果，若显现“S”型扩增曲线则为阳性，若没显现“S”型扩增曲线则为阴性。
请参阅图5，本实施例中，阳性对照、105 cfu/ml、104 cfu/ml、103 cfu/ml、102 cfu/ml均出现沉淀、“S”型扩增曲线显示为有扩增，阴性对照无沉淀、无“S”型扩增曲线，即无扩增；加入显色剂后，阳性对照、105 cfu/ml、104 cfu/ml、103 cfu/ml、102 cfu/ml的PCR管显绿色，101 cfu/ml、100 cfu/ml、阴性对照管呈现橙色。
PCR反应引物采用本方法反应中的外引物1和外引物2。PCR反应为25μl体系，10×PCR Buffer（PCR反应缓冲液，Life technologies）2.5μl，10mM dNTPs （Life technologies）0.5μl，上、下游引物分别对应外引物1和外引物2，各0.2μl，Taq酶（5U/μl ，Life technologies）0.5μl，DNA模板1μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补至25μl。反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸5min。PCR产物取5μl与2%琼脂糖凝胶电泳，110V电压下40min，通过凝胶成像分析仪观察结果，请参阅图6，对应条带分别为：M，DL600 DNA Marker（DNA分子量标准，最大DNA片段为600碱基对）； 1，阳性对照；2-7，105 cfu/ml；104 cfu/ml；103 cfu/ml；102 cfu/ml；101 cfu/ml；100 cfu/ml；8，阴性对照。其中PCR方法的灵敏度为103 cfu/ml，而6，7显示为阴性结果。
由两种方法比较可以看出，本发明的试剂盒的灵敏度的结果可以达到102 cfu/ml的浓度，PCR方法的灵敏度为103 cfu/ml，而103 cfu/ml或以下显示为阴性结果；经比对，本发明的试剂盒及方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出更低含量的样品。
实施例4：特异性实验：
用实施例1的鉴定方法分别对分离纯化的白假丝酵母菌（ATCC 66027）、热带假丝酵母（ATCC66029）、热带假丝酵母（分泌物）、热带假丝酵母（粪便）、热带假丝酵母（尿液）、克柔假丝酵母菌（ATCC6258）、克柔假丝酵母菌（痰液）、克柔假丝酵母菌（血液）、近平滑假丝酵母菌（ATCC22019）、近平滑假丝酵母菌（粪便）、近平滑假丝酵母菌（引流物）、近平滑假丝酵母菌（痰液）、光滑假丝酵母菌（ATCC MYA-2950）、光滑假丝酵母菌（血液）、光滑假丝酵母菌（尿液）、季也蒙假丝酵母菌（血液）、季也蒙假丝酵母菌（痰液）、挪威假丝酵母菌（尿液）、都柏林假丝酵母菌（分泌物）、红酵母菌（分泌物）进行鉴定，同时参照Claudia Schabereiter-Gurtner等《Development of Novel Real-Time PCR Assays for Detection and Differentiation of Eleven Medically Important Aspergillus and Candida Species in Clinical Specimens》中的引物Cand-F: TCCCGCTCTAGCGCTTCAAT（SEQ ID No.5），ITS-R: TCGAGCAGGACCTGCAGAA（SEQ ID No.6）和探针C.alb-S Probe: Cy5 -CATTGCTTGCGGCGGTA-biotin（SEQ ID No.7）进行荧光定量PCR检验。
请参阅图7，鉴定结果显示：热带假丝酵母ATCC66029、热带假丝酵母（分泌物）、热带假丝酵母（粪便）、热带假丝酵母（尿液）、克柔假丝酵母菌ATCC6258、克柔假丝酵母菌（痰液）、克柔假丝酵母菌（血液）、近平滑假丝酵母菌ATCC22019、近平滑假丝酵母菌（粪便）、近平滑假丝酵母菌（引流物）、近平滑假丝酵母菌（痰液）、光滑假丝酵母菌ATCC MYA-2950、光滑假丝酵母菌（血液）、光滑假丝酵母菌（尿液）、季也蒙假丝酵母菌（血液）、季也蒙假丝酵母菌（痰液）、挪威假丝酵母菌（尿液）、都柏林假丝酵母菌（分泌物）、红酵母菌（分泌物）反应管均为橙色、无“S”型扩增曲线，即无扩增；白假丝酵母菌的反应管为绿色、显现“S”型扩增曲线，即有扩增。本结果与《Development of Novel Real-Time PCR Assays for Detection and Differentiation of Eleven Medically Important Aspergillus and Candida Species in Clinical Specimens》中的荧光定量PCR反应结果相一致，显示出良好的特异性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其它的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其它实施方式。

Claims (10)

1.一种白假丝酵母菌的LAMP检测引物组，其特征在于：所述检测引物组包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物1：TAAGTATTTGGGAGAAGGGA（SEQ ID No：1）；
外引物2：AATTGTTAGTAAACGATATTTCCA（SEQ ID No：2）；
内引物1：CTAGTTTCCATAGATCATTGGCAACAAGAGAAAGGGTAAGAATATATGA（SEQ ID No：3）；
内引物2：GTTCAATCCGTTTAATGAACAATGCTGGGCATTAAGGAAAAGAG（SEQ ID No：4）。
2.根据权利要求1所述的白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括以下成分：
（1）引物液：含有权利要求1所述的白假丝酵母菌的LAMP检测引物组，所述引物液中各引物的浓度分别为48～52μM外引物1、48～52μM外引物2，48～52μM内引物1、48～52μM内引物2；
（2）反应液：含有12mM dNTP、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，所述dNTP、反应缓冲液和MgSO4水溶液的体积比是7～9：4～6：2；
（3）DNA聚合酶：DNA聚合酶的浓度为7～9U/μl；
（4）对照：阳性对照为白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
3.根据权利要求2所述的白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述引物液中含有50μM外引物1、50μM外引物2，50μM内引物1、50μM内引物2。
4.根据权利要求2所述的白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶的浓度为8U/μl。
5.根据权利要求2所述的白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述反应液中，12mM dNTP：10×Isothermal Amplification反应缓冲液：150mM MgSO4水溶液的体积比为8：5：2。
6.根据权利要求2～5中任一项权利要求所述的白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还含有显色剂，所述显色剂为荧光染料Calcein。
7.根据权利要求2～5中任一项权利要求所述的白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还含有荧光指示剂，所述荧光指示剂为SYTO-9。
8.一种利用权利要求2～5中任一项权利要求所述的白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒检测白假丝酵母菌的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA；
2）恒温检测反应：在PCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；
3）结果判断：通过观察PCR管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。
9.一种利用权利要求6所述的白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒检测白假丝酵母菌的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA；
2）恒温检测反应：在200μl PCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液 15.2μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；
3）结果判断：在上述PCR管中加入1～2μl显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。
10.一种利用权利要求7所述的白假丝酵母菌的LAMP检测试剂盒检测白假丝酵母菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）待检样品DNA的提取：采用煮沸法提取白假丝酵母菌纯化样品DNA；
2）恒温检测反应：在200μl PCR管中配制反应体系：引物液1.8μl，反应液 15.2 μl，DNA聚合酶1μl，荧光指示剂SYTO-9 1μl，待检DNA 1～6μl，用DNase/RNase-Free Distilled Water补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用白假丝酵母菌的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于实时荧光检测仪在60～65℃反应45～90min，并在80℃条件下持续2min；
3）结果判断：根据是否出现S型扩增曲线判断扩增结果。
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