CN103667271A - 定量检测白假丝酵母菌的引物和探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测白假丝酵母菌的引物和探针及其应用，引物的核苷酸序列为序列表中序列3和序列4；探针的核苷酸序列为序列表中序列5。本发明的有益效果为：本发明提供的一组白假丝酵母菌（Canidia Albicans）特异性引物和探针序列，可用于对白假丝酵母菌进行定性、定量检测，通过提取待检测样品中的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中白假丝酵母菌DNA含量的目的，可用于临床及科研中对真菌感染患者携带的白假丝酵母菌DNA进行定性、定量分析，对判断白假丝酵母菌感染的发生、治疗效果评价以及病情的动态观察具有重要意义，同时将在临床医学检测领域发挥重要作用。

Description

定量检测白假丝酵母菌的引物和探针及其应用

技术领域

本发明涉及一种定量检测白假丝酵母菌的引物和探针及其应用。

背景技术

白假丝酵母菌（Canidia Albicans）又称白色念珠菌，属于真菌界半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母目、隐球酵母科。广泛存在于自然界，也存在于健康人群口腔，上呼吸道，肠道以及阴道等部位，一般在正常机体总数量少并不引起疾病，为条件致病菌，无症状时常表现为酵母细胞状，侵染组织和出现症状时表现为菌丝性。

近年来，随着广谱抗菌药物的滥用、癌症放疗化疗的增多、器官移植免疫抑制剂及大量激素的临床应用，深部真菌感染率大幅上升，已成为上述疾病患者死亡的主要原因。白假丝酵母菌是最常见的医院感染致病真菌，50%以上的病例是由白假丝酵母菌感染引起的，同时也是引起女性生殖道感染的常见致病菌。假丝酵母菌引发的菌血症死亡率较高，达到40%-80%，有报道深部白假丝酵母菌感染病死率达68.9%。近年来白假丝酵母菌引起的外阴阴道炎（Vμlvovaginal candidiasis，VVC）的发病率呈上升趋势，大约75%的生育妇女至少有1次VVC发作史。

目前对白假丝酵母菌的实验室诊断主要有常规涂片镜检、培养法以及常规PCR等。常规涂片镜检检测具有简便、快速、廉价等优点，但是要求检测者具有丰富检测经验，同时敏感度低、特异性差、误判率高等缺点，需用科玛嘉显色培养基进一步验证；科玛嘉培养基含有特殊的显色物质，通过培养观察菌落颜色即可对白假丝酵母菌进行定性和定量，但是培养耗时长（48小时），易污染等缺点，滞后于临床治疗，不利于快速诊断；常规PCR技术也存在灵敏度低、易污染等缺点造成假阳性。

实时荧光定量PCR（Fluorescence quantitative PCR）技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便、利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合临床检测。浙江大学申请了关于肠道白假丝酵母菌检测的荧光定量PCR检测试剂盒（专利号CN200910098555.3），但是采用了SYBR Green染料法，该方法虽然灵敏度高但是假阳性率高。泰普生物科学有限公司根据白假丝酵母菌的耐药基因ERG11基因设计了检测引物和探针，建立了一种白假丝酵母菌的荧光定量PCR检测试剂盒（CN201110417477.6）。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一组白假丝酵母菌（CanidiaAlbicans）特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于临床的快速、灵敏、特异性好的用荧光定量PCR检测方法。

本发明采用基因克隆技术，将白假丝酵母菌ITS DNA片段插入到载体pMD18-T中，获得含有ITS片段的重组质粒，以此作为标准品。根据白假丝酵母菌ITS DNA片段中高度保守特异性强的核酸序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量PCR技术为平台的检测方法，并对所建立的方法进行有效性评估试验。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一对白假丝酵母菌ITS基因保守片段序列的引物，所述引物的核苷酸序列为序列表中序列1和序列2，称其为外围引物，用于标准品的制备，所述外围引物为：上游引物为5'-ATGAAGAACGCAGCGAAATG-3'，下游引物为5'-CGCAAGCAATGTTTTTGGTTAG-3'，采用该引物以白假丝酵母菌标准菌（CMCC98001）的DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物为242bp。

本发明的第二个目的是提供了一组用于定量检测白假丝酵母菌的引物和探针，所述引物的核苷酸序列为序列表中序列3和序列4；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列5。探针为Taqman探针，该组引物和探针是根据上述ITS保守片段设计,其中上游引物为5’-CCTAAGCCATTGTCAAAGCGA-3’，下游引物为5’-TGCCTGTTTGAGCGTCGTT-3’，探针为5’-TCCCGCCTTACCACTACCGTCTTTCAAG-3’。

本发明的第三个目的是提供了一组如上所述的用于定量检测白假丝酵母菌的引物和探针的衍生序列，所述引物的衍生序列包括引物序列的互补链序列、引物序列向5’端和3’方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列；所述探针的衍生序列包括探针5’端标记有荧光报告基团FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA、DABCYL或BHQ。

本发明的第四个目的是提供了一种用于检测白假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述引物和探针。

本发明的第五个目的是提供了上述的一组用于定量检测白假丝酵母菌的引物和探针在定量检测白假丝酵母菌中的应用。

本发明的第六个目的是提供了上述的一组用于定量检测白假丝酵母菌的引物和探针的衍生序列在定量检测白假丝酵母菌中的应用。

本发明的第七个目的是提供了上述的一种用于检测白假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒在定量检测白假丝酵母菌中的应用。

本发明的有益效果为：本发明提供的一组白假丝酵母菌（Canidia Albicans）特异性引物和探针序列，可用于对白假丝酵母菌进行定性、定量检测，通过提取待检测样品中的DNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中白假丝酵母菌DNA含量的目的，可用于临床及科研中对真菌感染患者携带的白假丝酵母菌DNA进行定性、定量分析，对判断白假丝酵母菌感染的发生、治疗效果评价以及病情的动态观察具有重要意义，同时将在临床医学检测领域发挥重要作用。

附图说明

图1为灵敏度实验结果。

其中A12-A19对应质粒浓度分别为1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、1.00×10²copies/ml、阴性对照。

图2为特异性实验结果。

其中A4-A17分别为：大肠埃希菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、白假丝酵母菌、阴性对照。

具体实施方式

下述实验例中所用方法如无特殊说明均为常规方法，所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。

实施例1：

ITS序列标准品的制备：

为建立实时荧光定量PCR方法，需先制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。本发明采用白假丝酵母菌ITS DNA序列保守区作为靶序列。主要采用PCR技术扩增白假丝酵母菌ITS序列，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-CaITS，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。

一、模板DNA的制备：

1、提取白假丝酵母菌（标准菌株CMCC98001）基因组DNA，用作PCR扩增的模板：

用接种环刮取科玛嘉固体培养基表面白假丝酵母菌菌体200mg，液氮研磨成粉状后收集到5ml离心管中，加入3ml3%CTAB提取缓冲液，65℃水浴45分钟，然后于4℃4000r/min离心20分钟。取上清转移到新离心管中，加入20μl10mg/ml的蛋白酶K，37℃水浴1小时，再加入800μl Tris饱和酚，摇匀，13000r/min离心10分钟。取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇，摇匀，13000r/min离心10分钟。取上清，加入600μl异丙醇，-20℃沉淀30分钟。12000r/min离心20分钟，收集沉淀，75%酒精冲洗，超净工作台真空干燥。加入50μlTE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。

二、ITS序列片段的PCR扩增：

1、引物的设计与合成：

本发明通过对NCBI数据库中白假丝酵母菌ITS全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用Primer express3软件、Primer Premier6软件以及Oligo7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围引物。

本发明选取的扩增序列如下：

5’-ATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGTTTCTCCCTCAAACCGCTGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGACTTGGGTTTGCTTGAAAGACGGTAGTGGTAAGGCGGGATCGCTTTGACAATGGCTTAGGTCTAACCAAAAACATTGCTTGCG-3’。

该外围引物序列如下：

上游引物：CaITS229F：5'-ATGAAGAACGCAGCGAAATG-3'，

下游引物：CaITS470R：5'-CGCAAGCAATGTTTTTGGTTAG-3'，

扩增片段大小为：242bp。

2、PCR反应体系和反应条件：

以提取得到的DNA溶液为模板，上述外围引物CaITS229F/CaITS470R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增

PCR体系如表1所示。

表1

成分	体积
		10×PCR buffer	5μl
dNTP（2.5μM）	1.5μl
		引物F（5μM）	1μl
引物R（5μM）	1μl
		模板DNA	2μl
Taq酶（5U）	1μl
		ddH2O	38.5μl
总体积	50μl

其中，引物采用CaITS229F/CaITS470R，Taq酶采用杭州博日（BSA09M2），PCR扩增仪为西安天隆PCR model MG96+。

扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃30s，35个循环；72℃10min。

取5μL扩增产物进行1%琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。

三、重组质粒pMD18-T-CaITS的构建和转化：

1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与pMD18-T（大连宝生物公司）进行连接，采用如下表2中的连接体系进行配制。

表2

成分	体积
		pMD18-T vector	1μL
回收DNA	2μL
		Solution1	5μL
ddH2O	2μL
		总体积	10μL

配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。

2、pMD18-T-CaITS质粒的转化以及PCR鉴定：

①从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻；

②取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；

③42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min；

④向1.5ml EP管中加入预冷的400ml的LB液体培养基（不含氨苄青霉素）混匀后，37℃200转轻摇培养1h；

⑤将上述培养液摇匀后取100μl涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；

⑥次日观察，从平板上挑取白单克隆菌落稀释于50μL无菌水中，吸取2μL作为PCR模板，剩余的稀释菌液加入到20ml的LB培养基中进行扩摇；

⑦用载体通用引物RV-M/M13-47扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子；

引物RV-M/M13-47序列如下：

引物RV-M：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，

引物M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。

反应体系如表3所示。

表3

成分	体积
		10×PCR buffer	2.5μL
dNTP（2.5μM）	0.5μL
		引物F（5μM）	0.5μL
引物R（5μM）	0.5μL
		模板	2μL
Taq酶（5U）	0.5μL
		ddH2O	18.5μL

扩增程序/反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s、55℃30s、72℃1min，35个循环；72℃10min。

⑧采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。

实施例2：

实时荧光定量PCR检测白假丝酵母菌方法的初步建立：

一、特异性引物和探针的设计与合成：

以上述选取的白假丝酵母菌的ITS序列的保守片段为靶目标，应用Primer express3软件、Primer Premier5软件以及Oligo7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针。

作为本发明的核心，一组用于白假丝酵母菌实时荧光PCR检测的引物和探针核苷酸序列如下：

上游引物：CaITS448F：5’-CCTAAGCCATTGTCAAAGCGA-3’，

下游引物：CaITS331R：5’-TGCCTGTTTGAGCGTCGTT-3’，

探针：CaITS426P：5’-FAM-TCCCGCCTTACCACTACCGTCTTTCAAG-TAMRA-3’。

该引物和探针扩增目标核苷酸序列为：

5’-TGCCTGTTTGAGCGTCGTTTCTCCCTCAAACCGCTGGGTTTGGTGTTGAGCAATACGACTTGGGTTTGCTTGAAAGACGGTAGTGGTAAGGCGGGATCGCTTTGACAATGGCTTAGG-3’。

二、标准品的获取和定量：

1、取将冻存的含有重组质粒pMD18-T-CaITS的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃200rpm过夜摇培；

2、取1ml培养过夜的菌液转种于30ml LB液体培养基，200rpm增菌培养2-3小时，然后采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；

3、利用超微量紫外可见分光光度计对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度，根据A260的吸光度值可计算出样品中质粒DNA的含量，即1OD值相当于50μg/ml双链DNA；

4、质粒pMD18-T-CaITS浓度（拷贝数）计算：

（1）质粒的分子量=2933bp×660（每对碱基的平均分子量）；

（2）测得质粒浓度为59.17μg/ml：因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml；

质粒copies/ml=阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数，

其中阿伏伽德罗常数=6.02×10²³copies/mol。

因此提取的质粒浓度copies/ml=59.17μg/ml×10^-6×6.02×10²³copies/mol÷（2933bp×660g/bp·mol）=1.84×10¹³copies/ml。

10μl质粒+8.4μl的无菌水就得到浓度为1.00×10¹³copies/ml的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。

实施例3：

评估实验：

1、灵敏度实验：

将上述制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml、1.00×10⁴copies/ml、1.00×10³copies/ml、1.00×10²copies/ml等作为梯度模板。反应体系如表4所示。

表4

成分	体积
		2×premix	10μl
Primer F（5μM）	1.5μl
		Primer R（5μM）	1.5μl
Probe（5μM）	0.75μl
		模板	2μl
ddH2O	补至20μl

反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果如图1所示。显示当质粒浓度达到1.00×10³copies/ml时依然有荧光信号，但质粒浓度达到1.00×10²copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×10³copies/ml。

2、特异性实验：

为了证实本发明对白假丝酵母菌检测的特异性，选取了其他常见病原体和常见污染菌做特异性实验，选取的微生物包括：大肠埃希菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、白假丝酵母菌。

其中金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、乙型溶血性链球菌、近平滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌等采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302-02）提取DNA，其余革兰氏阴性菌采用沸水裂解法提取DNA。采用百泰克公司生产的2×real-timePCR Premixture（probe）实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，反应体系如表5所示。

表5

成分	体积
		2×premix	10μl
Primer F（5uM）	1.5μl
		Primer R（5uM）	1.5μl
Probe（5uM）	1.5μl
		模板	2μl
ddH2O	补至20μl

反应条件：94℃预变性2分钟，94℃15秒、60℃40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果如图2所示，具体结果为仅白假丝酵母菌检测为阳性，其余易污染微生物和致病菌均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果如表6所示。

表6

菌株名称	Ct值	判读结果
			大肠埃希菌	无	阴性
奇异变形杆菌	无	阴性
			铜绿假单胞菌	无	阴性
流感嗜血杆菌	无	阴性
			淋病奈瑟菌	无	阴性
金黄色葡萄球菌	无	阴性
			粪肠球菌	无	阴性
乙型溶血性链球菌	无	阴性
			近平滑假丝酵母菌	无	阴性
热带假丝酵母菌	无	阴性
			克柔假丝酵母菌	无	阴性
光滑假丝酵母菌	无	阴性
			白假丝酵母菌	25.88	阳性
空白对照	无	阴性

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>  车团结

<120>  定量检测白假丝酵母菌的引物和探针及其应用

 

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgaagaacg cagcgaaatg                                                   20

 

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cgcaagcaat gtttttggtt ag                                                22

 

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cctaagccat tgtcaaagcg a                                                 21

 

 

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

tgcctgtttg agcgtcgtt                                                    19

 

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

tcccgcctta ccactaccgt ctttcaag                                          28

 

Claims (7)

1.一对用于白假丝酵母菌ITS基因保守片段序列的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为序列表中序列1和序列2。

2.一组用于定量检测白假丝酵母菌的引物和探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列为序列表中序列3和序列4；所述探针的核苷酸序列为序列表中序列5。

3.一组如上述权利要求2所述的用于定量检测白假丝酵母菌的引物和探针的衍生序列，其特征在于，所述引物的衍生序列包括引物序列的互补链序列、引物序列向5’端和3’方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列；所述探针的衍生序列包括探针5’端标记有荧光报告基团FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA、DABCYL或BHQ。

4.一种用于检测白假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1和2所述的引物和探针。

5.权利要求2所述的一组用于定量检测白假丝酵母菌的引物和探针在定量检测白假丝酵母菌中的应用。

6.权利要求3所述的一组用于定量检测白假丝酵母菌的引物和探针的衍生序列在定量检测白假丝酵母菌中的应用。

7.权利要求4所述的一种用于检测白假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒在定量检测白假丝酵母菌中的应用。

Images