CN110714070B

CN110714070B - 一种草鱼细菌性肠炎生物标记物及治疗靶点的应用

Info

Publication number: CN110714070B
Application number: CN201911205134.6A
Authority: CN
Inventors: 瞿符发; 刘臻; 谢宜芳; 邓张仁; 唐建洲; 房佳美; 周勇华; 彭亮
Original assignee: Changsha University
Current assignee: Changsha University
Priority date: 2019-11-29
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CN110714070A

Abstract

本发明公开了一种草鱼细菌性肠炎生物标记物及治疗靶点的应用。本发明首次从草鱼肠道中克隆得到完整的p38α基因、p38β基因，它们的cDNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明发现，p38α基因、p38β基因在患细菌性肠炎的草鱼肠道中表达水平显著上调，且干预p38活性后草鱼肠道炎症因子表达水平恢复至正常水平，因此，p38α基因、p38β基因可作为草鱼细菌性肠炎生物标记物和治疗靶点，实现对草鱼细菌性肠炎的诊断和治疗。

Description

一种草鱼细菌性肠炎生物标记物及治疗靶点的应用

技术领域

本发明具体涉及一种草鱼细菌性肠炎生物标记物及治疗靶点的应用。

背景技术

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国最主要的养殖经济草鱼，也是当今全球养殖产量最高的淡水草鱼，有超过1700年的养殖历史。当前，高密度、集约化养殖已成为草鱼的主要养殖模式。而在这种养殖环境中，草鱼抗病力差，易遭受病原微生物的感染。业已证实，鱼体的感染多数发生于各种黏膜组织，尤其是肠黏膜，因与肠腔内大量的病毒、细菌、寄生虫和藻类毒素广泛接触，可引起草鱼肠道组织坏死，并伴有严重的肠道炎症反应。细菌性肠炎是草鱼规模化养殖过程中频繁发生并具有严重危害的传染性疾病，与烂鳃病、赤皮病和病毒性出血病并称为草鱼“四大病”。研究表明，嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)等致病菌均可感染草鱼肠道，诱发严重的肠炎，引起大规模死亡，给产养殖业造成巨大损失，同时大量病、死鱼还污染了水体环境，造成极大的危害。

然而，在低等脊椎动物草鱼中，细菌性肠炎的发病机制尚不清楚，所以目前有关肠炎的诊断方法大多通过鱼体外部形态以及肠道切片的观察，这种诊断方法虽然简单有效，但往往在肠炎发生后期才能诊断出结果，时效性差，应用范围也有限。并且，长期以来，养殖户大多采用抗生素或化学药物预防和治疗草鱼细菌性肠炎，但效果不尽人意；而长期、过量使用化学药物、抗生素又使得草鱼自身肠黏膜免疫系统遭到破坏，抗病能力进一步下降，并且不可避免地造成环境污染。相比高等哺乳动物细菌性肠炎疾病的研究，目前在低等脊椎动物草鱼中，有关细菌性肠炎的发病机理及其治疗靶点的研究显得尤为缺乏。因此，开展草鱼细菌性肠炎的发病机理，开发诊断和治疗草鱼细菌性肠炎的基因靶点具有重要的科学意义和应用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种草鱼细菌性肠炎生物标记物及治疗靶点的应用。p38激酶是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated proteinkinase,MAPK)家族的重要成员，它的同源物存在广泛存在于生物界，包括低等的酵母、果蝇和线虫等物种。目前已发现p38并非单一的蛋白质，包括四种不同的异构体：p38α基因、p38β基因、p38γ和p38δ，它们分别被不同的基因编码。p38各个成员对外界刺激后不同的移位现象使得它们能够在细胞中发挥不同的生理功能。p38的四个异构体都属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，都具有相同的苏氨酸–甘氨酸–酪氨酸(Thr-Gly-Tyr,TGY)激活结构域，当Thr180和Tyr182同时磷酸化时，p38MAPK可被激活。p38MAPK是最重要的应激信号转导通路之一，可以广泛地被外界环境因子所激活，如病原体、热休克、渗透压、紫外线、氧化应激等。在外界刺激的作用下p38会磷酸化并激活下游底物，主要是转录因子，包括ATF1/2/6、Sap1、p53、C/EBPβ等，最终参与特异地调节TNF、c-myc、Fas/FasL等多种基因的转录和表达。大量的研究表明，p38参与高等动物机体炎症反应并发挥着重要的生物学功能。但截至目前，尚未有实验结果表明激酶与草鱼细菌性肠炎相关，更未有相关的实验结果证实p38可以作为草鱼细菌性肠炎诊断和治疗的靶点。本发明首次分离得到p38α基因、p38β基因完整的cDNA序列，且发现了p38α基因、p38β基因与草鱼细菌性肠炎存在相关性，p38特异性抑制剂能够抑制草鱼肠道炎症因子TNF-α、IL-15和抗菌肽β-defensin的表达水平，为草鱼细菌性肠炎提供了新的生物标记物和治疗靶点。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

提供了一种p38基因作为草鱼细菌性肠炎生物标记物的应用。

上述的应用中，进一步的，所述p38基因为p38α基因或p38β基因；所述p38α基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述p38β基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

上述的应用中，进一步的，所述应用包括：检测草鱼肠道组织中p38α基因或p38β基因的表达水平，以p38α基因或p38β基因的表达水平为评价指标对草鱼细菌性肠炎进行评价。

上述的应用中，进一步的，采用检测试剂盒对草鱼肠道组织中p38α基因或p38β基因的表达水平进行检测；所述检测试剂盒包含根据p38α基因的cDNA序列设计的特异性引物p38α-F2和p38α-R2，以及包含根据p38β基因的cDNA序列设计的特异性引物p38β-F2和p38β-R2；所述p38α-F2和p38α-R2的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；所述p38β-F2和p38β-R2的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

作为一个总的发明构思，本发明还提供了一种p38基因作为草鱼细菌性肠炎治疗靶点的应用。

上述的应用中，进一步的，所述应用包括：以p38α基因和p38β基因为靶点，制备用于治疗草鱼细菌性肠炎的药物；所述药物中含有用于干扰p38α基因和p38β基因表达或抑制p38活性的物质。

上述的应用中，进一步的，所述用于抑制p38活性的物质为p38特异性抑制剂；所述p38特异性抑制剂为SB203580。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明从草鱼肠道中首次克隆了p38α基因、p38β基因完整的cDNA序列，为后续设计定量引物开发检测p38α基因、p38β基因表达水平的检测试剂盒提供支撑，同时也将为进一步在基于此序列开展RNAi、基因敲除实验奠定基础。

(2)本发明发现，草鱼肠道p38α基因、p38β基因在注射细菌MDP 6小时后表达水平即显著上调，揭示了p38α基因、p38β基因与草鱼细菌性肠炎具有很好的相关性，因此，p38α基因、p38β基因可作为草鱼细菌性肠炎生物标记物，并以其表达水平对草鱼细菌性肠炎进行有效的诊断，能够大大提高草鱼细菌性肠炎的诊断的敏感性和特异性。

(3)本发明p38基因作为草鱼细菌性肠炎生物标记物的应用中，采用检测试剂盒检测草鱼肠道组织中p38α或p38β基因的表达水平，以p38α或p38β基因的表达水平为评价指标对草鱼细菌性肠炎进行评价。该检测试剂盒包含有根据p38α或p38β基因的cDNA序列设计的特异性引物，以此检测试剂盒进行荧光定量PCR技术检测，能够准确、快速检测p38α基因、p38β基因的表达水平，实现对草鱼细菌性肠炎进行诊断，方法简单、可靠，时效性较好，能够弥补传统草鱼肠炎诊断方法的不足。

(4)本发明发现，以p38α基因、p38β基因为靶点，在注射特异性抑制剂后6小时后，草鱼肠道炎症因子表达水平就能够恢复到未受细菌MDP感染时的水平，揭示了以p38α基因、p38β基因作为草鱼细菌性肠炎治疗靶点具有良好的效果。

(5)本发明以p38基因作为草鱼细菌性肠炎治疗靶点的应用中，以p38α基因、p38β基因为靶点制备用于治疗草鱼细菌性肠炎的药物，该药物中含有用于干扰p38α基因、p38β基因表达或抑制p38活性的物质，该药物通过干扰p38α基因、p38β基因的表达或抑制p38的活性对草鱼细菌性肠炎进行治疗。本发明中采用p38特异性抑制剂作为治疗药物，能够显著抑制鱼肠道炎症因子TNF-α、IL-15和抗菌肽β-defensin的表达水平，对草鱼肠炎具有很好的治疗效果。相较于现有的抗生素或化学药物，本发明的草鱼细菌性肠炎治疗药物具有更好的特异性，可大大减少用量，降低因过量使用抗病药物导致的草鱼自身肠黏膜免疫系统破坏、抗病能力下降的风险，并且能够减少对水体环境造成的污染。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例3中p38α基因在细菌MDP刺激下的表达水平。

图2为本发明实施例4中p38β基因在细菌MDP刺激下的表达水平。

图3为本发明实施例5中在干预p38活性后肠道炎症因子的表达水平。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售。

实施例1

p38α基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

p38α基因的克隆方法，具体如下：

(1)草鱼肠道总RNA提取：

取健康的鲜活草鱼(平均体重30g左右)，用消毒的镊子和剪刀解剖草鱼，分离草鱼肠道组织样品。肠道样品总RNA使用RNAiso(Takara)试剂提取，具体步骤如下：取100mg草鱼肠道组织于液氮预冷的研钵中，将组织磨成粉末之后，转移到装有1mL RNAiso的离心管中，吹打、混匀；加入200μL氯仿，剧烈震荡40s，室温放置5min；4℃，12,000×g离心15min，吸取上清0.5mL转移至新管；加入0.5mL的异丙醇，混匀；4℃，12,000×g离心10min，弃上清；用1mL 75％乙醇清洗RNA沉淀；弃上清，加入30μL DEPC水溶解RNA；用1.2％琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白定量仪分别检测RNA的完整性和浓度。

(2)草鱼肠道cDNA文库构建：

草鱼肠道cDNA文库构建使用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)，具体步骤如下：在Microtube管中制备cDNA反转录反应液，包括1μL Oligo dTPrimer(50μM)，1μg草鱼肠道总RNA，1μL dNTP Mixture(10mM each)，加RNase Free H₂O将总体积补至10μL；65℃保温5min后，冰上迅速。在上述Microtube管中配制下列反转录反应液：10μL上述变性后反应液，4μL 5×PrimeScript Buffer，0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)，4.5μL RNase Free H₂O和1μL PrimeScript RTase(200U/μL)；反应体系轻弹混匀，稍离心；42℃，60min；95℃，5min使反转录酶失活；冰上冷却，-20℃保存。

(3)草鱼p38α基因cDNA序列克隆：

根据草鱼肠道转录组数据库中筛选到的序列信息，设计一对包含草鱼p38α基因的开放阅读框的特异性引物p38α-F1和p38α-R1，如下所示：

p38α-F1：5'-GAAGTTTCCACTCCTCTACA-3'(SEQ ID NO.3)；

p38α-R1：5'-ACATTCTCTGTGTCCTTTTGG-3'(SEQ ID NO.4)。

以构建好的cDNA文库为模板，以p38α-F1和p38α-R1为引物进行PCR反应。

PCR反应体系为：37.75μL ddH₂O,0.25μL Ex Taq DNA Polymerase(5U/μL,TaKaRa),5μL 10×Ex PCR Buffer(Mg²⁺Plus),4μL dNTP mixture(2.5mM each),1μL正反引物(10μM),和1μL cDNA模板。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃30s、55℃30s、72℃90s(35个循环)；72℃10min；4℃保存。

PCR反应结束后用1.5％琼脂糖凝胶检测产物，产物经纯化后与pMD-19T(TaKaRa)载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，菌落PCR检测后选取阳性克隆送上海生工生物公司测序。PCR扩增出草鱼p38α基因的cDNA序列全长1086bp，编码361个氨基酸(序列如SEQ ID NO.1所示)。

实施例2

p38β基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

p38β基因的克隆方法同实施例1，区别仅在于，步骤(3)cDNA序列克隆时采用的引物为草鱼p38β基因的开放阅读框的特异性引物p38β-F1和p38β-R1，如下所示：

p38β-F1：5'-GAAGAAGAGGAACTAAAGCCG-3'(SEQ ID NO.5)；

p38β-R1：5'-CTCCTCCTCTTGCTTGGTTTA-3'(SEQ ID NO.6)。

PCR扩增出草鱼p38β基因的cDNA序列全长1086bp，编码361个氨基酸(序列如SEQID NO.2所示)。

实施例3

采用细菌MDP(胞壁酰二肽)诱导草鱼产生肠炎，考察p38α基因的表达水平。具体方法如下：

(1)样品收集：

取健康的鲜活草鱼(平均体重30g左右)，平均分为2组。实验组草鱼采用腹腔注射100μL MDP溶液(10μg/mL,Invitrogen)，对照组每条鱼注射等体积的PBS缓冲液。注射后的草鱼立即放回养殖桶，同时每组随机取样3条作为0h的样品。在注射后3、6、12、24、48和72小时随机取每组的3条草鱼，用消毒的镊子和剪刀解剖鱼体并取出肠道组织，样品置于液氮中保存用于总RNA的提取。

(2)总RNA提取：提取方法同实施例1。

(3)cDNA文库构建：

草鱼肠道cDNA文库构建使用PrimeScript^TM RT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)，具体步骤如下：1、去除基因组DNA反应：在Microtube管中配制反应液，包括2.0μL5×gDNA Eraser Buffer，1.0μL gDNA Eraser，1μg草鱼肠道总RNA，加RNase Free H₂O将总体积补至10μL；42℃，2min，4℃结束。2、反转录反应：在上述Microtube管中配制反转录反应液，包括步骤(1)中10μL反应液，4μL 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)，1.0μLPrimeScript RT Enzyme Mix 1，4.0μL RNase Free H₂O和1μL RT Primer Mix；反应体系轻弹混匀，稍离心；37℃，15min；85℃，5s使反转录酶失活；冰上冷却，-20℃保存。

(4)p38α基因转录水平的检测：根据克隆获得的草鱼p38α基因cDNA序列信息设计的检测p38α基因表达水平的特异性引物p38α-F2和p38α-R2，如下所示：

p38α-F2：5'-CTTCCCCGTGTTCTTATCCA-3'(SEQ ID NO.7)；

p38α-R2：5'-ACATTCTCTGTGTCCTTTTGG-3'(SEQ ID NO.8)。

以步骤(3)中构建的cDNA为模板，以p38α-F2和p38α-R2为引物进行荧光定量PCR反应，并以草鱼看家基因β-actin的转录水平作为内参对照。

PCR反应体系为：5.68μL ddH2O,8.0μL TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseHPlus)(2×,TaKaRa),0.32μL ROX Reference Dye II(50×),4μL dNTP mixture(2.5mMeach),0.5μL正反引物(10μM),和1μL cDNA模板。

PCR反应程序为：94℃预变性4min；94℃10s、55℃10s、72℃10s(45个循环)。

荧光定量PCR反应结束后，根据收集到的目的基因与内参基因的CT值，运用2^-ΔΔCT方法计算相对表达量，结果如图1所示。

图1为本发明实施例3中p38α基因在细菌MDP刺激下的表达水平。由图1可知，本发明利用实时荧光定量PCR技术检测发现，草鱼肠道p38α基因在注射细菌MDP 6小时后表达水平即显著上调，揭示了p38α基因与草鱼细菌性肠炎具有很好的相关性，p38α基因可作为草鱼细菌性肠炎生物标记物，利用p38α基因表达水平的检测方法可对草鱼细菌性肠炎进行有效的诊断。

实施例4

采用细菌MDP(胞壁酰二肽)诱导草鱼产生肠炎，考察p38β基因的表达水平。

考察方法同实施例3，区别仅在于步骤(4)中的引物为根据克隆获得的草鱼p38β基因cDNA序列信息设计的检测p38β基因表达水平的特异性引物p38β-F2和p38β-R2，如下所示：

p38β-F2：5'-TTTTTGTATTTGATGTGAGGC-3'(SEQ ID NO.9)；

p38β-R2：5'-CTCCTCCTCTTGCTTGGTTTA-3'(SEQ ID NO.10)。

荧光定量PCR反应结束后，根据收集到的目的基因与内参基因的CT值，运用2^-ΔΔCT方法计算相对表达量，结果如图2所示。

图2为本发明实施例4中p38β基因在细菌MDP刺激下的表达水平。由图2可知，本发明利用实时荧光定量PCR技术检测发现，草鱼肠道p38β基因在注射细菌MDP 12小时后表达水平即显著上调，揭示了p38β基因与草鱼细菌性肠炎具有很好的相关性，p38β基因可作为草鱼细菌性肠炎生物标记物，利用p38β基因表达水平的检测方法可对草鱼细菌性肠炎进行有效的诊断。

实施例5

采用p38特异性抑制剂对p38活性进行干预，考察草鱼肠道炎症因子的表达水平。

本实施例中采用的p38特异性抑制剂为SB203580，考察的草鱼肠道炎症因子为TNF-α、IL-15和抗菌肽β-defensin。

考察方法具体方法如下：

(1)样品收集：取健康的鲜活草鱼(平均体重30g左右)，平均分为3组。实验组1草鱼采用腹腔注射100μL MDP溶液(10μg/mL,Invitrogen)，实验组2草鱼注射等体积的MDP溶液(10μg/mL,Invitrogen)和p38特异性抑制剂SB203580(100μM,Sigma)，对照组每条鱼注射等体积的PBS缓冲液。注射后的草鱼立即放回养殖桶，在注射后24小时随机取每组的3条草鱼，用消毒的镊子和剪刀解剖鱼体并取出肠道组织，样品置于液氮中保存用于总RNA的提取。

(2)总RNA提取：提取方法同实施例1。

(3)cDNA文库构建：构建方法同实施例3。

(4)肠道炎症因子表达水平检测：根据NCBI中已公布的草鱼肠道炎症因子TNF-α、IL-15和抗菌肽β-defensin的cDNA序列信息，分别设计检测TNF-α、IL-15和抗菌肽β-defensin基因表达水平的荧光定量PCR特异性引物：

检测TNF-α的引物：

TNF-α-F：5'-CGCTGCTGTCTGCTTCAC-3'(SEQ ID NO.11)；

TNF-α-R：5'-CCTGGTCCTGGTTCACTC-3'(SEQ ID NO.12)；

检测IL-15的引物：

IL-15-F：5'-CCTTCCAACAATCTCGCTTC-3'(SEQ ID NO.13)；

IL-15-R：5'-AACACATCTTCCAGTTCTCCTT-3'(SEQ ID NO.14)；

检测抗菌肽β-defensin的引物：

β-defensin-F：5'-TTGCTTGTCCTTGCCGTCT-3'(SEQ ID NO.15)；

β-defensin-R：5'-AATCCTTTGCCACAGCCTAA-3'(SEQ ID NO.16)。

以构建好的cDNA文库为模板，分别以上述其中一组引物进行荧光定量PCR反应，以草鱼看家基因β-actin的转录水平作为内参对照。PCR反应体系和反应程序参照实施例3步骤(4)中的荧光定量PCR反应。荧光定量PCR反应结束后，根据收集到的目的基因与内参基因的CT值，运用2^-ΔΔCT方法计算相对表达量，结果如图3所示。

图3为本发明实施例5中在干预草鱼p38活性后肠道炎症因子的表达水平。由图3的结果可知，本发明利用p38特异性抑制剂SB203580干预p38活性后，由细菌MDP诱导的草鱼肠道炎症因子TNF-α、IL-15和抗菌肽β-defensin表达水平在6小时后显著下降，且恢复到未感染细菌MDP前的正常水平，证明了p38基因可以作为草鱼细菌性肠炎的治疗靶点，以p38基因为治疗靶点，采用p38特异性抑制剂能够对草鱼细菌性肠炎进行治疗，p38特异性抑制剂SB203580可应用于制备用于治疗草鱼细菌性肠炎的药物。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

序列表

<110> 长沙学院

<120> 一种草鱼细菌性肠炎生物标记物及治疗靶点的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1086

<212> DNA

<213> 草鱼(Ctenopharyngodon idella)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1086)

<223> 草鱼p38α基因cDNA

<400> 1

atgtcccaca aggagagacc gactttctat cgacaggagc tcaataagac catatgggag 60

gtgccggagc ggtaccagag tttatcgccc gtgggctctg gagcttatgg atccgtatgc 120

tccgcgttag actcaaagtc aggcctgagg gtcgcagtca agaagctgtc ccggcccttc 180

cagtccatca tccacgccaa gcgcacatac agagaactgc ggctgctgaa acacatgaaa 240

catgagaatg taattgggct tctagatgtt ttctcgcccg ctaccagtct agaagaattc 300

aatgacgtgt atctggtgac tcacctgatg ggagcagacc tcaacaatat tgtcaagtgc 360

cagaagctga cagatgacca cgtccagttc ctcatttatc aaatcctacg aggattaaag 420

tacattcact cagcagacat catccacaga gatcttaaac ccagtaactt ggctgtaaat 480

gaagactgtg aacttaagat tttagacttt ggtctggccc ggctgactga cgatgagatg 540

acgggatatg ttgccacccg atggtaccgt gccccagaga tcatgctcaa ctggatgcac 600

tacaacatga cagtggacat ctggtcggtg ggctgcataa tggctgagct cctcacagga 660

cggaccctgt ttcccggcac tgatcatatt gatcagttga agcttatctt gatgctcgtc 720

ggaaccccag ggccagagct cttgatgaaa atctcttcgg agtctgcaag gaactacatc 780

aattcccctc cccatatgcc caaaaggaac ttcgcagatg tgcttattgg tgcaaatcca 840

ttagctgtgg acctgctgga gaagatgctg gttctagaca cagataaacg gatcactgcg 900

tcacaggctc tcgcgcaccc gtactttgcc cagtatcacg acccagatga cgagcccgag 960

gcagagccgt acgaccagag cttcgagagt cgcgatctag agatcgacga gtggaaacga 1020

ctcacgtacg aggaagtggt cagcttcgag cctcccatgt tcgacggaga tgagatggag 1080

tcatga 1086

<210> 2

<211> 1086

<212> DNA

<213> 草鱼(Ctenopharyngodon idella)

<220>

<221> misc_structure

<222> (1)..(1086)

<223> 草鱼p38β基因cDNA

<400> 2

atgtcgacaa gaccgggatt ctaccgacaa gaactaaaca agactgtctg ggaggtgcca 60

gaacgatacc agaatctcac accggttgga tcgggggcat atggctcagt atgctcagca 120

tatgatgtgc gcctccgtca gaaagtggct gttaagaagc tctccaggcc cttccagtcc 180

ctcatccaca gcagaagaac gtacagagaa ctaagactgc tcaaacacat gaagcatgag 240

aatgttattg gactgctgga tgttttcacc ccggcagctt ctcttgaaga attcaatgag 300

gtctatcttg tgaccaacct gatgggagcc gatctcaaca acatcgccaa atttcaaaga 360

ctatcagatg aacatgtaca gttcctcatc tatcagcttc tccggggcct taagtacatc 420

cattcagctg gcctgatcca cagagacttg aagccaagca atgtagcggt gaatgaagat 480

tgtgaactca ggattctgga ttttggatta gccaggcaga cagatgatga gatgacgggt 540

tacgtggcga ctcgctggta cagagcccct gagatcatgc tcaactggat gcattacaat 600

cagacagtgg atatctggtc tgttggatgc atcatgggtg aacttctgaa ggggaaggtt 660

ttgtttcctg gcaacgatta tattgatcag ttaaagagaa tcatggagat ggtaggcact 720

cccacccctg acgttttgaa gaagatatcc tccgaacatg ctcagaagta catccagtct 780

cttccacaca tgccccagca ggacctgggg aagatattta ggggggcaaa tccaatggcg 840

gttgatctgt tgaaaaaaat gctggtatta gactgtgacg ggaggatctt agccagtgaa 900

gcactgtgcc atccgtactt ttcccaatac catgatcctg aagatgaacc ggaggcacct 960

ccgtatgatc agacccctga gagcaaggat cgcacattgg aggagtggaa ggagctggtg 1020

ttcgaggaag taaacaattt caaagaccct cccaataaaa ctgaaagtct tcaggttgaa 1080

caataa 1086

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 根据实验要求而设计，作为克隆p38α基因的正向引物p38α-F1

<400> 3

gaagtttcca ctcctctaca 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，作为克隆p38α基因的反向引物p38α-R1

<400> 4

acattctctg tgtccttttg g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，作为克隆p38β基因的正向引物p38β-F1

<400> 5

gaagaagagg aactaaagcc g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，作为克隆p38β基因的反向引物p38β-R1

<400> 6

ctcctcctct tgcttggttt a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 根据实验要求而设计，作为检测p38α基因表达水平的正向引物p38α-F2

<400> 7

cttccccgtg ttcttatcca 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，作为检测p38α基因表达水平的反向引物p38α-R2

<400> 8

acattctctg tgtccttttg g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，作为检测p38β基因表达水平的正向引物p38β-F2

<400> 9

tttttgtatt tgatgtgagg c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，作为检测p38β基因表达水平的反向引物p38β-R2

<400> 10

ctcctcctct tgcttggttt a 21

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 根据实验要求而设计，作为检测TNF-α基因表达水平的正向引物TNF-α-F

<400> 11

cgctgctgtc tgcttcac 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> 根据实验要求而设计，作为检测TNF-α基因表达水平的反向引物TNF-α-R

<400> 12

cctggtcctg gttcactc 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 根据实验要求而设计，作为检测IL-15基因表达水平的正向引物IL-15-F

<400> 13

ccttccaaca atctcgcttc 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 根据实验要求而设计，作为检测IL-15基因表达水平的反向引物IL-15-R

<400> 14

aacacatctt ccagttctcc tt 22

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 根据实验要求而设计，作为检测β-defensin基因表达水平的正向引物β-defensin-F

<400> 15

ttgcttgtcc ttgccgtct 19

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(20)

<223> 根据实验要求而设计，作为检测β-defensin基因表达水平的反向引物β-defensin-R

<400> 16

aatcctttgc cacagcctaa 20

Claims

1.检测p38基因表达水平的特异性引物在制备草鱼细菌性肠炎检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述p38基因为p38α基因或p38β基因；所述p38α基因的cDNA序列如SEQ IDNO.1所示，所述p38β基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示；特异性引物为p38α基因的cDNA序列设计的p38α-F2、p38α-R2，或，根据p38β基因的cDNA序列设计的p38β-F2、p38β-R2；所述p38α-F2和p38α-R2的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；所述p38β-F2和p38β-R2的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

2.p38特异性抑制剂在制备用于治疗草鱼细菌性肠炎的药物中的应用，其特征在于，所述p38特异性抑制剂为SB203580；所述p38基因为p38α基因或p38β基因；所述p38α基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述p38β基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。