CN110484615A - lncRNA在病毒性心肌炎中调控巨噬细胞极化的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种长链非编码RNA调控巨噬细胞极化在病毒性心肌炎中的应用。本申请人发现lncRNA AK085865在M1/M2巨噬细胞中的差异表达最显著，而且AK085865在M2巨噬细胞中表达水平高于M1巨噬细胞。AK085865基因的下调降低了M2的表型表达，同时促进了M1表型的极化；同时AK085865‑/‑基因敲除小鼠对CVB3诱导的VM的易感性增加。在AK085865‑/‑基因敲除VM模型小鼠中，M1巨噬细胞明显增加，而M2细胞数量下降，AK085865特异性地与白细胞介素增强子结合因子2相互作用，在ILF2/ILF3复合物介导的微小RNA加工途径中起负调节作用，促进M2型巨噬细胞极化。

Description

lncRNA在病毒性心肌炎中调控巨噬细胞极化的应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种长链非编码RNA调控巨噬细 胞极化在病毒性心肌炎中的应用。
背景技术
长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,lncRNA)是一类长度超过200个碱 基的不具有蛋白编码潜能的转录本。这些RNA分子可以是基因间的(在蛋白编 码基因之间；长基因间非编码RNA[lincRNA])，内含子，天然反义转录本(NATs)， 或由不同的增强子和启动子转录形成。LncRNAs通过与染色质修饰因子、核不 均一性核蛋白(hnRNPs)或转录因子结合来调控基因转录。此外，lncRNA通过转 录后机制靶向调控宿主mRNA的剪接、修饰或翻译。尽管lncRNA已经在几乎 所有的免疫细胞中被识别出来，但它们在这些细胞中的功能才开始渐渐被发现。 例如，lincRNA-Cox2被鉴定为一个动态调控基因。它是由TLR配体诱导的，反过来又起促进或抑制炎症基因表达的作用。在T细胞中，lncRNA NeST调节IFN-γ 基因转录和Theiler’s病毒持续感染，而lncRNA RMRP调节T-辅助细胞的效应 功能。其他一些lncRNAs，包括THRIL、lnc13和反义lncRNA AS-IL-1a，也能 够调节髓系细胞炎症基因的表达。
病毒性心肌炎(VM)以心肌炎症为特征，是健康青年猝死和心力衰竭的重 要病因。与人的VM病程相似，易感小鼠感染柯萨奇病毒B3(CVB3)后第7-14 天发展成急性心肌炎，在感染后第35天慢慢发展成自身免疫性心肌炎和扩张性 心肌病(DCM)，尽管经过数十年的广泛研究，但是VM的发病机制仍未得到充 分的解释。
尽管CVB3诱导的VM被认为是CD4+ T淋巴细胞介导的炎性心脏疾病，但 积累的数据表明巨噬细胞作为主要的炎性浸润细胞在VM发展中起着致病作用。 巨噬细胞作为炎症主要的调节细胞，具有高度的可塑性和异质性。对照Th1和 Th2的命名，巨噬细胞根据激活方式和分泌的细胞因子的不同，可以分为经典激 活(Classically activatedmacrophage,M1)或选择性激活(Alternatively activated macrophage,M2)两大类型。M1型巨噬细胞，由脂多糖(lipopolysaceharides,LPS) 和γ-干扰素(IFN-γ)诱导，通常产生大量的促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factorα,TNF-α)，白介素12(interleukin 12,IL-12)和一氧化氮 (nitric oxide,NO)。相反的，由Th2细胞分泌的IL-4和IL-13诱导的M2型巨 噬细胞表达高水平的抗炎细胞因子如IL-10、精氨酸酶1(Arginase1,Arg-1)， 类几丁质酶3样分子3(chitinase 3-like 3,Chi3l3或称YM1)和类抵抗素 α(resistin-like-α,Retnlα或称Fizz1)分子。
功能上，M1型巨噬细胞呈现出宿主防御所必需的促炎活性，M2巨噬细胞 参与组织修复和体内平衡的恢复。有研究报道，心肌炎症的严重程度与巨噬细 胞浸润的强度相关，并且巨噬细胞移除的小鼠不能发展成VM。然而，大量的巨 噬细胞浸润并不总是指示重症心肌炎。Frisancho-Kiss和Huber等人发现，对VM 不易感的雌性BALB/c小鼠感染CVB3后也有明显的巨噬细胞浸润。此外，Li 等人发现，过继转移体外极化的M1巨噬细胞显著增加了VM易感的雄性 BALB/c小鼠中心肌炎症状，而M2巨噬细胞转移到易感雄性小鼠中明显减轻了心肌炎症。本申请人前期研究表明，microRNA-155通过影响巨噬细胞极化导致 VM易感性增加。因此，本申请人推测巨噬细胞极化在调节心脏炎症反应中可能 发挥关键作用。然而，尽管这一过程对VM具有重要意义，但巨噬细胞极化的 机制仍有待探索。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种长链非编码RNA调控巨 噬细胞极化在病毒性心肌炎中的应用。
本发明提出的一种长链非编码RNA调控巨噬细胞极化在病毒性心肌炎中的 应用。
优选地，所述长链非编码RNA为lncRNA AK085865，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述病毒性心肌炎由柯萨奇病毒B3诱导。
优选地，所述长链非编码RNA在M2型巨噬细胞中表达水平高于M1型巨 噬细胞。
优选地，所述长链非编码RNA抑制巨噬细胞中LPS和IFN-γ诱导的M1型 表型表达，促进IL-4诱导的M2型表型表达。
优选地，所述长链非编码RNA抑制巨噬细胞中LPS和IFN-γ诱导的TNF-α、 IL-12和NOS2的表达。
优选地，所述长链非编码RNA调控M2型巨噬细胞的表达，调控M1型巨 噬细胞的极化。
优选地，所述长链非编码RNA维持M2型巨噬细胞的表达，抑制M1型巨 噬细胞的极化。
优选地，沉默所述长链非编码RNA加重病毒性心肌炎小鼠的死亡率和心功 能障碍。
优选地，所述长链非编码RNA与白细胞介素增强子结合因子2特异性相互 作用。
优选地，所述长链非编码RNA作为负调控子参与ILF2/ILF3复合物介导的microRNA加工通路。
优选地，所述长链非编码RNA在柯萨奇病毒B3诱导的病毒性心肌炎过程 中促进M2型巨噬细胞极化。
一种诊断或治疗病毒性心肌炎的生物制品，包括所述lncRNA AK085865。
优选地，生物制品包括：试剂、试剂盒、芯片。
本申请人通过长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)芯片分析， 筛选并鉴定出几个在巨噬细胞M1/M2极化过程中差异表达的转录本。其中， lncRNA AK085865的差异表达最显著。本申请人发现，AK085865在M2巨噬细 胞中表达水平高于M1巨噬细胞。AK085865基因的下调降低了M2的表型表达， 同时促进了M1表型的极化，进一步证实AK085865在巨噬细胞极化中起关键作 用。此外，本申请人发现AK085865-/-基因敲除小鼠对CVB3诱导的VM的易感 性增加。此外，在AK085865-/-基因敲除VM模型小鼠中，M1巨噬细胞明显增 加，而M2细胞数量下降。机制上，本申请人发现AK085865特异性地与白细胞 介素增强子结合因子2(interleukin enhancer binding factor,ILF2)，或称为核因 子45(NF45)相互作用，并在ILF2/ILF3复合物介导的微小RNA(microRNA) 加工途径中起负调节作用，从而促进M2型巨噬细胞极化。
综上所述，本申请人证实AK085865是巨噬细胞极化和炎症反应的重要调 节因子，在体外和体内调节巨噬细胞极化中具有关键作用，确定了VM发展中 的新参与者，并提供了一个潜在的具有临床意义的治疗靶点。
附图说明
图1为调控巨噬细胞极化的lncRNAs鉴定图；其中：
图1A为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞中lncRNA表达的变化火山图， 其中X轴为每组的平均归一化值(log2倍数变化)，Y轴的值是每组的平均归 一化值(-log10的P值)；
图1B为所选的lncRNAs在极化的巨噬细胞中差异表达的验证图；
图1C为雄性和雌性VM小鼠心肌浸润巨噬细胞中所选lncRNA的表达图。
图2为lncRNA AK085865的分子特征分析图；其中：
图2A为AK085865的染色体定位结果图；
图2B为M2型巨噬细胞中的AK085865的5’RACE和3’RACE电泳结果图；
图2C为BMDMs中细胞核和细胞质纯化的RNA的RT-qPCR分析结果图；
图2D为荧光原位杂交(FISH)检测BMDMs-M0中内源性AK085865分子 表达，用DAPI染色DNA的结果图(比例尺＝5μm)；
图2E为编码潜力评估工具(CPAT)对AK085865、PPARγ和HOTAIR的 编码预测结果。
图3为巨噬细胞极化过程中lncRNA AK085865的表达模式分析图；其中：
图3A为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞中AK085865的表达水平图；
图3B为诱导M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转变过程中AK085865的 表达水平图；
图3C为诱导M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞的转变过程中AK085865的 表达水平图；
图3D为AK085865在巨噬细胞极化过程中的表达时相分析图；
图3E为急性心肌炎病程中小鼠心脏组织中的AK085865的表达时相分析 图；
图3F为CVB3感染第7天的小鼠心脏浸润细胞中AK085865表达水平图。
图4为巨噬细胞极化过程中lncRNA AK085865作用图；其中：
图4A为转染BMDMs两天后AK085865表达水平图；
图4B为转染BMDMs两天后M1标志基因NOS2、TNF-α和IL-12的mRNA 水平图；
图4C为转染BMDMs两天后M2标志基因Arg1、Ym-1、FIZZ1的mRNA 水平图；
图4D为转染BMDMs两天，再用LPS+IFN-γ处理48h，TNF-α的蛋白水平 图；
图4E为转染BMDMs两天，再用LPS+IFN-γ处理48h，IL-12的蛋白水平 图；
图4F为转染BMDMs两天，再用LPS+IFN-γ处理48h，NOS2的mRNA水 平图；
图4G为转染BMDMs两天，再用IL-4处理48h，Arg1、YM-1、FIZZ1的 mRNA水平图。
图5为Cas9/RNA介导的基因靶向敲除图；其中：图5A为Cas9/RNA介导 的lncRNAAK085865基因靶向敲除模式图；图5B为提取所构建的敲除小鼠鼠 尾DNA作为模板，PCR扩增靶向片段的电泳图；图5C为PCR产物进行T-A 连接克隆至载体，随机挑选20个克隆进行DNA测序的图。
图6为骨髓源巨噬细胞极化分析图；其中：
图6A为LPS加IFN-γ诱导BMDMs的M1极化，M1巨噬细胞相关标志物 表达；
图6B为IL-4诱导BMDMs的M2极化，M2巨噬细胞相关标志物表达。
图7为lncRNA AK085865-/-小鼠对CVB3诱导的VM易感性增加图；其中：
图7A为CVB3感染的各组小鼠心脏切片H&E染色图(比例尺＝50μm)；
图7B为第7天各组小鼠的体重对比图；
图7C为第7天各组小鼠的血清中cTnI水平对比图；
图7D为感染十天内各组小鼠的存活率对比图；
图7E为各组小鼠左心室(LV)功能对比图。
图8为lncRNA AK085865-/-敲除小鼠在CVB3诱导的VM中高表达促炎细 胞因子图；其中：
图8A为第7天心脏组织匀浆液中IFN-γ的蛋白水平图；
图8B为第7天心脏组织匀浆液中IL-4的蛋白水平图；
图8C为第7天心脏组织匀浆液中IL-13的蛋白水平图；
图8D为各组小鼠体内病毒滴度对比图。
图9为lncRNA AK085865-/-敲除小鼠在CVB3诱导的VM中表现出下调的 心脏浸润T细胞的活化图；其中：
图9A为活化的CD4+ T细胞通过FACS检测细胞表面CD62Llow表达水平对 比图；
图9B为CD4+ T细胞的增殖通过FACS检测细胞BrdU表达水平对比图。
图10为各组小鼠心肌浸润白细胞中F4/80+iNOS+或F4/80+Arg1+细胞百分比 图。
图11为FACS分选的小鼠心脏组织中F4/80+巨噬细胞中NOS2、Arg1、 FIZZ1和YM-1的表达水平图。
图12为各组小鼠心脏切片染色共定位分析图(比例尺＝100μm)。
图13为各组小鼠心脏切片H&E染色图(比例尺＝50μm)。
图14为荧光显微镜观察各组小鼠心脏中eGFP的表达图(比例尺＝100μm)。
图15为lncRNA AK085865过表达可降低CVB3诱导的VM心肌炎症反应 图；其中：
图15A为CVB3感染第7天各组小鼠心脏切片染色图(比例尺＝50μm)；
图15B为CVB3感染第7天各组小鼠心脏重量对比图；
图15C为CVB3感染第7天各组小鼠体重减轻量对比图；
图15D为CVB3感染第7天各组小鼠血清中cTnI水平对比图；
图15E为CVB3感染第10天各组小鼠存活率对比图。
图16为lncRNA AK085865互作蛋白ILF2的鉴定图；其中：
图16A为生物素化AK085865或反义对照RNA对BMDMs体外结合实验纯 化的核提取物的SDS-PAGE分析图；
图16B为AK085865与ILF2在体外相互作用的蛋白免疫印迹图；
图16C为ILF2抗体对巨噬细胞的蛋白免疫沉淀图；
图16D为用于RNA-蛋白质结合检测的AK085865缺失突变体示意图；
图16E为ILF2结合AK085865的3'-区域的蛋白免疫印迹图。
图17为lncRNA AK085865调控ILF2/ILF3复合体的功能图；其中：
图17A为各组小鼠巨噬细胞中的ILF2和ILF3蛋白水平图；
图17B为抗ILF2的抗体进行Co-IP实验结果图；
图17C为各组小鼠巨噬细胞中差异表达miRNA的火山图；
图17D为各组小鼠巨噬细胞中差异表达miRNA的对比图；
图17E为ILF2 siRNAs转染WT小鼠后，其巨噬细胞中pri-miRNAs和成熟 miRNAs的表达水平图；
图17F为ILF2 siRNAs转染AK085865-/-小鼠后，其巨噬细胞中pri-miRNAs 表达水平图；
图17G为ILF2 siRNAs转染AK085865-/-小鼠后，其巨噬细胞中成熟miRNAs 表达水平图。
图18为转染3天后，LPS+IFN-γ或IL-4处理细胞48h，NOS2、Arg1的 表达水平图。
上述图中，**代表p<0.01，***代表p<0.001。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本申请人对体外极化的M1和M2巨噬细胞进行芯片分析以鉴定参与巨噬细 胞极化的lncRNAs，其结果如图1A所示。由图1A可知：当差异表达的阈值设 置为倍数变化≥2，且P<0.05时，M1巨噬细胞中高表达的lncRNAs为627个， M2中高表达的lncRNAs为624个。
根据lncRNA反向靶基因预测结合差异表达lncRNAs的邻近基因功能，本 申请人选择若干lncRNAs，并运用RT-qPCR对芯片结果进行验证，其结果如图 1B所示。由图1B可知：经RT-qPCR分析，M1/M2中表达差异显著的4个lncRNAs (AK048798、AK085865、AK083884、AK153212)结果与芯片相符。
已有研究发现VM急性期雄性和雌性小鼠心肌浸润巨噬细胞的表型存在差 异，雄性分化为M1型，雌性主要为M2型。本申请人上述4个lncRNAs在心 脏浸润巨噬细胞中的表达进行分析，其结果如图1C所示。由图1C可知：在VM 急性期雌性小鼠心肌浸润巨噬细胞中，lncRNA AK085865是其中上调表达最显 著并且含量丰富的分子。
实施例2
由于许多lncRNAs已被证明对其邻近基因具有正向或负向的调控作用，因 此其邻近基因的基因组位置需要进一步进行分析，如图2A所示。AK085865位 于小鼠的6号染色体上，并转录于蛋白编码基因PPARγ的第二内含子。
如图2B所示，本申请人采用5’cDNA末端和3’末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNA Ends,RACE)确定AK085865的长度为1266个bp。
核质分离后提取RNA进行RT-qPCR检测，其结果如图2C所示。由图2C 可知：约70％的AK085865转录本位于细胞核内。
如图2D所示，荧光原位杂交(FISH)也显示AK085865主要位于细胞核内， 提示AK085865可能在细胞核内发挥其生物学功能。与AK085865定义为一种非 编码RNA相符，序列上其没有大于200bp的开放阅读框(ORFs)。
如图2E所示，将AK085865、PPARγ和HOTAIR的RNA序列输入至编码 潜力评估工具(CPAT)中，预测结果为AK085865和HOTAIR两者均是非编码 RNA，而PPARγRNA被鉴定可编码蛋白质，即AK085865具有非常低的编码点 位，类似于已知的lncRNA HOTAIR。而使用体外翻译系统，本申请人没有发现 AK085865蛋白产物的证据。
实施例3
本申请人采用RT-qPCR检测巨噬细胞(M1和M2)极化过程中AK085865 的表达水平，GAPDH作为内参，其结果如图3A所示。由图3A可知：M2巨噬 细胞的AK085865水平明显高于M1巨噬细胞。
本申请人采用LPS和IFN-γ刺激M2型巨噬细胞或用IL-4刺激M1型巨噬 细胞来将巨噬细胞的表型进行逆转以判断AK085865是否有助于巨噬细胞极化 的可塑性。将M1型巨噬细胞在含有IL-4的新鲜培养基中再培养2天，诱导M1 向M2的转变；将M2型巨噬细胞在含有LPS和IFN-γ的新鲜培养基中培养2 天，以诱导M2向M1的转变；RT-qPCR检测AK085865水平，其结果如图3B、 图3C所示。由图3B和图3C可知：M1-to-M2的转化导致AK085865表达增加， 而M2-to-M1的转化导致AK085865表达减少。
本申请人对AK085865在巨噬细胞极化过程中的表达时相分析，其结果如 图3D所示。由图3D可知：IL-4的刺激导致AK085865表达显著增加，在48h 时最明显。上述结果表明AK085865可能参与巨噬细胞极化。
本申请人检测M1-to-M2转化过程中AK085865是否表达增加以确定 AK085865是否在巨噬细胞极化起重要作用。本申请人对急性心肌炎病程中小鼠 心脏组织中的AK085865进行表达时相分析，其结果如图3E所示。由图3E可 知：与对照PBS组小鼠相比，感染CVB3的小鼠心脏组织中AK085865表达增 加。
由于CD4+ T细胞和巨噬细胞是VM发病的关键介质，本申请人对AK085865 在心脏浸润性单核细胞中的表达进行分析，采用RT-qPCR检测CVB3感染第7 天的小鼠心脏浸润细胞中AK085865表达，其结果如图3F所示。由图3F可知： 巨噬细胞中AK085865的表达高于总单核细胞。
由于M1和M2巨噬细胞在VM中的既定作用，上述数据表明AK085865 可能通过调节巨噬细胞极化参与VM。
实施例4
本申请人运用AK085865特异性的lncRNA Smart Silencer来抑制BMDMs 中AK085865的表达，以确定AK085865在巨噬细胞极化中的功能作用。
本申请人采用100nM对照siRNA或AK085865抑制剂转染BMDMs，转染 两天后具体操作如下：
1、RT-qPCR检测AK085865表达，采用GAPDH作为内参；其结果如图4A 所示。
2、用LPS(100ng/ml)加IFN-γ(20ng/ml)处理48h。通过RT-qPCR测定M1标 志基因NOS2、TNF-α和IL-12的mRNA水平；其结果如图4B所示。由图4B 可知：。
3、用IL-4(20ng/ml)处理48h，RT-qPCR检测M2标志基因Arg1、Ym-1、 FIZZ1的mRNA水平；其结果如图4C所示。
由图4A、图4B和图4C可知：抑制AK085865表达可以促进BMDM中LPS 和IFN-γ诱导的M1型表型表达，并降低IL-4诱导的M2型表型表达。
本申请人再通过抑制了M2巨噬细胞中AK085865的表达以观察是否具有同 样的效果。本申请人用100nM对照siRNA或AK085865抑制剂转染M2巨噬细 胞，转染两天后具体操作如下：
4、用LPS(100ng/ml)加IFN-γ(20ng/ml)处理细胞48h，收集细胞培养上清， ELISA测定TNF-α的蛋白水平；其结果如图4D所示。
5、用LPS(100ng/ml)加IFN-γ(20ng/ml)处理细胞48h，收集细胞培养上清， ELISA测定IL-12的蛋白水平；其结果如图4E所示。
6、用LPS(100ng/ml)加IFN-γ(20ng/ml)处理细胞48h，RT-qPCR检测NOS2 的mRNA水平；其结果如图4F所示。
7、用IL-4(20ng/ml)处理细胞48h，RT-qPCR检测Arg1、YM-1、FIZZ1的 mRNA水平；其结果如图4G所示。
由图4D、图4E、图4F和图4G可知：AK085865抑制后上调了BMDM中 LPS和IFN-γ诱导的TNF-α、IL-12和NOS2的表达，提示AK085865对M1巨 噬细胞极化具有抑制作用；同时抑制AK085865的表达下调了IL-4诱导的M2 表型基因，如Arg1、FIZZ1和YM-1。上述数据表明AK085865参与维持M2巨 噬细胞表型。
本申请人敲除了包含AK085865完整的1922bp基因位点的序列，并构建 AK085865基因敲除(KO)小鼠，以验证AK085865调控巨噬细胞极化的假设。 具体地，通过Cas9/RNA介导的lncRNA AK085865基因靶向敲除；提取所构建 的敲除小鼠鼠尾DNA作为模板，PCR扩增靶向片段；PCR产物进行T-A连接 克隆至载体，随机挑选20个克隆进行DNA测序，如图5所示。由图5可知： AK085865 KO小鼠是健康的，并且按照预期的孟德尔频率繁殖，没有性别偏见，没有任何明显的发育缺陷。
本申请人提取了AK085865 KO和野生型WT小鼠的骨髓细胞制备BMDMs， 以确定AK085865是否参与巨噬细胞极化。通过分离AK085865-/-和WT小鼠股 骨，获得骨髓细胞，制备BMDMs。依次采用LPS(100ng/ml)加IFN-γ(20ng/ml) 诱导BMDMs的M1极化、IL-4(20ng/ml)的诱导BMDMs的M2极化，然后采用 RT-qPCR分别分析BMDMs的M1巨噬细胞相关标志物表达和M2巨噬细胞相 关标志物表达，分别如图6所示。
由图6A可知：与WT小鼠的BMDMs相比，LPS和IFN-γ作用后AK085865-/-敲除小鼠的BMDMs中TNF-α、IL-12和NOS2表达显著增加；而由图6B可知： IL-4诱导的AK085865-/-敲除小鼠的BMDMs中Arg1、FIZZ1和YM-1的表达水 平显著降低。上述数据证实：敲除AK085865对M2巨噬细胞极化具有抑制作用， 并使巨噬细胞极化向M1表型方向发展。
实施例5
本申请人通过AK085865-/-和WT小鼠在第0天接受1×105PFU的CVB3或 PBS进行腹腔注射，后续处理如下：
1、第7天各组小鼠分离心脏样本，用H&E染色对CVB3感染的WT和 AK085865-/-小鼠心脏切片进行染色，并在显微镜目镜网格的帮助下，以有炎症 的心脏切片占整个心脏切片的百分比来评估心肌炎的严重程度，其结果如图7A 所示；与WT小鼠相比，AK085865-/-小鼠的心肌炎症状明显加重，单核炎症灶 较多。
2、第7天各组小鼠测量体重，其结果如图7B所示；第7天各组小鼠检测 血清中cTnI水平，其结果如图7C所示。由图7B和图7C可知：AK085865的 缺失显著增加了与全身疾病相关的体重减轻，也增加了血清中的cTnI水平，与 上述观察结果一致。
3、观察小鼠感染后的存活率，直至第十天，其结果如图7D所示。由图7D 可知：AK085865的缺失显著降低了CVB3感染后的存活率，从约60％下降到 40％。
4、经右侧颈动脉插入自制的聚乙烯导管评估左心室(LV)功能。连续记录左 室压力信号并存储在计算机中，确定脱机左室舒张末期压力(LVEDP)、左室收缩 压(LVSP)、左室压力最大一阶导数(dP/dtmax)、左室压力最小一阶导数 (-dP/dtmin)，其结果如图7E所示。由图7E可知：在CVB3感染后存活的小鼠 中，AK085865-/-小鼠除了生存率降低外，还加重了心脏的功能障碍。存活到观 察时间点的AK085865-/-小鼠左室舒张末期压力(LVEDP)升高，左室收缩压 (LVSP)降低，左室压力最大一阶导数(+dP/dtmax)降低，左室压力最小一阶 导数(dP/dtmin)降低。总之，沉默AK085865会加重VM小鼠的死亡率和心功 能障碍。
5、第7天将CVB3感染的AK085865-/-和WT小鼠的心脏匀浆后，分别通过 ELISA检测IFN-γ的蛋白水平、IL-4的蛋白水平和IL-13的蛋白水平，其结果依 次如图8A-C所示。
本申请人利用ELISA检测心脏组织中包括IFN-γ、IL-4和IL-13在内的炎症 因子的水平来分析细胞因子在VM的第七天的表达变化。由图8A-C可知：CVB3 感染可导致WT小鼠心脏组织中产生IFN-γ，而AK085865缺失将导致心肌组织 中IFN-γ水平显著增加，而IL-4和IL-13表达水平降低，表明AK085865-/-小鼠 感染CVB3后心肌组织中抗炎细胞因子水平显著降低。
6、采用空斑实验检测AK085865-/-和WT小鼠体内病毒滴度，其其结果如图 8D所示。由图8D可知：在CVB3感染后第7天，所有组的心脏病毒复制没有 显著差异。
7、第7天各组小鼠分离心脏组织，通过酶消化心脏组织分离获得心脏浸润 的白细胞，通过FACS检测细胞表面CD62Llow表达获得活化的CD4+ T细胞，其 结果如图9A所示。
由于CD4+ Th免疫反应的偏倚在很大程度上影响心肌炎的严重程度，因此 本申请人测定了AK085865缺失对体内心脏浸润的CD4+ T细胞活化表型的影 响。由图9A可知：在CVB3感染的第7天，与WT小鼠相比，AK085865-/-VM 小鼠的心脏浸润性CD4+ T细胞表达低水平CD62L的比例增加，提示 AK085865-/-VM小鼠的CD4+ T细胞活化增加。
8、第6天向小鼠体内注射BrdU(0.8mg/mL PBS)，第7天处死小鼠，通过 酶消化心脏组织分离获得心脏浸润的白细胞，通过FACS检测细胞表面CD62Llow表达获得活化的CD4+ T细胞，其结果如图9B所示。
由图9B可知：与WT小鼠相比，感染后7天的AK085865-/-小鼠CD4+BrdU+效应T细胞显著增加。因此，AK085865-/-VM小鼠的心脏浸润性CD4+T细胞比 WT VM小鼠活化程度和增殖反应更高。
上述数据显示巨噬细胞极化在VM的发生发展中起着不可或缺的作用。鉴 于本申请人的数据已经表明AK085865-/-小鼠更容易发生VM，本申请人推测在 AK085865-/-和WT小鼠中可能存在功能不同的巨噬细胞。
基于此，本申请人检测了AK085865-/-和WT小鼠心脏浸润巨噬细胞的表型。 具体地，将上述酶消化后从心脏中分离心肌浸润白细胞采用流式细胞仪(FACS) 分了F4/80+iNOS+或F4/80+Arg1+细胞的百分比，其结果如图10所示。
由图10可知：在CVB3诱导VM的第7天，AK085865-/-VM小鼠心脏中表 达iNOS的F4/80+巨噬细胞中的比例增加；同时F4/80+Arg1+巨噬细胞的比例显 著下降，这可能表明M2巨噬细胞在AK085865-/-VM小鼠心脏组织中减少。
接着采用RT-qPCR检测FACS分选的小鼠心脏组织中F4/80+巨噬细胞中 NOS2、Arg1、FIZZ1和YM-1的表达，其结果如图11所示。由图11可知：与 图10相符，AK085865-/-VM小鼠中分离的F4/80+巨噬细胞与WT VM小鼠中分 离的巨噬细胞相比，M2特异性基因Arg1、FIZZ1、YM-1的表达均有下降。
本申请人进行共定位分析，切片双染CD68(巨噬细胞标记)和iNOS(M1 标记)或Arg1(M2标记)，采用DAPI进行细胞核染色，其结果如图12所示。 由图12可知：与FACS分析结果相似，源自AK085865-/-VM小鼠心脏组织CD68+巨噬细胞内iNOS信号明显增加，而Arg1信号几乎没有检测到。
综上所述，上述数据表明AK085865在CVB3诱导的VM过程中对心脏浸 润巨噬细胞的极化具有重要影响。
为了研究巨噬细胞中AK085865的缺失在VM发展中的关键作用，本申请 人首先利用AK085865 KO和WT小鼠构建骨髓(BM)嵌合小鼠。致死性照射 的AK085865 KO或WT小鼠被过继转移WT小鼠的骨髓。如图13所示，两种 基因型(WT BM-KO和WT BM-WT)的受者在CVB3感染后心肌炎症的严重程 度相当。然而，与WT BM-KO或WT BM-WT小鼠相比，用AK085865 KO小鼠(KO BM-WT)的BM重组的WT受体小鼠显示出明显的VM加重。上述结 果证实：巨噬细胞中AK085865的缺失是CVB3诱导的VM易感性增强的主要 原因。
实施例6
为了研究在CVB3感染前，体内心肌内注射AK085865是否影响WT小鼠 的VM进程。本申请人构建了AK085865过表达的腺相关病毒(AAV)，将6周 龄的C57BL/6野生型小鼠先进行麻醉、插管和机械通气，再用30号针将体积为 50μL(含2×109病毒颗粒/位点)的AAV9-scramble或AAV9-AK085865病毒以 每只小鼠6个注射部位注射到左心室顶部。
4周后，制备6-μm冷冻切片，荧光显微镜观察小鼠心脏中eGFP的表达， 其结果如图14所示。由图14可知：用AAV9衣壳处理的小鼠心脏切片中EGFP 表达均匀分布。
4周后，给予小鼠腹腔注射1×105PFU的CVB3病毒。CVB3感染的第7天 以心脏重量、体重减轻量、cTnI水平来评估VM的各项参数，其结果依次图图 15B-D所示；CVB3感染的第7天制备心脏切片并用HE染色，其结果如图15A 所示；同时观察小鼠感染后第10天的存活率，其结果如图15E所示。
由图15A可知：在CVB3感染后的第7天，AK085865过表达可减轻心肌 炎症，表现为炎症局限性病灶和炎症面积减少。由图15B-D可知：与图15A一 致，AK085865过表达显著降低了心脏重量的增加，并减少了与全身疾病疾病相 关的体重减轻和血清中的cTnI水平。同时由图15E可知：AK085865过表达显 著提高了CVB3感染后的存活率，从约50％提高到70％。
上述数据共同表明，AK085865过表达可有效地挽救因CVB3感染引起的致 死性心肌炎小鼠。
实施例7
本申请人将体外转录的生物素化AK085865或其反义对照RNA与BMDMs 的全细胞提取物孵育，进行RNA-蛋白结合实验，以鉴定AK085865的互作蛋白。 本申请人利用链霉亲和素磁珠捕获RNA-蛋白复合物，并在SDS-PAGE上进行解 析，对AK085865下拉富集的蛋白条带(35-50kd)进行质谱鉴定，如图16A所 示。由图16A可知：上述方法鉴定出三种RNA结合蛋白，与反义对照相比，它 们在AK085865的下拉过程中富集程度更高。
本申请人采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)证实了RNA结合蛋白与AK085865的结合能力，其结果如图16B所示。由图16B可知：本申请人证实 AK085865特异性地与ILF2相互作用，但不与真核翻译延伸因子1alpha 1 (EEF1A1)或RBMX样1(Rbmxl1)相互作用。
本申请人还在体内证实了AK085865-ILF2的相互作用，即采用ILF2抗体对 BMDMs进行RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验，对与ILF2相互作用的RNA 进行洗脱、逆转录、RT-qPCR检测，其结果如图16C所示。由图16C可知：在 非交联BMDMs中进行ILF2 RNA结合蛋白免疫沉淀，然后对共纯化RNA进行 RT-qPCR分析，发现AK085865在ILF2免疫沉淀物中特异性富集。
上述结果表明，AK085865在体内和体外均与ILF2特异性相互作用。
本申请人还利用AK085865的一系列缺失突变体来绘制ILF2结合区域，其 中用于RNA-蛋白质结合检测的AK085865缺失突变体示意图如图16D所示；而 利用AK085865的生物素化全长突变体或缺失突变体进行RNA-蛋白结合实验， 从BMDMs中分离的核提取物，使用链霉亲和素珠捕获，并对ILF2进行蛋白质 免疫印迹法(Western blot)，ILF2结合AK085865的3'-区域如图16E所示。
由图16D和图16E可知：ILF2与AK085865的3’-466核苷酸区相互作用， 而且该区域对结合ILF2来说既是必要的也是充分的。上述数据表明，AK085865 通过其3’-466区域与ILF2相互作用，而且该区域对ILF2的结合至关重要。
实施例8
先前的研究表明，ILF2和ILF3蛋白总是形成异二聚体，并在细胞核中发挥 作用。AK085865与ILF2的直接结合增加了AK085865可能调控ILF2/ILF3蛋白 水平和/或功能的可能性。
本申请人首先用蛋白质免疫印迹法(Western blot)分析比较了AK085865-/-和WT小鼠BMDMs中的ILF2和ILF3蛋白水平，以β-actin作为内参，其结果 如图17A所示。由图17A可知：AK085865缺失导致了ILF2和ILF3蛋白水平 升高。
再采用抗ILF2的抗体进行Co-IP实验，将与ILF2相互作用的蛋白进行洗脱， 并通过Western blot对其进行定量，其结果如图17B所示。由图17B可知：ILF2 和ILF3之间存在直接的相互作用，AK085865的缺失增强了ILF2与ILF3的结 合。
有报道称ILF2/ILF3复合物通过与pri或pre-miRNA结合来抑制miRNA的 加工。本申请人分析、比较AK085865-/-和WT小鼠BMDMs的miRNA表达谱 以检验miRNA加工是否受AK085865的调控，将AK085865-/-和WT小鼠BMDMs 中差异表达miRNA形成火山图，如图17C所示。由图17C可知：上述两组中 有24个miRNAs表达存在统计学差异。
本申请人又采用RT-qPCR对所选miRNA的差异表达进行验证，其结果如 图17D所示。由图17D可知：AK085865-/-小鼠BMDMs中miR-7a表达上调(倍 数变化>2，且P<0.05)，而miR-139、miR-149-3p和miR-192表达下调(倍数变 化<-2，且P<0.05)。
本申请人检测了AK085865-/-和WT小鼠BMDMs中相应的pri-miRNA的水 平，以找寻上述miRNA表达水平差异的原因，采用ILF2 siRNAs转染WT小鼠 BMDMs后提取RNA，RT-qPCR分析其中的pri-miRNAs和成熟miRNA的表达 水平，采用GAPDH和snRNA U6作为内部对照，对数据进行归一化处理，如图 17E所示。由图17E可知：与WT小鼠相比，AK085865-/-小鼠BMDMs中检测 到的pri-miR-139和pri-miR-192水平显著升高。
本申请人采用ILF2 siRNAs转染AK085865-/-小鼠BMDMs后提取RNA， RT-qPCR分析其中的pri-miRNAs和成熟miRNA表达水平，其结果分别如图17F 和图17G所示。由图17F和图17G可知：与AK085865-/-小鼠相比，ILF2的敲 低导致miR-139和miR-192水平升高，而pri-miR-139和pri-miR-192在BMDMs 中的表达降低。
因此，上述结果增加了KO小鼠BMDMs中miR-139和miR-192水平降低 的可能性，这是由于ILF2和ILF3的增强结合抑制了pri-miRNA的加工。
接下来本申请人评估了miR-139和miR-192对IL-4诱导的M2极化的影响。 本申请人采用100nM的对照siRNAH和miR-139或miR-192特异性siRNA转 染BMDMs，转染3天后，用LPS(100ng/ml)加IFN-γ(20ng/ml)或IL-4(20ng/ml) 继续处理细胞48h，RT-qPCR检测NOS2、Arg1的表达，其结果如图18所示。 由图18可知：miR-139和miR-192的敲低降低了M2巨噬细胞的表型表达，同 时促进WT小鼠BMDMs向M1表型极化。
上述结果均支持AK085865通过在ILF2/ILF3复合物介导的miRNA加工途 径中起负调控作用来促进M2巨噬细胞极化的观点。
上述所用引物序列(5’-3’方向)如下表所示：
上述用于siRNA转染的寡核苷酸序列如下表所示：
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本 发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护 范围之内。
序列表
<110> 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院）
<120> lncRNA在病毒性心肌炎中调控巨噬细胞极化的应用
<130> 2010
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1265
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
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gtgactaact ggttctgcat gattttaatc gagtttttca cttggctgct atgttaactt 120
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<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gcatgggaag gcaacgaat 19
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcagccagag gagagaaaag agt 23
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gccctgttgt agtaactta 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
accttggaag aacttactt 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccctgttgta gtaacttaa 19
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ttcaagcttg gcaggttatc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
caattagagg ccactgattc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gagactagag gaagtacatc 20

Claims (9)

1.一种长链非编码RNA调控巨噬细胞极化在病毒性心肌炎中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述长链非编码RNA为lncRNA AK085865，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述病毒性心肌炎由柯萨奇病毒B3诱导。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述长链非编码RNA在M2型巨噬细胞中表达水平高于M1型巨噬细胞。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述长链非编码RNA调控M2型巨噬细胞的表达，调控M1型巨噬细胞的极化。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述长链非编码RNA与白细胞介素增强子结合因子2特异性相互作用。
7.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述长链非编码RNA作为负调控子参与白细胞介素增强子结合因子2/白细胞介素增强子结合因子3复合物介导的微小RNA加工通路。
8.一种诊断或治疗病毒性心肌炎的生物制品，其特征在于，包括所述lncRNAAK085865。
9.根据权利要求8所述生物制品，其特征在于，生物制品包括：试剂、试剂盒、芯片。
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