CN108018310B - 可诱导的转基因小鼠心肌病动物模型的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有calpain‑1基因的表达载体，包括依次连接的Tet操纵子、α‑MHC启动子核酸序列、线粒体信号肽序列以及calpain‑1的基因片段。本发明还提供了一种可诱导的转基因小鼠心肌病动物模型的构建方法：将含有calpain‑1基因的表达载体导入小鼠受精卵，然后将受精卵移入受体小鼠子宫进行妊娠，获得阳性子代转基因小鼠；将阳性子代转基因小鼠与特异性表达tTA的转基因小鼠或特异性表达rtTA的转基因小鼠交配，从杂交子代中挑选出可诱导的转基因小鼠心肌病动物模型。本发明还公开了上述构建方法得到的转基因小鼠心肌病动物模型在筛选治疗心肌病药物的应用。本发明的建模成功率高，表型稳定，成本较低，可根据实际需要选择是否诱导心肌病的发生。

Description

可诱导的转基因小鼠心肌病动物模型的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，尤其涉及一种可诱导的转基因小鼠心肌病动物模型的构建方法及应用。

背景技术

心肌病是一类由多种原因引起的，以心肌增大、增厚和变硬为主要特征的心肌疾病，临床上常表现为心脏机械/心电活动障碍和心室异常肥厚或扩张，该病随病程发展可最终演变成心力衰竭。近些年来，心肌病发病率在全球逐年上升，在我国也已经成为临床最常见的心脏病之一。心肌病发病机制复杂、病程隐匿、预后极差并缺乏特效治疗手段，严重危害人群健康的同时也给国家和社会造成沉重负担。心肌病动物模型在相关研发过程中扮演着重要角色，同时兼具经济、可靠和简便易得等特性的心肌病动物模型能在很大程度上节约人力、物力和财力，加速推动研发过程。

目前常见的心肌病动物模型建模方式主要有以下几种：

1.病毒感染。具体是向健康动物的腹腔注射柯萨奇病毒3(CVB3)，根据接种量的不同约在1-3个月后发展为心肌病。CVB3感染所致的心肌病模型与临床关联性较好，能够比较好地模拟病毒所致扩张性心肌病的发生发展过程。这种方式的缺点：(1)建模时间偏长，有文献报道最长需1年以上；(2)病毒本身使用过程中存在很大的潜在风险；(3)在建模过程中心肌炎和心肌病的界限不易准确鉴别，可行性较差。

2.右室超速起搏。向健康动物的心脏右室前壁放置起搏器诱导心肌病，采用此种方法建立的心肌病模型与临床具有一定相关性。但缺点如下：(1)需要有一定的技术训练和配套设备；(2)小型动物例如大、小鼠心脏小，操作极为不便，失败率较高。

3.药物干预。阿霉素是一种直接作用于DNA的药物，临床上用来治疗多种肿瘤，由于其具有心肌损伤的毒副作用，因此也可用来制备心肌病动物模型。通常是向健康动物一次性高剂量或连续多次低剂量腹腔注射阿霉素，连续通过超声心动图做心功能检测直至确定心肌病造模成功。随着药物剂量的增加和作用时间的延长，可引起扩张性心肌病，病理可见心肌细胞肿胀、间隙变小、心肌纤维局限性断裂和心肌间质中血管扩张等变化，心功能方面则出现左室射血分数和左室短轴缩短率等多项指标显著下降，这些病理形态学方面和心功能方面的改变与临床心肌病较为接近。这种方式的缺点：(1)阿霉素使用剂量目前尚无统一标准，剂量不足容易造模失败而剂量过高容易直接致死；(2)腹腔注射需要有一定的技术训练，实际操作过程中由于操作人员的手法差异，存在着一定的失败率。

4.引进模型。直接引进心肌病动物模型，例如BIO 14.6地鼠，该品系动物存在δ2肌聚糖单一基因的缺失或突变，使其在生长发育过程中自发形成心肌病。但该模型多数需要从国外引进，操作实用性不佳且成本较高。此外，这种心肌病与某种特定基因突变相关，并不能很好模拟获得性心肌病的发生。

钙蛋白酶(Calpain)属于钙依赖性的半胱氨酸蛋白酶家族，其中calpain-1是当前家族成员中研究得最为清楚的一种。Calpain-1是异源二聚体，由一个特异的80kDa大催化亚基和共同的28kDa小调节亚基组成的。Calpain-1被钙离子激活后能通过有限酶切作用裂解底物，进而参与调控多种生理和病理过程。

Calpain-1与心肌病的发生发展关系密切。最近的研究发现心肌细胞线粒体中存在calpain-1，现有研究成果表明糖尿病和脓毒血症发生时，心肌细胞线粒体内calpain-1蛋白水平和活性均显著升高；缺血性心肌病中心肌细胞线粒体内calpain-1活性增高。此外，心肌细胞线粒体内calpain-1的升高能致使ATP合成酶和呼吸链1型复合体的功能失调，一方面这将引起能量代谢受阻和ATP产量减少，直接损伤心功能，另一方面线粒体呼吸链功能失调也会导致线粒体活性氧的过量产生，进而损伤线粒体引起心肌细胞死亡。由此可见，心肌细胞线粒体calpain-1特异性升高可能为某些获得性心肌病的共同机制。

四环素转录调控系统(Tetracycline-Controlled TranscriptionalActivation)是现阶段应用于调节转基因表达的常见系统，由Tet阻遏蛋白(TetR)和Tet操纵子(TetO)所组成，其中TetR分为Tet-Off和Tet-On两类。多个Tet操纵子序列能与例如人巨细胞病毒启动子(CMV promoter)形成四环素反应元件(TRE)。在Tet-Off系统中，由于启动子缺少增强子，目的基因不表达，当四环素反式激活子(tTA)结合并激活四环素反应元件时，下游目的基因得以顺利表达，四环素(Tet)及其衍生物强力霉素(Doxycycline)等能够与tTA结合从而改变其构象使其无法与四环素反应元件相结合，从而停止下游目的基因的表达；Tet-On系统的工作原理与Tet-Off类似，所不同的是tTA被反义四环素反式激活子(rtTA)所替代，rtTA只有与四环素(Tet)及其衍生物强力霉素(Doxycycline)结合后才能与四环素反应元件反应并使下游目的基因表达，反之，下游目的基因不表达。

综上所述，当前主要的心肌病动物模型和建模方式都存在着明显不足，并且目前的心肌病动物模型不能根据实际需要选择是否诱导心肌病发生。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种可诱导的转基因小鼠心肌病动物模型的构建方法及应用，本发明的建模成功率高，表型稳定，成本较低，可根据实际需要选择是否诱导心肌病的发生。

本发明提供了一种含有calpain-1基因的表达载体，包括依次连接的Tet操纵子(TetO)、α-MHC启动子核酸序列、线粒体信号肽序列以及calpain-1的基因片段。

进一步地，线粒体信号肽的序列如SEQ ID No.1所示。线粒体信号肽是指能靶向定位于线粒体的信号肽分子。

TetO用于构建Tet-Off或Tet-On系统，α-MHC启动子核酸序列用于确保心肌特异性表达，而线粒体信号肽核酸序列负责生成线粒体信号肽，以便引导目的产物calpain-1进入线粒体。

进一步地，出发载体为真核表达载体。

进一步地，真核表达载体为Alpha-MyHC clone 26质粒，该质粒为杂志Journal ofBiological Chemistry.1991May 15；266(14):9180-5中报道的质粒。

进一步地，含有calpain-1基因的表达载体的制备方法包括以下步骤：

(S1)在calpain-1的基因片段的5’端连接TetO、α-MHC启动子核酸序列和线粒体信号肽序列，PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(S2)将PCR扩增产物和真核表达载体经酶切、连接后，得到重组质粒；

(S3)将重组质粒转入大肠杆菌，提取质粒并经PCR扩增、酶切，得到所述含有calpain-1基因的表达载体。

进一步地，在步骤(S2)中，使用限制性内切酶Not I或BamH I进行酶切。

进一步地，在步骤(S2)中，连接时使用T4DNA连接酶。

进一步地，在步骤(S3)中，大肠杆菌可以为DH5αE.coli或TOP10E.coli。

本发明还提供了一种可诱导的转基因小鼠心肌病动物模型的构建方法，采用上述含有calpain-1基因的表达载体，包括以下步骤：

(1)将含有calpain-1基因的表达载体导入小鼠受精卵，然后将获得的受精卵移入受体小鼠子宫进行妊娠，获得阳性子代转基因小鼠；

(2)将阳性子代转基因小鼠与特异性表达四环素反式激活子(tTA)的转基因小鼠或特异性表达反义四环素反式激活子(rtTA)的转基因小鼠交配，挑选出杂交子代中心肌特异性且线粒体选择性过表达calpain-1的转基因小鼠(Tg-mtCapn1/tTA或Tg-mtCapn1/rtTA)，即为可诱导的转基因小鼠心肌病动物模型。

进一步地，上述方法构建的转基因小鼠心肌病动物模型可被四环素及其衍生物强力霉素诱导。

本发明还公开了上述构建方法得到的转基因小鼠心肌病动物模型在筛选治疗心肌病药物的应用。

进一步地，药物可以为Mito-TEMPO、MitoQ和SS31，或其他类似具有改善线粒体功能抵抗心肌病的潜力药物。

本发明构建了可诱导的心肌特异性线粒体选择性过表达calpain-1的转基因小鼠心肌病模型，借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)心肌病建模成功率高。本发明中心肌病动物模型造模方式的成功率显著高于现有其他造模方式，实例验证中优选品系的最终心肌病发生率为100％。

(2)该转基因小鼠心肌病模型遗传稳定，表型稳定，造模成功后可以长期维持繁殖，使用方便。

(3)该转基因小鼠心肌病模型对饲料和饲养环境无特殊要求，维护成本较低。

(4)需要时可以从外单位引进直接使用该心肌病模型，免去漫长的建模等待期，节约时间和精力。

(5)所建模型可以根据实际需要选择是否诱导心肌病发生，对于Tg-mtCapn1/tTA小鼠而言，可以通过四环素或强力霉素干预抑制calpain-1的表达从而阻断心肌病的发生；对于Tg-mtCapn1/rtTA而言，可以通过四环素或强力霉素干预促进calpain-1的表达从而诱导心肌病的发生。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为本发明含有calpain-1基因的表达载体的结构示意图；

图2为心肌特异性线粒体calpain-1过表达转基因小鼠心肌病动物模型构建过程示意图；

图3为转基因小鼠PCR初筛结果(编号1-56代表56只初代待筛查转基因小鼠)；

图4为对7只初筛阳性小鼠(编号36-39、45、49和54)的PCR复核结果；

图5为杂交后获得的小鼠子代的PCR鉴定结果示意图；

图6为转基因小鼠不同组织中calpain-1蛋白表达的Western Blot检测结果；

图7为转基因小鼠心功能检测结果；

图8为转基因小鼠心肌细胞肥大染色结果和相关基因实时定量PCR检测结果；

图9为转基因小鼠纤维化染色结果和相关基因实时定量PCR检测结果；

图10为采用强力霉素(doxycycline)验证模型可诱导可调控特性的操作流程图；

图11为采用强力霉素(doxycycline)验证模型可诱导可调控特性的实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

以人calpain-1质粒为模板，经PCR特异性扩增出calpain-1片段，在其5’端加入TetO、α-MHC启动子核酸序列和线粒体信号肽序列(见序列表SEQ ID No.1)。将PCR产物和真核表达载体(Alpha-MyHC clone 26质粒，其制备方法参见杂志Journal of BiologicalChemistry.1991May 15；266(14):9180-5)分别经限制性内切酶Not I酶切，胶回收，T4DNA连接酶连接，重组质粒转化E.coli DH5α，提取质粒并经PCR、酶切和测序鉴定。测序成功的即为含有calpain-1基因的表达载体。图1为本发明含有calpain-1基因的表达载体的结构示意图。图中MTS代表线粒体信号肽序列，Human capn1代表人的calpain-1基因序列，Myc为标签序列，方便目的蛋白的检测、筛选和纯化。

实施例2

将实施例1成功获得的calpain-1基因的表达载体经显微注射技术注入小鼠受精卵，再将其植入受体小鼠子宫。挑选经PCR鉴定为阳性的子代转基因小鼠(Tg-mtCapn1)，将其与特异性表达tTA的转基因小鼠(Tg-tTA)或特异性表达rtTA(Tg-rtTA)的转基因小鼠交配，。对杂交后的子代进行PCR和Western Blot鉴定，挑选获得心肌特异性、线粒体选择性过表达calpain-1的转基因小鼠(Tg-mtCapn1/tTA或Tg-mtCapn1/rtTA)。图2为以Tg-tTA小鼠为例的杂交示意图。

在通过PCR筛查初代Tg-mtCapn1阳性转基因小鼠时，选用小鼠内源性G proteinsignaling 7作为内参，具体如下：

1.引物

转基因PCR引物F1：AGCAAACACAAAGACCTGCGGACCA(SEQ ID No.2)

转基因PCR引物R1：ACTATGCGGCCCCATTCAGATCCTC(SEQ ID No.3)

内参PCR引物F1：CAACCACTTACAAGAGACCCGTA(SEQ ID No.4)

内参PCR引物R1：GAGCCCTTAGAAATAACGTTCACC(SEQ ID No.5)

退火温度：63℃

循环数：38

转基因PCR产物长度：476bp

内参PCR产物长度：632bp

2.反应体系如表1所示：

表1 PCR基因型初筛反应体系

10×标准Taq反应缓冲液	2.5μL
		10mMdNTPs	0.5μL
10μM Forward Primer	0.5μL
		10μM Reverse Primer	0.5μL
DNA模板	<1μg
		Taq DNA多聚酶(TaKaRa R004A)	0.125μL
不含核酸酶的双蒸水	加至25μL

3.对照

阴性对照：无DNA模板。

阳性对照：400ng含有约5拷贝转基因的小鼠全基因组DNA。

结果如图3所示，转基因PCR产物大小为476bp，图中的数字1-56下方的条带分别对应编号为1-56的56只初代小鼠，M代表标记条带，positive代表阳性对照条带。从结果可看出编号36-39、45、49和54所代表的初代小鼠为calpain-1转基因阳性小鼠Tg-mtCapn1。

然后再对初筛阳性结果进行第二轮PCR确认，具体方法如下：

1.引物

转基因PCR引物F1：AGCAAACACAAAGACCTGCGGACCA(SEQ ID No.6)

转基因PCR引物R1：ACTATGCGGCCCCATTCAGATCCTC(SEQ ID No.7)

退火温度：63℃

循环数：38

转基因PCR产物长度：476bp

2.反应体系如表2所示：

表2第二轮PCR确认反应体系

10×标准Taq反应缓冲液	2.5μL
		10mMdNTPs	0.5μL
10μM Forward Primer	0.5μL
		10μM Reverse Primer	0.5μL
DNA模板	<1μg
		Taq DNA多聚酶(TaKaRa R004A)	0.125μL
不含核酸酶的双蒸水	加至25μL

3.对照

阴性对照：无DNA模板。

阳性对照：400ng含有约5拷贝转基因的小鼠全基因组DNA。

野生型对照：400ng野生型小鼠全基因组DNA。

结果如图4所示，图中的数字分别对应编号为36-39，45,49和54，M代表标记条带，positive代表阳性对照条带，WT代表野生型对照条带。从图4可以看出，编号36-39、45、49和54所代表的初代小鼠与阳性对照条带一致，证明这些鼠确实为calpain-1转基因阳性小鼠Tg-mtCapn1。

再分析比较野生型和Tg-mtCapn1/tTA转基因小鼠心肌线粒体内calpain-1蛋白表达水平差异，具体方法如下：

制备Tg-mtCapn1/tTA转基因小鼠动物模型，采用商业化试剂盒分离心肌组织线粒体，采用商业化试剂盒QproteomeTMmitochondria isolation kit(Qiagen,Valencia，CA，USA)梯度离心纯化线粒体。图5为PCR鉴定转基因小鼠子代结果判定图。图中，如tTA和capn1条带皆为阴性，则该子代为野生型小鼠(wide type)；如仅capn1条带阳性，则为calpain-1转基因阳性小鼠Tg-mtCapn1；如仅tTA条带阳性，则为tTA转基因阳性小鼠Tg-tTA；当tTA和capn1条带皆为阳性时，则为目标转基因小鼠Tg-mtCapn1/tTA。

采用标准Western Blot方法检测心肌分离纯化线粒体内calpain-1蛋白表达水平并分析比较组间差异。图6为Western Blot检测蛋白表达结果，其中图6(A-D)分别为转基因小鼠心肌细胞、肺组织、肌肉组织、心肌细胞胞质内的calpain-1蛋白表达水平测试结果，图6(A)表明转基因小鼠心肌calpain-1蛋白表达水平显著增高；图6(B)表明转基因小鼠肺组织calpain-1蛋白表达水平不增高；图6(C)表明转基因小鼠肌肉组织calpain-1蛋白表达水平不增高；图6(D)表明转基因小鼠心肌细胞胞质中calpain-1蛋白表达水平不增高。

采用1％异氟醚麻醉小鼠，应用高分辨率的心脏超声探头(35-MHz linear arraytransducer attached to Vevo 2100ultrasound system)在二尖瓣乳头肌水平获取心室切面，在M模式图像测量心室前后壁厚度、心室腔直径大小及心室壁移动，然后分析收缩功能：短轴缩短率(FS％)和左室射血分数(EF％)。在心尖四腔心切面，利用脉冲多普勒组织超声心动图分析舒张功能：峰值心房血流速度(A)，峰值舒张早期血流速度(E)，和它们的比值(E/A)。结果如图7所示，图7(A)为小鼠生长至3个月时心脏收缩功能代表图；图7(B)为小鼠生长至3个月时心脏舒张功能代表图；图7(C)为小鼠生长至2个月和3个月时，小鼠射血分数间的比较；图7(D)为小鼠生长至2个月和3个月时，小鼠E/A间的比较。(数据为平均值±标准差，n＝5，*P<0.05与野生型相比，

与2个月时相比，#P<0.05与低拷贝转基因小鼠相比)。图7表明，转基因小鼠Tg-mtCapn1/tTA代表心脏收缩功能和舒张功能的两大重要指标左室射血分数和E/A相较于对照野生型小鼠皆显著下降，同时，高拷贝转基因小鼠相较于低拷贝转基因小鼠心功能下降更为明显，提示calpain-1的表达量高低与心功能降低程度密切相关。

使用WGA(Wheat germ agglutinin)及Hoechst染色指示测量心肌细胞横截面积，并使用实时定量PCR检测肥大相关基因(ANP、β-MHC)，结果如图8所示。图8(A)为细胞染色代表图；图8(B)为组间心肌细胞横截面积统计分析比较；图8(C)为实时定量PCR测定ANP结果；图8(D)为实时定量PCR测定β-MHC结果。(数据为平均值±标准差，*P<0.05与野生型相比，#P<0.05与低拷贝转基因小鼠对照组相比，

与对照组相比)。图8表明，高、低拷贝转基因小鼠相较于野生型小鼠，其心肌细胞横截面积显著增大，且高拷贝转基因小鼠的心肌细胞相较于低拷贝转基因小鼠肥大更加严重。

使用天狼星红对沉积胶原进行染色并使用实时定量PCR检测纤维化相关基因(Colleagen Ⅲ)，结果如图9所示。图9(A)为胶原沉积染色图，图9(B)为胶原沉积沉积百分比统计分析比较，图9(C)为实时定量PCR测定ColleagenⅢ结果。(数据为平均值±标准差，*P<0.05与野生型相比，#P<0.05与低拷贝转基因小鼠对照组相比，

与对照组相比)。图9表明，高拷贝转基因小鼠心肌纤维化程度高于低拷贝转基因小鼠，而低拷贝转基因小鼠心肌纤维化程度高于野生型小鼠。

以上实验结果均表明，本发明的方法成功地构建了转基因小鼠心肌病动物模型。

实施例3

本发明所建模型可以根据实际需要选择是否诱导心肌病发生，对于Tg-mtCapn1/tTA小鼠而言，可以通过四环素或强力霉素干预抑制calpain-1的表达从而阻断心肌病的发生；对于Tg-mtCapn1/rtTA而言，可以通过四环素或强力霉素干预促进calpain-1的表达从而诱导心肌病的发生。以下以Tg-mtCapn1/tTA转基因小鼠为例进行说明，具体方法如下：

选取一定数量的野生型(WT)和Tg-mtCapn1/tTA转基因小鼠(TG)，将Tg-mtCapn1/tTA转基因小鼠均分成三组，从第0周开始分别进行如下干预：正常对照组(TG-Ctrl)、饮水中添加0.2mg/ml doxycycline持续关闭calpain-1过表达的干预组(TG-Doxy)和饮水中添加0.2mg/ml doxycycline关闭calpain-1过表达2个月后停止干预组(TG-Doxy-Water)。在3月龄的时候检测各组小鼠心肌线粒体calpain-1蛋白水平及心功能水平以评价心肌病进展情况。实施步骤路线图如图10所示。

通过分离心肌线粒体并采用标准Western Blot方法检测比较组间calpain-1蛋白水平差异，可以看到相较于WT组，TG-Ctrl和TG-Doxy-Water两组的calpain-1蛋白水平显著上升，而TG-Doxy组的calpain-1蛋白水平与WT组相比无显著差别(图11A)。以上结果表明，本方法所构建的Tg-mtCapn1/tTA转基因小鼠可以通过特定时间段施加doxycycline干预，抑制calpain-1过表达，从而达到调控心肌病发病进程的目的。

进一步通过心脏超声检测心功能，分析代表心脏收缩功能的特征性指标：左室射血分数(Ejection Fraction％，图11B)；分析代表心脏舒张功能的特征性指标：峰值舒张早期血流速度/峰值心房血流速度(E/A,图11C)。图11表明，TG-Ctrl组与WT组和TG-Doxy组相比，心功能显著下降，而TG-Doxy-Water组与WT组和TG-Doxy组相比，心功能也呈现显著下降的趋势。综合以上分析，可以发现各组间心功能的变化趋势与心肌线粒体calpain-1表达的程度保持一致。

实施例4

将本发明所构建的转基因小鼠心肌病动物模型用于筛选心肌病治疗药物，以下以Mito-TEMPO试剂的筛选为例，具体方法如下：

Mito-TEMPO是一类线粒体靶向的抗氧化剂，能够特异性清除线粒体所产生的超氧化物如活性氧等。由于线粒体calpain-1介导产生过量的超氧化物是Tg-mtCapn1/tTA转基因小鼠自发性发生心肌病的重要原因，因此推测Mito-TEMPO可用于治疗心肌病。本实施例以Mito-TEMPO为样本，阐述本转基因小鼠心肌病动物模型用于筛选心肌病治疗药物的实施例。

首先各选取一定数量的野生型和Tg-mtCapn1/tTA转基因小鼠，分别向其腹腔注射空白对照(生理盐水)或Mito-TEMPO试剂(0.7mg/kg/d)，持续4周，之后检测心功能、心肌肥大和心肌纤维化水平，检测方法同实施例2。

采用Mito-TEMPO干预后心功能水平检测结果如图7所示，图7(A)和图7(B)中分别包含注射对照或Mito-TEMPO后野生型和转基因小鼠的心脏收缩功能和舒张功能代表图，图7(C)和图7(D)中分别包含注射对照或Mito-TEMPO后野生型和转基因小鼠的射血分数和E/A值(MT,Mito-TEMPO)的统计分析。(数据为平均值±标准差，n＝5，*P<0.05与野生型相比，

与2个月时相比，#P<0.05与低拷贝转基因小鼠相比)。图7表明，Mito-TEMPO干预后，转基因小鼠的收缩和舒张心功能水平得到明显改善。

采用Mito-TEMPO干预后心肌细胞肥大水平检测结果如图8所示，图8(A)和图8(B)中分别包含注射Mito-TEMPO后心肌细胞肥大染色代表图及心肌细胞横截面积统计分析，图8(C)和图8(D)为心肌细胞ANP和β-MHC的实时定量PCR分析结果。(数据为平均值±标准差，*P<0.05与野生型相比，#P<0.05与低拷贝转基因小鼠对照组相比，

与对照组相比)。图8表明，Mito-TEMPO干预后，转基因小鼠的心肌细胞肥大得到明显改善。

采用Mito-TEMPO干预后心肌细胞纤维化水平检测结果如图9所示，图9(A)为注射Mito-TEMPO后心肌细胞胶原沉积代表图；图9(B)为相应的心肌细胞胶原沉积统计分析；图9(C)为Colleagen III的实时定量PCR检测结果。图9表明，Mito-TEMPO干预后，转基因小鼠的心肌细胞纤维化得到明显改善。

以上证据综合表明，注射了Mito-TEMPO试剂的转基因小鼠的心功能、心肌肥大和心肌纤维化水平有了明显的改善，证实本转基因动物模型可以用于包括Mito-TEMPO在内的一系列心肌病治疗药物筛选。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种可诱导的转基因小鼠心肌病动物模型的构建方法，其特征在于，采用含有calpain-1基因的表达载体，包括以下步骤：

(1)将所述含有calpain-1基因的表达载体导入小鼠受精卵，然后将获得的受精卵移入受体小鼠子宫进行妊娠，经过筛查获得阳性子代转基因小鼠；所述含有calpain-1基因的表达载体包括依次连接的Tet操纵子、α-MHC启动子核酸序列、线粒体信号肽序列以及calpain-1的基因片段；线粒体信号肽的序列如SEQ ID No.1所示；

(2)将所述阳性子代转基因小鼠与特异性表达四环素反式激活子的转基因小鼠或特异性表达反义四环素反式激活子的转基因小鼠交配，在杂交子代中挑选心肌特异性的线粒体选择性过表达calpain-1的转基因小鼠，即为所述可诱导的转基因小鼠心肌病动物模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：含有calpain-1基因的表达载体的出发载体为真核表达载体。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述真核表达载体为Alpha-MyHCclone26质粒。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述含有calpain-1基因的表达载体的制备方法包括以下步骤：

(S1)在calpain-1的基因片段的5’端连接Tet操纵子、α-MHC启动子核酸序列和线粒体信号肽序列，PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(S2)将所述PCR扩增产物和真核表达载体经酶切、连接后，得到重组质粒；

(S3)将所述重组质粒转入大肠杆菌，提取质粒并经PCR扩增、酶切，得到所述含有calpain-1基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：在步骤(S2)中，使用限制性内切酶NotI或BamH I进行酶切。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：在步骤(S2)中，连接时使用T4 DNA连接酶。

7.根据权利要求1所述的构建方法得到的转基因小鼠心肌病动物模型在筛选治疗心肌病药物的应用。

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