CN112899309B - 心肌细胞特异性过表达Snhg5载体及以其构建转基因动物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明构建了一个在心肌细胞特异性过表达Snhg5的转基因载体α‑MHC‑Snhg5‑hGH，将其导入动物的受精卵中，通过受精卵移植得到稳定携带外源目的基因的动物子代为心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠。对小鼠心脏组织内Snhg5的表达进行检测发现Snhg5成功地在心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠心脏中过表达。对心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠进行系统的表型分析，发现其在病理条件刺激下更容易出现心肌肥厚，出现心脏重塑，其出现的病理改变与人类心脏疾病类似，因此该心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠的建立有可能为心脏疾病治疗和药物筛选提供理想的动物模型。

Description

心肌细胞特异性过表达Snhg5载体及以其构建转基因动物的 方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种心肌细胞特异性过表达Snhg5载体及以其构建转基因小鼠的方法。

背景技术

目前，心血管疾病致死率在世界范围内排名第一，而心脏疾病的发生呈逐年升高且呈现年轻化趋势，造成了巨大的健康威胁与经济负担。心力衰竭是导致大多数心脏疾病患者死亡的主要原因(1)。心力衰竭的发生和发展是多种因素参与的复杂变化过程，其中，心脏重构是引起心衰的一个重要原因。心脏重构是指在遗传、环境等众多刺激下，心脏出现的一种适应性反应，主要表现为心脏质量增加、心室壁增厚、心肌细胞体积增大、胚胎期基因表达升高及细胞外基质增多等特征(2)。心脏重构是多种心血管疾病，如高血压、心肌缺血、心律失常等的共同病理过程，随着心脏重构的进展，心力衰歇和心源性猝死发生率显著提升。因此阐明心脏重塑发生发展的机制对防治心力衰竭具有重要意义，寻找调节心脏重塑发生的新型调控分子对于未来寻找防治心衰的新靶点奠定理论基础，对发展心脏疾病个性化治疗策略具有重要和积极地意义。

转基因技术（transgenic technology）是将外源DNA导入动物受精卵或胚胎干细胞内，以随机插入或同源重组的方式整合到受体染色体中，并随细胞的分裂而遗传给后代的技术(1)。利用转基因技术已为生命科学和医学科学研究提供了一系列理想的疾病模型。建立心脏特异性转基因疾病动物模型对研究心脏疾病发生机制非常必要，目前在心血管疾病研究领域也得到了非常广泛的应用。

LncRNA（Long non-coding RNA）是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200 nt的长链非编码RNA分子，根据它们在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，将其分为正义、反义、双向、内含子间和基因间5种类型(2)。近年来的研究表明，LncRNA在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等层面上调控基因的表达，参与多种组织器官稳态维持过程 (3,4)。随着对LncRNA在心脏中功能研究的深入，心脏组织特异性LncRNA 转基因动物也逐渐进入了人们的视线。

2018年，有研究者建立了心脏特异性LncRNA CARL转基因小鼠，发现该小鼠心肌细胞分裂和增殖减少，在损伤情况下心脏再生能力降低 (5)。2019年，另一研究小组建立了心肌细胞特异性过表达HOTAIR转基因小鼠，该小鼠表现出抵抗链脲佐菌素诱导产生的心脏功能受损，氧化应激增加、炎症及心肌细胞死亡 (6)。

我们在前期研究中发现LncRNA Snhg5在主动脉结扎手术（TAC）引起的病理性心肌肥厚和心衰小鼠模型中表达水平明显升高，同时，在收集的人类心衰标本中进行检测也发现人Snhg5表达水平亦升高，提示其在心脏疾病发生过程中可能发挥了重要的作用，但关于其在心脏中的具体功能尚未见报导。

参考文献

1.Wall RJ, Hyman P, Kerr D, Pintado B, Wells K. Transgenic animaltechnology. J Androl;18(3):236-9.

2.Batista PJ, Chang HY. Long Noncoding RNAs: Cellular Address Codesin Development and Disease. Cell. 2013, 152(6):1298–1307.

3.Fatica A, Bozzoni I.Long non-coding RNAs: new players in celldifferentiation and development. Nat Rev Genet. 2013, 15: 7-21.

4.Lee JT. Epigenetic Regulation by Long Noncoding RNAs. Science.2012, 338(6113): 1435-1439.

5.Wang K, Long B, Zhou LY, Liu F, Zhou QY, Liu CY, Fan YY, Li PF.CARL lncRNA inhibits anoxia-induced mitochondrial fission and apoptosis incardiomyocytes by impairing miR-539-dependent PHB2. Nat Commun. 2014; 5:3596.doi: 10.1038/ncomms4596.

6.Gao L, Wang X, Guo S, Xiao L, Liang C, Wang Z, Li Y, Liu Y, Yao R,Liu Y, Zhang Y. LncRNA HOTAIR functions as a competing endogenous RNA toupregulate SIRT1 by sponging miR-34a in diabetic cardiomyopathy. J CellPhysiol. 2019;234(4):4944-4958.

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何为心脏疾病治疗和药物筛选提供理想的动物模型。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种表达盒，该表达盒的启动子为心肌细胞特异性启动子，靶基因为Snhg5基因，所述Snhg5基因的转录由心肌细胞特异性启动子驱动，所述表达盒能转录如SEQ ID No.2所示的LncRNA；

所述心肌细胞特异性启动子可为如SEQ ID No.1第1位-第5480位所示的核酸分子；

所述Snhg5基因为如SEQ ID No.1第5525位-第6536位所示的核酸分子。

上述表达盒中，所述Snhg5基因可为单拷贝或多拷贝。

上述表达盒还含有报道基因，所述报道基因为人生长激素基因polyA，所述人生长激素基因polyA具体为核苷酸序列如SEQ ID No.1第6586位-第8742位所示的核酸分子。

上述表达盒中，心肌细胞特异性启动子、Snhg5基因、人生长激素基因polyA基因三个元件依次顺序排列。

上述表达盒中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达长链非编码RNA（LncRNA）Snhg5的DNA分子。

具体的，所述表达盒的序列如SEQ ID No.1的第1位-第8742位所示。

本发明还提供上述表达盒的相关生物材料，所述相关生物材料为如下C1-C5中的任一种：

C1、含有所述表达盒的重组载体；

C2、含有所述表达盒的重组微生物、或含有C1所述重组载体的重组微生物；

C3、含有所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有C1所述重组载体的转基因动物细胞系；

C4、含有所述表达盒的转基因动物组织、或含有C1所述重组载体的转基因动物组织；

C5、含有所述表达盒的转基因动物器官、或含有C1所述重组载体的转基因动物器官。

上述相关生物材料中，C1所述重组载体可用现有的动物表达载体构建。所述动物表达载体可pRCH等。使用上述表达盒构建重组载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

本发明还提供一种具有心脏疾病动物模型的构建方法，包括将前述的重组载体导入非人动物的受精卵中，然后将所得受精卵移入非人动物的输卵管内进行妊娠，获得转基因动物。

上述方法中，所述动物模型的心脏疾病为心肌肥厚、心脏组织纤维化和/或心脏收缩功能受损。

所述心肌肥厚可体现在心脏质量体重比值和/或心脏质量胫骨长度比值上。所述心脏收缩功能受损可体现在左心室舒张末期后壁厚度（LVPWs）、左心室舒张末期内径（Lvidd）、射血分数（EF）和/或收缩分数（FS）上。

上述方法中，所述非人动物可为小鼠所述非人动物为小鼠；

本发明还提供上述表达盒在构建重组载体或在构建具有心脏疾病动物模型中的应用。

本发明还提供上述相关生物材料在构建具有心脏疾病动物模型中的应用。

本发明还提供上述具有心脏疾病动物模型的构建方法所构建的转基因动物在筛选用于治疗心脏疾病的药物中的应用。

本发明构建了一个在心肌细胞特异性过表达Snhg5的转基因载体a-MHC-Snhg5-hGH，将其导入动物的受精卵中，通过受精卵移植得到稳定携带外源目的基因的动物子代为心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠。对小鼠心脏组织内Snhg5的表达进行检测发现Snhg5成功地在心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠心脏中过表达。对心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠进行系统的表型分析，发现其在病理条件刺激下更容易出现心肌肥厚，出现心脏重塑，其出现的病理改变与人类心脏疾病类似，因此该心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠的建立有可能为心脏疾病治疗和药物筛选提供理想的动物模型。

附图说明

图1为本发明实施例1中a-MHC-Snhg5-hGH转基因载体构建示意图。

图2为本发明实施例2中心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠PCR鉴定示意图，其中，1为Marker，2-4为转基因阳性小鼠，5-7为转基因阴性小鼠，8为阳性对照。

图3为本发明实施例3中用Real-time PCR鉴定心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠及对照野生型小鼠心脏组织中Snhg5的表达水平的结果图。图中数据表示为平均值±标准差，心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠（6 只）、对照野生型小鼠（6只），“*”代表差异显著（p<0.05）。

图4为本发明实施例4中心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠及对照野生型小鼠在基础水平和经ISO处理后心重、体重和胫骨长度及相关分子标志物表达水平的测定结果图。图4的A图为小鼠心脏的形态照片，图4的B图为小鼠心脏质量/体重比值的测定结果图。图4的C图为小鼠心脏质量/胫骨长度比值的测定结果图。图4的D图为小鼠心脏组织中肥大标志基因ANF的表达水平测定结果图。图4的E图为小鼠心脏组织中肥大标志基因BNP的表达水平测定结果图。图中数据表示为平均值±标准差，心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠（3 只）、对照野生型小鼠（3只），ISO处理的转基因小鼠（3只）及对照小鼠（3只）“*”代表差异显著（p<0.05）。

图5为本发明实施例4中心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠及对照野生型小鼠心脏纤维化情况测定结果。图5的A图为小鼠心脏组织切片的纤维化检测（Masson）结果，图5的B图为小鼠心脏组织内纤维化相关基因Col 1的表达水平测定结果图。图5的C图为小鼠心脏组织内纤维化相关基因Col 3的表达水平测定结果图。图中数据表示为平均值±标准差，心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠（3 只）、对照野生型小鼠（3只），ISO处理的转基因小鼠（3只）及对照小鼠（3只），“*”代表差异显著（p< 0.05）。

图6为本发明实施例4中2月龄心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠及对照野生型小鼠心脏功能检测结果。图6的A图为左心室舒张末期厚壁（LVPWd）的测量结果图。图6的B图为左心室舒张末期内径（Lvidd）的测量结果图。图6的C图为射血分数（EF）结果图。图6的D图为收缩分数（FS）结果图。图中数据表示为平均值±标准差，心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠（3 只）、对照野生型小鼠（3只），ISO处理的转基因小鼠（3只）及对照小鼠（3只），“*”代表差异显著（p< 0.05）。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中RIP-Cre-hGH质粒携带有人生长素基因polyA，该质粒记载于非专利文献“周江，程萱，吕娅歆等.胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的建立及鉴定. 生物工程学报，2002，18（3）：286-290.”，公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中带有心肌细胞特异性启动子a-MHC的质粒a-5.5由美国的Robbin博士惠赠，该质粒记载于非专利文献“A Subramaniam, W K Jones, J Gulick, S Wert, JNeumann, J Robbins. Tissue-specific Regulation of the α-Myosin Heavy ChainGene Promoter in Transgenic Mice. J Biol Chem. 1991;266(36):24613-20.”公众可以从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

实施例1 心肌细胞特异性Snhg5转基因载体的构建

以ApaⅠ和SalⅠ双酶切带有心肌细胞特异性启动子a-MHC的质粒a-5.5，可获得5.5kb的片段，即为a-MHC启动子片段。

将携带有人生长素基因polyA（hGH）的RIP-Cre-hGH质粒中的胰岛素基因启动子以KpnⅠ和SalⅠ双酶切去除，将a-MHC启动子片段与其连接，得到a-MHC-Cre-hGH载体。

将Snhg5基因序列用分别添加了SalⅠ和Hind III的引物（引物1和引物2）进行扩增并进行连接，得到1个拷贝的Snhg5片段。具体引物序列如下：

引物1：5’-TTTGTCGACGGGCTCGTTCTTTTACGACG-3’（下划线指示的序列为SalⅠ酶识别位点序列）；

引物2：5’-TTTAAGCTTTTTGCAATTGAATGTTTTTTA-3’（下划线指示的序列为Hind III酶识别位点序列）。

将扩增所得的Snhg5片段，连入用SalⅠ和Hind III酶切的上述a-MHC-Cre-hGH载体，得到了含有a-MHC启动子、Snhg5基因以及人生长素基因polyA共三个元件的a-MHC-Snhg5-hGH的转基因载体，即本发明的心肌细胞特异性Snhg5转基因载体，其图谱见图1。a-MHC-Snhg5-hGH载体含有表达盒A，表达盒A的核苷酸序列如SEQ ID No.1第1位-第8742位所示：其中SEQ ID No.1第1位-第5480位为心肌细胞特异性启动子的序列，SEQ ID No.1第5525位-第6536位）为Snhg5基因的序列，SEQ ID No.1第6586位-第8742位为人生长激素基因polyA的序列。所述表达盒A能转录如SEQ ID No.2所示的LncRNA，记为LncRNA Snhg5。

实施例2 转基因载体的导入和转基因小鼠的筛选

将实施例1得到的a-MHC-Snhg5-hGH的转基因载体经KpnⅠ和SacⅡ酶切线性化后，通过受精卵原核显微注射法，共注射FVB小鼠（维通利华公司）受精卵200枚，然后将获得的受精卵移入8只母鼠（维通利华公司）的输卵管内进行妊娠，出生的小鼠通过PCR鉴定筛选阳性小鼠，筛选方式如下：

将出生10-15天小鼠剪尾巴尖约0.5cm放入Eppendorf管中，每管加入鼠尾裂解缓冲液（0.5% SDS，0.1M NaCl，0.05M EDTA，0.01M Tris-Cl pH8.0，蛋白酶K 200μg/ml）400μl，55℃保温过夜裂解细胞，加入200μl饱和的NaCl（6M）析出蛋白质，离心收集含有DNA的上清，上清经乙醇沉淀后，析出基因组DNA，基因组DNA重新溶于去离子水备用。

以基因组DNA作为PCR反应的模板，用引物3和引物4用于鉴定野生型和转基因阳性小鼠。引物序列如下：

引物3：5'-ATGACAGACAGATCCCTCCTATCTCC-3'；

引物4：5'-CGCCATTGTCCTTGTGAA-3'。

这对引物只能从转基因小鼠中扩增出大小为300bp的条带，从野生型小鼠中不能扩增出条带，从而区分出不同基因型的子代小鼠，部分扩增条带见图2。

结果见表1，有3只假孕母鼠怀孕，获得子代小鼠14只，阳性小鼠4只，阳性率28.6%。所得阳性小鼠即为构建得到的心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠。

表1 小鼠显微注射统计表

注射卵数	移植鼠数	怀孕鼠数	出生鼠数	阳性鼠数	阳性率
						200	8	3	14	4	28.6%

实施例3 转基因小鼠心脏组织内Snhg5表达水平的检测

以参照实施例2中的方式得到的心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠为材料，以同窝野生型小鼠为对照，每组各选6只小鼠。用Trizol提取心脏组织的总RNA，－70℃冰箱储存备用。

将提取的总RNA反转录得到cDNA。

反转录体系如下：

总RNA 2 μg；

5 × RT Mix（TOYOBO） 2 µL；

DEPC水 up to 10 L。

反转录反应条件：37℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min。

将上述所得产物cDNA加水稀释到50 L，用于后续实时荧光定量PCR的模板。

Real-time PCR检测心脏组织内Snhg5表达水平，所用引物为引物5和引物6：

引物5：5'-CAGTCCGCCTGTGAAGAT-3'；

引物6：5'- CTGCCAGAATAAGGAAATAG-3'。

内参基因为GAPDH, 所用引物为引物7和引物8：

引物7：5′-TGCCCAGAACATCATCCCT-3′；

引物8：5′-GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG-3′。

Real-time PCR反应体系如下：

cDNA 1 µL；

引物 0.2 µL；

2 × Mix 5 µL；

水 3.8 µL。

将配制好的反应体系放入ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR仪中。

Real-time PCR反应条件如下：

95℃：20 s，95℃：60 s，95℃：15 s，60 ℃： 15 s，72 ℃： 45 s，40个循环；95 ℃：15 s； 60 ℃： 60 s； 95 ℃： 30 s； 60 ℃： 15 s。

结果见图3。结果表明与对照野生型小鼠相比较，Snhg5在心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠的心脏组织中表达水平明显升高。

实施例4 心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠的表型分析

以参照实施例2中的方式得到的2月龄雄性心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠为材料，以其同窝雄性野生型小鼠为对照。每种小鼠又分为生理盐水处理组和异丙肾上腺素处理组，每组3只小鼠，具体处理组如下：

转基因小鼠生理盐水处理组（基础水平）：腹腔注射生理盐水，连续处理7天（给出具体处理的时机、方式）

对照小鼠生理盐水处理组（基础水平）：腹腔注射生理盐水，连续处理7天（给出具体处理的时机、方式）

转基因小鼠异丙肾上腺素处理组：腹腔注射异丙肾上腺素30 mg/kg/d，连续处理7天

对照小鼠异丙肾上腺素处理组：腹腔注射异丙肾上腺素30 mg/kg/d，连续处理7天

（一）心重、体重和胫骨长度的测定

处理7天后，不同处理组的小鼠称重后断颈处死，取出心脏先剪去周围大血管，用生理盐水清洗血液，滤纸吸干残余液体，用电子天平称取心脏重量,游标卡尺测量小鼠胫骨长度，计算心脏重量与体重或胫骨长度的比值，用这两个指标表示心肌肥厚的程度。

结果见图4：图4的A图显示从大体形态方面进行观察发现心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠的心脏较对照野生型小鼠明显增大；图4的B图和图4的C图显示心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠相比对照野生型小鼠，心脏质量/体重和心脏质量/胫骨长度明显增加。

（二）分子标志物表达水平的检测

检测不同处理组的小鼠分子标志物表达水平，逆转录反应及Real-time PCR方法同实施例3，针对ANF基因的引物为引物9和引物10：

引物9：5′-GCCGGTAGAAGATGAGGTCA-3′；

引物10：5′-GGGCTCCAATCCTGTCAATC-3′。

针对BNP基因的引物为引物11和引物12:

引物11：5′-GCTCTTGAAGGACCAAGGCCTCAC-3′；

引物12：5′-GATCCGATCCGGTCTATCTTGTGC-3′。

内参为GAPDH，序列见引物7和引物8。

结果见图4的D图和图4的E图，显示心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠的心脏组织内肥大标志基因，如ANF和BNP的表达水平较对照组小鼠明显升高。

（三）Masson三色法的检测

不同处理组的小鼠心脏组织切片进行纤维化检测（Masson三色法），结果见图5的A图，与对照小鼠相比，心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠的心脏组织出现明显的纤维化改变。

（四）纤维化相关基因表达水平的检测

检测不同处理组的小鼠纤维化相关基因表达水平，逆转录反应及Real-time PCR方法同实施例3，针对Col 1基因的引物为引物13和引物14:

引物13：5′-AGCGAAGAACTCATACAGCCG-3′；

引物14：5′-TTGGAGCAGCCATCGACTAG-3′。

针对Col 3基因的引物为引物15和引物16:

引物15：5′-GCCTCCCAGAACATTACATACC -3′ ；

引物16：5′-GGGTAGTCTCAT TGCCTTGC-3′。

结果见图5的B图和图5的C图。显示心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠心脏组织内纤维化相关基因Col 1和Col 3的表达水平较对照组野生型小鼠明显升高。

（五）小鼠心脏超声的检测

不同处理组的2月龄小鼠用三溴乙醇胺麻醉后，剔去胸前区的被毛，利用带有12-MHz 微型探头的Vivid 7 超声检测仪（GE公司）进行心脏M型超声的检测。

结果见图6，结果表明在异丙肾上腺素（ISO）处理情况下，心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠左心室舒张末期后壁厚度（LVPWs）和左心室舒张末期内径（Lvidd）较对照野生型小鼠显著增加；心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠的射血分数（EF）和收缩分数（FS）较对照野生型小鼠显著降低。以上结果提示心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠在病理刺激下的心脏收缩功能受损。

上述结果表明二月龄心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠在基础水平与对照野生型小鼠无明显差异，而在ISO处理情况下，心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠较对照小鼠更容易发生明显的心室重塑（图4），主要表现为心脏质量与体重或胫骨长度的比值增大，心脏体积增大，肥大标志基因表达水平上调，心肌纤维化增加（图5）和心脏收缩功能受损（图6）。其出现的病理改变与人类心脏疾病类似，因此该心肌细胞特异性Snhg5转基因小鼠的建立有可能为心脏疾病治疗和药物筛选提供理想的动物模型。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 心肌细胞特异性过表达Snhg5载体及以其构建转基因动物的方法

<130> GNCSY210035

<160> 2

<170> SIPOSeqtenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8742

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Seqtence)

<400> 1

ggtacctcca ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcctgcaag gtcacacaag 60

ggtctccacc caccaggtgc cctagtctca atttcagttt ccatgccttg ttctcacaat 120

gctggcctcc ccagagctaa tttggacttt gtttttattt caaaagggcc tgaatgagga 180

gtagatcttg tgctacccag ctctaagggt gcccgtgaag ccctcagacc tggagccttt 240

gcaacagccc tttaggtgga agcagaataa agcaattttc cttaaagcca aaatcctgcc 300

tctagactct tcttctctga cctcggtccc tgggctctag ggtggggagg tggggcttgg 360

aagaagaagg tggggaagtg gcaaaagccg atccctaggg ccctgtgaag ttcggagcct 420

tccctgtaca gcactggctc atagatcctc ctccagccaa acatagcaag aagtgatacc 480

tcctttgtga cttccccagg cccagtacct gtcaggttga aacaggattt agagaagcct 540

ctgaactcac ctgaactctg aagctcatcc accaagcaag cacctaggtg ccactgctag 600

ttagtatcct acgctgataa tatgcagagc tgggccacag aagtcctggg gtgtaggaac 660

tgaccagtga cttttcagtc ggcaaaggta tgaccccctc agcagatgta gtaatgtccc 720

cttagatccc atcccaggca ggtctctaag aggacatggg atgagagatg tagtcatgtg 780

gcattccaaa cacagctatc cacagtgtcc cttgcccctt ccacttagcc aggaggacag 840

taaccttagc ctatctttct tcctccccat cctcccagga cacaccccct ggtctgcagt 900

attcatttct tccttcacgt cccctctgtg acttccattt gcaaggcttt tgacctctgc 960

agctgctgga agatagagtt tggccctagg tgtggcaagc catctcaaga gaaagcagac 1020

aacaggggga ccagattttg gaaggatcag gaactaaatc actggcgggc ctgggggtag 1080

aaaaaagagt gagtgagtcc gctccagcta agccaagcta gtccccgaga tactctgcca 1140

cagctgggct gctcggggta gctttaggaa tgtgggtctg aaagacaatg ggattggaag 1200

acatctcttt gagtctcccc tcaaccccac ctacagacac actcgtgtgt ggccagactc 1260

ctgttcaaca gccctctgtg ttctgaccac tgagctaggc aaccagagca tgggccctgt 1320

gctgaggatg aagagttggt taccaatagc aaaaacagca ggggagggag aacagagaac 1380

gaaataagga aggaagaagg aaaggccagt caatcagatg cagtcagaag agatgggaag 1440

ccaacacaca gcttgagcag aggaaacaga aaagggagag attctgggca taaggaggcc 1500

acagaaagaa gagcccaggc cccccaagtc tcctctttat accctcatcc cgtctcccaa 1560

ttaagcccac tcttcttcct agatcagacc tgagctgcag cgaagagacc cgtagggagg 1620

atcacactgg atgaaggaga tgtgtggaga agtccaggga acctaagagc cagagcctaa 1680

aagagcaaga gataaaggtg cttcaaaggt ggccaggctg tgcacacaga gggtcgagga 1740

ctggtggtag agcctcaaga taaggatgat gctcagaatg ggcggggggg gggattctgg 1800

gggggggaga gagaaggtga gaaggagcct ggaacagaga atctggaagc gctggaaacg 1860

ataccataaa gggaagaacc caggctacct ttagatgtaa atcatgaaag acagggagaa 1920

gggaagctgg agagagtaga aggaccccgg ggcaagacat ggaagcaagg acaagccagg 1980

ttgagcgctc cgtgaaatca gcctgctgaa ggcagagccc tggtatgagc accagaacag 2040

cagaggctag ggttaatgtc gagacaggga acagaaggta gacacaggaa cagacagaga 2100

cgggggagcc aggtaacaaa ggaatggtcc ttctcacctg tggccagagc gtccatctgt 2160

gtccacatac tctagaatgt tcatcagact gcagggctgg cttgggaggc agctggaaag 2220

agtatgtgag agccagggga gacaaggggg cctaggaaag gaagaagagg gcaaaccagg 2280

ccacacaaga gggcagagcc cagaactgag ttaactcctt ccttgttgca tcttccatag 2340

gaggcagtgg gaactctgtg accaccatcc cccatgagcc cccactaccc ataccaagtt 2400

tggcctgagt ggcattctag gttccctgag gacagagcct ggcctttgtc tcttggacct 2460

gacccaagct gacccaatgt tctcagtacc ttatcatgcc ctcaagagct tgagaaccag 2520

gcagtgacat attaggccat gggctaaccc tggagcttgc acacaggagc ctcaagtgac 2580

ctccagggac acagctgcag acaggtggcc tttatcccca aagagcaacc atttggcata 2640

ggtggctgca aatgggaatg caaggttgaa tcaggtccct tcaagaatac tgcatgcaag 2700

acctaagacc cctggagaga ggggtatgct cctgccccca cccaccataa ggggagtgaa 2760

ctatcctagg gggctggcga ccttggggag acaccacatt actgagagtg ctgagcccag 2820

aaaaactgac cgccctgtgt cctgcccacc tccacactct agagctatat tgagaggtga 2880

cagtagatag ggtgggagct ggtagcaggg agagtgttcc tgggtgtgag ggtgtagggg 2940

aaagccagag caggggagtc tggctttgtc tcctgaacac aatgtctact tagttataac 3000

aggcatgacc tgctaaagac ccaacatcta cgacctctga aaagacagca gccctggagg 3060

acaggggttg tctctgagcc ttgggtgctt gatggtgcca caaaggaggg catgagtgtg 3120

agtataaggc cccaggagcg ttagagaagg gcacttggga aggggtcagt ctgcagagcc 3180

cctatccatg gaatctggag cctggggcca actggtgtaa atctctgggc ctgccaggca 3240

ttcaaagcag cacctgcatc ctctggcagc ctggggaggc ggaagggagc aaccccccac 3300

ttataccctt tctccctcag ccccaggatt aacacctctg gccttccccc ttcccacctc 3360

ccatcaggag tggagggttg cagagggagg gtaaaaacct acatgtccaa acatcatggt 3420

gcacgatata tggatcagta tgtgtagagg caagaaagga aatctgcagg cttaactggg 3480

ttaatgtgta aagtctgtgt gcatgtgtgt gtgtctgact gaaaacgggc atggctgtgc 3540

agctgttcag ttctgtgcgt gaggttacca gactgcaggt ttgtgtgtaa attgcccaag 3600

gcaaagtggg tgaatccctt ccatggttta aagagattgg atgatggcct gcatctcaag 3660

gaccatggaa aatagaatgg acactctata tgtgtctcta agctaaggta gcaaggtctt 3720

tggaggacac ctgtctagag atgtgggcaa cagagactac agacagtatc tgtacagagt 3780

aaggagagag aggagggggt gtagaattct cttactatca aagggaaact gagtcgtgca 3840

cctgcaaagt ggatgctctc cctagacatc atgactttgt ctctggggag ccagcactgt 3900

ggaacttcag gtctgagaga gtaggaggct cccctcagcc tgaagctatg cagatagcca 3960

gggttgaaag ggggaaggga gagcctggga tgggagcttg tgtgttggag gcaggggaca 4020

gatattaagc ctggaagaga aggtgaccct tacccagttg ttcaactcac ccttcagatt 4080

aaaaataact gaggtaaggg cctgggtagg ggaggtggtg tgagacgctc ctgtctctcc 4140

tctatctgcc catcggccct ttggggagga ggaatgtgcc caaggactaa aaaaaggcca 4200

tggagccaga ggggcgaggg caacagacct ttcatgggca aaccttgggg ccctgctgtc 4260

ctcctgtcac ctccagagcc aagggatcaa aggaggagga gccaggacag gagggaagtg 4320

ggagggaggg tcccagcaga ggactccaaa tttaggcagc aggcatatgg gatgggatat 4380

aaaggggctg gagcactgag agctgtcaga gatttctcca acccaggtaa gagggagttt 4440

cgggtggggg ctcttcaccc acaccagacc tctccccacc tagaaggaaa ctgcctttcc 4500

tggaagtggg gttcaggccg gtcagagatc tgacagggtg gccttccacc agcctgggaa 4560

gttctcagtg gcaggaggtt tccacaagaa acactggatg ccccttccct tacgctgtct 4620

tctccatctt cctcctgggg atgctcctcc ccgtcttggt ttatcttggc tcttcgtctt 4680

cagcaagatt tgccctgtgc tgtccactcc atctttctct actgtctccg tgccttgcct 4740

tgccttcttg cgtgtccttc ctttccaccc atttctcact tcaccttttc tccccttctc 4800

atttgtattc atccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt 4860

tctcccttcc ttccttcctt ccttccttcc ttccttcctt ccttcctgtg tcagagtgct 4920

gagaatcaca cctggggttc ccacccttat gtaaacaatc ttccagtgag ccacagcttc 4980

agtgctgctg ggtgctctct taccttcctc accccctggc ttgtcctgtt ccatcctggt 5040

caggatctct agattggtct cccagcctct gctactcctc ttcctgcctg ttcctctctc 5100

tgtccagctg cgccactgtg gtgcctcgtt ccagctgtgg tccacattct tcaggattct 5160

ctgaaaagtt aaccaggtga gaatgtttcc cctgtagaca gcagatcacg attctcccgg 5220

aagtcaggct tccagccctc tctttctctg cccagctgcc cggcactctt agcaaacctc 5280

aggcaccctt accccacata gacctctgac agagaagcag gcactttaca tggagtcctg 5340

gtgggagagc cataggctac ggtgtaaaag aggcagggaa gtggtggtgt aggaaagtca 5400

ggacttcaca tagaagccta gcccacacca gaaatgacag acagatccct cctatctccc 5460

ccataagagt ttgagtcgac ctgcagccca agctgtaccc cctcgaaact gacaggagaa 5520

ccaccgggct cgttctttta cgacggagcc taagatattc tttgtcttgt cggtgagtga 5580

gttacagtcg gatgaccaag tgaaatatag gggtgcaacg aggatttgga ggcttctgag 5640

acttgaactt agggtactgg tgtaaacttc ctcggagaag tgcgcagcag ctaatgatat 5700

ttcgggattg gagtctgggc cccagtgaga ttcgtactaa gcggcctgac tgaaggccgc 5760

atgcgtgagt ccccgcgtgg gtaggttttt acagcagggt ttgcagcctt ttgtgctgtt 5820

ccgaaggtac tagagtcacc gaaagagaca tcctattata tgcacgttca caaggacaat 5880

ggcgccattg ttcttcgcgt cttcaaagca gctacaagaa gaaaccaaga tggaggggag 5940

cccaaagcat ctgagagaat tgataaatga aagaaacatg cttaaaacat gaccgtttta 6000

aaggtgaatg ctgaccagtg agatgccagc ctgcgtgtga agatcctaca gcagaagtgc 6060

atggccagtg acacaagaac ttgcgagaga tgccagtccg cctgtgaaga tcctgcagca 6120

ggagtgcata gccagtgaca caagacgtgc gaatgaaaac tagatgtgac catccagaaa 6180

aagcatagac aaaaaaatgc agtcttagta ctgggatgtt tgagatgggg tctatctaca 6240

tgtctctagc tgtccctatc aggacagcat ctggtgtggc ctgcagagtt gattcctgta 6300

cttttttttt tttgtgggct gtatgtaaat ggattgtttt gacaatccat tcgacagtgt 6360

tctcttctgt gaaggtcata ggtgagctga ttgacagaca cagctgtaca gactgaatgc 6420

aatcctgact ataaagctgc agttcatcat tatgagctat ttccttattc tggcagtgat 6480

tgaaataaaa tggggagtat tgaaataaaa aacattcaat tgcaaaccat taacgcgcga 6540

ccagcttgat atcgaattcc tgcagcccgg gggatccact agtccgatcc caaggcccaa 6600

ctccccgaac cactcagggt cctgtggaca gctcacctag ctgcaatggc tacaggtaag 6660

cgcccctaaa atccctttgg gcacaatgtg tcctgagggg agaggcagcg acctgtagat 6720

gggacggggg cactaaccct caggtttggg gcttctgaat gtgagtatcg ccatgtaagc 6780

ccagtatttg gccaatctca gaaagctcct ggtccctgga gggatggaga gagaaaaaca 6840

aacagctcct ggagcaggga gagtgctggc ctcttgctct ccggctccct ctgttgccct 6900

ctggtttctc cccaggctcc cggacgtccc tgctcctggc ttttggcctg ctctgcctgc 6960

cctggcttca agagggcagt gccttcccaa ccattccctt atccaggctt tttgacaacg 7020

ctatgctccg cgcccatcgt ctgcaccagc tggcctttga cacctaccag gagtttgtaa 7080

gctcttgggg aatgggtgcg catcaggggt ggcaggaagg ggtgactttc ccccgctggg 7140

aaataagagg aggagactaa ggagctcagg gtttttcccg aagcgaaaat gcaggcagat 7200

gagcacacgc tgagtgaggt tcccagaaaa gtaacaatgg gagctggtct ccagcgtaga 7260

ccttggtggg cggtccttct cctaggaaga agcctatatc ccaaaggaac agaagtattc 7320

attcctgcag aacccccaga cctccctctg tttctcagag tctattccga caccctccaa 7380

cagggaggaa acacaacaga aatccgtgag tggatgcctt ctccccaggc ggggatgggg 7440

gagacctgta gtcagagccc ccgggcagca cagccaatgc ccgtccttcc cctgcagaac 7500

ctagagctgc tccgcatctc cctgctgctc atccagtcgt ggctggagcc cgtgcagttc 7560

ctcaggagtg tcttcgccaa cagcctggtg tacggcgcct ctgacagcaa cgtctatgac 7620

ctcctaaagg acctagagga aggcatccaa acgctgatgg gggtgagggt ggcgccaggg 7680

gtccccaatc ctggagcccc actgactttg agagctgtgt tagagaaaca ctgctgccct 7740

ctttttagca gtcaggccct gacccaagag aactcacctt attcttcatt tcccctcgtg 7800

aatcctccag gcctttctct acaccctgaa ggggagggag gaaaatgaat gaatgagaaa 7860

gggagggaac agtacccaag cgcttggcct ctccttctct tccttcactt tgcagaggct 7920

ggaagatggc agcccccgga ctgggcagat cttcaagcag acctacagca agttcgacac 7980

aaactcacac aacgatgacg cactactcaa gaactacggg ctgctctact gcttcaggaa 8040

ggacatggac aaggtcgaga cattcctgcg catcgtgcag tgccgctctg tggagggcag 8100

ctgtggcttc tagctgcccg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc 8160

cctggaagtt gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat 8220

tttgtctgac taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa 8280

ggggcaagtt gggaagacaa cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag 8340

tgcagtggca caatcttggc tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct 8400

gcctcagcct cccgagttgt tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt 8460

gtttttttgg tagagacggg gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc 8520

tcaggtgatc tacccacctt ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc 8580

tcccttccct gtccttctga ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca 8640

gcataggcta cctggccatg cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt 8700

cctctcatgc gttgggtcca ctcagtagat gcctgttgaa tt 8742

<210> 2

<211> 1011

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Seqtence)

<400> 2

gggcucguuc uuuuacgacg gagccuaaga uauucuuugu cuugucggug agugaguuac 60

agucggauga ccaagugaaa uauaggggug caacgaggau uuggaggcuu cugagacuug 120

aacuuagggu acugguguaa acuuccucgg agaagugcgc agcagcuaau gauauuucgg 180

gauuggaguc ugggccccag ugagauucgu acuaagcggc cugacugaag gccgcaugcg 240

uucuaguucc ugaguccccg cguggguagg uuuuuacagc aggguuugca gccuuuugug 300

cuguuccgaa gguacuagag ucaccgaaag agacauccua uuauaugcac guucacaagg 360

acaauggcgc cauuguucuu cgcgucuuca aagcagcuac aagaagaaac caagauggag 420

gggagcccaa agcaucugag agaauugaua aaugaaagaa acaugcuuaa aacaugaccg 480

uuuuaaaggu gaaugcugac cagugagaug ccagccugcg ugugaagauc cuacagcaga 540

agugcauggc cagugacaca agaacuugcg agagaugcca guccgccugu gaagauccug 600

cagcaggagu gcauagccag ugacacaaga cgugcgaaug aaaacuagau gugaccaucc 660

agaaaaagca uagacaaaaa aaugcagucu uaguacuggg auguuugaga uggggucuau 720

cuacaugucu cuagcugucc cuaucaggac agcaucuggu guggccugca gaguugauuc 780

cuguacuuuu uuuuuuuugu gggcuguaug uaaauggauu guuuugacaa uccauucgac 840

aguguucucu ucugugaagg ucauagguga gcugauugac agacacagcu guacagacug 900

aaugcaaucc ugacuauaaa gcugcaguuc aucauuauga gcuauuuccu uauucuggca 960

gugauugaaa uaaaaugggg aguauugaaa uaaaaaacau ucaauugcaa a 1011

Claims (9)

1.一种表达盒，其特征在于：所述表达盒的启动子为心肌细胞特异性启动子，外源目的基因为Snhg5基因，所述Snhg5基因的转录由心肌细胞特异性启动子驱动，所述表达盒能转录得到如SEQ ID No.2所示的LncRNA Snhg5；

所述心肌细胞特异性启动子为如SEQ ID No.1第1位-第5480位所示的核酸分子；

所述Snhg5基因为如SEQ ID No.1第5525位-第6536位所示的核酸分子。

2.根据权利要求1所述的表达盒，其特征在于：所述Snhg5基因为单拷贝或多拷贝。

3.根据权利要求1或2所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒还含有报道基因，所述报道基因为人生长激素基因polyA，所述人生长激素基因polyA具体为核苷酸序列如SEQ IDNo.1第6586位-第8742位所示的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒中，心肌细胞特异性启动子、Snhg5基因、人生长激素基因polyA基因三个元件依次顺序排列。

5.根据权利要求4所述的表达盒，其特征在于：所述表达盒的序列如SEQ ID No.1的第1位-第8742位所示。

6.权利要求1-5任一所述表达盒的相关生物材料，所述相关生物材料为如下C1-C5中的任一种：

C1、含有权利要求1-5任一所述表达盒的重组载体；

C2、含有权利要求1-5任一所述表达盒的重组微生物、或含有C1所述重组载体的重组微生物；

C3、含有权利要求1-5任一所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有C1所述重组载体的转基因动物细胞系；所述转基因动物细胞系不包含生殖细胞、受精卵、胚胎干细胞；

C4、含有权利要求1-5任一所述表达盒的转基因动物组织、或含有C1所述重组载体的转基因动物组织；

C5、含有权利要求1-5任一所述表达盒的转基因动物器官、或含有C1所述重组载体的转基因动物器官；所述转基因动物器官不包含转基因动物胚胎。

7.一种具有心脏疾病动物模型的构建方法，其特征在于：包括将权利要求6中C1所述的重组载体导入小鼠的受精卵中，然后将所得受精卵移入小鼠的输卵管内进行妊娠，获得转基因小鼠。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述动物模型的心脏疾病为心肌肥厚、心脏组织纤维化和/或心脏收缩功能受损。

9.如下Y1-Y3中的任一应用：

Y1、权利要求1-5任一所述表达盒在构建重组载体或在构建具有心脏疾病小鼠模型中的应用；

Y2、权利要求6所述的相关生物材料在构建具有心脏疾病小鼠模型中的应用；

Y3、权利要求7-8任一所述的具有心脏疾病动物模型的构建方法所构建的转基因小鼠在筛选用于治疗心脏疾病的药物中的应用。

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