CN102399822B

CN102399822B - 表达法尼基焦磷酸合成酶的转基因小鼠模型的构建与应用

Info

Publication number: CN102399822B
Application number: CN2011104386055A
Authority: CN
Inventors: 胡申江; 杨剑
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2011-12-25
Filing date: 2011-12-25
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2031-12-25
Also published as: CN102399822A

Abstract

本发明提供一种表达FPPS的转基因动物模型的构建方法，通过在真核表达质粒PJG/a-MHC的酶切位点SalI和HindIII插入编码FPPS蛋白的DNA片段重组表达载体pJG-mFPPS，提供线性化的转基因构建物，从5’端到3’端依次包含a-MHC启动子、FPPS编码序列、HGHPolyA序列，将线性化的构建物引入非人哺乳动物的受精卵，再移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管，分析转基因的表达谱，阳性转基因动物与正常动物杂交，以获得子代，子代与亲代同程度地过表达FPPS。本发明的模型特异地在小鼠心脏中过表达FPPS，在FPP层面上影响小G蛋白的活化，可在效筛选抑制FPPS功能的药物中应用。

Description

表达法尼基焦磷酸合成酶的转基因小鼠模型的构建与应用

技术领域

本发明属生物医学领域，具体涉及生物医学中心血管病学与转基因技术领域。更具体地，涉及一种表达FPPS的转基因小鼠模型的构建，以及表达FPPS的转基因小鼠模型的应用。

技术背景

法尼基焦磷酸合成酶（FPPS）是类异戊二烯生物合成的关键酶（图1），它催化异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲丙烯基焦磷酸（DMAPP）形成中间产物牻牛儿基焦磷酸（GPP）和终产物法尼基焦磷酸(FPP)。 FPP是胆固醇和固醇形成的重要中间物，另外，FPP也是牻牛儿牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合成的底物。FPP和GGPP在蛋白质法尼基化和牻牛儿牻牛儿基化过程中起重要作用，包括小G蛋白，如RhoA，Ras等。法尼基化和牻牛儿牻牛儿基化是小G蛋白活化的必要环节。最近有报道，FPPS表达在自发性高血压大鼠（SHR）的多种组织中显著升高，包括心脏组织中(Li等,2008;Ye等,2010)。Ye等(2009,2010)发现在心肌细胞及心肌组织中抑制FPPS酶可以防止血管紧张素II导致的心肌肥厚。也有研究发现在自发性高血压大鼠中长期抑制FPPS酶可以减轻心室的肥厚和纤维化（Li等，2010），也可以提高内皮的功能（Chen等，2010）。这些研究表明FPPS在心脏和血管重塑的过程中发挥了重要的作用。另有一些研究也发现，FPPS基因在肝癌和其它实体瘤中过表达(Sung等,2003; Caruso 等,2005; Jiang等,2001; Notarnicola等,2004)，这表明，它可能成为一个实体肿瘤的辅助诊断指标和治疗靶点。另外，据Eckert 等 (2009)报道，FPPS基因在男性阿尔茨海默病患者中过表达，这导致FPP和GGPP水平增加，而FPP和GGPP可引起蛋白质异戊二烯化，从而增加阿尔茨海默病的神经病理改变。然而，FPPS过表达导致的FPP和GGPP合成增加是否会引起转基因小鼠的心室血管重塑，FPPS过表达是否会导致实体瘤和神经退行性疾病，这都需要进一步的实验证实。

而FPPS基因敲除小鼠有可能导致胚胎致死，因为FPPS基因在胚胎期高表达（Su等，2008）。目前也没有相关的FPPS转基因过表达小鼠的研究报道，因此，为了方便从整体动物水平研究FPPS的功能，我们建立了高表达FPPS的转基因小鼠模型。

转基因处理可以导致一种蛋白质过表达，产生用于研究蛋白质功能和生理活性的转基因动物模型。产生转基因动物模型的方法是将一种外源DNA微注射或转基因入受精卵的原核中。导入的DNA表现为随机整合入染色体中。

发明内容

本发明的目的就是提供一种表达FPPS的转基因动物模型的构建方法，通过以下步骤实现：

（1）重组表达载体pJG-mFPPS：在真核表达质粒PJG/a-MHC的酶切位点SalI和HindIII插入编码FPPS蛋白的DNA片段产生，该片段从上游到下游依次包含（i）SalI酶切位点，（ⅱ）Kozak序列，（iii）FPPS基因，（ⅳ）HindIII酶切位点；通过常规的RT-PCR法获得FPPS基因片度，PCR使用的引物是：P1:5'-ATATGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGAATGGGAACCAGAAATTGG -3' 和P2:5'-ATTGGATCCTCACTTTCTCCGTTTGTAGATC-3'。在质粒pE-mFPPS中用以下引物：P3:5'-ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG-3'和P4:5'-CCCAAGCTTTCACTTTCTCCGTTTGTAGATCTTG-3'扩增出FPPS cDNA片段；

提供一线性化的转基因构建物，该构建物从5’端到3’端依次包含（a）a-MHC启动子，（b）FPPS编码序列，（c）HGH PolyA序列；

（3）步骤（2）中转基因构建物是在酶切位点BamHI线性化的；

（4）用显微注射的方法将步骤（2）中线性化的构建物引入非人哺乳动物的的受精卵；

（5）将（4）中的受精卵移植到假孕的非人哺乳动物的输卵管；

（6）产生的非哺乳动物的基因组中整合有FPPS表达盒，表达盒依次含有（a）a-MHC启动子，（b）FPPS编码序列，（c）HGH PolyA序列；

（7）对步骤（6）获得的转基因动物使用普通PCR法进行鉴定；使用引物(P5: 5’- ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG -3’; P6: 5’- GCCTGGAATCCCAACAAC -3’)进行PCR 反应；

（8）通过Real-time PCR法和Western blotting法分析转基因小鼠中的转基因的表达谱；Real-time PCR反应β-actin引物为P7: 5’-CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC-3’, P8: 5’-CCGGCGAGTGAGGGAAGAGTC-3’，FPPS引物为，P9:5-GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC-3’, P10 5'-AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC -3' ；

(9) 阳性转基因动物与正常动物杂交，以获得子代；转基因小鼠子代与亲代同样程度地过表达FPPS。

在本发明建立过表达FPPS的转基因小鼠模型中，FPPS cDNA 来自小鼠，编码353个氨基酸。本发明中采用了心脏特异表达的α-肌球蛋白重链启动子，使其心肌细胞特异性表达，启动子来源于小鼠。将cDNA 导入非人动物受精卵的原核中，待小鼠出生后用PCR 鉴定FPPS是否整合入其基因组，从而获得转基因动物。

本发明的另一目的是提供表达法尼基焦磷酸合成酶的转基因小鼠模型在筛选治疗心脏肥大和心衰的药物中的应用，所述心脏肥大和心衰是因FPPS过表达所致。

本发明的转基因小鼠模型不仅可用于研究FPPS体内生物学功能，同时可用于筛选治疗心脏肥大和心衰的药物，所述心脏肥大和心衰是因FPPS过表达所致。该方法包括将所述药物导入包含过表达FPPS细胞的转基因动物中，并通过任何适当方式监测所述动物中FPPS生物活性抑制情况。监测包括将野生型动物与转基因动物相对比。

本发明的有益之处是：FPPS 通过催化IPP和DMAPP 生成FPP。FPP是胆固醇和固醇形成的重要中间物，另外，FPP也是GGPP合成的底物。FPP 和GGPP 对小G蛋白活化起重要作用。而小G蛋白活化在心脏疾病，如心肌肥厚、心衰中发挥重要作用。因此特异地在小鼠心脏中过表达FPPS，在FPP层面上影响小G蛋白的活化，进一步理解心肌肥厚和心衰的发病机制。本发明提供的模型可有效筛选抑制FPPS功能的药物。

附图说明

图 1.甲羟戊酸通路。

图2.表达质粒pJG-mFPPS的结构，包括a-MHC启动子，FPPS基因和HGH PolyA 序列。

图3.通过PCR和酶切鉴定重组质粒pJG-mFPPS的电泳图；泳道1：分子量标记物(1kb DNA ladder Fermentas SM1163);泳道2-4：pJG-mFPPS质粒经SalI及HindIII酶切后的片段。

图4. 转基因小鼠的PCR鉴定结果，泳道7：分子量标记物；泳道6：非转基因小鼠；泳道1-5,8-11：首建转基因小鼠；泳道12：阳性对照（pJG-mFPPS）；泳道13：阴性对照（正常小鼠）；泳道14：水。

图5. Real-Time PCR分析转基因小鼠心脏组织的FPPS基因表达，NTG 心：非转基因小鼠心脏；TG 心：转基因小鼠心脏，***p＜0.001。

图6. Western blotting分析转基因小鼠心脏组织FPPS的表达，NTG:非转基因小鼠；TG：转基因小鼠。

图7. Real-Time PCR分析转基因和正常小鼠心脏组织肥厚相关基因表达，NTG ：非转基因小鼠；TG ：转基因小鼠，**p＜0.01。

图8. 转基因和正常小鼠心脏组织病理学分析，NTG:非转基因小鼠；TG：转基因小鼠。

图9. 转基因和正常小鼠心脏组织活性RhoA 比较，NTG:非转基因小鼠；TG：转基因小鼠，**p＜0.01。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1 重组表达载体pJG-mFPPS的构建

以C57BL/6小鼠脑组织总RNA经逆转录获得的cDNA为模板，通过常规的RT-PCR法获得FPPS基因片度，PCR使用的引物是：P1:5'-ATATGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGAATGGGAACCAGAAATTGG -3' 和P2:5'-ATTGGATCCTCACTTTCTCCGTTTGTAGATC-3'。PCR产物经NheI和BamHI酶切后，插入经NheI和BamHI酶切的质粒pEGFP-C1，产生新的质粒pE-mFPPS（FPPS基因cDNA序列取代pEGFP-C1中的EGFP 序列，mouse FPPS基因cDNA序列： atgaatgggaaccagaaattggatgcttataaccaagaaaagcagaatttcatccagcacttctcccagatcgtcaaggtgctgactgagaaggagctgggacacccagagataggggatgctattgcccggctcaaggaggtcctagagtacaatgccttaggaggcaagtacaaccggggtttgaccgtggtacaagccttccaggagctggtggagccgaagaaacaggatgctgagagtcttcagcgggccctgacagtgggctggtgtgtagaactgctccaggctttcttccttgtgtcagatgacatcatggactcttccctcactcgccggggacagatctgctggtatcagaagccaggcataggcttggatgccatcaacgacgctctgcttctggaagcctccatctatcgtttgctgaagttctactgcagggagcagccctactacctgaacctgctggagctctttctgcagagttcctatcagacagagatcgggcagactctagacctcatgacagcaccccagggccatgtggatcttggtagatacactgaaaagaggtacaaatcgattgtcaagtacaagacggctttctactctttctacctgcctattgcggccgccatgtacatggcaggcattgatggggagaaggaacacgccaatgccctgaagatcctgatggagatgggcgagttcttccaggtccaggacgactaccttgatctctttggagaccccagtgtgacgggaaaggtcggcactgacatccaggacaacaaatgcagctggctggtggttcagtgtctgctacgagcctctcctcaacagcgccagatcttagaggagaattatgggcagaaggacccagaaaaagtggctcgggtgaaagcactgtatgaggcgctggatctgcagtctgctttcttcaagtatgaggaagacagttacaaccgcctcaagagtctcatagagcagtgctctgcgcccctgcccccatccatcttcatggaacttgcaaacaagatctacaaacggagaaagtga）在质粒pE-mFPPS中用以下引物：P3:5'-ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG-3'和P4:5'-CCCAAGCTTTCACTTTCTCCGTTTGTAGATCTTG-3'扩增出FPPS cDNA片段,经SalI及HindIII酶切插入pJG/a-MHC 质粒中，重组成新的表达载体pJG/mFPPS。参见图2，显示了重组表达载体pJG-mFPPS的结构，包括a-MHC启动子，FPPS基因和hGHpolyA序列。参见图3，显示了酶切鉴定重组质粒pJG-mFPPS的电泳结果。经限制性内切酶法和DNA测序法鉴定重组质粒，表明FPPS片段插入得完全正确。

实施例2 转基因小鼠的制备和鉴定

pJG-mFPPS质粒经限制性内切酶BamHI酶切线性化后，电泳，使用凝胶回收试剂盒(Qiagen, CA)割胶纯化回收7.1kb的片段，用TE溶解，调整终浓度至2ng/μl，显微注射，将注射后的卵细胞移植到假孕小鼠的输卵管，小鼠怀孕约20后分娩。

PCR法鉴定转基因首建小鼠（G0）：剪取10天大的小鼠的尾巴，抽提基因组DNA，使用引物(P5: 5’- ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG -3’; P6: 5’- GCCTGGAATCCCAACAAC -3’)，进行PCR反应，阳性小鼠可产生约1.4kb的片段（图4）。

为了研究转基因小鼠中的转基因的传代，我们将转基因首建小鼠与正常C57BL/6小鼠杂交产生第一代转基因小鼠（F1）,F1与正常C57BL/6小鼠杂交产生第二代转基因小鼠（F2），鉴定第一代和第二代转基因小鼠的方法与鉴定首建鼠的方法相同。

参见图4，显示了FPPS转基因阳性小鼠的鉴定。转基因阳性出现1.4kb带，而野生型或者阴性小鼠无特异性扩增。以质粒DNA作为阳性对照。结果，共获得转基因阳性首建鼠15只，这些小鼠经交配繁殖建系，共建立了6个转基因小鼠系。

实施例3 转基因在小鼠中的表达

按照试剂盒说明书，使用RNAiso 试剂 (TaKaRa, DL) 抽提正常和转基因小鼠心脏组织中的总RNA，DNaseI (TaKaRa)消化后，逆转录(TaKaRa)产生第一条链cDNA。对此cDNA进行real-time PCR反应，内参β-actin引物为P7: 5’-CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC-3’, P8: 5’-CCGGCGAGTGAGGGAAGAGTC-3’，FPPS引物为，P9:5-GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC-3’, P10 5'-AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC -3' 。PCR反应条件为： 95°C 预变性2min,95度10s 60度40s, 40个循环。

按照说明书(Santa Cruz Biotechnology, Inc. CA)，制备组织的蛋白质样品，进行Western blotting。每个样品上样30μg，12%的SDS-PAGE电泳，转到PVDF膜，5%的脱脂奶粉（TBST）封闭1小时,TBST稀释的抗FPPS抗体(1:1500，Clontech)和抗β-actin抗体（1:2000，GenScript）4℃孵育过夜，TBST洗膜三次，再用HRP标记的抗兔抗体(1：5000)室温孵育1小时，化学发光法显色。参见图5,6，显示了Realtime-PCR和 Western blotting在心脏组织中FPPS基因表达，结果表明，FPPS基因在心脏中表达明显增强。

实施例4 正常和转基因小鼠肥厚相关基因表达情况

按照试剂盒说明书，使用RNAiso 试剂 (TaKaRa, DL) 抽提正常和转基因小鼠心脏组织中的总RNA，DNaseI (TaKaRa)消化后，逆转录(TaKaRa)产生第一条链cDNA。对此cDNA进行real-time PCR反应，内参引物为P7: 5’-CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC-3’, P8: 5’-CCGGCGAGTGAGGGAAGAGTC-3’，ANP引物为，P11:5-AGCGGACTGGGCTGTAACAG-3’, P12 5'-GCCCAGCCCTGCTTGTC-3' BNP引物为P13:5-AGACCCAGGCAGAGTCAGAA-3’, P14 5'-AGCGGACTGGGCTGTAACAG-3' ，β-MHC P15:5- TCGATTTGGGAAATTCATCC-3’, P16 5'- CGCATAATCGTAGGGGTTGT -3' 。PCR反应条件为： 95°C 预变性2min,95度10s 60度40s, 40个循环。如图7所示在转基因小鼠心脏组织中心肌肥厚相关基因表达明显增高。

实施例5转基因和正常小鼠心脏体重比

在6周龄和4月龄对正常和转基因小鼠测定体重和心脏重量。将存活小鼠在正常实验室刻度称重，心脏重量是在解剖心脏后获得的。参见表1，是转基因和正常小鼠心脏体重比，WT:野生型小鼠；TG：转基因小鼠。表1显示在转基因小鼠中可见心脏与体重比明显增加。

表1

。

实施例6 正常和转基因小鼠的病理学分析

取约5月龄转基因和正常动物小鼠心脏组织，10%福尔马林固定，4℃过夜，脱水，包埋于固体石蜡中并切片。将组织切片使用标准方法在苏木精/伊红中染色。显微镜观察，拍照。如图8所示在检测的5月龄转基因小鼠心脏组织中明显心肌肥厚。

实施例7 正常和转基因小鼠心功能比较

在4月龄和9月龄对正常和转基因小鼠测定心超和心室压力。小鼠心脏超声在超声仪上测定，小鼠心室压力通过右颈动脉插入Millar导管测定。参见表2,3，显示转基因小鼠在9月龄时心功能较之正常小鼠明显下降。

表2 转基因和正常小鼠心超结果。

表3 转基因和正常小鼠心室压力比较

。

实施例8 正常和转基因小鼠FPP 和GGPP浓度比较

取正常与转基因小鼠的心脏组织，经过超速匀浆裂解、固相萃取，氮气吹干等过程后，通过荧光高效液相色谱法分析。参见表4，表中所示转基因小鼠心脏中FPP 和GGPP浓度明显增高。

表4 转基因和正常小鼠心脏FPP和GGPP浓度比较

^** P＜0.01。

实施例9 正常和转基因小鼠活化的RhoA比较

取正常与转基因小鼠的心脏组织,通过G-LISA（RhoA 活化试剂盒）方法在酶标仪下490nm处检测活化的RhoA。如图9所示，转基因小鼠中活化的RhoA明显增高。

实施例10 在动物系统中鉴别FPPS 拮抗剂化合物的方法

一种化合物是FPPS 拮抗剂，是通过将所述化合物导入一个转基因动物中鉴别的，所述动物过表达FPPS。在导入所述化合物后，监测动物体内FPPS生物活性。FPPS生物活性受抑制表明所述化合物可以用作FPPS 拮抗剂。对比FPPS 的生物活性可包括将转基因动物与相同种属的正常（野生型）动物相对比。

实施例11 筛选定向于肥大和心衰的化合物

一种化合物抑制肥大和心衰的能力，可以通过将药物活性数量的所述化合物施用于转基因动物中加以评价，所述动物过表达FPPS。在导入所述化合物后，监测所述动物的心脏发育情况。所述动物心脏发育正常表明所述化合物有效抑制肥大和心衰发生。

在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

<110> 浙江大学

<120>表达法尼基焦磷酸合成酶的转基因小鼠模型的构建与应用

<160> 17

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据FPPS CDNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400> 1

ATATGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGAATGGGAACCAGAAATTGG 48

<210>2

<211>31

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据FPPS CDNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400> 2

ATTGGATCCTCACTTTCTCCGTTTGTAGATC 31

<210>3

<211>1062

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>小鼠FPPS基因 CDNA序列

<400> 3

atgaatgggaaccagaaattggatgcttataaccaagaaaagcagaatttcatccagcacttctcccagatcgtcaaggtgctgactgagaaggagctgggacacccagagataggggatgctattgcccggctcaaggaggtcctagagtacaatgccttaggaggcaagtacaaccggggtttgaccgtggtacaagccttccaggagctggtggagccgaagaaacaggatgctgagagtcttcagcgggccctgacagtgggctggtgtgtagaactgctccaggctttcttccttgtgtcagatgacatcatggactcttccctcactcgccggggacagatctgctggtatcagaagccaggcataggcttggatgccatcaacgacgctctgcttctggaagcctccatctatcgtttgctgaagttctactgcagggagcagccctactacctgaacctgctggagctctttctgcagagttcctatcagacagagatcgggcagactctagacctcatgacagcaccccagggccatgtggatcttggtagatacactgaaaagaggtacaaatcgattgtcaagtacaagacggctttctactctttctacctgcctattgcggccgccatgtacatggcaggcattgatggggagaaggaacacgccaatgccctgaagatcctgatggagatgggcgagttcttccaggtccaggacgactaccttgatctctttggagaccccagtgtgacgggaaaggtcggcactgacatccaggacaacaaatgcagctggctggtggttcagtgtctgctacgagcctctcctcaacagcgccagatcttagaggagaattatgggcagaaggacccagaaaaagtggctcgggtgaaagcactgtatgaggcgctggatctgcagtctgctttcttcaagtatgaggaagacagttacaaccgcctcaagagtctcatagagcagtgctctgcgcccctgcccccatccatcttcatggaacttgcaaacaagatctacaaacggagaaagtga 1062

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pE-mFPPS序列设计的PCR检测上游引物序列

<400> 4

ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG 31

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据pE-mFPPS序列设计的PCR检测下游引物序列

<400> 5

CCCAAGCTTTCACTTTCTCCGTTTGTAGATCTTG 34

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据FPPS CDNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400> 6

ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG 31

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据FPPS CDNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400> 7

GCCTGGAATCCCAACAAC 18

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据β-actin cDNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400> 8

CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC 22

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据β-actin cDNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400> 9

CCGGCGAGTGAGGGAAGAGTC 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据FPPS CDNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400> 10

GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC 22

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据FPPS CDNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400> 11

AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据ANP CDNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400> 12

AGCGGACTGGGCTGTAACAG 20

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据ANP CDNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400> 13

GCCCAGCCCTGCTTGTC 17

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据BNP CDNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400> 14

AGACCCAGGCAGAGTCAGAA 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据BNP CDNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400> 15

AGCGGACTGGGCTGTAACAG 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据β-MHC CDNA序列设计的PCR检测上游引物序列

<400> 16

TCGATTTGGGAAATTCATCC 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据β-MHC CDNA序列设计的PCR检测下游引物序列

<400> 17

CGCATAATCGTAGGGGTTGT 20

Claims

1.用于构建表达法尼基焦磷酸合成酶的转基因小鼠模型的引物，所述引物是

P1：5'-ATATGCTAGCGCTACCGGTCGCCACCATGAATGGGAACCAGAAATTGG -3'、

P2：5'-ATTGGATCCTCACTTTCTCCGTTTGTAGATC-3'、

P3：5'-ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG-3'、

P4：5'-CCCAAGCTTTCACTTTCTCCGTTTGTAGATCTTG-3'、

P5：5’- ACGCGTCGACATGAATGGGAACCAGAAATTG -3’、

P6：5’- GCCTGGAATCCCAACAAC -3’、

P7：5’-CGTCAGATCCGCTAGCGCTACC-3’、

P8：5’-CCGGCGAGTGAGGGAAGAGTC-3’、

P9：5-GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC-3’和

P10：5'-AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC -3。