CN112410341A - 一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法。本发明通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对Ly6G基因位点进行编辑后获得了一种全新的Ly6G‑DTR基因敲入小鼠模型，实现了DTR的表达直接受Ly6G启动子来驱动，并通过流式细胞术验证了DTR仅在Ly6G表达的中性粒细胞中具有很高的表达量，而T细胞、B细胞中均未检测到DTR表达。试验证明，对Ly6G‑DTR基因敲入小鼠注射白喉毒素，能够高度特异性的清除中性粒细胞，且清除效率高达100％，能够实现中性粒细胞的彻底清除；此外，还可以通过调整白喉毒素的给药剂量和时间来诱导中性粒细胞的清除程度，为中性粒细胞在疾病的发生和发展中扮演角色的解析提供更好的动物遗传模型。

Description

一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法

技术领域

本发明属于基因工程和遗传修饰技术领域，具体涉及一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法。

背景技术

中性粒细胞是机体外周血液免疫细胞中所占比例最大的一群效应细胞，其构成了机体抵御外来病原微生物的第一道防线，为保障机体的健康扮演了重要角色。尽管中性粒细胞具有非常重要的作用，但是对其在各种生理过程和疾病中发挥何种功能以及如何发挥功能还需要进行深入研究。因此，构建能够特异性清除中性粒细胞的小鼠模型十分必要。

现有的中性粒细胞清除的方法很多，主要有以下几种：注射药物、注射抗体、制作基因修饰小鼠。不同的方法有各自的优缺点，其中药物处理主要使用环磷酰胺(cyclophosphamide)和长春碱(Vinblastine)等，这种方法的优点是快速、高效，而且对小鼠没有品系限制，缺点是特异性很差，在清除中性粒细胞的同时对其他很多免疫细胞都有很大的影响；通过注射不同的抗体，如：RB6-8C5，1A8和NIMP-R14也可以比较有效地清除中性粒细胞，与药物处理相比，抗体处理特异性有所提高，但是依然会影响单核细胞等其他免疫细胞，而且由于抗体比较昂贵，此方法不适合于大规模应用；制作基因敲入小鼠，如PMN^DTR小鼠(需要通过hMRP8-CRE小鼠与Rosa26-iDTR小鼠交配才能构建好模型小鼠)，通过对其注射DT可以达到清除中性粒细胞的效果，但是由于hMRP8启动子在中性粒细胞中的表达效率，其对中性粒细胞的清除无法达到100％，进一步，其在单核细胞中也有表达，对单核细胞也会有一定的清除效果；通过制作基因敲除小鼠，如CXCR2^-/-,G-CSFR^-/-,Gfi1^-/-和Foxo3a^-/-等均可以一定程度上实现对中性粒细胞的剔除，但是也都存在特异性不高，清除效率无法满足需求和不能实现诱导性清除的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法，该方法能够可诱导的、特异性的清除小鼠的中性粒细胞，可操作性强、清除效率高。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法：先通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对Ly6G基因位点进行编辑，获得Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型；再对Ly6G-DTR基因敲入模型小鼠注射白喉毒素，获得经白喉毒素诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型。

其中，DTR为白喉毒素受体(Diphtheria toxin receptor，DTR)，当灵长类哺乳动物细胞上的白喉毒素受体与白喉毒素(Diphtheria toxin,DT)结合后，白喉毒素可以进入细胞内，抑制细胞内蛋白质的合成，从而导致细胞死亡。Ly6G(lymphocyte antigen6complex,locus G)是中性粒细胞的特异性标志物，利用其特异性抗体标记，可以将中性粒细胞与其它免疫细胞进行良好的区分。本发明选择Ly6G作为驱动DTR表达的基因，将白喉毒素受体引入小鼠的特异性细胞中进行表达，然后对小鼠注射白喉毒素，从而可以对特定细胞群进行剔除。

进一步的，上述Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型的构建，具体包括以下步骤：

1)确定打靶序列：针对Ly6G基因2个靶序列分别为：

Ly6G-sgRNA1：5‘-TCTGCAGAAGGACTGAAACC AGG-3’(SEQ ID NO:1)

Ly6G-sgRNA2：5‘-CAAGGATGAAGGTCATTGAA TGG-3’(SEQ ID NO:2)

2)通过体外转录获得Cas9 mRNA和sgRNA1/2：

通过体外转录试剂盒T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB，E2050S)获得sgRNA1/2；使用T7 Ultra Kit(Ambion,AM1345)试剂盒，体外转录获得Cas9 mRNA；

3)通过生物合成获得重组模板DNA：设计重组模板DNA序列，包含以下元件：5‘和3’同源臂、T2A连接序列、DTR序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

4)获得Ly6G-DTR基因敲入Founder小鼠：将Cas9 mRNA、sgRNA1/2和重组模板DNA按一定比例混合，然后通过显微注射操作系统将其注射入小鼠受精卵细胞中，进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕ICR小鼠雌鼠输卵管，最终获得Founder小鼠。

5)对Founder小鼠进行基因型检测，筛选出基因组中DTR序列插入而且插入位点正确的小鼠个体，获得Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型。

优选的，所述步骤5)具体包括如下步骤：

A.将获得的Founder小鼠抽提基因组DNA；

B.以获取的基因组DNA为模板，使用DTR特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，初步筛选出目标DTR序列在基因组中有插入的小鼠；

C.将具有目标DTR序列扩增条带的样本挑选出来，再分别使用针对左侧同源臂和针对右侧同源臂的引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，筛选出DTR序列在基因组中插入位置正确的小鼠；

D.将DTR序列插入而且插入位点正确的小鼠挑选出来，将以上3段PCR产物分别测序，挑选出插入目标序列正确的个体，即为Ly6G-DTR基因敲入模型小鼠。

优选的，步骤B中所述DTR特异性引物核苷酸序列如下：

h-DTR-F:TTCTGGCTGCAGTTCTCTCG(SEQ ID NO:4)

h-DTR-R:ACATGAGAAGCCCCACGATG(SEQ ID NO:5)

进一步优选的，步骤B中PCR反应体系如下：F和R引物各0.2μL，2×Taq Master Mix(Vazyme P112-01)5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序如下：预变性95℃5min；变性94℃30sec，退火60℃30sec，延伸72℃40sec，35个循环；终止反应72℃10min；将PCR产物进行凝胶电泳检测，若有516bp的扩增条带，表明DTR序列在基因组中插入；

优选的，步骤C中所述针对左侧同源臂的引物核苷酸序列如下：

1-F:AACTGCTGAGCCATGTCTCC(SEQ ID NO:6)

1-R:TTTTCCCGTGCTCCTCCTTG(SEQ ID NO:7)

所述针对右侧同源臂的引物核苷酸序列如下：

2-F:CATCGTGGGGCTTCTCATGT(SEQ ID NO:8)

2-R:ACCCAAACTACCAAGGCCAG(SEQ ID NO:9)

进一步优选的，步骤C中PCR体系如下：F和R引物各0.2μL，2×Taq Master Mix(Vazyme P112-01)5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序如下：预变性95℃5min；变性94℃30sec，退火60℃30sec，延伸72℃90sec，35个循环；终止反应72℃10min；将PCR产物进行凝胶电泳检测，若左侧同源臂引物有1428bp的扩增条带且右侧同源臂引物有1081bp的扩增条带，表明DTR序列插入而且插入位点正确；

优选的，上述对Ly6G-DTR基因敲入模型小鼠注射白喉毒素，通过间隔2-3天以低剂量(20ng/g体重)腹腔注射的方式，获得中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型。

本发明取得的有益效果：

本发明提供了一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法，首次通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对Ly6G基因位点进行编辑后获得了一种全新的Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型，实现了DTR的表达直接受Ly6G启动子来驱动，并通过流式细胞术验证了DTR仅在Ly6G表达的中性粒细胞中具有很高的表达量，而T细胞、B细胞中均未检测到DTR表达。本发明通过试验证明，对Ly6G-DTR基因敲入小鼠注射白喉毒素，能够高度特异性的清除中性粒细胞，且清除效率高达100％，能够实现中性粒细胞的彻底清除；此外，还可以通过调整白喉毒素的给药剂量和时间来诱导中性粒细胞的清除程度，为中性粒细胞在疾病的发生和发展中扮演角色的解析提供更好的动物遗传模型。

附图说明

图1为Ly6G-DTR基因敲入小鼠构建策略和基因型检测；

图中，(A)Ly6G-DTR基因敲入小鼠构建策略；(B)使用针对DTR的特异性引物对F0小鼠进行基因型检测；(C,D)使用针对左侧同源臂(D)和右侧同源臂(C)的特异性引物对F0小鼠进行基因型检测；(E)使用针对DTR的特异性引物对F1小鼠进行基因型检测。

图2为Ly6G-DTR基因敲入小鼠DTR表达量检测；

图中，(A)通过流式细胞术检测Ly6G-DTR基因敲入小鼠外周血中DTR在不同细胞群的表达量；(B)Ly6G-DTR基因敲入小鼠外周血中T细胞、B细胞和中性粒细胞中DTR的表达水平峰图叠加图。

图3为Ly6G-DTR基因敲入小鼠注射DT后中性粒细胞清除效率检测；

图中，(A)Ly6G-DTR基因敲入小鼠注射DT后血液中性粒细胞清除效率流式细胞数检测示意图；(B)野生型(WT)和Ly6G-DTR基因敲入小鼠(KI)注射DT后血液中性粒细胞百分比统计结果；(C)野生型(WT)和Ly6G-DTR基因敲入小鼠(KI)注射DT后血液中性粒细胞绝对计数统计结果；(D)野生型(WT)和Ly6G-DTR基因敲入小鼠(KI)注射DT后血液Ly6G平均荧光强度统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此；若未特别指明，实施例中所用的设备和试剂均常规市售可得。未特别指明的，实施例及试验例中相关操作均为领域内常规技术手段，比如参照Sambrook等编著的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW.Molecular cloning:a laboratory manual.2001)，或者产品制造厂商提供的说明书等。

实施例1 Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型的构建

该实施例提供了对Ly6G基因位点进行基因编辑获得DTR定点插入(knock-in，KI)小鼠模型的方法，具体包括如下步骤：

(1)确定打靶序列：为了将DTR序列插入Ly6G基因位点，以实现DTR与Ly6G同时表达，所以针对Ly6G基因终止密码子附近设计打靶位点。将Ly6G基因(MGI:109440)位点终止密码子附近约1000碱基长度的基因组DNA序列粘贴进入在线设计网站CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)，提交后，可以获得很多候选打靶位点，按照以下标准：离终止密码子近、特异性得分高，最终挑选2条sgRNA，序列分别为：

Ly6G-sgRNA1：5‘-TCTGCAGAAGGACTGAAACC AGG-3’

Ly6G-sgRNA2：5‘-CAAGGATGAAGGTCATTGAA TGG-3’

(2)通过体外转录获得Cas9 mRNA和sgRNA1/2：通过体外转录试剂盒T7 QuickHigh Yield RNA Synthesis Kit(NEB，E2050S)获得sgRNA1/2。使用T7 Ultra Kit(Ambion,AM1345)试剂盒，体外转录获得Cas9 mRNA。详细操作步骤参考试剂盒说明书。

(3)通过生物合成获得重组模板DNA：设计重组模板DNA序列，包含以下元件：5’同源臂和3’同源臂、T2A连接序列、DTR序列(图1A)。重组模板DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中，5’端起第1-1000位为5’同源臂序列；5’端起第1001-1063位为T2A连接序列；5’端起第1064-1687位为DTR序列；5’端起第1688-2637位为3’同源臂序列。由金斯瑞生物科技股份有限公司合成提供。

在特异性sgRNA的指导下，Cas9会在打靶位点切割DNA双链，当有模板DNA(左侧同源臂+T2A+DTR+右侧同源臂)存在时，机体会发生同源重组修复(Homology directedrepair，HDR)，从而将外源DNA序列(T2A+DTR)精确插入目标位点，实现基因敲入(knock-in，KI)(图1A)。

(4)获得Ly6G-DTR基因敲入Founder小鼠：将Cas9 mRNA、sgRNA1/2和重组模板DNA混合，使其终浓度为：sgRNA(50ng/μL)，Cas9 mRNA(50ng/μL)，模板DNA(10ng/μL)；然后通过显微注射操作系统(Eppendorf)将其注射入小鼠受精卵细胞中，进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕ICR小鼠雌鼠输卵管，20天以后即可获得Founder小鼠。

(5)Ly6G-DTR基因敲入小鼠基因型检测：

A.获取步骤(4)中的Founder小鼠基因组DNA，步骤如下：

分别剪取小鼠约5毫米鼠尾组织，将其置于500μL组织裂解液中，56℃震荡充分裂解2小时，10000rpm离心5min，吸取上清液350μL，加入2倍体积无水乙醇可以看见白色絮状沉淀，10000rpm离心15min，弃上清保留管底沉淀，加入500μL 75％乙醇，10000rpm离心5min，弃上清，将管底沉淀晾干，加入100μL去离子水，充分溶解，即为基因组DNA溶液。

B.以获取的基因组DNA为模板，使用DTR特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，初步筛选出目标序列在基因组中有插入的小鼠，具体的：

使用DTR特异性引物(h-DTR-F:TTCTGGCTGCAGTTCTCTCG,h-DTR-R:ACATGAGAAGCCCCACGATG，PCR扩增大小为516bp)进行初步筛选以确定目标序列在基因组中有插入，PCR体系如下：F和R引物各0.2μL，2×Taq Master Mix(Vazyme P112-01)5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序：预变性95℃5min；变性94℃30sec，退火60℃30sec，延伸72℃40sec，35个循环；终止反应72℃10min。将PCR产物进行凝胶电泳检测，检测结果如图1B所示，只有DTR序列插入的小鼠样本有516bp的目标扩增条带，而野生型对照样本没有扩增条带。

C.将具有目标扩增条带的样本挑选出来，再分别使用针对左侧同源臂和右侧同源臂的引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，筛选出目标序列在基因组中插入位置正确的小鼠，具体的：

将有516bp的目标扩增条带阳性样本挑选出来，再使用同源臂之外的引物(1-F:AACTGCTGAGCCATGTCTCC,1-R:TTTTCCCGTGCTCCTCCTTG针对左侧同源臂，扩增大小为1428bp；2-F:CATCGTGGGGCTTCTCATGT,2-R:ACCCAAACTACCAAGGCCAG针对右侧同源臂，扩增大小为1081bp；仅当有DTR序列插入，而且插入位置在Ly6G-DTR基因特定位点的小鼠样本才有扩增条带)进行检测以确定目标序列在基因组中插入位置正确。

PCR体系如下：F和R引物各0.2μL，2×Taq Master Mix(Vazyme P112-01)5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序：预变性95℃5min；变性94℃30sec，退火60℃30sec，延伸72℃90sec，35个循环；终止反应72℃10min。

将PCR产物进行凝胶电泳检测，结果如图1C/D所示，野生型对照样本没有扩增条带，图1C/D中3、15、19、23、31、33、36样本2对引物均有大小正确的扩增条带，表明样本来源小鼠基因组中DTR序列插入而且插入位点正确。通过2轮PCR检测，共获得7只阳性F0小鼠。

D.将具有目标扩增条带的7只阳性小鼠挑选出来，将以上3段PCR产物分别送测序(武汉金开瑞生物工程有限公司)，挑选出插入目标序列正确的个体，即为Ly6G-DTR基因敲入模型小鼠。测序结果表明，31号阳性小鼠的目标插入序列完全正确，而且插入位点与设计位点完全符合，说明上述方法成功构建Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型。

试验例1 Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型的遗传验证

将测序完全正确的31号F0小鼠与野生型小鼠交配进行繁育，在获得F1小鼠后，提取基因组DNA作为模板，参照实施例1步骤(5)，使用DTR特异性引物通过PCR的方式对小鼠基因型进行鉴定，将PCR产物进行凝胶电泳检测，结果如图1E所示，具有516bp大小扩增条带的阳性小鼠即为Ly6G-DTR基因敲入小鼠，这一结果表明31号F0小鼠可以进行稳定遗传。证明本发明实施例1提供的Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型的构建方法能够将T2A-DTR序列完全正确而且按照正确方式插入设计位点，即Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型构建成功且能够稳定遗传。

试验例2 Ly6G-DTR基因敲入小鼠DTR表达检测

将实施例1中获得的Ly6G-DTR基因敲入小鼠采取外周血，使用特异性抗体对细胞进行标记，然后利用流式细胞术对不同细胞中DTR表达量进行检测，步骤如下：取10μL血样加入10μL抗体混合物(抗体包括：anti-CD45 APC-eFluor780，anti-CD5 eFlour450，anti-CD19PerCP-Cy5.5和anti-Ly6G Alexa700)，充分混匀，置于冰上避光孵育30min；然后加入250μL1×红细胞裂解液(BD FACS Lysing solution，349202)，室温静置10min充分裂解红细胞；再加入130μL FACS buffer(含2mM EDTA)终止裂解。通过流式细胞仪BD FACSCanto^TM(BD,USA)采集数据，并进一步通过Flowjo 10.0软件完成数据分析。其中CD45⁺CD5⁺为T细胞(T cells)，CD45⁺CD19⁺为B细胞(B cells)，CD5^-CD19^-SSC^highLy6G⁺为中性粒细胞(Neutrophils)。结果表明，野生型小鼠外周血中T细胞、B细胞和中性粒细胞均不能检测到DTR的表达；Ly6G-DTR基因敲入小鼠外周血中T细胞和B细胞也不能检测到DTR的表达，但是在中性粒细胞中检测到DTR具有很高的表达水平(图2A)。将Ly6G-DTR基因敲入小鼠外周血中T细胞、B细胞和中性粒细胞中DTR的表达水平峰图进行叠加，可以更加明显看到DTR仅在中性粒细胞中具有很高的表达水平(图2B)。

实施例3 Ly6G-DTR基因敲入小鼠经DT诱导构建中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型

本实施例通过间隔2-3天以低剂量(20ng/g体重)腹腔注射白喉毒素的方式诱导获得中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型。并通过流式细胞术对外周血中中性粒细胞的数量和百分比进行检测，验证Ly6G-DTR基因敲入小鼠单次注射DT后中性粒细胞清除效率。

首先在对野生型和基因敲入小鼠注射DT之前，获取小鼠外周血作为对照，然后分别对其腹腔注射DT，注射剂量为20ng/g体重。在注射DT之后的第1、2、3、4、5天分别获取外周血作为实验组，利用特异性抗体对细胞进行标记，然后利用流式细胞术对外周血中中性粒细胞的数量进行检测，步骤如下：取10μL血样加入10μL抗体混合物(抗体包括：anti-CD45APC-eFluor780，anti-CD5 eFlour450，anti-CD19 PerCP-Cy5.5和anti-Ly6GAlexa700)，充分混匀，置于冰上避光孵育30min；然后加入250μL 1×红细胞裂解液(BDFACS Lysing solution，349202)，室温静置10min充分裂解红细胞；再加入130μL FACSbuffer(含2mM EDTA)终止裂解。通过流式细胞仪BD FACSCanto^TM(BD,USA)采集数据，并进一步通过Flowjo 10.0软件完成数据分析。

结果如图3所示，其中CD45⁺CD5⁺为T细胞(T cells)，CD45⁺CD19⁺为B细胞(Bcells)，CD5^-CD19^-SSC^highLy6G⁺为中性粒细胞(Neutrophils)；结果表明，Ly6G-DTR基因敲入小鼠注射DT后的第一天，其外周血中的中性粒细胞被完全清除，第二和第三天逐渐恢复，直到第五天完全恢复至DT处理之前的水平(图3A)。进一步对中性粒细胞在外周血中所占比例(图3B)和绝对计数(图3C)以及Ly6G的平均荧光强度(图3D)分别进行统计分析，也完全符合这一趋势，表明可以通过对Ly6G-DTR基因敲入小鼠注射DT的方式来达到特异性清除中性粒细胞的目的，综合以上结果，表明中性粒细胞特异性剔除的小鼠遗传模型构建成功。在后续研究中，可以通过间隔2-3天以低剂量(20ng/g体重)腹腔注射的方式来获得中性粒细胞完全清除的小鼠模型，为中性粒细胞在疾病的发生和发展中扮演角色的解析提供更好的动物遗传模型。

<110> 新乡医学院

<120> 一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Ly6G-sgRNA1

<400> 1

tctgcagaag gactgaaacc agg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Ly6G-sgRNA2

<400> 2

caaggatgaa ggtcattgaa tgg 23

<210> 3

<211> 2637

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 重组模板DNA序列

<222> (1)..(1000)

<223> 5‘同源臂

<220>

<221> 重组模板DNA序列

<222> (1001)..(1063)

<223> T2A连接序列

<220>

<221> 重组模板DNA序列

<222> (1064)..(1687)

<223> DTR序列

<220>

<221> 重组模板DNA序列

<222> (1688)..(2637)

<223> 3'同源臂

<400> 3

tggaggtcga gaagagggag gtagcagaga gttcccagga cctcctgatt ccccacccct 60

ccagcacaga gatcatgacc agcactccca tgcttggctg actggttaca tggttgcagg 120

ggattgaact tgggtctcta ggcttctatg tgtcaagcac ttcactgact gagctgcttc 180

cccagcacat tgccacctgt gtacaaggac acctgtgtac acatgtgtgg tggtcatgca 240

ctggggaggt tcagtgtatg gggcccagaa gttgacaggt atcttctgtg acaactattt 300

tatttactga ggaagatctc acactgaacc ccaagcttac aggttgaggt ggtctagcct 360

gtgagcttac tttggggatc tccatctttg tgtcctgagc acagagatac aattaggcct 420

ccatgcctgc ccatcttttg atgtgctcta cctgatggaa actggggact catgcttgtg 480

cacacaaaca ctttatccac caagcctcct taccagccca gggttttgat tttttttgtt 540

gttgtttgtt atttgagaca cggtctcatt tgagcctcat gtagctcagt ttgggattga 600

actcataaaa atgctccttc ctcagtcttc caagttctgg ggtgagaaat cttagctacc 660

atatctggct tcaccatacc ttagagacaa gtctgggcca tccaggtcag gtggcatgtg 720

acccagacat tgggatgttc tgttgttcct gcataagaag tgaatcactc cctgatatct 780

tgcagactct cacagaagca aagtcaagag caatctctgc cttcccatct gccccactac 840

tctggacaat actgagatca ctggtaatgc tgtcaacgtg aagacttact gttgcaagga 900

agacctctgc aatgcagcag ttcccactgg aggcagctcc tggaccatgg caggggtgct 960

tctgttctct ctcgtgtcag tccttctgca gacctttctc ggcagtggag agggcagagg 1020

aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc ccaatggagc tgctgccgtc 1080

ggtggtgctg aagctctttc tggctgcagt tctctcggca ctggtgactg gcgagagcct 1140

ggagcggctt cggagagggc tagctgctgg aaccagcaac ccggaccctc ccactgtatc 1200

cacggaccag ctgctacccc taggaggcgg ccgggaccgg aaagtccgtg acttgcaaga 1260

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cccatgtctt cggaaataca aggacttctg catccatgga gaatgcaaat atgtgaagga 1440

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ggctgtggtg ctgtcatctg tctgtctgct ggtcatcgtg gggcttctca tgtttaggta 1620

ccataggaga ggaggttatg atgtggaaaa tgaagagaaa gtgaagttgg gcatgactaa 1680

ttcctaatga tgatctatac agtgaccttc atccttgtcc ttttatcctc acttgcaacc 1740

aatgcttact ggagtcctct agcgatgaat tatgagatat agaagctctg agttgggggt 1800

agtgtgtgtg tgtggaacac cttgtttcca ctttataacc cctgctgtat aggcacccca 1860

ctcctctcta ggactttcaa atctgtactt cctggaatgt tcttttgttg tggcttgctg 1920

ctcttgaccc tggaggcatg tgggcagcac atgaaagagg cagtattcca aggtattatg 1980

ccatcaccat ccacacataa gtatctgggg tcctgcaggg ttcctatgtg tgctgttcaa 2040

tgtctccctg ttgagtccaa taaacacttc atcctcctag ccaagatctc tgtttttctt 2100

atattatact gagttcacag agtcctgcct gccgttttac atctctggcc tttcagccag 2160

ccacactagc tagctcatat tagctagctt agtgtggtag acctcttgga ttgggagggc 2220

ttccctcctg actgatgctg ggggggaaag taagggctcc tccacttcca aagagcactt 2280

ctgtgtggct tggaagcctg ggagatgatc catcaattgt gggtaggagc tgccttttct 2340

ttttctctag aggtggaagc tatttcttgc aggtgctcag ggcttgggtc agagagaaaa 2400

aaatcctcac actgcctgcc ctggagttct agtctatatt tgatgccccc attgggaagg 2460

gctgacttga cacattgaca acctgggatc catcactgct ctctttttgg ccttgagggc 2520

ttgctgaccc acagatgacc agaacctttg tggttaacat cacaggagtc ctcatggata 2580

tggacagtac cctggaaatg tgggtgatat gcaggagagc tggccctgac ccccacc 2637

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> h-DTR-F

<400> 4

ttctggctgc agttctctcg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> h-DTR-R

<400> 5

acatgagaag ccccacgatg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 1-F

<400> 6

aactgctgag ccatgtctcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 1-R

<400> 7

ttttcccgtg ctcctccttg 20

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 2-F

<400> 8

catcgtgggg cttctcatgt 20

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 2-R

<400> 9

acccaaacta ccaaggccag 20

Claims (8)

1.一种可诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型构建方法，其特征在于，先通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术对Ly6G基因位点进行编辑，获得Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型；再对Ly6G-DTR基因敲入小鼠注射白喉毒素，获得经白喉毒素诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型的构建，具体包括以下步骤：

1)确定打靶序列：针对Ly6G基因2个靶序列分别为：

Ly6G-sgRNA1：5‘-TCTGCAGAAGGACTGAAACC AGG-3’(SEQ ID NO:1)

Ly6G-sgRNA2：5‘-CAAGGATGAAGGTCATTGAA TGG-3’(SEQ ID NO:2)

2)通过体外转录获得Cas9 mRNA和sgRNA1/2；

3)通过生物合成获得重组模板DNA：设计重组模板DNA序列，包含以下元件：5‘和3’同源臂、T2A连接序列、DTR序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

4)获得Ly6G-DTR基因敲入Founder小鼠：将Cas9 mRNA、sgRNA1/2和重组模板DNA按一定比例混合，然后通过显微注射操作系统将其注射入小鼠受精卵细胞中，进一步将存活的受精卵细胞移植入假孕ICR小鼠雌鼠输卵管，获得Founder小鼠；

5)对Founder小鼠进行基因型检测，筛选出基因组中DTR序列插入而且插入位点正确的小鼠个体，获得Ly6G-DTR基因敲入小鼠模型。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤5)具体包括如下步骤：

A.将获得的Founder小鼠抽提基因组DNA；

B.以获取的基因组DNA为模板，使用DTR特异性引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，初步筛选出目标DTR序列在基因组中有插入的小鼠；

C.将具有目标DTR序列扩增条带的样本挑选出来，再分别使用针对左侧同源臂和针对右侧同源臂的引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，筛选出DTR序列在基因组中插入位置正确的小鼠；

D.将DTR序列插入而且插入位点正确的小鼠挑选出来，将以上3段PCR产物分别测序，挑选出插入目标序列正确的个体，即为Ly6G-DTR基因敲入小鼠。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤B中DTR特异性引物核苷酸序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反应体系如下：F和R引物各0.2μL，2×Taq Master Mix(Vazyme P112-01)5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序如下：预变性95℃5min；变性94℃30sec，退火60℃30sec，延伸72℃40sec，35个循环；终止反应72℃10min；将PCR产物进行凝胶电泳检测，若有516bp的扩增条带，表明DTR序列在基因组中插入。

6.据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤C中针对左侧同源臂的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；针对右侧同源臂的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

7.据权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR体系如下：F和R引物各0.2μL，2×TaqMaster Mix(Vazyme P112-01)5μL，基因组DNA 1μL，补充H2O至总体积10μL；PCR反应程序如下：预变性95℃5min；变性94℃30sec，退火60℃30sec，延伸72℃90sec，35个循环；终止反应72℃10min；将PCR产物进行凝胶电泳检测，若针对左侧同源臂引物有1428bp的扩增条带且针对右侧同源臂引物有1081bp的扩增条带，表明DTR序列插入而且插入位点正确。

8.据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过间隔2-3天以低剂量(20ng/g体重)腹腔注射白喉毒素的方式，获得经白喉毒素诱导的中性粒细胞特异性剔除的小鼠模型。

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