CN108300738B

CN108300738B - 一种nod遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法

Info

Publication number: CN108300738B
Application number: CN201810102962.6A
Authority: CN
Inventors: 梁银明; 张黎琛; 卢燎勋; 黄蓉; 晁天柱; 郑前前; 罗静; 谷妍蓉
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2038-02-01
Also published as: CN108300738A

Abstract

本发明涉及一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，属于基因工程和遗传修饰技术领域。本发明的制备方法包括：将NOD小鼠中Gfi1基因敲除后，即得NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型。本发明首次在NOD遗传背景小鼠模型中利用CRISPR/Cas9系统实现了对控制小鼠中性粒细胞发育的关键基因Gfi1进行特异性敲除，获得一种在NOD遗传背景下中性粒细胞缺失的新的人源化小鼠动物模型。该小鼠模型具有接受异种移植的潜力，为开发全新的人源化小鼠提供了新的思路。

Description

一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法

技术领域

本发明涉及一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，属于基因工程和遗传修饰技术领域。

背景技术

人源化小鼠模型即是指带有人类功能性基因、细胞或组织的小鼠模型，为了更好的在人源化小鼠体内重建人类的免疫系统，需要先去除小鼠自身的免疫系统，前人已经研究获得了很多经典人源化小鼠模型，如T细胞、B细胞和自然杀伤细胞完全缺失的NOG、NSG小鼠等。

人类的免疫系统是一个非常重要和复杂的网络系统，其与人类几乎所有疾病的发生都有千丝万缕的关系，为了深入研究人类免疫系统与疾病的关系，这就需要使用各种动物模型来对一些特殊的疾病进行模拟，由于伦理的原因，不能直接使用人作为疾病模型，而小鼠因为易于获取和饲养，且其免疫系统与人类有诸多相似之处，所以在阐明发病机制、药物筛选等方面有巨大的优势。

NOD小鼠是日本学者对远交系Jcl：JCR鼠进行近交培育第6代时从白内障易感亚系中分离出非肥胖糖尿病品系(NOD)和非肥胖正常品系(nod)，是I型糖尿病研究和人源化模型建立中使用最为广泛的小鼠品系，目前一些经典的人源化小鼠模型如NOG和NSG等均是在NOD小鼠遗传背景中制作获得的；中性粒细胞是免疫细胞中重要的一员，其对小鼠的生存至关重要，目前世界范围内还没有关于中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型制作成功的报道；所以，在NOD遗传背景小鼠中制作获得中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型，将为开启此类小鼠在异种移植中的研究提供更好的小鼠模型，也为人源化小鼠的研究开启全新的视野。

发明内容

本发明的目的是提供一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，该方法可操作性强，构建成功率高。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，包括：将NOD小鼠中Gfi1基因敲除后，即得。

本发明首次在NOD遗传背景小鼠模型中利用CRISPR/Cas9系统实现了对控制小鼠中性粒细胞发育的关键基因Gfi1进行特异性敲除，获得一种在NOD遗传背景下中性粒细胞缺失的新的人源化小鼠动物模型，该模型小鼠中成熟的中性粒细胞完全消失。NOD遗传背景小鼠中利用CRISPR/Cas9系统敲除Gfi1基因在国内外尚属首次，这也是首例缺失中性粒细胞的人源化小鼠模型，具有很高的原创性和非常重要的基础研究和实际应用价值，也为开发全新的人源化小鼠提供了新的思路。

在敲除所述Gfi1基因时，选择3个靶序列，分别如下所示：

Gfi1-sgRNA1：5‘-AGCTTTGACTGTAAGATCTG TGG-3’；

Gfi1-sgRNA2：5‘-GTACTGACAGGGATAGGGCC GGG-3’；

Gfi1-sgRNA3：5‘-TGCTCATTCACTCGGACACC CGG-3’。

本发明中首次确定了3个针对NOD小鼠Gfi1基因的特异性打靶位点，利用3个sgRNA针对NOD小鼠Gfi1基因进行打靶，保证被打靶基因能够彻底丧失生物学功能，并通过实验证明这三个sgRNA具有很高的剪切效率。

在敲除Gfi1基因时，合成4条引物，通过PCR扩增得到3个双链DNA；将所述3个双链DNA转录成3个sgRNA mRNA，将所述3个sgRNA mRNA与Cas9mRNA共同注射入小鼠受精卵细胞中，得到Gfi1基因敲除受精卵细胞；将所述Gfi1基因敲除受精卵细胞移植进入假孕雌鼠，出生后获得F0代小鼠。

所述4条引物分别如下所示：

Gfi1-IVT-1：TTAATACGAC TCACTATAGG GAGCTTTGAC TGTAAGATCT GGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

Gfi1-IVT-2：TTAATACGAC TCACTATAGG GGTACTGACA GGGATAGGGC CGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

Gfi1-IVT-3：TTAATACGAC TCACTATAGG GTGCTCATTC ACTCGGACAC CGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG；

IVT-R：AAAAAAGCAC CGACTCGGTG CC；

将所述IVT-R分别与Gfi1-IVT-1、Gfi1-IVT-2或Gfi1-IVT-3组合后用于PCR扩增，获得3个双链DNA。

所述Cas9mRNA为由pT7-3×Flag-hCas9载体经Agel酶线性化后，在体外转录获得。

所述PCR扩增时，采用的模板为pX330质粒。本发明中将T7启动子序列添加入合成的引物序列的5‘端，通过PCR扩增，获得带有T7启动子的双链DNA。

所述3个sgRNA mRNA与Cas9mRNA的终浓度为50ng/μL。

获得Gfi1基因敲除F0小鼠以后，鉴定选择Gfi1基因敲除的NOD小鼠与野生型NOD小鼠交配得到F1代杂合子小鼠，再将F1代杂合子小鼠进行自交，筛选出Gfi1基因敲除的纯合子个体即为NOD遗传背景中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型；同时保留筛选得到的杂合子小鼠，作为后续繁殖的亲本。因为Gfi1基因敲除的纯合子个体小鼠不能长时间存活，所以本申请中选用杂合子自交的繁殖方式来获得纯合子后代小鼠。

所述Gfi1基因敲除小鼠基因型的鉴定使用如下引物：

Gfi1-F PCR-F：5‘-CCTGTGTGGATGAAGGTGTG-3’；

Gfi1-F PCR-R：5‘-TCCTCCTCTCTTCCTCTCTGC-3’。所述Gfi1-F PCR-F引物的5‘端使用荧光进行标记，具体的采用FAM荧光进行标记。Gfi1野生型DNA模板扩增片段长度为195bp。

所述Gfi1基因敲除小鼠测序筛选使用如下引物：

Gfi1-S PCR-F：5‘-GGAGCTACGCTTTTGTCCTG-3’；

Gfi1-S PCR-R：5‘-CCTGTGTGGATGAAGGTGTG-3’。其中Gfi1野生型DNA模板扩增片段长度为429bp。

本发明在NOD遗传背景小鼠模型中利用CRISPR/Cas9系统实现了对控制小鼠中性粒细胞发育的关键基因Gfi1进行特异性敲除，获得一种在NOD遗传背景下中性粒细胞缺失的新的人源化小鼠动物模型。

上述的制备方法得到的NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型可以用于异种移植。本申请得到的小鼠是人源化小鼠模型，而且免疫系统不健全，从而可以在模型小鼠体内重建人类免疫系统，进行异种移植免疫排斥反应弱，因此可用于异种移植，为研究各种人类疾病提供更好的模型。

本发明的有益效果为：NOD小鼠是人源化模型建立中使用最为广泛的小鼠品系，但NOD背景小鼠基因敲除模型仍极其缺乏，本发明首次在NOD小鼠中实现控制中性粒细胞发育的Gfi1基因敲除、并获得中性粒细胞缺失的遗传模型。NOD遗传背景小鼠中利用CRISPR/Cas9系统敲除Gfi1基因在国内外尚属首次，这也是首例缺失中性粒细胞的人源化小鼠模型，具有很高的原创性和非常重要的基础研究和实际应用价值，也为开发全新的人源化小鼠提供了新的思路。

附图说明

图1为NOD遗传背景Gfi1基因敲除小鼠荧光PCR基因型检测结果图；

图2为NOD遗传背景Gfi1基因敲除小鼠Sanger测序结果图；

图3为NOD遗传背景Gfi1基因敲除小鼠流式细胞术免疫表型检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例及试验例中NOD小鼠购买于南京大学-南京医药研究院。pX330质粒DNA购于Addgene；pT7-3×Flag-hCas9质粒由黄军就教授馈赠。其他实验用品未经说明，均为市售商品。

实施例1

本实施例中NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，包括如下步骤：

一、确定NOD小鼠待敲除基因Gfi1(Gene ID：103170)的三个特异性靶位点Gfi1-sgRNA1、Gfi1-sgRNA2、Gfi1-sgRNA3。

在小鼠基因组数据库ensembl(http://asia.ensembl.org)中找到小鼠Gfi1基因DNA序列，然后使用在线设计软件CRISPOR(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，确定在小鼠Gfi1基因的exon6(exon ID：ENSMUSE00001072804)内挑选3个特异性位点作为sgRNA的靶序列，这三个靶序列分别为：

Gfi1-sgRNA1：5‘-AGCTTTGACTGTAAGATCTG TGG-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

Gfi1-sgRNA2：5‘-GTACTGACAGGGATAGGGCC GGG-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

Gfi1-sgRNA3：5‘-TGCTCATTCACTCGGACACC CGG-3’(如SEQ ID NO.3所示)。

二、获得3个sgRNA mRNA。

1)订购4条引物(上海百力格生物技术有限公司)，分别为：

Gfi1-IVT-1：TTAATACGAC TCACTATAGG GAGCTTTGAC TGTAAGATCT GGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG(如SEQ ID NO.4所示)；

Gfi1-IVT-2：TTAATACGAC TCACTATAGG GGTACTGACA GGGATAGGGC CGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG(如SEQ ID NO.5所示)；

Gfi1-IVT-3：TTAATACGAC TCACTATAGG GTGCTCATTC ACTCGGACAC CGTTTTAGAGCTAGAAATAG CAAG(如SEQ ID NO.6所示)；

IVT-R：AAAAAAGCAC CGACTCGGTG CC(如SEQ ID NO.7所示)。

2)将T7启动子序列添加入合成的引物序列的5‘端，通过PCR扩增，获得带有T7启动子的双链DNA，具体为：

PCR反应体系为：模板为pX330质粒DNA，加入10ng；上游引物Gfi1-IVT-1、2、3(10μM)分别加入2μl；下游通用引物IVT-R(10μM)分别加入2μl；2×Taq Master Mix(购于vazyme，P111-01)加入25μl；补充H₂O至总体积50μl。

PCR反应程序为：94℃，5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s；72℃，10min；循环数为30次。PCR程序结束后，使用invitrogen PCR回收试剂盒(invitrogen，K220001)，纯化PCR产物。

3)体外转录获得sgRNA mRNA。体外转录试剂盒使用NEB试剂盒(NEB，E2050S)，详细反应步骤如下：按照试剂盒要求，配制反应体系，依次加入NTP Buffer Mix 10μl；模板DNA1μg；T7RNA Polymerase Mix 2μl；补充H₂O至总体积30μl；置于37℃反应孵育4小时，获得体外转录产物；使用Ambion RNA纯化试剂盒(Ambion，AM1909)按照说明书要求回收条带得sgRNA mRNA。

三、获得Cas9mRNA。

1)使用高纯度质粒抽提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP116)提取pT7-3×Flag-hCas9载体质粒DNA，然后使用以下体系采用AgeI限制性内切酶(NEB，R3552S)酶切质粒DNA：质粒DNA 10μg；CutSmart Buffer 20μl；AgeI限制性内切酶2μl；补充H₂O至总体积200μl。使用封口胶将管口封好，然后置于37℃温箱过夜反应。

通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，酶切产物电泳后呈现单一条带，表明载体质粒DNA线性化完成。利用DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP205)纯化酶切产物，即获得Cas9体外转录模板DNA。

2)体外转录获得Cas9mRNA：体外转录试剂盒使用invitrogen试剂盒(invitrogen，AMB1345-5)，详细反应步骤如下：按照试剂盒要求，配制反应体系，依次加入T72*NTP/ARCA10μl；10*T7Reaction Buffer 2μl；模板DNA 1μg；T7Enzyme Mix 2μl；补充H₂O(invitrogen，10977015)至总体积20μl；置于37℃反应孵育2小时，然后加入1μl TURBODNase，充分混匀以后，置于37℃反应孵育15min；接下来再向以上反应产物中按照以下顺序配制加尾反应体系，mMESSAGEmMACHINE T7Ultra reaction产物20μl；H₂O(invitrogen，10977015)36μl；5*E-PAP Buffer 20μl；25mM MnCl2 10μl；ATP Solution 10μl；E-PAP 4μl，充分混匀以后，置于37℃反应孵育45min。获得体外转录产物以后，使用Ambion RNA纯化试剂盒(Ambion，AM1909)回收Cas9mRNA。

四、将获得的3条sgRNA mRNA和Cas9mRNA通过显微注射系统注射NOD背景小鼠受精卵细胞。

通过对8周龄NOD背景小鼠雌鼠注射激素，经过超排卵和交配以后获取受精卵细胞。将3条sgRNA mRNA和Cas9mRNA使用无RNA酶的超纯水(invitrogen，10977015)稀释至终浓度均为50ng/μl，混合后通过显微注射系统注射入NOD背景小鼠受精卵细胞中，置于培养箱(37℃，CO2浓度为5％)培养1小时以后，挑选存活的细胞，将其移植入假孕ICR小鼠雌鼠输卵管中。20天以后即可以得到Founder小鼠。本实施例中共注射50个受精卵细胞，存活45个细胞。

五、Founder小鼠基因型鉴定。

通过荧光PCR检测小鼠基因型：将得到的Founder小鼠剪鼠尾，抽提DNA，然后利用其作为模板DNA，使用引物进行荧光PCR扩增，使用引物序列为：

Gfi1-F PCR-F：5‘-CCTGTGTGGATGAAGGTGTG-3’(如SEQ ID NO.8所示，5‘端使用FAM荧光进行标记)；

Gfi1-F PCR-R：5‘-TCCTCCTCTCTTCCTCTCTGC-3’(如SEQ ID NO.9所示)。

PCR反应体系为：模板为鼠尾DNA，加入20ng；每一对上游引物各加入2μl；每一对下游引物各加入2μl；2×Taq Master Mix(购于vazyme，P111-01)加入25μl；补充H2O至总体积50μl。

PCR反应程序为：94℃，5min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，30s；72℃，10min；循环数为30次。其中Gfi1野生型DNA模板扩增片段长度为195bp。

得到PCR产物以后，取2μl产物用于电泳检测，如果有条带，则将PCR产物稀释200倍以后，将甲酰胺、所述稀释以后PCR产物和标准分子量内参DNA混合，变性后置于测序仪上进行毛细管电泳，结果使用Genemapper软件进行数据分析，直接获得PCR产物的大小，与野生型对照的PCR产物大小进行比较后，得出碱基插入或缺失的具体数目。与野生型扩增产物对照进行比较，发现2只Founder小鼠(分别命名为#1和#2)的扩增片段与野生型相比，均发生了缺失。

结果如图1所示，结果表明，获得的两只小鼠均为杂合子，其中#1小鼠Gfi1基因位点一条染色体缺失84个碱基，另外一条染色体为野生型；#2小鼠Gfi1基因位点一条染色体缺失9个碱基，另外一条染色体为野生型。

通过TA克隆检测小鼠基因型。使用引物序列为：

Gfi1-S PCR-F：5‘-GGAGCTACGCTTTTGTCCTG-3’(如SEQ ID NO.10所示)；

Gfi1-S PCR-R：5‘-CCTGTGTGGATGAAGGTGTG-3’(如SEQ ID NO.11所示)。

其中Gfi1野生型DNA模板扩增片段长度为429bp(如SEQ ID NO.12所示)，PCR反应体系与程序同上，取2μl#1和#2小鼠的PCR扩增产物用于TA克隆连接反应(天根生化科技(北京)有限公司，DP205)，然后将连接产物转化DH5α感受态细胞，于37℃培养箱过夜培养，待其长出单克隆以后，挑取单克隆进行培养，并送样进行测序鉴定。2只Founder小鼠均进行测序鉴定，测序结果如图2所示，A为#1敲除小鼠的基因型，B为#2敲除小鼠的基因型；与图1结果完全相同，表明荧光PCR具有很高的准确性。

六、将2只Founder小鼠进行回交和自交获得Gfi1基因敲除NOD小鼠纯合子。

具体为：将Founder小鼠与野生型NOD小鼠杂交，在杂交后代中挑选杂合子自交，自交后代经检测得到Gfi1基因敲除纯合子，此小鼠即为NOD遗传背景的中性粒细胞缺失小鼠模型。同时保留筛选得到的杂合子小鼠，作为后续繁殖的亲本。因为Gfi1基因敲除的纯合子个体小鼠不能长时间存活，所以选用杂合子自交的繁殖方式来获得纯合子后代小鼠。

七、对上述获得的Gfi1基因敲除中性粒细胞缺失的人源化小鼠遗传模型进行免疫表型鉴定。

分别抽取Gfi1基因敲除NOD小鼠、野生型NOD对照小鼠的外周血，然后使用特异性抗体进行标记，使用流式细胞术进行检测(Canto II，BD，USA)。步骤如下：首先配制抗体混合物，然后吸取40μl新鲜血液，加入10μl抗体混合物，充分震荡混匀以后，置于4℃冰箱避光孵育30min，孵育结束以后，加入400μl红细胞裂解液，充分震荡混匀以后，置于室温避光孵育10min，反应结束，然后采用流式细胞仪进行检测。

表1流式细胞术所使用抗体名称及品牌

抗体名称	通道名称	厂商
			CD5	Pecy-7	eBioscience
CD19	Pecy5.5	eBioscience
			CD4	FITC	eBioscience
CD11C	PE	eBioscience
			CD11B	APC	eBioscience
LY6G	Alexa700	Biolegend
			CD8	Alexa700	eBioscience
CD45	APC-efluor780	eBioscience
			NK1.1	BV421	Biolegend
CD44	BV605	Biolegend
			CD25	Pecy5.5	eBioscience

分析结果如图3所示，中A、B和C为野生型对照小鼠细胞分析示意图，D、E和F为基因敲除小鼠细胞分析示意图，其中A和D图中圆圈所示部分表示粒细胞，B和E图中左上角方框内部细胞表示T细胞，右下角方框内部表示B细胞，左下角方框内部表示T和B细胞以外的细胞；C和F图中圆圈内部表示中性粒细胞。从结果可以看出，在NOD小鼠中敲除Gfi1基因以后，其外周血液中成熟的中性粒细胞已经完全消失。以上数据表明本发明成功通过CRISPR/Cas9基因敲除技术获得NOD背景Gfi1基因敲除中性粒细胞缺失的人源化小鼠遗传模型。

<110> 新乡医学院

<120> 一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-sgRNA1

<400> 1

agctttgact gtaagatctg tgg 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-sgRNA2

<400> 2

gtactgacag ggatagggcc ggg 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-sgRNA3

<400> 3

tgctcattca ctcggacacc cgg 23

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-IVT-1

<400> 4

ttaatacgac tcactatagg gagctttgac tgtaagatct ggttttagag ctagaaatag 60

caag 64

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-IVT-2

<400> 5

ttaatacgac tcactatagg ggtactgaca gggatagggc cgttttagag ctagaaatag 60

caag 64

<211> 64

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-IVT-3

<400> 6

ttaatacgac tcactatagg gtgctcattc actcggacac cgttttagag ctagaaatag 60

caag 64

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> IVT-R

<400> 7

aaaaaagcac cgactcggtg cc 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-F PCR-F

<400> 8

cctgtgtgga tgaaggtgtg 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-F PCR-R

<400> 9

tcctcctctc ttcctctctg c 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-S PCR-F

<400> 10

ggagctacgc ttttgtcctg 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> Gfi1-S PCR-R

<400> 11

cctgtgtgga tgaaggtgtg 20

<211> 429

<212> DNA

<213> 小鼠

<221> Gfi1野生型DNA模板扩增片段

<400> 12

ggagctacgc ttttgtcctg gggtgtggag ggttgtggct gtaaagtgtt ttagtagtta 60

atcagtaggt gttgaatgat ggggtggagg gagagaggag agggtttctg gctctgggag 120

atcagtagat gttggagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 180

gagagagaga gagcacaagc gccaaggagg ctgctgaagg agcggcacat ttcttcctcc 240

tctcttcctc tctgctctgc aggaacgcag ctttgactgt aagatctgtg gcaagagctt 300

caagaggtca tccacgctgt ccacacatct gctcattcac tcggacaccc ggccctatcc 360

ctgtcagtac tgtggcaaaa gattccacca gaagtcagat atgaagaaac acaccttcat 420

ccacacagg 429

Claims

1.一种NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型的制备方法，其特征在于：包括：将NOD小鼠中Gfi1基因敲除后，即得；

在敲除所述Gfi1基因时，选择3个靶序列，分别如下所示：

Gfi1-sgRNA1：5‘-AGCTTTGACTGTAAGATCTG TGG-3’；

Gfi1-sgRNA2：5‘-GTACTGACAGGGATAGGGCC GGG-3’；

Gfi1-sgRNA3：5‘-TGCTCATTCACTCGGACACC CGG-3’；

在敲除Gfi1基因时，合成4条引物，通过PCR扩增得到3个双链DNA；将所述3个双链DNA转录成3个sgRNA mRNA，将所述3个sgRNA mRNA与Cas9 mRNA共同注射入小鼠受精卵细胞中，得到Gfi1基因敲除受精卵细胞；将所述Gfi1基因敲除受精卵细胞移植进入假孕雌鼠，出生后获得F0代小鼠；

所述4条引物分别如下所示：

IVT-R：AAAAAAGCAC CGACTCGGTG CC；

将所述IVT-R分别与Gfi1-IVT-1、Gfi1-IVT-2或Gfi1-IVT-3组合后用于PCR扩增，获得3个双链DNA；

获得Gfi1基因敲除F0小鼠以后，鉴定选择Gfi1基因敲除的NOD小鼠与NOD小鼠交配得到F1代杂合子小鼠，再将F1代杂合子小鼠进行自交，筛选出Gfi1基因敲除的纯合子个体即为NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型；同时保留筛选得到的杂合子小鼠，作为后续繁殖的亲本。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Cas9 mRNA为由pT7-3×Flag-hCas9载体经Agel酶线性化后，在体外转录获得。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述PCR扩增时，采用的模板为pX330质粒。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述Gfi1基因敲除小鼠基因型的鉴定使用如下引物：

Gfi1-F PCR-F：5‘-CCTGTGTGGATGAAGGTGTG-3’；

Gfi1-F PCR-R：5‘-TCCTCCTCTCTTCCTCTCTGC-3’。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述Gfi1-F PCR-F引物的5‘端使用荧光进行标记。

6.如权利要求1所述的制备方法得到的NOD遗传背景的中性粒细胞缺失的人源化小鼠模型在研究异种移植中的应用。