CN117866900A - 一种人源化细胞、动物模型及其构建方法和应用 - Google Patents

一种人源化细胞、动物模型及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基因修饰的小鼠细胞，包含该小鼠细胞的具有人源化免疫系统的小鼠以该人源化小鼠的构建方法。该方法包括，在小鼠上失活Gfi1基因，其后不经亚致死性辐照，通过注射造血干细胞直接进行人源化建模过程，其中造血干细胞的剂量可减少为原参考剂量的八分之一，因此大幅减少了造血干细胞的使用剂量。通过上述方法，不仅降低了人源化小鼠模型的构建成本，简化了构建步骤，缩短了构建时间，同时免辐照也解决了目前实验小鼠抗辐照能力弱的问题，降低了小鼠感染的风险，并在小鼠中重建出包括人源中性粒细胞在内的多种免疫亚群，为临床前研究提供了更好的小鼠模型。

Description

一种人源化细胞、动物模型及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于动物实验模型及其制备技术领域，具体涉及一种人源化小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
免疫学研究和探索依赖实验动物模型，通过体外实验获得结论也需要在体内实验中获得进一步的认证。小鼠作为经典实验动物，被广泛应用于多种免疫学实验中，推动了免疫学的长足的进步。然而数千万年“分道扬镳”的进化，小鼠的免疫系统和人体真实情况之间还是存在巨大差异(Mestas and Hughes,2004)；这也导致了基础研究和临床转化之间出现鸿沟，造成了社会资源的浪费。而面对这一问题，科研人员发明的带有人类功能性基因、细胞或组织的人源化小鼠模型，凭借着其可以模拟人体免疫动态的特点，有望成为破局的关键。常见的人源化小鼠模型是在免疫缺陷型小鼠的基础上，移植人的造血干细胞，逐步分化各种免疫细胞亚群。人源化小鼠模型搭建了基础研究和临床转化的“桥梁”，提高了安全性，降低了资源的浪费。而对人源化小鼠模型本身的改造，推进其更好地模拟人类免疫系统，将可以带来免疫学研究和检验的更好的实验动物模型，促进科学进步，造福人类社会(Shultz et al.,2007)。
人源化小鼠模型功能性的基础是造血干细胞在免疫缺陷小鼠中分化出的各个免疫细胞亚型；因而优化免疫细胞亚群的比例、数量和功能，就成为了改进人源化小鼠模型的关键。目前大部分人源免疫细胞亚群都可以实现在免疫缺陷小鼠中的重建；与之相比，嗜中性粒细胞是目前各类免疫细胞亚群的最大短板。嗜中性粒细胞是人体免疫细胞的最大亚群，在外周血中占比达到50～70％(Eruslanov et al.,2017)；但是在目前的人源化小鼠模型中，外周血几乎检测不到人源嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞在作为最大亚群的免疫细胞在免疫反应中发挥着重要的作用，作为感染和炎症的第一道防线，嗜中性粒细胞激活和唤醒免疫系统(Hidalgo et al.,2019)；在过度激活的条件下，嗜中性粒细胞浸润也会加剧组织损伤(Hasler et al.,2016)；在肿瘤微环境中，免疫抑制性嗜中性粒细胞抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤生长和侵袭(Lecot et al.,2019)。因此，重建出嗜中性粒细胞将会使得现有人源化小鼠模型更上一步台阶。
人源化小鼠品系一路发展，目前人源化小鼠的明星品系是发明于21世纪初的NOD/Shi-scid Il2Rγ-/-(NOG)和NOD/LtSzscid Il2Rγ-/-(NSG)(Ishikawa etal.,2005；Ito etal.,2002；Shultz et al.,2005；Traggiai et al.,2004)。NOG和NSG小鼠都通过敲除小鼠的IL2受体γ链，来阻断小鼠的体内的IL2、4、7、9、15、21信号；IL15调节小鼠NK细胞发育，因而在NOG和NSG小鼠中成熟NK细胞几乎消失，使得NOG和NSG小鼠可以实现较高水平的人源化。但是由于IL7信号的缺失，小鼠缺少次级淋巴组织诱导细胞(LTi)，这也导致了NOG和NSG小鼠中的次级淋巴组织发育受阻，脾脏、胸腺较小，外周淋巴结和肠道派氏淋巴集结(Peyerpatch)均消失(Shultz et al.,2012)。次级淋巴组织是人源化小鼠中人源免疫细胞进一步发育成熟的场所，在次级淋巴组织中，人源细胞接受机体的训练和刺激，增强其功能性。在NOG，NSG或NCG品系的人源化小鼠中，进入循环的人源免疫细胞，如T细胞、B细胞等缺乏进一步发育的场所，导致功能性减少。研究人员通过补充TSLP的方式，构建了BRGST小鼠，实现了重建免疫缺陷小鼠外周淋巴结，显著增加了人源T，B细胞的功能性。因此，进一步重建小鼠次级淋巴组织，将有利于提高人源化小鼠模型的人源免疫系统功能(Li etal.，2018)。但是即使在BRGST免疫缺陷型小鼠中，小鼠的肠道派氏淋巴集结(Peyer patch)还是发育不出来。肠道是接触外界抗原最多最频繁的器官，位于肠道的派氏淋巴集结(Peyer patch)被认为是机体免疫系统重要的练兵场(Kobayashi et al.,2019)。因此在人源化小鼠中重建出肠道派氏淋巴集结(Peyer patch)将补上次级淋巴组织缺陷的重要一环，将增强人源化小鼠的免疫细胞功能。
此外，目前人源化小鼠模型领域的门槛较高，其原因在于生产人源化小鼠模型的成本较高，分离从脐带血来源的HSC数量很少，价格非常高。人源化小鼠构建也需要辐照仪等大型设备。在构建人源化，NOG，NSG，和NCG均需要进行亚致死辐照(Ren et al.,2022)。辐照仪是大型设备，需要专门的房间(防辐射处理)和操作人员保存和运行，仪器故障不仅对实验有影响，也可能危害操作人员的安全。研究人员对小鼠的c-kit基因进行功能性点突变，造成了X品系(NSGW41)，如NSG-X，NCG-X可以免于辐照，简化了操作步骤。因此，可以免于辐照而构建出的人源化小鼠的品系将简化操作流程，是一个有希望的发展方向。
因此需要一种方法能够在人源化免疫小鼠中重建人源的各类免疫细胞亚型，包括粒细胞，各种淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)，巨噬细胞等，同时重建出次级淋巴组织，包括全身的淋巴结和肠道的派氏淋巴集结(Peyer patch)，并且希望该方法与现有方法相比具有过程简便、成本降低、构建周期缩短的优势。
中国专利CN113907042A，CN108300738A，CN 112410341A，CN113907042A，公开了通过Gfi1基因敲除的方法可以获得小鼠中性粒细胞缺失的遗传小鼠模型。但与制备人源化免疫系统重建良好的小鼠模型这一目标有较大差别。
因此，本发明要提供一种人源化免疫系统重建良好的小鼠模型。
发明内容
本发明通过使小鼠体内Gfi1基因失活，获得了Gfi1基因失活的小鼠，之后无需亚致死性辐照，通过对小鼠注射造血干细胞直接进行了人源化操作，获得了人源化的小鼠模型，以解决现有技术中存在的上述技术缺陷。
1.细胞
本发明提供一种基因修饰的小鼠细胞，该小鼠细胞的Gfi1基因失活。
可选地，该Gfi1基因失活的小鼠细胞是通过非同源性末端接合、同源重组、插入突变和干扰RNA技术中的一种获得的。
可选地，通过对细胞Gfi1基因进行基因编辑获得该小鼠细胞。
可选地，通过敲除该细胞Gfi1基因获得该小鼠细胞。
在某些实施例中，该Gfi1基因失活的小鼠细胞可以是体细胞、受精卵细胞、全能干细胞或其他任一种小鼠细胞。
在某些实施例中，所述细胞可直接获自本发明提供的小鼠或其功能活性部分。
2.人源化免疫系统的小鼠
进一步地，本发明提供一种人源化免疫系统的小鼠，该小鼠由上述细胞发育而来。
可选地，该小鼠在其生长过程中未经辐射照射的人源化过程。
可选地，该小鼠具有重建的次级淋巴组织。
在某些实施例中，该小鼠重建的次级淋巴组织包括重建的肠道派氏淋巴集结(Peyer patch)。
在某些实施例中，该小鼠可以为NCG小鼠，其中所述NCG小鼠是一种重度免疫缺陷小鼠。
3.人源化免疫系统小鼠的构建方法
进一步地，本发明提供一种人源化免疫系统小鼠的构建方法。
在某些实施例中，该方法包括，将细胞发育成小鼠个体，并在幼鼠阶段对其注射人源造血干细胞，优选地，在小鼠出生一周内注射人源造血干细胞。
可选地，在构建过程中不对小鼠进行辐射照射。
可选地，注射造血干细胞的剂量大于0.625×104个/鼠(6.25×103个/鼠)。
在某些实施例中，注射造血干细胞的剂量不超过2.5×104个/鼠。
在某些实施例中，注射造血干细胞的剂量不超过1.0×104个/鼠。
在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：利用CRISPR Cas9技术敲除免疫缺陷型小鼠受精卵细胞的Gfi1基因；
1)将Gfi1基因敲除的受精卵细胞移植进入假孕雌鼠获得F0代小鼠，并筛选出Gfi1基因敲除的小鼠；
2)将Gfi1基因敲除的小鼠进行回交和自交获得Gfi1基因敲除的纯合子小鼠；
3)将步骤3)中获得的纯合子小鼠同现有免疫缺陷型小鼠进行交配获得免疫缺陷型小鼠；
4)对步骤4)中获得的免疫缺陷型小鼠注射人源造血干细胞。
在某些实施例中，选择如下靶向序列对Gfi1基因进行敲除：
AAGATCTGTGGCAAGAGCTTCAAGAGGTCATCCACGCTGTCCACACATCTGCTCATTCACTCGGACACCCGGCCCTATCCCTGT。
进一步地，对获得的Gfi1敲除的小鼠使用如下引物鉴定其基因型的：
Gfi1-上游引物：5’-CCTGTGTGGATGAAGGTGTG-3’；
Gfi1-下游引物：5’-TCCTCCTCTCTTCCTCTCTGC-3’。
4.人源化免疫系统小鼠的的应用
进一步地，本发明提供上述制备方法得到的人源化小鼠在肿瘤和人体免疫系统疾病治疗中的应用。
现有技术中，构建人源化小鼠模型需要以下过程，首先去掉小鼠的免疫细胞，使小鼠免疫系统不能正常发育；之后经射线亚致死性辐照,破坏小鼠自体骨髓造血系统；最后再通过静脉注射、骨髓腔内注射或新生鼠肝内注射等途径移植人脐带血、骨髓、胎肝等来源的造血干细胞，并在小鼠体内发育成人的免疫系统。其中最关键的是第二步，也就是破坏小鼠的造血细胞。为实现该步骤，现有技术中对小鼠的人源化过程均需采用一定强度的X射线，经过亚致死性辐照以杀死小鼠自身大部分骨髓造血干细胞(Ren et al.,2022)，目前尚无其他途径替代该辐照操作。
上述现状造成了目前生产人源化小鼠模型的成本较高。一方面，分离从脐带血来源的造血干细胞数量很少，造血干细胞的成本较高，是人源化过程最重要的经济支出。另一方面，亚致死性辐照需要辐照仪等大型设备，该仪器需要专门防辐射处理的房间进行保存和运行，对相关人员的专业技能也提出了较高要求。同时，仪器故障不仅对实验有影响，也可能危害操作人员的安全。
同时，对辐照特别敏感的免疫缺陷小鼠品系不适合在移植前进行辐照处理，在实际操作中还需对小鼠在辐照前后给予一个周期的抗生素治疗，以避免无免疫系统的小鼠在操作过程中感染死亡，因此辐照会影响该类小鼠的寿命。
本发明提供的细胞，人源化免疫系统小鼠，该人源化免疫系统小鼠的制备方法及应用，具有以下技术优势：
①人源化免疫系统小鼠的制备免去了亚致死性辐照过程，既简化了操作流程，又减去了辐照所需的专门仪器、场所以及专业人员。
②因无需亚致死性辐照过程，从而降低了辐照对小鼠的不利影响，避免了小鼠因辐照引发的感染和死亡。
③人源化过程从开始注射造血干细胞至人源化完成这一过程从NOG，NSG或NCG人源化小鼠制备所需的12周左右缩短至8周左右，极大节省了时间。
④在人源化过程中需要注射的造血干细胞的剂量大大减少，最低可以低至NOG，NSG或NCG人源化小鼠制备所需参考剂量的八分之一，大幅减少了造血干细胞的使用剂量，极大地降低了成本。
⑤重建出的完整的人源免疫细胞亚群并且具有完善的功能性，从实验数据来看，本方法获得的人源化小鼠人源化中性粒细胞发育良好，次级淋巴组织生长发育良好。
⑥人源化构建的成功率高，从实验数据上看大大高于NOG，NSG或NCG的构建成功率，目前人源化构建成功率100％，平均人源化水平高于40％。
因此本发明提供的技术方案，一方面大大简化操作步骤、降低经济成本和时间成本，另一方面具有更好的人源化免疫系统重建效果以及更高的成功率。在本发明之前对此并无任何公开报道，达到了意想不到的技术效果。
附图说明
图1：小鼠Gfi1基因敲除策略示意图和序列信息。
图2：Gfi1基因未敲除、杂合敲除和纯合敲除的琼脂糖凝胶图。
图3：小鼠体重与生长周数的对应示意图。
图4：小鼠外周血白细胞和骨髓细胞的数量示意图。
图5：流式细胞仪检测小鼠外周血中的成熟NK细胞水平。
图6：流式细胞仪检测小鼠脾脏中的成熟NK细胞水平。
图7：流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏、外周血、肺的嗜中性粒细胞水平。
图8：流式细胞仪检测小鼠外周血，脾脏，肺部和骨髓中的免疫细胞水平。
图9：流式细胞仪检测小鼠外周血、脾脏、肺部及骨髓中的免疫祖细胞水平。
图10：流式细胞术检测小鼠脾脏和小肠的LTi细胞水平。
图11：拍照记录小鼠派氏淋巴集结(Peyer patch)水平。
图12：对小鼠淋巴结进行芝加哥天空蓝染色。
图13：HE染色检测小鼠脾脏、胸腺和腹股沟淋巴结发育水平。
图14：辐照构建人源化小鼠模型策略及流式细胞术检测小鼠人源免疫系统重建水平。
图15：流式细胞仪检测人源化小鼠人源免疫细胞发育水平。
图16：非辐照构建人源化小鼠模型策略及流式细胞仪检测小鼠人源免疫系统重建水平。
图17：流式细胞仪检测人源化BALB/c-品系小鼠人源嗜中性粒细胞重建水平。
图18：流式细胞仪检测Gfi1敲除小鼠的最低造血干细胞用量(以人源化百分比为标准)。
图19：流式细胞仪检测Gfi1敲除小鼠的最低造血干细胞用量(以人源化白细胞数目为标准)。
图20：Gfi1-CDX小鼠构建策略及流式细胞仪检测人源化小鼠人源嗜中性粒细胞动态。
图21：利用CRISPR Cas9技术构建人源化免疫系统小鼠的流程图。
图22：NCG-Gfi1-KO小鼠Gfi1的mRNA表达水平检测结果图(脾、结肠)；其中，+/+代表NOD/ShiLtJGpt-Il2rg-KO，-/-代表NCG-Gfi1-KO纯合子(homozygote)。
图23：NCG-Gfi1-KO小鼠Gfi1的蛋白表达水平检测结果图；其中，WT/WT代表NOD/ShiLtJGpt-Il2rg-KO，KO/KO代表NCG-Gfi1-KO纯合子(homozygote)。
图24：NCG-Gfi1-KO小鼠外周血、骨髓中中性粒细胞和单核细胞的比例及分布(流式细胞术检测)；其中，+/+代表NOD/ShiLtJGpt-Il2rg-KO，-/-代表NCG-Gfi1-KO纯合子(homozygote)。
图24A具体为以mCD45+细胞得到的小鼠外周血中中性粒细胞的比例及分布(流式细胞术检测)；
图24B具体为以mCD45+细胞统计得到的小鼠外周血中单核细胞的比例及分布(流式细胞术检测)；
图24C具体为以mCD45+细胞得到的小鼠骨髓中中性粒细胞的比例及分布(流式细胞术检测)；
图24D具体为以mCD45+细胞统计得到的小鼠骨髓中单核细胞的比例及分布(流式细胞术检测)。
图25：NCG-Gfi1-KO小鼠外周血、骨髓中中性粒细胞和单核细胞的比例统计学结果；其中，+/+代表NOD/ShiLtJGpt-Il2rg-KO，-/-代表NCG-Gfi1-KO纯合子(homozygote)。
图25A具体为以mCD45+细胞统计得到的小鼠中性粒细胞占比结果；
图25B具体为以mCD45+细胞统计得到的小鼠单核细胞占比结果。
下文中的实施方式仅仅是为了阐释本发明的细胞，人源化免疫系统的小鼠、其制备方法及应用，而不用于限制本发明发明的范围。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本发明发明的其他优点及效果。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本发明中，术语“同源重组”通常是指一种遗传重组类型，其中核苷酸序列在被称为同源序列或同源臂的两个相似或相同的DNA分子之间交换。
在本发明中，术语“基因敲除”是指通过同源重组使特定靶基因失活。
在本发明中，术语“CRISPR”通常是指成簇的规则间隔的短回文重复序列。CRISPR基因座通常与其他SSR的不同之处在于重复序列的结构，这些重复序列被称为短规则间隔重复序列(SRSR)。通常，重复序列是短的元件，以规则间隔的簇出现，具有基本恒定长度的独特插入序列。菌株之间的重复序列高度保守，但是散布的重复序列的数目和间隔区的序列通常因菌株而异。
在本发明中，术语“CRISPR Cas9技术”也可称为“Cas9-gRNA系统”,通常是指用于生物体中位点特异性基因组靶向的工具。例如，它可以是Ⅱ型CRISPR/Cas系统，它是一种原核适应性免疫反应系统，该系统使用非编码RNA指导Cas9核酸酶诱导位点特异性DNA切割。通过细胞DNA修复机制，可以通过非同源末端连接DNA修复途径(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)途径修复这种DNA损伤。可以利用CRISPR/Cas9系统创建一种简单的RNA可编程方法来介导哺乳动物细胞中的基因组编辑，并可以用于生成基因敲除(通过插入/缺失)或敲入(通过HDR)。
在本发明中，术语“纯合子”是针对特定基因或DNA(例如已被敲入的异源核酸序列)使用的，并且是指二倍体细胞或生物。这两个同源染色体都具有相同的等位基因或基因/DNA拷贝。
在本发明中，术语“杂合子”是针对特定基因或DNA(例如已被敲入的异源核酸序列)使用的，并且是指二倍体细胞或生物。这两个同源染色体具有不同的基因或DNA等位基因/拷贝/版本。
在本发明中，独立生长因子1(growth factor independence 1，Gfi1)，是锌指蛋白家族中重要的转录抑制子，其主要通过与染色质修饰分子结合从而抑制靶基因转录，并与造血细胞发生、免疫细胞分化和恶性肿瘤进展密切相关。
在本发明中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。以下实施例及试验例中实验小鼠购买于江苏集萃药康生物科技股份有限公司，引物购自金斯瑞生物科技有限公司。其他实验用品如未经说明，均为市售商品。
1.获得Gfi1基因失活小鼠细胞的过程如下：
通过非同源性末端接合、同源重组、插入突变和干扰RNA技术中的任意一种，对小鼠细胞Gfi1基因进行基因编辑，使Gfi1基因失活，从而获得该小鼠细胞。
在某些实施例中，该Gfi1基因失活的小鼠细胞可以是受精卵细胞、全能干细胞或任何一种能够发育成完整个体的细胞。
备选地，该Gfi1基因失活的小鼠细胞可直接获自本发明提供的小鼠或其功能活性部分。
2.利用CRISPR Cas9技术敲除Gfi1基因的过程如下：
确定NOD小鼠待敲除基因Gfi1(Gene ID：103170)的特异性靶位点。
在小鼠基因组数据库ensembl(http://asia.ensembl.org)中找到小鼠Gfi1基因DNA序列，然后使用在线设计软件CRISPOR(http://crispor.tefor.net/crispor.cgi)，确定在小鼠Gfi1基因的exon6(exon ID：ENSMUSE00001072804)内挑选特异性位点作为sgRNA的靶序列，靶序列为：
AAGATCTGTGGCAAGAGCTTCAAGAGGTCATCCACGCTGTCCACACATCTGCTCATTCACTCGGACACCCGGCCCTATCCCTGT。
敲除序列参加附图1，是对Gfi1基因第六外显子进行了敲除操作；未敲除、杂合敲除和纯合敲除Gfi1基因的琼脂糖凝胶图参见附图2。
引物信息如下：
PCR反应体系如下：
试剂 体积(ul) 规格
10X Buffer 2.5
ddH2O 16.75
Primer 1 10uM
Primer 1 10uM
Mg2+ 2 25mM
dNTPs 0.5 10mM each
Taq 0.25 5U/ul
Template 1
PCR程序如下：
3.敲除小鼠Prkdc和IL2Rγc基因的方法
NOG,NSG,NCG小鼠均为Prkdc和IL2Rγc敲除的常规免疫缺陷型小鼠品系,可以在市场购得。将获得的Gfi1基因敲除小鼠和上述品系杂交，在经过基因鉴定、纯合敲除筛选即可在Gfi1纯合敲除的基础上，获得Prkdc和IL2Rγc敲除的免疫缺陷型小鼠品系，包括NOD-prkdcscid-IL2Rγc-/--Gfi1-/-,NOD-prkdcscid-Gfi1-/-,NOD-prkdcscid-IL2Rγc-/--X-Gfi1-/-,NOD-prkdcscid-X-Gfi1-/-等。其中，
NOD-prkdcscid-IL2Rγc-/--Gfi1-/-小鼠：巨噬细胞、树突状细胞功能性缺陷，缺少T,B,NK,ILC淋巴细胞和粒细胞；
NOD-prkdcscid-Gfi1-/-小鼠：巨噬细胞、树突状细胞功能性缺陷，缺少T,B淋巴细胞和粒细胞；
NOD-prkdcscid-IL2Rγc-/--X-Gfi1-/-小鼠：巨噬细胞、树突状细胞功能性缺陷，缺少T,B,NK,ILC淋巴细胞和粒细胞，造血干细胞和前体细胞受损；
NOD-prkdcscid-X-Gfi1-/-小鼠：巨噬细胞、树突状细胞功能性缺陷，缺少T,B淋巴细胞和粒细胞，造血干细胞和前体细胞受损。
人源化小鼠F0代基因型鉴定引物：
Gfi1-Forward：5’-CCTGTGTGGATGAAGGTGTG-3’；
Gfi1-Reverse：5’-TCCTCCTCTCTTCCTCTCTGC-3’。
4.小鼠的人源化建模过程
1)注射剂量：
目前本领域研究中，注射的造血干细胞的参考剂量如下：
参考上述剂量，本发明对每只小鼠注射造血干细胞的参考剂量为：5×104个，即对每只小鼠，一次性注射的剂量为5×104个细胞。
2)注射方式：注射方式：静脉注射，骨髓腔内注射或肝内注射。
3)注射时间：新生鼠出生后一周内，优选为3～6天。
4)干细胞来源：人胎肝来源干细胞。
实施例1
1)实验目的：
评估Gfi1基因失活对小鼠免疫细胞的影响
2)实验操作：
本实施例利用CRISPR Cas9技术敲除NOD-Prkdcscid小鼠细胞的Gfi1基因，选择如下靶向序列对Gfi1基因进行敲除：
AAGATCTGTGGCAAGAGCTTCAAGAGGTCATCCACGCTGTCCACACATCTGCTCATTCACTCGGACACCCGGCCCTATCCCTGT。
获得Gfi1基因失活的小鼠细胞。
3)实验结果：
独立生长因子1(growth factor independence 1，Gfi1)，是锌指蛋白家族中重要的转录抑制子，其主要通过与染色质修饰分子结合从而抑制靶基因转录，并与造血细胞发生、免疫细胞分化和恶性肿瘤进展密切相关。
目前对小鼠的人源化过程，需要先破坏小鼠自身的免疫系统。为此，需要通过基因编辑技术，使相应基因失活，从而获得免疫缺陷小鼠。现有研究中的免疫系统缺陷鼠包括：prkdcscid鼠，即小鼠prkdc基因失活，造成小鼠缺失T和B淋巴细胞；L2Rγc-/-鼠：即小鼠IL2Rγchain基因失活，造成小鼠缺失NK，ILC淋巴细胞；Gfi1-/-鼠：即小鼠Gfi1基因失活，造成小鼠缺失粒细胞；X点突变小鼠，即c-kit基因失活，代表小鼠造血干细胞和前体细胞受损。其中
近年来研究表明，Gfi1分子在多种疾病中以不同机制发挥功能。Gfi1基因影响骨髓前体细胞(myeloid precursors)向粒细胞(granulocytes)和单核细胞(monocytes)，抑制炎症反应。Gfi1基因在骨髓重建、造血干细胞的更新和多向分化中起重要作用。
图22显示了NCG-Gfi1-KO小鼠脾脏和结肠中Gfi1mRNA的表达水平检测结果，从图22可以看出，NCG-Gfi-KO小鼠的Gfi1 mRNA转录水平明显降低(甚至完全不表达)。
图23显示了NCG-Gfi1-KO小鼠脾脏中Gfi1蛋白的表达水平检测结果，从图23可以看出，NCG-Gfi-KO小鼠的Gfi1蛋白表达明显降低(甚至完全不表达)。
图24显示了以流式细胞术检测到的NCG-Gfi1-KO小鼠外周血、骨髓中中性粒细胞和单核细胞的比例及分布情况；图25显示了NCG-Gfi1-KO小鼠外周血、骨髓中中性粒细胞和单核细胞的比例统计学结果。从图中可以看出，NCG-Gfi-KO小鼠外周血及骨髓中的中性粒细胞缺失，单核细胞增多。
因此对Gfi1分子的研究将有助于理解相关疾病的发病机制,并对预测恶性肿瘤的靶标有提示作用。
实施例2
1)实验目的：
评估Gfi1基因失活小鼠与Gfi1非基因失活小鼠嗜中性粒细胞水平的差异2)实验操作：
本发明提供一种人源化免疫系统的小鼠，该小鼠由实施例1中的Gfi1细胞发育而来，该小鼠在其生长过程中未经辐射照射的人源化过程，并具有重建的次级淋巴组织。具体地，该小鼠重建的次级淋巴组织包括重建的肠道派氏淋巴集结(Peyer patch)。在本实施例中，该小鼠为NCG小鼠。所述NCG小鼠是一种重度免疫缺陷小鼠，该小鼠的T细胞、B细胞和NK细胞均缺陷。
3)实验结果：
Gfi1基因是调节嗜中性粒细胞形成的关键基因。Gfi1基因敲除后，小鼠嗜中性粒细胞的发育停滞，在小鼠体内几乎检测不到。在对免疫缺陷小鼠敲除其Gfi1基因，造成嗜中性粒细胞缺失后，为人源嗜中性粒细胞的重建腾出来空间。在其基础上进行人源化建模，可以实现在外周免疫微环境中重建出人源嗜中性粒细胞。
此外，Gfi1敲除策略可以替代传统的IL2 receptorγchain敲除策略。在现有小鼠模型的基础上，选择不敲除IL2Rγc，而直接敲除Gfi1，可在不牺牲小鼠次级淋巴组织发育照的前体下实现同等水平的人源化。
小鼠嗜中性粒细胞参与小鼠NK细胞成熟和功能，在Gfi1基因失活小鼠中，成熟NK细胞也出现下降。并且Gfi1也参与调控小鼠多种免疫细胞前体发育，因此，在Gfi1敲除小鼠中，小鼠的多种免疫祖细胞数量减少。因此，在Gfi1基因失活的免疫缺陷小鼠中可以实现免辐照的高水平人源化重建。
实施例3
1)实验目的：
评估Gfi1基因失活对小鼠体内鼠源免疫细胞的影响
2)实验操作：
实验组：利用CRISPR Cas9技术敲除NOD-Prkdcscid小鼠的Gfi1基因，获得了NOD-Prkdcscid-Gfi1-/-小鼠。
对照组：未敲除Gfi1基因的NOD-Prkdcscid小鼠。
3)实验结果：
本实施例对两组小鼠的体重进行了长期监测，结果参加附图3，其中NS表示NOD-Prkdcscid小鼠，+/+代表Gfi1基因的纯合子小鼠，+/-代表Gfi1基因的杂合子小鼠，-/-代表Gfi1基因敲除的纯合子小鼠。图3表明，敲除Gfi1基因对小鼠体重并无影响，两组小鼠的体重不存在显著性差异。
附图4表明Gfi1基因敲除对小鼠外周血白细胞和骨髓细胞数量的影响，Gfi1基因敲除的NOD-Prkdcscid-Gfi1-/-小鼠的外周血白细胞数量，骨髓细胞数量明显下降。
为比较NOD-Prkdcscid-Gfi1-/-小鼠与NOD-Prkdcscid小鼠鼠源免疫细胞发育的差别，用流式细胞仪分别检测小鼠骨髓造血免疫祖细胞水平，骨髓、外周血白细胞和脾脏成熟NK细胞的水平，以及外周血，脾脏、肺部和骨髓中的外周血嗜中性粒细胞水平，结果参见附图5，6，7，8和9。
附图5是小鼠外周血中成熟NK细胞占整体白细胞的比例，附图6是脊柱中成熟NK细胞占整体白细胞的比例，两者都说明，敲除Gfi1基因的小鼠外周血中和脊柱中的成熟NK细胞大幅减少。附图7表明，Gfi1基因敲除后，小鼠骨髓、脾脏、外周血、肺的嗜中性粒细胞显著减少。附图8流式细胞仪中CD11b标记的是单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞，NK细胞等免疫细胞的情况，其表明，和对照组NOD-Prkdcscid小鼠相比，实验组小鼠体内免疫细胞数量明显下降。附图9表明，Gfi1基因敲除的小鼠，造血祖细胞数量出现明显下降。
综上，敲除小鼠Gfi1基因可清除小鼠体内的鼠源免疫细胞。
实施例4
1)实验目的：
评估敲除小鼠Gfi1基因与敲除小鼠IL2Rγc基因失活小鼠，对小鼠肠道派氏淋巴集结(Peyer patch)的影响
2)实验操作：
Gfi1组：通过CRISPR Cas9技术使NOD-Prkdcscid小鼠的Gfi1基因失活。待小鼠成年后，通过芝加哥天空蓝染料，记录外周淋巴结重建情况。对脾脏、胸腺等可通过苏木精-伊红染色法(HE染色法)切片进行观察。对于肠道派氏淋巴集结(Peyer patch)可以通过直接计数的方式，进行比较。
IL2Rγc组：利用上述CRISPR Cas9技术敲除小鼠IL2Rγc基因。
4)实验结果：
结果参见附图10，11，12和13，Gfi1敲除策略导致免疫缺陷型小鼠的次级淋巴组织诱导生成细胞(LTi)没有减少，可以不损害淋巴结等小鼠次级淋巴组织，从而实现正常数量的淋巴结，脾脏和胸腺发育较IL2Rγc敲除策略的免疫缺陷小鼠明显改善，可以观察到肠道派氏淋巴集结(Peyer patch)。HE切片结果也显示，保留IL2Rγc基因而敲除Gfi1，可以不损害脾脏、淋巴结、胸腺等小鼠次级淋巴组织。
综上，敲除Gfi1基因的同时保留IL2受体γ链基因IL2Rγc，可使小鼠具备完善的淋巴组织，重建出的完整的人源免疫细胞亚群并且具有完善的功能性，从实验数据来看，本方法获得的人源化小鼠次级淋巴组织生长发育良好。
实施例5
1)实验目的：
评估NCG小鼠和NCG-Gfi1-/-小鼠的人源化建模效果
2)实验操作：
实验组：利用上述CRISPR Cas9技术敲除NCG小鼠的Gfi1基因，将获得的Gfi1基因敲除的小鼠，通过肝内注射造血干细胞的方式进行了人源化建模过程。
对照组：对未敲除Gfi1基因的NCG小鼠进行亚致死性辐照，剂量是60cGy，之后同样通过肝内注射造血干细胞的方式进行了人源化建模过程
将实验组与对照组小鼠的人源化达标情况对比。
3)实验结果：
目前判定人源化小鼠重构成功的标准为10周人源化百分比达到10％或外周血中人的白细胞占比达到105/ml。根据这一条件，NCG和NCG-Gfi1-/-小鼠的人源化达标情况如下表所示：
注射造血干细胞8周的Gfi1-/-人源化小鼠的人源化水平要显著好于注射造血干细胞12周后NCG小鼠的情况，目前人源化构建成功率100％，平均人源化水平40％左右。
人的嗜中性粒细胞发育有多种描述方式，本实施例以N1-N5五阶段方式的形式描述人源化小鼠中人源嗜中性粒细胞的发育情况(参见文献Coexpression of CD71 andCD117 Identifies an Early Unipotent Neutrophil Progenitor Population in HumanBone Marrow，Immunity，2020)。
结果参见附图14，15和16。结果表明，对NCG小鼠可以实现实现超高水平的人源化重建，并支持粒细胞生成。Gfi1敲除的人源化小鼠的人源粒细胞发育比非敲除小鼠更加成熟，同时使用Gfi1敲除的人源化小鼠可以模拟人源嗜中性粒细胞在肿瘤免疫微环境下的动态。
综上，在Gfi1敲除的小鼠中可以实现快速、稳定、高水平的人源化重建过程，并且大大提高人源化构建的成功率，缩短构建过程，节约造血干细胞的使用量，降低构建人源化的成本。
实施例6
1)实验目的：
评估Gfi1基因失活对BALB/c小鼠鼠源嗜中性粒细胞的影响
2)实验操作：
对实验组小鼠，敲除BALB/c小鼠的Gfi1基因，之后测定Gfi1基因敲除后BALB/c小鼠的骨髓，脾脏，肺脏和血液中嗜中性粒细胞的百分比。
同时，以Gfi1基因未敲除小鼠作为对照组进行比较。
3)实验结果：
其中，+/+代表Gfi1基因的纯合子小鼠，+/-代表Gfi1基因的杂合子小鼠，-/-代表Gfi1基因敲除的纯合子小鼠。
结果参见附图17，可以观察到，与Gfi1基因纯合子BALB/c-Gfi1+/+小鼠以及Gfi1基因杂合子BALB/c-Gfi1+/-小鼠相比，Gfi1基因失活的BALB/c-Gfi1-/-小鼠中鼠源嗜中性粒细胞下降的程度非常明显，尤其是外周血(血液、脾脏、肺脏)中，几乎观察不到嗜中性粒细胞的存在，表明鼠源嗜中性粒细胞几乎消失。
综上，在BALB/c小鼠背景下进行Gfi1基因敲除，同样对小鼠嗜中性粒细胞造成极大损害。
实施例7
1)实验目的：
在人源化建模过程中，Gfi1基因失活的NCG-Gfi1-/-小鼠干细胞注射剂量的优化
2)实验操作：
对照组：以NCG小鼠作为对照，先进行亚致死性辐照，剂量是60cGy，之后对每只小鼠通过静脉注射造血干细胞的剂量为5×104，并以该剂量作为参考剂量。
实验组：对敲除Gfi1基因的NCG-Gfi1-/-小鼠，无亚致死性辐照过程，注射造血干细胞进行人源化建模，对每只小鼠采取的四种剂量分别为参考剂量，1/2参考剂量，1/4参考剂量和1/8参考剂量四种。
3)实验结果：
注射造血干细胞8周左右，检测两者人源化水平和人源嗜中性粒细胞重建情况。
结果参见附图18和19。人源免疫系统可以在注射1/4参考剂量造血干细胞的NCG-Gfi1-/-小鼠中完全稳定重建，在注射1/8参考剂量造血干细胞的NCG-Gfi1-/-小鼠中大部分稳定重建；人源化过程需要8到10周；待小鼠成年后，与同等情况下人源化NCG小鼠相比，该人源化小鼠中人类嗜中性粒细胞增加10～20％。
综上，从开始注射造血干细胞至人源化完成这一过程从NOG，NSG或NCG人源化小鼠制备所需的12周左右缩短至8周左右，极大节省了时间。在人源化过程中需要注射的造血干细胞的剂量大大减少，最低可以低至NOG，NSG或NCG人源化小鼠制备所需参考剂量的1/8，大幅减少了造血干细胞的使用剂量，极大地降低了成本。
实施例8
1)实验目的：
在人源化建模过程中，Gfi1基因失活的BALB/c-Gfi1-/-小鼠的干细胞注射剂量的优化
2)实验操作：
对照组：以BALB/c小鼠作为对照，先进行亚致死辐照过程，剂量为60cGy，之后对每只小鼠通过静脉注射造血干细胞的剂量为5×104个，并以该剂量作为参考剂量。
实验组：对敲除Gfi1基因的BALB/c-Gfi1-/-小鼠，无亚致死辐照过程，直接注射造血干细胞进行人源化建模，对每只小鼠采取的四种剂量分别为上述参考剂量，1/2参考剂量，1/4参考剂量和1/8参考剂量四种。
3)实验结果：
注射造血干细胞8周左右，检测人源化水平和人源嗜中性粒细胞重建情况
结果表明：人源免疫系统可以在注射1/4参考剂量造血干细胞的BALB/c-Gfi1-/-小鼠中完全稳定重建，在注射1/8参考剂量造血干细胞的BALB/c-Gfi1-/-小鼠中大部分稳定重建；人源化过程需要8到10周；待小鼠成年后，与同等情况下人源化BALB/c小鼠相比，该人源化小鼠中人类嗜中性粒细胞增加10～20％。
综上，即使在BALB/c小鼠背景下，Gfi1敲除的人源化小鼠仍可以大大节约造血干细胞用量，缩减构建人源化小鼠的成本；同时可以极大地缩短人源化过程，节省时间。
应用例1
1)实验目的：
将Gfi1基因失活的人源化小鼠应用于肿瘤学，验证其是否支持肿瘤细胞系(Cell-line-derived xenograft，CDX)的成瘤性
2)实验操作：
本应用例以人黑色素瘤A375细胞-人源肿瘤组织异种移植模型为例，对5～8周的Gfi1-/-人源化小鼠进行CDX接种，每只小鼠皮下注射5×106个/100ul，之后观察肿瘤生长情况。
3)实验结果：
对A375-Gfi1-/-CDX模型小鼠，4周后检测嗜中性粒细胞动态情况。实验表明，该肿瘤细胞系在所述小鼠上有较好的成瘤率，肿瘤小鼠的外周血不成熟嗜中性粒细胞增多，人源嗜中性粒细胞动态，尤其是不成熟嗜中性粒细胞增多。而使用Gfi1未敲除NCG小鼠构建的人源化小鼠模型，因不支持人源嗜中性粒细胞的重建，所以用于Gfi1-/-人源化小鼠进行成瘤研究更加贴合实际情况，参见附图20。
本发明提供的新一代人源化免疫系统小鼠的制备方法，将注射造血干细胞的剂量减少为原参考剂量的八分之一，减少了造血干细胞的使用成本。因免去了亚致死性辐照过程，简化了操作流程。不仅解决了小鼠抗辐照能力差的问题，降低了小鼠感染的风险，而且使人源化过程从十二周缩短至八周，节省了人源化所需时间，无需辐照，节省了辐照仪和相关配套设施的经济支出，也保障了操作人员的安全。
同时，上述过程选择敲除Gfi1基因而不是敲除IL2Rγc基因，因此可保留淋巴结和肠道派氏淋巴集结(Peyer patch)，弥补次级淋巴组织缺陷，重建出了人源免疫细胞亚群并增强该亚群的功能性，获得的小鼠模型可以进行多种免疫学实验。
相比与普通小鼠，Gfi1-/-小鼠具有快速高水平人源化的优势，支持外周人源嗜中性粒细胞的重建，可以用来研究特殊免疫情况下的嗜中性粒细胞动态和功能，从而推动人源化小鼠模型在更大的范围内的应用。

Claims (10)

1.一种基因修饰的小鼠细胞，其特征在于，该小鼠细胞的Gfi1基因失活。
2.根据权利要求1所述的小鼠细胞，其特征在于，所述Gfi1基因失活的小鼠细胞是通过非同源性末端接合、同源重组、插入突变和干扰RNA技术中的任意一种技术获得的；或
通过对细胞Gfi1基因进行基因编辑获得该小鼠细胞；或
通过敲除该细胞Gfi1基因获得该小鼠细胞。
3.根据权利要求1所述的小鼠细胞，其特征在于，所述Gfi1基因失活的小鼠细胞包括体细胞、受精卵细胞、全能干细胞或其他任一种小鼠细胞。
4.一种具有人源化免疫系统的小鼠，其特征在于，所述小鼠包含权利要求1-3中任一项所述的细胞或由权利要求1-3中任一项所述细胞发育而来。
5.根据权利要求4所述的小鼠，其特征在于，所述小鼠在其生长过程中未经辐射照射。
6.根据权利要求5所述的小鼠，其特征在于，所述小鼠具有重建的次级淋巴组织；优选为重建的肠道派式淋巴集结。
7.一种人源化免疫系统小鼠的构建方法，其特征在于：该方法为构建含有权利要求1-3中任一所述细胞的小鼠的方法或将权利要求1-3中任一所述细胞发育成小鼠个体的方法，并在小鼠幼体阶段对其注射人源造血干细胞；
优选为在构建过程中不对小鼠幼体进行辐射照射；或
优选为注射造血干细胞的剂量大于6.25×103个/只。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)利用CRISPR Cas9技术敲除免疫缺陷型小鼠受精卵细胞的Gfi1基因；
2)将Gfi1基因敲除的受精卵细胞移植进入假孕雌鼠获得F0代小鼠，并筛选出Gfi1基因敲除的小鼠；
3)将Gfi1基因敲除的小鼠进行回交和自交获得Gfi1基因敲除的纯合子小鼠；
4)将步骤3)中获得的纯合子小鼠同现有免疫缺陷型小鼠进行交配获得免疫缺陷型小鼠；
5)对步骤4)中获得的免疫缺陷型小鼠注射人源造血干细胞。
9.一种权利要求1-3中任意一项所述的细胞在构建人源化免疫系统小鼠中的应用或在医学研究中的应用。
10.一种权利要求4-6中任意一项所述的小鼠或按照权利要求7或8中所述方法构建得到的小鼠在医学研究中的应用。
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