CN113897399A - 一种scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用 - Google Patents
一种scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113897399A CN113897399A CN202111016236.0A CN202111016236A CN113897399A CN 113897399 A CN113897399 A CN 113897399A CN 202111016236 A CN202111016236 A CN 202111016236A CN 113897399 A CN113897399 A CN 113897399A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- zebra fish
- gene
- seq
- scn1lab
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 title claims abstract description 72
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 title claims abstract description 26
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 title description 8
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 19
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 8
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 101000631760 Homo sapiens Sodium channel protein type 1 subunit alpha Proteins 0.000 abstract description 5
- 102100028910 Sodium channel protein type 1 subunit alpha Human genes 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 8
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 201000007547 Dravet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000036572 Myoclonic epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010073677 Severe myoclonic epilepsy of infancy Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000001037 epileptic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 230000007233 immunological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 108700024526 zebrafish sox32 Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/40—Fish
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明通过CRISPANT技术,在斑马鱼scn1lab基因第三个外显子上插入6bp片段同时缺失2bp片段,选育出scn1lab基因缺失型斑马鱼,从而构建斑马鱼癫痫模型。本发明使用两个sgRNA靶向同一基因,可以最大限度地提高编辑效率,更有效进行基因编辑。本发明提供的斑马鱼癫痫模型为进一步开展SCN1A突变与癫痫发病机制的关系研究及筛选抗癫痫药物奠定了很好的基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因敲除技术领域,具体涉及一种scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用。
背景技术
CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中,CRISPR系统共分成3类,其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。目前,CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。研究人员发现使用多个sgRNA靶向同一基因,可以最大限度地提高编辑效率,并将这种方法命名为CRISPANT技术。
在前期的文献调研中筛选到可以引起癫痫疾病(Dravet syndrome)的基因SCN1A。斑马鱼作为脊椎动物,具有复杂的神经系统,遗传结构与人类相似,约70%的基因与人类共享,约84%的人类疾病已知相关基因也在斑马鱼中表达。与小鼠等啮齿类动物相比,斑马鱼遗传操作简单,更适合用于制备癫痫模型。且斑马鱼scn1lab基因进化上较为保守,研究发现scn1lab在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。因此,本发明旨在利用CRISPANT技术建立scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型,该斑马鱼系可用于研究SCN1A突变与癫痫发病机制的关系及后续抗癫痫药物筛选。
发明内容
本发明提供一种scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用,以为进一步开展SCN1A突变与癫痫发病机制的关系研究及筛选抗癫痫药物奠定基础。
本发明采用以下技术方案:
本发明第一方面提供了一种斑马鱼癫痫模型,是利用sgRNA组合敲除斑马鱼scn1lab基因来构建,所述sgRNA组合序列如SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.4所示,所述敲除斑马鱼scn1lab基因是在斑马鱼scn1lab基因第三个外显子上插入6bp片段同时缺失2bp片段,其序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明第二方面提供了一种sgRNA组合在构建斑马鱼癫痫模型中的应用,是利用sgRNA组合敲除斑马鱼scn1lab基因来构建斑马鱼癫痫模型,所述sgRNA组合序列如SEQ IDNO.3至SEQ ID NO.4所示,所述敲除斑马鱼scn1lab基因是在斑马鱼scn1lab基因第三个外显子上插入6bp片段同时缺失2bp片段,其序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明第三方面提供了所述斑马鱼癫痫模型在筛选抗癫痫药物中的应用。
本发明第四方面提供了一种斑马鱼癫痫模型的构建方法,包括如下步骤:
1)、靶向CRISPANT基因的sgRNA组合和检测引物的筛选:sgRNA组合序列如SEQ IDNO.3至SEQ ID NO.4所示,检测引物序列如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6所示;
2)、将2个sgRNA和Cas9蛋白混合物注射到斑马鱼的受精卵中;
3)、F0代突变斑马鱼筛选:筛选出敲除有效的胚胎,培养至成鱼,获得F0代突变斑马鱼;
4)、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代:将F0代突变斑马鱼与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,筛选存在突变的胚胎,培养至成鱼,筛选得到可遗传的斑马鱼突变体的F1代,其与野生型相比,scn1lab基因第三个外显子上插入6bp片段同时缺失2bp片段,其序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明的有益效果是:
本发明利用CRISPANT特异性敲除斑马鱼scn1lab基因构建斑马鱼癫痫模型的sgRNA组合,通过CRISPANT技术,成功在斑马鱼scn1lab基因第三个外显子上插入6bp片段缺失2bp片段,选育出scn1lab基因突变型斑马鱼,从而构建斑马鱼癫痫模型。
本发明使用两个sgRNA靶向同一基因,可以最大限度地提高编辑效率,更有效进行基因编辑。
本发明提供的斑马鱼癫痫模型为进一步开展SCN1A突变与癫痫发病机制的关系研究及筛选抗癫痫药物奠定了很好的基础。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9敲除原理图。
图2为scn1lab基因上打靶位点在基因组上的序列位置图。
图3为4条sgRNA电泳检测图(M表示为DNA Marker,从下向上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp、1000bp;编号1、2、3、4分别为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4)。
图4为4条sgRNA活性验证电泳图(M表示为DNA Marker,从下向上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp、1000bp;编号1、2、3为sgRNA1单靶注射后胚胎,编号4、5、6为sgRNA2单靶注射后胚胎,编号7、8、9为sgRNA3单靶注射后胚胎,编号10、11、12为sgRNA4单靶注射后胚胎,WT为野生型)。
图5为scn1lab F0代基因型鉴定电泳图(M表示为DNA Marker,从下向上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp、1000bp;编号1-23表示为F0代剪鱼尾序号,WT为野生型)。
图6为scn1lab F1代基因型鉴定电泳图(M表示为DNA Marker,从下向上依次为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、700bp、1000bp;编号1-17表示为F1代剪鱼尾序号,WT为野生型)。
图7为scn1lab F1代野生型与突变体测序峰图对比。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细地说明。下列实施例仅用于说明本发明,但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1
1)设计CRISPANT基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼scn1lab基因的基因组DNA序列(基因编号为:Gene ID:559447),根据CRISPR/Cas9敲除原理(图1),在网站The ZFIN(https://zfin.org/)上设计scn1lab基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准:5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分,设计靶位点时可以不受此限制,但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内,以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响scn1lab基因的整个结构域,从而来改变基因的表达。待敲除基因的靶位点位于scn1lab基因的第三个外显子(图2),sgRNA序列如表1所示。
表1 sgRNA序列
取scn1lab基因的CRISPANT靶位点上下游约200bp的基因组区域于PrimerPremier 3.0软件中设计引物(如表2所示)。
表2引物序列
2)sgRNA合成及质检
使用以上设计好的引物,进行PCR实验检测设计好的sgRNA序列是否有误。确认无误后,将设计好的sgRNA送往商业公司(南京金斯瑞生物科技有限公司,以下简称南京金斯瑞)进行合成。
将收到的四条sgRNA以14000rpm的转速离心10min,沉淀RNA干粉。随后加入15μL的RNase-free双蒸水溶解RNA干粉。对溶解好的四条sgRNA进行质量检测。
首先,取1μL sgRNA溶液于紫外分光光度计上检测浓度,记录每条sgRNA的浓度及OD260/280数据。其次,取1μL sgRNA溶液与loading buffer混合进行琼脂糖凝胶电泳,检测sgRNA是否为单一条带。若sgRNA浓度较高(至少高于600ng/μL),且电泳条带为均一条带,则可进行显微注射实验。结果如图3所示,表明4条sgRNA条带均为单一条带,不含杂质,且浓度较高,可进行显微注射实验。
3)单条sgRNA的活性验证
在进行正式打靶之前,需先测试设计的sgRNA是否能有效编辑。故而进行单条sgRNA的活性验证。将Cas9蛋白(南京金斯瑞,Z03389-50)分别和4个不同的sgRNA按表3体系进行络合,使Cas9蛋白的终浓度为250ng/μl,sgRNA的终浓度为100ng/μl。注射约1nL Cas9蛋白和sgRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水中,28℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型,筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析。
表3 sgRNA与cas9蛋白络合体系
4)Sanger测序检测sgRNA的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎,检测其scn1lab基因是否存在突变,提前确认此次选择的靶位点是否有效果,显微注射操作是否规范。
a、提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精24小时后(24hpf),分别收集野生型1管(做对照)和注射后实验组胚胎(各个实验组分别3管)于1.5mL Ep管中(每管5颗胚胎),加入裂解液提取基因组DNA。
b、PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后,使用表2引物序列,表4PCR反应体系扩增出目的DNA片段。
表4 PCR反应体系
震荡混匀之后离心,于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为:预变性95℃5min,(变性95℃30s,退火56℃30s,延伸72℃30s)35个循环,再72℃8min。待反应结束后,离心PCR产物,取2μL样品点样于1.3%琼脂糖凝胶上进行电泳,检测PCR产物大小是否正确。
c、若PCR产物正确,送PCR产物进行Sanger测序,如图4所示,结果表明,条带单一,可送往商业公司(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行Sanger测序,由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息,经tide网站比对后得出sgRNA敲除效率,确定sgRNA有效后,进行正式注射,结果如表5所示。
表5单个sgRNA敲除效率
sgRNA1 | sgRNA2 | sgRNA3 | sgRNA4 | |
敲除效率 | 0% | 0% | 34.6% | 30.6% |
4)斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30min之内,用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中。
由于Sanger测序检测到sgRNA1、sgRNA2打靶无效,故而选择sgRNA3、sgRNA4进行打靶。在进行显微注射之前,将Cas9蛋白和2个不同的sgRNA充分混匀配成一混合液,使Cas9蛋白的终浓度为250 ng/μl,每个sgRNA的终浓度为100ng/μl。注射约1nL Cas9蛋白和sgRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水中,28℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型,筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析。
选取3管胚胎(每管5枚)检测打靶敲除效率,检测步骤同上,确定敲除有效后,将剩余胚胎养大至两月龄。
5)F0代突变斑马鱼筛选
a、提取斑马鱼基因组
胚胎养至两月龄后,收集斑马鱼成鱼的部分尾鳍组织于1.5mL离心管中,向EP管中加入裂解液提取基因组DNA。
b、PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后,使用表2引物序列,表4 PCR反应体系扩增出目的DNA片段。反应条件为:预变性95℃5min,(变性95℃30s,退火56℃30s,延伸72℃30s)35个循环,再72℃8min。待反应结束后,离心PCR产物,取2μL样品点样于1.3%琼脂糖凝胶上进行电泳,检测PCR产物大小是否正确。
c、若PCR产物正确,送PCR产物进行Sanger测序,实验结果如图5所示,结果表明条带单一,可送往商业公司(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行Sanger测序,由测序的峰图来获得插入或缺失的信息。筛选出携带有突变的F0代斑马鱼。
6)获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代,紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,置于28℃培养,在初期观察F1代的存活率。
如果从F1代胚胎中检测到存在突变,则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月。再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾,筛选F1代突变体(具体方法如步骤5)所述),实验结果如图6所示,结果表明条带单一,可送往商业公司(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行Sanger测序。根据已筛选到的F1代突变体的Sanger测序结果分析,如图7所示,根据测序峰图可知,与野生型序列相比,scn1lab突变体在第三个外显子插入6bp片段同时缺失2bp片段,引起移码突变。红色方框表示sgRNA3序列,蓝色方框部分为缺失2bp片段。插入6bp片段序列:AGGTTT,缺失2bp片段序列:GG。
<110> 浙江赛微思生物科技有限公司
<120> 一种scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> scn1lab-sgRNA1(人工序列)
<400> 1
cccacgattc aaaactataa agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> scn1lab-sgRNA2(人工序列)
<400> 2
acctttatag ttttgaatcg tgg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> scn1lab-sgRNA3(人工序列)
<400> 3
cctttatagt tttgaatcgt ggg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> scn1lab-sgRNA4(人工序列)
<400> 4
tatagttttg aatcgtggga agg 23
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> scn1lab-F(人工序列)
<400> 5
cgtacatctt agcgttcc 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> scn1lab-R(人工序列)
<400> 6
gtgtttactc cctttcca 18
<210> 7
<211> 6
<212> DNA
<213> 6bp插入片段(人工序列)
<400> 7
aggttt 6
<210> 8
<211> 2
<212> DNA
<213> 2bp缺失片段(人工序列)
<400> 8
gg 2
Claims (4)
1.一种斑马鱼癫痫模型,其特征在于,是利用sgRNA组合敲除斑马鱼scn1lab基因来构建,所述sgRNA组合序列如SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.4所示,所述敲除斑马鱼scn1lab基因是在斑马鱼scn1lab基因第三个外显子上插入6bp片段同时缺失2bp片段,其序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。
2.一种sgRNA组合在构建斑马鱼癫痫模型中的应用,其特征在于,是利用sgRNA组合敲除斑马鱼scn1lab基因来构建斑马鱼癫痫模型,所述sgRNA组合序列如SEQ ID NO.3至SEQID NO.4所示,所述敲除斑马鱼scn1lab基因是在斑马鱼scn1lab基因第三个外显子上插入6bp片段同时缺失2bp片段,其序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
3.权利要求1所述的斑马鱼癫痫模型在筛选抗癫痫药物中的应用。
4.一种斑马鱼癫痫模型的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)、靶向CRISPANT基因的sgRNA组合和检测引物的筛选:sgRNA组合序列如SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.4所示,检测引物序列如SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.6所示;
2)、将2个sgRNA和Cas9蛋白混合物注射到斑马鱼的受精卵中;
3)、F0代突变斑马鱼筛选:筛选出敲除有效的胚胎,培养至成鱼,获得F0代突变斑马鱼;
4)、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代:将F0代突变斑马鱼与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,筛选存在突变的胚胎,培养至成鱼,筛选得到可遗传的斑马鱼突变体的F1代,其与野生型相比,scn1lab基因第三个外显子上插入6bp片段同时缺失2bp片段,其序列如SEQID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111016236.0A CN113897399A (zh) | 2021-08-31 | 2021-08-31 | 一种scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111016236.0A CN113897399A (zh) | 2021-08-31 | 2021-08-31 | 一种scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113897399A true CN113897399A (zh) | 2022-01-07 |
Family
ID=79188186
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111016236.0A Pending CN113897399A (zh) | 2021-08-31 | 2021-08-31 | 一种scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113897399A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114958857A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-08-30 | 苏州赛美科基因科技有限公司 | 一种pigg基因敲除斑马鱼神经发育障碍模型及其构建方法和应用 |
WO2024119960A1 (zh) * | 2022-12-06 | 2024-06-13 | 复旦大学附属华山医院 | 一种pkhd1l1基因点突变大鼠模型及其构建方法和检测方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015187988A1 (en) * | 2014-06-04 | 2015-12-10 | Intellimedix | Composition and methods of treating epilepsy and/or epilepsy-related disorders |
JP2016216438A (ja) * | 2015-05-15 | 2016-12-22 | ゾゲニクス インターナショナル リミテッド | ドラベ症候群を処置するための選択的5−ht受容体アゴニストおよびアンタゴニスト |
CN110684767A (zh) * | 2019-09-18 | 2020-01-14 | 中山大学 | 一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除amh基因的方法及应用 |
CN111926017A (zh) * | 2020-08-27 | 2020-11-13 | 南开大学 | 一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用 |
-
2021
- 2021-08-31 CN CN202111016236.0A patent/CN113897399A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015187988A1 (en) * | 2014-06-04 | 2015-12-10 | Intellimedix | Composition and methods of treating epilepsy and/or epilepsy-related disorders |
JP2016216438A (ja) * | 2015-05-15 | 2016-12-22 | ゾゲニクス インターナショナル リミテッド | ドラベ症候群を処置するための選択的5−ht受容体アゴニストおよびアンタゴニスト |
CN110684767A (zh) * | 2019-09-18 | 2020-01-14 | 中山大学 | 一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除amh基因的方法及应用 |
CN111926017A (zh) * | 2020-08-27 | 2020-11-13 | 南开大学 | 一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WOUT J WEURING 等: "NaV1.1 and NaV1.6 selective compounds reduce the behavior phenotype and epileptiform activity in a novel zebrafish model for Dravet Syndrome", PLOS ONE, vol. 15, no. 3, pages 3 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114958857A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-08-30 | 苏州赛美科基因科技有限公司 | 一种pigg基因敲除斑马鱼神经发育障碍模型及其构建方法和应用 |
WO2024119960A1 (zh) * | 2022-12-06 | 2024-06-13 | 复旦大学附属华山医院 | 一种pkhd1l1基因点突变大鼠模型及其构建方法和检测方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108441520B (zh) | 利用CRISPR/Cas9系统构建的基因条件性敲除方法 | |
CN107475300B (zh) | Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用 | |
CN105647969B (zh) | 一种基因敲除选育stat1a基因缺失型斑马鱼的方法 | |
CN110904103A (zh) | 一种GRNa基因敲除斑马鱼突变体及其制备方法 | |
CN109628454B (zh) | 斑马鱼糖原贮积症gys1和gys2基因突变体的构建方法 | |
CN106282231B (zh) | 粘多糖贮积症ii型动物模型的构建方法及应用 | |
CN110551759A (zh) | 一种提高转基因细胞重组效率的组合物及方法 | |
CN115058424A (zh) | 一种irf2bpl基因敲除斑马鱼癫痫模型及其构建方法和应用 | |
CN110684777B (zh) | 一段分离的核苷酸序列在肌间刺减少的斑马鱼构建中的应用 | |
CN108048486A (zh) | 一种基因敲除选育fhl1b基因缺失型斑马鱼的方法 | |
CN113897399A (zh) | 一种scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型及其应用 | |
CN111926017A (zh) | 一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用 | |
CN113817734A (zh) | 一种hectd4基因敲除斑马鱼癫痫模型及其构建方法和应用 | |
CN110541002A (zh) | 一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法 | |
CN111154758A (zh) | 敲除斑马鱼slc26a4基因的方法 | |
CN110643636A (zh) | 一种团头鲂MSTNa&b基因敲除方法与应用 | |
CN110066805A (zh) | 基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法 | |
CN108893495B (zh) | 一种Pdzd7基因突变动物模型的构建方法 | |
CN113897362A (zh) | 一种scn1lab基因敲除斑马鱼癫痫模型及其构建方法和应用 | |
CN114958857A (zh) | 一种pigg基因敲除斑马鱼神经发育障碍模型及其构建方法和应用 | |
CN113897361A (zh) | 一种eef1b2基因敲除斑马鱼癫痫模型及其构建方法和应用 | |
CN113957070A (zh) | 一种chd2基因敲除斑马鱼癫痫模型及其构建方法和应用 | |
CN113234756A (zh) | 一种基于CRISPR/Cas9技术的LAMA3基因敲除动物模型的构建方法 | |
CN109136351A (zh) | 一种通过扩增子高通量测序技术检测sgRNA活性和特异性的方法 | |
CN114480497B (zh) | 一种ep400基因敲除斑马鱼心力衰竭模型的构建及其应用的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |