CN110541002A - 一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法 - Google Patents

一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法。具体包括以下步骤：确定asap1b基因敲除的靶点位置即asap1b‑gRNA‑Cas9靶位点，体外转录获得asap1b‑gRNA，将asap1b‑gRNA与Cas9mRNA导入斑马鱼受精卵中，筛选培养获得稳定遗传的asap1b基因敲除突变体。本发明根据选择的一段位于asap1b基因第1个外显子的高效率打靶序列，利用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼中的asap1b基因并产生可稳定遗传的asap1b基因敲除斑马鱼，且本发明共获得了3种突变类型的asap1b基因敲除斑马鱼品系，均对Asap1b蛋白翻译造成了提前终止，对研究asap1b基因的功能奠定动物模型基础。

Description

一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变 体的方法
技术领域
本发明涉及一种基因工程斑马鱼突变体技术领域，尤其涉及一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法。
背景技术
CRISPR/Cas系统是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫防御系统，当细菌遭受病毒的侵染时，会在自身基因组里留下外源基因片段作为“记忆抗体”以识别再次侵入的病毒。CRISPR/Cas系统由CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeat)元件和编码一系列Cas蛋白的基因组成，其中CRISPR元件由多个相同的重复序列(repeat)与不同的间隔序列(spacer)交替排列组成。该系统工作的原理为：细菌依靠Cas蛋白捕获外源性核酸片段并将其插入到基因组CRISPR元件的间隔序列中，这样CRISPR元件在转录过程中将携带有外源基因片段的新的间隔序列也同时转录，形成新的crRNA，内源性Cas蛋白复合物在成熟的crRNA的序列引导下特异性识别与新的插入间隔序列互补的外源核酸序列，之后招募核酸酶对形成的双链结构进行切割，引发DNA错配修复造成基因的突变。CRISPR/Cas9是CRISPR/Cas系统中应用最为广泛的一种类型，Cas蛋白由单一的Cas9蛋白构成，Cas9蛋白主要功能的发挥依赖于：1Cas9在细菌内需要crRNA和反式激活RNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)共同引导其靶向目标序列，现基因工程中已将两个RNA分子进行适当改造，序列整合为一条单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)；2Cas9特异性识别靶向DNA3’端的3～7bp的碱基对，即PAM(protospaceradjacent motif)区。现由于gRNA设计合成方便，且此系统对靶基因敲除效率的高效性，使得CRISPR/Cas9系统被广泛应用于细胞与动物模型的遗传学改造。但是目前此技术也面临一些挑战，如：相同基因利用CRISPR/Cas9系统敲除后得到的生物学表型是否完全相同；如何完全消除CRISPR/Cas9的脱靶效应在基因组中引入的错误编辑。
斑马鱼asap1b位于第24号染色体，CDS区约3400bp，29个外显子，编码蛋白约130kDa，与人ASAP1蛋白的同源性可达78％，与斑马鱼中asap1a基因同源性高达97％，目前尚无文献报道斑马鱼asap1b基因功能。人类ASAP1(ADPribosylation factor-GTPaseactivating protein)表达产物为ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白，前期研究的主要功能多集中于调控细胞内吞、细胞内膜泡转运与细胞骨架等方面，近年来，随着越来越多的研究发现ASAP1蛋白与结核病(Tuberculosis,TB)易感性相关，对于ASAP1的功能则主要多倾向于ASAP1蛋白表达影响结核易感的机制，并且国内学者已经在细胞水平上作出了初步探究，但是还未有在动物模型上验证ASAP1的结核易感功能的研究报道。
结核病是全世界流行的重大人畜共患传染病，其发病与病原菌、外界环境和人体本身的免疫遗传因素有关。关于结核病研究的动物模型，小鼠虽然是应用较多的并具有许多优点的TB动物模型，但其显著的缺点在于小鼠感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)后不能形成典型的坏死钙化肉芽肿病理生理组织。斑马鱼TB模型在很大程度上弥补了小鼠模型的不足。在结核病病理生理和致病机制研究方面，斑马鱼具有非常独特的优势：斑马鱼是海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum,Mm)的自然宿主；斑马鱼感染Mm后可以形成类似于人感染Mtb后导致的免疫细胞聚集的肉芽肿组织；同时斑马鱼胚胎发育全程透明，可以直接观察Mm感染后组织病理结构变化过程。这些优势都使得斑马鱼成为具有较高医学价值的TB病理生理机制研究模型。因此，在斑马鱼中建立结核易感基因编辑的动物模型对研究基因的功能、筛选结核病预防探针和结核病药物具有良好的指导意义。但是，目前鲜有在斑马鱼模型中改造结核易感基因研究结核病病理生理的报道，更未有利用基因编辑技术产生斑马鱼asap1b基因突变体的报道，加之asap1b的转录本数高达6个，使得利用CRISPR/Cas9技术对asap1b的改造更加困难。基于以上内容，提供一种asap1b基因敲除斑马鱼对补充asap1b基因基本功能与研究其对结核病的易感性就显得尤为重要。
发明内容
为了探究斑马鱼asap1b基因基本功能以及在发育过程中对于结核病的易感性调节机制，本发明克服了asap1b基因转录本复杂的困难，选择了一段特异性强且敲除效率高的打靶序列对斑马鱼asap1b进行改造，提供了一种高效的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，具体是通过以下技术步骤来实现的：
S1.设计斑马鱼asap1b基因的gRNA-Cas9打靶位点，并确认asap1b-gRNA-Cas9靶位点敲除特异性；
S2.制备asap1b-gRNA；
S3.将asap1b-gRNA和Cas9mRNA共同导入斑马鱼胚胎中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1b-gRNA-Cas 9靶位点序列突变效率；
S4.检测嵌合型F0代斑马鱼子代遗传基因类型，筛选出可以生殖遗传敲除asap1b的F0代亲本；
S5.筛选F1代斑马鱼中asap1b基因敲除杂合突变体，确认asap1b杂合敲除突变类型；
S6.筛选F2代斑马鱼中asap1b基因敲除纯合突变体，确认asap1b纯合敲除突变类型，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1b基因敲除突变体，即完成利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼asap1b基因敲除突变体的构建。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S1中asap1b-gRNA-Cas9靶位点序列为TGGTGAAGCTGGATGTAG(SEQ ID NO.1)，且位于斑马鱼asap1b基因第1个外显子。gRNA-Cas9靶位点的选择不同产生的突变体可能不尽相同，本方法首先选择在1号外显子对asap1b基因进行敲除，有效地避免了因CRISPR/Cas9敲除后产生的截短蛋白对后续基因功能研究造成的未知影响。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S2中制备asap1b-gRNA的方法为：
S2.1将asap1b-gRNA-Cas9靶位点的DNA序列连接入pDR274载体；
S2.2从重组的pDR274-asap1b-gRNA质粒中扩增T7promoter-asap1b-gRNA；
S2.3扩增产物进行PCR产物回收并通过体外转录得到asap1b-gRNA。通过琼脂糖凝胶电泳与Nanodrop分光光度计检测asap1b-gRNA纯度，高质量的gRNA的合成能有效的最大程度的为后续进行生物体内敲除实验提供分子材料保证。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S2.1中将asap1b-gRNA-Cas9靶位点的DNA序列连接入pDR274载体的引物序列为TGGTGAAGCTGGATGTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(SEQ IDNO.2)和CCTATAGTGAGTCGTATTAGC(SEQ ID NO.3)。通过Sanger测序鉴定pDR274-asap1b-gRNA是否连接成功。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S2.2中扩增T7promoter-asap1b-gRNA引物序列为CATTATGGTGAAAGTTGGAAC(SEQ ID NO.4)和AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC(SEQ IDNO.5)。扩增的产物T7promoter-asap1b-gRNA通过进行琼脂糖凝胶电泳验证分子量是否与预期相符，保证后续体外转录实验的准确性。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S3中将asap1b-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1b-gRNA-Cas9靶位点打靶效率，具体为：
S3.1将体外转录获得的asap1b-gRNA与Cas9mRNA混合后通过显微注射导入斑马鱼受精卵，其中asap1b-gRNA终浓度为100ng/μL，Cas9mRNA终浓度为300ng/μL，导入体积为：1nL/卵；
S3.2选取至少50粒已经导入asap1b-gRNA与Cas9mRNA的受精后24h的斑马鱼卵混合提取鱼卵基因组，且以此混合鱼卵基因组为模板设计引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，计算设计的asap1b-gRNA-Cas9靶位点突变效率。排除显微注射等实验操作的影响因素外，选择的靶位点的突变效率原则上应高于20％，以便后续F0代敲除斑马鱼种的筛选与鉴定以及保证此种利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼asap1b基因进行改造的高效性。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S3.2中扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列的引物为GGTCATCTGAACGCACATTTCTA(SEQ ID NO.6)和ACGCCACTGTAAACTTGTATAGC(SEQID NO.7)。扩增引物选择设置在靶位点序列上下游各约150bp左右位置，引物位置离靶位点过远则不利于基因组中的靶位点的扩增，且降低了PCR产物的保真性，过近则会影响PCR产物的Sanger测序准确性。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S4中检测嵌合型F0代斑马鱼子代遗传基因类型，筛选出可以生殖遗传敲除asap1b的F0代亲本，具体为：
S4.1将导入asap1b-gRNA与Cas9mRNA的性成熟的F0代斑马鱼与AB野生型斑马鱼侧交，得到F1代斑马鱼卵；
S4.2挑取50粒受精后24h的F1代斑马鱼卵分别提基因组，然后以单个卵的基因组为模板利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，通过鉴定F1代斑马鱼卵中asap1b基因类型进而分析F0代斑马鱼中是否产生可以生殖遗传的asap1b成功敲除的突变体；
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S5中筛选F1代斑马鱼中asap1b基因敲除杂合突变体，确认asap1b杂合敲除突变类型，具体为：将F1代鱼养至2-3月龄，剪取部分尾鳍分别提基因组，然后以单个尾鳍的基因组为模板利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，测序鉴定不同类型突变的F1代斑马鱼，得到asap1b杂合敲除突变体。考虑到CRISPR/Cas9技术在基因敲除过程中会出现的脱靶效应和误敲效应，所以在鉴定F1代突变斑马鱼的过程中应尽量筛选到2-3种不同突变类型的斑马鱼品系，方便后续基因功能探究实验中的比对研究以增加实验结果的准确性。
作为上述方案的进一步改进，所述步骤S6中筛选F2代斑马鱼中asap1b基因敲除纯合突变体，确认asap1b纯合敲除突变类型，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1b基因敲除突变体，具体为：
S6.1将鉴定得到的asap1b相同敲除突变类型的F1代斑马鱼自交，产生asap1b F2代敲除突变斑马鱼；
S6.2待asap1b F2代敲除突变斑马鱼长至2-3月龄，剪取部分尾鳍分别提取基因组，然后以单个尾鳍的基因组为模板利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，鉴定出的F2代中asap1b基因敲除纯合子斑马鱼即为稳定遗传的asap1b基因敲除突变体，此敲除斑马鱼品系可用于asap1b基因功能的探究与在斑马鱼结核病易感性方面的研究。
本发明的有益效果是：
1首次在斑马鱼中利用CRISPR/Cas9技术获得asap1b基因敲除的纯合突变体，设计的asap1b-gRNA特异性强且敲除效率高，敲除流程简单快捷，该突变体为国内外首例；
2为解释斑马鱼asap1b基本功能和研究asap1b在结核易感中的作用提供动物材料；
3该基因突变体可用于结核的易感基因功能研究与抗结核药物筛选，具有很高的医学研究价值。
附图说明
以下结合附图对本发明的具体实施方式做进一步的详细说明，其中：
图1为asap1b F1突变类型统计结果与示意图；
图2为asap1b F1和F2代纯合和杂合突变体斑马鱼基因型测序峰图结果。
具体实施方式
本发明中所涉及到的材料、设备具体如下：
1材料与设备
实验用鱼：本实验中所用的斑马鱼均为AB品系，购自于国家斑马鱼资源中心(CZRC)。
质粒：pDR274质粒，pUCm-T质粒；pT3TS-nzCas9n质粒。
主要试剂：DNA clean&contentrator-5(ZYMO RESEARCH)，普通DNA纯化试剂盒(上海生工生物技术有限公司)，MEGAshortscriptTM T7Kit(Invitrogen Cat#AM1354)，2×Premix TaqTM(Ex TaqTM Version 2.0plus dye)(TAKARA，RR902)，质粒小提试剂盒(上海生工生物技术有限公司)，DH5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)，pUCm-TVector Cloning Kit(上海生工生物技术有限公司)，2×PrimeSTAR Max Premix(TAKARA，9165A)，mMESSAGE mMACHINETMT3Transcription Kit(Invitrogen Cat#AM1348)。
主要仪器：PCR仪器(品牌：ABI，型号：Veriti)，离心机(品牌：GENESPEED，型号：1730R)，震荡混匀仪(品牌：VORTEX-GENIE，型号：G560E)，紫外分光光度计(品牌：ThermoScientific，型号：Nanodrop 2000C)，电泳仪(品牌：BIO-RAD，型号：PowerPac Basic)，凝胶成像仪(品牌：Gene，型号：G：BoxF3)，垂直拉针仪(品牌：WPI，型号：PUL-1000)，恒温摇床(品牌：ZHICHENG，型号：ZWY-200D)，微量注射泵(品牌：WPI，型号PV830)，恒温水浴锅(品牌：上海一恒，型号：DK-8D型)，4℃冰箱(品牌：中科都菱，型号：MPC-5V316)，-20℃低温冰箱(品牌：中科都菱，型号：MDF-25V278W)，-80℃超低温冰箱(品牌：Pana-sonic，型号：MDF-U53V)，高压蒸汽灭菌锅(品牌：zealway，型号：GI80DWS)，电热恒温鼓风干燥箱(品牌：上海齐欣，型号：DHG-9055A)，体式显微镜(品牌：OLYMPUS，型号：SZX16)。
2实验方法
一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，包括如下步骤：
S1.设计斑马鱼asap1b基因的gRNA-Cas9打靶位点，并确认asap1b-gRNA-Cas9靶位点敲除特异性。
从Ensemble网站上获取斑马鱼asap1b的蛋白编码序列(CDS)；在http:// zifit.partners.org/ZiFiT/网站输入asap1b蛋白编码序列并设计靶位点，设定靶位点长度为18-22bp，靶位点的3’端碱基构成PAM区，自动生成靶位点序列位于asap1b第1个外显子，见表1所示；
表1 asap1b-gRNA-Cas 9靶位点序列
所述asap1b-gRNA-Cas9靶位点序列为SEQ ID NO.1所示序列，在Ensemble网站和NCBI上比对靶位点序列，比对结果显示asap1b-gRNA-Cas9靶位点是asap1b基因的特异序列，且位于斑马鱼asap1b基因第1个外显子上。
S2.制备asap1b-gRNA，方法为：
S2.1将asap1b-gRNA靶位点的DNA序列连接入pDR274载体，反应体系见表2所示，扩增引物信息见表3所示。
表2 PCR反应体系
组分 体积
pDR274plasmid 5-20ng
Forward asap1b-gRNA primer(5mmol/L) 0.5μL
universal reverse CRISPR primer(5mmol/L) 0.5μL
PrimeSTAR Max Premix(2×) 10μL
ddH<sub>2</sub>O to 20μL
表3上述表2中的扩增引物信息
按照表2反应体系进行PCR反应并将PCR产物进行电泳分离，得到大约2.1kbp电泳条带，将目的条带进行切胶回收后取40-100ng进行自连反应，转化入LB Kana+平板；所述将asap1b-gRNA-Cas9靶位点的DNA序列连接入pDR274载体的引物序列为SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示序列。
S2.2从重组的pDR274-asap1b-gRNA质粒中扩增T7promoter-asap1b-gRNA，使用引物信息见表4所示：
表4引物序列
所述扩增T7promoter-asap1b-gRNA引物序列为SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示序列。
S2.3扩增的PCR产物进行回收，使用MEGAshortscriptTM T7Kit进行体外转录得到asap1b-gRNA，反应体系为表5所示：
表5体外转录反应体系
组分 体积
T7promoter-asap1b-gRNA DNA template 1000ng
10×Transcription Buffer 2μL
10mM ATP 1μL
10mM CTP 1μL
10mM GTP 1μL
10mM UTP 1μL
T7Enzyme Mix 1μL
Nuclease-free Water to 20μL
反应体系混匀后，37℃放置2h，再向体系中加入1μL TURBO DNase并混匀，37℃15min；每20μL体外转录体系中加入15μL醋酸铵和115μL无核酸酶水，混匀后放于-20℃冰箱至少1h；4℃12000rpm离心20min，弃去上清，用70％无核酸酶水的乙醇溶液清洗沉淀转录产物，4℃12000rpm离心5min，弃上清后将转录产物吹干，使乙醇挥发干净；加入适量的无核酸酶水溶解asap1b-gRNA沉淀；用Nanodrop检测浓度和OD值，并电泳检测条带的单一性。
S3.将asap1b-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1b-gRNA靶位点突变效率，具体为：
S3.1将体外转录获得的asap1b-gRNA与Cas9mRNA(质粒pT3TS-nzCas9n购自于国家斑马鱼资源中心)混合后通过显微注射导入斑马鱼受精卵，其中asap1b-gRNA终浓度为100ng/μL，Cas9mRNA终浓度为300ng/μL，加入10％的母液浓度为0.5％酚红作为指示剂，导入体积为：1nL/卵；
S3.2取注射后24h的发育正常的F0代鱼卵50粒混合放置于1.5mL离心管中，按照5μL/卵加入预先配制的鱼卵温和提取基因组溶液250μL(配方见表6)，将鱼卵置于金属浴中50℃裂解2h，98℃5s灭活蛋白酶，其中混匀数次，加入等体积的异丙醇后吸取出白色线索状的物质，用70％乙醇洗涤2-3次，将白色物质吹干后，加入40-100μL ddH2O混匀即得到斑马鱼卵的基因组DNA；
表6鱼卵温和提取基因组溶液配方
组分 终浓度或质量分数
Tris pH 8.2 10mM
EDTA 10mM
NaCl 200mM
SDS 0.5％
Proteinase K 200μg/mL
以上一步提取的斑马鱼卵的基因组DNA为模板，用引物asap1b-gRNA-screenFR扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近基因组DNA(引物信息见表7)，设计的引物应在靶位点的上下游各约150bp左右，由上海生工生物工程股份有限公司合成，然后PCR产物进行切胶回收并通过TA克隆连接入pUCm-T载体，转化入LB Amp+平板中，通过蓝白斑筛选阳性重组子，随机挑取48个阳性重组子使用通用引物M13分别进行菌落PCR，将48个PCR产物送测序检测敲除的效率。所述扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列的引物asap1b-gRNA-screenFR为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列。
表7引物asap1b-gRNA-screenFR序列
S4.检测嵌合型F0代斑马鱼子代遗传基因类型，筛选出可以生殖遗传敲除asap1b的F0代亲本，具体为：
S4.1将导入asap1b-gRNA与Cas9mRNA的性成熟的F0代斑马鱼与AB野生型斑马鱼侧交，得到F1代斑马鱼卵；
S4.2随机挑取受精后24h的F1代斑马鱼卵约50粒分别提基因组，将每颗鱼卵单独放于离心管后加入预先配制的鱼卵粗提取基因组溶液(配方见表8)，置于金属浴中50℃裂解2h，98℃5s即得到鱼卵基因组粗提物，用引物SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，扩增体系见表9所示，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，通过鉴定F1代斑马鱼卵中asap1b基因类型进而分析F0代斑马鱼中是否产生可以遗传的asap1b成功敲除的突变体，并饲养剩余的可以遗传的asap1b敲除突变F1代斑马鱼卵；挑取50粒受精后24h的F1代斑马鱼卵分别提基因组，然后以单个卵的基因组为模板利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列。
表8鱼卵粗提取基因组溶液配方
组分 终浓度或质量分数
Tris pH 8.0 10mM
EDTA 2mM
Triton X-100 0.2％
Proteinase K 200μg/mL
表9 PCR反应体系
组分 体积
genomic DNA 0.5μL
asap1b-gRNA-screenF(5mmol/L) 0.5μL
asap1b-gRNA-screenR(5mmol/L) 0.5μL
2×Premix Taq 10μL
ddH<sub>2</sub>O to 20μL
S5.筛选F1代斑马鱼中asap1b基因敲除杂合突变体，确认asap1b杂合敲除突变类型；将F1代鱼养至2-3月龄，剪取部分尾鳍分别提基因组，使用溶液与PCR反应体系同上述粗提鱼卵基因组方法，然后以单个尾鳍的基因组为模板利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，测序鉴定不同类型突变的F1代斑马鱼，筛选至少2-3种突变类型，相同类型的突变体集中饲养。
S6.筛选F2代斑马鱼中asap1b基因敲除纯合突变体，确认asap1b纯合敲除突变类型，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1b基因敲除突变体，具体为：
S6.1将鉴定得到的asap1b相同敲除突变类型的F1代斑马鱼自交，产生asap1b F2代敲除突变斑马鱼；
S6.2待asap1b F2代敲除突变斑马鱼长至2-3月龄，剪取部分尾鳍分别提取基因组，使用溶液与PCR反应体系同上述粗提鱼卵基因组方法，然后以单个尾鳍的基因组为模板利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，鉴定F2代中asap1b基因敲除的纯合子，此即为稳定遗传的asap1b基因敲除突变体，然后通过自交获得大量的纯合突变体，即建立起可稳定遗传的asap1b基因敲除突变体。
3敲除突变斑马鱼结核易感性功能初步鉴定
幼鱼准备：收集28-35h野生型与asap1b敲除突变体斑马鱼鱼卵，用镊子拨除卵膜后将幼鱼浸泡在0.016％三卡因中实施麻醉处理，约30条鱼为一组。
注射准备：制备海鱼分枝杆菌红色荧光细菌悬液约108CFU/mL，并按10％加入酚红溶液(0.2g/mL)作为注射指示剂，用eppendorf毛细上样管吸取细菌悬液2μL加入到注射针管中，通过控制针尖的大小、注射时间与压力调整注射剂量(约1nL)。
注射海鱼分枝杆菌：待幼鱼完全麻醉后将其固定于2％琼脂糖表面，注射针管与鱼体成45°夹角为宜，然后从泄殖孔附近的尾静脉处缓缓注入海鱼分枝杆菌悬液，注射完毕后用吸管轻轻将幼鱼移入新鲜的E3培养液中，定期更换培养液并统计胚胎的存活率。注射后每天观测鱼体内细菌的荧光强度与扩散程度，比较敲除突变asap1b斑马鱼与野生型斑马鱼对于结核分枝杆菌的易感程度。
本发明实施例提供一种利用CRISPR/Cas9构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其具体结果与特征在于：
1得到asap1b基因敲除突变斑马鱼三个品系，具有不同的突变类型：突变1(MT1)：缺失31bp；突变2(MT2)：缺失1bp；突变3(MT3)：缺失4bp，测序峰图与说明如附图所示；
2得到的asap1b基因敲除突变斑马鱼其蛋白翻译提前终止，三个突变都位于Asap1b蛋白的第一个结构域BAR，野生型asap1b蛋白有1140个氨基酸构成，突变1有49个氨基酸，突变2有59个氨基酸，突变3有58个氨基酸，三种敲除突变体的Asap1b蛋白有明显的截短，有效的降低了利用CRISPR/Cas9敲除后残余截短蛋白对后期实验研究的影响。
3得到的asap1b纯合突变体斑马鱼无明显的表型，无致死效应。筛选到的三种类型的突变为后续对比研究asap1b基因功能奠定了可靠基础，消除了因CRISPR/Cas9脱靶效应带来的其它表型，为结核病易感基因的研究以及结核病药物的筛选提供了可靠的材料基础，突变斑马鱼结核易感性功能鉴定实验结果可能初步暗示asap1b基因与结核病易感性相关。
序列信息表：
SEQ ID NO.1：tggtgaagctggatgtag；
SEQ ID NO.2：tggtgaagctggatgtaggttttagagctagaaatagc；
SEQ ID NO.3：cctatagtgagtcgtattagc；
SEQ ID NO.4：cattatggtgaaagttggaac；
SEQ ID NO.5：aaaagcaccgactcggtgccac；
SEQ ID NO.6：ggtcatctgaacgcacatttcta；
SEQ ID NO.7：acgccactgtaaacttgtatagc。
以上实施例不局限于该实施例自身的技术方案，实施例之间可以相互结合成新的实施例。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而并非对其进行限制，凡未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 山西大学
长治医学院
<120> 一种利用CRISPR/Cas9 技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 斑马鱼(zebrafish)
<400> 1
tggtgaagct ggatgtag 18
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 质粒(plasmid)
<400> 2
tggtgaagct ggatgtaggt tttagagcta gaaatagc 38
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 质粒(plasmid)
<400> 3
cctatagtga gtcgtattag c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 质粒(plasmid)
<400> 4
cattatggtg aaagttggaa c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 质粒(plasmid)
<400> 5
aaaagcaccg actcggtgcc ac 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 斑马鱼(zebrafish)
<400> 6
ggtcatctga acgcacattt cta 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 斑马鱼(zebrafish)
<400> 7
acgccactgt aaacttgtat agc 23

Claims (10)

1.一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1.设计斑马鱼asap1b基因的gRNA-Cas9打靶位点，并确认asap1b-gRNA-Cas9靶位点敲除特异性；
S2.制备asap1b-gRNA；
S3.将asap1b-gRNA和Cas9mRNA共同导入斑马鱼胚胎中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1b-gRNA-Cas9靶位点序列突变效率；
S4.检测嵌合型F0代斑马鱼子代遗传基因类型，筛选出可以生殖遗传敲除asap1b的F0代亲本；
S5.筛选F1代斑马鱼中asap1b基因敲除杂合突变体，确认asap1b杂合敲除突变类型；
S6.筛选F2代斑马鱼中asap1b基因敲除纯合突变体，确认asap1b纯合敲除突变类型，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1b基因敲除突变体，即完成利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼asap1b基因敲除突变体的构建。
2.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S1中asap1b-gRNA-Cas9靶位点序列为SEQ ID NO.1所示序列，且位于斑马鱼asap1b基因第1个外显子。
3.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2中制备asap1b-gRNA的方法为：
S2.1将asap1b-gRNA-Cas9靶位点的DNA序列连接入pDR274载体；
S2.2从重组的pDR274-asap1b-gRNA质粒中扩增T7promoter-asap1b-gRNA；
S2.3扩增产物进行PCR产物回收并通过体外转录得到asap1b-gRNA。
4.根据权利要求4所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2.1中将asap1b-gRNA-Cas9靶位点的DNA序列连接入pDR274载体的引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。
5.根据权利要求4所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2.2中扩增T7promoter-asap1b-gRNA引物序列为SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示序列。
6.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S3中将asap1b-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1b-gRNA-Cas9靶位点突变效率，具体为：
S3.1将体外转录获得的asap1b-gRNA与Cas9mRNA混合后通过显微注射导入斑马鱼受精卵，其中asap1b-gRNA终浓度为100ng/μL，Cas9 mRNA终浓度为300ng/μL，导入体积为：1nL/卵；
S3.2选取至少50粒已经导入asap1b-gRNA与Cas9mRNA的受精后24h的斑马鱼卵混合提取鱼卵基因组，且以此混合鱼卵基因组为模板设计引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，计算设计的asap1b-gRNA-Cas9靶位点突变效率。
7.根据权利要求7所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S3.2中扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列的引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列。
8.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S4中检测嵌合型F0代斑马鱼子代遗传基因类型，筛选出可以生殖遗传敲除asap1b的F0代亲本，具体为：
S4.1将导入asap1b-gRNA与Cas9mRNA的性成熟的F0代斑马鱼与AB野生型斑马鱼侧交，得到F1代斑马鱼卵；
S4.2挑取50粒受精后24h的F1代斑马鱼卵分别提基因组，然后以单个卵的基因组为模板利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，通过鉴定F1代斑马鱼卵中asap1b基因类型进而分析F0代斑马鱼中是否产生可以生殖遗传的asap1b成功敲除的突变体；
9.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S5中筛选F1代斑马鱼中asap1b基因敲除杂合突变体，确认asap1b杂合敲除突变类型，具体为：将F1代鱼养至2-3月龄，剪取部分尾鳍分别提基因组，然后以单个尾鳍的基因组为模板利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，测序鉴定不同类型突变的F1代斑马鱼，得到asap1b成功敲除的F1代杂合突变体。
10.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1b基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S6中筛选F2代斑马鱼中asap1b基因敲除纯合突变体，确认asap1b纯合敲除突变类型，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1b基因敲除突变体，具体为：
S6.1将鉴定得到的asap1b相同敲除突变类型的F1代斑马鱼自交，产生asap1b F2代敲除突变斑马鱼；
S6.2待asap1b F2代敲除突变斑马鱼长至2-3月龄，剪取部分尾鳍分别提取基因组，然后以单个尾鳍的基因组为模板利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7引物扩增asap1b-gRNA-Cas9靶位点附近序列，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，鉴定F2代中asap1b基因敲除的纯合子，此即为稳定遗传的asap1b基因敲除突变体。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111926017A (zh) * 2020-08-27 2020-11-13 南开大学 一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用
CN113174406A (zh) * 2021-05-08 2021-07-27 湖南农业大学 斑马鱼lgp2基因敲除纯合子制备方法
CN114891833A (zh) * 2021-11-02 2022-08-12 湖南农业大学 Gnaq基因敲除系赤眼鳟模型构建与应用
CN114934073A (zh) * 2022-06-30 2022-08-23 上海海洋大学 hoxa1a基因敲除斑马鱼突变体的构建方法和应用
CN115074390A (zh) * 2022-06-30 2022-09-20 上海海洋大学 高效构建基因组大片段删除突变体的方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108823249A (zh) * 2018-05-28 2018-11-16 上海海洋大学 CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108823249A (zh) * 2018-05-28 2018-11-16 上海海洋大学 CRISPR/Cas9构建notch1a突变体斑马鱼的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCHREIBER 等: ""Loss of ASAP1 in mice impairs adipogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal progenitor cells through dysregulation of FAK/Src and AKT signaling"", 《PLOS GENET》 *
崔佳 等: ""ＡＳＡＰ１基因影响结核易感性的研究进展"", 《中国人兽共患病学报》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111926017A (zh) * 2020-08-27 2020-11-13 南开大学 一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用
CN111926017B (zh) * 2020-08-27 2023-08-11 南开大学 一种csf1ra基因缺失斑马鱼突变体的制备及其应用
CN113174406A (zh) * 2021-05-08 2021-07-27 湖南农业大学 斑马鱼lgp2基因敲除纯合子制备方法
CN114891833A (zh) * 2021-11-02 2022-08-12 湖南农业大学 Gnaq基因敲除系赤眼鳟模型构建与应用
CN114934073A (zh) * 2022-06-30 2022-08-23 上海海洋大学 hoxa1a基因敲除斑马鱼突变体的构建方法和应用
CN115074390A (zh) * 2022-06-30 2022-09-20 上海海洋大学 高效构建基因组大片段删除突变体的方法和应用
CN114934073B (zh) * 2022-06-30 2024-04-19 上海海洋大学 hoxa1a基因敲除斑马鱼突变体的构建方法和应用

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