CN110923265A - 一种在h11位点条件性过表达hpv e7基因小鼠模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：设计并获得sgRNA；制备Cas9/sgRNA混合物；构建打靶载体；(4)将打靶载体、Cas9/sgRNA混合物共注射到小鼠受精卵中，后续得到F0代小鼠；F1代小鼠获得。本发明解决了现有技术中“裸鼠缺乏健全的免疫系统，不适用于研究HPV E7在介导肿瘤微环境免疫调控、免疫逃逸等过程中的作用”的问题，本发明所提供动物模型具有健全的免疫系统，适用于所有关于HPV E7与免疫系统相互作用的研究。

Description

一种在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建 方法

技术领域

本发明涉及一种在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，属于分子生物学与生物医学技术领域。

背景技术

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在妇科恶性肿瘤中仅次于乳腺癌。近年来我国宫颈癌发病率呈上升态势，且趋于年轻化。人乳头瘤病毒(HPV)属乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是一种球形DNA病毒，特异性感染上皮细胞。目前已有200多种HPV亚型被鉴定，根据其致癌性可分为高危型HPV(hrHPV)与低危型HPV(lrHPV)。持续性hrHPV感染是宫颈高度病变及宫颈癌发生的主要诱因，90％以上的宫颈癌组织携带hrHPV(16，18，31型)DNA。但HPV感染导致宫颈癌发生的分子机制仍不太明了。体外细胞转化研究发现HPV仅能诱导正常上皮细胞的永生化而不能使之充分恶化，提示HPV并非宫颈癌发生发展的唯一因素，HPV致癌因素与易感因素还有待进一步研究。病毒基因组分为3个部分：早期基因区(E)、晚期基因区(L)及长调控区(LCR)。其中，早期基因区(E)的E7是明确的致癌基因。hrHPV(如HPV16)E7可编码具有转化及反式激活功能的蛋白，其阳性表达与宫颈病变程度之间呈正相关，被证实是导致宫颈上皮癌变的重要因子。且不同型的HPV致癌能力与其各自E7与Rb蛋白结合能力等有关，结合越紧密，其致癌能力越强。对E7基因及其蛋白产物在宫颈癌发生发展过程中的机制、宫颈癌诊疗与疫苗研发等方面开展深入研究具有重要的医学应用价值。

目前，如何全面评价hrHPV E7的促癌机制，尤其是在诱导正常细胞恶性转化及肿瘤微环境免疫调控等过程中的机理研究尚存在着瓶颈。为探讨上述科学问题，体内模型的发展是十分必要的，体内环境的有机整体是研究分子与病变相互作用所需要的。体内hrHPVE7蛋白的作用可通过相关动物模型的特征来评价，并以此为根据探讨hrHPV与妇女宫颈不典型增生、宫颈癌等发生的关系。目前多利用裸鼠、传统随机转基因小鼠开展相关研究。

(1)裸鼠：国内研究者通过构建带有角蛋白K14启动子的E6/E7腺病毒载体，尾静脉注射重组病毒Ad-K14-E6/E7至裸鼠体内联合腹腔注射雌激素等方式，诱导E6/E7在受试小鼠子宫体中的表达，并且当前无单独过表达E7的裸鼠模型。

(2)转基因小鼠：转基因动物是指用实验方法转入的外源基因在其基因组内整合并表达和传与后代的一类动物，转基因动物打破了物种界限，为研究不同来源的基因提供了可能。如，研究者通过构建带有角蛋白K14启动子的HPV16 E7真核表达载体，线性化后显微注射的方式获得了K14HPV16E7转基因首建鼠，阳性后代比例符合孟德尔遗传定律。

在上述模型中，由于裸鼠缺乏健全的免疫系统，该模型不适用于研究HPV E7在介导肿瘤微环境免疫调控、免疫逃逸等过程中的作用。而对于传统的随机转基因小鼠，尽管其已在很多领域已经得到应用，但却依然受到一定限制。转基因的效率及整合位点的不确定性是主要原因。此类小鼠一般利用质粒进行受精卵原核注射的方式来制备，其整合是随机的，有的发生于单位点，也有的情况下整合于不同染色体的多个位点上，其随机性可能造成基因组的重排、易位缺失，外源基因插入可能破坏小鼠內源基因；此外整合的拷贝数不固定，多拷贝串联整合可能导致外源基因表达率低甚至不表达，不利于控制基因的表达水平及功能研究。因此获得首建鼠(基因型鉴定为阳性)后还需进一步筛选外源基因高表达的品系line，并且至少需要2个表达的品系line，相互印证表型才可以。通过这种方式建立小鼠品系需要花费较高的时间与金钱成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法。

本发明采用了如下技术方案：

一种在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据HPV E7基因的序列，设计并获得sgRNA，评估候选序列脱靶效应；

(2)将得到的sgRNA与Cas9蛋白共同孵育，制备Cas9/sgRNA混合物；

(3)构建打靶载体，利用In-Fusion克隆技术构建携带条件性过表达E7序列的同源重组载体，构建过程中所用重组系统为Cre-LoxP诱导表达系统，载体包括“启动子-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPV E7-筛选标记-polyA”基因片段；

(4)将所述打靶载体、Cas9/sgRNA混合物共注射到小鼠受精卵中；再将显微注射后的受精卵送回至代孕鼠输卵管中，待小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠，即F0代小鼠；

(5)F1代小鼠获得，将性成熟的阳性F0鼠与野生型鼠配繁产生F1代，经PCR与Southern验证后最终得到阳性杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。

进一步，本发明的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征：sgRNA的序列为：GAACACUAGUGCACUUAUCCUGG。

进一步，本发明的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，还包括：验证步骤：采用PCR检测或测序验证，提取小鼠鼠尾基因组DNA，进行repair donor中靶后的PCR鉴定。

引物H11-seqF1/H11-seqR1分别位于5’同源臂外及repair donor片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，则目标donor在小鼠基因组5’进行了有效插入；H11-seqF2/H11-seqR2分别位于repair donor的片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，则目标donor在小鼠基因组3’进行了有效插入。

进一步，本发明的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，

PCR采用的引物序列如下：

。

进一步，本发明的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征：

若引物F3、R3无法扩增得到，则采用备选PCR引物，序列如下：

引物名称	引物序列
		F4	5’-GTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGC-3’
R4	5’-CTTTATTAGCCAGAAGTCAGATGC-3’

。

进一步，本发明的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：

备选PCR反应体系：

反应组件	体积
		Mouse tail genomic DNA	1μL
Forward primer(10μM)	1μL
		Reverse primer(10μM)	1μL
Premix Taq Polymerase	12.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	9.5μL
Total	25μL

。

进一步，本发明的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，还具有这样的特征：

备选PCR反应条件：

。

本发明解决了现有技术中“裸鼠缺乏健全的免疫系统，不适用于研究HPV E7在介导肿瘤微环境免疫调控、免疫逃逸等过程中的作用”的问题，本发明所提供动物模型具有健全的免疫系统，适用于所有关于HPV E7与免疫系统相互作用的研究；

本发明解决了现有技术中传统的随机转基因小鼠“基因的效率及整合位点不确定性”的问题，本发明所提供动物模型构建方法具有基因编辑效率高、整合位点明确的特点；

本发明解决了现有技术中传统的随机转基因小鼠“基因整合拷贝数不固定”的问题，本发明所提供动物模型构建方法具有基因整合拷贝数固定的特点；

本发明解决了现有技术中传统的随机转基因小鼠“时间与金钱成本高”的问题，本发明所提供动物模型构建方法可降低小鼠定制成本，缩短构建周期。

本发明还解决了在特定组织或特定时间表达HPV E7基因的问题。

发明的有益效果

(1)本发明采用CRISPR-Cas9系统，该系统主要利用Cas9核酸酶在sgRNA的引导下介导目的基因的原间区毗邻序列(PAM序列，NGG)上游3个碱基的双链断裂，Cas9上的HNH结构域切割与sgRNA形成互补的单链DNA，Ruv C结构域切割非互补的单链，在模板链存在的条件下，通过同源重组修复(Homology-Directed Repair,HDR)实现基因片段的定点敲入。该系统具有编辑效率与靶向性高、打靶容易，实验操作更加精准、高效的特点。

(2)本发明使用含有小鼠同源序列作为同源重组修复模板的repair donor，与Cas9/sgRNA共同注射到小鼠受精卵中，增加了同源重组修复的几率以及获得阳性小鼠的概率，使用该方法制备的小鼠不含有目的序列之外的其他外源序列；

(3)本发明选择H11位点作为目的基因的特定插入位点，该位点位于小鼠第11号染色体Eif4enif1与Drg1两个基因之间，外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小，且同时H11位点所在的Eif4enif1与Drg1这两个基因的侧翼序列区域具有广泛的空间和时间EST(expression sequence tag)表达模式，可使整合在此的外源基因受指定启动子的驱动而稳定表达；

(4)本发明将“启动子-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPV E7-筛选标记-polyA”序列定点嵌入到H11位点，由于启动子与目的基因E7之间用loxP-STOP-loxP结构隔开，使得正常情况下启动子无法启动E7表达基因的表达。只有与组织特异性Cre工具鼠交配后，才会在特异细胞或组织或者特定时间中表达目的基因，较常规的转基因小鼠模型具有更好的特异性与可控性；

(5)本发明实现了单拷贝目的基因插入，更容易预测表达量；且在打靶载体中增加了筛选标记，后续可通过此标记对模型进行灵活的检测；

(6)本发明可降低基因敲入小鼠模型的定制成本，大大缩短了研发周期；

(7)本发明的小鼠模型，可以和任何带有组织特异性启动子的Cre鼠杂交或利用Cre病毒感染，实现个体特定的组织或特定时间选择性地调控E7基因的功能，最终所得到的条件性过表达E7小鼠可用于研究HPV感染过程中E7对诱导细胞恶性转化、肿瘤微环境调控及免疫逃逸等过程的影响，并且对研究宫颈癌发生发展机制具有重要意义。

附图说明

图1是本发明一个实施例中基因编辑整体策略示意图。

图2为本发明一个实施例中sgRNA脱靶效应评估。

图3是本发明一个实施例中打靶载体示意图。

图4是本发明一个实施例中打靶载体酶切验证结果图。

图5是本发明一个实施例中中靶小鼠PCR鉴定引物设计原理图。

图6是本发明一个实施例中F1代小鼠5’同源臂PCR电泳结果图。

图7是本发明一个实施例中F1代小鼠3’同源臂PCR电泳结果图。

图8是本发明一个实施例中F1代小鼠5’同源臂PCR产物测序比对结果图。

图9是本发明一个实施例中F1代小鼠3’同源臂PCR产物测序比对结果。

图10是本发明一个实施例中中靶小鼠备选PCR鉴定引物设计原理图。

图11是本发明一个实施例中中靶小鼠Southern blot鉴定酶切及引物设计原理图。

图12A和图12B是本发明一个实施例中中靶小鼠Southern blot验证结果图。

具体实施方式

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，以下结合具体实施例与附图对本发明的技术方案进行详细说明。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，不能以此来限制本发明的保护范围。

以下实施例中如无特殊说明，所采用的试剂和生物材料均来源于市售。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

术语解释：

HPV，人乳头瘤病毒；

CRISPR-Cas9，成簇的规律间隔的短回文重复序列-CRISPR相关蛋白9。

具体实施例：在H11位点进行条件性过表达HPV16 E7动物模型的构建

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在小鼠模型H11位点定点敲入HPV16 E7基因序列，可实现条件性过表达HPV16 E7，以建立条件性过表达HPV16 E7小鼠模型。包括如下步骤：

(1)sgRNA设计与脱靶效应评估

在C57BL/6小鼠H11位点进行条件性过表达HPV16 E7的sgRNA设计，并对候选sgRNA进行脱靶效应评估，如图1所示，筛选得到sgRNA(matching forward strand of gene):

GAACACUAGUGCACUUAUCCUGG。

(2)将得到的sgRNA与Cas9蛋白共同孵育，制备Cas9/sgRNA混合物；

(3)基因编辑策略与打靶载体构建

基因编辑整体策略如图2所示，为实现此基因编辑目的，利用In-Fusion克隆技术构建携带条件性过表达E7序列的同源重组载体，如图3所示，构建过程中所用重组系统为Cre-LoxP诱导表达系统，载体包括“CAG-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPV16 E7-HA-polyA”基因片段。载体酶切验证结果如图4所示。

(4)显微共注射与F0代小鼠获得

将上述打靶载体、Cas9/sgRNA混合物共注射到小鼠受精卵中；再将显微注射后的受精卵送回至代孕鼠输卵管中，待小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠，即F0代小鼠。

(5)F1代小鼠获得

将性成熟的阳性F0鼠与野生型鼠配繁产生F1代，经PCR与Southern验证后最终得到阳性杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。(6)上述小鼠基因型鉴定方案采用A和B两种方案：

A方案：PCR检测及测序验证

提取小鼠鼠尾基因组DNA，进行repair donor中靶后的PCR鉴定。如图5所示，引物H11-seqF1/H11-seqR1分别位于5’同源臂外及repair donor片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标donor在小鼠基因组5’进行了有效插入；H11-seqF2/H11-seqR2分别位于repair donor的片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标donor在小鼠基因组3’进行了有效插入。并分别利用引物H11-seqF3/H11-seqR3对上述PCR产物进行测序及序列比对。

PCR引物序列：

引物名称	引物序列
		F1	5’-GTACATCCACAGCATCTTCCAAG-3’
R1	5’-AGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTC-3’
		F2	5’-GCATCTGACTTCTGGCTAATAAAG-3’
R2	5’-GCCTTGACCTAAGAGATGATGCGAC-3’
		F3	5’-CTCTACTGGAGGAGGACAAACTG-3
R3	5’-GTCTTCCACCTTTCTTCAGTTAGC-3’

PCR反应体系：

PCR反应条件：

本实例中经PCR及测序验证共获得阳性F1代小鼠3只，编号9、10、11号：5’和3’同源臂PCR鉴定电泳结果分别如图6、图7所示，图中数字：F1代小鼠编号；WT：野生型对照；分别取上述5’和3’同源臂PCR产物进行测序及序列比对，结果以10号小鼠为例，见图8和图9。

备注：

1)使用的Taq DNA聚合酶是LongAmp Taq DNA聚合酶(NEB M0323V)。

2)PCR基因分型中使用的两个对照是：

水控制：不添加DNA模板。

野生型对照：400ng小鼠基因组DNA。

如果DNA样品不是很纯净或没有足够的PCR延伸时间，则可能无法扩增长片段PCR产物。此时可使用如图10备选引物。

备选PCR引物序列：

备选PCR反应体系：

反应组件	体积
		Mouse tail genomic DNA	1μL
Forward primer(10μM)	1μL
		Reverse primer(10μM)	1μL
Premix Taq Polymerase	12.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	9.5μL
Total	25μL

备选PCR反应条件：

B方案：Southern blot鉴定

取上述经PCR及测序验证双臂同源重组阳性小鼠9-11号，提取鼠尾DNA。如图11所示，经限制性内切酶EcoNI或Sspl酶切，同时选择用于Southern blot分析的DNA探针。检测结果如图12A和图12B所示，显示上述三只小鼠DNA酶切后对应基因组片段均可与所设计探针发生杂交，产物大小符合预期。

KI探针引物序列：

引物名称	引物序列
		Forward	5’-TGCCCTGGCTCACAAATACCACT-3’
Reverse	5’-TAGCCAACCTTTGTTCATGGCAGC-3’

序列表

<110> 上海同科生物科技有限公司

<120> 一种在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法

<130> JSP11912143

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial

<220>

Claims (7)

1.一种在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据HPV E7基因的序列，设计并获得sgRNA，评估候选序列脱靶效应；

(2)将得到的sgRNA与Cas9蛋白共同孵育，制备Cas9/sgRNA混合物；

(3)构建打靶载体，利用In-Fusion克隆技术构建携带条件性过表达E7序列的同源重组载体，构建过程中所用重组系统为Cre-LoxP诱导表达系统，载体包括“启动子-loxP-Stop-loxP-Kozak-HPV E7-筛选标记-polyA”基因片段；

(4)将所述打靶载体、Cas9/sgRNA混合物共注射到小鼠受精卵中；再将显微注射后的受精卵送回至代孕鼠输卵管中，待小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠，即F0代小鼠；

(5)F1代小鼠获得，将性成熟的阳性F0鼠与野生型鼠配繁产生F1代，经PCR与Southern验证后最终得到阳性杂合子F1代鼠，完成可传代繁育的小鼠模型构建。

2.如权利要求1所述的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：

sgRNA的序列为：GAACACUAGUGCACUUAUCCUGG。

3.如权利要求1所述的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，还包括：

验证步骤：采用PCR检测或测序验证，

提取小鼠鼠尾基因组DNA，进行repair donor中靶后的PCR鉴定。引物H11-seqF1/H11-seqR1分别位于5’同源臂外及repair donor片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，则目标donor在小鼠基因组5’进行了有效插入；H11-seqF2/H11-seqR2分别位于repair donor的片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，则目标donor在小鼠基因组3’进行了有效插入。

4.如权利要求3所述的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，

PCR采用的引物序列如下：

引物名称 引物序列 F1 5’-GTACATCCACAGCATCTTCCAAG-3’ R1 5’-AGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTC-3’ F2 5’-GCATCTGACTTCTGGCTAATAAAG-3’ R2 5’-GCCTTGACCTAAGAGATGATGCGAC-3’ F3 5’-CTCTACTGGAGGAGGACAAACTG-3 R3 5’-GTCTTCCACCTTTCTTCAGTTAGC-3’

。

5.如权利要求4所述的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：

若DNA样品纯度较低或希望缩短PCR反应时间，则采用备选PCR引物，可获得较短片段PCR产物，备选PCR引物的序列如下：

引物名称 引物序列 F4 5’-GTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGC-3’ R4 5’-CTTTATTAGCCAGAAGTCAGATGC-3’

。

6.如权利要求5所述的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：

备选PCR反应体系：

反应组件 体积 Mouse tail genomic DNA 1μL Forward primer(10μM) 1μL Reverse primer(10μM) 1μL Premix Taq Polymerase 12.5μL ddH₂O 9.5μL Total 25μL

。

7.如权利要求6所述的在H11位点条件性过表达HPV E7基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：

备选PCR反应条件：

。

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