CN109371021A - 一种使用CRISPR/Cas9治疗HPV阳性的宫颈上皮内瘤变的方法 - Google Patents

一种使用CRISPR/Cas9治疗HPV阳性的宫颈上皮内瘤变的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种使用CRISPR/Cas9治疗HPV阳性的宫颈上皮内瘤变的方法。本发明采用经阴道体内质粒转染的方式，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术破坏靶基因E7，降低病毒载量，恢复肿瘤抑制因子RB的功能，从而逆转宿主细胞的恶性表型，大大降低治疗成本以及患者的心理负担。CRISPR/Cas9基因编辑技术在K14‑HPV16宫颈上皮内瘤变的小鼠动物模型中发挥的作用使其成为治疗宫颈上皮内瘤变的非常有前景的治疗方式。该gRNA能够有效的治疗HPV阳性的宫颈上皮内瘤变，比现有技术的gRNA具有显著的优势，适宜于临床和病患者中使用。

Description

一种使用CRISPR/Cas9治疗HPV阳性的宫颈上皮内瘤变的方法
技术领域
本发明属于基因治疗领域，本发明公开了包括针对高危型人乳头瘤病毒E6E7癌基因序列构建靶向CRISPR/Cas9质粒的方法，并用CRISPR/Cas9靶向敲除高危型人乳头瘤病毒E7癌基因的方法。
背景技术
宫颈癌是世界范围内女性发病率仅次于乳腺癌的恶性肿瘤(E.P.Armstrong等，Managed Care Pharmacy杂志，2010，16：217-230)。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPVs)，尤其是HPV16和HPV18，被认为是宫颈癌发病的主要因素。癌蛋白E6和E7在HPV感染的早期表达，其中E6蛋白结合并讲解肿瘤抑制因子p53和促凋亡蛋白BAK从而增加宿主细胞对细胞凋亡的抵抗力并允许病毒DNA复制，E7蛋白则抑制肿瘤抑制性视网膜母细胞瘤1(RB1)释放E2F1转录因子，刺激细胞周期依赖性激酶2(CDK2)/细胞周期蛋白A以及CDK2细胞周期蛋白E复合物的形成，从而消除细胞周期停滞和刺激细胞增殖(Werness BA等，Science杂志，1990，248：76-79)。E6和E7在宫颈癌驱动癌变中的关键作用，使其成为治疗干预的目标。
既往研究表明，使用siRNA靶向HPV E6/E7mRNA可以有效地敲低其表达并诱导HPV阳性细胞系凋亡。然而，siRNA仅在时间上阻断HPV E6/E7mRNA，不会对细胞核中的HPV DNA发挥作用(Shillitoe,E.J，2006，Cancer gene therapy.13：445-450)。
CRISPR/Cas系统是新开发的可编程RNA引导内切核酸酶系统。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(single-guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割(Mali P等,Nature Methods,2013,10(10):957-963)。它已经成为包括原核生物，秀丽隐杆线虫和斑马鱼在内的许多生物体的强大基因组编辑工具。该系统由一个位点特异性单引导RNA(sgRNA)和一个Cas9酶组成，可以基本上以5’-N20NGG-3’的形式靶向任何基因组位点(P.Mali等,Science,2013,339：823–826)。在与sgRNA序列互补的基因组位点识别后，Cas9酶诱导双链断裂(DSBs)。DSB主要通过非同源末端连接(NHEJ)修复途径修复，导致靶基因的破坏(E.Heidenreich等,The EMBOJournal,2003,22:2274–2283)。
我们设计了成簇规律间隔的短回文序列相关联的Cas9系统(CRISPR/Cas9)，以直接切割癌基因E7的DNA序列，而不是针对RNA。由CRISPR/Cas9切割产生的双链DNA断裂通过NHEJ途径修复，导致靶基因E7的破坏和消除，可以有效降低病毒的DNA载量，恢复肿瘤抑制因子RB1的功能，并逆转宿主细胞在体外和体内的恶性表型。本发明为HPV持续感染及相关疾病药物的研发提供了新的见解。
发明内容
目前认为高危型HPV的持续感染是导致宫颈癌发生的最主要原因。宫颈癌的发生和发展依次经过宫颈不典型增生，宫颈原位癌，早期浸润癌和宫颈癌的过程，其中宫颈不典型增生和原位癌均为与宫颈癌发生密切相关的癌前病变，称为宫颈上皮内瘤变。用于治疗宫颈上皮内瘤变的方式主要有激光、冷冻、手术切除等有创性手术方式。本发明采取经阴道转染CRISPR/Cas9质粒的方式在K14-HPV16宫颈上皮内瘤变小鼠模型中取得突破性进展，观察到小鼠宫颈上皮内瘤变回退。
本发明的目的是提供一种利用CRISPR/Cas9技术敲除高危型人乳头瘤病毒E6E7基因的应用方法。
本发明中所述的高危型人乳头瘤病毒包括但不限于HPV16和HPV18两种最常见的HPV亚型。
为了实现本发明的目的，本发明采取了如下技术方案：
针对高危型HPV E6E7基因序列的成簇规律间隔的短回文序列相关联的Cas9系统(CRISPR/Cas9)，能特异性的高效识别并切割高危型HPV E7基因序列；
所述的CRISPR/Cas9由识别高危型HPV E7基因序列的sgRNA和Cas9组成；所述的sgRNA由crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成的复合物，可引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA；
本发明提供上述靶向高危型HPV E7基因的定点修饰系统的制备方法，包括以下步骤：
以下步骤以高危型HPV亚型HPV16为例，但不限于这种亚型。
根据高危型人乳头瘤病毒E7基因序列，设计sgRNA，其作用的DNA序列分别为：HPV16E7碱基序列(NCBI数据库RefSeq:NC_001526.2和NC_001357.1)。所述设计并非简单的根据在线软件来设计，而是通过发明人近百种gRNA中筛选得到的特异性适合体内治疗的gRNA。
构建CRISPR/Cas9的真核表达载体。选定位点后，构建按照George Church等报道的方法进行构建(Mali P等Science,2013,339(6121):823)，构建后通过测序确保碱基序列正确。
本发明提供利用CRISPR/Cas9治疗K14-HPV16阳性小鼠宫颈上皮内瘤变的方法。
具体方案如下：
针对高危型HPV癌基因序列设计靶向的CRISPR/Cas9的序列，然后将靶向序列构建至质粒骨架中，经过测序筛选，得到序列正确的系统验证其效率。进一步在高危型HPV16阳性的细胞系中进行验证其敲减及敲弱的效率，筛选出效果较好的系统。在K14-HPV16宫颈上皮内瘤变小鼠模型中，将小鼠使用1％戊巴比妥钠麻醉后，经阴道给予筛选出的效果较好的CRISPR/Cas9质粒系统，与体内转染试剂混合孵育后共转入阴道，停留约30分钟以上，持续给药三天，间隔三天，四个周期结束后，检测小鼠宫颈上皮内瘤变情况的变化，以及相应癌基因的敲减情况和癌蛋白表达变化。
本发明进一步提供以下技术方案：
在CRISPR/Cas9系统中特异性敲除HPV16E7基因的gRNA，所述gRNA在HPV16E7基因基因上的靶序列符合5'-N(20)-NGG-3'或者5'-CCN-N(20)-3'的序列排列规则，在HPV16E7基因上的靶序列是唯一的，所述gRNA依照5’-3’的顺序序列如ACGCCTTACATACCGCTGTT所示。
上述的gRNA进一步在制备特异性敲除HPV16E7基因的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种药物，其包含上述gRNA的药物。
上述gRNA或上述包含gRNA的药物在制备特异性治疗宫颈癌的药物中的应用。该应用优选，gRNA表达质粒与hCas9质粒一起给药。
其给药方式优选为阴道给药。
另外本发明的gRNA还可以在制备治疗宫颈癌小鼠模型的药物中的应用，其中宫颈癌小鼠模型为K14-HPV16阳性小鼠，所述疾病为宫颈上皮内瘤变。
进一步优选，在K14-HPV16宫颈上皮内瘤变小鼠模型中，将小鼠使用1％戊巴比妥钠麻醉后，经阴道给予筛选出的效果较好的CRISPR/Cas9质粒系统，与体内转染试剂混合孵育后共转入阴道，停留约30分钟以上，持续给药三天，间隔三天，四个周期结束后，检测小鼠宫颈上皮内瘤变情况的变化，以及相应癌基因的敲减情况和癌蛋白表达变化。
2016ACGO最新指南指出，处于宫颈上皮内瘤变的患者，可行宫颈锥切术或LEEP治疗，也可选用冷冻、激光、微波等物理治疗，严重者可行子宫切除术。本发明采用经阴道体内质粒转染的方式，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术破坏靶基因E7，降低病毒载量，恢复肿瘤抑制因子RB的功能，从而逆转宿主细胞的恶性表型，大大降低治疗成本以及患者的心理负担。CRISPR/Cas9基因编辑技术在K14-HPV16宫颈上皮内瘤变的小鼠动物模型中发挥的作用使其成为治疗宫颈上皮内瘤变的非常有前景的治疗方式。
附图说明
图1为在K14-HPV16阳性小鼠阴道注射CRISPR/Cas9后宫颈上皮组织学改变及癌蛋白E7以及下游相关基因蛋白表达的变化。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
在本实施例中，真核表达质粒gRNA-GFP-T1(plasmid#41819)和hCas9(plasmid#41815)购自addgene公司。如无特殊说明，所使用的引物均由Primer3 Plus在线引物设计工具
(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计完成，引物合成以及测序由武汉擎科生物技术有限公司完成；构建所使用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶购自美国Thermo Scientific公司；PCR产物回收试剂盒，胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自Omega公司。
一.构建sgRNA表达载体
申请人根据HPV16 E7基因的特性，通过条件优化以及前期大量的筛选，获得了具有较好效果的gRNA。其序列为：HPV16 E7-gRNA的序列ACGCCTTACATACCGCTGTT，PAM序列为AGG，其靶向的DNA的序列为AACAGCGGTATGTAAGGCGT。阳性对照组为HPV E7-gRNA4(Hu Z等，BioMed Research International，2014，2014(3):612823)。按照George Church等报道的方法进行构建(Mali P等Science,2013,339(6121):823)，构建后通过测序确保碱基序列正确。再次克隆测序鉴定，挑选正确克隆进行扩增并提取质粒。质粒的扩增、提取参照《分子克隆实验指南》第二版。
二.利用CRISPR/Cas9治疗K14-HPV16阳性小鼠宫颈上皮内瘤变
(1)K14-HPV16小鼠的繁殖与鉴定
在SPF级动物饲养室，将K14-HPV16小鼠雌雄分开，每笼2～3只进行饲养。取鼠尾或脚趾进行组织PCR鉴定，组织DNA提取采用Omega公司的Tissue DNA kit(货号D3396-01),测定浓度后进行PCR验证，(引物序列为JA7：AGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAG，JA4：TCTGCAACAAGACATACATCGACCGG)，1％琼脂糖凝胶电泳后，选择有条带的PCR产物进行测序，进一步确定基因型。将阳性雌雄小鼠按照2：1比例进行配种，仔鼠按照上述方法进行鉴定，选择雌性的阳性小鼠进行下一步的实验。
(2)小鼠阴道内转染体系的建立
小鼠阴道内质粒转染的方法参考Hu Z等(Hu Z等,Journal of ClinicalInvestigation,2015,125(1):425)。按照质粒：turbofect＝10μg:1.2μl的比例，用5％的葡萄糖溶液配制成25μl的体系，体外孵育后，注入用1％戊巴比妥钠麻醉并经生理盐水冲洗过的小鼠阴道内。同时转染HPV16E7-gRNA4+hCas9质粒做阳性对照。连续转染三天后间隔三天，共转染四个周期后将小鼠处死，取宫颈石蜡包埋切片。
(3)小鼠宫颈的组织切片及癌蛋白表达鉴定
取石蜡包埋的小鼠宫颈切片HE染色后显微镜下观察组织变化。宫颈切片的白片用作免疫组化检测HPV16E7癌蛋白及下游相关蛋白的表达(结果如图所示)。
结果显示，经CRISPR/Cas9处理的K14-HPV16小鼠宫颈上皮内瘤变得到逆转，被替换为正常表现的分化良好的宫颈上皮。而RB1的功能也得到了恢复，其下游基因CDK2和E2F1也明显减少。恶性增殖指标Ki67也明显减少。而本发明使用的gRNA序列比阳性对照的效果更为明显，效果更佳显著，更加适宜于体内治疗，而非细胞学实验。

Claims (9)

1.在CRISPR/Cas9系统中特异性敲除HPV16 E7基因的gRNA，所述gRNA在HPV16 E7基因基因上的靶序列符合5'-N(20)-NGG-3'或者5'-CCN-N(20)-3'的序列排列规则，在HPV16 E7基因上的靶序列是唯一的，其特征在于:所述gRNA依照5’-3’的顺序序列如ACGCCTTACATACCGCTGTT所示。
2.根据权利要求1所述的gRNA在制备特异性敲除HPV16 E7基因的试剂盒中的应用。
3.含有权利要求1所述的gRNA的药物。
4.权利要求1所述的gRNA或权利要求3所述的药物在制备特异性治疗宫颈癌的药物中的应用。
5.根据权利要求3所述的药物或者权利要求4的所述的应用，其中gRNA表达质粒与hCas9质粒一起给药。
6.根据权利要求4所述的应用，其中用药方式为阴道给药。
7.权利要求1所述的gRNA在制备治疗宫颈癌小鼠模型的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其中宫颈癌小鼠模型为K14-HPV16阳性小鼠，所述疾病为宫颈上皮内瘤变。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，在K14-HPV16宫颈上皮内瘤变小鼠模型中，将小鼠使用1％戊巴比妥钠麻醉后，经阴道给予筛选出的效果较好的CRISPR/Cas9质粒系统，与体内转染试剂混合孵育后共转入阴道，停留约30分钟以上，持续给药三天，间隔三天，四个周期结束后，检测小鼠宫颈上皮内瘤变情况的变化，以及相应癌基因的敲减情况和癌蛋白表达变化。
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