CN101380478A

CN101380478A - 荧光可视高转移人肝癌裸鼠模型的建立方法

Info

Publication number: CN101380478A
Application number: CNA2007100456758A
Authority: CN
Inventors: 吴伟忠; 孙惠川; 汤钊猷; 王鲁; 夏景林; 杨毕伟; 梁英; 徐泱
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2007-09-06
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2009-03-11

Abstract

本发明属微生物动物细胞系领域，涉及可自发高强度红色或绿色荧光，具转移能力的荧光可视人肝癌裸鼠模型的建立方法。本发明用假慢病毒感染的方法获得荧光基因高染色体整合度、高荧光强度、表达稳定的人高转移荧光肝癌细胞系HCCLM3－R，HCCLM3－G，HCCLM6－R和HCCLM6－G后，置荧光表达肝癌细胞于裸鼠皮下建立荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下肿瘤模型或置皮下荧光表达肿瘤组织至裸鼠肝脏，建立荧光可视高转移人肝癌裸鼠肝脏原位肿瘤模型。所得模型可作为动物在体肝癌细胞的示踪，可用于肝癌复发与转移的分子机理研究，以及抗肝癌新疗法和抗肝癌新药临床前期的疗效判别等。

Description

荧光可视高转移人肝癌裸鼠模型的建立方法

技术领域

本发明属微生物动物细胞系领域，涉及高转移人肝癌裸鼠模型的建立方法，具体涉及红色荧光或绿色荧光可视、具高转移能力的人肝癌裸鼠模型的建立方法。

背景技术

原发性肝细胞癌是我国乃至全球的高发恶性肿瘤之一。在我国每年约有20万人死于肝癌，占全球肝癌死亡人数的一半左右。原发性肝细胞癌已日益成为严重影响我国人们健康的一种重大恶性疾病。近年来，各国政府、相关医疗和科研机构以及药物研发企业加大了对原发性肝细胞癌的临床与基础研究及新药研制工作。尽管临床上已有多种方法用于肝癌的治疗，如手术切除、肝动脉化疗栓塞(TACE)、外放射治疗、瘤内酒精注射(PAI)、微波固化治疗(PMCT)、射频消融(RFA)、激光热疗(LTT)及肝移植等，但疗效均十分有限。肝癌患者五年的复发与转移率高达60％，总体生存率仍低于5％。总而言之，现有治疗手段未能显著延长肝癌患者的生存期、改善病人的生存质量。这可能肝癌的发病隐匿，肿瘤细胞容易早期播散；传统疗法不能彻底消灭患者机体中的肝癌细胞；传统疗法存在较大的毒副作用，限制其在临床上的反复应用；以及肝癌复发与转移的机理不明有关。为促进肝癌复发与转移分子机理的探索，寻找新的药物治疗靶点，开发有效的抗肝癌新药和探索新的治疗方法，在国内外迫切需要建立一个可用于新药物及新疗法临床前期研究的荧光可视高转移人肝癌动物模型。现有技术公开了人肝癌动物模型包括:复旦大学肝癌研究所建立的人肝细胞癌裸小鼠模型(肿瘤1986，6:10-13)、高转移人肝细胞癌裸小鼠模型(Int JCancer 1996，66:239-243)、高转移人肝细胞癌细胞系HCCLM3和HCCLM6(J Cancer Res Clin Oncol.2004；130:187-196；J Cancer ResClin Oncol.2004；130:460-468；中华医学杂志.2004；84:675-679；Cancer Genet Cytogenet.2005；158:180-183；和Clin Cancer Res.2006；12:7140-7148)以及可稳定表达红色或绿色荧光能转移的人肝癌细胞系HCCLM3-R，HCCLM3-G，HCCLM6-R和HCCLM6-G(申请中国专利)。研发新一代稳定表达红色或绿色荧光的人高转移肝癌裸鼠模型，为实现肝癌研究领域中肝癌细胞复发与转移的实时、整体、连续和定量观察已成为本领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种荧光可视高转移人肝癌裸鼠模型的建立方法，本方法能建立长期稳定表达的、红色或绿色荧光可视的、高转移人肝癌裸鼠皮下或肝脏原位模型。

本发明采用假慢病毒荧光蛋白编码基因的转染技术，建立红色或绿色荧光示踪的肝癌细胞及其相应荧光可视人肝癌裸鼠转移模型，经动物体内连续4代，经100天的实验观察，结果显示，本肝癌转移模型具有自发荧光强、表达稳定；荧光不易衰减和淬灭；各代肝癌组织荧光强度均一，实验重复性好；与传统的免疫组织化学染色方法相比较，荧光示踪方法在观察裸鼠肝、肺和淋巴结组织中的肝癌转移瘤方面具有发现时间早、准确率高、操作方便等特点。

本发明所述的荧光蛋白是具有序列1的红色荧光蛋白(RFP)或具有序列2的绿色荧光蛋白(GFP)。

本发明所建立的荧光可视人高转移肝癌裸鼠皮下或肝脏原位模型均不改变原有人肝癌裸鼠转移模型中的肿瘤细胞生物学功能和特性，是理想的研究人肝癌早期复发与转移生物学规律和客观评价抗肝癌新药疗效的荧光可视肿瘤动物观察模型。具有广泛的实际应用前景和潜在而巨大的社会与经济价值。

本发明通过下述方法和步骤实现:

选择三种慢病毒包装质粒pLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G(Tronolab公司)，通过在大肠杆菌中的质粒DNA扩增、回收和纯化，将所得的三种纯化质粒DNA按一定比例用CaCl2共转染293T细胞，包装成真核表达RFP或GFP的假慢病毒颗粒，感染已克隆到的肺、淋巴结高转移人肝癌细胞系HCCLM3和HCCLM6(复旦大学肝癌研究所)，获得高强度、染色体整合型、稳定表达红色或绿色荧光的人高转移肝癌细胞系HCCLM3-R，HCCLM3-G，HCCLM6-R和HCCLM6-G(申请国家专利)，将上述荧光表达肝癌细胞置裸鼠皮下，建立荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下肿瘤转移模型，经移植皮下荧光肝癌组织至裸鼠肝包膜下，建立荧光可视高转移人肝癌裸鼠肝脏原位肿瘤转移模型，分别命名为:

HCCLM3-R-BALB/C-nu/nu-SUB(红色荧光，皮下模型)，

HCCLM3-R-BALB/C-nu/nu-LIV(红色荧光，肝脏模型)，

HCCLM3-G-BALB/C-nu/nu-SUB(绿色荧光，皮下模型)，

HCCLM3-G-BALB/C-nu/nu-LIV(绿色荧光，肝脏模型)，

HCCLM6-R-BALB/C-nu/nu-SUB(红色荧光，皮下模型)，

HCCLM6-R-BALB/C-nu/nu-LIV(红色荧光，肝脏模型)，

HCCLM6-G-BALB/C-nu/nu-SUB(绿色荧光，皮下模型)，

HCCLM6-G BALB/C-nu/nu-LIV(绿色荧光，肝脏模型)。

本发明所获得的荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下或肝脏原位肿瘤转移模型具有以下特征:

1、由于采用了经过基因改造的红色荧光及绿色荧光蛋白编码基因，所获得的荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下或肝脏原位模型具有肿瘤组织自发荧光强度高，不易衰减和淬灭，易于实时、整体、连续和定量实验观察。

2、由于采用了假慢病毒感染新策略，极大地提高了荧光蛋白编码基因的细胞转染效率和染色体整合效率，使得模型中不同代数肝癌组织的荧光表达稳定、强度均一，从而提高了实验的可重复性。

3、本发明所获得的荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下或肝脏移植瘤中的红色荧光可在激发波长为560nm、发射波长为585nm的条件下，用荧光解剖显微镜进行直接地观察；移植瘤中的绿色荧光可在激发波长为488nm、发射波长为509nm的条件下，用荧光解剖显微镜进行直接地观察。移植瘤荧光观察可在麻醉活体动物中进行；肝癌转移瘤的生长和数量判定可在已处死动物的相应脏器中进行。荧光示踪方法能明显提高早期转移瘤的检测敏感性、准确性和方便性。

4、本发明所获得荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下或肝原位肿瘤转移模型，其特征是肿瘤组织能稳定发射红色或绿色荧光，荧光可视模型中的肝癌生长与转移等主要生物学行为与其相应的母代肿瘤模型基本一致。

结果表明，本发明用假慢病毒感染的方法获得高染色体整合度、高荧光强度、遗传性状稳定的人高转移荧光肝癌细胞系HCCLM3-R，CCLM3-G，HCCLM6-R和HCCLM6-G后，置荧光表达肝癌细胞至裸鼠皮下建立荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下肿瘤模型；置皮下荧光表达肿瘤组织至裸鼠肝脏，建立荧光可视高转移人肝癌裸鼠肝脏原位移植肿瘤模型。本发明的荧光可视高转移人肝癌裸鼠转移模型具有自发荧光强、表达稳定；荧光不易衰减和淬灭；荧光强度均一，实验重复性好；操作方便等特点。是理想的研究人肝癌复发与转移生物学规律以及观察药物疗效的荧光可视肝癌裸鼠转移模型，具有广泛的实际应用前景和潜在而巨大的社会与经济价值。

附图说明

图1是红色荧光可视人高转移肝癌裸鼠皮下和肝脏原位移植肿瘤转移模型及其肺转移灶。

图2是绿色荧光可视人高转移肝癌裸鼠皮下和肝脏原位移植肿瘤转移模型及其肝转移灶。

具体实施方式

实施例1

1、慢病毒包装质粒(Lentivirual vector)的选择:在本发明中红色与绿色荧光蛋白编码基因的细胞转染采用假慢病毒载体系统(Tronolab公司)，由pLVTHM，pCMV-dR8.74和pMD2G三种质粒组成。其中pLVTH含有红色荧光蛋白(RFP)或绿色荧光蛋白(GFP)编码基因，在EF1(Elongation Factor)启动子驱动下表达。pCMV-dR8.74含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因编码病毒特异性的酶；rev基因编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pMD2G含有单纯疱疹病毒来源的VSVg基因，提供病毒包装所需要的衣壳蛋白。

2、质粒DNA的扩增:按常规方法，选用大肠杆菌扩增pLVTHM、pCMV-dR8.74和pMD2G质粒DNA，用DNA提取试剂盒(Qiagen公司)和琼脂糖凝胶回收试剂盒(Promega公司)进行质粒DNA的抽提和纯化。

3、假慢病毒的包装与纯化:用CaCl2法将10μg pLVTHM，5μgpCMV-dR8.74和3.5μg pMD2G的质粒DNA共转染新鲜培养、融合度为50％-70％的293细胞(上海吉凯公司)，在37℃、5％CO2条件下培养12小时后，用新鲜细胞培养液替换转染液，收集、纯化72小时后经293细胞包装后的假慢病毒颗粒。

4、病毒滴度的测定:将5×10⁵/100μl/孔的293细胞铺在96孔板中。假病毒颗粒以10倍的稀释度用DMEM培养液连续稀释。12小时后吸尽96孔板中的细胞培养液，加人45μl病毒颗粒稀释液，37℃温育36小时后，更换含10％FBS的新鲜培养液，3天后在倒置荧光显微镜下检测GFP或RFP的表达量。以5个克隆细胞均为阳性的病毒最高稀释度为该批病毒的最终滴度。

5、HCCLM3和HCCLM6细胞的病毒感染:将1×10⁶/2ml/孔的HCCLM3和HCCLM6细胞铺在6孔板中，12小时后吸尽细胞培养上清液，加入2ml5×10⁵-1×10⁶TU/ml病毒感染液，48小时后换用新鲜细胞培养液，72小时后观察荧光表达细胞的阳性率。若HCCLM3和HCCLM6细胞的病毒感染率小于95％时，可在培养液中加入400ng/ml的G418，以杀灭低表达或不表达荧光的肝癌细胞。

6、荧光表达细胞的扩增及表达稳定性的鉴定:红色或绿色荧光表达的HCCLM3和HCCLM6细胞，经体外180天的连续传代培养，检测荧光的表达强度及表达率改变。

7、建立荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下和肝脏原位移植肿瘤模型:将1×10⁷/0.2ml的荧光表达肝癌细胞无菌条件下置4-6周龄、体重为20g的雄性BALB/C-nu/nu裸小鼠皮下(中国科学院上海药物研究所)，在无特殊病原体环境下饲养1-2周后，肝癌皮下瘤生长至直径约1.0cm，取皮下瘤切成直径1mm的肿瘤组织小块，原位移置裸鼠肝包膜下，1-2周后用荧光解剖显微镜对活裸鼠中的移植瘤进行实时、连续和定量的观察，可对裸鼠的各脏器中的肝癌的转移灶进行荧光观察，确定转移瘤的大小和数目。

8、荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下和肝脏原位移植肿瘤模型的生物学特性鉴定:观察荧光移植瘤的生长、转移等特性，荷瘤裸鼠的生存期、AFP的分泌情况等。

结果显示，本发明的荧光可视高转移人肝癌裸鼠转移模型具有自发荧光强、表达稳定；荧光不易衰减和淬灭；荧光强度均一，实验重复性好；操作方便等特点。肿瘤组织能稳定发射红色或绿色荧光，荧光可视模型中的肝癌生长与转移等主要生物学行为与其相应的母代肿瘤模型基本一致。

表1是HCCLM3、HCCLM3-R及HCCLM3-G裸鼠移植模型生物学特性的比较。

表2是HCCLM6、HCCLM6-R及HCCLM6-G裸鼠移植模型生物学特性的比较。

表1

表2

SEQUENCE LISTING

<110>复旦大学附属中山医院

<120>荧光可视高转移人肝癌裸鼠模型的建立方法

<130>11

<160>2

<170>Patent In vers ion3.1

<210>1

<211>675

<212>DNA

<213>昆虫

<400>1

<210>2

<211>720

<212>DNA

<213>昆虫

<400>2

Claims

1、荧光可视高转移人肝癌裸鼠模型的建立方法，其特征是采用假慢病毒荧光蛋白编码基因的转染技术，建立红色或绿色荧光示踪的肝癌细胞及其相应荧光可视人肝癌裸鼠转移模型，所述肝癌细胞是HCCLM3-R，CCLM3-G，HCCLM6-R或HCCLM6-G，所述的荧光蛋白是具有序列1的红色荧光蛋白RFP或具有序列2的绿色荧光蛋白GFP，所述的荧光可视高转移人肝癌裸鼠模型其肝癌组织稳定发射红色或绿色荧光。

2、按权利要求1所述的方法，其特征是包括下述步骤:

1)选择慢病毒包装质粒:采用假慢病毒载体系统进行红色与绿色荧光蛋白编码基因的细胞转染；

2)质粒DNA的扩增；

3)包装与纯化假慢病毒颗粒；

4)测定病毒滴度，以5个克隆细胞均为阳性的病毒最高稀释度为病毒的最终滴度；

5)病毒感染母细胞HCCLM3和HCCLM6；

6)荧光表达细胞的扩增及表达稳定性的鉴定；

7)建立荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下或肝脏原位移植肿瘤模型:将上述1×10⁷/0.2ml的荧光表达肝癌细胞置裸小鼠皮下，1-2周后，取皮下瘤组织小块，原位移置裸鼠肝包膜下，1-2周后用荧光解剖显微镜对活裸鼠中的移植瘤进行实时、连续和定量的观察及生物学特性鉴定。

3、按权利要求1或2所述的方法，其特征是其中所述的荧光可视高转移人肝癌裸鼠模型自发红色或绿色荧光，根据其移植瘤生长的位置和所发射荧光种类的不同，分别命名为:

红色荧光，皮下模型，HCCLM3-R-BALB/C-nu/nu-SUB；

红色荧光，肝脏模型，HCCLM3-R-BALB/C-nu/nu-LIV；

绿色荧光，皮下模型，HCCLM3-G-BALB/C-nu/nu-SUB；

绿色荧光，肝脏模型HCCLM3-G-BALB/C-nu/nu-LIV；

红色荧光，皮下模型HCCLM6-R-BALB/C-nu/nu-SUB；

红色荧光，肝脏模型，HCCLM6-R-BALB/C-nu/nu-LIV；

绿色荧光，皮下模型，HCCLM6-G-BALB/C-nu/nu-SUB；

绿色荧光，肝脏模型，HCCLM6-G BALB/C-nu/nu-LIV。

4、按权利要求1或2所述的方法，其特征是所建立的荧光可视高转移人肝癌裸鼠皮下或肝脏原位肿瘤转移模型，其荧光表达强，MOI>90)表达稳定，不易传代而衰减和淬灭，保留母代肝癌裸鼠转移模型中肿瘤生长与转移的生物学性状，能对活体动物的移植瘤进行实时、连续和定量观察。