CN107513520B

CN107513520B - 一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法及相应细胞

Info

Publication number: CN107513520B
Application number: CN201710126993.0A
Authority: CN
Inventors: 刘超; 施祥德; 吴文睿; 许磊波; 余先焕; 张锐
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2017-03-06
Filing date: 2017-03-06
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2037-03-06
Also published as: CN107513520A

Abstract

本发明提供了一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法及以此方法筛选出的稳定肝癌细胞，方法包括如下步骤：S1：对大鼠成体肝干细胞进行扩增、培养并保存；S2：采用基因转染技术将含有Notch1基因的慢病毒载体转入大鼠成体肝干细胞，获得稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞；S3：利用稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞，采用选择性条件培养法进行培养，使其在体外进一步分化，筛选出致瘤能力强及稳定的肝癌细胞；S4：采用筛选出的肝癌细胞，通过同种属的原位肝脏移植瘤模型，可在肝脏形成肝癌，并伴自发形成双肺转移瘤，从而获得高转移肝癌细胞。采用本发明的方法筛选出的稳定肝癌细胞成瘤时间短、致瘤性好、具有肺转移能力。

Description

一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法及相应细胞

技术领域

本发明涉及一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法及相应细胞。

背景技术

肝癌是我国常见的恶性肿瘤，具有起病隐匿、进展迅速、易于早期经血道转移、难以根治等特点，预后很差。尽管在肝癌的早期诊断、手术切除和综合治疗等方面均取得了长足的进步，但近十余年来肝癌的五年生存率提高并不明显。肝癌术后复发一直是制约肝癌治疗效果的主要原因。近年来发现肿瘤干细胞与肿瘤的形成、发展、转移及复发、耐药有着很大的相关性。肿瘤干细胞学说认为大部分肿瘤来源于已转化成肿瘤起源细胞的单个细胞(肿瘤干细胞),只有肿瘤干细胞具有无限增殖、多向分化和体内外形成肿瘤的能力。随着研究的深入，研究者开始探讨这一功能上与组织干细胞十分相似的细胞类型，本质上是否就是由正常组织干细胞恶性转变而来。正常干细胞与肿瘤干细胞可能具有相同的信号通路，区别在于这些信号通路在肿瘤干细胞是高度激活和/或紊乱。对肝癌干细胞发生癌变机制的探讨，将揭示其在肝癌发生、发展和转移，以及耐药和复发过程中的作用，为研究肝癌新的诊断治疗方法提供理论依据。

肝脏内胆管树的末梢区域，即相当于组织学上的郝令氏管区，存在具有双向分化潜能的上皮细胞。这些细胞核质比大，胞核圆形或卵圆形，被称之为肝卵圆细胞。目前普遍认为，肝卵圆细胞就是成体肝组织内的干细胞，即成体肝干细胞。大量增殖的卵圆细胞沿肝实质向肝小叶中央区迁移，可分化为成熟的肝细胞，修复和重建肝脏。与此同时，卵圆细胞也可以向胆管上皮细胞分化，参与肝内胆管的形成。而肝癌可能通过成体肝干细胞(“卵圆细胞”)的分化受阻分别形成肝细胞型、胆管细胞型和混合型肝癌。

由正常干细胞、祖细胞、分化细胞转化为肿瘤干细胞必须满足两个条件：一是基因突变或染色体畸变，二是肿瘤微环境因子功能失调。因此，肿瘤干细胞起源于突变基因或畸变染色体与恶劣环境因素对正常细胞的转化作用。多项研究显示正常的F344大鼠成体肝干细胞WB-F344在选择性条件培养条件下，能够自发获得裸鼠皮下致瘤能力，形成肝癌。由大鼠成体肝干细胞WB-F344恶性转化的异倍体肝癌细胞株GP7TB，也可在同系大鼠肝内形成分化较好的肝癌。信号通路在干细胞发生恶性转化中扮演了重要的调控角色。其中Notch信号通路可影响细胞正常形态发生的多个过程及干细胞“干性”维持、肿瘤发生发展等。国外研究发现，Notch信号通路的异常激活可以促使肝脏肿瘤的发生：例如异常激活裸鼠肝脏肝细胞的 Notch1表达，可在裸鼠肝脏内形成肝细胞癌；或者上调肝细胞的Notch1和 Rb基因，可以诱导成体肝细胞在裸鼠体内产生胆管细胞癌.因此调控 Notch1通路，及联合具有选择压力的培养条件，为成体肝干细胞体外诱导分化为肝癌细胞提供了有效途径；为研究肝癌癌变和转移的机制提供实验基础。

肝癌术后易复发，复发部位常见肝内或远处肺转移。恶性转变的正常细胞获得致瘤性同时能否获得能够转移的能力，目前尚未清楚。同时目前研究肝癌肺转移的模型局限，人源的肝癌发生肺转移差，动物原位肝脏移植瘤局限于免疫缺陷小鼠，成功率低，死亡率高。

现有技术中，采用未转染任何基因的大鼠成体肝干细胞，通过连续传代培养方法8-12周期后，可以自发形成肿瘤，但所需处理时间长，自发成瘤率低，且恶性转化的细胞无肺转移能力。

采用Notch1基因转染成体肝干细胞或者肝细胞，不做连续传代处理，则只能够形成肿瘤，且裸鼠肝内成瘤时间长，致瘤性低，未见报道有肺转移发生。

若采用其他基因转染成体肝干细胞或者肝细胞，不做连续传代处理，虽然能够形成肿瘤，但成瘤时间不肯定，致瘤性低，且未见肺转移。

上述方式的缺陷在于得到的肝癌细胞不稳定，且成瘤时间长、致瘤性差、不具有肺转移能力。

因此，如何提供一种可筛选出成瘤时间短、致瘤性好、具有肺转移能力及稳定肝癌细胞的方法,成为了业界需要解决的问题。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明的目的是提供一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法，其可筛选出成瘤时间短、致瘤性好、具有肺转移能力的稳定肝癌细胞。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法，其包括如下步骤：

S1：对大鼠成体肝干细胞进行扩增、培养并保存；

S2：采用基因转染技术将含有Notch1基因的慢病毒载体转入大鼠成体肝干细胞中，获得稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞；

S3：利用稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞，采用选择性条件培养法，使其在体外进一步分化，筛选出致瘤能力强及稳定的肝癌细胞；

S4：采用筛选出的肝癌细胞，通过同种属的原位肝脏移植瘤模型，可在肝脏形成肝癌，并伴自发形成双肺转移瘤，从而获得高转移肝癌细胞。

本发明证明成体肝干细胞可以作为肝癌的细胞起源；恶性转化的大鼠成体肝干细胞，能够在获得致瘤性的同时拥有远处肺部转移能力：在同种属的大鼠原位肝脏形成肝癌，并自发形成双肺转移瘤。

根据本发明另一具体实施方式，步骤S2中，通过基因测序确认 Notch1基因是否已插入慢病毒载体。

根据本发明另一具体实施方式，步骤S2中，通过观察GFP阳性率，并利用Westernblot检测细胞过表达效果，筛选出稳定过表达 Notch1的大鼠肝干细胞(WB-F344-Notch1)。

根据本发明另一具体实施方式，步骤S3包括多次重复的选择性条件培养法，每一周期所述选择性条件培养法的内容包括：

a：反复更换细胞培养液，持续时间为4周；

b：细胞培养液采用选择性条件培养的改良Richter培养液；

c：每周期培养后需观察细胞形态并记录；

d:每周期培养后将细胞分为三组，一组为用于验证致瘤性的评估组，一组为用于冷冻存样的冻存组，一组为用于下一培养周期的继续培养组。

根据本发明另一具体实施方式，通过观察细胞形态，筛选出细胞形态学上稳定的肝癌细胞。

根据本发明另一具体实施方式，通过裸鼠皮下成瘤，来评估细胞的致瘤性，筛选出致瘤能力强的肝癌细胞。

根据本发明另一具体实施方式，致瘤性包括成瘤率和肿瘤大小。

根据本发明另一具体实施方式，步骤S3中，通过免疫组织化学方法确定裸鼠皮下肿瘤类型。

另一方面，本发明提供了一种采用上述方法制备的细胞，其成瘤时间短、致瘤性好、具有肺转移能力。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明优选Notch1基因的胞内段，转染大鼠成体肝干细胞，获得稳定过表达Notch1的成体肝干细胞。利用选择性条件培养的传代方法，通过对每一周期的细胞形态学、皮下致瘤性和成瘤大小、肿瘤分子表型的变化进行评估，优选出第五代的恶性转化的细胞；再利用大鼠原位肝癌模型形成肝癌并发生肺转移。

下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。

附图说明

图1是实施例1中，荧光显微镜下，WB-F344-Notch1和WB-F344-NC 表达绿色荧光蛋白GFP，合并后转染效率大于95％。Western blot显示 WB-F344-Notch1细胞高表达Notch1蛋白；

图2是实施例1中，光学显微镜下，选择性条件培养法后，第1周期和第5周期的WB-F344-Notch1细胞形态、生长方式发生明显改变；

图3是实施例1中，第5周期的WB-F344-Notch1细胞可裸鼠皮下形成肿瘤，组织类型为低分化肝癌，表达CK7+,CK19+,AFP-,ALB-, Mucin1+；

图4是实施例1中，大鼠原位肝脏移植瘤模型中，第5周期的 WB-F344-Notch1细胞在同种属的肝脏形成低分化肝癌，且伴自发形成肺转移瘤。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法，同时提供了一种成瘤时间短、致瘤性好、具有肺转移能力的稳定肝癌细胞。

本实施例的具体实验方案如下：

S1.实施Fisher 344系大鼠成体肝干细胞WB-F344的扩增及培养

(1)WB-F344的复苏：常规消毒超净工作台，在无菌15mL离心管中加入10mL DMEM培养基，从液氮罐中取出冻存的大鼠成体肝干细胞WB-F344 一管，立即放置37℃的水浴箱中，并振荡，观察细胞悬液的解冻情况，待至约2/3解冻后把冻存管经75％酒精喷洒消毒后放入超净台，用吸管把细胞悬液转移至含有10mL培养基的离心管中，并吹打匀，进行1000rpm室温离心5分钟，弃去上清液，加入含有10％血清的5mL DMEM培养液，吹打均匀后转移至25cm²培养瓶中，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中。

(2)细胞换液及传代：当大鼠成体肝干细胞WB-F344扩增到70％-80％覆盖瓶底时进行传代。首先弃去瓶中旧液，用0.1M PBS清洗1遍，弃去 PBS，加入2mL 0.25％胰蛋白酶/0.04％EDTA消化液，消化2-3分钟，加入2mL 含有10％血清的DMEM培养液中和液，用吸管吹打至所有细胞脱壁，把细胞悬液转移至15mL离心管中，进行1000rpm室温离心5分钟，弃去上清液，加入5mL 10％血清的DMEM培养液，吹打均匀后等分至4个25cm²培养瓶中 (即1：4传代)，每瓶培养基补充至5mL，然后培养瓶放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱。

(3)大鼠成体肝干细胞WB-F344冻存：当ESC扩增到70％-80％覆盖瓶底时进行冻存。首先弃去瓶中旧液，用0.1M PBS清洗1遍，弃去PBS，加入2mL 0.25％胰蛋白酶/0.04％EDTA消化液，消化2-3分钟，加入2mL 10％血清的DMEM培养液中和液，用吸管吹打至所有细胞脱壁，把细胞悬液转移至15mL离心管中，进行1000rpm室温离心5分钟，弃去上清液，加入细胞冻存液重悬细胞，调整细胞浓度为1.0-1.2×10⁷/mL。将细胞悬液转移至冻存管，然后放置于含有异丙醇的梯度冻存盒，-80℃冻存。再转移至液氮罐保存。

大鼠成体肝干细胞WB-F344在传代后6-8小时后，逐渐在培养瓶中贴壁生长，细胞呈圆形，细胞核大，有一个或几个核仁，胞质胞浆少。形成边缘清楚的细胞克隆，克隆呈“巢状”或“岛状”，其中细胞排列紧密，与周围存在明显边界。每3-4天即可1：4传代一次。

S2.构建稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞(WB-F344-Notch1)

(1)慢病毒的包装及质粒的构建由广州永诺生物科技有限公司协作完成。慢病毒表达载体，本次实验采用LV003，即pCDH-CMV-GFP-Puro载体。本次实验采用大鼠Notch1胞内段(Notch1 intracellular domain，NICD) 进行扩增。选择Rat Notch1-NICD序列：NM_001105721.1进行扩增，Rat Notch1-NICD基因全长大小为2364bp，采用扩增引物序列：

Notch1-Rat-F1：5'AAAGAGTGAGACGGTGGAGCCT 3'

Notch1-Rat-R1：5'TTTGGTCGCCCCAGCATC 3'

Notch1-Rat-F2：

5'ATAGTCTAGAGCCACCATGGTGCTGCTGTCCCGCAAG 3'

Notch1-Rat-R2：

5'ACCGGAATTCTCACTTAAATGCCTCTGGAATGTGGG 3'

Lv003-Notch1-Rat表达载体测序结果表明大鼠Notch1基因的胞内段已成功插入到Lv003载体中，测序序列正确。Blast结果比对显示已经测出来的部分序列与Pubmed上序列100％一致。利用293T细胞包装慢病毒，LV- Notch1-Rat滴度检测结果为5×10⁸TU/mL。

(2)感染方法

按实验需要将细胞铺板。细胞数以第2天密度约30％为宜。37℃培养过夜。感染前，从冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒，用新鲜完全培养基稀释成所需浓度。吸去细胞原有培养基，将稀释好的病毒液加入细胞中。加入Polybrene(终浓度5ug/mL)，轻轻摇匀。37℃培养过夜。感染后第二天，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。感染后第三天，荧光显微镜下观察GFP阳性率，约为90％-95％。换上含适当浓度的Puromycin的新鲜完全培养液，筛选稳定转染的细胞株。10天至12天后可获得稳定表达目的蛋白的细胞。荧光显微镜下拍照观察GFP阳性率>95％。利用Western blot检测细胞过表达Notch1效果。稳定构建过表达Notch1的大鼠肝干细胞为WB-F344-Notch1；WB-F344-NC作为阴性对照组，按照步骤1方法培养及冻存。

S3.稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞(WB-F344-Notch1)的选择性条件培养

(1)稳定过表达细胞WB-F344-Notch1及其对照组WB-F344-NC扩增到 80％-90％覆盖瓶底时开始进行选择性条件培养。首先弃去瓶中旧液，用 0.1M PBS清洗2遍，弃去PBS，加入5mL选择性条件培养的改良Richter 培养液,随后放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱中继续培养。依据培养瓶中旧液的情况决定是否换液，通常间隔48小时-60小时全量换液1次。注意重复以上步骤时：PBS清洗需要轻柔，避免细胞成片脱落，反复给予细胞换液持续4周，此过程中始终不给予0.25％胰蛋白酶/0.04％EDTA消化，保持细胞紧密生长状态。

(2)选择性条件培养持续4周结束后，显微镜下观察细胞形态学变化情况及细胞边界是否清晰，细胞是否形成团块，并拍照记录。首先弃去瓶中旧液，用0.1M PBS清洗1遍，弃去PBS，加入2mL 0.25％胰蛋白酶 /0.04％EDTA消化液，消化3-4分钟，加入3mL连续选择改良的Richter培养液中和，用吸管吹打至所有细胞脱壁，把细胞悬液转移至15mL离心管中，进行1000rpm室温离心5分钟，弃去上清液，加入5mL选择性条件培养的改良Richter培养液，吹打均匀后等分至4个25cm²培养瓶(即1：4传代)，每瓶培养基补充至5mL，然后培养瓶放入37℃，5％CO₂的细胞培养箱中。2瓶细胞用于裸鼠的皮下成瘤实验评估其致瘤性，1瓶细胞冻存，1瓶细胞继续进行选择性条件培养。

(3)选择性条件培养4周时间为1周期，本次实验持续培养细胞长达 10周期。每一周期的操作如(1)，(2)和(4)步骤。

(4)裸鼠动物皮下移植瘤

每一周期选择性条件培养后的细胞，需要进行裸鼠皮下注射评价致瘤能力。消化、中和、重悬细胞，细胞计数，离心后弃去上清液，加入0.1M PBS，吹打均匀，调整细胞浓度为5.0×10⁶/mL。给予裸鼠背部两侧皮下注射200ul。每一周期皮下成瘤的裸鼠为3只。观察4周后处死动物，评价皮下肿瘤的成瘤率和肿瘤大小。联合HE染色及免疫组织化学方法检测CK7,CK19,AFP,ALB,Mucin1标记的表达，以评估肿瘤类型及肿瘤表达的标记是否稳定。通过评估每周期的裸鼠皮下成瘤及免疫组织化学方法确定肿瘤类型，发现稳定过表达细胞WB-F344-Notch1的致瘤性逐步增加，选择性条件培养第5周期的细胞形态学、肿瘤组织标记逐步稳定，皮下肿瘤类型为低分化肝癌。而WB-F344-NC对照组从第1周期到第10周期始终无法在裸鼠皮下形成肿瘤。

S4.大鼠原位肝脏移植瘤模型制作

本实验采取第5周期后的WB-F344-Notch1过表达稳定细胞作为实验细胞(C5WB-F344-Notch1)，本细胞株表达绿色荧光蛋白，可用于活体成像检测肿瘤。C5-WB-F344-NC作为阴性对照组。

(1)选取Fisher 344系雄性大鼠，体重160g-170g。10％水合氯醛麻醉动物，300-350ul/100g。腹腔注射麻醉成功后，脱毛，固定动物，酒精消毒2次，取腹部正中偏左切口暴露肝脏。暴露肝十二指肠韧带区域，3-0 慕丝线，结扎十二指肠上缘的胆总管。暴露左肝脏面，PBS重悬后的肿瘤细胞悬液150ul，细胞密度1×10⁷个/mL，胰岛素注射器沿肝门方向进针，深度1cm。注射后压迫出针部位的肝实质，压迫时间为5分钟。观察注射部位的肝实质血运情况，无渗血可立即关腹，消毒皮肤，纱布包扎，电热毯保持动物体温，直至苏醒为止。

(2)造模后3周、4周和4周以上给予药物过量麻醉(10％水合氯醛， 0.5-0.6mL/100g)后联合颈椎脱臼处死动物。病理发现肝脏存在低分化肝癌和双肺部转移灶形成。而阴性对照组C5WB-F344-NC未发现肝内肿瘤、无肺转移灶形成。

本实施例的实验结果说明如下：

步骤S1实施Fisher 344系大鼠WB-F344成体肝干细胞的扩增及培养

Fisher 344大鼠来源的WB-F344系成体肝卵圆细胞，属于成体肝干细胞，来源于上海东方肝胆医院馈赠。

步骤S2构建稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞

(1)Lv003-Notch1-Rat表达载体测序结果全长为:

CCAATTGGAGTAATAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATC CACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCCACCATGGTGCTGCTGTCCCGCAAGCGCA GGCGGCAGCATGGCCAGCTCTGGTTCCCTGAGGGTTTCAAAGTGTCAGAGGCCAGCAAGAAGAA GCGGAGAGAACCCCTCGGCGAGGACTCAGTCGGCCTCAAGCCCCTGAAGAACGCCTCAGATGGT GCCCTGATGGACGACAATCAGAACGAGTGGGGGGACGAAGACCTGGAGACCAAGAAGTTCCGGT TTGAGGAACCAGTGGTTCTCCCTGACCTGGATGATCAGACTGACCACCGGCAGTGGACCCAGCA GCACCTGGATGCCGCTGACCTACGTGTGTCTGCCATGGCCCCAACGCCGCCTCAGGGGGAGGTA GATGCTGACTGCATGGACGTCAATGTTCGAGGACCAGATGGCTTCACTCCCCTAATGATTGCCT CCTGCAGCGGAGGGGGCCTGGAGACAGGCAACAGTGAGGAAGAAGAAGATGCACCTGCTGTCAT CTCCGACTTCATCTATCAGGGTGCCAGCTTGCACAACCAGACGGACCGCACAGGGGAGACTGCC CTGCACCTGGCTGCCCGATACTCTCGTTCAGATGCTGCCAAGCGCTTGCTGGAGGCCAGCGCAG ATGCCAACATCCAAGACAACATGGGGCGTACCCCATTACATGCCGCTGTTTCTGCAGACGCTCA GGGTGTCTTCCAGATCCTGCTCCGGAACAGAGCCACAGATCTGGATGCCCGAATGCATGATGGC ACAACCCCTCTGATCCTGGCGGCACGCCTGCCGTGGAAAGCATGCTAGAGGACCTCATCAACTCTCACGCTGATGTCAATGCTGTGGATGACCTAGGCAAGTCAGCTCTGCACTGGGCAGCCGCTGTG AACAATGTGGACGCTGCTGTTGTGCTCCTGAAGACGGAGCCACCAAAGACATGCAGAACAACAA GGAGGAGACTCCCCTGTTCCTGGCCGCCCGTGAGGGCAAGCTATGAAGACCTGCCAAAGTGTTT GCTGGGACACACCTTTGGGGGGGGCGTACCATTACATGCCGCTGTTTCTGCAGACGCTCAGGGT GTCTTCCAGATCCTGCTCCGGAACAGAGCCACAGATCTGGATGCCCGAATGCATGATGGCACAA CCCCTCTGATCCTGGCGGCACGCCTGGCCGTGGAAGGCATGCTAGAGGACCTCATCAACTCTCA CGCTGATGTCAATGCTGTGGATGACCTAGGCAAGTCAGCTCTGCACTGGGCAGCCGCTGTGAAC AATGTGGACGCTGCTGTTGTGCTCCTGAAGAACGGAGCCAACAAAGACATGCAGAACAACAAGG AGGAGACTCCCCTGTTCCTGGCCGCCCGTGAGGGCAGCTATGAGACTGCCAAAGTGTTGCTGGA CCACTTTGCCAACCGGGACATCACGGATCACATGGACCGATTGCCACGGGACATTGCACAGGAG CGCATGCACCACGATATCGTGCGGCTTTTGGATGAATACAACCTGGTGCGCAGCCCACAGCTGC ATGGCACTGCCTTGGGTGGCACACCCACTCTGTCTCCCACACTCTGCTCGCCCAACGGCTACCT GGGCAACCTCAAGTCTGCCACACAGGGCAAGAAGGCCCGAAAGCCCAGCACCAAAGGGCTGGCT TGCAGTAGCAAGGAAGCTAAGGACCTCAAGGCCCGGAGGAAGAAGTCCCAGGATGGCAAGGGCT GCCTGTTGGACAGCTCAAGCATGCTGTCACCCGTGGACTCCCTCGAGTCACCCCATGGCTACTT GTCAGATGTGGCCTCACCACCCCTCCTTCCCTCCCCGTTCCAGCAGTCTCCATCCATGCCTCTC AGCCACCTGCCAGGTATGCCTGACACCCACCTGGGCATCAGCCACTTGAATGTGGCAGCCAAGC CCGAGATGGCAGCTCTGGCCGGAGGCAGCCGGTTGGCCTTTGAGCCACCCCCACCACGCCTCTC CCACCTGCCTGTAGCCTCCAGTGCCAGCACAGTGCTGAGTACCAATGGCACAGGGGCTATGAAT TTCACCGTGGGTGCACCGGCCAGCTTGAATGGCCCAGGGTGAAGTGGCTTCCCCGGCTCACAAG AGGCGAATAGCCAGCACCAAAAGTCTGGCTGAGTAGCAAGAAGTAAGGCCTCAAGCCCGGAGAG GAGTCCCAGGATGGCAAGGGCTGCTGTGGACAGCTCAAGCATGCTGTCACCCGTGACTCCCTCG AATCACCCCATGGCTACTGTCAGGATGTGGCTCACACCCTCCTTCCCTCCCGTTCCAGCAGTCT CCATCCATGCCTCTCAGCCACCTGCCAGGTATGCCTGACACCCACCTGGGCATCAGCCACTTGA ATGTGGCAGCCAAGCCCGAGATGGCAGCTCTGGCCGGAGGCAGCCGGTTGGCCTTGAGCCACCC CCACCACGCCTCTCCCACCTGCCTGTAGCCTCCAGTGCCAGCACAGTGCTGAGTACCAATGGCA CAGGGGCTATGAATTTCACCGTGGGTGCACCGGCAAGCTTGAATGGCCAGTGTGAGTGGCTTCC CCGGCTCCAGAATGGCATGGTGCCCAGCCAGTACAACCCGCTAAGGCCAGGTGTGACTCCGGGC ACACTAAGCACACAGGCAGCTGGCCTCCAGCATGGCATGATGGGCCCGATACACAGCAGCCTCT CCACCAATACCTTGTCCCCGATTATCTACCAGGGCCTGCCCAACACAAGGCTGGCCACACAGCC CCACCTGGTGCAGACCCAGCAGGTGCAGCCACAGAACTTACAAATCCAGCCTCAGAACCTGCAG CCACCATCGCAGCCACACCTCAGTGTGAGCTCAGCAGCCAATGGGCACCTGGGTCGGAGCTTCC TGAGCGGGGAGCCCAGCCAGGCAGACGTACAGCCGCTGGGCCCCAGCAGTCTGCCTGTGCACAC CATTCTGCCCCAGGAAAGCCAGGCTCTGCCGACATCACTGCCATCCTCCATGGTCCCACCCATG ACCACTACCCAGTTCCTGACCCCTCCTTCTCAGCACAGCTACTCATCCTCACCTGTGGACAACA CCCCCAGCCACCAGCTGCAGGTGCCAGAGCACCCCTTCCTCACCCCATCCCCTGAGTCCCCTGA CCAGTGGTCCAGCTCCTCCCCGCATTCCAACATCTCTGATTGGTCCGAGGGCATCTCTAGCCCGCCCACGAGCATGCCCGTCCCAGATACAAA

大鼠Notch1基因的胞内段已成功插入到Lv003载体中，测序序列正确。Blast结果比对显示已经测出来的部分序列与PubMed上序列100％一致。

(2)如图1所示,荧光显微镜下拍照观察绿色荧光蛋白GFP阳性率>95％，Westernblot证实WB-F344-Notch1细胞的Notch1表达增加。

步骤S3稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞(WB-F344-Notch1) 的选择性条件培养

(1)本实施例中使用的选择性条件培养液：

选择性条件培养液是在改良Richter培养液基础上进一步添加相关成分而获得，即选择性条件培养的改良Richter培养液。配方为：以改良的 Richter培养基(改良的MEM含Zn)为基础培养基：含L-谷氨酰胺，2mg/IL- 脯氨酸及50ug/mL庆大霉素，不含胰岛素、HEPES及酚红。在前者基础上添加碳酸氢钠、HEPES、胰岛素，胎牛血清；各添加物的终浓度为：2.6mM碳酸氢钠，20mM HEPES，4.0mg/L胰岛素，10％胎牛血清。0.22μm过滤器除菌，4℃保存，即可获得选择性条件培养液。细胞冻存液由改良Richter 培养液或者DMEM培养基7mL，胎牛血清2mL和DMSO 1mL组成，使用前现配。

(2)稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞的细胞形态变化。

如图2所示，通过慢病毒上调Notch1后，WB-F344细胞形态发生变化，长梭形细胞包绕融合，形成类似结节，但细胞边界仍清晰，细胞大小均一。无法在裸鼠皮下形成肿瘤。经过选择性条件培养法后，选择性条件培养第5周期后WB-F344-Notch1细胞形态不再变化，呈现为长梭型，长满后呈颗粒状，细胞边界模糊不清，融合形成边界不清晰的结节，少量出现透亮的细胞团块。

(3)裸鼠皮下成瘤及组织学类型变化

每个周期选择性条件培养后的细胞，通过裸鼠皮下成瘤评估致瘤性，然后通过免疫组织化学方法确定肿瘤类型，发现WB-F344-Notch1细胞的裸鼠皮下肿瘤大小随着选择性条件培养法周期增多而逐步增加，并于第4周期后开始稳定不变，致瘤性为3/3，100％。经过选择性条件培养5周期的细胞，其形态逐步稳定，同时裸鼠皮下成瘤的类型为低分化肝癌，稳定表达 CK7+,CK19+,AFP-,ALB-,Mucin1+(图3所示)。而WB-F344-NC对照组始终无法在裸鼠皮下形成肿瘤。

步骤S4大鼠原位肝脏移植瘤模型

如图4所示，A，为大鼠原位肝脏移植瘤模型制作示意图.A1,A2结扎肝外胆管，模拟肝外胆管梗阻过程。A3,大鼠肝脏左外叶注射肿瘤细胞。

B，标本大体及HE发现肝脏形成肝癌，并伴发双肺多发转移灶形成。根据 B1,B2,B3不同时间点处死动物，肺部转移灶散在分布，随着时间推移，肺转移灶逐渐增多、增大并融合。C，利用CRi多光谱活体成像系统可检测肝脏占位和肺部多发转移灶,绿色部分为肿瘤。

本实施例所述的高转移肝癌细胞已提交保藏，保藏信息如下：

保藏编号：CCTCC NO：C201730

分类命名：大鼠恶性转化株C5WB-F344-Notch1

保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心

保藏单位地址：中国武汉武汉大学

虽然本发明以较佳实施例揭露如上，但并非用以限定本发明实施的范围。任何本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的发明范围内，当可作些许的改进，即凡是依照本发明所做的同等改进，应为本发明的范围所涵盖。

Claims

1.一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法，其包括如下步骤：

S1：对大鼠成体肝干细胞进行扩增、培养并保存；

S2：采用基因转染技术将含有Notch1基因的慢病毒载体转入大鼠成体肝干细胞，采用大鼠Notch1胞内段(Notch1 intracellular domain，NICD) 进行扩增；选择Rat Notch1-NICD序列：NM_001105721 .1进行扩增，采用扩增引物序列：

Notch1-Rat-F1：5 'AAAGAGTGAGACGGTGGAGCCT 3 '

Notch1-Rat-R1：5 'TTTGGTCGCCCCAGCATC 3 '

Notch1-Rat-F2：

5 'ATAGTCTAGAGCCACCATGGTGCTGCTGTCCCGCAAG 3 '

Notch1-Rat-R2：

5 'ACCGGAATTCTCACTTAAATGCCTCTGGAATGTGGG 3 '；

获得稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞；

S3：利用稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞，采用选择性条件培养法进行培养，使其在体外进一步分化，筛选出致瘤能力强及稳定的肝癌细胞；具体包括如下步骤：

(1)稳定过表达细胞及其对照组扩增到 80％-90％覆盖瓶底时开始进行选择性条件培养；首先弃去瓶中旧液，清洗后加入选择性条件培养液,随后放入37℃、5％CO₂的细胞培养箱中继续培养；依据培养瓶中旧液的情况决定是否换液，通常间隔48小时-60小时全量换液1次；

(2)选择性条件培养持续4周结束后，显微镜下观察细胞形态学变化情况及细胞边界是否清晰，细胞是否形成团块，并拍照记录；首先弃去瓶中旧液，清洗后，加入消化液进行消化，加入选择性条件培养液中和，用吸管吹打至所有细胞脱壁，把细胞悬液转移至离心管中，进行室温离心，弃去上清液，加入选择性条件培养液，吹打均匀后等分至多个培养瓶，每瓶补充培养基后，将培养瓶放入37℃、5％CO₂的细胞培养箱中；其中1瓶细胞继续进行选择性条件培养；

(3)选择性条件培养4周时间为1周期，持续培养细胞10个周期；

S4：采用筛选的肝癌细胞，通过同种属的原位肝脏移植瘤模型，可在肝脏形成肝癌，并伴自发形成双肺转移瘤，从而获得高转移肝癌细胞；

所述选择性条件培养液是在改良Richter培养液基础上进一步添加相关成分而获得，即选择性条件培养的改良Richter培养液；配方为：以改良的 Richter培养基为基础培养基：含L-谷氨酰胺，2mg/IL- 脯氨酸及50ug/mL庆大霉素，不含胰岛素、HEPES及酚红；在前者基础上添加碳酸氢钠、HEPES、胰岛素，胎牛血清；各添加物的终浓度为：2 .6mM碳酸氢钠，20mM HEPES，4 .0mg/L胰岛素，10％胎牛血清；0 .22μm过滤器除菌，4℃保存，即可获得选择性条件培养液。

2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤S2中，通过基因测序确认所述Notch1胞内段基因插入所述慢病毒载体。

3.如权利要求2所述的方法，其中，步骤S2中，通过观察GFP阳性率，并利用Westernblot检测Notch1过表达效果，建立稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其中，通过观察细胞形态变化情况，筛选出细胞形态学上稳定的肿瘤细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤S3中，通过免疫组织化学方法确定裸鼠皮下肿瘤类型为肝癌细胞。

6.一种采用权利要求1-5之一所述方法制备的细胞株，其保藏编号：CCTCCNO.C201730。