发明内容
针对现有技术的缺点,本发明的目的是提供一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法,其可筛选出成瘤时间短、致瘤性好、具有肺转移能力的稳定肝癌细胞。
为了实现上述目的,一方面,本发明提供了一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法,其包括如下步骤:
S1:对大鼠成体肝干细胞进行扩增、培养并保存;
S2:采用基因转染技术将含有Notch1基因的慢病毒载体转入大鼠成体肝干细胞中,获得稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞;
S3:利用稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞,采用选择性条件培养法,使其在体外进一步分化,筛选出致瘤能力强及稳定的肝癌细胞;
S4:采用筛选出的肝癌细胞,通过同种属的原位肝脏移植瘤模型,可在肝脏形成肝癌,并伴自发形成双肺转移瘤,从而获得高转移肝癌细胞。
本发明证明成体肝干细胞可以作为肝癌的细胞起源;恶性转化的大鼠成体肝干细胞,能够在获得致瘤性的同时拥有远处肺部转移能力:在同种属的大鼠原位肝脏形成肝癌,并自发形成双肺转移瘤。
根据本发明另一具体实施方式,步骤S2中,通过基因测序确认 Notch1基因是否已插入慢病毒载体。
根据本发明另一具体实施方式,步骤S2中,通过观察GFP阳性率,并利用Westernblot检测细胞过表达效果,筛选出稳定过表达 Notch1的大鼠肝干细胞(WB-F344-Notch1)。
根据本发明另一具体实施方式,步骤S3包括多次重复的选择性条件培养法,每一周期所述选择性条件培养法的内容包括:
a:反复更换细胞培养液,持续时间为4周;
b:细胞培养液采用选择性条件培养的改良Richter培养液;
c:每周期培养后需观察细胞形态并记录;
d:每周期培养后将细胞分为三组,一组为用于验证致瘤性的评估组,一组为用于冷冻存样的冻存组,一组为用于下一培养周期的继续培养组。
根据本发明另一具体实施方式,通过观察细胞形态,筛选出细胞形态学上稳定的肝癌细胞。
根据本发明另一具体实施方式,通过裸鼠皮下成瘤,来评估细胞的致瘤性,筛选出致瘤能力强的肝癌细胞。
根据本发明另一具体实施方式,致瘤性包括成瘤率和肿瘤大小。
根据本发明另一具体实施方式,步骤S3中,通过免疫组织化学方法确定裸鼠皮下肿瘤类型。
另一方面,本发明提供了一种采用上述方法制备的细胞,其成瘤时间短、致瘤性好、具有肺转移能力。
与现有技术相比,本发明具备如下有益效果:
本发明优选Notch1基因的胞内段,转染大鼠成体肝干细胞,获得稳定过表达Notch1的成体肝干细胞。利用选择性条件培养的传代方法,通过对每一周期的细胞形态学、皮下致瘤性和成瘤大小、肿瘤分子表型的变化进行评估,优选出第五代的恶性转化的细胞;再利用大鼠原位肝癌模型形成肝癌并发生肺转移。
下面结合附图对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例提供了一种诱导成体肝干细胞转化为高转移肝癌细胞的方法,同时提供了一种成瘤时间短、致瘤性好、具有肺转移能力的稳定肝癌细胞。
本实施例的具体实验方案如下:
S1.实施Fisher 344系大鼠成体肝干细胞WB-F344的扩增及培养
(1)WB-F344的复苏:常规消毒超净工作台,在无菌15mL离心管中加入10mL DMEM培养基,从液氮罐中取出冻存的大鼠成体肝干细胞WB-F344 一管,立即放置37℃的水浴箱中,并振荡,观察细胞悬液的解冻情况,待至约2/3解冻后把冻存管经75%酒精喷洒消毒后放入超净台,用吸管把细胞悬液转移至含有10mL培养基的离心管中,并吹打匀,进行1000rpm室温离心5分钟,弃去上清液,加入含有10%血清的5mL DMEM培养液,吹打均匀后转移至25cm2培养瓶中,放入37℃,5%CO2细胞培养箱中。
(2)细胞换液及传代:当大鼠成体肝干细胞WB-F344扩增到70%-80%覆盖瓶底时进行传代。首先弃去瓶中旧液,用0.1M PBS清洗1遍,弃去 PBS,加入2mL 0.25%胰蛋白酶/0.04%EDTA消化液,消化2-3分钟,加入2mL 含有10%血清的DMEM培养液中和液,用吸管吹打至所有细胞脱壁,把细胞悬液转移至15mL离心管中,进行1000rpm室温离心5分钟,弃去上清液,加入5mL 10%血清的DMEM培养液,吹打均匀后等分至4个25cm2培养瓶中 (即1:4传代),每瓶培养基补充至5mL,然后培养瓶放入37℃,5%CO2的细胞培养箱。
(3)大鼠成体肝干细胞WB-F344冻存:当ESC扩增到70%-80%覆盖瓶底时进行冻存。首先弃去瓶中旧液,用0.1M PBS清洗1遍,弃去PBS,加入2mL 0.25%胰蛋白酶/0.04%EDTA消化液,消化2-3分钟,加入2mL 10%血清的DMEM培养液中和液,用吸管吹打至所有细胞脱壁,把细胞悬液转移至15mL离心管中,进行1000rpm室温离心5分钟,弃去上清液,加入细胞冻存液重悬细胞,调整细胞浓度为1.0-1.2×107/mL。将细胞悬液转移至冻存管,然后放置于含有异丙醇的梯度冻存盒,-80℃冻存。再转移至液氮罐保存。
大鼠成体肝干细胞WB-F344在传代后6-8小时后,逐渐在培养瓶中贴壁生长,细胞呈圆形,细胞核大,有一个或几个核仁,胞质胞浆少。形成边缘清楚的细胞克隆,克隆呈“巢状”或“岛状”,其中细胞排列紧密,与周围存在明显边界。每3-4天即可1:4传代一次。
S2.构建稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞(WB-F344-Notch1)
(1)慢病毒的包装及质粒的构建由广州永诺生物科技有限公司协作完成。慢病毒表达载体,本次实验采用LV003,即pCDH-CMV-GFP-Puro载体。本次实验采用大鼠Notch1胞内段(Notch1 intracellular domain,NICD) 进行扩增。选择Rat Notch1-NICD序列:NM_001105721.1进行扩增,Rat Notch1-NICD基因全长大小为2364bp,采用扩增引物序列:
Notch1-Rat-F1:5'AAAGAGTGAGACGGTGGAGCCT 3'
Notch1-Rat-R1:5'TTTGGTCGCCCCAGCATC 3'
Notch1-Rat-F2:
5'ATAGTCTAGAGCCACCATGGTGCTGCTGTCCCGCAAG 3'
Notch1-Rat-R2:
5'ACCGGAATTCTCACTTAAATGCCTCTGGAATGTGGG 3'
Lv003-Notch1-Rat表达载体测序结果表明大鼠Notch1基因的胞内段已成功插入到Lv003载体中,测序序列正确。Blast结果比对显示已经测出来的部分序列与Pubmed上序列100%一致。利用293T细胞包装慢病毒,LV- Notch1-Rat滴度检测结果为5×108TU/mL。
(2)感染方法
按实验需要将细胞铺板。细胞数以第2天密度约30%为宜。37℃培养过夜。感染前,从冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒,用新鲜完全培养基稀释成所需浓度。吸去细胞原有培养基,将稀释好的病毒液加入细胞中。加入Polybrene(终浓度5ug/mL),轻轻摇匀。37℃培养过夜。感染后第二天,吸去含病毒的培养液,换上新鲜的完全培养液,继续37℃培养。感染后第三天,荧光显微镜下观察GFP阳性率,约为90%-95%。换上含适当浓度的Puromycin的新鲜完全培养液,筛选稳定转染的细胞株。10天至12天后可获得稳定表达目的蛋白的细胞。荧光显微镜下拍照观察GFP阳性率>95%。利用Western blot检测细胞过表达Notch1效果。稳定构建过表达Notch1的大鼠肝干细胞为WB-F344-Notch1;WB-F344-NC作为阴性对照组,按照步骤1方法培养及冻存。
S3.稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞(WB-F344-Notch1)的选择性条件培养
(1)稳定过表达细胞WB-F344-Notch1及其对照组WB-F344-NC扩增到 80%-90%覆盖瓶底时开始进行选择性条件培养。首先弃去瓶中旧液,用 0.1M PBS清洗2遍,弃去PBS,加入5mL选择性条件培养的改良Richter 培养液,随后放入37℃,5%CO2的细胞培养箱中继续培养。依据培养瓶中旧液的情况决定是否换液,通常间隔48小时-60小时全量换液1次。注意重复以上步骤时:PBS清洗需要轻柔,避免细胞成片脱落,反复给予细胞换液持续4周,此过程中始终不给予0.25%胰蛋白酶/0.04%EDTA消化,保持细胞紧密生长状态。
(2)选择性条件培养持续4周结束后,显微镜下观察细胞形态学变化情况及细胞边界是否清晰,细胞是否形成团块,并拍照记录。首先弃去瓶中旧液,用0.1M PBS清洗1遍,弃去PBS,加入2mL 0.25%胰蛋白酶 /0.04%EDTA消化液,消化3-4分钟,加入3mL连续选择改良的Richter培养液中和,用吸管吹打至所有细胞脱壁,把细胞悬液转移至15mL离心管中,进行1000rpm室温离心5分钟,弃去上清液,加入5mL选择性条件培养的改良Richter培养液,吹打均匀后等分至4个25cm2培养瓶(即1:4传代),每瓶培养基补充至5mL,然后培养瓶放入37℃,5%CO2的细胞培养箱中。2瓶细胞用于裸鼠的皮下成瘤实验评估其致瘤性,1瓶细胞冻存,1瓶细胞继续进行选择性条件培养。
(3)选择性条件培养4周时间为1周期,本次实验持续培养细胞长达 10周期。每一周期的操作如(1),(2)和(4)步骤。
(4)裸鼠动物皮下移植瘤
每一周期选择性条件培养后的细胞,需要进行裸鼠皮下注射评价致瘤能力。消化、中和、重悬细胞,细胞计数,离心后弃去上清液,加入0.1M PBS,吹打均匀,调整细胞浓度为5.0×106/mL。给予裸鼠背部两侧皮下注射200ul。每一周期皮下成瘤的裸鼠为3只。观察4周后处死动物,评价皮下肿瘤的成瘤率和肿瘤大小。联合HE染色及免疫组织化学方法检测CK7,CK19,AFP,ALB,Mucin1标记的表达,以评估肿瘤类型及肿瘤表达的标记是否稳定。通过评估每周期的裸鼠皮下成瘤及免疫组织化学方法确定肿瘤类型,发现稳定过表达细胞WB-F344-Notch1的致瘤性逐步增加,选择性条件培养第5周期的细胞形态学、肿瘤组织标记逐步稳定,皮下肿瘤类型为低分化肝癌。而WB-F344-NC对照组从第1周期到第10周期始终无法在裸鼠皮下形成肿瘤。
S4.大鼠原位肝脏移植瘤模型制作
本实验采取第5周期后的WB-F344-Notch1过表达稳定细胞作为实验细胞(C5WB-F344-Notch1),本细胞株表达绿色荧光蛋白,可用于活体成像检测肿瘤。C5-WB-F344-NC作为阴性对照组。
(1)选取Fisher 344系雄性大鼠,体重160g-170g。10%水合氯醛麻醉动物,300-350ul/100g。腹腔注射麻醉成功后,脱毛,固定动物,酒精消毒2次,取腹部正中偏左切口暴露肝脏。暴露肝十二指肠韧带区域,3-0 慕丝线,结扎十二指肠上缘的胆总管。暴露左肝脏面,PBS重悬后的肿瘤细胞悬液150ul,细胞密度1×107个/mL,胰岛素注射器沿肝门方向进针,深度1cm。注射后压迫出针部位的肝实质,压迫时间为5分钟。观察注射部位的肝实质血运情况,无渗血可立即关腹,消毒皮肤,纱布包扎,电热毯保持动物体温,直至苏醒为止。
(2)造模后3周、4周和4周以上给予药物过量麻醉(10%水合氯醛, 0.5-0.6mL/100g)后联合颈椎脱臼处死动物。病理发现肝脏存在低分化肝癌和双肺部转移灶形成。而阴性对照组C5WB-F344-NC未发现肝内肿瘤、无肺转移灶形成。
本实施例的实验结果说明如下:
步骤S1实施Fisher 344系大鼠WB-F344成体肝干细胞的扩增及培养
Fisher 344大鼠来源的WB-F344系成体肝卵圆细胞,属于成体肝干细胞,来源于上海东方肝胆医院馈赠。
步骤S2构建稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞
(1)Lv003-Notch1-Rat表达载体测序结果全长为:
CCAATTGGAGTAATAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAGCCACCATGGTGCTGCTGTCCCGCAAGCGCAGGCGGCAGCATGGCCAGCTCTGGTTCCCTGAGGGTTTCAAAGTGTCAGAGGCCAGCAAGAAGAAGCGGAGAGAACCCCTCGGCGAGGACTCAGTCGGCCTCAAGCCCCTGAAGAACGCCTCAGATGGTGCCCTGATGGACGACAATCAGAACGAGTGGGGGGACGAAGACCTGGAGACCAAGAAGTTCCGGTTTGAGGAACCAGTGGTTCTCCCTGACCTGGATGATCAGACTGACCACCGGCAGTGGACCCAGCAGCACCTGGATGCCGCTGACCTACGTGTGTCTGCCATGGCCCCAACGCCGCCTCAGGGGGAGGTAGATGCTGACTGCATGGACGTCAATGTTCGAGGACCAGATGGCTTCACTCCCCTAATGATTGCCTCCTGCAGCGGAGGGGGCCTGGAGACAGGCAACAGTGAGGAAGAAGAAGATGCACCTGCTGTCATCTCCGACTTCATCTATCAGGGTGCCAGCTTGCACAACCAGACGGACCGCACAGGGGAGACTGCCCTGCACCTGGCTGCCCGATACTCTCGTTCAGATGCTGCCAAGCGCTTGCTGGAGGCCAGCGCAGATGCCAACATCCAAGACAACATGGGGCGTACCCCATTACATGCCGCTGTTTCTGCAGACGCTCAGGGTGTCTTCCAGATCCTGCTCCGGAACAGAGCCACAGATCTGGATGCCCGAATGCATGATGGCACAACCCCTCTGATCCTGGCGGCACGCCTGCCGTGGAAAGCATGCTAGAGGACCTCATCAACTCTCACGCTGATGTCAATGCTGTGGATGACCTAGGCAAGTCAGCTCTGCACTGGGCAGCCGCTGTGAACAATGTGGACGCTGCTGTTGTGCTCCTGAAGACGGAGCCACCAAAGACATGCAGAACAACAAGGAGGAGACTCCCCTGTTCCTGGCCGCCCGTGAGGGCAAGCTATGAAGACCTGCCAAAGTGTTTGCTGGGACACACCTTTGGGGGGGGCGTACCATTACATGCCGCTGTTTCTGCAGACGCTCAGGGTGTCTTCCAGATCCTGCTCCGGAACAGAGCCACAGATCTGGATGCCCGAATGCATGATGGCACAACCCCTCTGATCCTGGCGGCACGCCTGGCCGTGGAAGGCATGCTAGAGGACCTCATCAACTCTCACGCTGATGTCAATGCTGTGGATGACCTAGGCAAGTCAGCTCTGCACTGGGCAGCCGCTGTGAACAATGTGGACGCTGCTGTTGTGCTCCTGAAGAACGGAGCCAACAAAGACATGCAGAACAACAAGGAGGAGACTCCCCTGTTCCTGGCCGCCCGTGAGGGCAGCTATGAGACTGCCAAAGTGTTGCTGGACCACTTTGCCAACCGGGACATCACGGATCACATGGACCGATTGCCACGGGACATTGCACAGGAGCGCATGCACCACGATATCGTGCGGCTTTTGGATGAATACAACCTGGTGCGCAGCCCACAGCTGCATGGCACTGCCTTGGGTGGCACACCCACTCTGTCTCCCACACTCTGCTCGCCCAACGGCTACCTGGGCAACCTCAAGTCTGCCACACAGGGCAAGAAGGCCCGAAAGCCCAGCACCAAAGGGCTGGCTTGCAGTAGCAAGGAAGCTAAGGACCTCAAGGCCCGGAGGAAGAAGTCCCAGGATGGCAAGGGCTGCCTGTTGGACAGCTCAAGCATGCTGTCACCCGTGGACTCCCTCGAGTCACCCCATGGCTACTTGTCAGATGTGGCCTCACCACCCCTCCTTCCCTCCCCGTTCCAGCAGTCTCCATCCATGCCTCTCAGCCACCTGCCAGGTATGCCTGACACCCACCTGGGCATCAGCCACTTGAATGTGGCAGCCAAGCCCGAGATGGCAGCTCTGGCCGGAGGCAGCCGGTTGGCCTTTGAGCCACCCCCACCACGCCTCTCCCACCTGCCTGTAGCCTCCAGTGCCAGCACAGTGCTGAGTACCAATGGCACAGGGGCTATGAATTTCACCGTGGGTGCACCGGCCAGCTTGAATGGCCCAGGGTGAAGTGGCTTCCCCGGCTCACAAGAGGCGAATAGCCAGCACCAAAAGTCTGGCTGAGTAGCAAGAAGTAAGGCCTCAAGCCCGGAGAGGAGTCCCAGGATGGCAAGGGCTGCTGTGGACAGCTCAAGCATGCTGTCACCCGTGACTCCCTCGAATCACCCCATGGCTACTGTCAGGATGTGGCTCACACCCTCCTTCCCTCCCGTTCCAGCAGTCTCCATCCATGCCTCTCAGCCACCTGCCAGGTATGCCTGACACCCACCTGGGCATCAGCCACTTGAATGTGGCAGCCAAGCCCGAGATGGCAGCTCTGGCCGGAGGCAGCCGGTTGGCCTTGAGCCACCCCCACCACGCCTCTCCCACCTGCCTGTAGCCTCCAGTGCCAGCACAGTGCTGAGTACCAATGGCACAGGGGCTATGAATTTCACCGTGGGTGCACCGGCAAGCTTGAATGGCCAGTGTGAGTGGCTTCCCCGGCTCCAGAATGGCATGGTGCCCAGCCAGTACAACCCGCTAAGGCCAGGTGTGACTCCGGGCACACTAAGCACACAGGCAGCTGGCCTCCAGCATGGCATGATGGGCCCGATACACAGCAGCCTCTCCACCAATACCTTGTCCCCGATTATCTACCAGGGCCTGCCCAACACAAGGCTGGCCACACAGCCCCACCTGGTGCAGACCCAGCAGGTGCAGCCACAGAACTTACAAATCCAGCCTCAGAACCTGCAGCCACCATCGCAGCCACACCTCAGTGTGAGCTCAGCAGCCAATGGGCACCTGGGTCGGAGCTTCCTGAGCGGGGAGCCCAGCCAGGCAGACGTACAGCCGCTGGGCCCCAGCAGTCTGCCTGTGCACACCATTCTGCCCCAGGAAAGCCAGGCTCTGCCGACATCACTGCCATCCTCCATGGTCCCACCCATGACCACTACCCAGTTCCTGACCCCTCCTTCTCAGCACAGCTACTCATCCTCACCTGTGGACAACACCCCCAGCCACCAGCTGCAGGTGCCAGAGCACCCCTTCCTCACCCCATCCCCTGAGTCCCCTGACCAGTGGTCCAGCTCCTCCCCGCATTCCAACATCTCTGATTGGTCCGAGGGCATCTCTAGCCCGCCCACGAGCATGCCCGTCCCAGATACAAA
大鼠Notch1基因的胞内段已成功插入到Lv003载体中,测序序列正确。Blast结果比对显示已经测出来的部分序列与PubMed上序列100%一致。
(2)如图1所示,荧光显微镜下拍照观察绿色荧光蛋白GFP阳性率>95%,Westernblot证实WB-F344-Notch1细胞的Notch1表达增加。
步骤S3稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞(WB-F344-Notch1) 的选择性条件培养
(1)本实施例中使用的选择性条件培养液:
选择性条件培养液是在改良Richter培养液基础上进一步添加相关成分而获得,即选择性条件培养的改良Richter培养液。配方为:以改良的 Richter培养基(改良的MEM含Zn)为基础培养基:含L-谷氨酰胺,2mg/IL- 脯氨酸及50ug/mL庆大霉素,不含胰岛素、HEPES及酚红。在前者基础上添加碳酸氢钠、HEPES、胰岛素,胎牛血清;各添加物的终浓度为:2.6mM碳酸氢钠,20mM HEPES,4.0mg/L胰岛素,10%胎牛血清。0.22μm过滤器除菌,4℃保存,即可获得选择性条件培养液。细胞冻存液由改良Richter 培养液或者DMEM培养基7mL,胎牛血清2mL和DMSO 1mL组成,使用前现配。
(2)稳定过表达Notch1的大鼠成体肝干细胞的细胞形态变化。
如图2所示,通过慢病毒上调Notch1后,WB-F344细胞形态发生变化,长梭形细胞包绕融合,形成类似结节,但细胞边界仍清晰,细胞大小均一。无法在裸鼠皮下形成肿瘤。经过选择性条件培养法后,选择性条件培养第5周期后WB-F344-Notch1细胞形态不再变化,呈现为长梭型,长满后呈颗粒状,细胞边界模糊不清,融合形成边界不清晰的结节,少量出现透亮的细胞团块。
(3)裸鼠皮下成瘤及组织学类型变化
每个周期选择性条件培养后的细胞,通过裸鼠皮下成瘤评估致瘤性,然后通过免疫组织化学方法确定肿瘤类型,发现WB-F344-Notch1细胞的裸鼠皮下肿瘤大小随着选择性条件培养法周期增多而逐步增加,并于第4周期后开始稳定不变,致瘤性为3/3,100%。经过选择性条件培养5周期的细胞,其形态逐步稳定,同时裸鼠皮下成瘤的类型为低分化肝癌,稳定表达 CK7+,CK19+,AFP-,ALB-,Mucin1+(图3所示)。而WB-F344-NC对照组始终无法在裸鼠皮下形成肿瘤。
步骤S4大鼠原位肝脏移植瘤模型
如图4所示,A,为大鼠原位肝脏移植瘤模型制作示意图.A1,A2结扎肝外胆管,模拟肝外胆管梗阻过程。A3,大鼠肝脏左外叶注射肿瘤细胞。
B,标本大体及HE发现肝脏形成肝癌,并伴发双肺多发转移灶形成。根据 B1,B2,B3不同时间点处死动物,肺部转移灶散在分布,随着时间推移,肺转移灶逐渐增多、增大并融合。C,利用CRi多光谱活体成像系统可检测肝脏占位和肺部多发转移灶,绿色部分为肿瘤。
本实施例所述的高转移肝癌细胞已提交保藏,保藏信息如下:
保藏编号:CCTCC NO:C201730
分类命名:大鼠恶性转化株C5WB-F344-Notch1
保藏单位名称:中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址:中国武汉武汉大学
虽然本发明以较佳实施例揭露如上,但并非用以限定本发明实施的范围。任何本领域的普通技术人员,在不脱离本发明的发明范围内,当可作些许的改进,即凡是依照本发明所做的同等改进,应为本发明的范围所涵盖。