CN110177868A - 用于癌症干细胞(csc)扩增的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用例如FiSSTM(纤维激发的智能支架)平台增加癌症干细胞(CSC)(包括人CSC)群体的方法，所述FiSSTM平台是一种用于细胞培养的支架，其包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸‑共‑羟基乙酸)(PLGA)的静电纺丝混合物。例如，我们证明了在FiSScsc上生长的MCF‑7细胞发育成结构良好的单细胞类肿瘤(SCT)，所述类肿瘤相对于作为单层生长的类似传代细胞显示出约3倍的癌症干细胞(CSC)群体增加。当使用第一代类肿瘤生长第二代类肿瘤和第三代类肿瘤时，这种增加得到进一步加强。另外，我们将细胞培养方案从例如96孔板扩大到例如6孔板，同时未损失CSC的诱导。我们还对富含CSC的细胞进行分选和冷冻，并再次成功解冻它们以生长类肿瘤，同时保持了CSC群体。

Description

用于癌症干细胞(CSC)扩增的方法
本申请要求2016年10月6日提交的美国申请号62/405,187的优先权，其以引用的方式并入。
发明内容
本发明描述了使用例如FiSSTM(纤维激发的智能支架，fiber-inspired smartscaffold)平台，用于细胞培养的、包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的静电纺丝混合物的支架，来增加癌症干细胞(CSC)群体的方法。在一个实施方式中，使用常规生长培养基生长第一代类肿瘤，和来自所述第一代类肿瘤的第二代类肿瘤。在每一代结束时，对所得到的类肿瘤进行处理，并例如通过流式细胞术分析细胞的干细胞标记物(例如CD44高/CD44+和CD24低/CD24-)。令人惊讶的是，与用于生长类肿瘤的癌细胞相比，类肿瘤的CSC增加了约3倍。
在另一个实施方式中，使用补充有氯化钴(CoCl2)的常规生长培养基，来模拟类肿瘤中的低氧。或者，将氯化钴注入支架基质中，以确保在支架上生长的第一代类肿瘤的低氧条件得以持续。
CSC的增加在第二代类肿瘤中得到进一步且出人意料的加强，其中观察到CSC增加了约10倍。在另一个实施方式中，在注入氯化钴的支架上生长类肿瘤，得到较大的第一代类肿瘤，该第一代类肿瘤显示出与在常规支架上生长的类肿瘤相比CSC增加的趋势。
在又一实施方式中，通过在条件培养基(CM)中培养类肿瘤，进一步增加了CSC群体，其中条件培养基(CM)收集自原代癌相关成纤维细胞(CAF)和来自人外周血的髓源抑制性细胞(MDSC)。
在另一个实施方式中，将类肿瘤培养条件从较小孔规格(例如96孔规格组织培养皿)扩展至较大孔规格(例如6孔规格组织培养皿)，以增加CSC的产量(增加约30倍)，同时保持CSC扩增的能力。
在又一实施方式中，扩增CSC以进行储存。
背景技术
癌症仍然是全世界范围内导致发病和死亡的主要原因。传统疗法通常不能在肺癌患者中完全根除肿瘤、预防癌症复发或预防转移。最近，在一些实例中，有效治疗癌症中的这些失败归因于癌症干细胞(CSC)，癌症干细胞具有自我更新、肿瘤起始和肿瘤保持的特性，并且被认为是治疗之后发生复发导致死亡的主要原因。
虽然化学疗法和其他常规癌症疗法在杀死大量肿瘤细胞方面可能更有效，但由于静息CSC的存活，CSC可设法逃脱并播种新的肿瘤生长(Clarke等人(2006)Cancer Res.66,9339-44；Reya等人(2001)Nature 414,105-11)。随着越来越多的证据支持CSC在肿瘤发生(Gupta等人(2009)Nat.Med.15,1010-12)、肿瘤异质性(Meacham&Morrison(2013)Nature501,328-37)、对化学疗法和放射疗法的耐受性(Li等人(2008)J.Natl.Cancer Inst.100,672-9；Diehn等人(2009)Nature 458,780-3)以及转移表型(Shiozawa等人(2013)Pharmacol.Ther.138,285-93)中的作用，开发靶向CSC的特定疗法有望改善癌症患者，尤其是那些患有转移性疾病的患者的存活和生活质量(Takebe等人(2011)Nat.Rev.Clin.Oncol.8,97-106；Dalerba&Clarke(2007)Cell Stem Cell 1,241-2)。
因此，持续且迫切地需要开发靶向CSC的新型治疗剂，特别是靶向CSC自我更新、再生和分化过程的试剂。这些试剂，诸如小分子或生物制剂，应设计用于靶向CSC，CSC相关的生物标记物，以及影响与癌发生、肿瘤进展、保持、复发和转移相关的基础过程的CSC通路。
CSC的保持受其微环境的调节。因此，细胞-细胞外基质(ECM)的相互作用和细胞-细胞的相互作用可在干细胞重编程中发挥重要作用。CSC向肿瘤的进展取决于肿瘤微环境或基质(stroma)，其包括ECM(例如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白)、内皮细胞、癌相关成纤维细胞(CAF)和免疫细胞(例如巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞)。肿瘤微环境在许多癌细胞中诱导上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)的激活，其中包括肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌(Polyak&Weinberg(2009)Nat.Rev.Cancer 9,265-73)。
信号转导的持久激活显示，涉及hedgehog、表皮生长因子受体(EGFR)、Wnt/β-连环蛋白(catenin)、Notch、转化生长因子-β(TGF-β)/TGF-β受体和/或基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/CXC趋化因子受体4(CXCR4)的通路，在CSC的高度自我更新潜能、存活、侵润和转移中发挥重要作用(Takebe等人(2011)Nat.Rev.Clin.Oncol.8,97-106；Singh等人(2012)Mol.Cancer 11,73)。诸如Sox2、c-Myc、Oct4、Nanog、Klf-4和Lin-28等转录因子也在胚胎干细胞(Kim等人(2008)Cell 132,1049-61)和CSC(Chiou等人(2010)Cancer Res.70,10433-10444)的自我更新中发挥重要作用。这些转录因子在各种癌症中过表达并且与它们的恶性进展相关。总的来说，这些分子事件相互配合，使得癌细胞能够存活，并在转变为转移性和复发性疾病状态期间，能够获得更具攻击性和迁移性的行为。
随着越来越多的证据支持CSC在肿瘤发生(Sell等人(2009)Adv.DrugDeliv.Rev.61,1007-19)、肿瘤异质性(Gurski等人(2009)Biomaterials 30,6076-85)、对化学疗法和放射疗法的耐受性(Ulrich等人(2010)Biomaterials 31,1875-84；Lin&Chang(2008)Biotechnol.J.3,1172-84)以及转移表型(Li等人(2011)J.Biomol.Screen.16,141-54)中的作用，开发靶向CSC的特定疗法有望改善癌症患者，尤其是那些患有转移性疾病的患者的存活和生活质量(Karlsson等人(2012)Exp.Cell Res.318,1577-85；Dhiman等人(2005)Biomaterials 26,979-86)。然而，研究这些细胞的主要障碍包括它们在体内的低丰度(≤1％)和它们在扩增期间表现出的表型可塑性。
因此，迫切需要开发用于扩增CSC的新方法，扩增的CSC继而可以用于研究例如CSC药物靶标、CSC相关的生物标记物，以及影响与癌发生、肿瘤进展、保持、复发和转移相关的基础过程的CSC通路。CSC的清除可以提供癌症的梦寐以求的“治愈”，目前正在对这些能够特异性靶向与CSC相关的分子事件的试剂进行深入研究。然而，在肿瘤中仅存在少量百分比的这些细胞，这使得难以分离这些细胞。在体外扩增CSC的新途径仍然是迫切需要、但尚未满足的需求。
附图说明
图1使用含不同百分比的CSC(A)和(B)的MCF-7单层细胞，来生长第一代类肿瘤。将单层细胞铺在支架(此处为FiSSCSC平台；Girard等人(2013)PLoS ONE 8,e75345)上保持6天，并使用使所得的第一代类肿瘤可视化。然后，对MCF-7类肿瘤进行处理以获得单细胞悬浮液，并用CD44和CD24荧光染料抗体进行染色。然后，使用流式细胞术检测CD44高CD24低细胞，并使用FlowJo软件进行分析。
图2将MCF-7细胞铺在支架(此处为FiSSCSC平台)上保持6天，以产生第一代类肿瘤(支架，第一代)。然后，对第一代类肿瘤进行处理，并重新铺在FiSSCSC平台上，并使其生长为第二代类肿瘤(支架，第二代)。使用使第一代类肿瘤和第二代类肿瘤可视化。然后，对MCF-7类肿瘤进行处理以获得单细胞悬浮液，并用CD44和CD24荧光染料抗体进行染色。使用流式细胞术检测CD44高CD24低细胞，并使用FlowJo软件进行分析。
图3将MCF-7单层细胞铺在FiSSCSC平台上，其中FiSSCSC平台使用常规培养基(支架)和补充有50μM氯化钴的常规培养基(支架+CoCl2)。6天后，使用使发育的类肿瘤可视化。然后，对MCF-7类肿瘤进行处理以获得单细胞悬浮液，并用CD44和CD24荧光染料抗体进行染色。使用流式细胞术检测CD44高CD24低细胞，并使用FlowJo软件进行分析。
图4将MCF-7单层细胞铺在FiSSCSC平台(支架)上，或铺在经操作以包含100μM氯化钴的FiSSCSC(CoCl2支架)上。6天后，使用使发育的类肿瘤可视化。然后，对MCF-7类肿瘤进行处理以获得单细胞悬浮液，并用CD44和CD24荧光染料抗体进行染色。使用流式细胞术检测CD44+CD24-细胞，并使用FlowJo软件进行分析。
图5第二代类肿瘤示出调节干细胞特性的转录因子发生上调。将MCF-7细胞接种在FiSSCSC上保持6天，以形成第一代类肿瘤。收获这些类肿瘤，并在FiSSCSC上再培养6天以形成第二代类肿瘤。在每个培养期结束时，处理类肿瘤以进行RNA提取，并使用针对Sox-2、Oct-4和Nanog的探针进行qRT-PCR。使用HPRT作为管家基因对照，用对基因表达进行标准化。数据表示为平均值±SEM。测定以一式四份进行(*p<0.05)。
图6当从96孔FiSSCSC板扩大至6孔FiSSCSC板时，CSC群体得以维持。将MCF-7细胞以不同细胞数量接种在FiSSCSC上保持6天，以在6孔板中形成类肿瘤。使用铺在单层和96孔FiSSCSC板上的细胞作为对照。在6天结束时，用对细胞进行染色，并使用荧光显微术使活的类肿瘤可视化并进行成像(A)。另外，将细胞处理成单细胞悬浮液，并用CD44-FITC和CD24-APC抗体进行染色，使用流式细胞术进行分析(B)。
图7当在CAF CM中培养类肿瘤时，CSC群体得到加强。将MCF-7细胞接种在FiSSCSC上保持6天以形成类肿瘤。将细胞暴露于不同浓度的CAF CM，并使用在常规培养基(RM)上生长的类肿瘤作为对照。在6天结束时，用对细胞进行染色，并使用荧光显微术使活类肿瘤可视化并进行成像(A)。另外，将细胞处理成单细胞悬浮液，用CD44-FITC和CD24-APC抗体进行染色，并使用流式细胞术进行分析(B)。绘制不同条件下的CD44+CD24-群体的倍数变化。
图8在含有MDSC的MCF-7-MCT中CSC群体得到加强。将MCF-7细胞与人MDSC在FiSSCSC上共培养6天，以形成MCT。使用在常规培养基(支架)上生长的单细胞类肿瘤(SCT)作为对照。在6天结束时，使用对细胞进行染色，并使用荧光显微术使活类肿瘤可视化并进行成像(A)。另外，将细胞处理成单细胞悬浮液，用CD44-FITC和CD24-APC抗体进行染色，并使用流式细胞术进行分析(B)。绘制不同条件下的CD44+CD24-群体的百分比。
图9在FiSS上培养的LLC1细胞和肿瘤中的CSC扩增。(A)对在单层或在FiSS上培养6天的LLC1细胞进行Aldefluor测定。通过用二乙基氨基-苯甲醛(DEAB)抑制ALDH活性，来建立基线荧光。将第一代类肿瘤用胰蛋白酶消化并重新铺在FiSS上再保持6天，以先后获得第二代类肿瘤和第三代类肿瘤。(B)使用荧光激活细胞分选术(FACS)，从支架收集ALDH+LLC。将亲代LLC1或ALDH+LLC1(分选的)注射到C57BL/6小鼠的侧腹中，并测量肿瘤生长。(C)通过流式细胞术测定的，LLC1肿瘤中的ALDH阳性群体(左)(10％)vs.在FISS上培养6天后的ALDH阳性群体(右)(55％)。
图10(A)通过流式细胞术测定的，A549异种移植物中的CD44高CD24低群体(左)vs.在FISS上培养6天后的CD44高CD24低群体(右)。(B)将分选的CD24减少的细胞皮下注射到NSG小鼠中，并在60天内监测肿瘤生长。当肿瘤达到150mm3时，对小鼠实施安乐死。
图11纯化的癌症干细胞的储存。通过流式细胞术分析A549CD44+CD24-细胞的MACS富集，并以富集前(A)和富集后(B)示出。C)在支架上培养的A549亲代细胞系(26％CD44+CD24-)，和D)被MACS减少CD24、然后被冷冻并解冻以作为单层生长的A549(55.9％CD44+CD24-)。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供了一种用于扩增癌症干细胞(CSC)的方法，所述方法包括以下步骤：将类肿瘤生长在体外细胞培养物中的三维支架上；以及，从所述类肿瘤中分离出CSC。
取决于癌细胞类型和细胞培养物的尺寸(例如96孔细胞培养皿或6孔细胞培养板)，接种细胞的数量通常为每孔/皿5～10,000个细胞，更优选为3,000～6,000个细胞。然而，可以铺展单细胞以及肿瘤碎片。类肿瘤的尺寸通常为10～1000微米，更优选为25～700微米，甚至更优选为50～300微米。
在一个实施方式中，所述方法还包括对所述类肿瘤进行细胞解离的步骤。在另一个实施方式中，使用包含具有蛋白水解活性的酶的组合物(例如或胰蛋白酶/EDTA)，进行细胞解离。可以将类肿瘤解离成单细胞，或小于1,000、500、100、50或10个细胞的类肿瘤细胞碎片。类肿瘤解离通常包括从所述类肿瘤形成类肿瘤癌细胞的单细胞悬浮液。从所述类肿瘤中分离出CSC包括从类肿瘤形成类肿瘤癌细胞的单细胞悬浮液，以及从单细胞悬浮液中分离出CSC。
在一个实施方式中，本发明提供了一种扩增癌症干细胞(CSC)的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在包含三维支架的体外细胞培养物中，生长第一癌细胞群体；
b)在所述支架上，从所述第一癌细胞群体生长类肿瘤；
c)从所述细胞培养物中收获所述类肿瘤，包括将所述类肿瘤细胞解离成第二癌细胞群体(类肿瘤癌细胞)；以及
d)从所述类肿瘤中分离出CSC。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种扩增癌症干细胞(CSC)的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在包含三维支架的体外细胞培养物中生长癌细胞；
b)在所述支架上从所述癌细胞生长类肿瘤；
c)从所述类肿瘤中收获癌细胞(类肿瘤癌细胞)；
d)将所述类肿瘤癌细胞，转移到包含三维支架的新的体外细胞培养物中；
e)在所述新的体外细胞培养物的所述支架上，从所述类肿瘤癌细胞生长下一代类肿瘤。
在一个实施方式中，将上述方法的步骤c)至步骤e)重复至少一次。在另外的实施方式中，将上述方法的步骤c)至步骤e)重复至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次或至少七次。在另外的实施方式中，所述方法包括从所述类肿瘤中分离出CSC的步骤。
在一个实施方式中，上述方法中的所述第一癌细胞群体是人癌细胞。在另一个实施方式中，所述人癌细胞来自人活检物。在一个实施方式中，所述人癌细胞是选自由以下项组成的组：星形细胞瘤、肾上腺皮质癌、阑尾癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、脑干胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、导管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、尤因肉瘤(Ewing sarcoma)、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、生殖细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤(Kaposisarcoma)、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、黑色素瘤、间皮瘤、口腔癌、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌症和肾母细胞瘤(Wilmtumor)。在另一个实施方式中，所述人癌细胞是选自由以下项组成的组：乳腺癌细胞、结肠癌细胞、头颈癌细胞、胃癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、子宫内膜癌细胞、肝癌细胞、皮肤癌细胞、前列腺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、肾癌细胞和甲状腺癌细胞。在一个实施方式中，所述人活检物是选自由以下项组成的组：星形细胞瘤、肾上腺皮质癌、阑尾癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、脑干胶质瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、导管癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、尤因肉瘤、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、生殖细胞瘤、胶质瘤、肝细胞癌、组织细胞增多症、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、巨球蛋白血症、黑色素瘤、间皮瘤、口腔癌、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌症和肾母细胞瘤。在另一个实施方式中，所述人活检物是选自由以下项组成的组：乳腺癌活检物、结肠癌活检物、头颈癌活检物、胃癌活检物、肺癌活检物、脑癌活检物、子宫内膜癌活检物、肝癌活检物、皮肤癌活检物、前列腺癌活检物、胰腺癌活检物、卵巢癌活检物、子宫癌细胞、肾癌细胞和甲状腺癌细胞。
本发明的支架是三维支架，并且通常包含无规取向的纤维。在一个实施方式中，支架纤维是聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物。在另一个实施方式中，支架是聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的静电纺丝混合物。静电纺丝PLGA-mPEG-PLA支架的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如美国专利9624473中，该专利以引用方式整体并入。在一个实施方式中，支架涂覆有壳聚糖。
在一些实施方式中，每种支架纤维中mPEG-PLA与PLGA的比例为约1:4。在其他实施方式中，每种支架纤维中mPEG-PLA与PLGA的比例为约1:10。在还有其他实施方式中，每种支架纤维中mPEG-PLA与PLGA的比例为约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10或1:20，或前述任何两个比例之间，例如1:2～1:6。
在一个实施方式中，PLGA含有约85％的乳酸和15％的乙醇酸。本文还包括这样的实施方式，其中PLGA的乳酸:乙醇酸比例为约75:25、80:20、85:15、90:10或95:5，或前述任何两个比例之间，例如80:20～90:10。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法将mPEG-PLA和PLGA成型为纤维。在一些实施方式中，对mPEG-PLA和PLGA的溶液进行静电纺丝，以形成mPEG-PLA-PLGA纤维。可以在任何电压、流速和距离下对支架纤维进行静电纺丝，提供约0.1～10微米、0.1～7微米、0.3与10微米、0.3～6微米之间的纤维直径，或更优选约0.69至4.18微米之间的纤维直径。在一个实施方式中，使用高压电源，在16kV的正电压下，以0.2ml/小时的流速和13cm的距离，对PEG-PLA和PLGA的溶液进行静电纺丝。将纤维以约70mm的固定距离，收集在铝包铜板上。本发明还包括一种mPEG-PLA-PLGA支架，其通过以约60mm和80mm之间的固定距离，收集静电纺丝纤维制备而成。
所得到的mPEG-PLA-PLGA支架是具有孔隙的三维纤维支架。在一些实施方式中，支架包含直径小于约20微米的孔隙。在其他实施方式中，支架包含直径小于约50、25、15、10或5微米的孔隙。
在本发明的一个实施方式中，使用常规生长培养基来生长一代或更多代类肿瘤。如本文所用，“常规生长培养基(medium或media)”是指不含任何外源性生长因子补充剂的培养基，其中外源性生长因子补充剂经添加来特异性刺激干细胞。
在一个实施方式中，所述类肿瘤是第一代类肿瘤，即由除了类肿瘤之外的癌细胞源，例如细胞系、活检物产生的类肿瘤。在一个实施方式中，癌细胞系选自由以下项组成的组：MCF-7细胞、MDA-MB细胞、MCF-10A乳腺癌细胞、PC3前列腺癌细胞、B16黑色素瘤细胞、BG-1卵巢细胞和LLC路易斯肺癌细胞(Lewis lung cancer cell)。
第一代类肿瘤可以解离成类肿瘤癌细胞并用于后续生长，即第二代类肿瘤。第二代类肿瘤可以解离成类肿瘤癌细胞并用于生长第三代类肿瘤。可以重复该过程以产生后续几代类肿瘤。
在每一代类肿瘤结束时，可以对所得到的类肿瘤癌细胞进行处理并分析，以确定干细胞标记物(例如CD44+/高和CD24-/低)是否存在/不存在或是高/低，和/或是否从非CSC中分离出CSC。这可以通过常规方法，诸如流式细胞术或磁珠来完成。分离出的类肿瘤CSC可用于生长随后几代的类肿瘤。例如，类肿瘤CSC可以从一代或更多代或从每一代中分离，并用于生长下一代类肿瘤。
在一个实施方式中，与用于生长第一代类肿瘤的癌细胞相比，第一代类肿瘤的CSC增加了至少2倍、2.5倍或3倍。在另一个实施方式中，与用于生长第二代类肿瘤的第一代类肿瘤相比，第二代类肿瘤的CSC增加了至少5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在另一个实施方式中，与用于生长第一代类肿瘤的癌细胞相比，第二代类肿瘤的CSC增加了至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、75倍或80倍。在另一个实施方式中，与用于生长第一代类肿瘤的癌细胞相比，与第一代类肿瘤或与第二代类肿瘤相比，第三代类肿瘤的CSC增加了至少5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、75倍或80倍。
在另一个实施方式中，在低氧条件下或在模拟低氧条件的条件下，生长一代或更多代类肿瘤。在另一个实施方式中，低氧条件遍及培养基。在一个实施方式中，支架诱导低氧条件。在另一个实施方式中，低氧条件局限于支架。在另一个实施方式中，支架诱导局部低氧条件。在一个实施方式中，生长培养基，例如常规生长培养基，补充有氯化钴以模拟类肿瘤中的低氧。或者，将氯化钴注入支架基质中，以确保在支架上生长的类肿瘤的低氧条件得以持续。在一个实施方式中，在静电纺丝之前，将CoCl2添加到聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物中。在一个实施方式中，将CoCl2添加到用于生长第一代类肿瘤的生长培养基或支架基质中。在另一个实施方式中，将CoCl2添加到用于生长一代或更多代、连续几代类肿瘤，例如第二代、第三代和/或第四代类肿瘤的生长培养基或支架基质中。
在另一个实施方式中，将类肿瘤(例如第一代、第二代、第三代或第四代类肿瘤等)或分离自类肿瘤的CSC培养在条件培养基(CM)中，以增加CSC的数量，其中条件培养基(CM)收集自原代癌相关成纤维细胞(CAF)(例如来自乳腺癌肿瘤的CAF)和/或来自人外周血的髓源抑制性细胞(MDSC)。在一个实施方式中，CAF是人CAF。
在另一个实施方式中，将类肿瘤培养物从较小细胞培养规格扩展至较大细胞培养规格，例如从96孔规格组织培养皿扩展至6孔规格组织培养皿，以增加CSC的产量(增加约30倍)，同时保持了CSC扩增的能力。
在一个实施方式中，在包含基于ECM的水凝胶的培养基中培养类肿瘤。在另一个实施方式中，支架包括聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的静电纺丝混合物，培养基包含基于ECM的水凝胶。在另一个实施方式中，基于ECM的水凝胶是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤提取的溶解的基底膜制剂，例如
在另一个实施方式中，所述方法提供了多代类肿瘤的生长，其中连续各代均具有比前一代类肿瘤高的CSC百分比，或者在第一代类肿瘤的情况下，具有比癌细胞初始培养物高的CSC百分比，其中癌细胞初始培养物产生第一代类肿瘤。
在一个实施方式中，培养解离的第一代类肿瘤，例如第一代类肿瘤癌细胞的单细胞悬浮液，以生长第二代类肿瘤。在另一个实施方式中，培养解离的第二代类肿瘤，例如第二代类肿瘤癌细胞的单细胞悬浮液，以生长第三代类肿瘤。在另一个实施方式中，培养解离的第三代类肿瘤，例如第三代类肿瘤癌细胞的单细胞悬浮液，以生长第四代类肿瘤。在另外的实施方式中，对于第五代、第六代、第七代、第八代、第九代、第十代或更多代类肿瘤，重复该过程。在一个实施方式中，使用来自每一代类肿瘤的类肿瘤癌细胞的单细胞悬浮液，来生长下一代类肿瘤。在每种情况下，在包含根据本发明的三维支架的体外细胞培养物中，生长类肿瘤。
在一个实施方式中，根据本发明的方法所分离的CSC来自：第一代类肿瘤、第二代类肿瘤、第三代类肿瘤、第四代类肿瘤。在其他实施方式中，根据本发明的方法所分离的CSC来自第五代、第六代、第七代、第八代、第九代、第十代或更多代类肿瘤。
在一个实施方式中，从第一代类肿瘤中分离出CSC并进行培养，以生长第二代类肿瘤。在另一个实施方式中，从第二代类肿瘤中分离出CSC并进行培养，以生长第三代类肿瘤。在另一个实施方式中，从第三代类肿瘤中分离出CSC并进行培养，以生长第四代类肿瘤。在一个实施方式中，使用从每代类肿瘤中分离出的CSC，生长紧接的下一代的类肿瘤。
在一个实施方式中，收获最后一代类肿瘤。在另一个实施方式中，从最后一代类肿瘤中分离出CSC。在另一个实施方式中，从最后一代类肿瘤中分离出的CSC：a)在体外培养物中生长以扩增群体；b)用于体外细胞测定，例如筛选药物化合物(诸如抗癌药物化合物)的测定；c)进行储存，例如冷冻；或者，d)用于体内动物模型，例如肿瘤或肿瘤异种移植模型。在一个实施方式中，动物是啮齿动物，例如小鼠(NOD-EGFP小鼠)或大鼠。在另一个实施方式中，小鼠是NOD-EGFP小鼠。
在另一个实施方式中，培养物包含一种或更多种铁螯合剂。在另一个实施方式中，支架进一步包含一种或更多种铁螯合剂。在另一个实施方式中，在静电纺丝之前，将所述一种或更多种铁螯合剂添加到聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物中。
在另一个实施方式中，所述培养物或所述支架包含敲低希佩尔·林道(vonHippel-Lindau，VHL)肿瘤抑制基因的siRNA。
在另一个实施方式中，所述培养物、支架或癌细胞包含编码生长因子的异源DNA。在另一个实施方式中，所述培养物或所述支架包含TGF-β。
在一个实施方式中，所有方法步骤均在体外进行。在另一个实施方式中，所述方法包括一个或更多个体内步骤。在一个实施方式中，将癌细胞注射到非人的宿主动物，例如啮齿动物(诸如小鼠或大鼠)中，以形成肿瘤(例如肿瘤异种移植物)。在一个实施方式中，宿主动物是NOD-EGFP小鼠。在一个实施方式中，注射到非人的宿主动物中的癌细胞使用基于ECM的水凝胶来注射。在另一个实施方式中，所述基于ECM的水凝胶是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤提取的溶解的基底膜制剂(例如)。
在一个实施方式中，从宿主动物中移除肿瘤。将肿瘤解离成肿瘤细胞或肿瘤碎片的悬浮液，并在支架上进行体外培养，以根据本发明的方法生长类肿瘤。在另一个实施方式中，从类肿瘤中分离出CSC。在另一个实施方式中，从类肿瘤或类肿瘤癌细胞中分离出的CSC经培养并在支架上生长，以产生下一代类肿瘤。在另一个实施方式中，从肿瘤/肿瘤异种移植癌细胞中分离出CSC。在另一个实施方式中，从肿瘤/肿瘤异种移植癌细胞中分离出的CSC在支架上进行体外培养，以生长根据本发明的类肿瘤。在一个实施方式中，注射到宿主动物中的癌细胞是本发明的类肿瘤细胞、来自肿瘤(例如人肿瘤)或癌细胞系的细胞。在另一个实施方式中，注射到宿主动物中的类肿瘤细胞是第一代、第二代或第三代类肿瘤细胞。在另一个实施方式中，注射到宿主动物中的类肿瘤细胞是从类肿瘤中分离出的CSC。
在另一方面，本发明涉及一种筛选药物化合物，例如抗癌化合物的方法。在一个实施方式中，所述方法包括：a)培养本发明的类肿瘤；b)使类肿瘤与药物化合物接触；以及c)测量药物化合物对类肿瘤的影响。在另一个实施方式中，所述方法包括：a)培养本发明的类肿瘤癌细胞；以及b)使类肿瘤癌细胞与药物化合物接触；以及c)测量药物化合物对类肿瘤癌细胞的影响。在另一个实施方式中，所述方法包括：a)培养本发明的分离出的CSC；以及b)使分离出的CSC与药物化合物接触；以及c)测量药物化合物对分离出的CSC的影响。
在一个实施方式中，所述方法包括测量IC50、GI50、ED50或LD50。IC50是引起所需活性的50％抑制的药物浓度。GI50是用于细胞增殖最大抑制的50％的浓度。GI50优选用于细胞生长抑制剂(与细胞毒性剂相对)。ED50(或EC50)是对感兴趣的任何测量的生物效应(包括细胞毒性)的最大效应的50％的有效剂量(或有效浓度)。致死剂量50(LD50)是引起50％细胞死亡的浓度。
本发明部分地涉及使用例如FiSSTM平台扩增癌症干细胞数量，利用所述FiSSTM平台，我们使用例如MCF7乳腺癌细胞系示出了CSC数量的数倍扩大。表1总结了这些发现。
这些结果显示几个变量影响CSC扩增。总之，例如通过在FiSSTM平台上生长MCF癌症干细胞，总共实现了超过80倍的扩增。另外，在FiSSTM上培养的活检细胞异种移植物，诸如A549(肺癌)，显示第一代中的扩增的CSC，其高于在FiSSTM支架上MCF7细胞系诱导的CSC扩增。
表1.CSC扩增
变量 倍数扩大
细胞系(例如MCF7)
第一代支架 3.3
第二代支架 10
含CoCl<sub>2</sub>的支架 1.3
CAF条件培养基 1.5
MDSC条件培养基 1.3
总计 83.6
肿瘤活检物(异种移植物)
第一代支架 8
有几种因素对在支架诸如FiSSTM上的CSC扩增中起到作用。这些包括物理修饰、生理、生物化学和生物因素，显示在器官型FiSSTM类肿瘤中的CSC数量升高。在物理条件方面，FiSSTM支架材料和其他支架材料的许多变化也可用于扩大CSC。类似地，在生理生态位中，我们的结果表明，低氧条件可促进干细胞特性。因此，诱导低氧条件的支架是有价值的，如我们通过将CoCl2引入支架中所显示的。具有编码生长因子的DNA的支架也可以增加干细胞扩大的潜力。产生低氧的其他方法包括添加铁螯合剂，表明该刺激物可通过对铁蛋白氧传感器的影响而相互作用。此外，敲低von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制基因，诸如通过将siRNA连接到支架上，可以增加HIF 1a和低氧样调节。
进一步，向用于培养类肿瘤的细胞培养基中添加其他因子，可以产生CSC的扩大。因此，来自癌相关成纤维细胞培养物或来自髓源抑制性细胞培养物的条件培养基，可以提高CSC扩增。类似地，来自患者肿瘤的肿瘤浸润物也可以提高CSC的数量。添加少量(约1％至约3％)可以增加CSC的数量。此外，发现添加生长因子，诸如TGF-β和/或SDF1，使干细胞扩大增加高达约5倍。类似地，其他生长因子在扩大CSC扩增中也可以是有价值的。
本发明描述了使用例如FiSSTM(纤维激发的智能支架)平台，增加癌症干细胞(CSC)群体的方法。在一个实施方式中，使用常规生长培养基生长第一代MCF-7类肿瘤，并开发了从第一代MCF-7类肿瘤生长第二代类肿瘤的方案。在每一代结束时，我们对得到的类肿瘤进行处理，并通过流式细胞术分析细胞的干细胞标记物(例如CD44高和CD24低)。结果显示，第一代MCF-7类肿瘤的CSC增加了约3倍。
本发明的实施方式包括扩增癌症干细胞(CSC)的一系列方法，该一系列方法使用例如聚合物纳米纤维支架，诸如纤维激发的智能支架(FiSSTM)平台，一种用于细胞培养的、包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的静电纺丝混合物的支架，在该支架上培养癌细胞形成肿瘤样结构，这里称为“类肿瘤”。更具体地，“类肿瘤”是癌细胞的紧密聚集体，具有或不具有在3D聚合物支架上培养的任何其他基质细胞，它们在形态学上、生理学上和生物化学上类似于肿瘤。如通过波形蛋白的上调和E-钙粘蛋白的下调所观察到的，我们发现在此类支架上生长的类肿瘤显示出EMT的标记物。EMT标记物的增加导致CD44+CD24-细胞群体的增加。我们还证实，CSC群体的增加与醛脱氢酶活性的增加相关联。本发明的实施方式提供了，用于从癌细胞扩大癌症干细胞(CSC)的方法。本发明的另外的实施方式提供了，用于从人癌细胞扩大人癌症干细胞(CSC)的方法。
在常规培养基中生长的MCF-7单细胞类肿瘤增加了第一代中CSC的数量。我们在常规生长培养基中生长MCF-7细胞。将细胞铺在96孔细胞培养板中的支架上。在接种后第2天和接种后第6天添加新鲜培养基，使类肿瘤可视化。在确认存在健康外观的类肿瘤后，将它们从支架上脱离下来，并使用accutase:柠檬酸盐溶液进行处理以获得单细胞悬浮液。然后，对单细胞悬浮液进行计数以测定活力，并用人抗CD44-APC-cy7和抗CD24-APC抗体进行染色。使用DAPI来区分单细胞群体中的活细胞，并且使用流式细胞术来测定CD44+CD24-细胞群体。在使用常规生长培养基的FiSSCSC上6天后，MCF-7细胞形成发育良好的第一代SCT。重要的是，如通过CD44+CD24-细胞群体的增加所确定的，无论单层MCF-7细胞中的CSC群体的百分比如何，第一代类肿瘤的CSC群体始终显示出约3倍的增加，。
第二代MCF-7类肿瘤在常规培养基中进一步扩增CSC。如前所述，我们首先生长第一代类肿瘤。然后对第一代类肿瘤进行处理获得单细胞悬浮液，并铺在96孔细胞培养板中的支架上。在接种后第2天和接种后第6天添加新鲜培养基，使第二代类肿瘤可视化。在确认存在健康外观的类肿瘤后，使它们脱离下来，并用人抗CD44-APC-cy7和抗CD24-APC抗体对单细胞悬浮液进行染色。未经DAPI染色的活细胞用于使用流式细胞术来测定CD44+CD24-细胞群体。第一代类肿瘤的CSC增加了约3倍，而在第二代MCF-7类肿瘤中CSC呈指数增加，增加了约10倍。
我们表征了在低氧条件下生长的MCF-SCT内的CSC。由于已认为低氧是保持CSC所必需的，所以我们在我们的3D模型中使用氯化钴(CoCl2)，一种已知的低氧诱导剂，对此进行了测试。为此，我们将MCF-7细胞铺在补充有50μM氯化钴的常规生长培养基中。如前所述，类肿瘤在接种后第6天经可视化，然后经处理，以使用人抗CD44-APC-cy7和抗CD24-APC抗体进行流式细胞术。使用DAPI区分单细胞群体中的活细胞，并且使用流式细胞术测定CD44+CD24-细胞群体。结果显示，添加氯化钴并未明显改变第一代MCF-7类肿瘤中CSC的百分比。CSC扩大的这种缺失可归因于，外部添加的氯化钴无法在整个细胞培养期间保持低氧条件。频繁补充氯化钴可能是确保持续低氧所必需的。
我们表征了在含有氯化钴的支架上生长的第一代MCF-7-SCT中的CSC。因为我们早期的实验显示外部添加的氯化钴无法明显增加第一代类肿瘤中的CSC，所以我们将氯化钴掺入支架的基质内。我们的假设是，包埋在支架内的氯化钴会有助于在整个实验期间保持低氧细胞培养环境。为此，我们将100μM氯化钴与聚合物的混合物混合，并使用所得到的静电纺丝支架来测试其对MCF-7-SCT生长的影响。我们将MCF-7细胞铺在常规生长培养基中我们的含有氯化钴的支架上。如前所述，在接种后第6天且在进行流式细胞术之前使类肿瘤可视化，我们首先确定了支架内的氯化钴保持低氧条件的能力。使用低氧的荧光探针，其利用在低氧细胞中存在的硝基还原酶活性，通过将硝基转化为羟胺(NHOH)和氨基(NH2)并释放出荧光探针，来检测MCF-7SCT中的低氧区域。在培养6天后，仅在氯化钴支架上生长的MCF-7SCT显示出荧光，而在常规支架上生长的MCF-7SCT未显示出荧光，这证明了含有氯化钴的支架保持低氧的能力。然后，我们处理细胞，以使用人抗CD44-APC-cy7和抗CD24-APC抗体进行流式细胞术。使用DAPI区分单细胞群体中的活细胞，并且使用流式细胞术测定CD44+CD24-细胞群体。MCF-7SCT显示出CSC群体增加，其略高于在常规支架上生长的第一代MCF-7SCT中观察到的CSC群体增加。
增加的CD44+CD24-MCF-7细胞群体与已知调节干细胞特性的转录因子的上调相关。我们之前表明，当顺序培养第一代和第二代时，定义为CD44+CD24-细胞的CSC群体在类肿瘤中逐渐增加。由于已经报道了几种干细胞特性标记物，我们试图确定FiSSCSC平台是否显示出取决于所使用的标记物的CSC增加。我们检验了转录因子家族，Oct-4、Sox-2和Nanog，它们是所谓的Yamanaka转录因子的一部分。Oct-4、Sox-2和Nanog是在保持CSC的多能性和自我更新特征中发挥重要作用的三种转录因子。如前所述，我们将第一代MCF-7类肿瘤在FiSSCSC上培养6天，然后收获类肿瘤并将它们分成两组。一组进行RNA提取，第二组在FiSSCSC上进一步培养以形成第二代类肿瘤。在6天结束时，收获第二代类肿瘤并进行RNA提取。对从单层和第二代类肿瘤提取的RNA进行处理，并使用针对Oct-4、Sox-2和Nanog的探针进行qRT-PCR。结果显示，相对于单层细胞，Oct-4、Sox-2和Nanog在第二代中的表达在统计学上显著增加。而它们的转录物，相对于单层细胞，Sox-2显示出相对适度的增加，Oct-4和Nanog显示出约3～4倍的增加。如CD44+CD24-群体的增加所证明的，这证明了CSC增加与Oct-4、Sox-2和Nanog的基因表达增加相关。
当以6孔FiSSCSC规格培养类肿瘤时，增加的CD44+CD24-MCF-7细胞群体得以保持。本发明的实施方式可用于增加CSC的产量。我们表征了在6孔FiSSCSC板上生长类肿瘤的条件。相对于96孔板，这种规格放大使得细胞接种增加了约30倍，在实验结束时经处理的CSC也随之增加。因此，通过培养接种在例如6孔板中的增加数量的细胞，发现所有测试的细胞数量在第6天结束时均产生形成良好的类肿瘤。当我们检验CD44+CD24-细胞群体时，我们发现CSC数量得到增加。细胞的活力与在96孔规格中获得的活力相当。
将MCF-7细胞暴露于CAF CM增加了在FiSSCSC上培养的类肿瘤中的CSC群体。据报道，CSC的保持需要来自肿瘤微环境中存在的细胞组分和非细胞组分的稳定提示。在这种现象中，显示发挥作用的成员包括CAF。为了评定来自CAF的分泌因子是否可以扩增CSC群体，我们从乳腺癌患者收集CAF并进行培养。具体地，我们将CAF培养至约80％汇合，然后将它们在生长培养基中孵育48小时，最后收集培养基、离心并储存在-80℃直至使用。使用前，将培养基在冰上解冻，并用MCF-7生长培养基制备适当的稀释物以进行测试。所有测试百分比的CAF CM均有助于在FiSSCSC上形成类肿瘤。重要的是，与常规生长培养基所观察到的相比，10％和25％的CAF CM使CSC群体增加的更多。这证实了，CAF CM中存在的分泌因子增加了用FiSSCSC平台培养的MCF-7类肿瘤中的CD44+CD24-CSC群体。
我们表征了，在与MDSC共培养生长的MCF-7多细胞类肿瘤(MCT)中的CSC。已表明细胞-细胞相互作用，尤其是癌细胞和免疫细胞(如MDSC)之间的细胞-细胞相互作用，在体内促进CSC的诱导和保持。为了测试共培养的效果，我们取得了正常的健康全血，对其进行处理以获得单个核细胞。然后将单个核细胞与HeLa细胞一起培养，以帮助单个核细胞向MDSC分化。培养6天后，分离出CD33+细胞，并使用流式细胞术表征MDSC细胞表面标记物。
将从三名不同个体分离出的MDSC与MCF-7细胞在支架上共培养。共培养物形成不规则的类肿瘤，其尺寸略大于MCF-SCT，并且CD44+CD24-干细胞样群体与MCF-SCT相比略微增加。
我们表征了在FiSSCSC上生长的源自A549肺癌的异种移植物中的CSC。我们接下来检验了从体内肿瘤中分离和扩增罕见CSC群体的潜力。为了建立异种移植物，将A549细胞与混合，并皮下注射到雌性NOD-EGFP小鼠的侧腹中，并且我们监测了肿瘤生长。是专有溶解的基底膜，是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的制剂，该小鼠肉瘤是富含诸如层粘连蛋白(主要成分)、IV型胶原蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白(entactin/nidogen)和一些生长因子等ECM蛋白的肿瘤。切除肿瘤并将这些肿瘤的单细胞悬浮液在FiSSCSC上培养7天。相对于A549异种移植物，发现源自在FiSSCSC上培养的A549异种移植物细胞的类肿瘤中的CD44+CD24-群体(指示干细胞样细胞)增加了5～9倍。此外，将CD44+CD24-细胞注射到NSG小鼠中可以在体内引发肿瘤，这表明CD44+CD24-细胞真正代表A549中的CSC样细胞。
我们从每一A549异种移植物中获得约106个细胞，在一个6孔规格的FiSSCSC板上培养之后，我们使表达CD44+CD24-的细胞富集约50％。因此，可以从约20个A549异种移植物中收集约107个CD44+CD24-细胞。可以使用类似的策略，从用不同细胞类型(包括人细胞)生长的其他异种移植物中分离出CD44+CD24-CSC样细胞。
概括地说，本发明描述了使用例如FiSSTM(纤维激发的智能支架)平台，增加癌症干细胞(CSC)群体的方法。实际上，本发明描述了一种使用支架，诸如纤维激发的智能支架(FiSSCSC)，来大规模富集癌症干细胞(CSC)的方案。我们使用了不同的细胞培养条件，诸如在低氧条件下生长细胞，使用来自肿瘤基质细胞的条件培养基(CM)，共培养癌细胞与基质细胞，以及使用外源可溶性因子。
我们的发现显示MCF-7乳腺癌细胞在FiSSCSC上形成了类肿瘤。相对于作为单层生长的细胞，这些类肿瘤含有约3～5倍的CD44+CD24-干细胞样细胞。此外，我们将类肿瘤中CD44+CD24-干细胞样细胞的增加与Sox-2、Oct-4和Nanog的表达增加相关联，其中Sox-2、Oct-4和Nanog已知赋予细胞干细胞特性。当类肿瘤生长在注入氯化钴以模拟低氧的支架上时，MCF-7CD44+CD24-干细胞样细胞群体未明显增加。当与人免疫细胞，具体是MDSC共培养时，MCF-7细胞形成类肿瘤。该CD44+CD24-干细胞样群体与MCF-7细胞的单细胞类肿瘤的相当。当暴露于来自人癌相关成纤维细胞(CAF)的CM时，MCF-7细胞形成类肿瘤。
我们将类肿瘤形成的方案从例如96孔规格放大到例如6孔规格。这导致细胞输入量增加了约30倍，同时保持了我们在96孔规格中观察到的CD44+CD24-干细胞样群体的倍数增加。我们收获了第一代类肿瘤并对它们进行重新接种，以形成第二代和第三代类肿瘤。在随后的每一代中，我们发现了CD44+CD24-干细胞样群体的增加。我们使用微珠并处理CD44+细胞，并冷冻它们。此外，我们证明在解冻后，这些细胞在支架上生长成类肿瘤，并保持CD44+CD24-细胞群体。
实施例
实施例1.在常规培养基中生长的MCF-7单细胞类肿瘤增加了第一代中CSC的数量
我们首先将MCF-7细胞铺在常规生长培养基中，其中常规生长培养基由补充有10％胎牛血清(FBS)和1×青霉素-链霉素的RPMI-1640组成。将细胞以每个支架约7,000个细胞铺在96孔细胞培养板中。在接种后第2天和接种后第6天添加新鲜培养基，使用染料使类肿瘤可视化。在确认存在健康外观的类肿瘤后，使它们从支架上脱离下来，并使用accutase:柠檬酸盐溶液(1:1比例)进行处理以获得单细胞悬浮液。然后计数单细胞悬浮液的活力，并用人抗CD44-APC-cy7和抗CD24-APC染色。使用DAPI区分单细胞群体中的活细胞，并且使用流式细胞术从活细胞中测定CD44+CD24-细胞群体。如图1A和图1B所示，使用常规生长培养基在FiSSCSC上6天后，MCF-7细胞形成发育良好的第一代SCT。重要的是，如通过CD44+CD24-细胞群体增加所确定的，无论单层MCF-7细胞中CSC群体的百分比如何，第一代类肿瘤的CSC群体一直显示出约3倍的增加。
实施例2.第二代MCF-7类肿瘤在常规培养基中进一步扩增CSC
如前所述，我们首先生长了第一代类肿瘤。然后对第一代类肿瘤进行处理，获得单细胞悬浮液，并以每个支架约8,000个细胞铺在96孔细胞培养板中。在接种后第2天和接种后第6天添加新鲜培养基，使用染料使第二代类肿瘤可视化。在确认健康外观的类肿瘤后，使它们脱离下来并用人抗CD44-APC-cy7和抗CD24-APC对单细胞悬浮液进行染色。未经DAPI染色的活细胞用于使用流式细胞术来测定CD44+CD24-细胞群体。因此，第一代类肿瘤的CSC增加了约3倍，而在第二代MCF-7类肿瘤中CSC呈指数增加，增加了约10倍(图2)。
实施例3.表征在低氧条件下生长的MCF-SCT中的CSC
由于低氧似乎是保持CSC所必需的，所以我们想要使用氯化钴(一种已知的低氧诱导剂)在我们的3D模型中对此进行测试。为此，我们将MCF-7细胞铺在补充有50μM氯化钴的常规生长培养基中。如前所述，在接种后第6天使类肿瘤可视化，然后经处理以使用人抗CD44-APC-cy7和抗CD24-APC进行流式细胞术。使用DAPI区分单细胞群体中的活细胞，并且使用流式细胞术测定CD44+CD24-细胞群体。结果显示，添加氯化钴并未改变第一代MCF-7类肿瘤中CSC的百分比(图3)。CSC扩大的这种缺失可归因于，外部添加的氯化钴无法在整个细胞培养期间保持低氧条件。频繁补充氯化钴可能是确保持续低氧所必需的。
实施例4.表征在含有氯化钴的支架上生长的第一代MCF-7-SCT中的CSC
因为我们早期的实验显示外部添加的氯化钴无法增加第一代类肿瘤中的CSC，所以我们决定将氯化钴掺入支架的基质内。我们的假设是，包埋在支架内的氯化钴会有助于在整个实验期间保持低氧细胞培养环境。为此，我们将100μM氯化钴与专有的聚合物混合物混合，并使用所得到的静电纺丝支架测试其对MCF-7-SCT生长的影响。我们将MCF-7细胞铺在常规生长培养基中的含有氯化钴的支架上。如前所述，在接种后第6天和进行流式细胞术之前使用使类肿瘤可视化，我们首先确定了支架内的氯化钴维持低氧条件的能力。使用低氧的荧光探针(红色)，其利用低氧细胞中存在的硝基还原酶活性，通过将硝基转化为羟胺(NHOH)和氨基(NH2)并释放荧光探针，来检测MCF-7SCT中的低氧区域。在培养6天后，仅仅在氯化钴支架上生长的MCF-7 SCT显示出红色荧光，而在常规支架上生长的MCF-7SCT未显示出红色荧光，这证明了含有氯化钴的支架保持低氧的能力。然后，我们处理细胞，以使用人抗CD44-APC-cy7和抗CD24-APC进行流式细胞术。使用DAPI区分单细胞群体中的活细胞，并且使用流式细胞术测定CD44+CD24-细胞群体。MCF-7 SCT显示出CSC群体增加，其略高于在常规支架上生长的第一代MCF-7 SCT中观察到的CSC群体增加(图3)。
实施例5.增加的CD44+CD24-MCF-7细胞群体与已知调节干细胞特性的转录因子的上调相关
我们之前表明，当顺序培养第一代和第二代时，定义为CD44+CD24-细胞的CSC群体在类肿瘤中逐渐增加。由于已经报道了几种干细胞特性标记物，我们试图确定FiSSCSC平台是否显示出取决于所使用的标记物的CSC增加。我们检验了转录因子家族，Oct-4、Sox-2和Nanog，它们是所谓的Yamanaka转录因子的一部分。Oct-4、Sox-2和Nanog是在保持CSC的多能性和自我更新特征中发挥重要作用的三种基础转录因子。如前所述，我们将第一代MCF-7类肿瘤在FiSSCSC上培养6天，然后收获类肿瘤并将它们分成两组。一组使用Trizol试剂进行RNA提取，第二组在FiSSCSC上进一步培养以形成第二代类肿瘤。在6天结束时，收获第二代类肿瘤并进行RNA提取。对从单层和第二代类肿瘤提取的RNA进行处理，并使用针对Oct-4、Sox-2和Nanog的探针进行qRT-PCR。使用HPRT作为管家基因，以对基因表达进行标准化。结果显示，与单层相比，Oct-4、Sox-2和Nanog在第二代中的表达在统计学上显著增加(图5)。而它们的转录物，相对于单层细胞，Sox-2显示出相对适度的增加，Oct-4和Nanog显示出约3～4倍的增加。如CD44+CD24-群体的增加所证明的，这证明了CSC增加与Oct-4、Sox-2和Nanog的基因表达增加相关。
实施例6.当以6孔FiSSCSC规格培养类肿瘤时，CD44+CD24-MCF-7细胞群体的增加得以保持
本发明的实施方式可用于增加CSC的产量。我们表征了在6孔FiSSCSC板上生长类肿瘤的条件。相对于96孔板，这种放大使得细胞接种增加了约30倍，在实验结束时经处理的CSC也随之增加。因此，通过培养接种在例如6孔板中的增加数量的细胞，发现所有测试的细胞数量在第6天结束时均产生结构良好的类肿瘤(图6A)。当我们检验CD44+CD24-细胞群体时，我们发现尽管实验与实验之间略有不同，但CSC数量都是增加的。具体地，我们发现存在这样的细胞密度，其相对于96孔规格，在6孔规格中产生大量的CD44+CD24-细胞。在6孔板中，这一细胞数量为每孔约240,000至约270,000个细胞(图6B)。低于或高于该范围的细胞数量导致CD44+CD24-细胞群体减少。细胞的活力与在96孔规格中获得的相当(约80％)。因此，在本发明的一个实施方式中，使用约240,000个细胞/6孔在FiSSCSC上生长类肿瘤。
实施例7.将MCF-7细胞暴露于CAF CM增加了在FiSSCSC上培养的类肿瘤中的CSC群体
据报道，CSC的保持需要来自肿瘤微环境中存在的细胞组分和非细胞组分的稳定提示。在这种现象中，显示发挥作用的成员包括CAF。为了评定来自CAF的分泌因子是否可以扩增CSC群体，我们从乳腺癌患者收集CAF并进行培养。具体地，我们将CAF培养至约80％汇合，然后将它们在生长培养基中孵育48小时，最后收集培养基、离心、并储存在-80℃直至使用。使用前，将培养基在冰上解冻，并用MCF-7生长培养基制备适当的稀释物以进行测试。
如图7A所示，所有测试百分比的CAF CM均有助于在FiSSCSC上形成类肿瘤。重要的是，与常规生长培养基所观察到的相比，10％和25％的CAF CM使CSC群体增加更多(图7B)。这证实了CAF CM中存在的分泌因子使得用FiSSCSC平台培养的MCF-7类肿瘤中的CD44+CD24-CSC群体增加。
实施例8.表征在与MDSC共培养生长的MCF-7多细胞类肿瘤(MCT)中的CSC
细胞-细胞相互作用，尤其是癌细胞和免疫细胞(如MDSC)之间的细胞-细胞相互作用，已被证明可以在体内促进CSC的诱导和保持。为了测试共培养的效果，我们获取了正常的健康全血，对其进行了处理获得单个核细胞。然后将单个核细胞与HeLa细胞(1:100比例)一起培养，以帮助单个核细胞向MDSC分化。培养6天后，分离出CD33+细胞，并使用流式细胞术表征MDSC细胞表面标记物。
将从三名不同个体分离出的MDSC与MCF-7细胞在支架上共培养(图8A)。共培养形成不规则的类肿瘤，其尺寸略大于MCF-SCT，并且相对于MCF-SCT，CD44+CD24-干细胞样群体显示略微增加(图8B)。然而，我们还观察到所使用的三种供体MDSC之间的倍数诱导的变化。
实施例9.FiSS诱导癌症干细胞扩增
如基于醛脱氢酶(ALDH)活性所鉴定的，我们发现，与单层细胞(0.3％)相比，在FiSS平台上培养LLC1诱导CSC活性至少增加了30倍(图9A)。与在单层上生长的细胞相比，这些类肿瘤表现出ALDH-Hi群体，代表CSC样群体。经分选的ALDH阳性群体可以在C57BL/6小鼠中引发比未经分选的LLC1类肿瘤好的肿瘤生长(图9B)，这意味着ALDH阳性群体具有CSC样细胞。此外，这些类肿瘤在FiSS上连续传代，使得ALDH阳性细胞在第三代中富集至87.5％，并且在扩增的群体中大多数干细胞特性基因是保守的。为了检验从体内肿瘤中分离和扩增罕见CSC群体的潜力，我们切除了植入C57BL/6小鼠的LLC1肿瘤。当在FiSS上将LLC1肿瘤的单细胞悬浮液培养6天时，发现ALDH阳性群体扩增了10倍(图9C)。
实施例10.表征在FiSSCSC上生长的源自A549肺癌的异种移植物中的CSC
我们接下来检验了从体内肿瘤中分离和扩增罕见CSC群体的潜力。为了检验从体内肿瘤中分离和扩增罕见CSC群体的潜力，我们切除了植入C57BL/6小鼠的LLC1肿瘤。当在FiSS上将LLC1肿瘤的单细胞悬浮液培养6天时，发现ALDH阳性群体扩增了10倍。类似地，将植入NSG小鼠的A549异种移植物和这些肿瘤的单细胞悬浮液在FiSS上培养6天。与A549异种移植物(6.84％)相比，发现在FiSS上培养的源自A549异种移植物细胞的类肿瘤中CD44+CD24-群体(代表干细胞样细胞)增加了5～9倍(50.9％)(图10A)。此外，在NSG小鼠中注射至少1,000个CD44+CD24-群体可以在体内引发肿瘤，这表明CD44+CD24-细胞真正代表A549中的CSC样细胞。因此，与初次注射3×106个细胞相比，仅注射20,000个CD44+CD24-细胞诱导相同尺寸的肿瘤，这一证据表明我们开发的CSC扩增方案富集了肿瘤引发细胞(图10B)。
我们从每个A549异种移植物中获得约106个细胞，在一个6孔规格的FiSSCSC板上培养后，我们使表达CD44+CD24-的细胞富集了约50％。因此，可以从v20A549异种移植物中收集约107个CD44+CD24-细胞。可以使用类似的策略从其他异种移植物中分离CD44+CD24-CSC样细胞。
实施例11.储存纯化的癌症干细胞
为了检验扩增的CSC是否可以适当地储存，我们使用微珠并处理CD44+细胞，然后在例如培养基中冷冻这些细胞。在富集之前，在单层培养的细胞中，约19％的细胞是CD44+，而在支架上生长的细胞中，约26％是CD44+。此外，在减少类肿瘤细胞后，约67％是CD44+细胞。在冷冻和解冻细胞后，约55％的细胞是CD44+(图11)。
本发明的实施方式至少包括以下内容。在本发明的一个实施方式中，使用常规生长培养基来生长第一代MCF-7类肿瘤，并且从所述第一代MCF-7类肿瘤生长第二代类肿瘤。在每一代结束时，我们对所得的类肿瘤进行处理，并通过流式细胞术分析细胞的干细胞标记物(例如CD44高和CD24低)。结果显示，第一代MCF-7类肿瘤的CSC增加了约3倍。
在另一个实施方式中，使用补充有氯化钴的常规生长培养基来模拟第一代MCF-7类肿瘤中的低氧。或者，将氯化钴注入支架基质中，以确保在支架上生长的第一代MCF-7类肿瘤的低氧条件得以持续。在第二代类肿瘤中，这种增加得到进一步加强，我们观察到CSC增加了约10倍。虽然补充氯化钴对CSC扩大影响很小，但是在注入氯化钴的支架上生长第一代类肿瘤得到了更大的第一代类肿瘤，其显示出与在常规支架上生长的类肿瘤相比CSC增加的趋势。
在另一个实施方式中，通过在条件培养基(CM)中培养类肿瘤，进一步增加了CSC群体，该条件培养基(CM)收集自原代癌相关成纤维细胞(CAF)和来自人外周血的髓源抑制性细胞(MDSC)。
在另一个实施方式中，将类肿瘤培养条件从96孔规格扩展至6孔规格组织培养皿，以增加CSC的产量(增加约30倍)，同时保持了CSC扩增的能力。
在又一实施方式中，检验了CSC的长期储存以及活力和功能特性的测试，其结果证明了干细胞扩增和储存的可行性。
本发明的其他实施方式至少包括以下内容：
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体外方法，所述体外方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体外方法，所述体外方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述类肿瘤培养在培养基中，所述培养基包括：从原代人癌相关成纤维细胞(CAF)收集的条件培养基(CM)。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体外方法，所述体外方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述类肿瘤培养培养基中，所述培养基包括：从来自人外周血的原代髓源抑制性细胞(MDSC)收集的条件培养基(CM)。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体外方法，所述体外方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述支架是纤维激发的智能支架(FiSSTM)。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体外方法，所述体外方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离处CSC，其中所述支架进一步包含基于ECM的水凝胶。在一个实施方式中，所述基于ECM的水凝胶是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的溶解的基底膜制剂(例如Corning Life Sciences和BD Biosciences的或Trevigen Inc.的基底膜提取物(BME))，其中EHS小鼠肉瘤是一种富含诸如层粘连蛋白(主要成分)、IV型胶原蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白(entactin/nidogen)和生长因子的ECM蛋白的肿瘤。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体外方法，所述体外方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中从第一代类肿瘤中收获所述CSC。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体外方法，所述体外方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中从第二代类肿瘤中收获所述CSC，所述第二代类肿瘤从第一代类肿瘤生长。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体外方法，所述体外方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中从第三代类肿瘤中收获所述CSC，所述第三代类肿瘤从第二代类肿瘤生长，所述第二代类肿瘤从第一代类肿瘤生长。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物，其中所述支架是通过对所述聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物进行静电纺丝而制备的。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物，其中所述支架进一步包含氯化钴(CoCl2)。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物，其中所述支架是纤维激发的智能支架(FiSSTM)。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物，其中所述支架进一步包含
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物，其中所述支架诱导低氧培养条件。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物，其中所述支架进一步包含氯化钴(CoCl2)。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物，其中所述支架进一步包含一种或多种铁螯合剂。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物，其中所述支架进一步包含敲低希佩尔·林道(VHL)肿瘤抑制基因的siRNA。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物，其中所述支架进一步包含编码生长因子的DNA。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的支架，所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物，其中所述支架进一步包含TGF-β。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体内方法，所述体内方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体内方法，所述体内方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC，其中所述宿主动物是小鼠。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体内方法，所述体内方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC，其中所述宿主动物是NOD-EGFP小鼠。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体内方法，所述体内方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC，其中所述癌细胞是人癌细胞。
一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的体内方法，所述体内方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC，其中所述癌细胞与一起注射。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述支架是纤维激发的智能支架(FiSSTM)。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述支架是通过对聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物进行静电纺丝而制备的。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述支架进一步包含氯化钴(CoCl2)。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中在培养基中培养所述类肿瘤，所述培养基包括从原代人癌相关成纤维细胞(CAF)收集的条件培养基(CM)。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中在包含的培养基中培养所述类肿瘤。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中从第一代类肿瘤中收获所述CSC。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中从第二代类肿瘤中收获所述CSC，所述第二代类肿瘤从第一代类肿瘤生长。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中从第三代类肿瘤中收获所述CSC，所述第三代类肿瘤从第二代类肿瘤生长，所述第二代类肿瘤从第一代类肿瘤生长。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述支架诱导低氧培养条件。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述支架进一步包含一种或多种铁螯合剂。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述支架进一步包含敲低希佩尔·林道(VHL)肿瘤抑制基因的siRNA。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述支架进一步包含编码生长因子的DNA。
一种用于体外癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括在支架上生长类肿瘤以及从培养物中分离出CSC，其中所述支架进一步包含TGF-β。
一种用于体内癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC。
一种用于体内癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC，其中所述癌细胞获自哺乳动物。
一种用于体内癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC，其中所述癌细胞获自哺乳动物，其中所述哺乳动物是癌症的实验动物模型。
一种用于体内癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC，其中所述癌细胞获自哺乳动物，其中所述哺乳动物是人癌症的实验动物模型。
一种用于体内癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC，其中所述癌细胞来自人活检物。
一种用于体内癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC，其中所述癌细胞是人肿瘤细胞。
一种用于体内癌症干细胞(CSC)扩增的方法，所述方法包括：通过注射癌细胞在宿主动物中生长异种移植物，从所回收的异种移植物中分离出细胞，在支架上生长所述细胞以形成类肿瘤，以及从培养物中分离出CSC，其中所述癌细胞与一起注射。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、诸如分子量等特性、反应条件等等的所有数字，均应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反说明，否则以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，这些值可以根据试图利用本发明获得的所需特性而变化。在最低限度上，且不试图将等同原则的应用限制于权利要求书的范围，每个数字参数应至少根据所报道的有效位的数目并通过应用一般舍入技术来解释。
虽然已经参考优选实施方式具体地示出并描述了本发明，但本领域技术人员应理解，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下在其中做出形式和细节上的各种改变。
本文引用的所有文献、出版物、手册、文章、专利、概述、参考文献和其他材料均以引用方式整体并入。通过考虑本文所公开的本发明的说明书和实践，本发明的其他实施方式对本领域技术人员而言将为显而易见的。本说明书和实施例旨于理解为示例性的，本发明的真实范围和精神由权利要求书来指示。

Claims (48)

1.一种用于扩增癌症干细胞(CSC)的方法，包括：
a)在体外细胞培养物中的三维支架上，生长类肿瘤；以及
b)从所述类肿瘤中分离出CSC。
2.一种用于扩增癌症干细胞(CSC)的方法，包括：
a)在包含三维支架的体外细胞培养物中，生长癌细胞；
b)在所述支架上，从所述癌细胞生长类肿瘤；
c)从所述类肿瘤中，收获癌细胞(类肿瘤癌细胞)；
d)将所述类肿瘤癌细胞，转移到包括三维支架的新的体外细胞培养物中；
e)在所述新的体外细胞培养物的所述支架上，从所述类肿瘤癌细胞生长下一代类肿瘤。
3.如权利要求2所述的方法，其中将步骤c)至步骤e)重复至少一次。
4.如权利要求2所述的方法，其中将所述步骤c)至步骤e)重复至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次或至少七次。
5.如权利要求2～4中任一项所述的方法，包括：从所述类肿瘤中分离出CSC。
6.如权利要求1～5中任一项所述的方法，其中所述方法包括：将所述类肿瘤解离成单个细胞，或小于1000、500、100、50或10个细胞的类肿瘤细胞碎片。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中所述方法包括：从所述类肿瘤，形成类肿瘤癌细胞的单细胞悬浮液。
8.如权利要求1或5～7中任一项所述的方法，其中所述从所述类肿瘤中分离出CSC包括：从所述类肿瘤形成类肿瘤癌细胞的单细胞悬浮液；以及，从所述类肿瘤癌细胞的单细胞悬浮液中分离出CSC。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括：从人癌细胞生长类肿瘤。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述人癌细胞来自人活检物。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述支架包含聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的静电纺丝混合物。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述类肿瘤生长在低氧条件或模拟低氧条件的条件下，所述低氧条件或模拟低氧条件遍及所述细胞培养物或局部于所述支架。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞培养物或所述支架进一步包含氯化钴(CoCl2)。
14.如权利要求13所述的方法，其中在静电纺丝之前，将所述CoCl2添加到聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物中。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述类肿瘤培养在培养基中，该培养基包括条件培养基(CM)，所述条件培养基(CM)收集自：原代人癌相关的成纤维细胞(CAF)和/或来自人外周血的髓源抑制性细胞(MDSC)。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述类肿瘤培养在包含基于ECM的水凝胶的培养基中。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述基于ECM的水凝胶是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤提取的、溶解的基底膜制剂。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与用于生长第一代类肿瘤的癌细胞相比，所述第一代类肿瘤的CSC增加了至少2倍、2.5倍或3倍。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括生长第二代类肿瘤，并且其中，与用于生长所述第二代类肿瘤的所述第一代类肿瘤癌细胞相比，或与用于生长所述第一代类肿瘤的所述癌细胞相比，所述第二代类肿瘤的CSC增加了至少5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
20.如权利要求19所述的方法，其中与用于生长所述第二代类肿瘤的所述第一代类肿瘤癌细胞相比，所述第二代类肿瘤的CSC增加了至少10倍。
21.如权利要求20所述的方法，其中与用于生长所述第一代类肿瘤的所述癌细胞相比，所述第二代类肿瘤的CSC增加了至少10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、75倍或80倍。
22.如权利要求21所述的方法，其中与用于生长所述第一代类肿瘤的所述癌细胞相比，所述第二代类肿瘤的CSC增加了至少80倍。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括生长第三代类肿瘤，并且其中，与用于生长所述第一代类肿瘤的所述癌细胞、所述第一代类肿瘤或所述第二代类肿瘤相比，所述第三代类肿瘤的CSC增加了至少10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、75倍或80倍。
24.如权利要求19所述的方法，其中所述方法包括生长第三代类肿瘤，并且其中，与用于生长所述第一代类肿瘤的癌细胞相比，所述第三代类肿瘤的CSC增加了至少10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、75倍或80倍。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中从第一代、第二代、第三代或第四代、第五代、第六代、第七代、第八代、第九代或第十代的类肿瘤中，收获所述CSC。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用从所述类肿瘤中分离出的CSC，来生长下一代类肿瘤。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用从第一代类肿瘤中分离出的CSC，来生长第二代类肿瘤。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用从第二代类肿瘤中分离出的CSC，来生长第三代类肿瘤。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用从第一代类肿瘤中分离出的CSC来生长第二代类肿瘤，并且使用从所述第二代类肿瘤中分离出的CSC来生长第三代类肿瘤。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养物或所述支架进一步包含一种或多种铁螯合剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中在静电纺丝之前，将所述一种或多种铁螯合剂添加到聚乳酸(PLA)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的嵌段共聚物和聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的混合物中。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养物或所述支架进一步包含敲低希佩尔·林道(VHL)肿瘤抑制基因的siRNA。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌细胞包含编码生长因子的异源DNA。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养物或所述支架进一步包含TGF-β。
35.一种用于癌症干细胞(CSC)扩增的方法，包括：
a)将癌细胞注射到非人宿主动物中以形成肿瘤；
b)从所述宿主动物中移出所述肿瘤；
c)将所述肿瘤解离成肿瘤细胞和/或肿瘤碎片的悬浮液；以及
d)使所述悬浮液生长在体外细胞培养物中的三维支架上，以形成类肿瘤。
36.如权利要求1～34中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
a)将癌细胞注射到非人宿主动物中以形成肿瘤；
b)从所述宿主动物中移出所述肿瘤；
c)将所述肿瘤解离成肿瘤细胞或肿瘤碎片的悬浮液；以及
d)使所述悬浮液生长在体外细胞培养物中的三维支架上，以形成类肿瘤。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述肿瘤是肿瘤异种移植物。
38.如权利要求35或36所述的方法，其中所述癌细胞获自哺乳动物。
39.如权利要求35～38中任一项所述的方法，其中所述癌细胞来自人活检物。
40.如权利要求35～39中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是人肿瘤细胞。
41.如权利要求35～40中任一项所述的方法，其中所述癌细胞与基于ECM的水凝胶一起注射。
42.如权利要求35或36所述的方法，其中在步骤d)中生长的所述类肿瘤是第一代类肿瘤、第二代类肿瘤、第三代类肿瘤或第四代类肿瘤。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述类肿瘤是第一代类肿瘤。
44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在常规培养基中培养所述类肿瘤。
45.一种筛选抗癌药物化合物的方法，包括：a)培养如权利要求1～44中任一项所述的类肿瘤；b)使所述类肿瘤与抗癌药物化合物接触；以及，c)测量所述药物化合物对所述类肿瘤的影响。
46.一种筛选抗癌药物化合物的方法，包括：a)培养如权利要求1～44中任一项所述的类肿瘤癌细胞；b)使所述类肿瘤癌细胞与抗癌药物化合物接触；以及，c)测量所述药物化合物对所述类肿瘤癌细胞的影响。
47.一种筛选抗癌药物化合物的方法，包括：a)培养如权利要求1～44中任一项所述的分离出的CSC；b)使所述分离出的CSC与抗癌药物化合物接触；以及，c)测量所述药物化合物对所述分离出的CSC的影响。
48.如权利要求45、46或47所述的方法，其中所述方法包括测量所述药物化合物的IC50、GI50、ED50或LD50。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528445A (zh) * 2021-06-21 2021-10-22 创模生物科技(北京)有限公司 Pdx建模佐剂及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113574164A (zh) * 2018-10-16 2021-10-29 得克萨斯州大学系统董事会 用于产生肿瘤类器官的组合物和产生肿瘤类器官的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013155114A1 (en) * 2012-04-09 2013-10-17 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Scaffold and method for proliferation and enrichment of cancer stem cells
WO2015179393A1 (en) * 2014-05-19 2015-11-26 University Of South Florida Formation of multicellular tumoroids and uses thereof
CN105209074A (zh) * 2012-10-20 2015-12-30 得克萨斯大学体系董事会 癌细胞陷阱
US20150374692A1 (en) * 2013-02-19 2015-12-31 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions relating to the treatment of cancer
WO2016083612A1 (en) * 2014-11-27 2016-06-02 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium for expanding breast epithelial stem cells

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013184193A2 (en) * 2012-06-04 2013-12-12 Medimmune, Llc Cancer stem cells and methods of using the same
US20140080214A1 (en) * 2012-09-20 2014-03-20 Agency For Science, Technology And Research Cleavable cellulosic sponge development for 3 dimensional cell culture and spheroids retrieval
CA2919486C (en) * 2013-08-02 2021-11-02 University Of South Florida Three dimensional fibrous scaffolds for cell culture
US20160095885A1 (en) * 2014-10-01 2016-04-07 WibiWorks Therapeutics, Inc. Induction Medium & Methods for Stem Cell Culture & Therapy
GB201421092D0 (en) * 2014-11-27 2015-01-14 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium
CA2978729A1 (en) * 2015-03-06 2016-09-15 Tsunekazu Oikawa Human fibrolamellar hepatocellular carcinomas (hfl-hccs)

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013155114A1 (en) * 2012-04-09 2013-10-17 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Scaffold and method for proliferation and enrichment of cancer stem cells
CN105209074A (zh) * 2012-10-20 2015-12-30 得克萨斯大学体系董事会 癌细胞陷阱
US20150374692A1 (en) * 2013-02-19 2015-12-31 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions relating to the treatment of cancer
WO2015179393A1 (en) * 2014-05-19 2015-11-26 University Of South Florida Formation of multicellular tumoroids and uses thereof
WO2016083612A1 (en) * 2014-11-27 2016-06-02 Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen Culture medium for expanding breast epithelial stem cells

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528445A (zh) * 2021-06-21 2021-10-22 创模生物科技(北京)有限公司 Pdx建模佐剂及其应用

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