JP2019534041A - がん幹細胞（ｃｓｃ）増大のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、例えばＦｉＳＳ（商標）（線維に励起されたスマートスキャフォールド）プラットフォーム（乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体のエレクトロスピンされた混合物を含む、細胞培養のためのスキャフォールド）を使用して、がん幹細胞（ＣＳＣ）（ヒトＣＳＣが挙げられる）の集団を増加させる方法に関する。一例として、ＦｉＳＳＣＳＣ上で増殖させたＭＣＦ−７細胞は、良好に形成された単一細胞腫瘍オルガノイド（ＳＣＴ）へと発達したことが実証され、単層として増殖された類似の継代の細胞に対して、がん幹細胞（ＣＳＣ）集団の約３倍の増加を示す。第一世代腫瘍オルガノイドを使用して第二世代腫瘍オルガノイド及び第三世代腫瘍オルガノイドを増殖させた場合に、この増加はさらに増強された。加えて、ＣＳＣの誘導における損失なしに、例えば９６ウェルプレートから例えば６ウェルプレートへ細胞培養プロトコールをスケールアップした。さらに、ＣＳＣをエンリッチした細胞を選別及び冷凍し、成功裡にそれらを再び融解して、ＣＳＣ集団を維持しながら腫瘍オルガノイドを増殖させた。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１６年１０月６日に出願された米国特許出願第６２／４０５，１８７号の優先権を主張し、当該出願は参照により本明細書に援用される。

本発明は、例えばＦｉＳＳ（商標）（線維に励起されたスマートスキャフォールド（ｆｉｂｅｒ−ｉｎｓｐｉｒｅｄ ｓｍａｒｔ ｓｃａｆｆｏｌｄ））プラットフォーム（乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体のエレクトロスピンされた混合物を含む、細胞培養のためのスキャフォールド）を使用して、がん幹細胞（ＣＳＣ）の集団を増加させる方法を記載する。一実施形態において、通常の増殖培地を使用して、第一世代腫瘍オルガノイド（ｔｕｍｏｒｏｉｄ）、及び第一世代腫瘍オルガノイドからの第二世代腫瘍オルガノイドを増殖させる。各々の世代の終了時で、もたらされた腫瘍オルガノイドはプロセシングされ、細胞は、例えばフローサイトメトリーによって幹細胞マーカー（例えばＣＤ４４^高／ＣＤ４４^＋及びＣＤ２４^低／ＣＤ２４⁻）について分析される。意外にも、腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用したがん細胞に比較して、腫瘍オルガノイドは約３倍のＣＳＣの増加を有する。

別の実施形態において、通常の増殖培地に塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）を補足して使用して、腫瘍オルガノイドにおいて低酸素を模倣する。あるいは、塩化コバルトをスキャフォールドマトリックスの中へ注入して、スキャフォールド上で増殖する第一世代腫瘍オルガノイドのための低酸素条件の持続を確実にする。

ＣＳＣの増加は、第二世代腫瘍オルガノイドにおいて、さらにそして予想外に増強され、そこで、ＣＳＣの約１０倍の増加が観察された。別の実施形態において、腫瘍オルガノイドは塩化コバルト注入スキャフォールド上で増殖され、通常のスキャフォールド上で増殖させた腫瘍オルガノイドと比較して、ＣＳＣ増加に向かう傾向を示す、より大きな第一世代腫瘍オルガノイドをもたらす。

さらなる実施形態において、ＣＳＣ集団は、原発性がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）及びヒト末梢血からの骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）から収集された馴化培地（ＣＭ）中での腫瘍オルガノイドの培養によってさらに増加する。

別の実施形態において、腫瘍オルガノイド培養条件を、より小さなウェルフォーマット（例えば９６ウェルフォーマット）から、より大きなウェルフォーマット（例えば６ウェルフォーマット組織培養ディッシュ）へ増大して、ＣＳＣ増大のための能力を維持しながら、ＣＳＣの収率を増加させる（約３０倍まで）。

さらに別の実施形態において、ＣＳＣは、増大されて保管される。

がんは、世界中の罹病率及び死亡率の主要な原因を構成し続ける。従来の治療法では、多くの場合、腫瘍の完全な根絶、がん再発の予防、または肺癌患者における転移の予防ができない。最近、いくつかの事例において、がんの有効な治療におけるこれらの失敗は、がん幹細胞（ＣＳＣ）（それは自己更新、腫瘍開始及び腫瘍維持の特性を有する）に起因し、治療に続く再燃後の死亡の主要な原因と判断される。

化学療法及び他の従来のがん療法は大量の腫瘍細胞の殺傷についてはより有効であり得るが、ＣＳＣの生存は静止性であるため、ＣＳＣは回避及び新しい腫瘍増殖の播種を上手にやっていくことができる（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６，９３３９−４４；Ｒｅｙａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１４，１０５−１１）。腫瘍形成（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１５，１０１０−１２）、腫瘍不均一性（Ｍｅａｃｈａｍ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ ５０１，３２８−３７）、化学療法及び放射線療法への耐性（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１００，６７２ ９；Ｄｉｅｈｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４５８，７８０−３）、ならびに転移性表現型（Ｓｈｉｏｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３８，２８５−９３）におけるＣＳＣの役割を支持する証拠が増すにつれて、ＣＳＣを標的とする特異的療法の開発は、がん患者（特に転移性疾患のある患者）の生存及び生活の質の改善のために有望である（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８，９７−１０６；Ｄａｌｅｒｂａ ＆ Ｃｌａｒｋｅ（２００７）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １，２４１−２）。

したがって、ＣＳＣを標的とする新規の治療剤（特にＣＳＣの自己更新、再生、及び分化過程を標的とする薬剤）の開発についての持続的且つ緊急の必要性がある。これらの薬剤（小分子または生物学的製剤等）は、標的ＣＳＣ、ＣＳＣに関するバイオマーカー、ならびに発がん、腫瘍進行、維持、再発及び転移と関連する基本的なプロセスに影響するＣＳＣ経路に対してデザインされるべきである。

ＣＳＣの維持はそれらの微小環境によって調節される。したがって、細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）相互作用及び細胞−細胞相互作用は、幹細胞再プログラミングにおいて重要な役割を果たし得る。ＣＳＣから腫瘍への進行は、ＥＣＭ（例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン）、内皮細胞、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、及び免疫細胞（例えばマクロファージ、好中球、リンパ球）を含む、腫瘍の微小環境または間質に依存する。腫瘍微小環境は、多数のがん細胞（肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌及び乳癌が挙げられる）における上皮間充織転換（ＥＭＴ）の活性化を誘導する（Ｐｏｌｙａｋ ＆ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ（２００９）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ９，２６５−７３）。

シグナル伝達の持続的活性化は、ヘッジホッグ、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｗｎｔ／βカテニン、ノッチ、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ-β）／ＴＧＦ-β受容体、及び／またはストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）／ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）が関与する経路が、ＣＳＣの高い自己更新能力、生存、浸潤及び転移において重要な役割を果たすことを示す（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８，９７−１０６；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ １１，７３）。転写因子（Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ−４及びＬｉｎ−２８等）も、胚性幹細胞（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ １３２，１０４９−６１）及びＣＳＣ（Ｃｈｉｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０，１０４３３−１０４４４）の自己更新において重要な役割を果たす。これらの転写因子は様々ながんにおいて過剰発現され、悪性進行と関連する。まとめると、これらの分子的な事象は協力して、がん細胞が、転移性で再発性の疾患状態への転換の間に、生存し、より侵襲性且つ移動性の挙動を取得することを可能にする。

腫瘍形成（Ｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６１，１００７−１９）、腫瘍不均一性（Ｇｕｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３０，６０７６−８５）、化学療法及び放射線療法への耐性（Ｕｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１，１８７５−８４；Ｌｉｎ ＆ Ｃｈａｎｇ（２００８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．３，１１７２−８４）、ならびに転移性表現型（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．１６，１４１−５４）におけるＣＳＣの役割を支持する証拠が増すにつれて、ＣＳＣを標的とする特異的療法の開発は、がん患者（特に転移性疾患のある患者）の生存及び生活の質の改善のために有望である（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．３１８，１５７７−８５；Ｄｈｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２６，９７９−８６）。しかしながら、これらの細胞の研究における主要な障壁としては、インビボでの低い量（≦１％）及び増大の間に示す表現型の可塑性が挙げられる。

したがって、例えばＣＳＣ薬物標的、ＣＳＣに関するバイオマーカー、ならびに発がん、腫瘍進行、維持、再発及び転移と関連する基本的なプロセスに影響するＣＳＣ経路の調査において使用され得るＣＳＣの増大のための新規方法の開発についての緊急の必要性がある。ＣＳＣの除去は、非常に切望されるがんの「治癒」を提供し、ＣＳＣと関連するこれらの分子的な事象を特異的に標的化できる薬剤についての探索は、懸命に調査されている。しかしながら、腫瘍におけるこれらの細胞のわずかなパーセンテージのみの存在は、かかる細胞を単離することを難しくする。ＣＳＣをインビトロで増大する新規アプローチは、依然として緊急の未解決の必要性がある。

異なるパーセントのＣＳＣ（Ａ）及び（Ｂ）を備えたＭＣＦ−７単層細胞を使用して、第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させた。単層細胞を、スキャフォールド（本明細書においてＦｉＳＳ^ＣＳＣプラットフォーム；Ｇｉｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８，ｅ７５３４５）上に６日間プレーティングし、もたらされた第一世代腫瘍オルガノイドをＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）を使用して可視化した。次いでＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドを単一細胞懸濁液のためにプロセシングし、ＣＤ４４蛍光色素抗体及びＣＤ２４蛍光色素抗体により染色した。次いでＣＤ４４^高ＣＤ２４^低細胞をフローサイトメトリーを使用して検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。 ＭＣＦ−７細胞を、スキャフォールド（本明細書においてＦｉＳＳ^ＣＳＣプラットフォーム）上に６日間プレーティングした（スキャフォールド、第一世代）。次いで第一世代腫瘍オルガノイドをプロセシングし、ＦｉＳＳ^ＣＳＣプラットフォーム上に再プレーティングし、第二世代腫瘍オルガノイドへと増殖させた（スキャフォールド、第二世代）。第一世代腫瘍オルガノイド及び第二世代腫瘍オルガノイドを、ＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）を使用して可視化した。次いでＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドを単一細胞懸濁液のためにプロセシングし、ＣＤ４４蛍光色素抗体及びＣＤ２４蛍光色素抗体により染色した。ＣＤ４４^高ＣＤ２４^低細胞をフローサイトメトリーを使用して検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。 ＭＣＦ−７単層細胞を、通常の培地（スキャフォールド）及び５０μＭの塩化コバルトを補足した通常の培地（スキャフォールド＋ＣｏＣｌ_２）を使用して、ＦｉＳＳ^ＣＳＣプラットフォーム上にプレーティングした。６日後に、発達した腫瘍オルガノイドをＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）を使用して可視化した。次いでＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドを単一細胞懸濁液のためにプロセシングし、ＣＤ４４蛍光色素抗体及びＣＤ２４蛍光色素抗体により染色した。ＣＤ４４^高ＣＤ２４^低細胞をフローサイトメトリーを使用して検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。 ＭＣＦ−７単層細胞を、ＦｉＳＳ^ＣＳＣプラットフォーム（スキャフォールド）または１００μＭの塩化コバルトを含有するように操作されたＦｉＳＳ^ＣＳＣ（ＣｏＣｌ_２スキャフォールド）上にプレーティングした。６日後に、発達した腫瘍オルガノイドをＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）を使用して可視化した。次いでＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドを単一細胞懸濁液のためにプロセシングし、ＣＤ４４蛍光色素抗体及びＣＤ２４蛍光色素抗体により染色した。ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞をフローサイトメトリーを使用して検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。 第二世代腫瘍オルガノイドは、幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）を調節する転写因子のアップレギュレーションを示した。ＭＣＦ−７細胞をＦｉＳＳ^ＣＳＣ上に６日間播種して、第一世代腫瘍オルガノイドを形成させた。これらを収穫及び培養して、ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で第二世代腫瘍オルガノイドをさらに６日間形成させた。各々の培養期間の終了時に、腫瘍オルガノイドをＲＮＡ抽出のためにプロセシングし、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ ４、及びＮａｎｏｇについてのプローブを使用してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。ＨＰＲＴをハウスキーピング遺伝子対照として使用して、遺伝子発現を正規化した。データを平均±標準誤差として表現した。アッセイを四重で遂行した（＊ｐ＜０．０５）。 ９６ウェルＦｉＳＳ^ＣＳＣプレートから６ウェルＦｉＳＳ^ＣＳＣプレートへスケールアップする場合に、ＣＳＣ集団は維持された。ＭＣＦ−７細胞をＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で異なる細胞数で６日間播種して、６ウェルプレート中で腫瘍オルガノイドを形成させた。単層及び９６ウェルＦｉＳＳ^ＣＳＣプレート上にプレーティングされた細胞を、対照として使用した。６日間の終了時に、細胞をＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）により染色し、生存する腫瘍オルガノイドを蛍光顕微鏡法を使用して可視化及び画像化した（Ａ）。加えて、細胞を単一細胞懸濁液へとプロセシングし、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ抗体及びＣＤ２４−ＡＰＣ抗体により染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した（Ｂ）。 腫瘍オルガノイドをＣＡＦ ＣＭ中で培養した場合に、ＣＳＣ集団は増強された。ＭＣＦ−７細胞をＦｉＳＳ^ＣＳＣ上に６日間播種して、腫瘍オルガノイドを形成させた。細胞を異なる濃度のＣＡＦ ＣＭへ曝露し、通常の培地（ＲＭ）上で増殖させた腫瘍オルガノイドを対照として使用した。６日間の終了時に、細胞をＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）により染色し、生存する腫瘍オルガノイドを蛍光顕微鏡法を使用して可視化及び画像化した（Ａ）。加えて、細胞を単一細胞懸濁液へとプロセシングし、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ抗体及びＣＤ２４−ＡＰＣ抗体により染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した（Ｂ）。ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻集団中で何倍の変化があるのかを、異なる条件についてプロットした。 ＣＳＣ集団は、ＭＤＳＣを含有するＭＣＦ−７−ＭＣＴ中で増強された。ＭＣＦ−７細胞をＦｉＳＳ^ＣＳＣ上でヒトＭＤＳＣにより６日間共培養して、ＭＣＴを形成させた。通常の培地で増殖させた単一細胞腫瘍オルガノイド（ＳＣＴ）（スキャフォールド）を、対照として使用した。６日間の終了時に、細胞をＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）により染色し、生存する腫瘍オルガノイドを蛍光顕微鏡法を使用して可視化及び画像化した（Ａ）。加えて、細胞を単一細胞懸濁液へとプロセシングし、ＣＤ４４−ＦＩＴＣ抗体及びＣＤ２４−ＡＰＣ抗体により染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した（Ｂ）。ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻集団のパーセンテージを、異なる条件についてプロットした。 ＬＬＣ１細胞及びＦｉＳＳ上で培養した腫瘍中のＣＳＣの増大。（Ａ）単層またはＦｉＳＳ上で６日間培養したＬＬＣ１細胞のＡｌｄｅｆｌｕｏｒアッセイ。ベースライン蛍光を、ジエチルアミノ−ベンズアルデヒド（ＤＥＡＢ）によるＡＬＤＨ活性の阻害によって確立した。第一世代腫瘍オルガノイドをトリプシン処理し、ＦｉＳＳ上に追加の６日間再プレーティングして、第二世代腫瘍オルガノイド、及び次いで第三世代腫瘍オルガノイドを誘導した。（Ｂ）ＡＬＤＨ＋ ＬＬＣを、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、スキャフォールドから収集した。親ＬＬＣ１またはＡＬＤＨ＋ ＬＬＣ１（選別された）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹の中へ注射し、腫瘍増殖を測定した。（Ｃ）ＬＬＣ１腫瘍（左側）中の（１０％）ｖｓ ＦＩＳＳ上での６日間の培養後（右側）中の（５５％）、フローサイトメトリーによって決定したＡＬＤＨ陽性集団。 （Ａ）Ａ５４９異種移植物（左側）中のｖｓ ＦＩＳＳ上での６日間の培養後（右側）中の、フローサイトメトリーによって決定したＣＤ４４^高ＣＤ２４^低集団。（Ｂ）選別されたＣＤ２４枯渇細胞をＮＳＧマウスの中へ皮下注射し、腫瘍増殖を６０日にわたってモニターした。腫瘍が１５０ｍｍ^３に到着した場合に、マウスを安楽死させた。 精製されたがん幹細胞の保管。Ａ５４９ ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞のＭＡＣＳエンリッチメントを、フローサイトメトリーによって分析し、エンリッチメント前（Ａ）及びエンリッチメント後（Ｂ）を示す。Ｃ）スキャフォールド上で培養したＡ５４９親細胞株（２６％のＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻）、及びＤ）ＭＡＣＳによってＣＤ２４を枯渇し、次いで凍結及び融解して単層として増殖させたＡ５４９（５５．９％のＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻）。

一態様において、本発明は、腫瘍オルガノイドを、インビトロの細胞培養における三次元スキャフォールド上で増殖させるステップと；腫瘍オルガノイドからＣＳＣを単離するステップと、を含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）を増大するための方法を提供する。

がん細胞のタイプ及び細胞培養のサイズ（例えば９６ウェル細胞培養ディッシュまたは６ウェル細胞培養プレート）に依存して、播種される細胞数は、典型的には、ウェル／ディッシュあたり５〜１０，０００細胞、より好ましくは３，０００〜６，０００細胞の間の範囲である。しかしながら、単一細胞は、腫瘍断片と同様にプレーティングされ得る。腫瘍オルガノイドは、一般的に、１０〜１０００ミクロン、より好ましくは２５〜７００ミクロン、さらにより好ましくは５０〜３００ミクロンの範囲のサイズである。

一実施形態において、前記方法は、前記腫瘍オルガノイドの細胞解離のステップをさらに含む。さらなる実施形態において、細胞解離は、タンパク質分解性活性を備えた酵素（例えばＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）またはトリプシン／ＥＤＴＡ）を含む組成物を使用して遂行される。腫瘍オルガノイドは、単一細胞、または１，０００、５００、１００、５０もしくは１０細胞未満の腫瘍オルガノイド細胞断片へと解離され得る。腫瘍オルガノイド解離は、典型的には、前記腫瘍オルガノイドから腫瘍オルガノイドがん細胞の単一細胞懸濁液を形成することを含む。前記腫瘍オルガノイドからのＣＳＣの単離は、腫瘍オルガノイドから腫瘍オルガノイドがん細胞の単一細胞懸濁液を形成することと、単一細胞懸濁液からＣＳＣを単離することと、を含む。

一実施形態において、本発明は、
ａ）三次元スキャフォールドを含むインビトロの細胞培養において、がん細胞の第１の集団を増殖させるステップと；
ｂ）前記がん細胞の第１の集団から腫瘍オルガノイドを前記スキャフォールド上で増殖させるステップと；
ｃ）前記腫瘍オルガノイドをがん細胞の第２の集団（腫瘍オルガノイドがん細胞）へと細胞解離することを含む、前記細胞培養から前記腫瘍オルガノイドを収穫するステップと；
ｄ）前記腫瘍オルガノイドからＣＳＣを単離するステップと、
を含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）を増大する方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、
ａ）三次元スキャフォールドを含むインビトロの細胞培養において、がん細胞を増殖させるステップと；
ｂ）前記がん細胞から腫瘍オルガノイドを前記スキャフォールド上で増殖させるステップと；
ｃ）前記腫瘍オルガノイドからがん細胞（腫瘍オルガノイドがん細胞）を収穫するステップと；
ｄ）前記腫瘍オルガノイドがん細胞を、三次元スキャフォールドを含む新しいインビトロの細胞培養へ移すステップと；
ｅ）前記腫瘍オルガノイドがん細胞から、腫瘍オルガノイドの後続する世代を、前記新しいインビトロの細胞培養の前記スキャフォールド上で増殖させるステップと、
を含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）を増大する方法を提供する。

一実施形態において、直前の方法のステップｃ）〜ｅ）は、少なくとも１回反復される。さらなる実施形態において、直前の方法のステップｃ）〜ｅ）は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、または少なくとも７回反復される。さらなる実施形態において、方法は、前記腫瘍オルガノイドからＣＳＣを単離するステップを含む。

一実施形態において、上記の方法におけるがん細胞の前記第１の集団は、ヒトがん細胞である。さらなる実施形態において、前記ヒトがん細胞はヒト生検からである。一実施形態において、前記ヒトがん細胞は、星細胞腫、副腎皮質癌、虫垂癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、脳幹部グリオーマ、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、子宮内膜癌、上衣腫、ユーイング肉腫、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、消化管癌、胚細胞腫瘍、神経膠腫、肝細胞癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、カポージ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、メラノーマ、中皮腫、口腔癌、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、扁平上皮細胞癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、喉頭癌、胸腺腫、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される。さらなる実施形態において、前記ヒトがん細胞は、乳癌細胞、結腸癌細胞、頭頸部癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、脳腫瘍細胞、子宮内膜癌細胞、肝臓癌細胞、皮膚癌細胞、前立腺癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、子宮癌細胞、腎臓癌細胞、及び甲状腺癌細胞からなる群から選択される。別の実施形態において、前記ヒト生検は、星細胞腫、副腎皮質癌、虫垂癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、脳幹部グリオーマ、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、子宮内膜癌、上衣腫、ユーイング肉腫、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃癌、消化管癌、胚細胞腫瘍、神経膠腫、肝細胞癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内メラノーマ、カポージ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、メラノーマ、中皮腫、口腔癌、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、下垂体癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、扁平上皮細胞癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、喉頭癌、胸腺腫、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される。さらなる実施形態において、前記ヒト生検は、乳癌生検、結腸癌生検、頭頸部癌生検、胃癌生検、肺癌生検、脳腫瘍生検、子宮内膜癌生検、肝臓癌生検、皮膚癌生検、前立腺癌生検、膵臓癌生検、卵巣癌生検、子宮癌生検、腎臓癌生検、及び甲状腺癌生検からなる群から選択されるがん生検である。

本発明のスキャフォールドは、三次元スキャフォールドであり、典型的にはランダムに配向した線維を含む。一実施形態において、スキャフォールド線維は、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物である。さらなる実施形態において、スキャフォールドは、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体のエレクトロスピンされた混合物である。ＰＬＧＡ−ｍＰＥＧ−ＰＬＡスキャフォールドをエレクトロスピンする方法は当技術分野において公知であり、例えば米国特許９６２４４７３（参照によってその全体が援用される）中で記載される。一実施形態において、スキャフォールドはコーティングされたキトサンである。

いくつかの実施形態において、各々のスキャフォールド線維中のｍＰＥＧ−ＰＬＡ対ＰＬＧＡの比は、およそ１：４である。他の実施形態において、各々のスキャフォールド線維中のｍＰＥＧ−ＰＬＡ対ＰＬＧＡの比は、およそ１：１０である。さらに他の実施形態において、各々のスキャフォールド線維中のｍＰＥＧ−ＰＬＡ対ＰＬＧＡの比は、およそ１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０もしくは１：２０、または以前の比の任意の２つの間（例えば１：２〜１：６）である。

一実施形態において、ＰＬＧＡは、およそ８５％の乳酸及び１５％のグリコール酸を含有する。ＰＬＧＡの乳酸：グリコール比が、およそ７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０もしくは９５：５、または以前の比の任意の２つの間（例えば８０：２０〜９０：１０）である実施形態も、本明細書に包含される。

ｍＰＥＧ−ＰＬＡ及びＰＬＧＡは、当業者に公知の任意の方法を経由して線維へと形成され得る。いくつかの実施形態において、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ及びＰＬＧＡの溶液はエレクトロスピンされて、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＬＧＡ線維を形成する。スキャフォールド線維は、およそ０．１〜１０ミクロン、０．１〜７ミクロン、０．３〜１０ミクロン、０．３〜６ミクロンの間の線維径、またはより好ましくはおよそ０．６９〜４．１８ミクロンの間の線維径を提供する任意の電圧、流速及び距離で、エレクトロスピンされ得る。一実施形態において、ＰＥＧ−ＰＬＡ及びＰＬＧＡの溶液は、高電圧電源を使用して、０．２ｍｌ／時間の流速及び１３ｃｍの距離で１６ｋＶの正電圧で、エレクトロスピンされる。線維は、およそ７０ｍｍの固定距離でアルミニウムで被覆された銅板の上へ収集される。本発明は、およそ６０ｍｍ〜８０ｍｍの間の固定距離でエレクトロスピンされた線維を収集することによって調製されたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＬＧＡスキャフォールドをさらに包含する。

もたらされたｍＰＥＧ−ＰＬＡ−ＰＬＧＡスキャフォールドは、孔を有する三次元線維状スキャフォールドである。いくつかの実施形態において、スキャフォールドは、直径がおよそ２０ミクロン未満である孔を含む。他の実施形態において、スキャフォールドは、直径がおよそ５０、２５、１５、１０または５ミクロン未満である孔を含む。

本発明の一実施形態において、通常の増殖培地を使用して、腫瘍オルガノイドの１つまたは複数の世代を増殖させる。本明細書において使用される時、「通常の増殖培地（または培地）」は、幹細胞を特異的に刺激するために添加される任意の外来性増殖因子補足物を含有しない培地を意味する。

一実施形態において、前記腫瘍オルガノイドは、第一世代腫瘍オルガノイド（すなわちがん細胞の源（例えば細胞株、生検であり、腫瘍オルガノイド以外のもの）から産生された腫瘍オルガノイド）である。一実施形態において、がん細胞株は、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ細胞、ＭＣＦ−１０Ａ乳癌細胞、ＰＣ３前立腺癌細胞、Ｂ１６メラノーマ細胞、ＢＧ−１卵巣細胞、及びＬＬＣルイス肺癌細胞からなる群から選択される。

第一世代腫瘍オルガノイドを腫瘍オルガノイドがん細胞へと解離し使用して、後続する、すなわち第二世代腫瘍オルガノイドを増殖させることができる。第二世代腫瘍オルガノイドは腫瘍オルガノイドがん細胞へと解離し使用して、第三世代腫瘍オルガノイドを増殖させることができる。このプロセスを繰り返して、腫瘍オルガノイドの後続する世代を産生することができる。

各々の腫瘍オルガノイド世代の終了時に、もたらされた腫瘍オルガノイドがん細胞を、プロセシング及び分析して、幹細胞マーカー（例えばＣＤ４４^＋／高及びＣＤ２４^−／低）が存在するか／存在しないかもしくは高いか／低いかどうかを決定する、及び／または非ＣＳＣからＣＳＣを単離する。これは、ルーチンの方法（フローサイトメトリーまたは磁気ビーズ等）によって行われ得る。単離された腫瘍オルガノイドＣＳＣを使用して、腫瘍オルガノイドの後続する世代を増殖させることができる。例えば、腫瘍オルガノイドＣＳＣを、１つもしくは複数の世代または各々の世代から単離し使用して、腫瘍オルガノイドの次の世代を増殖させることができる。

一実施形態において、第一世代腫瘍オルガノイドは、第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用したがん細胞に比較して、少なくとも２倍、２．５倍または３倍のＣＳＣの増加を有する。別の実施形態において、第二世代腫瘍オルガノイドは、第二世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用した第一世代腫瘍オルガノイドに比較して、少なくとも５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍のＣＳＣの増加を有する。別の実施形態において、第二世代腫瘍オルガノイドは、第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用したがん細胞に比較して、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、７５倍または８０倍のＣＳＣの増加を有する。別の実施形態において、第三世代腫瘍オルガノイドは、第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用したがん細胞に比較して、第一世代腫瘍オルガノイドに、または第二世代腫瘍オルガノイドに比較して、少なくとも５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、７５倍または８０倍のＣＳＣの増加を有する。

別の実施形態において、腫瘍オルガノイドの１つまたは複数の世代は低酸素条件において増殖されるか、または低酸素条件を模倣する条件において増殖される。さらなる実施形態において、低酸素条件は培養培地の全体にわたる。一実施形態において、スキャフォールドは低酸素条件を誘導する。さらなる実施形態において、低酸素条件はスキャフォールドに局所的である。別の実施形態において、スキャフォールドは局所的低酸素条件を誘導する。一実施形態において、増殖培地（例えば通常の増殖培地）に塩化コバルトを補足して、腫瘍オルガノイド中で低酸素を模倣する。あるいは、スキャフォールド上で増殖する腫瘍オルガノイドのために持続的低酸素条件を確実にするために、塩化コバルトはスキャフォールドマトリックスの中へ注入される。一実施形態において、ＣｏＣｌ_２は、前記乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物へ、エレクトロスピンの前に添加される。一実施形態において、ＣｏＣｌ_２は、第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用した増殖培地またはスキャフォールドマトリックスへ添加される。別の実施形態において、ＣｏＣｌ_２は、腫瘍オルガノイドの１つまたは複数の続く世代（例えば第二世代、第三世代及び／または第四世代の腫瘍オルガノイド）を増殖させるのに使用した増殖培地またはスキャフォールドマトリックスへ添加される。

さらなる実施形態において、腫瘍オルガノイド（例えば第一世代、第二世代、第三世代、第四世代の腫瘍オルガノイドなど）または腫瘍オルガノイドから単離されたＣＳＣを、原発性がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）（例えば乳癌腫瘍からのＣＡＦ）及び／またはヒト末梢血からの骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ））から収集された馴化培地（ＣＭ）中で培養し、ＣＳＣの数を増加させる。一実施形態において、ＣＡＦはヒトＣＡＦである。

別の実施形態において、腫瘍オルガノイド培養を、より小さな細胞培養フォーマットから、より大きな細胞培養フォーマット（例えば９６ウェルフォーマット組織培養ディッシュから６ウェルフォーマット組織培養ディッシュ）へ増大して、ＣＳＣ増大のための能力を維持しながら、ＣＳＣの収率を増加させる（約３０倍まで）。

一実施形態において、腫瘍オルガノイドは、ＥＣＭベースのハイドロゲルを含む培地中で培養される。別の実施形態において、スキャフォールドは、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体のエレクトロスピンされた混合物を含み、培地はＥＣＭベースのハイドロゲルを含む。さらなる実施形態において、ＥＣＭベースのハイドロゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））である。

さらなる実施形態において、継承した各々の世代が、腫瘍オルガノイドの先行する世代よりも高いパーセンテージのＣＳＣを有するか、または腫瘍オルガノイドの第一世代の事例において、腫瘍オルガノイドの第一世代を生じさせたがん細胞の初期培養よりも高いパーセンテージのＣＳＣを有する、腫瘍オルガノイドの複数の世代を増殖させるための方法を提供する。

一実施形態において、解離された第一世代腫瘍オルガノイド（例えば第一世代腫瘍オルガノイドがん細胞の単一細胞懸濁液）を培養して、腫瘍オルガノイドの第二世代を増殖させる。さらなる実施形態において、解離された第二世代腫瘍オルガノイド（例えば第二世代腫瘍オルガノイドがん細胞の単一細胞懸濁液）を培養して、腫瘍オルガノイドの第三世代を増殖させる。さらなる実施形態において、解離された第三世代腫瘍オルガノイド（例えば第三世代腫瘍オルガノイドがん細胞の単一細胞懸濁液）を培養して、腫瘍オルガノイドの第四世代を増殖させる。さらなる実施形態において、プロセスは、腫瘍オルガノイドの第五世代、第六世代、第七世代、第八世代、第九世代、第十世代、またはそれ以上の世代について反復される。一実施形態において、腫瘍オルガノイドの各々の世代からの腫瘍オルガノイドがん細胞の単一細胞懸濁液は、腫瘍オルガノイドの次の世代の増殖に使用される。各々の事例において、腫瘍オルガノイドは、本発明に記載の三次元スキャフォールドを含むインビトロの細胞培養中で増殖される。

一実施形態において、本発明の方法に従って単離された前記ＣＳＣは、第一世代腫瘍オルガノイド、第二世代腫瘍オルガノイド、第三世代腫瘍オルガノイド、第四世代腫瘍オルガノイドからのものである。他の実施形態において、本発明の方法に従って単離された前記ＣＳＣは、第五世代腫瘍オルガノイド、第六世代腫瘍オルガノイド、第七世代腫瘍オルガノイド、第八世代腫瘍オルガノイド、第九世代腫瘍オルガノイド、第十世代腫瘍オルガノイド、またはそれ以上の世代の腫瘍オルガノイドからのものである。

一実施形態において、ＣＳＣを腫瘍オルガノイドの第一世代から単離及び培養して、腫瘍オルガノイドの第二世代を増殖させる。さらなる実施形態において、ＣＳＣを腫瘍オルガノイドの第二世代から単離及び培養して、腫瘍オルガノイドの第三世代を増殖させる。さらなる実施形態において、ＣＳＣを腫瘍オルガノイドの第三世代から単離及び培養して、腫瘍オルガノイドの第四世代を増殖させる。一実施形態において、腫瘍オルガノイドの各々の世代から単離されたＣＳＣを使用して、腫瘍オルガノイドのすぐ次の後続する世代を増殖させる。

一実施形態において、腫瘍オルガノイドの最後の世代が収穫される。さらなる実施形態において、ＣＳＣは腫瘍オルガノイドの最後の世代から単離される。さらなる実施形態において、腫瘍オルガノイドの最後の世代から単離されたＣＳＣは、ａ）インビトロの培養においてこの集団を増大するように増殖されるか；ｂ）インビトロの細胞アッセイ（例えば抗がん薬化合物等の薬物化合物をスクリーニングするアッセイ）において使用されるか；ｃ）保管される（例えば凍結される）か；またはｄ）インビボの動物モデル（例えば腫瘍モデルまたは腫瘍異種移植モデル）において使用される。一実施形態において、動物は、齧歯動物、例えばマウス（ＮＯＤ−ＥＧＦＰマウス）またはラットである。さらなる実施形態において、マウスはＮＯＤ−ＥＧＦＰマウスである。

別の実施形態において、培養は１つまたは複数の鉄キレーターを含む。さらなる実施形態において、スキャフォールドは、１つまたは複数の鉄キレーターをさらに含む。さらなる実施形態において、前記１つまたは複数の鉄キレーターは、前記乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物へ、エレクトロスピンの前に添加される。

別の実施形態において、前記培養または前記スキャフォールドは、フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）腫瘍抑制遺伝子をノックダウンするｓｉＲＮＡを含む。

別の実施形態において、前記培養、スキャフォールド、またはがん細胞は、増殖因子をコードする異種ＤＮＡを含む。別の実施形態において、前記培養または前記スキャフォールドは、ＴＧＦ−βを含む。

一実施形態において、すべての方法ステップは、インビトロで実行される。別の実施形態において、方法は、１つまたは複数のインビボのステップを含む。一実施形態において、がん細胞を非ヒト宿主動物（例えばマウスまたはラット等の齧歯動物）の中へ注射して、腫瘍を形成させる（例えば腫瘍異種移植）。一実施形態において、宿主動物はＮＯＤ−ＥＧＦＰマウスである。一実施形態において、非ヒト宿主動物の中へ注射されるがん細胞は、ＥＣＭベースのハイドロゲルと共に注射される。さらなる実施形態において、前記ＥＣＭベースのハイドロゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））である。

一実施形態において、腫瘍は宿主動物から取り出される。腫瘍を腫瘍細胞の懸濁物または腫瘍断片へと解離し、インビトロでスキャフォールド上で培養して、本発明の方法に従って腫瘍オルガノイドを増殖させる。さらなる実施形態において、ＣＳＣは腫瘍オルガノイドから単離される。別の実施形態において、腫瘍オルガノイドまたは腫瘍オルガノイドがん細胞から単離されたＣＳＣを、スキャフォールド上で培養し増殖させて、腫瘍オルガノイドの後続する世代を産生する。さらなる実施形態において、ＣＳＣは、腫瘍がん細胞／腫瘍異種移植がん細胞から単離される。さらなる実施形態において、腫瘍がん細胞／腫瘍異種移植がん細胞から単離されたＣＳＣを、インビトロのスキャフォールド上で培養して、本発明に記載の腫瘍オルガノイドを増殖させる。一実施形態において、宿主動物の中へ注射されるがん細胞は、本発明の腫瘍オルガノイド細胞、腫瘍（例えばヒト腫瘍）からの細胞、またはがん細胞株である。さらなる実施形態において、宿主動物の中へ注射される腫瘍オルガノイド細胞は、第一世代腫瘍オルガノイド細胞、第二世代腫瘍オルガノイド細胞、または第三世代腫瘍オルガノイド細胞である。さらなる実施形態において、宿主動物の中へ注射される腫瘍オルガノイド細胞は、腫瘍オルガノイドから単離されたＣＳＣである。

別の態様において、本発明は、薬物化合物（例えば抗がん化合物）をスクリーニングする方法に関する。一実施形態において、方法は、ａ）本発明の腫瘍オルガノイドを培養することと；ｂ）薬物化合物と腫瘍オルガノイドを接触させることと；ｃ）腫瘍オルガノイドに対する薬物化合物の効果を測定することとを含む。別の実施形態において、方法は、ａ）本発明の腫瘍オルガノイドがん細胞を培養することと；ｂ）薬物化合物と腫瘍オルガノイドがん細胞を接触させること；ｃ）腫瘍オルガノイドがん細胞に対する薬物化合物の効果を測定することとを含む。別の実施形態において、方法は、ａ）本発明の単離されたＣＳＣを培養することと；ｂ）薬物化合物と単離されたＣＳＣを接触させることと；ｃ）単離されたＣＳＣに対する薬物化合物の効果を測定することと、を含む。

一実施形態において、方法は、ＩＣ_５０、ＧＩ_５０、ＥＤ_５０またはＬＤ_５０を測定することを含む。ＩＣ_５０は、所望される活性の５０％の阻害をもたらす薬物濃度である。ＧＩ_５０は、細胞分裂増殖の最大阻害の５０％についての濃度である。ＧＩ_５０は、好ましくは細胞静止性（細胞毒性の対語として）薬剤について使用される。ＥＤ_５０（またはＥＣ_５０）は、対象となる任意の測定された生物学的効果（細胞毒性を包含する）についての最大効果の５０％をもたらす有効用量（または有効濃度）である。５０％致死用量（ＬＤ_５０）は、５０％の細胞死をもたらす濃度である。

本発明は、例えばＦｉＳＳ（商標）プラットフォームを使用してがん幹細胞数を増大することに部分的に関し、それにより、ＭＣＦ７乳癌細胞株を使用して一例としてＣＳＣ数の数倍の増幅が示された。表１はこれらの所見を要約する。

複数の変数がＣＳＣ増大に影響したことを、これらの結果は示した。累積的に、合計で８０倍を超える増大は、一例としてＦｉＳＳ（商標）プラットフォーム上でＭＣＦがん幹細胞を増殖させることによって達成された。さらに、ＦｉＳＳ（商標）上で培養した生検細胞異種移植物（Ａ５４９（肺癌）等）は、ＭＣＦ７細胞株がＦｉＳＳ（商標）スキャフォールド上でＣＳＣの増大を誘導したよりも高い、第一世代におけるＣＳＣの増大を示した。

複数の因子が、スキャフォールド（ＦｉＳＳ（商標）等）上のＣＳＣ増大における役割を果たす。これらとしては、物理的な修飾、生理的因子、生化学的な因子、及び生物学的因子が挙げられ、これらは、器官型ＦｉＳＳ（商標）腫瘍オルガノイドにおいてＣＳＣ数の促進を示した。物理的条件に関して、ＦｉＳＳ（商標）スキャフォールド材料、及びＣＳＣの増幅にも供することができる他のスキャフォールド材料に対する多くの変動がある。同様に、生理的ニッチの中で、本発明の結果は、低酸素条件が幹細胞性を増進し得ることを示した。したがって、本発明者がスキャフォールドの中へＣｏＣｌ_２を導入することによって示したように、低酸素条件を誘導するスキャフォールドは有益である。増殖因子をコードするＤＮＡを備えたスキャフォールドはさらに幹細胞増幅能力を増加させ得る。低酸素を生成する他の手法としては鉄キレーターを添加することが挙げられ、刺激は鉄タンパク質酸素センサーに対する効果を介して相互作用し得ることが指摘される。さらに、フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）腫瘍抑制遺伝子のノックダウン（スキャフォールドへのｓｉＲＮＡの連結によって等）は、ＨＩＦ １ａ及び低酸素様調節を増加させ得る。

さらに、腫瘍オルガノイドを培養するための細胞培養培地への他の因子の添加は、ＣＳＣの増幅を生ずることができる。したがって、がん関連線維芽細胞の培養または骨髄由来抑制細胞の培養からの馴化培地は、ＣＳＣ増大を促進することができる。同様に、患者腫瘍からの腫瘍浸潤物もＣＳＣ数を促進し得る。少量（約１〜約３％）のＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）添加は、ＣＳＣ数を増加させ得る。さらに、増殖因子（ＴＧＦ-β及び／またはＳＤＦ１等）の添加は最大約５倍まで幹細胞増幅を増加させることが見出された。同様に、他の増殖因子もＣＳＣ増大を増幅することに有益であり得る。

本発明は、例えばＦｉＳＳ（商標）（線維に励起されたスマートスキャフォールド）プラットフォームを使用して、がん幹細胞（ＣＳＣ）の集団を増加させる方法を記載する。一実施形態において、通常の増殖培地を使用して第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドを増殖させ、第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドから第二世代腫瘍オルガノイドを増殖させるプロトコールを開発した。各々の世代の終了時で、もたらされた腫瘍オルガノイドをプロセシングし、細胞をフローサイトメトリーによって幹細胞マーカー（例えばＣＤ４４^高及びＣＤ２４^低）について分析した。結果から、第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドはＣＳＣの約３倍の増加を与えたことが示された。

本発明の実施形態は、例えば重合体ナノファイバースキャフォールド（線維に励起されたスマートスキャフォールド（ＦｉＳＳ（商標））プラットフォーム等、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体のエレクトロスピンされた混合物を含む細胞培養のためのスキャフォールド）を使用して、がん幹細胞（ＣＳＣ）を増大する方法のシリーズを包含し、そのスキャフォールド上のがん細胞の培養は、本明細書において「腫瘍オルガノイド」と称される、腫瘍様の構造の形成をもたらす。より具体的には、「腫瘍オルガノイド」は、形態学的、生理学的及び生化学的に腫瘍に似ている、３Ｄ重合体スキャフォールド上で、他の間質細胞有りまたは無しで培養したがん細胞のコンパクトな凝集物である。本発明者は、ビメンチンのアップレギュレーション及びＥ−カドヘリンのダウンレギュレーションによって観察されるように、かかるスキャフォールド上で増殖する腫瘍オルガノイドがＥＭＴのマーカーを示すことを見出した。ＥＭＴマーカーの増加は、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞の集団の増加をもたらした。ＣＳＣ集団の増加がアルデヒド脱水素酵素活性の増加と相関することも確認された。本発明の実施形態は、がん細胞からがん幹細胞（ＣＳＣ）を増幅するための方法を提供する。本発明のさらなる実施形態は、ヒトがん細胞からヒトがん幹細胞（ＣＳＣ）を増幅するための方法を提供する。

通常の培地中で増殖させたＭＣＦ−７単一細胞腫瘍オルガノイドで、第一世代におけるＣＳＣの数は増加した。通常の増殖培地中でＭＣＦ−７細胞を増殖させた。細胞を、９６ウェル細胞培養プレート中のスキャフォールド上にプレーティングした。新鮮培地を播種後２日目に添加し、播種後６日目に腫瘍オルガノイドを可視化した。健康に見える腫瘍オルガノイドの存在を確認した後に、ａｃｃｕｔａｓｅ：クエン酸塩溶液を使用して、それらをスキャフォールドから剥がし、単一細胞懸濁液のためにプロセシングした。次いで単一細胞懸濁液を生存率についてカウントし、ヒト抗ＣＤ４４−ＡＰＣ−ｃｙ７抗体及び抗ＣＤ２４−ＡＰＣ抗体により染色した。ＤＡＰＩを使用して単一細胞の集団内の生細胞を弁別し、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団を決定した。ＭＣＦ−７細胞は、通常の増殖培地を使用して、ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で６日後に、良く発達した第一世代ＳＣＴを形成した。重要なことには、単層ＭＣＦ−７細胞中のＣＳＣ集団のパーセンテージにかかわらず、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団の増加によって決定されるように、第一世代腫瘍オルガノイドはそれらのＣＳＣ集団の約３倍の増加を一貫して示した。

第二世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドは、通常の培地中でＣＳＣがさらに増大した。以前に記載されるように、最初に、第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させた。次いで第一世代腫瘍オルガノイドを単一細胞懸濁液のためにプロセシングし、９６ウェル細胞培養プレート中のスキャフォールド上にプレーティングした。新鮮培地を播種後２日目に添加し、播種後６日目に第二世代腫瘍オルガノイドを可視化した。健康に見える腫瘍オルガノイドを確認した後に、それらを剥がし、単一細胞懸濁液をヒト抗ＣＤ４４−ＡＰＣ−ｃｙ７抗体及び抗ＣＤ２４−ＡＰＣ抗体により染色した。フローサイトメトリーを使用してＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団を決定するために、非ＤＡＰＩ染色生細胞を使用した。第一世代腫瘍オルガノイドはＣＳＣの約３倍の増加を与え、それは第二世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイド中で約１０倍まで指数関数的に増加した。

低酸素条件下で増殖させたＭＣＦ−ＳＣＴ内のＣＳＣの特徴を評価した。低酸素がＣＳＣの維持のために要求されることが示唆されたので、塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）（既知の低酸素の誘導因子）を使用して、本発明の３Ｄモデルにおいてこのことを試験した。このために、５０μＭの塩化コバルトを補足した通常の増殖培地中でＭＣＦ−７細胞をプレーティングした。以前のように、腫瘍オルガノイドを播種後６日目に可視化し、次いでヒト抗ＣＤ４４−ＡＰＣ−ｃｙ７抗体及び抗ＣＤ２４−ＡＰＣ抗体を使用して、フローサイトメトリーのためにプロセシングした。ＤＡＰＩを使用して単一細胞の集団内の生細胞を弁別し、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団を決定した。結果から、塩化コバルトの添加が、第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイド中のＣＳＣのパーセンテージを著しく変化させなかったことが示された。このＣＳＣの増幅の欠如は、細胞培養の継続期間を通して低酸素条件を維持するように塩化コバルトを外部から添加できないことに起因し得る。塩化コバルトの頻繁な補充が、低酸素の持続を確実にするのに必要であろう。

塩化コバルトを含有するスキャフォールド上で増殖させた、第一世代ＭＣＦ−７−ＳＣＴ中のＣＳＣの特徴を評価した。本発明者の初期の実験が、第一世代腫瘍オルガノイド中のＣＳＣを著しく増加させるために塩化コバルトを外部から添加するできないことを示したので、スキャフォールドのマトリックス内に塩化コバルトを取り込んだ。本発明者の仮定は、スキャフォールド内に包埋された塩化コバルトが、実験の継続期間を通しての低酸素の細胞培養環境の維持を支援するであろうということであった。この目的のために、１００μＭの塩化コバルトをポリマーの混合物と混合し、もたらされたエレクトロスピンされたスキャフォールドを使用して、ＭＣＦ−７−ＳＣＴの増殖に対する効果を試験した。塩化コバルト含有するスキャフォールド上に通常の増殖培地中のＭＣＦ−７細胞をプレーティングした。以前のように、腫瘍オルガノイドを播種後６日目及びフローサイトメトリーの遂行の前に可視化し、最初にスキャフォールド内の塩化コバルトが低酸素条件を維持する能力を決定した。ＭＣＦ−７ ＳＣＴ中の低酸素領域を、低酸素についての蛍光発生性プローブ（それは、低酸素細胞中に存在するニトロ還元酵素活性を利用することによって、ヒドロキシルアミン（ＮＨＯＨ）及びアミノ（ＮＨ_２）へニトロ基を変換し、蛍光プローブを放出する）を使用して検出した。６日間の培養後に、通常のスキャフォールドではなく塩化コバルトスキャフォールド上で増殖させたＭＣＦ−７ ＳＣＴのみが、蛍光を示し、塩化コバルト含有するスキャフォールドが低酸素を維持する能力を実証した。次いでヒト抗ＣＤ４４−ＡＰＣ−ｃｙ７抗体及び抗ＣＤ２４−ＡＰＣ抗体を使用して、フローサイトメトリーのために細胞をプロセシングした。ＤＡＰＩを使用して単一細胞の集団内の生細胞を弁別し、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団を決定した。ＭＣＦ−７ ＳＣＴはＣＳＣ集団の増加を示し、それは通常のスキャフォールド上で増殖させた第一世代ＭＣＦ−７ ＳＣＴにおいて観察されたものよりもわずかに高かった。

ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻ＭＣＦ−７細胞集団の増加は、幹細胞性を調節することが公知の転写因子のアップレギュレーションと相関していた。本発明者は、第一世代及び第二世代を介して連続して培養した場合に、ＣＳＣ集団（ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞として定義された）は腫瘍オルガノイド中で漸進的に増加したことを以前に示した。幹細胞性の複数のマーカーが報告されているので、ＦｉＳＳ^ＣＳＣプラットフォームが、使用されるマーカーに依存してＣＳＣの増加を示すかどうかを確認しようとした。転写因子のファミリーのＯｃｔ-４、Ｓｏｘ−２、及びＮａｎｏｇ（いわゆるＹａｍａｎａｋａ転写因子の一部）を検討した。Ｏｃｔ-４、Ｓｏｘ−２、及びＮａｎｏｇは、ＣＳＣの多分化能及び自己更新の特徴の維持において重要な役割を果たす３つの転写因子である。以前に記載されるように、ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドを６日間培養し、その後、それらを収穫し、２つの群へと分割した。１群にＲＮＡ抽出を行い、第２の群をＦｉＳＳ^ＣＳＣ上でさらに培養して第二世代腫瘍オルガノイドを形成させた。６日間の終了時に、第二世代腫瘍オルガノイドを収穫し、ＲＮＡ抽出を行った。単層及び第二世代腫瘍オルガノイドから抽出されたＲＮＡをプロセシングし、Ｏｃｔ-４及びＳｏｘ−２、及びＮａｎｏｇについてのプローブを使用してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。結果から、第二世代におけるＯｃｔ−４、Ｓｏｘ-２、及びＮａｎｏｇの発現は、単層細胞に対して、統計的に有意に増加したことが示された。単層細胞に比べて、Ｓｏｘ−２は比較的緩やかな増加を示したが、Ｏｃｔ-４、及びＮａｎｏｇは転写物の３〜４倍の増加を示した。このことは、ＣＳＣ増加（ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻集団中の増加によって実証されるように）は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、及びＮａｎｏｇの遺伝子発現の増加と相関したことを実証した。

腫瘍オルガノイドを６ウェルＦｉＳＳ^ＣＳＣフォーマット中で培養した場合に、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻ＭＣＦ−７細胞集団の増加が維持された。本発明の実施形態は、ＣＳＣの収率の増加のために有用である。６ウェルＦｉＳＳ^ＣＳＣプレート上での腫瘍オルガノイドの増殖のための条件の特徴を評価した。このスケールアップは、９６ウェルプレートに対して、細胞播種の約３０倍の増加、及び実験の終了時のプロセシングされたＣＳＣの当然の増加を導いた。したがって、例えば６ウェルプレート中で播種した細胞数を増加させた培養で、すべての試験された細胞の数は、６日目の終了時に良好に形成された腫瘍オルガノイドを与えることが見出された。ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団を検討した場合に、ＣＳＣ数の増加が見出された。細胞の生存率は９６ウェルフォーマットにおいて得られたものに匹敵した。

ＭＣＦ−７細胞のＣＡＦ ＣＭへの曝露は、ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で培養した腫瘍オルガノイド中のＣＳＣの集団を増加させた。ＣＳＣ維持には、腫瘍微小環境内に存在する細胞性及び非細胞性の構成要素からの安定した合図が要求されることが報告されていた。この現象内で、役割を有することが示されたものとしてはＣＡＦが挙げられる。ＣＡＦからの分泌因子がＣＳＣの集団を増大できるかどうかを査定するために、乳癌患者からＣＡＦを収集及び培養した。具体的には、ＣＡＦを約８０％コンフルエンスまで培養し、次いでそれらを増殖培地中で４８時間インキュベーションし、その終了時に培地を収集し、遠心分離し、使用するまで−８０℃で保管した。使用の前に、培地を氷上で融解し、試験のために適切な希釈物をＭＣＦ−７増殖培地中で作製した。試験されたすべてのパーセンテージのＣＡＦ ＣＭは、ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上での腫瘍オルガノイドの形成を支援した。重要なことには、１０％及び２５％のＣＡＦ ＣＭは、通常の増殖培地により観察されたよりもＣＳＣ集団をより増加させた。このことから、ＣＡＦ ＣＭ内に存在する分泌因子が、ＦｉＳＳ^ＣＳＣプラットフォームにより培養したＭＣＦ−７腫瘍オルガノイド中のＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻ＣＳＣの集団を増加させることが確認された。

ＭＤＳＣとの共培養中で増殖させた、ＭＣＦ−７多細胞性腫瘍オルガノイド（ＭＣＴ）中のＣＳＣの特徴を評価した。細胞−細胞相互作用（特にがん細胞とＭＤＳＣのような免疫細胞との間の）は、ＣＳＣの誘導及び維持をインビボで促進することが示されている。共培養の効果を試験するために、正常で健康な全血液を獲得し、それを単核細胞についてプロセシングした。次いで単核細胞をＨｅＬａ細胞と共に培養して、単核細胞のＭＤＳＣへの分化を支援した。６日間の培養後に、ＣＤ３３^＋細胞を単離し、フローサイトメトリーを使用してＭＤＳＣ細胞表面マーカーについての特徴を評価した。

３名の異なる個体から単離されたＭＤＳＣを、スキャフォールド上でＭＣＦ−７細胞と共培養した。共培養は、ＭＣＦ−ＳＣＴによるよりも、わずかに大きいサイズの不規則な腫瘍オルガノイドを形成し、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻の幹細胞様の集団は、ＭＣＦ−ＳＣＴに対してわずかな増加を示した。

ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で増殖させた、Ａ５４９肺癌に由来する異種移植物中のＣＳＣの特徴を評価した。次にインビボの腫瘍から稀なＣＳＣ集団を単離及び増大する可能性を検討した。異種移植物を確立するために、Ａ５４９細胞をＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）と混合し、メスＮＯＤ−ＥＧＦＰマウスの脇腹の中へ皮下注射し、腫瘍増殖をモニターした。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫（ラミニン（主要な構成要素）、コラーゲンＩＶ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲン等のＥＣＭタンパク質及びいくつかの増殖因子に富む腫瘍）から抽出された、専売の可溶化基底膜調製物である。腫瘍を切除し、これらの腫瘍の単一細胞懸濁液をＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で７日間培養した。ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻集団（幹様細胞を示す）の５〜９倍の増加が、Ａ５４９異種移植物に対して、ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で培養したＡ５４９異種移植物細胞に由来する腫瘍オルガノイドにおいて見出された。さらに、ＮＳＧマウス中でのＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞の注射は、インビボで腫瘍を開始することができ、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞が本当にＡ５４９中でＣＳＣ様細胞を示すことを示唆した。

Ａ５４９異種移植物あたり、及び１つの６ウェルフォーマットＦｉＳＳ^ＣＳＣプレート上で培養後に、約１０^６細胞を得た。ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻を発現する細胞を約５０％までエンリッチした。したがって、約２０のＡ５４９異種移植物から約１０^７のＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞を収集することは可能である。類似するストラテジーを使用して、異なる細胞タイプ（ヒト細胞が挙げられる）により増殖させた他の異種移植物からＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻ＣＳＣ様細胞を単離することができる。

要約すると、本発明は、例えばＦｉＳＳ（商標）（線維に励起されたスマートスキャフォールド）プラットフォームを使用して、がん幹細胞（ＣＳＣ）の集団を増加させる方法を記載する。実際は、本発明は、スキャフォールド（線維に励起されたスマートスキャフォールド（ＦｉＳＳ^ＣＳＣ））を使用する、がん幹細胞（ＣＳＣ）の大スケールのエンリッチメントのためのプロトコールを記載する。本発明者は、異なる細胞培養条件（低酸素条件下で細胞を増殖すること、腫瘍間質細胞からの馴化培地（ＣＭ）を使用すること、がん細胞を間質細胞と共培養すること、及び外来性可溶性因子を使用すること等）を使用した。

本発明者は、ＭＣＦ−７乳癌細胞がＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で腫瘍オルガノイドを形成したことを示した。これらの腫瘍オルガノイドは、単層として増殖させた細胞に対して、約３〜５倍多いＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻の幹様細胞を保有した。さらに、腫瘍オルガノイド中のＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻幹様細中の増加は、Ｓｏｘ−２、Ｏｃｔ−４、及びＮａｎｏｇ（それらは細胞において幹細胞性を付与することが公知である）の発現の増加と相関した。腫瘍オルガノイドを、塩化コバルトを注入して低酸素を模倣したスキャフォールド上で増殖させた場合に、ＭＣＦ−７ ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻幹様細胞集団は著しく増加しなかった。ヒト免疫細胞（特にＭＤＳＣ）と共培養した場合に、ＭＣＦ−７細胞は腫瘍オルガノイドを形成した。ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻幹様集団は、ＭＣＦ−７細胞の単一細胞の腫瘍オルガノイドによるものに匹敵した。ヒトがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）からのＣＭに曝露された場合に、ＭＣＦ−７細胞は腫瘍オルガノイドを形成した。

例えば９６ウェルフォーマットから例えば６ウェルフォーマットへ腫瘍オルガノイド形成のためにプロトコールをスケールアップした。これは、９６ウェルフォーマットにおいて観察される集団のようにＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻幹細胞の何倍もの増加を維持しながら、細胞数インプットの約３０倍の増加をもたらした。第一世代腫瘍オルガノイドを収穫し、それらを再播種して、第二世代腫瘍オルガノイド及び第三世代腫瘍オルガノイドを形成する。各々の継承される世代内で、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻幹細胞様集団の増加が見出された。マイクロビーズを使用し、ＣＤ４４^＋細胞をプロセシングし、それらを冷凍した。さらに、融解に際して、これらの細胞がスキャフォールド上で腫瘍オルガノイドへと増殖し、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞の集団を維持したことが実証された。

実施例１。通常の培地中で増殖させたＭＣＦ−７単一細胞腫瘍オルガノイドで、第一世代におけるＣＳＣの数は増加した
最初に、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１×ペニシリンストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ−１６４０からなる通常の増殖培地中で、ＭＣＦ−７細胞をプレーティングした。細胞を、９６ウェル細胞培養プレート中で１スキャフォールドあたり約７，０００細胞でプレーティングした。新鮮培地を播種後２日目に添加し、播種後６日目にＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）色素を使用して腫瘍オルガノイドを可視化した。健康に見える腫瘍オルガノイドの存在を確認した後に、ａｃｃｕｔａｓｅ：クエン酸塩溶液（１：１）を使用して、それらをスキャフォールドから剥がし、単一細胞懸濁液のためにプロセシングした。次いで単一細胞懸濁液を生存率についてカウントし、ヒト抗ＣＤ４４−ＡＰＣ−ｃｙ７及び抗ＣＤ２４−ＡＰＣにより染色した。ＤＡＰＩを使用して単一細胞の集団内の生細胞を弁別し、フローサイトメトリーを使用して生存細胞からＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団を決定した。図１Ａ及び１Ｂ中で参照されるように、ＭＣＦ−７細胞は、通常の増殖培地を使用して、ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で６日後に、良く発達した第一世代ＳＣＴを形成した。重要なことには、単層ＭＣＦ−７細胞中のＣＳＣ集団のパーセンテージにかかわらず、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団の増加によって決定されるように、第一世代腫瘍オルガノイドはそれらのＣＳＣ集団の約３倍の増加を一貫して示した。

実施例２。第二世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドは、通常の培地中でＣＳＣがさらに増大した
以前に記載されるように、最初に、第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させた。次いで第一世代腫瘍オルガノイドを単一細胞懸濁液のためにプロセシングし、９６ウェル細胞培養プレート中のスキャフォールドあたり約８，０００細胞でプレーティングした。新鮮培地を播種後２日目に添加し、播種後６日目にＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）色素を使用して第二世代腫瘍オルガノイドを可視化した。健康に見える腫瘍オルガノイドを確認した後に、それらを剥がし、単一細胞懸濁液をヒト抗ＣＤ４４−ＡＰＣ−ｃｙ７及び抗ＣＤ２４−ＡＰＣにより染色した。フローサイトメトリーを使用してＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団を決定するために、非ＤＡＰＩ染色生細胞を使用した。したがって、第一世代腫瘍オルガノイドはＣＳＣの約３倍の増加を与え、それは第二世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイド中で約１０倍まで指数関数的に増加した（図２）。

実施例３。低酸素条件中で増殖させたＭＣＦ−ＳＣＴ中のＣＳＣの特徴評価
低酸素がＣＳＣの維持のために要求されるように思われるので、塩化コバルト（既知の低酸素の誘導因子）を使用して、本発明の３Ｄモデルにおいてこのことを試験することが所望された。このために、５０μＭの塩化コバルトを補足した通常の増殖培地中でＭＣＦ−７細胞をプレーティングした。以前のように、腫瘍オルガノイドを播種後６日目に可視化し、次いでヒト抗ＣＤ４４−ＡＰＣ−ｃｙ７及び抗ＣＤ２４−ＡＰＣを使用して、フローサイトメトリーのためにプロセシングした。ＤＡＰＩを使用して単一細胞の集団内の生細胞を弁別し、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団を決定した。結果から、塩化コバルトの添加が、第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイド中のＣＳＣのパーセンテージを変化させなかったことが示された（図３）。このＣＳＣの増幅の欠如は、細胞培養の継続期間を通して低酸素条件を維持するように塩化コバルトを外部から添加できないことに起因し得る。塩化コバルトの頻繁な補充が、低酸素の持続を確実にするのに必要であろう。

実施例４。塩化コバルトを含有するスキャフォールド上で増殖させた、第一世代ＭＣＦ−７−ＳＣＴ中のＣＳＣの特徴評価
本発明者の初期の実験が、第一世代腫瘍オルガノイド中のＣＳＣを増加させるために、塩化コバルトを外部から添加するできないことを示したので、スキャフォールドのマトリックス内に塩化コバルトを取り込むことにした。本発明者の仮定は、スキャフォールド内に包埋された塩化コバルトが、実験の継続期間を通しての低酸素の細胞培養環境の維持を支援するであろうということであった。この目的のために、１００μＭの塩化コバルトを専売のポリマーの混合物と混合し、もたらされたエレクトロスピンされたスキャフォールドを使用して、ＭＣＦ−７−ＳＣＴの増殖に対する効果を試験した。塩化コバルト含有するスキャフォールド上に通常の増殖培地中のＭＣＦ−７細胞をプレーティングした。以前のように、腫瘍オルガノイドを播種後６日目及びフローサイトメトリーの遂行の前にＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）を使用して可視化し、最初にスキャフォールド内の塩化コバルトが低酸素条件を維持する能力を決定した。ＭＣＦ−７ ＳＣＴ中の低酸素領域を、低酸素（赤色）についての蛍光発生性プローブ（それは、低酸素細胞中に存在するニトロ還元酵素活性を利用することによって、ヒドロキシルアミン（ＮＨＯＨ）及びアミノ（ＮＨ_２）へニトロ基を変換し、蛍光プローブを放出する）を使用して検出した。６日間の培養後に、通常のスキャフォールドではなく塩化コバルトスキャフォールド上で増殖させたＭＣＦ−７ ＳＣＴのみが、赤色蛍光を示し、塩化コバルト含有するスキャフォールドが低酸素を維持する能力を実証した。次いでヒト抗ＣＤ４４−ＡＰＣ−ｃｙ７及び抗ＣＤ２４−ＡＰＣを使用して、フローサイトメトリーのために細胞をプロセシングした。ＤＡＰＩを使用して単一細胞の集団内の生細胞を弁別し、フローサイトメトリーを使用してＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団を決定した。ＭＣＦ−７ ＳＣＴはＣＳＣ集団の増加を示し、それは通常のスキャフォールド上で増殖させた第一世代ＭＣＦ−７ ＳＣＴにおいて観察されたものよりもわずかに高かった（図３）。

実施例５。ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻ＭＣＦ−７細胞集団の増加は、幹細胞性を調節することが公知の転写因子のアップレギュレーションと相関していた
本発明者は、第一世代及び第二世代を介して連続して培養した場合に、ＣＳＣ集団（ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞として定義された）は腫瘍オルガノイド中で漸進的に増加したことを以前に示した。幹細胞性の複数のマーカーが報告されているので、ＦｉＳＳ^ＣＳＣプラットフォームが、使用されるマーカーに依存してＣＳＣの増加を示すかどうかを確認しようとした。転写因子のファミリーのＯｃｔ-４、Ｓｏｘ−２、及びＮａｎｏｇ（それらはいわゆるＹａｍａｎａｋａ転写因子の一部）を検討した。Ｏｃｔ-４、Ｓｏｘ−２、及びＮａｎｏｇは、ＣＳＣの多分化能及び自己更新の特徴の維持において重要な役割を果たす３つの基本的な転写因子である。以前に記載されるように、ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドを６日間培養し、その後、それらを収穫し、２つの群へと分割した。１群にトリゾール試薬を使用するＲＮＡ抽出を行い、第２の群をＦｉＳＳ^ＣＳＣ上でさらに培養して第二世代腫瘍オルガノイドを形成させた。６日間の終了時に、第二世代腫瘍オルガノイドを収穫し、ＲＮＡ抽出を行った。単層及び第二世代腫瘍オルガノイドから抽出されたＲＮＡをプロセシングし、Ｏｃｔ-４及びＳｏｘ−２、及びＮａｎｏｇについてのプローブを使用してｑＲＴ−ＰＣＲを行った。ＨＰＲＴをハウスキーピング遺伝子として使用して、遺伝子発現を正規化した。結果から、単層と比較した場合に、第二世代におけるＯｃｔ−４、Ｓｏｘ-２、及びＮａｎｏｇの発現の統計的に有意な増加が示されたことが示された（図５）。単層細胞に比べて、Ｓｏｘ−２は比較的緩やかな増加を示したが、Ｏｃｔ-４、及びＮａｎｏｇは転写物の３〜４倍の増加を示した。このことは、ＣＳＣ増加（ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻集団中の増加によって実証されるように）は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、及びＮａｎｏｇの遺伝子発現の増加に相関したことを実証した。

実施例６。腫瘍オルガノイドを６ウェルＦｉＳＳ^ＣＳＣフォーマット中で培養した場合に、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻ＭＣＦ−７細胞集団の増加が維持された
本発明の実施形態は、ＣＳＣの収率の増加のために有用である。６ウェルＦｉＳＳ^ＣＳＣプレート上での腫瘍オルガノイドの増殖のための条件の特徴を評価した。このスケールアップは、９６ウェルプレートに対して、細胞播種の約３０倍の増加、及び実験の終了時のプロセシングされたＣＳＣの当然の増加を導いた。したがって、例えば６ウェルプレート中で播種した細胞数を増加させた培養で、すべての試験された細胞の数は、６日目の終了時に良好に形成された腫瘍オルガノイドを与えることが見出された（図６Ａ）。ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団を検討した場合に、ＣＳＣ数の増加が見出されたが、これは実験間でわずかに変動した。具体的には、６ウェルフォーマットでは、９６ウェルフォーマットに対して、高い数のＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞を与える細胞密度があることが見出された。この細胞数は、６ウェルプレート中でウェルあたり約２４０，０００〜約２７０，０００細胞の間であった（図６Ｂ）。この範囲よりも低いかまたは高い細胞の数は、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞集団の減少をもたらした。細胞の生存率は、９６ウェルフォーマットにおいて得られたものに匹敵した（約８０％）。したがって、本発明の一実施形態において、約２４０，０００細胞／６ウェルをＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で腫瘍オルガノイドの増殖のために使用した。

実施例７。ＭＣＦ−７細胞のＣＡＦ ＣＭへの曝露は、ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で培養した腫瘍オルガノイド中のＣＳＣの集団を増加させた
ＣＳＣ維持が腫瘍微小環境内で存在する細胞性及び非細胞性の構成要素からの安定した合図を要求することが報告された。この現象内で、役割を有することが示されたものとしてはＣＡＦが挙げられる。ＣＡＦからの分泌因子がＣＳＣの集団を増大できるかどうかを査定するために、乳癌患者からＣＡＦを収集及び培養した。具体的には、ＣＡＦを約８０％コンフルエンスまで培養し、次いでそれらを増殖培地中で４８時間インキュベーションし、その終了時に培地を収集し、遠心分離し、使用するまで−８０℃で保管した。使用の前に、培地を氷上で融解し、試験のために適切な希釈物をＭＣＦ−７増殖培地中で作製した。

図７Ａ中で示されるように、試験されたすべてのパーセンテージのＣＡＦ ＣＭは、ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上での腫瘍オルガノイドの形成を支援した。重要なことには、１０％及び２５％のＣＡＦ ＣＭは、通常の増殖培地により観察されたよりもＣＳＣ集団をより増加させた（図７Ｂ）。このことから、ＣＡＦ ＣＭ内に存在する分泌因子が、ＦｉＳＳ^ＣＳＣプラットフォームにより培養したＭＣＦ−７腫瘍オルガノイド中のＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻ＣＳＣの集団を増加させることが確認された。

実施例８。ＭＤＳＣとの共培養中で増殖させた、ＭＣＦ−７多細胞性腫瘍オルガノイド（ＭＣＴ）中のＣＳＣの特徴評価
細胞−細胞相互作用（特にがん細胞とＭＤＳＣのような免疫細胞との間の）は、ＣＳＣの誘導及び維持をインビボで促進することが示されている。共培養の効果を試験するために、正常で健康な全血液を獲得し、それを単核細胞についてプロセシングした。次いで単核細胞をＨｅＬａ細胞と共に培養して（１：１００の比）、単核細胞のＭＤＳＣへの分化を支援した。６日間の培養後に、ＣＤ３３^＋細胞を単離し、フローサイトメトリーを使用してＭＤＳＣ細胞表面マーカーについての特徴を評価した。

３名の異なる個体から単離されたＭＤＳＣを、スキャフォールド上でＭＣＦ−７細胞と共培養した（図８Ａ）。共培養は、ＭＣＦ−ＳＣＴによるよりも、わずかに大きいサイズの不規則な腫瘍オルガノイドを形成し、ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻の幹細胞様の集団は、ＭＣＦ−ＳＣＴに対してわずかな増加を示した（図８Ｂ）。しかしながら、使用される３名のドナーＭＤＳＣの間で何倍誘導するかにおける変動も観察された。

実施例９。ＦｉＳＳはがん幹細胞増大を誘導する
単層細胞（０．３％）に比較して、ＦｉＳＳプラットフォーム上でのＬＬＣ１の培養が少なくとも３０倍のＣＳＣ活性（アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）活性に基づいて同定された）の増加を誘導することが見出された（図９Ａ）。これらの腫瘍オルガノイドはＡＬＤＨ−Ｈｉ集団を示し、単層上で増殖させた細胞に比較して、ＣＳＣ様集団を提示する。選別されたＡＬＤＨ陽性集団は、選別されないＬＬＣ１腫瘍オルガノイドよりもＣ５７ＢＬ／６マウス中で良好な腫瘍増殖を開始することができ（図９Ｂ）、ＡＬＤＨ陽性集団がＣＳＣ様細胞を保持することを示唆する。加えて、ＦｉＳＳ上でこれらの腫瘍オルガノイドを継承して継代することは、第三世代におけるＡＬＤＨ陽性細胞を８７．５％へエンリッチし、大多数の幹細胞性遺伝子は増大させた集団中で保存された。インビボの腫瘍から稀なＣＳＣ集団を単離及び増大する可能性を検討するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中にインプラントしたＬＬＣ１腫瘍を切除した。ＬＬＣ１腫瘍の単一細胞懸濁液をＦｉＳＳ上で６日間培養した場合に、ＡＬＤＨ陽性集団の１０倍の増大が見出された（図９Ｃ）。

実施例１０。ＦｉＳＳ^ＣＳＣ上で増殖させた、Ａ５４９肺癌に由来する異種移植物中のＣＳＣの特徴評価
次にインビボの腫瘍から稀なＣＳＣ集団を単離及び増大する可能性を検討した。インビボの腫瘍から稀なＣＳＣ集団を単離及び増大する可能性を検討するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス中にインプラントしたＬＬＣ１腫瘍を切除した。ＬＬＣ１腫瘍の単一細胞懸濁液をＦｉＳＳ上で６日間培養した場合に、ＡＬＤＨ陽性集団の１０倍の増大が見出された。同様に、Ａ５４９異種移植物をＮＳＧマウス中にインプラントし、これらの腫瘍の単一細胞懸濁液を６日間ＦｉＳＳ上で培養した。ＣＤ４４＋ＣＤ２４−集団（幹様細胞を示す）の５〜９倍の増加が、Ａ５４９異種移植物（６．８４％）に比較して、ＦｉＳＳ上で培養したＡ５４９異種移植物細胞に由来する腫瘍オルガノイド（５０．９％）中で見出された（図１０Ａ）。さらに、ＮＳＧマウス中での少なくとも１，０００のＣＤ４４＋ＣＤ２４−集団の注射は、インビボで腫瘍を開始することができ、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−細胞が本当にＡ５４９中でＣＳＣ様細胞を示すことを示唆した。したがって、２０，０００のＣＤ４４＋ＣＤ２４−細胞のみの注射は、３×１０^６細胞の一次注射に比較して、同じサイズの腫瘍を誘導したという証拠は、本発明者が開発したＣＳＣ増大プロトコールが腫瘍開始細胞をエンリッチすることを指摘する（図１０Ｂ）。

Ａ５４９異種移植物あたり、及び１つの６ウェルフォーマットＦｉＳＳ^ＣＳＣプレート上で培養後に、約１０^６細胞を得た。ＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻を発現する細胞を約５０％までエンリッチした。したがって、ｖ２０のＡ５４９異種移植物から約１０^７のＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻細胞を収集することは可能である。類似するストラテジーを使用して、他の異種移植物からＣＤ４４^＋ＣＤ２４⁻ＣＳＣ様細胞を単離することができる。

実施例１１。精製されたがん幹細胞の保管
増大させたＣＳＣを適切に保管きるかどうかを検討するために、マイクロビーズを使用し、ＣＤ４４^＋細胞をプロセシングし、次いで一例としてＣｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地中でこれらの細胞を冷凍した。エンリッチメントの前に、単層培養した細胞中で、細胞の約１９％はＣＤ４４^＋であったが、スキャフォールド上で増殖された細胞の約２６％はＣＤ４４^＋であった。さらに、腫瘍オルガノイド細胞の涸渇後に、約６７％はＣＤ４４^＋細胞であった。細胞を冷凍及び融解した後に、細胞の約５５％はＣＤ４４^＋であった（図１１）。

本発明の実施形態は、少なくとも以下のものを含む。本発明の一実施形態において、通常の増殖培地を使用して第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドを増殖させ、第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドから第二世代腫瘍オルガノイドを増殖させた。各々の世代の終了時で、もたらされた腫瘍オルガノイドをプロセシングし、細胞をフローサイトメトリーによって幹細胞マーカー（例えばＣＤ４４^高及びＣＤ２４^低）について分析した。結果から、第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドはＣＳＣの約３倍の増加を与えたことが示された。

別の実施形態において、通常の増殖培地に塩化コバルを補足して使用して、第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドにおいて低酸素を模倣した。あるいは、塩化コバルトをスキャフォールドマトリックスの中へ注入して、スキャフォールド上で増殖する第一世代ＭＣＦ−７腫瘍オルガノイドのための低酸素条件の持続を確実にした。この増加は、第二世代腫瘍オルガノイドにおいて、さらに増強され、そこで、ＣＳＣの約１０倍の増加が観察された。塩化コバルトの補足はＣＳＣ増幅に対してほとんど効果がなかったが、塩化コバルト注入スキャフォールド上での第一世代腫瘍オルガノイドの増殖は、通常のスキャフォールド上で増殖させた腫瘍オルガノイドと比較して、ＣＳＣ増加に向かう傾向を示す、より大きな第一世代腫瘍オルガノイドを与えた。

さらなる実施形態において、ＣＳＣ集団は、原発性がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）及びヒト末梢血からの骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）から収集された馴化培地（ＣＭ）中での腫瘍オルガノイドの培養によってさらに増加した。

別の実施形態において、腫瘍オルガノイド培養条件を、９６ウェルフォーマット組織培養ディッシュから、６ウェルフォーマット組織培養ディッシュへ増大して、ＣＳＣ増大のための能力を維持しながら、ＣＳＣの収率を増加させた（約３０倍まで）。

さらに別の実施形態において、ＣＳＣの長期間保管及び生存率の試験及び機能的特性を検討し、その結果から、幹細胞の増大及び保管の実現可能性が実証された。

本発明の他の実施形態は、少なくとも以下のものを含む。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビトロの方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記腫瘍オルガノイドが、原発性ヒトがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）から収集された馴化培地（ＣＭ）を含む培地中で培養される、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビトロの方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記腫瘍オルガノイドが、ヒト末梢血からの原発性骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）から収集された馴化培地（ＣＭ）を含む培地中で培養される、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビトロの方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記スキャフォールドが、線維に励起されたスマートスキャフォールド（ＦｉＳＳ（商標））である、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビトロの方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記スキャフォールドが、ＥＣＭベースのハイドロゲルをさらに含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビトロの方法。一実施形態において、ＥＣＭベースのハイドロゲルは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫（ラミニン（主要な構成要素）、コラーゲンＩＶ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ニドゲン等のＥＣＭタンパク質及び増殖因子に富む腫瘍）から抽出された、可溶化基底膜調製物（例えばＣｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ及びＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによるＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、またはＴｒｅｖｉｇｅｎ Ｉｎｃ．によるＣＵＬＴＲＥＸ（登録商標）基底膜抽出物（ＢＭＥ））である。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記ＣＳＣが、第一世代腫瘍オルガノイドから収穫される、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビトロの方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記ＣＳＣが、第一世代腫瘍オルガノイドから増殖させた第二世代腫瘍オルガノイドから収穫される、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビトロの方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記ＣＳＣが、第一世代腫瘍オルガノイドから増殖させた第二世代腫瘍オルガノイドから増殖させた、第三世代腫瘍オルガノイドから収穫される、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビトロの方法。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含み、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の前記混合物のエレクトロスピンによって調製される、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含み、さらに塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）を含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含み、線維に励起されたスマートスキャフォールド（ＦｉＳＳ（商標））である、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含み、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をさらに含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含み、低酸素培養条件を誘導する、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含み、塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）をさらに含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含み、１つまたは複数の鉄のキレーターをさらに含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含み、フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）腫瘍抑制遺伝子をノックダウンするｓｉＲＮＡをさらに含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含み、増殖因子をコードするＤＮＡをさらに含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物を含み、ＴＧＦ−βをさらに含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのスキャフォールド。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビボの方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記宿主動物がマウスである、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビボの方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記宿主動物がＮＯＤ−ＥＧＦＰマウスである、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビボの方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記がん細胞がヒトがん細胞である、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビボの方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記がん細胞がＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）と共に注射される、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のためのインビボの方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含む、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記スキャフォールドが線維に励起されたスマートスキャフォールド（ＦｉＳＳ（商標））である、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記スキャフォールドが、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物のエレクトロスピンによって調製される、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記スキャフォールドが塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）をさらに含む、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記腫瘍オルガノイドが、原発性ヒトがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）から収集された馴化培地（ＣＭ）を含む培地中で培養される、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記腫瘍オルガノイドがＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を含む培地中で培養される、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記ＣＳＣが第一世代腫瘍オルガノイドから収穫される、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記ＣＳＣが、第一世代腫瘍オルガノイドから増殖させた第二世代腫瘍オルガノイドから収穫される、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記ＣＳＣが、第一世代腫瘍オルガノイドから増殖させた第二世代腫瘍オルガノイドから増殖させた、第三世代腫瘍オルガノイドから収穫される、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記スキャフォールドが低酸素培養条件を誘導する、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記スキャフォールドが、１つまたは複数の鉄のキレーターをさらに含む、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記スキャフォールドが、フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）腫瘍抑制遺伝子をノックダウンするｓｉＲＮＡをさらに含む、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記スキャフォールドが、増殖因子をコードするＤＮＡをさらに含む、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

スキャフォールド上で腫瘍オルガノイドを増殖させることと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記スキャフォールドがＴＧＦ−βをさらに含む、インビトロのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含む、インビボのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記がん細胞が哺乳動物から得られる、インビボのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記がん細胞が哺乳動物から得られ、前記哺乳動物ががんの実験動物モデルである、インビボのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記がん細胞が哺乳動物から得られ、前記哺乳動物がヒトがんの実験動物モデルである、インビボのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記がん細胞がヒト生検からである、インビボのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記がん細胞がヒト腫瘍細胞である、インビボのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

がん細胞の注射によって宿主動物中で異種移植物を増殖させることと、回収された異種移植物から細胞を分離することと、スキャフォールド上でそれらを増殖させて腫瘍オルガノイドを形成することと、培養物からＣＳＣを分離することと、を含み、前記がん細胞がＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）と共に注射される、インビボのがん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。

特別の指示のない限り、明細書及び請求項中で使用される成分の量、特性（分子量等）、反応条件などを表現するすべての数は、「約」という用語によって、すべての実例で修飾されていると理解すべきである。したがって、相反する指示がない限り、以下の明細書及び添付の請求項中で説明された数値パラメータは、本発明により得ることが求められる所望される特性に依存して変動し得る近似値である。最低限でも、そして請求項の範囲への均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各々の数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の桁数を考慮して及び通常の丸め技法の適用によって解釈されるべきである。

本発明は好ましい実施形態に関して特に示され記載されたが、形態及び詳細における様々な変化が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、その中で行われ得ることは当業者によって理解されるだろう。

すべての文書、公報、マニュアル、論文、特許、要約、参照文献、及び本明細書において引用される他の材料は、参照によってそれらの全体が援用される。本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮及び本明細書において開示される本発明の実践から当業者に明らかとなるだろう。明細書及び実施例は例示的なものとして考慮され、本発明の真の範囲及び趣旨は請求項によって示されることが意図される。

Claims (48)

1. ａ）腫瘍オルガノイドを、インビトロの細胞培養における三次元スキャフォールド上で増殖させることと；
   ｂ）前記腫瘍オルガノイドからＣＳＣを単離することと、
   を含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）を増大する方法。
2. ａ）三次元スキャフォールドを含むインビトロの細胞培養において、がん細胞を増殖させることと；
   ｂ）前記がん細胞から腫瘍オルガノイドを前記スキャフォールド上で増殖させることと；
   ｃ）前記腫瘍オルガノイドからがん細胞（腫瘍オルガノイドがん細胞）を収穫することと；
   ｄ）前記腫瘍オルガノイドがん細胞を、三次元スキャフォールドを含む新しいインビトロの細胞培養へ移すことと；
   ｅ）前記腫瘍オルガノイドがん細胞から、腫瘍オルガノイドの後続する世代を、前記新しいインビトロの細胞培養の前記スキャフォールド上で増殖させることと、
   を含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）を増大する方法。
3. ステップｃ）〜ｅ）が少なくとも１回反復される、請求項２に記載の方法。
4. 前記ステップｃ）〜ｅ）が、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、または少なくとも７回反復される、請求項２に記載の方法。
5. 前記腫瘍オルガノイドからＣＳＣを単離することを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記方法が、前記腫瘍オルガノイドを単一細胞、または１，０００、５００、１００、５０もしくは１０細胞未満の腫瘍オルガノイド細胞断片に解離することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記方法が、前記腫瘍オルガノイドから腫瘍オルガノイドがん細胞の単一細胞懸濁液を形成することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記の前記腫瘍オルガノイドからＣＳＣを単離することが、前記腫瘍オルガノイドから腫瘍オルガノイドがん細胞の単一細胞懸濁液を形成することと；前記腫瘍オルガノイドがん細胞の前記単一細胞懸濁液からＣＳＣを単離することと、を含む、請求項１または５〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記方法が、ヒトがん細胞から腫瘍オルガノイドを増殖させることを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ヒトがん細胞がヒト生検からである、請求項９に記載の方法。
11. 前記スキャフォールドが、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体のエレクトロスピンされた混合物を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記腫瘍オルガノイドが、前記細胞培養の全体にわたってまたは前記スキャフォールドに局所的に、低酸素条件または低酸素条件を模倣する条件において増殖される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記細胞培養またはスキャフォールドが、塩化コバルト（ＣｏＣｌ_２）をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＣｏＣｌ_２が、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物へ、エレクトロスピンの前に添加される、請求項１３に記載の方法。
15. 前記腫瘍オルガノイドが、原発性ヒトがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）及び／またはヒト末梢血からの骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）から収集された馴化培地（ＣＭ）を含む培地を中で培養される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記腫瘍オルガノイドが、ＥＣＭベースのハイドロゲルを含む培地を中で培養される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ＥＣＭベースのハイドロゲルが、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された可溶化基底膜調製物（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記腫瘍オルガノイドの第一世代が、前記第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用したがん細胞に比較して、少なくとも２倍、２．５倍または３倍のＣＳＣの増加を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記方法が腫瘍オルガノイドの第二世代を増殖させることを含み、前記腫瘍オルガノイドの第二世代が、前記第二世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用した前記第一世代腫瘍オルガノイドがん細胞に、または前記第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用した前記がん細胞に比較して、少なくとも５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍のＣＳＣの増加を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記第二世代腫瘍オルガノイドが、前記第二世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用した前記第一世代腫瘍オルガノイドがん細胞に比較して、少なくとも１０倍のＣＳＣの増加を有する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第二世代腫瘍オルガノイドが、第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用したがん細胞に比較して、少なくとも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、７５倍または８０倍のＣＳＣの増加を有する、請求項２０に記載の方法。
22. 前記第二世代腫瘍オルガノイドが、前記第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用した前記がん細胞に比較して、少なくとも８０倍のＣＳＣの増加を有する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記方法が腫瘍オルガノイドの第三世代を増殖させることを含み、腫瘍オルガノイドの前記第三世代が、前記第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用した前記がん細胞、前記第一世代腫瘍オルガノイド、または前記第二世代腫瘍オルガノイドに比較して、少なくとも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、７５倍または８０倍のＣＳＣの増加を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記方法が腫瘍オルガノイドの第三世代を増殖させることを含み、腫瘍オルガノイドの前記第三世代が、前記第一世代腫瘍オルガノイドを増殖させるのに使用した前記がん細胞に比較して、少なくとも１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、７５倍または８０倍のＣＳＣの増加を有する、請求項１９に記載の方法。
25. 前記ＣＳＣが、第一世代腫瘍オルガノイド、第二世代腫瘍オルガノイド、第三世代腫瘍オルガノイド、または第四世代腫瘍オルガノイド、第五世代腫瘍オルガノイド、第六世代腫瘍オルガノイド、第七世代腫瘍オルガノイド、第八世代腫瘍オルガノイド、第九世代腫瘍オルガノイドまたは第十世代腫瘍オルガノイドから収穫される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記腫瘍オルガノイドから単離された前記ＣＳＣを使用して腫瘍オルガノイドの次世代を増殖させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
27. 第一世代腫瘍オルガノイドから単離された前記ＣＳＣを使用して第二世代腫瘍オルガノイドを増殖させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
28. 第二世代腫瘍オルガノイドから単離された前記ＣＳＣを使用して第三世代腫瘍オルガノイドを増殖させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
29. 第一世代腫瘍オルガノイドから単離された前記ＣＳＣを使用して第二世代腫瘍オルガノイドを増殖させ、前記第二世代腫瘍オルガノイドから単離されたＣＳＣを使用して第三世代腫瘍オルガノイドを増殖させる、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記培養またはスキャフォールドが１つまたは複数の鉄のキレーターをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記１つまたは複数の鉄キレーターが、前記乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）及びモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のブロック共重合体の混合物へ、エレクトロスピンの前に添加される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記培養またはスキャフォールドが、フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）腫瘍抑制遺伝子をノックダウンするｓｉＲＮＡをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記がん細胞が増殖因子をコードする異種ＤＮＡを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記培養またはスキャフォールドがＴＧＦ−βをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
35. ａ）非ヒト宿主動物の中へがん細胞を注射して腫瘍を形成することと；
    ｂ）前記宿主動物から前記腫瘍を取り出すことと；
    ｃ）腫瘍細胞及び／または腫瘍断片の懸濁物へと前記腫瘍を解離することと；
    ｄ）インビトロの細胞培養における三次元スキャフォールド上で前記懸濁物を増殖させて、腫瘍オルガノイドを形成することと、
    を含む、がん幹細胞（ＣＳＣ）増大のための方法。
36. 前記方法が、
    ａ）非ヒト宿主動物の中へがん細胞を注射して腫瘍を形成することと；
    ｂ）前記宿主動物から前記腫瘍を取り出すことと；
    ｃ）腫瘍細胞または腫瘍断片の懸濁物へと前記腫瘍を解離することと；
    ｄ）インビトロの細胞培養における三次元スキャフォールド上で前記懸濁物を増殖させて、腫瘍オルガノイドを形成することと、
    を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記腫瘍が腫瘍異種移植物である、請求項３５または３６に記載の方法。
38. 前記がん細胞が哺乳動物から得られる、請求項３５または３６に記載の方法。
39. 前記がん細胞がヒト生検からである、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記がん細胞がヒト腫瘍細胞である、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記がん細胞がＥＣＭベースのハイドロゲルと共に共注射される、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
42. ステップｄ）において増殖させた前記腫瘍オルガノイドが、第一世代腫瘍オルガノイド、第二世代腫瘍オルガノイド、第三世代腫瘍オルガノイド、または第四世代腫瘍オルガノイドである、請求項３５または３６に記載の方法。
43. 前記腫瘍オルガノイドが第一世代腫瘍オルガノイドである、請求項４２に記載の方法。
44. 前記腫瘍オルガノイドが通常の培地中で培養される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
45. ａ）請求項１〜４４のいずれか一項に記載の前記腫瘍オルガノイドを培養することと；ｂ）前記腫瘍オルガノイドを抗がん薬化合物と接触させることと；ｃ）前記腫瘍オルガノイドに対する前記薬物化合物の効果を測定することと、を含む、抗がん薬化合物をスクリーニングする方法。
46. ａ）請求項１〜４４のいずれか一項に記載の前記腫瘍オルガノイドがん細胞を培養することと；ｂ）前記腫瘍オルガノイドがん細胞を抗がん薬化合物と接触させることと；ｃ）前記腫瘍オルガノイドがん細胞に対する前記薬物化合物の効果を測定することと、を含む、抗がん薬化合物をスクリーニングする方法。
47. ａ）請求項１〜４４のいずれか一項に記載の前記単離されたＣＳＣを培養することと；ｂ）前記単離されたＣＳＣを抗がん薬化合物と接触させることと；ｃ）前記単離されたＣＳＣに対する前記薬物化合物の効果を測定することと、を含む、抗がん薬化合物をスクリーニングする方法。
48. 前記方法が、前記薬物化合物のＩＣ_５０、ＧＩ_５０、ＥＤ_５０またはＬＤ_５０を測定することを含む、請求項４５、４６または４７のいずれか一項に記載の方法。