JP5774496B2 - 癌組織由来細胞塊または癌細胞凝集塊の培養方法、評価方法および保存方法 - Google Patents
癌組織由来細胞塊または癌細胞凝集塊の培養方法、評価方法および保存方法 Download PDFInfo
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Description
(ヒト大腸癌マウス移植腫瘍からの癌組織由来細胞塊の調製)
ヒト大腸癌マウス移植腫瘍を、以下のように異種移植法にて作製した。
(ヒト大腸癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製)
大腸癌手術検体を用いた以外は、実施例1と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図7に示す通り、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
(ヒト卵巣癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製)
卵巣癌手術検体を用いた以外は、実施例2と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図7に示す通り、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
(ヒトすい臓癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製)
すい臓癌手術検体を用いた以外は、実施例2と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図7に示す通り、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
(ヒト小細胞癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製)
肺癌の一種である小細胞癌手術検体を用いた以外は、実施例2と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図7に示す通り、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
(ヒト腎癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製)
腎癌手術検体を用いた以外は、実施例2と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図7に示す通り、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
(ヒト膀胱癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製)
膀胱癌手術検体を用いた以外は、実施例2と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図7に示す通り、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
(ヒト乳癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製)
乳癌手術検体を用いた以外は、実施例2と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図7に示す通り、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
(ヒト前立腺癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製)
前立腺癌手術検体を用いた以外は、実施例2と同様にして組織由来細胞塊を取得した。培養培地に、10-8モル/L濃度のジヒドロテストステロン(DHT)を添加し、実施例1と同様に培養した。この結果、図7に示す通り、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
(ヒト咽頭癌手術検体からの癌組織由来細胞塊の調製)
咽頭癌手術検体を用いた以外は、実施例2と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、図7に示す通り、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた。
(乳癌由来癌組織由来細胞塊のホルモン感受性試験)
実施例8と同じ培地条件で、エストラジオールの有無で、複数の患者から得られた乳癌組織由来細胞塊の状態がどのように異なるかを調べた。その結果、図8に示す通り、 エストラジオールの添加で増殖が促進する症例と、エストラジオールに反応しない症例とがあることがわかった。由来する患者のホルモン療法を行う際の感受性試験として応用できることがわかった。
(マウス膵島腫瘍からの癌組織由来細胞塊の調製)
RipTagはラットインスリンプロモーターの支配下にSV40-T antigenを強制発現させたトランスジェニックマウスで、膵島に腫瘍が発生する。RipTagマウスの膵島腫瘍を用いた以外は、実施例2と同様にして癌組織由来細胞塊を取得した。この結果、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌組織由来細胞塊が得られた(図9)。
実施例2で得られ、図7に示す培養中の癌組織由来細胞塊を培養後24時間で、培地と共に5ml取り出し、1000rpm、4℃にて遠心分離し、上清を捨てた。回収した癌組織由来細胞塊をセルバンカー(BLC-1、三菱化学メディスン社製)に懸濁し、さらに、10μMのY27632(和光純薬工業社製)を加え、冷凍保存チューブ(Cryogenic vials 2.0 ml、Nalge Nunc社製)に移して、−80℃ディープフリーザーで保存した。
(癌組織由来細胞塊からの癌細胞凝集塊の調製)
実施例2と同様の方法で得られた癌組織由来細胞塊を、用いて以下の処理を行った。まず、24 ウェルプレート(未処理のディッシュ)中央にコラーゲンゲル(Cell Matrix type I-A : 5x DMEM : ゲル再構成用緩衝液 = 7 : 2 : 1) 50μL / wellを敷いた。37℃、30分静置してコラーゲンゲルを固化した。浮遊培養の癌組織由来細胞塊を(ウエルあたり100個)、1.5 mLチューブに回収する。これを5秒程度遠心分離し、上清を除去した。癌組織由来細胞塊を、コラゲナーゼゲル(ウエルあたり30μL)で懸濁し、予め固化したゲルの上に30μLずつ乗せた。37℃、30分静置して固化させ、 StemPro(EGF 50 ng/mL) 600μL /ウェルずつ入れた。2〜3日に一度培地を交換しながら、10日間培養した。
次に、培地を、1 mL / wellのDMEM(Gibco; 11965-092、コラゲナーゼIV 200 mg/mL含む)に交換し、37℃、5時間程度培養した。
培養後、1.5 mLエッペンチューブに移し、遠心分離(約5秒)し、上清を除去して、1 mLのPBSを加えて懸濁し、遠心分離(チビタン、約5秒)後上清除去を2回繰り返した。Trypsin / EDTA (0.05%)を1 mL加えて懸濁し、37℃で8分静置した。数回懸濁して、癌組織由来細胞塊様の大きな塊がなくなったことを確認した。これを、15 mLチューブに移し、2 mLのDMEM(Gibco; 11965-092)を加えて懸濁した。
次に、懸濁液を、遠心分離(1000 rpm、5分)し、上清を除去した。2 mL のStemPro(EGF 50 ng/mL、Y-27632 10μM)で懸濁し、φ35mm non-treated dish (Iwaki: 1000-035)に移した。これを、37℃で一晩培養した。
12時間経過後、直径40μm程度の癌組織由来細胞塊形成を確認した。培地をStemPro(EGF 50 ng/mL)に交換した。
(ヒト大腸癌手術検体からの癌細胞凝集塊の調製)
大腸癌手術検体を用いた以外は、実施例14と同様にして癌細胞凝集塊を取得した。この結果、図12に示す通り、少なくとも12時間後には図1と同様のほぼ球形状の癌細胞凝集塊が得られた。
実施例2と同様の方法で得られた癌組織由来細胞塊の細胞保存を行った。癌組織由来細胞塊を実施例14と同様の方法で、トリプシン処理して単一細胞化処理を行った。凍結保存液はセルバンカー1(十慈フィールド)にY-27632を添加したものを用いた。
ヒト大腸癌手術検体を用いて、文献記載の方法(Todaro Mら(2007)Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell 1:389-402)に従い単細胞にまで処理した試料を調製した。しかしながら、単細胞処理して選別したCD133陽性細胞は、インビトロでの増殖が見出せなかった。
実施例1で得られた癌組織由来細胞塊を温度37℃、5%CO2インキュベーターの培養条件下で、STEMPROヒトES細胞用無血清培地(Gibco)1ccで3日間培養を行った。これをホルマリン固定後パラフィン包埋し、薄切して抗ラミニン抗体染色(シグマ−アルドリッチ社製、マウスラミニン由来ラビット抗体)を、製造元の指示書に従って行ったところ、癌組織由来細胞塊の外周および、外周に近い細胞の細胞質内にラミニンの抗原性が観察された。これによって、本発明の癌組織由来細胞塊は、癌細胞の集合体の周辺をラミニンが取り囲んでいることが判明した。一方、手術検体処理後24時間ではラミニンの発現は確認できなかった。
ピモニダゾールを用いた低酸素の検知の例
ニトロイミダゾール系化合物ピモニダゾールは酸素非存在下では蛋白や核酸とAdductを形成する特性を持つ。低酸素下でピモニダゾール処理された組織の低酸素領域は、ピモニダゾールを特異的に認識する抗体を用いて認識することができる。癌組織では血管から約100マイクロメーター離れると低酸素領域が出現するが、実施例1で得られた癌組織由来細胞塊でも外縁より約100マイクロメーターを境にして内部は低酸素領域で、広範な細胞死が観察された。
インビトロにおける癌組織由来細胞塊の増殖能は、以下のようにして検証した。実施例1で得られた癌組織由来細胞塊をコラーゲンゲル(CellMatrix typeIA(Nitta Gelatin):5x DMEM (Gibco;12100-038):ゲル再構成用緩衝液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES)=7:2:1)に×10個ずつ包埋し、温度37℃、5%CO2インキュベーターの培養条件下で、STEMPROヒトES細胞用無血清培地(Gibco)1ccで培養を行った。定期的に細胞の状態を観察し、CCDカメラを装着した位相差顕微鏡(倍率40倍)で大きさを測定した。その結果、図3に示すように、機械的分割なしに、少なくとも13日間増殖能を保持することができた。さらに、13日目に機械的分割を行ったところ、さらに少なくとも13日間増殖能を保持していることが確認された。なお、機械的分割は、直径500マイクロメーターの癌組織由来細胞塊を眼科尖刀で4分割することで行った。
実施例1と同様の方法で、100から250μmの癌組織由来細胞塊をトリプシン0. 25%、EDTA2.6mMで3分間処理し、約30回ピペッティングで機械的に分解した。これを96ウェル培養プレート1ウェルに1個の割合で細胞が入るように希釈して分注した。単細胞化されていない細胞塊については構成する細胞数をカウントして記録した。その後培養(同上の条件)をおこない、各ウェルの細胞数の増加を記録し、30日間培養観察をおこなった。その結果、3個の細胞があれば、細胞塊にまで成長できるものもあることが確認された。
DNA合成に必要な代謝過程であるチミジル酸合成酵素と結合しDNA合成を阻害することが知られている5−FUを用いて、実施例2の試料による薬剤感受性試験を行った。試験は、癌組織由来細胞塊をコラーゲンゲル(CellMatrix typeIA(Nitta Gelatin):5x DMEM (Gibco;12100-038):ゲル再構成用緩衝液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES)=7:2:1)に×10個ずつ包埋し、温度37℃、5%CO2インキュベーターの培養条件下で、STEMPROヒトES細胞用無血清培地(Gibco)1ccで培養を行った。さらに5−FUを0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/mlの濃度で適用し、それぞれ培養0日目(上)と8日目(下)の状態を比較評価した。その結果を、図4に示す(左から右へ、濃度の低い方より高い方へ)。癌組織由来細胞塊の面積に関する増大率について、薬剤非適用培養での面積に関する増大率を1として相対的に表記した。図4において、5−FUの濃度依存的に、培養8日目における癌細胞増殖が抑制されており、本発明の癌組織由来細胞塊が、薬剤感受性試験で有用であることが実際に証明された。
実施例2で得られた本発明の3日間培養した直径約100マイクロメーターの癌組織由来細胞塊 ×10個をMatrigel(BD社)に懸濁して、NOD−SCIDマウスの背部皮下に投与移植した。腫瘍形成の評価は、経時的に腫瘍のサイズを計測することにより行なった。その結果、本発明の実施例2の癌組織由来細胞塊を移植したマウス個体には顕著な腫瘍形成が認められ、本発明の癌組織由来細胞塊が高い腫瘍形成能を有することが確認された。この組織を解析すると、マウスに移植して形成された腫瘍と、生体内に存在していた腫瘍とで類似した組織型が得られていることがわかった(図5)。
実施例2で得られた本発明の使用した直径約100マイクロメーターの癌組織由来細胞塊をコラーゲンゲル(CellMatrix typeIA(Nitta Gelatin):5x DMEM (Gibco;12100-038):ゲル再構成用緩衝液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES)=7:2:1)に包埋し、温度37℃、5%CO2インキュベーターの培養条件下で、STEMPROヒトES細胞用無血清培地(Gibco)1ccに×10個ずつ接種し、培養を行った。これにコバルトの放射性同位体を線源とするγ線を照射して、塊の状況を確認した。その結果を、図6に示す。図6において、照射線量依依存的に、培養8日目までにおける癌細胞増殖が抑制されており、本発明の癌組織由来細胞塊が、放射線照射試験で有用であることが実際に証明された。
腫瘍細胞のDNAの塩基対間に挿入し、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、トポイソメラーゼII反応を阻害し、DNA、RNA双方の生合成を抑制することによって抗腫瘍効果を発揮することが知られているドキソルビシンを用いて、実施例12の試料による薬剤感受性試験を行った。試験は、癌細胞凝集塊をコラーゲンゲル(CellMatrix typeIA(Nitta Gelatin):5x DMEM (Gibco;12100-038):ゲル再構成用緩衝液(50mM NaOH, 260mM NaHCO3, 200mM HEPES)=7:2:1)に×10個ずつ包埋し、温度37℃、5%CO2インキュベーターの培養条件下で、STEMPROヒトES細胞用無血清培地(Gibco)1ccで培養を行った。さらにドキソルビシンを0.1μM、1μM、10μMの濃度で適用し、それぞれ培養0日目と 日目の状態を比較評価した。その結果を、図14に示す。癌細胞凝集塊の面積に関する増大率について、薬剤非適用培養での面積に関する増大率を1として相対的に表記した。図14において、ドキソルビシンの濃度依存的に、培養8日目における癌細胞増殖が抑制されており、本発明の癌細胞凝集塊が、薬剤感受性試験で有用であることが実際に証明された。
実施例1および実施例2と同様に調製した培養2日目の癌組織由来細胞塊(それぞれサンプル1およびサンプル2)を、約100個、DNeasy Blood and Tissue (Quagen)を用いてDNA抽出し、1/100量をPCR法にて増幅した。これを鋳型として、直接シークエンス法で常法に従い、配列決定した。その結果、図15に示すように、サンプル1において、KRASの12位のグリシンがバリンに置換されていること、サンプル2において、BRRAFの593位のアスパラギン酸がグリシンに置換されていることがわかった。これらのサンプルの患者においては、セツキシマブが効かないことが予想される。
実施例2および実施例4と同様に調製した癌組織由来細胞塊を24時間、StemProを用いて浮遊状態で、37℃5%CO2、通常酸素濃度下で培養した場合と、マルチガスインキュベーション(ASTEC)で37℃5%CO2、1%の低酸素下で培養した場合を比較した。全mRNA抽出後、RT−PCR法にて、VEGF遺伝子の発現を検出した。この結果、図16に示すように、本発明の癌組織由来細胞塊では、低酸素条件下で、VEGF遺伝子の発現が認められ、生体内の状態をより正確に反映し、それによって、ベバシズマブの適用可能性が確認できた。
Claims (21)
- 生体から摘出した癌組織の細片化物をコラゲナーゼを含む酵素で処理する工程;
該酵素処理物から、サイズを分ける方法を用いて、直径、長径、または体積平均粒子径20μm以上500μm以下であって、3個以上の癌細胞を含む塊を選別回収する工程;および
該回収された塊を無血清の基礎培地に血清代替物を添加して得られる培地で少なくとも3時間培養し、略球形または楕円球形の培養物を得る工程を含む、癌組織由来細胞塊の培養方法。 - 前記酵素が、C. histolyticum neutral protease、thermolysinおよびdispaseからなる群より選択される1種以上のプロテアーゼ;およびコラゲナーゼI、コラゲナーゼII、およびコラゲナーゼIVからなる群より選択される1種以上のコラゲナーゼを含む混合酵素である請求項1記載の癌組織由来細胞塊の培養方法。
- さらに、前記略球形または楕円球形の培養物を機械的に分割する工程を含む、請求項1または2記載の癌組織由来細胞塊の培養方法。
- さらに、ホルモンを培地中に添加して培養する、請求項1から3までのいずれか1項記載の癌組織由来細胞塊の培養方法。
- 前記癌組織由来細胞塊が、乳癌、子宮癌、および前立腺癌からなる群より選択される1つの癌由来であり、前記ホルモンが、エストロゲン、プロジェステロン、およびテストステロンからなる群より選択される少なくとも1つのホルモンである、請求項4記載の培養方法。
- 生体から摘出した癌組織の細片化物をコラゲナーゼを含む酵素で処理する工程;
該酵素処理物から、サイズを分ける方法を用いて、直径、長径、または体積平均粒子径20μm以上500μm以下であって、3個以上の癌細胞を含む塊を選別回収する工程;
該回収された塊を少なくとも3時間、ホルモンの存在下または不存在下において培養する工程;および
培養後の培養物の状態を、ホルモンの有無により比較する工程、を含む、癌組織由来細胞塊のホルモン依存性の評価方法。 - 前記癌組織由来細胞塊が、乳癌、子宮癌、および前立腺癌からなる群より選択される1つの癌由来であり、前記ホルモンが、エストロゲン、プロジェステロン、およびテストステロンからなる群より選択される少なくとも1つのホルモンである、請求項6記載のホルモン依存性の評価方法。
- 前記比較する工程が、前記癌組織由来細胞塊の増殖状態または生死状態を比較することである、請求項6または7記載のホルモン依存性の評価方法。
- 生体から摘出した癌組織の細片化物をコラゲナーゼを含む酵素で処理する工程;
該酵素処理物から、サイズを分ける方法を用いて、直径、長径、または体積平均粒子径20μm以上500μm以下であって、3個以上の癌細胞を含む塊を選別回収する工程;
該回収された塊を少なくとも3時間培養し、略球形または楕円球形の培養物を得る工程;および
該培養物の遺伝子を評価する工程、を含む癌組織由来細胞塊の評価方法。 - 前記遺伝子が、KRAS遺伝子またはBRAF遺伝子であり、前記評価が、遺伝子の変異の有無を検知することである、請求項9記載の癌組織由来細胞塊の評価方法。
- 前記遺伝子を評価する工程が、該遺伝子発現量を検知することである、請求項9または10記載の癌組織由来細胞塊の評価方法。
- 前記培養が、低酸素状態および通常の酸素状態でなされ、前記遺伝子を評価する工程が、低酸素状態と通常の酸素状態下での培養における該遺伝子発現量の比較である、請求項11記載の癌組織由来細胞塊の評価方法。
- 前記遺伝子が、VEGF遺伝子である、請求項11または12記載の評価方法。
- 生体から摘出した癌組織の細片化物をコラゲナーゼを含む酵素で処理する工程;
該酵素処理物から、サイズを分ける方法を用いて、直径、長径、または体積平均粒子径20μm以上500μm以下であって、3個以上の癌細胞を含む塊を選別回収する工程;
該回収された塊を少なくとも3時間培養し、略球形または楕円球形の培養物を得る工程;および
該培養物を冷凍する工程、を含む癌組織由来細胞塊の冷凍保存方法。 - 癌組織由来細胞塊の単一細胞化処理、および細胞凝集促進処理または細胞死抑制薬剤処理を含む方法である、請求項14記載の冷凍保存方法。
- 前記単一細胞化処理が、トリプシン、ディスパーゼ、および場合により、コラゲナーゼ、パパイン、ヒアルロニダーゼ、C. histolyticum neutral protease、thermolysin、およびdispaseからなる群より選択される1種、またはこれらの2種以上の組合せによる処理であり、細胞凝集促進処理または細胞死抑制薬剤処理が、ROCK阻害剤またはカスパーゼ阻害剤による処理である、請求項15記載の冷凍保存方法。
- ガラス化法による、請求項14記載の冷凍保存方法。
- 前記癌組織由来細胞塊が、該癌組織由来細胞塊が有する遺伝子情報と関連付けられた状態で保存されている、請求項14から17までのいずれか1項記載の冷凍保存方法。
- 前記癌組織由来細胞塊が、由来する患者の臨床情報と関連付けられた状態で保存されている、請求項14から17までのいずれか1項記載の冷凍保存方法。
- 前記癌組織由来細胞塊が、該癌組織由来細胞塊の培養条件情報と関連付けられた状態で保存されている、請求項14から17までのいずれか1項記載の冷凍保存方法。
- 前記培養条件情報が、ホルモン依存性の有無である、請求項20記載の冷凍保存方法。
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