WO2009154265A1 - 癌幹細胞及び癌細胞株の製造方法 - Google Patents

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  • a CD133-negative cancer stem cell that can be produced by the method according to [1].
  • a method for producing a cancer cell line comprising co-culturing cancer cells that are not cancer stem cells with stellate cells, and isolating a cancer cell line established from the culture.
  • a method for producing a non-human mammal carrying a tumor mass comprising transplanting a cancer cell that is not a cancer stem cell to a non-human mammal together with a stellate cell to form a tumor mass in the non-human mammal. .
  • a cell phenotype when a cell phenotype is expressed by the presence or absence of marker molecule (antigen) expression, the cell phenotype is expressed by the presence or absence of specific binding by an antibody to the marker molecule, unless otherwise specified.
  • the determination of the phenotype of a cell based on the presence or absence of expression of a marker molecule is usually performed by flow cytometry analysis using a specific antibody against the marker molecule.
  • “Positive” expression of a marker molecule means that the marker molecule is expressed on the cell surface (or in the cell) and specific binding by an antibody to the marker molecule can be detected.
  • “Negative” expression of a marker molecule means that the marker molecule is not substantially expressed on the cell surface (or in the cell) and specific binding by an antibody to the marker molecule cannot be detected.
  • Co-culture of cancer cells that are not cancer stem cells and stellate cells is usually performed so that the cancer cells and the stellate cells can be contacted in the same well.
  • test compound to be used for screening may be any known compound or new compound, for example, nucleic acid, carbohydrate, lipid, protein, peptide, organic low molecular weight compound, compound prepared using combinatorial chemistry technology
  • libraries random peptide libraries prepared by solid phase synthesis and phage display methods, or natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, and the like.

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Abstract

　本発明は、癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養することにより該癌細胞から癌幹細胞を誘導すること、及び培養物から該癌幹細胞を単離することを含む、癌幹細胞の製造方法を提供する。また、本発明は、癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養すること、培養物から株化した癌細胞株を単離することを含む、癌細胞株の製造方法を提供する。

Description

癌幹細胞及び癌細胞株の製造方法
　本発明は、癌幹細胞を高い効率で誘導する方法に関する。また、本発明は癌細胞株を高い効率で樹立する方法に関する。
　現在使われている抗癌剤の多くは、「癌細胞の増殖する性質」を標的として開発されたものである。ところで、最近になって、癌細胞集団の中に、組織の幹細胞と同様の性質を持つ細胞が存在することが指摘されるようになった。その「癌幹細胞」は、癌細胞の源であり、癌治療のためのもっとも重要な標的細胞であるが、癌細胞の中では増殖期にあることが少ないという特徴をもっている。よって、癌幹細胞に対しては従来の抗癌剤が効きにくいということが示唆されている。そのため、癌幹細胞を単離し、これを標的とする新たな抗癌剤を開発することが求められている。
　大腸癌幹細胞としては、ＣＤ１３３陽性（＋）細胞が同定されており（非特許文献１）、ＣＤ１３３陽性（＋）細胞を標的とする新しい抗癌剤の開発が期待されている。しかしながら、ＣＤ１３３陰性（－）細胞から癌幹細胞を誘導したとの報告はない。従来技術によって得られた癌細胞株は、ＣＤ１３３陽性（＋）癌細胞をベースとして樹立されたものであると考えられ、それ以外の画分（即ち、ＣＤ１３３陰性（－）細胞）から癌幹細胞を誘導する可能性や、そこから得られる新たな癌細胞株を標的とする抗癌剤の開発については、十分な検討がなされていない。
　非特許文献２には、ＣＤ１３３陰性の細胞をマウスに移植すると腫瘍形成が起こったこと、ＣＤ１３３陰性の細胞を移植して形成された腫瘍からはＣＤ１３３陰性の細胞しか検出されなかったことが報告されている。しかしながら、癌幹細胞ではない癌細胞から癌幹細胞を誘導したことについては何ら記載されていない。
　また、ヒトの癌組織から癌細胞株を樹立し、これを用いて抗癌作用を有する化合物をスクリーニングすることが抗癌剤の研究開発において一般的に行われている。しかし、癌組織の初代培養においては、細胞の継代や凍結保存が一般的に不可能であるため、スクリーニングに使用可能なレベルにまで癌細胞をインビトロで増殖させることは極めて難しく、癌組織から癌細胞株を樹立し得る効率（成功率）は極めて低い（通常１０％以下）。また細胞の株化には、癌幹細胞を維持したまま癌組織から癌細胞を分離し培養する必要があるが、樹立効率の低さを考慮すると、多くの癌治療の標的となるべき細胞がスクリーニングの対象から外れてしまっている可能性がある。従って、従来行われている細胞株を用いた抗癌剤のスクリーニングにおいては、極めて限定された種類の細胞を標的とする化合物しか得られていない。そこで、癌組織から効率よく癌細胞株を樹立する方法の開発が望まれていた。
Nature. 2007 Jan 4;445(7123):111-5. The Journal of Clinical Investigation, vol. 118, no. 6, 2021-2024, 2008
　本発明は、癌幹細胞及び癌細胞株を樹立する新たな方法を開発することを目的とする。
　本発明者らは、癌幹細胞ではないＣＤ１３３陰性癌細胞を星細胞と共培養することにより、高い効率で癌幹細胞が誘導されることを見出した。ＣＤ１３３陰性癌細胞を星細胞と共に免疫不全マウスの皮下に移植することにより、腫瘍塊が形成されたことから、インビトロのみならず、インビボにおいても星細胞との共培養によりＣＤ１３３陰性癌細胞から癌幹細胞が誘導可能であることが示された。このようにして得られた癌幹細胞はＣＤ１３３陰性であった。
　以上の知見に基づき、本発明を完成した。
　即ち、本発明は以下に関する。
［１］癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養することにより該癌細胞から癌幹細胞を誘導すること、及び培養物から該癌幹細胞を単離することを含む、癌幹細胞の製造方法。
［２］星細胞がＳＤＦ－１産生能を有するものである、［１］記載の方法。
［３］共培養に供される癌細胞がＣＤ１３３陰性である、［１］記載の方法。
［４］１ウェルにつき１個の癌細胞を星細胞と共培養する、［１］記載の方法。
［５］得られ得る癌幹細胞がＣＤ１３３陰性である、［１］記載の方法。
［６］［１］記載の方法により製造され得る、ＣＤ１３３陰性癌幹細胞。
［７］癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養すること、培養物から株化した癌細胞株を単離することを含む、癌細胞株の製造方法。
［８］星細胞がＳＤＦ－１産生能を有するものである、［７］記載の方法。
［９］癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共に非ヒト哺乳動物に移植することにより、該非ヒト哺乳動物中に腫瘍塊を形成させることを含む、腫瘍塊を担持した非ヒト哺乳動物の製造方法。
［１０］星細胞がＳＤＦ－１産生能を有するものである、［９］記載の方法。
［１１］移植に供される癌細胞がＣＤ１３３陰性である、［９］記載の方法。
［１２］被検化合物の存在下で癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養すること、被検化合物の非存在下の場合と比較して、癌幹細胞ではない癌細胞からの癌幹細胞の誘導を抑制した化合物を、ＳＤＦ－１の産生又は機能を阻害し得る候補化合物として選択することを含む、ＳＤＦ－１の産生又は機能を阻害し得る化合物のスクリーニング方法。
［１３］被検化合物の存在下で、［１］記載の方法により製造され得る癌幹細胞を培養すること、被検化合物の非存在下の場合と比較して、癌幹細胞の生存率、増殖又は幹細胞活性を抑制した化合物を、抗腫瘍性化合物の候補として選択することを含む、抗腫瘍性化合物のスクリーニング方法。
　本発明により、癌幹細胞ではない癌細胞から、癌幹細胞や癌細胞株を誘導することが可能となる。本発明の製造方法により得られ得る癌幹細胞や癌細胞株は、癌幹細胞の基礎的研究や、癌幹細胞を標的とする新たな抗癌剤のスクリーニングに有用である。特に、従来は、ＣＤ１３３陽性癌幹細胞から増殖した癌細胞集団のみを標的として抗癌剤のスクリーニングが行われてきており、本発明の製造方法により得られるようなＣＤ１３３陰性の癌幹細胞やそこから分化した癌細胞に対する効果が十分に評価されてこなかった可能性がある。従って、本発明の製造方法により得られ得る癌幹細胞や癌細胞株を使用して抗癌剤のスクリーニングを行うことにより、従来の抗癌剤のスクリーニング方法を補完することが出来る。
ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株からのＣＤ１３３＋画分及びＣＤ１３３－画分のソーティング。縦軸は細胞数を、横軸はＣＤ１３３発現に相当する蛍光強度を示す。グラフ中の数字はＣＤ１３３陽性細胞の割合を示す。 ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株から分離したＣＤ１３３陽性癌幹細胞の癌コロニー形成に対する種々の薬物の効果を示す。Ｃｏｎ．　コントロール、Ｏｘａｌｉ　オキサリプラチン、ＡＭＤ　ＡＭＤ３１００。 ＨＣＴ１１６大腸癌細胞株中のＣＤ１３３陰性画分と星細胞との共培養により誘導した癌幹細胞の癌コロニー形成に対する種々の薬物の効果を示す。Ｃｏｎ．　コントロール、Ｏｘａｌｉ　オキサリプラチン、ＡＭＤ　ＡＭＤ３１００。 活性型又は不活性型の星細胞から分泌されたＳＤＦ－１の濃度を示す。
Ｉ．癌幹細胞の製造方法
　本発明は、癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養することにより該癌細胞から癌幹細胞を誘導すること、及び培養物から該癌幹細胞を単離することを含む、癌幹細胞の製造方法（本発明の製造方法Ｉ）を提供する。
　癌幹細胞とは、継続的に増殖可能な腫瘍の再構築に必要な癌細胞であって、自己複製能、多分化能及び増殖能を有する癌細胞をいう。自己複製能とは、分裂した２つの娘細胞のどちらか１つ、あるいは、両方の細胞が、細胞系譜上、親細胞と同等の能力および分化程度を保持している細胞を産出できる能力をいう。多分化能とは、腫瘍を構成する複数種の癌細胞へ分化できる能力をいう。
　本発明の製造方法Ｉにおいて、共培養に供される癌細胞は癌幹細胞ではなく、自己複製能及び多分化能から選択される少なくとも一方の能力を有していない。通常、癌幹細胞ではない癌細胞は、哺乳動物に移植されても、腫瘍塊を形成することができない。
　癌幹細胞は、一般的にＣＤ１３３を発現しているため、ＣＤ１３３陽性の癌細胞として特定することができる。従って、本発明の製造方法Ｉにおいて共培養に供される癌細胞は、ＣＤ１３３陰性であり得る。
　本明細書において、細胞の表現型をマーカー分子（抗原）発現の有無で表す場合、特に断りのない限り、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合の有無で細胞の表現型が表記される。マーカー分子の発現の有無による細胞の表現型の決定は、通常、当該マーカー分子に対する特異的抗体等を用いたフローサイトメトリー解析等により行われる。マーカー分子の発現が「陽性」とは、該マーカー分子が細胞表面上（或いは細胞内）に発現しており、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合が検出できることをいう。マーカー分子の発現が「陰性」とは、該マーカー分子が細胞表面上（或いは細胞内）に実質的に発現しておらず、当該マーカー分子に対する抗体による特異的結合が検出できないことをいう。
　本発明の製造方法Ｉにおいて使用される癌幹細胞ではない癌細胞の態様には、以下のものが含まれる：
（１）癌幹細胞ではない癌細胞及び癌幹細胞を含む、癌細胞混合物。一般的な腫瘍塊、腫瘍塊の初代培養物、癌細胞株等は、それを構成する癌細胞が不均一であるため、癌幹細胞ではない癌細胞及び癌幹細胞の両方を含む、癌細胞混合物として存在する。該癌細胞混合物には、癌細胞ではない細胞（即ち正常細胞）が含まれていてもよい。
（２）単離精製された、癌幹細胞ではない癌細胞。該癌細胞は、癌幹細胞の混入を実質的に含有しない。癌幹細胞ではない癌細胞の単離精製は、癌幹細胞のマーカー（例えばＣＤ１３３）に対する特異的抗体を用いて、セルソーターや、磁性ビーズ等により、該抗体の特異的結合の有無を指標に、癌細胞集団から癌幹細胞を除去することにより行うことができる。
　本発明の製造方法Ｉにおいては、種々の癌由来の癌細胞を共培養に用いることが可能である。癌の種類としては、固形癌（例えば、大腸癌（特にカルシノーマ）、肺癌、胃癌、食道癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌等）、血液癌（例えば、骨髄腫、リンパ腫等）等を挙げることができるが、特にこれらに限定されない。本発明においては、好ましくは大腸癌（好ましくはカルシノーマ）由来の癌細胞が用いられる。
　本発明の製造方法Ｉにおいては、癌幹細胞ではない癌細胞が星細胞と共培養される。星細胞は、伊東細胞とも呼ばれ、肝類洞周囲腔に存在する、間質細胞の一種である。本発明の製造方法Ｉに用いられる星細胞は好ましくは単離されたものである。星細胞は、脂肪の取り込みが強く、ビタミンＡを貯蔵する機能を有することが知られている。星細胞は自体公知の方法により肝臓より単離することが可能である。例えば、マウスの場合は、肝臓を酵素処理して細胞を分離した後に、遠心分離することにより、星細胞を単離することが出来る。ヒト星細胞は、LI90としてヒューマンサイエンス研究資源バンクから入手可能である。また、ヒトの場合は、肝間質腫瘍を初代培養することによって、星細胞を単離することが出来る。星細胞の単離方法については、例えば、Laboratory Investigation, 72, 731-739, 1995等に記載されている。
　本発明において使用する星細胞は、ＳＤＦ－１産生能を有するものである。星細胞は活性化によりＳＤＦ－１を多量に産生することが知られている。星細胞から産生されたＳＤＦ－１は、癌幹細胞ではない癌細胞から癌幹細胞への誘導を強力に促進する。ＳＤＦ－１産生の有無は、ＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ等により確認することが可能である。
　本発明の製造方法Ｉにおいて用いられる癌細胞及び星細胞は、通常哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。
　癌細胞が由来する哺乳動物の種類と、星細胞が由来する哺乳動物の種類は、同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは同一の動物種である。
　癌幹細胞ではない癌細胞と星細胞との共培養は、通常、同一のウェル内において、該癌細胞と該星細胞とが接触し得るように行われる。
　細胞数の比は、共培養により癌幹細胞ではない癌細胞から癌幹細胞を誘導し得る範囲内であれば特に限定されないが、通常、癌幹細胞ではない癌細胞１個に対して、０．１～１００００個、好ましくは１～１０００個の星細胞が使用される。
　共培養において用いられる培地の基礎培地としては、哺乳動物細胞の培養で一般的に使用されるものを用いることができ、培養対象の癌細胞の種類に応じて適宜選択することが可能である。基礎培地としては、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
　共培養において用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば血清、成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ－グルタミン等）、糖類（例えばグルコース等）、還元剤（例えば２－メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ－ビオチン等）、ステロイド（例えばβ－エストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
　その他の培養条件も、哺乳動物細胞の培養で一般的に使用される条件を適用することができる。例えば、雰囲気中のＣＯ２濃度は、通常約１～１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。雰囲気中の湿度は、通常約７０～１００％の範囲内であり、好ましくは約９５～１００％である。培養温度は、通常約３０～４０℃の範囲内であり、好ましくは約３７℃である。
　培養期間は、共培養により癌幹細胞ではない癌細胞から癌幹細胞を誘導し得る範囲内であれば特に限定されないが、通常１～２１日間、好ましくは３～７日間の範囲内である。培養期間が長すぎると、分化した癌細胞が増加してしまうおそれがある。一方、培養期間が短すぎると、癌幹細胞の十分な誘導を達成できないおそれがある。
　上記条件での共培養の結果、癌幹細胞ではない癌細胞から癌幹細胞が誘導され、癌幹細胞を含有する培養物を得ることができる。「培養物」とは、細胞を培養することにより得られる結果物をいい、細胞、培地、場合によっては細胞分泌性成分等が含まれる。
　所望に応じ、共培養後に癌幹細胞が誘導されたことを確認してもよい。癌幹細胞が誘導されたか否かは、得られた細胞の一部（例えば約１０４～１０５個）を免疫不全動物に移植した際の腫瘍塊形成の有無に基づき評価することができる。腫瘍塊が形成された場合には、癌幹細胞が誘導されたと判断することができる。また、癌幹細胞が誘導されたか否かは、インビトロ培養においてシングルセルから増殖可能か否かに基づき評価することもできる。癌細胞がシングルセルから増殖可能であった場合には、癌幹細胞が誘導されたと判断することができる。
　上記培養物から癌幹細胞を単離（又は精製）することにより、癌幹細胞を得ることができる。本明細書中、「単離」とは目的とする細胞以外の成分（細胞、タンパク質、培地等）の混入を除去する操作を意味する。癌幹細胞の単離は、例えば細胞の形状や性質等に基づき、自体公知の方法により行うことができる。例えば、星細胞は、線維芽細胞様の形状を呈するので、癌幹細胞と星細胞の混合物から癌幹細胞をマイクロマニピュレーター等を用いてピックアップすることにより、癌幹細胞を単離することができる。また、星細胞と癌細胞とは、タンパク分解酵素（例えば、トリプシンなど）およびキレート剤（例えば、EDTAなど）に対する反応性の違いを利用して、段階的にシャーレから剥離することによって分離することができる。
　本発明は、上記方法により製造され得る癌幹細胞をも提供する。本発明の製造方法Ｉにより製造され得る癌幹細胞は、ＣＤ１３３陰性であり得る。
　また、別の局面において、本発明の製造方法Ｉにより製造され得る癌幹細胞は、ＣＤ１３３陽性であり得る。
　１つの好ましい態様において、１ウェルにつき１個の癌幹細胞ではない癌細胞が星細胞と共培養される。セルソーターや限界希釈等の自体公知の方法を用いることにより、１ウェルにつき１個の細胞を播種することができる。１個の癌幹細胞ではない癌細胞から癌幹細胞を誘導することにより、遺伝的な不均一性が限りなく排除された、モノクローナルな癌幹細胞を樹立することが出来る。
　上述の方法により、癌幹細胞ではない癌細胞から癌幹細胞を誘導させ、この癌幹細胞を引き続き培養することにより、株化した癌細胞株を得ることができる。従って、本発明は、癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養すること、培養物から株化した癌細胞株を単離することを含む、癌細胞株の製造方法をも提供する。「株化した癌細胞株」とは、インビトロで継代培養可能であって、一定の安定した形質を有する癌細胞を意味する。従って、「株化した癌細胞株」には、上述の癌幹細胞のみならず、癌幹細胞とそこから分化した癌幹細胞ではない癌細胞とから構成される癌細胞集団であって、継代を通じてその形質が不変な状態に至った癌細胞集団もが含まれる。
　本発明の製造方法Ｉにより得られ得る癌幹細胞や癌細胞株は、癌幹細胞の基礎的研究や、癌幹細胞を標的とする新たな抗癌剤のスクリーニングに有用である。特に、従来は、ＣＤ１３３陽性癌幹細胞から増殖した癌細胞集団のみを標的として抗癌剤のスクリーニングが行われてきており、本発明の製造方法Ｉにより得られるようなＣＤ１３３陰性の癌幹細胞やそこから分化した癌細胞に対する効果が十分に評価されてこなかった可能性がある。従って、本発明の製造方法Ｉにより得られ得る癌幹細胞や癌細胞株を使用して抗癌剤のスクリーニングを行うことにより、従来の抗癌剤のスクリーニング方法を補完することが出来る。
ＩＩ．腫瘍塊を担持した非ヒト哺乳動物の製造方法
　本発明は、癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共に非ヒト哺乳動物に移植することにより、該非ヒト哺乳動物中に腫瘍塊を形成させることを含む、腫瘍塊を担持した非ヒト哺乳動物の製造方法（本発明の製造方法ＩＩ）を提供する。本発明の製造方法ＩＩは、端的にいえば、上述の本発明の製造方法Ｉをインビボにおいて行い、癌幹細胞ではない癌細胞から癌幹細胞を誘導することにより、癌幹細胞ではない癌細胞に由来する腫瘍塊を形成する方法に相当する。
　「癌幹細胞ではない癌細胞」及び「星細胞」の定義は上述の通りである。
　本発明の製造方法ＩＩにおいて使用可能なレシピエント非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。
　移植された細胞の拒絶を回避するため、レシピエント非ヒト哺乳動物としては、好ましくは移植に用いられる細胞が由来する動物種と同種（同種異系又は同種同系）の動物種が選択され、より好ましくは同種同系の動物種が選択される。動物種及び／又は系統がレシピエント非ヒト哺乳動物と移植に用いられる細胞との間で異なっている場合は、移植された細胞が拒絶される可能性を減弱する目的で、レシピエント非ヒト哺乳動物は免疫不全動物であることが好ましい。該免疫不全動物としては、遺伝的に免疫機能を欠損している動物（例えばヌードマウス等）や、Ｔ細胞等の免疫担当細胞の細胞表面抗原（例えばＣＤ４等）に対する抗体を投与すること等により免疫寛容を誘導した動物等が挙げられる。
　癌幹細胞ではない癌細胞と星細胞の移植は、レシピエント非ヒト哺乳動物の移植部位において、該癌細胞と該星細胞とが接触し得るように行われる。このような移植の態様としては以下を挙げることが出来る：（１）癌幹細胞ではない癌細胞と星細胞との混合物の移植；（２）癌幹細胞ではない癌細胞の細胞懸濁液と星細胞の細胞懸濁液の同一部位への同時移植；又は（３）癌幹細胞ではない癌細胞の細胞懸濁液と星細胞の細胞懸濁液の同一部位への時間差をおいての移植（例えば、癌幹細胞ではない癌細胞→星細胞の順序での移植、あるいは逆の順序での移植）。
　時間差をおいて移植する場合の時間差は、腫瘍塊の形成が達成可能な範囲内であれば特に限定されないが、通常１時間以内、好ましくは１０分以内である。
　移植部位は、腫瘍塊の形成が達成可能な限り特に限定されないが、手術のし易さの観点から、好ましくはレシピエント非ヒト哺乳動物の皮下に細胞が移植される。
　移植に使用される癌幹細胞ではない癌細胞の細胞数は、腫瘍塊の形成が達成可能な範囲内であれば特に限定されないが、通常レシピエント非ヒト哺乳動物１匹につき１０２～１０７個、好ましくは１０３～１０６個である。移植される癌細胞の数が多すぎると、癌幹細胞の混入に由来する腫瘍塊が優先的に形成されてしまうおそれがある。移植される癌細胞の数が少なすぎると、評価に十分な大きさの腫瘍塊が形成されないおそれがある。
　移植に使用される星細胞の細胞数は、腫瘍塊の形成が達成可能な範囲内で適宜設定できるが、通常の癌幹細胞ではない癌細胞１個に対して、０．１～１００００個、好ましくは１～１０００個の星細胞を移植する。
　上記移植によりレシピエンド動物の移植部位において癌幹細胞ではない癌細胞から癌幹細胞が誘導され、該部位において移植された癌幹細胞ではない癌細胞に由来する腫瘍塊が形成される。
　本発明の製造方法ＩＩにより作成された腫瘍塊を担持した非ヒト哺乳動物は、新たな腫瘍動物モデルとして、抗癌剤のスクリーニング等に有用である。
ＩＩＩ．ＳＤＦ－１阻害化合物のスクリーニング方法
　また、本発明は、被検化合物の存在下で癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養すること、被検化合物の非存在下の場合と比較して、癌幹細胞ではない癌細胞からの癌幹細胞の誘導を抑制した化合物を、ＳＤＦ－１の産生又は機能を阻害し得る候補化合物として選択することを含む、ＳＤＦ－１の産生又は機能を阻害し得る化合物のスクリーニング方法（本発明のスクリーニング方法Ｉ）を提供するものである。ＳＤＦ－１は星細胞による癌幹細胞の誘導に重要な役割をはたしているので、この誘導を阻害する化合物を選択することにより、ＳＤＦ－１の産生又は機能を阻害し得る化合物を獲得し得る。
　スクリーニングに供される被検化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
　「癌幹細胞ではない癌細胞」及び「星細胞」の定義は上述の通りである。
　被検化合物の存在下での癌幹細胞ではない癌細胞と星細胞との共培養は、上記方法Ｉと同様に行うことが可能である。
　培養の結果、培養物中の癌幹細胞の誘導レベル（癌幹細胞の量）が測定される。癌幹細胞の量は、培養物を免疫不全動物に移植した際の腫瘍塊形成の有無や、形成される腫瘍塊の大きさに基づき評価することができる。或いは、共培養を継続した結果、癌細胞株が樹立されるか否かによっても評価することができる。
　次いで、癌幹細胞の誘導レベルが、被検化合物の非存在下での癌幹細胞の誘導レベル（対照）と比較される。誘導レベルの比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行なわれる。実験の精度、再現性の観点から、被検化合物の非存在下での試験（対照試験）は、被検化合物の存在下での試験と同時平行して行うことが好ましい。
　比較の結果、癌幹細胞ではない癌細胞からの癌幹細胞の誘導を抑制した化合物を、ＳＤＦ－１の産生又は機能を阻害し得る候補化合物として選択することが出来る。
　更に、得られた候補化合物が、実際にＳＤＦ－１の産生又は機能を阻害し得るか、確認する試験を行ってもよい。ＳＤＦ－１産生の抑制を確認する場合、被検化合物とＳＤＦ－１の発現を測定可能な細胞とを接触させ、被検化合物を接触させた細胞におけるＳＤＦ－１の発現量を測定し、該発現量を被検化合物を接触させない対照細胞におけるＳＤＦ－１の発現量と比較する。ＳＤＦ－１の発現を測定可能な細胞とは、ＳＤＦ－１遺伝子の産物、例えば、転写産物、翻訳産物の発現レベルを評価可能な細胞をいう。ＳＤＦ－１の発現を測定可能な細胞としては、例えば星細胞を挙げることが出来る。
　ＳＤＦ－１の機能を抑制し得る化合物を選択する場合、被検化合物の存在下でＳＤＦ－１の機能（活性）を測定し、該機能（活性）を被検化合物の不在下におけるＳＤＦ－１の機能（活性）と比較する。ＳＤＦ－１の機能とは、その受容体（ＣＸＣＲ４）を発現する細胞を活性化させることを意味する。該機能は、具体的には、該細胞のＳＤＦ－１に対する走化性、ＳＤＦ－１刺激による細胞内カルシウムイオン濃度の上昇、ＳＤＦ－１とその受容体との結合等を指標に評価することができる。
　比較の結果、ＳＤＦ－１の発現又は機能を抑制した化合物が、最終的に選択される。
　ＳＤＦ－１はＨＩＶ感染、肺線維症等の疾患の発症や進行に関与することが知られているので、本発明のスクリーニング方法Ｉにより得られる化合物は、これらの疾患の治療薬の開発のための候補化合物として有用である。
ＩＶ．抗腫瘍性化合物のスクリーニング方法
　また、本発明は、被検化合物の存在下で、上記本発明の製造方法Ｉにより製造され得る癌幹細胞を培養すること、被検化合物の非存在下の場合と比較して、癌幹細胞の生存率、増殖又は幹細胞活性を抑制した化合物を、抗腫瘍性化合物の候補として選択することを含む、抗腫瘍性化合物のスクリーニング方法（本発明のスクリーニング方法ＩＩ）を提供するものである。
　スクリーニングに供される被検化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
　被検化合物の存在下での癌幹細胞の培養は、哺乳動物細胞の培養で一般的に使用される条件下で行うことが出来る。
　培養において用いられる培地の基礎培地としては、哺乳動物細胞の培養で一般的に使用されるものを用いることができ、培養対象の癌幹細胞の種類に応じて適宜選択することが可能である。基礎培地としては、例えばＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｆ－１０、Ｍ－１９９等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、上記基礎培地の混合物を用いてもよい。
　培養において用いられる培地は、自体公知の添加物を含むことができる。添加物としては、例えば血清、成長因子（例えばインスリン等）、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ポリアミン類（例えばプトレシン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばＬ－グルタミン等）、糖類（例えばグルコース等）、還元剤（例えば２－メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、ｄ－ビオチン等）、ステロイド（例えばβ－エストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ等）等が挙げられる。当該添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
　その他の培養条件も、哺乳動物細胞の培養で一般的に使用される条件を適用することができる。例えば、雰囲気中のＣＯ２濃度は、通常約１～１０％の範囲内であり、好ましくは約５％である。雰囲気中の湿度は、通常約７０～１００％の範囲内であり、好ましくは約９５～１００％である。培養温度は、通常約３０～４０℃の範囲内であり、好ましくは約３７℃である。
　培養期間は、抗腫瘍性化合物をスクリーニングするのに十分な長さであれば特に限定されないが、通常０．５～１４日間程度、好ましくは１～３日間程度である。
　培養の結果、培養物中の癌幹細胞の生存率、増殖又は幹細胞活性が測定される。細胞の生存率は、トリパンブルー染色により測定することが出来る。細胞増殖は、トリチウムチミジンの取込みや、ＭＴＴ法でのホルマザン産物の吸光度を指標に測定することが出来る。幹細胞活性とは、癌幹細胞が生体内で腫瘍塊を形成する能力をいう。幹細胞活性は、例えば、評価対象の細胞を免疫不全哺乳動物内に移植した場合に、腫瘍塊を形成するのに最低限必要な細胞数を評価することにより測定することが出来る。
　次いで、癌幹細胞の生存率、増殖又は幹細胞活性が、被検化合物の非存在下での生存率、増殖又は幹細胞活性（対照）と比較される。比較は、好ましくは有意差の有無に基づいて行なわれる。実験の精度、再現性の観点から、被検化合物の非存在下での試験（対照試験）は、被検化合物の存在下での試験と同時平行して行うことが好ましい。
　比較の結果、癌幹細胞の生存率、増殖又は幹細胞活性を抑制した化合物を、抗腫瘍性化合物の候補として選択することが出来る。
　尚、本発明のスクリーニング方法ＩＩは、被検化合物の存在下での癌幹細胞の培養の前に、当該培養に用いられる癌幹細胞を、上記本発明の製造方法Ｉに従い製造する工程を含んでいてもよい。
　本発明のスクリーニング方法ＩＩにより得られる化合物は、抗腫瘍薬開発のための候補化合物として有用である。特に、本発明の製造方法Ｉにより得られる癌幹細胞は、再発時の癌幹細胞の性質をよく反映しているため、本発明のスクリーニング方法ＩＩは、再発癌の治療薬の開発に有利である。
　以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
　［実施例１］
　ヒト大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６をフローサイトメトリーで解析すると、６％程度のＣＤ１３３＋細胞が存在することが判明した（図１）。ＦＡＣＳｓｏｒｔｅｒにより、ＣＤ１３３＋細胞及びＣＤ１３３－細胞を単離精製した（図１）。ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ１３３－細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの皮下に表１に示した数だけ移植すると、ＣＤ１３３＋細胞は、１ｘ１０３の数で腫瘍塊を形成したが、ＣＤ１３３－細胞は、１ｘ１０５の数でも腫瘍塊を形成しなかった（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１は上段に示した数の癌細胞を移植した場合に、腫瘍塊を形成したマウスの匹数を示す（ｎ＝５）。
　以上の結果から、これまでの報告通り、ＣＤ１３３＋細胞が癌幹細胞の性質を示し、ＣＤ１３３－細胞は非癌幹細胞であることが確認できた。
　［実施例２］
　ヒト星細胞としては、ヒューマンサイエンス研究資源バンクから購入したＬＩ９０を使用した。
　実施例１で分離したＣＤ１３３－細胞をマウスに皮下移植する際に、１×１０５個の星細胞を同時に同一部位に移植した。すると、星細胞を使用しない場合には腫瘍塊の形成が見られなかったＣＤ１３３－細胞において、１ｘ１０３という少数の細胞でも腫瘍塊形成を誘導した（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２は左欄に示した数の癌細胞を星細胞と共に移植した場合に、腫瘍塊を形成したマウスの匹数を示す（ｎ＝５）。
　［実施例３］
　実施例２と同様に、ＨＣＴ１１６を星細胞と共にヌードマウスに移植した。後述するように、星細胞は高いＳＤＦ－１産生能を有することから、ＳＤＦ－１の寄与について検討するため、ＳＤＦ－１阻害剤ＡＭＤ３１００（１０ｍｇ／ｋｇ）をマウスの腹腔内に１日おきに投与した。
　その結果、実施例２と同様に、星細胞による腫瘍形成の促進が再現された（表３）。ＡＭＤ３１００は、星細胞による１０３個のＨＣＴ１１６の腫瘍形成を阻害した（表３）。この結果から、星細胞による癌幹細胞の誘導をＳＤＦ－１阻害剤が抑制したと考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３は左欄に示した数のＨＣＴ１１６を星細胞と共に又は星細胞なしで移植した場合に、腫瘍塊を形成したマウスの匹数を示す（ｎ＝５）。
　［実施例４］
　４８０穴プレートを用いて、ＣＤ１３３－細胞の単独細胞培養（Single cell culture）を行った。この結果、４８０ウェルのうち３７ウェルで、培養が成立した。しかし、増殖した細胞をフローサイトメトリーで解析すると、そのいずれもがＣＤ１３３＋細胞を含むことが判明した。この試験におけるＣＤ１３３－細胞の採取効率が９０％であったことから、増殖した細胞は、ＣＤ１３３＋細胞のコンタミネーションに由来するものと考えられた。
　一方、ＣＤ１３３－細胞の単独細胞培養中に星細胞（ＬＩ９０）（１×１０３個／ウェル）を共存させると、４８０ウェル中３８４ウェルで培養が成立した。増殖した細胞をフローサイトメトリーで解析すると、ほぼ全て（９５％）のウェルの細胞が、ＣＤ１３３－細胞のみから構成されていることが判明した。
　［実施例５］
　実施例４とは別ロットのＨＣＴ１１６細胞株を用いて、実施例４と同一の実験を行った。その結果、一部のウェルで、ＣＤ１３３－細胞から、ＣＤ１３３＋細胞が誘導された。この細胞をヌードマウスの皮下に移植すると、腫瘍が形成された。従って、ＣＤ１３３陰性非癌幹細胞から、ＣＤ１３３陽性癌幹細胞が誘導され得ることが示された。
　［実施例６］
　大腸癌に対して標準治療とされる５－ＦＵとオキサリプラチンに対する感受性を調べた。まず、ＨＣＴ１１６細胞株からＣＤ１３３陽性癌幹細胞を分離し、培養することにより癌幹細胞を得た。この細胞の癌コロニー形成能及びそれに対する５－ＦＵおよびオキサリプラチンの効果を図２に示す。５－ＦＵおよびオキサリプラチンにより、癌コロニー形成は抑制され、５－ＦＵとオキサリプラチンとを同時に投与すると、癌コロニー形成は１００％抑制された。一方、ＣＤ１３３陰性非癌幹細胞と星細胞とを共培養することにより得られた癌幹細胞（これを誘導癌幹細胞（ｉＣＳＣ：ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ）と呼ぶ場合がある）を用いた場合には、癌コロニー形成に対する５－ＦＵおよびオキサリプラチンの抑制効果が、ＨＣＴ１１６細胞株からＣＤ１３３陽性癌幹細胞を分離した場合よりも減弱した（図３）。５－ＦＵおよびオキサリプラチンを同時に投与しても、癌コロニー形成は完全には抑制されなかった。再発時の癌幹細胞は抗癌剤が効きにくいことが報告されており、本発明の製造方法により樹立した癌幹細胞は、このような再発時の癌幹細胞の性質をよく反映していることが示唆された。また、誘導癌幹細胞の癌コロニー形成に対してＣＸＣＲ４阻害剤であるＡＭＤ３１００が強い抑制効果を示したことから、本発明の製造方法により樹立した癌幹細胞は抗癌剤のスクリーニングに有用であることが示唆された。
　［参考例１］
　星細胞をマウス肝臓から分離・培養した。通常培養条件で５日間以上培養するか、ＴＧＦ－βを投与することにより、星細胞を活性化した。不活性型星細胞と活性型星細胞の培養液中のＳＤＦ－１の濃度をＥＬＩＳＡで測定すると、不活性型では、検出感度以下であった。一方、活性型では、平均６ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ－１が分泌されていることがわかった（図４）。
　以上の結果より、癌幹細胞ではないＣＤ１３３－癌細胞を星細胞と共存させることにより、インビトロ及びインビボの両方において、癌幹細胞を誘導し得ることが立証された。また、星細胞から分泌されているＳＤＦ－１が癌幹細胞の誘導に重要であることが示唆された。
　本発明により、癌幹細胞ではない癌細胞から、癌幹細胞や癌細胞株を誘導することが可能となる。本発明の製造方法により得られ得る癌幹細胞や癌細胞株は、癌幹細胞の基礎的研究や、癌幹細胞を標的とする新たな抗癌剤のスクリーニングに有用である。特に、従来は、ＣＤ１３３陽性癌幹細胞から増殖した癌細胞集団のみを標的として抗癌剤のスクリーニングが行われてきており、本発明の製造方法により得られるようなＣＤ１３３陰性の癌幹細胞やそこから分化した癌細胞に対する効果が十分に評価されてこなかった可能性がある。従って、本発明の製造方法により得られ得る癌幹細胞や癌細胞株を使用して抗癌剤のスクリーニングを行うことにより、従来の抗癌剤のスクリーニング方法を補完することが出来る。
　本出願は日本で出願された特願２００８－１６０９２４（出願日：２００８年６月１９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (13)

  1. 　癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養することにより該癌細胞から癌幹細胞を誘導すること、及び培養物から該癌幹細胞を単離することを含む、癌幹細胞の製造方法。
  2. 　星細胞がＳＤＦ－１産生能を有するものである、請求項１記載の方法。
  3. 　共培養に供される癌細胞がＣＤ１３３陰性である、請求項１記載の方法。
  4. 　１ウェルにつき１個の癌細胞を星細胞と共培養する、請求項１記載の方法。
  5. 　得られ得る癌幹細胞がＣＤ１３３陰性である、請求項１記載の方法。
  6. 　請求項１記載の方法により製造され得る、ＣＤ１３３陰性癌幹細胞。
  7. 　癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養すること、培養物から株化した癌細胞株を単離することを含む、癌細胞株の製造方法。
  8. 　星細胞がＳＤＦ－１産生能を有するものである、請求項７記載の方法。
  9. 　癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共に非ヒト哺乳動物に移植することにより、該非ヒト哺乳動物中に腫瘍塊を形成させることを含む、腫瘍塊を担持した非ヒト哺乳動物の製造方法。
  10. 　星細胞がＳＤＦ－１産生能を有するものである、請求項９記載の方法。
  11. 　移植に供される癌細胞がＣＤ１３３陰性である、請求項９記載の方法。
  12. 　被検化合物の存在下で癌幹細胞ではない癌細胞を星細胞と共培養すること、被検化合物の非存在下の場合と比較して、癌幹細胞ではない癌細胞からの癌幹細胞の誘導を抑制した化合物を、ＳＤＦ－１の産生又は機能を阻害し得る候補化合物として選択することを含む、ＳＤＦ－１の産生又は機能を阻害し得る化合物のスクリーニング方法。
  13. 　被検化合物の存在下で、請求項１記載の方法により製造され得る癌幹細胞を培養すること、被検化合物の非存在下の場合と比較して、癌幹細胞の生存率、増殖又は幹細胞活性を抑制した化合物を、抗腫瘍性化合物の候補として選択することを含む、抗腫瘍性化合物のスクリーニング方法。
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