JP2018516586A - TCRγδ+T細胞の生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、Vδ2−TCRγδ+T細胞の分離および選択的な生体外のエクスパンジョンのための新規な方法およびそれらの臨床応用に関する。
TCRγδ+T細胞
有顎脊椎動物の免疫系は、腫瘍細胞を認識および除去することができる様々なリンパ球集団(lymphocyte populations)を含んでいる。それは癌の免疫療法の基礎を構成する。1つの集団は、ガンマ(γ)鎖およびデルタ(δ)鎖の結合によって形成されたT細胞受容体(TCR)の発現により特徴づけられる。TCRγδ+T細胞(ここでγδT細胞と指定される)は人間の末梢血リンパ球(PBLs)の1−10%を構成できるが、健康な個体の上皮組織の中で本質的に富化され、最大50%のT細胞となる1。TCRγδ+T細胞は悪性および感染細胞に対する主要組織適合遺伝子複合体(Major Histcoompatibility Complex:MHC)−無制限の細胞毒性を潜在的に有するが、正常細胞および組織には無害である。したがって、それらは感染と腫瘍に対する第1ラインの監視機構と通常考えられる1。人間では、TCRγδ+T細胞の異なるサブセット(subsets)または亜集団(subpopulations)はそれらのδ鎖をコード化する遺伝子に基づいて、同定され分類される。ほとんどの残りのTCRγδ+T細胞が様々なVγ要素、Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5またはVγ8とともにVδ1鎖を発現する一方、末梢血中のTCRγδ+T細胞の約60−95%は、Vγ9鎖とともにVδ2鎖を発現する:他の(よりまれな)ヒトTCRγδ+T細胞集団はVδ3、Vδ5、Vδ6、Vδ7およびVδ8鎖を発現する2−4。
TCRγδ+T細胞に基づいた現在の養子免疫療法アプローチは、Vδ2+TCRγδ+T細胞亜集団(ここでVδ2+T細胞と指定される)に制限されている5,6。ほとんどのVδ2+T細胞は、特異的に非ペプチド・アルキルリン酸エステル塩(たとえばイソペンテニルピロ燐酸(IPP))に応答する。それは腫瘍細胞内で異常なレベルまで生産される。個体においては骨を強くするアミノビスフォスフォネート(たとえばゾレドロネートおよびパミドロネート)に暴露される。これらの化合物は、インターロイキン−2と組み合わされた時、Vδ2+T細胞の増殖および抗腫瘍の細胞毒性の機能を生体外で刺激する。また臨床応用のための清浄化された細胞集団を生成する5−7。しかしながら、現在まで終了した臨床試験は、癌患者における低い割合の奏効を示した8。したがって、現在のγδT細胞に基づいた治療は、実現可能で、安全であるが、明白な制限を有している6。
ヒトVδ1+TCRγδ+T細胞(ここでVδ1+T細胞として指定される)は、すべてのTCRγδ+ PBLsの1−40%を構成するが、上皮部位(たとえば腸と皮膚)でのメジャーγδT細胞集団である。それは臨床試験で評価されていないが、この細胞サブセットはさらに強い抗腫瘍活性を示すことができる。皮膚、結腸、腎臓および肺腫瘍に浸透しているVδ1+T細胞は、自己由来および同種異型の両方の癌細胞に対して細胞毒性だった9−13。興味深い相関が、ドナー由来の末梢血Vδ1+T細胞の数の増加と、急性リンパ芽球性白血病(ALL)での骨髄移植に続く5−10の−年無病生存の改善の間に見られた14。重要なことには、しみこんだVδ1+T細胞は、数年間これらの患者内で生き続けた14,15。別のセッティングでは、高いVδ1+T細胞カウントを有する低グレード−非ホジキンリンパ腫患者は、1年の追跡で安定した疾病を経験し、Vδ1+T細胞のより低いカウントを有する患者と比較され、改善された臨床経過を示した16。Vδ1+T細胞の循環も、慢性リンパ球性白血病(CLL)患者17の中で典型的に増加し17、低リスクのB−CLL患者での非進行に関係している18。最後に、循環Vδ1+T細胞の量的増加は、腎移植術に続くヒト−サイトメガロウイルス(HCMV)感染と同様にヒト免疫不全ウィルス(HIV)19およびマラリア20感染でも観察された4,21。異なる状況では、しかしながら、Vδ1+T細胞の亜集団は免疫抑制および調整(regulatory)特性、治療目的のために発現することができる機能を示す場合がある22。生体外のVδ1+T細胞が特異的に増殖する少数の方法が述べられてきたが、それらのどれは臨床応用に適していなかった(Siegers,G.et al.,2014,ref.22)。Meehらは、健康なドナーからのVδ1+T細胞がALL白血病のブラストに応じて生体外で増殖することを最初に示した23。Knight,A.と同僚およびMerims,S.と同僚は、末梢血Vδ1+T細胞を分離し、3週間、フィトヘマグルチニン(PHA)または抗CD3モノクローナル抗体(mAb)、IL−2および照射された同種異型(allogeneic)の末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cells:PBMCs)が存在する状態でそれらを処理した24,25。より最近の研究では、PHAはインターロイキン7(IL−7)と共同して使用された26。Siegers,G.らは、ツーステップ培養プロトコルを報告した。ここでソートされたTCRγδ+T細胞は、6−8日間コンカナバリンA(ConA)、IL−2およびIL−4で最初に処理され、さらに10日間、IL−2およびIL−4で刺激された27。培養期間の後、Vδ1+T細胞は59%増大されて、培養の半分で優勢なサブセット(Vδ1+T細胞の平均70%)だった;しかしながら、この方法でVδ1+T細胞の最大の25倍増加を達成することができるかもしれない27。この2ステップの培養方法は、国際特許出願第PCT/CA99/01024(WO 00/26347として公表された)にも述べられていた。それらの発明者によれば、継続的な細胞増殖と引き続く有系分裂促進物質の除去について、第2の培地中のIL−2およびIL−4の両方は不可欠だった。このプロトコルの変形がその後開発された。その中でPBMCsの合計は、ConA、IL−2およびIL−4が存在する状態で最初に6−13日間培養され、次いで汚染物質TCRαβ+T細胞の磁気消耗をし、さらに10日間、IL−2、IL−4およびConAで残りの細胞を刺激した。21日後に、Vδ1+T細胞は136から24,384まで増殖した。非常に低い純度レベル(培養中の細胞の30%未満がVδ1+T細胞だった)であり、ほとんどの汚染物質細胞(細胞の約55%)がVδ2+T細胞だった28。最後に、我々のグループは、以前に、白血病細胞株およびCLL患者新生細胞の改善された死滅を媒介することができる天然細胞毒性レセプター(natural cytotoxicity receptors:NCRs)を発現するVδ1+T細胞が富化された細胞集団を選択的に増殖し分化する方法について記述した29。この特許の方法は、一般的なγ−鎖サイトカイン(たとえばIL−2またはIL−15)およびTCRアゴニスト(例えばPHAまたは抗CD3 mAb)で刺激した際に、培地中のTCRγδ+T細胞またはその前駆物質の2−3週間の培養からなる(WO2012/156958として公表された国際特許出願第PCT/IB2012/052545)。この方法の重要な1つの制限は得られる細胞数が少なく、臨床応用に不適当であることである。
ヒトの中の大多数の非Vδ1+および非Vδ2+TCRγδ+T細胞は、Vδ3 TCR鎖を発現する。ヒトTCRγδ+ Vδ3+T細胞は、循環するT細胞の−0.2%を占める30。しかしCMV活性を持った腎と幹細胞移植レシピエントの末梢血4,21、HIV感染者31、またはB−CLL感染者17、および健康な肝臓32において富化されている。活性化されたTCRγδ+ Vδ3+T細胞はCD1d+細胞および上皮性腫瘍を生体外で殺すことができた4。しかしながら、利用可能な細胞培養方法は、臨床応用用の多くのTCRγδ+ Vδ3+T細胞を生産することができない。
いくつかの方法は、TCRγδ+T細胞集団のいくつかのサブセットの同時のエクスパンジョンに生体外で使用された。PBMCsの合計は、3週間、プレート−バウンド抗TCRγδmAbおよびIL−2で処理され、約90%のTCRγδ+T細胞を得た。それらの大部分はVδ2+T細胞であり、数パーセントがVδ1+T細胞だった33。Lopezらは、IL−2が存在する状態で、高投与量のインターフェロン−γ(IFN−γ)、IL−12および抗CD2 mAbおよび可溶性の抗CD3 mAbで処理することにより耐アポトーシス性のTCRγδ+T細胞を生成した。Vδ2+T細胞は細胞エクスパンジョンの後の主要なサブセットだった34。最近、ポリクローナルTCRγδ+T細胞が、CD19、CD64、CD86、CD137L、および細胞膜結合されたIL−15に、遺伝子組み換えされた腫瘍起源のγ−線照射された人工抗原(aAPC)の存在下でエクスパンジョンされた3,35。細胞は可溶性のIL−2およびIL−21が存在する状態でさらに培養された。
最近の研究は、Vδ1鎖を有しVδ1鎖もVδ2鎖も含まないTCRγδ+T細胞が、養子免疫療法の中でそれらをより魅力的な抗癌性エフェクターにする特性を持っていることを実証した36。Vδ2−TCRγδ+T細胞(ここでVδ2−γδT細胞とも指定される)は、生体外・生体内の両方でVδ2+T細胞より高い抗腫瘍細胞毒性および増加した生存キャパシティーを示した26、29、37。従って、Vδ2−γδ T細胞が高度に富化された医薬製造品が、より有力な抗腫瘍結果を生成し、治療された患者に改善された効果を与えると予想される。過去5年において、腫瘍ターゲティングVδ2−γδ T細胞の実質的な数を生体外で生成することができるいくつかの方法が述べられているが、重要な未決着の問題がこれらの細胞の臨床応用を除外している:
1) 製造工程中の安全でない試薬および材料の使用;
2) 特に異なるドナーから得られたか、癌患者から得られた細胞生成物における、最終細胞生成物の組成物における大きな変化;および/または
3)最終生産物の低い抗腫瘍活性22、27、28、38。
しかしながら、Vδ2−γδT細胞はアルキルリン酸エステル塩に応答しない。また、それらが認識する抗原に関する非常に制限された知識はそれらの生体外でのエクスパンジョンを制限する。植物レクチン(たとえばPHAおよびCon−A)は、前臨床のスケールで、これらの細胞を生体外で増殖し富化する(非常に高純度レベルで)ために使用された。従って、まだ未知の理由のために、これらの一般の有系分裂促進物質は、汚染物質Vδ2+T細胞の成長を阻害(あるいは、アポトーシスを引き起こして)するが、Vδ2−γδT細胞には著しく選択的であり、培養中のそれらの増殖を促進する27,29。しかしながら、ヒトに不注意に注入された場合、植物レクチンは有毒かもしれない。また、取り締まり機関は、安全性の観点から臨床応用のための使用を勧めないかもしれない。さらに、我々のデータによれば、少数の細胞を生成するので、植物レクチンは、Vδ2−γδT細胞のエクスパンジョンを生体外で引き起こすことではモノクローナル抗体ほど効率的ではない。いくつかのグループはPHAの代わりに、抗CD3モノクローナル抗体が存在する状態でTCRγδ+T細胞を培養した。しかしながら、CD3分子への抗CD3 mAb結合はさらに汚染物質CD3+TCRαβ+T細胞およびCD3+ Vδ2+T細胞を発現し、その結果最終細胞生成物の純度レベルの減少を引き起こした。従って、抗CD3 mAbによる刺激に先立って、磁気活性化された細胞選別(magnetic-activated cell sorting:MACS)、または蛍光活性化細胞分類(fluorescence-activated cell sorting:FACS)によってVδ2−γδT細胞を分離しなければならない25,40。事態をさらに複雑にすることに、重要な試薬(たとえば抗TCRγδmAb、抗TCRVδ1 mAbおよび抗TCRVδ3 mAb)が、合計のTCRγδ+T細胞、TCRγδ+ Vδ1+T細胞およびTCRγδ+ Vδ3+T細胞をそれぞれ分離するために使用されていたが、現在製造されないか、臨床使用が承認されていない(取り締まり機関によって)。したがって、ヒトへの直接の投与に適している清浄化されたVδ2−γδT細胞の十分な数を生成することは可能ではなかった22。純粋なVδ2−γδT細胞集団の生産のための、植物レクチンおよび他の安全でない試薬に依存しない方法への必要がある。従来の研究では、Denigerらは、γおよびδTCR鎖のポリクローナルレパートリーを発現するTCRγδ+T細胞を多量に増殖させる細胞を提供する、腫瘍由来の人工抗原細胞(artificial antigen presenting cells:aAPCs)を開発した37。しかしながら、著者によって指摘されたように41、この方法は、TCRγδ+T細胞の臨床応用に関連した重大な障害を解決することができなかった。例えば、ほとんどの成分はGMP品質では現在生産されていない。また、さらなる開発は、まだ異なる試薬でおよび癌患者から同じ細胞生成物を得ることができると仮定しても、メーカーの将来の興味および複雑な規定による承認に依存する。
更に、生成された細胞生成物の正確な組成(およびその変化)に関する重要な詳細はこの研究の中で失われ、この方法の潜在的な適用を妨害する。インターロイキン−2、インターロイキン−7およびインターロイキン−15は、TCRαβ+TおよびVδ2+T細胞を含む、多数の免疫細胞に対する強い刺激的な影響を有する多面発現性分子である。従って、汚染細胞がさらに培養中で増殖し細胞純度を損うので、これらの試薬はVδ2−γδT細胞の生体外での増殖に適切ではない。更に、γδTCRアゴニストとこれらの炎症促進性のサイトカインの典型的な組み合わせは、しばしば刺激された細胞の活性化誘導細胞死(AICD)に結びつき、少数の細胞しか得られない。非常に純度の低いスタートサンプルから増殖させたVδ2−γδT細胞のための、より選択的な試薬に依存する方法の技術への必要がある。
本発明は、フィーダー細胞または微生物又はウイルス成分の使用の必要なしで、生体外でヒトVδ2−TCRγδ+T細胞を増殖および分化させる新規な方法を提供する。最初に、発明者は、培養されたVδ2−TCRγδ+T細胞のエクスパンジョンと純度のレベルを改善することを目的とする。培地中でこれらの細胞を増殖する、新規で、より効率的・より選択的な方法は、T細胞マイトージェン(T cell mitogen)およびIL−4が存在する状態、およびIL−2、IL−7およびIL−15がない状態で開発された。最後に、得られたVδ2−TCRγδ+T細胞は、追加の生体外の最適化ステップを通じてより細胞毒性の表現型へ分化した。IL−4の除去、およびT細胞マイトージェンとIL−15、IL−2、あるいはIL−7の培地への追加の後、先に得られたVδ2−TCRγδ+T細胞は炎症促進性のサイトカインを生成し、生体外で腫瘍細胞の死滅を媒介する、活性化ナチュラルキラー・レセプター(Natural Killer receptors:NKR)をハイ・レベルで発現した。重要なことには、ハツカネズミ中への注入に際して、分化したTCRγδ+T細胞はそれらの細胞毒性の表現型を維持し、腫瘍成長を生体内で阻害した。本明細書に記載された細胞培養方法は非常に確固としており、高度に再現可能で、大規模臨床応用に完全に適合する。それは、癌の養子免疫療法および様々な実験・治療および商用用途で使用される分化したVδ2−TCRγδ+T細胞の十分な数を生成する。
(1)インターロイキン4−様活性(interleukin-4-like activity)を有する少なくとも1つの成長因子、およびT細胞マイトージェンを含む第1の培地中のサンプル中の細胞を、インターロイキン15−様活性を有する成長因子の非存在下で培養すること;および
(2)インターロイキン4−様活性を有する成長因子の非存在下で、インターロイキン15−様活性を有する少なくとも1つの成長因子およびT細胞マイトージェンを含む第2の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養すること。
(1)T細胞マイトージェンとインターロイキン4を含む第1の培地中のサンプル中の細胞を、インターロイキン15、インターロイキン2およびインターロイキン7の非存在下で培養すること;および
(2)インターロイキン4の非存在下で、T細胞マイトージェンとインターロイキン15を含む第2の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養すること。
新しく得られた方法(ここに詳述される)は、Vδ2−TCRγδ+T細胞の、以前に未確認であった生物学の特性に基づき、これまでどこにも記載されていないものである。
本発明は、Vδ2−TCRγδ+T細胞の分離および選択的な生体外/体外エクスパンジョン(in vitro lex vivo expansion)および分化のための新規の方法、およびそれらの臨床応用に関する。発明者は、培地中の末梢血Vδ2−TCRγδ+T細胞を増殖および分化させる(2−3週で)キャパシティーに関して、臨床グレードのアゴニスト抗体およびサイトカインの多数の組み合わせをテストした。TCRγδ+T細胞は、微生物の起源の分子およびフィーダー細胞がない培地中で分離され増殖した。発明者はそのVδ2−TCRγδ+T細胞(ここでVδ2−γδT細胞としても指定された)が、T細胞マイトージェンとインターロイキン4を含み、インターロイキン2、インターロイキン7およびインターロイキン15が非存在である第1の培地中でこれらの細胞を培養し、さらにこれらの細胞を、T細胞マイトージェンおよびインターロイキン15、インターロイキン2、あるいはインターロイキン7を含み、インターロイキン4が非存在であるサブ培地中で培養することにより、生体外で選択的に増殖できることを示した。他の重要な成長因子(たとえばインターフェロンγ、インターロイキン−21およびインターロイキン−1β)も1または両方の培地に加えられ、培養されたVδ2−γδT細胞のエクスパンジョンと純度のレベルを増加させた。
(1)インターロイキン4−様活性がある少なくとも1つの成長因子、およびT細胞マイトージェンを含み、インターロイキン15−様活性がある成長因子が非存在の第1の培地中でサンプル中の細胞を培養すること;および
(2)ステップ(1)で得た細胞を、インターロイキン15−様活性がある少なくとも1つの成長因子、およびT細胞マイトージェンを含み、インターロイキン4−様活性がある成長因子が非存在の、第2の培地中で培養すること。
(1)T細胞マイトージェンとインターロイキン4を含み、インターロイキン15、インターロイキン2およびインターロイキン7が非存在である第1の培地中で、サンプル中の細胞を培養すること;および
(2)インターロイキン4の非存在下で、T細胞マイトージェンとインターロイキン15を含む第2の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養すること。
(1)T細胞マイトージェンとインターロイキン4を含み、インターロイキン15、インターロイキン2およびインターロイキン7が非存在である第1の培地中で、サンプル中の細胞を培養すること;および
(2)インターロイキン4の非存在下で、T細胞マイトージェンとインターロイキン2を含む第2の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養すること。
(1)T細胞マイトージェンとインターロイキン4を含み、インターロイキン15、インターロイキン2およびインターロイキン7が非存在である第1の培地中で、サンプル中の細胞を培養すること;および
(2)インターロイキン4の非存在下で、T細胞マイトージェンとインターロイキン7を含む第2の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養すること。
(1)T細胞マイトージェン、インターロイキン4およびインターフェロン−γを含み、インターロイキン2、インターロイキン−7およびインターロイキン−15を含まない第1の培地中でのサンプル中の細胞を培養すること;および
(2)ステップ(1)で得られた細胞を、T細胞マイトージェン、インターロイキン−15およびインターフェロン−γを含み、インターロイキン−4を含まない第2の培地中で増殖し、Vδ2−γδT細胞を増殖し、分化させること。
(1)T細胞マイトージェン、インターロイキン−4、インターフェロン−γおよびインターロイキン−21を含み、インターロイキン−2、インターロイキン−7およびインターロイキン−15を含まない第1の培地中でサンプル中の細胞を培養すること:および
(2)ステップ(1)で得られた細胞を、T細胞マイトージェン、インターロイキン−15およびインターフェロン−γを含み、インターロイキン−4を含まない第2の培地中で培養し、Vδ2−γδT細胞を増殖し、分化させること。
(1)T細胞マイトージェン、インターロイキン−4、インターフェロン−γ、インターロイキン−21、およびインターロイキン−1βを含み、インターロイキン−2、インターロイキン−7およびインターロイキン−15を含まない第1の培地中でサンプル中の細胞を培養すること:および
(2)ステップ(1)で得られた細胞を、T細胞マイトージェン、インターロイキン−15、インターロイキン−γおよびインターフェロン−21を含み、インターロイキン−4を含まない第2の培地中で培養し、Vδ2−γδT細胞を増殖すること。
(1)T細胞マイトージェン、インターロイキン−4、CD27の任意の分子リガンド、SLAMの任意の分子リガンド、またはCD7レセプターの任意の分子リガンドを含み、インターロイキン−2、インターロイキン−7およびインターロイキン−15を含まない第1の培地中でサンプル中の細胞を培養すること:および
(2)ステップ(1)で得られた細胞を、T細胞マイトージェン、およびインターロイキン−15を含み、インターロイキン−4を含まない第2の培地中で培養し、Vδ2−γδT細胞を増殖すること。
(1)T細胞マイトージェン、インターロイキン−4、インターフェロン−γ、インターロイキン−1βおよびインターロイキン−21を含み、インターロイキン−2、インターロイキン−7およびインターロイキン−15を含まない第1の培地中でサンプル中の細胞を培養すること:および
(2a)ステップ(1)で得られた細胞を、T細胞マイトージェン、インターロイキン−15およびインターロイキン−21を含み、インターロイキン−4を含まない第2の培地中で培養すること;および
(2b)ステップ(2a)で得られた細胞を、T細胞マイトージェン、インターロイキン−15およびインターロイキン−γを含み、インターロイキン−4を含まない第3の培地中で培養し、Vδ2−γδT細胞を増殖すること。
(1a)T細胞マイトージェン、インターロイキン−4、インターフェロン−γ、およびインターロイキン−21を含み、インターロイキン−2、インターロイキン−7およびインターロイキン−15を含まない第1の培地中でサンプル中の細胞を培養すること:および
(1b)T細胞マイトージェン、インターロイキン−4、インターフェロン−γ、およびインターロイキン−1βを含み、インターロイキン−2、インターロイキン−7およびインターロイキン−15を含まない第2の培地中でサンプル(1a)で得られた細胞を培養すること:および
(2)ステップ(1b)で得られた細胞を、T細胞マイトージェン、およびインターロイキン−15を含み、インターロイキン−4を含まない第3の培地中で培養し、Vδ2−γδT細胞を増殖すること。
本発明は今、次の例および図を参照して記述される。
MEC−1 CLL細胞line46はGerman Resource Center for Biologic Material(DSMZ)から得られた。MEC−1腫瘍細胞は、10%のRPMI 1640、10%のウシ胎児血清、2mM L−グルタミン中で、T25フラスコにおいて培養されて、稀釈および1:3比率に3−4日ごとに分割することで、105から106の細胞/mLで維持した。細胞毒性について、生体外で増殖されたTCRγδ+T細胞が、96−ウエル丸底プレート内でプレートされた。腫瘍細胞株または白血病一次サンプルは、CellTrace Far Red DDAO−SE(1μM;Molecular Probes,Invitrogen)で染色され、示されたターゲット:エフェクター比率でRPMI 1640媒体中のTCRγδ+T細胞と、37℃で3時間、5%CO2で、70ナノグラム/mlのIL−15が存在する状態で培養した。その後、細胞はすべてAnnexin V−FITC(BD Biosciences)で染色され、流動細胞計測法によって分析された。
我々は、CLL/SSL由来のMEC−1細胞の、NOD−SCIDγc−/−(NSG)動物を宿主として使用してさらに応用される、Balb/cRag−/−γc−/−(BRG)の、皮膚下の養子免疫細胞移入の際に異種移植されたヒトCLLの以前に記述されたモデルを使用した。治療またはPBSコントロールを受ける動物が担癌動物であることを保証するために、我々は、治療細胞に帰着する前の初期の時間ポイントで腫瘍移植を検知し測定するために、ホタルルシフェラーゼでMEC−1 CLL細胞を変換した。7日か4日(異なる研究で)後に、我々はルシフェリンをi.p注射し、治療(あるいはPBSコントロール)を帰着する前に、動物へのルミネセンスの機能としての腫瘍ロードを決定した。動物は、かごの中で任意に分配され、最も高いルミネセンスを備えた動物が治療を受け、第2の最も高いものがPBS処理され、第3に高いものが治療を受けるように、7日目で測定されたルミネセンスによって各治療(PBSまたはDOT細胞)に割り当てられた。これは、無作為化されていない分布のグループ化だが、異なるかごの中での無作為化の分布に帰着する。2匹の追加の動物が最初のホーミング分析のための示された実験でDOT細胞を受け取った。我々は1つの実験当たり1つの異なるドナーからの細胞を使用して、2つの107または2x107 DOT細胞トランスファー(5日以内)を行なった。腫瘍はカリパスを使用し、3つの垂直の測定により測定された。使用される式は1/2 x L x W x Hだった49。腫瘍測定が1000mm3に達した時、動物を殺した。
GFPホタルルシフェラーゼでのMEC−1細胞株の形質導入の後、細胞成長が、FACS−Aria(Becton Dickinson(アメリカ))を使用して、GFP陽性細胞の最大>95%まで、GFP発現によってスリーニングされソートされた。その後、宿主動物へ皮下で転送される(50μl PBS中)まで、これらの細胞は培養中で維持された。転送後の示された時間ポイントでは、動物は麻酔をかけられ(Ketamin/Medetomidine)。また、ルシフェリンが注射された(i.p.)。4分後のルシフェラーゼ活性が、IMMバイオ画像診断設備でIVIS管腔(カリパスLifeSciences)を使用して、検知され得られた。その後、麻酔から覚め、動物は前のハウジングに返された。
細胞数は血球計数器で数えられたか、またはAccuriフローサイトメーター(Becton Dickinson(アメリカ))を使用して数えられた。器官の部品を組織学の分析のためにサンプリングし、サンプルの分裂の前後に器官を秤量することにより、1つの器官当たりの数が評価された。その後、示された数は、全体の器官に対して修正される。骨髄データでは、絶対数が計算され、1つの大腿骨について表示される。
麻酔の過剰服用でハツカネズミを殺した。検死が行なわれ選択された器官(肺、心臓、腸、ひ臓、肝臓、腎臓、生殖器官、脳、小脳、脊髄および大腿骨)を採取し、10%の中性緩衝ホルマリン中で固定されて、パラフィン中に埋められ、3μmのセクションがヘマトキシリン‐エオジン(H&E)で染色された。骨はさらにCalci−Clear(登録商標)中で脱灰された後、埋められた。組織セクションは、ライカMC170 HD顕微鏡カメラにつながれたライカDM2500顕微鏡の中で実験群に対してブラインドで病理学者によって考察された。CD3(Dako,cat.no.A0452)のための免疫組織化学の染色は、Dako Autostainer Link 48で、標準プロトコルを使用して、IMMのHistology and Comparative Pathology Laboratoryによって行なわれた。抗原熱検索は低pH溶液(pH 6)とDAKO PTリンク中で行なわれ、ENVISIONキット(ペルオキシダーゼ/DAB検出システム、DAKO、Santa Barbara、CA)でインキュベーションし、ついでHarriのヘマトキシリンカウンター染色(Bio Otica,Milan,IT)をした。負の対照では、主抗体が非存在だった;また、CD3染色は負の対照では観察されなかった。イメージはライカMC170 HD顕微鏡カメラに取り付けられたライカDM2500顕微鏡で得られた。
細胞は、LegendScreenキット(Biolegend)を使用して、抗−CD3−APC(cloneUCHT1)、抗TCRVδ1FITC、およびレセプターのパネルが染色された。
右欄は試薬の供給者またはメーカーを示す。
2つの独立した実験の代表的結果を示す。
(培養の終わりのVδ1+T細胞の絶対数)/(培養の0日目のVδ1+T細胞の絶対数)
2つの独立した実験の代表的結果を示す。
ヒトVδ1+TCRγδ+T細胞の生体外のエクスパンジョンの最適化
発明者は、生体外で培養されたVδ2−γδT細胞のエクスパンジョンと純度のレベルを改善することを目標とする一連の実験を行なった。TCRのVδ3+鎖に対して市販の抗体がなかったので、抗TCRVδ1 mAbは細胞サンプル中のVδ1+T細胞を同定するために培養最適化段階中に使用された。健康なドナーのパネルからのTCRγδ+T PBLsはMACSによって分離され、IL−2およびPHAでの生体外の刺激へのそれらの反応(つまり細胞活性化および増殖の検知できる変化)についてテストした。反応性のVδ1+ PBLsを持った1つのドナーは残りの最適化研究に血液サンプルを提供するために選ばれた。より信頼できる比較が異なる実験中で得られた結果間で行なわれることができるので、固定の健康なドナーに対する偏好は重要だった。選ばれたドナーは、末梢血中のTCRγδ+T細胞の正常な(しかし高い)割合(PBLsの合計の10%−12%)を持っていた。しかし、Vδ1+ PBLsの割合は非常に低かった(PBLsの合計の0.3%、または合計のTCRγδ+T PBLsの3.0%;図1)。彼は、培養されたVδ1+T細胞の最終の数および純度レベルでのすべての少しの改善が、流動細胞計測法によって容易に検知されることができるので、これらの実験の中で使用する適切なドナーと考えられた。
培地中のVδ1+T細胞の分離およびエクスパンジョンのための有効なプロトコルを確立して、我々は、多くの健康なドナーおよびさらに癌患者から集められた血液サンプルでテストしようと努力した。これは新しい培養方法の強健さおよび一般的な適用可能性をテストするのに必要だった。さらに、プラスチックプレートまたはフラスコの代わりに、臨床応用のために開発された閉じた、大規模のガス浸透性の細胞バッグ内で細胞は培養された。
多くの機能的なTCRγδ+T細胞を生成する方法を成功裡に開発して、我々はそれを「DOT細胞」と呼んだ。我々は次にそれらのホーミング(homing)および白血病治療活性を生体内で調査した。我々は、以前にその病気のいくつかの態様を再生すると示され、CART細胞を含む他の細胞療法の効能をテストするために使用されるヒトCLLの異種移植片モデルを利用した51,52。モデルは、CLL/SLL−由来 MEC−1 細胞の、Balb/c Rag−/−γc−/−(BRG)動物(それらはリンパ球をすべて欠き、したがって直ちにヒト細胞を拒絶しない)への養子免疫細胞移入に依存する。しかしながら、ヒト異種移植片の骨髄性のリネッジを媒介とした拒絶が依然幾分か生じる。この拒絶はSIRP−αをコード化する異なる対立遺伝子のため、使用されるマウス株によりその大きさが異なる53。宿主としてNOD−SCIDγc−/−(NSG)動物を使用して、我々は、トランスファーの後の遅い時間ポイントでTCRγδ+T細胞を特徴づけるためにモデルを適応させた。確かに、腫瘍を有するNSG宿主へのトランスファーに際して、我々は、トランスファーの30日後に、CD3+Vδ1+T細胞の強い富化と共に、分析されたすべての組織中でTCRγδ+T細胞を回収することができた(図12)。重要なことには、我々は、回収されたTCRγδ+T細胞のNKp30とNKG2Dの発現を発見し、これは安定して生体内で特性を保存することを実証する。BRG動物の中へのトランスファーに際して、我々はそのような遅い時間ポイントでTCRγδ+T細胞を回収することができなかった。しかし、我々はトランスファーの後に72時間後において肺および肝臓の両方の中でそれらを観察した(図12)。これらの実験は、NSG動物中のヒト異種移植細胞のよりよい適合性を確認する。また我々が増殖されたVδ2−γδT細胞の抗腫瘍特性を生体内でテストするために2つの異なるモデルを持つことを可能にする。
次のセクションは、先に記述された発明の使用で生成された追加データを開示する。ここに示されるデータは前の結果を確認し、前の観察に広げられ、主題についてのよりよい理解のためのサポート情報として使用されるべきである。
(図21)。
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Claims (63)
- サンプル内のVδ2−TCRγδ+T細胞を増殖する方法:
(1)インターロイキン4−様活性(interleukin-4-like activity)を有する少なくとも1つの成長因子、およびT細胞マイトージェンを含む第1の培地中のサンプル中の細胞を、インターロイキン15−様活性を有する成長因子の非存在下で培養すること;および
(2)インターロイキン4−様活性を有する成長因子の非存在下で、インターロイキン15−様活性を有する少なくとも1つの成長因子およびT細胞マイトージェンを含む第2の培地中で、ステップ(1)で得られた細胞を培養すること。 - インターロイキン4−様活性を有する成長因子がインターロイキン−4であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- インターロイキン15−様活性を有する成長因子が、インターロイキン15、インターロイキン−2またはインターロイキン−7であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
- インターロイキン−15−様活性を有する成長因子が、インターロイキン−15であることを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 第1または第2の培地、または両方の培地が、さらに第2の成長因子を含む、請求項1から4のいずれか1項記載の方法。
- 前記成長因子がインターフェロン−γまたはそのミメティック、または機能的な等価物であることを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 第1または第2の培地、または両方の培地が、さらに第2および第3の成長因子を含む、請求項1から4のいずれか1項記載の方法。
- 前記成長因子がインターフェロン−γ、インターロイキン−21、またはそれらのミメティック、または機能的な等価物であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 第1または第2の培地、または両方の培地が、さらに第2、第3および第4の成長因子を含む、請求項1から4のいずれか1項記載の方法。
- 前記成長因子がインターフェロン−γ、インターロイキン−21、インターロイキン−1β、またはそれらのミメティック、または機能的な等価物であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- 第1または第2の培地、または両方の培地、さらにVδ2−TCRγδ+T細胞の共刺激性分子を含む、請求項1から4のいずれか1項記載の方法。
- 共刺激性分子が、SLAMレセプターの分子リガンドまたはアゴニスト、またはCD27レセプターの分子リガンドまたはアゴニスト、またはCD7レセプターの分子リガンドまたはアゴニストのいずれかであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
- 第1および第2の培地が血清または血漿を含むことを特徴とする請求項1から12のいずれか1項記載の方法。
- ステップ(1)に先立って、サンプル中の細胞のT細胞が富化されることを特徴とする請求項1から13のいずれか1項記載の方法。
- ステップ(1)に先立って、サンプル中の細胞のTCRγδ+T細胞が富化されることを特徴とする請求項1から14のいずれか1項記載の方法。
- ステップ(1)に先立って、サンプル中の細胞がTCRαβ+T細胞を消耗させることを特徴とする請求項1から15のいずれか1項記載の方法。
- ステップ(1)に先立って、サンプル中の細胞がTCRαβ+T細胞を最初に消耗され、次にCD3+細胞が富化されることを特徴とする請求項1から16のいずれか1項記載の方法。
- ステップ(1)に先立って、サンプル中の細胞が非TCRγδ+T細胞を消耗されることを特徴とする請求項1から17のいずれか1項記載の方法。
- サンプルが血液または組織またはそのフラクションであることを特徴とする請求項1から18のいずれか1項記載の方法。
- サンプルが、末梢血、臍帯血、リンパ組織、上皮、胸腺、骨髄、ひ臓、肝臓、ガン組織、感染した組織、リンパ節組織またはそのフラクションから選ばれることを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 出発サンプルが人間の末梢血またはそのフラクションであることを特徴とする請求項19または20に記載の方法。
- サンプルが低密度単核細胞(LDMC)または末梢血単核細胞(PBMCs)から成ることを特徴とする請求項1から21のいずれか1項記載の方法。
- 第1の培地中に、T細胞マイトージェンが約10から約5000ナノグラム/mlの量で存在し、インターロイキン4−様活性を有する成長因子が約1から約1000ナノグラム/mlの量で存在する、請求項1から22のいずれか1項記載の方法。
- 第1の培地中に、T細胞マイトージェンが約20から約2000ナノグラム/mlの量で存在し、インターロイキン4−様活性を有する成長因子が約5から約500ナノグラム/mlの量で存在する、請求項23記載の方法。
- 第1の培地中に、T細胞マイトージェンが約50から約1000ナノグラム/mlの量で存在し、インターロイキン4−様活性を有する成長因子が約20から約200ナノグラム/mlの量で存在する、請求項24記載の方法。
- 第1の培地が、T細胞マイトージェンを70ナノグラム/ml含み、インターロイキン4−様活性を有する成長因子を100ナノグラム/ml含む、請求項25記載の方法。
- 第2の培地中に、T細胞マイトージェンが約0.1から約50μg/mlの量、およびインターロイキン15−様活性を有する成長因子が約1から約1000ナノグラム/mlの量で存在する、請求項1から22のいずれか1項記載の方法。
- 第2の培地中に、T細胞マイトージェンが約0.3から約10μg/mlの量、およびインターロイキン15−様活性を有する成長因子が約2から約500ナノグラム/mlの量で存在する、請求項27記載の方法。
- 第2の培地中に、T細胞マイトージェンが約0.5から約5μg/mlの量、およびインターロイキン15−様活性を有する成長因子が約20から約200ナノグラム/mlの量で存在する、請求項28記載の方法。
- 第2の培地が、T細胞マイトージェンを1μg/mlで含み、およびインターロイキン15−様活性を有する成長因子を70ナノグラム/mlの量で含む、請求項29記載の方法。
- 第1または第2の培地、または両方の培地中に、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子が約1から約1000ナノグラム/mlの量で存在し、インターロイキン−1β−様活性を有する成長因子およびインターロイキン−21−様活性を有する成長因子が1から約500ナノグラム/mlの量で存在する、請求項1から30のいずれか1項記載の方法。
- 第1または第2の培地、または両方の培地中に、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子が約2から約500ナノグラム/mlの量で存在し、インターロイキン−1β−様活性を有する成長因子およびインターロイキン−21−様活性を有する成長因子が2から約200ナノグラム/mlの量で存在する、請求項31記載の方法。
- 第1または第2の培地、または両方の培地中に、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子が約20から約200ナノグラム/mlの量で存在し、インターロイキン−1β−様活性を有する成長因子およびインターロイキン−21−様活性を有する成長因子が5から約100ナノグラム/mlの量で存在する、請求項32記載の方法。
- 第1または第2の培地、または両方の培地がさらに、インターフェロン−γ−様活性を有する成長因子を70ナノグラム/ml、インターロイキン−21−様活性を有する成長因子をが2から15ナノグラム/ml、インターロイキン−1β−様活性を有する成長因子を15ナノグラム/mlで含む、請求項33記載の方法。
- T細胞マイトージェンが抗体またはそのフラグメントであることを特徴とする請求項1から34のいずれか1項記載の方法。
- 抗体がCD3またはそのフラグメントに結合することを特徴とする請求項35に記載の方法。
- 血清または血漿が約2から約20積%の量で存在することを特徴とする請求項1から36のいずれか1項記載の方法。
- 血清または血漿が約0.5から約25体積%の量で存在することを特徴とする、請求項37記載の方法。
- 血清または血漿が約2.5から約10体積%の量で存在することを特徴とする、請求項38記載の方法。
- 血清または血漿が5体積%の量で存在することを特徴とする、請求項39記載の方法。
- 請求項1から30のいずれか1項記載の方法によって調製された、TCRγδ+T細胞が富化された細胞調製物。
- 細胞の合計の80%以上がTCRγδ+T細胞であることを特徴とするTCRγδ+T細胞が富化された細胞調製物。
- 細胞の合計の90%以上がTCRγδ+T細胞であることを特徴とする請求項41または42に記載の細胞調製物。
- 細胞の合計の95%以上がTCRγδ+T細胞であることを特徴とする請求項41から43のいずれか1項記載の細胞調製物。
- Vδ1+TCRγδ+T細胞およびVδ2+TCRγδ+T細胞の両方を含む、請求項41から44のいずれか1項記載の細胞調製物。
- 調製物中の合計のTCRγδ+T細胞に対して、約55−90%のVδ1+TCRγδ+T細胞および約1−10%のVδ2+TCRγδ+T細胞を含む、請求項45に記載の細胞調製物。
- 調製物中の合計のTCRγδ+T細胞に対して、約60−80%のVδ1+TCRγδ+T細胞および約1−5%のVδ2+TCRγδ+T細胞を含む、請求項45に記載の細胞調製物。
- 請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞の、免疫反応を調整するための医薬品の製造のための使用。
- 請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞の、感染を治療するための医薬品の製造のための使用。
- 請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞の、癌を治療するための医薬品の製造のための使用。
- 癌は慢性リンパ球性白血病であることを特徴とする請求項50に記載の使用。
- 請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞の、ワクチンの製造のための使用。
- 請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞の、抗原認識、活性化、信号伝達または機能を研究するための使用。
- 免疫反応を調整する方法において使用するために、請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞。
- 感染の治療方法において使用するために、請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞。
- 癌の治療方法において使用するために、請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞。
- 癌は慢性リンパ球性白血病であることを特徴とする請求項55に記載の使用のためのTCRγδ+T細胞。
- 動物に予防注射をする方法において使用するための、請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞。
- 請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞を、必要とする動物に有効量を投与することを含む、免疫反応を調整する方法。
- 請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞を、必要とする動物に有効量を投与することを含む、感染の治療方法。
- 請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞を、必要とする動物に有効量を投与することを含む、癌の治療方法。
- 癌は慢性リンパ球性白血病である、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、またT細胞およびB細胞白血病、リンパ腫(ホジキンのおよび非ホジキン)、リンパ増殖性障害、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、肉腫、健全な組織の癌、低酸素性の腫瘍、りん状細胞癌、尿生殖器の癌(頚部および膀胱癌)、造血器癌、頭頸部癌、また神経系癌である、請求項60に記載の方法。
- 請求項1から40のいずれか1項記載の方法によって調製されたか、請求項41から47のいずれか1項記載の細胞調製物から得られたTCRγδ+T細胞を、必要とする動物に有効量を投与することを含む、動物に予防注射をする方法。
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