KR102663157B1

KR102663157B1 - Ｔｃｒ감마 델타 양성 ｔ 세포의 생산 방법

Info

Publication number: KR102663157B1
Application number: KR1020187000741A
Authority: KR
Inventors: 디오고 안토니오 헤메시두 안주스; 다니엘 바르가스 코레이아; 아폰소 로차 마르틴스 드 알메이다
Original assignee: 감마델타 테라퓨틱스 엘티디
Priority date: 2015-06-09
Filing date: 2016-06-08
Publication date: 2024-05-13
Also published as: DK3307875T3; PL3307875T3; KR20180026726A; KR20240063197A; ES2908840T3; PT3307875T

Abstract

본 발명은 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포의 분리 및 선택적 생체 외 증식의 신규한 방법 및 그들의 임상 응용에 관한 것이다.

Description

TCR 감마 델타 양성 T 세포의 생산 방법

본 발명은 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포들의 격리 및 선택적 체외 증식 및 이들의 임상적용에 대한 새로운 방법에 관한 것이다.

TCRγδ ⁺ T 세포 ( TCR 감마 델타 양성 T 세포)

유악류 척추 동물의 면역 체계는 암 면역요법의 기초가 되는 종양 세포를 인식하고 제거할 수 있는 다양한 림프구 집단(lymphocyte populations)을 포함한다. 한 집단은 감마(γ) 사슬과 델타(δ) 사슬의 접합부(junction)에 의해 형성된 T 세포 수용체(TCR)의 발현을 특징으로 한다. TCRγδ⁺ T 세포 (여기서는 "γδ T 세포"로도 지칭됨)는 인간의 말초혈액 림프구(PBL)의 1 내지 10 %를 차지하지만 건강한 사람의 상피 조직(epithelial tissues)에서 실질적으로 농축되게 되며, 이들은 T 세포의 50 %까지 차지한다 ^<1>. TCRγδ⁺ T 세포는 건강한 세포 및 조직은 남기는 반면, 악성 및 감염 세포에 대해 강력한 주요 조직적합성 복합체-비제한 세포독성(Major Histocompatibility Complex-unrestricted cytotoxicity)을 갖는다. 따라서 흔히 감염 및 종양에 대한 1차 감시(first-line surveillance) 메커니즘으로 여겨진다 ^<1>.

인체에서, TCRγδ⁺ T 세포의 상이한 아형(subset) 또는 아군(subpopulations)이 그들의 δ 사슬(δ chain)을 인코딩하는 유전자(genes)에 기초하여 확인되고 분류된다. 말초혈액(peripheral blood) 내 TCRγδ⁺ T 세포의 약 60-95 %는 Vγ9 사슬과 결합하여 Vδ2 사슬을 발현하지만, 나머지 TCRγδ⁺ T 세포의 대부분은 다양한 Vγ 요소들(Vγ2, Vγ3, Vγ4, Vγ5, Vγ8)와 결합하여 Vδ1 사슬을 발현한다. 다른 (희소한) 인간 TCRγδ⁺ T 세포 집단은 Vδ3, Vδ5, Vδ6, Vδ7 및 Vδ8 사슬을 발현한다 ^<2-4>.

Vδ2 ⁺ TCRγδ ⁺ T 세포

TCRγδ⁺ T 세포에 기초한 현재의 입양면역요법(adoptive immunotherapy approaches)은 Vδ2⁺ TCRγδ⁺ T 세포 아군(subpopulation) (여기서는 Vδ2⁺ T 세포로도 지칭됨)으로 제한된다 ^<5,6>. 대부분의 Vδ2⁺ T 세포는 이소펜테닐 피로포스페이트 (isopentenyl pyrophosphate, IPP)와 같은 비 펩타이드 알킬 포스페이트(nonpeptide alkylphosphates)에 특이적으로 반응하며, 이는 종양세포 및 졸레드로네이트(zoledronate) 및 파이드로네이트(pamidronate)와 같은 뼈 강화 아미노비스포스포네이트(aminobisphosphonates)에 노출된 개인들에서 비정상적인 수준으로 생성된다. 이들 화합물은 인터루킨-2와 결합할 때 시험관 내(in vitro)에서 Vδ2⁺ T 세포의 증식 및 항종양 세포독성 기능(anti-tumour cytotoxic function)을 자극하고, 임상 적용을 위한 정제된 세포집단(cell populations)을 생성한다 ^<5-7>. 그러나 지금까지 완료된 임상시험에서 암 환자의 객관적 반응(objective response)은 적은 비율로 나타났다 ^<8>. 따라서, 현재의 γδ T 세포 기반 치료(cell-based treatments)는 유용하고 안전하기는 하지만 명백한 한계를 갖고 있다 ^<6>.

Vδ1 ⁺ TCRγδ ⁺ T 세포

인간의 Vδ1⁺ TCRγδ⁺ T 세포 (여기서는 Vδ1⁺ T 세포로 또한 지칭됨)는 모든 TCRγδ⁺ PBLs의 1-40 %를 구성하지만, 내장(intestine)과 피부(skin) 같은 상피 부위(epithelial sites)에서는 주요 γδ T 세포 집단이다. 임상시험에서 한번도 평가된 적은 없지만, 이 세포 아형(subset)은 강력한 항암활동(antitumor activity)을 나타낼 수 있다. 피부, 결장, 신장 및 폐 종양에 침투하는 Vδ1⁺ T 세포는 자가(autologous) 및 동종(allogeneic) 암 세포 모두에 대해 세포독성을 나타내었다 ^<9-13>. 급성 림프성 백혈병 (Acute lymphoblastic leukemia, ALL)에 대해 골수 이식 후 공여자-유래(donor-derived) 말초혈액(peripheral blood) Vδ1⁺ T 세포의 증가와 5-10년 무병(disease-free) 생존율의 개선 간에 흥미로운 상관관계가 발견되었다 ^<14>. 중요하게도, 주입된 Vδ1⁺ T 세포는 수년 동안 이러한 환자들에서 지속되었다(persist) ^<14,15>. 또 다른 상황(setting)에서, Vδ1⁺ T 세포수가 높은 저등급(low-grade) 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma) 환자는, Vδ1⁺ T 세포수가 낮은 환자와 비교했을 때, 1년 간의 추적 조사에서 향상된 임상경과(clinical course)를 경험하였다 ^<16>.

순환성(Circulating) Vδ1⁺ T 세포는 보통 만성 림프구성 백혈병(CLL) 환자^<17>에서 증가하며 저위험 B-CLL 환자의 비진행성(non-progression)과 관련되어 있다 ^<18>. 최종적인 순환성 Vδ1⁺ T 세포의 양적 증가는 신장 이식(renal transplantation) 후 휴먼 사이토메갈로 바이러스 (Human cytomegalovirus, HCMV) 감염뿐만 아니라 인간 면역결핍 바이러스(Human immunodeficiency virus, HIV)^<19> 및 말라리아^<20> 감염에서도 관찰되었다 ^<4,21>. 그러나, 다른 환경들에서 Vδ1⁺ T 세포의 아군(subpopulation)은 면역 억제성 및 조절 성질을 나타낼 수 있으며, 이는 치료 목적으로도 활용될 수 있는 기능이다. 시험관 내(in vitro)에서 Vδ1⁺ T 세포를 특이적으로 증식시키는 소수의 방법이 기술되었지만, 이들 중 어느 것도 임상에 적용될 수 없었다 (Siegers, G. et al., 2014, ref. <22>). Meeh 등은 먼저 건강한 공여자/도너(donor)로부터의 Vδ1⁺ T 세포가 ALL 백혈병 발작(leukemic blasts)에 반응하여 생체 내에서 증식(expand)할 수 있다는 것을 보여 주었다 ^<23>.

Knight, A. 및 그의 동료와 Merims, S. 및 그의 동료들은 말초혈액 Vδ1⁺ T 세포를 분리하고, 파이토헤마글루티닌(Phytohemagglutinin, PHA) 또는 항-CD3 단클론 항체(monoclonal antibody) (mAb) IL-2 및 방사선 조사된(irradiated) 동종 말초혈액 단핵세포(allogeneic peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)의 존재 하에 이 세포들을 처치했다. 그리고 동종 말초혈액 단핵세포(PBMCs)를 3 주간 방사능 처리하였다^<24,25> 최근의 연구에서, PHA는 인터루킨-7 (IL-7)과 함께 사용되었다 ^<26>. Siegers, G. 등은 분류된(sorted) TCRγδ⁺ T 세포를 콘카나발린-A (concanavalin-A, ConA) IL-2 및 IL-4로 6-8일 동안 먼저 처리하고, 이후 10일 동안 IL-2와 IL-4을 이용한 자극(stimulation)으로 처리하였다는 2단계 배양 프로토콜(two-step culture protocol)을 보고한 바 있다. 배양 기간 경과 후, Vδ1⁺ T 세포는 배양물(cultures)의 59 %로 증식되고, 배양물의 절반에서 지배적인 아형(Vδ1⁺ T 세포의 평균 70%)이었다; 그러나, 이 방법으로 최대 25 배의 Vδ1⁺ T 세포 증식을 얻을 수 있었다 ^<27>. 이 2단계 배양 방법은 또한 국제특허 출원번호 PCT/CA99/01024 (WO 00/26347 호로 공개됨)에 기재되어 있다.

이들 발명자들에 따르면, 미토겐(mitogen) 제거 후 계속되는 세포 증식(cell proliferation)을 위해서는 제2 배양 배지(the second culture medium)에서 IL-2 및 IL-4가 모두 필수적이었다. 이후 변형된 프로토콜이 개발되었는데, 이에 다르면, ConA, IL-2 및 IL-4의 존재 하에 6-13일 동안 총 PBMC를 우선 배양한 후, 이후 10일 동안 오염된 TCRαβ+ T 세포의 자기 고갈(magnetic depletion) 및 IL-2, IL-4 및 ConA을 갖는 나머지 세포들에 대한 자극(stimulation)이 수행되었다. 21일 후에, 대부분의 오염 세포(약 55%의 세포)가 Vδ2⁺ T 세포인 반면, 훨씬 낮은 순도임에도 불구하고 (배양된 세포의 30% 미만이 Vδ1⁺ T 세포), Vδ1⁺ T 세포가 136에서 24,384배 정도로 증식되었다 ^<28>.

마지막으로, 우리 그룹은 이미 백혈병 세포 라인(leukemia cell lines) 및 CLL 환자 종양 세포(neoplastic cells)를 보다 효과적으로 제거할 수 있는 천연세포독성수용체 (Natural cytotoxicity receptors, NCRs)를 발현하는 Vδ1⁺ T 세포가 농축된 세포 집단을 선택적으로 증식 및 분화시키는 방법을 기술한 바 있다 ^<29>. 이 특허된 방법은 일반적인 γ-사슬 사이토킨(cytokines, IL-2 또는 IL-15와 같은) 및 TCR 작용제(TCR agonists, 예: PHA 또는 anti-CD3 mAb)로 자극시 배양 배지에서 TCRγδ⁺ T 세포 또는 그 전구체(precursors)를 2-3주간 배양하는 것으로 구성된다 (WO 2012/156958로 공개된 국제특허 출원번호 PCT/IB2012/052545). 이 방법의 한가지 중요한 한계점은 얻은 세포의 수가 적어 임상적용(clinical applications)에 적합하지 않다는 것이다.

기타 인간 TCRγδ ⁺ T 세포 아형들

인간의 비-Vδ1⁺(non-Vδ1⁺) 및 비-Vδ2⁺(non-Vδ2⁺) TCRγδ⁺ T 세포의 대다수(majority)는 Vδ3 TCR 사슬(chain)을 발현(express)한다. 인간 TCRγδ⁺ Vδ3⁺ T 세포는 순환하는(circulating) T 세포의 약 ~0.2%를 차지하지만^<30> CMV 활성(CMV activation) ^<4,21>을 가진 신장(renal) 및 줄기세포(stem cell) 이식 환자의 말초혈액에서, HIV 감염^<31> 또는 B-CLL를 가진 환자^<17>, 및 건강한 간에 농축되어(enriched) 있다 ^<32>. 활성화된 TCRγδ⁺ Vδ3⁺ T 세포는 시험관 내(in vitro)에서 CD1d⁺ 세포들 및 상피 종양(epithelial tumors)을 제거할 수 있었다 ^<4>. 그러나, 이용 가능한 세포 배양 방법들로는 임상 적용을 위한 대량의 TCRγδ⁺ Vδ3⁺ T 세포를 생산할 수 없다.

TCRγδ ⁺ T 세포가 농축된 군들(populations)을 위한 다른 방법들

시험관 내에서 TCRγδ⁺ T 세포 집단의 몇몇 아형의 동시 증식을 위해 여러 방법이 사용되어 왔다. 총 PBMC들을 플레이트 한정(plate-bound) 항-TCRγδ mAb와 IL-2로 3주 동안 처리하여 TCRγδ⁺ T 세포의 약 90%를 얻었으며 그 중 대부분은 Vδ2⁺ T 세포였고 Vδ1⁺ T 세포도 적은 비율로 있었다 ^<33>. Lopez 등은 IL-2의 존재 하에 고용량(high dose) 인터페론-γ (IFN-γ), IL-12, 항-CD2 mAb 및 가용성(soluble) 항-CD3 mAb로 세포를 처리함으로써 세포자멸사 방지(apoptosis-resistant) TCRγδ⁺ T 세포를 생성시켰다. Vδ2⁺ T 세포가 세포 증식 후 우세한 아형이었다 ^<34>. 보다 최근에, CD19, CD64, CD86, CD137L 및 멤브레인 결합(membrane bound) IL-15를 공동 발현하도록 유전적으로 변형된 종양 기원의 γ-방사(γ-irradiated) 인공 항원 보유 세포 (aAPC)의 존재 하에 다클론성(polyclonal)의 TCRγδ⁺ T 세포를 증식시켰다 ^<3,35>. 용해성 IL-2 및 IL-21의 존재 하에서 세포를 추가로 배양하였다.

체외(in vitro)에서 Vδ2 ^- TCRγδ ⁺ T 세포를 증식시키는 개선된 방법의 필요성

최근의 연구에 따르면 Vδ1 사슬을 갖는 TCRγδ⁺ T 세포 및 Vδ1 또는 Vδ2 사슬 어느 것도 갖지 않는 TCRγδ⁺ T 세포는 입양면역요법(adoptive immunotherapy)에서 보다 효과적인 항암 이펙터들(anticancer effectors)을 갖는 특성을 보였다 ^<36>. Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포 (여기서는 Vδ2^- γδ T 세포로도 지칭됨)는 시험관 내(in vitro) 및 생체(in vivo)에서 Vδ2⁺ T 세포보다 높은 항종양(anti-tumor) 세포독성 및 증가된 생존 능력을 나타냈다 ^{<26, 29 37>}. 결과적으로, Vδ2^- γδ T 세포가 농축된(enriched) 의약품은 보다 강력한 항종양 효과를 발생시키고 환자에게 개선된 치료 효과를 제공할 것으로 기대된다. 지난 5년간 여러가지 방법으로 시험관에서 상당한 양의 종양표적화(tumor-targeting) Vδ2^- γδ T 세포를 생성할 수 있었지만, 핵심 미해결 문제로 인해 여전히 이들 세포의 임상 적용이 배제되었다는 것이다: 1) 제조공정에서의 안전하지 않은 시약 및 물질(reagents and materials)의 사용; 2) 최종 세포 생성물, 특히 상이한 공여자로부터 얻은 세포 생성물(cell products) 또는 암 환자로부터 얻은 최종 세포 생성물의 조성(composition)의 높은 레벨의 편차(variation); 및/또는 3) 최종 생성물의 낮은 항종양 활동 ^{<22,27,28,38>}.

당 업계에는 시험관 내에서 대량의 실질적으로 순수한 Vδ2^- γδ T 세포(즉, 이들 세포를 90% 이상 포함하는)를 시험관(in vitro), 체외(ex vivo)에서 꾸준하게 생성할 수 있고, 각기 다른 공여자들, 특히 암 환자들에 대해 유사한 효능을 가지도록 하는 신뢰할 만한 임상 레벨의 세포 배양 방법이 필요하다.

주입된 Vδ2⁺ T 세포에 대한 이전의 임상 데이터는, 질병을 치료하기 위한TCRγδ⁺ T 세포의 임상적 투여량이 적어도 약 1 x 10⁹개의 생세포(live cells)라고 제안한다 ^<39>. 결과적으로, 임상 적용을 위해서는 Vδ2^- γδ T 세포를 생성하는 것을 목표로 하는 방법은 시험관 내에서 이들 세포를 적어도 1,000배 증식시킬 수 있어야 한다. 그러나 Vδ2^- γδ T 세포는 인산알킬(alkylphosphoates)에 반응하지 않으며, 그들이 인식하는 항원에 대한 매우 제한된 지식으로 인해 시험관(in vitro)에서의 그들의 증식을 제한한다. PHA와 Con-A와 같은 식물 렉틴(plant lectin)은 전임상 규모(preclinical scale)로 시험관 내에서 이들 세포를 증식시키고 (매우 높은 순도 레벨로) 농축하게(enrich) 하는 데 사용되어 왔다. 따라서, 아직 알려지지 않은 이유들로 인해, 이들 공통 미토겐은 Vδ2^- γδ T 세포에 현저한 선택성이 있으며, 배양물에서 이들의 증식을 촉진하고, 오염된 Vδ2⁺ T 세포의 성장을 억제 (또는 아폽토시스를 유도)한다 ^<27,29>. 그럼에도 불구하고, 식물 렉틴은 사람에게 부주의하게 주입되면 독성을 나타낼 수 있으며 안전 문제로 인해 규제 당국은 임상 용도로의 사용을 권장하지 않는다.

더욱이, 우리의 데이터에 따르면, 식물 렉틴은 시험관 내에서 Vδ2^- γδ T 세포의 증식을 유도하여 세포수를 줄이는 데 단일클론(monoclonal) 항체만큼 효율적이지 못하다. 몇몇 그룹들은 PHA 대신에 항-CD3(anti-CD3) 단일클론 항체의 존재 하에 TCRγδ⁺ T 세포를 배양하였다. 그러나, 항-CD3 mAb는 오염된 CD3⁺ TCRαβ⁺ T 세포 및 CD3⁺ Vδ2⁺ T 세포에서도 발현되는 CD3 분자와 결합하여 최종 세포 생성물의 순도 수준을 저하시킨다. 결과적으로, Vδ2^- γδ T 세포는 항-CD3 mAb로 자극하기 전에 자성활성화 세포분류 (Magnetic-activated cell sorting, MACS) 또는 형광활성화 세포분류 (Fluorescence-activated cell sorting, FACS) 방법에 의해 분리되어야 한다 ^<25,40>. 문제를 더 복잡하게 하는 것은, 전체 TCRγδ⁺ T 세포, TCRγδ⁺ Vδ1⁺ T 세포 및 TCRγδ⁺ Vγ3⁺ T 세포를 각각 분리시키는 데 사용되는 항-TCRγδ mAb, 항-TCRVδ1 mAb 및 항-TCRVδ3 mAb와 같은 시약은 현재 임상 용도로 (규제 기관에 의해) 제조되거나 승인되지 않았다.

따라서, 사람에게 직접 적용하기에 적합한 충분한 수의 정제된 Vδ2^- γδ T 세포를 생성할 수 없었다 ^<22>. 정제된 Vδ2^- γδT 세포 집단의 생산을 위해 식물 렉틴 및 다른 안전하지 않은 시약에 의존하지 않는 방법이 당 업계에 필요하다.

이전 연구에서, Deniger 등은 γ 및 δTCR 사슬들의 폴리클로날 레파토리(polyclonal repertoire)를 발현하는 다수의 TCRγδ⁺ T 세포를 증식시키기 위해 종양유도 인공항원 발현세포 (tumor-derived artificial Antigen Presenting Cells, aAPC)를 개발하였다 ^<37>. 그러나 저자들에 의해 지적된 바와 같이^<41>, 이 방법은 TCRγδ⁺ T 세포의 임상 적용과 관련된 중대한 문제를 해결할 수 없었다. 예를 들어, 동일한 시약 제품을 다른 시약과 암환자로부터 얻을 수 있다고 가정할 때, 대부분의 성분은 현재 GMP 품질로 생산되지 않으며 추가 개발은 제조사의 미래 관심, 복잡한 규제 승인에 따라 달라진다. 더욱이, 생성된 세포 생성물의 정확한 조성(composition) (및 변이성(variability))에 관한 주요 세부 사항이 본 연구에서 누락되어 있어 이 방법의 적용 가능성을 저해한다.

인터루킨-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15는 TCRδβ⁺ T 및 Vδ2⁺ T 세포를 비롯한 다중 면역 세포에 강한 자극 효과를 갖는 다면발현성(pleiotropic) 분자이다. 결과적으로, 이러한 시약은 시험관 내에서 Vδ2^- γδ T 세포를 증식시키는 데 적합하지 않다. 왜냐하면 오염 세포(contaminating cells) 역시 배양에서 증식하여 세포 순도를 떨어뜨리기 때문이다. 더욱이, 이들 전염증성(pro-inflammatory) 사이토킨과 γδTCR 작용제(agonists)와의 전형적인 조합은 종종 자극된 세포에 대한 활성화 유도 세포사멸 (Activation-induced-cell-death, AICD)을 유도할 뿐 아니라, 적은 수의 세포만을 수득하게 한다. 매우 불순한 최초 시료로부터 Vδ2^- γδ T 세포를 증식시키기 위해 보다 선택적인 시약에 의존할 수 있는 방법이 당 업계에 필요하다.

IL-2와 IL-4의 조합은 시험관 내에서 Vδ1⁺ T 세포를 증식시키는 데 부분적으로 성공했고 또 사용되어 왔다. 그러나, 우리는 배양 배지에서 IL-4의 존재가 Vδ2- γδ T 세포에서 NK(natural killer) 활성화 수용체 (NKG2D 및 NCR과 같은)를 강하게 하향 조절(downregulation)하여 항종양 반응을 약화시킨다는 것을 발견했다 (표 3). Vδ2^- γδ T 세포에 대한 IL-4의 억제 효과(inhibitory effect)는 IL-2가 존재할 때에도 발생하였다. 같은 맥락에서, IL-4와 항-TCRVδ1 mAb로 처리한 배양된 Vδ1⁺ T 세포가 Vδ2⁺T 세포에 비해 현저히 적은 IFN-γ와 많은 IL-10을 분비한다는 것이 Mao, Y. 및 동료들의 독립적인 연구에 의해 최근 입증되었다. 더욱이, IL-4 처리된 Vδ1⁺ T 세포는 NKG2D 수준이 낮았으며, 이는 IL-4가 TCRγ⁺ T 세포 매개 항종양 면역 반응을 약화시킨다는 것을 나타낸다 ^<42>. 인터루킨-17 (참고 문헌 ^<43,44>)을 생산하는 Vδ1⁺ T 세포의 종양 촉진 효과에 대한 최근의 발견과 함께, 이들 관찰은 그들의 적용에 대한 우려를 제기하고, 입양세포치료법(adoptive cell therapy)으로 고려될 수 있는 이펙터 Vδ1⁺ 림프구의 상세한 특성 규명의 필요성을 강조했다. IL-4의 면역 억제 내지는 방해 효과 없이 시험관 내에서 Vδ2- γδ T 세포를 증식시킬 수 있는 방법에 대한 필요성이 명백하게 존재한다.

마지막으로, 체외(ex vivo)에서 Vδ2^- γδ T 세포를 증식시키는 것을 목표로 하는 몇몇 공표된 방법은 대개 바이러스 감염(virus-infected) 또는 형질전환 세포 또는 세포주(transformed cells or cell lines), 박테리아 및 기생충의 형태인 천연 또는 인공 피더세포(feeder cell)의 존재를 필요로 한다. 이러한 배양 방법은 더 복잡하고, 미생물에 오염되기 쉽고 임상 용도에는 적합하지 않다.

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본 발명은 피더 세포 또는 미생물 또는 바이러스 성분을 사용하지 않고도 시험관 내에서 인간 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포를 증식 및 분화시키는 신규한 방법을 제공하려는 것이다.

피더 세포 또는 미생물 또는 바이러스 성분을 사용하지 않고도 시험관 내에서 인간 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포를 증식 및 분화시키는 본 발명의 신규한 방법을 제공하기 위하여 우선, 본 발명자들은 배양된 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포의 증식 및 순도를 개선시키는 것을 목표로 하였다. T 세포 미토겐과 IL-4의 존재 하에서, 그리고 IL-2, IL-7 및 IL-15의 부재 하에, 배양물에서 이들 세포를 증식시키는 신규하고, 보다 효율적이며, 선택적인 방법이 개발되었다. 마지막으로, 얻어진 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포는 추가적인 시험관 내 최적화 과정을 통해 더 많은 세포 독성 표현형으로 분화되었다. IL-4를 제거하고 T 세포 미토겐 및 IL-15, IL-2 또는 IL-7을 배양 배지에 첨가한 후, 이전에 수득된 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포는 염증 유발성 사이토킨을 생산하고, 높은 수준의 자연 살해 수용체(Natural Killer receptors, NKR)의 활성화를 발현하였으며, 이는 시험관 내의 종양세포 억제를 조정했다. 중요한 것은, 쥐에 주입하였을 때, 분화된 TCRγδ⁺ T 세포들은 세포 독성 표현형을 유지하였고 체내에서 종양 성장을 억제하였다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 시료로부터 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포를 증식 및 분화시키는 방법을 제공하며, 다음을 포함한다.

(1) 인터루킨-15-유사 활성을 갖는 성장인자의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 인터루킨-4-유사 활성을 갖는 하나 이상의 성장인자를 포함하는 제1 배양 배지에서 시료 중의 세포를 배양하는 과정; 및

(2) 인터루킨-4-유사 활성을 갖는 성장인자의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 인터루킨-15-유사 활성을 갖는 하나 이상의 성장인자를 포함하는 제2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포를 배양하는 과정.

바람직하게는, 본 발명은 시료에서 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포를 증식 및 분화시키는 방법을 제공하며, 다음을 포함한다.

(1) 인터루킨-15, 인터루킨-2 및 인터루킨-7의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 인터루킨-4를 포함하는 제1 배양 배지에서 시료 중의 세포를 배양하는 과정; 및

(2) 인터루킨-4의 부재 하에, T 미토겐 및 인터루킨-15를 포함하는 제 2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포를 배양하는 과정.

새로이 얻어진 방법(본 명세서에서 상세하게 설명됨)은 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포의 이전에 확인되지 않은 생물학적 특성에 기초하고, 다른 곳에서 기술된 적이 없다.

여기에 설명된 세포배양 방법은 매우 견고하고 재현성이 뛰어나고 대규모 임상 응용 분야에 완전히 적용된다. 암의 입양면역요법 및 다양한 실험적, 치료적 및 상업적 용도로 사용하기 위해 충분한 수의 분화된 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포를 생성한다.

도 1은 건강한 공여자로부터 수집된 말초혈액 시료에서 자기활성화세포분류 (MACS) 전후의 TCRγδ⁺ T PBLs의 백분율을 나타낸다.
도 2는 2단계(two-steps) MACS 분류 절차 전후에 사전에 선택된 건강한 공여자로부터 수집한 말초혈액 시료에서 TCRγδ⁺ T PBLs의 백분율을 나타낸다.
도 3은 시험된 배양 조건의 개요를 보여준다.
도 4는 15일간의 시험관 배양 전후의 Vδ1⁺ T PBLs의 백분율을 보여준다.
도 5는 시험된 세포 배양 배지의 패널을 도시한다.
도 6은 Vδ1⁺ T 세포들이 시험관 내에서 증식되어 배양에서 지배적인 세포 아형이 됨을 보여준다.
도 7은 시험관 내에서 증식된 Vδ1⁺ T 세포들에서 여러 세포 표면 마커(cell surface markers)의 발현을 보여준다.
도 8은 시험관 내 확대된 TCRγδ⁺ T 세포들이 CLL 세포에 대해 세포독성이지만 자가 PBMC에 대해서는 세포독성이 없음을 보여준다.
도 9는 활성화된 TCRγδ⁺ T 세포가 고농도의 IFN-γ를 생성한다는 것을 보여준다.
도 10은 CLL/SLL 환자의 TCRγδ⁺ T 세포가 시험관 내에서 견고하게 증식하고 CLL/SLL 세포 및 CMV-감염 세포들에 대해 고도의 세포독성을 갖는다는 것을 보여준다.
도 11은 시험관 내 증식된 TCRγδ⁺ T 세포들이 다양한 기원(tissue origin)의 암세포에 대해 세포독성을 갖는다는 것을 보여준다.
도 12는 주입된 TCRγδ⁺ T 세포들이 자리잡고(home) 이종 이식종양 모델(xenograft tumor model)에서 생존하는 것을 보여준다.
도 13은 TCRγδ⁺ T 세포들이 생체 내(in vivo)에서 종양 성장을 제한할 수 있다는 것을 보여준다.
도 14는 TCRγδ⁺ T 세포가 CLL 종양의 전이(spread)를 제한한다는 것을 보여준다.
도 15는 TCRγδ⁺ T 세포가 원발 종양(primary tumour)에 침투하여 생체 내에서 활성화될 수 있음을 보여준다.
도 16은 혈액 시료의 생화학적 분석을 나타낸다.
도 17은 2단계 MACS 분류 후의 TCRγδ⁺ PBLs 농축을 나타낸다.
도 18은 얻어진 Vδ1⁺ T 세포들의 활성화 및 성숙 표현형(maturation phenotype)의 특성을 보여준다.
도 19는 백혈병 (그러나 건강하지 않은) 세포에 대한 TCRγδ⁺ T 세포의 TCR/NCR-의존성 세포독성을 나타낸다.
도 20은 시험관 내 확대된 Vδ1⁺ 및 Vδ1^- Vδ2^- T 세포들에서 세포 표면 NK 수용체를 활성화시키는 발현을 나타낸다.
도 21은 백혈병 세포에 대한 TCRγδ⁺ T 세포들의 증식된 Vδ1^- Vδ2^- T 세포들의 아형의 세포독성을 나타낸다.

본 발명은 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포들의 분리 및 시험관내/체외(in vitro/ex vivo) 증식 및 분화(differentiatation)를 위한 신규한 방법 및 이들의 임상 적용에 관한 것이다. 본 발명자들은 배양물에서 말초혈액 Vδ1^- TCRγδ⁺ T 세포들을 증식 및 분화 (2-3주 이상)할 수 있는 능력에 대해 임상 등급(clinical-grade) 작용제 항체(agonist antibodies) 및 사이토킨(cytokines)의 여러 조합을 시험하였다. 피더 세포(feeder cells) 및 미생물 기원(microbial origin) 분자가 없는 배양에서 TCRγδ⁺ T 세포를 분리하고 증식시켰다. 본 발명자들은 Vδ1^- TCRγδ⁺ T 세포 (여기서는 Vδ1^- γδ⁺ T 세포로도 지칭됨)가 인터루킨 (interleukin)-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15의 부재 하에 T 세포 미토겐(mitogen) 및 인터루킨-4를 포함하는 제1 배양 배지에서 이들 세포를 배양함으로써, 그리고 인터루킨-4의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 인터루킨-15, 인터루킨-2 또는 인터루킨-7을 함유하는 제2 배양 배지에서 계대배양(sub-culturing)함으로써, 시험관 내에서 선택적으로 증식될 수 있음을 보였다.

인터페론-γ, 인터루킨-21 및 인터루킨-1β와 같은 다른 주요 성장인자도 배양된 Vδ2^- γδ T 세포들의 증식 및 순도를 더욱 증가시키기 위해 하나 또는 둘 모두의 배양 배지에 첨가하였다.

첫번째 배지(culture medium)는 Vδ2^- γδ T 세포의 선택적 생존 및 증식을 지원했다 (14일 동안 Vδ1⁺ T 세포들의 8,000 배 증가; 표 3). 중요하게는, 배양 첫날 동안 인터루킨-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15가 부재함으로써, 생존을 위해 이 사이토킨들에 의지하는 오염 세포의(TCR αβ⁺ T 및 Vδ2⁺ T 세포를 포함하는) 기아(starvation) 및 세포 사멸(apoptosis)에 기여하였다.

마지막으로, 제2 배양 배지에서의 IL-2, IL-7 또는 IL-15의 존재 및 IL-4의 부재는, 사전에 선택된 Vδ2^- γδ T 세포 집단의 분화(differentiation)를 허용하였고, 이는 시험관 내에서 수천 배 증식되고, 배양 21일 후에 전체 세포의 90 % 이상에 도달했다 (표 3 및 표 7). 이 두번째 배양 과정은 항종양(anti-tumor) 또는 항바이러스(anti-viral) 치료제로 사용하기에 보다 적절한 표현형(phenotype)으로 세포의 생리적 특성을 변화시키는 데 필요하다. 두번째 배양 과정 후에 얻은 증식 및 분화된 Vδ2^- γδ T PBLs는, 건강한 세포는 표적화하지 않은 채, 시험관 내에서 종양세포 표적화를 중재하기(mediate) 위해 T 세포 수용체와 상승 작용을 하는(synchronized with) NKp30 및 NKp44를 포함한 자연살상 수용체(Natural killer receptors, NKR)에 대해 고도의 활성화(high levels of activating) 발현을 했다. 처치되지 않은(non-treated) 동물과 비교하여 종양을 보유한 면역결핍 쥐에서 증식되고 분화된 Vδ2^- γδ T PBLs 세포의 주입은 종양 성장을 억제하고 다수의 기관으로의 종양 전파를 제한하였다. 생화학적 및 조직학적 분석에서 치료와 관련하여 독성의 증거는 발견되지 않았다.

중요하게도, 증식되고 분화된 Vδ2^- γδ T PBL 세포들은 건강한 공여자 및 백혈병 환자의 혈액 시료와 유사한 효능으로 얻어졌다는 것이다. 마지막으로, 본 발명은 산업 및 임상 적용 분야와 완전히 호환되는 물질 및 시약을 사용하여 세포를 분리하고 배양하는 방법을 개시한다. TCRγδ⁺ T 세포들은 임상등급 세포선별기 (CliniMACS; Miltenyi Biotec, GmbH, Germany)에서 사용하기에 적합한 2단계 프로토콜을 이용하여 먼저 분류하였다. 그런 다음 세포를 무혈청(serum-free) 세포 배양 배지에서 최소의 조작을 가해 배양하였다. 밀봉된 대규모의 가스 투과성(gas-permeable) 플라스틱 세포 배양 백을 개방 배양 플레이트 또는 플라스크 대신 세포 배양을 위한 수용주(recipients)로 사용했다. 사용된 모든 시약 및 재료(또는 동등한 시약 및 재료)는 현재 가용하고 제조되고 있는 임상등급 수준 또는 동물-유래 성분이 없는 GMP (Good Manufacturing Practice) 품질로 제조된다. 따라서, 이 방법으로 생산된 세포는 다양한 실험적, 치료적 및 상업적 용도로 사용될 수 있다.

제1 측면에서, 본 발명은 TCRγδ⁺ T 세포들 또는 이들의 전구체(precursors)를 함유하는 시료로부터 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포를 증식 및 분화시키는 방법을 제공하며, 다음을 포함한다.

(1) 인터루킨-15-유사 활성을 갖는 성장인자(growth factor)의 부재 하에, T 세포 미토겐과, 인터루킨-4-유사 활성을 갖는 하나 이상의 성장인자를 포함하는 제1 배양 배지에서 세포를 배양하는 과정; 및

(2) 인터루킨-4-유사 활성을 갖는 성장인자(growth factor)의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 인터루킨-15-유사 활성을 갖는 하나 이상의 성장인자를 포함하는 제2 배양 배지에서, (1) 과정에서 수득한 세포를 배양하는 과정.

본 발명의 제1 측면에 따른 방법은 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포의 세포 집단(cell populations)을 증식시킨다. "증식된(expanded)"의 의미는 최종 제제(final preparation)에서 원하는 또는 목표 세포 유형의 수가 초기 또는 초기 세포 집단의 수보다 많음을 의미한다.

용어 "T 세포 미토겐"은 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin, PHA) 및 콘카나발린 A (concanavalin A, ConA)와 같은 식물 렉틴(plant lectins), 비식물성 기원의 렉틴(lectins of non-plant origin), T 세포를 활성화할 수 있는 항체 및 모든 약제, 및 다른 비렉틴/비항체 물질들로서 TCR 시그널링을 통해 T 세포들을 자극할 수 있는 모든 약제를 일컫는다. 바람직한 항체 클론(antibody clones)은 OKT-3 및 UCHT-1 클론과 같은 항-CD3 항체, B1 및 IMMU510과 같은 항-TCRγδ 항체, 또는 δTCS1과 같은 항-TCRVδ1 항체를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 볼 때, 항체는 단일클론 항체(mAb), 폴리클로날 항체(polyclonal antibody), 항체 단편(antibody fragments, 예를 들어, Fab 및 F (ab')2), 단일 사슬(single chain) 항체, 단일 사슬 가변 단편(single chain variable fragments; ScFv) 및 재조합으로 생성된 결합 파트너(recombinantly produced binding partners)를 포함한다. 일 실시예에서, 항체는 항-CD3 모노클로날 항체(monoclonal antibody, mAb)이다. 다른 미토겐들은 phorbol 12-myristate-13-acetate(TPA) 및 메제레인(mezerein)과 같은 관련 화합물, 또는 박테리아 화합물(예: Staphylococcal enterotoxin A (SEA) 및 Streptococcal protein A)을 포함한다. T 세포 미토겐은 가용성이거나 고정될 수 있으며(soluble or immobilized), 하나 이상의 T 세포 미토겐이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

본 발명에서는, 한편으로는 인터루킨-4, 다른 한편으로는 인터루킨-15, 인터루킨-2 및 인터루킨-7의 2개의 상이한 그룹의 사이토킨(cytokines)이 각각의 배양 과정에서 매우 특정한 목적으로 사용되어야 하고, 이 그룹들이 배양된 Vδ2^- γδ T 세포들에 반대되는 행동을 한다는 것이 명백하게 밝혀졌다. Vδ2^- γδ T 세포에 대한 IL-4 및 IL-15/IL-2/IL-7의 효능에 대한 현재의 연구에 기초하면, 통상의 기술자에게는 이들 두 그룹의 사이토킨이 본 발명의 범위 내에서 사용될 수 있는 "인터루킨-4-유사 활성"또는 "인터루킨-15-유사 활성" 중 하나를 갖는 두 성장인자 그룹의 대표라는 것이 명백하다.

용어 "인터루킨-4-유사 활성을 갖는 성장인자"는 배양 중 Vδ2^- γδT 세포에 대해 유사한 생리학적 효능을 촉진시키는 능력과 관련하여 IL-4와 동일한 활성을 갖고, IL-4 및 IL-4 모방체(mimetics), 또는 IL-4의 모든 기능적 등가물을 포함하는 임의의 화합물을 의미한다. Vδ2^- γδT 세포(본 발명에서 기술된 바와 같은)에 대하여 IL-4에 의해 촉진되는 생리학적 효과는 NKG2D 및 NCR 발현 수준의 감소, 세포독성 기능의 억제 및 개선된 선택 생존을 포함한다. Vδ2^- γδT 세포에 대한 IL-4의 활성은 다른 그룹에 의해 별도로 보고되었다. 그 연구에서, IL-4는 활성화된 TCRγδ⁺ T 세포로부터의 IFN-γ, TNF-α를 포함하는 전염증성 (pro-inflammatory) 사이토킨의 분비(secretion)를 억제하였다 ^<45>.

용어 "인터루킨-15-유사 활성을 갖는 성장인자"는 배양 중 Vδ2^- γδT 세포에 대해 유사한 생리학적 효능을 촉진시키는 능력과 관련하여 IL-15와 동일한 활성을 갖고, IL-15 및 IL-15 모방체, 또는IL-2와 IL-7을 포함하는 IL-15의 임의의 기능적 등가물을 포함하는 임의의 화합물을 의미한다. 배양된 Vδ2^- γδT 세포(본 발명에서 기술된 바와 같은)에 대한 IL-15, IL-2 및 IL-7에 의해 촉진된 생리학적 효과는 본질적으로 동등했는데, 이는 즉 NKG2D 및 NCR (NKp30 및 NKp44) 발현 수준의 증가, 항종양 세포독성 기능의 증가 및 IFN-γ와 같은 전염증성 사이토킨의 증대된 생산을 포함하여 세포독성 표현형에 대한 세포 분화의 유도 등이다.

용어들 "인터루킨-15, 인터루킨-2, 인터루킨-7의 부재" 및 "인터루킨-4의 부재"는, 배양 배지에서의 이들 사이토킨의 완전한 부재뿐만 아니라, 그러한 사이토킨의 농도가 너무 낮아서 표적 세포에서 측정 가능한 반응 또는 생리학적 효과를 생성할 수 없어 실용상 부재로 간주될 수 있게 사용하는 것을 의미한다. 또한, 용어 "표적 세포에서의 측정 가능한 생리학적 효과"는, 본 발명의 범주 내에서 그리고 표준적인 정의에 따라 세포의 생리학적 상태의 임의의 측정 가능한 변화를 나타낸다. 예를 들어, 세포의 생리 상태의 변화는, 사이토킨과의 접촉 후 몇 시간 또는 며칠 후에, 활성화 상태의 변화 (초기활성화 세포 마커(early-activation cell marker) CD69의 발현 수준의 상향 조절 또는 하향 조절(up-regulation or downregulation)에 의해 인지됨)에 의해 검출될 수 있거나; 분화 상태의 변화(NKG2D 또는 NCR의 상향 조절 또는 하향 조절에 의해 인지되는)에 의해 검출될 수 있다.

측정 가능한 생리적 효과는 CFSE 염색(staining) 또는 당업계에 공지된 다른 기술에 의해 측정된 세포의 증식 속도의 변화일수 있다. 제1 배양 배지에서 배양된 세포가 IL-2, IL-7 및 IL-15 또는 기능적으로 유사한 성장인자에 의하여 기능적으로 관련된 자극을 받지 않아야 한다는 것이 통상의 기술자에게는 명백하다. 또한, 제2 배양 배지의 세포는 IL-4 또는 기능적으로 유사한 성장인자에 의한 기능적으로 관련된 자극을 받아서는 안 된다. 바람직하게는, 이들 사이토킨은 2 ng/ml보다 높은 최종 농도로 세포 배양 배지에 존재해서는 안되며; 더욱 바람직하게는 1 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 0.1 ng/ml 이하, 보다 바람직하게는 아예 존재 하지 않아야 한다.

바람직하게는, 본 발명은 시료에서 Vδ2^- γδT 세포를 증식(expanding) 및 분화시키는(differentiating) 방법을 제공하며, 다음을 포함한다.

(1) 인터루킨-15, 인터루킨-2 및 인터루킨-7의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 인터루킨-4를 포함하는 제1 배양 배지의 시료 중의 세포를 배양하는 과정; 및

(2) 인터루킨-4의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 인터루킨-15를 포함하는 제2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포를 배양하는 과정.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 시료에서 Vδ2^- γδ T 세포를 증식 및 분화시키는 방법을 제공하며, 다음을 포함한다.

(2) 인터루킨-4의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 인터루킨-2를 포함하는 제2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포를 배양하는 과정.

추가로, 또 다른 실시예에서, 본 발명은 시료에서 Vδ2^- γδ T 세포를 증식 및 분화시키는 방법을 제공하며, 다음을 포함한다.

(2) 인터루킨-4의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 인터루킨-7을 포함하는 제2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포를 배양하는 과정.

제1 또는 제2 배양 배지 또는 두 배양 배지 모두는 Vδ2^- γδ T 세포의 성장 및 증식을 보조할 수 있는 다른 성분(ingredients)을 추가로 포함할 수 있다. 추가될 수 있는 다른 성분의 예는 혈장(plasma) 또는 혈청(serum), 알부민과 같은 정제된 단백질, 저밀도 지단백질(LDL)과 같은 지질 소스(lipid source), 비타민, 아미노산, 스테로이드 및 세포 성장 및 생존을 촉진하는 임의의 다른 보조제를 포함하되, 반드시 여기에 한정되지 않는다.

제1 또는 제2 배양 배지 또는 두 배양 배지 모두는 Vδ2^- γδ T 세포의 증식을 추가로 증진시킬 수 있는 사이토킨을 포함하는 다른 성장인자도 함유할 수 있다. 이러한 사이토킨의 예로는 (i) 인터페론-γ 및 인터페론-γ-유사 활성을 갖는 임의의 성장인자, (ii) 인터루킨-21 및 인터루킨-21과 유사한 활성을 갖는 임의의 성장인자 및 (iii) ) IL-1β 및 인터루킨-1β-유사 활성을 갖는 임의의 성장인자를 포함하되, 반드시 여기에 한정되지 않는다. 첨가될 수 있는 다른 성장인자의 예로는 인간 항-SLAM 항체, CD27의 임의의 가용성 리간드(soluble ligand) 또는 CD7의 임의의 가용성 리간드와 같은 공동자극분자(co-simulatory molecules)를 포함한다. 이들 성장인자의 임의의 조합물은 제1 또는 제2 배양 배지 또는 두 배양 배지 모두에 포함될 수 있다.

용어 "인터페론-γ-유사 활성을 갖는 성장인자"는 배양 중 Vδ2^- γδ T 세포의 생존 또는 증식을 촉진시키는 능력과 관련하여 IFN-γ와 동일한 활성을 갖는 화합물을 의미하며, IFN-γ 및 IFN-γ 모방체(mimetics) 또는 IFN-γ의 기능적 등가물을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

용어 "인터루킨-21-유사 활성을 갖는 성장인자”는 배양물에서 Vδ2^- γδ T 세포의 생존 또는 증식을 촉진시키는 능력과 관련하여 IL-21과 동일한 활성을 갖는 임의의 화합물을 의미하며, IL-21 및 IL-21 모방체, 또는 IL-21의 임의의 기능적 등가물을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

용어 "인터루킨-1β-유사 활성을 갖는 성장인자"는 배양물에서 Vδ2^- γδ T 세포의 생존 또는 증식을 촉진시키는 능력에 대해 IL-1β와 동일한 활성을 갖는 임의의 화합물을 의미하며, IL-1β 및 IL-1β 모방체, 또는 IL-1β의 임의의 기능적 등가물을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

특히, 본 발명자는 인터페론-γ-유사 활성을 갖는 제2 성장인자를 제1 또는 제2 배양 배지 또는 두 배양 배지 모두에 첨가하면, 하나의 성장인자를 사용했을 때와 비교하였을 때 Vδ2^- γδ T 세포의 증식이 증가한다는 것을 발견했다.

따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 방법은 다음을 포함한다.

(1) 인터루킨-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15의 부재 하에, T 세포 미토겐, 인터루킨-4 및 인터페론-γ를 포함하는 제1 배양 배지의 시료 중의 세포를 배양하는 과정; 및

(2) 인터루킨-4의 부재 하에, T 세포 미토겐, 인터루킨-15 및 인터페론-γ를 포함하는 제2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포를 배양하여 Vδ2^- γδ T 세포를 증식 및 분화시키는 과정.

바람직하게는, IFN-γ-유사 활성을 갖는 성장인자는 약 1 내지 약 1000 ng/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 이 성장인자는 약 2 내지 약 500 ng/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 이 성장인자는 약 20 내지 약 200 ng/ml의 양으로 존재한다. 가장 바람직하게는, 제2 배양 배지는 IFN-γ와 같은 IFN-γ-유사 활성을 갖는 성장인자 약 70 ng/ml를 포함한다.

본 발명자는 IFN-γ-유사 활성을 갖는 제2 성장인자 및 IL-21-유사 활성을 갖는 제3 성장인자를 제1 또는 제2 배양 배지 또는 두 배양 배지 모두에 첨가하면, 하나 또는 두 개의 성장인자를 사용하였을 때와 비교하였을 때 Vδ2^- γδ T 세포의 증식이 증가한다는 것도 발견했다.

(1) 인터루킨-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15의 부재 하에, T 세포 미토겐, 인터루킨-4, 인터페론-γ 및 인터루킨-21을 포함하는 제1 배양 배지의 시료 중의 세포를 배양하는 과정; 및

바람직하게는, IL-21-유사 활성을 갖는 성장인자는 약 1 내지 약 500 ng/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 이 성장인자는 약 2 내지 약 200 ng/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 이 성장인자는 약 5 내지 약 100 ng/ml의 양으로 존재한다. 가장 바람직하게는, 제2 배양 배지는 IL-21과 같은 IL-21-유사 활성을 갖는 성장인자 약 15 ng/ml를 포함한다.

본 발명자는 또한 IFN-γ-유사 활성을 갖는 제2 성장인자 및 IL-21-유사 활성을 갖는 제3 성장인자 및 IL-1β-유사 활성을 갖는 제4 성장인자를 제1 또는 제2 배양 배지 또는 두 배양 배지 모두에 첨가하면 하나 또는 두 개 또는 세 개의 성장인자를 사용하였을 때와 비교하였을 때 Vδ2^- γδ T 세포의 증식이 증가한다는 것도 발견했다.

(1) 인터루킨-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15의 부재 하에 T 세포 미토겐, 인터루킨-4, 인터페론-γ, 인터루킨-21 및 인터루킨-1β를 포함하는 제1 배양 배지의 시료 중의 세포를 배양하는 과정; 및

(2) IL-4의 부재 하에 T 세포 미토겐, 인터루킨-15, 인터페론-γ 및 인터루킨-21을 포함하는 제2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포를 배양하여 Vδ2^- γδ T 세포를 증식시키는 과정.

바람직하게는, IL-1β-유사 활성을 갖는 성장인자는 약 1 내지 약 500 ng/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 이 성장인자는 약 2 내지 약 200 ng/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 이 성장인자는 약 5 내지 약 100 ng/ml의 양으로 존재한다. 가장 바람직하게는, 상기 제2 배양 배지는 IL-1β와 같은 IL-1β-유사 활성을 갖는 성장인자 약 15 ng/ml를 포함한다

본 발명자는 또한 제1 또는 제2 배양 배지 또는 두 배양 배지 모두에 공동 자극(co-simulatory) 분자를 첨가하면 그러한 배양 배지를 사용하지 않고 수득된 증식과 비교하였을 때 Vδ2^- γδ T 세포의 증식이 증가한다는 것을 발견하였다.

(1) 인터루킨-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15의 부재 하에, 인터루킨-4, 및 CD27의 임의의 분자 리간드 또는 SLAM의 임의의 분자 리간드(molecular ligand) 또는 CD7 수용체의 임의의 분자 리간드를 포함하는 제1 배양 배지의 시료 중의 세포를 배양하는 과정; 및

(2) IL-4의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 인터루킨-15를 포함하는 제2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포를 배양하여 Vδ2^- γδ T 세포를 증식시키는 과정.

용어 "분자 리간드(molecular ligand)"는 특정 표적 수용체(target receptor)에 결합하는 임의의 분자 또는 화합물을 의미한다. 특히, 본 발명자는 CD27의 가용성(soluble) 리간드, 또는 CD7의 가용성 리간드 또는 SLAM의 가용성 리간드의 첨가가 Vδ2^- γδ T 세포의 증식을 증대시킨다는 것을 발견했다. 이러한 가용성 리간드는 이들 분자 수용체 각각의 기능적 작용제를 구성하고, 이들 수용체에 결합하는 임의의 유사한 작용제는 Vδ2^- γδ T 세포에 동일한 효과, 예를 들어 인간 항-SLAM 항체, 인간 항-CD27 항체 및 인간 항-CD7 항체를 포함한다.

총 배양 기간 동안 두 가지 이상의 계대배양 단계(subculture step)를 수행할 수 있다. 예를 들어, 전술한 계대배양 과정 각각은 2가지 계대배양 과정 (1a) 및 (1b) 및 (2a) 및 (2b)로 추가로 나누어질 수 있으며, 원래의 기술된 방법에 따라 다양한 조합이 사용될 수 있다.

(1) 인터루킨-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15의 부재 하에, T 세포 미토겐, 인터루킨-4, 인터페론-γ, 인터루킨-1β 및 인터루킨-21을 포함하는 제1 배양 배지의 시료 중의 세포를 배양하는 과정; 및

(2a) 인터루킨-4의 부재 하에, T 세포 미토겐, 인터루킨-15 및 인터루킨-21을 포함하는 제2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포를 배양하는 과정; 및

(2b) 인터루킨-4의 부재 하에, 과정 (2a)에서 수득된 세포를 T 세포 미토겐, 인터루킨-15 및 인터페론-γ를 포함하는 제3 배양 배지에서 배양하여 Vδ2^- γδ T 세포를 증식시키는 과정.

다른 실시예에서, 본 발명의 제1 양태에 따른 방법은 다음을 포함한다.

(1a) 인터루킨-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15의 부재 하에, T 세포 미토겐, 인터루킨-4, 인터페론-γ 및 인터루킨-21을 포함하는 제1 배양 배지의 시료 중의 세포를 배양하는 과정; 및

(1b) 인터루킨-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15의 부재 하에, 과정 (1a)에서 수득된 세포를 T 세포 미토겐, 인터루킨-4, 인터페론-γ 및 인터루킨-1β를 포함하는 제2 배양 배지에서 배양하는 과정; 및

(2) 인터루킨-4의 부재 하에, 과정 (1b)에서 수득된 세포를 T 세포 미토겐 및 인터루킨-15를 포함하는 제3 배양 배지에서 배양하여 Vδ2^- γδ T 세포를 증식시키는 과정.

본 발명의 방법에 의해 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포는 다양한 실험적, 치료적 및 상업적 용도에 적용될 수 있다. 예를 들어 치료 효능을 향상시킬 목적으로 그러한 세포의 유전적 변형(genetic modification) 또는 유전적 편집(genetic editing)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 예를 들어, 이러한 세포 상의 키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR) 또는 TCR의 발현을 통해 TCRγδ⁺ T 세포의 특이성(specificity)을 정하는(redirecting) 것을 목적으로 한다. CAR 발현은 유전 물질 삽입을 위한 TCRγδ⁺ 세포의 전기천공법(electroporation)을 통해 또는 원하는 유전자 물질을 함유하는 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스와 같은 바이러스 벡터(viral vectors)로 이들 세포를 감염시킴으로써 유도될 수 있다. 이러한 유전자 편집은 원점 복귀(homing), 사이토킨 생산, 재사용 킬링(recycling killing) 및/또는 개선된 생식(engraftment)을 개선함으로써 TCRγδ⁺ T 세포의 효능을 향상시킬 수 있다.

본 발명은 배양 중인 Vδ2^- γδ T 세포를 선택적으로 증식시키는 새로운 방법을 제공한다. 본 발명의 제1 양태에 따른 방법은 본 명세서에서 "시작 시료(starting sample)"로도 지칭되는 시료에 대해 수행된다. 이 방법은 미분획된(unfractionated) 시료 또는 TCRγδ⁺ T 세포에 대해 농축된(enriched) 시료를 사용할 수 있다.

시료는 TCRγδ⁺ T 세포 또는 혈액, 골수, 림프성 조직, 상피세포, 간세포, 비장세포, 암조직, 림프절조직, 감염된 조직, 태아조직 및 그 분획물(fractions) 또는 농축 부분 등을 포함하는 TCRγδ⁺ T 세포 또는 그의 전구체를 포함하는 임의의 시료일 수 있으나 반드시 이에 한정되지는 않는다. 시료는 바람직하게는 버피 코트 세포(buffy coat cells), 백혈구 제거제(leukapheresis products), 말초혈액 단핵세포 (Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 및 저밀도 단핵세포 (Low density mononuclear cells, LDMCs)를 포함하는 말초혈액 또는 제대혈 또는 그 분획물을 포함하는 혈액이다. 일부 실시예에서, 시료는 인간 혈액 또는 그의 분획물이다. 세포는 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation)와 같은 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 혈액 시료로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 전혈(whole blood)은 같은 부피의 Ficoll-Hypaque™ 위에 놓고 실온에서 15분에서 30분 동안 400xg에서 원심 분리될 수 있다. 계면 물질(interface material)은 배양 배지에서 수집 및 세척되고 실온에서 200xg에서 10분간 원심 분리될 수 있는 저농도 단핵세포가 포함할 것이다.

분리되거나 비정제된 TCRγδ⁺ T 세포는, 혈청(serum)이나 혈장(plasma)의 존재 하에, AIM-V™, RPMI 1640, OPTIMIZER CTS™ (Gibco, Life Technologies), EXVIVO-10, EXVIVO-15 또는 EXVIVO-20 (Lonza)와 같은 임의의 적합한 포유동물 세포 배양 배지에서 배양되거나 유지될 수 있다. 예를 들어 세포는 VueLife^® 임상등급의 가스 투과성 세포 배양 정적 백(gas-permeable cell culture static bags) (Saint Gobain) 또는 Miltenyi Biotec의 임상등급 세포 배양 백(Miltenyi Biotec’s clinical-grade cell culture bags)으로 옮겨질 수 있다. 세포와 배양 배지가 들어있는 세포 백은 어둠 속에서 37 °C와 5% CO₂ 인큐베이터에 놓여질 수 있다.

제1 배양 배지에서 시료 또는 PBMC와 같은 그 분획물을 배양하기 전에, 시료 또는 분획물을 특정 세포 유형에 대해서는 농축시키고(enrich) 및/또는 다른 세포 유형에 대해서는 고갈시킬(deplete) 수 있다. 특히, 시료 또는 그의 분획물은 T 세포에 대해 농축되거나, TCRγδ⁺ T 세포에 대해 농축되거나, TCRαβ⁺ T 세포가 고갈되거나 또는 비-TCRγδ⁺ T 세포가 고갈될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 시료는 먼저 TCRαβ⁺ T 세포가 고갈되고 그 다음 CD3⁺ 세포가 농축되게 한다.

시료는 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 특정 세포 유형이 농축되거나 고갈될 수 있다. 일 실시예에서, 특정 표현형(phenotype)의 세포는 고갈될 세포 상의 특정 분자에 결합하는 항체를 함유하는 항체 칵테일(antibody cocktail)로 시료 또는 그 분획물을 배양함으로써 고갈될 수 있다. 바람직하게는, 칵테일 내의 항체는 표적 세포를 자기 칼럼(magnetic column)에 강제로 통과시킬 때 표적 세포를 자기적(magnetically)으로 고갈시키거나 농축되게 하는 데 사용될 수 있는 자기 마이크로비드(magnetic microbeads)에 결합된다.

일단 시료 중의 세포가 분획되고 농축되면, 원한다면, 인터루킨-15, 인터루킨-2 및 인터루킨-7과 같은 인터루킨-15-유사 활성을 갖는 성장인자의 부재 하에, 세포들이 T 세포 미토겐 및 인터루킨-4와 같은 인터루킨-4-유사 활성을 갖는 하나 이상의 성장인자를 포함하는 제1 배양 배지에서 배양된다.

바람직하게는, 제1 배양 배지에 있는 T 세포 미토겐은 약 10 내지 약 5,000 ng/ml의 양으로 존재한다. 보다 바람직하게는, T 세포 미토겐이 약 20 내지 약 2,000 ng/ml의 양으로 존재한다. 보다 바람직하게는, T 세포 미토겐은 약 50 내지 약 1,000 ng/ml의 양으로 존재한다. 가장 바람직하게는, 배지는 70 ng/ml의 T 세포 미토겐을 포함한다.

바람직하게는, 인터루킨-4-유사 활성을 갖는 성장인자는 약 1 내지 약 1,000 ng/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 이 성장인자는 약 5 내지 약 500 ng/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 이 성장인자는 약 20 내지 약 200 ng/ml의 양으로 존재한다. 가장 바람직하게는, IL-4와 같은 인터류킨 -4-유사 활성을 갖는 100 ng/ml의 성장인자를 포함한다.

세포는 바람직하게는 약 2일에서 약 21일 범위의 기간 동안 제1 배양 배지에서 배양된다. 더욱 바람직하게는 약 3일에서 약 14일이다. 보다 바람직하게는 약 4일에서 8일이다.

제1 배양 배지에서 배양한 후, IL-4와 같은 인터루킨-4-유사 활성을 갖는 성장인자의 부재 하에, 세포는T 세포 미토겐 및 IL-15, IL-2 또는 IL-7과 같은 인터루킨-15-유사 활성을 갖는 하나 이상의 성장인자를 포함하는 제2 배양 배지에서 세포가 계대배양(sub-cultured)된다. 예를 들어, IL-15 및 IL-4 모두의 존재 하에 세포를 계대배양하는 경우, 증식은 계속되지만 세포 생존력은 감소하고 세포 표면에 위치한 주요 NK 수용체(예: NKG2D, NKp30 및 NKp44)는 세포의 내부에 내재되어 있다. 결과적으로, 이들 수용체는 종양세포 상에 발현된 리간드에 더 이상 결합할 수 없어 이들 세포의 항종양 세포독성 활성을 감소시킨다.

계대배양 과정은 제1과정에서 수득된 세포를 새로운 배양 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 이것은 바람직하게는 제1 배양 배지의 분획물을 제거한 후에 새로운 배양 배지를 제1 배양 배지에 첨가함으로써 달성될 수 있다. 이것은 세포를 원심분리 및/또는 경사분리(decanting)하고, 제1 배양 배지의 일부를 제거하고, 제2 배양 배지에서 세포를 재현탁(resuspending)함으로써 수행될 수 있다. 바람직하게, 계대배양 과정은 적어도 제1 배양 배지의 적어도 3/4의 제거를 포함한다. 계대배양 과정은 Vδ2^- γδ T 세포의 증식과 분화에 중요하므로 계대배양 과정에서 인터루킨-4-유사 활성을 갖는 성장인자가 제거되어야 한다.

바람직하게는, 제2 배양 배지에서, T 세포 미토겐은 약 0.1 내지 약 50 ㎍/㎕의 양으로 존재한다. 보다 바람직하게는, T 세포 미토겐은 약 0.3 내지 약 10 μg/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, T 세포 미토겐은 약 0.5 내지 약 5 μg/ml의 양으로 존재한다. 가장 바람직하게는, 배지는 1 μg/mL의 T 세포 미토겐을 포함한다.

바람직하게는 IL-15, IL-2 또는 IL-7과 같은 인터루킨-15-유사 활성을 갖는 성장인자는 약 1 내지 약 1,000 ng/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 이 성장인자는 약 2 내지 약 500 ng/ml의 양으로 존재한다. 더욱 바람직하게는, 이 성장인자는 약 20 내지 약 200 ng/ml의 양으로 존재한다. 가장 바람직하게는, 제2 배양 배지는 IL-15, IL-2 또는 IL-7과 같은 인터루킨-15-유사 활성을 갖는 성장인자를 약 70 ng/ml를 포함한다.

세포는 바람직하게는 약 2일 내지 약 30일 범위의 기간 동안 제2 배양 배지에서 배양된다. 보다 바람직하게는 약 5일 내지 약 21일이다. 더욱 바람직하게는 약 10일 내지 15일이다.

바람직하게는, 본 발명의 제1 양태에서, 제1 및 제2 배양 배지 모두는 혈청 또는 혈장으로 보충된다. 제1 및 제2 배양 배지에서의 혈장의 양은 바람직하게는 약 0.5 내지 약 25 %의 부피, 예를 들어 약 2 내지 약 20%의 부피 또는 약 2.5 내지 약 10% 부피, 예를 들어 약 5 부피%이다. 혈청 또는 혈장은 인간 말초혈액, 제대혈 또는 다른 포유류 종으로부터 얻어질 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 혈장은 단일 공여자로부터 얻거나 복수의 공여자로부터 얻어질 수 있다. 자가(autologous) TCRγδ⁺ T 세포가 임상적으로 사용되는 경우, 즉 원래의 시료가 채취된 환자와 동일한 환자에게 다시 주입되는 경우, 안전하지 않은 산물(product, 예, 바이러스)을 환자에게 투입하는 것을 피하기 위해 자가 혈장을 사용하는 것이 바람직하다. 혈장은 동물 생산물을 환자에게 투여하는 것을 피하기 위해 인간의 것이어야 한다.

본 발명의 제1 측면의 방법에 따라 수득된 TCRγδ⁺ T 세포는 형광 활성화된 세포 분류(fluorescence activated cell sorting), 면역 자기분리(immunomagnetic separation), 친화성 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography), 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation), 세포이동(cellular panning)을 포함하는 당 업계에 알려진 기술을 사용하여 최종 배양물 중에 존재할 수 있는 다른 세포로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 제1 측면의 방법에 의해 수득된 TCRγδ⁺ T 세포 또한 사용된다. 따라서, 본 발명자는 TCRγδ⁺T 세포의 세포 표본(cell preparation)을 설명한다.

제2측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면의 방법에 따라 제조된 TCRγδ⁺ T 세포가 농축된 세포 표본을 제공한다.

제3 측면에서, 본 발명은 총 세포의 80 % 이상이 TCRγδ⁺ T 세포인 TCRγδ⁺ T 세포가 농축된 세포 표본을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 제2 및 제3 측면에서, TCRγδ⁺ T 세포는 농축 집단의 총 세포의 80 % 초과, 보다 바람직하게는 90 % 초과, 가장 바람직하게는 95 % 초과를 구성한다.

본 발명의 제1 및 제2 측면의 방법에 의해 얻어진TCRγδ⁺ T 세포는 어떠한 용도에도 사용될 수 있다. TCRγδ⁺ T 세포는 감염성 병원균(infectious pathogens)에 대한 초동(first-line) 방어선으로 생각된다. 또한, TCRγδ⁺ T 세포는 B-세포 림프종, 육종(sarcoma) 및 암종(carcinoma)을 비롯한 다양한 기원의 형질 전환된(transformed) 세포에 대한 고유세포 용해활성(intrinsic cytolytic activity)을 갖는다. 결과적으로, 본 발명의 방법에 따라 생체 외에서 얻어지고 배양된 TCRγδ⁺ T 세포는 면역 억제로 인한 감염, 암 또는 질환의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 주입될 수 있다.

따라서, 제4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 방법에 따라 얻어진, 혹은 필요에 따라 동물에 대한 제2 또는 제3 측면에 따른 세포 표본에서 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포들의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 면역 반응(immune response)을 조절하는(modulate) 방법을 제공한다.

여기서 사용된 용어 "유효량(effective amount)"은 목적하는 결과를 달성하는 데 필요한 투여량 및 소요기간을 의미한다.

여기서 사용된 용어 "동물(animal)"은 동물계의 모든 개체를 포함한다. 바람직하게는, 동물은 포유동물이다. 더 바람직하게는 인간이다.

제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 방법에 따라 얻어진, 혹은 필요에 따라 동물에 대한 제2 또는 제3 측면에 따른 세포 표본에서 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포들의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 감염치료 방법을 제공한다.

치료할 수 있는 감염의 예에는 미코박테리아(Mycobateria) (예: 결핵)와 같은 박테리아 감염, 단순포진 바이러스(HSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 간염 바이러스와 같은 바이러스 감염, 및 말라리아 원충(Plasmodium) (예: 말라리아)로 인한 기생충 감염을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 방법에 따라 얻어진, 혹은 필요에 따라 동물에 대한 제2 또는 제3 측면에 따른 세포 표본에서 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포들의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암치료 방법을 제공한다.

치료될 수 있는 암의 예로는 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia) 및 T 세포 및 B 세포 백혈병, 호지킨 및 비호지킨 림프종(Hodgkin's and non-Hodgkins lymphomas), 림프증식성 질환(lymphoproliferative disorders), 형질세포종(plasmacytomas ), 조직구종(histiocytomas), 흑색종(melanomas), 선종(adenomas), 육종(sarcomas), 경부조직상피암(carcinomas of solid tissues), 저산소 종양(hypoxic tumors), 편평상피암(squamous cell carcinomas), 자궁경부암 및 방광암과 같은 비뇨생식기암(genitourinary cancers), 조혈암(hematopoietic cancers), 두경부암(head and neck cancers) 및 신경계암(nervous system cancers )을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

일 실시예에서, 치료될 암은 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)이다. 이러한 실시예에서, PBMC는 만성 림프성 백혈병(CLL) 환자에게서 얻어질 수 있다. TCRγδ⁺ T 세포를 배양하고 증식시킨 후의 증식된 세포는 암성 CLL 세포를 많이 함유하지 않으므로 환자에게 재주입하기에 적합하다.

본 발명의 이들 측면은 제1 또는 제2 측면의 방법 또는 본 발명의 제2 또는 제3 양태에 따른 세포 표본으로부터 TCRγδ⁺ T 세포를 얻어, 위에서 언급했듯이 면역 반응의 조절, 감염의 치료 또는 암의 치료를 하는 데 사용된다. 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제2 측면의 방법에 따라 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포가 위에서 언급했듯이 면역 반응을 조절하거나 감염을 치료하거나 암을 치료하기 위한 약제 또는 약학 조성물을 제조하는 것을 포함한다.

본 발명에 따라 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포는 세포의 기능을 더 연구하고 명료하게 하기 위한 실험모델(experimental models)에서 사용될 수 있다. 또한, 이들 세포는 TCRγδ⁺ T 세포에 의해 인식되는 항원/에피토프(epitope)의 식별, 및 백신의 설계 및 개발에 관한 연구에 사용될 수 있다.

따라서, 제7 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면 또는 제2 측면에 따른 방법, 또는 제3 또는 제4 측면에 따른 세포 표본으로부터 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포의 유효량을 동물에게 백신 접종하는 방법을 제공한다. 그러한 백신은 면역저하 환자(immunocompromised patients)나 전염병 감염이나 암 발생 위험이 높은 개인에게 투여될 수 있다.

본 발명의 이러한 측면은 본 발명의 제1 측면 또는 제2 측면에 따라 얻어진, 또는 제3 또는 제4 측면의 백신 제조방법에 따른 세포 표본으로부터 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포의 사용에까지 확장된다. 또한 이러한 측면은 본 발명의 제1 측면 또는 제2 측면에 따라 얻어진, 또는 제3 또는 제4 측면의 동물을 백신하는 방법에 따른 세포 표본으로부터 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포의 사용에까지 확장된다.

본 발명에 따라 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포는 위에서 언급한 치료학적, 실험적 또는 상업적 적용에서 즉시 사용될 수도 있고, 추후 사용을 위해 저온보존(cryopreserved)될 수도 있다.

본 발명의 제2 및 후속 측면의 바람직한 특징들은 본 발명의 제1 측면을 준용하여(mutatis mutandis) 설명된다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 이 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직일 실시예를 나타내는 상세한 설명 및 특정 예들은 본 상세한 설명으로부터 통상의 기술자에게 다양한 변경 및 수정이 가해질 수 있을 것이므로 단지 예시로서 주어진 것임을 알아야 한다.

본 발명은 이 분야에서 이전에 설명된 다른 발명과 완전히 다르다. 특허 출원 PCT/CA1999/001024 (WO/2000/026347, 출원일 1999.11.04)는 TCR宸⁺ T 세포의 생산 방법을 기술한다. 이 방법은 두 과정을 포함하는 데, 시작 시료의 TCRγδ⁺ T 세포가 T 세포 미토겐 및 적어도 2 개의 사이토킨, 바람직하게는 인터루킨-2 및 인터루킨-4를 포함하는 제1 배양 배지에서 배양된다. 이어서, 제1 과정에서 얻어진 세포는 바람직하게는 인터루킨-2 및 인터루킨-4를 포함형 2개 이상의 사이토킨을 포함하는 제2 배양 배지에서 배양된다. 중요한 것은, 각 과정에서 사용되는 사이토킨은 같을 수도, 다를 수도 있다.

이와는 대조적으로, 본 발명은 배양 중 Vδ2^- γδ T 세포를 선택적으로 증식 및 분화시키는 2 단계 방법을 제시하는 데, 여기서 제1 및 제2 배양 단계는 반드시 서로 달라야 한다. 첫번째 과정은 인터루킨-2, 인터루킨-7 및 인터루킨-15의 부재 하에, T 세포 미토겐 및 IL-4-유사 활성을 갖는 성장인자, 바람직하게는 인터루킨-4를 포함하는 배양 배지의 시작 시료에서 TCRγδ⁺ T 세포를 배양하는 것을 포함한다. 본 발명에서는 IL-4 및 IL-2 (또는 IL-7 또는 IL-15)가 각 배양 과정에서 매우 특이적인 기능을 발휘하고, 각각 반대의 활성을 갖는 것이 분명하게 증명되었다. 첫번째 배양 배지는 (IL-2/IL-7/IL-15-유사 활성) 성장인자와 혼합될 수 없는 IL-4-유사 활성을 갖는 성장인자를 함유한다. 그렇지 않으면 세포 생존력 및 증식이 감소하고 기대하는 세포 생산물이 생산되지 않는다. 첫번째 세포 배양 과정은 세포가 매우 농축된 Vδ2^- γδ T 세포 생성물을 생성하도록 예외적으로 짧은 기간 동안 TCRγδ⁺ T 세포를 여러 배로 증식시키는 데 사용된다.

실제로, 배양 배지에서 IL-2/IL-7/IL15-유사 성장인자의 부재는, 이러한 기술혁신(innovation) 없이는 제거되지 않을 많은 불순물(다른 세포 유형)의 제거를 가능하게 한다. 증식된 Vδ2^- γδ T 세포는 인터루킨-2/-15/-7-유사 성장인자와 접촉하지 않아서 덜 분화된 상태에 있다. 세포독성(cytotoxic) 및 염증 유발성 표현형(pro-inflammatory phenotype)으로 세포를 분화시키기 위하여, 인터루큰-4-유사 활성을 갖는 성장인자의 부재 하에, 제1 과정에서 얻어진 Vδ2^- γδ T 세포는 T 세포 미토겐 및 인터루킨-15-유사 활성을 갖는 성장인자를 포함하는 제2 배양 배지에서 배양되어야 한다. 다시 말하지만, 두번째 배양 배지에서 IL-4의 존재가 세포 생존력 및 세포독성 기능을 감소시키기 때문에, 이들 상이한 성장인자가 서로 혼합되지 않는 것이 중요하다. 두번째 배양 과정은 배양물에서 Vδ2^- γδ T 세포를 더욱 증식시켜 더 많은 이펙터 세포(effector cell)를 만들어 많은 치료 목적으로 사용될 수 있는 특유의 세포 생성물을 생성한다.

특허번호 US2003/0157060 A1 (출원번호 US10239854 및 출원일 2000.04.03)에는 배양 중인 TCRγδ⁺ T 세포를 증식시키는 또 다른 방법이 개시되어 있다. 이 방법 또한 2개의 과정을 포함하는 데, 시작 시료에 있는 TCRγδ⁺ T 세포가 제1 배양 배지에서 증식된다. 제1 배양 배지는, (1) T 세포 미토겐, (2) 인터루킨-2-유사 (interleukin-2-like) 성장인자 (3) 인터류킨-7-유사 활성을 갖는 성장인자를 포함한다. 이어서, 첫번째 과정에서 얻어진 세포는 TCRγδ⁺ T 세포를 증식하기 위해 제2 배양 배지에서 증식된다. 제2 배양 배지는 (1) 인터루킨-2-유사 활성을 갖는 성장인자 및 (2) 인터루킨-7-유사 활성을 갖는 성장인자를 포함한다.

이와는 대조적으로, 본 발명에서 두 배양 과정은 별개의 목적에 기여하고 따라서 필수적으로 상이하므로 본 발명은 위 개시와 다르다. 본 발명은 이미 설명된 이유로 (위 참조), 제1 배양 과정에서 인터류킨-2-유사 활성 또는 인터루킨-7-유사 활성을 갖는 성장인자의 사용을 명확히 배제한다. 본 발명은 인터페론-γ, IL-1β 및 IL-21과 같은 사이토킨을 포함하는 제1 및/또는 제2 배양 배지에서 다른 성장인자의 존재를 기술하기는 하지만, 이들 사이토킨은 Vδ2^- γδ T 세포에 작용하는 생리적 효과가 매우 다르므로 인터루킨-2-유사 또는 인터루킨-7-유사 활성을 갖는다고 생각될 수 없다. 예를 들어, (IL-2, IL-7 및 IL-15의 부재 하에서) 인터페론-γ, IL-1β 및 IL-21의 존재 하에 배양된 세포는 그들의 완전한 세포독성 기능 및 분화된 상태를 얻을 수 없었고, 따라서 인터페론-γ, IL-1β 및 IL-21은 배양된 Vδ2^- γδ T 세포에 대한 IL-2, IL-7 및 IL-15에 의해 유도된 높은 전염증성 효과(pro-inflammatory effects)를 모방할 수 없었다 (표 2). 더욱이, 인터페론-γ 및 IL-1β와 같은 이들 사이토킨의 일부는 구조적으로 상이한 사이토킨의 계열(family)에 속한다.

본 발명은 다음의 실시예와 도면을 참조하여 설명될 것이다:

도면 설명:

도 1은 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)의 전후 건강한 공여자들로부터 수집한 말초 혈액 시료에서 TCR - γδ ⁺ T PBLs 의 백분율들을 도시한다. 신선한 말초 혈액 50-150 ml를 건강한 지원자로부터 획득되었고 PBS (Invitrogen Gibco)로 1 : 1 비율 (부피 대 부피)로 희석되고 Ficoll-Paque (Histopaque-1077, Sigma-Aldrich)에서 1.500 rpm 및 25 °C에서 35 분 동안 1 : 3 (피콜(Ficoll) 1 대 희석된 혈액 3)의 부피비로 원심 분리되었다. 단핵 세포들을 함유한 계면(the interphase containing mononuclear cells (PBMCs))이 수집되고 (PBS에서) 세척되었다. 모든 TCRγδ⁺ T 세포들이 자성 마이크로비드 (magnetic microbead)가 결합된(conjugated) 항-TCRγδ mAb로 표시되었고, 자기 컬럼(magnetic column) (Miltenyi Biotec, German)을 이용하여 TCRγδ⁺ T 세포들이 (75 % 이상의 순도까지) 분리되었다. 세포들이 다음과 같은 형광 단클론 항체들(fluorescent monoclonal antibodies)로 표시되었다: 항-CD3-PerCP-Cy5.5 (Biolegend, clone SK7); 항-TCR-γδ1-APC (Miltenyi Biotec, clone REA173); 항-Mouse IgG1k-APC Isotype Ctrl (Miltenyi Biotec, clone IS5-21F5). 세포들은 Fortessa II 유세포 분석기(Flow Cytometer) (BD Biosciences) 상에서 분석되었다. 6개의 독립적인 실험의 대표 결과들을 보여준다.

도 2는 2단계 MACS 분류(MACS sorting) 절차의 전후에, 이전에 선택된 건강한 공여자로부터 수집한 말초 혈액 시료에서의 TCRγδ ⁺ T PBLs의 백분율들을 나타 낸다. 신선한 말초 혈액 50-150ml을 건강한 공여자들로부터 획득되고 PBS (Invitrogen Gibco)로 1 : 1 비율 (부피 대 부피)로 희석되고 Ficoll-Paque (Histopaque-1077, Sigma-Aldrich)에서 1 : 3의 부피비 (피콜 1 대 희석된 혈액 3)로 1.500 rpm 및 25 ℃에서 35 분간 원심 분리되었다. 단핵 세포 (PBMCs)를 함유한 계면이 수집되고 (PBS에서) 세척되었다. Biotin (Miltenyi Biotec Ref # 701 -48, clone BW242/412)에 결합된(conjugated) 뮤린 항-인간(murine anti-human) TCRαβ 단클론 항체 (mAb)의 존재 하에서 원하지 않는 TCRαβ⁺ T 림프구가 인큐베이션되어 표시되었다. 이어서, 세포들이 자성 마이크로비드 (Miltenyi Biotec Ref #173-01)에 결합된 뮤린 항-Biotin mAb로 다시 표시되었다. 최종적으로, 세포 현탁액(cell suspension)이 자기 칼럼(magnetic column) (Miltenyi Biotec, Germany)에 로딩되고 TCRαβ⁺ T 림프구를 자기적으로 고갈(및 폐기) 되었다.

남아있는 세포 집단에 존재하는 CD3⁺ 세포들(그 중 대부분은 TCRγδ⁺ T 세포)은 초자기 아이언 덱스트란 입자(supermagnetic iron dextran particle)와 결합된 뮤린 항인간 CD3mAb (Miltenyi Biotec Ref # 273-01, clone OKT-3, 표적화 CD3 엡실론 사슬 상에 위치하는 에피토프)으로 표시되었다. 세포를 자기 MACS 분리 컬럼(magnetic MACS separation column)에 채워졌고 CD3⁺ 세포들은 양성적으로(positively) 선택(정제)되었다. 세포들은 TCRγδ, CD3, TCRγδ1 및 TCRγδ2 마커들로 염색되고(stained), Fortessa II 유세포 분석기(BD Biosciences) 상에서 분석되었다. 6개의 독립적인 실험의 대표 결과들을 보여준다.

도 3은 시험된 배양 조건들(culture conditions)의 요약을 보여준다.

A-C. 전술한 바와 같이 한 건강한 공여자로부터의 TCRγδ⁺ PBLs가 MACS에 의해 분리되었고, 37 ℃ 및 5 % CO₂에 5 % 인간 혈청, 1 mM L- 글루타민으로 보충된 완전한 배지(complete medium) (Optmizer CTS, GIBCO)에서 1백만 세포/ml가 있는 96-웰 플레이트(96-well plates)에서 배양되었다. 세포들은 복수의 웰에 균등하게 분배되었고 항-D3 mAb 및 IL-4의 3 가지 고정 배합물의 존재 하에 배양되었으며, 다양한 농도의 IL-2, IL-7, IL-15 또는 IFN-γ가 추가 보충되었다. 동일한 성장 인자들을 가진 신선한 배지가 5-6 일마다 첨가되었다. 배양 기간이 끝났을 때, 세포 개수가 계수되고 세포 표현형(cell phenotype)이 유세포 분석법(flow cytometry)으로 분석되었다. 각 성장 인자들은 500 ng/ml에서 0.1 ng/ml까지의 연속 희석법(serial dilutions)으로 각각 따로 사용되었다. 그래프들이 각각의 사이토킨(IL-2, IL-7, IL-15 및 IFN-γ)에 대해 얻어진 최상의 배양 조건 (즉, Vδ1⁺ 세포들의 최대 배수 증식)을 나타낸다. 대조군 시료(control sample)은 IL-4 및 항-CD3 mAb만을 함유하였다.

D. 모든 CD3⁺ PBLs은 동일한 공여자의 말초 혈액으로부터의 항인간 CD3 mAb (상자성 비드와 결합됨)를 갖는 MACS에 의해 분리되었고 전술한 바와 같이 배양 및 분석되었다. 3 번의 중복실험(technical replicates)의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 통계 분석에는 Graphpad-Prism 소프트웨어가 사용되었다. 부분 집단 간의 차이점들은 Student t test를 사용하여 평가되었으며, 중요한 경우 도면에서 *P < .05; **P < .01; 및 ***P < .001로 표시되었다.

도 4는 15 일 동안 시험관 내 배양 전후의 Vδ1 ⁺ PBLs의 백분율들을 나타낸다. 한 건강한 공여자로부터의 TCRγδ⁺ PBLs는 전술한 바와 같이 MACS에 의해 분리되었고 200 ng/ml IFN-γ, 1 ug/ml α-CD3 및 100 ng/ml IL-4의 존재 하에 배양되었다. 성장 인자들의 동일한 조합을 함유하는 새로운 배지(fresh medium)의 일부가 5-6 일마다 추가되었다. 15 일째에 FACS-plot 분석을 보여준다. 3가지 독립적인 실험의 대표 결과들이다.

도 5는 시험된 세포 배양 배지의 패널(panel)을 도시한다. 한 건강한 공여자로부터의 TCRγδ⁺ T PBLs는 전술한 바와 같이 MACS에 의해 분리되고 상이한 상업적으로 이용 가능한 무 혈청 임상 등급 세포 배양 배지(commercially available serum-free clinical grade cell culture media)에서 배양되었다. 세포들은 먼저 70ng/ml IFN-γ, α-CD3 및 100ng/ml IL-4의 존재하에 제 1 배양 배지에서 배양되고, 이후, 100ng/ml IL-15 및 2μg/ml 항-CD3 mAb (IL-4의 부재 하에)의 존재하에 제 2 배양 배지에서 배양되었다. FACS 분석 15일 째의 세포들의 최종 수 및 세포들의 백분율들을 도시한다. 3 번의 중복실험(technical replicates)의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.

도 6은 Vδ1 ⁺ T 세포들이 시험관 내에서 증식하여 배양에서 지배적인 세포 아형(subset)이 되는 것을 도시한다. 8명의 건강한 공여자들로부터 수집된 8개의 버피 코트(Buffy Coat) 유닛들로부터 70ml의 농축된 말초 혈액(concentrated peripheral blood) (말초 혈액 450ml에 상응함)이 획득되었다. 혈액이 1,600 rpm에서 25 ℃ 35분 동안 Ficoll-Paque (Histopaque-1077, 시그마 - 알드리치)에서 1:3의 부피비로, 희석되지 않게 원심 분리되었다. 단핵 세포들(PBMCs)을 함유한 계면이 수집되고 (식염수 완충액에서) 세척되었다. TCRγδ⁺ PBLs은 전술한 2단계 MACS에 의해 분리되고, 5 % 자가 혈장 및 1 mM L-글루타민으로 보충된 무혈청 배양 배지 (OPTMIZER, GIBCO)에 재현탁되었다. 세포들은 0.5x10⁶ cells/ml의 농도로 씨드되고(seeded) 37 ℃ 및 5 % CO₂ 인큐베이터에서 폐쇄된 가스 투과성 1 L 세포 배양 플라스틱 백들에서 증식되었다. 이전에 기술된 2단계 프로토콜에 따라 성장 인자들이 세포 배양 배지에 첨가되었다: 70 ng/ml 항-CD3 mAb, 100 ng/ml IL-4, 70 ng/ml IFN-γ, 7 ng/ml IL-21 및 15 ng/ml IL-1β가 제1 배양 배지에 첨가되었고, 70 ng/ml IL-15, 100 ng/ml IFN-γ, 15 ng/ml IL-21 및 1 ㎍/ml 항-CD3 mAb가 제2 배양 배지에 첨가되었다.

오래된 배지의 일부가 제거되고 성장 인자들이 보충된 새로운 배지가 5-6 일마다 첨가되었다. 액세서리(accessory) "피더 (feeder)"세포들은 이 시스템에서 요구되지 않는다. 좌측 패널은 유세포 분석기에 의해 분석된 전체 생세포 중 CD3⁺ Vδ1⁺ 세포들의 비율들을 나타낸다. 우측 패널은 초기 세포 수외 비교하여 CD3⁺ Vδ1⁺ T 세포들의 절대적인 수의 증가 배수를 나타낸다. 살아있는 세포들은 haemocytometer에서 트리판 블루-양성 배제(Trypan Blue-positive exclusion)를 사용하여 계수되었다. 세포들의 수를 평균 3회 측정한 것들을 도시한다.

도 7은 시험관 내에서 증식된 Vδ1 ⁺ T 세포에서의 여러 세포 표면 마커들의 발현을 나타낸다. 배양 16 일 후 CD3⁺ Vδ1⁺ T 세포들에서 활성화 수용체들인 NKp30, NKp44 및 NKG2D의 발현(표 8에서와 같이). Isotype mAb 대조군 염색(control stainings)도 도시되어 있다(NKp30 및 NKp44 발현에 대한 대조군은 동일함).

도 8은 시험관 내 증식된 TCRγδ ⁺ T 세포들이 CLL 세포들에 대해 세포 독성을 지니고 있지만 자가(autologous) PBMCs에 대해서는 세포 독성을 지니고 있지 않음을 나타낸다. 증식 및 분화 21 일 후에(도 6에 기재되었듯이), 생성된 TCRγδ⁺ T 세포들은 37 ℃에서 3시간 동안 표적 세포들(DDAO-SE로 미리 표지 됨)과 함께 배양되었고, 표적 세포 사멸은 Annexin V 염색(Annexin V staining)에 의해 평가되었다.

(A) 민감한(susceptible) MEC-1 CLL 세포 (상부 패널) 및 민감하지 않은(non-susceptible) 자가(autologous) PBMC들(하부 패널)에 대한 유세포 분석. 3 번의 중복 실험의 대표적인 도표이다.

(B) 상이한 표적의 영향: MEC-1 백혈병 세포 살상에 대한 NKG2D 또는 NKp30에 대한 항체 차단 및 이펙터(effector) 세포 비율. 오차 막대들(error bars)은 SD (n = 3, *P < .05)를 나타낸다.

(C) 공여자 A의 증식 (및 분화된) TCγδ⁺ T 세포들(여기서 "DOT-세포들"로 명명됨)이 3 개의 B-CLL 1차 세포 시료들(primary cell samples) (CLL/SLL 환자의 말초 혈액 MACS에 의해 CD19가 농축됨(enriched)) 또는 자가 건강한(autologous healthy) PBMCs와 함께 배양되었다. 3번의 중복 실험의 평균+ SD(표준편차)를 나타낸다.

자세한 방법 : MEC-1 CLL 세포계^<46>는 독일 생물 자원 센터 (DSMZ)에서 획득되었다. MEC-1 종양 세포들은 T25 플라스크들에서 10 % 소태아 혈청, 2mM L-글루타민을 함유하는 완전한 10 % RPMI 1640에서 배양되고 3-4일마다 1:3 비율로 희석 및 분획되어 10⁵-10⁶cells/mL로 유지되었다. 세포 독성 분석법(cytotoxicity assay)을 위해 시험관 내 증식된 TCRγδ⁺ T 세포들은 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 도말되었다(plated). 종양 세포계 또는 백혈병 1차 시료들(primary samples)은 CellTrace 원적외선 DDAO-SE (1 μM, Molecular Probes, Invitrogen)로 염색되었고 70ng/ml IL-15의 존재 하에 37 ℃, 5 % CO₂에서 3 시간 동안 RPMI 1640 배지에서 TCRγδ⁺ T 세포들을 갖는 이펙터 비율(effector ratio)로 지시 표적(indicated target)에서 배양되었다. 모든 세포들은 Annexin V-FITC (BD Biosciences)로 염색되고 유세포 계측법으로 분석되었다.

도 9는 활성화된 TCRγδ ⁺ T 세포들이 고농도의 IFN -γ를 생산한다는 것을 보여준다. TCRγδ⁺ T 세포들은 전술한 바와 같이 2단계 배양 프로토콜에 뒤이어 21일 동안 세포 배양 백(bag)들에서 2명의 건강한 공여자들로부터 생산되었다. 세포들은 세척되어 96-well 플레이트에 도말되고 100 ng/ml IL-15 및 2 μg/ml 항-CD3 mAb가 보충된 새로운 배지로 재자극(re-stimulated)되었다. 48시간 후 세포 배양 상청액(supernatant)들은 Cytometric bead array (BD Biosciences)에 의해 유세포 분석기로 분석되었다. OpTmizer는 활성화 화합물이 보충되지 않은 배지에 보관된 세포들을 의미한다. 3번의 중복실험의 평균 + SD를 나타낸다. 오차 막대들은 SD (n = 3, **P < .01)를 나타낸다.

도 10은 CLL/SLL 환자의 TCRγδ ⁺ T 세포들이 시험관 내에서 견고하게 증식되고 CLL / SLL 세포 및 CMV 감염 세포들에 대해 고도의 세포 독성을 가짐을 보인다. 3명의 CLL/SLL 환자로부터의 MACS-분류된(MACS-sorted) TCRγδ⁺ PBLs이 전술한 바와 같이 사이토킨들 및 mAb로 21일 동안 배양되었다. 좌측 패널: 세포들은 TCRVδ1/CD3 동시 - 발현을 위해 유세포 분석법으로 분석되었고 CD3⁺Vδ1⁺ T 세포들의 배율 증가가 계산되었다. viability dye (Zombie Violet; Biolegend)로부터 유세포 분석법으로 생세포가 확인되었고 혈구계(haemocytometer)에서 트리판 블루(Trypan Blue)로 개수가 계수되었다. 우측 패널: CLL/SLL 환자로부터의 TCRγδ⁺ T 세포는 CLL/SLL-유래 MEC-1 세포 또는 인간 피부 섬유 아세포(FFB)를 갖는 96-well 플레이트에서 1 : 10 표적-이펙터(effector) 비율로 3 시간 동안 공동 배양되었다. FFB는 건강한 또는 YFP⁺ 사이토 메갈로 바이러스 균주 AD169로 감염됨(m.o.i 0.005); 오차 막대들은 SD (각 군에 대해 n = 3)을 나타낸다. DOT-세포로 배양 전에 죽은 종양 세포의 비율은 각 그룹에서 약 20 %이다. SLL은 소 림프 구성 림프종(Small Lymphocytic Lymphoma)이다.

도 11은 시험관 내 증식된 TCRγδ ⁺ T 세포들이 다양한 조직 기원의 암세포에 대해 세포 독성을 가짐을 보여준다. 한 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 TCRγδ⁺ T 림프구가 MACS-분류되고, 전술한 2단계 배양 프로토콜에 따라 21일 동안 사이토킨들 및 항-CD3 mAb의 존재 하에 생체 외에서 자극되었다. 세포들은 96-well 플레이트에서 3시간 동안 다음의 종양 세포계 패널과 함께 공동 배양되었다: MOLT-4 (급성 림프 구성 백혈병; ALL); HL-60 (급성 골수성 백혈병; AML); K562 (만성 골수성 백혈병; CML); MEC-1 (만성 림프 성 백혈병; CLL); HELA (자궁 경부암); Daudi (버킷 림프종); THP-1 (급성 단핵구 백혈병; AMoL); MDA-231 (유방암), PA-1 (난소 암종); PC3 (전립선 암종) 및 HCT116 (결장암종). 종양 세포 사멸은 Annexin-V 염색법으로 평가되었다 (n = 3 중복 실험).

도 12는 주입된 TCRγδ ⁺ T 세포들이 제 자리에서(home) 이종 이식 종양 모델에서 살아남는 것을 보여준다.

A. 2x10⁷ TCRγδ⁺ T 세포들은 종양 보유 (MEC-1 CLL\SLL 세포계) NSG 면역 결핍 숙주로 옮겨졌다. TCRγδ⁺ T 세포의 전달 30일 후, 동물들은 희생되었고, TCRγδ⁺ T 세포-자손은 표시 조직에서 FACS에 의해 평가되었다. 분석된 모든 조직에 TCRγδ⁺ T 세포들이 존재하고 또한 CLL 종양의 존재 하에 CD3⁺ Vδ1⁺T 세포가 고도로 농축(enriched)되며, 이는 우선적 적합성 및/또는 활성화를 시사한다. 도트-플롯(Dot-Plots)은 분석된 6마리 동물 중 대표 동물로부터의 것이다.

B. 주입된 TCRγδ⁺ T 세포는 생체 내에서 NCR들을 발현한다. 전달 후 30일에 간으로부터 회수된 TCRγδ⁺ T 세포는 NCR 발현을 위해 FACS에 의해 분석되었다. NKp30과 NKG2D의 높은 발현에 유의해야 한다. 위의 점으로 된 도표들은 isotype 대조군들이다. 분석된 3 동물의 대표 동물이 표시된다. C. 주입된 TCRγδ⁺ T 세포는 BRG 면역 결핍성 숙주로 존재(home into BRG immunodeficient hosts)할 수 있다. 상이한 공여자로부터의 10⁷ TCRγδ⁺ T 세포가 CLL 종양 보유 BRG 숙주로 옮겨지고, 전달 72시간 후 FACS에 의해 정량화된다. TCRγδ⁺ T 세포는 폐와 간 모두로부터 회수될 수 있었고, TCRVδ1⁺-발현 세포는 초기 전달과 유사한 비율로 발견되었다. 2마리 중 1마리가 표시된다.

도 13은 TCRγδ ⁺ T 세포가 생체 내에서 종양 성장을 제한할 수 있음을 보여준다. 10⁷ 루시퍼라제 발현(Luciferase-expressing) MEC-1 CLL/SLL 종양 세포들은 면역 결핍 BRG 숙주에게 피하(subcutaneously) 투여(transferred) 되었다. 투여 10 및 15일 후, 발광 분석에 의해 입증 되었듯이 10⁷ TCRγδ⁺ T 세포 또는 대조군 PBS는 정맥 내에 CLL 종양 보유 숙주로 투여되었다. CLL/SLL 종양 성장은 캘리퍼를 사용하여 주기적으로 측정되었다. 종양 크기가 보여지고, CLL 종양 크기에서 보여질 수 있는 TCRγδ⁺ T 세포들의 효과에 주목한다(그룹당 n = 8 마리의 쥐).

도 14는 TCRγδ ⁺ T 세포가 CLL 종양 전파를 제한한다는 것을 보여준다.

A. 10⁷ 루시퍼라제-발현 MEC-1 CLL/SLL 종양 세포는 면역 결핍 NSG 숙주 내로 피하 투여되었다. 투여 10 및 15일 후, 발광 분석에 의해 입증되었듯이 TCRγδ⁺ T 세포들(2x10⁷) 또는 대조군 PBS는 정맥 내의 CLL/SLL 종양 보유 숙주로 투여되었다. CLL/SLL 종양의 성장은 Caliper를 사용하여 주기적으로 측정되었다. 종양 크기가 보여지며, 치료 초기에 부분 및 일시적인 경향을 주목해야 하지만 TCRγδ⁺ T 세포들은 이들 숙주에서 더 빠른 벌크 CLL/SLL 종양의 성장을 제한할 수 없었다.

B-D. CLL/SLL 종양 세포계는 이 실험에서 다른 기관으로 퍼질 수 있다. B에 도시된 도표는 TCRγδ⁺ T 세포 전달 또는 대조군 PBS를 수용하는 NSG 숙주로부터의 실험 후에 회복된 기관의 FACS 분석을 도시한다. 여기서, 다른 장기에서 회복된 CLL/SLL 종양 세포의 일반화된 감소가 관찰되었으나, 이 효과는 이 모델에서 종양이 퍼지는 주요 기관인 간에서 더욱 두드러졌다.

C. PBS 치료된 동물의 조직학적 표시 부위에서의 CLL/SLL 종양 전이와 치료된 동물에서 종양 침윤의 부재를 보여주는 각 그룹의 대표 동물의 조직학적 (H & E) 분석. (*p <0.05; **p <0.01).

D. 종양 침윤이 없는 동물에 대해 CLL/SLL 종양 침윤이 발견된 각 군의 동물을 나타내는 조직학적 분석의 요약이 도시되어 있다. 채점은 도15에 묘사된 실험에서 동물의 표시된 조직에서 H & E로 염색된 조직학적 시료들에 대해 인증된 병리학자에 의해 정보가 없는 상태로(blindly) 수행되었다. 결과들은 분석된 모든 동물에 대해 나타내지며, 시험관 내 증식된 TCRγδ⁺ T 세포들로 치료된 동물 군에서의 전체 종양 전파의 명백한 감소를 나타낸다.

도 15는 TCRγδ ⁺ T 세포가 원발 종양에 침투하여 생체 내에서 활성화될 수 있음을 보여준다.

A. MEC-1 종양 세포들로 전이되고 TCRγδ⁺ T 세포들로 치료된 NSG 동물의 원발(primary) CLL/SLL 종양의 CD3 염색 절편들에 대한 IHC 분석을 도시한다.

B. 우리는 여러 장기에서 생체 내 CD69 (n = 3, 대표적인 도트 도표가 표시됨), Nkp30 및 NKG2D 발현 (n = 2)을 분석하여, CLL/SLL 종양에서 회수된 TCRγδ⁺ T 세포들에서 이들 활성화 마커의 주요 발현과 함께 최근 활성화된 TCRγδ⁺ T 세포들을 발견하였다.

도 16은 혈액 시료의 생화학적 분석을 나타낸다.

(A) 도14에 나타난 실험에서 동물의 부검시에 혈액을 채취하였고, ALT/GPT (Aminotransferase), AST/GOT (Aspartate Aminotransferase), BRE (Blood Urea Nitrogen), Creatinin, CPK(Creatin phosphokinase) 및 LDH (Lactate Dehiidrogenase)에 생화학적 분석이 적용되었다.

(B) 도11에 표시된 동물의 경우 A와 동일하다. DOT 세포 치료와 관련된 독성에 대한 증거는 발견되지 않았다.

생체 내 연구의 상세한 방법:

Balb/c Rag^-/- γc^-/- ^<47>동물들은 Taconic (USA)로부터 획득되었다. NOD-SCIDγc^-/- ^<48> 쥐들은 Jackson Laboratories (USA)로부터 획득되었다. BRG 또는 NSG 쥐들에게 MEC-1 세포들이 피하 주사되고 10⁷ 또는 2 × 10⁷ DOT 세포들의 2회 정맥 내 투여로 6일 및 11일 후에 처치된 다음 (종양 크기, 조직학, 종양의 유세포 분석법 또는 장기 침윤 및 혈액 생화학) 분석되었다. 모든 동물 절차는 Direcao Geral de Veterinaria의 국가 지침에 따라 수행되었으며 관련 윤리위원회의 승인을 받았다. 생체내 DOT-세포 전달 후 표현형 분석을 위해, 심장 천자(cardiac puncture)를 통한 채혈을 위해 동물을 Eutasil을 사용하여 안락사시키고; PBS + 헤파린으로 신속히 살포되었다. 장기는 균질화되었고 70 μM 세포 여과기로 세척되었다. 대퇴골은 씻은 후 여과(flushed and then filtered) 되었다. 세포들은 ebioscience, Biolegend, Myltenyi Biotec 또는 Beckton Dickinson의 항체: CD45 (30-F11) 및 항-인간 항체: CD45 (HI30)로 염색되었다.

사용된 다른 항체들은 체외 연구에 일반적이다. 항체들은 FITC, PE, PerCP, PerCP-Cy5, PE-Cy7, APC, APC-Cy7, Pacific Blue, Brilliant Violet 421 및 Brilliant Violet 510 fluorochromes에 결합되었다. 통계 분석은 Graphpad-Prism 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 시료 수단은 Student의 언페어드(unpaired) t-테스트를 사용하여 비교되었다. F-테스트를 사용했을 때 두 시료가 서로 다른 경우 데이터가 로그 변환되고, 다르지 않으면 언페어드 t-테스트가 로그 변환된(log-transformed) 데이터에 적용되었다. 생존 데이터의 경우 로그 순위 (Mantel-Cox) 테스트가 사용되었다.

생체 내 실험 설계: 우리는 Balb/c Rag^-/- γc^-/- (BRG) 동물들에 CLL/SLL 유래 MEC-1 세포들의 피하 입양전달 시 이종 이식 인간 CLL의 이전에 기술된 모델을 사용하였으며, NOD-SCIDγc^-/-(NSG) 동물들을 숙주로서 사용하여 채용했다. 처치 또는 PBS 대조군(PBS control)을 받는 동물들이 종양 보유 동물이었음을 확인하기 위해, 우리는 처치 세포들(treatment cells)을 부여(ascribing)하기 전 초기의 시점에서 종양 생착을 검출하고 측정하기 위해 MEC-1 CLL 세포에 파이어플라이 루시퍼라제(firefly-luciferase)를 형질 도입(transduce)했다. 7 또는 4일 후에 (여러 연구에서) 우리는 치료(또는 PBS 대조군)를 동물들에 부여하기 전에 발광 기능으로서의 종양 부하를 결정하기 위해 루시퍼린을 복강내 주입한다. 동물을 케이지에 무작위로 분배하고 7일차에 측정된 발광량에 따라 각 처치(PBS 또는 DOT-Cells)를 부여한다. 동물이 가장 높은 발광량을 갖도록 치료 받고, 두 번째로 높은 PBS를 받고, 세 번째로 높은 처치 등을 받는 방식으로 진행된다. 이로 인해 그룹으로는 규칙 있게 배분되었지만 서로 다른 케이지에서는 무작위로 배분되었다. 2 마리의 추가 동물은 초기 호밍(homing) 분석을 위해 표시 실험(indicated experiments)에서 DOT-Cells를 받았다.

우리는 실험 당 각각 다른 하나의 공여자로부터의 세포들을 사용하여 2 개의 10⁷ or 2x10⁷ DOT-Cells 투여(5 일 이내)를 수행하였다. 종양은 캘리퍼를 사용하여 측정되었고 세 가지 수직 측정을 했다. 사용된 공식은 1/2 x L x W x H이었다^<49>. 종양 측정치가 1000 mm³에 이르면 동물들이 희생되었다.

발광 분석: GFP-파이어플라이 루시퍼라제로 MEC-1 세포계를 형질 도입한 후, 성장 세포들이FACS-Aria (Becton Dickinson, USA)를 사용한 GFP 발현에 따라 선별되고 95 % 이상의 GFP 양성 세포들로 분류(sorted)되었다. 이 세포들은 배양되어 숙주 동물 (50μl PBS) 피하로 전달 때까지 보관되었다. 전달 후 표시 시점에서 동물들이 마취되고(Ketamin/Medetomidine) 루시페린이 (복강 내로) 주입된다. 4 분 후에 IMM 바이오 이미징 시설에서 I VIS Lumina (Calliper LifeSciences)를 사용하여 루시퍼라제 활성이 검출되고 획득되었다. 그런 다음 마취상태에서 되돌아가고 동물들이 이전 거소로 하우징(housing)으로 돌려보내졌다.

림프구 수 : 세포 수는 혈구계 또는 Accuri Flow cytometer (Becton Dickinson, USA)를 사용하여 계수되었다. 장기(organ) 당 수는, 시료들이 분리되기 전과 후에 기관에 가중치를 주면서 조직 분석을 위해 시료들을 채취할 때 추정되었다. 제시된 숫자는 전체 장기에 대해 수정되었다. 골수 데이터에서 절대 수치가 계산되어 대퇴골 1개에 대해 표시되었다.

조직 병리학 및 면역 조직 화학: 쥐들을 마취 과량으로 희생시켜 부검이 시행되고 선택된 장기 (폐, 심장, 장, 비장, 간, 신장, 생식 기관, 뇌, 소뇌, 척수 및 대퇴골)가 수확되고 10 % 중성 완충 포르말린에 고정되고, 파라핀에 끼워져(embedded) 3 μm의 절편들이 헤마톡실린과 에오신 (H & E)으로 염색되었다. 끼워지기 전에 Calci-Clear™ (Fisher Scientific)에서 뼈들이 더 제거되었다. Leica MC170 HD 현미경 카메라에 결합된 Leica DM2500 현미경을 사용하여, 실험군에 대한 정보가 없는(blinded) 병리학자에 의해 조직 절편들이 검사되었다.

CD3에 대한 면역 조직 화학 염색(Dako, cat. no. A0452)은 Dako Autostainer Link 48과 함께 표준 프로토콜을 사용하여 IMM의 조직 병리학 및 비교 병리 실험실에서 수행되었다. 항원 열회수(heat-retrieval)는 낮은 pH 용액 (pH 6)으로 DAKO PT 링크에서 수행되었고, ENVISION kit (Peroxidase/DAB 검출 시스템, DAKO, Santa Barbara, CA)로 배양된 후 Harri's hematoxylin counterstaining (Bio Otica, Milan, IT)이 이루어진다. 음성 대조군은 1 차(primary) 항체들의 부재(absence)를 포함하고; 음성 대조군들에서는 CD3 염색이 관찰되지 않았다. Leica MC170 HD 현미경 카메라와 결합된 Leica DM2500 현미경으로 이미지들이 획득되었다.

쥐 혈액 생화학 : 쥐들은 심하게 마취되고 혈액은 심장에서 헤파린 코팅 튜브로 수집되어 독립적인 실험실에 표시된 생화학적 파라미터(parameter) 분석을 위해 보내졌다. 생화학적 파라미터들은 RX 모나코 임상 화학 분석기 (RANDOX)의 혈청에서 측정되었다.

도 17은 2 단계 MACS-분류 후 TCRγδ ⁺ PBL 농축(enrichment)을 도시한다.

4 명의 건강한 지원자로부터 말초 혈액(버피 코트(buffy coats)로부터 얻어진)이 수집되었고 전체 TCRγδ⁺ 세포들은 MACS에 의해 분류되었다: 먼저 TCRαβ 고갈이 수행된 다음 CD3⁺ 세포가 양성적으로(positively) 선택되었다. 세포들은 TCRγδ, CD3 및 TCRVδ1에 대해 염색되었고 유세포 분석법으로 분석되었다. 도트 도표들은 각 MACS 정렬 단계 전후에 TCRγδ⁺ PBLs의 일부(왼쪽 패널); 및 Vδ1⁺ T 세포들의 초기 및 최종 비율을 보여준다(우측 패널).

도 18은 얻어진 Vδ1 ⁺ T 세포들의 활성화 및 성숙 표현형의 특성을 나타낸다.

(A) 배양 21 일째에 Vδ1⁺ T 세포들의 세포 표면 표현형의 유세포 분석 비교 (전술한 2 단계 배양 프로토콜을 사용); LEGENDScreen 키트 (Biolegend)를 사용하여 분석한 바와 같이 새로 분리된 Vδ1⁺ T 세포들(점선)을 사용(전체 라인)함. 림프구 활성화 및 분화와 관련된 여러 마커들의 히스토그램 오버레이 및 접착 및 이동과 관련된 마커들이 도시되어 있다. 한 건강한 공여자들의 세포들이 표시된다.

(B) 새로 분리된 Vδ1⁺ T 세포들(공여자 1 및 2)과 비교하여, 4 명의 상이한 건강한 공여자들(Cultur.1-4)로부터 생산된 Vδ1⁺ T 세포들을 배양한 것(배양 21 일째)의 각 표면 마커에 대한 양성 세포의 백분율을 나타내는 히트 맵. 오른쪽에 색상 코드가 표시된다. 세포 생성 후 표현형 분석을 위해: LegendScreen 키트 (Biolegend)를 사용하여 세포들이 항-CD3-APC (clone UCHT1), 항- TCRγδ1-FITC 및 수용체 패널로 염색되었다.

도 19는 백혈병 (그러나 건강하지 않은) 세포들에 대한 TCRγδ ⁺ T 세포들의 TCR/NCR-의존성 세포 독성을 도시한다.

2명의 건강한 공여자로부터 생성된 TCRγδ⁺ T 세포들이 증식 및 분화된 것을, 증가된 이펙터/표적 비(이전의 2 단계 배양 프로토콜을 사용)에서, 또한 지시 분자에 대한 (α, anti-) 차단 항체들의 존재 하에서 개별적으로 (Expt 1) 또는 조합하여 (Expt 2) (in presence of blocking antibodies for (α, anti-) the indicated molecules, either individually (Expt 1) or in combinations (Expt 2)) MEC-1 (CLL) 표적 세포에 대한 상이한 실험으로 시험 되었다. 가장 높은 이펙터/타겟 비율 (10 : 1)이 차단 실험에 사용되었고 이 비율(IgG 이소 타입 항체와 함께)의 회색 막대가 대조군으로 사용되었다. 죽은 (Annexin-V⁺) MEC-1 표적 세포의 백분율들이 보여진다. * 및 #은 각각 IgG isotype 대조군(control) 또는 α-TCRVδ1과 관련하여 상대적으로 유의한 차이가 있음을 의미한다(평균+SD; ^{*, #}p < 0.05; ^{**, ##}p < 0.01; Student 's t-test).

세포 독성 분석을 위해, MEC-1 종양 세포들이 10 % 소태아 혈청, 2mM L-글루타민이 함유된 완전한 10 % RPMI 1640로 T25 플라스크들에서 배양되고 매 3-4 일마다 1 : 3의 비율로 희석 및 분리되어 10⁵ 내지 10⁶ cells/mL로 유지되었다. 시험관 내 증식된 TCRγδ⁺ T 세포들이 96-well 둥근 바닥 플레이트에 도말되었다. 종양 세포들이 CellTrace Far Red DDAO-SE (1 μM; Molecular Probes, Invitrogen)로 염색되고 37 ℃ 및 5 % CO²에서 3 시간 동안 RPMI 1640 배지에서 TCRγδ⁺ T 세포들과 함께 표시 표적:이펙터 비율로, 70ng/ml IL-15 존재 하에서 배양되었다. 수용체 차단을 위해, γδ PBLs가 다음의 차단 항체들로 사전 배양되었다(pre-incubated): 인간 항-TCRγδ (clone B1); 인간 항-NKG2D (clone 1D11); 인간 항-CD2 (clone RPA-2.10); 인간 항-CD3 (clone OKT-3); 인간 항-NKp30 (clone P30-15); Biolegend의 인간 항-NKp44 (clone P44-8), mouse IgG1,k (clone MOPC-21), mouse IgG2b (clone MPC-11), mouse IgG3k (clone MG3-35).

인간 항-CD226 (clone DX11)은 BD Biosciences로부터 입수하였다. 인간 항-Vδ1 TCR (clone TCS-1 또는 TS8.2)은 Fisher Scientific으로부터 입수되었고, 인간 항-TCRγδ (clone IMMU510)는 BD Biosciences로부터 입수 되었다. 차단 항체들은 살해측정 동안 배양 배지에서 유지되었다.

마지막으로, 모든 세포들은 Annexin V-FITC (BD Biosciences)로 염색시키고 유세포 분석법으로 분석되었다.

도 20은 시험관 내 증식된 Vδ1 ⁺ 및 Vδ1 ^- Vδ2 ^- T 세포들에서 세포 표면 NK 수용체를 활성화시키는 발현을 나타낸다.

증식 및 분화된 TCRγδ⁺ T 세포들은 이전에 기술된 2 단계 배양 프로토콜을 사용하여 건강한 공여자들로부터 생산되었다. 배양 21 일 후 CD3⁺ Vδ1⁺ 세포들 및 CD3⁺ Vδ1^- Vδ2^- T 세포들에서 활성화 수용체 NKp30 및 NKp44의 발현을 보여준다. 첫째, CD3⁺Vδ2⁺ 세포들이 (형광 염색체에 접합된 항-CD3 및 항-Vδ2 항체로) 확인되었고 분석에서는 제외되었다. 나머지 CD3⁺ 세포들이 Vδ1 및 NKp30, NKp44 및 이소 타입 대조군의 발현에 대해 분석되었다. 4 명의 다른 공여자들을 대상으로 한 4번의 독립적인 실험 결과들을 보여준다.

도 21은 백혈병 세포들에 대한 TCRγδ ⁺ T 세포들의 증식된 Vδ1 ^- Vδ2 ^- T 아형세포의 세포 독성을 나타낸다.

한 건강한 공여자로부터 (이전에 설명한 2 단계 배양 프로토콜을 사용하여) 생산된 TCRγδ⁺ T 세포가 증식 및 분화된 것이, 형광 염색체에 결합된 단클론 항체들 및 CD3⁺ Vδ1^- Vδ2^- T 세포들을 이용하여 CD3⁺ Vδ1^- 및 Vδ2^- T 세포 마커들에 대해 염색되었고, CD3⁺ Vδ1^- Vδ2^- T 세포 모집단은 유세포 분석법에 의해 분리되었다. 그런 다음 분리된 세포들이 시험관 내에서 급성 골수성 백혈병 (AML) 표적 세포계 (KG-1, THP-1, HL-60 및 NB-4)에 대해 10 : 1의 이펙터/표적 비율에 의해 살해분석법으로 시험되었다. 살해 분석이 전술한 바와 같이 수행되었다.

표 설명:

표 1은 최적화 과정에서 Vδ1 ⁺ T 세포의 증식(proliferation)을 자극하는 데 사용되는 분자들을 설명한다. 시약(reagent)들은 0.1 ng/ml ~ 8 μg/ml의 농도 범위에서 사용되었다. 오른쪽 열에 시약 유통 업체 또는 제조업체가 표시된다.

표 2는 시험된 배양 조건들의 요약을 나타낸다. TCRγδ⁺ PBLs는 한 건강한 공여자로부터 MACS에 의해 분리되었고, 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 96-well 플레이트에서 1 백만 cells/ml로 배양되었다. 세포들이 5 % 자가 혈장, 1 mM L-글루타민 및 전술된 성장 인자들이 보충된 완전한 배지 (Optmizer CTS, GIBCO)에서 증식되었다. 배양 기간의 말기에 세포들이 계수되고 세포 표현형이 유세포 분석법으로 분석되었다. 연속된 4 회의 실험 결과들을 보여준다. 각 실험의 최상의 배양 조건은 배수 증가에 따라 순위가 매겨진다. Vδ1⁺ T 세포들의 배수 증식률은 (배양 말기의 Vδ1⁺ T 세포의 절대 수) / (배양 0일째의 Vδ1⁺ T 세포의 절대 수)로 계산되었다. 2 개의 독립적인 실험의 대표 결과를 보여준다.

표 3은 시험된 배양 조건들의 요약을 보여준다. 한 건강한 공여자로부터 MACS에 의해 TCRγδ⁺ PBLs가 분리되고 전술한 성장 인자들의 존재하에 14 일 동안 배양되었다. 배양 14 일째에, 세포들이 분할되고, 세포의 한 분획이 종전과 같이 배양되고, 세포들의 다른 분획이 IL-4의 부재하에 지시된 성장 인자들의 존재하에 배양되었다. 21 일째에 세포들이 계수되고 세포 표현형이 FACS에 의해 분석되었다. 두 번의 독립적인 실험 결과를 보여준다. 세포 독성 분석 역시 21 일째에 MOLT-4 백혈병 표적들에 대해 생성된 TCRγδ⁺ 세포들을 사용하여 수행되었다(방법은 도 8에 기재되어 있다). Fortineta II 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 Annexin-V 시약으로 양성 염색을 하여 세포사멸된 (죽는) 표적 세포들이 검출되었다. 기초 종양 세포 사멸 (즉 TCRγδ⁺ 세포와 공동 배양되지 않은 종양 시료에서의 세포 사멸 종양 세포의 백분율)은 10±3 %였다. 두 개의 중복실험의 평균을 보여준다.

표 4는 시험된 배양 조건들의 요약을 보여준다. 한 건강한 공여자로부터 MACS에 의해 TCRγδ⁺ PBLs 가 분리되고 전술한 성장 인자들의 존재하에 2 단계 및 3 단계 배양 프로토콜로 15 일 동안 배양되었다. 세포들이 계수되고 세포 표현형이 배양 기간 말기에 FACS에 의해 분석되었다. 2개의 독립적인 실험의 대표 결과들을 보여준다.

표 5는 시험된 배양 조건들의 요약을 보여준다. TCRγδ⁺ PBLs 가 한 건강한 공여자로부터 MACS에 의해 2단계 프로토콜로 분리되었고 전술한 성장 인자들의 존재하에 21 일 동안 배양되었다. 세포가 계수되고 세포 표현형이 배양 기간 말기에 FACS에 의해 분석되었다. 2개의 독립적인 실험의 대표 결과를 보여준다.

표 6은 2단계 MACS 프로토콜을 통해 분리된 TCRγδ ⁺ PBLs 의 순도 및 표현형을 나타낸다.

PBMCs는 8명의 건강한 공여자들로부터 채취한 버피 코트 (Buffy Coat) 제품으로부터의 피콜(ficoll)에서의 밀도 구배 원심 분리에 의해 획득되었다. TCRγδ⁺ T 세포들은 도 2에서 설명된대로 2단계 MACS 프로토콜에 의해 추가로 분리되었다. 세포 표현형은 세포 표면 항원의 유세포 분석법으로 특성화되었다. 데이터는 전체 생존 세포의 백분율들에 해당한다.

표 7은 시험관 내 증식된 TCRγδ ⁺ T 세포들의 순도 및 표현형을 나타낸다. 건강한 공여자들(donors)(표 6에서와 동일)로부터 MACS-분류된 TCRγδ⁺ T 세포들이 전술한 2 단계 배양 프로토콜에 따라 세포 배양 백에서 21일 동안 배양되었다. 세포 집단은 유세포 분석법으로 특징지어졌다. TCRγδ⁺ T 세포들 및 오염 세포들의 백분율을 배양 물에 존재하는 총 살아있는 세포들에 대해 상대적으로 나타낸다.

표 8은 배양된 Vδ1 ⁺ T 세포 대해 새롭게 분리된 것에 대한 NCR 및 NKG2D의 발현을 나타낸다.

사이토킨 및 항-CD3 mAb 치료의 16 또는 21일 후 CD3⁺Vδ1⁺ T 세포들에서 활성화 수용체들인 NKp30, NKp44 및 NKG2D의 발현. 이 표의 데이터는 10명의 독립적인 공여자들로부터 얻은 데이터를 대표하며, NKp30과 NKp44 발현이 다른 공여자들 사이에서 약 10 %와 70 % 사이에서 변하는 반면 NKG2D는 모든 공여자들의 Vδ1⁺ PBLs 의 80 % 이상에 의해 발현된다는 것을 주목한다.

표 9는 CLL / SLL 환자의 MACS 분류 전 및 후 TCRγδ ⁺ PBLs의 순도와 표현형을 보여준다. B- 세포 만성 림프 성 백혈병 (CLL) 세포들은 정보 제공 동의 및 제도 검토위원회 승인 후 첫 번째 프리젠테이션(presentation)에서 환자의 말초 혈액으로부터 채취되었다. TCRγδ⁺ T 세포들은 3 명의 CLL 환자 (CLL-1-3)의 말초 혈액으로부터 MACS-분류되었고, 세포 집단 표현형은 세포 표면 항원의 유세포 분석법에 의해 특징화되었다. 2 단계 자기 분리 절차 전후에 즉시 얻은 TCRγδ⁺ T 세포들 및 오염 세포들의 백분율을 보여준다. 각 아형세포는 전체 살아있는 세포들에 게이트 온 된다(gated on).

표 10은 오염성 자가(autologous) B-CLL 세포들이 배양물에서 잔류하는 개체군이 되는 것을 보여준다.

TCRγδ⁺ T 세포들을 3 명의 CLL/SLL 환자(표 9에서와 같음; CLL-1-3)의 말초 혈액으로부터 MACS-분류되고 이전에 기술된 바와 같이 16 일 동안 시험관 내에서 배양되었다. 세포 집단 표현형은 세포 표면 항원의 유세포 분석법에 의해 특징지어졌다. TCRγδ⁺ T 세포들 및 오염 세포들의 백분율들을 보여준다. 각각의 아형 세포는 Vδ1⁺ T 세포들에 게이트 온 된 NKp30 및 NKG2D 발현을 제외하고 전체 생세포들에 게이트 온 된다.

표 11은 이전 응용의 표 2에 제시된 시험된 배양 조건들을 보다 상세히 보여준다. TCRγδ⁺ PBLs 가 한 건강한 공여자로부터 MACSdp 의해 분리되고 96-well 플레이트의 1 million cells/ml 안에서, 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 배양되었다. 세포들은 5 % 자가 혈장, 1 mM L-글루타민 및 전술한 성장 인자들이 보충된 완전한 배지(Optmizer CTS, GIBCO)에서 증식되었다. 배양 기간의 말기에서 세포들이 계수되고 세포 표현형이 유세포 분석법으로 분석되었다. 4 회 연속 실험의 선택된 결과들을 보여준다(이전 실험의 표 2에 설명된 것과 동일한 실험이지만, 결과를 보다 완전하게 이해하기 위해 별표가 표시된 병행 대조 배양 조건 결과들을 추가로 공개함). 또한 각 조건에서 획득된 NKp30⁺ Vδ1⁺ T 세포의 백분율들을 보여준다. 각 실험의 배양 조건은 배수 증가에 따라 순위가 매겨졌다. Vδ1⁺ T 세포들의 배수 증식률은 (배양 말기의 Vδ1⁺ T 세포들의 절대 수) / (배양 0 일째의 Vδ1⁺ T 세포들의 절대 수)로 계산되었다. 2 개의 독립적인 실험의 대표 결과를 보여준다.

표 12는 시험된 배양 조건들의 요약을 나타낸다.

TCRγδ⁺ PBLs는, 전술한 바와 같이, 제시된 성장 인자들의 존재하에 건강한 공여자로부터 분리되고 증식되었다. 복수의 배양 조건을 갖는 한 실험의 선택된 결과들을 표시한다. 배양된 TCRγδ⁺ 세포들에게 IL15/IL-2/IL-7 및 IFN-γ가 미치는 영향을 더 잘 이해하기 위해, IL15/IL-2/IL-7 및 IFN-γ의 존재 또는 부재 하에서 TCRγδ⁺ 세포들이 배양 배지에서 3 가지 농도의 IL-4 및 항-CD3 mAb에서 배양되었다. 이 세포들이 IL-4 및 IFN-γ의 존재 하에 배양되었을 때 T 세포 증식에 IL-15, IL-2 및 IL-7가 미치는 해로운 영향을 보여준다. 2 개의 독립적인 실험의 대표 결과를 보여준다.

표 13은 대규모 2 단계 세포 배양 프로토콜 전후에 얻은 TCRγδ ⁺ 세포들의 총 절대 수를 보여준다. 건강한 공여자들(도 6에 표시)로부터 수득한 MACS-분류된 말초 혈액 TCRγδ⁺ 세포들은 세포 배양 증식/분화 전후에 혈구계로 계수되었다. 각각의 Buffy Coat는 450ml의 말초 혈액으로부터 농축되었으며 약 450 내지 550 million PBMCs가 포함되었다. 평균적으로, 1700 만 TCRγδ⁺ T 세포들이 각 버피 코트(Buffy Coat)로부터 MACS에 의해 수집될 수 있었다. 그러나, 미래의 임상적 응용에서, 시작 시료는 많은 수의 세포들을 포함하고 Apheresis 장비에 의해 수집되는 Leukapheresis 제품이 될 것이다. 이전 연구에서, 백혈병 환자들로부터 수집된 자극받지 않은 leukapheresis 제품은 평균 13.4x10⁹ (4.4-20.6x10⁹ 범위)의 말초 혈구 세포들을 포함하며, 그 중 약 1 억 6 천만 개의 TCRγδ⁺ 세포들(1.0-3.0x10⁸ 범위)가 MACS 이후에 획득되었다(Wilhelm, M., et al., Successful adoptive transfer and in vivo expansion of haploidentical gammadelta T cells. J Transl Med, 2014. 12: p. 45.). 이것은, 평균적으로 Buffy Coats로 획득된 것보다 약 9 배 더 많은 초기 세포들을 나타낸다. 결과적으로, leukapheresis 제품을 출발 시료로 사용된 경우 동일한 배양 시스템에서 생성될 것으로 예상되는 평균 세포 수는 약 10.2x10⁹ cells(범위 : 3.9x10⁹ - 14.4 x10⁹ cells)이다.

표 14는 약제학적 등급의 TCRγδ ⁺ T 세포들을 생산하는 데 사용된 시약들 및 물질들을 나타낸다.

실시예들 :

인간 Vδ2 ⁺ TCRγδ ⁺ T 세포의 생체 외 팽창의 최적화

본 발명자들은 시험관 내 배양된 Vδ2^- γδ T 세포들의 팽창 및 순도를 향상시키는 일련의 실험을 수행하였다. TCR의 Vδ3⁺ 사슬에 대한 상업적으로 이용 가능한 항체가 없었기 때문에, 항-TCRVδ1 mAb가 배양 최적화 과정에서 세포 시료들에서 Vδ1⁺ T 세포들을 확인하는 데에 사용되었다. 건강한 공여자들의 패널로부터의 TCRγδ⁺ T PBLs가 MACS에 의해 분리되고, IL-2 및 PHA (즉, 세포 활성화 및 증식(proliferation)의 검출 가능한 변화)로 시험관 내 자극에 대한 반응성이 시험되었다.

반응성 Vδ1⁺ PBLs 을 가진 한 명의 공여자가 나머지 최적화 연구를 위해 혈액 시료들을 제공하도록 선택되었다. 하나의 고정된 건강한 공여자에 대한 선호도는 중요했는데, 이는 여러 실험에서 얻은 결과간에 더 신뢰할 수 있는 비교가 수행될 수 있기 때문이었다. 위의 선별된 공여자는 말초 혈액에서 TCRγδ⁺ T 세포들이 정상 (그러나 높은) 비율을 보였으나 (전체 PBLs의 10 % -12 %), Vδ1⁺ PBLs (전체 PBLs의 0.3 % , 전체 TCRγδ⁺ T PBLs의 3.0 %: 도 1). 배양된 Vδ1⁺ T 세포들의 최종 수와 순도가 조금씩 향상될 때마다 유세포 분석법으로 쉽게 검출될 수 있기 때문에 그는 이 실험에 사용할 수 있는 적합한 공여자로 여겨졌다.

PBMC로부터 TCRγδ⁺ T 세포들을 분리하는 데 사용되는 단일 단계 MACS 프로토콜은 매우 효율적이어서 고도로 순수한 세포 집단들을 생성한다 (도 1). 하지만, 하나의 중요 시약(즉, Miltenyi Biotec의 자성 마이크로 비드와 접합된 인간 항-TCRγδ mAb)은 현재 임상 적용이 승인되지 않았다. 이러한 시약의 임상 등급 생산, 검증 및 규제 승인은 수년이 걸릴 수 있으며, 이 문제는 임상 응용 분야에서 전술한 프로토콜의 즉각적인 사용을 방해한다. TCRγδ⁺ T 세포들을 분리하기 위한 다른, 그러나 동등한 방법이 개발되고 채택되었다.

이 과정은 도 2에서 설명한 바와 같이, 자성 세포 분리의 두 과정으로 구성되었다. 획득된 TCRγδ⁺ T 세포의 최종 순도 수준은 이전 (단일 단계) 방법보다 낮지만 여전히 세포 배양에 적합하다. 중요하게도, 이 새로운 세포 분리 방법은 임상 적용들을 위해 이미 승인된 시약들(Miltenyi Biotec GmbH(독일) 제조)만을 사용하였다.

이어서, 본 발명자들은 말초 혈액으로부터 Vδ1⁺ T 세포들을 증식 및 분화(2-3 주에 걸쳐)시키는 능력에 대한 임상-등급 작용제 항체들 및 사이토킨들의 여러 조합을 시험하였다. 이전에 선택된 건강한 공여자로부터 수집된 TCRγδ⁺ PBLs가 MACS-분류된 것은, 58개의 T/NK 세포 활성화 분자들의 존재하에 96-well 플레이트에서, 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 2 내지 3 주 동안 배양 배지에서 배양되었다(테이블 1). 여기에는 13 가지의 다른 TCR 작용제들(agonists), 23가지의 공동 수용체 작용제들(co-receptor agonists) 및 22가지의 상이한 사이토킨들이 포함되어 있으며, 이들은 2,488 가지의 다양한 조합과 농도로 테스트되었다. 항체들은 용해성 있고 플라스틱-바운드 프리젠테이션(plastic-bound presentations) 모두에 사용되었다. 사이토킨들은 0.1 ng/ml 내지 1000 ng/ml의 농도 범위에서 시험되었고; TCR 작용제들은 0.1 ng/ml 내지 40 μg/ml로 사용되었고 보조 수용체 작용제들은 최종 농도 0.5 μg/ml 내지 80 μg/ml로 사용되었다.

연속 세포 분리와 세포 배양 증식 실험이 동일한 공여자에게서 수행 되었다. 각 실험은 활성화 분자의 약 100-400 가지 조합의 효과를 시험한다. 최적화는 기본적이고 최적화되지 않은 혼합제(cocktail)로부터 시작되었다(즉, IL-2 및 PHA의 존재하에 TCRγδ⁺ T 세포들을 배양). 활성화 분자들의 선택된 동일한 혼합제를 포함하는 신선한 배지가 5 일마다 추가되었다. 14 일 후, 세포들이 수집되고 그들의 표현형이 유세포 분석법으로 분석되었다. 각 실험의 최적 배양 조건은 (Vδ1⁺ T 세포들의 가장 높은 배수 증식을 위해) 확인되었고, 추가 최적화를 위해 선택되었으며, 모든 이용 가능한 시약들에 결합되었고, 다양한 농도로 시험되었다. Vδ1⁺ T 세포의 배수 증식 및 순도 수준은 각 우수 배양 조건이 얻어진 후 최적화 과정에서 점차적으로 증가되었다.

실험 1 ~ 4의 결과들이 표 2에 요약되어 있다. 1번 실험은 배양 시에 IL-4가 Vδ1⁺ T 세포들의 증식(proliferation) 및 농축(enrichment)의 촉진에 중요한 성장 인자(key growth factor)라는 이전 관찰 사실을 확인하였다^<27,42>. 이 실험에서, T 세포 유사 분열 촉진제(mitogen) 및 IL-2의 존재하에, 배양된 TCRγδ⁺ T 세포들에서 22 가지 상이한 사이토킨들의 활성을 시험하였다. 분명히, IL-4는 이들 세포의 강력한 농축 및 증식을 유도하는 능력에서 독특했다. 대조적으로 IL-2의 증가된 농도를 사용하거나 IL-2와 다른 T 세포 미토겐의 조합이 동등한 효과를 나타내지 않는다. 이는 아마도 배양된 세포들의 활성화 유발 세포 사멸(AICD) 때문일 것이다(표 2, 조건 2-3).

실험 2의 결과는 배양물에서 Vδ1⁺ T 세포의 증가된 증식 및 농축을 위해 낮은 농도에서 IL-2 (IL-4 및 PHA의 존재 하에)를 사용해야 한다는 것을 입증했다 (표 2, 조건 3-7). 이 효과는 이전 실험 (1번)에서 관찰되지 않았는데, 거기서는 IL-4가 없을 때 PHA와 IL-2의 존재 하에서 배수 증식 수준이 더 높았다. 또한, 항-CD3 단클론 항체는 배양물에서 Vδ1⁺ T 세포의 생존과 증식을 촉진하는 가장 효과적인 미토겐인 것으로 나타났다 (표 2, 조건1 대 조건2 참조).

실험 3 (표 2)의 결과는 이전의 관찰을 확인하였고 IL-4 및 T 세포 미토겐의 존재 하에서 보다 낮은(이전에 사용된 것보다) IL-2 농도가 더 높은 Vδ1⁺ T 세포 증식, 생존 및 농축을 촉진한다는 것을 보여주었다. 또한, 동일한 농도로 사용하면 IL-15는 Vδ1⁺ T 세포 생존, 농축 및 증식을 촉진하는 데 IL-2보다 효과적이었다. 역시, 항-CD3 단클론 항체가 우리의 시험에서 가장 효과적인 미토겐인 것으로 나타났다.

실험 4의 결과는 상기 배지에서 고농도의 IL-15 존재는 Vδ1⁺ T 세포의 증식에 해로운 것을 나타냈다. IL-4와 α-CD3 의 존재 하에서 실제로, 이전에 사용된 것보다 더욱 낮은 IL-15의 농도 수준이 Vδ1⁺ T 세포의 더 높은 증식 수준을 촉진시켰다 (표 2, 조건 3-5).

마지막으로, 조금도 예상치 못한 발견으로서, IL-15를 INF-γ로 대체하자 (즉, 배양 배지에서의 IL-15의 부재 및 IFN-γ의 존재) 배양된 Vδ1⁺ T 세포의 증식 수준의 증가가 발생하였다.

IL-2, IL-7, IL-15의 다양한 농도 및 조합을 병렬로 테스트하였지만, IFN-γ는 배양물 내 Vδ1⁺ T 세포의 선택적 증식을 촉진하는 더 효과적인 시약인 것으로 일관되게 나타났다 (항-CD3 mAb와 같은 IL-4 및 T 세포 미토겐의 존재 하에 사용된 경우; 도 3). 이들 배양물에서 IFN-γ의 높은 성능은 사용된 IL-4 및 항-CD3 mAb의 농도와 무관하였다 (도 3A-C 및도 4 ). 중요한 점으로서, IL-2, IL-15 또는 IL-7이 아닌 IFN-γ의 사용은 CD3⁺ T 세포의 벌크 배양물들에서 Vδ1⁺ T 세포의 농축 및 증식 수준을 급격히 증가시켰다 (도 3D ). 이 배양물들에서 출발 시료들에 존재하는 오염시키는 TCRαβ⁺ T 세포들은 IL-2, IL-15 및 IL-7에 반응하고 그들의 존재 하에서 증식하였으나 IFN-γ의 존재에서는 반응이 일어나지 않았기 때문에 이들의 존재 여부가 Vδ1⁺ T 세포의 더욱 선택적인 활성제 역할을 하는 것으로 보인다. 이러한 실험은 Vδ1⁺ T 세포의 생산을 위해 IL-2, IL-7 및 IL-15의 부재 하에 IFN-γ와 IL-4 및 T 세포 미토겐의 특정한 (그리고 이전에 기술되지 않은) 조합이 다양한 신규한 치료 및 상업적 응용에 이용될 수 있는 독특한 이점들을 갖는다는 점을 보여주었다.

IFN-γ는 이량 체화된 용해성 사이토킨이며 II형 인터페론 부류의 유일한 구성원이다 ^<50>. 이는 IL-2, IL-4, IL-7 또는 IL-15와 같은 일반적인 γ-사슬 사이토킨과 구조적 및 기능적으로 상이하며 I형 인터페론과 혈청학적으로 구별된다: IFN-γ는 산 반응성인 반면, I형 변이체는 산 안정성이다.

우리는 배양된 Vδ1⁺ T 세포 집단을 확대하고 풍부하게 하는 새롭고 향상된 방법을 얻었지만 생체 외에서 생성된 세포의 항 종양 기능을 분석하는 목표도 추구했다. 우리는 배양 배지에서 IL-4의 존재가 천연 세포 독성 수용체 (Natural Cytotoxicity Receptor: NCR, 즉 NKp30 및 NKp44) 및 증식된 Vδ1⁺ T 세포 상의 NKG2D와 같은 활성화 수용체들의 발현을 강하게 억제하거나 감소시키는 것을 발견했다 (표 3 ).

활성화 자연 킬러(Natural Killer, NK) 수용체들(예 NKp30, NKP44 및 NKG2D 등)은, 종양 또는 감염된 세포 표면에 발현된 Vδ1⁺ T 세포들의 분자 리간드에의 결합을 통해 Vδ1⁺ T 세포들의 항 종양 및 항 바이러스성 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. 수용체-리간드 결합은 Vδ1⁺ T 세포에 의해 그랜자임(granzyme) 및 퍼포린(perforine) 생산 및 방출을 트리거함으로써 표적 세포의 죽음을 초래한다 ^<29>. 본 연구에서 우리는 배양 배지 내 IL-4의 존재가 배양된 TCRγδ⁺ T 세포의 표면에 위치한 NK 수용체의 활성화 수준을 감소시킴으로써 MOLT-4 백혈병 세포에 대한 그들의 세포 독성 기능을 감소시킨다는 것을 발견했다 (표 3 ). 참고로, IL-4에 의해 유도된 억제는 Vδ1^- 및 Vδ1⁺ TCRγδ⁺ T 세포들 모두를 포함한 최종 세포생성물에 존재하는 모든 TCRγδ⁺ T 세포 서브세트들에 영향을 주는 것으로 보였다 (표 3).

이는 IL-4가 IL-10 생산을 통한 조절(regulatory) Vδ1⁺ T 세포의 생성을 촉진한다는 최근 연구와 일치한다. IL-4 처리된 Vδ1⁺ T 세포는 Vδ2⁺ T 세포에 비해 유의하게 적은 IFN-γ와 많은 IL-10을 분비하였다. 또한, Vδ1⁺ T 세포는 IL-4의 존재 하에 상대적으로 낮은 수준의 NKG2D 발현을 보여, Vδ1⁺ T 세포가 TCRγδ⁺ T 세포 매개의 항-종양 면역 반응을 약화한 것을 시사하였다 ^<42>.

발명자들은 Vδ1⁺ T 세포의 항 종양 이펙터(effector) 기능을 향상시키는 목적으로 새로운 배양 방법을 찾고 있었기 때문에, IL-4 처리된 세포에서 활성화 NK 수용체의 발현을 회복시키고 이들 세포의 세포 독성 표현형을 회복 시키는 시도를 하였는데, 이는 전에 결코 시도된 바가 없는 것이다.

TCRγδ⁺ T 세포를 2단계(2-step) 프로토콜로 배양하였다. 제 1 과정은 T 세포 미토겐(예 : 항-CD3 단클론 항체 또는 PHA) 및 IL-4의 존재 하에, 그리고 IL-2, IL-15 및 IL-7의 부재 하에, 배양 배지에서 세포를 처리하는 과정으로 구성되며, 이에 따라 Vδ1⁺ T 세포의 선택적 증식이 촉진된다. 두 번째 배양 과정은 IL-4의 부재 하에, 그리고 T 세포 미토겐 및 IL-2, 또는 IL-7 또는 IL-15의 존재 하에 배양 배지에서 세포를 처리하는 과정으로 구성되며, 이에 따라 세포 분화 및 NKR 발현이 촉진된다 (표 3 및 표 4 ).

조건 1-5 (표 3 )는 이전의 결과를 확인한 것으로서, IL-4 존재 하에서 배양된 Vδ1⁺ T 세포가 배양물에서 수천 배 증식할 수 있지만 분화할 수 없어 종양 세포의 비효율적인 킬러가 된다는 것을 보여준다. 대조적으로, 조건 6-13에서와 같이, IL-4의 부재 하에 그리고 T 세포 미토겐 및 IL-2, 또는 IL-7 또는 IL-15의 존재 하에 세포가 제 2 배양 배지에서 계대 배양될 때, 종양 세포를 제거하는 능력은 과격하게 증가했다. 이들 3 가지 사이토킨(IL-2, IL-7 및 IL-15) 각각의 존재는 단독으로 또는 조합하여, 배양된 Vδ1⁺ T 세포의 표현형을 되돌릴 수 있었고 따라서 이러한 목적으로 사용될 수 있다.

실험 6 및 7 (표 4)의 결과는 2단계 프로토콜 및 심지어 3단계 프로토콜을 이용하여 더욱 효율적으로 Vδ1⁺ T 세포의 증식 및 분화를 자극할 수 있음을 보여 주었다. 세포가 3가지 상이한 배양 배지(예를 들어, 표 4의 실험 7의 조건 2 참조)에서 배양되는 3 단계 프로토콜의 경우, IL-4-함유 배지를 IL-2 또는 IL-7 또는 IL-15를 포함하는 배지로부터 분리하는 것은 매우 중요했다. 이러한 결과로부터 세포 증식을 향상시키기 위해서는 각각의 계대 배양 단계에서 기존 배양 배지의 일부를 제거해야 한다고 결론을 내릴 수 있다. 또한 제 2 배양 배지에서 IL-15는 Vδ1⁺ T-세포 증식을 촉진하는 데 있어서 IL-2보다 약간 더 효율적이라는 결론을 내릴 수 있다.

3단계 및 4단계 배양 프로토콜을 사용하는 추가 실험은 Vδ1⁺ T 세포의 증가된 증식 수준 및 이들 세포 상의 향상된 NK 수용체 발현을 위해 다른 성장 인자가 제 1 및/또는 제 2 배양 배지에 첨가될(표 3 및 표 4 ) 수 있음을 입증했다. INF-γ, IL-21 및 IL-1β는 Vδ1⁺ T 세포 증식 및 생존에 효율적인 유발 인자로 확인되었다 (표 5 ). 이러한 성장 인자는 첫 번째 또는 두 번째 배지에서 사용될 수 있다.

마지막으로, CD27 수용체의 가용성 리간드 또는 CD7 수용체의 가용성 리간드 또는 SLAM 수용체의 가용성 리간드를 첨가하면 Vδ1⁺ T 세포의 증식이 촉진되었다 (표 5의 조건 3-6 ). CD27 수용체는 전형적으로 T 세포 면역의 생성 및 장기간 유지에 필요하다. 그것은 그것의 리간드 CD70에 결합하고, B세포 활성화 및 면역 글로불린 합성의 통제에 중요한 역할을 한다. CD7 수용체는 면역 글로불린 수퍼 패밀리의 구성원이다. 이 단백질은 흉선 세포와 성숙한 T 세포에서 발견된다. 그것은 초기 림프구 발달 동안 T 세포 상호 작용 및 T 세포/B 세포 상호 작용에서 필수적인 역할을 한다. SLAM 수용체는 면역 조절 수용체의 시그널링 림프구 활성화 분자 군의 구성원이다.

참고로 여러 가지 배양 배지가 시험되었다 (도 5). 이러한 시험은 상이한 제조자에 의해 생산되고 임상적 용도에 적합한 상업적으로 이용 가능한 무 혈청 임상 등급 매체를 포함하는 상이한 배양 배지에서 본 발명이 매우 잘 작동함을 보여 주었다.

대규모 증식 TCRγδ ⁺ T 세포의 시험 관내 특성 규명

배양된 Vδ1⁺ T 세포의 분리 및 증식을 위한 효과적인 프로토콜을 확립한 후, 더 많은 수의 건강한 공여자와 암 환자로부터 채혈한 혈액 시료를 사용하여 이에 대한 테스트를 추진했다. 이것은 새로운 배양 방법의 견고함과 일반적인 적용 가능성을 테스트하는 데 필요했다. 또한 플라스틱 플레이트나 플라스크 대신 임상 적용을 위해 개발된 밀폐된 대형 가스 투과성 세포 백에서 세포를 배양했다.

MACS (magnetic-associated cell sorting)의 2단계 방법을 채용하여 공여자 8명으로부터 TCRγδ⁺ T 세포가 풍부한 생존 가능한 세포 집단을 만들었다 (표 6 ). Vδ1⁺ TCRγδ⁺ T 세포는 MACS 이후 처음에 존재하는 전체 생존 세포의 약 1% 내지 44%만을 구성한다. 그러나, 최적화된 2단계 배양법을 따르고, 설명된 사이토킨 및 T 세포 미토겐의 칵테일 존재 상태로 11-21일 이내에, Vδ1⁺ T 세포는 배양에서 지배적인 세포 서브세트가 되었고, 그 수는 공여자들 사이 총 세포 수의 60-80%에서 변동했다(도 6 ). 참고로, 매우 재현 가능한 증식이 이루어졌으며 최종 세포 생성물의 조성은 여러 공여자에서 현저하게 유사했다 (도 6, 표 7) . 중요하 점으로서, 최종 생성물에서 비(non) Vδ1⁺ TCRγδ⁺ T 세포는 대부분 Vδ1^- Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포인 것이 밝혀졌다(전체 세포의 약 17% -37%를 구성 함). 이 세포들은 아마도 Vδ3⁺ TCRγδ⁺ T 세포로 구성된 것으로 보이는데, 그 이유는 말초 혈액에서 세 번째로 가장 풍부한 TCRγδ⁺ T 세포 하위 집합이기 때문이다. 전체 TCRγδ⁺ T 세포의 비율에서 Vδ1⁺ T 세포 및 Vδ2⁺ T 세포의 비율을 감산함으로써 최종 생성물에서 Vδ1^- Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포의 비율을 계산할 수 있었다 (표 7). 플라스틱 봉지(plastic bags) 안에서의 배수 증식은 예상대로 플레이트에서 보다 크기가 작지만, 여전히 임상적 번역(clinical translation)에 적절한 수만큼 생성되었다.

활성화 천연 세포 독성 수용체 (NKp30 및 NKp44 포함 NCR) 및 NKG2D의 발현은 모든 시험 공여자의 장기 배양된 Vδ1⁺ T 세포에서 강하게 유도되었다 (표 8 및 도 7) . 얻어진 TCRγδ⁺ T 세포( Vδ1⁺ 및 Vδ1^- Vδ2^- 세포 서브세트 모두 포함)는 CLL 세포(MEC-1 세포주 및 원발성 CLL 환자 시료)에 대해 높은 세포 독성을 나타냈지만, 건강한 자가 PBMC를 표적으로 삼지 않았다(도 8A 및 도 8C). TCRγδ⁺ T 세포 활성화 수용체에 대한 차단 항체를 사용하여 실시한 예비 실험은 항 종양 세포 독성이 부분적으로 NKG2D 및 NKp30 수용체에 의존한다는 것을 보여 주었다 (도 8B). 또한, 증식 및 분화 TCRγδ⁺ T 세포는 고농도의 전염증성 사이토킨 IFN-γ를 생성하였다 (도 9).

마지막으로, Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포는 매우 높은 종양 부담을 가진 노인 CLL 환자의 PBL로부터 효율적으로 분리되고 증식될 수 있으며(표 9 및 표 10 및 도 10A), 강력한 항 종양 및 항 바이러스 활성을 나타냈다 (도 10B). 참고로 TCRγδ⁺ T 세포의 체외 배양 중에 오염을 일으키는 자가 백혈병 B 세포는 제거되었다 (표 10).

이러한 수집 데이터는 자가 또는 동종 세포 대체 요법을 위한 기능 Vδ2^- γδ T 세포(즉, 암 환자로부터의)를 생성하는 본 발명의 고유한 기능을 전적으로 나타낸다. 이 방법은 CLL 환자에게서 얻은 고도의 비정제 시료로부터 Vδ1⁺ T 세포를 풍부하게(> 60%) 확대 (최대 2,000배)하여 NKR 발현 및 고도의 세포 독성 능력이 있는 TCRγδ⁺ T 세포들로 분화시킬 정도로 견고하다.

중요한 문제로서, 또한 예비 시험은 다른 조직 기원의 종양 세포에 대한 배양된 TCRγδ⁺ T 세포의 시험 관내 반응성을 입증하였으며 (도 11), 증식 및 분화된 Vδ2^- γδ T 세포가 이러한 조건의 치료에도 이용될 수 있음을 시사한다.

증식된 TCRγδ ⁺ T 세포의 생체 내 연구

우리가 "DOT-세포"라고 부르는 기능적 TCRγδ⁺ T 세포를 많은 수로 생성하는 방법을 성공적으로 개발한 다음, 우리는 생체 내에서 그들의 원점 복귀(homing) 및 백혈병 활성을 조사했다. 우리는 이전에 이 질병의 여러 측면을 재현하는 것으로 밝혀진 인간 CLL의 이종 이식 모델을 유리하게 활용해서 CAR-T 세포를 포함한 다른 세포 치료법의 효능을 테스트하는 데 적용했다 ^{<51, 52>}. 이 모델은 CLL/SLL 유래 MEC-1 세포를, 모든 림프구가 결여되어 있어 인간 세포를 즉시 거부하지 않는 Balb/c Rag^-/- γc^-/- (BRG) 동물들로 입양전달(adoptive transfer) 또는 전이하는 데에 의존한다. 그러나, 인간 이종 이식의 골수 계통 중재 거부가 여전히 일부 발생한다. 이 거부는 SIRP-α에 대한 상이한 다른 대립 유전자들의 암호화로 인해, 사용된 마우스의 변형률에 따라 그 크기가 변한다 ^<53>. 따라서 NOD-SCID γc^-/- (NSG) 동물들을 숙주로 사용하여 전이 후 늦은 시점에서 TCRγδ⁺ T 세포를 특성화하기 위해 모델을 추가로 적용했다. 실제, 종양 보유 NSG 숙주로 전이되었을 때, 우리는 CD3⁺ Vδ1⁺ T 세포에 대한 강력한 농축물(enrichment)과 함께, 전이 후 30일 동안, 분석된 모든 조직에서 TCRγδ⁺ T 세포들을 회수할 수 있었다 (도 12). 중요한 점으로서, 우리는 회수된 TCRγδ⁺ T 세포에서 NKp30과 NKG2D의 발현을 검출하여 생체 내에서 그들의 특성을 안정적으로 유지한다는 것을 보여주었다. 주목할 점으로서, BRG 동물로 전이되었을 때, 우리는 그 정도로 늦은 시점에서 TCRγδ⁺ T 세포들을 회복할 수는 없었지만, 전이 72 시간 후 폐와 간에서 그 세포들을 관찰했다 (도 12). 이 실험은 NSG 동물들에서 이종 이식된 인간 세포의 적합성을 확인하는 동시에 증식된 Vδ2^- γδ T 세포의 생체 내 항 종양 특성을 테스트하기 위해 두 가지 모델을 사용할 수 있게 해준다.

생물 발광을 이용하여 종양 성장을 역동적으로 수행하기 위해, 우리는 파이어플라이 루시퍼라제-GFP로써 MEC-1 세포를 형질 전환시켰고, 10⁷개의 MEC-1 세포를 BRG 동물들로 피하 전이시켰다. 7일 후 우리는 발광(luminescence)의 함수로서 종양 부하를 결정하기 위해 루시페린(luciferin)을 주사했고, 그 후 동물들에 치료(또는 PBS 대조군)를 부여했다. 우리는 후 5일 이내에 TCRγδ⁺ T 세포의 전이를 2회 수행하였다. 그런 다음 Caliper를 사용하여 종양 크기를 시간의 함수로 측정했다. 중요한 점으로서, 대조군과 비교했을 때 치료 동물에서 원발 종양 크기의 명확한 감소를 발견했다 (도 13). 이 감소는 TCRγδ⁺ T 세포의 두 번째 전달 9일 후에 유의했다. 이 결과는 TCRγδ⁺ T 세포들이 생체 내에서 효과적이라는 점을 보여주었는데, BRG 숙주에서의 인간 세포의 짧은 반감기에 의해 그 세포들의 항 종양 특성에 대한 더 광범위한 특성화 배제가 있었음에도 불구하고 효과적이라는 사실은 여전하다. 이러한 한계를 극복하기 위해 다음으로 NSG 동물들을 호스트로 사용하여 유사한 실험을 수행했다.

종양 진행의 성장은 NSG 숙주에서 더 빨랐으며, 이는 외견상 TCRγδ⁺ T 세포가 원발 종양 성장에 간섭하는 것을 막는 것처럼 보였다 (도 14 ). 그러나 이 모델에서는 종양이 늦은 시점에 다양한 기관에 전파되어, TCRγδ⁺ T 세포는, 조직 어레이에 대한 유세포 분석법 및 조직학적 분석에 의해 문서로 기록된 바와 같이, 종양의 확산을 현저하게 제한할 수 있음을 발견했다(도 14B-D). 조직 어레이에는 골수 및 간과 같은 전파 지점들이 포함된다. 2가지 이종 이식 모델에서 얻어진 데이터는 집합적으로 TCRγδ⁺ T 세포의 생체 내 효능, 즉 원발 종양 크기의 감축 효능(NSG 숙주 내, 도14) 및 표적 기관으로 종양이 전파하는 것을 통제하는 효능(BRG 숙주 내, 도13)을 입증한다.

NSG 모델에서의 실험 마지막에서 TCRγδ⁺ T 세포 자손을 조사한 결과, 종양 조직으로의 강력한 침투를 확인했고(도 15A); TCRγδ⁺ T 세포에서의 NKp30 및 NKG2D의 안정한 발현을 확인했다(도 15B). 흥미롭게도, 우리는 종양-침윤 TCRγδ⁺ T 세포에서 조기 활성화 마커 CD69의 높은 발현을 검출하였고, 이는 종양 내에서 TCRγδ⁺ T 세포의 최적 활성화를 시사하는 것이다 (도 15B ). 중요한 점으로서, 우리는 (여러 장기의) 조직학적 분석에서, 또는 검시 시 수집된 혈액의 생화학적 분석에서 치료와 관련된 독성을 전혀 관찰하지 못했다 (도 16 ).

종합적으로, 이러한 생체 내 데이터는 CLL 치료를 위해 생성된 TCRγδ⁺ T 세포들의 안전성과 효능에 큰 확신을 주며, 따라서 그들의 임상 적용에 고무적이다.

결론적으로, 우리는 세포 독성 Vδ2^- γδ T 세포의 선택적 및 대규모 증식 및 분화를 위해, 피더 세포가 없는 새롭고 견고한(재현성 높은) 임상 등급 방법을 개발했고, 만성 림프구성 백혈병(CLL)의 전임상 모델에서 치료 가능성을 시험했다. DOT 세포라고 명명한 우리의 세포 제품은 어떤 유전자 조작도 포함하지 않고, 체외에서 백혈병성이지만 건강한 세포는 목표로 삼지 않으며, 건강한 조직 손상의 징후가 전혀 없이 종양이 생체 내에서 말초 장기로 광범위하게 퍼지는 것을 막는다. 우리의 결과는 암의 입양면역요법에서 DOT 세포의 임상적 적용을 위한 새로운 수단과 원리 증명을 제공한다.

보충 자료

다음 부분은 전술한 발명의 사용으로 생성된 추가 데이터를 개시한다. 여기에 포함된 데이터는 이전 결과를 확인하고 이전 관측 내용을 확장한 것으로서, 본 주제에 대해 더 잘 이해하는 데 돕는 정보로 사용되어야 한다.

앞서 설명한 바와 같이, 인터루킨-2 (IL-2)과 인터루킨-4(IL-4)의 조합은 시험관 내에서 Vδ1⁺ T 세포를 증식하는 데 어느 정도 성공적으로 사용되고 있다. 그러나 우리는 배양 배지 내 IL- 4의 존재가 배양된 TCRγδ⁺ T 세포에서 NK 활성화 수용체(NKG2D, NKp30 및 NKp44와 같은)를 강력하게 하향 조절하여 항 종양 반응을 약화시킨다는 것을 발견했다.

우리의 이전 실험 1-4 결과가 다시 여기에 더 자세히 설명된다(표 11 참조). 그 결과의 보다 완벽한 이해를 돕기 위해, 평행 배양 조건(별표로 표시)에서 얻은 추가 결과를 표시한다. 또한 각 조건에서 세포 배양 후 관찰된 NKp30⁺ Vδ1⁺ T 세포의 백분율을 본 명세서에 개시하였다. 배양된 세포 상의 NKp30 발현의 하향 조절이 관찰되어, IL-2가 배양 배지에 존재했을 때(즉, 배양 배지가 IL-2 및 IL-4를 모두 포함했을 때) IL-4의 Vδ2^- γδ T 세포에 대한 강력한 억제 효과의 발생까지도 확인할 수 있었다. 이러한 데이터는 IL-4의 억제 효과가 배양 TCRγδ⁺ T 세포에 대한 IL-2의 활성화 효과보다 우세하다는 것을 확인해주었고, 제 2 배양 단계에서 IL-4 제거의 중요성을 강조하여 알려주었다.

이전에 설명했듯이, IL-2, IL-7 및 IL-15의 다양한 농도 및 조합을 병행하여 시험하였지만, IFN-γ가 배양 중 Vδ1⁺ T 세포의 선택적 증식을 촉진시키는 훨씬 효과적인 시약임을 일관되게 발견하였다 (IL-4 및 항-CD3 단클론 항체와 같은 T 세포 미토겐의 존재 하에서 사용될 때). 이전에 제안된 (그러나 정식으로 도시하지 않은) 바와 같이, IFN-γ와 IL-2, IL-7 또는 IL-7의 조합보다, 또는 IL-2와 IL-15 또는 IL-7의 조합보다, IFN-γ의 단독 사용이 (배양 중 세포의 증식을 촉진하는 데) 더욱 효과적이었다 (표 12 ). 이러한 데이터는 IL-4 및 IFN-γ의 존재 하에서 세포가 배양될 때 IL-15, IL-2 및 IL-7이 TCRγδ⁺ T 세포 증식에 악영향을 미친다는 것을 확인했다.

이전에 설명했듯이, 대형 세포 배양 백(bag)에서 배수 증식은 예상대로 96-웰 플레이트에서의 배율 증식보다 작은 크기이지만, 임상 번역에 여전히 의의 있는 숫자만큼 생성되었다. 임상 등급 세포 백에서 대규모 세포 배양 후 얻은 총 절대 세포 수는 표 13에 자세히 나와 있다.

앞서 설명한 바와 같이, 이전에 설명한 방법으로 얻은 세포 배양 프로토콜은 임상 응용 분야에 사용하는 데 적합하다. 사실, 몇몇 재료와 시약이 임상 응용 분야에 사용하기 위해 유럽 의약청(European Medicines Agency)이나 식품 의약품 안전청(Food and Drug Administration)과 같은 적어도 하나의 규제 기관에 의해 승인되었다. 전체 목록은 표 14에 설명되어 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제안한 2단계 세포 분리 방법은 실용적이며 더욱 배양될 수 있는, TCRγδ⁺ T 세포가 풍부한 세포 시료들을 생성한다. 도 17은 2단계 MACS 정렬 후 TCRγδ⁺ PBL 농축의 FACS-플롯을 보다 자세히 보여준다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 배양 방법으로 매우 재현 가능한 증식이 달성되었고, 최종 세포 생성물의 조성물은 여러 공여자에 걸쳐 현저하게 유사하였다.

위에 기술된 발명으로 얻은 세포의 보다 완전한 특성화를 위해, 이 방법과 그 결과 세포 생성물의 참신함을 가지고, 우리는 332개의 상이한 세포 표면 마커의 대형 스펙트럼 표현형(phenotyping)을 수행했다 (도 18). Vδ1⁺ T 세포들을 세포 배양 과정의 시작(0일)과 마지막(21일차)을 비교하였다. 관찰한 바, 생체 외 생성 Vδ1⁺ T 세포들의 증가된 증식 잠재력의 지표인 보조 자극 수용체 CD27, CD134/OX-40 및 CD150/SLAM 뿐만 아니라 활성화 표지자 CD69 및 CD25와 HLA-DR의 현저한 상향조절(upregulation)이 있었다(그들의 기본 Vδ1⁺ T 세포 대조군에 비교).

또한 증식된 Vδ1⁺ T 세포들은 종양 세포 표적화에서 중요한 역할을 하는 것으로 이미 나타난 NK 세포 관련 활성화/세포 독성 수용체, 즉 NKp30, NKp44, NKG2D, DNAM-1 및 2B4의 발현을 증가시켰다. 대조적으로, PD-1, CTLA-4 또는 CD94와 같은 주요 저해 및 고갈 관련 분자는 매우 낮은 수준으로 또는 전혀 발현되지 않았으며, 그에 따라 자극 조건 하에서 배양한 날 수로 21일 후에도 증식 및 분화된 TCRγδ⁺ T 세포의 현저한 "적합성"을 입증했다. 특히, 세포부착(cell adhesion)에 관련된 여러 분자(예를 들어, CD56, CD96, CD172a/SIRPα, 인테그린-β7 및 ICAM-1) 및 케모카인 수용체 (CD183/CXCR3, CD196/CCR6, 및 CX3CR1)와 같은 여러 분자의 상향 조절은 혈액과 조직들 사이를 이동하고 재순환시키는 고도의 성능을 시사하였다. 주목할 것은, 타입-1 (인터페론-γ-생산) 반응을 촉진하는 것으로 알려진 IL-18Rα 및 Notch1 도 또한 확대되고 분화된 TCRγδ⁺ T 세포에 의해 고도로 발현된다는 것이다. 중요한 점으로서, 본 방법의 견고성을 뒷받침해서, 히트 맵(도 18B)에 의해 설명된 것처럼, 테스트한 공여자 4명 모두에서 현저하게 유사한 세포 표현형들을 발견했다. 이러한 데이터는 집합적으로, 증식 및 분화된 TCRγδ⁺ T 세포를, 이동 가능성(migratory potential) 및 자연 세포 독성 기작이 부여된 활성화된(소진 안된: non-exhausted) 림프구의 고도로 재현 가능한 세포 생성물로 특성화한다.

이전에 설명한 바와 같이, TCRγδ⁺ T 세포에서 발현되는 활성화 수용체에 대한 차단 항체를 사용한 예비 실험은 항 종양 세포 독성이 증식된 TCRγδ⁺ T 세포에 의해 발현된 NKG2D 및 NKp30 수용체에 부분적으로 의존한다는 것을 보여 주었다. 본원에서 제시된 추가 실험은 또한 종양 세포 인식에서의 γδTCR 역할을 밝혀냈다 (도 19).

이전에 설명했듯이, 활성화 자연 세포 독성 수용체(NKp30과 NKp44를 포함한 NCR)의 발현은 장기간 배양된 Vδ1⁺ T 세포에서 강하게 유도되었다. 여기에서 우리는 같은 효과가 Vδ1^- Vδ2^- 세포 서브세트에서 관찰된 것을 보여준다. 우리가 같은 배양물들 내의 증식된(분화된) CD3⁺ Vδ1^- Vδ2^- 세포 서브세트에 게이트를 (FACS 플롯 분석에서) 적용했을 때, 이들 세포가 동일한 수준의 NCR 주위로 발현하는 것을, 분화 Vδ1⁺ 세포에 의해 표현된 것으로 관찰했다 (도 20). 이러한 데이터는 본 발명에 개시된 2단계 프로토콜이 Vδ1⁺ 및 Vδ1^- Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포 서브세트 모두를 증식 및 분화할 수 있음을 추가로 확인해준다. 첫번째 배양 단계에서, T 세포 미토겐 및 IL-4의 존재 하에 (그리고 IL-15, IL-2 또는 IL-7의 부재 하에), Vδ1⁺ 및 Vδ1^- Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포 서브세트 모두는 배양물 안에서 증식되었지만 세포 독성 표현형으로 분화할 수는 없었다. 얻은 세포를 T 세포 미토겐 및 IL-2, 또는 IL-7, 또는 IL-15의 존재 하에 (그리고 IL-4의 부재 하에), 제 2 배양 배지에서 계대 배양하였을 때, 세포 서브세트 모두는 분화되어 고농도의 활성 NK 수용체들을 표출하였고, 이는 차례로 종양 세포의 살상을 매개하였다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 방법으로 수득된 증식 및 분화된 Vδ1⁺ 세포는 시험 관내 백혈병 세포에 대해 고도의 세포 독성을 나타낸다. 여기서는 증식 및 분화된 Vδ1^- Vδ2^- 세포 서브세트가 종양 표적들에 대해 높은 세포 독성을 나타낸는 것도 더 자세히 보여준다. 동일한 배양 세포 시료들에서 나온 CD3⁺ Vδ1⁺ 세포들과 CD3⁺ Vδ1^- Vδ2^- 세포들을 유세포 분석법으로 분류하였고, 각 서브세트를 시험관 내에서 표적 종양 세포들과 함께 공동 배양했다. 세포 서브세트 모두는 표적 세포들을 효과적으로 제거할 수 있음을 관찰하였다 (도 21).

Claims

시료 중의 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포를 증식하는 방법으로서,
(1)T 세포 미토겐(mitogen) 및 인터루킨-4을 포함하는 제 1 배양 배지에서 상기 시료 중의 세포들을 배양하는 과정으로서,
상기 제 1 배양 배지 내에는 인터루킨-15, 인터루킨-2 및 인터루킨-7이 부재하는, 과정; 및
(2) T 세포 미토겐 및 인터루킨-15, 인터루킨-2 및 인터루킨-7에서 선택되는 성장 인자를 포함하는 제 2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포들을 배양하는 과정으로서, 상기 제 2 배양 배지 내에 인터루킨-4가 부재하는, 과정
을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
과정 (2)의 성장 인자는 인터루킨-15 인 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서,
상기 제 1 또는 제 2 배양 배지, 또는 두 배지 모두는 제 2 성장 인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 성장 인자는 인터페론-γ 또는 이의 모방체 또는 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제 1 배양 배지 또는 제 2 배양 배지, 또는 두 배지 모두는 제 2 및 제 3 성장 인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 제 2 및 제 3 성장 인자들은 인터페론-γ 및 인터루킨-21 또는 이들의 모방체, 또는 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제2 항에 있어서,
상기 제 1 배양 배지 또는 제 2 배양 배지, 또는 제 1 배양 배지 및 제 2 배양 배지 모두는 제 2, 제 3 및 제 4 성장 인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서,
상기 제 2, 제 3 및 제 4 성장 인자들은 인터페론-γ, 인터루킨-21 및 인터루킨-1β 또는 이들의 모방체 또는 기능적 등가물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제 1 또는 제 2 배양 배지, 또는 두 배지 모두는 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포의 보조 자극 분자(costimulatory molecule)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 보조 자극 분자는 SLAM 수용체의 분자 리간드 또는 작용제, CD27 수용체의 분자 리간드 또는 작용제, 또는 CD7 수용체의 분자 리간드 또는 작용제 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에 있어서,
상기 제 1 및 제 2 배양 배지는 혈청 또는 혈장을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에 있어서,
과정 (1) 전에 상기 시료 중의 세포들은 T 세포들에 대해 풍부하게 되는(enriched) 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에 있어서,
과정 (1) 전에 상기 시료 내의 세포들은 TCRγδ⁺ T 세포들에 대해 풍부하게 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 따르는 방법에 있어서,
과정 (1) 전에 상기 시료 중의 세포들은 TCRαβ⁺ T 세포들을 고갈시킨 상태로 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법에 있어서,
과정 (1) 전에 상기 시료 중의 세포들은 먼저 TCRαβ⁺ T 세포들을 고갈시킨 다음 CD3⁺ 세포들을 풍부하게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
과정 (1) 전에 상기 시료 내의 세포들은 비(non) TCRγδ⁺ T 세포들을 고갈시킨 상태로 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 시료는 혈액 또는 조직 또는 그의 분획들인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 시료는 말초 혈액, 제대혈, 림프계 조직, 상피 세포, 흉선, 골수, 비장, 간, 암 조직, 감염 조직, 림프절 조직 또는 이들의 분획들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 시료는 인간 말초 혈액 또는 그의 일부분인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서,
상기 시료는 저밀도 단핵 세포 (low density mononuclear cell: LDMCs) 또는 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell: PBMCs)로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제 1 배양 배지에서 상기 T 세포 미토겐은 10 내지 5000 ng/ml의 양으로 존재하고, 인터루킨-4은 1 내지 1000 ng/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서,
상기 제 1 배양 배지에서 상기 T 세포 미토겐은 20 내지 2000 ng/ml의 양으로 존재하고, 인터루킨-4은 5 내지 500 ng/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서,
상기 제 1 배양 배지에서 상기 T 세포 미토겐은 50 내지 1000 ng/ml의 양으로 존재하고, 인터루킨-4은 20 내지 200 ng/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 21 항에 있어서,
상기 제 1 배양 배지는 70 ng/mL의 T 세포 미토겐 및 100 ng/mL의 인터루킨-4을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제 2 배양 배지에서 상기 T 세포 미토겐은 0.1 내지 50㎍/ml의 양으로 존재하고, 인터루킨-15, 인터루킨-2 또는 인터루킨-7은 1 내지 1000 ng/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서,
상기 제 2 배양 배지에서 상기 T 세포 미토겐은 0.3 내지 10 ㎍/ml의 양으로 존재하고, 인터루킨-15, 인터루킨-2 또는 인터루킨-7은 2 내지 500 ng/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서,
상기 제 2 배양 배지에서 상기 T 세포 미토겐은 0.5 내지 5 ㎍/ml의 양으로 존재하고, 인터루킨-15, 인터루킨-2 또는 인터루킨-7은 20 내지 200 ng/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25 항에 있어서,
상기 제 2 배양 배지는 1 ㎍/mL의 T 세포 미토겐 및 70 ng/mL의 인터루킨-15, 인터루킨-2 또는 인터루킨-7을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 제 1 또는 제 2 배양 배지 또는 상기 배양 배지 모두에서 인터페론-γ는 1 내지 1000 ng/ml의 양으로 존재하고, 인터루킨-21 및 인터루킨-1β는 1 내지 500 ng/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서,
상기 제 1 또는 제 2 배양 배지 또는 상기 배양 배지 모두에서, 인터페론-γ는 2 내지 500 ng/ml의 양으로 존재하고, 인터루킨-21 및 인터루킨-1β는 2 내지 200 ng/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서,
상기 제 1 또는 제 2 배양 배지 또는 상기 배양 배지 모두에서, 인터페론-γ는 20 내지 200 ng/ml의 양으로 존재하고, 인터루킨-21 및 인터루킨-1β는 5 내지 100 ng/ml의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서,
상기 제 1 또는 제 2 배양 배지 또는 두 배지 모두에서, 인터페론-γ는 70 ng/ml의 양으로 존재하고, 인터루킨-21 및 인터루킨-1β는 15 ng/ml로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 T 세포 미토겐은 항체 또는 그의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
제 33 항에 있어서,
상기 항체는 CD3 또는 그의 단편에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 혈청 또는 혈장은 0.5 내지 25 부피%의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서,
상기 혈청 또는 혈장은 2 내지 20 부피%의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서,
상기 혈청 또는 혈장은 2.5 내지 10 부피%의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 35 항에 있어서,
상기 혈청 또는 혈장은 5 부피%의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
시료 중의 Vδ2^- TCRγδ⁺ T 세포를 증식하는 방법으로서,
(1) T 세포 미토겐(mitogen) 및 인터루킨-4을 포함하는 제 1 배양 배지에서 상기 시료 중의 세포들을 배양하는 과정으로서,
상기 제 1 배양 배지 내에는 인터루킨-15, 인터루킨-2 및 인터루킨-7이 부재하는, 과정; 및
(2) T 세포 미토겐 및 인터루킨-15을 포함하는 제 2 배양 배지에서 과정 (1)에서 얻은 세포들을 배양하는 과정으로서,
상기 제 2 배양 배지 내에는 인터루킨-4가 부재하고,
상기 시료는 말초 혈액, 제대혈, 또는 그 분획들을 포함하는 혈액이고,
상기 T 세포 미토겐은 CD3에 결합하는 항체인 방법.
제 39 항에 있어서,
상기 제 1 배양 배지, 제 2 배양 배지, 또는 제 1 배양 배지 및 제 2 배양 배지 모두는,
i) 인터페론-γ,
ii) 인터루킨-21,
iii) 인터루킨-1β,
iv) 인터페론-γ, 인터루킨-21 및 인터루킨-1β,
v) 인터페론-γ 및 인터루킨-21,
vi) 인터페론-γ 및 인터루킨-1β, 또는
vii) 인터루킨-21 및 인터루킨-1β
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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