WO2021230304A1 - ヒトプロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法 - Google Patents

ヒトプロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法 Download PDF

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祐一郎 萩谷
靖史 植村
恭子 福田
達昭 岩間
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Ａｇｃ株式会社
国立研究開発法人国立がん研究センター
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Definitions

  • the present invention uses a method for producing a human professional antigen-presenting cell derived from pluripotent stem cells, a human professional antigen-presenting cell derived from pluripotent stem cells produced by the method, and a T cell using the human professional antigen-presenting cell.
  • the present invention relates to a method for inducing proliferation of the cells.
  • Professional antigen-presenting cells are cells that activate T cells by presenting fragments such as bacteria that have invaded the body, virus-infected cells, and cancer cells on their own cell surface as antigens.
  • Professional antigen-presenting cells are cells specialized for antigen presentation that express not only human leukocyte antigen (HLA) class I molecules possessed by normal nucleated cells but also HLA class II molecules, and are macrophages and trees. Includes dendritic cells, B cells, etc.
  • Dendritic cells (hereinafter also referred to as DC) are antigen-presenting cells that have strong T cell stimulating activity and play a role in inducing an immune response against foreign antigens.
  • the so-called DC vaccine therapy which activates cancer-reactive T cells in the body by loading this DC with a "cancer antigen” and administering it to the living body, is expected to have excellent effects. It is considered to be one of (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Documents 3 to 7 The technique for inducing differentiation of DC from embryonic stem cells (ESC) or induced pluripotent stem cells (iPSC) (Non-Patent Documents 3 to 7) enables DC preparation from pluripotent stem cells, which are an infinite cell source.
  • ESC embryonic stem cells
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • the process of differentiating ESCs and iPSCs into DCs via hematopoietic differentiation is complicated and requires a production time and cost of one month or more, and a DC vaccine method using these has not been put into practical use.
  • iPS-ML The human iPSC-derived myeloid blood cell line (iPS-ML), which has been reported as a prior art, is produced by two main steps of differentiation induction and gene transfer (Patent Document 1).
  • iPS-ML cannot exert the same function as DC, and in order to exert the function as DC, it is necessary to induce some differentiation such as culture in the presence of cytokine, which is also a problem for practical use.
  • Patent Document 1 There are also reports on the production of human myeloid blood cells having the ability to proliferate in vitro (Patent Document 1) and the method of producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity (Patent Document 2).
  • Patent Document 2 There are also reports on the production of human myeloid blood cells having the ability to proliferate in vitro (Patent Document 1) and the method of producing human myeloid blood cells with suppressed tumorigenicity (Patent Document 2).
  • Patent Document 2 discloses or suggests a method for producing human myeloid cells having an antigen-presenting ability or the existence or characteristics of cells having an antigen-presenting ability.
  • An object of the present invention is a human professional antigen-presenting cell derived from a pluripotent stem cell having an in vitro proliferation ability that enables a stable supply as a cell preparation and an antigen-presenting ability comparable to that of a living-derived DC.
  • an object of the present invention is a method for promoting the proliferation of antigen-specific or non-specific T cells using the human professional antigen-presenting cells of the present invention, and the method for promoting and / or producing the proliferation. Is to provide T cells.
  • a further subject of the present invention is to proliferate using the pharmaceutical composition for promoting the proliferation of T cells containing the pluripotent stem cell-derived professional antigen-presenting cells of the present invention and the human professional antigen-presenting cells of the present invention.
  • the present invention provides a method for producing professional antigen-presenting cells derived from pluripotent stem cells.
  • Proliferative myeloid cells are obtained by expressing c-MYC, BMI1 and MDM2 in myeloid cells (MC), and GM-CSF and / or M-CSF are expressed in the pMC to obtain professional antigen presenting cells (pAPC).
  • pAPC professional antigen presenting cells
  • the myeloid cell may be a myeloid cell differentiated from a pluripotent stem cell.
  • the pluripotent stem cell may be an induced pluripotent stem cell or an embryonic stem cell.
  • the c-MYC, BMI1 and MDM2 may be gene-introduced into myeloid cells.
  • the GM-CSF and / or M-CSF may be gene-introduced into pMC.
  • the myeloid cell is a myeloid cell (MC) differentiated from a pluripotent stem cell
  • Embryoid bodies (EBs) derived from the pluripotent stem cells are layer-cultured on feeder cells in a medium containing VEGF, and then further cultured in a medium containing VEGF, SCF and TPO.
  • Process to do, or (ii) Embryoid bodies (EB) derived from the pluripotent stem cells were subjected to monolayer culture without feeder cells in a medium containing BMP-4, VEGF and SCF, and then further VEGF, TPO and GM.
  • - May include differentiating myeloid cells (MC) from pluripotent stem cells by culturing in a medium containing CSF.
  • the embryoid body (EB) is an embryoid body formed from pluripotent stem cells
  • Pluripotent stem cells are seeded in cell mass-forming culture vessels to form embryoid bodies (EBs)
  • the vessel forms embryoid bodies (EBs) from pluripotent stem cells by a process involving a fine spheroid well at the bottom and no flat surface between adjacent wells. It may be a manufacturing method including the above.
  • the manufacturing method of the present invention (i) Embryoid bodies (EB) by seeding pluripotent stem cells in a cell mass-forming culture vessel with a fine spheroid well at the bottom and no flat surface between adjacent spheroid wells. To form, (ii) The following steps (ii) -1 or (ii) -2, that is, (ii) -1 the embryoid body is subjected to multi-layer culture on feeder cells in a medium containing VEGF, and then VEGF.
  • EB Embryoid bodies
  • the embryoid body is subjected to monolayer culture without feeder cells in a medium containing BMP-4, VEGF and SCF, and then further cultured in a medium containing VEGF, TPO and GM-CSF. matter, To obtain myeloid cells (MC) from the embryoid body (EB).
  • MC myeloid cells
  • the myeloid cells (MC) obtained in (ii) are expressed with c-MYC, BMI1 and MDM2 to obtain proliferative myeloid cells (pMC), and (iv) Even if the production method comprises expressing GM-CSF and / or M-CSF in the proliferative myeloid cells (pMC) obtained in (iii) to obtain professional antigen presenting cells (pAPC). good.
  • c-MYC, BMI1 and MDM2 may be gene-introduced into myeloid cells (MC), and GM-CSF and / or M-CSF may be gene-introduced into proliferative myeloid cells (pMC). ..
  • the size of the embryoid body (EB) may be 50 to 200 ⁇ m.
  • the production method of the present invention may further include irradiating the professional antigen presenting cells (pAPC) with radiation.
  • pAPC professional antigen presenting cells
  • the present invention provides professional antigen presenting cells (pAPC) produced by any of the production methods of the present invention.
  • pAPC professional antigen presenting cells
  • the professional antigen-presenting cell (pAPC) of the present invention may be a professional antigen-presenting cell (pAPC) that disappears from the living body at least 3 to 4 days after the living body administration when administered to the living body after irradiation.
  • the professional antigen presenting cell (pAPC) of the present invention may be a professional antigen presenting cell (pAPC) having low expression of CD11b / c and expressing CD74.
  • the present invention provides a pluripotent stem cell-derived professional antigen-presenting cell (pAPC) that has low expression of CD11b / c and expresses CD74.
  • pAPC pluripotent stem cell-derived professional antigen-presenting cell
  • the professional antigen-presenting cell (pAPC) produced by any of the production methods of the present invention or the pluripotent stem cell-derived professional antigen-presenting cell (pAPC) of the present invention may further express CD33.
  • the pluripotent stem cell may be an embryonic stem cell or an induced pluripotent stem cell.
  • the pluripotent stem cell-derived professional antigen-presenting cells (pAPC) of the present invention may express exogenous GM-CSF and / or M-CSF.
  • the pluripotent stem cell-derived professional antigen-presenting cell expressing exogenous GM-CSF and / or M-CSF
  • the GM-CSF and / or M-CSF is gene-introduced. There may be.
  • Professional antigen-presenting cells produced by the production method of the present invention, or professional antigen-presenting cells (pAPC) derived from pluripotent stem cells of the present invention, which have low expression of CD11b / c and express CD74. May have self-proliferation ability and exhibit resistance to apoptosis.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising any of the professional antigen presenting cells of the present invention for inducing and / or promoting the proliferation of CD8 expressing T cells.
  • the present invention co-cultures any of the professional antigen presenting cells or GM-CSF of the present invention with CD8-expressing naive T cells in vitro and in vitro and in vitro, antigen-nonspecific or antigen-specific.
  • a method for promoting the proliferation of T cells expressing naive CD8 is provided.
  • the professional antigen-presenting cell may be a professional antigen-presenting cell loaded with a desired antigen.
  • the method for promoting the proliferation of CD8-expressing T cells of the present invention may further include in vitro irradiation of the antigen-loaded professional antigen-presenting cells.
  • the irradiated professional antigen-presenting cells when administered to a living body after irradiation in vitro, at least 3 to 3 to 3 in the living body. It may disappear in 4 days.
  • the CD8-expressing T cells may be T cells expressing CD8 specific to the antigen loaded on the professional antigen-presenting cells.
  • the present invention provides T cells expressing CD8 whose proliferation is promoted by a method of promoting the proliferation of T cells expressing CD8 of the present invention.
  • the present invention provides a method for producing T cells expressing non-antigen-specific or specific CD8 using the method of promoting the proliferation of T cells expressing CD8 of the present invention.
  • the present invention provides T cells expressing non-antigen-specific or specific CD8 produced by the method for producing T cells expressing non-antigen-specific or specific CD8 of the present invention.
  • the present invention provides a method for producing T cells expressing antigen-specific CD8 for administration into the body.
  • the method for producing an antigen-specific CD8-expressing T cell for administration in the body of the present invention is to load the professional antigen-presenting cell (pAPC) antigen of the present invention, or to load the antigen-loaded professional antigen-presenting cell.
  • pAPC professional antigen-presenting cell
  • the professional antigen-presenting cells (pAPC) may have self-proliferating ability and exhibit resistance to apoptosis.
  • the present invention provides T cells expressing antigen-specific CD8 for administration into the body, which are produced by the method for producing T cells expressing antigen-specific CD8 for administration into the body of the present invention. ..
  • the T cells expressing the antigen-specific CD8 for administration into the body which are produced by the method for producing the antigen-specific CD8 for administration into the body of the present invention, the T cells are exposed to the living body after irradiation.
  • the irradiated pluripotent stem cell-derived professional antigen-presenting cells may disappear at least 3-4 days after bioadministration.
  • the present invention provides an anticancer agent.
  • the anticancer agent of the present invention is a T cell expressing CD8 whose proliferation is promoted by a method of promoting the proliferation of T cells expressing CD8 of the present invention, or an antigen for administration into the body of the present invention. It contains T cells expressing antigen-specific CD8 for administration into the body, which are produced by a method for producing T cells expressing specific CD8, and promotes the proliferation of T cells expressing CD8 of the present invention.
  • the antigen in the method and the method for producing T cells expressing antigen-specific CD8 for administration in the body of the present invention is a cancer-specific antigen.
  • the pluripotent stem cell-derived professional antigen-presenting cells provided in the present invention are cells that have acquired self-proliferation ability. Once the pluripotent stem cell-derived professional antigen-presenting cells of the present invention are constructed, there is no need to induce or regenerate the pluripotent stem cells into myeloid cells, which is equivalent to DC, which has not been reported so far. Has excellent antigen-presenting ability.
  • MTT investigating the effect of medium containing GM-CSF and / or M-CSF ( ⁇ MEM containing 20% FBS) on the growth rate of iPSC-derived proliferative myeloid cells (pMC) cultured with or without feeder cells.
  • a line graph showing the measurement results of the assay.
  • the vertical axis represents the concentration of formazan metabolized from the MTT reagent (evaluated as the absorbance at a wavelength of 595 nm), and the horizontal axis represents the number of culture days.
  • Histogram showing the results of CD11b and CD11c and CD33 surface antigen analysis by flow cytometer of iPSC-derived pMC cultured with or without feeder cells.
  • GM-CSF-Venus surface antigen analysis by flow cytometer of mouse pMC and ipAPC-GM (upper left), M-CSF-dCD19 surface antigen analysis of human pMC and ipAPC-M (lower left), GM of human pMC and ipAPC-GM -A histogram showing the results of CSF-dCD19 surface antigen analysis (upper right) and GM-CSF-M-CSF-CD19 (lower right) surface antigen analysis of human pMC and ipAPC-GMM.
  • GM-CSF production in culture supernatants in mouse pMC and ipAPC-GM left
  • M-CSF production in culture supernatants in human pMC ipAPC-M
  • ipAPC-GM ipAPC-GM
  • ipAPC-GMM center
  • GM -A bar graph showing the results of quantifying CSF production (right) by the ELISA method.
  • the results of HLA-ABC, HLA-DR, CD40, CD80, CD83, CD86, CCR7, CD74, CD11b, CD11c and CD33 surface antigen analysis by human ipAPC-GM, ipAPC-M, and ipAPC-GMM flow cytometers are shown. histogram. Histogram showing the results of HLA-ABC, HLA-DR, CD40, CD80, CD83, CD86, CCR7, CD74, CD11b, CD11c and CD33 surface antigen analysis by DC flow cytometer.
  • PC1 and PC2 For two axes (PC1 and PC2) with high contribution rate obtained by principal component analysis (PCA) multivariate analysis after total transcriptome analysis (RNA-seq analysis) for GM-CSF-added mouse pMC.
  • PCA principal component analysis
  • RNA-seq analysis total transcriptome analysis
  • GSEA Gene Set Enrichment Analysis
  • mice ipAPC-GM lower and mouse pMC (upper) on the day of culture initiation (Day 0, left side) and day 4 of culture (Day 4, right side) with ⁇ MEM containing 20% FBS containing no exogenous cytokines.
  • Cytokine showing the results of Annexin V and 7-AAD analysis with a meter.
  • the vertical axis of FIG. 10A represents the fluorescence intensity of 7-AAD, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity of Annexin V.
  • FIG. 10B show Annexin V negative and 7-AAD negative, Annexin V positive and 7-AAD negative, and Annexin V positive and 7-AAD positive, as in FIG. 10A.
  • Fractions of live cells lower left
  • early apoptotic cells lower right
  • late apoptotic cells upper right
  • a broken line graph showing the results of analysis of percentages in whole cells with a flow cytometer. The vertical axis of the line graph in the lower left, lower right, and upper right of FIG.
  • 10B is the cells gated in each fraction among all the cells analyzed by flow cytometry on each sampling day of mouse ipAPC-GM or mouse pMC. The percentage is represented, and the horizontal axis represents the sampling date from the culture start date to the culture day 4. Similar cytograms (Day 0 and Day 3) of human ipAPC-GMM (1st stage), ipAPC-M (2nd stage), ipAPC-GM (3rd stage) and pMC (4th stage). Line graph of the results of analyzing the percentages of living cells (lower left), early apoptotic cells (lower right), and late apoptotic cells (upper right).
  • the vertical axis [3 H] - thymidine incorporation scintillation measurement results represent, abscissa ipAPC-GMM, ipAPC-GM, ipAPC-M or pMC number of cells: T cells that have not undergone antigenic stimulation Represents the ratio of the number of cells in. Cytograms (left) of human pMC, ipAPC-GM, ip-APC-M, ip-APC-GM and DC loaded with DQ-OVA protein evaluated by flow cytometry, and DQ-OVA uptake and digested intracellularly. A bar graph (right) showing the percentage of cells that have been cultivated.
  • An asterisk (*) indicates that p ⁇ 0.05 by Student's t-test.
  • the vertical axis represents the volume (unit: cm) of the transplanted tumor, and the horizontal axis represents the number of days after transplanting the tumor.
  • the asterisk (*) indicates p-values: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001 by One-way ANOVAs with Tukey's test.
  • mice to which neither mouse ipAPC-GM nor mouse pMC was administered had the weakest inhibitory effect, mouse ipAPC-GM and mouse pMC not loaded with peptide had almost the same inhibitory effect, and mouse ipAPC-GM loaded with OVA peptide had the weakest inhibitory effect. The effect was high, and the mouse pMC loaded with the OVA peptide was found to have the second inhibitory effect.
  • An asterisk (*) indicates p-values by log-rank tests: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001.
  • the combined photo above shows an antigen-specific product of interferon gamma produced by ELISPOT assay of mouse ipAPC-GM (right side) stimulated with OVA peptide (bottom) or control SIY peptide (top) and naive T cells (left side). Represents the frequency of target T cells.
  • the bar graph below quantitatively shows the results of the combination photo above, with interferon gamma induced by mouse ipAPC-GM or naive T cells stimulated with OVA peptide (gray) or control SIY peptide (white). The frequency of antigen-specific T cells produced is shown.
  • the vertical axis of the graph represents the number of spots that react with interferon gamma (unit: 1 ⁇ 10 2 ).
  • the vertical axis represents the scintillation measurement result (unit: 10 3 cpm) of [3 H] -thymidine uptake into T cells.
  • the horizontal axis represents each of the repertoires of TCRV ⁇ , and the vertical axis represents the frequency of use of each repertoire.
  • the absorbed doses of the cells in the uppermost to lowermost stages are 0 Gy, 65 Gy, 85 Gy and 100 Gy, respectively, and the magnification of the photograph represents 400 times.
  • the scale bar indicates 50 ⁇ m.
  • the horizontal axis absorbed dose (Unit: Gy) of radiation irradiated represent, and the vertical axis of [3 H] ipAPC-GM after radiation exposure in each condition (right side) or pMC (left) - scintillation counting of thymidine incorporation
  • the result (unit: 10 2 cpm (left side), 10 4 cpm (center), cpm (right side)) is represented.
  • FIG. 23 is a cytogram showing the results of Annexin V and 7-AAD analysis by the flow cytometers of mouse ipAPC-GM (lower row) and mouse pMC (upper row) before irradiation and 24 hours after irradiation of 0 Gy or 85 Gy.
  • the lower left and lower right of FIG. 23 are the fractions of Annexin V positive and 7-AAD negative and Annexin V positive and 7-AAD positive, respectively, as in the above cytogram diagram, in the early apoptotic cells (lower left).
  • FIG. 23 A bar graph showing the results of flow cytometer analysis of the percentages of cells gated in each fraction sampled before irradiation and 24 hours after irradiation with 0 Gy or 85 Gy as late apoptotic cells (lower right). ..
  • the vertical axis of the cytogram on FIG. 23 represents the fluorescence intensity of 7-AAD, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity of Annexin V.
  • FIG. 23 The vertical axis of the lower left and lower right bar graphs represents the percentage of cells gated in each fraction of all cells analyzed by flow cytometry on each sampling date of mouse ipAPC-GM or mouse pMC.
  • the horizontal axis represents a sample before irradiation and 24 hours after 0 Gy or 85 Gy irradiation.
  • the vertical axis represents the concentration of formazan metabolized from the MTT reagent (measured by the absorbance at a wavelength of 595 nm), and the horizontal axis represents the number of culture days.
  • Luciferase-expressing ipAPC-GM (ipAPC-GM-Luc) or pMC (pMC-Luc) irradiated with 85 Gy was subcutaneously administered to mice of the same strain, and from the day of administration (Day 0) to the 4th day (Day 4).
  • the right side of the above image is a scale showing the luciferase emission intensity in chromatic colors.
  • the minimum emission intensity is 5.46 x e5, and the maximum emission intensity is 4.31 x e6 (unit: p / sec / cm 2 / sr). ).
  • Total flux of ordinate luciferase luminescence line graph below (unit: 10 7 p / s), the horizontal axis represents the number of days after administration. After loading the OVA peptide on ipAPC-GM whose growth ability was stopped by irradiation and intraperitoneally administering it, the cancer cell MO4 was subcutaneously transplanted and the tumor diameter was evaluated every 3 to 4 days. A line graph showing changes in volume.
  • the vertical axis represents the volume of the tumor (unit: 10 3 mm 3 ), and the horizontal axis represents the number of days after tumor transplantation.
  • the tumor-suppressing effect was the weakest when no antigen-presenting cells were administered, the tumor-suppressing effect was the second weakest in the group administered with pMC after 85 Gy irradiation, and the ipAPC-GM after 85 Gy irradiation was unirradiated bone marrow-derived dendritic cells. Like cells (BM-DC), it had the highest tumor suppressive effect. Survivorship curve of a cancer-bearing mouse individual treated with each cell of FIG. 26.
  • the combination picture above shows the mouse ipAPC-GM (ipAPC-GM 85 Gy), which was loaded with the OVA peptide (lower) or the control SIY peptide (upper) and then irradiated with 85 Gy, and also the OVA peptide (lower).
  • mice pMC 85 Gy loaded with 85 Gy of radiation after loading the control SIY peptide (upper side) and a myeloid dendritic cell loaded with the same OVA peptide (lower side) or control SIY peptide (upper side). It represents the frequency of antigen-specific T cells that produce interferon ⁇ by the ELISPOT assay of cells (BM-DC, right end) and naive T cells (left end).
  • the bar graph below quantitatively shows the results of the combination photographs above, with mouse ipAPC-GM and pMC loaded with OVA peptide (gray) or control SIY peptide (white) and irradiated with OVA peptide.
  • the frequency of myeloid dendritic cells loaded with (gray) or control SIY peptide (white) and antigen-specific T cells that produce interferon ⁇ induced by naive T cells is shown.
  • the vertical axis of the graph represents the number of spots that react with interferon gamma (unit: 1 ⁇ 10 2 ).
  • luciferase-expressing ipAPC-GM ipAPC-GM-HSV-TK-Luc or ipAPC-GM-iCasp9-Luc
  • luciferase-expressing ipAPC-GM ipAPC-GM-Luc
  • the results of intraperitoneal administration of GCV, AP1903, which is a suicide gene-inducing reagent, or physiological saline (Medium) without an inducing reagent are shown for 5 consecutive days from the day of administration (Day 0) to the 4th day (Day 4).
  • Luciferase-expressing ipAPC-GM (ipAPC-GM-iCasp9-Luc) into which the suicide gene iCasp9 has been introduced is subcutaneously administered to mice of the same strain, and living cells in vivo are administered from the day of administration (Day 0) to the 7th day (Day 7).
  • a line graph (left) showing changes over time in the total flux of luciferase luminescence obtained by in vivo imaging of all individuals measured by biochemiluminescence.
  • a bar graph (right) showing the signal attenuation rate (Redoxtion rate) on each measurement day when the signal intensity of Day 0 is 100%.
  • AP1903 which is an inducing reagent for iCasp9, YM-155, which is a Survivin inhibitor, or saline (Medium) without an inducing reagent is intraperitoneally applied.
  • the results of internal administration are shown. * Indicates p ⁇ 0.05 by Student's t-test.
  • the tumor-suppressing effect is the weakest
  • the group to which ICI is administered has the second weakest tumor-suppressing effect
  • the combined use of ipAPC-GM, ipAPC-GM and ICI after 85 Gy irradiation is a tumor.
  • the inhibitory effect was the highest.
  • IpiAPC-GM or ICI anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody
  • mAdpgk or wtAdpgk peptide as a cancer antigen in mice in which ICI-sensitive cancer cell MC38 was subcutaneously transplanted to form a tumor.
  • a broken line graph showing the transition of the tumor volume as a result of intraperitoneal administration using ipAPC-GM and ICI in combination and evaluating the tumor diameter every 3 to 4 days, and the survival curve of the cancer-bearing mouse.
  • the vertical axis of the line graph (left) is the volume of the tumor (unit: 10 3 mm 3 ), and the horizontal axis is the number of days after tumor transplantation.
  • the vertical axis of the survival curve (right) is the survival rate of mice, and the horizontal axis is the number of days after tumor transplantation.
  • * indicates p ⁇ 0.05
  • ** indicates p ⁇ 0.01
  • *** indicates p ⁇ 0.001.
  • the tumor-suppressing effect was the weakest, and the group administered with ipAPC-GM loaded with wtAdpgk had the second weakest tumor-suppressing effect, compared with the wtAdpgk peptide-loaded ipAPC-GM.
  • the mAdpgk peptide-loaded ipAPC-GM treatment group showed a tendency to suppress the increase in tumor diameter, although no significant difference was observed, and the survival of the mice was significantly prolonged. There were no significant differences in the time course of tumor diameter and mouse survival of mAdpgk peptide-loaded ipAPC-GM compared to ICI monotherapy.
  • the figure on the right is a bar graph showing the proportion of MDSC calculated from the results of flow cytometry analysis. ** indicates p ⁇ 0.01 by Student's t-test, and *** indicates p ⁇ 0.001.
  • the figure on the right is a bar graph showing the proportion of both GzmB and Perforin-positive CD8-positive T cells calculated from the results of flow cytometry analysis.
  • the present invention in one embodiment, expresses c-MYC, BMI1 and MDM2 in myeloid cells (MC) to obtain proliferative myeloid cells (pMC), and GM-CSF and / or M-CSF in said pMC.
  • MC myeloid cells
  • pMC proliferative myeloid cells
  • GM-CSF proliferative myeloid cells
  • M-CSF proliferative myeloid cells
  • M-CSF GM-CSF and / or M-CSF in said pMC.
  • pAPC professional antigen presenting cells
  • myeloid cells are a general term for monocytes, macrophages, dendritic cells, and progenitor cells belonging to the cell lineage that differentiate into these cells among leukocytes differentiated from stem cells.
  • the myeloid cells are myeloid cells differentiated from pluripotent stem cells.
  • myeloid cells are also referred to as MC.
  • the “stem cell” refers to a cell that maintains the same differentiation potential into a cell having a specific function even after cell division as before cell division.
  • pluripotent stem cells are all cells that can be cultured in vitro while maintaining an undifferentiated state and that constitute a living body except the placenta (three germ layers (ectodermal, mesodermal,).
  • Embryonic stem cells (ES cells) isolated from embryos after fertilization, pre-formation of the three germ layers, embryos after the organ formation stage including primordial germ cells, and embryos or fetuses are also included in "pluripotent stem cells”.
  • the pluripotent stem cell in the present invention is an induced pluripotent stem cell.
  • induced pluripotent stem cells are pluripotent by directly reprogramming somatic cells that have once lost pluripotency by expressing several types of genes such as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and Myc.
  • a cell that has induced the ability hereinafter, also referred to as iPSC or iPS cell.
  • This "induced pluripotent stem cell” is also included in the "pluripotent stem cell”.
  • Pluripotent stem cells can be produced by known methods. As a production method, for example, for human induced pluripotent stem cells, Cell, 2007, 131 (5) pp. 861-872, Kitayama, S.A. Et al. (Stem Cell Reports.
  • Pluripotent stem cells can also be obtained from animals that have undergone embryo manipulation techniques, including cloned embryos, transgenic animals, and genome-edited mutant animals. Pluripotent stem cells are known to be able to differentiate into cells of various cell types, including myeloid cells. Professional antigen-presenting cells (pAPC) prepared from induced pluripotent stem cells are referred to as iPSC-derived professional antigen-presenting cells (ipAPC).
  • Human or mouse iPSCs can be maintained and expanded using StemFit (Ajinomoto), a medium for regenerative medicine.
  • Laminin 511 may be added.
  • a lock inhibitor for example, Y-27632, may be added to the medium in an amount of about 10 ⁇ M in order to reduce and remove the damage of iPSC caused by dissociating the cells for subculture of the cells.
  • Pluripotent stem cells can be obtained from a predetermined institution, and commercial products can also be purchased.
  • human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are available from the Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University.
  • EB5 cells, which are mouse embryonic stem cells, are available from RIKEN, and D3 strains are available from ATCC.
  • Pluripotent stem cells can be maintained and cultured by a known method.
  • human pluripotent stem cells can be maintained by culturing in a medium supplemented with KnockOut TM Serum Replacement (Invitrogen).
  • Mouse pluripotent stem cells can be maintained by adding fetal bovine serum (FBS) and Leukemia Inhibitory Factor (LIF) and culturing under a feeder-free environment.
  • FBS fetal bovine serum
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • a proliferative myeloid cell is a myeloid cell that can be cultured for a long period of 3 months or longer, and is superior in proliferative property as compared with a myeroid cell normally present in an embryo or an adult.
  • proliferative myeloid cells are also referred to as pMC.
  • the professional antigen-presenting cell is a cell specialized for antigen presentation that expresses not only a human leukocyte antigen (Hman Leukocyte Antigen: HLA) class I molecule possessed by a normal dendritic cell but also an HLA class II molecule. Yes, including macrophages, dendritic cells, B cells, etc.
  • HLA human leukocyte Antigen
  • pAPC professional antigen-presenting cells
  • c-MYC "BMI1”, “MDM2”, “GM-CSF” and “M-CSF” are professional antigens derived from myeloid cells derived from pluripotent stem cells of humans or non-human mammals.
  • genomic DNA or genomic DNA of human c-MYC, BMI1, MDM2, GM-CSF and M-CSF and variants thereof are useful.
  • genomic DNA or cDNA of c-MYC, BMI1, MDM2, GM-CSF and / or M-CSF derived from other species can also be used.
  • cDNA can be used.
  • genomic DNA or cDNA of c-MYC, BMI1, MDM2, GM-CSF and / or M-CSF derived from other species can also be used.
  • Sequence information of various biological species such as "c-MYC”, “BMI1”, “MDM2”, “GM-CSF” and “M-CSF” proteins, genomic DNAs or cDNAs of the present invention can be obtained, for example, from the National Center for Biotechnology Information. It can be obtained from sources well known to those of skill in the art, such as the Gene of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • expression means that a desired gene or protein is produced intracellularly and, in some cases, secreted extracellularly to exert the function of the gene or protein.
  • gene-introduced means that a desired gene is introduced into a specific cell, the gene or a protein encoded by the gene is produced intracellularly, and in some cases, secreted extracellularly, and the protein is produced. It means to exert the function of.
  • the desired gene or protein in the present invention refers to "c-MYC", "BMI1", “MDM2”, “GM-CSF”, “M-CSF” and the like.
  • c-MYC, BMI1 and MDM2 are gene-introduced into myeloid cells.
  • GM-CSF and / or M-CSF are gene-introduced into proliferative myeloid cells.
  • the present invention further comprises differentiating myeloid cells (MC) from pluripotent stem cells by the following method (i) or (ii).
  • MC myeloid cells
  • the manufacturing method Embryoid bodies (EBs) derived from the pluripotent stem cells are layer-cultured on feeder cells in a medium containing VEGF, and then further cultured in a medium containing VEGF, SCF and TPO.
  • Embryoid bodies derived from the pluripotent stem cells were subjected to monolayer culture without feeder cells in a medium containing BMP-4, VEGF and SCF, and then further VEGF, TPO and GM-CSF were added. Incubate in the medium containing.
  • the “embryoid body” in the present invention refers to a cell mass formed by adhesion of undifferentiated pluripotent stem cells.
  • the pluripotent stem cells that make up the cell mass have a limited repertoire of cell differentiation due to close cell-cell interactions within the cell mass, as if embryo layers were formed after implantation. Similar to the embryo of.
  • the size of the embryoid body in the present invention is not particularly limited, but the diameter is preferably 50 to 1000 ⁇ m, more preferably 50 to 500 ⁇ m, and particularly preferably 50 to 200 ⁇ m. If the size of the embryoid body is larger than the above range, the oxygen supply to the inside of the embryoid body becomes insufficient and cell necrosis may occur. If the size of the embryoid body is too smaller than the above range, a single cell that does not form an embryoid body may undergo cell death due to apoptosis.
  • Mouse embryo-like bodies may be cultured using mouse mesenchymal C3H10T1 / 2 cells or mouse bone marrow-derived stromal OP9 cells as feeder cells. Human embryoid bodies can be cultured without the use of feeder cells.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • SCF serotonin-containing cell
  • TPO myeloid cells
  • BMP-4 myeloid cells
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • SCF embryo-like organism species to be cultured
  • BMP-4" and / or GM-CSF provided that they have the same level of differentiation-inducing activity, VEGF, SCF, TPO, BMP of organisms other than the embryo-like organisms to be cultured.
  • -4 and / or GM-CSF protein, or variants of VEGF, SCF, TPO, BMP-4 and / or GM-CSF protein of the same species as the embryo-like organism to be cultured can be used. can.
  • Flt-3L, IL-3 and / or bFGF are also used in the culture of the cells of the present invention together with the above-mentioned VEGF, SCF, TPO, BMP-4 and / or GM-CSF and the like.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • SCF vascular endothelial growth factor
  • TPO vascular endothelial growth factor
  • BMP-4 / or GM-CSF and the like.
  • GM-CSF GM-CSF and the like.
  • sources well known to those of skill in the art such as Gene in the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • a recombinant protein reagent for example, from R & D Systems (https://www.rndssystems.com/), Recombinant Human Flt-3 Land / FLT3L Protein (308-FKN), Recombinant Human-IL-3Pro.
  • Recombinant Human FGF basic / FGF2 / bFGF (145 aa) Protein 3718-FB
  • Recombinant Human VEGF 165 Protein 293-VE
  • Recombinant HumanRetmanSCF2-temanSCF2-temanSCF2 Recombinant Human BMP-4 Protein (314-BP)
  • Recombinant Human GM-CSF Protein 215-GM
  • Sequence information of various species of proteins, genomic DNAs or cDNAs of the "VEGF”, “SCF”, “TPO”, “BMP-4" and / or "GM-CSF” of the present invention can be found, for example, in the National Center for Biotechnology Information. It can be obtained from sources well known to those of skill in the art, such as the Gene of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the gene or protein it is preferable to use a gene or protein of the same type as the pluripotent stem cell used.
  • the pluripotent stem cell is of human origin, it is preferable to use human-derived VEGF, SCF, TPO, BMP-4, GM-CSF, Flt-3L, IL-3 and / or bFGF.
  • the pluripotent stem cells are derived from mice, it is preferable to use the gene or protein derived from mice as well.
  • the "medium containing the substance X” means a medium to which the exogenous substance X is added or a medium containing the extrinsic substance X, and the "medium containing no substance X" is used.
  • the "extrinsic substance X” means a substance X foreign to the cells or tissues cultured in the medium, and the endogenous substance X produced by the cells or tissues is included therein. I can't.
  • the "medium containing VEGF” is a medium to which exogenous VEGF is added or a medium containing exogenous VEGF.
  • the dose of VEGF may be affected by other growth factors and the like, but is preferably 0.2 ng / mL to 200 ng / mL, more preferably 2 ng / mL to 100 ng / mL, and 5 ng / mL to 5 ng / mL. 50 ng / mL is particularly preferred.
  • the “VEGF-free medium” is a medium to which exogenous VEGF is not added or a medium containing no extrinsic VEGF.
  • the medium containing SCF, TPO, BMP-4 and / or GM-CSF is extrinsic SCF, TPO, BMP-4 and / or GM.
  • / ML to 100 ng / mL is more preferable, 5 ng / mL to 50 ng / mL is more preferable, 5 ng / mL to 15 ng / mL is particularly preferable, and 10 ng / mL is most preferable.
  • Medium without SCF, TPO, BMP-4 and / or GM-CSF means medium without exogenous VEGF or exogenous SCF, TPO, BMP-4 and / or GM-CSF. It is a medium that does not contain.
  • ⁇ MEM As the medium for the embryoid body of the mouse in the present invention, ⁇ MEM supplemented with 20% fetal bovine serum (FBS) can be used.
  • FBS fetal bovine serum
  • mouse mesenchymal C3H10T1 / 2 cells or mouse bone marrow-derived stromal OP9 cells can be used.
  • X-VIVO15 As the medium for the human embryoid body, X-VIVO15 (Lonza), which is a completely synthetic medium, can be used.
  • HPC hematopoietic progenitor cells
  • the CD11b-positive fraction can be concentrated with magnetic beads.
  • ⁇ MEM As the medium, ⁇ MEM or the like to which 20% FBS is added can be used.
  • the proliferative myeloid cell (pMC) of the present invention can introduce the gene of GM-CSF and / or M-CSF.
  • the "feeder cell” in the present invention is another cell type used for adjusting the culture conditions of undifferentiated maintenance culture and differentiation induction culture of iPS cells. Feeder cells are used by stopping their growth by treatment with mitomycin C or irradiation. Mouse-derived fibroblasts can be used for undifferentiated maintenance culture, mouse bone marrow-derived stromal cells OP-9, mouse-derived mesenchymal cells C3H10T1 / 2 and the like can be used for differentiation-inducing culture.
  • the "multilayer culture” in the present invention is to inoculate the target iPS cells or embryoid bodies into the culture system of the feeder cell layer cultured in a predetermined culture vessel and co-culture.
  • “monolayer culture” means culturing a single cell type by adhering it to a container for tissue culture.
  • monolayer culture without feeder cells refers to inoculating the target iPS cells or embryoid bodies in a culture vessel and statically culturing them.
  • the present invention further relates to a method for producing a professional antigen-presenting cell, which comprises forming an embryoid body from pluripotent stem cells by the following method.
  • a single cell dispersion of pluripotent stem cells is seeded in a cell mass-forming culture vessel to form an embryoid body (EB), and
  • EB embryoid body
  • the container includes a fine spheroid well at the bottom and no flat surface between adjacent spheroid wells.
  • Forming an embryoid body means dissociating pluripotent stem cells that have grown in an undifferentiated state to obtain a single cell dispersion of pluripotent stem cells, and using the dispersion to form pluripotent stem cells. It refers to forming a qualitatively uniform cell mass by suspension culture or static culture under the condition of adhesion and aggregation. Confirmation of embryoid body formation is performed by confirming the presence of living cells by visual observation with a microscope.
  • the term "suspended culture” refers to culturing cells or cell masses in a suspended state under conditions that do not adhere to substrates such as the bottom surface and wall surface of a culture vessel.
  • the incubator used for the suspension culture is not particularly limited as long as it can be "suspended culture", and a person skilled in the art can appropriately determine the incubator.
  • Examples of such an incubator include a flask, a tissue culture flask, a dish, a petri dish, a tissue culture dish, a multi-dish, a microplate, a microwell plate, a micropore, a multi-plate, a multi-well plate, and a chamber slide. Examples include petri dishes, tubes, trays, culture bags, or roller bottles.
  • These incubators are preferably cell non-adhesive to allow suspension culture.
  • the cell non-adhesive incubator one in which the surface of the incubator is not artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving the adhesion to cells can be used.
  • pluripotent stem cells it is preferable to rapidly aggregate pluripotent stem cells to form an embryoid body derived from pluripotent stem cells.
  • a cell mass of pluripotent stem cells is formed in this way and transferred to a medium supplemented with VEGF at a concentration of 50 ng / mL and cultured, the cells of the cell mass are formed from hematopoietic stem cells to myeloids in the same manner as the blood islets of the ocher sac. It can be differentiated into a cell lineage into cells.
  • a small space using a culture vessel such as a plate having many small-diameter holes (wells) (for example, a 96-well plate) or a cell mass-forming culture vessel is used.
  • a culture vessel such as a plate having many small-diameter holes (wells) (for example, a 96-well plate) or a cell mass-forming culture vessel.
  • Examples include a method of confining cells in a cell and a method of agglutinating cells by centrifuging for a short time using a small centrifuge tube.
  • the culture conditions for aggregates of cells and pluripotent stem cells are swirling culture, shaking culture and other suspension cultures, as well as pluripotency by preliminarily treating the substrate surface in contact with cells in the culture vessel to make it hydrophobic.
  • the static culture can also be performed on condition that the adhesion between the sex stem cells and the substrate surface of the culture vessel is reduced or suppressed.
  • embryoid bodies as cell clusters of pluripotent stem cells and the differentiation of embryoid body cells into myeloid cells can be confirmed by using a microscope or FACS to confirm the size and number of embryoid bodies.
  • Confirmation of microscopic morphology of embryoid body in culture, confirmation of tissue or cytochemical findings, and / or expression of differentiation and undifferentiated markers, their homogeneity, regulation of expression of differentiation markers, their synchronization it is possible to make a judgment based on characteristics including, but not limited to, confirmation of reproducibility between embryoid bodies of differentiation efficiency.
  • "positive” for a certain marker means that the cell is measured by flow cytometry, and the average fluorescence intensity ratio of the positive cell to the negative control is + 10 times or more, and 2 times or more. Less than 10 times is low, and less than 2 times is-.
  • the expression level of the gene is measured by a real-time PCR method, and the housekeeping genes ⁇ -actin and GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate) are measured.
  • the expression level for dehydology), HPRT 1 (hypoxanthine phosphoribothyltransphase 1) or ⁇ 2-microglobulin is assumed to be 1-fold or higher, and less than 1-fold.
  • the single cell dispersion means that cultured cells are washed with PBS or the like, treated with a cell stripping solution Tripsin-EDTA (Life Technologies) or TripLE Select (Life Technologies) for 4 to 5 minutes, and further treated with PBS or the like.
  • the pellets of the target cells obtained by centrifugation after washing with the above-mentioned cells were prepared by resuspending them with a desired culture solution or the like by pipetting.
  • the cell mass-forming culture container means a container in which cells seeded at the time of culturing can form a cell aggregate without adhering to the container.
  • the container is provided with a fine spheroid well at the bottom, which is the culture surface, and there is no flat surface between adjacent spheroid wells, and the adjacent spheroid well is one of the spheroid wells.
  • Most of the cells seeded in the culture vessel are spheroids because they are separated by a curved surface that slopes toward the surface and the curved surface is surface-treated to suppress the adhesion of the cells. Fall into the well.
  • a container is a container in which spheroid wells having a diameter of about 400 to 800 ⁇ m and a depth of 100 to 800 ⁇ m are uniformly arranged on the culture surface (bottom) to the wall surface without any gaps.
  • the spheroid well has a diameter of 400 to 500 ⁇ m and a depth of 50 to 200 ⁇ m.
  • the spheroid well is a container having a diameter of about 500 ⁇ m and a depth of about 400 ⁇ m, a container having a diameter of about 800 ⁇ m and a depth of about 400 ⁇ m, or a container having a diameter of about 800 ⁇ m and a depth of about 300 ⁇ m.
  • the spheroid well is a container having a diameter of about 400 ⁇ m and a depth of 100 to 200 ⁇ m.
  • the spheroid well is uniformly processed to the wall surface without any gap on the culture surface (bottom).
  • the spheroid well is uniformly processed to the wall surface without any gap on the culture surface (bottom).
  • the spheroid well is uniformly processed to the wall surface without any gap on the culture surface (bottom).
  • the seeded single cell suspension falls into one of the spheroid wells, forming a uniform aggregate. Because it can be done.
  • it is a microfabricated cell culture vessel (EZSPHERE®) manufactured by AGC.
  • the present invention further (i) Embryoid bodies (EB) by seeding pluripotent stem cells in a cell mass-forming culture vessel with a fine spheroid well at the bottom and no flat surface between adjacent spheroid wells. To form, (ii) Obtaining myeloid cells (MC) from the embryoid body by the following method (ii) -1 or (ii) -2.
  • EB Embryoid bodies
  • the myeloid cells (MC) obtained in (ii) are expressed with c-MYC, BMI1 and MDM2 to obtain proliferative myeloid cells (pMC), and (iv) The proliferative myeloid cells (pMC) obtained in (iii) are expressed with GM-CSF and / or M-CSF to obtain professional antigen presenting cells (pAPC). Regarding a method for producing professional antigen-presenting cells.
  • the present invention further comprises transgenesis of c-MYC, BMI1 and MDM2 into myeloid cells, and GM-CSF and / or M-CSF are proliferative myeloid cells.
  • the present invention relates to a method for producing a professional antigen-presenting cell, which is gene-introduced into (pMC).
  • the present invention further relates to a method for producing a professional antigen-presenting cell having an embryoid body (EB) having a size of 50 to 200 ⁇ m.
  • EB embryoid body
  • pluripotent stem cells When the embryoid body size is 50 to 200 ⁇ m, pluripotent stem cells can efficiently differentiate into myeloid cells in both on-feeder differentiation induction and feeder-free differentiation induction.
  • the present invention further comprises irradiating the professional antigen presenting cells (pAPC) with radiation (R / pAPC step) and / or introducing a suicide gene into pAPC. Further, the present invention relates to a method for producing a professional antigen presenting cell.
  • the radiation may be any radiation, including gamma rays, X-rays, ultraviolet rays, visible rays, infrared rays, and microwave radiation. X-rays are preferable.
  • irradiating radiation means exposing cells to radiation.
  • any professional antigen-presenting cells after irradiation lose their self-proliferation ability, but can maintain the ability to promote the proliferation of T cells. Absorbed dose may be applied.
  • introducing a suicide gene into pAPC means that the suicide gene is retained in pAPC and the suicide gene is in a functional state.
  • a suicide gene is a gene that can cause the cell into which the gene has been introduced to die.
  • the method of removing a cell by a suicide gene first introduces into the cell a suicide gene encoding a protein that causes the death of the cell into which the suicide gene has been introduced only when the suicide gene is activated by a specific compound. It is done by.
  • the suicide gene may encode an enzyme that selectively converts a non-toxic compound into a highly toxic metabolite. As a result, cells expressing the enzyme are specifically removed.
  • the suicide gene is a herpes virus thymidine kinase (HSV-tk) gene, the trigger of which can be purchased from ganciclovir, AP1903 (available from MedChemExpress), or YM-155 (Cayman Chemical).
  • the suicide gene is an E. coli cytosine deaminase (EC-CD) gene, the trigger of which is 5-fluorocytosine (5-FC) (Barrese et al., Mol. Therap. 20 (10). ): 1932-1943 (2012), Xu et al., Cell Res. 8: 73-8 (1998), both of which are incorporated herein by reference in their entirety).
  • the suicide gene is an inducible caspase protein.
  • Inducible caspase proteins include at least a portion of caspase proteins that can induce apoptosis.
  • the inducible caspase protein is iCasp9. It contains the sequence of a human FK506 binding protein (FKBP12) with an F36V mutation linked to a gene encoding human caspase-9 via a series of amino acids. FKBP12-F36V binds to AP1903, a small molecule dimerizing agent, with high affinity. Therefore, the suicidal function of iCasp9 in the present invention is caused by administration of a chemical inducer of dimerization (CID).
  • CID chemical inducer of dimerization
  • the CID is the small molecule drug AP1903. Apoptosis is rapidly induced by dimerization (WO2011146862; Stasi et al, N. Engl. J. Med 365; 18 (2011); Tey et al., Biol. Blood Marlow Transplant. 13: 913-924. (2007), each of which is incorporated herein by reference in its entirety).
  • a method for introducing a suicide gene it can be introduced into cells using a gene transfer vector containing a desired suicide gene.
  • the gene transfer vector include a viral vector and a non-viral vector.
  • the virus vector include a lentiviral vector and a retroviral vector, and the lentiviral vector is preferable.
  • non-viral vectors include transposon vectors and plasmid DNA.
  • the suicide gene can be introduced into the desired cell by incorporating the suicide gene into genomic DNA by genome editing.
  • the present inventors when irradiating a professional antigen-presenting cell with radiation, the present inventors lose the self-proliferative ability of the professional antigen-presenting cell, but the radiation is sufficient to maintain the ability to promote the proliferation of T cells. It was found that when the professional antigen-presenting cells are administered in vivo at the time of irradiation, they disappear from the living body at least 3 to 4 days after the in vivo administration.
  • the irradiation dose of the radiation of the present invention may be any range as long as the irradiated professional antigen-presenting cells disappear from the living body within 3 to 4 days after the in vivo administration.
  • 5 to 100 Gy, 10 to 85 Gy, 10 to 75 Gy, 10 to 65 Gy, 10 to 55 Gy, and the like can be mentioned. It is preferably 10 Gy to 85 Gy, more preferably 10 Gy to 75 Gy, still more preferably 10 Gy to 65 Gy, particularly preferably 10 Gy to 55 Gy, and most preferably 10 Gy to 40 Gy.
  • the irradiation dose of the radiation of the present invention is preferably 5 to 85 Gy, more preferably 10 to 85 Gy, further preferably 20 to 85 Gy, and particularly preferably 25 to 85 Gy. Within the above range, the irradiated mouse pAPC disappears from the living body 3 to 4 days after the in vivo administration.
  • the irradiation dose of the radiation of the present invention is preferably 5 to 80 Gy, more preferably 10 to 80 Gy, further preferably 20 to 80 Gy, and particularly preferably 20 to 40 Gy. Within the above range, the irradiated human pAPC disappears from the living body 3 to 4 days after the in vivo administration.
  • T cells are lymphocytes that recognize the antigen presented by pAPC via HLA / MHC and cause a cell-mediated immune response to damage and kill cells regarded as foreign substances.
  • Naive T cells are a surface marker CD3-positive cell population differentiated from hematopoietic stem cells, and subtypes such as CD4-positive helper T cells, CD8-positive killer T cells, and Foxp3-positive regulatory T cells are present depending on the co-expressed surface markers. do.
  • CD8-positive killer T cells specific for the antigen loaded on pAPC are particularly desirable.
  • the present invention further relates to a professional antigen presenting cell (pAPC) produced by the production method described in the present specification.
  • pAPC professional antigen presenting cell
  • the present invention is a professional antigen-presenting cell (pAPC) produced by the production method described in the present specification, which is a living body when administered to a living body after irradiation. With respect to professional antigen presenting cells (pAPC), which disappear from the body at least 3-4 days after administration.
  • the present invention relates to a professional antigen presenting cell (pAPC), which has low expression of CD11b / c and expresses CD74.
  • pAPC professional antigen presenting cell
  • the present invention relates to a professional antigen presenting cell (pAPC), which has low expression of CD11b / c and expresses CD74 and CD33.
  • pAPC professional antigen presenting cell
  • This professional antigen presenting cell can be produced by the method described herein.
  • CD11b is a differentiation marker for myeloid cells expressed on the cell surface. It can be detected by immunostaining with an anti-CD11b antibody and analyzing with a flow cytometer.
  • CD11c is a differentiation marker for dendritic cells expressed on the cell surface. It can be detected by immunostaining with an anti-CD11c antibody and analyzing with a flow cytometer.
  • CD33 is a differentiation marker for myeloid cells expressed on the cell surface. It can be detected by immunostaining with an anti-CD33 antibody and analyzing with a flow cytometer.
  • CD74 is a marker expressed on the cell surface involved in cross-presentation. It can be detected by immunostaining with an anti-CD74 antibody and analyzing with a flow cytometer.
  • the average fluorescence intensity ratio of positive cells to the negative control is doubled or more.
  • Low expression means that the average fluorescence intensity ratio of positive cells to a negative control is 2 times or more and less than 10 times.
  • CD11b and c we have low expression of CD11b and c, and professional antigen-presenting cells expressing CD74 or CD74 and CD33 non-antigenically represent T cells, especially naive T cells expressing CD8.
  • the present inventors also promote the proliferation of CD8-expressing T cells in vivo by irradiating the professional antigen-presenting cells, but the professional antigen-presenting cells are 3 to 4 after administration. It was found that it disappears from the living body in a day.
  • Disappearance means that the cells administered to the living body cannot be detected or are immunologically eliminated. Specifically, for example, by the method described in Example 8 below, the photographed image of in vivo imaging and the change with time of the total flux of luciferase emission can be confirmed, and it can be confirmed by the detection limit or less. Further, not only luciferase but also fluorescent dyes, radioactive compounds and the like can be used for confirmation by the same method.
  • CD11b / c is lowly expressed from the blood sample of the living body, and T cells expressing CD33 and CD74 are below the detection limit. It can also be confirmed by that.
  • any method may be used as long as the professional antigen-presenting cell of the present invention or a method capable of confirming T cells expressing CD33 and CD74 with low expression of CD11b / c can be used, and the antigen can be used by these methods. If the presence of presenting cells or T cells cannot be detected, it can be determined that the professional antigen-presenting cells of the present invention have disappeared.
  • the present invention further has a self-proliferating ability and With respect to the above-mentioned professional antigen presenting cells (pAPC), which exhibit resistance to apoptosis.
  • pAPC professional antigen presenting cells
  • This professional antigen presenting cell can be produced by the method described herein.
  • the autoproliferative ability is the ability to activate a cell proliferation signal and carry out cell proliferation by a cytokine produced and autocrine by the cell itself.
  • Self-proliferation ability can be confirmed by the proliferation of cells seeded using a culture medium containing, for example, RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), which does not contain cytokines.
  • FBS fetal bovine serum
  • As a confirmation method of cell proliferation cell counting before and after incubation, MTT assay, [3 H] - can be evaluated, such as thymidine uptake activity.
  • Apoptosis resistance is a property that can avoid cell death due to apoptosis.
  • Apoptosis resistance can be assessed by staining cells with the fluorescent dye labeling reagents FITC-labeled Annexin-V, 7-AAD and PI, which can detect cell death, and then analyzing with a flow cytometer.
  • the present invention further co-cultures the above-mentioned professional antigen presenting cells or GM-CSF and naive T cells expressing CD8 in vitro, and in vitro and in vitro. , A method of promoting the proliferation of T cells expressing antigen-non-specific or antigen-specific CD8.
  • the invention is antigen-non-specific or antigen-specific using the aforementioned method of promoting the proliferation of antigen-non-specific or antigen-specific CD8-expressing T cells.
  • the present invention relates to a method for producing T cells expressing CD8.
  • This professional antigen presenting cell can be produced by the method described herein.
  • GM-CSF alone can promote the proliferation of T cells, particularly T cells expressing CD8, in a non-antigen-specific manner.
  • Naive T cells expressing CD8 are cell populations expressing CD3, which is a cell surface marker of T cells, that have not been stimulated with an antigen.
  • the non-antigen-specific T cell is a T cell population that maintains a state of having a variety of T cell receptors without being biased toward a population of T cells having a T cell receptor that recognizes a specific antigen.
  • the professional antigen-presenting cell may be a professional antigen-presenting cell loaded with a desired antigen.
  • An antigen-specific T cell is a T cell that expresses a T cell receptor that specifically recognizes a specific antigen by stimulation of an antigen-presenting cell loaded with a desired antigen.
  • the "antigen” refers to all proteins, sugar chains and other molecules capable of inducing an immune response specific to the antigen, particularly a cell-mediated immune response.
  • the antigen of the present invention is an autologous cell harmful to a living body such as a cancer cell, a cell having nerve degeneration or other tissue degeneration, or a cell having a harmful reaction to the living body through a physiological or pathological process.
  • An antigen that induces cell-mediated immunity specific to these cells is preferred in order to eliminate the cells.
  • it is particularly preferable that it is a cancer-specific antigen.
  • the "cancer-specific antigen” is a protein, sugar chain or other molecule expressed only when a cell of a specific cell type becomes malignant and proliferates, and such a malignant cell is defined as a molecule.
  • the professional antigen-presenting cells may be those irradiated with radiation in vitro.
  • T cells expressing antigen-specific or non-specific CD8 are promoted in vivo after the cells are administered in vivo.
  • the professional antigen-presenting cells can disappear from the living body 3 to 4 days after administration to the living body.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition for inducing the proliferation of CD8-expressing T cells, which further comprises the above-mentioned professional antigen-presenting cells.
  • the "pharmaceutical composition for inducing T cell proliferation” refers to a pharmaceutical composition for inducing T cell proliferation.
  • the present invention refers to a pharmaceutical composition for inducing proliferation by acting on naive T cells that are in a dormant state or a state close to that of cell proliferation, and produces cytokines themselves that promote T cell proliferation or the cytokines thereof. It also includes secreted cells and pharmaceutical compositions that induce not only proliferative but also proliferating T cells with cytotoxicity as specific cytotoxic T cells. This pharmaceutical composition can activate immunity in vivo.
  • the present invention comprises loading the above-mentioned professional antigen-presenting cell with an antigen, irradiating the professional antigen-presenting cell loaded with the antigen with radiation, and irradiating the radiation.
  • CD8 for administration into the body, including co-culturing professional antigen-presenting cells and naive T cells expressing CD8 in vitro to promote the proliferation of T cells expressing the antigen-specific CD8.
  • a method for producing T cells and T cells expressing CD8 produced by this method are included.
  • the CD8-expressing T cells produced by this method can be administered into the body. Professional antigen-presenting cells irradiated with the radiation of this method can disappear from the living body 3 to 4 days after the living body administration.
  • the CD8-expressing T cell produced by this method may be a T cell expressing an antigen-specific CD8 loaded on the professional antigen-presenting cell, and the antigen may be a cancer-specific antigen. ..
  • the professional antigen presenting cells of the invention or T cells expressing CD8 can be used in combination with anticancer agents and / or other methods of treating cancer.
  • the professional antigen-presenting cells of the present invention or T cells expressing CD8 can be used in combination with an immune checkpoint inhibitor.
  • anticancer agents and / or other methods of treating cancer include surgical therapies that physically remove and remove cancer cells, alkylating agents, platinum compounds, metabolic antagonists, and topoisomerase inhibition.
  • Chemotherapy and chemotherapeutic agents that administer chemicals, including but not limited to drugs, microtube inhibitors, antibiotics, and chemotherapeutic and immunotherapeutic agents that attack cancer cells as non-self.
  • X-rays, electron beams, gamma rays, neutron rays but not limited to radiotherapy that inhibits the growth of cancer cells and kills them by irradiation.
  • Chemotherapeutic agents for the treatment of cancer include 6-O- (N-chloroacetylcarbamoyl) fumaguilol, bleomycin, methotrexate, actinomycin D, mitomycin C, doxorubicin, adriamycin, neocultinostatin, cytosine arabinoside.
  • the other treatment method may
  • the immune checkpoint inhibitor is an anticancer drug that suppresses the growth of cancer by binding to an immune checkpoint molecule that suppresses the activity of T cells by presentation of an antigen and inhibiting its signal transduction. It is an agent.
  • Immune checkpoint molecules can include both receptors and ligands that function as immune checkpoints.
  • the "immune checkpoint inhibitor” is, but is not limited to, for example, binding or interaction between PD-L1 and PD-1, CD80 / CD86 and CTLA4. Binding or interaction between CD137L and CD137, binding or interaction between MHC and LAG-3 / KIR, binding or interaction between CD48 and CD244, binding or interaction between GAL9 and TIM3. It can inhibit action, binding or interaction between HVEM and BTLA / CD160, binding or interaction between CD40L and CD40, binding or interaction between OX40L and OX40, and binding or interaction between GITRL and GITR. Includes any antibody or compound.
  • the "immune checkpoint inhibitor” is, but is not limited to, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA4 antibody, anti-B7 antibody, anti-C27. It is selected from the group consisting of antibodies, anti-KIR antibodies, IDO inhibitors, anti-CD137 antibodies, and anti-TIM3 antibodies.
  • the "immune checkpoint inhibitor” is, but is not limited to, atezolizumab, Durvalumab, Averumab, Nivolumab, pembrolizumab. (Pembrolizumab), Pijirizumabu (Pidilizumab), BMS-936559, ipilimumab (ipilimumab), Toremerimumabu (tremelimumab), Enoburitsuzumabu (Enoblituzumab), Varurirumabu (Varlilumab), Ririrumabu (Lirilumab), Epakadosutatto (Epacadostat), Utomirumabu (Utomilumab), Urerumabu ( Urelumab), and TSR-022.
  • the "immune checkpoint inhibitor" is preferably an anti-PD-L1 antibody, an anti-PD-1 antibody, or an anti-CTLA4 antibody, more preferably an anti-PD-L1 antibody or an anti-CTLA4 antibody. ..
  • Example 1 Preparation of embryoid body derived from human iPSC Kitayama, S.A. (Stem Cell Reports. 6: 213-227, (2016)) et al. (Stem Cell Reports. 6: 213-227, (2016)) prepared human iPSCs.
  • Maintenance culture of human iPSC was performed on a polystyrene tissue culture plate coated with iMatrix511 (Nippi) using StemFit AK02N (Ajinomoto Healthy Supply), a medium for regenerative medicine.
  • Medium exchange is performed every 1 to 2 days, treated once a week with a cell stripping solution TripLE Select (Life Technologies) for 4 to 5 minutes according to the growth of cells, and collected as a single cell dispersion, which is suitable.
  • the seeds were sown in a culture vessel of a size and the culture was continued.
  • the seeded iPSCs were cultured overnight in the presence of a Rock inhibitor 10 ⁇ M Y-27632 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the medium was exchanged the next day to remove Y-27632.
  • human EB The embryoid body derived from human iPSC (hereinafter referred to as human EB) is prepared by StemFit containing 10 ⁇ M Y-27632 in a 6-well plate type cell mass formation culture vessel EZ SPHERE SP (AGC technoglass). This was done by sowing human iPSCs having a predetermined density. One to four days after the formation of an embryoid body having a diameter of 50 to 200 ⁇ m, the differentiation-inducing culture of Example 3 described later was carried out.
  • Example 2 Preparation of embryoid body derived from mouse iPSC Araki, R. et al. Et al. (Nature, 494: 100-104. (2013)) produced mouse iPSCs.
  • Maintenance culture of mouse iPSC is, ES cell medium ESM (15% KSR (Life Technologies) containing DMEM (Wako Pure Chemical)) to a final concentration of 55 [mu] M 2-mercaptoethanol (Life Technologies) and 10 4 U / mL Leukemia Inhibitory Factor (Using complete medium complete ESM (cESM) prepared by adding LIF) (Merck, trade name ESGROM LIF), it was performed on the feeder cells of mouse embryonic fibroblasts MEF (reprocell) seeded on a 6-well tissue culture plate. rice field.
  • ESM complete medium complete ESM
  • LIF Merck, trade name ESGROM LIF
  • Feeder cells were prepared by seeding a gelatin-coated dish with MEF (reprocell) whose cell proliferation was stopped by Mitomycin C treatment, and used for maintenance culture of mouse iPSCs the day after the MEF adhered.
  • MEF reprocell
  • mouse EB The embryoid body derived from mouse iPSC (hereinafter referred to as mouse EB) was prepared by inoculating a 6-well plate type EZ SPHERE with a predetermined density of mouse iPSC prepared with a complete medium cESM. One to four days after the formation of an embryoid body having a diameter of 50 to 200 ⁇ m, the differentiation-inducing culture of Example 3 described later was carried out.
  • Example 3 Induction of embryoid body differentiation into myeloid cells (1) Preparation of feeder cells A mouse-derived cultured cell line C3H10T1 / 2 or OP9 was seeded on a gelatin-coated dish, and the cell line was seeded the next day. used. The feeder cells used for inducing the differentiation of embryoid bodies derived from human iPSC were used after irradiating with radiation of 60 Gy to stop their proliferation. BME medium (Life Technologies) containing 10% FBS was used for culturing C3H10T1 / 2 cells, and ⁇ MEM medium (Life Technologies) containing 20% FBS was used for culturing OP9 cells.
  • BME medium (Life Technologies) containing 10% FBS was used for culturing C3H10T1 / 2 cells
  • ⁇ MEM medium Life Technologies
  • Mouse EB prepared from mouse iPSC is cultured on feeder cell OP9 for 7 to 10 days using ⁇ MEM containing 20% FBS in differentiation-inducing medium, and then recovered cells are newly prepared. It was re-sown on the OP9 feeder. Differentiated cells containing myeloid cells were obtained by culturing for 7 to 10 days in the presence of 55 ⁇ M 2-mercaptoethanol and 50 ng / mL GM-CSF.
  • the reseeded cells were cultured for 7 to 10 days in the presence of 50 ng / mL SCF, 50 ng / mL Flt-3L and 50 ng / mL GM-CSF to obtain differentiated cells containing myeloid cells.
  • any two concentrations in the range of 0.2 ng / mL to 200 ng / mL can be set as the upper and lower limits, for example, 0.2 ng / mL. , 2 ng / mL, 2 ng / mL, 10 ng / mL, 20 ng / mL, 50 ng / mL, 100 ng / mL to 200 ng / mL, and any two concentrations can be used as upper and lower limits.
  • Example 4 Preparation of Proliferated Myeloid Cell pMC by Introduction of Proliferation Gene (1) Preparation of Lentiviral Vector By gene synthesis using sequence information from the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). Human c-MYC, BMI1, and MDM2 cDNAs were synthesized. The cDNA fragment of each gene was inserted into the lentiviral vector pSL or CDII-EF-MSC-IRES2-Veneus. Each of the genes introduced into the lentiviral vector pSL or CDII-EF-MSC-IRES2-Veneus prepared above using the lipofection method and the packaging construct pCAG-HIVgp and the envelope and Rev construct pCMV-VSV-G-RSV. -Rev was introduced into 293T cells, which are packaging cells (virus-producing cells).
  • the cell culture medium was collected, filtered through a filter having a pore diameter of 0.45 ⁇ m, and then the virus particles were concentrated and collected by a Lenti-X concentrator (Clontech).
  • the recovered recombinant virus particles were suspended in DMEM solution, dispensed into cryovials, and stored in an environment of ⁇ 150 ° C.
  • the myeloid cells prepared in the previous section are cultured in a 48-well tissue culture plate, and in the case of mouse myeloid cells, a lentivirus suspension expressing c-MYC is applied. Infection was performed by adding turbidity at the same time. In the case of human myeloid cells, the lentivirus suspension expressing c-MYC, BMI1 and MDM2 was simultaneously added to infect the cells. From the day after gene transfer, the culture scale was expanded while adding a culture medium according to the growth of cells.
  • Post-infection cells were cultured in the presence of 50 ng / mL GM-CSF and 50 ng / mL M-CSF using ⁇ MEM containing 20% FBS as a culture medium for myeloid cells after virus infection.
  • the transgenic cells continued to proliferate for more than 3 months.
  • the proliferation-capable myeloid cells thus produced were named proliferation myeloid cells (pMC).
  • FIG. 1 shows the measurement results of the MTT assay. From this result, GM-CSF or M-CSF of about 50 ng / mL was required in the culture solution for the growth of pMC. In addition, the combined use of GM-CSF and M-CSF had the effect of promoting proliferation.
  • the pMC was recovered by a pipetting operation and stained with an anti-CD11b antibody, an anti-CD11c antibody and an anti-CD33 antibody, or an isotype-matched control antibody.
  • the cells were then washed twice with PBS containing 2% FBS or PBS.
  • the washed cells were analyzed using a flow cytometer analyzer (trade name: BD Accuri C6 Flow Cutometer, manufactured by Becton Dickinson).
  • FIG. 2 shows the results of surface antigen analysis by a flow cytometer after antibody staining. From the results of this analysis, it was found that the expression of pMC on the cell surface of CD11b and CD11c, which had been observed in differentiated cells, was decreased. It was also found that pMC expresses CD33, which is a marker of physiologically present myeloid cells, on the cell surface.
  • Example 5 Preparation of iPSC-derived professional antigen-presenting cells (ipAPC) (1) Preparation of lentiviral vector (human) Human GM-CSF and M-CSF cDNAs were synthesized by gene synthesis, and the cDNA fragments of each gene were inserted into the lentiviral vector pSL in the same manner as in Example 4 (1), and then virus particles were prepared. The recovered recombinant virus particles were suspended in DMEM solution, dispensed into cryovials, and stored in an environment of ⁇ 150 ° C.
  • Example 4 (2) Introduction of GM-CSF and M-CSF genes into iPSC-derived pMC (human / mouse)
  • the human proliferative myeloid cell pMC prepared in Example 4 (2) was cultured in a 48-well tissue culture plate, and human GM-CSF only, human M-CSF only, or human GM-CSF and human M-CSF were expressed therein. Infected by adding a lentivirus suspension.
  • the mouse proliferating myeloid cell pMC prepared in Example 4 (2) is cultured in a 48-well tissue culture plate and infected by adding a lentivirus suspension expressing only mouse GM-CSF to the culture. rice field.
  • the culture scale was expanded while adding culture medium according to the growth of cells.
  • culture was performed in the presence of 50 ng / mL GM-CSF and 50 ng / mL human M-CSF.
  • Human GM-CSF was used for human proliferative myeloid cell pMC
  • mouse GM-CSF was used for mouse proliferative myeloid cell pMC.
  • the gene-introduced cells self-proliferated by the GM-CSF and M-CSF produced by the cells themselves without extrinsically adding the cytokines GM-CSF and M-CSF to the culture medium.
  • the self-proliferating pMC thus prepared was named iPSC-derived professional antigen-presenting cell-GMM (ipAPC-GMM).
  • ipAPC-GMM iPSC-derived professional antigen-presenting cell-GMM
  • pMC having self-proliferating ability by GM-CSF produced by the cell itself was named ipAPC-GM
  • pMC having self-proliferating ability by GM-CSF produced by the cell itself was named ipAPC-M.
  • FIG. 3 shows the expression of GM-CSF-Venus in mouse pMC and ipAPC-GM, GM-CSF-dCD19 in human pMC and ipAPC-GM, M-CSF-dCD19 in ipAPC-M, and GM-CSF- in ipAPC-GMM.
  • the results of examining the expression of M-CSF-dCD19 with a flow cytometer are shown. It can be seen that mouse ipAPC-GM emits Venus fluorescence and human ipAPC-GM, ipAPC-M, and ipAPC-GMM express CD19 as compared to pMC before cytokine introduction.
  • FIG. 4 shows the results of quantifying GM-CSF in the culture supernatant obtained by the above-mentioned culture by the Enzyme-Linked ImmunoSorbento assay (ELISA) method (BioLegend).
  • GM-CSF and M-CSF are not produced from the control pMC, but GM-CSF of about 150 ng / mL is produced from mouse ipAPC-GM, and about 40 ng / mL is produced from human ipAPC-GM and ipAPC-GMM. About 15 ng / mL of M-CSF was produced from GM-CSF, human ipAPC-M, and ipAPC-GMM.
  • Mouse ipAPC-GM and human ipAPC-GMM produce GM-CSF or M-CSF sufficient for self-proliferation, as mouse pMC exhibits GM-CSF-dependent cell proliferation and human pMC exhibits GM-CSF and M-CSF-dependent cell proliferation. I found out that I was doing it.
  • FIG. 5 shows the measurement results of the MTT assay for mouse ipAPC-GM and human ipAPC-GMM. From this result, it was found that ipAPC-GM and ipAPC-GMM were proliferated even when the culture solution did not contain GM-CSF and M-CSF. Therefore, it was found that ipAPC-GM and ipAPC-GMM self-proliferate without the addition of cytokines. In addition, growth promotion was not observed even when GM-CSF was extrinsically added to the culture broth. On the other hand, it was found that adding 50 ng / mL of M-CSF to the culture solution has an effect of promoting the growth of ipAPC-GM and ipAPC-GMM.
  • the ipAPC-GMM, ipAPC-GM, and ipAPC-M prepared in Example 5 (2) were prepared in a 12-well tissue culture plate.
  • the ipAPC-GMM, ipAPC-GM, and ipAPC-M prepared in Example 5 (2) were prepared in a 12-well tissue culture plate.
  • Dendritic cells (DC) were seeded on a 12-well tissue culture plate using RPMI-1640 medium containing 10% FBS without cytokines and cultured for 48 hours.
  • DC was induced by culturing CD14-positive monocyte cells derived from healthy donor blood samples in the presence of 50 ng / mL GM-CSF and 50 ng / mL IL-4 for 5 days.
  • Collected cells were used as anti-HLA-ABC antibody, anti-HLA-DR antibody, anti-CD40 antibody, anti-CD80 antibody, anti-CD83 antibody, anti-CD86 antibody, anti-CCR7 antibody, anti-CD74 antibody, anti-CD11b antibody, anti-CD11c antibody, and anti-CD11b antibody. It was stained with a CD33 antibody or an isotype-matched antibody and analyzed with a flow cytometer.
  • FIG. 6 shows the results of surface antigen analysis of human ipAPC-GM, ipAPC-M, and ipAPC-GMM.
  • ipAPC-GMM was CD86, HLA-ABC, HLA-DR, CD74, CD33 positive, CD40, CD80 low expression, CD11b, CD11c low expression to positive, CD83, CCR7 negative.
  • Positive indicates that the intensity ratio (RFI) of the surface marker to the average fluorescence intensity of the isotype-matched antibody is 10-fold or more.
  • Low expression indicates that the RFI is more than 2-fold and less than 10-fold. Negative means less than double.
  • FIG. 7 shows the results of surface antigen analysis of DC.
  • DC was found to be positive for all markers except low expression CD83, CCR7.
  • ipAPC-GM, ipAPC-M, and ipAPC-GMM express the antigen-presenting molecules HLA-ABC, HLA-DR, and the co-stimulatory molecule CD86, and express CD74, which is important for cross-presentation, in the same manner as DC. You can see that.
  • RNA-seq analysis which is a total transcriptome analysis
  • PCA principal component analysis
  • GSEA gene set enrichment analysis
  • FIG. 8 shows the results of PCA. This figure plots the profiles of mouse pMC, mouse ipAPC-GM and GM-CSF-added mouse pMC against two axes (PC1, PC2) with high contributions obtained by multivariate analysis. It was found that the gene expression profile of mouse ipAPC-GM showed a profile significantly separated from mouse pMC and GM-CSF-added mouse pMC.
  • FIG. 9 shows the results of GSEA of mouse ipAPC-GM for mouse pMC and GM-CSF-added mouse pMC. It was found that the cell cycle and its processes, and transcripts involved in cell division and its regulation were detected as a gene set in which the expression was significantly increased in mouse ipAPC-GM. Specifically, as genes involved in the cell cycle, XRCC2, KNTC1, TTK, PKMYT1, AURKA, HMGN5, ANKLE1, KIF2C, MCM8, CDC45, MCM7, CDCA5, CABLES1, CDC6, CDK1, SGOL1, TPX2, NNAP.
  • genes involved in the cell cycle XRCC2, KNTC1, TTK, PKMYT1, AURKA, HMGN5, ANKLE1, KIF2C, MCM8, CDC45, MCM7, CDCA5, CABLES1, CDC6, CDK1, SGOL1, TPX2, NNAP.
  • Apoptosis analysis of ipAPC-GM The mouse ipAPC-GM and human ipAPC-GM, ipAPC-M, and ipAPC-GMM prepared in Example 5 (2) were fluorescently labeled Annexin V and 7-Amino-Actinomycin D (7). -AAD) was used to analyze cell death.
  • Annexin-V is a protein that specifically binds to phosphatidylserine (PS), which is a phospholipid of the cell membrane component. Although living cells do not expose PS to the cell surface, Annexin V binds to the reversal of the cell membrane due to apoptosis.
  • PS phosphatidylserine
  • 7-AAD permeates dead cells whose cell membrane has collapsed due to late apoptosis or necrosis, intercalates into the DNA strand, and emits red fluorescence. In this way, apoptosis of cells in culture can be analyzed.
  • FIG. 10C shows the results of analysis of human-derived cells with a flow cytometer in cytograms.
  • the positive rates of Annexin V and 7-AAD showing cell death were maintained low in human ipAPC-GMM and ipAPC-M as compared with human pMC as in mouse ipAPC-GM. It turned out.
  • human ipAPC-GM has a high frequency of cell death like human pMC.
  • 10B (mouse-derived cells) and 10D (human-derived cells) show line graphs of changes over time in the proportions of live cells, early-stage apoptotic cells, and late-stage apoptotic cells separated by a four-quadrant gate in cytogram.
  • the viable cell rates of mouse ipAPC-GM, human ipAPC-GMM, and human ipAPC-M were high during the culture period, and the proportion of apoptotic cells was maintained low, while mouse pMC, human pMC, and human ipAPC-GMM were cultured 2 From day one, the viable cell rate began to decline and the proportion of apoptotic cells increased.
  • mouse ipAPC-GM has higher apoptosis resistance than pMC by introduction of GM-CSF, and human ipAPC-GMM and human ipAPC-M by introduction of M-CSF alone or with GM-CSF. I understood.
  • Example 6 Examination of antigen-presenting function of ipAPC-GM (1) In vitro mouse ipAPC-GM and allo-reactive T cell proliferation C57BL / 6 strain mice by human ipAPC-GM, ipAPC-M, and ipAPC-GMM Using mouse ipAPC-GM similarly prepared from iPSC by the above method, human ipAPC-GM, human ipAPC-M, and human ipAPC-GMM prepared in Example 5 (2), allolymphocyte mixed reaction (aroMLR). Inducible activity was evaluated.
  • aroMLR allolymphocyte mixed reaction
  • the BALB / c naive T cells 1.5 ⁇ 10 5 cells / well receiving no antigen stimulation prepared from mouse strains were different C57BL / 6 strain derived from a mouse ipAPC-GM or mouse pMC and 6 days co-cultivation of strains after, [3 H] - thymidine was added (Perkin Elmer, 1 [mu] Ci / well), the high molecular weight DNA in cells supplemented in a glass filter using a cell harvester (Perkin Elmer) the next day.
  • the proliferative activity of human T cells can be enhanced by co-culturing with CD3-positive naive T cells derived from human healthy donor peripheral blood mononuclear cells. evaluated. Then, to the high molecular weight DNA [3 H] - thymidine incorporation was determined by scintillation counting. To high molecular weight DNA [3 H] - thymidine incorporation is proportional to the speed or rate of cell proliferation of DNA synthesis.
  • FIG. 11 shows the results of scintillation measurement of naive T cell stimulating activity.
  • the ratio of mouse ipAPC-GM to T cells increased, the proliferation of alloreactive naive CD8 positive T cells was induced.
  • allo-reactive naive T cell proliferation against mouse pMC was weak. Similar to mouse ipAPC-GM, as the proportion of human ipAPC-GM and ipAPC-GMM increased, the proliferation of allo-reactive naive CD8-positive T cells was induced.
  • allo-reactive naive T cell proliferation against human pMC and ipAPC-M was weak. From the above results, it can be seen that the immune response by pMC is improved by the effects of the cytokine GM-CSF introduced into ipAPC-GM and ipAPC-GMM.
  • antigen-presenting cells take up extracellular antigens and decompose them into peptides, followed by major histocompatibility complex.
  • the peptide antigen is presented to CD4 positive T cells via a major histocompatibility complex (MHC) class II antigen presenting molecule.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Special antigen-presenting cells such as dendritic cells (DCs) have the function of presenting the incorporated extracellular antigen to CD8-positive T cells via MHC class I molecules. Such a mechanism is called cross-presentation.
  • Human ipAPC- produced in Example 5 (2) using ovalbumin (DQ-OVA), which emits green fluorescence when taken up into cells and digested by peptides by labeling with a self-quenching fluorescent dye.
  • OVA ovalbumin
  • GM, ipAPC-M, and ipAPC-GMM were examined.
  • Cross-presentation by mouse ipAPC-GM was investigated using ovalbumin (OVA) and OVA-specific T cells.
  • the human ipAPC-GM, ipAPC-M, and ipAPC-GMM prepared in Example 5 (2) were seeded on a 24-well tissue culture plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well, and the ipAPC-GM, ipAPC-M, and ipAPC- GMM was loaded with 10 ⁇ g / mL DQ-OVA and then incubated at 37 ° C. for 4 hours. A sample incubated at 4 ° C. was also prepared as a negative control without antigen uptake. The frequency of antigen uptake was compared with the bio-derived DC induced in Example 5 (6).
  • mouse ipAPC-GM prepared from the C57BL / 6 strain mouse iPSC described in Example 6 (1) was seeded on a 96-well tissue culture plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well, and the ipAPC-GM was inoculated with an OVA peptide. After loading OVA 257-264 or OVA protein in a concentration-dependent manner, the growth of ipAPC-GM was stopped by irradiation (85 Gy). Then, they were co-cultured with naive CD8-positive T cell OT-1 (1 ⁇ 10 4 cells / well) having an OVA-specific T cell receptor (TCR) for 4 days.
  • TCR OVA-specific T cell receptor
  • Fig. 12A The results of measuring the cellular uptake of DQ-OVA by flow cytometry are shown in Fig. 12A (left), the growth of OT-1 [3 H] - shows the results of measurement by the thymidine incorporation in Figure 12A (right) .
  • human ipAPC-GM, ipAPC-M, and ipAPC-GMM take up the antigen at a high frequency of about 95%, similar to pMC before cytokine introduction.
  • the frequency of antigen uptake was about 75% for DCs derived from living organisms.
  • mice ipAPC-GM After loading mouse ipAPC-GM with OVA peptide OVA 257-264 or OVA protein in a concentration-dependent manner, the growth of ipAPC-GM is stopped by irradiation, and naive CD8 with OVA-specific T cell receptor (TCR).
  • TCR OVA-specific T cell receptor
  • FIG. 12B a plot of the results of quantifying by scintillation counting of thymidine incorporation .
  • Mouse ipAPC-GM induced the growth of OT-1 depending on the concentration of OVA peptide and protein.
  • FIG. 13 shows the results of comparing the OT-1 growth-inducing activity under the condition of loading 10 ⁇ M OVA peptide or 100 ⁇ g / mL OVA protein between mouse ipAPC-GM and mouse pMC. From the above results, human ipAPC-GM, ipAPC-M, and ipAPC-GMM have a higher frequency of antigen uptake than DC, and mouse ipAPC-GM has a higher antigen-specific T cell proliferation-stimulating activity than mouse pMC. Was there.
  • Mouse ipAPC-GM or mouse pMC alone prepared from C57BL / 6 strain mouse iPSC described in Example 6 (1) to C57BL / 6 strain mouse, and mouse ipAPC-GM or mouse ipAPC-GM loaded with OVA peptide or OVA protein.
  • mouse pMC 1 ⁇ 10 5 cells twice every 7 days, after intraperitoneal administration, the OVA-expressing cancer cells (MO4) 2 ⁇ 10 5 cells from melanoma were transplanted into mice by subcutaneous injection.
  • the tumor diameters of the mice in the mouse ipAPC-GM or mouse pMC administration group and the control group were measured twice a week. Continued until the mice died or the tumor diameter reached 20 mm.
  • FIG. 14 shows the time course of the transplanted tumor volume.
  • ipAPC-GM significantly suppressed the increase in tumor volume.
  • the inhibitory effect was higher in ipAPC-GM than in pMC, and both ipAPC-GM and pMC were more pronounced when loaded with OVA peptide or OVA protein.
  • FIG. 15 shows the survival curve of mice transplanted with cancer cells.
  • the significant prolongation of survival in the group administered with ipAPC-GM loaded with OVA peptide or OVA protein was higher than that in the group administered with pMC similarly loaded with OVA peptide or OVA protein.
  • the significant prolongation of survival in the group administered with ipAPC-GM loaded with OVA peptide or OVA protein was higher than that in the group administered with pMC similarly loaded with OVA peptide or OVA protein. was also remarkable.
  • FIG. 16 shows the results of in vitro detection of OVA peptide antigen-specific T cells in the spleen 56 days after transplantation.
  • the collected peripheral blood mononuclear cells were isolated from CD8-positive T cells using beads coated with an anti-CD8 antibody.
  • the resulting cells were analyzed for antigen-specific T cell frequency by Enzyme-Linked ImmunoSpot (ELISPOT) assay, which detects interferon gamma 36 hours after stimulation with an OVA peptide or control SIY peptide.
  • ELISPOT Enzyme-Linked ImmunoSpot
  • the ipAPC-GM of the present invention has a function of presenting a desired antigen such as a cancer antigen to CD8-positive T cells, and further produces CD8-positive T cells having the antigen-specific T cell receptor. It turned out to multiply.
  • Example 7 Induction of constancy maintenance and expansion of CD8-positive T cells by ipAPC-GM (1) Promotion of naive T cell proliferation by GM-CSF and ipAPC-GM culture supernatant
  • the mouse ipAPC-GM prepared in Example 5 The effect of the produced GM-CSF on the proliferation of naive OT-1 CD8 positive T cells was investigated.
  • Naive OT-1 CD8 positive T cells (1 ⁇ 10 5 cells / well) were cultured for 6 days in the presence of various concentrations of recombinant GM-CSF protein or culture supernatant of ipAPC-GM.
  • the contribution of GM-CSF was verified by adding an anti-GM-CSF neutralizing antibody to the culture supernatant of ipAPC-GM.
  • FIG. 17 shows the results of evaluating T cell proliferation in the presence of a culture supernatant of ipAPC-GM or pMC. While the culture supernatant of ipAPC-GM promoted the proliferation of T cells, the same effect was not seen in the culture supernatant of pMC.
  • FIG. 17 shows the results of evaluating T cell proliferation in the presence of a culture supernatant of ipAPC-GM or pMC. While the culture supernatant of ipAPC-GM promoted the proliferation of T cells, the same effect was not seen in the culture supernatant of pMC.
  • ipAPC-GM not only induces antigen-specific T cells, but also promotes the proliferation of CD8-positive naive T cells by the GM-CSF secreted by the cells. In particular, it was found that 1.5 ng / mL or more of GM-CSF is required for maintaining and expanding homeostasis of CD8-positive naive T cells.
  • FIG. 19 shows the proliferative activity of T cells co-cultured with ipAPC-GM or pMC. It can be seen that T cells proliferated remarkably by co-culture with ipAPC-GM.
  • FIG. 20 shows the results of analysis of the T cell receptor (TCR) V ⁇ frequency of naive CD8-positive T cells with a flow cytometer before and after co-culture with ipAPC-GM. It can be seen that co-culture with ipAPC-GM does not affect specific TCR clones and promotes homeostatic expansion of polyclonal T cells.
  • TCR T cell receptor
  • Example 8 Irradiation of ipAPC-GM controls pharmacokinetics while maintaining antigen-presenting ability (disappears from the living body in 3 to 4 days) (1) Apoptosis analysis of ipAPC-GM irradiated with radiation of 85 Gy As described above in Examples 5 (7) and (8), ipAPC-GM activates cell division due to the GM-CSF produced by itself. It was found that the viability was improved as compared with pMC. While the high self-proliferative capacity of ipAPC-GM is useful in producing the number of cells required for treatment, there is concern about tumorigenicity after administration in vivo.
  • Non-Patent Documents Science 311, 1160-1164 in order for antigen-presenting cells to activate CD8-positive T cells, ipAPC-GM needs to survive in vivo for several days after transplantation, but promptly thereafter. It is desirable to have a clearance. Therefore, in order to solve this problem, the ipAPC-GM was irradiated with radiation, and the effect on the self-proliferation ability was examined.
  • mice ipAPC-GM and mouse pMC prepared in Example 5 were irradiated with 65, 85, 100 Gy and cultured for 4 days at 37 ° C. and 5% CO2 conditions using ⁇ MEM containing 20% FBS in the absence of cytokines. bottom.
  • Human pMC, ipAPC-GM, ipAPC-M, ipAPC-GMM are irradiated with 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 Gy and the presence of cytokines 50 ng / mL GM-CSF and 50 ng / mL M-CSF. It was cultured underneath for 6 days. The cell morphology is shown in FIG. ipAPC-GM retained its cell morphology even after irradiation.
  • mice ipAPC-GM prepared in Example 5 was seeded on a 96-well plate and irradiated with 85 Gy of radiation.
  • Mouse ipAPC-GM and mouse pMC (1 ⁇ 10 5 cells) were stained with Annexin V and 7-AAD.
  • In vitro survival was analyzed by analysis with a flow cytometer.
  • FIG. 23 shows the analysis result of the flow cytometer. Twenty-four hours after 85 Gy irradiation, ipAPC-GM survived with the major cell population negative for both Annexin V and 7-AAD. On the other hand, in pMC, most of the cells became positive with both Annexin V and 7-AAD reagents and caused apoptosis.
  • Luciferase-expressing ipAPC-GM or pMC (1 ⁇ 10 6 cells) irradiated with 85 Gy was subcutaneously administered to C57BL / 6 strain mice.
  • Cell viability of ipAPC-GM and pMC in vivo was measured daily by biochemical luminescence with an IVIS imaging system (PerkinElmer).
  • FIG. 25 shows a photographed image of in vivo imaging and a change over time in the total flux of luciferase emission.
  • ipAPC-GM or pMC was detected as a clear luminescent signal locally at the transplantation site and disappeared over the course of days.
  • ipAPC-GM was retained in vivo for 3 days after being administered subcutaneously to mice and disappeared on the 4th day. In contrast, most of the pMC disappeared from the body the day after administration.
  • the ipAPC-GM of the present invention exists in the living body for 3 days after the administration to the living body even after irradiation, and disappears after 4 days. From this, it was found that ipAPC-GM disappears 3 to 4 days after administration when administered in vivo after irradiation.
  • FIG. 26 shows the transition of the tumor volume.
  • the ipAPC-GM-administered group significantly suppressed tumor growth compared to the untreated and pMC-administered groups.
  • the tumor suppressive effect of ipAPC-GM was equivalent to that of the positive control bone marrow-derived dendritic cells (BM-DC).
  • FIG. 27 shows the survival curve of mice.
  • the ipAPC-GM group significantly prolonged survival compared to untreated. It was found that the survival prolonging effect of ipAPC-GM administration was not significantly different from that of BM-DC and pMC.
  • FIG. 28 shows the results of the ELISPOT assay.
  • the ipAPC-GM-administered group significantly induced OVA-specific CD8-positive T cells, which are cancer antigens, as compared with the untreated and pMC-administered groups.
  • the induction of cancer-specific CD8-positive T cells by ipAPC-GM was found to be comparable to BM-DC.
  • the ipAPC-GM of the present invention has a function of presenting a desired antigen such as a cancer antigen to CD8-positive T cells even after irradiation, and further, the desired antigen-specific T cells. It was found to proliferate CD8-positive T cells with receptors.
  • Example 9 Control of pharmacokinetics by introducing a suicide gene into ipAPC-GM
  • a lentiviral vector expressing HSV-TK or iCasp9 as a suicide gene was introduced into the mouse ipAPC-GM prepared in Example 5.
  • the ipAPC-GM introduced with HSV-TK is referred to as ipAPC-GM-HSV-TK
  • the ipAPC-GM introduced with iCasp9 is referred to as ipAPC-GM-iCasp9.
  • the pharmacokinetics of the virus was examined optically.
  • the cells into which luciferase has been introduced are referred to as ipAPC-GM-Luc, ipAPC-GM-HSV-TK-Luc and ipAPC-GM-iCasp9-Luc.
  • Luciferase and expressing a suicide gene ipAPC-GM luciferase gene only expresses ipAPC-GM (1 ⁇ 10 6 cells) were subcutaneously administered to C57BL / 6 strains of mice. Subsequently, for 5 consecutive days from the day of administration (Day 0) to the 4th day (Day 4), 100 mg / kg GCV, which is an inducing reagent for the suicide gene HSV-TK, or 2.5 mg / kg, which is an inducing reagent for iCasp9. AP1903 was administered intraperitoneally. Cell survival of ipAPC-GM-HSV-TK, ipAPC-iCasp9 and ipAPC-GM in vivo was measured daily by biochemical luminescence with an IVIS imaging system (PerkinElmer).
  • FIG. 29 shows the time course of the total flux of luciferase emission obtained from the captured image of in vivo imaging.
  • HSV-TK introduction, iCasp9 introduction, and ipAPC-GM without the suicide gene were all detected as clear luminescence signals locally at the transplant site immediately after administration and decreased over the course of days.
  • No significant reduction in signal was observed with GCV or AP1903 in mice in the ipAPC-GM-Luc group, whereas in the ipAPC-HSV-TK-Luc or ipAPC-GM-iCasp9-Luc group.
  • Administration of GCV or AP1903 markedly reduced the signal of cells retained in vivo and completely disappeared 7 days after transplantation.
  • FIG. 30 shows the combined effect of the suicide gene iCasp9 and 5 mg / kg YM-155, which is an inhibitor of the anti-apoptotic factor Survivin.
  • ipAPC-GM-iCasp9-Luc administration of 5 mg / kg YM-155 alone showed a signal attenuation process similar to that of physiological saline (Medium), while cells when administered in combination with AP1903. The day after transplantation, a significant decrease in signal was observed compared to AP1903 alone.
  • Example 10 Examination of safety for in vivo administration of ipAPC-GM (1) Measurement of blood cytokines in mice administered with ipAPC-GM The mouse ipAPC-GM prepared in Example 5 was subjected to ipAPC-GM on the 7th. Two single doses were administered at intervals, and blood cytokines were measured the day after the second dose. The group receiving 4.0 mg / kg of lipopolysaccharide (LPS) was compared as a positive control. In the mice to which ipAPC-GM was administered, no increase in blood levels of IL-6, TNF ⁇ and GM-CSF was observed, and no inflammation was induced in the living body.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Example 11 Comparison of the effect of ipAPC-GM with an immune checkpoint inhibitor
  • an immune checkpoint inhibitor known as an existing cancer immunotherapy and ipAPC-GM are compared, and ICI and ipAPC are further compared.
  • the combined effect of GM was investigated. Mice transplanted with tumor cells by subcutaneous injection were intraperitoneally administered with ipAPC-GM or ICI (anti-CTLA-4 antibody and anti-PD-L1 antibody), or ipAPC-GM and ICI in combination. Tumor diameter and mouse survival were assessed every 3-4 days.
  • the antitumor effect on immune checkpoint inhibitor (ICI) hyposensitive cancer cell MO4 tumors is shown in FIG.
  • the OVA 257-264 peptide was loaded onto ipAPC-GM as a cancer antigen for MO4 tumors.
  • ipAPC-GM significantly suppressed tumor growth and prolonged mouse survival.
  • the combined use of ICI and ipAPC-GM showed a tendency to suppress tumor growth and prolong the survival of mice as compared with ipAPC-GM alone.
  • FIG. 32 shows the antitumor effect on the ICI-sensitive cancer cell MC38 tumor.
  • the ipAPC-GM was loaded with a mutant Adpgk (mAdpgk) peptide as a cancer antigen for MC38 tumor and a wild-type Adpgk (wtAdpgk) peptide as a negative control for the cancer antigen.
  • mAdpgk mutant Adpgk
  • wtAdpgk wild-type Adpgk
  • the mAdpgk peptide-loaded ipAPC-GM treatment group showed no significant difference, but tended to suppress the increase in tumor diameter, and significantly prolonged the survival of mice.
  • Example 12 Effect of ipAPC-GM on myeloid-derived immunosuppressive cells (MDSC) in tumors
  • MDSC myeloid-derived immunosuppressive cells
  • ICI immune checkpoint inhibitor
  • FIG. 12 Mice in which ICI hyposensitive cancer cell MO4 subcutaneous tumor has been prepared in advance are treated with ipAPC-GM or combined treatment with ICI (anti-CTLA-4 antibody + anti-PD-L1 antibody) and ipAPC-GM.
  • MDSC myeloid-derived immunosuppressive cells
  • MDSC is thought to be a factor that makes cancer immunotherapy treatment resistant because it suppresses the immune response.
  • Example 13 Effect of ipAPC-GM on CD8-positive T cells in tumor
  • Figure 34 shows the results of flow cytometric evaluation of CD8-positive T cells in tumor after treatment obtained in Example 11.
  • Perforin and Granzyme are cytotoxic granules secreted by CD8-positive T cells that recognize the antigenic peptide. Perforin polymerizes and punctures the target cancer cell membrane, allowing GzmB to invade the target cancer cells through the pores, causing cell death.
  • Administration of ipAPC-GM increased Perforin and GzmB-expressing cells in CD8-positive T cells from 0.52% to 6.19% in tumors compared to no treatment, with ipAPC-GM and ICI (anti-antibody).
  • Comparative Example 1 Feeder-free differentiation-inducing culture of human iPSC
  • the differentiation-inducing method of Example 3 (4) was compared with the differentiation-inducing method described in the non-patent document (Gene Therapy 2011 18, 874-883).
  • Human EBs prepared from human iPSCs were seeded in a tissue culture 12-well plate coated with recombinant human fibronectin and allowed to stand in a StemFit medium at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for overnight culture.
  • the iPSC colonies adhered to the plate were cultured for 10 days in the presence of 50 ng / mL BMP-4 using a 1: 1 mixture of AIM-V (Life Technologies) and X-VIVO15 (Lonza) as a differentiation-inducing medium.
  • X-VIVO15 was cultured in the presence of 50 ng / mL BMP-4 for 14 days.
  • the obtained cells were exfoliated by TripLE (Life Technologies), collected, seeded on a low-adhesion plate (Corning), and used with X-VIVO15 in the presence of 50 ng / mL GM-CSF and 50 ng / mL M-CSF.
  • Differentiated cells were obtained by culturing for 7 days.
  • the expression of hematopoietic differentiation markers CD34 and CD43 antibodies or myeloid differentiation markers CD11b and CD11c was examined by flow cytometry using the differentiated cells on the 18th and 25th days of culture as samples.
  • Differentiated cells were collected by pipetting operation and stained with anti-CD11b antibody, anti-CD11c antibody, anti-CD34 antibody, anti-CD43 antibody, or isotype-matched control antibody. The cells were then washed twice with PBS containing 2% FBS or PBS. The washed cells were analyzed using a flow cytometer analyzer.
  • FIG. 35 shows the results of surface antigen analysis by a flow cytometer after antibody staining. From the results of this analysis, in the differentiated cells prepared in Example 3 (4), the frequency of hematopoietic differentiation marker CD34-positive cells was 19.4% on the 18th day of differentiation induction. On day 25, the frequency of myeloid differentiation marker CD11b positive cells was 48.3%.
  • Differentiation cells (Comparative Example 1) prepared by the differentiation induction method described in the non-patent document (Gene Therapy 2011 18, 874-883) were negative for the hematopoietic differentiation marker CD34 on the 18th day of differentiation induction. After that, the cells died and the number of recovered cells was significantly small. On day 25, it was negative for the myeloid differentiation marker CD11b. From this result, it was found that the referred differentiation induction protocol could not obtain reproducibility and the differentiation induction efficiency was poor.
  • the human professional antigen-presenting cell derived from the pluripotent stem cell of the present invention has an in vitro proliferation ability and an antigen-presenting ability comparable to that of a living-derived DC, so that a stable supply as a cell preparation is possible. do.

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Abstract

本発明は、多能性幹細胞から分化させたミエロイド細胞（ＭＣ）に、ｃ－ＭＹＣなどを発現させることにより、増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）を得ること、並びに前記ｐＭＣにＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを発現させて、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）を得ることを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法と、該方法により製造されるヒトプロフェッショナル抗原提示細胞とを提供する。

Description

ヒトプロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法
　本発明は、多能性幹細胞由来のヒトプロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法と、該方法により製造される多能性幹細胞由来のヒトプロフェッショナル抗原提示細胞と、該ヒトプロフェッショナル抗原提示細胞を用いる、Ｔ細胞の増殖を誘導する方法等に関する。
　プロフェッショナル抗原提示細胞は、体内に侵入してきた細菌や、ウイルス感染細胞、がん細胞などの断片を抗原として自己の細胞表面上に提示し、Ｔ細胞を活性化する細胞である。プロフェッショナル抗原提示細胞は、通常の有核細胞が有するヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ：　ＨＬＡ）クラスＩ分子のみならず、ＨＬＡクラスＩＩ分子も発現する抗原提示に特化した細胞であり、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞などを含む。樹状細胞（以下ＤＣとも記載する）は、強力なＴ細胞刺激活性を有し、外来抗原に対する免疫応答を惹起する役割を担う抗原提示細胞である。このＤＣに「がん抗原」を負荷して生体に投与することにより、体内のがん反応性Ｔ細胞を活性化する、いわゆるＤＣワクチン療法は、優れた効果が期待される「がん免疫療法」の１つと考えられている（非特許文献１および２）。
　現在実施されているＤＣ療法は、（１）ＤＣ前駆細胞取得の為に患者からアフェレーシスを必要とする、（２）ＤＣ誘導効率が患者間で異なり治療に充分なＤＣ機能と細胞数を得るのが困難である、（３）自己細胞を用いた個別化医療の費用が高額であるなど多くの問題を抱えている。
　細胞製剤としてＤＣを使用して臨床的な効果を得るためには、採血からでは実現し得ない１０８～１０９個程度もの大量の細胞を必要とする。生体内組織に存在するＤＣの数は有限であり、生体外での培養による増幅は困難であることから、生体内組織からＤＣを大量に採取・調製することは困難である。
　胚性幹細胞（ＥＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からＤＣを分化誘導する技術（非特許文献３～７）は、無限の細胞ソースとなる多能性幹細胞からＤＣ調製を可能にする。しかしＥＳＣおよびｉＰＳＣから造血系分化を経由してＤＣへと分化させる過程は煩雑である上、１カ月以上に及ぶ作製時間と費用を必要とし、これを用いたＤＣワクチン法は実用化に至っていない。先行技術として報告のあるヒトｉＰＳＣ由来のミエロイド系血液細胞ライン（ｉＰＳ－ＭＬ）は、分化誘導と遺伝子導入の主要な２つの工程で作製される（特許文献１）。これまでに報告されたｉＰＳ－ＭＬの作製方法は、誘導効率および再現性が低く、細胞製剤としての安定的な供給が実現不可能であった。ｉＰＳ－ＭＬはＤＣ同等の機能を発揮できず、ＤＣとしての機能を発揮させるためには、サイトカイン存在下での培養など、何らかの分化誘導が必要となることも実用化の課題であった。
　また、生体外で増殖する能力を有するヒトミエロイド系血液細胞の製造（特許文献１）や造腫瘍性の抑制されたヒトミエロイド系の血液細胞の製造方法（特許文献２）についても報告がある。しかしこれらの先行技術文献のいずれにも、抗原提示能を有するヒトミエロイド系細胞の製造方法や、抗原提示能を有する細胞の存在又は特性を開示または示唆する記載は全くない。
特許第５８６１１９１号公報 特開２０１８－１７１００５号公報
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　３９：　３８－４８，　２０１３． Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｃａｎｃｅｒ　１７，　２０９－２２２，　２０１７． Ｂｌｏｏｄ　１０１：　３５０１－８，　２００３． Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１７２：　７７６－８６，　２００４． Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１７４：　１８８８－９７，　２００５． Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１７８：　９１８－２５，　２００７． Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　２５：　２７２０－２９，　２００７．
　本発明の課題は、細胞製剤としての安定的な供給を可能にする生体外で増殖する能力と、生体由来のＤＣに匹敵する抗原提示能とを有する多能性幹細胞由来のヒトプロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法と、該方法により製造されるヒトプロフェッショナル抗原提示細胞とを提供することである。また本発明のさらなる課題は、本発明のヒトプロフェッショナル抗原提示細胞を用いる抗原特異的または非特異的なＴ細胞の増殖を促進する方法、およびその方法で増殖が促進されるおよび／または製造されるＴ細胞を提供することである。また、本発明のさらなる課題は、本発明の多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞を含むＴ細胞の増殖を促進するための医薬組成物と、本発明のヒトプロフェッショナル抗原提示細胞を用いて増殖が促進されるおよび／または製造される抗原特異的または非特異的なＴ細胞を含む抗がん剤とを提供することである。
　本発明は、多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法等を提供する。
　すなわち、本発明は、
ミエロイド細胞（ＭＣ）にｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２を発現させ増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）を得ること、並びに
前記ｐＭＣにＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを発現させてプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）を得ることを含む、
プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法を提供する。
　本発明のプロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法（以下、「本発明の製造方法」という。）において、前記ミエロイド細胞は多能性幹細胞から分化させたミエロイド細胞であってもよい。
　本発明の製造方法において、前記多能性幹細胞は人工多能性幹細胞あるいは胚性幹細胞であってもよい。
　本発明の製造方法において、前記ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２はミエロイド細胞に遺伝子導入されたものであってもよい。
　本発明の製造方法において、前記ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦはｐＭＣに遺伝子導入されたものであってもよい。
　本発明の製造方法は、前記ミエロイド細胞が多能性幹細胞から分化させたミエロイド細胞（ＭＣ）である場合、
(i)　前記多能性幹細胞から誘導された胚様体（ＥＢ）を、ＶＥＧＦを含む培地中でフィーダー細胞の上で重層培養を行った後、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＴＰＯを含む培地中でさらに培養する工程、または
(ii)　前記多能性幹細胞から誘導された胚様体（ＥＢ）を、ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦおよびＳＣＦを含む培地中でフィーダー細胞なしの単層培養を行った後、さらにＶＥＧＦ、ＴＰＯおよびＧＭ－ＣＳＦを含む培地中で培養する工程により多能性幹細胞からミエロイド細胞（ＭＣ）を分化させることを含んでもよい。
　本発明の製造方法は、前記胚様体（ＥＢ）が多能性幹細胞から形成された胚様体である場合、さらに、
(i)　多能性幹細胞を細胞塊形成培養用容器に播種して胚様体（ＥＢ）を形成させ、および
(ii)　前記容器は、底に微細なスフェロイドウェルが設けられ、かつ、隣接するウェルの間に平坦な面が存在しないことを含む工程によって、多能性幹細胞より胚様体（ＥＢ）を形成することを含む製造方法であってもよい。
　本発明の製造方法は、
(i)　多能性幹細胞を、底に微細なスフェロイドウェルが設けられ、かつ、隣接するスフェロイドウェルの間に平坦な面が存在しない細胞塊形成培養用容器に播種して胚様体（ＥＢ）を形成させること、
(ii)　以下の(ii)-1または(ii)-2の工程、すなわち
　(ii)-1　前記胚様体を、ＶＥＧＦを含む培地中でフィーダー細胞の上で重層培養を行った後、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＴＰＯを含む培地中でさらに培養すること、または、
　(ii)-2　前記胚様体を、ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦおよびＳＣＦを含む培地中でフィーダー細胞なしの単層培養を行った後、さらにＶＥＧＦ、ＴＰＯおよびＧＭ－ＣＳＦを含む培地中で培養すること、
により前記胚様体（ＥＢ）からミエロイド細胞（ＭＣ）を得ること、
(iii)　(ii)で得られたミエロイド細胞（ＭＣ）にｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２を発現させて増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）を得ること、および、
(iv)　(iii)で得られた増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）にＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを発現させてプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）を得ること、を含む製造方法であってもよい。
　前記(i)～(iv)を含む本発明の製造方法において、
ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２はミエロイド細胞（ＭＣ）に遺伝子導入されたものであり、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦは増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）に遺伝子導入されたものであってもよい。
　多能性幹細胞より胚様体（ＥＢ）を形成することを含む本発明の製造方法において、前記胚様体（ＥＢ）のサイズが５０～２００μｍであってもよい。
　本発明の製造方法は、前記プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）に放射線を照射することをさらに含んでもよい。
　本発明は、本発明のいずれかの製造方法で製造される、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）を提供する。
　本発明のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）は、放射線照射後に生体に投与されるとき、生体投与後少なくとも３～４日で生体から消失する、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）であってもよい。
　本発明のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）は、ＣＤ１１ｂ／ｃが低発現であって、ＣＤ７４を発現する、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）であってもよい。
　本発明は、ＣＤ１１ｂ／ｃが低発現であって、ＣＤ７４を発現する、多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）を提供する。
　本発明のいずれかの製造方法で製造される、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）、または、本発明の多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）は、さらにＣＤ３３を発現してもよい。
　本発明の多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）において、前記多能性幹細胞は胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であってもよい。
　本発明の多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）は、外来性のＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを発現してもよい。
　外来性のＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを発現する本発明の多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）において、前記ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦは遺伝子導入されたものであってもよい。
　本発明の製造方法で製造されるプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）、または、ＣＤ１１ｂ／ｃが低発現であって、ＣＤ７４を発現する、本発明の多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）は、自己増殖能を有し、かつ、アポトーシス抵抗性を示してもよい。
　本発明は、本発明のいずれかのプロフェッショナル抗原提示細胞を含む、ＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を誘導および／または促進するための医薬組成物を提供する。
　本発明は、本発明のいずれかのプロフェッショナル抗原提示細胞またはＧＭ－ＣＳＦと、ＣＤ８を発現するナイーブＴ細胞を生体外で共培養し、生体内および生体外で、抗原非特異的または抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法を提供する。
　本発明のＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法において、前記プロフェッショナル抗原提示細胞が、所望の抗原を負荷したプロフェッショナル抗原提示細胞であってもよい。
　本発明のＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法は、前記抗原を負荷したプロフェッショナル抗原提示細胞にさらに生体外で放射線を照射することを含んでもよい。
　本発明のＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法において、前記放射線を照射されたプロフェッショナル抗原提示細胞が、生体外での放射線照射後に生体に投与された場合、その生体内で少なくとも３～４日で消失してもよい。
　本発明のＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法において、ＣＤ８を発現するT細胞がプロフェッショナル抗原提示細胞に負荷した抗原に特異的なＣＤ８を発現するT細胞であってもよい。
　本発明は、本発明のＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法で増殖が促進される、ＣＤ８を発現するＴ細胞を提供する。
　本発明は、本発明のＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法を使って抗原非特異的または特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞を製造する方法を提供する。
　本発明は、本発明の抗原非特異的または特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞を製造する方法によって製造される、抗原非特異的または特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞を提供する。
　本発明は、体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の製造方法を提供する。本発明の体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の製造方法は、本発明のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）抗原を負荷すること、前記抗原を負荷したプロフェッショナル抗原提示細胞に放射線を照射すること、前記放射線を照射されたプロフェッショナル抗原提示細胞、および、ＣＤ８を発現するナイーブＴ細胞を生体外で共培養し、抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進すること、を含む。このプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）は自己増殖能を有し、かつ、アポトーシス抵抗性を示すものであってもよい。
　本発明は、本発明の体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の製造方法により製造される、体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞を提供する。
　本発明の体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の製造方法により製造される、体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞において、放射線照射後に生体に投与されるとき、前記放射線を照射された多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞は生体投与後少なくとも３～４日で消失してもよい。
　本発明は、抗がん剤を提供する。本発明の抗がん剤は、本発明のＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法で増殖が促進される、ＣＤ８を発現するＴ細胞、または、本発明の体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の製造方法により製造される、体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞を含み、本発明のＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法、および、本発明の体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の製造方法における抗原は、がん特異抗原である。
　本発明で提供する多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞は、自己増殖能を獲得した細胞である。本発明の多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞は一度構築すれば多能性幹細胞からミエロイド系細胞への再分化誘導・再作製の必要はなく、今までに報告されていない、ＤＣと同等の優れた抗原提示能を有する。
フィーダー細胞を用いるか、用いないで培養されたｉＰＳＣ由来増殖ミエロイド細胞（ｐＭＣ）の増殖速度に及ぼすＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを含む培地（２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭ）の効果を調べたＭＴＴアッセイの測定結果を示す折れ線グラフ。縦軸はＭＴＴ試薬から代謝されたホルマザンの濃度（波長５９５ｎｍの吸光度として評価）、横軸は培養日数を表す。 フィーダー細胞を用いるか、用いないで培養されたｉＰＳＣ由来ｐＭＣのフローサイトメーターによるＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃおよびＣＤ３３表面抗原解析の結果を示すヒストグラム。 マウスｐＭＣおよびｉｐＡＰＣ－ＧＭのフローサイトメーターによるＧＭ－ＣＳＦ－Ｖｅｎｕｓ表面抗原解析（左上）、ヒトｐＭＣおよびｉｐＡＰＣ－ＭのＭ－ＣＳＦ－ｄＣＤ１９表面抗原解析（左下）、ヒトｐＭＣおよびｉｐＡＰＣ－ＧＭのＧＭ－ＣＳＦ－ｄＣＤ１９表面抗原解析（右上）、並びにヒトｐＭＣおよびｉｐＡＰＣ－ＧＭＭのＧＭ－ＣＳＦ－Ｍ－ＣＳＦ－ＣＤ１９（右下）表面抗原解析の結果を示すヒストグラム。 マウスｐＭＣおよびｉｐＡＰＣ－ＧＭにおける培養上清中のＧＭ－ＣＳＦ産生（左）、ヒトｐＭＣ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、およびｉｐＡＰＣ－ＧＭＭにおける培養上清中のＭ－ＣＳＦ産生（中央）およびＧＭ－ＣＳＦ産生（右）を、ＥＬＩＳＡ法によって定量した結果を示す棒グラフ。 マウスのｉｐＡＰＣ－ＧＭ（上）およびヒト（下）のｉｐＡＰＣ－ＧＭＭの増殖速度に及ぼすＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを含む培地（２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭ）の効果を調べたＭＴＴアッセイの測定結果を示す折れ線グラフ。測定結果は反復試行回数ｎ＝３における平均値を、誤差棒は標準偏差を示す。 ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、およびｉｐＡＰＣ－ＧＭＭのフローサイトメーターによるＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＣＲ７、ＣＤ７４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ３３表面抗原解析の結果を示すヒストグラム。 ＤＣのフローサイトメーターによるＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＣＲ７、ＣＤ７４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ３３表面抗原解析の結果を示すヒストグラム。 ＧＭ－ＣＳＦ添加マウスｐＭＣに対する全トランスクリプトーム解析（ＲＮＡ－ｓｅｑ解析）後の主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ；　ＰＣＡ）多変量解析によって得られた寄与率の高い２軸（ＰＣ１およびＰＣ２）に対する、マウスｐＭＣ、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびＧＭ－ＣＳＦ添加マウスｐＭＣのプロファイルのプロット（Ｃ５７ＢＬ／６（左側）および１２９/Ｓｖ（右側））。 マウスｐＭＣとＧＭ－ＣＳＦ添加マウスｐＭＣに対するマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭの遺伝子セットエンリッチメント解析（Ｇｅｎｅ　Ｓｅｔ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ；　ＧＳＥＡ）の結果を示す図。 外因性のサイトカインを含まない２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭで培養開始日（Ｄａｙ　０、左側）および培養４日目（Ｄａｙ　４、右側）のマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ（下段）およびマウスｐＭＣ（上段）のフローサイトメーターによるＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖおよび７－ＡＡＤ解析の結果を示すサイトグラム。図１０Ａの縦軸は７－ＡＡＤの蛍光強度を表し、横軸はＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖの蛍光強度を表す。 図１０Ｂの折れ線グラフ（左下、右下および右上）は、図１０Ａと同様に、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陰性かつ７－ＡＡＤ陰性、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性かつ７－ＡＡＤ陰性、および、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性かつ７－ＡＡＤ陽性、の分画をそれぞれ、生細胞（左下）、初期アポトーシス細胞（右下）、後期アポトーシス細胞（右上）として、培養開始日から培養４日目まで毎日サンプリングして各分画でゲーティングした細胞の全細胞中の百分率をフローサイトメーターで解析した結果を示す折れ線グラフ。図１０Ｂ左下、右下および右上の折れ線グラフの縦軸は、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはマウスｐＭＣのそれぞれのサンプリング日のフローサイトメトリーで解析された全細胞のうち各分画でゲーティングされた細胞の百分率を表し、横軸は、培養開始日から培養４日目までのサンプリング日を表す。 ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭ（１段目）、ｉｐＡＰＣ－Ｍ（２段目）、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ（３段目）およびｐＭＣ（４段目）の同様なサイトグラム（Ｄａｙ０およびＤａｙ３）。 生細胞（左下）、初期アポトーシス細胞（右下）、後期アポトーシス細胞（右上）の百分率を解析した結果の折れ線グラフ。 Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびｐＭＣを、ＢＡＬＢ／ｃ系統のマウスから調製した抗原刺激を受けていないＴ細胞と混合比を変えて共培養して、アロリンパ球混合反応（アロＭＬＲ）を［３Ｈ］－チミジン取り込みのシンチレーション計測で定量化した結果のプロット図（左）。ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、およびｐＭＣをアロ反応性Ｔ細胞と同様に共培養してアロＭＬＲを定量した結果のプロット図（右）。縦軸は［３Ｈ］－チミジン取り込みのシンチレーション計測結果（単位：ｃｐｍ）を表し、横軸はｉｐＡＰＣ－ＧＭＭ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－ＭまたはｐＭＣの細胞数：抗原刺激を受けていないＴ細胞の細胞数の比を表す。 ＤＱ－ＯＶＡタンパク質を負荷したヒトｐＭＣ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐ－ＡＰＣ－Ｍ、ｉｐ－ＡＰＣ－ＧＭおよびＤＣをフローサイトメトリーで評価したサイトグラム（左）および、ＤＱ－ＯＶＡを取込み細胞内で消化した細胞の割合を示す棒グラフ（右）。 マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭにＯＶＡペプチドＯＶＡ２５７－２６４あるいはＯＶＡタンパク質を濃度依存的に負荷した後、放射線照射によりｉｐＡＰＣ－ＧＭの増殖を停止させ、ＯＶＡ特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞ＯＴ－１と共培養したときの試験管内での抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖を、［３Ｈ］－チミジン取り込みのシンチレーション計測で定量化した結果のプロット図。縦軸は［３Ｈ］－チミジン取り込みのシンチレーション計測結果（単位：１０４ｃｐｍ）を表し、横軸はＯＶＡペプチドＯＶＡ２５７－２６４あるいはＯＶＡタンパク質の濃度を表す。 １０μＭ　ＯＶＡペプチド（左側）または、１００μｇ／ｍＬ　ＯＶＡタンパク質（右側）を負荷した条件でのＯＴ－１増殖誘導活性を、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭとマウスｐＭＣで比較した棒グラフ。縦軸は［３Ｈ］－チミジン取り込みのシンチレーション計測結果（単位：１０４ｃｐｍ（左側）、１０３ｃｐｍ（右側））を表し、横軸はＯＴ－１と共培養された細胞を表す。アスタリスク（＊）はスチューデントｔ両側検定によるｐ＜０．０５であることを示す。 ＯＶＡペプチドで負荷されたマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびマウスｐＭＣと、ペプチドで負荷されないマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびマウスｐＭＣとによる、ＯＶＡ発現がん細胞の皮下移植腫瘍の抑制効果を比較した折れ線グラフ。縦軸は、移植された腫瘍の体積（単位：ｃｍ）を表し、横軸は腫瘍を移植後の日数を表す。アスタリスク（＊）はＯｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡｓ　ｗｉｔｈ　Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔによるｐ－ｖａｌｕｅｓ:＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，　＊＊＊ｐ＜０．００１を示す。マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭもマウスｐＭＣも投与しない動物は抑制効果が最も弱く、ペプチドで負荷されないマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびマウスｐＭＣはほぼ同等の抑制効果で、ＯＶＡペプチドで負荷されたマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭがもっとも抑制効果が高く、ＯＶＡペプチドで負荷されたマウスｐＭＣがこれに次ぐ抑制効果が認められた。 図１５の各細胞で処理された担がんマウス個体の生存曲線。アスタリスク（＊）はｌｏｇ－ｒａｎｋ　ｔｅｓｔｓによるｐ－ｖａｌｕｅｓ:＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１を示す。 腫瘍移植５６日目のマウスから採取した末梢血単核細胞のうちＯＶＡペプチド抗原特異的Ｔ細胞の頻度を調べたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す染色された培養ディッシュの写真と、結果をまとめた棒グラフ。上の組み合わせ写真は、ＯＶＡペプチド（下側）または対照のＳＩＹペプチド（上側）で刺激されたマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ（右側）と、ナイーブＴ細胞（左側）のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるインターフェロンγを産生する抗原特異的Ｔ細胞の頻度を表す。下の棒グラフは、上の組み合わせ写真の結果を定量的に示すもので、ＯＶＡペプチド（灰色）または対照のＳＩＹペプチド（白）で刺激されたマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはナイーブＴ細胞が誘導したインターフェロンγを産生する抗原特異的Ｔ細胞の頻度を示す。グラフの縦軸はインターフェロンγと反応するスポットの数（単位：１×１０２個）を表す。 ｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはｐＭＣの培養上清を含む培地でのナイーブＯＴ－１　ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖を示す棒グラフ。縦軸はＴ細胞への［３Ｈ］－チミジン取り込みのシンチレーション計測結果（単位：１０３ｃｐｍ）を表す。アスタリスク（＊＊）は、スチューデントｔ両側検定によるｐ＜０．０１を示す。 ｉｐＡＰＣ－ＧＭの培養上清を含む培地に抗ＧＭ－ＣＳＦ中和抗体（αＧＭ－ＣＳＦ　Ａｂ）または対照抗体（Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ａｂ）を添加してナイーブＯＴ－１　ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖への効果を示す棒グラフ。縦軸はＴ細胞への［３Ｈ］－チミジン取り込みのシンチレーション計測結果（単位：１０３ｃｐｍ）を表す。 ｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはｐＭＣとの共培養がＴ細胞の増殖活性に与える効果を示す棒グラフ。縦軸はＴ細胞への［３Ｈ］－チミジン取り込みのシンチレーション計測結果（単位：１０２ｃｐｍ）を表す。アスタリスク（＊＊）は、スチューデントｔ両側検定によるｐ＜０．０１を示す。 ナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞（左側）、ｉｐＡＰＣ－ＧＭとナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞の共培養後（中央）、および、脾臓細胞とナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞の共培養後（右側）のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβ頻度をフローサイトメーターで解析した結果を示すヒストグラム。横軸はＴＣＲＶβのレパートリーのそれぞれを表し、縦軸は各レパートリーの使用頻度を表す。 異なる強度の放射線照射がｉｐＡＰＣ－ＧＭ（右側）またはｐＭＣ（左側）の細胞形態に与える影響を比較した位相差顕微鏡写真を表す。最上段から最下段までの段の細胞の吸収線量は、それぞれ、０Ｇｙ、６５Ｇｙ、８５Ｇｙおよび１００Ｇｙで、写真の拡大倍率は４００倍を表す。スケールバーは５０μｍを示す。 異なる強度の放射線照射がマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ（中央）またはマウスｐＭＣ（左側）、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、およびｐＭＣ（右側）の細胞増殖に与える影響を比較した棒グラフ。横軸は照射された放射線の吸収線量（単位：Ｇｙ）を表し、縦軸は各条件の放射線被ばく後のｉｐＡＰＣ－ＧＭ（右側）またはｐＭＣ（左側）の［３Ｈ］－チミジン取り込みのシンチレーション計測結果（単位：１０２ｃｐｍ（左側）、１０４ｃｐｍ（中央）、ｃｐｍ（右側））を表す。 図２３の上は、照射前、０Ｇｙまたは８５Ｇｙ照射の２４時間後のマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ（下段）およびマウスｐＭＣ（上段）のフローサイトメーターによるＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖおよび７－ＡＡＤ解析の結果を示すサイトグラム。図２３の左下および右下は、上のサイトグラム図と同様に、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性かつ７－ＡＡＤ陰性、および、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ陽性かつ７－ＡＡＤ陽性、の分画をそれぞれ、初期アポトーシス細胞（左下）、後期アポトーシス細胞（右下）として、照射前、０Ｇｙまたは８５Ｇｙ照射の２４時間後にそれぞれサンプリングして各分画でゲーティングした細胞の全細胞中の百分率をフローサイトメーターで解析した結果を示す棒グラフ。図２３上のサイトグラムの縦軸は７－ＡＡＤの蛍光強度を表し、横軸はＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖの蛍光強度を表す。図２３左下および右下の棒グラフの縦軸は、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはマウスｐＭＣのそれぞれのサンプリング日のフローサイトメトリーで解析された全細胞のうち各分画でゲーティングされた細胞の百分率を表し、横軸は、照射前、０Ｇｙまたは８５Ｇｙ照射の２４時間後のサンプルを表す。 ０または８５Ｇｙを照射したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはマウスｐＭＣの試験管内における細胞増殖をＭＴＴアッセイで照射後３日間連続して評価した結果を示す折れ線グラフ。縦軸はＭＴＴ試薬から代謝されたホルマザンの濃度（波長５９５ｎｍの吸光度により測定）、横軸は培養日数を表す。 ８５Ｇｙの放射線照射を行ったルシフェラーゼ発現ｉｐＡＰＣ－ＧＭ（ｉｐＡＰＣ－ＧＭ－Ｌｕｃ）またはｐＭＣ（ｐＭＣ－Ｌｕｃ）を同一系統のマウスに皮下投与して、投与当日（Ｄａｙ　０）から４日目（Ｄａｙ　４）まで毎日生存細胞を生物化学発光により測定した全個体のｉｎ　ｖｉｖｏイメージングの撮影画像（上）と、ルシフェラーゼ発光の全フラックスの経時変化を示す折れ線グラフ（下）。上の撮影画像の右はルシフェラーゼ発光強度を有彩色で表したスケールで、最小発光強度は５．４６×ｅ５で、最大発光強度は４．３１×ｅ６（単位：ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ２／ｓｒ）。下の折れ線グラフの縦軸はルシフェラーゼ発光の全フラックス（単位：１０７ｐ／ｓ）、横軸は投与後の日数を表す。 放射線照射によって増殖能を停止させたｉｐＡＰＣ－ＧＭにＯＶＡペプチドを負荷し、腹腔内投与した後、がん細胞ＭＯ４を皮下に移植して、腫瘍径を３～４日毎に評価した結果の腫瘍の体積の推移を示す折れ線グラフ。縦軸は腫瘍の体積（単位：１０３ｍｍ３）で、横軸は腫瘍移植後の日数を表す。抗原提示細胞をまったく投与しない場合は腫瘍抑制効果が最も弱く、８５Ｇｙ照射後のｐＭＣを投与した群が２番目に腫瘍抑制効果が弱く、８５Ｇｙ照射後のｉｐＡＰＣ－ＧＭは未照射の骨髄由来樹状細胞（ＢＭ－ＤＣ）と同じく腫瘍抑制効果が最も高かった。 図２６の各細胞で処理された担がんマウス個体の生存曲線。 腫瘍移植５６日目のマウスから採取した末梢血単核細胞のうちＯＶＡペプチド抗原特異的Ｔ細胞の頻度を調べたＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す染色された培養ディッシュの写真と、結果をまとめた棒グラフ。上の組み合わせ写真は、ＯＶＡペプチド（下側）または対照のＳＩＹペプチド（上側）を負荷した後８５Ｇｙの放射線を照射されたマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ（ｉｐＡＰＣ－ＧＭ　８５　Ｇｙ）と、同じくＯＶＡペプチド（下側）または対照のＳＩＹペプチド（上側）を負荷した後８５Ｇｙの放射線を照射されたマウスｐＭＣ（ｐＭＣ　８５　Ｇｙ）と、同じくＯＶＡペプチド（下側）または対照のＳＩＹペプチド（上側）を負荷した骨髄樹状細胞（ＢＭ－ＤＣ、右端）と、ナイーブＴ細胞（左端）のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによるインターフェロンγを産生する抗原特異的Ｔ細胞の頻度を表す。下の棒グラフは、上の組み合わせ写真の結果を定量的に示すもので、ＯＶＡペプチド（灰色）または対照のＳＩＹペプチド（白）を負荷され放射線を照射されたマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびｐＭＣと、ＯＶＡペプチド（灰色）または対照のＳＩＹペプチド（白）を負荷された骨髄樹状細胞と、ナイーブＴ細胞が誘導したインターフェロンγを産生する抗原特異的Ｔ細胞の頻度を示す。グラフの縦軸はインターフェロンγと反応するスポットの数（単位：１×１０２個）を表す。 自殺遺伝子ＨＳＶ－ＴＫまたはｉＣａｓｐ９を導入したルシフェラーゼ発現ｉｐＡＰＣ－ＧＭ（ｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ＨＳＶ－ＴＫ－ＬｕｃまたはｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ｉＣａｓｐ９－Ｌｕｃ）または、ルシフェラーゼ発現ｉｐＡＰＣ－ＧＭ（ｉｐＡＰＣ－ＧＭ－Ｌｕｃ）を同一系統のマウスに皮下投与して、投与当日（Ｄａｙ０）から７日目（Ｄａｙ７）まで生体内の生存細胞を生物化学発光により測定した全個体のｉｎ　ｖｉｖｏイメージングで得たルシフェラーゼ発光の全フラックスの経時変化を示す折れ線グラフ。投与当日（Ｄａｙ０）から４日目（Ｄａｙ４）までの５日間連続で、自殺遺伝子の誘導試薬であるＧＣＶ、ＡＰ１９０３、または誘導試薬無しの生理食塩水（Ｍｅｄｉｕｍ）を腹腔内投与した結果を示す。＊はスチューデントｔ両側検定によるｐ＜０．０５を、＊＊はｐ＜０．０１を示す。 自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９を導入したルシフェラーゼ発現ｉｐＡＰＣ－ＧＭ（ｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ｉＣａｓｐ９－Ｌｕｃ）を同一系統のマウスに皮下投与して、投与当日（Ｄａｙ０）から７日目（Ｄａｙ７）まで生体内の生存細胞を生物化学発光により測定した全個体のｉｎ　ｖｉｖｏイメージングで得たルシフェラーゼ発光の全フラックスの経時変化を示す折れ線グラフ（左）。Ｄａｙ０のシグナル強度を１００％とした時の、各測定日におけるシグナル減衰率（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｅ）を示した棒グラフ（右）。投与当日（Ｄａｙ０）から４日目（Ｄａｙ４）までの５日間連続で、ｉＣａｓｐ９の誘導試薬であるＡＰ１９０３、またはＳｕｒｖｉｖｉｎ阻害剤であるＹＭ－１５５、または誘導試薬無しの生理食塩水（Ｍｅｄｉｕｍ）を腹腔内投与した結果を示す。＊はスチューデントｔ両側検定によるｐ＜０．０５を示す。 免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）低感受性のがん細胞ＭＯ４を皮下移植して腫瘍を形成させたマウスに、ＯＶＡペプチドを負荷したｉｐＡＰＣ－ＧＭ、またはＩＣＩ（抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、またはｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびＩＣＩを併用して腹腔内投与して、腫瘍径を３～４日毎に評価した結果の腫瘍の体積の推移を示す折れ線グラフ（左）と担がんマウス個体の生存曲線（右）。折れ線グラフ（左）の縦軸は腫瘍の体積（単位：１０３ｍｍ３）で、横軸は腫瘍移植後の日数を表す。生存曲線（右）の縦軸はマウスの生存率で、横軸は腫瘍移植後の日数を表す。Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡｓ　ｗｉｔｈ　Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔにて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。ＩＣＩあるいは抗原提示細胞をまったく投与しない場合は腫瘍抑制効果が最も弱く、ＩＣＩを投与した群が２番目に腫瘍抑制効果が弱く、８５Ｇｙ照射後のｉｐＡＰＣ－ＧＭとｉｐＡＰＣ－ＧＭとＩＣＩの併用は腫瘍抑制効果が最も高かった。 ＩＣＩ感受性のがん細胞ＭＣ３８を皮下移植して腫瘍を形成させたマウスに、がん抗原としてｍＡｄｐｇｋまたはｗｔＡｄｐｇｋペプチドを負荷したｉｐＡＰＣ－ＧＭ、またはＩＣＩ（抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、またはｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびＩＣＩを併用して腹腔内投与して、腫瘍径を３～４日毎に評価した結果の腫瘍の体積の推移を示す折れ線グラフ（左）と担がんマウス個体の生存曲線（右）。折れ線グラフ（左）の縦軸は腫瘍の体積（単位：１０３ｍｍ３）で、横軸は腫瘍移植後の日数を表す。生存曲線（右）の縦軸はマウスの生存率で、横軸は腫瘍移植後の日数を表す。Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡｓ　ｗｉｔｈ　Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｔｅｓｔにて、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。ＩＣＩあるいは抗原提示細胞をまったく投与しない場合は腫瘍抑制効果が最も弱く、ｗｔＡｄｐｇｋを負荷したｉｐＡＰＣ－ＧＭを投与した群が２番目に腫瘍抑制効果が弱く、ｗｔＡｄｐｇｋペプチド負荷ｉｐＡＰＣ－ＧＭと比較して、ｍＡｄｐｇｋペプチド負荷ｉｐＡＰＣ－ＧＭ治療群は、有意差を認めなかったが腫瘍径増大の抑制傾向が見られ、有意にマウスの生存を延長した。ＩＣＩ単独治療と比較して、ｍＡｄｐｇｋペプチド負荷ｉｐＡＰＣ－ＧＭの腫瘍径の経時変化およびマウスの生存に有意差は見られなかった。ＩＣＩとｍＡｄｐｇｋペプチド負荷ｉｐＡＰＣ－ＧＭを併用した場合、ＩＣＩ単独との有意差は認めなかったが、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ単独治療よりも有意に腫瘍径の増大を抑制し、マウスの生存を延長した。 がん細胞ＭＯ４を移植した担がんマウスをｉｐＡＰＣ－ＧＭ単独または免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）との併用で治療した後の腫瘍内のＣＤ４５陽性免疫細胞に対するフローサイトメトリーによるＧｒ－１およびＣＤ１１ｂ表面抗原解析の結果を示すサイトグラム（左）。ゲートの数値は骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の割合を示す。右図はフローサイトメトリー解析の結果から算出したＭＤＳＣの割合を示した棒グラフ。＊＊はスチューデントｔ両側検定によるｐ＜０．０１を、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。 がん細胞ＭＯ４を移植した担がんマウスをｉｐＡＰＣ－ＧＭ単独または免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）との併用で治療した後の腫瘍内のＣＤ８陽性T細胞に対するフローサイトメトリーによるＧｚｍＢおよびＰｅｒｆｏｒｉｎ表面抗原解析の結果を示すサイトグラム（左）。ゲートの数値は測定したＣＤ８陽性Ｔ細胞に対する割合を示す。右図はフローサイトメトリー解析の結果から算出したＧｚｍＢおよびＰｅｒｆｏｒｉｎ両陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を示した棒グラフ。＊＊はスチューデントｔ両側検定によるｐ＜０．０１を、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。 実施例３（４）および非特許文献（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２０１１　１８，　８７４－８８３）に記載のフィーダーフリー分化誘導法（比較例１）で作製したヒトｉＰＳ細胞に由来する分化細胞のＣＤ３４およびＣＤ４３または、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃ表面抗原解析の結果を示すサイトグラム（上）。培養１８日目におけるＣＤ３４陽性細胞頻度と培養２５日目におけるＣＤ１１ｂ陽性細胞頻度を示す表（下）。Ｎ．Ｄ．はＮｏｔ　Ｄｅｔｅｃｔｅｄを表す。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
　本発明は、１つの実施形態において、ミエロイド細胞（ＭＣ）にｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２を発現させ増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）を得ること、並びに前記ｐＭＣにＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを発現させてプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）を得ること、を含む、
プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法に関する。
　本製造方法により初めてｅｘ　ｖｉｖｏでミエロイド細胞から抗原提示能を有するプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）を得ることができた。
　本発明において、ミエロイド細胞とは、幹細胞から分化した白血球のうち、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびこれらの細胞に分化する細胞系譜に属する前駆細胞との総称である。好ましくは、ミエロイド細胞は多能性幹細胞から分化されたミエロイド細胞である。以下、ミエロイド細胞をＭＣともいう。
　本発明において、「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても特定の機能を有する細胞への分化能を細胞分裂前と同等に維持する細胞をいう。
　本発明において、多能性幹細胞とは、インビトロにおいて未分化な状態を維持して培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。受精後三胚葉の形成前の胚、始原生殖細胞を含む器官形成期以降の胚や胎仔または胎児から単離される胚性幹細胞（ＥＳ細胞）も「多能性幹細胞」に含まれる。好ましくは、本発明における、多能性幹細胞は人工多能性幹細胞である。
　本発明において、「人工多能性幹細胞」とは、いったん多分化能を喪失した体細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ等の数種類の遺伝子の発現により直接初期化するなどして多分化能を誘導した細胞をいう（以下、ｉＰＳＣ又はｉＰＳ細胞とも言う）。この「人工多能性幹細胞」も「多能性幹細胞」に含まれる。多能性幹細胞は、公知の方法で作製することが可能である。作製方法としては、例えばヒトの人工多能性幹細胞についてはＣｅｌｌ，２００７，１３１（５）ｐｐ．８６１－８７２やＫｉｔａｙａｍａ，　Ｓ．ら（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ．　６：　２１３－２２７，（２０１６））が、マウスの人工多能性幹細胞についてはＣｅｌｌ，２００６，１２６（４）　ｐｐ．６６３－６７６に、それぞれ記載される方法が挙げられる。「多能性幹細胞」は、クローン胚、トランスジェニック動物、ゲノム編集による突然変異体動物をはじめとする胚操作技術を施した動物から得ることもできる。多能性幹細胞は、ミエロイド細胞を含む、さまざまな細胞タイプの細胞に分化できることが知られている。なお、人工多能性幹細胞から作成したプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）をｉＰＳＣ由来プロフェッショナル抗原提示細胞（ｉｐＡＰＣ）という。
　ヒトまたはマウスのｉＰＳＣは、再生医療用培地ＳｔｅｍＦｉｔ（味の素）を用いて維持・拡大培養することができる。このときにＬａｍｉｎｉｎ５１１を加えてもよい。また、細胞の継代培養のために細胞を解離することによるｉＰＳＣの損傷を軽減除去するためにロック阻害剤、例えば、Ｙ－２７６３２を、１０μＭ程度培地に添加してもよい。
　多能性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞である、ＥＢ５細胞は独立行政法人理化学研究所より、Ｄ３株はＡＴＣＣより、入手可能である。
　多能性幹細胞は、公知の方法により維持培養できる。例えば、ヒト多能性幹細胞は、ＫｎｏｃｋＯｕｔ(商標）　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した培地で培養することにより維持できる。マウス多能性幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びＬｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を添加し無フィーダー下に培養することにより維持できる。
　本発明において、増殖性ミエロイド細胞とは、３カ月以上の長期に渡り培養が可能なミエロイド細胞であって、かつ胚または成体に通常存在するミエロイド細胞と比較して増殖性が優れるものをいう。以下、増殖性ミエロイド細胞をｐＭＣともいう。
　本発明において、プロフェッショナル抗原提示細胞とは、通常の有核細胞が有するヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ：　ＨＬＡ）クラスＩ分子のみならず、ＨＬＡクラスＩＩ分子も発現する抗原提示に特化した細胞であり、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞などを含む。本明細書では、プロフェッショナル抗原提示細胞をｐＡＰＣとも言う。
　本発明において、「ｃ－ＭＹＣ」、「ＢＭＩ１」、「ＭＤＭ２」、「ＧＭ－ＣＳＦ」および「Ｍ－ＣＳＦ」とは、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の多能性幹細胞由来のミエロイド細胞からプロフェッショナル抗原提示細胞への分化を誘導する活性を有するいずれかの生物種のｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの遺伝子、又はそのホモログまたはオーソログをいう。
　例えば、ヒトの多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞への分化を誘導する場合には、ヒトのｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦとこれらの変異体のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いる。
　さらに、他の生物種由来のｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いることもできる。ヒト以外の他の生物種の多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞についても、同様に、当該生物種由来のｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いることができる。さらに目的の細胞を得ることができる場合には、他の生物種由来のｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦのゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いることもできる。
　本発明の「ｃ－ＭＹＣ」、「ＢＭＩ１」、「ＭＤＭ２」、「ＧＭ－ＣＳＦ」および「Ｍ－ＣＳＦ」のタンパク質、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのさまざまな生物種の配列情報は、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のデータベースのＧｅｎｅのような当業者に周知の情報源から入手することができる。
　本発明において、発現させるとは、所望の遺伝子またはタンパク質を細胞内で産生させ、場合によっては細胞外に分泌させて、その遺伝子またはタンパク質の機能を発揮させることをいう。
　本発明において、遺伝子導入されたとは、所望の遺伝子を特定の細胞に導入し、その遺伝子又は当該遺伝子にコードされるタンパク質を細胞内で産生させ、場合によっては細胞外に分泌させて、そのタンパク質の機能を発揮させることをいう。
　本発明における所望の遺伝子またはタンパク質は「ｃ－ＭＹＣ」、「ＢＭＩ１」、「ＭＤＭ２」、「ＧＭ－ＣＳＦ」および「Ｍ－ＣＳＦ」などをいう。
　本発明において、好ましくは、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２はミエロイド細胞に遺伝子導入される。また、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦは増殖性ミエロイド細胞に遺伝子導入される。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、さらに、以下の(i)又は(ii)の方法により多能性幹細胞からミエロイド細胞（ＭＣ）を分化させることを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法、に関する。
(i)前記多能性幹細胞から誘導された胚様体（ＥＢ）を、ＶＥＧＦを含む培地中でフィーダー細胞の上で重層培養を行った後、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＴＰＯを含む培地中でさらに培養すること、又は、
(ii)前記多能性幹細胞から誘導された胚様体を、ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦおよびＳＣＦを含む培地中でフィーダー細胞なしの単層培養を行った後、さらにＶＥＧＦ、ＴＰＯおよびＧＭ－ＣＳＦを含む培地中で培養すること。
　本発明における「胚様体」とは、未分化な多能性幹細胞が接着して形成された細胞塊をいう。該細胞塊の中での密接な細胞間相互作用により、前記細胞塊を構成する多能性幹細胞は細胞分化のレパートリーが限定されていく点で、あたかも着床後から胚葉が形成される発生段階の胚に類似する。
　本発明における胚様体の大きさは、特に制限されないが、直径が５０～１０００μｍであることが好ましく、５０～５００μｍであることがさらに好ましく、５０～２００μｍであることが特に好ましい。胚様体の大きさが上記範囲より大きすぎると胚様体内部への酸素供給が不十分になり細胞壊死が起こる恐れがある。胚様体の大きさが上記範囲より小さすぎると、胚様体を形成せず単一の細胞はアポトーシスによる細胞死を起こす恐れがある。マウスの胚様体は、マウス間葉系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞またはマウス骨髄由来間質ＯＰ９細胞をフィーダー細胞として用いて培養する場合がある。ヒトの胚様体はフィーダー細胞を用いずに培養することができる。
　本発明の「ＶＥＧＦ」、「ＳＣＦ」、「ＴＰＯ」、「ＢＭＰ－４」および／または「ＧＭ－ＣＳＦ」は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類の多能性幹細胞からミエロイド細胞（ＭＣ）への分化を誘導する活性を有する、いずれかの生物種のＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４および／またはＧＭ－ＣＳＦタンパク質、およびそのホモログまたはオーソログをいう。
　本発明の「ＶＥＧＦ」、「ＳＣＦ」、「ＴＰＯ」、「ＢＭＰ－４」および／または「ＧＭ－ＣＳＦ」は、培養される胚様体の生物種の「ＶＥＧＦ」、「ＳＣＦ」、「ＴＰＯ」、「ＢＭＰ－４」および／または「ＧＭ－ＣＳＦ」と同程度の分化誘導活性を有することを条件として、培養される胚様体の生物種以外の生物種のＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４および／またはＧＭ－ＣＳＦタンパク質、又は、培養される胚様体の生物種と同じ生物種のＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４および／またはＧＭ－ＣＳＦタンパク質の変異体、を用いることができる。
　本明細書においては、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３および／またはｂＦＧＦも、上述のＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４および/またはＧＭ－ＣＳＦ等と一緒に、本発明の細胞の培養に用いられることがある。これらは、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のデータベースのＧｅｎｅのような当業者に周知の情報源から入手することができる。また遺伝子組換えタンパク質試薬として、例えばＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ.ｃｏｍ/）からＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｌｔ－３　Ｌｉｇａｎｄ／ＦＬＴ３Ｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（３０８－ＦＫＮ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－３　Ｐｒｏｔｅｉｎ（２０３－ＩＬ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＦＧＦ　ｂａｓｉｃ／ＦＧＦ２／ｂＦＧＦ　（１４５　ａａ）　Ｐｒｏｔｅｉｎ（３７１８－ＦＢ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＶＥＧＦ　１６５　Ｐｒｏｔｅｉｎ（２９３－ＶＥ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＳＣＦ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（２５５－ＳＣ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（２８８－ＴＰ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＢＭＰ－４　Ｐｒｏｔｅｉｎ（３１４－ＢＰ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｈｕｍａｎ　ＧＭ－ＣＳＦ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（２１５－ＧＭ）を購入して入手することも出来る。
　本発明の「ＶＥＧＦ」、「ＳＣＦ」、「ＴＰＯ」、「ＢＭＰ－４」および／または「ＧＭ－ＣＳＦ」のタンパク質、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのさまざまな生物種の配列情報は、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のデータベースのＧｅｎｅのような当業者に周知の情報源から入手することができる。
　なお、上述の遺伝子またはタンパク質は、用いる多能性幹細胞と同種の遺伝子またはタンパク質を用いることが好ましい。例えば、当該多能性幹細胞がヒト由来の場合には、ヒト由来のＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＩＬ－３および／またはｂＦＧＦを用いることが好ましく、当該多能性幹細胞がマウス由来の場合には同様にマウス由来の当該遺伝子またはタンパク質を用いることが好ましい。
　本発明において、「物質Ｘを含む培地」とは、外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地または外因性の物質Ｘを含む培地を意味し、「物質Ｘを含まない培地」とは、外因性の物質Ｘが添加されていない培地または外因性の物質Ｘを含まない培地を意味する。ここで、「外因性の物質Ｘ」とは、その培地で培養される細胞または組織にとって外来の物質Ｘを意味し、その細胞または組織が産生する内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘはこれに含まれない。
　例えば、「ＶＥＧＦを含む培地」とは、外因性のＶＥＧＦが添加された培地または外因性のＶＥＧＦを含む培地である。ＶＥＧＦの用量は、他の成長因子などにも影響されることがあるが、０．２ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、２ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬがさらに好ましく、５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。「ＶＥＧＦを含まない培地」とは、外因性のＶＥＧＦが添加されていない培地または外因性のＶＥＧＦを含まない培地である。
　同様に、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４、ＧＭ－ＣＳＦについても、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４および／またはＧＭ－ＣＳＦを含む培地とは、外因性のＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４および／またはＧＭ－ＣＳＦが添加された培地または外因性のＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４および／またはＧＭ－ＣＳＦを含む培地である。したがって、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４および／またはＧＭ－ＣＳＦの用量は、他の成長因子などにも影響されることがあるが、０．２ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬであることが好ましく、２ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬがさらに好ましく、５ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、５ｎｇ／ｍＬから１５ｎｇ／ｍＬが特に好ましく、１０ｎｇ／ｍＬが最も好ましい。
　「ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４および／またはＧＭ－ＣＳＦを含まない培地」とは、外因性のＶＥＧＦが添加されていない培地または外因性のＳＣＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ－４および／またはＧＭ－ＣＳＦを含まない培地である。
　本発明におけるマウスの胚様体用の培地としては、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したαＭＥＭを用いることができる。フィーダー細胞としては、マウス間葉系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、またはマウス骨髄由来間質ＯＰ９細胞を用いることができる。ヒトの胚様体用の培地としては完全合成培地のＸ－ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ）を用いることができる。造血前駆細胞（ＨＰＣ）からの分化には、ＣＤ１１ｂ陽性画分を磁気ビーズで濃縮することができる。
　培地は、２０％ＦＢＳを添加したαＭＥＭなどを用いることができる。
　本発明の増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）は、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦの遺伝子を導入することができる。
　本発明における、「フィーダー細胞」とは、ｉＰＳ細胞の未分化維持培養や分化誘導培養の培養条件を整えるために用いる他の細胞種である。フィーダー細胞はマイトマイシンＣ処理や放射線照射で増殖を停止させて用いる。未分化維持培養にはマウス由来線維芽細胞を、分化誘導培養にはマウス骨髄由来間質細胞ＯＰ－９や、マウス由来間葉系細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２等を用いることができる。
　本発明における、「重層培養」とは、改め所定の培養容器にて培養したフィーダー細胞層の培養系に、目的のｉＰＳ細胞や胚様体を播種して共培養することである。本発明において、「単層培養」とは、単一の細胞種を組織培養用の容器に接着させて培養することである。
　本発明における、フィーダー細胞なしの単層培養とは、培養容器に目的のｉＰＳ細胞または胚様体を播種して静置培養することを指す。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、さらに、以下の方法で多能性幹細胞より胚様体を形成させることを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法、に関する。
(i)　多能性幹細胞の単細胞分散液を細胞塊形成培養用容器に播種して胚様体（ＥＢ）を形成させ、および
(ii)　前記容器は、底に微細なスフェロイドウェルが設けられ、かつ、隣接するスフェロイドウェルの間に平坦な面が存在しないことを含む。
　「胚様体を形成させる」とは、未分化状態で増殖していた多能性幹細胞を解離して、多能性幹細胞の単細胞分散液を得て、該分散液を多能性幹細胞どうしが接着して集合する条件下で浮遊培養または静置培養させることにより、質的に均一な細胞塊を形成させることをいう。胚様体の形成の確認は、顕微鏡による目視観察で生細胞が存在することを確認することによって行われる。
　本明細書において、「浮遊培養」とは、細胞または細胞塊を懸濁状態に保つことにより、培養容器等の底面、壁面などの基質に接着させない条件で培養することをいう。
　浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものなどを使用できる。
　本発明においては、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞由来の胚様体を形成させることが好ましい。このように多能性幹細胞の細胞塊を形成させて、ＶＥＧＦを５０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した培地に移して培養すると、卵黄嚢の血島と同様に、細胞塊の細胞を造血幹細胞からミエロイド細胞への細胞系譜に分化させることができる。
　胚様体を形成させる実験的な操作としては、例えば、小さな口径の穴（ウェル）を多数備えたプレート（例えば、９６穴プレート）や細胞塊形成培養用容器などの培養容器を用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。細胞また多能性幹細胞の凝集体の培養条件は、旋回培養、振蕩培養その他の浮遊培養の他、あらかじめ培養容器の細胞と接する基質表面に、疎水性にするなどの処理を施して、多能性幹細胞と培養容器の基質表面との接着を軽減または抑制することを条件として、静置培養とすることもできる。
　多能性幹細胞の細胞塊としての胚様体が形成されることや、胚様体の細胞からミエロイド細胞に分化することは、顕微鏡やFACSを用いた、胚様体のサイズおよび細胞数の確認、培養下での胚様体の微視的形態の確認、組織または細胞化学的所見の確認、及び/又は、分化並びに未分化マーカーの発現、その均一性、分化マーカーの発現制御、その同期性若しくは分化効率の胚様体間の再現性の確認、等を含むがこれらに限られない特性に基づき判断することが可能である。
　本発明において、ある細胞があるマーカーについて「陽性」であるとは、当該細胞をフローサイトメトリーで測定し、陰性対照に対する陽性細胞の平均蛍光強度比が１０倍以上を＋として、２倍以上～１０倍未満をｌｏｗ、２倍未満を－とする。
また、本発明において、ある細胞のある遺伝子の発現が高い、または、低いとは、当該遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定し、ハウスキーピング遺伝子であるβアクチン、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ＨＰＲＴ　１（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　１）またはβ２－ミクログロブリンに対する発現量が１倍以上を高いとして、それ未満を低いとする。
　本発明における、単細胞分散液とは、培養した細胞をＰＢＳ等で洗浄し、細胞剥離液トリプシン―ＥＤＴＡ（ライフテクノロジーズ）やＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジーズ）を用いて４～５分間処理し、さらにＰＢＳ等で洗浄した後に遠心分離で得た目的細胞のペレットを、所望の培養液等でピペッティングにより再懸濁して調製したものである。
　本発明における、細胞塊形成培養用容器とは、培養時に播種した細胞が容器に接着することなく細胞の凝集塊を形成できるものをいう。好ましくは、当該容器は、培養面であるその底に微細なスフェロイドウェルが設けられ、かつ、隣接するスフェロイドウェルの間に平坦な面が存在せず、隣接するスフェロイドウェルは、いずれかのスフェロイドウェルに向かって傾斜する曲面で隔てられており、当該曲面には細胞の接着性を抑制するための表面処理が施されるために、当該培養用容器に播種された細胞はほとんどがいずれかのスフェロイドウェルに落下する。
　容器の例としては、直径約４００～８００μｍ、深さ１００～８００μｍのスフェロイドウェルが培養面（底）に隙間なく壁面まで均一にされた容器が挙げられる。好ましくは、スフェロイドウェルが直径４００～５００μm、深さ５０～２００μｍである。より好ましくは、スフェロイドウェルが直径約５００μｍ、深さ約４００μｍの容器、直径約８００μｍ、深さ約４００μｍの容器、又は直径約８００μｍ、深さ約３００μｍの容器である。最も好ましくは、スフェロイドウェルが直径約４００μｍ、深さ１００～２００μｍ、の容器である。
　容器として、好ましくは、スフェロイドウェルが培養面（底）に隙間なく壁面まで均一に加工されているものがよい。このような容器の場合、当該容器には隣接するスフェロイドウェルの間に平坦な面が存在せず、播種された単細胞懸濁液はいずれかのスフェロイドウェルに落下するため、均一な凝集体を形成することができるためである。より好ましくは、ＡＧＣによって製造される微細加工細胞培養容器（ＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標））である。
　本発明は、さらに、
(i)　多能性幹細胞を、底に微細なスフェロイドウェルが設けられ、かつ、隣接するスフェロイドウェルの間に平坦な面が存在しない細胞塊形成培養用容器に播種して胚様体（ＥＢ）を形成させること、
(ii)　以下の(ii)-1又は(ii)-2の方法により前記胚様体からミエロイド細胞（ＭＣ）を得ること、
(ii)-1　前記胚様体を、ＶＥＧＦを含む培地中でフィーダー細胞の上で重層培養を行った後、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＴＰＯを含む培地中でさらに培養すること、又は、
(ii)-2　前記胚様体を、ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦおよびＳＣＦを含む培地中でフィーダー細胞なしの単層培養を行った後、さらにＶＥＧＦ、ＴＰＯおよびＧＭ－ＣＳＦを含む培地中で培養すること、
(iii)　(ii)で得られたミエロイド細胞（ＭＣ）にｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２を発現させて増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）を得ること、および、
(iv)　(iii)で得られた増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）にＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを発現させてプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）を得ること、を含む、
プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法、に関する。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、さらに、ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２はミエロイド細胞に遺伝子導入されたものであり、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦは増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）に遺伝子導入されたものである、プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法、に関する。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明はさらに、前記胚様体（ＥＢ）のサイズが５０～２００μｍである、プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法、に関する。
　胚様体のサイズが５０～２００μｍであると、オンフィーダー分化誘導およびフィーダーフリー分化誘導のいずれの場合でも、多能性幹細胞がミエロイド細胞へ効率的に分化できる。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、さらに、前記プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）に放射線を照射すること（Ｒ／ｐＡＰＣ工程）及び/又は自殺遺伝子をｐＡＰＣに導入すること、をさらに含む、プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法、に関する。
　本発明において、放射線とは、いかなる放射線でもよく、ガンマ線、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線、およびマイクロ波放射線が挙げられる。好ましくはＸ線である。
　本発明において、放射線を照射するとは、細胞を放射線に暴露させることをいう。本発明において、プロフェッショナル抗原提示細胞に放射線を照射する場合、放射線照射後のプロフェッショナル抗原提示細胞が、その自己増殖能は喪失するが、Ｔ細胞の増殖を促進する能力を維持できるのであれば、いかなる吸収線量を照射してもよい。
　本発明において、自殺遺伝子をｐＡＰＣに導入するとは、自殺遺伝子をｐＡＰＣ内に保持させ、その自殺遺伝子が機能する状態にあることをいう。
　自殺遺伝子とは、その遺伝子を導入された細胞を死に至らしめることができる遺伝子をいう。自殺遺伝子による細胞の除去の方法は、まず、特定の化合物によって当該自殺遺伝子が活性化された場合にのみその自殺遺伝子が導入された細胞の死滅をもたらすタンパク質をコードする自殺遺伝子を細胞に導入することで行われる。自殺遺伝子は、無毒性の化合物を高毒性の代謝物に選択的に変換する酵素をコードしてもよい。その結果、酵素を発現している細胞が特異的に除去される。いくつかの実施形態では、前記自殺遺伝子はヘルペス・ウイルス・チミジン・キナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、その引き金はガンシクロビル、ＡＰ１９０３（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓより購入可能）、又はＹＭ－１５５（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌより購入可能）である。他の実施形態では、前記自殺遺伝子は大腸菌シトシン・デアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子であり、その引き金は　５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である（Ｂａｒｅｓｅ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｔｈｅｒａｐ．　２０（１０）：１９３２－１９４３　（２０１２）、Ｘｕ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．　８：７３－８　（１９９８）、両方ともその全体が参照により本明細書に取り込まれる）。
　他の実施形態では、前記自殺遺伝子は誘導性カスパーゼ・タンパク質である。誘導性カスパーゼ・タンパク質は、アポトーシスを誘導することができるカスパーゼ・タンパク質の少なくとも一部を含む。好ましい実施形態では、前記誘導性カスパーゼ・タンパク質はｉＣａｓｐ９である。これは、一連のアミノ酸を介してヒト・カスパーゼ９をコードする遺伝子と連結した、Ｆ３６Ｖ突然変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）の配列を含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、低分子二量体化剤であるＡＰ１９０３に高い親和性で結合する。従って、本発明におけるｉＣａｓｐ９の自殺機能は、二量体化の化学誘導剤（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｉｎｄｕｃｅｒ　ｏｆ　ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ（ＣＩＤ））を投与することによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、前記ＣＩＤは低分子薬ＡＰ１９０３である。二量体化によって、アポトーシスが急速に誘導される（ＷＯ２０１１１４６８６２；Ｓｔａｓｉ　ｅｔ　ａｌ，　Ｎ．　Ｅｎｇｌ．　Ｊ．　Ｍｅｄ　３６５；１８　（２０１１）；Ｔｅｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｌ．　Ｂｌｏｏｄ　Ｍａｒｒｏｗ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．　１３：９１３－９２４　（２００７）　を参照のこと、それぞれは、その全体が参照により本明細書に取り込まれる）。
　自殺遺伝子の導入方法としては、所望の自殺遺伝子を含む遺伝子導入ベクターを使って細胞内に導入することができる。遺伝子導入ベクターとしては、ウイルスベクター、非ウイルスベクター等が挙げられる。ウイルスベクターの例としてはレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターがあり、レンチウイルスベクターが好ましい。非ウイルスベクターとしてはトランスポゾンベクターやプラスミドＤＮＡが挙げられる。別の方法として、ゲノム編集によって自殺遺伝子をゲノムＤＮＡに組み込むことによって、所望の細胞に自殺遺伝子を導入することもできる。
　驚くべきことに、本発明者らは、プロフェッショナル抗原提示細胞に放射線を照射する場合、そのプロフェッショナル抗原提示細胞の自己増殖能は喪失するが、Ｔ細胞の増殖を促進する能力を維持できる程度に放射線を照射したときに、そのプロフェッショナル抗原提示細胞を生体内に投与すると、少なくとも生体内投与後３から４日で生体内から消失することを見出した。
　本発明の放射線の照射用量としては、放射線を照射されたプロフェッショナル抗原提示細胞が、生体内投与後に３から４日で生体内から消失する範囲内であればいずれでもよい。例えば、５～１００Ｇｙ、１０～８５Ｇｙ、１０～７５Ｇｙ、１０～６５Ｇｙ、１０～５５Ｇｙ、などが挙げられる。好ましくは１０Ｇｙ～８５Ｇｙであり、より好ましくは１０Ｇｙ～７５Ｇｙであり、さらに好ましくは１０Ｇｙ～６５Ｇｙであり、特に好ましくは１０Ｇｙ～５５Ｇｙであり、最も好ましくは１０Ｇｙ～４０Ｇｙである。
　マウスｐＡＰＣに放射線を照射する場合、本発明の放射線の照射用量としては、５～８５Ｇｙが好ましく、１０～８５Ｇｙがより好ましく、２０～８５Ｇｙがさらに好ましく、２５～８５Ｇｙが特に好ましい。上記範囲内であれば、放射線を照射されたマウスｐＡＰＣは、生体内投与後に３から４日で生体内から消失する。
　ヒトｐＡＰＣに放射線を照射する場合、本発明の放射線の照射用量としては、５～８０Ｇｙが好ましく、１０～８０Ｇｙがより好ましく、２０～８０Ｇｙがさらに好ましく、２０～４０Ｇｙが特に好ましい。上記範囲内であれば、放射線を照射されたヒトｐＡＰＣは、生体内投与後に３から４日で生体内から消失する。
　Ｔ細胞とは、ＨＬＡ／ＭＨＣを介してｐＡＰＣから提示された抗原を認識して、細胞性免疫反応を起こすことにより異物と見なした細胞を傷害して死滅させるリンパ球である。ナイーブＴ細胞は造血幹細胞から分化した表面マーカーＣＤ３陽性の細胞集団であり、さらに共発現する表面マーカーによってＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８陽性キラーＴ細胞、Ｆｏｘｐ３陽性レギュラトリーＴ細胞等のサブタイプが存在する。本発明において、ｐＡＰＣにより誘導される細胞傷害性Ｔ細胞として、ｐＡＰＣに負荷した抗原に特異的なＣＤ８陽性キラーＴ細胞が特に望ましい。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、さらに、本明細書に記載の製造方法で製造される、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）、に関する。また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、本明細書に記載の製造方法で製造される、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）であって、放射線照射後に生体に投与されるとき、生体投与後少なくとも３～４日で生体から消失するプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）、に関する。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、ＣＤ１１ｂ／ｃが低発現となり、ＣＤ７４を発現する、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）、に関する。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、ＣＤ１１ｂ／ｃが低発現となり、ＣＤ７４およびＣＤ３３を発現する、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）、に関する。
　このプロフェッショナル抗原提示細胞は本明細書に記載の方法で製造可能である。
　ＣＤ１１ｂとは、細胞表面に発現するミエロイド細胞の分化マーカーである。抗ＣＤ１１ｂ抗体を用いて免疫染色を行いフローサイトメーターで分析することで検出することができる。
　ＣＤ１１ｃとは、細胞表面に発現する樹状細胞の分化マーカーである。抗ＣＤ１１ｃ抗体を用いて免疫染色を行いフローサイトメーターで分析することで検出することができる。
　ＣＤ３３とは、細胞表面に発現するミエロイド細胞の分化マーカーである。抗ＣＤ３３抗体を用いて免疫染色を行いフローサイトメーターで分析することで検出することができる。
　ＣＤ７４とは、クロスプレゼンテーションに関与する細胞表面に発現するマーカーである。抗ＣＤ７４抗体を用いて免疫染色を行いフローサイトメーターで分析することで検出することができる。
　発現するとは、陰性対照に対する陽性細胞の平均蛍光強度比が２倍以上とする。
低発現とは、陰性対照に対する陽性細胞の平均蛍光強度比が２倍以上～１０倍未満とする。
　本発明者らは、驚くべきことに、ＣＤ１１ｂおよびｃが低発現となり、ＣＤ７４又はＣＤ７４とＣＤ３３を発現するプロフェッショナル抗原提示細胞が、Ｔ細胞、特にＣＤ８を発現するナイーブＴ細胞を抗原非特異的に増殖促進することを初めて見出した。また本発明者らは、驚くべきことに、このプロフェッショナル抗原提示細胞に放射線を照射すると、生体内でＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進するが、このプロフェッショナル抗原提示細胞は投与後３から４日で生体から消失することを見出した。
　消失するとは、生体に投与した細胞が検出できない、または免疫的に排除されることをいう。具体的には、例えば以下の実施例８に記載の方法で、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングの撮影画像およびルシフェラーゼ発光の全フラックスの経時変化を確認し、検出限界以下であることにより確認できる。またルシフェラーゼに限らず蛍光色素や放射性化合物等を用い、同等の方法で確認することもできる。
　さらに、本発明の放射線照射後のプロフェッショナル抗原提示細胞を生体に投与したのち、その生体の血中サンプルからＣＤ１１ｂ／ｃが低発現であってCD３３とＣＤ７４を発現するT細胞が検出限界以下であることによっても確認できる。
　なお、本発明のプロフェッショナル抗原提示細胞やＣＤ１１ｂ／ｃが低発現であってＣＤ３３とＣＤ７４を発現するＴ細胞を確認できる方法であればどのような方法を用いてもよく、それらの方法で当該抗原提示細胞やT細胞の存在を検出できない場合には、本発明のプロフェッショナル抗原提示細胞が消失したと判断できる。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、さらに、自己増殖能を有し、かつ、
アポトーシス抵抗性を示す、上述のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）、に関する。
　このプロフェッショナル抗原提示細胞は本明細書に記載の方法で製造可能である。
　自己増殖能とは、細胞自身が産生して自己分泌するサイトカインによって、細胞増殖のシグナルを活性化して細胞増殖を行う能力を有することである。自己増殖能は、サイトカインを含まない、例えば１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ－１６４０培地などの培養液を用いて播種した細胞が増殖することによって確認することが出来る。細胞増殖の確認方法としては、培養前後の細胞数計測、ＭＴＴアッセイ、［３Ｈ］―チミジンの取り込み活性などで評価することが出来る。
　アポトーシス抵抗性とは、アポトーシスによる細胞死を回避できる性質である。アポトーシス抵抗性は、細胞死を検出することが出来る蛍光色素標識試薬ＦＩＴＣ標識Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ、７－ＡＡＤおよびＰＩを用いて細胞を染色した後にフローサイトメーターで分析することで評価することが出来る。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、さらに、上述のプロフェッショナル抗原提示細胞またはＧＭ－ＣＳＦと、ＣＤ８を発現するナイーブＴ細胞を生体外で共培養し、生体内および生体外で、抗原非特異的又は抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法、に関する。
　さらに、本発明の１つの実施形態として、本発明は、上述の抗原非特異的または抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法を用いて抗原非特異的または抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞を製造する方法、に関する。
　このプロフェッショナル抗原提示細胞は本明細書に記載の方法で製造可能である。
　また、本発明者らは、驚くべきことに、ＧＭ－ＣＳＦのみでも、Ｔ細胞、特にＣＤ８を発現するＴ細胞を抗原非特異的に増殖の促進ができることを見出した。
　ＣＤ８を発現するナイーブＴ細胞とは、Ｔ細胞の細胞表面マーカーであるＣＤ３を発現する細胞集団のうち、抗原刺激を受けていないものである。抗原非特異的なＴ細胞とは、特定の抗原を認識するＴ細胞受容体を持つＴ細胞の集団に偏ることなく、Ｔ細胞受容体の多様性を有する状態を維持したＴ細胞集団である。
　さらに、このプロフェッショナル抗原提示細胞は、所望の抗原を負荷したプロフェッショナル抗原提示細胞でもよい。
　抗原特異的なＴ細胞とは、所望の抗原を負荷した抗原提示細胞の刺激によって特定の抗原を特異的に認識するＴ細胞受容体を発現するＴ細胞である。
　本発明において「抗原」とは、当該抗原に特異的な免疫反応、特に、細胞免疫反応を惹起することができる全てのタンパク質、糖鎖その他の分子をいう。本発明の抗原は、がん細胞、神経変性その他の組織変性を起こした細胞、生理的または病理的なプロセスを経て生体に有害な反応を起こすようになった細胞などの生体にとって有害な自己細胞を除去するためにこれらの細胞に特異的な細胞免疫を惹起する抗原が好ましい。本発明では、特にがん特異的抗原であることが好ましい。
　本発明において「がん特異的抗原」とは、ある特定の細胞タイプの細胞が悪性化して増殖するときにだけ発現するタンパク質、糖鎖その他の分子であって、このような悪性化した細胞が存在しない生体では存在しない抗原を指す。正常発生では胚または胎児期までしか発現しないが、がん細胞では発現する、いわゆるがん胎児抗原は典型的ながん特異的抗原のひとつである。
　またさらに、このプロフェッショナル抗原提示細胞は、生体外で放射線を照射されたものでもよい。
　本発明のプロフェッショナル抗原提示細胞に上述の方法で放射線を照射することにより、当該細胞を生体投与後、生体内で抗原特異的又は非特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進するが、このプロフェッショナル抗原提示細胞は生体に投与後３から４日で生体から消失されることができる。
　また、本発明の１つの実施形態として、本発明は、さらに上述のプロフェッショナル抗原提示細胞を含む、ＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を誘導するための医薬組成物、に関する。
　本発明において、「Ｔ細胞の増殖を誘導するための医薬組成物」とは、Ｔ細胞の増殖を誘導するための医薬組成物をいう。本発明では、細胞増殖に関して休眠状態またはそれに近い状態にある、ナイーブなＴ細胞に作用して増殖を誘導するための医薬組成物を指し、Ｔ細胞の増殖を促すサイトカインそのものや、当該サイトカインを産生分泌する細胞と、単に増殖を誘導するのにとどまらず、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞として細胞傷害性を備えて増殖するＴ細胞を誘導する医薬組成物も含む。この医薬組成物により、生体内の免疫を賦活化することができる。
　また、本発明の1つの実施形態として、本発明は、上述のプロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を負荷すること、前記抗原を負荷したプロフェッショナル抗原提示細胞に放射線を照射すること、前記放射線を照射されたプロフェッショナル抗原提示細胞およびＣＤ８を発現するナイーブＴ細胞を生体外で共培養し当該抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進すること、を含む、体内に投与するためのＣＤ８を発現するＴ細胞の製造方法および本方法で製造されたＣＤ８を発現するＴ細胞、を含む。
　本方法により製造されたＣＤ８を発現するＴ細胞は、体内に投与されうる。本方法の放射線を照射されたプロフェッショナル抗原提示細胞は、生体投与後３から４日で生体から消失しうる。本方法により製造されたＣＤ８を発現するＴ細胞は、前記プロフェッショナル抗原提示細胞に負荷された抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞でもよく、また当該抗原はがん特異的抗原であってもよい。
　本発明のプロフェッショナル抗原提示細胞またはＣＤ８を発現するＴ細胞は、抗がん剤および/または他のがん治療方法と併用できる。
　また、本発明のプロフェッショナル抗原提示細胞またはＣＤ８を発現するＴ細胞は、免疫チェックポイント阻害剤と併用できる。
　本明細書において、抗がん剤および／または他のがんの治療方法には、がん細胞を物理的に摘出除去する外科手術療法と、アルキル化薬、白金化合物、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害薬、微小管阻害薬、抗生物質を含むが、これらに限られない、化学物質を投与する化学療法および化学療法剤と、がん細胞を非自己として免疫細胞が攻撃する免疫療法および免疫療法剤と、エックス線、電子線、ガンマ線、中性子線を含むがこれらに限られない放射線の照射によりがん細胞の増殖を阻害し、死滅させる放射線療法とを含むが、これらに限られない。がんを治療するための化学療法薬には、６－Ｏ－（Ｎ－クロロアセチルカルバモイル）フマギロール、ブレオマイシン、メトトレキサート、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、アドリアマイシン、ネオカルチノスタチン、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、テトラヒドロフリル－５－フルオロウラシル、ピシバニール、レンチナン、レバミゾール、ベスタチン、アジメキソン、グリチルリチン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ブレオマイシン、硫酸ヘプロマイシン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、塩酸イリノテカン、シクロフォスファミド、メルファラン、ブスルファン、チオテパ、塩酸プロカルバジン、シスプラチン、アザチオプリン、メルカプトプリン、テガフール、カルモフール、シタラビン、メチルテストステロン、プロピオン酸テストステロン、エナント酸テストステロン、メピチオスタン、ホスフェストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸リュープロレリン、酢酸ブセレリン等を含む。前記他の治療方法は、がん組織を外科的手術によって摘出除去すること、および／または、がん細胞を殺傷する放射線を照射することを含むこともできる。
　本明細書において、免疫チェックポイント阻害剤には、抗原の提示によるＴ細胞の活性を抑制する免疫チェックポイント分子に結合し、そのシグナル伝達を阻害することで、がんの増殖を抑える抗がん剤である。免疫チェックポイント分子には、免疫チェックポイントとして機能する受容体とリガンドの両者が含まれ得る。
　本発明の一実施形態において、「免疫チェックポイント阻害剤」には、これに限定されるものではないが、例えば、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合または相互作用、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＴＬＡ４との結合または相互作用、ＣＤ１３７ＬとＣＤ１３７との結合または相互作用、ＭＨＣとＬＡＧ－３／ＫＩＲとの結合または相互作用、ＣＤ４８とＣＤ２４４とのとの結合または相互作用、ＧＡＬ９とＴＩＭ３との結合または相互作用、ＨＶＥＭとＢＴＬＡ／ＣＤ１６０との結合または相互作用、ＣＤ４０ＬとＣＤ４０との結合または相互作用、ＯＸ４０ＬとＯＸ４０との結合または相互作用、およびＧＩＴＲＬとＧＩＴＲとの結合または相互作用を阻害することができる任意の抗体または化合物が含まれる。
　本発明の別の実施形態において、「免疫チェックポイント阻害剤」は、これに限定されるものではないが、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗Ｂ７抗体、抗Ｃ２７抗体、抗ＫＩＲ抗体、ＩＤＯ阻害薬、抗ＣＤ１３７抗体、および抗ＴＩＭ３抗体よりなる群から選択される。
　本発明のさらに別の実施形態において、「免疫チェックポイント阻害剤」は、これに限定されるものではないが、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ピジリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＢＭＳ－９３６５５９、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、エノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、ヴァルリルマブ（Ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、エパカドスタット（Ｅｐａｃａｄｏｓｔａｔ）、ウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）、およびＴＳＲ－０２２から選択される。
　本発明のさらに別の実施形態において、「免疫チェックポイント阻害剤」は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－１抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体が好ましく、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体がより好ましい。
　本明細書において言及される全ての文献と、本願の基礎出願の特願2020-084821並びに特願2020-149486の明細書及び図面とは、その全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除および置換を行うことができる。
　実施例１：ヒトｉＰＳＣに由来する胚様体の作製
　Ｋｉｔａｙａｍａ，　Ｓ．ら（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ．　６：　２１３－２２７，（２０１６））に記載の方法でヒトｉＰＳＣを作製した。ヒトｉＰＳＣの維持培養は、再生医療用培地ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（味の素ヘルシーサプライ）を用いて、ｉＭａｔｒｉｘ５１１（ニッピ）をコートしたポリスチレン製組織培養プレートにて行った。１～２日毎に培地交換を実施して、細胞の増殖に応じて週に一度、細胞剥離液ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（ライフテクノロジーズ）を用いて４～５分間処理して単細胞分散液として回収し、適当な大きさの培養容器へ播種して培養を継続した。播種したｉＰＳＣはＲｏｃｋ阻害剤１０μＭ　Ｙ－２７６３２（和光純薬）の存在下で一晩培養して、翌日に培地交換してＹ－２７６３２を除去した。
　ヒトｉＰＳＣに由来する胚様体（以下ヒトＥＢと記載する）の作製は、６穴プレートタイプの細胞塊形成培養容器ＥＺ　ＳＰＨＥＲＥ　ＳＰ（ＡＧＣテクノグラス）に、１０μＭ　Ｙ－２７６３２を含有するＳｔｅｍＦｉｔで調製した所定密度のヒトｉＰＳＣを播種することで行った。直径５０～２００μｍの胚様体形成後１～４日後に後述の実施例３の分化誘導培養を行った。
　実施例２：マウスｉＰＳＣに由来する胚様体の作製
　Ａｒａｋｉ，　Ｒ．ら（Ｎａｔｕｒｅ、４９４：１００－１０４．（２０１３））に記載の方法でマウスｉＰＳＣを作製した。マウスｉＰＳＣの維持培養は、ＥＳ細胞用培地ＥＳＭ（１５％ＫＳＲ（ライフテクノロジーズ）含有ＤＭＥＭ（和光純薬））に終濃度５５μＭ　２－メルカプトエタノール（ライフテクノロジーズ）および１０４Ｕ／ｍＬ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＬＩＦ）（メルク、商品名ＥＳＧＲＯｍＬＩＦ）を添加して調製した完全培地ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＥＳＭ　（ｃＥＳＭ）を用いて、６穴組織培養プレート上に播種したマウス胎児線維芽細胞ＭＥＦ（リプロセル）のフィーダー細胞上で行った。
　フィーダー細胞は、ゼラチンをコートしたディッシュにＭｉｔｏｍｙｃｉｎ　Ｃ処理によって細胞増殖を停止させたＭＥＦ（リプロセル）を播種して調製し、ＭＥＦが接着した翌日以降にマウスｉＰＳＣの維持培養に使用した。
　マウスｉＰＳＣに由来する胚様体（以下マウスＥＢと記載する）の作製は、６穴プレートタイプのＥＺ　ＳＰＨＥＲＥに完全培地ｃＥＳＭで調製した所定密度のマウスｉＰＳＣを播種することで行った。直径５０～２００μｍの胚様体形成後１～４日後に後述の実施例３の分化誘導培養を行った。
　実施例３：胚様体のミエロイド系細胞への分化誘導
　（１）フィーダー細胞の調製
　マウス由来の培養細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＯＰ９を、ゼラチンをコートしたディッシュに播種し、その細胞株を翌日に使用した。ヒトｉＰＳＣに由来する胚様体の分化誘導に用いるフィーダー細胞は、放射線６０Ｇｙを照射して増殖を停止させてから使用した。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の培養には１０％ＦＢＳを含有するＢＭＥ培地（ライフテクノロジーズ）を、ＯＰ９細胞の培養には２０％ＦＢＳを含有するαＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ）を用いた。
　（２）マウスｉＰＳＣのオンフィーダー分化誘導培養
　マウスｉＰＳＣから作製したマウスＥＢを、分化誘導培地２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭを用いてフィーダー細胞ＯＰ９上で７～１０日間培養した後に、回収した細胞を新しく調製したＯＰ９フィーダー上に再播種した。５５μＭ　２－メルカプトエタノール、５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦ存在下で７～１０日間培養してミエロイド細胞を含む分化細胞を得た。
　（３）ヒトｉＰＳＣのオンフィーダー分化誘導培養
　ヒトｉＰＳＣから作製したヒトＥＢを、分化誘導培地として２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭを用いて、２０ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦの存在下、フィーダー細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２上で７～１０日間培養した。その後、２０ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌｔ－３Ｌ、１０ｎｇ／ｍＬ　ＴＰＯおよび２０ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－３の存在下で７～１０日間培養し、回収した細胞を新しく調製したＯＰ９フィーダー上に再播種した。その再播種した細胞を、５０ｎｇ／ｍＬ　ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌｔ－３Ｌ及び５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦの存在下で７～１０日間培養してミエロイド細胞を含む分化細胞を得た。
　（４）ヒトｉＰＳＣのフィーダーフリー分化誘導培養
　ヒトｉＰＳＣから作製したヒトＥＢを、分化誘導培地Ｘ－ＶＩＶＯ１５（ロンザ）を用いて、５０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　ＢＭＰ－４、５０ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ　ＳＣＦの存在下で５～７日間培養した。その後、５０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌｔ－３Ｌ、１０ｎｇ／ｍＬ　ＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－３および５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦの存在下で７～１０日間培養した。その後、５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　ＳＣＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ　Ｆｌｔ－３Ｌの存在下で７～１０日間培養してミエロイド細胞を含む分化細胞を得た。他の成長因子などにも影響されることがあるが、０．２ｎｇ／ｍＬから２００ｎｇ／ｍＬの範囲内の任意の２つの濃度を上限および下限とすることができ、例えば、０．２ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬ、のうちの任意の２つの濃度を上限および下限とすることができる。
　実施例４：増殖遺伝子の導入による増殖ミエロイド細胞ｐＭＣの作製
　（１）レンチウイルスベクターの調製
　米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のデータベースの配列情報を用いて、遺伝子合成によってヒトｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２のｃＤＮＡを合成した。各遺伝子のｃＤＮＡ断片をレンチウイルスベクターｐＳＬまたはＣＤＩＩ－ＥＦ－ＭＳＣ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｅｕｓへ挿入した。リポフェクション法を用いて、上記で作製したレンチウイルスベクターｐＳＬまたはＣＤＩＩ－ＥＦ－ＭＳＣ－ＩＲＥＳ２－Ｖｅｎｅｕｓに導入した遺伝子の各々とパッケージングコンストラクトｐＣＡＧ－ＨＩＶｇｐおよびエンベロープおよびＲｅｖのコンストラクトｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇ－ＲＳＶ－Ｒｅｖをパッケージング細胞（ウイルス産生細胞）である２９３Ｔ細胞へ導入した。
　２９３Ｔ細胞への遺伝子導入の３日後に、細胞培養液を回収し、細孔径０．４５μｍのフィルターでろ過した後、Ｌｅｎｔｉ－Ｘコンセントレーター（クロンテック）によって、ウイルス粒子を濃縮して回収した。回収した組換えウイルス粒子はＤＭＥＭ溶液に懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃環境下で保管した。
　（２）ｉＰＳＣ由来ミエロイド細胞への増殖遺伝子導入による増殖能の付与
　前項で作製したミエロイド細胞を４８穴組織培養プレートで培養し、そこへマウスミエロイド細胞の場合はｃ－ＭＹＣを発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。また、ヒトミエロイド細胞の場合はｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、およびＭＤＭ２を発現するレンチウイルス懸濁液を同時に加えることにより、感染させた。遺伝子導入の翌日より、細胞の増殖に応じて培養液を追加しつつ、培養スケールの拡大を行った。ウイルス感染後のミエロイド細胞の培養液として２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭを用いて、５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ　Ｍ－ＣＳＦ存在下で感染後の細胞の培養を行った。遺伝子導入を行った細胞は、３ヶ月以上に渡り増殖を続けた。このようにして作製した増殖能を持つミエロイド細胞を増殖ミエロイド細胞（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｃｅｌｌ、ｐＭＣ）と名付けた。
　（３）ｐＭＣの増殖におけるＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの必要性の検討
　遺伝子導入後、２週間以上に培養を継続した後のｐＭＣを回収して９６穴組織培養プレートに播種し（２×１０３細胞／ｗｅｌｌ）培養を行った。そして、培養液中にＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦが含まれている場合と含まれていない場合とで増殖の速度を比較した。
　９６穴組織培養プレートでの培養開始直後から、２４時間ごとに３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ　（ＭＴＴ）試薬（メルク）０．５ｍｇ／ｍＬを添加し、その４時間後に代謝されたホルマザンを波長５９５ｎｍの吸光度により測定した。代謝されたホルマザンの量はＭＴＴ試薬添加時点における細胞数、すなわち細胞増殖の速度に比例する。
　図１にＭＴＴアッセイの測定結果を示す。この結果から、ｐＭＣの増殖には培養液中に５０ｎｇ／ｍＬ程度のＧＭ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦが必要であった。また、ＧＭ－ＣＳＦとＭ－ＣＳＦを併用することで、増殖を促進する効果があった。
　（４）ｐＭＣの形態および表面抗原解析
　得られたｐＭＣはｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１、ＭＤＭ２の導入による細胞形態の変化は見られず、ミエロイド系細胞の示す突起を持った歪な形態を保持していた。
　ｐＭＣをピペッティング操作により回収し、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体および抗ＣＤ３３抗体、あるいは、アイソタイプ適合対照抗体を用いて染色した。その後、細胞を２％ＦＢＳ含有ＰＢＳまたはＰＢＳを用いて２回洗浄した。洗浄後の細胞をフローサイトメーター解析装置（商品名：ＢＤ　Ａｃｃｕｒｉ　Ｃ６　Ｆｌｏｗ　Ｃｕｔｏｍｅｔｅｒ，　Ｂｅｃｋｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて分析した。図２に抗体染色後のフローサイトメーターによる表面抗原解析の結果を示す。この解析の結果から、ｐＭＣは、分化細胞で発現が見られていたＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃの細胞表面上の発現が低下していることが分った。また、ｐＭＣは生理的に存在するミエロイド細胞のマーカーであるＣＤ３３を細胞表面上に発現していることが分った。
　実施例５：ｉＰＳＣ由来プロフェッショナル抗原提示細胞（ｉｐＡＰＣ）の作製
　（１）レンチウイルスベクターの調製（ヒト）
　遺伝子合成によってヒトＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦのｃＤＮＡを合成し、実施例４（１）と同様に各遺伝子のｃＤＮＡ断片をレンチウイルスベクターｐＳＬへ挿入したのちに、ウイルス粒子を調製した。回収した組換えウイルス粒子はＤＭＥＭ溶液に懸濁した後、クライオバイアルに分注し、－１５０℃環境下で保管した。
　（２）ｉＰＳＣ由来ｐＭＣへのＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ遺伝子の導入（ヒト・マウス）
　実施例４（２）で作製したヒト増殖ミエロイド細胞ｐＭＣを４８穴組織培養プレートで培養し、そこへヒトＧＭ－ＣＳＦのみ、ヒトＭ－ＣＳＦのみ、あるいはヒトＧＭ－ＣＳＦ及びヒトＭ－ＣＳＦを発現するレンチウイルス懸濁液を加えることにより、感染させた。また同様に、実施例４（２）で作製したマウス増殖ミエロイド細胞ｐＭＣを４８穴組織培養プレートで培養し、そこへマウスＧＭ－ＣＳＦのみを発現するレンチウイルス懸濁液を加えることにより、感染させた。
　遺伝子導入の翌日より、細胞の増殖に応じて培養液を追加しつつ、培養スケールの拡大を行った。培養液には２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭを用いて、５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ　ヒトＭ－ＣＳＦ存在下で培養を行った。なお、ヒト増殖ミエロイド細胞ｐＭＣにはヒトのＧＭ－ＣＳＦを、マウス増殖ミエロイド細胞ｐＭＣにはマウスのＧＭ－ＣＳＦを用いた。
　遺伝子導入を行った細胞は、培養液にサイトカインＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを外因性に添加せずとも、細胞自身の産生するＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦによって自己増殖した。このようにして作製した自己増殖能を持つｐＭＣをｉＰＳＣ由来プロフェッショナル抗原提示細胞－ＧＭＭ（ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭ）と名付けた。また、同様に、細胞自身が産生するＧＭ－ＣＳＦによって自己増殖能を持つｐＭＣをｉｐＡＰＣ－ＧＭ、細胞自身が産生するＧＭ－ＣＳＦによって自己増殖能を持つｐＭＣをｉｐＡＰＣ－Ｍと名付けた。
　（３）ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭに導入したサイトカインＧＭ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦ産生量の検討（マウスおよびヒト）
　上記のマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭにおけるＧＭ－ＣＳＦ、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭにおけるＧＭ－ＣＳＦ、ｉｐＡＰＣ－ＭにおけるＭ－ＣＳＦ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭにおけるＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの発現をフローサイトメーターで調べた。レンチウイルスベクターに組込んだマウスＧＭ－ＣＳＦ　ｃＤＮＡ３’末端側の核酸配列に、ＩＲＥＳ配列を介して蛍光タンパク質であるＶｅｎｕｓを発現させた。これにより、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭにおけるＧＭ－ＣＳＦの発現をＶｅｎｕｓの蛍光を指標としてフローサイトメーターにより解析することが可能になる。ヒトＧＭ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦ　ｃＤＮＡ３’末端側の核酸配列には、活性化ドメインを有さないトランケートｄＣＤ１９を発現させた。これにより、蛍光色素を標識した抗ＣＤ１９抗体を用いて調べたｄＣＤ１９の発現を指標として、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭにおけるＧＭ－ＣＳＦ、ｉｐＡＰＣ－ＭにおけるＭ－ＣＳＦ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭにおけるＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの発現を解析することが可能になる。図３に、マウスｐＭＣおよびｉｐＡＰＣ－ＧＭにおけるＧＭ－ＣＳＦ－Ｖｅｎｕｓの発現、ヒトｐＭＣおよびｉｐＡＰＣ－ＧＭにおけるＧＭ－ＣＳＦ－ｄＣＤ１９、ｉｐＡＰＣ－ＭにおけるＭ－ＣＳＦ－ｄＣＤ１９、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭにおけるＧＭ－ＣＳＦ－Ｍ－ＣＳＦ－ｄＣＤ１９の発現をフローサイトメーターで調べた結果を示す。サイトカイン導入前のｐＭＣと比較して、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭはＶｅｎｕｓ蛍光を発すること、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭはＣＤ１９を発現することが分かる。
　マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ、またはヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭを、２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭを用いて外因性のサイトカインを添加せずに、一定の細胞密度（１×１０５～１×１０６／ｍＬ）を維持しつつ培養を行った。前述の培養によって得た培養上清中のＧＭ－ＣＳＦを、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によって定量した結果を図４に示す。対照となるｐＭＣからはＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦが産生されていないが、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭからは１５０ｎｇ／ｍＬ程度のＧＭ－ＣＳＦ、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭからは４０ｎｇ／ｍＬ程度のＧＭ－ＣＳＦ、ヒトｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭからは１５ｎｇ／ｍＬ程度のＭ－ＣＳＦが産生されていた。マウスｐＭＣはＧＭ－ＣＳＦに、ヒトｐＭＣはＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦに依存した細胞増殖を示すので、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭは自己増殖に足るＧＭ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦを産生していることが分かった。
　（４）ｉｐＡＰＣ－ＧＭの自己増殖能と増殖におけるＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの必要性の検討（ヒト・マウス）
　上記のようにして得たマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ、またはオンフィーダー分化誘導由来ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭを回収して９６穴組織培養プレートに播種し（２×１０３細胞／ｗｅｌｌ）培養を行った。この際、培養液中に５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦのみ、５０ｎｇ／ｍＬ　Ｍ－ＣＳＦのみ、または５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ　Ｍ－ＣＳＦが含まれている場合と、いずれも含まない場合とでＭＴＴアッセイにより増殖の速度を比較した。
　図５にマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭに対するＭＴＴアッセイの測定結果を示す。この結果から、培養液中にＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦを含まない場合であってもｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびｉｐＡＰＣ－ＧＭＭが増殖していることが分かった。よって、ｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびｉｐＡＰＣ－ＧＭＭはサイトカインを添加せずに自己増殖することが分かった。また、培養液中にＧＭ－ＣＳＦを外因性に添加しても増殖促進は見られなかった。一方で、５０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦを培養液中に添加することでｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびｉｐＡＰＣ－ＧＭＭの増殖を促進する効果があることが分かった。
　（５）ｉｐＡＰＣ－ＧＭの形態（マウス）
　実施例５（２）で作製したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭは、ＧＭ－ＣＳＦの導入による細胞形態の変化は見られず、突起を有するミエロイド様細胞の形態をしていた。
　（６）ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭの形態および樹状細胞の表面抗原解析（ヒト）
　実施例５（２）で作成したヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭは、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭと同様に、ＧＭ－ＣＳＦおよびＭ－ＣＳＦの導入による細胞形態の変化は見られなかった。
　５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ　Ｍ－ＣＳＦ含有２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭ培地を用いて、実施例５（２）で作成したｉｐＡＰＣ－ＧＭＭ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍを１２穴組織培養プレートに播種して培養した。サイトカイン不含１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて、樹状細胞（ＤＣ）を１２穴組織培養プレートに播種し、４８時間培養した。ＤＣは、健常人ドナー採血由来ＣＤ１４陽性単球細胞を５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ　ＩＬ－４存在下で５日間培養することで誘導した。回収した細胞を抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体、抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８３抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＣＲ７抗体、抗ＣＤ７４抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、および抗ＣＤ３３抗体または、アイソタイプ適合抗体を用いて染色し、フローサイトメーターで分析した。
　図６にヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、およびｉｐＡＰＣ－ＧＭＭの表面抗原分析の結果を示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭは、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ７４、ＣＤ３３陽性であり、ＣＤ４０、ＣＤ８０低発現、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ低発現～陽性、ＣＤ８３、ＣＣＲ７陰性であった。陽性はアイソタイプ適合抗体の平均蛍光強度に対する表面マーカーの強度比（ＲＦＩ）が１０倍以上であることを示す。低発現はＲＦＩが２倍以上１０倍未満であることを示す。陰性とは２倍未満であることを示す。
　図７にＤＣの表面抗原分析の結果を示す。ＤＣは、低発現のＣＤ８３、ＣＣＲ７を除く全てのマーカーに陽性であることが分かった。この結果から、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭは、抗原提示分子ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＨＬＡ－ＤＲ、および共刺激分子ＣＤ８６を発現し、クロスプレゼンテーションに重要なＣＤ７４をＤＣと同様に発現することが分かる。
　（７）マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭの網羅的遺伝子発現解析
　実施例５（２）で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭに対して全トランスクリプトーム解析であるＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行い、転写産物の発現定量化を行った。マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ、マウスｐＭＣおよびマウスｐＭＣに外因性のＧＭ－ＣＳＦを添加した３種類の細胞から、ＱＩＡＧＥＮ　ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉ　ｋｉｔを用いてトータルＲＮＡを抽出して、次世代シーケンサーＢＧＩＳＥＱ（ＢＧＩ）を用いてシーケンスし、主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ；　ＰＣＡ）および遺伝子セットエンリッチメント解析（Ｇｅｎｅ　Ｓｅｔ　Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ；　ＧＳＥＡ）を行った。
　図８に、ＰＣＡの結果を示した。この図は多変量解析によって得られた寄与率の高い２軸（ＰＣ１、ＰＣ２）に対して、マウスｐＭＣ、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびＧＭ－ＣＳＦ添加マウスｐＭＣのプロファイルをプロットしたものである。マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭの遺伝子発現プロファイルは、マウスｐＭＣ、およびＧＭ－ＣＳＦ添加マウスｐＭＣと顕著に分離したプロファイルを示すことが分かった。
　図９は、マウスｐＭＣとＧＭ－ＣＳＦ添加マウスｐＭＣに対するマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭの　ＧＳＥＡの結果を示す。マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭで顕著に発現の増加が見られた遺伝子セットとして、細胞周期やその過程、細胞分裂やその制御に関与する転写産物が検出されることが分かった。具体的には、細胞周期に関与する遺伝子として、ＸＲＣＣ２、ＫＮＴＣ１、ＴＴＫ、ＰＫＭＹＴ１、ＡＵＲＫＡ、ＨＭＧＮ５、ＡＮＫＬＥ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＭＣＭ８、ＣＤＣ４５、ＭＣＭ７、ＣＤＣＡ５、ＣＡＢＬＥＳ１、ＣＤＣ６、ＣＤＫ１、ＳＧＯＬ１、ＴＰＸ２、ＮＵＳＡＰ１、ＴＡＣＣ３、ＵＢＥ２Ｃ、ＭＣＭ５、ＯＳＭ、ＵＨＲＦ１、ＣＣＮＤ１、ＡＢＣＢ１Ａ、ＡＰＩＴＤ１、ＮＳＬ１、ＤＳＣＣ１、ＨＡＵＳ５、ＦＯＸＭ１、ＣＨＥＫ１、ＫＩＦ４、ＢＵＢ１、ＳＫＡ１、ＥＲＣＣ６Ｌ、ＲＥＣＱＬ４、ＧＩＮＳ１、ＥＸＯ１、ＣＥＮＰＮ、ＭＫＩ６７、ＤＬＧＡＰ５、ＫＩＦ１８Ａ、ＳＹＣＥ２、ＢＩＲＣ５、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ２５Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＧＳＧ２、ＣＥＮＰＨ、ＦＡＭ６４Ａ、ＥＰＳ８、ＮＵＰ６２、ＲＡＳＳＦ１、ＫＩＦ２０Ｂ、ＣＥＮＰＴ、ＵＴＰ１４Ｂや、細胞周期過程に関与する遺伝子として、ＨＡＵＳ５、ＸＲＣＣ２、ＦＯＸＭ１、ＫＮＴＣ１、ＴＴＫ、ＡＵＲＫＡ、ＣＨＥＫ１、ＨＭＧＮ５、ＡＮＫＬＥ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＣＤＣ４５、ＫＩＦ４、ＢＵＢ１、ＳＫＡ１、ＣＤＣＡ５、ＣＡＢＬＥＳ１、ＥＲＣＣ６Ｌ、ＲＥＣＱＬ４、ＧＩＮＳ１、ＣＤＣ６、ＣＥＮＰＮ、ＣＤＫ１、ＭＫＩ６７、ＳＧＯＬ１、ＴＰＸ２、ＫＩＦ１８Ａ、ＮＵＳＡＰ１、ＳＹＣＥ２、ＢＩＲＣ５、ＣＤＣ２０、ＣＤＫＮ３、ＵＢＥ２Ｃ、ＴＡＣＣ３、ＣＤＣ２５Ｃ、ＧＳＧ２、ＣＥＮＰＨ、ＯＳＭ、ＦＡＭ６４Ａ、ＣＣＮＤ１、ＡＢＣＢ１Ａ、ＥＰＳ８、ＮＵＰ６２、ＡＰＩＴＤ１、ＮＳＬ１、ＲＡＳＳＦ１、ＫＩＦ２０Ｂ、ＣＥＮＰＴ、ＤＳＣＣ１、有糸細胞分裂に関与する遺伝子として、ＸＲＣＣ２、ＨＡＵＳ５、ＦＯＸＭ１、ＫＮＴＣ１、ＴＴＫ、ＡＵＲＫＡ、ＣＨＥＫ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＣＤＣ４５、ＫＩＦ４、ＢＵＢ１、ＳＫＡ１、ＣＤＣＡ５、ＣＡＢＬＥＳ１、ＥＲＣＣ６Ｌ、ＧＩＮＳ１、ＣＤＣ６、ＣＤＫ１、ＣＥＮＰＮ、ＭＫＩ６７、ＳＧＯＬ１、ＴＰＸ２、ＫＩＦ１８Ａ、ＮＵＳＡＰ１、ＢＩＲＣ５、ＣＤＣ２０、ＣＤＫＮ３、ＵＢＥ２Ｃ、ＴＡＣＣ３、ＣＤＣ２５Ｃ、ＧＳＧ２、ＣＥＮＰＨ、ＦＡＭ６４Ａ、ＣＣＮＤ１、ＡＢＣＢ１Ａ、ＥＰＳ８、ＮＵＰ６２、ＡＰＩＴＤ１、ＮＳＬ１、ＫＩＦ２０Ｂ、ＣＥＮＰＴ、ＤＳＣＣ１、有糸細胞分裂の制御に関与する遺伝子として、ＨＡＵＳ５、ＦＯＸＭ１、ＫＮＴＣ１、ＴＴＫ、ＡＵＲＫＡ、ＣＨＥＫ１、ＫＩＦ２Ｃ、ＣＤＣ４５、ＫＩＦ４、ＢＵＢ１、ＳＫＡ１、ＣＤＣＡ５、ＣＡＢＬＥＳ１、ＥＲＣＣ６Ｌ、ＧＩＮＳ１、ＣＤＣ６、ＣＤＫ１、ＣＥＮＰＮ、ＳＧＯＬ１、ＴＰＸ２、ＫＩＦ１８Ａ、ＮＵＳＡＰ１、ＢＩＲＣ５、ＣＤＣ２０、ＣＤＫＮ３、ＵＢＥ２Ｃ、ＴＡＣＣ３、ＣＤＣ２５Ｃ、ＧＳＧ２、ＣＥＮＰＨ、ＦＡＭ６４Ａ、ＣＣＮＤ１、ＡＢＣＢ１Ａ、ＥＰＳ８、ＮＵＰ６２、ＡＰＩＴＤ１、ＮＳＬ１、ＫＩＦ２０Ｂ、ＣＥＮＰＴ、ＤＳＣＣ１等の発現がｉｐＡＰＣ－ＧＭにおいて上昇することが分かった。
　（８）ｉｐＡＰＣ－ＧＭのアポトーシス分析
　実施例５（２）で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ、およびヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭを蛍光標識Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖおよび７－Ａｍｉｎｏ－Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ　Ｄ（７－ＡＡＤ）を用いて細胞死を解析した。Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖは細胞膜成分のリン脂質であるホスファチジルセリン（ＰＳ）に特異的に結合するタンパク質である。生細胞は細胞表面にＰＳを露出していないが、アポトーシスによる細胞膜の反転によりＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖが結合する。７－ＡＡＤは後期アポトーシスやネクローシスによって細胞膜が崩壊した死細胞に透過し、ＤＮＡ鎖にインターカレートして赤色蛍光を発する。このようにして、培養中の細胞のアポトーシスを解析することが出来る。
　マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびマウスｐＭＣ、または、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭおよびヒトｐＭＣを２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭで外因性のサイトカインを添加せずにマウス由来細胞は４日間、ヒト由来細胞は３日間培養した。上記の条件で培養した細胞を１日毎にサンプリングして、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖおよび７－ＡＡＤで染色後にフローサイトメーターで分析した。図１０Ａに、マウス由来細胞についてフローサイトメーターで解析した結果をサイトグラムで示す。培養４日目（Ｄａｙ４）において、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭは対照細胞であるマウスｐＭＣに比較して細胞死を示すＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖおよび７－ＡＡＤの陽性率が低く維持されていることが分かった。図１０Ｃに、ヒト由来細胞についてフローサイトメーターで解析した結果をサイトグラムで示す。培養３日目（Ｄａｙ３）において、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭ、ｉｐＡＰＣ－ＭはマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭと同様にヒトｐＭＣに比較して細胞死を示すＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖおよび７－ＡＡＤの陽性率が低く維持されていることが分かった。一方で、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭはヒトｐＭＣと同様に細胞死の頻度が高いことが分かった。図１０Ｂ（マウス由来細胞）および図１０Ｄ（ヒト由来細胞）にサイトグラムで四象限のゲートで分けられた生細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞の比率の経時変化の折れ線グラフを示す。マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭ、ヒトｉｐＡＰＣ－Ｍの生細胞率は培養期間中に高く、アポトーシス細胞の比率が低く維持されていた一方、マウスｐＭＣ、ヒトｐＭＣ、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭは培養２日目から生細胞率が低下し始め、アポトーシス細胞の比率が増加した。以上のことから、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭはＧＭ－ＣＳＦの導入によって、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭおよびヒトｉｐＡＰＣ－ＭはＭ－ＣＳＦ単独またはＧＭ－ＣＳＦとのダブル導入によって、ｐＭＣに比べアポトーシス抵抗性が高いことが分かった。
　実施例６：ｉｐＡＰＣ－ＧＭの抗原提示機能の検討
（１）試験管内におけるマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ、およびヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭによるアロ反応性Ｔ細胞増殖
　Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスｉＰＳＣから上述の方法で同様に作製したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ、実施例５（２）で作成したヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ヒトｉｐＡＰＣ－Ｍ、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭを用いて、アロリンパ球混合反応（アロＭＬＲ）誘導活性を評価した。ＢＡＬＢ／ｃ系統のマウスから調製した抗原刺激を受けていないナイーブＴ細胞１．５×１０５細胞／ｗｅｌｌを、系統の異なるＣ５７ＢＬ／６系統由来マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはマウスｐＭＣと６日間共培養した後に、［３Ｈ］－チミジン（パーキンエルマー、１μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加し、その翌日にセルハーベスタ（パーキンエルマー）を用いて細胞中の高分子量ＤＮＡをガラスフィルターに補足した。ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ヒトｉｐＡＰＣ－Ｍ、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭＭのアロＭＬＲ誘導活性として、ヒト健常ドナー末梢血単核球由来のＣＤ３陽性ナイーブＴ細胞と共培養することで、ヒトＴ細胞の増殖活性を評価した。そして、高分子量ＤＮＡへの［３Ｈ］－チミジンの取り込みを、シンチレーション計測により測定した。高分子量ＤＮＡへの［３Ｈ］－チミジンの取り込みは、ＤＮＡ合成の速度すなわち細胞増殖の速度に比例する。
　図１１に、ナイーブＴ細胞刺激活性のシンチレーション計測の結果を示す。Ｔ細胞に対するマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭの割合が高まるにつれて、アロ反応性ナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖が誘導された。一方で、マウスｐＭＣに対するアロ反応性ナイーブＴ細胞増殖は弱かった。マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭと同様に、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭの割合が高まるにつれて、アロ反応性ナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖が誘導された。一方で、ヒトｐＭＣ、ｉｐＡＰＣ－Ｍに対するアロ反応性ナイーブＴ細胞増殖は弱かった。以上の結果から、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、およびｉｐＡＰＣ－ＧＭＭに導入されたサイトカインＧＭ－ＣＳＦの効果によって、ｐＭＣによる免疫応答が向上することが分かる。
　（２）ペプチドおよびタンパク質負荷したｉｐＡＰＣ－ＧＭによる試験管内での抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖検討
　通常、抗原提示細胞は細胞外抗原を取り込み、ペプチドに分解するプロセッシング過程の後に、主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）クラスＩＩ抗原提示分子を介して、ペプチド抗原をＣＤ４陽性Ｔ細胞に提示する。樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ；　ＤＣ）などの特殊な抗原提示細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を介して、取り込んだ細胞外抗原をＣＤ８陽性Ｔ細胞へ提示する機能を有する。このような機構はクロスプレゼンテーションと呼ばれる。自己消光型の蛍光色素の標識により、細胞内に取り込まれてペプチドに消化されることで緑色蛍光を発する卵白アルブミン（ＤＱ－ＯＶＡ）を用いて、実施例５（２）で作成したヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭの抗原取込み能力を検討した。卵白アルブミン（ＯＶＡ）とＯＶＡ特異的Ｔ細胞を用いて、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭによるクロスプレゼンテーションを検討した。
　実施例５（２）で作成したヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭを２４穴組織培養プレートに５×１０４細胞／ｗｅｌｌで播種し、そのｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭに１０μｇ／ｍＬ　ＤＱ－ＯＶＡを負荷した後、３７℃で４時間インキュベートした。抗原取込みを行わない陰性対照として、４℃でインキュベートしたサンプルも調製した。実施例５（６）で誘導した生体由来のＤＣと抗原取込みの頻度を比較した。次いで、実施例６（１）に記載したＣ５７ＢＬ／６系統のマウスｉＰＳＣから作製したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭを　９６穴組織培養プレートに５×１０４細胞／ｗｅｌｌで播種し、そのｉｐＡＰＣ－ＧＭにＯＶＡペプチドＯＶＡ２５７－２６４あるいはＯＶＡタンパク質を濃度依存的に負荷した後、放射線照射（８５　Ｇｙ）によりｉｐＡＰＣ－ＧＭの増殖を停止させた。次いで、ＯＶＡ特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞ＯＴ－１（１×１０４細胞／ｗｅｌｌ）と４日間共培養を行った。
　ＤＱ－ＯＶＡの細胞内取込みをフローサイトメトリーによって測定した結果を図１２Ａ（左）に示し、ＯＴ－１の増殖を［３Ｈ］－チミジンの取り込みによって測定した結果を図１２Ａ（右）に示す。ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭはサイトカイン導入前のｐＭＣと同様に、９５％程度の高い頻度で抗原を取りこむことが分かった。一方で、生体由来のＤＣは抗原取込みの頻度が７５％程度であった。マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭにＯＶＡペプチドＯＶＡ２５７－２６４あるいはＯＶＡタンパク質を濃度依存的に負荷した後、放射線照射によりｉｐＡＰＣ－ＧＭの増殖を停止させ、ＯＶＡ特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を持つナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞ＯＴ－１と共培養したときの試験管内での抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖を、［３Ｈ］－チミジン取り込みのシンチレーション計測で定量化した結果のプロット図を図１２Ｂに示す。マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭはＯＶＡペプチドおよびタンパク質の濃度に依存してＯＴ－１の増殖を誘導した。図１３に、１０μＭ　ＯＶＡペプチドまたは、１００μｇ／ｍＬ　ＯＶＡタンパク質を負荷した条件でのＯＴ－１増殖誘導活性を、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭとマウスｐＭＣで比較した結果を示す。以上の結果から、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭはＤＣよりも抗原取込みの頻度が優れており、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭはマウスｐＭＣよりも抗原特異的Ｔ細胞の増殖刺激活性に優れていた。
　（３）生体内での抗原特異的がん反応性Ｔ細胞の誘導
　マウス予防モデルを用いて、ｉｐＡＰＣ－ＧＭの生体内における抗原特異的Ｔ細胞刺激活性を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスに、実施例６（１）に記載したＣ５７ＢＬ／６系統のマウスｉＰＳＣから作製したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭあるいはマウスｐＭＣ単独で、ＯＶＡペプチドあるいはＯＶＡタンパク質を負荷したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはマウスｐＭＣ　１×１０５細胞を７日間おきに２回、腹腔内投与した後、メラノーマ由来のＯＶＡ発現がん細胞（ＭＯ４　）２×１０５細胞を皮下注射によりマウスに移植した。腫瘍径が２～３ｍｍに達した移植後５日目から、マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭあるいはマウスｐＭＣ投与群と対照群のマウスの腫瘍径を週に２回計測した。マウスが死亡する、あるいは腫瘍径が２０ｍｍに到達するまで継続した。
　図１４に、移植した腫瘍体積の経時変化を示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭは腫瘍体積の増加を有意に抑制した。抑制効果はｉｐＡＰＣ－ＧＭの方がｐＭＣよりも高く、ｉｐＡＰＣ－ＧＭとｐＭＣのどちらもＯＶＡペプチドまたはＯＶＡタンパク質を負荷する方が顕著であった。
　図１５に、がん細胞を移植したマウスの生存曲線を示す。前述の腫瘍体積の測定結果と対応して、ＯＶＡペプチドあるいはＯＶＡタンパク質を負荷したｉｐＡＰＣ－ＧＭを投与した群で有意な生存の延長が同様にＯＶＡペプチドあるいはＯＶＡタンパク質を負荷したｐＭＣを投与した群よりも顕著であった。
　図１６に、移植後５６日目の脾臓内ＯＶＡペプチド抗原特異的Ｔ細胞を試験管内で検出した結果を示す。採取した末梢血単核細胞は抗ＣＤ８抗体でコートしたビーズを用いて、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を分離した。得られた細胞は、ＯＶＡペプチドまたは対照のＳＩＹペプチドで刺激して３６時間後にインターフェロンγを検出するＥｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）ａｓｓａｙにより抗原特異的Ｔ細胞の頻度を解析した。ｉｐＡＰＣ－ＧＭ処置群のマウスでは、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞を高頻度に検出した。以上のことから、本発明のｉｐＡＰＣ－ＧＭはがん抗原などの所望の抗原をＣＤ８陽性Ｔ細胞へ提示する機能を有し、さらにその抗原特異的なＴ細胞受容体を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖させることが分かった。
　実施例７：ｉｐＡＰＣ－ＧＭによるＣＤ８陽性Ｔ細胞の恒常性維持拡大の誘導
　（１）ＧＭ－ＣＳＦおよびｉｐＡＰＣ－ＧＭ培養上清によるナイーブＴ細胞の増殖促進
　実施例５で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭが産生するＧＭ－ＣＳＦがナイーブＯＴ－１　ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖に与える影響を検討した。ナイーブＯＴ－１　ＣＤ８陽性Ｔ細胞（１×１０５細胞／ｗｅｌｌ）を種々の濃度の遺伝子組換えＧＭ－ＣＳＦタンパク質あるいは、ｉｐＡＰＣ－ＧＭの培養上清の存在下で６日間培養した。また、ｉｐＡＰＣ－ＧＭの培養上清に対して抗ＧＭ－ＣＳＦ中和抗体を添加することでＧＭ－ＣＳＦの寄与を検証した。Ｔ細胞の増殖は［３Ｈ］－チミジンの取り込みで評価した。
　種々の濃度の組換えＧＭ－ＣＳＦ存在下でナイーブＯＴ－１　ＣＤ８陽性Ｔ細胞を培養した結果、ＧＭ－ＣＳＦ濃度に依存してＴ細胞の増殖が起こり、少なくとも１．５ｎｇ／ｍＬ以上のＧＭ－ＣＳＦが必要であった。図１７に、ｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはｐＭＣの培養上清の存在下でＴ細胞の増殖を評価した結果を示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭの培養上清はＴ細胞の増殖を促進する一方、ｐＭＣの培養上清には同様な効果は見られなかった。図１８に、ｉｐＡＰＣ－ＧＭの培養上清に抗ＧＭ－ＣＳＦ中和抗体を添加した場合のＴ細胞の増殖を評価した結果を示す。抗ＧＭ－ＣＳＦ抗体によって、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ培養上清によるＴ細胞増殖活性が阻害された。以上のことから、ｉｐＡＰＣ－ＧＭは抗原特異的Ｔ細胞を誘導するのみならず、細胞が分泌するＧＭ－ＣＳＦによって、ＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞の増殖を促進することも分かった。特にＣＤ８陽性ナイーブＴ細胞の恒常性維持拡大に、１．５ｎｇ／ｍＬ以上のＧＭ－ＣＳＦが必要であることを見出した。
　（２）ｉｐＡＰＣ－ＧＭと共培養したナイーブＴ細胞の増殖促進
　実施例５で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭについて放射線照射８５　Ｇｙにより増殖を停止させたマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはマウスｐＭＣ（５×１０４細胞）を、Ｃ５７ＢＬ／６系統のマウスから調製したナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞と４日間共培養して、Ｔ細胞の増殖を［３Ｈ］－チミジン取込みで評価した。図１９に、ｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはｐＭＣと共培養したＴ細胞の増殖活性を示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭとの共培養によって、Ｔ細胞が顕著に増殖したことが分かる。ｉｐＡＰＣ－ＧＭによるＴ細胞の増殖促進効果はｐＭＣと比較して有意に高いことが分かる。図２０に、ｉｐＡＰＣ－ＧＭとの共培養の前後で、ナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｖβ頻度をフローサイトメーターで解析した結果を示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭとの共培養は、特定のＴＣＲクローンに影響を及ぼさず、ポリクローナルなＴ細胞の恒常性維持拡大を促進することが分かる。
　実施例８：ｉｐＡＰＣ－ＧＭへの放射線照射で抗原提示能を有したまま体内動態を制御（３～４日で生体内から消失）
　（１）放射線８５　Ｇｙを照射したｉｐＡＰＣ－ＧＭのアポトーシス分析
　実施例５（７）および（８）で前述したように、ｉｐＡＰＣ－ＧＭは自身が産生するＧＭ－ＣＳＦにより細胞分裂が活発になり、ｐＭＣと比較して生存能力が向上することを見出した。ｉｐＡＰＣ－ＧＭの高い自己増殖能は治療に必要な細胞数を製造する上で有用である一方、生体内に投与後の造腫瘍性が懸念される。非特許文献Ｓｃｉｅｎｃｅ　３１１，　１１６０－１１６４にあるように、抗原提示細胞がＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化するために、ｉｐＡＰＣ－ＧＭは移植後数日間生体内で生存する必要があるが、その後は速やかにクリアランスされることが望ましい。そこで、この課題を解決するため、ｉｐＡＰＣ－ＧＭに放射線照射を行い、自己増殖能に与える影響を検討した。
　実施例５で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびマウスｐＭＣに６５、８５、１００　Ｇｙの放射線を照射し、サイトカイン非存在下２０％ＦＢＳ含有αＭＥＭを用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件で４日間培養した。ヒトｐＭＣ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭに２．５、５、１０、２０、４０、８０Ｇｙの放射線を照射し、サイトカイン５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦおよび５０ｎｇ／ｍＬ　Ｍ－ＣＳＦの存在下で６日間培養した。その細胞形態を図２１に示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭは放射線照射後も細胞形態を保持していた。一方、対照のｐＭＣは放射線照射によって多くが崩壊して細胞傷害を受けていた。図２２に、放射線照射後のマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ヒトｐＭＣ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭの細胞増殖を［３Ｈ］－チミジン取込み活性で評価した結果を示す。マウスｉｐＡＰＣ－ＧＭとｐＭＣとも、いずれの照射線量でも細胞増殖が有意に抑制されていた。ヒトｐＭＣ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭは２０Ｇｙ以上で細胞増殖が停止した一方、１０Ｇｙ以下の低い照射線量では細胞増殖が見られた。以上の結果から、ヒトｉｐＡＰＣ－ＧＭ、ｉｐＡＰＣ－Ｍ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭＭの細胞増殖は２０Ｇｙ以上の放射線照射で制御可能であることが分かった。
　実施例５で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭについて９６穴プレートに播種して放射線８５Ｇｙを照射したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびマウスｐＭＣ（１×１０５細胞）を、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖおよび７－ＡＡＤで染色して、フローサイトメーターでの分析により試験管内での生存率を解析した。図２３に、フローサイトメーターの分析結果を示す。８５Ｇｙ照射２４時間後において、ｉｐＡＰＣ－ＧＭは主要な細胞集団がＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖおよび７－ＡＡＤのいずれにも陰性となり生存していた。対してｐＭＣは大半の細胞がＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖおよび７－ＡＡＤの両試薬で陽性となりアポトーシスを起こしていた。
　（２）放射線を照射したｉｐＡＰＣ－ＧＭの細胞増殖能の検討
　図２４に、実施例５で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭを用い、９６穴プレートに播種して８５Ｇｙを照射したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびマウスｐＭＣ（２×１０４細胞／ｗｅｌｌ）の試験管内における細胞増殖をＭＴＴアッセイで照射後３日間連続して評価した結果を示す。８５Ｇｙの放射線照射により非照射細胞（０　Ｇｙ）で見られていたｉｐＡＰＣ－ＧＭの増殖が抑制された。ｐＭＣでは放射線照射によって有意にＭＴＴ活性の低下が起こった。この結果は、放射線照射による細胞傷害でｐＭＣが崩壊している図２１の結果と一致する。
　（３）放射線を照射したｉｐＡＰＣ－ＧＭの体内動態
　ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として発現するレンチウイルスベクターを、実施例５で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭに導入した。同様にルシフェラーゼ遺伝子を導入したマウスｐＭＣも作成した。ルシフェラーゼ遺伝子を発現した細胞は、発光基質ルシフェリンを加えることで生物化学発光を発する。これにより生体内に投与したｉｐＡＰＣ－ＧＭの体内動態を光学的に調べることが出来る。
　８５Ｇｙの放射線照射を行ったルシフェラーゼ発現ｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはｐＭＣ（１×１０６細胞）をＣ５７ＢＬ／６系統のマウスに皮下投与した。生体内におけるｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびｐＭＣの細胞生存を、１日毎にＩＶＩＳイメージングシステム（パーキンエルマー）で生物化学発光により測定した。図２５に、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングの撮影画像およびルシフェラーゼ発光の全フラックスの経時変化を示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはｐＭＣは投与直後に移植部位の局所に明瞭な発光シグナルとして検出されて、日数の経過とともに消失した。ｉｐＡＰＣ－ＧＭはマウス皮下に投与された後３日間、生体内に保持されて４日目に消失した。対して、ｐＭＣは投与の翌日にほとんどが生体内から消失した。
　以上のことから、本発明のｉｐＡＰＣ－ＧＭは放射線照射後であっても生体投与後３日間は生体内に存在し、４日後に消失することが分かった。このことからｉｐＡＰＣ－ＧＭは放射線照射後、生体内に投与すると、投与後３から4日で消失することが分かった。
　（４）放射線を照射したｉｐＡＰＣ－ＧＭの生体内でのクロスプレゼンテーション能力
　実施例５で作製したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびｐＭＣについて、放射線照射によって増殖能を停止させた後にＯＶＡペプチドを負荷して、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスに腹腔内投与した後、がん細胞ＭＯ４を皮下に移植して、腫瘍径とマウスの生存を３～４日毎に評価した。陽性対照として放射線照射をしていない骨髄由来樹状細胞（ＢＭ－ＤＣ）を、陰性対照として未処置群を用いた比較実験を行った。ＭＯ４移植５４日後にインターフェロンγに対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。
　図２６に腫瘍体積の推移を示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭ投与群は、未処置およびｐＭＣ投与群に比較して有意に腫瘍の増大を抑制した。ｉｐＡＰＣ－ＧＭの腫瘍抑制効果は、陽性対照である骨髄由来樹状細胞（ＢＭ－ＤＣ）と同等であった。
　図２７にマウスの生存曲線を示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭ投与群は、未処置に比較して有意に生存を延長させた。ｉｐＡＰＣ－ＧＭ投与による生存延長効果は、ＢＭ－ＤＣおよびｐＭＣとの有意差が無いことが分かった。
　図２８に、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭ投与群はがん抗原であるＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を未処置およびｐＭＣ投与群と比較して顕著に誘導した。ｉｐＡＰＣ－ＧＭによるがん特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導は、ＢＭ－ＤＣと同等であることが分かった。
　以上のことから、本発明のｉｐＡＰＣ－ＧＭは放射線照射後であってもがん抗原などの所望の抗原をＣＤ８陽性Ｔ細胞へ提示する機能を有し、さらにその所望の抗原特異的なＴ細胞受容体を有するＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖させることが分かった。
　実施例９：ｉｐＡＰＣ－ＧＭへの自殺遺伝子の導入で体内動態を制御
　ＨＳＶ－ＴＫまたはｉＣａｓｐ９を自殺遺伝子として発現するレンチウイルスベクターを、実施例５で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭに導入した。ＨＳＶ－ＴＫを導入したｉｐＡＰＣ－ＧＭをｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ＨＳＶ－ＴＫと記載し、ｉＣａｓｐ９を導入したｉｐＡＰＣ－ＧＭをｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ｉＣａｓｐ９と記載する。ｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ＨＳＶ－ＴＫ、またはｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ｉＣａｓｐ９に、さらにルシフェラーゼをレポーター遺伝子として発現するレンチウイルスベクターを導入して、生体内に投与したｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ＨＳＶ－ＴＫやｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ｉＣａｓｐ９の体内動態を光学的に調べた。ルシフェラーゼを導入した細胞をｉｐＡＰＣ－ＧＭ－Ｌｕｃ、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｌｕｃ及びｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ｉＣａｓｐ９－Ｌｕｃと記載する。ルシフェラーゼおよび自殺遺伝子を発現するｉｐＡＰＣ－ＧＭまたはルシフェラーゼ遺伝子のみを発現するｉｐＡＰＣ－ＧＭ（１×１０６細胞）をＣ５７ＢＬ／６系統のマウスに皮下投与した。続けて、投与当日（Ｄａｙ０）から４日目（Ｄａｙ４）までの５日間連続で、自殺遺伝子ＨＳＶ－ＴＫの誘導試薬である１００ｍｇ／ｋｇのＧＣＶ、またはｉＣａｓｐ９の誘導試薬である２．５ｍｇ／ｋｇのＡＰ１９０３を腹腔内投与した。生体内におけるｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ＨＳＶ－ＴＫ、ｉｐＡＰＣ－ｉＣａｓｐ９およびｉｐＡＰＣ－ＧＭの細胞生存を、１日毎にＩＶＩＳイメージングシステム（パーキンエルマー）で生物化学発光により測定した。
　図２９に、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングの撮影画像より得たルシフェラーゼ発光の全フラックスの経時変化を示す。ＨＳＶ－ＴＫ導入、ｉＣａｓｐ９導入および自殺遺伝子無しのｉｐＡＰＣ－ＧＭのいずれも、投与直後に移植部位の局所に明瞭な発光シグナルとして検出されて日数の経過とともに減少した。ｉｐＡＰＣ－ＧＭ－Ｌｕｃ投与群のマウスにおいて、ＧＣＶまたはＡＰ１９０３の投与による有意なシグナルの低下は見られなかった一方で、ｉｐＡＰＣ－ＨＳＶ－ＴＫ－Ｌｕｃ投与またはｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ｉＣａｓｐ９－Ｌｕｃ投与群において、ＧＣＶまたはＡＰ１９０３の投与により生体内に保持された細胞のシグナルは顕著に低下して移植後７日目に完全に消失した。
　図３０に、自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９と抗アポトーシス因子Ｓｕｒｖｉｖｉｎの阻害剤である５ｍｇ／ｋｇ　ＹＭ－１５５との併用効果を示す。ｉｐＡＰＣ－ＧＭ－ｉＣａｓｐ９－Ｌｕｃを投与したマウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇ　ＹＭ－１５５単独の投与では生理食塩水（Ｍｅｄｉｕｍ）と類似したシグナルの減衰経過を示した一方、ＡＰ１９０３と併用で投与した場合に細胞移植の翌日にＡＰ１９０３単独よりも有意なシグナルの低下を認めた。この結果から、ＹＭ－１５５と併用することにより、移植細胞の自殺遺伝子ｉＣａｓｐ９をＡＰ１９０３で早期にアポトーシス誘導させることで速やかな細胞除去効果が得られることが分かった。また自殺遺伝子と抗アポトーシス因子と併用することで、ｉｐＡＰＣを速やかに除去できることが分かった。
　実施例１０：ｉｐＡＰＣ－ＧＭの生体内投与に対する安全性の検討
　（１）ｉｐＡＰＣ－ＧＭを投与したマウスの血中サイトカインの測定
　実施例５で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭについて、ｉｐＡＰＣ－ＧＭを７日間隔で２回単独投与して、２回目の投与翌日に血中サイトカインを測定した。リポ多糖（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）４．０ｍｇ／ｋｇを投与した群を陽性コントロールとして比較した。ｉｐＡＰＣ－ＧＭを投与したマウスでは、ＩＬ－６、ＴＮＦαおよびＧＭ－ＣＳＦの血中濃度の上昇は観察されず、生体に炎症を惹起していなかった。
　（２）ｉｐＡＰＣ－ＧＭを投与したマウスの血球分画の変動
　実施例４（２）で作成したマウスｉｐＡＰＣ－ＧＭについて、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ投与後（翌日）の白血球分画の変動をフローサイトメトリーで調べた。Ｔ細胞（Ｂ２２０－／ＣＤ３＋）、Ｂ細胞（Ｂ２２０＋／ＣＤ３－）、ミエロイド細胞（ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ－１－）、骨髄由来免疫抑制細胞（ＣＤ１１ｂ＋／Ｇｒ－１＋）などの細胞集団の頻度に、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ投与による大きな変動はなく、白血球分画に影響がなかった。
　実施例１１：ｉｐＡＰＣ－ＧＭの免疫チェックポイント阻害剤との効果比較
　既存のがん免疫療法として知られる免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）とｉｐＡＰＣ－ＧＭの抗腫瘍効果を比較し、さらにＩＣＩとｉｐＡＰＣ－ＧＭの併用効果を調べた。皮下注射によって腫瘍細胞を移植したマウスに、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ、またはＩＣＩ（抗ＣＴＬＡ－４抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、またはｉｐＡＰＣ－ＧＭおよびＩＣＩを併用して腹腔内投与した。腫瘍径とマウスの生存を３～４日毎に評価した。免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）低感受性のがん細胞ＭＯ４腫瘍に対する抗腫瘍効果を図３１に示す。ＭＯ４腫瘍のがん抗原として、ＯＶＡ２５７－２６４ペプチドをｉｐＡＰＣ－ＧＭに負荷した。ＩＣＩ単独治療と比較してｉｐＡＰＣ－ＧＭは有意に腫瘍の増大を抑制し、マウスの生存を延長させた。さらに、ＩＣＩとｉｐＡＰＣ－ＧＭを併用することで、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ単独投与よりも腫瘍の増大の抑制、およびマウスの生存延長の傾向が見られた。
　次に、ＩＣＩ感受性のがん細胞ＭＣ３８腫瘍に対する抗腫瘍効果を図３２に示す。ＭＣ３８腫瘍のがん抗原として変異型Ａｄｐｇｋ（ｍＡｄｐｇｋ）ペプチドを、がん抗原の陰性対照として野生型Ａｄｐｇｋ（ｗｔＡｄｐｇｋ）ペプチドをｉｐＡＰＣ－ＧＭに負荷した。ｗｔＡｄｐｇｋペプチド負荷ｉｐＡＰＣ－ＧＭと比較して、ｍＡｄｐｇｋペプチド負荷ｉｐＡＰＣ－ＧＭ治療群は、有意差を認めなかったが腫瘍径増大の抑制傾向が見られ、有意にマウスの生存を延長した。ＩＣＩ単独治療と比較して、ｍＡｄｐｇｋペプチド負荷ｉｐＡＰＣ－ＧＭの腫瘍径の経時変化およびマウスの生存に有意差は見られなかった。ＩＣＩとｍＡｄｐｇｋペプチド負荷ｉｐＡＰＣ－ＧＭを併用した場合、ＩＣＩ単独との有意差は認めなかったが、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ単独治療よりも有意に腫瘍径の増大を抑制し、マウスの生存を延長した。
　実施例１２：ｉｐＡＰＣ－ＧＭが腫瘍内の骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）に及ぼす影響
　既存のがん免疫療法として知られる免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）とｉｐＡＰＣ－ＧＭの併用が腫瘍内の骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）に及ぼす影響を図３３に示す。事前にＩＣＩ低感受性のがん細胞ＭＯ４皮下腫瘍を作製しておいたマウスにｉｐＡＰＣ－ＧＭによる治療または、ＩＣＩ（抗ＣＴＬＡ－４抗体＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体）とｉｐＡＰＣ－ＧＭによる併用治療を行い、治療後の腫瘍内における骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）をフローサイトメトリーで評価した。ＭＤＳＣは免疫応答を抑制することからがん免疫療法の治療を抵抗性にする要因と考えられている。無治療の腫瘍組織における１５．５％と比較して、ｉｐＡＰＣ－ＧＭ単独の治療で１２．１％、およびｉｐＡＰＣ－ＧＭとＩＣＩを併用した場合で４．３３％にまで、腫瘍内のＭＤＳＣの割合を有意に減少させることが分かった。
　実施例１３：ｉｐＡＰＣ－ＧＭが腫瘍内のＣＤ８陽性Ｔ細胞に及ぼす影響
　実施例１１で得た治療後の腫瘍内におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞をフローサイトメトリーで評価した結果を図３４に示す。Ｐｅｒｆｏｒｉｎおよびグランザイム（ＧｚｍＢ）は抗原ペプチドを認識したＣＤ８陽性Ｔ細胞が分泌する細胞傷害性顆粒である。Ｐｅｒｆｏｒｉｎは標的となるがん細胞膜上で重合し孔を開け、ＧｚｍＢが孔を通じて標的がん細胞に侵入し、細胞死を引き起こす。ｉｐＡＰＣ－ＧＭの投与によって無治療と比較して、腫瘍内でＣＤ８陽性Ｔ細胞におけるＰｅｒｆｏｒｉｎおよびＧｚｍＢの発現細胞が０．５２％から６．１９％まで増加しており、ｉｐＡＰＣ－ＧＭとＩＣＩ（抗ＣＴＬＡ－４抗体＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体）を併用して治療することでさらに１２．３％まで増加した。腫瘍内におけるＭＤＳＣの減少とＰｅｒｆｏｒｉｎおよびＧｚｍＢ両陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の増加がｉｐＡＰＣ－ＧＭの抗腫瘍効果に寄与していると考えられる。またこの結果より、ｉｐＡＰＣ－ＧＭと様々なＩＣＩを併用することでより抗腫瘍効果を示せることを見出した。
　比較例１：ヒトｉＰＳＣのフィーダーフリー分化誘導培養
　実施例３（４）の分化誘導を非特許文献（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２０１１　１８，　８７４－８８３）に記載の分化誘導法と比較した。ヒトｉＰＳＣから作製したヒトＥＢを、組換えヒトフィブロネクチンをコートした組織培養１２ウェルプレートに播種してＳｔｅｍＦｉｔ培地で３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内に静置して一晩培養した。プレートに接着したｉＰＳＣコロニーをＡＩＭ－Ｖ（ライフテクノロジーズ）とＸ－ＶＩＶＯ１５（ロンザ）の１：１混合液を分化誘導培地として、５０ｎｇ／ｍＬ　ＢＭＰ－４の存在下で１０日間培養した。さらに、Ｘ－ＶＩＶＯ１５を用いて５０ｎｇ／ｍＬ　ＢＭＰ－４の存在下で１４日間培養した。得られた細胞をＴｒｉｐＬＥ（ライフテクノロジーズ）で剥離して回収し、低接着プレート（コーニング）に播種し、Ｘ－ＶＩＶＯ１５を用いて５０ｎｇ／ｍＬ　ＧＭ－ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍＬ　Ｍ－ＣＳＦの存在下で７日間培養して分化細胞を得た。培養１８日目および２５日目の分化細胞をサンプルとして造血分化マーカーＣＤ３４およびＣＤ４３抗体、またはミエロイド分化マーカーＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃの発現をフローサイトメトリーによって調べた。
　分化細胞をピペッティング操作により回収し、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ４３抗体、あるいは、アイソタイプ適合対照抗体を用いて染色した。その後、細胞を２％ＦＢＳ含有ＰＢＳまたはＰＢＳを用いて２回洗浄した。洗浄後の細胞をフローサイトメーター解析装置を用いて分析した。図３５に抗体染色後のフローサイトメーターによる表面抗原解析の結果を示す。この解析の結果から、実施例３（４）で作製した分化細胞は、分化誘導１８日目において造血分化マーカーＣＤ３４陽性細胞の頻度が１９．４％であった。２５日目において、ミエロイド分化マーカーＣＤ１１ｂ陽性細胞の頻度は４８．３％であった。
　非特許文献（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　２０１１　１８，　８７４－８８３）に記載の分化誘導法で作製した分化細胞（比較例１）は、分化誘導１８日目において造血分化マーカーＣＤ３４に陰性であった。その後、細胞が死滅して回収された細胞は著しく少ない結果となった。２５日目において、ミエロイド分化マーカーＣＤ１１ｂに陰性であった。この結果から、参照した分化誘導プロトコルは再現性が得られず分化誘導効率が悪いことが分かった。
　本発明の多能性幹細胞由来のヒトプロフェッショナル抗原提示細胞は、生体外で増殖する能力と、生体由来のＤＣに匹敵する抗原提示能とを有するので、細胞製剤としての安定的な供給を可能にする。

Claims (33)

  1. 　ミエロイド細胞（ＭＣ）にｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２を発現させ増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）を得ること、並びに
    前記ｐＭＣにＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを発現させてプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）を得ることを含む、
    プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法。
  2. 　前記ミエロイド細胞は多能性幹細胞から分化させたミエロイド細胞である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記多能性幹細胞は人工多能性幹細胞あるいは胚性幹細胞である、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２はミエロイド細胞に遺伝子導入されたものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　前記ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦは増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）に遺伝子導入されたものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　請求項２～５のいずれか一項に記載の方法において、以下の(i)又は(ii)の方法により多能性幹細胞からミエロイド細胞（ＭＣ）を分化させることを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法。
    (i)　前記多能性幹細胞から誘導された胚様体（ＥＢ）を、ＶＥＧＦを含む培地中でフィーダー細胞の上で重層培養を行った後、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＴＰＯを含む培地中でさらに培養すること、または
    (ii)　前記多能性幹細胞から誘導された胚様体（ＥＢ）を、ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦおよびＳＣＦを含む培地中でフィーダー細胞なしの単層培養を行った後、さらにＶＥＧＦ、ＴＰＯおよびＧＭ－ＣＳＦを含む培地中で培養すること。
  7. 　請求項６の方法において、さらに、以下の方法で多能性幹細胞より胚様体（ＥＢ）を形成することを含む、プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法。
    (i)　多能性幹細胞を細胞塊形成培養用容器に播種して胚様体（ＥＢ）を形成させ、および
    (ii)　前記容器は、底に微細なスフェロイドウェルが設けられ、かつ、隣接するウェルの間に平坦な面が存在しないこと。
  8. 　(i)　多能性幹細胞を、底に微細なスフェロイドウェルが設けられ、かつ、隣接するスフェロイドウェルの間に平坦な面が存在しない細胞塊形成培養用容器に播種して胚様体（ＥＢ）を形成させること、
    (ii)　以下の(ii)-1または(ii)-2の方法により前記胚様体（ＥＢ）からミエロイド細胞（ＭＣ）を得ること、
    　(ii)-1　前記胚様体を、ＶＥＧＦを含む培地中でフィーダー細胞の上で重層培養を行った後、ＶＥＧＦ、ＳＣＦおよびＴＰＯを含む培地中でさらに培養すること、または、
    　(ii)-2　前記胚様体を、ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦおよびＳＣＦを含む培地中でフィーダー細胞なしの単層培養を行った後、さらにＶＥＧＦ、ＴＰＯおよびＧＭ－ＣＳＦを含む培地中で培養すること、
    (iii)　(ii)で得られたミエロイド細胞（ＭＣ）にｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２を発現させて増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）を得ること、および、
    (iv)　(iii)で得られた増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）にＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを発現させてプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）を得ること、を含む、
    プロフェッショナル抗原提示細胞の製造方法。
  9. 　ｃ－ＭＹＣ、ＢＭＩ１およびＭＤＭ２はミエロイド細胞（ＭＣ）に遺伝子導入されたものであり、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦは増殖性ミエロイド細胞（ｐＭＣ）に遺伝子導入されたものである、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　前記胚様体（ＥＢ）のサイズが５０～２００μｍである、請求項６～９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 　前記プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）に放射線を照射することをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の製造方法。
  12. 　請求項１～１１のいずれか一項に記載の製造方法で製造される、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）。
  13. 　請求項１１に記載の製造方法で製造される、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）であって、放射線照射後に生体に投与されるとき、生体投与後少なくとも３～４日で生体から消失する、プロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）。
  14. 　ＣＤ１１ｂ／ｃが低発現であって、ＣＤ７４を発現する、請求項１２または１３に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）。
  15. 　ＣＤ１１ｂ／ｃが低発現であって、ＣＤ７４を発現する、多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）。
  16. 　さらにＣＤ３３を発現する、請求項１４または１５に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）。
  17. 　前記多能性幹細胞は胚性幹細胞または人工多能性幹細胞である、請求項１５に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）。
  18. 　外来性のＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦを発現する、請求項１５～１７のいずれか一項に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）。
  19. 　ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＭ－ＣＳＦが遺伝子導入されたものである、請求項１８に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）。
  20. 　自己増殖能を有し、かつ、アポトーシス抵抗性を示す、請求項１～１１のいずれか一項に記載の製造方法で製造されるプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）、または、請求項１５～１９のいずれか一項に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）。
  21. 　請求項１２～２０のいずれか一項に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞を含む、ＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を誘導および／または促進するための医薬組成物。
  22. 　請求項１２～２０のいずれか一項に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞またはＧＭ－ＣＳＦと、ＣＤ８を発現するナイーブＴ細胞を生体外で共培養し、生体内および生体外で、抗原非特異的または抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法。
  23. 　前記プロフェッショナル抗原提示細胞が、所望の抗原を負荷したプロフェッショナル抗原提示細胞である、請求項２２に記載のＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進する方法。
  24. 　前記抗原を負荷したプロフェッショナル抗原提示細胞にさらに生体外で放射線を照射することを含む、請求項２２または２３に記載のＣＤ８を発現するT細胞の増殖を促進する方法。
  25. 　前記放射線を照射されたプロフェッショナル抗原提示細胞が、生体外での放射線照射後に生体に投与された場合、その生体内で少なくとも３～４日で消失する、請求項２２～２４のいずれか一項に記載のＣＤ８を発現するT細胞の増殖を促進する方法。
  26. 　ＣＤ８を発現するT細胞がプロフェッショナル抗原提示細胞に負荷した抗原に特異的なＣＤ８を発現するT細胞である、請求項２２～２５のいずれか一項に記載のT細胞の増殖を促進する方法。
  27. 　請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法で増殖が促進される、ＣＤ８を発現するＴ細胞。
  28. 　請求項２２～２６のいずれか一項に記載の方法を使って、抗原非特異的または特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞を製造することを含む、抗原非特異的または特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞を製造する方法。
  29. 　請求項２８に記載の方法で製造される、抗原非特異的または特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞。
  30. 　請求項２０に記載のプロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を負荷すること、前記抗原を負荷したプロフェッショナル抗原提示細胞に放射線を照射すること、前記放射線を照射されたプロフェッショナル抗原提示細胞、および、ＣＤ８を発現するナイーブＴ細胞を生体外で共培養し、抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の増殖を促進すること、を含む、体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞の製造方法。
  31. 　請求項３０に記載の方法により製造される、体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞。
  32. 　放射線照射後に生体に投与されるとき、前記放射線を照射された多能性幹細胞由来のプロフェッショナル抗原提示細胞は生体投与後少なくとも３～４日で消失する、請求項３１に記載の体内に投与するための抗原特異的なＣＤ８を発現するＴ細胞。
  33. 　前記抗原はがん特異的抗原である、請求項２７に記載のＣＤ８を発現するＴ細胞、または、請求項２９、３１または３２に記載のＣＤ８を発現するＴ細胞を含む、抗がん剤。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023229013A1 (ja) * 2022-05-27 2023-11-30 北京天一方生物科技▲発▼展有限公司 ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞の製造方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008536511A (ja) * 2005-04-21 2008-09-11 コリア ユニバーシティー インダストリー アンド アカデミー コーオペレーション ファウンデーション ＣＤ８Ｔ細胞の活性化方法｛ＭｅｔｈｏｄＦｏｒＡｃｔｉｖａｔｉｎｇＣＤ８ＴＣｅｌｌｓ｝
JP2011515110A (ja) * 2008-03-27 2011-05-19 ジェロン・コーポレーション 霊長類多能性幹細胞の造血系統細胞への分化
WO2011146862A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing selective apoptosis
WO2012043651A1 (ja) * 2010-09-30 2012-04-05 国立大学法人 熊本大学 ミエロイド系血液細胞の製造方法
JP2014526244A (ja) * 2011-09-08 2014-10-06 イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド 抗第三者セントラルメモリーｔ細胞、その作製方法ならびに移植および疾患処置におけるその使用
WO2018181903A1 (ja) * 2017-03-31 2018-10-04 国立大学法人熊本大学 インターフェロンβ産生細胞の作製方法
JP2018171005A (ja) * 2017-03-31 2018-11-08 国立大学法人 熊本大学 ヒトミエロイド系血液細胞及び該細胞の作製方法
JP2019528773A (ja) * 2016-10-05 2019-10-17 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド ＭｅＣＰ２が破壊された誘導多能性幹細胞からの成熟系列の生成
WO2020045368A1 (ja) * 2018-08-27 2020-03-05 マイキャン・テクノロジーズ株式会社 不死化単球細胞および誘導細胞を用いた抗感染症薬，ワクチンなどの評価方法
JP2020084821A (ja) 2018-11-19 2020-06-04 ダイキン工業株式会社 ロータリー圧縮機
JP2020149486A (ja) 2019-03-14 2020-09-17 日本電産モビリティ株式会社 車両制御装置

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008536511A (ja) * 2005-04-21 2008-09-11 コリア ユニバーシティー インダストリー アンド アカデミー コーオペレーション ファウンデーション ＣＤ８Ｔ細胞の活性化方法｛ＭｅｔｈｏｄＦｏｒＡｃｔｉｖａｔｉｎｇＣＤ８ＴＣｅｌｌｓ｝
JP2011515110A (ja) * 2008-03-27 2011-05-19 ジェロン・コーポレーション 霊長類多能性幹細胞の造血系統細胞への分化
WO2011146862A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing selective apoptosis
WO2012043651A1 (ja) * 2010-09-30 2012-04-05 国立大学法人 熊本大学 ミエロイド系血液細胞の製造方法
JP2014526244A (ja) * 2011-09-08 2014-10-06 イェダ リサーチ アンド デベロップメント カンパニー リミテッド 抗第三者セントラルメモリーｔ細胞、その作製方法ならびに移植および疾患処置におけるその使用
JP2019528773A (ja) * 2016-10-05 2019-10-17 フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド ＭｅＣＰ２が破壊された誘導多能性幹細胞からの成熟系列の生成
WO2018181903A1 (ja) * 2017-03-31 2018-10-04 国立大学法人熊本大学 インターフェロンβ産生細胞の作製方法
JP2018171005A (ja) * 2017-03-31 2018-11-08 国立大学法人 熊本大学 ヒトミエロイド系血液細胞及び該細胞の作製方法
WO2020045368A1 (ja) * 2018-08-27 2020-03-05 マイキャン・テクノロジーズ株式会社 不死化単球細胞および誘導細胞を用いた抗感染症薬，ワクチンなどの評価方法
JP2020084821A (ja) 2018-11-19 2020-06-04 ダイキン工業株式会社 ロータリー圧縮機
JP2020149486A (ja) 2019-03-14 2020-09-17 日本電産モビリティ株式会社 車両制御装置

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARAKI, R. ET AL., NATURE, vol. 494, 2013, pages 100 - 104
BARESE ET AL., MOL. THERAP., vol. 20, no. 10, 2012, pages 1932 - 1943
BLOOD, vol. 101, 2003, pages 3501 - 8
CELL, vol. 126, no. 4, 2006, pages 663 - 676
CELL, vol. 131, no. 5, 2007, pages 861 - 872
GENE THERAPY, vol. 18, 2011, pages 874 - 883
IMMUNITY, vol. 39, 2013, pages 38 - 48
J IMMUNOL, vol. 172, 2004, pages 776 - 86
J IMMUNOL, vol. 174, 2005, pages 1888 - 97
J IMMUNOL, vol. 178, 2007, pages 918 - 25
KITAYAMA, S ET AL., STEM CELL REPORTS, vol. 6, 2016, pages 213 - 227
NAT REV CANCER, vol. 17, 2017, pages 209 - 222
NON PATENT LITERATURE SCIENCE, vol. 311, pages 1160 - 1164
STASI ET AL., N. ENGL. J. MED, vol. 365, 2011, pages 18
STEM CELLS, vol. 25, 2007, pages 2720 - 29
TEY ET AL., BIOL. BLOOD MARROW TRANSPLANT, vol. 13, 2007, pages 913 - 924
XU ET AL., CELL RES, vol. 8, 1998, pages 73 - 8

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023229013A1 (ja) * 2022-05-27 2023-11-30 北京天一方生物科技▲発▼展有限公司 ＩＬ－１２ｐ７０を恒常的に産生する増殖性ミエロイド細胞の製造方法

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