KR20240099331A

KR20240099331A - 면역 세포를 배양하기 위한 방법

Info

Publication number: KR20240099331A
Application number: KR1020247017082A
Authority: KR
Inventors: 수만 쿠마르 보드날라; 요긴 파텔; 니콜라스 피. 레스티포; 벤자민 해리스
Original assignee: 라이엘 이뮤노파마, 인크.
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2022-10-27
Publication date: 2024-06-28

Abstract

본 개시내용은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온을 포함하는 배지에서 TIL을 배양하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 CD4⁺ TIL에 비해 CD8⁺ TIL의 확장을 향상시킨다. 일부 측면에서, 상기 방법은 세포 집단에서 덜 분화된 세포, 예를 들어, 덜 분화된 TIL의 수를 추가로 증가시킨다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 클론 다양성이 보존되도록 종양 반응성, 예를 들어, 종양 특이적 TIL을 농축시킨다. 일부 측면에서, 세포, 예를 들어, TIL은 치료가 필요한 대상체에게 투여된다.

Description

면역 세포를 배양하기 위한 방법

관련 출원에 대한 교차 참조

본 출원은 2021년 10월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 63/273,138; 2022년 5월 25일에 출원된 63/365,326; 및 2022년 10월 14일에 출원된 63/379,632에 대한 우선권 이익을 주장하며; 이들 각각은 본원에 전문이 참조로 포함된다.

EFS-WEB를 통해 전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조

본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(이름: 4385_110PC02_Seqlisting_ST26; 크기: 7,976바이트; 생성일: 2022년 10월 27일)의 전자적으로 제출된 서열 목록의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

분야

본 개시내용은 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)를 포함하는 조성물 및 세포 배양 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 올리고클론 또는 다클론 종양 반응성(예를 들어, 종양 특이적) 줄기 유사 T 세포, 예를 들어, 덜 분화되는 것을 특징으로 하는 TIL의 농축(enrichment)을 우선적으로 촉진한다. 본원에 개시된 방법을 사용하여 배양된 세포는 자가 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법(adoptive cell therapies)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 세포 요법에 사용될 수 있다.

면역요법 전략의 사용은 특정 유형의 진행성 암 치료에서 상당한 임상적 효능을 입증하였다. 그러나 주목할만한 성공에도 불구하고 진행성 암 환자의 대다수는 여전히 면역요법 치료의 혜택을 받지 못하고 결국 질병에 굴복하게 된다. 키메라 항원 수용체(CAR) 및 조작된 TCR T 세포를 포함하는 입양 세포 요법과 같은 세포 요법 기술에 대한 주요 한계는 적절한 종양 표적의 부족이며, 이는, 예를 들어, CAR T 세포로 치료된 고형암 환자에서 관찰되는 광범위한 임상 반응의 부족에 일조할 수 있다.

진행성 암 환자에서 임상 반응을 중재하는 데 어느 정도 성공한 또 다른 접근법은 자가 종양 침윤 림프구(TIL)의 단리, 확장 및 주입이다. TIL은 종양 반응성 및 무관 또는 억제성 T 세포의 다양한 조성을 가진 이종(heterogenous)이다. 종양 반응성 집단은 흔히 항원 경험이 높기 때문에 기능이 제한된 사전 기능장애된 상태에 있는 세포 생성물이 생성된다.

TIL을 배양하고 확장하는 전통적인 방법은 TIL의 최종 분화를 초래하여 환자에게 전달될 때 TIL의 불량한 지속성을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, Rosenberg 등, Clinical Cancer Research 17(13):4550-557 (2011) 참조. 또한, 종양 단편으로부터 이종 TIL 집단을 확장하는 현재의 방법은 다클론성이 감소되고 많은 종양 우세 T 세포 클론이 손실된 TIL 집단을 산출한다(예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 Poschke, 등, Clin. Cancer Res. (2020) 참조). 결과적으로, 이러한 TIL 유래 주입 생성물을 생성하면 종종 확장 동안 종양 특이적 T 세포의 손실과 다양한 분화 상태에서 면역 세포의 불명확한 혼합이 발생하여 고형 종양을 근절하는 데 비효율적이다. 치료를 위해서는 자가 재생 줄기/이펙터 특성이 강화된 TIL이 필요하다. 더욱이, 암세포를 추가로 분할하고 표적화하고 살해하는 능력을 보유하는 높은 수준의 클론 다양성을 갖는 덜 분화된 TIL의 확장된 집단을 얻기 위한 방법은 아직 기술되지 않았다.

현재까지, 이러한 한계 및 기타 중대한 한계는 효과적인 치료제로서 TIL의 사용을 축소시켰고, T 세포 요법에 사용하기 위한 충분한 수의 종양 반응성 TIL을 얻는 것을 어렵게 만들었다. 이와 같이, TIL 조성물을 제조하는 개선된 방법 및 이를 사용하는 요법에 대한 요구가 당업계에 남아 있다.

본 발명의 일부 측면은 약 30mM 내지 약 100mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 대사 재프로그래밍 배지(metabolic reprogramming medium)("MRM")에 종양 침윤 림프구(TIL)의 이종 집단을 배치하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 종양 침윤 림프구(TIL)를 배양하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, TIL의 이종 집단은 MRM에 배치된 후 CD8⁺ TIL이 농축된다.

본 발명의 일부 측면은 약 30mM 내지 약 100mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 MRM에서 TIL의 이종 집단을 배양하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 CD8⁺ TIL의 수 또는 백분율을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일부 측면은 약 30mM 내지 약 100mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 MRM에서 생체 외 또는 시험관 내에서 TIL의 이종 집단을 배양하는 것을 포함하는, CD8⁺ 농축 TIL 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일부 측면에서, TIL의 이종 집단은 CD4⁺ TIL 및 CD8⁺ TIL을 포함한다. 일부 측면에서, TIL의 이종 집단은 대상체로부터 얻은 하나 이상의 종양 샘플로부터 얻는다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 초기 TIL 배양된 것이다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 MRM에서 종양 샘플을 배양하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 초기 TIL 배양 동안 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 초기 TIL 배양 동안 IL-7, IL-15, IL-21 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 초기 TIL 배양 동안 IL-2 및 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 초기 TL 배양은 적어도 약 14-19일 지속된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 적어도 약 11일 지속된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 적어도 약 14일 지속된다. 일부 측면에서, 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL의 비율은 초기 TIL 배양 전 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL의 비율과 비교하여 초기 TIL 배양 후 증가된다. 일부 측면에서, TIL은 초기 TIL 배양 후 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 CD3 작용제(agonist) 및/또는 CD28 작용제와 함께 TIL을 배양함으로써 자극된다.

일부 측면에서, 종양 샘플은 종양 생검을 포함한다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 배양 전에 단편화된다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 배양 전에 해리된다.

일부 측면에서, TIL의 이종 집단의 배양 후, 집단 내 TIL의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 이종 집단의 배양 후, 집단 내 TIL의 적어도 약 50%는 CD8⁺ TIL이다.

일부 측면에서, MRM은 나트륨 이온, 칼슘 이온, 글루코스 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 세포 확장제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 세포 확장제는 GSK3B 억제제, ACLY 억제제, PI3K 억제제, AKT 억제제 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, PI3K 억제제는 LY294002, 픽틸리시브(pictilisib), CAL101, IC87114 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, AKT 억제제는 MK2206, A443654, AKTi-VIII 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 적어도 약 30mM, 적어도 약 35mM, 적어도 약 40mM, 적어도 약 45mM, 적어도 약 50mM, 적어도 약 55mM, 적어도 약 60mM, 적어도 약 65mM, 적어도 약 70mM, 적어도 약 75mM, 적어도 약 80mM, 적어도 약 85mM, 적어도 약 90mM, 적어도 약 95mM 또는 적어도 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 30mM 내지 약 100mM, 약 30mM 내지 약 90mM, 약 30mM 내지 약 80mM, 약 30mM 내지 약 70mM, 약 30mM 내지 약 60mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 100mM, 약 40mM 내지 약 90mM, 약 40mM 내지 약 80mM, 약 40mM 내지 약 70mM, 약 40mM 내지 약 60mM 또는 약 40mM 내지 약 50mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 80mM이다.

일부 측면에서, MRM은 나트륨 이온을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 나트륨 이온의 농도는 약 25mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온의 농도는 약 30mM 내지 약 40mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 60mM, 약 30mM 내지 약 70mM, 약 30mM 내지 약 80mM, 약 40mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 60mM, 약 40mM 내지 약 70mM, 약 40mM 내지 약 80mM, 약 50mM 내지 약 55mM, 약 50mM 내지 약 60mM, 약 50mM 내지 약 65mM, 약 50mM 내지 약 70mM, 약 50mM 내지 약 75mM, 약 50mM 내지 약 80mM, 약 55mM 내지 약 60mM, 약 55mM 내지 약 65mM, 약 55mM 내지 약 70mM, 약 55mM 내지 약 75mM, 약 55mM 내지 약 80mM, 약 60mM 내지 약 65mM, 약 60mM 내지 약 70mM, 약 60mM 내지 약 75mM, 약 60mM 내지 약 80mM, 약 70mM 내지 약 75mM, 약 70mM 내지 약 80mM 또는 약 75mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온의 농도는 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 55mM, 약 60mM, 약 65mM, 약 70mM, 약 75mM 또는 약 80mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온의 농도는 약 55mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온의 농도는 약 60mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온의 농도는 약 65mM이다.

일부 측면에서, MRM은 글루코스를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 글루코스의 농도는 약 10mM 초과이다. 일부 측면에서, 글루코스의 농도는 약 10mM 내지 약 25mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 15mM 내지 약 25mM, 약 15mM 내지 약 20mM, 약 15mM 내지 약 19mM, 약 15mM 내지 약 18mM, 약 15mM 내지 약 17mM, 약 15mM 내지 약 16mM, 약 16mM 내지 약 20mM, 약 16mM 내지 약 19mM, 약 16mM 내지 약 18mM, 약 16mM 내지 약 17mM, 약 17mM 내지 약 20mM, 약 17mM 내지 약 19mM 또는 약 17mM 내지 약 18mM이다. 일부 측면에서, 글루코스의 농도는 약 10mM, 약 11mM, 약 12mM, 약 13mM, 약 14mM, 약 15mM, 약 16mM, 약 17mM, 약 18mM, 약 19mM, 약 20mM, 약 21mM, 약 22mM, 약 23mM, 약 24mM 또는 약 25mM이다.

일부 측면에서, MRM은 칼슘 이온을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.4mM 초과이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.4mM 내지 약 2.5mM, 약 0.5mM 내지 약 2.0mM, 약 1.0mM 내지 약 2.0mM, 약 1.1mM 내지 약 2.0mM, 약 1.2mM 내지 약 2.0mM, 약 1.3mM 내지 약 2.0mM, 약 1.4mM 내지 약 2.0mM, 약 1.5mM 내지 약 2.0mM, 약 1.6mM 내지 약 2.0mM, 약 1.7mM 내지 약 2.0mM, 약 1.8mM 내지 약 2.0mM, 약 1.2 내지 약 1.3mM, 약 1.2 내지 약 1.4mM, 약 1.2 내지 약 1.5mM, 약 1.2 내지 약 1.6mM, 약 1.2 내지 약 1.7mM, 약 1.2 내지 약 1.8mM, 약 1.3 내지 약 1.4mM, 약 1.3 내지 약 1.5mM, 약 1.3 내지 약 1.6mM, 약 1.3 내지 약 1.7mM, 약 1.3 내지 약 1.8mM, 약 1.4 내지 약 1.5mM, 약 1.4 내지 약 1.6mM, 약 1.4 내지 약 1.7mM, 약 1.4 내지 약 1.8mM, 약 1.5 내지 약 1.6mM, 약 1.5 내지 약 1.7mM, 약 1.5 내지 약 1.8mM, 약 1.6 내지 약 1.7mM, 약 1.6 내지 약 1.8mM 또는 약 1.7 내지 약 1.8mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.0mM, 약 1.1mM, 약 1.2mM, 약 1.3mM, 약 1.4mM, 약 1.5mM, 약 1.6mM, 약 1.7mM, 약 1.8mM, 약 1.9mM 또는 약 2.0mM이다.

일부 측면에서, MRM은 약 40mM 내지 약 90mM 칼륨 이온 및 (ⅰ) 약 40mM 내지 약 80mM 나트륨 이온; (ⅱ) 약 10mM 내지 약 24mM 글루코스; (ⅲ) 약 0.5mM 내지 약 2.8mM 칼슘 이온; 또는 (ⅳ) (ⅰ)-(ⅲ)의 임의의 조합을 포함한다.

본 개시내용의 일부 측면은 초기 TIL 배양 배지에서 TIL을 배양하는 단계; 2차 TIL 배양 배지에서 TIL을 배양하는 단계; 3차(또는 최종) TIL 배양 배지에서 TIL을 배양하는 단계를 포함하고, 초기 TIL 배양 배지, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차 TIL 확장 배지가 MRM인, 인간 대상체로부터 얻은 TIL을 확장하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 배지 및 2차 TIL 확장 배지는 고칼륨성(hyperkalemic)이고 3차 TIL 확장 배지는 고칼륨성이 아니다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 배지는 T 세포 보충제, 혈청 대체물, 글루타민, 글루타민 대체물(예를 들어, 글루타맥스(L-알라닌-L-글루타민)), 비필수 아미노산, 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 또는 둘 다), 항진균제(예를 들어, FUNGIN™) 및/또는 나트륨 피루베이트를 추가로 포함한다.

일부 측면에서, TIL은 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 1주, 적어도 약 2주 또는 적어도 약 3주 동안 초기 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 1×10⁵개, 적어도 약 2×10⁵개, 적어도 약 3×10⁵개, 적어도 약 4×10⁵개, 적어도 약 5×10⁵개, 적어도 약 6×10⁵개, 적어도 약 7×10⁵개, 적어도 약 8×10⁵개, 적어도 약 9×10⁵개, 적어도 약 1×10⁶개, 적어도 약 2×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개, 적어도 약 10×10⁶개, 적어도 약 15×10⁶개, 적어도 약 20×10⁶개, 적어도 약 25×10⁶개, 적어도 약 30×10⁶개, 적어도 약 35×10⁶개, 적어도 약 40×10⁶개, 적어도 약 45×10⁶개 또는 적어도 약 50×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 TIL 배양 배지에서 배양된다.

일부 측면에서, TIL은 2차 TIL 배양 배지 이전에 CD3 작용제, CD28 작용제 또는 둘 다로 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 TIL 배양 배지에서 또는 그 이전에 CD27 작용제로 추가로 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 TIL 배양 배지에서 또는 그 이전에 4-1BB 작용제로 추가로 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 자극 후 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일, 적어도 약 21일, 적어도 약 22일, 적어도 약 23일, 적어도 약 24일, 적어도 약 25일 또는 적어도 약 26일 동안 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 세포 수율이 적어도 약 1×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷개, 적어도 약 4×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷개, 적어도 약 6×10⁷개, 적어도 약 7×10⁷개, 적어도 약 8×10⁷개, 적어도 약 9×10⁷개, 적어도 약 10×10⁷개, 적어도 약 11×10⁷개, 적어도 약 12×10⁷개, 적어도 약 13×10⁷개, 적어도 약 14×10⁷개, 적어도 약 15×10⁷개, 적어도 약 16×10⁷개, 적어도 약 17×10⁷개, 적어도 약 18×10⁷개, 적어도 약 19×10⁷개 또는 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 배양 배지에서 배양된다.

일부 측면에서, TIL은 3차 TIL 배양 배지에서 CD3 작용제, CD28 작용제, CD27 작용제 및/또는 4-1BB 작용제로 자극된다. 일부 측면에서, 3차 TIL 배양 배지는 고칼륨성이 아니다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일 또는 적어도 약 21일 동안 3차 TIL 배양 배지에서 배양된다.

본 개시내용의 일부 측면은 고칼륨성이고 IL-2 및 선택적으로 IL-21을 포함하는 초기 TIL 배양 배지에서 하나 이상의 종양 단편을 최대 약 11 내지 19일 배양함으로써 종양 단편으로부터 TIL을 얻는 단계; (ⅰ) CD3 작용제 및 (ⅱ) CD28 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제 또는 이들의 임의의 조합을 첨가한 후, 고칼륨성인 2차 TIL 배양 배지에서 TIL을 약 7일 내지 적어도 약 14일 동안 배양하는 단계; (ⅰ) CD3 작용제 및 (ⅱ) CD28 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제 또는 이들의 임의의 조합을 첨가한 후, 고칼륨성이 아닌 3차 TIL 배양 배지에서 TIL을 약 14일 내지 적어도 약 21일 동안 배양하는 단계를 포함하는, 종양 반응성, 예를 들어, 종양 특이적 TIL을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

일부 측면에서, TIL은 고칼륨성이 아닌 대조군 배지에서 배양한 후 TIL 집단에서 TCF7 발현에 비해 MRM에서 배양한 후 TCF7의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, TIL 집단은 고칼륨성이 아닌 대조군 배지에서 배양한 후 CD8⁺ CD62L⁺ TIL의 비율에 비해 MRM에서의 배양 후 CD8⁺ CD62L⁺ TIL의 증가된 비율을 포함한다. 일부 측면에서, TIL 집단은 고칼륨성이 아닌 대조군 배지에서 배양한 후 CD8⁺ PD1⁺TIL의 비율에 비해 MRM에서 배양 후 CD8⁺ PD1⁺ TIL의 증가된 비율을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 제공된 방법은 종양이 있는 대상체에게 TIL 집단을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 면역 체크포인트 억제제에 불응성이다. 일부 측면에서, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 재발된다. 일부 측면에서, 종양은 전이성이다.

일부 측면에서, TIL의 이종 집단은 대조군 배지에 배치된 TIL의 이종 집단의 클론 다양성과 비교하여 MRM에 배치된 후 증가된 클론 다양성을 갖는다.

일부 측면에서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 99% 내지 약 100%, 적어도 약 98% 내지 약 100%, 적어도 약 97% 내지 약 100%, 적어도 약 96% 내지 약 100%, 적어도 약 95% 내지 약 100%, 적어도 약 94% 내지 약 100%, 적어도 약 93% 내지 약 100%, 적어도 약 92% 내지 약 100%, 적어도 약 91% 내지 약 100%, 적어도 약 90% 내지 약 100%, 적어도 약 85% 내지 약 100%, 적어도 약 80% 내지 약 100%, 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 70% 내지 약 100%, 적어도 약 65% 내지 약 100%, 적어도 약 60% 내지 약 100%, 적어도 약 55% 내지 약 100%, 적어도 약 50% 내지 약 100%, 적어도 약 45% 내지 약 100% 또는 적어도 약 40% 내지 약 100%이다.

일부 측면에서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성 점수는 심슨 클론성(Simpsons clonality)으로 측정했을 때 약 0.5 미만, 약 0.45 미만, 약 0.4 미만, 약 0.35 미만, 약 0.3 미만, 약 0.275 미만, 약 0.25 미만, 약 0.225 미만, 약 0.2 미만, 약 0.175 미만, 약 0.15 미만, 약 0.125 미만, 약 0.1 미만, 약 0.075 미만, 약 0.07 미만, 약 0.06 미만 또는 약 0.05 미만이다.

일부 측면에서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.3 미만이다.

일부 측면에서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.25 미만이다.

일부 측면에서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.2 미만이다.

일부 측면에서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.1 미만이다.

본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 배양된 하나 이상의 CD8⁺ TIL을 포함하는 면역 세포의 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 면역 세포의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%는 CD8⁺ TIL이다.

본 개시내용의 일부 측면은 면역 세포 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 면역 세포의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, 상기 세포의 적어도 약 50%는 CD8⁺ TIL이다.

일부 측면에서, 상기 세포는 고칼륨성이 아닌 대조군 배지에서 배양한 후 면역 세포 집단에서 TCF7 발현에 비해 MRM에서 배양한 후 TCF7의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺/CD62L⁺ TIL이다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 종료 시 얻은 CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 PD1⁺이다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 종료 시 얻은 CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 CD39⁺이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 CD27⁺이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 CD28⁺이다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 종료 시 얻은 CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 PD1⁺ CD39⁺이다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 종료 시 얻은 CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 PD1⁺ CD27⁺이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 CD27⁺ CD62L⁺이다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 종료 시 얻은 CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 CD27⁺ CD28⁺ CD103⁺ PD1⁺ TCF7⁺이다.

일부 측면에서, 면역 세포 집단은 적어도 약 2×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개 또는 적어도 약 1×10⁷개의 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 면역 세포 집단은 적어도 약 1×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개 또는 적어도 약 1×10⁷개의 CD8⁺ 세포를 포함한다.

일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 99% 내지 약 100%, 적어도 약 98% 내지 약 100%, 적어도 약 97% 내지 약 100%, 적어도 약 96% 내지 약 100%, 적어도 약 95% 내지 약 100%, 적어도 약 94% 내지 약 100%, 적어도 약 93% 내지 약 100%, 적어도 약 92% 내지 약 100%, 적어도 약 91% 내지 약 100%, 적어도 약 90% 내지 약 100%, 적어도 약 85% 내지 약 100%, 적어도 약 80% 내지 약 100%, 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 70% 내지 약 100%, 적어도 약 65% 내지 약 100%, 적어도 약 60% 내지 약 100%, 적어도 약 55% 내지 약 100%, 적어도 약 50% 내지 약 100%, 적어도 약 45% 내지 약 100% 또는 적어도 약 40% 내지 약 100%이다.

일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성 점수(예를 들어, 심슨 클론성 지수)는 심슨 클론성으로 측정했을 때 0.5 미만, 약 0.45 미만, 약 0.4 미만, 약 0.35 미만, 약 0.3 미만, 약 0.275 미만, 약 0.25 미만, 약 0.225 미만, 약 0.2 미만, 약 0.175 미만, 약 0.15 미만, 약 0.125 미만, 약 0.1 미만, 약 0.075 미만, 약 0.07 미만, 약 0.06 미만 또는 약 0.05 미만이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.3 미만이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.25 미만이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.2 미만이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.1 미만이다.

본 개시내용의 일부 측면은 대상체에게 TIL 집단을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료가 필요한 대상체에서 암(종양)을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 TIL 집단은 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 배양된다. 일부 측면에서, TIL 집단은 CD8⁺ TIL이 농축되어 있다. 일부 측면에서, TIL 집단에서 TIL의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL 집단에서 TIL의 적어도 약 50%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, 종양은 체크포인트 억제제에 불응성이다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 재발된다. 일부 측면에서, 종양은 전이성이다.

본 개시내용의 일부 측면은 대상체에게 본원에 개시된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료가 필요한 대상체에서 암(종양)을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 흑색종, 결장암, 폐암, 자궁경부암, 위장관암, 유방암, 전립선암, 간암, 골암, 췌장암, 두경부의 소세포 암종(small cell carcinoma of the head and neck), 폐 편평 세포 암종(lung squamous cell carcinoma), 폐 선암종(lung adenocarcinoma), 췌장 선암종(pancreatic adenocarcinoma), 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma), 고환 생식 세포 종양(testicular germ cell tumor), 위 선암종(stomach adenocarcinoma), 피부 흑색종(skin cutaneous melanoma), 중피종(mesothelioma), 신장 투명 세포 암종(kidney renal clear cell carcinoma), 자궁경부 편평 상피세포 암종(cervical squamous cell carcinoma) 및 자궁경내 선암종(endocervical adenocarcinoma), 식도 암종(esophageal carcinoma), 방광 요로상피 암종(bladder urothelial carcinoma), 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma), 신장 유두 세포 암종(kidney renal papillary cell carcinoma), 결장 선암종(colon adenocarcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 또는 이들의 임의의 조합에서 유래된 고형 종양을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 체크포인트 억제제에 불응성이다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 재발된다. 일부 측면에서, 종양은 전이성이다.

일부 측면에서, 상기 방법은 적어도 약 2×10⁹개, 적어도 약 3×10⁹개, 적어도 약 4×10⁹개, 적어도 약 5×10⁹개, 적어도 약 6×10⁹개, 적어도 약 7×10⁹개, 적어도 약 8×10⁹개, 적어도 약 9×10⁹개, 또는 적어도 약 1×10¹⁰개, 또는 적어도 약 10×10¹⁰개, 또는 적어도 약 15×10¹⁰개, 또는 적어도 약 20×10¹⁰개, 또는 적어도 약 25×10¹⁰개, 또는 적어도 약 30×10¹⁰개의 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 적어도 약 1×10⁹개, 적어도 약 3×10⁹개, 적어도 약 4×10⁹개, 적어도 약 5×10⁹개, 적어도 약 6×10⁹개, 적어도 약 7×10⁹개, 적어도 약 8×10⁹개, 적어도 약 9×10⁹개 또는 적어도 약 1×10⁹개의 CD8⁺ 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 1×10⁹개 내지 약 4×10⁹개, 약 5×10⁹개 내지 약 7×10⁹개, 약 10×10⁹개 내지 약 30×10⁹개, 약 40×10⁹개 내지 약 60×10⁹개, 약 70×10⁹개 내지 약 90×10⁹개의 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 대상체에게 90×10⁹개 초과의 세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 5x10⁹개 내지 약 8x10⁹개, 약 10x10⁹개 내지 약 40x10⁹개, 약 50x10⁹개 내지 약 80x10⁹개의 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, 상기 방법은 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 세포 집단을 투여한 후 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 CTLA-4 길항제, PD1 길항제, TIM-3 길항제 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체, 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM-3 항체 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 체크포인트 활성화제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 TIL 집단을 투여한 후 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 체크포인트 활성화제는 OX40 작용제, LAG-3 작용제, 4-1BB(CD137) 작용제, GITR 작용제, TIM3 작용제 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 체크포인트 활성화제는 항-OX40 항체, 항-LAG-3 항체, 항-CD137 항체, 항-GITR 항체, 항-TIM3 항체 또는 이들의 조합을 포함한다.

일부 측면에서, 상기 방법은 사이토카인을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 사이토카인은 TIL 집단을 투여한 후 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 사이토카인은 IL-2이다.

일부 측면에서, 상기 방법은 세포 집단을 투여하기 전에 대상체에게 림프구고갈 요법(lymphodepleting therapy)을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 림프구 고갈 요법은 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 플루다라빈(fludarabine), 또는 사이클로포스파미드와 플루다라빈 모두를 포함한다.

본 개시내용의 일부 측면은 클론 다양성이 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 99% 내지 약 100%, 적어도 약 98% 내지 약 100%, 적어도 약 97% 내지 약 100%, 적어도 약 96% 내지 약 100%, 적어도 약 95% 내지 약 100%, 적어도 약 94% 내지 약 100%, 적어도 약 93% 내지 약 100%, 적어도 약 92% 내지 약 100%, 적어도 약 91% 내지 약 100%, 적어도 약 90% 내지 약 100%, 적어도 약 85% 내지 약 100%, 적어도 약 80% 내지 약 100%, 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 70% 내지 약 100%, 적어도 약 65% 내지 약 100%, 적어도 약 60% 내지 약 100%, 적어도 약 55% 내지 약 100%, 적어도 약 50% 내지 약 100%, 적어도 약 45% 내지 약 100% 또는 적어도 약 40% 내지 약 100%인 확장된 TIL 집단에 관한 것이다.

본 개시내용의 일부 측면은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.5 미만, 약 0.45 미만, 약 0.4 미만, 약 0.35 미만, 약 0.3 미만, 약 0.275 미만, 약 0.25 미만, 약 0.225 미만, 약 0.2 미만, 약 0.175 미만, 약 0.15 미만, 약 0.125 미만, 약 0.1 미만, 약 0.075 미만, 약 0.07 미만, 약 0.06 미만 또는 약 0.05 미만인 확장된 TIL 집단에 관한 것이다. 일부 측면에서, 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.3 미만이다. 일부 측면에서, 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.25 미만이다. 일부 측면에서, 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.2 미만이다. 일부 측면에서, 클론 다양성 점수는 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.1 미만이다.

일부 측면에서, 확장된 TIL의 집단은 적어도 약 2×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개 또는 적어도 약 1×10⁷개의 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 집단의 적어도 약 적어도 약 1×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개, 또는 적어도 약 1×10⁷개의 세포는 CD8+ 세포이다.

일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 50%는 CD8⁺ TIL이다.

일부 측면에서, 확장된 TIL은 고칼륨성이 아닌 대조군 배지에서 배양한 후 면역 세포 집단에서 TCF7 발현에 비해 MRM에서 배양한 후 TCF7의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺/CD62L⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 PD1⁺이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 CD39⁺이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 CD27⁺이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 CD28⁺이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 PD1⁺ CD39⁺이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 50%는 PD1⁺ CD27⁺이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 CD27⁺ CD62L⁺이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%는 CD27⁺ CD28⁺ CD103⁺ PD1⁺ TCF7⁺이다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 조성물 또는 본원에 개시된 확장된 TIL 집단은 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 적어도 하나의 면역 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 줄기 유사 마커는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+ 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서 줄기 유사 마커는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+ 및 TCF7+ 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 이펙터 유사 마커는 pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+, STAT3+ 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 조성물 또는 집단에서 확장된 TIL의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 약 100%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 적어도 하나의 면역 세포를 포함한다.

본 개시내용의 일부 측면은 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 TIL에 관한 것이다. 일부 측면에서, 줄기 유사 마커는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 줄기 유사 세포는 CD39- CD69-이다. 일부 측면에서, 줄기 유사 마커는 다음 중 하나 이상을 포함한다: CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, CD39-, 및 CD69-. 일부 측면에서, 줄기세포 마커는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, 및 TCF7+를 포함한다. 일부 측면에서, 이펙터 유사 마커는 pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+, STAT3+, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 TIL, 예를 들어, 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 포함하는 TIL을 포함하는 확장된 TIL 집단에 관한 것이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 약 100%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 포함하는 TIL을 포함한다.

본 개시내용의 일부 측면은 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 포함하는 TIL 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 개시내용의 특정 측면은 본원에 개시된 TIL, 본원에 개시된 확장된 TIL 집단, 또는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 병태의 치료가 필요한 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 질환 또는 병태는 암(종양)이다. 일부 측면에서, 종양은 체크포인트 억제제에 불응성이다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 재발된다. 일부 측면에서, 종양은 전이성이다.

일부 측면에서, TIL 집단은 대조군 배지에서 배양한 후 CD39^-/CD69^- TIL의 비율에 비해 MRM에서 배양한 후 증가된 비율의 CD39^-/CD69^- TIL을 포함한다.

일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 TIL 집단의 총 TIL 수의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35% 또는 적어도 약 40%는 CD39^-/CD69^-임을 포함한다.

일부 측면에서, 2차 TIL 배양 배지의 TIL의 배양은 하나 이상의 기체 투과성 용기에서 수행된다. 일부 측면에서, 3차(또는 최종) TIL 배양 배지에서 TIL의 배양은 하나 이상의 기체 투과성 용기에서 수행되지 않는다. 일부 측면에서, TIL은 2차 TIL 배양 배지에서의 TIL의 배양 및 3차(또는 최종) TIL 배양 배지에서의 TIL의 배양 사이에 분할된다.

본 개시내용의 일부 측면은 인간 대상체로부터 얻은 TIL을 확장하는 방법에 관한 것으로, (a) 4mM 초과의 칼륨 이온, CD3 작용제 및 항원 제시 세포를 포함하는 배지에서 TIL을 배양하는 단계("정적 REP 단계"); 및 (b) 4mM 초과의 칼륨 이온을 포함하는 배지를 정적 REP 단계로부터의 TIL에 첨가하되, 여기서 교반을 배양에 적용하는, 단계("동적 REP 단계")를 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP 단계 동안 CD3 작용제 및 항원 제시 세포가 첨가되지 않는다.

일부 측면에서, 교반은 흔들림을 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP 단계는 관류를 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 24시간마다 배양 작업 부피의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55% 또는 약 60%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 24시간마다 배양 작업 부피의 약 25%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 24시간마다 배양 작업 부피의 약 50% 비율로 연속 배지 교환을 포함한다.

일부 측면에서, 관류는 동적 REP 배양의 최초 48시간 동안 배양 24시간마다 작업 부피의 약 25% 비율로 연속 배지 교환을 포함하고, 여기서 관류는 동적 REP 배양의 나머지 부분에 대해 배양 24시간마다 작업 부피의 약 50%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다.

일부 측면에서, 연속 배지 교환은 신선한 MRM의 배양에 대한 첨가를 포함하며, 여기서 신선한 MRM은 항-CD-3 항체를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 연속 배지 교환은 신선한 MRM의 배양에 대한 첨가를 포함하며, 여기서 신선한 MRM은 항원 제시 세포를 포함하지 않는다.

일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도가 24시간마다 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 또는 약 60% 감소한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도가 동적 REP의 개시 후 적어도 약 24시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 75% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP 개시 후 적어도 약 48시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 45% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP 개시 후 적어도 약 72시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 35% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP 개시 후 적어도 약 96시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 27% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP 개시 후 적어도 120시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 21% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 생존 가능한 항원 제시 세포의 수는 동적 REP 개시 후 적어도 약 24시간에 정적 REP의 항원 제시 세포의 수 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 미만 약 5%이다. 일부 측면에서, 동적 REP 중 생존 가능한 항원 제시 세포의 수가 동적 REP 개시 후 적어도 약 48시간에 정적 REP의 항원 제시 세포 수의 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만인 배양이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 생존 가능한 항원 제시 세포의 수는 동적 REP 개시 후 적어도 약 72시간에 정적 REP의 항원 제시 세포 수의 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 생존 가능한 항원 제시 세포의 수는 동적 REP 개시 후 적어도 약 96시간에 정적 REP의 항원 제시 세포 수의 약 10% 미만이다.

일부 측면에서, 항-CD3 항체는 OKT-3을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 제시 세포는 조사된 PBMC를 포함한다.

일부 측면에서, TIL은 종양 단편의 해리 후 동결보존된다. 일부 측면에서 TIL은 사전 REP 이후에 동결보존된다. 일부 측면에서, TIL은 정적 REP 후 및 동적 REP 전에 동결보존된다. 일부 측면에서, TIL은 동적 REP 후 동결보존된다.

일부 측면에서, TIL은 약 5일 동안 정적 REP에 적용된다. 일부 측면에서, TIL은 약 6일 동안 정적 REP에 적용된다. 일부 측면에서, TIL은 약 7일 동안 정적 REP에 적용된다. 일부 측면에서, TIL은 약 9일 내지 약 12일 동안 동적 REP에 적용된다. 일부 측면에서, TIL은 약 9일 내지 약 13일 동안 동적 REP에 적용된다. 일부 측면에서, TIL은 약 5일 동안 정적 REP에 적용된 후 약 9일 동안 동적 REP를 지속한다. 일부 측면에서, TIL은 약 5일 동안 정적 REP에 적용되고 약 12일 동안 동적 REP를 지속한다. 일부 측면에서, TIL은 약 5일 동안 정적 REP에 적용되고 약 13일 동안 동적 REP를 지속한다.

일부 측면에서, 정적 REP 배양의 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양의 배지는 적어도 약 1000IU, 적어도 약 1100IU, 적어도 약 1200IU, 적어도 약 1300IU, 적어도 약 1400IU, 적어도 약 1500IU, 적어도 약 1600IU, 적어도 약 1700IU, 적어도 약 1800IU, 적어도 약 1900IU, 또는 적어도 약 2000IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양의 배지는 약 1500IU IL-2를 포함한다.

일부 측면에서, 정적 REP 배양의 배지는 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 적어도 약 5ng/mL, 적어도 약 6ng/mL, 적어도 약 7ng/mL, 적어도 약 8ng/mL, 적어도 약 9ng/mL, 적어도 약 10ng/mL, 적어도 약 11ng/mL, 적어도 약 12ng/mL, 적어도 약 13ng/mL, 적어도 약 14ng/mL, 또는 적어도 약 15ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양의 배지는 약 10ng/mL IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, 정적 REP 배양의 배지는 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양의 배지는 적어도 약 0.1ng/mL, 적어도 약 0.2ng/mL, 적어도 약 0.3ng/mL, 적어도 약 0.4ng/mL, 적어도 약 0.5ng/mL, 적어도 약 0.6ng/mL, 적어도 약 0.7ng/mL, 적어도 약 0.8ng/mL, 적어도 약 0.9ng/mL, 또는 적어도 약 1ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양의 배지는 약 0.4ng/mL IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, 정적 REP 배양의 배지는 약 1500IU IL-2, 약 10ng/mL IL-21, 및 약 0.4ng/mL IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지의 배지는 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 적어도 약 1000IU, 적어도 약 1100IU, 적어도 약 1200IU, 적어도 약 1300IU, 적어도 약 1400IU, 적어도 약 1500IU, 적어도 약 1600IU, 적어도 약 1700IU, 적어도 약 1800IU, 적어도 약 1900IU, 또는 적어도 약 2000IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1500IU IL-2를 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 적어도 약 5ng/mL, 적어도 약 6ng/mL, 적어도 약 7ng/mL, 적어도 약 8ng/mL, 적어도 약 9ng/mL, 적어도 약 10ng/mL, 적어도 약 11ng/mL, 적어도 약 12ng/mL, 적어도 약 13ng/mL, 적어도 약 14ng/mL, 또는 적어도 약 15ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 10ng/mL IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 적어도 약 0.1ng/mL, 적어도 약 0.2ng/mL, 적어도 약 0.3ng/mL, 적어도 약 0.4ng/mL, 적어도 약 0.5ng/mL, 적어도 약 0.6ng/mL, 적어도 약 0.7ng/mL, 적어도 약 0.8ng/mL, 적어도 약 0.9ng/mL, 또는 적어도 약 1ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 0.4ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1500IU IL-2, 약 10 ng/mL IL-21, 및 약 0.4ng/mL IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, 정적 REP 이전에 TIL은 초기 TIL 확장에 적용된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 확장은 종양 샘플 또는 이의 일부를 MRM에서 배양하는 것을 포함하며, 여기서 MRM은 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 초기 TIL 확장 동안 IL-7, IL-15, IL-21, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 초기 TIL 배양 동안 IL-2 및 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 초기 TIL 배양 동안 약 6000IU/mL IL-2 및 약 30ng/mL IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 약 11일 내지 약 15일 지속된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 적어도 약 11일 지속된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 적어도 약 13일 지속된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 적어도 약 15일 지속된다.

일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 초기 TIL 배양의 세포 수율이 적어도 약 10x10⁶ 내지 50x10⁶ 세포에 도달할 때까지 지속된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 초기 배양의 세포 수율이 적어도 약 10x10⁶, 적어도 약 15x10⁶, 적어도 약 20x10⁶, 적어도 약 25x10⁶, 적어도 약 30x10⁶, 적어도 약 35x10⁶, 적어도 약 40x10⁶, 적어도 약 45x10⁶, 또는 적어도 약 50x10⁶ 세포에 도달할 때까지 지속된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 초기 배양의 세포 수율이 적어도 약 30x10⁶ 세포에 도달할 때까지 지속된다.

일부 측면에서, 초기 TIL 확장은 TIL을 TRANSACT™와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 초기 TIL 배양의 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 TRANSACT™와 접촉된다. 일부 측면에서, TIL은 초기 TIL 배양의 약 4일에 TRANSACT™와 접촉된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 확장은 TIL을 4-1BB 리간드와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 초기 TIL 배양의 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일에 4-1BB 리간드와 접촉된다. 일부 측면에서, TIL은 초기 TIL 배양의 약 4일에 4-1BB 리간드와 접촉된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 확장은 초기 TIL 배양의 약 4일에 TIL을 TRANSACT™ 및 4-1BB 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다.

본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 방법에 의해 얻어진 TIL의 집단에 관한 것이다. 일부 측면에서, CD8+ TIL의 약 20% 내지 약 80%는 줄기 유사 TIL이다. 일부 측면에서, CD8+ 세포의 적어도 50% 내지 90%는 추정 종양 반응성 TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 35% 내지 90%는 종양 반응성 TIL이다.

본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 TIL의 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 대상체는 암을 앓고 있다. 일부 측면에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 흑색종, 결장암, 폐암, 자궁경부암, 위장관암, 유방암, 전립선암, 간암, 골암, 췌장암, 두경부의 소세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 췌장 선암종, 두경부 편평 세포 암종, 고환 생식 세포 종양, 위 선암종, 피부 흑색종, 중피종, 신장 투명 세포 암종, 자궁경부 편평 상피세포 암종 및 자궁경내 선암종, 식도 암종, 방광 요로상피 암종, 유방 침윤성 암종, 신장 유두 세포 암종, 결장 선암종, 또는 이들의 임의의 조합에서 유래된 고형 종양을 포함한다.

일부 측면에서, 종양은 체크포인트 억제제에 불응성이다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 재발된다. 일부 측면에서, 종양은 전이성이다.

도 1a-1f는 종양 단편으로부터 TIL을 배양하고 확장하는 예시적인 과정을 보여주는 개략도이다. 도 1a-1b는 초기 확장 및 2차 확장을 포함하는 예시적인 과정을 보여주며, 여기서 TIL은 초기 TIL 배양에서 2차 TIL 확장으로의 전이 시(도 1a-1b) 및 초기 TIL 배양 동안(도 1b)(예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라, 예를 들어, 세포를 4-1BBL, TRANSACT™, 항-CD3 항체, 항원 제시 세포 또는 이들의 임의의 조합과 접촉시킴으로써) 선택적으로 자극된다. 도 1c-1d는 초기 확장, 2차 확장 및 최종 확장을 포함하는 예시적인 과정을 보여주며, 여기서 TIL은 (ⅰ) 초기 TIL 배양에서 2차 TIL 확장으로의 전이 시(도 1c-1d); (ⅱ) 2차 TIL 확장에서 최종 TIL 확장으로의 전이 시(도 1c-1d); 및 (ⅲ) 초기 TIL 배양 동안(도 1d) 선택적으로 자극된다. 도 1e-1f는 미성숙 TIL을 생성하기 위한 예시적인 과정을 보여주며, 여기서 초기 확장 및 2차 확장은 기간이 더 짧고, 예를 들어, 각각의 확장에 대해 11일(또는 그 미만)이고, TIL은 초기 TIL 배양에서 2차 TIL 확장으로의 전이 시(도 1e-1f) 및 초기 TIL 배양 동안(도 1f) 선택적으로 자극된다.
도 2a-2b는 T 세포 배양액(T cell conditioned media)(예를 들어, CTS™ OPTIMIZER™; 본원에서 "대조군 배지"라고도 함; 도 2a) 또는 대사 재프로그래밍 배지(본원에서 "MRM"이라고도 함; 도 2b)에서 초기 배양(14일) 후 TIL의 FACS 세포 표현형의 그래프 표시이다. 도 2a 및 2b는 MRM에서의 배양이 대조군 배지에서 배양된 TIL과 비교하여 CD39 및 PD1의 발현이 강화된 TIL(20% 초과)을 생성하였음을 보여준다. 도 2c는 대조군 또는 MRM에서 다양한 종양 유형으로부터의 TIL을 배양함으로써 얻은 CD8⁺ 세포의 백분율의 각각의 차이를 보여주는 산점도(scatter plot)이다. 연결된 각 점은 동일한 샘플에서 얻은 TIL을 나타내며 해당 도면은 13명의 환자의 데이터를 요약한 것이다. 별표는 대조군 배지에서 배양한 후 CD8⁺ TIL의 평균 백분율이 MRM에서 배양한 후 CD8⁺ TIL의 평균 백분율과 상당히 상이하다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 MRM에서 TIL을 배양하면 대조군 배지에서 TIL을 배양하는 것과 비교하여 CD8⁺ T 세포가 농축됨을 보여준다.
도 3a-3e는 대조군 배지(도 3a 및 3c) 또는 MRM(도 3b 및 3d)에서 14일 배양한 후 배양된 CD4⁺(도 3a-3b) 및 CD8⁺(도 3c-3d) TIL의 PD1 및 CD27의 발현에 기초한 FACS 세포 표현형의 도해적 표현(graphical representation)이다. 도 3c는 대조군 또는 MRM에서 다양한 종양 유형으로부터의 TIL을 배양함으로써 얻은 CD27⁺PD1⁺ 세포의 백분율의 각각의 차이를 나타내는 산점도이다. 각각의 연결된 점은 동일한 샘플에서 얻은 TIL을 나타내며 도 3c는 9명의 환자의 데이터를 요약한 것이다. 별표는 대조군 배지에서 배양한 후 CD27⁺PD1⁺ TIL의 평균 백분율이 MRM에서 배양한 후 CD27⁺PD1⁺ TIL의 평균 백분율과 상당히 상이하다는 것을 나타낸다. 이러한 데이터는 MRM에서 TIL을 배양하면 대조군 배지에서 TIL을 배양하는 것과 비교하여 CD27⁺PD1⁺ T 세포가 농축됨을 보여준다.
도 4는 초기 배양(14일) 후 대조군 배지 또는 MRM에서 다양한 종양 유형으로부터의 TIL을 배양하여 얻은 CD27⁺CD28⁺ 세포의 백분율의 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 도해적 표현이다. 각각의 연결된 점은 동일한 샘플에서 얻은 TIL을 나타내며 도 4는 9명의 환자로부터의 데이터를 요약한 것이다. 이러한 데이터는 MRM에서 TIL을 배양하면 대조군 배지에서 배양된 TIL과 비교하여 CD27⁺CD28⁺ T 세포가 농축됨을 보여준다.
도 5a-5b는 대조군 배지(도 5a) 또는 MRM(도 5b)에서 배양된(14일) TIL의 FACS 세포 표현형의 도해적 표현으로, 처음은 CD8 또는 CD4 발현에 의한 게이팅, 이어서 CD28 및 CD27 발현에 의한 게이팅, 이어서 CD103 및 CD27 발현에 의한 게이팅, 이어서 PD1 및 CD103 발현에 의한 게이팅, 마지막으로 TCF7 및 CD27 발현에 의한 게이팅이다. 도 5c는 대조군 배지(1) 또는 MRM(2)에서 초기 배양(약 14일)한 후 TCF7⁺ TIL의 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity, MFI)를 나타내는 도해적 표현이다.
도 6a-6h는 2차 확장(약 21-26일) 후 대조군 배지(도 6a-6d) 또는 MRM(도 6e-6h)에서 확장된 TIL의 FACS 세포 표현형의 도해적 표현으로, 처음은 CD8 또는 CD4 발현에 의한 게이팅(도 6a 및 6e), 이어서 CD8+ 세포에 게이팅된 CD28 및 CD27 발현(도 6b 및 6f), 이어서 CD8+ 세포에 게이팅된 PD1 및 CD27 발현(도 6c 및 6g), 마지막으로 CD8+ 세포에 게이팅된 TCF7 및 CD39 발현(도 6d 및 6h)이다. 도 6b-6d 및 6f-6h는 CD8⁺ 세포이다.
도 7a-7h는 2차 확장(약 21일) 후 대조군 배지(도 7a-7d) 또는 MRM(도 7e-7h)에서 돌연변이체 KRAS 펄스 수지상 세포와의 공동 배양에 의해 확장된 CD8⁺ TIL의 FACS 세포 표현형의 도해적 표현으로, 처음은 CD8 또는 CD4 발현에 의한 게이팅(도 7a 및 7e), 이어서 CD8⁺ 세포에 게이팅된 CD28 및 CD27 발현(도 7b 및 7f), 이어서 CD8⁺ 세포에 게이팅된 PD1 및 CD27 발현(도 7c 및 7g), 마지막으로 PD1⁺ 단독 및 CD27⁺, PD1⁺ 세포에 게이팅된 TCF7 및 CD8 발현(도 7d 및 7h)이다. 도 7b-7d 및 7f-7h는 CD8⁺ 세포이다.
도 8a-8h는 2차 확장(약 21일) 후 대조군 배지(도 8a-8d) 또는 MRM(도 8e-8h)에서 야생형 KRAS 펄스 수지상 세포와의 공동 배양에 의해 확장된 TIL의 FACS 세포 표현형의 도해적 표현으로, 처음은 CD8 또는 CD4 발현에 의한 게이팅(도 8a 및 8e), 이어서 CD8⁺ 세포에 게이팅된 CD28 및 CD27 발현(도 8b 및 8f), 이어서 CD8⁺ 세포에 게이팅된 PD1 및 CD27 발현(도 8c 및 8g), 마지막으로 PD1⁺ 단독 및 CD27⁺, PD1⁺ 세포에 게이팅된 TCF7 및 CD8 발현(도 8d 및 8h)이다. 도 8b-8d 및 8f-8h는 CD8⁺ 세포이다.
도 9a-9b는 대조군 배지(도 9a) 또는 MRM(도 9b)에서 2차 확장(약 21-26일) 후 배양된 TIL의 FACS 세포 표현형의 도해적 표현이다.
도 10은 2차 확장(약 21일) 후 대조군 배지 또는 MRM에서 배양된 TIL에서 IL-2, B2M, GZMB, IFNγ 및 TCF7의 유전자 발현의 변화 배수(FC)를 나타내는 막대 그래프이다. 각 유전자의 발현은 대조군 배지에서 배양된 TIL에서의 발현에 대해 정규화된다.
도 11a-11l은 2차 확장(약 21-26일) 후 대조군 배지(도 11a, 11b, 11e 및 11f) 또는 MRM(도 11c, 11d 및 11g-11l)에서 배양된 CD4⁺ 또는 CD8⁺ TIL의 FACS 세포 분리(cell sorting)의 도해적 표현으로, PD1 발현(도 11a-11d) 또는 CD103 발현(도 11e-11h) 및 CD39 발현(도 11a-11h)에 의한 게이팅이다. 도 11i-11l은 PD1 및 CD39 발현(도 11i-11j)에 이어 CD45RO 및 CD103 발현(도 11k-11l)에 게이팅된 CD4⁺ TIL(도 11i 및 11k) 및 CD8⁺ TIL(도 11j 및 11l)의 게이팅을 보여준다.
도 12는 종양 단편("종양"), 대조군 배지를 사용하여 확장된 TIL("대조군") 및 대사 재프로그래밍 배지("MRM")를 사용하여 확장된 TIL의 면역 세포에 대한 심슨 클론성 값을 나타내는 막대 그래프이다.
도 13a-13b는 대조군 배지에서 확장된 TIL(도 13a) 및 MRM에서 확장된 TIL(도 13b)에 대해 도 12에 제시된 데이터를 사용하여 생성된 차등 풍부도(differential abundance, DA) 플롯이다. 도 13c-13d는 대조군 배지(도 13c) 또는 MRM(도 13d)에서 배양된 TIL 집단에서 상위 50개의 우세 종양 TCR의 종양 항원 인식의 도해적 표현이다.
도 14는 MRM에서 배양한 TIL의 KRAS 돌연변이 활성을 보여주는 다이아그램이다. ¹서열번호 6; ²서열번호 1; ³서열번호 7; ⁴서열번호 8; ⁵서열번호 9; ⁶서열번호 10; ⁷서열번호 11.
도 15a-15d는 분비된 IFN-감마(도 15a 및 15d), 분비된 IL-2(도 15a), 분비된 TNF-알파(도 15b), 종양 세포 살해 백분율(도 15c)에 의해 입증되는 바와 같이 대조군 배지 또는 MRM을 사용하여 생성된 TIL의 종양 인식 및 종양 살해 활성을 나타내는 막대 그래프이다. A = 대조군 배지를 사용하여 생성된 TIL 및 B = MRM을 사용하여 생성된 TIL(도 15a, 15b 및 15d); "대조군 TIL" = 대조군 배지를 사용하여 생성된 TIL 및 "MRM TIL" = MRM을 사용하여 생성된 TIL(도 15c); 및 "TC 라인" = 종양 세포주(도 15d).
도 16은(화살표로 표시된 시간에) TIL과의 접촉 및 공동 배양 후 시간 경과에 따라 생체 외에서 배양된 자가 흑색종 종양 세포의 세포 용해 백분율의 도해적 표현이다. TIL을 대조군 배지 또는 MRM에서 배양하고 표시된 대로 배양된 종양 세포에 1:1의 이펙터 T 세포(E) 대 종양 세포(T), 2:1의 E:T 및 4:1의 E:T의 비율로 첨가하였다.
도 17a-17h는 대조군 공정(도 17a-17d) 또는 MRM(17e-17h)을 사용하여 확장된 NSCLC TIL에서 마커 유전자의 발현을 나타내는 도해적 표현이다. MRM에서 확장된 TIL은 CD8⁺ T 세포 분획, 낮은 CD39/CD69 발현(도 17b 및 17d), 중앙 기억(CD45RO+CD6L+; 도 17c 및 17g) 및 높은 CD27 발현(도 17d 및 17h)에 의해 측정된 바와 같이 우수한 표현형 특징을 나타냈다. 점선으로 강조한 박스는 불리한 표현형을 나타내고 실선으로 강조한 박스는 유리한 표현형을 나타낸다.
도 18a-18c는 흑색종(도 8a), NSCLC(도 18b) 또는 결장직장암(도 18c)으로부터 얻은 TIL에서 T 세포 구획 내의 CD39 및 CD69 모두의 CD8+ T 세포에 의한 음성 발현을 나타내는 도해적 표현이다. 신선하게 공급된 인간 종양 샘플로부터 배양을 개시하고 세포를 대조군 또는 MRM 조건하에 확장시켰다. 최종 급속 확장 과정(rapid expansion process, REP) 후, T 세포 구획 내의 CD39 및 CD69 모두의 CD8+ T 세포에 의한 음성 발현에 대해 TIL을 분석하였다. 각각의 분석에 대해, 흑색종(n=6개의 독립적인 종양), NSCLC(n=5개의 독립적인 종양) 및 결장직장암(n=11개의 독립적인 종양)에서 확장된 TIL을 평가하였다. 통계적 유의성은 대응표본 t 검정(paired t test)으로 측정하였다. *** p<.001, * p<.05.
도 19a 및 19b는 비소세포 폐암(NSCLC)(도 19a) 및 흑색종(도 19b)에 대한 종양 단편("종양"), 대조군 배지를 사용하여 확장된 TIL("대조군") 및 대사 재프로그래밍 배지("MRM")를 사용하여 확장된 TIL의 면역 세포에 대한 심슨 클론성 값을 나타내는 막대 그래프이다.
도 20a-20j는 표준(AIM-V에서 배양된 TIL), 대조군(대조군 배지에서 배양된 TIL) 또는 MRM(MRM에서 배양된 TIL) 공정에 의해 배양된 CD8(도 20a-20f) 및 CD4(도 20g-20i) TIL 생성물에 대한 줄기 유사(20a-20c 및 20g-20i) 및 고갈(도 20d-20f, 20g, 20h 및 20j) 표현형을 보여주는 데이터를 제시한다. 도 20a, 20d 및 20g는 CD8(도 20a 및 20d) 및 CD4(도 20g) TIL의 대량 RNAseq(도 20a 및 20d)에 의해 측정된 바와 같은 줄기 유사 마커(도 20a 및 20g) 및 고갈 마커(도 20d 및 20g)의 발현을 예시하는 히트맵이다. 도 20b(줄기 유사 마커), 20e(고갈 마커), 및 20h(줄기 유사 및 고갈 마커)는 다양한 유전자세트에 대한 조사 결과를 요약한다. 도 20c는 줄기 유사 CD8 세포의 비율의 도해적 표현이다(각 데이터 세트는 단일 공여자를 나타냄). 도 20f는 고갈된 CD8 세포의 비율의 도해적 표현이다(각 데이터 세트는 단일 공여자를 나타냄). 도 20i는 줄기 유사 CD4 세포의 비율의 도해적 표현이다(각 데이터 세트는 단일 공여자를 나타냄). 도 20j는 고갈된 CD4 세포의 비율의 도해적 표현이다(각 데이터 세트는 단일 공여자를 나타냄).
도 21a-21b는 표준, 대조군, 또는 MRM 공정에 의해 배양된 TIL 생성물에서 대사 표현형 및 세포 주기와 관련된 다양한 유전자의 발현을 예시하는 데이터를 제시한다. 도 21a는 CD8 TIL의 대량 RNAseq에 의해 측정된 바와 같은 대사 표현형 및 세포 주기 마커의 발현을 예시하는 히트맵이다. 도 21b는 다양한 유전자세트에 대한 조사 결과를 요약한다.
도 22a-22h는 6명의 공여자로부터의 0일째 gMACS T 세포에 대해 수행된 CITEseq + scTCRseq의 결과의 도해적 표현이다. 도 22a는 개별 6개의 공여자 샘플 각각의 결과의 오버레이를 보여준다(도 22b-22g).
도 23a-23d는 표준, 대조군 또는 MRM 공정에 의해 배양된 TIL 생성물의 CD8(도 23a-23b) 및 CD4(도 23c-23d) 구성요소에 대한 0일째 5' CITEseq 데이터 및 대량 TCR 빈도(상위 100개 클론)의 고갈된 표현형을 기반으로 각 샘플에서 확인된 추정 종양 반응성 클론의 수를 보여준다. 도 23e는 세 과정 각각에 대한 다양한 공여자에 대한 줄기 유사 생성물 클러스터 내 종양 반응성 클론의 수를 예시하는 막대 그래프이다.
도 24a-24f는 MRM 추정 종양 반응성 세포가 AIM-V 및 대조군 추정 종양 반응성 세포와 비교하여 차등적으로 발현된 유전자를 갖는다는 것을 예시하는 데이터를 제공한다. 도 24a는 Zhang_TEX_3 종양 유전자 세트의 차등적 발현을 보여주는 히트맵이다(표 3 참조). 도 24b는 다양한 유전자 세트의 조사 결과를 제공한다. 도 24c-24f는 표준(도 24c 및 24d), 대조군(24c 및 24e), 또는 MRM(도 24c 및 24f) 공정에 의해 배양된 TIL 생성물에서 SEL 및 IL7R RNA(도 24c) 및 CD39 및 CD69 단백질(도 24c-24f)의 차등적 발현을 보여주는 도해적 표현이다.
도 25a 및 25b는 MRM 프로토콜(1:1, 5:1 및 10:1의 E:T 비율; 도 25a) 또는 표준, 대조군, MRM 및 10:1의 E:T 비율에서 자가 종양 세포와의 공동 배양에서 4-1BB/TRANSACT™ 부스트 공정이 없는 경우 MRM에 의해 배양된 TIL 생성물에 의한 세포용해 백분율(%)의 도해적 표현이다(도 25b).
도 26a-26c는 4-1BB를 발현하는 종양 반응성 클론의 비율의 도해적 표현이다. 도 26d는 다양한 분화 및 고갈 마커 유전자의 차등적 발현을 예시하는 히트맵이다. 각 공정 그룹의 고유 클론 수는 도 26e에 표시된다.
도 27a-27c는 공정 각각에 대해 1.5배를 초과하는 사전 REP TIL 확장에 도달할 가능성을 보여주는 원형 차트이다. 도 27d-27f는 출발 물질로서 전이성 결장(도 27d), 전이성 흑색종(도 27e), 및 NSCLC(도 27f) 종양을 사용하여 각 공정에 대해 달성된 사전 REP 배수 확장을 보여준다. 사전 REP 배수 확장은 사전 REP 말의 세포 수와 비교하여 시딩된 세포 수에 기반하여 계산되었다. 도 27g는 공정 각각에 대해 REP에 이후의 TIL의 배수 확장을 보여준다. REP 배수 확장은 REP 말의 세포 수와 비교하여 시딩된 세포 수에 기반하여 계산되었다. 도 27h 및 27i는 REP 후 각각 건강한 PBMC 및 조사된 PBMC의 증식을 나타내는 CTV 희석 분석 결과를 나타낸다.
도 28은 TIL 생성물의 표현형 분석을 위한 게이팅 전략을 보여준다. TIL 생성물은 FSCA 대 SSCA에 의해 림프구에 대해 게이팅된 다음, FSCA 대 FSCH에 의해 단일항, FSCA에 대한 배제 염료에 의해 살아있는 세포, CD3 대 FSCA에 의해 CD3+ T 세포에 대해 게이팅되었다. 생성물 특성화를 위해 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 CD8과 CD4를 비교하여 별도로 게이팅했다. CD8+ T 세포는 CD69에 대해 CD39를 플롯팅하고 이중 양성 집단(CD39+CD69+) 및 이중 음성 집단(CC39-CD69-)에 대한 게이팅을 통해 줄기 특성에 대해 추가로 분석되었다. CD8+ T 세포 서브세트의 줄기 유사 이중 양성 집단의 경우, CD62L과 CD27 또는 CD27과 CD127을 서로에 대해 플롯팅하고 이중 양성 집단(CD62L+CD27+ 또는 CD27+CD127+)에 대해 게이팅했다.
도 29a-29b는 표준품, 대조군 및 MRM 생성물 중 CD8+(도 29a) 및 CD4+(도 29b)의 퍼센트를 나타내는 상자 도표이다. CD3+ T 세포는 대조군과 Epi-R TIL 세포 생성물 모두에서 CD8 대 CD4에 대해 게이팅되었다. 쌍을 이루는 T 테스트로 계산된 통계적 유의성. P-값은 NS, *P<0.05, **P<0.01로 정의되었다.
도 30a-30d는 각 공정에 대한 CD8+ TIL의 다양한 표면 단백질 수준을 나타내는 상자 그림이다. 유세포 분석 표면 단백질 발현에 기초하여, CD8+ TIL을 CD8 대 CD27에 플롯팅하고, CD27+ 집단의 부모 빈도(P<0.0001) 및 조부모 빈도(P<0.0001)를 계산했다. CD8+ TIL은 CD62L 대 CD27(P<0.0001) 또는 CD127 대 CD27(P=0.0011)에 플롯팅되었으며 두 이중 양성 집단 모두에 대한 부모의 빈도 백분율이 계산되었다. 쌍을 이루는 T 테스트로 계산된 통계적 유의성. P-값은 NS, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001로 정의되었다.
도 31a-31c는 유세포 분석 표면 단백질을 기준으로 표준, 대조군 및 MRM 생성물에 대한 CD39-CD69- 줄기 유사(도 31a-31b) 및 CD39+CD69+(도 31c) CD8+ TIL의 수준을 나타내는 상자 그림이다. 쌍을 이루는 T 테스트로 계산된 통계적 유의성. P-값은 NS, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001로 정의되었다.
도 32a-32b는 유세포 분석 표면 단백질 발현을 기준으로 표준, 대조군 및 MRM 생성물에 대한 CD39-CD69-줄기 유사(도 32a) 및 CD39+CD69+(도 32b) CD4+ TIL의 수준을 나타내는 상자 그림이다. 쌍을 이루는 T 테스트로 계산된 통계적 유의성. P-값은 NS, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001로 정의되었다.
도 33은 심슨 클론성에 의해 측정된, 표준, 대조군 및 MRM 공정을 사용하여 생성된 원시 종양 세포 및 TIL 생성물의 다클론성을 예시하는 상자 플롯이다.
도 34는 실시예 18에 추가로 기술된 바와 같이 추정 종양 반응성 클론을 식별, 추적 및 분석하기 위한 실험 설계의 도식을 제공한다.
도 35a는 심슨 클론성 지수를 사용하여 다음 TIL 생성물의 다클론성을 나타내는 상자 도표를 제공한다: (i) 초기 종양 세포("종양"), 및 (ii) 연구 규모에서 MRM 공정("MRM")을 사용하여 생성됨.
도 35b는 연구 규모의 MRM 공정 또는 대규모 MRM 공정을 사용하여 생성된 TIL 생성물의 다클론성을 예시하는 상자 플롯을 제공한다. TIL 생성물의 다클론성은 심슨 클론성 지수를 사용하여 표시된다.
도 36a는 다양한 이펙터 대 표적 세포 비율: (i) 10:1, (ii) 5:1, (iii) 1:1 및 (iv) 0:1에서 MRM 과정을 사용하여 생성된 TIL에 의한 자가 종양 세포 사멸을 보여준다.
도 36b-36c는 항-CD3/CD28 항체를 사용한 시험관 내 자극 후 염증성 사이토카인(도 36b) 및 면역억제성 사이토카인(도 36c)을 생성하는 MRM 공정을 사용하여 생성된 TIL의 능력을 보여준다. 자극되지 않은 세포를 대조군으로 사용했다. 도 36b에서, 도시된 전염증성 사이토카인은 IFN-γ(왼쪽 그래프), TNF-α(가운데 그래프) 및 IL-2(오른쪽 그래프)를 포함한다. 도 36c에서, 도시된 면역억제성 사이토카인은 IL-4(왼쪽 그래프), IL-5(가운데 그래프) 및 IL-13(오른쪽 그래프)을 포함한다.
도 37a-37d는 단일 세포 RNA/TCR 및 대량TCR 서열분석 후 0일의 종양 샘플(11개 흑색종, 3개 폐암 및 2개 결장암)로부터 추정 종양-반응성 클론의 식별을 위한 UMAP 표현을 보여준다. 도 37a는 CD4+ T 세포와 대조적으로 CD8+ T 세포를 향한 확인된 추정 종양-반응성 클론의 편향을 보여준다. 도 37b 및 37c는 CXCL13, 4-1BB, PD-1 및 TIGIT 발현에 기초한 종양 반응성 표현형의 확인을 보여준다. 도 37d는 대량TCR-seq에서 종양 반응성 표현형 및 높은 빈도로 확인된 세포를 보여준다.
도 38a 및 38b는 확인된 상위 3개의 추정 종양 반응성 TCR(즉, TCR 1, TCR 2 또는 TCR 3) 중 하나를 발현하도록 변형된 건강한 공여자로부터의 T 세포의 항종양 활성 비교를 제공한다. 도 38a는 시험관 내 사멸 검정을 사용하여 자가 종양 세포를 사멸시키는(5:1 이펙터:표적 비율에서) 상이한 변형된 T 세포의 능력을 보여준다. 종양 단독 그룹을 대조군으로 사용하였다. 도 38b는 자가 종양 세포(즉, "TR TCR 1", "TR TCR 2" 및 "TR TCR 3") 로 시험관 내 자극 후 다양한 변형된 T 세포에 의한 IFN-γ생산을 보여준다. 종양 단독 및 자극되지 않은 세포(즉, "TIL 단독")를 대조군으로 사용했다.
도 39는 높은 빈도로 테스트했을 때 종양 반응성이 있는 것으로 확인된 추정 종양 반응성 클론의 검증을 제공한다. MRM 공정을 사용하여 생산된 TIL을 표적(자가 종양 세포주 또는 해리된 종양 현탁액)과 공동 배양한 후 TIL 활성화(41BB+/IFN-γ+)를 측정하여 종양 반응성을 확인했다.
도 40a-40d는 scRNAseq/scTCRseq 분석에 기초한 대조군 공정 또는 MRM(연구 규모 또는 대규모)을 사용한 확장 후 추정 종양 반응성 클론의 표현형 특성화의 UMAP 표현을 보여준다. 총 23개의 서로 다른 TIL 생성물이 분석되었다(9개 대조군 생성물, 9개 MRM - 연구 규모, 6개 MRM - 대규모). 도 40a-40d의 각각에서, 좌측에는 대조군, 중앙에는 MRM(연구 규모), 우측에는 MRM(대규모)을 나타내었다. 도 40a는 제어, MRM 연구 규모 및 MRM 대규모 조건 하에 확장된 TIL 생성물 내 세포의 UMAP 표현을 보여준다. 도 40b는 SELL(왼쪽), CD39(중앙) 또는 CD69(오른쪽)의 발현에 의해 확인된 UMAP 표현 줄기 유사 클러스터와 표 3에 나열된 유전자 세트를 보여준다. 줄기 유사 클러스터는 SELL+, CD39- 및 CD69-로 확인되었다. 도 40c는 다양한 TIL 그룹 내의 모든 줄기유사 세포의 UMAP 표현을 보여준다. 도 40d는 다양한 TIL 그룹 내에 존재하는 추정 종양 반응성 세포의 UMAP 표시를 제공한다.
도 41a 및 41b는 다음을 사용하여 배양한 후 추정 종양 반응성 세포에서 줄기세포능(도 41a) 또는 고갈(도 41b)과 관련된 다양한 유전자의 상대적 발현을 보여주는 다음의 히트맵 분석을 제공한다: (i) 대조군 공정, (ii) 연구 대규모 MRM 공정, 또는 (iii) 다양한 종양 유형에 대한 대규모 MRM 공정.
도 41c 및 41d는 대조군 공정 또는 MRM 공정을 사용하여 배양한 후 추정 종양 반응성 세포에서 줄기세포능 관련 또는 고갈 관련 유전자 세트의 상대적 발현을 보여주는 유전자 세트 농축 분석(GSEA)을 제공한다. 도 41c는 대조군과 비교하여 MRM(연구 규모)에 대한 결과를 제공한다. 41d는 대조군과 비교하여 MRM(대규모)에 대한 결과를 제공한다.
도 42는 도 40c에 제시된 단일 세포 데이터의 도해적 표현이며, (i) 대조군 공정, (ii) MRM 연구 규모 과정 및 (iii) 결장직장 종양(CRC; 왼쪽), 전이성 흑색종(가운데) 및 비소세포 폐암(NSCLC; 오른쪽)에 대한 MRM 대규모 공정을 사용하여 확장된 TIL에 대한 CD8+ 줄기 유사 세포의 비율을 보여준다. 각 점은 한 공여자의 단일 세포 데이터를 나타낸다.
도 43a-43c는 이전에 면역 체크포인트 차단으로 치료되지 않은 종양("나이브") 또는 이전에 면역 체크포인트 차단("ICB")으로 치료받은 종양의 TIL에 대한 MRM 과정의 효과를 보여준다. TIL(치료받은 적이 없는 그룹과 ICB 그룹 모두)은 비교 목적("대조군")을 위해 대조군 공정을 사용하여 확장 및 배양되었다. 도 43a는 대조군과 ICB에 대한 REP 이전 배수 확장의 비교를 제공한다. 도 43b는 CD8+ T 세포 백분율의 비교를 제공한다. 도 43c는 CD39- CD69- 발현에 의해 입증된 바와 같은 줄기 유사 세포의 백분율을 제공한다.

본 개시내용은 면역 세포(예를 들어, TIL)를 배양하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 세포(예를 들어, 농축된 올리고클론 또는 다클론 종양 반응성, 예를 들어, 종양 특이적, 줄기 유사 T 세포 및/또는 CD8⁺ TIL을 포함하는 조성물) 및/또는 본원에 기술된 면역 세포를 사용하여 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 세포 배양 방법은 CD8⁺ TIL의 확장을 향상시킬 수 있고/있거나 배양된 TIL의 다능성(multipotency) 및/또는 전분화능(pluripotency)을 증가시킬 수 있다. 일부 측면에서, 상기 배양 방법은 면역 세포가 배양되고/되거나 면역 세포가 생체 내 요법에서 사용될 때, 면역 세포 고갈, 예를 들어, TIL 고갈을 감소 및/또는 예방할 수 있다. 일부 측면에서 본 개시내용의 배양 방법은 암 환자에서 유래된 TIL의 클론 다양성을 보존할 수 있다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 40mM 초과의 농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지에서 TIL의 이종 집단을 배양하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 TIL을 배양하는 방법에 관한 것으로, 상기 고칼륨성 배지는 고장성이 아니다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 적어도 5mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지에서 TIL의 이종 집단을 배양하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 CD8⁺ TIL의 수 또는 백분율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 종양 침윤 림프구(TIL)의 CD8⁺ 농축 집단을 제조하는 방법에 관한 것으로, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 적어도 5mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지에서 생체 외 또는 시험관 내에서 TIL의 이종 집단을 배양하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 종양 침윤 림프구(TIL)의 CD8⁺ 농축 집단을 제조하는 방법에 관한 것으로, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 40mM 내지 80mM 농도의 칼륨 이온 및 100mM 내지 30mM 농도의 NaCl을 포함하는 배지에서 생체 외 또는 시험관 내에서 TIL의 이종 집단을 배양하는 것을 포함하고, 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 고칼륨성 배지는 고장성이 아니다. 일부 측면에서, 고칼륨성 배지는 저장성이다. 일부 측면에서, 고칼륨성 배지는 등장성이다. 일부 측면에서, 고칼륨성 배지는 인터류킨(IL)-2, IL-21, IL-7, IL-15 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 고칼륨성 배지는 나트륨 이온, 칼슘 이온, 글루코스 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다.

본 발명을 더 상세하게 설명하기 전에, 본 개시내용이 기술된 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않으며, 이는 물론 다양함을 이해해야 한다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백한 바와 같이, 본원에 기술되고 예시된 각각의 개별 측면은 본 개시내용의 범위 또는 정신으로부터 벗어나지 않고 임의의 다른 여러 측면의 특징과 쉽게 분리되거나 결합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 언급된 임의의 방법은 언급된 사건의 순서 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.

본원에 제공된 제목은 본 명세서 전체를 참조하여 정의될 수 있는 본 개시내용의 다양한 측면을 제한하는 것이 아니다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 측면만을 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.

Ⅰ. 용어

본 개시내용을 더 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 본원에 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 다음 각 용어는 아래에 제시된 의미가 있다. 추가 정의는 본 출원 전반에 걸쳐 제시된다.

본 개시내용 전반에 걸쳐, 용어 "a" 또는 "an" 실체(entity)는 하나 이상의 해당 실체를 지칭한다; 예를 들어, "키메라 폴리펩티드"는 하나 이상의 키메라 폴리펩티드를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "a"(또는 "an"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각을 나머지 것과 함께 또는 없이 특정하게 개시한 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음의 각 측면을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독). 또한, "또는"은 목록에 있는 구성요소의 열린 목록을 의미한다. 예를 들어, "여기서 X는 A 또는 B를 포함한다"는 X가 A를 포함하거나, X가 B를 포함하거나, X가 A 및 B를 포함하거나, X가 A 또는 B와 임의의 다른 성분을 포함함을 의미한다.

본원에서 "포함하는"이라는 용어로 측면이 기술되는 경우, 용어 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"으로 기술되는 유사한 측면이 또한 제공되는 것으로 이해된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용과 관련된 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미가 있다. 예를 들어, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press는 당업자에게 본 개시내용에서 사용되는 많은 용어의 일반 사전을 제공한다.

단위, 접두사 및 기호는 SI(System International de Unites) 허용 형식으로 표시된다. 숫자 범위에는 범위를 한정하는 숫자가 포함된다.

본원에서 사용되는 약어는 본 개시내용 전반에 걸쳐 정의된다. 본 개시내용의 다양한 측면은 다음 서브섹션에서 더 상세히 설명된다.

용어 "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 당업자에 의해 결정되는 특정 값 또는 조성에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 당업계의 관행에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 최대 10%의 범위를 의미할 수 있다. 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여 상기 용어는 최대 한 자릿수 또는 최대 5배의 값을 의미할 수 있다. 특정 값 또는 조성이 본 출원 및 청구범위에 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 특정 값 또는 조성에 대해 허용 가능한 오류 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.

본원에서 사용되는, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략"은 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 일부 측면에서, 용어 "대략"은 달리 명시되지 않았거나 문맥에서 달리 명백하지 않은 한 명시된 기준 값의 각 방향(초과 또는 미만)으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다(이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외).

본원에 기술된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 명시되지 않는 한 인용된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적절한 경우 그의 분수(예컨대 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해해야 한다.

본원에서 사용되는 용어 "대조군 배지"는 본원에 개시된 대사 재프로그래밍 배지("MRM")와 비교하여 임의의 배지를 지칭한다. 대조군 배지는 특정 이온 농도, 예를 들어, 칼륨 이온을 제외하고 대사 재프로그래밍 배지와 동일한 성분을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 대사 재프로그래밍 배지는 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 이온 농도, 예를 들어, 칼륨 이온 농도를 조정함으로써 대조군 배지로부터 제조된다. 일부 측면에서, 대조군 배지는 기초 배지, 예를 들어, CTS™ OPTIMIZER™를 포함한다. 일부 측면에서, 대조군 배지는 AIM V, RPMI, 또는 AIM V와 RPMI를 포함하는 혼합물을 포함한다. 일부 측면에서, 대조군 배지는 (ⅰ) 50% AIM V, (ⅱ) 50% RPMI1640, (ⅲ) 5% 또는 10% 인간 혈청 및 (ⅳ) IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 따라서 대조군 배지는 대사 재프로그래밍 배지에도 첨가되는 아미노산, 글루코스, 글루타민, T 세포 자극제, 항체, 치환체 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가 성분을 포함하지만, 대조군 배지는 대사 재프로그래밍 배지와 특정 이온 농도가 상이하다. 달리 명시하지 않는 한 용어 "배지(media)"와 "배지(medium)"는 같은 의미로 사용할 수 있다.

본원에 사용된 "대조군 공정" 또는 "MRM 공정"은 본원에 개시된 방법을 지칭하며, 여기서 TIL 배양 및 확장 공정은 각각 대조군 배지 또는 MRM 배지를 포함한다. 따라서, "대조군 공정"은 변형된 농도의 칼륨(즉, 40mM 미만, 예를 들어 5mM, 칼륨 이온) 없이 AIM V 또는 TCM과 같은 본원에 개시된 대조군 배지에서 TIL을 배양하는 것을 지칭하고, "MRM 공정"은 본원에 개시된 MRM 배지에서 TIL을 배양하는 것을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "면역 세포"는 면역계의 세포를 의미한다. 일부 측면에서, 면역 세포는 T 림프구("T 세포"), B 림프구("B 세포"), 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 또는 호중구)로부터 선택된다. 일부 측면에서, 면역 세포는 종양 침윤 세포(TIL)이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "TIL"은 적어도 한 번 종양에 들어갔었거나 예를 들어, 종양의 실질(parenchyma) 내에서 종양에 들어갈 수 있는 T 세포를 지칭한다. 일부 측면에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 측면에서, 종양은 액상 종양, 예를 들어, 조혈암(hematopoietic cancer)이다. 본 방법에 의해 제조된 TIL은 천연 발생 TIL과 동일한 특성을 하나 이상 가질 수 있다. 일부 측면에서, 본 방법에 의해 제조된 TIL은 천연 발생 TIL에 존재하지 않는 특성을 하나 이상 갖는다. TIL은 임의의 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 일부 측면에서, TIL은 대상체로부터의 종양 샘플로부터 얻는다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 일부는 종양 조직으로부터 TIL의 회피(evasion), TIL의 증식 및/또는 TIL의 확장을 촉진하는 조건 하에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL의 회피, 증식 및/또는 확장을 촉진하는 데 사용되는 배지는 임의의 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 본원에 개시된 고칼륨성 배지이다.

본원에서 사용되는, 세포 "집단"은 하나 초과의 세포, 예를 들어, 복수의 세포의 집합체를 지칭한다. 일부 측면에서, 세포 집단은 하나 초과의 TIL, 예를 들어, 복수의 TIL을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 집단은 다중 유형의 세포를 포함하는 세포의 이종 혼합물, 예를 들어, TIL과 TIL 이외의 세포의 이종 혼합물을 포함한다.

TIL은 CD8+ T 세포(즉, 세포독성 T 세포), CD4+ T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. TIL은 1차(예를 들어, 환자 조직 샘플로부터 얻음) 및 2차 TIL(예를 들어, 1차 TIL로부터 배양, 확장 또는 증식된 TIL 세포 집단 둘 다를 포함한다. 일부 측면에서 TIL은 유전적으로 변형된다. 일부 측면에서, TIL은 CD8⁺ T 세포이다. CD8⁺ TIL은 일반적으로 암세포 파괴를 담당하는 TIL의 하위집단으로 간주된다. 반대로 CD4⁺ TIL은 일반적으로 종양에 대한 면역 반응을 제한할 수 있는, 면역 반응의 억제자로 작용하는 것으로 간주된다.

일부 측면에서, TIL은 세포 표면 마커를 사용하여 생화학적으로 정의될 수 있다. TIL은 일반적으로 다음 바이오마커 중 하나 이상을 발현함으로써 분류될 수 있다: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45RA, CD95, PD-1 및 CD25. 일부 측면에서, TIL은 종양에 침투하여 암세포를 선택적으로 살해하는 능력에 의해 기능적으로 정의될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 상호교환 가능하며 흉선(thymus gland)에 의해 생성되거나 처리되는 임의의 림프구를 지칭한다. T 세포의 비제한적 부류에는 이펙터 T 세포(예컨대 CD8⁺ T 세포) 및 Th 세포(예컨대 CD4⁺ T 세포)가 포함된다. 일부 측면에서, 면역 세포는 Th1 세포이다. 일부 측면에서, 면역 세포는 Th2 세포이다. 일부 측면에서, 면역 세포는 Tc17 세포이다. 일부 측면에서, 면역 세포는 Th17 세포이다. 일부 측면에서, 면역 세포는 T_reg 세포이다.

본원에 사용되는 용어 "기억" T 세포는 이전에 그의 동족 항원을 접하고 이에 반응하였거나(예를 들어, 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외) 예를 들어, 항-CD3 항체로 자극되었던(예를 들어, 시험관 내 또는 생체 외) T 세포를 지칭한다. 항원 또는 자극에 대한 2차 노출 시 "기억 유사" 표현형을 갖는 면역 세포, 예를 들어, TIL은 1차 노출 동안보다 더 빠르고 강한 면역 반응을 일으키기 위해 번식하거나 증식한다. 일부 측면에서, 기억 T 세포는 중앙 기억 T 세포(T_CM 세포), 이펙터 기억 T 세포(T_EM 세포), 조직 상주 기억 T 세포(T_RM 세포), 줄기 세포 유사 기억 T 세포(T_SCM 세포) 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "줄기 유사" 또는 "줄기세포 유사"는 세포가 자가 재생하는 특성 또는 능력을 지칭하며, 기억 및 이펙터 T 세포 하위세트의 전체 범위를 생성하고 재구성하는 다능성 능력이 있다. 일부 측면에서, 줄기 유사 세포는 이 세포에 의해 발현되는 특정 마커에 의해 측정될 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 줄기 유사 마커는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+ 및 TCF7+ 중 하나 이상일 수 있다. 일부 측면에서, 줄기 유사 세포는 CD39- 및 CD69- 발현을 기반으로 식별될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, 마커(예를 들어, CD39-)에 인접한 기호 "-"는 세포에 마커의 발현이 완전히 결여되어 있음을 반드시 나타내는 것은 아니다. 예를 들어, 일부 측면에서, CD39- 세포는 약간의 CD39 발현을 가질 수 있지만 그 발현은 기준 세포, 예를 들어 CD39+ 세포에 비해 훨씬 감소된다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, "CD39-세포"는 CD39의 발현이 없는 세포뿐만 아니라 기준 세포, 예를 들어 CD39+ 세포와 비교하여 CD39 발현이 감소된 세포를 포함할 수 있다. 도 55에 도시된 바와 같이, CD39- CD69- 세포(즉, 줄기 유사 세포)는 유동 세포측정법을 사용하여 식별할 수 있다. 예를 들어, CD39- CD69- 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 첫 번째 게이팅을 통해 식별할 수 있다(왼쪽 흐름도 참조). 그런 다음 CD39+ CD69+ 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 집단 내에서 식별된다(오른쪽 흐름도의 오른쪽 위 사분면 참조). CD39- CD69- 세포는 왼쪽 하단 두 개의 상자에 해당한다(두 개의 화살표 참조).(Krishna 등, Science 370 :1328-34(Dec. 11, 2020); 및/또는 Galletti 등, Nature Immunology(October 2018). 일부 측면에서, CD39 희미한/-CD69-줄기 유사 TIL은 FMO(형광 마이너스 1) 컨트롤을 사용하여 CD39 및 CD69에 대한 배경 신호의 상한을 결정한다. FMO 경계 내에 속하는 집단은 관련 마커에 대한 음성 발현으로 간주된다. FMO 경계를 사용하여 집단은 CD39 희미한/-CD69- 발현에 대해 게이팅된다. CD39 게이팅은 FMO 경계를 약간 지나서 확장되어 CD69-로 남아 있는 CD39 희미한 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 줄기 유사 세포는 다음 중 하나 이상을 기반으로 식별될 수 있다: CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, CD39- 및 CD69-. 일부 측면에서, 줄기 유사 세포는 예를 들어, 본원에 개시된 줄기세포능 유전자 시그니처를 사용하여, 전사체 분석(단독으로 또는 위에서 설명한 표현형 마커와 조합하여)에 의해 식별될 수 있다. 일부 측면에서, 이펙터 유사 마커는 각각 전문이 본원에 참조로 포함된 Krishna 등, Science 370:1328-34 (Dec. 11, 2020); 및/또는 Galletti 등, Nature Immunology (October 2018)에 개시된 마커를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포 유사 기억 T 세포", "T 기억 줄기 세포" 또는 "T_SCM 세포"는 CD95, CD45RA, CCR7 및 CD62L을 발현하고 자가 재생에 대한 줄기 세포 유사 능력과 기억 및 이펙터 T 세포 하위세트의 전체 범위를 재구성하는 다능성 능력이 부여된 기억 T 세포를 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "중앙 기억 T 세포" 또는 "T_CM 세포"는 CD45RO, CCR7 및 CD62L을 발현하는 기억 T 세포를 지칭한다. 중앙 기억 T 세포는 일반적으로 림프절과 말초 순환계에서 발견된다.

본원에서 사용되는 용어 "이펙터 유사" 또는 "이펙터 세포 유사"는 종양 세포 살해 능력 및 사이토카인 다기능성, 예를 들어, 염증성 사이토카인 및/또는 세포독성 분자를 생성하는 세포의 능력을 지칭한다. 일부 측면에서, 이펙터 유사 세포는 이 세포에 의해 발현되는 특정 마커에 의해 측정될 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 이펙터 유사 마커는 pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+ 중 하나 이상일 수 있다. 일부 측면에서, 이펙터 유사 마커는 AKT1, AKT2, AKT3, BCL2L1, CBL, CBLB, CBLC, CCND1, CCND2, CCND3, CISH, CLCF1, CNTF, CNTFR, CREBBP, CRLF2, CSF2, CSF2RA, CSF2RB, CSF3, CSF3R, CSH1, CTF1, EP300, EPO, EPOR, GH1, GH2, GHR, GRB2, IFNA1, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNAR1, IFNAR2, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNGR1, IFNGR2, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNLR1, IFNW1, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL19, IL2, IL20, IL20RA, IL20RB, IL21, IL21R, IL22, IL22RA1, IL22RA2, IL23A, IL23R, IL24, IL26, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL3RA, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL7R, IL9, IL9R, IRF9, JAK1, JAK2, JAK3, LEP, LEPR, LIF, LIFR, MPL, MYC, OSM, OSMR, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PIK3CG, PIK3R1, PIK3R2, PIK3R3, PIK3R5, PIM1, PRL, PRLR, PTPN11, PTPN6, SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS7, SOS1, SOS2, SPRED1, SPRED2, SPRY1, SPRY2, SPRY3, SPRY4, STAM, STAM2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, TPO, TSLP, TYK2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 STAT 표적을 포함한다. 일부 측면에서, 이펙터 유사 세포는 전사체 분석에 의해 확인될 수 있다. 일부 측면에서, 이펙터 유사 마커는 각각 전문이 본원에 참조로 포함된 Kaech 등, Cell 111:837-51(2002); Tripathi 등, J. Immunology 185:2116-24(2010); 및/또는 Johnnidis 등, Science Immunology 6:eabe3702(Jan. 15, 2021)에 개시된 마커를 포함한다.

일부 측면에서, 이펙터 유사 세포는 Gattinoni, L., 등, Nat Med 17(10):1290-97(2011)에 기술된 이펙터 연관 유전자 세트를 사용하여 특성화된다. 일부 측면에서, 이펙터 유사 세포에 대한 유전자 시그니처는 MTCH2, RAB6C, KIAA0195, SETD2, C2orf24, NRD1, GNA13, COPA, SELT, TNIP1, CBFA2T2, LRP10, PRKCI, BRE, ANKS1A, PNPLA6, ARL6IP1, WDFY1, MAPK1, GPR153, SHKBP1, MAP1LC3B2, PIP4K2A, HCN3, GTPBP1, TLN1, C4orf34, KIF3B, TCIRG1, PPP3CA, ATG4D, TYMP, TRAF6, C17orf76, WIPF1, FAM108A1, MYL6, NRM, SPCS2, GGT3P, GALK1, CLIP4, ARL4C, YWHAQ, LPCAT4, ATG2A, IDS, TBC1D5, DMPK, ST6GALNAC6, REEP5, ABHD6, KIAA0247, EMB, TSEN54, SPIRE2, PIWIL4, ZSCAN22, ICAM1, CHD9, LPIN2, SETD8, ZC3H12A, ULBP3, IL15RA, HLA-DQB2, LCP1, CHP, RUNX3, TMEM43, REEP4, MEF2D, ABL1, TMEM39A, PCBP4, PLCD1, CHST12, RASGRP1, C1orf58, C11orf63, C6orf129, FHOD1, DKFZp434F142, PIK3CG, ITPR3, BTG3, C4orf50, CNNM3, IFI16, AK1, CDK2AP1, REL, BCL2L1, MVD, TTC39C, PLEKHA2, FKBP11, EML4, FANCA, CDCA4, FUCA2, MFSD10, TBCD, CAPN2, IQGAP1, CHST11, PIK3R1, MYO5A, KIR2DL3, DLG3, MXD4, RALGDS, S1PR5, WSB2, CCR3, TIPARP, SP140, CD151, SOX13, KRTAP5-2, NF1, PEA15, PARP8, RNF166, UEVLD, LIMK1, CACNB1, TMX4, SLC6A6, LBA1, SV2A, LLGL2, IRF1, PPP2R5C, CD99, RAPGEF1, PPP4R1, OSBPL7, FOXP4, SLA2, TBC1D2B, ST7, JAZF1, GGA2, PI4K2A, CD68, LPGAT1, STX11, ZAK, FAM160B1, RORA, C8orf80, APOBEC3F, TGFBI, DNAJC1, GPR114, LRP8, CD69, CMI, NAT13, TGFB1, FLJ00049, ANTXR2, NR4A3, IL12RB1, NTNG2, RDX, MLLT4, GPRIN3, ADCY9, CD300A, SCD5, ABI3, PTPN22, LGALS1, SYTL3, BMPR1A, TBK1, PMAIP1, RASGEF1A, GCNT1, GABARAPL1, STOM, CALHM2, ABCA2, PPP1R16B, SYNE2, PAM, C12orf75, CLCF1, MXRA7, APOBEC3C, CLSTN3, ACOT9, HIP1, LAG3, TNFAIP3, DCBLD1, KLF6, CACNB3, RNF19A, RAB27A, FADS3, DLG5, APOBEC3D, TNFRSF1B, ACTN4, TBKBP1, ATXN1, ARAP2, ARHGEF12, FAM53B, MAN1A1, FAM38A, PLXNC1, GRLF1, SRGN, HLA-DRB5, B4GALT5, WIPI1, PTPRJ, SLFN11, DUSP2, ANXA5, AHNAK, NEO1, CLIC1, EIF2C4, MAP3K5, IL2RB, PLEKHG1, MYO6, GTDC1, EDARADD, GALM, TARP, ADAM8, MSC, HNRPLL, SYT11, ATP2B4, NHSL2, MATK, ARHGAP18, SLFN12L, SPATS2L, RAB27B, PIK3R3, TP53INP1, MBOAT1, GYG1, KATNAL1, FAM46C, ZC3HAV1L, ANXA2P2, CTNNA1, NPC1, C3AR1, CRIM1, SH2D2A, ERN1, YPEL1, TBX21, SLC1A4, FASLG, PHACTR2, GALNT3, ADRB2, PIK3AP1, TLR3, PLEKHA5, DUSP10, GNAO1, PTGDR, FRMD4B, ANXA2, EOMES, CADM1, MAF, TPRG1, NBEAL2, PPP2R2B, PELO, SLC4A4, KLRF1, FOSL2, RGS2, TGFBR3, PRF1, MYO1F, GAB3, C17orf66, MICAL2, CYTH3, TOX, HLA-DRA, SYNE1, WEE1, PYHIN1, F2R, PLD1, THBS1, CD58, FAS, NETO2, CXCR6, ST6GALNAC2, DUSP4, AUTS2, C1orf21, KLRG1, TNIP3, GZMA, PRR5L, PRDM1, ST8SIA6, PLXND1, PTPRM, GFPT2, MYBL1, SLAMF7, FLJ16686, GNLY, ZEB2, CST7, IL18RAP, CCL5, KLRD1, KLRB1 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다(예를 들어, Gattinoni, L., 등 Nat Med 17(10):1290-97(2011) 참조.

본원에서 사용되는 용어 "이펙터 기억 T 세포" 또는 "T_EM 세포"는 CD45RO를 발현하지만 CCR7 및 CD62L은 발현하지 않는 기억 T 세포를 지칭한다. 이펙터 기억 T 세포에는 림프절 귀환 수용체(lymph node-homing receptor)(예를 들어, CCR7 및 CD62L)가 없기 때문에 이러한 세포는 전형적으로 말초 순환 및 비림프성 조직에서 발견된다.

본원에서 사용되는 용어 "조직 상주 기억 T 세포" 또는 "T_RM 세포"는 순환하지 않고 피부, 폐 및 위장관과 같은 말초 조직에 상주하는 기억 T 세포를 지칭한다. 일부 측면에서, 조직 상주 기억 T 세포 역시 이펙터 기억 T 세포이다.

본원에서 사용되는 용어 "나이브 T 세포", "T_N 세포" 또는 "나이브 TIL"은 CD45RA, CCR7 및 CD62L을 발현하지만 CD95는 발현하지 않는 T 세포 및/또는 TIL을 지칭한다. 이러한 세포는 T 세포 계통에서 가장 미분화된 세포를 나타낸다. 나이브 T 세포와 항원 제시 세포(APC) 사이의 상호작용은 나이브 T 세포의 활성화된 T_EFF 세포로의 분화 및 면역 반응을 유도한다.

본원에서 사용되는 용어 "단편화", "단편" 및 "단편화된"은 종양 조직을 파쇄, 슬라이싱, 분할 및 세절하는 것과 같은 기계적 단편화 방법은 물론 종양 조직의 물리적 구조를 파괴하기 위한 임의의 다른 방법을 포함하여 종양을 파괴하는 과정을 기술한다.

본원에서 사용되는 용어 "배양"은 생체 외 및/또는 시험관 내에서 세포의 조절된 성장을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "배양"은 세포 확장 동안 세포, 예를 들어, TIL의 성장을 포함한다. 일부 측면에서, 배양된 세포는 대상체, 예를 들어, 인간 대상체로부터 얻는다. 일부 측면에서, 배양된 세포는 인간 대상체로부터 얻은 TIL을 포함한다. 일부 측면에서, 배양은 종양 샘플 또는 종양 단편을 본원에 개시된 배지에 배치하는 것을 포함하며, 상기 배지는 종양 샘플로부터의 TIL 회피 및 TIL 확장을 촉진한다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 종양 단편은 해리된 종양 샘플(예를 들어, 단일 세포 현탁액)이다. 일부 측면에서, 해리된 종양 샘플(예를 들어, 단일 세포 현탁액)은 본원에 개시된 배지에서 해리된다. 일부 측면에서, 배양은 해리된 종양 샘플 또는 종양 단편을 본원에 개시된 배지에 넣는 것을 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 배양 전에 단리되거나 정제된다. 일부 측면에서, 세포 배양은 배양된 세포의 수를 확장하기 위한 것, 예를 들어, 세포의 증식을 증가시키기 위한 것이다.

TIL과 관련하여 본원에서 사용되는 "확장하다" 또는 "확장"은 세포를 자극하거나 활성화하고 세포를 배양하는 과정을 지칭한다. 확장 과정은 세포가 자극되거나 활성화되고 배양된 후 원하는 세포의 비율 또는 총 수의 증가, 예를 들어, 배양된 세포 집단에서 TIL의 비율 또는 총 수의 증가를 초래할 수 있다. 확장은 배양된 세포 집단에서 모든 세포 유형의 수가 증가할 것을 요구하지 않는다. 오히려, 일부 측면에서, 배양된 세포 집단에서 세포의 하위세트만이 확장 동안 그 수가 증가하는 반면, 다른 세포 유형의 수는 변하지 않거나 감소할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "수율"은 배양 방법 후 세포의 총 수 또는 이의 일부를 의미한다. 일부 측면에서, 용어 "수율"은 세포의 특정 집단, 예를 들어, TIL 집단 내의 줄기 유사 TIL을 지칭한다. 수율은 대표 샘플을 기반으로 수율을 추정하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포 유사", "줄기 유사" 또는 "덜 분화된"은 더 나이브한 표현형과 일치하는 마커를 발현하는 세포, 예를 들어, 면역 세포(예를 들어, TIL)를 지칭한다. 예를 들어, 덜 분화된 TIL은 T_N 또는 T_SCM 세포의 특징적인 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다. 일부 측면에서, "덜 분화된" 또는 "줄기 유사" TIL은 CD45RA, CCR7 및 CD62L을 발현한다. 일부 측면에서, "덜 분화된" 또는 "줄기 유사" TIL은 CD45RA, CCR7 및 CD62L을 발현하고, CD45RO^low이다. 일부 측면에서, "덜 분화된" 또는 "줄기 유사" 면역 세포(예를 들어, TIL)는 CD45RA, CCR7 및 CD62L을 발현하고 CD45RO는 발현하지 않는다. 일부 측면에서, "덜 분화된" 또는 "줄기 유사" T 세포는 CD45RA, CCR7, CD62L 및 TCF7을 발현한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 덜 분화된 표현형을 갖는 세포, 예를 들어, TIL의 성장 및/또는 증식을 촉진한다. 임의의 특정 메커니즘에 얽매이지 않고, 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 덜 분화된 세포, 예를 들어, TIL의 분화를 차단, 억제 또는 제한하여 배양물에서 줄기 유사 세포의 수를 증가시킨다. 예를 들어, 일반적으로 종양을 효과적으로 제어하기 위해서는 줄기 세포 유사 기억 또는 중심 기억 표현형을 갖는 덜 분화된 TIL의 입양 전이가 선호되는 것으로 생각된다. 예를 들어, Gattinoni, L., 등, J. Clin. Invest. 115:1616-1626(2005); Gattinoni, L., 등 Nat Med 15(7):808-814(2009); Lynn, R.C., 등, Nature 576(7786):293-300(2019); Gattinoni, L., 등, J. Clin. Invest. 115:1616-1626(2005); Gattinoni, L., 등 Nat Med 15(7):808-814(2009); 및 Gattinoni, L., 등, Nat Med 17(10):1290-1297(2011) 참조.

줄기세포능은 자가 재생 능력, 다능성 및 증식 잠재력의 지속성을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 줄기세포능은 특정 유전자 시그니처, 예를 들어, 다수의 유전자에 걸친 결합된 발현 패턴을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 유전자 시그니처는 ACTN1, DSC1, TSHZ2, MYB, LEF1, TIMD4, MAL, KRT73, SESN3, CDCA7L, LOC283174, TCF7, SLC16A10, LASS6, UBE2E2, IL7R, GCNT4, TAF4B, SULT1B1, SELP, KRT72, STXBP1, TCEA3, FCGBP, CXCR5, GPA33, NELL2, APBA2, SELL, VIPR1, FAM153B, PPFIBP2, FCER1G, GJB6, OCM2, GCET2, LRRN1, IL6ST, LRRC16A, IGSF9B, EFHA2, LOC129293, APP, PKIA, ZC3H12D, CHMP7, KIAA0748, SLC22A17, FLJ13197, NRCAM, C5orf13, GIPC3, WNT7A, FAM117B, BEND5, LGMN, FAM63A, FAM153B, ARHGEF11, RBM11, RIC3, LDLRAP1, PELI1, PTK2, KCTD12, LMO7, CEP68, SDK2, MCOLN3, ZNF238, EDAR, FAM153C, FAAH2, BCL9, C17orf48, MAP1D, ZSWIM1, SORBS3, IL4R, SERPINF1, C16orf45, SPTBN1, KCNQ1, LDHB, BZW2, NBEA, GAL3ST4, CRTC3, MAP3K1, HLA-DOA, RAB43, SGTB, CNN3, CWH43, KLHL3, PIM2, RGMB, C16orf74, AEBP1, SNORD115-11, SNORD115-11, GRAP 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다(예를 들어, Gattinoni(2011) 참조). 일부 측면에서, 유전자 시그니처는 NOG, TIMD4, MYB, UBE2E2, FCER1G, HAVCR1, FCGBP, PPFIBP2, TPST1, ACTN1, IGF1R, KRT72, SLC16A10, GJB6, LRRN1, PRAGMIN, GIPC3, FLNB, ARRB1, SLC7A8, NUCB2, LRRC7, MYO15B, MAL, AEBP1, SDK2, BZW2, GAL3ST4, PITPNM2, ZNF496, FAM117B, C16orf74, TDRD6, TSPAN32, C18orf22, C3orf44, LOC129293, ZC3H12D, MLXIP, C7orf10, STXBP1, KCNQ1, FLJ13197, LDLRAP1, RAB43, RIN3, SLC22A17, AGBL3, TCEA3, NCRNA00185, FAM153B, FAM153C, VIPR1, MMP19, HBS1L, EEF2K, SNORA5C, UBASH3A, FLJ43390, RP6-213H19.1, INPP5A, PIM2, TNFRSF10D, SNRK, LOC100128288, PIGV, LOC100129858, SPTBN1, PROS1, MMP28, HES1, CACHD1, NSUN5C, LEF1, TTTY14, SNORA54, HSF2, C16orf67, NSUN5B, KIAA1257, NRG2, CAD, TARBP1, STRADB, MT1F, TMEM41B, PDHX, KDM6B, LOC100288322, UXS1, LGMN, NANOS2, PYGB, RASGRP2, C14orf80, XPO6, SLC24A6, FAM113A, MRM1, FBXW8, NDUFS2, KCTD12 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다(예를 들어, Gattinoni, L., 등, Nat Med 17(10): 1290-1297(2011) 또는 Galletti 등 Nat Immunol 21, 1552-1562(2020) 참조). 일부 측면에서, 유전자 시그니처는 SELL, CCR7, S1PR1, KLF3, TCF7, GPR183, SC5D, FAAH2, LTB, SESN3, MAL, TSHZ2, LEF1, AP3M2, SLC2A3, ICAM2, PLAC8, SCML1, IL7R, ABLIM1, RASGRP2, TRABD2A, SATB1, ALG13, ARID5A, BACH2, PABPC1, GPCPD1, NELL2, TAF4B, FCMR, ARRDC2, C1orf162, FAM177A1, ANKRD12, TXK, SORL1, AQP3, ADTRP, FXYD7, CD28, P2RY8, CRYBG1, TNFSF8, BEX2, PGAP1, PTGER4, MAML2, BEX3, PCSK1N, INPP4B, AC119396.1, CXCR5, LINC00402, CCR4, IL6R, ZBTB10, ITGA6, ARMH1, RILPL2, FOXP1, TESPA1, YPEL5, LPAR6, CMSS1, RIPOR2, ZNF331, EMP3, GIMAP7, WDR74, RIC3, CYSLTR1, ITGB1, CD5, SAMHD1, SERINC5, 및 이들의 임의의 조합(예를 들어, Caushi 등, Nature 596: 126-132(2021) 참조)에서 선택된 하나 이상의 유전자를 포함한다.

예컨대 많은 암에서 항원에 연장된 노출 시, 더 분화된 면역 세포, 예를 들어, 이펙터 및 이펙터 기억 T 세포는 종종 고갈되고 이들의 항종양 기능을 잃는다. 바이오마커, 예를 들어, T 세포 마커는 임의의 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 측면에서, T 세포는 항체 염색에 이어 게이팅된 유세포분석(gated flow cytometry)을 사용하여 확인된다.

본원에서 사용되는 용어 "클론형(clonotype)"은 TCRα 또는 TCRß 재배열로부터 기인하는 고유한 DNA 서열을 갖는 T 세포 집단을 지칭한다. 고유한 가변 α 사슬(VA) 서열은 하나 초과의 가변 β 사슬(VB) 서열과 쌍을 이룰 수 있다. 반대로 고유한 VB 서열은 하나 초과의 VA 서열과 쌍을 이룰 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "장성(tonicity)"은 세포막을 가로지르는 유효 삼투압 구배의 척도를 지칭한다. 장성은 용액 중 칼륨 이온과 염화나트륨(NaCl)의 수준을 기준으로 측정하거나 계산할 수 있다. 여기서 장성은 칼륨 이온(K+)의 농도와 염화나트륨(NaCl)의 농도의 합에 2를 곱하여 계산한다. 장성은 용액, 예를 들어, 배지의 삼투질농도(osmolality)로 표현될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용액, 예를 들어, 배지는 배지 내의 용질 농도가 세포 내부의 용질 농도와 동일할 때 "등장성"으로 간주된다. 본원에서 사용되는 등장성 배지는 삼투질농도가 약 280mOsm/L이다(예를 들어,([K+] + [NaCl]) × 2 = 280).

본원에서 사용되는 바와 같이, 용액, 예를 들어, 배지는 용액 내의 용질 농도가 세포 내의 용질 농도보다 낮은 경우 "저장성"인 것으로 간주된다. 본원에 사용되는 저장성 용액은 장성이 280mOsm/L 미만이다(예를 들어,([K+] + [NaCl]) × 2 < 280). 일부 측면에서, 본원에 기술된 저장성 배지는 삼투질 농도가 약 240mOsm/L 또는 약 250mOsm/L이다. 일부 측면에서, 저장성 배지는 장성이 약 220mOsm/L 이상 약 280mOsm/L 미만이다. 일부 측면에서, 저장성 배지는 장성이 약 230mOsm/L 이상 약 280mOsm/L 미만이다. 일부 측면에서, 저장성 배지는 장성이 약 240mOsm/L 이상 약 280mOsm/L 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 저장성 배지는 장성이 약 250mOsm/L(예를 들어,([K+] + [NaCl]) × 2 = 250)이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용액, 예를 들어, 배지는 용액 내의 용질 농도가 세포 내의 용질 농도보다 높은 경우 "고장성"으로 간주된다. 본원에서 사용되는 고장성 용액은 삼투질농도가 300mOsm/L 초과(예를 들어,([K+] + [NaCl]) × 2 > 280)이다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 고장성 배지는 삼투질농도가 약 320mOsm/L이다. 특정 측면에서, 용액, 예를 들어, 배지의 장성은 칼륨 이온, 나트륨 이온, 글루코스 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 용질의 농도를 증가시키거나 감소시킴으로써 조절된다. 일부 측면에서, 용액, 예를 들어, 배지의 장성은 칼륨 이온 및 NaCl의 농도를 증가시키거나 감소시킴으로써 조절된다. 일부 측면에서, 배지의 장성은 하나의 용질의 증가를 제2 용질의 감소로 상쇄함으로써 유지될 수 있다. 예를 들어, 나트륨 이온의 농도를 변경하지 않고 배지에서 칼륨 이온의 농도를 증가시키면 배지의 장성을 증가시킬 수 있다. 그러나 칼륨 이온의 농도를 높이고 나트륨 이온의 농도를 낮추면 원래 배지의 장성을 유지할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 배지의 장성은 칼륨 농도와 NaCl 농도의 합에 2를 곱한 값으로 정의된다. 예를 들어, 표 2 참조.

본원에서 사용되는 용어 "칼륨", "칼륨 이온", "칼륨 양이온" 및 "K+"는 원소 칼륨을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 원소 칼륨은 양이온으로 용액에 존재한다. 그러나 칼륨 이온을 포함하는 용액을 제조하는 표준 수단이 칼륨 함유 염(예를 들어, KCl)을 용액에 희석하는 것을 포함한다는 것은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 이와 같이, 몰(M) 농도의 칼륨 이온을 포함하는 용액, 예를 들어, 배지는 칼륨을 포함하는 염을 등몰(M) 농도로 포함하는 것으로 기술될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "나트륨 이온" 및 "나트륨 양이온"은 원소 나트륨을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 원소 나트륨은 1가 양이온으로 용액에 존재한다. 그러나 나트륨 이온을 포함하는 용액을 제조하는 표준 수단이 나트륨 함유 염(예를 들어, NaCl)을 용액에 희석하는 것을 포함한다는 것은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 이와 같이, 몰(M) 농도의 나트륨 이온을 포함하는 용액, 예를 들어, 배지는 나트륨을 포함하는 염을 등몰(M) 농도로 포함하는 것으로 기술될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "칼슘 이온" 및 "칼슘 양이온"은 원소 칼슘을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 원소 칼슘은 2가 양이온으로 용액에 존재한다. 그러나 칼슘 이온을 포함하는 용액을 제조하는 표준 수단이 칼슘 함유 염(예를 들어, CaCl₂)을 용액에 희석하는 것을 포함한다는 것은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 이와 같이, 몰(M) 농도의 칼슘 이온을 포함하는 용액, 예를 들어, 배지는 칼슘을 포함하는 염을 등몰(M) 농도로 포함하는 것으로 기술될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "고칼륨성", 예를 들어, "고칼륨성 배지"는 칼륨 농도가 증가된 배지를 의미한다. 일부 측면에서, 고칼륨성 배지는 5mM 초과의 농도의 칼륨 이온을 포함한다. 일부 측면에서, 고칼륨성 배지는 40mM보다 높은 농도의 칼륨 이온을 포함한다. 일부 측면에서, 고칼륨성 배지 적어도 약 10mM, 적어도 약 15mM, 적어도 약 20mM, 적어도 약 25mM, 적어도 약 30mM, 적어도 약 35mM, 적어도 약 40mM, 적어도 약 45mM, 적어도 약 50mM, 적어도 약 55mM, 적어도 약 60mM, 적어도 약 65mM, 적어도 약 70mM, 약 75mM, 약 80mM, 약 85mM, 약 90mM, 약 95mM 또는 약 100mM 칼륨 이온 농도. 본원에서 사용되는 용어 "대사 재프로그래밍 배지", "대사 재프로그래밍 배지들" 또는 "MRM"은 본 개시내용의 고칼륨성 배지를 지칭한다. 일부 측면에서, MRM은 약 50mM 농도의 칼륨 이온을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 55mM 농도의 칼륨 이온을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 60mM 농도의 칼륨 이온을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 65mM 농도의 칼륨 이온을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 70mM 농도의 칼륨 이온을 포함한다. 특정 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지는 약 40mM 내지 약 80mM NaCl, 약 40mM 내지 약 90mM KCl, 약 0.5mM 내지 약 2.8mM 칼슘 및 약 10mM 내지 약 24mM 글루코스를 포함한다. 일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지는 약 250 내지 약 340mOsmol의 삼투질농도를 추가로 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "기초" 배지는 본원에 개시된 하나 이상의 추가 요소, 예를 들어, 칼륨, 나트륨, 칼슘, 글루코스, IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 또는 이들의 임의의 조합이 보충된 임의의 출발 배지를 지칭한다. 기초 배지는 TIL과 같은 면역 세포 배양을 위한 임의의 배지일 수 있다. 일부 측면에서, 기초 배지는 평형 염 용액(balanced salt solution)(예를 들어, PBS, DPBS, HBSS, EBSS), 둘베코 수정 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), 클릭 배지(Click's medium), 최소 필수 배지(Minimal Essential Medium, MEM), 기초 배지 이글(Basal Medium Eagle, BME), F-10, F-12, RPMI 1640, 글래스고 최소 필수 배지(Glasgow Minimal Essential Medium, GMEM), 알파 최소 필수 배지(alpha MEM), 이스코브 수정 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), M199, OPTMIZER™ CTS™ T 세포 확장 기초 배지(ThermoFisher), OPTMIZER™ Complete, IMMUNOCULT™ XF(STEMCELL™ Technologies), IMMUNOCULT™ XF, AIM V, TEXMACS™ 배지, TRANSACT™ TIL 확장 배지, TIL 급속 확장 프로토콜 배지 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 기초 배지는 무혈청이다. 일부 측면에서, 기초 배지는 PRIME-XV T 세포 CDM을 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 OPTMIZER™을 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 OPTMIZER™ Pro를 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 X-VIVO™ 15(LONZA)를 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 IMMUNOCULT™를 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 클릭 배지를 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 TRANSACT™ TIL 확장 배지를 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 TIL 급속 확장 배지를 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 면역 세포 혈청 대체물(immune cell serum replacement, ICSR)을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 기초 배지는 ICSR이 보충된 OPTMIZER™ Complete, ICSR이 보충된 AIM V, ICSR이 보충된 IMMUNOCULT™ XF, ICSR이 보충된 RPMI, ICSR이 보충된 TEXMACS™ 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 적합한 기초 배지는 클릭 배지, OpTimizer®(CTS®) 배지, Stemline® T 세포 확장 배지(Sigma-Aldrich), AIM V® 배지(CTS®), TexMACS® 배지(Miltenyi Biotech), ImmunoCult® 배지(Stem Cell Technologies), PRIME-XV® T-Cell Expansion XSFM(Irvine Scientific), Iscoves 배지 및/또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 NaCl 비함유 CTS™ OPTIMIZER™를 포함한다. 일부 측면에서, 적합한 기초 배지는 클릭 배지, OpTimizer®(CTS®) 배지, Stemline® T 세포 확장 배지(Sigma-Aldrich), AIM V® 배지(CTS®), TexMACS® 배지(Miltenyi Biotech), ImmunoCult® 배지(Stem Cell Technologies), PRIME-XV® T 세포 확장 XSFM(Irvine Scientific), Iscoves 배지 및/또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 NaCl 비함유 CTS™ OpTimizer™를 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 장성을 조절하기 위해 첨가되는 NaCl, 예를 들어, 칼륨 이온과 함께 첨가되는 NaCl에 더하여 하나 이상의 나트륨 염을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "사이토카인"은 세포 사이의 상호작용 및 소통에 특정한 효과가 있는 세포에 의해 방출되는 작은 분비된 단백질을 지칭한다. 사이토카인의 비제한적 예는 인터류킨(예를 들어, 인터류킨(IL)-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15, IL-3, IL-5, IL-6, IL-11, IL-10, IL-20, IL-14, IL-16, IL-17, IL-21, IL-23 및 IL-29), 인터페론(IFN; 예를 들어, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ), 종양 괴사 인자(TNF) 계열 구성원 및 전환 성장 인자(TGF) 계열 구성원을 포함한다. 본 개시내용의 일부 측면은 사이토카인을 포함하는 배지에서 세포, 예를 들어, T 세포 및/또는 NK 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 사이토카인을 포함하는 배지에서 TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 사이토카인을 포함하는 배지에서 TIL을 확장시키는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 사이토카인은 인터류킨이다. 일부 측면에서, 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 및 이들의 조합으로부터 선택된다. IL-2(UniProtKB - P60568)는 항원 또는 분열촉진 자극(mitogenic stimulation)에 대한 반응으로 T 세포에서 생성된다. IL-2는 T 세포 증식 및 면역 반응 조절에 중요한 기타 활성을 자극하는 것으로 알려져 있다. IL-7(UniProtKB - P13232)은 림프구 전구체의 증식을 자극할 수 있는 조혈 성장 인자이다. IL-7은 B 세포 성숙의 특정 단계 동안 증식에 일조하는 것으로 여겨진다. IL-15(UniProtKB - P40933)는 IL-2와 마찬가지로 T 림프구의 증식을 자극하는 사이토카인이다. IL-21(UniProtKB - Q9HBE4)은 면역 조절 활성이 있는 사이토카인이다. IL-21은 선천성 면역과 후천성 면역 사이의 전환을 촉진하고 B 세포에서 IgG1 및 IgG3 생성을 유도하는 것으로 생각된다. IL-21은 IL-15와의 상승작용으로 자연 살해(NK) 세포의 증식 및 성숙에도 일조할 수 있으며, IL-21은 활성화 자극에 반응하여 성숙한 B 및 T 세포의 증식을 조절할 수 있다. IL-15 및 IL-18과의 상승작용으로 IL-15는 T 세포 및 NK 세포에서 인터페론 감마 생성도 자극하고, IL-21은 T 세포 매개 면역 반응 동안 수지상 세포 활성화 및 성숙도 억제할 수 있다.

본원에서 사용되는 "보다 높은"이라는 용어는 초과하지만 같지는 않음을 의미한다. 예를 들어, "5mM보다 높은"은 5mM 초과이지만 5mM을 포함하지 않는 임의의 양을 의미한다.

본원에서 사용되는 "우선적으로"라는 용어는 우세한 결과를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법이 CD8⁺ TIL의 확장을 우선적으로 촉진한다면, 우세한 확장 생성물이 CD8⁺ TIL인 것으로 이해해야 한다. "우선적으로"라는 용어는, 예를 들어, 생성된 TIL의 100%가 CD8⁺라는 것을 반드시 의미하지는 않으며, 오히려 이 용어는 CD8⁺ TIL이 CD8^- TIL보다 더 큰 정도로 확장된다는 것을 암시한다.

본원에서 사용되는 "투여"는 임의의 다양한 방법 및 전달 시스템을 사용하여 치료제 또는 치료제를 포함하는 조성물을 대상체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 기술된 치료제(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 배양된 TIL)에 대한 상이한 투여 경로는, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 척수 또는 기타 비경구 투여 경로를 포함한다.

본원에서 사용되는 어구 "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 제한 없이 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 척수강 내(intrathecal), 림프 내(intralymphatic), 병변 내(intralesional), 피막 내(intracapsular), 안와 내(intraorbital), 심장 내(intracardiac), 피 내(intradermal), 기관경(transtracheal), 기관 내(intratracheal), 폐, 피하(subcutaneous), 피부 밑(subcuticular), 관절 내(intraarticular), 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 심실 내(intraventricular), 유리체 내(intravitreal), 경막 외(epidural) 및 흉골 내(intrasternal) 주사 및 주입은 물론 생체 내 전기천공법을 포함한다.

대안적으로, 본원에 기술된 치료제(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 배양된 TIL)는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로와 같은 비경구 경로를 통해, 예를 들어, 비강 내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소로 투여될 수 있다. 투여는 또한, 예를 들어, 1회, 복수 회 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항원"은 단백질, 펩티드 또는 합텐과 같은 임의의 천연 또는 합성 면역원성 물질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "동족 항원(cognate antigen)"은 면역 세포(예를 들어, TIL)가 인식함으로써 면역 세포의 활성화(예를 들어, 예컨대 사이토카인 생성과 같은 이펙터 기능을 유도하는 및/또는 세포 증식을 위한 세포 내 신호 촉발)를 유도하는 항원을 지칭한다.

"암"은 체내 비정상 세포의 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 그룹을 지칭한다. 조절되지 않은 세포 분열 및 성장은 인접 조직을 침범하는 악성 종양의 형성을 야기하고 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 먼 부분으로 전이될 수도 있다. 본원에서 사용되는 "암"은 원발성, 전이성 및 재발성 암을 의미한다.

용어 "혈액학적 악성종양(hematological malignancy)" 또는 "혈액암(hematological cancer)"은 포유동물 암과 조혈 및 림프 조직의 종양을 지칭한다. 혈액학적 악성종양의 비제한적 예는 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성 림프구성 림프종(chronic lymphocytic lymphoma, CLL), 소림프구성 림프종(small lymphocytic lymphoma, SLL), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia, AML), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CIVIL), 급성 단구성 백혈병(acute monocytic leukemia, AMoL), 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma) 및 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas)을 포함하여 혈액, 골수, 림프절 및 림프계의 조직이 이환된 것을 포함한다. 혈액학적 악성종양은 "액체 종양"으로도 지칭된다. 액체 종양 암은 백혈병, 골수종 및 림프종은 물론 기타 혈액학적 악성종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 액상 종양으로부터 얻은 TIL은 본원에서 골수 침윤 림프구(MIL)로 지칭될 수도 있다.

본원에서 사용되는 "고형 종양"은 비정상적인 조직 덩어리를 지칭한다. 고형 종양은 양성일 수도 있고 악성일 수도 있다. 고형 종양의 비제한적 예는 육종, 암종 및 림프종, 예컨대 폐암, 유방암, 전립선암, 결장암, 직장암 및 방광암을 포함한다. 고형 종양의 조직 구조는 실질(암세포), 및 암세포가 분산되어 있고 지지하는 미세환경을 제공할 수 있는 지지 간질 세포를 포함하는 상호의존적인 조직 구획을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "면역 반응"은 외래 물질에 대한 척추동물 내의 생물학적 반응을 지칭하며, 이 반응은 이러한 물질 및 이에 의해 유발되는 질환으로부터 유기체를 보호한다. 면역 반응은 면역계 세포(예를 들어, T 림프구(예를 들어, TIL), B 림프구, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호산구, 비만 세포, 수지상 세포 또는 호중구)의 작용 및 이러한 세포 또는 간(항체, 사이토카인 및 보체 포함) 중 임의의 것에 의해 생성된 가용성 거대분자에 의해 매개되며 이는 척추동물의 신체에 침범하는 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암세포 또는 다른 비정상 세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 경우 정상적인 인간 세포 또는 조직의 표적화, 이에 대한 결합, 이에 대한 손상, 이의 파괴 및/또는 이로부터의 제거를 초래한다. 면역 반응은, 예를 들어, T 세포, 예를 들어, 이펙터 T 세포 또는 Th 세포, 예컨대 CD4⁺ 또는 CD8⁺ TIL의 활성화 또는 억제, 또는 Treg 세포의 억제를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "T 세포" 및 "T 림프구"는 상호교환 가능하며 흉선에 의해 생성되거나 처리되는 임의의 림프구를 지칭한다. 일부 측면에서, TIL은 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL은 CD4⁺ TIL이다.

본원에서 사용되는 용어 "항종양 면역 반응"은 종양 항원에 대한 면역 반응을 지칭한다.

"대상체"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 비인간 영장류, 양, 개와 같은 척추동물, 및 마우스, 래트 및 기니피그와 같은 설치류를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 측면에서, 대상체는 인간이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에서 사용되는 "이를 필요로 하는 대상체"라는 어구는, 예를 들어, 종양 성장을 제어하기 위해 본원에 기술된 바와 같이 배양된 면역 세포, 예를 들어, TIL의 투여로부터 이익을 얻을 대상체, 예컨대 포유동물 대상체를 포함한다.

용어 "치료적 유효량" 또는 "치료적 유효 투여량"은 원하는 생물학적, 치료적 및/또는 예방적 결과를 제공하는 작용제(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 배양된 TIL)의 양을 지칭한다. 그 결과는 질환의 징후, 증상 또는 원인 중 하나 이상의 감소, 개선, 경감(palliation), 축소, 지연 및/또는 완화(alleviation), 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 바람직한 변경일 수 있다. 고형 종양과 관련하여, 유효량은 종양을 축소시키고/시키거나 종양의 성장 속도를 감소시키거나(예컨대 종양 성장을 억제하거나) 다른 원치 않는 세포 증식을 방지하거나 지연시키기에 충분한 양을 포함한다. 일부 측면에서, 유효량은 종양 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 측면에서, 유효량은 종양 재발을 예방하거나 지연시키기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.

유효량의 조성물(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 배양된 세포)은, 예를 들어, (ⅰ) 암세포 수를 감소시킬 수 있고/있거나; (ⅱ) 종양 크기를 감소시킬 수 있고/있거나; (ⅲ) 암세포가 말초 기관으로 침투하는 것을 억제, 지연, 어느 정도 늦출 수 있고 멈출 수 있고/있거나; (ⅳ) 억제할 수(즉, 어느 정도 늦추고 종양 전이를 멈출 수) 있고/있거나; (ⅴ) 종양 성장을 억제할 수 있고/있거나; (ⅵ) 종양의 발생 및/또는 재발을 예방 또는 지연할 수 있고/있거나; (ⅶ) 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 경감시킬 수 있다.

일부 측면에서, "치료적 유효량"은 진행성 고형 종양과 같은 암의 현저한 감소 또는 진행의 둔화(퇴행)를 초래하는 것으로 임상적으로 입증된 본원에 개시된 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 배양된 T 세포)의 양이다. 질환 퇴행을 촉진하는 본 개시내용의 치료제(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이 배양된 T 세포)의 능력은 숙련된 의사에게 공지된 다양한 방법을 사용하여, 예컨대 임상 시험 동안 인간 대상체에서, 인간에서의 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 또는 시험관 내 검정에서 작용제의 활성을 검정함으로써 평가될 수 있다.

치료와 관련하여 "유효한" 및 "유효성"이라는 용어는 약리학적 유효성 및 생리학적 안전성을 모두 포함한다. 약리학적 유효성은 환자에서 암 퇴행을 촉진하는 본원에 개시된 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 배양된 세포)의 능력을 지칭한다. 생리학적 안전성은 본원에 개시된 조성물(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 배양된 세포)의 투여로 인한 세포, 기관 및/또는 유기체 수준에서의 독성 또는 다른 불리한 생리학적 효과(부작용)의 수준을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "종양 반응성"은 종양 세포를 표적화하고 살해하는 면역 세포, 예를 들어, TIL의 능력을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "종양 특이적"은 종양 세포를 특이적으로 표적화하는 종양 반응성 면역 세포, 예를 들어, TIL을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "종양 반응성 추정"이라는 용어는 기능적 또는 표현형 특성(예를 들어, CXCL13, 4-1BB, PD-1 및 TIGIT과 같은 유전자의 발현)을 기반으로 잠재적으로 종양 반응성인 면역 세포(예를 들어, TIL) 또는 클론을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "T 세포 수용체(T cell receptor)" 또는 "TCR"은 2개의 상이한 막관통 폴리펩티드 사슬인 α 사슬과 β 사슬로 구성된 이종이량체를 지칭하며, 상기 사슬 각각은 사슬을 T 세포 표면 막 내부에 고정시키는 불변 영역과 MHC에 의해 제시된 항원을 인식하고 결합하는 가변 영역으로 이루어진다. TCR 복합체는 2개의 이종이량체 CD3γε 및 CD3δε와 1개의 동종이량체 CD3 ζ를 형성하는 6개의 폴리펩티드와 회합되어 함께 CD3 복합체를 형성한다. T 세포 수용체 조작된 T 세포 요법은 특정 종양 세포에 의해 발현되는 항원을 특이적으로 표적화하기 위해 이러한 복합체를 보유하는 T 세포의 변형을 이용한다. 본원에서 사용되는 "TCR"이라는 용어는 천연 발생 TCR 및 조작된 TCR을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "ug" 및 "uM"은 각각 "μg" 및 "μM"과 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 용어 "연구 규모", "MRM 연구 규모 공정" 또는 "연구 규모 TIL"은 대규모 MRM 공정과 비교하여 더 낮은 목표 TIL 수율 및 최종 생성물 부피로 MRM에서 배양 및/확장된 TIL을 의미한다. 일부 측면에서는 대규모 MRM 공정과 비교하여 다양한 비율의 TIL 대 PBMC를 사용할 수 있다. 예를 들어, 어떤 측면에서는 연구 규모 MRM 공정의 PBMC에 대한 TIL의 비율이 대규모 MRM 공정에 비해 더 높다. 일부 측면에서 배양 및/또는 확장 시간은 대규모 TIL보다 연구 규모 TIL의 경우 더 길 수 있다. 일부 측면에서는 동적 REP 단계가 연구 규모 공정에서 제외된다.

본원에 사용된 용어 "대규모", "MRM 대규모 공정" 또는 "대규모 TIL"은 연구 규모 MRM 공정에 비해 더 높은 목표 TIL 수율 및 최종 생성물 부피를 갖는 MRM에서 배양 및/확장된 TIL을 의미한다. 일부 측면에서는 연구 규모의 MRM 공정과 비교하여 다양한 TIL 대 PBMC 비율을 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서 대규모 MRM 공정의 PBMC에 대한 TIL의 비율은 연구 규모 MRM 공정의 해당 비율보다 낮다. 어떤 측면에서는 연구 규모 TIL보다 대규모 TIL의 배양 및/또는 확장 시간이 더 짧을 수 있다. 어떤 측면에서는 동적 REP 단계가 대규모 공정에 포함된다.

본원에 기술된 다양한 측면은 다음 하위섹션에서 더 상세히 기술된다.

Ⅱ. 개시내용의 방법

본 개시내용은 생체 외 또는 시험관 내에서 면역 세포, 예를 들어, TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 본 개시내용의 방법은 면역 세포, 예를 들어, TIL을 배양 조건에서 배양하거나 배치하는 것을 포함하며, 상기 배양(예를 들어, 특정 이온 농도, 배지의 장성, 사이토카인 및 또는 이들의 임의의 조합)은 CD8⁺ TIL의 확장을 향상시킬 수 있다. 일부 측면에서, 배양(예를 들어, 특정 이온 농도, 배지의 장성, 사이토카인 및 또는 이들의 임의의 조합)은 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL 및/또는 CD4⁺ TIL)의 분화를 감소, 제한 또는 방지할 수 있어서 세포 치료에서의 상기 세포의 사용에 영향을 주거나 상기 세포의 사용을 개선시킨다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 칼륨 농도가 높은 대사 재프로그래밍 배지에서 TIL을 배양하는 것을 포함한다. 증가된 칼륨은 낮은 칼륨 수준, 예를 들어, 약 40mM 미만의 칼륨 이온, 예를 들어, 5mM 칼륨 이온을 사용하는 기존의 방법과 비교하여 종양 반응성(예를 들어, 종양 특이성)을 유지하면서 줄기 유사 마커의 발현이 증가하고 클론 다양성이 증가한 CD8⁺ TIL의 증가된 확장과 놀랍게도 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 매우 높은 농도의 칼륨(예를 들어, > 80mM, > 90mM 또는 > 100mM)은 TIL 확장을 감소시켰지만, 본원에 기술된 방법은 통상적인 방법과 일치하는 배양 조건, 예를 들어, 지속 기간 후 TIL의 치료적 유효 수를 산출하였다.

면역요법 전략의 사용은 특정 유형의 진행성 암 치료에서 상당한 임상적 효능을 입증하였다. 면역 체크포인트 차단(Immune checkpoint blockade, ICB)은 전이성 흑색종 환자에서 객관적이고 때로는 지속적인 반응을 유발할 수 있다. 결장암, 폐암 환자 및 추가 악성 종양이 있는 특정 코호트도 ICB의 혜택을 받을 수 있다. 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 혈액 세포 악성종양, 특히 CD19 또는 B 세포 성숙 항원(B cell maturation antigen, BCMA) CAR로 표적화될 수 있는 B 세포 계통 종양 환자에서 극적인 임상 반응을 매개하였다. NY-ESO-1과 같은 공유되고 돌연변이되지 않은 종양 항원을 인식하는 T 세포 수용체(TCR)로 형질도입된 T 세포를 사용한 치료는 TCR 일치 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen, HLA)을 발현하는 환자의 임상 반응도 중재할 수 있다. 그러나 이러한 주목할만한 성공에도 불구하고 진행성 암 환자의 대다수는 여전히 면역요법 치료의 혜택을 받지 못하며 결국 질병에 굴복하게 된다.

TIL 요법은 진행성 암 환자의 임상 반응을 매개하는 잠재성도 보였다. 새로운 증거는 TIL이 종양 반응성 세포와 비특이적 방관자 세포(bystander cell)로 구성된 이종 집단이라는 것을 입증하였다. TIL의 이러한 이종 집단은 이종 집단의 비특이적 방관자 세포가 선호되지 않기 때문에 TIL 요법에서 어려움을 유발하고/하거나 TIL 요법의 효능을 희석시킨다. 방관자 세포는 반응성 TIL의 다양성을 희석시킬 수 있는 비특이적 T 세포이다. 방관자 세포는 종양과 관련이 없는 에피토프를 인식하는 TIL을 포함한다. 또한, TIL 요법의 효능은 흑색종, 진행성 자궁경부암, 폐암, 유방암 및/또는 위장관 암 환자에서 다양한 반응을 나타냈다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 생체 내 요법을 위해 생체 외 또는 시험관 내에서 TIL 집단의 이질성을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 특정 유형의 TIL 집단, 예를 들어, CD8+ TIL 및/또는 종양 반응성 CD8+ TIL을 농축시킨다. 일부 측면에서 본원에 개시된 방법은 줄기 유사 T 세포 집단, 예를 들어, 줄기 유사 종양 반응성 TIL 및/또는 줄기 유사 종양 반응성 CD8+ TIL을 농축시킨다.

임의의 이론에 얽매이지 않고, 본 개시내용은 고칼륨성 배지를 사용하여 TIL 집단에서 특정 세포 유형, 즉 종양 반응성 TIL, CD8+ TIL, 종양 반응성 CD8+ TIL, 줄기 유사 종양 반응성 TIL, 줄기 유사 CD8+ TIL 및/또는 줄기 유사 종양 반응성 CD8+ TIL을 농축시키는 방법을 제시한다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 TIL의 이종 집단을 40mM보다 높은 농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지에 배치하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, TIL의 이종 집단은 고칼륨성 배지에 놓인 후 CD8+ TIL이 농축된다.

본 개시내용의 일부 측면은 TIL의 이종 집단을 적어도 5mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 CD8+ TIL(예를 들어, 종양 반응성, 예를 들어, 종양 특이성 CD8+ TIL)의 수 또는 백분율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 측면은 TIL의 이종 집단을 적어도 5mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지에서 생체 외 또는 시험관 내에서 배양하는 것을 포함하는, TIL의 CD8⁺ 농축(예를 들어, 종양 반응성 CD8⁺ 농축) 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 개시내용의 일부 측면은 TIL의 이종 집단을 적어도 5mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 종양 반응성 TIL의 수 또는 백분율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 측면은 TIL의 이종 집단을 적어도 5mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지에서 생체 외 또는 시험관 내에서 배양하는 것을 포함하는, TIL의 종양 반응성 농축 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 개시내용의 일부 측면은 TIL의 이종 집단을 적어도 5mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 줄기 유사 TIL(예를 들어, 줄기 유사 종양 반응성 TIL, 줄기 유사 CD8+ TIL 또는 줄기 유사 종양 반응성 CD8+ TIL)의 수 또는 백분율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 측면은 TIL의 이종 집단을 적어도 5mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지에서 생체 외 또는 시험관 내에서 배양하는 것을 포함하는, 줄기 유사 TIL(예를 들어, 줄기 유사 종양 반응성 TIL, 줄기 유사 CD8+ TIL 또는 줄기 유사 종양 반응성 CD8+ TIL)이 농축된 TIL 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법 및/또는 조성물은 제어된 조건하에(예를 들어, 약 5mM 미만의 농도의 칼륨 이온을 포함하는 배지에서) 배양된 TIL과 비교하여 배양물에서 TIL의 클론 다양성을 증가시킨다.

클론 다양성은 임의의 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 일부 측면에서, 클론 다양성은 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 서브세트를 사용하여 평가한다. TIL 집단의 클론 다양성을 평가하는 방법의 비제한적 예는, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 Venturi 등, J. Immunolog. Mtd. 321:182-95(2007)에서 찾을 수 있다. 일부 측면에서, 클론 다양성은 IMMUNOSEQ®(ADAPTIVE BIOTECHNOLOGIES®)를 사용하여 평가한다. 일부 측면에서, 클론 다양성은 TCR 딥 시퀀싱(deep sequencing)을 사용하여 평가한다. 특정 측면에서, 클론 다양성은 TIL 집단으로부터 단리된 전체 RNA(예를 들어, 전체 RNA로부터 제조된 cDNA)에서 TCRβ CDR3 서열을 시퀀싱함으로써 평가한다. 일부 측면에서, 심슨 클론성을 사용하여 클론 다양성을 평가한다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성과 동일하다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 99% 내지 약 100%, 적어도 약 98% 내지 약 100%, 적어도 약 97% 내지 약 100%, 적어도 약 96% 내지 약 100%, 적어도 약 95% 내지 약 100%, 적어도 약 94% 내지 약 100%, 적어도 약 93% 내지 약 100%, 적어도 약 92% 내지 약 100%, 적어도 약 91% 내지 약 100%, 적어도 약 90% 내지 약 100%, 적어도 약 85% 내지 약 100%, 적어도 약 80% 내지 약 100%, 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 70% 내지 약 100%, 적어도 약 65% 내지 약 100%, 적어도 약 60% 내지 약 100%, 적어도 약 55% 내지 약 100%, 적어도 약 50% 내지 약 100%, 적어도 약 45% 내지 약 100% 또는 적어도 약 40% 내지 약 100%이다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 95% 내지 약 100%이다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 90% 내지 약 100%이다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 85% 내지 약 100%이다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 80% 내지 약 100%이다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 75% 내지 약 100%이다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 70% 내지 약 100%이다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 60% 내지 약 100%이다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 50% 내지 약 100%이다. 특정 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 40% 내지 약 100%이다.

일부 측면에서, 클론 다양성은 심슨 클론성(√∑pi², 여기서 pi는 주어진 샘플에서 클론 i의 비례 풍부도임)를 사용하여 평가한다. 심슨 클론성은 일반적으로 샘플 내의 생산적인 재배열을 평가하여 클론 빈도 분포의 크기를 측정하는 데 사용된다(예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 Venturi 등, J. Immunol. Meth. 321:182-95(2007) 참조). 심슨 클론성의 값은 0에서 1의 범위이며, 1에 가까운 값은 클론이 덜 다양함을 나타내므로 더욱 단클론인 TIL 집단을 나타낸다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.5 미만, 약 0.45 미만, 약 0.4 미만, 약 0.35 미만, 약 0.3 미만, 약 0.275 미만, 약 0.25 미만, 약 0.225 미만, 약 0.2 미만, 약 0.175 미만, 약 0.15 미만, 약 0.125 미만, 약 0.1 미만, 약 0.075 미만, 약 0.07 미만, 약 0.06 미만 또는 약 0.05 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.5 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.4 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.3 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.275 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.25 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.24 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.23 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.22 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.21 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.2 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.19 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.18 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.17 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.16 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.15 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.14 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.13 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.12 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.11 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.1 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.09 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.08 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.07 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.06 미만이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL의 클론 다양성은 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.05 미만이다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 인간 대상체로부터 얻은 TIL을 확장하는 방법을 포함하고,

a. 초기 TIL 배양 배지에서 TIL을 배양하는 단계("초기 TIL 배양");

b. 2차 TIL 배양 배지에서 TIL을 배양하는 단계("제2 TIL 배양"); 및

c. 3차(또는 최종) TIL 배양 배지에서 TIL을 배양하는 단계("최종 TIL 배양")

를 포함하며,

여기서 초기 TIL 배양 배지, 2차 TIL 배양 배지 및/또는 3차 TIL 배양 배지는 고칼륨성이다. 일부 측면에서, 최종 TIL 배양은 T 세포 자극 또는 활성화를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 제2 TIL 배양은 T 세포 자극 또는 활성화를 추가로 포함한다.

a. 초기 TIL 배양 배지에서 TIL을 배양하는 단계("초기 TIL 배양"); 및

b. 2차 TIL 배양 배지에서 TIL을 확장하는 단계("제2 TIL 확장")

를 포함하며,

여기서 초기 TIL 배양 배지 및/또는 2차 TIL 배양 배지는 고칼륨성이다.

b. 2차 TIL 배양 배지에서 TIL을 확장하는 단계("제2 TIL 확장"); 및

c. 3차(또는 최종) TIL 배양 배지에서 TIL을 확장하는 단계("최종 TIL 확장")

를 포함하며,

여기서 초기 TIL 배양 배지, 2차 TIL 배양 배지 및/또는 3차 TIL 배양 배지는 고칼륨성이다.

일부 측면에서, 초기 TIL 배양 배지만 고칼륨성이다. 일부 측면에서, 2차 TIL 배양 배지만 고칼륨성이다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 배지 및 2차 TIL 배양 배지 둘 다 고칼륨성이다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 배지 및 2차 TIL 배양 배지는 고칼륨성이고, 3차 TIL 배양 배지는 고칼륨성이 아니다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양 배지는 IL-2, IL-21 또는 둘 다를 추가로 포함한다. 일부 측면에서 초기 TIL 배양, 2차 TIL 배양 및 3차 또는 최종 TIL 배양은 IL-21과 함께 또는 IL-21 없이 IL-2를 포함한다.

일부 측면에서, 초기 TIL 배양 배지, 2차 TIL 배양 및/또는 3차 또는 최종 TIL 배양물은 T 세포 보충제, 혈청 대체물, 글루타민, 글루타민 대체물(예를 들어, 글루타맥스(L-알라닌-L-글루타민)), 비필수 아미노산, 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 또는 둘 다), 항진균제(예를 들어, FUNGIN™) 및/또는 나트륨 피루베이트를 추가로 포함한다.

일부 측면에서, TIL은 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일 또는 약 19일까지 초기 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서 TIL은 약 14일 내지 약 19일 동안 초기 TIL 배양 배지에서 배양된다.

일부 측면에서, 제2 TIL 배양에서 TIL은 (b)의 2차 TIL 배양 배지에서 CD3 작용제, CD28 작용제 또는 둘 다로 자극된다. 일부 측면에서, 제2 TIL 배양에서 TIL은 2차 TIL 배양 배지에서 CD27 리간드로 추가로 자극된다. 일부 측면에서, 제2 TIL 배양에서 TIL은 2차 TIL 배양 배지에서 4-1BB 리간드로 추가로 자극된다.

일부 측면에서, 제2 TIL 확장에서 TIL은 자극 또는 활성화 후 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일 동안 배양된다.

일부 측면에서, 제2 TIL 확장에서 TIL은 자극 또는 활성화 후 약 6일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 8일 내지 약 12일 동안 배양된다.

일부 측면에서, 3차 또는 최종 TIL 확장에서 TIL은 제2 자극 또는 활성화 후 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일 동안 배양된다.

일부 측면에서, 3차 또는 최종 TIL 확장에서 TIL은 제2 자극 또는 활성화 후 약 7일 내지 약 14일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 8일 내지 약 14일, 약 8일 내지 약 13일, 약 8일 내지 약 12일 동안 배양된다.

본 개시내용은 초기 TIL 배양으로서 본원에 개시된 대사 재프로그래밍 배지, 본원에 개시된 세포 배양물, 또는 본원에 개시된 세포 백(cell bag) 또는 생물반응기(bioreactor)에서 TIL을 배양하는 것도 제공한다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양물 배양은 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 19일 동안 유지된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양물 배양은 14일 내지 약 19일 동안 유지된다.

본 방법은 추가로 2차 TIL 확장으로 발전될 수 있다. 2차 TIL 확장을 시작하기 위해 TIL을 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제, 예를 들어, TRANSACT™로 자극하거나 활성화한다. 일부 측면에서, 배지의 TIL은 CD27 리간드로 추가로 자극된다. 일부 측면에서, 배지의 TIL은 4-1BB 리간드로 추가로 자극된다. 일부 측면에서, 제2 TIL 확장은 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일 동안 유지된다. 일부 측면에서, 2차 TIL 확장 배양은 약 7일(약 1주) 동안 유지된다.

일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 1×10⁷ 내지 적어도 약 50×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷ 내지 적어도 약 40×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷ 내지 적어도 약 30×10⁷개, 적어도 약 4×10⁷ 내지 적어도 약 25×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개, 적어도 약 1×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개 또는 적어도 약 4×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 5×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 1×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷개, 적어도 약 4×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷개, 적어도 약 6×10⁷개, 적어도 약 7×10⁷개, 적어도 약 8×10⁷개, 적어도 약 9×10⁷개, 적어도 약 10×10⁷개, 적어도 약 11×10⁷개, 적어도 약 12×10⁷개, 적어도 약 13×10⁷개, 적어도 약 14×10⁷개, 적어도 약 15×10⁷개, 적어도 약 16×10⁷개, 적어도 약 17×10⁷개, 적어도 약 18×10⁷개, 적어도 약 19×10⁷개 또는 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 5×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 6×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 7×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 8×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 9×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 10×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 15×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다.

2차 TIL 확장 후, TIL은 최종 확장 단계에서 추가로 확장될 수 있다. 최종 TIL 확장을 시작하기 위해 제2 TIL 확장 배양으로부터의 TIL을 대조군 배지(즉, 비고칼륨성 배지)로 이동시킨다. 최종 TIL 확장 배양의 시작 시, TIL을 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제, 예를 들어, TRANSACT™로 추가로 자극한다. 일부 측면에서, 배지의 TIL은 CD27 리간드로 추가로 자극된다. 일부 측면에서, 배지의 TIL은 4-1BB 리간드로 추가로 자극된다.

일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 1×10⁷ 내지 적어도 약 50×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷ 내지 적어도 약 40×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷ 내지 적어도 약 30×10⁷개, 적어도 약 4×10⁷ 내지 적어도 약 25×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개, 적어도 약 1×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개 또는 적어도 약 4×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 5×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 1×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷개, 적어도 약 4×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷개, 적어도 약 6×10⁷개, 적어도 약 7×10⁷개, 적어도 약 8×10⁷개, 적어도 약 9×10⁷개, 적어도 약 10×10⁷개, 적어도 약 11×10⁷개, 적어도 약 12×10⁷개, 적어도 약 13×10⁷개, 적어도 약 14×10⁷개, 적어도 약 15×10⁷개, 적어도 약 16×10⁷개, 적어도 약 17×10⁷개, 적어도 약 18×10⁷개, 적어도 약 19×10⁷개 또는 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 5×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 6×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 7×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 8×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 9×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 10×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 15×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배양 배지에서 배양된다.

일부 측면에서, TIL은 최종 확장된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 자극을 포함한다. 일부 측면에서 자극은 2차 확장 중에 사용된 자극과 동일하다. 일부 측면에서, TIL은 TRANSACT™를 포함하고 4-1BBL 및/또는 CD27L이 있거나 없는 배지에서 세포를 배양함으로써 최종 확장 동안 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 TRANSACT™ 및 4-1BBL 및/또는 CD27L을 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 최종 확장 동안 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 약 1:100 TRANSACT™, 적어도 약 1μg/ml의 4-1BBL 및 적어도 약 5μg/ml의 CD27L을 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 최종 확장 동안 자극된다.

일부 측면에서, 최종 확장 단계는 정적 GREX에서 수행된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 교반 탱크에서 수행된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배양 배지에서 세포 수율이 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 100×10⁹개, 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 90×10⁹개, 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 80×10⁹개, 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 70×10⁹개, 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 60×10⁹개, 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 50×10⁹개, 적어도 약 10×10⁹ 내지 적어도 약 100×10⁹개, 적어도 약 20×10⁹ 내지 적어도 약 100×10⁹개, 적어도 약 30×10⁹ 내지 적어도 약 100×10⁹개, 적어도 약 30×10⁹ 내지 적어도 약 50×10⁹개 또는 적어도 약 35×10⁹ 내지 적어도 약 45×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배양 배지에서 세포 수율이 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 100×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배양 배지에서의 세포 수율이 적어도 약 40×10⁹개, 적어도 약 45×10⁹개, 적어도 약 50×10⁹개, 적어도 약 55×10⁹개, 적어도 약 60×10⁹개, 적어도 약 65×10⁹개, 적어도 약 70×10⁹개, 적어도 약 75×10⁹개, 적어도 약 80×10⁹개, 적어도 약 85×10⁹개, 적어도 약 90×10⁹개, 적어도 약 95×10⁹개 또는 적어도 약 100×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배양 배지에서 세포 수율이 적어도 약 40×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배양 배지에서 세포 수율이 적어도 약 50×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배양 배지에서 세포 수율이 적어도 약 60×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배양 배지에서 세포 수율이 적어도 약 70×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배양 배지에서 세포 수율이 적어도 약 80×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배양 배지에서 세포 수율이 적어도 약 90×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배양 배지에서 세포 수율이 적어도 약 100×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다.

일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 7일 내지 적어도 약 21일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 7일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 8일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 9일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 10일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 11일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 12일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 13일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 14일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 15일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 16일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 17일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 18일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 19일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 20일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 21일 동안 최종 TIL 배양 배지에서 세포가 산출될 때까지 계속된다.

일부 측면에서, 고칼륨성 배지는 저장성이 아니다. 일부 측면에서, 고칼륨성 배지는 등장성이 아니다. 일부 측면에서, 고칼륨성 배지는 고장성이 아니다.

일부 측면에서, TIL의 이종 집단은 CD4⁺ TIL 및 CD8⁺ TIL을 포함한다. 일부 측면에서, TIL의 이종 집단은 대상체로부터 얻은 하나 이상의 종양 샘플로부터 얻는다. 대상체로부터 얻은 임의의 종양 샘플은 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 종양 생검을 포함한다. 일부 측면에서, 종양 생검은 펀치 생검(punch biopsy)을 포함한다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 종양 절제 수술 동안 얻은 종양 조직을 포함한다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 중심부 바늘 생검(core needle biopsy)을 포함한다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 염증이 생긴 종양, 예를 들어, 많은 수의 TIL을 포함하는 종양으로부터 채취된다.

일부 측면에서, 종양 샘플을 플레이팅하고 초기 TIL 배양한다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배지에서 종양 샘플을 배양하는 것을 포함한다. 종양 샘플로부터의 TIL 확장을 위한 임의의 방법이 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 플레이팅 및 초기 TIL 배양 전에 분획화된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일, 적어도 약 21일, 적어도 약 22일, 적어도 약 23일, 적어도 약 24일, 적어도 약 25일, 적어도 약 26일, 적어도 약 27일 또는 적어도 약 28일 지속된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 적어도 약 14일 내지 약 19일 지속된다. 일부 측면에서 초기 TIL 배양은 적어도 약 14일 지속된다.

일부 측면에서, 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL 및/또는 줄기 유사 CD8+ TIL)의 비율은 초기 TIL 배양 이전의 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL의 비율과 비교하여 초기 TIL 배양 후 증가한다. 일부 측면에서, 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL 및/또는 줄기 유사 CD8+ TIL)의 비율은 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배 또는 적어도 약 100배 증가한다. 일부 측면에서, 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL 및/또는 줄기 유사 CD8+ TIL)의 비율은 적어도 약 50배 증가한다.

일부 측면에서, TIL의 이종 집단의 배양 후, 상기 집단에서 TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%는 CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL 및/또는 줄기 유사 CD8+ TIL)이다. 일부 측면에서, TIL의 이종 집단의 배양 후, 상기 집단에서 TIL의 적어도 약 50%는 CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL 및/또는 줄기 유사 CD8+ TIL)이다. 일부 측면에서, TIL의 이종 집단의 배양 후, 상기 집단에서 TIL의 적어도 약 25%는 CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL 및/또는 줄기 유사 CD8+ TIL)이다. 일부 측면에서, TIL의 이종 집단의 배양 후, 상기 집단에서 TIL의 적어도 약 75%는 CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL 및/또는 줄기 유사 CD8+ TIL)이다.

일부 측면에서, TIL은 초기 TIL 배양 후 자극되거나 활성화된다. TIL을 자극하는 동안 TIL의 확장 및/또는 자극을 위한 임의의 방법을 사용할 수 있다. 일부 측면에서, TIL은 초기 TIL 배양 후 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 TIL이 TRANSACT™ TIL 확장, TIL 급속 확장 프로토콜 또는 이들의 조합에 적용되도록 함으로써 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 본원에 개시된 고칼륨성 배지에서 자극된다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))과 같은 면역 세포 집단은, 예를 들어, 약 40mM 미만의 칼륨 이온을 갖는 배지에서 통상적인 방법을 사용하여 배양된 세포 집단에 비해 증가된 수의 줄기 유사 TIL을 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))은 세포의 출발 집단에 비해 줄기 유사 세포의 특징적인 마커의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 세포의 출발 집단은 인간 대상체로부터 얻은 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 세포의 출발 집단은 인간 대상체로부터 얻은 TIL을 포함한다.

증가된 세포 다능성은 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 측면에서, 세포 줄기세포능은 항체 염색 후 게이트 유세포분석에 의해 측정된다. 일부 측면에서, 세포 줄기세포능은 자가포식 플럭스(autophagy flux)에 의해 측정된다. 일부 측면에서, 세포 줄기세포능은 글루코스 흡수에 의해 측정된다. 일부 측면에서, 세포 줄기세포능은 지방산 흡수에 의해 측정된다. 일부 측면에서, 세포 줄기세포능은 미토콘드리아 바이오매스(mitochondrial biomass)에 의해 측정된다. 일부 측면에서, 세포 줄기세포능은 RNA 정량화/발현 분석(예를 들어, 마이크로어레이, qPCR(TaqMan), RNA-Seq., 단일 세포 RNA-Seq. 또는 이들의 임의의 조합)에 의해 측정된다. 일부 측면에서, 세포 줄기세포능은 대사 검정(예를 들어, Seahorse 대사 검정, 세포 외 산성화율(extracellular acidification rate, ECAR)의 분석; 산소 소모율(oxygen consumption rate, OCR)의 분석; 예비 호흡 용량(spare respiratory capacity)의 분석 및/또는 미토콘드리아 막 전위의 분석)(예를 들어, 연결된 전사체)에 의해 측정된다. 일부 측면에서, 줄기세포능은 하나 이상의 생체 내 기능적 검정(예를 들어, 세포 지속성, 항종양 능력, 항종양 클리어런스, 바이러스 클리어런스, 다능성, 사이토카인 방출, 세포 살해 또는 이들의 임의의 조합의 검정)을 사용하여 측정된다.

일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 분화 상태는 덜 분화된 세포의 전형적인 마커를 발현하는 세포의 증가된 수를 특징으로 한다. 일부 측면에서, 줄기 유사 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 수의 증가는 T_N 및/또는 T_SCM 세포의 전형적인 마커를 발현하는 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 특징으로 한다. 일부 측면에서, 줄기 유사 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 수의 증가는 T_SCM 세포의 전형적인 마커를 발현하는 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 특징으로 한다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CD45RA를 발현하는 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CCR7을 발현하는 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, TIL 집단은 CD62L을 발현하는 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, TIL 집단은 CD28을 발현하는 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CD95를 발현하는 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))은 CD45RO^low이다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))은 CD45RO를 발현하지 않는다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CD8⁺, CD45RA⁺, CCR7⁺ 및 CD62L⁺인 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CD8⁺, CD95⁺, CD45RA⁺, CCR7⁺ 및 CD62L⁺인 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 TCF7을 발현하는 세포의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CD8⁺, CD45RA⁺, CCR7⁺, CD62L⁺ 및 TCF7⁺인 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CD8⁺, CD95⁺, CD45RA⁺, CCR7⁺, CD62L⁺ 및 TCF7⁺인 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))은 CD3을 발현한다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CD8⁺, CD3⁺, CD45RA⁺, CCR7⁺, CD62L⁺, TCF7⁺인 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CD8⁺, CD3⁺, CD95⁺, CD45RA⁺, CCR7⁺, CD62L⁺, TCF7⁺인면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))은 CD27을 발현한다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CD8⁺, CD27⁺, CD3⁺, CD95⁺, CD45RA⁺, CCR7⁺, CD62L⁺, TCF7⁺인 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 CD8⁺, CD27⁺, CD3⁺, CD95⁺, CD45RA⁺, CCR7⁺, CD62L⁺, TCF7⁺인 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL)) 집단은 T_SCM 세포의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포 집단, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))은 T_N 세포의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포 집단, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))은 T_SCM 및 T_N 세포의 증가된 수를 나타낸다. 일부 측면에서, 세포 집단은 줄기 유사 TIL의 증가된 수을 나타낸다.

일부 측면에서, 배양물에서 줄기 유사 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 수는 배양 전 줄기 유사 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 수에 비해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100% 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 줄기 유사 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 수는 배양 전 줄기 유사 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 수에 비해 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배 또는 적어도 약 20배 증가된다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 배양 후, 줄기 유사 CD8⁺ TIL(예를 들어, 줄기 유사 종양 반응성 CD8+ TIL)은 배양물에서 CD8⁺ TIL의 총 수의 적어도 약 1%, 적어도 약 2%, 적어도 약 3%, 적어도 약 4%, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%를 구성한다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL의 배양 후, 줄기 유사 TIL은 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 10% 내지 적어도 약 70%를 구성한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL의 배양 후, 줄기 유사 TIL은 배양물에서 CD8⁺ TIL의 총 수의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 적어도 약 70%를 구성한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL의 배양 후, 줄기 유사 TIL은 배양물에서 CD4⁺ TIL의 총 수의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 적어도 약 70%를 구성한다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL의 배양 후, 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 10% 내지 적어도 약 40%는 CD39^-/CD69^- TIL이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL의 배양 후, 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35% 또는 적어도 약 40%는 CD39^-/CD69^- TIL이다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL의 배양 후, 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 10% 내지 적어도 약 70%는 CD39^-/TCF7⁺ TIL이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL의 배양 후, 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35% 또는 약 40%는 CD39^-/TCF7⁺ TIL이다. 일부 측면에서 TIL은 CD4⁺ T 세포이다. 일부 측면에서 TIL은 CD8⁺ TIL이다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 면역 세포, 예를 들어, TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL(예를 들어, 종양 반응성 CD8+ TIL))의 입양 전이(adoptive transfer) 시, 전이된 세포는 종래의 배양 조건을 사용하여 배양한 세포와 비교하여 감소된 세포 고갈을 나타낸다. 일부 측면에서, 배양된 TIL의 입양 전이 시, 전이된 CD8⁺농축 TIL은 종래의 배양 조건을 사용하여 배양된 TIL과 비교하여 더 오랫 동안 생체 내에서 견딘다. 이러한 증가된 지속성은 TIL이 종양 미세환경에 침투하고 기능하는 능력, 고갈에 저항하는 능력, 및 지속적인 확장 및 반응 지속성을 보장하는 줄기세포능의 지속성을 지칭한다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 T 세포는 줄기 유사 세포이다. 이러한 세포는 자가 재생, 증식 및 분화할 수 있다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 T 세포는 이펙터 유사 마커도 발현하는 줄기 유사 세포이다. 일부 측면에서, 면역 세포, 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 T 세포는 종양 세포를 표적화하고 살해하는 능력도 유지하는 줄기 유사 세포이다.

일부 측면에서, 전이된 CD8⁺ 농축 TIL은 종래의 배양 조건을 사용하여 배양된 TIL과 비교하여 더 큰 생체 내 효능, 예를 들어, 종양 살해 활성을 갖는다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 CD8⁺ 농축 TIL의 더 낮은 용량은 종래의 배양 조건을 사용하여 배양된 세포와 비교하여 대상체에서 반응, 예를 들어, 감소된 종양 부피를 유도하는 데 필요하다.

일부 측면에서, TIL은 생체 외 배양 전체 동안, 예를 들어, 종양 샘플이 처음 플레이팅되는 시간부터 전체 확장 과정을 거쳐 투여될 때까지 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 본원에 개시된 고칼륨성 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 확장 기간 동안 본원에 개시된 배지에서 배양된다.

일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배양 배지는 미토콘드리아 연료를 포함한다. 일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배양 배지는 O-아세틸-L-카르니틴 하이드로클로라이드를 포함한다. 일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배양 배지는 적어도 약 0.1mM, 적어도 약 0.5mM, 적어도 약 1.0mM, 적어도 약 5mM 또는 적어도 약 10mM O-아세틸-L-카르니틴 하이드로클로라이드를 포함한다. 일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배양 배지는 적어도 약 1.0mM O-아세틸-L-카르니틴 하이드로클로라이드를 포함한다.

일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배양 배지는 해당작용(glycolysis) 매개 대사의 억제제, 예를 들어, 키나아제 억제제, 예를 들어, 포스포이노시티드 3-키나아제 억제제를 포함한다. 일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배양 배지는 포스파티딜이노시톨-3-키나아제(PI3K) 억제제, 예를 들어, 이델라리시브(idelalisib)(예를 들어, CAL-101; Selleckchem)를 포함한다. 일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배양 배지는 적어도 약 0.1mM, 적어도 약 0.5mM, 적어도 약 1.0mM, 적어도 약 5mM 또는 적어도 약 10mM 이델라리시브를 포함한다. 일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배양 배지는 적어도 약 1.0mM 이델라리시브를 포함한다.

일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배양 배지는 (ⅰ) 하나 이상의 세포 확장제, (ⅱ) 나트륨 이온, (ⅲ) 하나 이상의 당류(saccharide), (ⅳ) 칼슘 이온 및 (ⅴ) 하나 이상의 사이토카인 중 하나 이상을 추가로 포함한다.

II.A. 칼륨

본 개시내용의 일부 측면은 TIL의 이종 집단을 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배지에 배치하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 TIL의 이종 집단을 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배지에서 배양하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 CD8⁺ TIL의 수 또는 백분율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 다른 측면은 종양 침윤 림프구(TIL)의 이종 집단을 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배지에서 생체 외 또는 시험관 내에서 배양하는 것을 포함하는, TIL의 CD8⁺ 농축 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 적어도 약 30mM, 적어도 약 35mM, 적어도 약 40mM, 적어도 약 45mM, 적어도 약 50mM, 적어도 약 55mM, 적어도 약 60mM, 적어도 약 65mM, 적어도 약 70mM, 적어도 약 75mM, 적어도 약 80mM, 적어도 약 85mM, 적어도 약 90mM, 적어도 약 95mM 또는 적어도 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 적어도 약 50mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 45mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 적어도 약 55mM, 적어도 약 60mM, 적어도 약 65mM, 적어도 약 70mM, 적어도 약 75mM, 적어도 약 80mM, 적어도 약 85mM, 적어도 약 90mM, 적어도 약 95mM 또는 적어도 약 100mM, 적어도 약 105mM, 적어도 약 110mM, 적어도 약 115mM, 적어도 약 120mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM, 약 60mM, 약 65mM, 약 70mM, 약 75mM, 약 80mM, 약 85mM, 약 90mM, 약 95mM, 약 100mM, 약 105mM, 약 110mM, 약 115mM, 약 120mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM이다. 일부 측면에서 칼륨 이온의 농도는 약 40mM 내지 약 90mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM 내지 약 85mM, 약 40mM 내지 약 80mM, 약 40mM 내지 약 75mM, 약 40mM 내지 약 70mM, 약 40mM 내지 약 65mM, 약 40mM 내지 약 60mM, 약 40mM 내지 약 55mM 또는 약 40mM 내지 약 50mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 90mM, 약 50mM 내지 약 85mM, 약 50mM 내지 약 80mM, 약 50mM 내지 약 75mM, 약 50mM 내지 약 70mM, 약 50mM 내지 약 65mM, 약 50mM 내지 약 60mM 또는 약 50mM 내지 약 55mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 100mM, 약 50mM 내지 약 95mM, 약 50mM 내지 약 90mM, 약 50mM 내지 약 85mM, 약 50mM 내지 약 80mM, 약 50mM 내지 약 75mM, 약 50mM 내지 약 70mM, 약 50mM 내지 약 65mM, 약 50mM 내지 약 60mM 또는 약 50mM 내지 약 55mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM 내지 약 100mM, 약 55mM 내지 약 95mM, 약 55mM 내지 약 90mM, 약 55mM 내지 약 85mM, 약 55mM 내지 약 80mM, 약 55mM 내지 약 75mM, 약 55mM 내지 약 70mM, 약 55mM 내지 약 65mM 또는 약 55mM 내지 약 60mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 100mM, 약 60mM 내지 약 95mM, 약 60mM 내지 약 90mM, 약 60mM 내지 약 85mM, 약 60mM 내지 약 80mM, 약 60mM 내지 약 75mM, 약 60mM 내지 약 70mM 또는 약 60mM 내지 약 65mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM 내지 약 100mM, 약 65mM 내지 약 95mM, 약 65mM 내지 약 90mM, 약 65mM 내지 약 85mM, 약 65mM 내지 약 80mM, 약 65mM 내지 약 75mM 또는 약 65mM 내지 약 70mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM 내지 약 100mM, 약 70mM 내지 약 95mM, 약 70mM 내지 약 90mM, 약 70mM 내지 약 85mM, 약 70mM 내지 약 80mM 또는 약 70mM 내지 약 75mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 75mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 75mM 내지 약 100mM, 약 75mM 내지 약 95mM, 약 75mM 내지 약 90mM, 약 75mM 내지 약 85mM 또는 약 75mM 내지 약 80mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM 내지 약 100mM, 약 80mM 내지 약 95mM, 약 80mM 내지 약 90mM 또는 약 80mM 내지 약 85mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 85mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 85mM 내지 약 100mM, 약 85mM 내지 약 95mM 또는 약 85mM 내지 약 90mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 90mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 90mM 내지 약 95mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 95mM 내지 약 100mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 배지는 고장성이다. 일부 측면에서, 배지는 등장성이다. 일부 측면에서, 배지는 적어도 약 50mM 칼륨 이온 및 약 90mM 미만의 NaCl을 포함한다. 일부 측면에서, 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 55mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM 내지 약 60mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 65mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM 내지 약 70mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM 내지 약 75mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 75mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM 내지 약 85mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 85mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 90mM 내지 약 95mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 95mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 100mM 내지 약 105mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 105mM 내지 약 110mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 110mM 내지 약 115mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 115mM 내지 약 120mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM 내지 약 70mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 70mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM 내지 약 70mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 70mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM 내지 약 70mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 41mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 41mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 42mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 42mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 43mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 43mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 44mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 44mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 45mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 45mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 46mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 46mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 47mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 47mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 48mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 48mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 49mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 49mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 51mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 51mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 52mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 52mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 53mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 53mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 54mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 54mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 56mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 56mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 57mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 57mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 58mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 58mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 59mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 59mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 61mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 61mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 62mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 62mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 63mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 63mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 64mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 64mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 66mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 66mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 67mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 67mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 68mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 68mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 69mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 69mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 71mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 71mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 72mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 72mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 73mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 73mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 74mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 74mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 75mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 75mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 76mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 76mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 77mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 77mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 78mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 78mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 79mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 79mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 81mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 81mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 82mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 82mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 83mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 83mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 84mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 84mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 85mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 85mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 86mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 86mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 87mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 87mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 88mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 88mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 89mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 89mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 90mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 91mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 91mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 92mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 92mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 93mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 93mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 94mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 94mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 95mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 95mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 96mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 96mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 97mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 97mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 98mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 98mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 99mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 99mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 100mM보다 높다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 100mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 90mM이고, NaCl의 농도는 약 90mM 미만 내지 약 50mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 80mM이고, NaCl의 농도는 약 90mM 미만 내지 약 60mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 90mM이고, NaCl의 농도는 약 90mM 미만 내지 약 60mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 80mM이고, NaCl의 농도는 약 80mM 미만 내지 약 60mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM 내지 약 90mM이고, NaCl의 농도는 약 70mM 미만 내지 약 50mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM 내지 약 80mM이고, NaCl의 농도는 약 70mM 미만 내지 약 60mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM 내지 약 90mM이고, NaCl의 농도는 약 60mM 미만 내지 약 50mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 55mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM 내지 약 55mM이고, NaCl의 농도는 약 90mM 미만 내지 약 85mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM 내지 약 60mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM 내지 약 60mM이고, NaCl의 농도는 약 85mM 미만 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 65mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM 내지 약 65mM이고, NaCl의 농도는 약 80mM 미만 내지 약 75mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM 내지 약 70mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM 내지 약 70mM이고, NaCl의 농도는 약 75mM 미만 내지 약 70mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM 내지 약 75mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM 내지 약 75mM이고, NaCl의 농도는 약 70mM 미만 내지 약 65mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 75mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 75mM 내지 약 80mM이고, NaCl의 농도는 약 65mM 미만 내지 약 60mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM 내지 약 85mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM 내지 약 85mM이고, NaCl의 농도는 약 60mM 미만 내지 약 55mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 85mM 내지 약 90mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 85mM 내지 약 90mM이고, NaCl의 농도는 약 55mM 미만 내지 약 50mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 90mM 내지 약 95mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 90mM 내지 약 95mM이고, NaCl의 농도는 약 50mM 미만 내지 약 45mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 95mM 내지 약 100mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 95mM 내지 약 100mM이고, NaCl의 농도는 약 45mM 미만 내지 약 40mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 100mM 내지 약 105mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 100mM 내지 약 105mM이고, NaCl의 농도는 약 40mM 미만 내지 약 35mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 105mM 내지 약 110mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 105mM 내지 약 110mM이고, NaCl의 농도는 약 35 미만 내지 약 30이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 110mM 내지 약 115mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 110mM 내지 약 115mM이고, NaCl의 농도는 약 30mM 미만 내지 약 25mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 115mM 내지 약 120mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 115mM 내지 약 120mM이고, NaCl의 농도는 약 25mM 미만 내지 약 20mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 40mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 41mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 41mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 42mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 42mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 43mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 43mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 44mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 44mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 45mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 45mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 46mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 46mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 47mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 47mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 48mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 48mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 49mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 49mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 50mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 51mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 51mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 52mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 52mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 53mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 53mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 54mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 54mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 55mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 56mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 56mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 57mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 57mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 58mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 58mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 59mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 59mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 60mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 61mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 61mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 62mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 62mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 63mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 63mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 64mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 64mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 65mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 66mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 66mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 67mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 67mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 68mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 68mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 69mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 69mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 70mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 71mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 71mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 72mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 72mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 73mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 73mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 74mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 74mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 75mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 75mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 76mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 76mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 77mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 77mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 78mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 78mM이며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 79mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 79mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 80mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 81mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 81mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 82mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 82mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 83mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 83mM이며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 84mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 84mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 85mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 85mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 86mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 86mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 87mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 87mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 88mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 88mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 89mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 89mM이며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 90mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 90mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 91mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 91mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 92mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 92mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 93mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 93mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 94mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 94mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 95mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 95mM이며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 96mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 96mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 97mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 97mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 98mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 98mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 99mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 99mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 100mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 100mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 101mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 101mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 102mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 102mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 103mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 103mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 104mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 104mM이며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 105mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 105mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 106mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 106mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 107mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 107mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 108mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 108mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 109mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 109mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 110mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 110mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 111mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 111mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 112mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 112mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 113mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 113mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 114mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 114mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 115mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 115mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 116mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 116mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 117mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 117mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 118mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 118mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 119mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 119mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 120mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 120mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 121mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 121mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 122mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 122mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 123mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 123mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 124mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 124mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 125mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 125mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 126mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 126mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 127mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 127mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 128mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 128mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 129mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 129mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 130mM보다 높으며, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, 칼륨 이온의 농도는 약 130mM이고, 배지에서 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 고농도의 칼륨 이온을 포함하는 고칼륨성 배지는 배지에 충분한 양의 칼륨염을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 일부 측면에서, 칼륨염의 비제한적 예는 아민트리클로로백금산칼륨, 칼륨 아쿠아펜타클로로루테네이트, 칼륨 비스(옥살라토)백금(Ⅱ) 이수화물, 중황산칼륨, 수소화붕소칼륨, 브롬화칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 크롬산칼륨, 중크롬산칼륨, 칼륨 디시아노아르제네이트, 디시아노금산칼륨, 불화칼륨, 플루오로황산칼륨, 헥사클로로이리듐산칼륨, 헥사클로로오스뮴산칼륨, 헥사클로로팔라리움산칼륨, 헥사클로로백금산칼륨, 헥사클로로레늄산칼륨, 헥사시아노크롬산칼륨, 헥사시아노철산칼륨, 헥사시아노루테늄산칼륨(Ⅱ) 수화물, 헥사플루오로안티몬산칼륨, 헥사플루오로니켈산칼륨, 헥사플루오로인산칼륨, 헥사플루오로티탄산칼륨, 헥사플루오로지르콘산칼륨, 헥사하이드록소안티몬산칼륨, 헥사요오도백산칼륨, 헥사요오도레늄산칼륨, 수산화칼륨, 요오드산칼륨, 요오드화칼륨, 망간산칼륨, 메타바나듐산칼륨, 몰리브덴산칼륨, 질산칼륨, 칼륨 니트로소디설포네이트, 오스뮴산칼륨(Ⅵ) 이수화물, 펜타클로로니트로실루테늄산칼륨, 과염소산칼륨, 과레늄산칼륨, 과루테늄산칼륨, 과황산칼륨, 제2인산칼륨, 제1인산칼륨, 피로인산칼륨, 칼륨 셀레노시아네이트, 칼륨 셀레노시아네이트, 주석산칼륨 삼수화물, 황산칼륨, 텔루르산칼륨 수화물, 텔루르산칼륨, 사붕산칼륨 사수화물, 테트라브로모금산칼륨, 테트라브로모팔라리움산칼륨, 테트라클로로팔라리움산칼륨, 테트라클로로백금산칼륨, 테트라시아노팔라듐산칼륨, 테트라시아노백금산칼륨, 테트라플루오로붕산칼륨, 테트라니트로백금산칼륨, 테트라티온산칼륨, 칼륨 p-톨루엔티오설포네이트 및 칼륨 하이드록시시트레이트 삼염기성 일수화물을 포함한다. 일부 측면에서, 칼륨염은 염화칼륨(KCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 칼륨염은 글루콘산칼륨을 포함한다. 특정 측면에서, 칼륨염은 시트르산칼륨을 포함한다. 특정 측면에서, 칼륨염은 칼륨 하이드록시시트레이트를 포함한다. 일부 측면에서, 칼륨염은 본원에 개시된 임의의 칼륨염의 조합을 포함한다.

II.B. 세포 확장제

일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배지는 세포 확장제를 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "세포 확장제"는 배양된 면역 세포, 예를 들어, TIL의 시험관 내 및/또는 생체 외 성장 및 증식을 촉진하는 작용제, 예를 들어, 소분자, 폴리펩티드 또는 이들의 임의의 조합을 지칭한다. 일부 측면에서, 세포 확장제는 PI3K 억제제를 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 AKT 억제제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 PI3K 억제제 및 AKT 억제제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, PI3K 억제제는 LY294002를 포함한다. 일부 측면에서, PI3K 억제제는 IC87114를 포함한다. 일부 측면에서, PI3K 억제제는 이델라리시브를 포함한다(예를 들어, Peterson 등, Blood Adv. 2(3):210-23(2018) 참조). 일부 측면에서, 배지는 GSK3B 억제제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, GSK3B 억제제는 TWS119를 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 ACLY 억제제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, ACLY 억제제는 칼륨 하이드록시시트레이트 삼염기성 일수화물을 포함한다. 일부 측면에서, PI3K 억제제는 하이드록실 시트레이트를 포함한다. 일부 측면에서, PI3K 억제제는 픽틸리시브를 포함한다. 일부 측면에서, PI3K 억제제는 CAL-101을 포함한다. 일부 측면에서, AKT 억제제는 MK2206, A443654 또는 AKTi-VIII(CAS 612847-09-3)를 포함한다.

II.C. 나트륨

일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지, 예를 들어, 고칼륨성 배지는 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지는 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 약 115mM 미만의 농도로 포함한다. 일부 측면에서 대사 재프로그래밍 배지는 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 40mM 내지 약 80mM 농도로 포함한다.

일부 측면에서, 나트륨의 목표 농도는 고농도의 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함하는 기초 배지로 시작하고 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 목표 농도에 도달하기 위해 용액을 희석함으로써 도달된다. 일부 측면에서, 나트륨의 목표 농도는 하나 이상의 나트륨염(예를 들어, 더 많은 NaCl)을 첨가하여 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도를 높임으로써 도달된다. 나트륨염의 비제한적인 예는 (메타)과요오드산나트륨, 나트륨 아르세닐 타르트레이트 수화물, 나트륨 아지드, 나트륨 벤질옥사이드, 브롬화나트륨, 탄산나트륨, 염화나트륨, 크롬산나트륨, 나트륨 사이클로헥산부티레이트, 나트륨 에탄티올레이트, 불화나트륨, 플루오로인산나트륨, 포름산나트륨, 헥사클로로이리듐산나트륨(Ⅲ) 수화물, 헥사클로로이리듐산나트륨(Ⅳ) 육수화물, 헥사클로로백금산나트륨(Ⅳ) 육수화물, 나트륨 헥사클로로로데이트(Ⅲ), 헥사플루오로알루민산나트륨, 헥사플루오로안티몬산나트륨(Ⅴ), 헥사플루오로비산나트륨(Ⅴ), 헥사플루오로철산나트륨(Ⅲ), 헥사플루오로인산나트륨, 헥사플루오로규산나트륨, 헥사하이드록시백금산나트륨(Ⅳ), 헥사메타인산나트륨, 이불화수소나트륨, 황산수소나트륨, 나트륨 하이드로겐시안아미드, 수산화나트륨, 요오드화나트륨, 메타붕산나트륨 사수화물, 메타규산나트륨 구수화물, 메타바나듐산나트륨, 몰리브덴산나트륨, 질산나트륨, 아질산나트륨, 옥살산나트륨, 과붕산나트륨 일수화물, 과탄산나트륨, 과염소산나트륨, 과요오드산나트륨, 과망간산나트륨, 과레늄산나트륨, 인산나트륨, 피로인산나트륨, 셀렌산나트륨, 아셀렌산나트륨, 주석산나트륨, 황산나트륨, 아텔루르산나트륨, 사붕산나트륨, 테트라클로로알루민산나트륨, 테트라클로로금산나트륨(Ⅲ), 테트라클로로팔라듐산나트륨(Ⅱ), 테트라클로로백금산나트륨(Ⅱ), 제3티오인산나트륨, 티오황산나트륨, 티오황산나트륨 오수화물, 옥시불화이트륨나트륨, 트리메타인산삼나트륨 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 나트륨염은 염화나트륨(NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 나트륨염은 글루콘산나트륨을 포함한다. 특정 측면에서, 나트륨염은 중탄산나트륨을 포함한다. 특정 측면에서, 나트륨염은 하이드록시시트르산나트륨을 포함한다. 특정 측면에서, 나트륨염은 인산나트륨을 포함한다.

일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 기초 배지의 농도보다 낮다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 칼륨 이온의 농도가 증가함에 따라 감소된다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 25mM 내지 약 115mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 25mM 내지 약 100mM, 약 30mM 내지 약 40mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 60mM, 약 30mM 내지 약 70mM, 약 30mM 내지 약 80mM, 약 40mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 60mM, 약 40mM 내지 약 70mM, 약 40mM 내지 약 80mM, 약 50mM 내지 약 55mM, 약 50mM 내지 약 60mM, 약 50mM 내지 약 65mM, 약 50mM 내지 약 70mM, 약 50mM 내지 약 75mM, 약 50mM 내지 약 80mM, 약 55mM 내지 약 60mM, 약 55mM 내지 약 65mM, 약 55mM 내지 약 70mM, 약 55mM 내지 약 75mM, 약 55mM 내지 약 80mM, 약 60mM 내지 약 65mM, 약 60mM 내지 약 70mM, 약 60mM 내지 약 75mM, 약 60mM 내지 약 80mM, 약 70mM 내지 약 75mM, 약 70mM 내지 약 80mM 또는 약 75mM 내지 약 80mM이다. 특정 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 40mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 50mM 내지 약 85mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 55mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 30mM 내지 약 35mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 35mM 내지 약 40mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 40mM 내지 약 45mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 45mM 내지 약 50mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 50mM 내지 약 55mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 55mM 내지 약 60mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 60mM 내지 약 65mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 65mM 내지 약 70mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 70mM 내지 약 75mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 75mM 내지 약 80mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 80mM 내지 약 85mM이다.

일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 55mM, 약 60mM, 약 65mM, 약 70mM, 약 75mM, 약 80mM, 약 85mM 또는 약 90mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 40mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 45mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 50mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 55mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 60mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 65mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 70mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 75mM이다. 일부 측면에서, 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)의 농도는 약 80mM이다.

일부 측면에서, 배지는 약 40mM 내지 약 90mM 칼륨 이온 및 약 40mM 내지 약 80mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다.

일부 측면에서, 배지는 약 50mM 내지 약 75mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 90mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 55mM 내지 약 75mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 90mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 60mM 내지 약 75mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 90mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 65mM 내지 약 75mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 65mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 66mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 67mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 68mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 69mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 70mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 71mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 72mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 73mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 74mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 75mM 칼륨 이온 및 약 80mM 내지 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 65mM 칼륨 이온 및 약 80mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 65mM 칼륨 이온 및 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 65mM 칼륨 이온 및 약 90mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 70mM 칼륨 이온 및 약 80mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 70mM 칼륨 이온 및 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 70mM 칼륨 이온 및 약 90mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 75mM 칼륨 이온 및 약 80mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 75mM 칼륨 이온 및 약 85mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 75mM 칼륨 이온 및 약 90mM 나트륨 이온(예를 들어, NaCl)을 포함한다.

일부 측면에서, 배지는 약 40mM 내지 약 90mM 칼륨 이온 및 약 30mM 내지 약 109mM NaCl을 포함하며, NaCl의 농도(mM)는 (135 - 칼륨 이온 농도) 이하이다. 일부 측면에서, 배지는 약 40mM 칼륨 이온 및 약 95mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 95mM, 약 94mM, 약 93mM, 약 92mM, 약 91mM, 약 90mM, 약 85mM, 약 80mM, 약 75mM, 약 70mM, 약 65mM, 약 60mM, 약 55mM 또는 약 50mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 45mM 칼륨 이온 및 약 90mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 90mM, 약 89mM, 약 88mM, 약 87mM, 약 86mM, 약 85mM, 약 80mM, 약 75mM, 약 70mM, 약 65mM, 약 60mM, 약 55mM 또는 약 50mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 50mM 칼륨 이온 및 약 85mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 85mM, 약 84mM, 약 83mM, 약 82mM, 약 81mM, 약 80mM, 약 75mM, 약 70mM, 약 65mM, 약 60mM, 약 55mM 또는 약 50mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 55mM 칼륨 이온 및 약 80mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 80mM, 약 79mM, 약 78mM, 약 77mM, 약 76mM, 약 75mM, 약 70mM, 약 65mM, 약 60mM, 약 55mM 또는 약 50mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 60mM 칼륨 이온 및 약 75mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 75mM, 약 74mM, 약 73mM, 약 72mM, 약 71mM, 약 70mM, 약 65mM, 약 60mM, 약 55mM 또는 약 50mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 65mM 칼륨 이온 및 약 70mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 70mM, 약 69mM, 약 68mM, 약 67mM, 약 66mM, 약 65mM, 약 60mM, 약 55mM 또는 약 50mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 70mM 칼륨 이온 및 약 70mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 65mM, 약 64mM, 약 63mM, 약 62mM, 약 61mM, 약 60mM, 약 55mM 또는 약 50mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 75mM 칼륨 이온 및 약 60mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 60mM, 약 59mM, 약 58mM, 약 57mM, 약 56mM, 약 55mM, 약 50mM, 약 45mM 또는 약 40mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 80mM 칼륨 이온 및 약 55mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 55mM, 약 54mM, 약 53mM, 약 52mM, 약 51mM, 약 50mM, 약 45mM, 약 40mM 또는 약 35mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 85mM 칼륨 이온 및 약 50mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 50mM, 약 49mM, 약 48mM, 약 47mM, 약 46mM, 약 45mM, 약 40mM, 약 35mM 또는 약 30mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 90mM 칼륨 이온 및 약 45mM 이하의 NaCl(예를 들어, 약 45mM, 약 44mM, 약 43mM, 약 42mM, 약 41mM, 약 40mM, 약 35mM, 약 30mM 또는 약 25mM NaCl)을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 70mM 칼륨 이온 및 약 60mM NaCl을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 70mM 칼륨 이온 및 약 61mM NaCl을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 약 70mM 칼륨 이온 및 약 62mM NaCl을 포함한다.

일부 측면에서, 배지는 약 50mM 칼륨 이온 및 약 75mM NaCl을 포함한다. 일부 측면에서 배지는 저장성이다. 일부 측면에서, 배지는 등장성이다.

본 개시내용의 일부 측면은 세포를 (ⅰ) 40mM보다 높은 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 약 100mM 미만의 농도의 NaCl을 포함하는 배지에 배치하는 것을 포함하는, 세포, 예를 들어, 다능성, 전분화능 및/또는 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 및/또는 TIL)를 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 특정 측면은 T 세포를 (ⅰ) 적어도 약 50mM 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 약 90mM 미만의 농도의 NaCl을 포함하는 배지에 배치하는 것을 포함하는, T 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.

II.D. 당류

일부 측면에서, 대사 재프로그래밍 배지(MRM), 예를 들어, 고칼륨성 배지는 당류를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 저장성이다. 일부 측면에서, MRM은 등장성이다. 일부 측면에서, 당류의 목표 농도는 고농도의 당류를 포함하는 기초 배지로 시작하고 당류의 목표 농도에 도달하기 위해 용액을 희석함으로써 도달된다. 일부 측면에서, 당류의 목표 농도는 원하는 농도에 도달할 때까지 당류를 첨가하여 당류의 농도를 높임으로써 도달된다.

일부 측면에서, 당류는 단당류, 이당류 또는 다당류이다. 일부 측면에서, 당류는 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 만노스, 말토스, 수크로스, 락토스, 트레할로스 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 당류는 글루코스이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 글루코스를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM보다 높은 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 글루코스를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 만노스를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM보다 높은 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 만노스를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 만노스를 포함한다. 일부 측면에서 MRM은 저장성이다. 일부 측면에서 MRM은 등장성이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM보다 높은 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 글루코스를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 50mM보다 높은 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 글루코스를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 40mM 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 만노스를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 만노스를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM보다 높은 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 글루코스를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 50mM보다 높은 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 글루코스를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 40mM 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 만노스를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 농도의 칼륨 이온 및 (ⅱ) 만노스를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 10mM 내지 약 24mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 24mM 미만이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 10mM 초과이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 5mM 내지 약 20mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 10mM 내지 약 20mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 10mM 내지 약 25mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 5mM, 약 15mM 내지 약 25mM, 약 15mM 내지 약 20mM, 약 15mM 내지 약 19mM, 약 15mM 내지 약 18mM, 약 15mM 내지 약 17mM, 약 15mM 내지 약 16mM, 약 16mM 내지 약 20mM, 약 16mM 내지 약 19mM, 약 16mM 내지 약 18mM, 약 16mM 내지 약 17mM, 약 17mM 내지 약 20mM, 약 17mM 내지 약 19mM 또는 약 17mM 내지 약 18mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 5mM 내지 약 20mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 10mM 내지 약 20mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 10mM 내지 약 15mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 14mM 내지 약 14.5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 14.5mM 내지 약 15mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 15mM 내지 약 15.5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 15.5mM 내지 약 16mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 16mM 내지 약 16.5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 16.5mM 내지 약 17mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 17mM 내지 약 17.5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 17.5mM 내지 약 18mM이다.

일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 8mM, 약 9mM, 약 10mM, 약 10.5mM, 약 11mM, 약 11.5mM, 약 12mM, 약 12.5mM, 약 13mM, 약 13.5mM, 약 14mM, 약 14.5mM, 약 15mM, 약 15.5mM, 약 16mM, 약 16.5mM, 약 17mM, 약 17.5mM, 약 18mM, 약 18.5mM, 약 19mM, 약 19.5mM, 약 20mM, 약 20.5mM, 약 21mM, 약 22mM, 약 23mM, 약 24mM 또는 약 25mM이다.

일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 6mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 7mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 8mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 9mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 10mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 10.5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 11mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 11.5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 12mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 12.5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 13mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 13.5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 14mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 14.5mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 15mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 15.4mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 15.9mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 16.3mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 16.8mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 17.2mM이다. 일부 측면에서, 당류, 예를 들어, 글루코스의 농도는 약 17.7mM이다.

II.E. 칼슘

일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 고칼륨성 배지는 칼슘 이온을 포함한다. 일부 측면에서, 칼슘의 목표 농도는 고농도의 칼슘 이온을 포함하는 기초 배지로 시작하고 칼슘 이온의 목표 농도에 도달하기 위해 용액을 희석함으로써 달성된다. 일부 측면에서, 칼슘의 목표 농도는 하나 이상의 칼슘염을 첨가하여 칼슘 이온의 농도를 높임으로써 달성된다. 칼슘염의 비제한적 예는 브롬화칼슘, 탄산칼슘, 염화칼슘, 칼슘 시안아미드, 불화칼슘, 수소화칼슘, 수산화칼슘, 요오드산칼슘, 요오드화칼슘, 질산칼슘, 아질산칼슘, 옥살산칼슘, 과염소산칼슘 사수화물, 제1인산칼슘, 제3인산칼슘, 황산칼슘, 티오시안산칼슘 사수화물, 하이드록시아파타이트 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 칼슘염은 염화칼슘(CaCl₂)을 포함한다. 일부 측면에서, 칼슘염은 글루콘산칼슘을 포함한다.

일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 기초 배지의 농도보다 낮다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 기초 배지의 농도보다 높다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.4mM 초과이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 2.8mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 2.5mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 2.0mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.9mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.8mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.7mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.6mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.5mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.4mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.3mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.2mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.1mM 미만이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.0mM 미만이다.

일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.4mM 내지 약 2.8mM, 약 0.4mM 내지 약 2.7mM, 약 0.4mM 내지 약 2.5mM, 약 0.5mM 내지 약 2.0mM, 약 1.0mM 내지 약 2.0mM, 약 1.1mM 내지 약 2.0mM, 약 1.2mM 내지 약 2.0mM, 약 1.3mM 내지 약 2.0mM, 약 1.4mM 내지 약 2.0mM, 약 1.5mM 내지 약 2.0mM, 약 1.6mM 내지 약 2.0mM, 약 1.7mM 내지 약 2.0mM, 약 1.8mM 내지 약 2.0mM, 약 0.8 내지 약 0.9mM, 약 0.8 내지 약 1.0mM, 약 0.8 내지 약 1.1mM, 약 0.8 내지 약 1.2mM, 약 0.8 내지 약 1.3mM, 약 0.8 내지 약 1.4mM, 약 0.8 내지 약 1.5mM, 약 0.8 내지 약 1.6mM, 약 0.8 내지 약 1.7mM, 약 0.8 내지 약 1.8mM, 약 0.9 내지 약 1.0mM, 약 0.9 내지 약 1.1mM, 약 0.9 내지 약 1.2mM, 약 0.9 내지 약 1.3mM, 약 0.9 내지 약 1.4mM, 약 0.9 내지 약 1.5mM, 약 0.9 내지 약 1.6mM, 약 0.9 내지 약 1.7mM, 약 0.9 내지 약 1.8mM, 약 1.0 내지 약 1.1mM, 약 1.0 내지 약 1.2mM, 약 1.0 내지 약 1.3mM, 약 1.0 내지 약 1.4mM, 약 1.0 내지 약 1.5mM, 약 1.0 내지 약 1.6mM, 약 1.0 내지 약 1.7mM, 약 1.0 내지 약 1.8mM, 약 1.1 내지 약 1.2mM, 약 1.1 내지 약 1.3mM, 약 1.1 내지 약 1.4mM, 약 1.1 내지 약 1.5mM, 약 1.1 내지 약 1.6mM, 약 1.1 내지 약 1.7mM, 약 1.1 내지 약 1.8mM, 약 1.2 내지 약 1.3mM, 약 1.2 내지 약 1.4mM, 약 1.2 내지 약 1.5mM, 약 1.2 내지 약 1.6mM, 약 1.2 내지 약 1.7mM, 약 1.2 내지 약 1.8mM, 약 1.3 내지 약 1.4mM, 약 1.3 내지 약 1.5mM, 약 1.3 내지 약 1.6mM, 약 1.3 내지 약 1.7mM, 약 1.3 내지 약 1.8mM, 약 1.4 내지 약 1.5mM, 약 1.4 내지 약 1.6mM, 약 1.4 내지 약 1.7mM, 약 1.4 내지 약 1.8mM, 약 1.5 내지 약 1.6mM, 약 1.5 내지 약 1.7mM, 약 1.5 내지 약 1.8mM, 약 1.6 내지 약 1.7mM, 약 1.6 내지 약 1.8mM 또는 약 1.7 내지 약 1.8mM이다.

일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.8mM 내지 약 1.8mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.9mM 내지 약 1.8mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.0mM 내지 약 1.8mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.1mM 내지 약 1.8mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.2mM 내지 약 1.8mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.8mM 내지 약 1.8mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.8mM 내지 약 0.9mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.9mM 내지 약 1.0mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.0mM 내지 약 1.1mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.1mM 내지 약 1.2mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.2mM 내지 약 1.3mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.3mM 내지 약 1.4mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.4mM 내지 약 1.5mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.5mM 내지 약 1.6mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.7mM 내지 약 1.8mM이다.

일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.6mM, 약 0.7mM, 약 0.8mM, 약 0.9mM, 약 1.0mM, 약 1.1mM, 약 1.2mM, 약 1.3mM, 약 1.4mM, 약 1.5mM, 약 1.6mM, 약 1.7mM, 약 1.8mM, 약 1.9mM 또는 약 2.0mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.6mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.7mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.8mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 0.9mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.0mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.1mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.2mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.3mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.4mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.5mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.6mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.7mM이다. 일부 측면에서, 칼슘 이온의 농도는 약 1.8mM이다.

일부 측면에서, MRM은 약 40mM 내지 약 90mM 칼륨 이온 및 약 0.5mM 내지 약 2.8mM 칼슘 이온을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 40mM 내지 약 90mM 칼륨 이온, NaCl, 및 약 0.5mM 내지 약 2.8mM 칼슘 이온을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

II.F. 사이토카인

일부 측면에서, MRM은 사이토카인을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 저장성이다. 일부 측면에서 MRM은 등장성이다. 일부 측면에서, 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 측면에서, MRM은 IL-2를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, MRM은 IL2 및 IL21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 IL2, IL21 및 IL15를 포함한다.

사이토카인은 임의의 시점에서 MRM에 첨가될 수 있다. 일부 측면에서, 사이토카인은 TIL(예를 들어, 종양 샘플)이 배지에 첨가되기 전에 MRM에 첨가된다. 일부 측면에서, TIL(예를 들어, 종양 샘플)은 확장을 포함하는 TIL 배양 내내 (ⅰ) 본원에 개시된 농도의 칼륨 및 (ⅱ) 사이토카인을 포함하는 MRM에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL(예를 들어, 종양 샘플)은 TIL 확장 내내 (ⅰ) 본원에 개시된 농도의 칼륨 및 (ii) 사이토카인을 포함하는 MRM에서 배양된다.

일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM 초과의 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM 초과의 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM 초과의 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM 초과의 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 칼륨 이온 및 (ⅱ) IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 IL-7 및/또는 IL-15를 포함하지 않는다.

일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM 초과의 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM 초과의 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM 초과의 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 40mM 초과의 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 50mM 칼륨 이온, (ⅱ) NaCl 및 (ⅲ) IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 IL-7 및/또는 IL-15를 포함하지 않으며; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.1ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 50ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 50ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 100ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 200ng/mL 내지 약 300ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 600ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 500ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 450ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 400ng/mL, 약 300ng/mL 내지 약 350ng/mL, 약 250ng/mL 내지 약 300ng/mL 또는 약 275ng/mL 내지 약 325ng/mL의 IL-2를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50ng/mL, 적어도 약 60ng/mL, 적어도 약 70ng/mL, 적어도 약 80ng/mL, 적어도 약 90ng/mL, 적어도 약 100ng/mL, 적어도 약 110ng/mL, 적어도 약 120ng/mL, 적어도 약 130ng/mL, 적어도 약 140ng/mL, 적어도 약 150ng/mL, 적어도 약 160ng/mL, 적어도 약 170ng/mL, 적어도 약 180ng/mL, 적어도 약 190ng/mL, 적어도 약 200ng/mL, 적어도 약 210ng/mL, 적어도 약 220ng/mL, 적어도 약 230ng/mL, 적어도 약 240ng/mL, 적어도 약 250ng/mL, 적어도 약 260ng/mL, 적어도 약 270ng/mL, 적어도 약 280ng/mL, 적어도 약 290ng/mL, 적어도 약 300ng/mL, 적어도 약 310ng/mL, 적어도 약 320ng/mL, 적어도 약 330ng/mL, 적어도 약 340ng/mL, 적어도 약 350ng/mL, 적어도 약 360ng/mL, 적어도 약 370ng/mL, 적어도 약 380ng/mL, 적어도 약 390ng/mL, 적어도 약 400ng/mL, 적어도 약 410ng/mL, 적어도 약 420ng/mL, 적어도 약 430ng/mL, 적어도 약 440ng/mL, 적어도 약 450ng/mL, 적어도 약 460ng/mL, 적어도 약 470ng/mL, 적어도 약 480ng/mL, 적어도 약 490ng/mL, 적어도 약 500ng/mL, 적어도 약 510ng/mL, 적어도 약 520ng/mL, 적어도 약 530ng/mL, 적어도 약 540ng/mL, 적어도 약 550ng/mL, 적어도 약 560ng/mL, 적어도 약 570ng/mL, 적어도 약 580ng/mL, 적어도 약 590ng/mL 또는 적어도 약 600ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 73.6ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 100ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 200ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 400ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 500ng/mL IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 600ng/mL의 IL-2를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1500IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1500IU/mL 내지 약 12,000IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1500IU/mL, 적어도 약 1600IU/mL, 적어도 약 1700IU/mL, 적어도 약 1800IU/mL, 적어도 약 1900IU/mL, 적어도 약 2000IU/mL, 적어도 약 2100IU/mL, 적어도 약 2200IU/mL, 적어도 약 2300IU/mL, 적어도 약 2400IU/mL, 적어도 약 2500IU/mL, 적어도 약 2600IU/mL, 적어도 약 2700IU/mL, 적어도 약 2800IU/mL, 적어도 약 2900IU/mL, 적어도 약 3000IU/mL, 적어도 약 3100IU/mL, 적어도 약 3200IU/mL, 적어도 약 3300IU/mL, 적어도 약 3400IU/mL, 적어도 약 3500IU/mL, 적어도 약 3600IU/mL, 적어도 약 3700IU/mL, 적어도 약 3800IU/mL, 적어도 약 3900IU/mL, 적어도 약 4000IU/mL, 적어도 약 4100IU/mL, 적어도 약 4200IU/mL, 적어도 약 4300IU/mL, 적어도 약 4400IU/mL, 적어도 약 4500IU/mL, 적어도 약 4600IU/mL, 적어도 약 4700IU/mL, 적어도 약 4800IU/mL, 적어도 약 4900IU/mL, 적어도 약 5000IU/mL, 적어도 약 5100IU/mL, 적어도 약 5200IU/mL, 적어도 약 5300IU/mL, 적어도 약 5400IU/mL, 적어도 약 5500IU/mL, 적어도 약 5600IU/mL, 적어도 약 5700IU/mL, 적어도 약 5800IU/mL, 적어도 약 5900IU/mL, 적어도 약 6000IU/mL, 적어도 약 6100IU/mL, 적어도 약 6200IU/mL, 적어도 약 6300IU/mL, 적어도 약 6400IU/mL, 적어도 약 6500IU/mL, 적어도 약 6600IU/mL, 적어도 약 6700IU/mL, 적어도 약 6800IU/mL, 적어도 약 6900IU/mL, 적어도 약 7000IU/mL의 IL-2, 적어도 약 7100IU/mL, 적어도 약 7200IU/mL, 적어도 약 7300IU/mL, 적어도 약 7400IU/mL, 적어도 약 7500IU/mL, 적어도 약 7600IU/mL, 적어도 약 7700IU/mL, 적어도 약 7800IU/mL, 적어도 약 7900IU/mL 또는 적어도 약 8000IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 3000IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 본원에 기술된 바와 같이 제2 배양(예를 들어, REP 배양) 동안 MRM에서 배양되며, MRM은 약 3000IU/mL를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 6000IU/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 본원에 기술된 바와 같이 초기 배양 동안 MRM에서 배양되며, MRM은 약 6000IU/mL를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.1ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.1ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 25ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 15ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 30ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng/mL 또는 약 15ng/mL 내지 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.1ng/mL, 적어도 약 0.5ng/mL, 적어도 약 1ng/mL, 적어도 약 2ng/mL, 적어도 약 3ng/mL, 적어도 약 4ng/mL, 적어도 약 5ng/mL, 적어도 약 6ng/mL, 적어도 약 7ng/mL, 적어도 약 8ng/mL, 적어도 약 9ng/mL, 적어도 약 10ng/mL, 적어도 약 11ng/mL, 적어도 약 12ng/mL, 적어도 약 13ng/mL, 적어도 약 14ng/mL, 적어도 약 15ng/mL, 적어도 약 16ng/mL, 적어도 약 17ng/mL, 적어도 약 18ng/mL, 적어도 약 19ng/mL, 적어도 약 20ng/mL, 적어도 약 25ng/mL, 적어도 약 30ng/mL, 적어도 약 35ng/mL 또는 적어도 약 40ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 2.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 3.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 4.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 5.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 6.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 7.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 8.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 9.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 10ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 15ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 25ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 35ng/mL의 IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 50IU/mL 내지 약 500IU/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 50IU/mL, 약 60IU/mL, 약 70IU/mL, 약 80IU/mL, 약 90IU/mL, 약 100IU/mL, 약 125IU/mL, 약 150IU/mL, 약 175IU/mL, 약 200IU/mL, 약 225IU/mL, 약 250IU/mL, 약 275IU/mL, 약 300IU/mL, 약 350IU/mL, 약 400IU /mL, 약 450IU/mL 또는 약 500IU/mL의 IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.1ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 15ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 14ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 13ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 12ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 11ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 9ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 8ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 7ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 6ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 5ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 4ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 3ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 2ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 15ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 15ng/mL 또는 약 15ng/mL 내지 약 20ng/mL의 IL-7을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.1ng/mL, 적어도 약 0.5ng/mL, 적어도 약 1ng/mL, 적어도 약 1.3ng/mL, 적어도 약 1.5ng/mL, 적어도 약 1.7ng/mL, 적어도 약 2ng/mL, 적어도 약 2.3ng/mL, 적어도 약 2.5ng/mL, 적어도 약 2.7ng/mL, 적어도 약 3ng/mL, 적어도 약 3.3ng/mL, 적어도 약 3.5ng/mL, 적어도 약 3.7ng/mL, 적어도 약 4ng/mL, 적어도 약 4.3ng/mL, 적어도 약 4.5ng/mL, 적어도 약 4.7ng/mL, 적어도 약 5ng/mL, 적어도 약 5.3ng/mL, 적어도 약 5.5ng/mL, 적어도 약 5.7ng/mL, 적어도 약 6ng/mL, 적어도 약 7ng/mL, 적어도 약 8ng/mL, 적어도 약 9ng/mL, 적어도 약 10ng/mL, 적어도 약 11ng/mL, 적어도 약 12ng/mL, 적어도 약 13ng/mL, 적어도 약 14ng/mL, 적어도 약 15ng/mL, 적어도 약 16ng/mL, 적어도 약 17ng/mL, 적어도 약 18ng/mL, 적어도 약 19ng/mL 또는 적어도 약 20ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, 배지는 적어도 약 1.0ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 2.0ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 2.3ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 2.5ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 2.7ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 3.0ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 3.3ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 3.5ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 3.7ng/mL의 IL-7을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 500IU/mL 내지 약 1,500IU/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 500IU/mL, 약 550IU/mL, 약 600IU/mL, 약 650IU/mL, 약 700IU/mL, 약 750IU/mL, 약 800IU/mL, 약 850IU/mL, 약 900IU/mL, 약 950IU/mL, 약 1,000IU/mL, 약 1,050IU/mL, 약 1,100IU/mL, 약 1,150IU/mL, 약 1,200IU/mL, 약 1,250IU /mL, 약 1,300IU/mL, 약 1,350IU/mL, 약 1,400IU/mL, 약 1,450IU/mL 또는 약 1,500IU/mL의 IL-7을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.1ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 15ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 14ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 13ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 12ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 11ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 9ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 8ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 7ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 6ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 5ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 4ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 3ng/mL, 약 1ng/mL 내지 약 2ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 15ng/mL, 약 5ng/mL 내지 약 10ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 20ng/mL, 약 10ng/mL 내지 약 15ng/mL 또는 약 15ng/mL 내지 약 20ng/mL의 IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.1ng/mL, 적어도 약 0.2ng/mL, 적어도 약 0.3ng/mL, 적어도 약 0.4ng/mL, 적어도 약 0.5ng/mL, 적어도 약 0.6ng/mL, 적어도 약 0.7ng/mL, 적어도 약 0.8ng/mL, 적어도 약 0.9ng/mL, 적어도 약 1ng/mL, 적어도 약 2ng/mL, 적어도 약 3ng/mL, 적어도 약 4ng/mL, 적어도 약 5ng/mL, 적어도 약 6ng/mL, 적어도 약 7ng/mL, 적어도 약 8ng/mL, 적어도 약 9ng/mL, 적어도 약 10ng/mL, 적어도 약 11ng/mL, 적어도 약 12ng/mL, 적어도 약 13ng/mL, 적어도 약 14ng/mL, 적어도 약 15ng/mL, 적어도 약 16ng/mL, 적어도 약 17ng/mL, 적어도 약 18ng/mL, 적어도 약 19ng/mL 또는 적어도 약 20ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.1ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.2ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.3ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.5ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.6ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.7ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.8ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.9ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1.0ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 2.0ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 3.0ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 4.0ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 5.0ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 6.0ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 7.0ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 8.0ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 9.0ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 10ng/mL의 IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 50IU/mL 내지 약 500IU/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 50IU/mL, 약 60IU/mL, 약 70IU/mL, 약 80IU/mL, 약 90IU/mL, 약 100IU/mL, 약 125IU/mL, 약 150IU/mL, 약 175IU/mL, 약 200IU/mL, 약 225IU/mL, 약 250IU/mL, 약 275IU/mL, 약 300IU/mL, 약 350IU/mL, 약 400IU/mL, 약 450IU/mL 또는 약 500IU/mL의 IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨, (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스 및 (ⅴ) 약 10ng/mL의 IL-2를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온 및 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 40mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨, (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 300ng/mL의 IL-2 및 (ⅵ) 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨, (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 300ng/mL의 IL-2 및 (ⅵ) 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온 및 약 10ng/mL의 IL-2, 약 1ng/mL의 IL-7 및 약 1ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨, (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 300ng/mL의 IL-2, (ⅵ) 약 290ng/mL의 IL-7 및 (ⅶ) 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 1005mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨, (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 300ng/mL의 IL-2 및 (ⅵ) 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨, (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 290ng/mL의 IL-7 및 (ⅵ) 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨, (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 (ⅵ) 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨(예를 들어, NaCl), (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스 및 (ⅴ) 약 10ng/mL의 IL-2를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, NaCl 및 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 40mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 290ng/mL의 IL-7을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨(예를 들어, NaCl), (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 300ng/mL의 IL-2 및 (ⅵ) 약 290ng/mL의 IL-7을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨(예를 들어, NaCl), (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 300ng/mL의 IL-2 및 (ⅵ) 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, NaCl, 및 약 10ng/mL의 IL-2, 약 1ng/mL의 IL-7 및 약 1ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨(예를 들어, NaCl), (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 300ng/mL의 IL-2, (ⅵ) 약 290ng/mL의 IL-7 및 (ⅶ) 약 0.4ng/mL의 IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, NaCl, 약 300ng/mL의 IL-2 및 약 30ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨(예를 들어, NaCl), (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 300ng/mL의 IL-2 및 (ⅵ) 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, NaCl, 약 290ng/mL의 IL-7 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨(예를 들어, NaCl), (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 290ng/mL의 IL-7 및 (ⅵ) 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 30mM 내지 적어도 약 100mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 40mM 초과의 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 45mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 50mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 55mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 60mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 65mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 70mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 75mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 80mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 85mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 90mM 칼륨 이온, NaCl, 약 0.4ng/mL의 IL-15, 및 약 20ng/mL의 IL-21을 포함하고; 칼륨 이온과 NaCl의 총 농도는 110mM 내지 140mM이다. 일부 측면에서, MRM은 (ⅰ) 적어도 약 70mM 칼륨 이온, (ⅱ) 약 60mM 나트륨(예를 들어, NaCl), (ⅲ) 약 1.4mM 칼슘, (ⅳ) 약 16mM 글루코스, (ⅴ) 약 0.4ng/mL의 IL-15 및 (ⅵ) 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다.

II.G. T 세포 배양 배지(예를 들어, 대사 재프로그래밍 배지)

일부 측면에서, MRM은 기초 배지에 칼륨 이온을 첨가함으로써 제조한다. 면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포 및/또는 TIL)를 배양하는 데 사용되는 모든 기초 배지를 사용할 수 있다.

일부 측면에서, MRM은 하나 이상의 필수 아미노산을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 L-아르기닌, L-시스틴, L-이소류신, L-류신, L-라이신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-트레오닌, L-트립토판, L-히스티딘, L-티로신, L-발린, L-글루타민 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 필수 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 L-글루타민을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.01mM의 하나 이상의 필수 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.01mM 내지 약 10mM의 하나 이상의 필수 아미노산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.01mM 내지 약 10mM, 약 0.01mM 내지 약 9mM, 약 0.01mM 내지 약 8mM, 약 0.01mM 내지 약 7mM, 약 0.01mM 내지 약 6mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 4mM, 약 0.01mM 내지 약 3mM, 약 0.01mM 내지 약 2mM, 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 9mM, 약 0.1mM 내지 약 8mM, 약 0.1mM 내지 약 7mM, 약 0.1mM 내지 약 6mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 4mM, 약 0.1mM 내지 약 3mM, 약 0.1mM 내지 약 2mM, 약 0.1mM 내지 약 1mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 9mM, 약 1mM 내지 약 8mM, 약 1mM 내지 약 7mM, 약 1mM 내지 약 6mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM 또는 약 1mM 내지 약 2mM의 하나 이상의 필수 아미노산을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.01mM, 적어도 약 0.1mM, 적어도 약 0.5mM, 적어도 약 1.0mM, 적어도 약 2mM, 적어도 약 3mM, 적어도 약 4mM, 적어도 약 5mM, 적어도 약 6mM, 적어도 약 7mM, 적어도 약 8mM, 적어도 약 9mM, 적어도 약 10mM, 적어도 약 11mM, 적어도 약 12mM, 적어도 약 13mM, 적어도 약 14mM, 또는 적어도 약 15mM 또는 적어도 약 50mM의 하나 이상의 필수 아미노산을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 0.01mM, 약 0.05mM, 약 0.1mM, 약 0.2mM, 약 0.3mM, 약 0.4mM, 약 0.5mM, 약 0.6mM, 약 0.7mM, 약 0.8mM, 약 0.9mM, 약 1mM, 약 1.1mM, 약 1.2mM, 약 1.3mM, 약 1.4mM, 약 1.5mM, 약 1.6mM, 약 1.7mM, 약 1.8mM, 약 1.9mM, 약 2.0mM, 약 2.1mM, 약 2.2mM, 약 2.3mM, 약 2.4mM, 약 2.5mM, 약 2.6mM, 약 2.7mM, 약 2.8mM, 약 2.9mM, 약 3.0mM, 약 3.1mM, 약 3.2mM, 약 3.3mM, 약 3.4mM, 약 3.5mM, 약 3.6mM, 약 3.7mM, 약 3.8mM, 약 3.9mM, 약 4.0mM, 약 4.1mM, 약 4.2mM, 약 4.3mM, 약 4.4mM, 약 4.5mM, 약 4.6mM, 약 4.7mM, 약 4.8mM, 약 4.9mM, 약 5.0mM, 약 5.1mM, 약 5.2mM, 약 5.3mM, 약 5.4mM, 약 5.5mM, 약 5.6mM, 약 5.7mM, 약 5.8mM, 약 5.9mM, 약 6.0mM, 약 6.1mM, 약 6.2mM, 약 6.3mM, 약 6.4mM, 약 6.5mM, 약 6.6mM, 약 6.7mM, 약 6.8mM, 약 6.9mM 또는 약 7.0mM의 하나 이상의 필수 아미노산을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.01mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.01mM 내지 약 10mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.01mM 내지 약 10mM, 약 0.01mM 내지 약 9mM, 약 0.01mM 내지 약 8mM, 약 0.01mM 내지 약 7mM, 약 0.01mM 내지 약 6mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 4mM, 약 0.01mM 내지 약 3mM, 약 0.01mM 내지 약 2mM, 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 9mM, 약 0.1mM 내지 약 8mM, 약 0.1mM 내지 약 7mM, 약 0.1mM 내지 약 6mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 4mM, 약 0.1mM 내지 약 3mM, 약 0.1mM 내지 약 2mM, 약 0.1mM 내지 약 1mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 9mM, 약 1mM 내지 약 8mM, 약 1mM 내지 약 7mM, 약 1mM 내지 약 6mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM 또는 약 1mM 내지 약 2mM L-글루타민을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.01mM, 적어도 약 0.1mM, 적어도 약 0.5mM, 적어도 약 1.0mM, 적어도 약 2mM, 적어도 약 3mM, 적어도 약 4mM, 적어도 약 5mM, 적어도 약 6mM, 적어도 약 7mM, 적어도 약 8mM, 적어도 약 9mM, 적어도 약 10mM, 적어도 약 11mM, 적어도 약 12mM, 적어도 약 13mM, 적어도 약 14mM, 또는 적어도 약 15mM 또는 적어도 약 50mM L-글루타민을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 0.01mM, 약 0.05mM, 약 0.1mM, 약 0.2mM, 약 0.3mM, 약 0.4mM, 약 0.5mM, 약 0.6mM, 약 0.7mM, 약 0.8mM, 약 0.9mM, 약 1mM, 약 1.1mM, 약 1.2mM, 약 1.3mM, 약 1.4mM, 약 1.5mM, 약 1.6mM, 약 1.7mM, 약 1.8mM, 약 1.9mM, 약 2.0mM, 약 2.1mM, 약 2.2mM, 약 2.3mM, 약 2.4mM, 약 2.5mM, 약 2.6mM, 약 2.7mM, 약 2.8mM, 약 2.9mM, 약 3.0mM, 약 3.1mM, 약 3.2mM, 약 3.3mM, 약 3.4mM, 약 3.5mM, 약 3.6mM, 약 3.7mM, 약 3.8mM, 약 3.9mM, 약 4.0mM, 약 4.1mM, 약 4.2mM, 약 4.3mM, 약 4.4mM, 약 4.5mM, 약 4.6mM, 약 4.7mM, 약 4.8mM, 약 4.9mM, 약 5.0mM, 약 5.1mM, 약 5.2mM, 약 5.3mM, 약 5.4mM, 약 5.5mM, 약 5.6mM, 약 5.7mM, 약 5.8mM, 약 5.9mM, 약 6.0mM, 약 6.1mM, 약 6.2mM, 약 6.3mM, 약 6.4mM, 약 6.5mM, 약 6.6mM, 약 6.7mM, 약 6.8mM, 약 6.9mM 또는 약 7.0mM L- 글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.7mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.68mM L-글루타민을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 0.14mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.15mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.76mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.83mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.84mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.97mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 2.05mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 2.11mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 2.18mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 5.41mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 5.47mM L-글루타민을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 < 0.10mM L-글루타민을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.01mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.01mM 내지 약 10mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.01mM 내지 약 10mM, 약 0.01mM 내지 약 9mM, 약 0.01mM 내지 약 8mM, 약 0.01mM 내지 약 7mM, 약 0.01mM 내지 약 6mM, 약 0.01mM 내지 약 5mM, 약 0.01mM 내지 약 4mM, 약 0.01mM 내지 약 3mM, 약 0.01mM 내지 약 2mM, 약 0.01mM 내지 약 1mM, 약 0.1mM 내지 약 10mM, 약 0.1mM 내지 약 9mM, 약 0.1mM 내지 약 8mM, 약 0.1mM 내지 약 7mM, 약 0.1mM 내지 약 6mM, 약 0.1mM 내지 약 5mM, 약 0.1mM 내지 약 4mM, 약 0.1mM 내지 약 3mM, 약 0.1mM 내지 약 2mM, 약 0.1mM 내지 약 1mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 1mM 내지 약 9mM, 약 1mM 내지 약 8mM, 약 1mM 내지 약 7mM, 약 1mM 내지 약 6mM, 약 1mM 내지 약 5mM, 약 1mM 내지 약 4mM, 약 1mM 내지 약 3mM 또는 약 1mM 내지 약 2mM L-글루탐산을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.01mM, 적어도 약 0.1mM, 적어도 약 0.5mM, 적어도 약 1.0mM, 적어도 약 2mM, 적어도 약 3mM, 적어도 약 4mM, 적어도 약 5mM, 적어도 약 6mM, 적어도 약 7mM, 적어도 약 8mM, 적어도 약 9mM, 적어도 약 10mM, 적어도 약 11mM, 적어도 약 12mM, 적어도 약 13mM, 적어도 약 14mM, 또는 적어도 약 15mM 또는 적어도 약 50mM L-글루탐산을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 0.01mM, 약 0.05mM, 약 0.1mM, 약 0.2mM, 약 0.3mM, 약 0.4mM, 약 0.5mM, 약 0.6mM, 약 0.7mM, 약 0.8mM, 약 0.9mM, 약 1mM, 약 1.1mM, 약 1.2mM, 약 1.3mM, 약 1.4mM, 약 1.5mM, 약 1.6mM, 약 1.7mM, 약 1.8mM, 약 1.9mM, 약 2.0mM, 약 2.1mM, 약 2.2mM, 약 2.3mM, 약 2.4mM, 약 2.5mM, 약 2.6mM, 약 2.7mM, 약 2.8mM, 약 2.9mM, 약 3.0mM, 약 3.1mM, 약 3.2mM, 약 3.3mM, 약 3.4mM, 약 3.5mM, 약 3.6mM, 약 3.7mM, 약 3.8mM, 약 3.9mM, 약 4.0mM, 약 4.1mM, 약 4.2mM, 약 4.3mM, 약 4.4mM, 약 4.5mM, 약 4.6mM, 약 4.7mM, 약 4.8mM, 약 4.9mM, 약 5.0mM, 약 5.1mM, 약 5.2mM, 약 5.3mM, 약 5.4mM, 약 5.5mM, 약 5.6mM, 약 5.7mM, 약 5.8mM, 약 5.9mM, 약 6.0mM, 약 6.1mM, 약 6.2mM, 약 6.3mM, 약 6.4mM, 약 6.5mM, 약 6.6mM, 약 6.7mM, 약 6.8mM, 약 6.9mM 또는 약 7.0mM L- 글루탐산을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 0.15mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.17mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.18mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.19mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.85mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.86mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.9mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.95mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.06mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.09mM L-글루탐산을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 < 0.10mM L-글루탐산을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 디펩티드를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 글루타민-글루타민(Gln-Gln)을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 알라닐-글루타민(Ala-Gln)을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.1mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.1mM 내지 약 50mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.1mM 내지 약 40mM, 약 0.1mM 내지 약 35mM, 약 0.1mM 내지 약 30mM, 약 0.1mM 내지 약 25mM, 약 0.1mM 내지 약 20mM, 약 1mM 약 20mM, 약 2mM 내지 약 20mM, 약 3mM 내지 약 20mM, 약 4mM 내지 약 20mM, 약 5mM 내지 약 20mM, 약 6mM 내지 약 20mM, 약 7mM 내지 약 20mM, 약 8mM 내지 약 20mM, 약 9mM 내지 약 20mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 1mM 내지 약 10mM, 약 2mM 내지 약 10mM, 약 3mM 내지 약 10mM, 약 4mM 내지 약 10mM, 약 5mM 내지 약 10mM, 약 6mM 내지 약 10mM, 약 7mM 내지 약 10mM, 약 8mM 내지 약 10mM 또는 약 9mM 내지 약 10mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 적어도 약 0.1mM, 적어도 약 1.0mM, 적어도 약 2mM, 적어도 약 3mM, 적어도 약 4mM, 적어도 약 5mM, 적어도 약 6mM, 적어도 약 7mM, 적어도 약 8mM, 적어도 약 9mM, 적어도 약 10mM, 적어도 약 11mM, 적어도 약 12mM, 적어도 약 13mM, 적어도 약 14mM, 적어도 약 15mM, 적어도 약 16mM, 적어도 약 17mM, 적어도 약 18mM, 적어도 약 19mM, 적어도 약 20mM, 적어도 약 25mM, 적어도 약 30mM 또는 적어도 약 50mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 1mM, 약 1.1mM, 약 1.2mM, 약 1.3mM, 약 1.4mM, 약 1.5mM, 약 1.6mM, 약 1.7mM, 약 1.8mM, 약 1.9mM 또는 약 2.0mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다. 일부 측면에서, 기초 배지는 약 1.7mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.68mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 6mM, 약 6.1mM, 약 6.2mM, 약 6.3mM, 약 6.4mM, 약 6.5mM, 약 6.6mM, 약 6.7mM, 약 6.8mM, 약 6.9mM, 약 7.0mM, 약 7.1mM 또는 약 7.2mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 6.8mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 6.81mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 6.9mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 6.96mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 7.0mM 디펩티드(예를 들어, Ala-Gln)를 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 약 5mM 미만의 암모니아(NH₃)를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 4mM 미만, 약 3.5mM 미만, 약 3mM 미만, 약 2.5mM 미만, 약 2mM 미만, 약 1.5mM 미만, 약 1mM 미만, 약 0.5mM 미만, 약 0.4mM 미만, 약 0.3mM 미만, 약 0.2mM 미만 또는 약 0.1mM 미만의 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.01mM 암모니아 내지 약 2mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 1.9mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 1.8mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 1.7mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 1.6mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 1.5mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 1.4mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 1.3mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 1.2mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 1.1mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 1mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 0.9mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 0.8mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 0.7mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 0.6mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 0.5mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 0.4mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 0.3mM 미만의 암모니아, 약 0.01mM 암모니아 내지 약 0.2mM 미만의 암모니아, 또는 약 0.01mM 암모니아 내지 약 0.1mM 미만의 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.2mM 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.25mM 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.259mM 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.28mM 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 1.3mM 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.3mM 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.34mM 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.35mM 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.36mM 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.37mM 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.3mM 미만의 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.29mM 미만의 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.28mM 미만의 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.278mM 미만의 암모니아를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 암모니아를 포함하지 않는다.

일부 측면에서, MRM은 락테이트를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 락테이트를 포함하지 않는다.

일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차(또는 최종) TIL 확장 배지는 CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제를 추가로 포함한다. CD3 작용제 및/또는 CD28 작용제는 배지에서 배양되는 TIL을 자극할 수 있다. 일부 측면에서, CD3 작용제는 CD3 복합체에 결합할 수 있고 CD3를 활성화할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 일부 측면에서, CD3 작용제는 소분자이다. 일부 측면에서, CD3 작용제는 단백질이다. 일부 측면에서, CD3 작용제는 항-CD3 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "항-CD3 항체"는 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어, 단클론 항체를 지칭하고 T 세포에서 CD3 복합체를 향하는 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한다. 일부 측면에서, 항-CD3 항체는 무로모나브(muromonab)로도 알려진 OKT-3과 UCHT-1을 포함한다. 다른 항-CD3 항체는, 예를 들어, 비실리주맙(visilizumab) 오텔릭시주맙(otelixizumab) 및 테플리주맙(teplizumab)을 포함한다.

용어 "OKT-3" 또는 "OKT3"은 성숙한 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체를 향하는, 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함하는 단클론 항체 또는 이의 바이오시밀러(biosimilar) 또는 변이체를 지칭하며, OKT-3(30ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, Calif., USA)과 같은 시판 형태 및 무로모나브 또는 이의 변이체, 보존적 아미노산 대체물, 글리코폼(glycoform) 또는 바이오시밀러를 포함한다. OKT-3를 생성할 수 있는 하이브리도마는 ECACC(European Collection of Authenticated Cell Cultures)에 기탁되어 카탈로그 번호 86022706으로 지정된다. OKT-3을 생성할 수 있는 하이브리도마 역시 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되고 ATCC 수탁 번호 CRL 8001이 지정된다.

일부 측면에서, CD28 작용제는 CD28 또는 이의 다운스트림 경로를 활성화할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 일부 측면에서, CD28 작용제는 소분자이다. 일부 측면에서, CD28 작용제는 단백질이다. 일부 측면에서, CD28 작용제는 항-CD28 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "항-CD28 항체"는 항체 또는 이의 변이체, 예를 들어, 단클론 항체를 지칭하고 CD28를 향하는 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함하며 T 세포를 활성화시킨다. 일부 측면에서, 항-CD28 항체는 카탈로그 #100182-1(BPS Bioscicence), 카탈로그 #100186-1(BPS Bioscicence)을 포함한다.

일부 측면에서, CD3 작용제 및 CD28 작용제가 MRM에 함께 첨가된다. 일부 측면에서, CD3 작용제 및 CD28 작용제는 하나의 조성물로 동시에 MRM에 첨가된다. 일부 측면에서, CD3 작용제 및 CD28 작용제는 순서대로 첨가된다. 일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차(또는 최종) TIL 확장 배지는 CD3 작용제 및 CD28 작용제 모두를 포함하는 대체물, 예를 들어, TRANSACT™를 포함하고/하거나 보충된다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1:100 TRANSACT™를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1:150 TRANSACT™를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1:200 TRANSACT™를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1:250 TRANSACT™를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1:300 TRANSACT™를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1:350 TRANSACT™를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1:400 TRANSACT™를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1:450 TRANSACT™를 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1:500 TRANSACT™를 포함한다.

일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차(또는 최종) TIL 확장 배지는 TRANSACT™ 대체물을 포함하고/하거나 보충된다. 유전자 조작된 인간 K562 aAPC와 같은 인공 항원 제시 세포(aAPC)가 TIL의 신속한 확장에 사용될 수 있다. 일부 측면에서, aAPC는 CD70, CD80, CD86, 41BB 리간드 및 OX40 리간드를 암호화하는 유전자를 포함하는 폴리시스트론 렌티바이러스 벡터(polycistronic lentiviral vector)로 K562 세포를 형질도입함으로써 생성된다. K562 세포는 HLA-A, HLA-B 또는 HLA-DR 분자를 발현하지 않으므로 위에서 언급한 공동 자극 리간드로 형질도입될 때 T 세포 확장을 위한 강력한 도구가 된다(예를 들어, Suhoski 등, Molecular therapy, 2007 참조). 일부 측면에서, 2차 TIL 확장 및/또는 3차 TIL 확장은 TIL을 aAPC + OKT3과 공동-배양하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 2차 TIL 확장 및/또는 3차 TIL 확장은 TRANSACT™ 대신에 OKT3(예를 들어, 적어도 약 30ng/mL의 OKT3)의 존재하에 조사된 APC(예를 들어, PBMC)와 TIL을 공동-배양하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 면역 세포(예를 들어, TIL) 대 피더 세포(feeder cell)(예를 들어, aAPC)의 비율은 적어도 약 1:50, 적어도 약 1:100, 적어도 약 1:150, 적어도 약 1:200, 적어도 약 1:250, 적어도 약 1:300, 적어도 약 1:350, 적어도 약 1:400, 적어도 약 1:450 또는 적어도 약 1:500이다. 일부 측면에서, 면역 세포(예를 들어, TIL) 대 피더 세포(예를 들어, aAPC)의 비율은 적어도 약 1:100이다. 일부 측면에서, 면역 세포(예를 들어, TIL) 대 피더 세포(예를 들어, aAPC)의 비율은 적어도 약 1:200이다.

일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차(또는 최종) TIL 확장 배지는 CD27 리간드(CD27L)를 포함하고/하거나 보충된다. CD27 리간드(CD70)는 수용체에 결합할 수 있으며, 결합 시 수용체는 T 세포 면역력을 생성하고 장기간 유지할 수 있다. CD27은 TNF-수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 120kDa의 막관통 단독이량체성 포스포당단백질(transmembrane homodimeric phosphoglycoprotein)인 CD27도 공동 자극에 일조하는 것으로 보인다. CD27L, CD70은 항원 자극에 대한 반응으로 T 및 B 세포에서 발현되는 막관통 당단백질이다; 따라서 이것은 활성화 초기 단계의 마커로 간주된다. 시험관 내에서, T 세포 상의 CD27과 B 세포 상의 CD70의 상호작용은 증식 측면에서 T 세포 활성화를 향상시키지만 상대적으로 적은 양의 IL-2만 분비된다. 녹아웃 마우스에 대한 연구는 CD27이 나이브 T 세포 활성화에는 미미한 역할을 하지만 T 세포 기억 생성에는 결정적인 역할을 한다는 것을 보여주었다.

일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차(또는 최종) TIL 확장 배지는 약 0.1μg/ml 내지 약 50μg/ml의 CD27L을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.1μg/ml 내지 약 40μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 30μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 20μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 10μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 5μg/ml, 약 1μg/ml 내지 약 10μg/ml, 약 2μg/ml 내지 약 10μg/ml, 약 3μg /ml 내지 약 10μg/ml, 약 4μg/ml 내지 약 10μg/ml, 약 5μg/ml 내지 약 10μg/ml, 약 1μg/ml 내지 약 9μg/ml, 약 1μg/ml 내지 약 8μg/ml, 약 1μg/ml 내지 약 7μg/ml, 약 1μg/ml 내지 약 6μg/ml, 약 1μg/ml 내지 약 5μg/ml, 약 3μg/ml 내지 약 7μg/ml, 약 4μg/ml 내지 약 6μg/ml, 약 3μg/ml 내지 약 6μg/ml 또는 약 4μg/ml 내지 약 7μg/ml의 CD27L을 포함하고/하거나 보충된다.

일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차(또는 최종) TIL 확장 배지는 적어도 약 0.1μg/ml, 적어도 약 1μg/ml, 적어도 약 2μg/ml, 적어도 약 3μg/ml, 적어도 약 4μg/ml, 적어도 약 5μg/ml, 적어도 약 6μg/ml, 적어도 약 7μg/ml, 적어도 약 8μg/ml, 적어도 약 9μg/ml, 적어도 약 10μg/ml, 적어도 약 11μg/ml, 적어도 약 12μg/ml, 적어도 약 13μg/ml, 적어도 약 14μg/ml, 적어도 약 15μg/ml, 적어도 약 16μg/ml, 적어도 약 17μg/ml, 적어도 약 18μg/ml, 적어도 약 19μg/ml, 적어도 약 20μg/ml, 적어도 약 25μg/ml, 적어도 약 30μg/ml 또는 적어도 약 50μg/ml의 CD27L을 포함하고/하거나 보충된다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 5μg/ml의 CD27L을 포함하고/하거나 보충된다.

일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차(또는 최종) TIL 확장 배지는 4-1BB 리간드(4-1BBL)를 포함하고/하거나 보충된다. 4-1BBL(4-1BB 리간드, CD137L)은 APC(항원 제시 세포)에서 발견되며 활성화된 T 림프구에서 발현되는, TNF 슈퍼패밀리에 속하는 2형 막관통 당단백질 수용체인 4-1BB(CD137이라고도 함)에 결합한다. 4-1BB 리간드는 시험관 내에서 T 세포를 활성화하는 데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차(또는 최종) TIL 확장 배지는 약 0.1μg/ml 내지 약 50μg/ml의 CD27L을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 약 0.1μg/ml 내지 약 10μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 9μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 8μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 7μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 6μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 5μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 4μg/ml, 약 0.1μg /ml 내지 약 3μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 2μg/ml, 약 0.1μg/ml 내지 약 1μg/ml, 1μg/ml 내지 약 10μg/ml, 약 1μg/ml 내지 약 5μg/ml, 약 1μg/ml 내지 약 4μg/ml, 약 1μg/ml 내지 약 3μg/ml 또는 약 1μg/ml 내지 약 2μg/ml의 4-1BBL을 포함하고/하거나 보충된다.

일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차(또는 최종) TIL 확장 배지는 적어도 약 0.1μg/ml, 적어도 약 0.2μg/ml, 적어도 약 0.3μg/ml, 적어도 약 0.4μg/ml, 적어도 약 0.5μg/ml, 적어도 약 0.6μg/ml, 적어도 약 0.7μg/ml, 적어도 약 0.8μg/ml, 적어도 약 0.9μg/ml, 적어도 약 1μg/ml, 적어도 약 1.1μg/ml, 적어도 약 1.2μg/ml, 적어도 약 1.3μg/ml, 적어도 약 1.4μg/ml, 적어도 약 1.5μg/ml, 적어도 약 1.6μg/ml, 적어도 약 1.7μg/ml, 적어도 약 1.8μg/ml, 적어도 약 1.9μg/ml, 적어도 약 μg/ml, 적어도 약 2μg/ml, 적어도 약 3μg/ml, 적어도 약 4μg/ml, 적어도 약 5μg/ml 또는 적어도 약 10μg/ml의 4-1BBL을 포함하고/하거나 보충된다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1μg/ml의 4-1BBL을 포함하고/하거나 보충된다.

일부 측면에서, 4-1BBL은 CD27L과 함께 MRM에 추가된다. 일부 측면에서, 4-1BBL은 CD27L과 동시에 MRM에 추가된다. 일부 측면에서, 4-1BBL은 CD27L과 차례로 MRM에 추가된다. 일부 측면에서, 확장 과정(예를 들어, 2차 확장 및/또는 최종 확장) 동안 사용되는 MRM은 TRANSACT™, 4-1BBL 및 CD27L을 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 적어도 약 1:100 TRANSACT™, 적어도 약 1μg/ml의 4-1BBL 및 적어도 약 5μg/ml의 CD27L을 포함한다. 일부 측면에서, 확장 과정(예를 들어, 2차 확장 및/또는 최종 확장) 동안 사용되는 MRM은 적어도 약 1:100 TRANSACT™, 적어도 약 1μg/ml의 4-1BBL 및 적어도 약 5μg/ml의 CD27L을 포함한다.

일부 측면에서, MRM, 예를 들어, 초기 TIL 배양 배지, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차(또는 최종) TIL 확장 배지는 평형 염 용액(예를 들어, PBS, DPBS, HBSS, EBSS), 둘베코 수정 이글 배지(DMEM), 클릭 배지, 최소 필수 배지(MEM), 기초 배지 이글(BME), F-10, F-12, RPMI 1640, 글래스고 최소 필수 배지(GMEM), 알파 최소 필수 배지(alpha MEM), 이스코브 수정 둘베코 배지(IMDM), M199, OpTmizer™ CTS™ T 세포 확장 기초 배지(ThermoFisher), OPTMIZER™ Complete, IMMUNOCULT™ XF(STEMCELL™ Technologies), IMMUNOCULT™ XF, AIM V, TEXMACS™ 배지 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 기초 배지로부터 수정된다. 일부 측면에서, 기초 배지는 무혈청이다. 일부 측면에서, 기초 배지는 면역 세포 혈청 대체물(ICSR)을 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 기초 배지는 ICSR이 보충된 OPTMIZER™ Complete, ICSR이 보충된 AIM V, ICSR이 보충된 IMMUNOCULT™ XF, ICSR이 보충된 RPMI, ICSR이 보충된 TEXMACS™ 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 측면에서, 기초 배지는 OPTMIZER™ complete를 포함한다. 일부 측면에서, 적합한 기초 배지는 클릭 배지, OpTimizer®(CTS®) 배지, Stemline® T 세포 확장 배지(Sigma-Aldrich), AIM V® 배지(CTS®), TexMACS® 배지(Miltenyi Biotech), ImmunoCult® 배지(Stem Cell Technologies), PRIME-XV® T 세포 확장 XSFM(Irvine Scientific), Iscoves 배지 및/또는 RPMI-1640 배지를 포함한다.

본 개시내용은 기초 배지, NaCl, KCl, 칼슘 및 글루코스를 포함하는 MRM을 포함하며, NaCl의 농도는 약 40mM 내지 약 80mM이고, KCl의 농도는 40 내지 90mM이고, 칼슘의 농도는 약 0.5mM 내지 약 2.8mM이고, 글루코스의 농도는 약 10mM 내지 약 24mM이다.

일부 측면에서, MRM은 면역 세포를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 면역 세포는 TIL을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 IL-2 및 IL-21을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, IL-2의 농도는 약 200ng/ml 내지 약 400ng/ml(예를 들어, 약 200ng/ml, 약 300ng/ml 또는 약 400ng/ml)이다. 일부 측면에서, IL-21의 농도는 약 20ng/ml 내지 약 40ng/ml(예를 들어, 약 20ng/ml, 약 30ng/ml 또는 약 40ng/ml)이다.

일부 측면에서, MRM은 약 2.5% 혈청 보충제(CTS™ Immune Cell SR, Thermo Fisher), 2mM L-글루타민, 2mM L-글루타맥스, MEM 비필수 아미노산 용액, Pen-strep, 20μg/ml의 FUNGIN™, 나트륨 피루베이트 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 O-아세틸-L-카르니틴 하이드로클로라이드를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 키나아제 억제제를 추가로 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 CD3 작용제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, CD3 작용제는 항-CD3 항체이다. 일부 측면에서, 항-CD3 항체는 OKT-3을 포함한다.

일부 측면에서, MRM은 CD28 작용제를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, CD28 작용제는 항-CD28 항체이다. 일부 측면에서, MRM은 CD27 리간드(CD27L)를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, MRM은 4-1BB 리간드(4-1BBL)를 추가로 포함한다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 MRM을 포함하는 세포 배양물, 본원에 개시된 MRM을 포함하는 세포 백 또는 본원에 개시된 MRM을 포함하는 생물반응기를 포함한다.

II.H. 세포

본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 바와 같이 5mM 초과의 농도의 칼륨 이온을 포함하는 배지에 TIL을 배치하는 것을 포함하는, TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 바와 같이 40mM 초과의 농도의 칼륨 이온을 포함하는 배지에 TIL을 배치하는 것을 포함하는, TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 바와 같이 적어도 약 50mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 배지에 TIL을 배치하는 것을 포함하는, TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 바와 같이 적어도 약 40mM 내지 적어도 약 90mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 배지에 TIL을 배치하는 것을 포함하는, TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다.

본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 바와 같이 40mM 초과의 농도의 칼륨 이온 및 100mM 미만의 농도의 NaCl을 포함하는 배지에 TIL을 배치하는 것을 포함하는, TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 바와 같이 적어도 약 50mM 농도의 칼륨 이온 및 90mM 미만의 농도의 NaCl을 포함하는 배지에 TIL을 배치하는 것을 포함하는, TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일부 측면은 본원에 개시된 바와 같이 적어도 약 40mM 내지 적어도 약 90mM 농도의 칼륨 이온 및 100mM 미만 내지 약 50mM 농도의 NaCl을 포함하는 배지에 TIL을 배치하는 단계를 포함하는, TIL을 배양하는 방법에 관한 것이다.

MRM에 배치된 TIL은 치료가 필요한 대상체로부터 수집되고/되거나 단리된 TIL일 수 있다. 일부 측면에서, 배지에 배치된 TIL은 본원에 개시된 MRM에 배치되기 전에 확장된 것이다. 배지에 배치된 TIL은 출발(초기, 즉, 환자 샘플, 성분채집(apheresis) 샘플, 버피 코트(buffy coat)) TIL로 지칭될 수 있다. 본원에 개시된 배지에서 TIL을 배양하여 생성된 TIL은 생성된(배양된) TIL로 지칭될 수 있다.

일부 측면에서, TIL은 대상체로부터 얻은 종양 샘플에 존재한다. 따라서, 일부 측면에서, 상기 방법은 본원에 개시된 MRM에 종양 샘플을 배치하는 것을 포함한다. 표준 TIL 배양 동안, 종양 샘플, 예를 들어, 종양 생검 또는 이의 단편을 초기 TIL 배양 배지에 플레이팅하고 적어도 약 14-19일 동안 배양한다. 일부 측면에서, 종양 샘플, 예를 들어, 종양 생검을 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일, 적어도 약 21일 동안 초기 TIL 배양물 내 MRM에서 배양한다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 약 14일 지속된다. 일부 측면에서, 초기 TIL 배양은 약 2×10⁶ 내지 약 10×10⁶개의 세포의 세포 수율이 생성될 때까지 충분한 일수 동안 지속된다.

일부 측면에서, 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL의 비율(예를 들어, CD4⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL의 비율)은 초기 TIL 배양 전 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL의 비율과 비교하여 초기 TIL 배양 후 증가된다. 일부 측면에서, 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL의 비율(예를 들어, CD4⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL의 비율)은 기초 배지 또는 증가된 농도의 칼륨 이온을 포함하지 않는 배지(대조군 배지)에서의 초기 TIL 배양 후 CD8⁺ TIL 대한 비-CD8⁺ TIL의 비율과 비교하여 초기 TIL 배양 후 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 45배 또는 적어도 약 50배 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 적어도 약 40배 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 적어도 약 50배 증가된다.

일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 125%, 적어도 약 150%, 적어도 약 175%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 450% 또는 적어도 약 500% 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 적어도 약 20% 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 적어도 약 40% 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 적어도 약 60% 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 적어도 약 80% 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 적어도 약 100% 증가된다.

일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%로 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 20%로 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 30%로 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 40%로 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 50%로 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 배양물에서 총 TIL 수의 적어도 약 60%로 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 배양물에서 총 TIL 수의 적어도 약 70%로 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 75%로 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 80%로 증가된다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 비율은 배양물에서 총 TIL 수의 적어도 약 90%로 증가된다.

일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 초기 TIL 배양 전 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 250배, 약 2배 내지 약 200배, 약 2배 내지 약 150배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 90배, 약 2배 내지 약 80배, 약 2배 내지 약 70배, 약 2배 내지 약 60배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 40배, 약 2배 내지 약 30배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 200배, 약 5배 내지 약 150배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 90배, 약 5배 내지 약 80배, 약 5배 내지 약 70배, 약 5배 내지 약 60배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 40배, 약 5배 내지 약 30배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 150배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 90배, 약 10배 내지 약 80배, 약 10배 내지 약 70배, 약 10배 내지 약 60배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 40배, 약 10배 내지 약 30배 또는 약 10배 내지 약 20배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 초기 TIL 배양 전 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 2배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 125배, 적어도 약 150배, 적어도 약 175배, 적어도 약 200배, 적어도 약 250배, 적어도 약 300배, 적어도 약 350배, 적어도 약 400배, 적어도 약 450배 또는 적어도 약 500배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 초기 TIL 배양 전 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 2배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 초기 TIL 배양 전 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 3배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 초기 TIL 배양 전 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 4배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 초기 TIL 배양 전 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 5배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 초기 TIL 배양 전 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 10배 증가된다.

일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 (예를 들어, 40mM 미만의 칼륨 이온, 예를 들어, 4mM 칼륨 이온을 포함하는 배지에서의) 대조군 방법을 사용한 확장 후 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 250배, 약 2배 내지 약 200배, 약 2배 내지 약 150배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 90배, 약 2배 내지 약 80배, 약 2배 내지 약 70배, 약 2배 내지 약 60배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 40배, 약 2배 내지 약 30배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 200배, 약 5배 내지 약 150배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 90배, 약 5배 내지 약 80배, 약 5배 내지 약 70배, 약 5배 내지 약 60배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 40배, 약 5배 내지 약 30배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 150배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 90배, 약 10배 내지 약 80배, 약 10배 내지 약 70배, 약 10배 내지 약 60배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 40배, 약 10배 내지 약 30배 또는 약 10배 내지 약 20배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 (예를 들어, 40mM 미만의 칼륨 이온, 예를 들어, 4mM 칼륨 이온을 포함하는 배지에서의) 대조군 방법을 사용한 확장 후 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 2배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 125배, 적어도 약 150배, 적어도 약 175배, 적어도 약 200배, 적어도 약 250배, 적어도 약 300배, 적어도 약 350배, 적어도 약 400배, 적어도 약 450배 또는 적어도 약 500배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 (예를 들어, 40mM 미만의 칼륨 이온, 예를 들어, 4mM 칼륨 이온을 포함하는 배지에서의) 대조군 방법을 사용한 확장 후 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 2배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 (예를 들어, 40mM 미만의 칼륨 이온, 예를 들어, 4mM 칼륨 이온을 포함하는 배지에서의) 대조군 방법을 사용한 확장 후 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 3배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 (예를 들어, 40mM 미만의 칼륨 이온, 예를 들어, 4mM 칼륨 이온을 포함하는 배지에서의) 대조군 방법을 사용한 확장 후 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 4배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 (예를 들어, 40mM 미만의 칼륨 이온, 예를 들어, 4mM 칼륨 이온을 포함하는 배지에서의) 대조군 방법을 사용한 확장 후 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 5배 증가된다. 일부 측면에서, 배양물에서 종양 반응성 세포의 수는 (예를 들어, 40mM 미만의 칼륨 이온, 예를 들어, 4mM 칼륨 이온을 포함하는 배지에서의) 대조군 방법을 사용한 확장 후 종양 반응성 세포의 수와 비교하여 본원에 개시된 배양 방법 후 적어도 약 10배 증가된다.

일부 측면에서, 종양 샘플은 인간 대상체로부터 단리된다. 일부 측면에서, 인간 대상체로부터 단리된 출발 종양 샘플 및 그 안의 TIL은 동종이계 세포 요법을 위해 확장된다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 인간 대상체로부터 단리되고, 그 안의 TIL은 자가 세포 요법을 위해 확장된다.

II.I. TIL 단리, 확장 및 수확

임의의 TIL 단리, 배양 및/또는 확장 방법은 본원에 개시된 방법에 따라, 예를 들어, 본원에 기술된 배양 배지에서 TIL을 배양 및/또는 확장함으로써 변형될 수 있다.

II.I.1. 초기 확장

일반적으로, TIL은 인간 대상체로부터 얻은 종양 샘플로부터 얻는다. 종양 샘플이 종양과 TIL의 혼합물을 함유하는 한 대상체로부터 종양 생검을 얻기 위한 임의의 방법을 본원에 개시된 방법에서 사용할 수 있다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 종양 절제를 통해 단리된다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 바늘 생검에 의해 단리된다(예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 공개 번호 US 2020/0277573 참조). 일부 측면에서, 종양 샘플은 원발성 종양, 침습성 종양 또는 전이성 종양을 포함한 고형 종양을 포함한다. 다른 측면에서, 종양 샘플은 혈액학적 악성종양으로부터 얻은 종양과 같은 액상 종양을 포함한다. 종양은 유방암, 췌장암, 전립선암, 결장직장암, 자궁경부암, 폐암, 뇌암, 신장암, 위암, 간(간세포암을 포함하지만 이에 제한되지 않음) 및 피부(편평 세포 암종, 기저 세포 암종 및 흑색종을 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 암 유형일 수 있다. 일부 측면에서, 종양은 흑색종을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 결장직장암을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 췌장암을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 두경부암을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 자궁경부암을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 난소암을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 비소세포 폐암을 포함한다. 일부 측면에서, 종양은 유방암을 포함한다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 종양 샘플이 해리된 후 동결보존된다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 동결보존 전에 MRM에서 해리된다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 TIL 단리/확장 전에 동결보존된다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 초기 TIL 확장 후에 동결보존된다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 신선하고, 예를 들어, 동결보존되지 않는다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 MRM 배지에 직접 배치된다.

일부 측면에서, 공여자 환자(예를 들어, 종양을 얻는 대상체)는 치료 경험이 없다(즉, 환자가 종양 치료를 위한 이전 요법(prior therapy)을 받지 않았다). 일부 측면에서, 공여자 환자는 종양 치료를 위해 하나 이상의 이전 요법을 받았다. 일부 측면에서, 대상체는 적어도 하나의 이전 요법, 적어도 두 가지의 이전 요법, 적어도 세 가지의 이전 요법 또는 적어도 네 가지의 이전 요법을 받았다. 일부 측면에서, 대상체는 하나 이상의 이전 요법에 대해 재발되거나 불응성이다.

일부 측면에서, 대상체는 하나 이상의 이전 항암 요법을 받았다. 일부 측면에서, 이전 항암 요법은 표준 치료 요법을 포함한다. 일부 측면에서, 이전 항암 요법은 면역요법을 포함한다. 일부 측면에서, 이전 요법은 체크포인트 억제제를 포함하는 면역요법을 포함한다. 일부 측면에서, 이전 요법은 항-PD-1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 면역요법을 포함한다.

일부 측면에서, 대상체는 종양 샘플의 절제 전에 TIL의 단리 및/또는 확장을 향상시키는 하나 이상의 요법을 투여받는다. 일부 측면에서, 대상체는 키나아제 억제제 또는 ITK 억제제를 투여받는다. 키나아제 억제제 및/또는 ITK 억제제의 예는, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 국제 공개 번호 WO2019217753에서 찾을 수 있다. 일부 측면에서, 키나아제 억제제 및/또는 ITK 억제제는 초기 확장 및/또는 제2 확장 동안 배양 배지에 첨가된다. 일부 측면에서, ITK 억제제는 아미노티아졸계 ITK 억제제, 벤즈이미다졸계 ITK 억제제, 아미노피리미딘계 ITK 억제제, 3-아미노피리드-2-온계 ITK 억제제, 인돌린다졸계 ITK 억제제, 피라졸릴-인돌계 억제제, 티에노피라졸 억제제 및 ATP 포켓에서 시스테인-442를 표적으로 하는 ITK 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, ITK 억제제는 이브루티닙(ibrutinib), 다사티닙(dasatinib), 보수티닙(bosutinib), 닐로티닙(nilotinib), 엘로티닙(erlotinib), BMS509744, CTA056, GSK2250665A, PF06465469 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 측면에서, 종양 샘플은 더 작은 단편으로 절단된다. 일부 측면에서, 더 작은 단편 중 하나 이상은 적어도 약 1㎟, 적어도 약 1.5㎟, 적어도 약 2㎟, 적어도 약 2.5㎟, 적어도 약 3㎟, 적어도 약 3.5㎟, 적어도 약 4㎟, 적어도 약 4.5㎟, 적어도 약 5㎟, 적어도 약 5.5㎟, 적어도 약 6㎟ 또는 적어도 약 6.5㎟이다. 일부 측면에서, 더 작은 단편 중 하나 이상은 적어도 약 1㎣, 적어도 약 1.5㎣, 적어도 약 2㎣, 적어도 약 2.5㎣, 적어도 약 3㎣, 적어도 약 3.5㎣, 적어도 약 4㎣, 적어도 약 4.5㎣, 적어도 약 5㎣, 적어도 약 5.5㎣, 적어도 약 6㎣, 적어도 약 6.5㎣, 적어도 약 7㎣, 적어도 약 7.5㎣, 적어도 약 8㎣, 적어도 약 8.5㎣, 적어도 약 9㎣, 적어도 약 9.5㎣ 또는 적어도 약 10㎣이다. 일부 측면에서, 종양 샘플은 효소 배지(예를 들어, 글루타메이트(예를 들어, 약 2mM), 겐타마이신(gentamicin)(예를 들어, 약 10mcg/mL), DNase(예를 들어, 약 30단위/mL) 및 콜라게나제(collagenase)(예를 들어, 약 1.0mg/mL)가 보충된 RPMI 1640 버퍼 또는 MRM)에 종양 샘플을 배양함으로써 효소 분해된다. 일부 측면에서, 종양 분해물은 효소 배지에 종양을 배치하고/하거나 종양을 기계적으로 해리(즉, 분해)하고(예를 들어, 약 1분 동안), 이어서 5% CO₂ 중(예를 들어, 30분 동안) 37℃에서 인큐베이션한 다음, 작은 조직 조각만이 존재할 때까지 전술한 조건 하에서 기계적 해리 및 인큐베이션을 반복 사이클링함으로써 생성된다. 이 과정의 마지막에 세포 현탁액에 많은 수의 적혈구 또는 죽은 세포가 포함되어 있는 경우 FICOLL 분지형 친수성 다당류를 사용하여 밀도 구배 분리를 수행하여 이러한 세포를 제거할 수 있다. 기계적 및/또는 효소적 해리는 임의의 배지에서 수행될 수 있다. 일부 측면에서, 기계적 및/또는 효소적 해리는 본원에 개시된 MRM 배지에서 수행된다.

일부 측면에서, 기계적 해리는 절제된 종양에 물리적 압력을 가하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 기계적 해리는 반복되는 물리적 압력을 포함한다. 일부 측면에서, 반복되는 물리적 압력은 분당 적어도 약 50회, 적어도 약 60회, 적어도 약 70회, 적어도 약 80회, 적어도 약 90회, 적어도 약 100회, 적어도 약 110회, 적어도 약 120회, 적어도 약 130회, 적어도 약 140회, 적어도 약 150회, 적어도 약 160회, 적어도 약 170회, 적어도 약 180회, 적어도 약 190회, 적어도 약 200회, 적어도 약 210회, 적어도 약 220회, 적어도 약 230회, 적어도 약 240회, 적어도 약 250회, 적어도 약 260회, 적어도 약 270회, 적어도 약 280회, 적어도 약 290회, 적어도 약 300회, 적어도 약 310회, 적어도 약 320회, 적어도 약 330회, 적어도 약 340회, 적어도 약 350회 또는 적어도 약 360회 가해진다. 일부 측면에서, 반복되는 물리적 압력은 분당 적어도 약 120 내지 260회 가해진다. 일부 측면에서, 반복되는 물리적 압력은 약 6N/㎠까지, 약 5.5N/㎠까지, 약 5.0N/㎠까지, 약 4.5N/㎠까지, 약 4.0N/㎠까지, 약 3.5N/㎠까지, 약 3.0N/㎠까지 가해진다. 일부 측면에서, 기계적 해리는 약 90분 이하, 약 85분 이하, 약 80분 이하, 약 75분 이하, 약 70분 이하, 약 65분 이하, 약 60분 이하, 약 55분 이하 또는 약 50분 이하 동안 진행된다. 일부 측면에서, 기계적 해리는 실온에서 적용된다. 일부 측면에서, 기계적 해리는 실온 미만에서 적용된다. 일부 측면에서, 기계적 해리는 전문이 본원에 참고로 포함된 국제 공개 번호 WO 2021/123832에 개시된 방법에 따라 및/또는 개시된 장치를 사용하여 적용된다.

일부 측면에서, 종양 샘플(즉, 절제된 종양 조직 샘플 또는 해리된 종양 샘플) 또는 이의 단편은 배양 배지, 예를 들어, 본원에 개시된 배양 배지에 배치되며, 배양 배지는 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 4000IU/ml의 IL-2, 적어도 약 4500IU/ml의 IL-2, 적어도 약 5500IU/ml의 IL-2, 적어도 약 6000IU/ml의 IL-2 또는 적어도 약 6500IU/ml의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 600IU/ml의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 100ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 200ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 300ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 400ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 500ng/mL의 IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 600ng/mL의 IL-2를 포함한다.

다른 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 배양 배지, 예를 들어, 본원에 개시된 배양 배지에 배치되며, 배양 배지는 IL-21을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 1.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 2.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 3.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 4.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 5.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 6.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 7.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 8.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 9.0ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 10ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 15ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 20ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지는 적어도 약 30ng/mL의 IL-21을 포함한다.

개별 종양 단편은 단일 배양 챔버, 예를 들어, 웰에서 함께 배양될 수 있거나, 개별 종양 단편은 개별 배양 챔버, 예를 들어, 웰에서 배양될 수 있다. 배양된 종양 샘플로부터 TIL 회피를 촉진하기 위한 표준 배양 배지는 글루타맥스(Gibco/Tnvitrogen; Carlsbad, CA), 1×Pen-Strep(Gibco/Invitrogen; Carlsbad, CA), 50μm 2-머캅토에탄올(Gibco/Invitrogen; Carlsbad, CA), 20μg/ml의 겐타마이신(Gibco/Invitrogen; Carlsbad, CA) 및 1mM 피루베이트(Gibco/Invitrogen; Carlsbad, CA)가 보충된 RPMI 1640을 포함한다. 일부 측면에서, 표준 배양 배지는 본 개시내용에 따라 수정된다. 일부 측면에서, 표준 배양 배지는 혈청 보충제(CTS™ Immune Cell SR, Thermo Fisher), L-글루타민(Gibco), L-글루타맥스(Gibco), MEM 비필수 아미노산 용액(Gibco), Pen-strep(Gibco), fungin™(InvivoGen), 나트륨 피루베이트(Gibco), IL-2, IL-21, O-아세틸-L-카르니틴 하이드로클로라이드(Sigma) 또는 이들의 임의의 조합이 보충된 CTS™ OpTimizer™를 포함한다. 일부 측면에서, 표준 배양 배지는 약 2.5% 혈청 보충제(CTS™ Immune Cell SR, Thermo Fisher), 약 2mM L-글루타민(Gibco), 약 2mM L-글루타맥스(Gibco), MEM 비필수 아미노산 용액(Gibco), Pen-strep(Gibco), 약 20μg/ml의 fungin™(InvivoGen), 나트륨 피루베이트(Gibco), 약 IL-2(300ng/mL), 약 IL-21(30ng/ml) 및 약 1mM O-아세틸-L-카르니틴 하이드로클로라이드(Sigma)가 보충된 CTS™ OpTimizer™를 포함한다.

일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 적어도 약 1주, 적어도 약 2주 또는 적어도 약 3주 동안 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 적어도 약 2주 동안 배양된다. 본원에 사용된 "종양 샘플"은 종양 조직 및/또는 분해된 종양 조직(즉, 종양 조직의 기계적 및/또는 화학적 분해로 인한 세포 현탁액)을 지칭한다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 단편은 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일 또는 약 14일 동안 초기 배양으로 배양된다.

일부 측면에서, 초기 배양은 종양 샘플 또는 단편을 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFRSF) 작용제와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, TNFRSF 작용제는 4-1BB 작용제, OX40 작용제, CD27 작용제, GITR 작용제, HVEM 작용제, CD95 작용제 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, TNFRSF 작용제는 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 공개 번호 US 2020/0121719 A1에 개시된 임의의 TNFRSF 작용제이다. 일부 측면에서, 초기 배양은 종양 샘플 또는 이의 단편을 약 10-500ng/ml의 4-1BB 리간드와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양은 종양 샘플 또는 이의 단편을 약 50ng/ml, 약 60ng/ml, 약 70ng/ml, 약 75ng/ml, 약 80ng/ml, 약 90ng/ml, 약 100ng/ml, 약 125ng/ml, 약 150ng/ml, 약 175ng/ml, 약 200ng/ml, 약 250ng/ml, 약 300ng/ml, 약 350ng/ml, 약 400ng/mL, 약 450ng/mL, 약 500ng/ml, 약 550ng/ml, 약 600ng/ml, 약 650ng/ml, 약 700ng/ml, 약 750ng/ml, 약 800ng/ml, 약 850ng/ml, 약 900ng/ml, 약 950ng/ml, 약 1000ng/ml 또는 약 1100ng/ml의 4-1BB 리간드와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양은 종양 샘플 또는 이의 단편을 약 100ng/ml의 4-1BB 리간드와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양 약 3일째, 초기 배양 약 4일째, 초기 배양 약 5일째, 초기 배양 약 6일째 또는 초기 배양 약 7일째에 4-1BB 리간드와 접촉된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양 약 5일째에 4-1BB 리간드와 접촉된다.

일부 측면에서, 초기 배양은 종양 샘플 또는 이의 단편을 TRANSACT™와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양은 종양 샘플 또는 이의 단편을 TRANSACT™와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다(예를 들어, 약 1:50, 약 1:100, 약 1:150, 약 1:200, 약 1:250, 약 1:300, 약 1:350 또는 약 1:400). 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양 약 4일째, 초기 배양 약 5일째, 초기 배양 약 6일째 또는 초기 배양 약 7일째에 TRANSACT™와 접촉된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양 약 5일째에 TRANSACT™와 접촉된다. 일부 측면에서, 초기 배양은 종양 샘플 또는 이의 단편을 4-1BB 리간드 및 TRANSACT™ 둘 다와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양 약 3일째에 4-1BB 리간드 및 TRANSACT™ 둘 다와 접촉된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양 약 4일째에 4-1BB 리간드 및 TRANSACT™ 둘 다와 접촉된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양 약 5일째에 4-1BB 리간드 및 TRANSACT™ 둘 다와 접촉된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양 약 6일째에 4-1BB 리간드 및 TRANSACT™ 둘 다와 접촉된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양 약 7일째에 4-1BB 리간드 및 TRANSACT™ 둘 다와 접촉된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양 약 8일째에 4-1BB 리간드 및 TRANSACT™ 둘 다와 접촉된다.

일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 배양된 단편당 적어도 약 1×10⁵ 내지 적어도 약 1×10⁸개, 적어도 약 5×10⁵ 내지 적어도 약 1×10⁸개, 적어도 약 1×10⁶ 내지 적어도 약 1×10⁸개, 적어도 약 2×10⁶ 내지 적어도 약 1×10⁸개, 적어도 약 3×10⁶ 내지 적어도 약 1×10⁸개, 적어도 약 4×10⁶ 내지 적어도 약 1×10⁸개, 적어도 약 5×10⁶ 내지 적어도 약 1×10⁸개, 적어도 약 1×10⁵ 내지 적어도 약 5×10⁷개, 적어도 약 5×10⁵ 내지 적어도 약 10×10⁶개, 적어도 약 1×10⁶ 내지 적어도 약 10×10⁶개, 적어도 약 2×10⁶ 내지 적어도 약 10×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶ 내지 적어도 약 10×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶ 내지 적어도 약 10×10⁶개 또는 적어도 약 5×10⁶ 내지 적어도 약 10×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 2×10⁶ 내지 10×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 적어도 약 10x10⁶ 내지 50x10⁶에 도달할 때까지 초기 배양에서 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 세포 수율이 적어도 약 10x10⁶, 적어도 약 15x10⁶, 적어도 약 20x10⁶, 적어도 약 25x10⁶, 적어도 약 30x10⁶, 적어도 약 35x10⁶, 적어도 약 40x10⁶, 적어도 약 45x10⁶, 또는 적어도 약 50x10⁶에 도달할 때까지 초기 배양에서 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 적어도 약 20x10⁶에 도달할 때까지 초기 배양에서 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 적어도 약 25x10⁶에 도달할 때까지 초기 배양에서 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 적어도 약 30x10⁶에 도달할 때까지 초기 배양에서 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 적어도 약 35x10⁶에 도달할 때까지 초기 배양에서 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 적어도 약 40x10⁶에 도달할 때까지 초기 배양에서 배양된다.

일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 1×10⁵개, 적어도 약 2×10⁵개, 적어도 약 3×10⁵개, 적어도 약 4×10⁵개, 적어도 약 5×10⁵개, 적어도 약 6×10⁵개, 적어도 약 7×10⁵개, 적어도 약 8×10⁵개, 적어도 약 9×10⁵개, 적어도 약 1×10⁶개, 적어도 약 2×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개 또는 적어도 약 10×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 2×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 3×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 4×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 5×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 6×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 7×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 8×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 9×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다. 일부 측면에서, 종양 샘플 또는 이의 단편은 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 10×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 배양으로 배양된다.

일부 측면에서, 세포(예를 들어, TIL)는 초기 배양 후 스트레이너(strainer)를 통과한다. 일부 측면에서, 세포(예를 들어, TIL)는 초기 배양 후 적어도 약 10μm, 적어도 약 15μm, 적어도 약 20μm, 적어도 약 25μm, 적어도 약 30μm, 적어도 약 35μm, 적어도 약 40μm, 적어도 약 45μm, 적어도 약 50μm 스트레이너를 통과한다. 일부 측면에서, 세포(예를 들어, TIL)는 초기 배양 후 약 40μm 스트레이너를 통과한다.

일부 측면에서, 초기 확장 단계는 하나 이상의 기체 투과성 플라스크(예를 들어, GREX 플라스크)에서 수행된다. 일부 측면에서, 초기 확장 단계는 정적 GREX에서 수행된다. 일부 측면에서, 초기 확장은 교반 탱크에서 수행된다. 일부 측면에서 초기 확장 단계는 생물반응기에서 수행된다. 일부 측면에서, 초기 확장은 (예를 들어, GREX 폐쇄형 시스템을 사용하는) 폐쇄형 시스템에서 수행된다.

일부 측면에서, 초기 확장은 종양 샘플 또는 이의 단편/세포를 TRANSACT™ (또는 다른 적합한 T 세포 활성화 시약) 및 4-1BB 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 초기 확장은 초기 배양 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일에 종양 샘플 또는 이의 단편을 TRANSACT™ 및 4-1BB 리간드와 접촉시키는 단계; 여기서 초기 확장은 약 11일 동안 수행된다. 일부 측면에서, 초기 확장은 초기 배양 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일에 종양 샘플 또는 이의 단편을 TRANSACT™ 및 4-1BB 리간드와 접촉시키는 단계; 여기서 초기 확장은 약 12일 동안 수행된다. 일부 측면에서, 초기 확장은 초기 배양 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일에, 약 7일에 종양 샘플 또는 이의 단편을 TRANSACT™ 및 4-1BB 리간드와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 초기 확장은 약 13일 동안 수행된다. 일부 측면에서, 초기 확장은 초기 배양 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일에 종양 샘플 또는 이의 단편을 TRANSACT™ 및 4-1BB 리간드와 접촉시키는 단계; 여기서 초기 확장은 약 14일 동안 수행된다. 일부 측면에서, 초기 확장은 초기 배양 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일에 종양 샘플 또는 이의 단편을 TRANSACT™ 및 4-1BB 리간드와 접촉시키는 단계; 여기서 초기 확장은 약 15일 동안 수행된다.

일부 측면에서 TIL은 초기 확장 이후 동결보존된다. 일부 측면에서, 초기 팽창으로부터의 TIL은 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 초기 팽창 이후에 2차 팽창에 직접 접종된다.

II.I.2. 2차 확장

일부 측면에서, TIL은 2차 확장된다. 일부 측면에서, 2차 확장 단계는 하나 이상의 기체 투과성 플라스크(예를 들어, GREX 플라스크)에서 수행된다. 일부 측면에서, TIL은 폐쇄형 시스템을 개방하지 않고 2차 확장으로 이행된다. 일부 측면에서, 제1 확장으로부터의 TIL은 TIL을 2차 확장으로 진행시키기 전에 종양 특이적 세포용해 활성에 대해 스크리닝된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장으로 진행하기 전에 하나 이상의 바이오마커의 발현에 대해 스크리닝된다. 일부 측면에서, 바이오마커는 더 나이브한 TIL, 예를 들어, CD8⁺, CD27⁺, CD3⁺, CD95⁺, CD45RA⁺, CCR7⁺, CD62L⁺, TCF7⁺ 또는 이들의 임의의 조합에 의해 전형적으로 발현되는 하나 이상의 유전자의 발현을 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장으로 진행되기 전에 PD-1의 발현에 대해 스크리닝된다. 일부 측면에서, 제1 확장으로부터의 TIL은 TIL을 2차 확장으로 진행시키기 전에 스크리닝되지 않는다. 일부 측면에서, 초기 확장에서 얻은 모든 TIL은 2차 확장을 거친다. 일부 측면에서, 제1 확장으로부터의 TIL은 2차 확장으로의 진행 전에 풀링된다.

II.I.2.a. REP별 2차 확장

일부 측면에서, TIL은 신속 증식 프로토콜(Rapid Expansion Protocol, REP)를 사용하여 2차 확장된다. 예를 들어, 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된 Dudley, 등, Science 298:850-54 (2002); Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 23:2346-57 (2005); Dudley, 등, J. Clin. Oncol. 26:5233-39 (2008); Riddell, 등, Science 257:238-41 (1992); 및 Dudley, 등, J. Immunother. 26:332-42 (2003) 참조. 일부 측면에서, TIL은 피더 림프구(feeder lymphocyte) 및 인터류킨-2(IL-2), IL-7, IL-15, IL-21 또는 이들의 조합의 존재하에 비특이적 T 세포 수용체 자극을 사용하여 빠르게 확장된다. 특정 측면에서, TIL은 IL-2, IL-15 및 IL-21의 존재하에 급속히 확장된다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 배지에서 IL-2의 농도는 초기 배양 동안 배지에서 IL-2의 농도보다 낮다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 300ng/ml 미만이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 50ng/ml, 약 55ng/ml, 약 60ng/ml, 약 65ng/ml, 약 70ng/ml, 약 73.6ng/ml, 약 75ng/ml, 약 80ng/ml, 약 85ng/ml, 약 90ng/ml, 약 95ng/ml, 약 100ng/ml, 약 105ng/ml, 약 110ng/ml, 약 115ng/ml, 약 120ng/ml, 약 125ng/ml, 약 130ng/ml, 약 135ng/ml, 약 140ng/ml, 약 145ng/ml, 약 150ng/ml, 약 175ng/ml, 약 200ng/ml, 약 225ng/ml, 약 250ng/ml 또는 약 275ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 50ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 55ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 60ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 65ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 70ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 73.6ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 75ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 80ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 85ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 90ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 95ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-2의 농도는 약 100ng/ml이다.

일부 측면에서, 급속 확장 동안 배지에서 IL-21의 농도는 초기 배양 동안 배지에서 IL-21의 농도보다 낮다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 30ng/ml 미만이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 1ng/ml, 약 2ng/ml, 약 3ng/ml, 약 4ng/ml, 약 5ng/ml, 약 6ng/ml, 약 7ng/mL, 약 8ng/mL, 약 9ng/ml, 약 10ng/ml, 약 11ng/ml, 약 12ng/ml, 약 13ng/ml, 약 14ng/ml, 약 15ng/ml, 약 16ng/ml, 약 17ng/ml, 약 18ng/ml, 약 19ng/ml, 약 20ng/ml, 약 21ng/ml, 약 22ng/ml, 약 23ng/ml, 약 24ng/ml, 약 25ng/ml, 약 26ng/ml, 약 27ng/ml, 약 28ng/ml 또는 약 29ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 5ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 6ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 7ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 8ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 9ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 10ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 11ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 12ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 13ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 14ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-21의 농도는 약 15ng/ml이다.

일부 측면에서, 급속 확장 동안 배지에서 IL-15의 농도는 약 0.1ng/ml, 약 0.2ng/ml, 약 0.3ng/ml, 약 0.4ng/ml, 약 0.5ng/ml, 약 0.6ng/ml, 약 0.7ng/ml, 약 0.8ng/ml, 약 0.9ng/ml, 약 1.0ng/ml, 약 1.1ng/ml, 약 1.2ng/ml, 약 1.3ng/ml, 약 1.4ng/ml, 약 1.5ng/ml, 약 1.6ng/ml, 약 1.7ng/ml, 약 1.8ng/ml, 약 1.9ng/ml, 약 2.0ng/ml, 약 2.25ng/ml, 약 2.5ng/ml, 약 2.75ng/ml, 약 3.0ng/ml, 약 3.5ng/ml, 약 4.0ng/ml, 약 4.5ng/ml 또는 약 5.0ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.1ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.2ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.3ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.4ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.5ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.6ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.7ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.8ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.9ng/ml이다. 일부 측면에서, 급속 확장 동안 IL-15의 농도는 약 1.0ng/ml이다.

비특이적 T 세포 수용체 자극은, 예를 들어, OKT3(예를 들어, 약 30ng/ml), 마우스 단클론 항-CD3 항체(Ortho-McNeil®(Raritan, N.J.) 또는 Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach, Germany)에서 시판)를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, TIL은 T 세포 성장 인자, 예컨대 약 200-400IU/ml의 T 세포 성장 인자, 예컨대 300IU/ml IL-2 또는 IL-15의 존재하에 하나 이상의 항원(에피토프(들)와 같은 항원 부분, 또는 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어, 대략 0.3μM MART-1:26-35(27L) 또는 gp100:209-217(210M))과 같은 벡터로부터 선택적으로 발현될 수 있는 암세포 포함)으로 시험관 내에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 자극에 의해 급속하게 확장된다. 일부 측면에서 TIL은 TRANSACT™를 사용한 자극에 의해 확장된다. 일부 측면에서, 시험관 내 유도된 TIL은 HLA-A2 발현 항원 제시 세포 상에 펄싱된 암의 동일한 항원(들)을 사용한 자극에 의해 급속하게 확장된다. 일부 측면에서, TIL은 조사된 자가 림프구 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2로 자극될 수 있다.

일부 측면에서, TIL은 TRANSACT™ 및 선택적으로 4-1BBL 및/또는 CD27L을 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 제2 확장 동안 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 TRANSACT™, 4-1BBL 및 CD27L을 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 제2 확장 동안 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 약 1:100 TRANSACT™, 적어도 약 1μg/ml의 4-1BBL 및 적어도 약 5μg/ml의 CD27L을 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 제2 확장 동안 자극된다.

일부 측면에서, 하나 이상의 TIL은 TIL 확장 전, TIL 확장 동안 또는 TIL 확장 후 유전적으로 변형된다. TIL의 유전적 변형은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 일부 측면에서, 하나 이상의 TIL은 Cas9 엔도뉴클레아제(CRISPR; 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 US2017067021A1 참조), TALEN, 징 핑거(zing-finger) 엔도뉴클레아제, 부위 지정 돌연변이 유발 또는 이들의 임의의 조합을 사용하여 변형된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 TIL은 인간 사이토카인 유도성 SH2 함유 단백질(CISH; 전문이 본원에 참조로 포함된 US10406177B2 참조)의 발현을 방해하거나 제거하기 위해 유전적으로 변형된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 TIL은 AAV를 사용하여 변형되며, 예를 들어, 하나 이상의 TIL은 AAV를 포함한다. 일부 측면에서 하나 이상의 TIL은 렌티바이러스 또는 레트로바이러스를 사용하여 변형된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 TIL은 외인성 변형된 또는 조작된 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 TIL은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 TIL은 CD86을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 TIL은 OX40L을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 TIL은 4-1BBL을 발현하도록 유전적으로 변형된다. 일부 측면에서, 하나 이상의 TIL은 항-PD1 항체를 발현하도록 유전적으로 변형된다.

일부 측면에서, TIL은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRSF) 작용제를 추가로 포함하는 배양 배지에서 확장된다. 임의의 TNFRSF 작용제가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. TNFRSF 작용제의 비제한적 예는, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 US20200121719A1에서 찾을 수 있다. 일부 측면에서, TNFRSF 작용제는 초기 배양 후 첨가된다. 일부 측면에서, TNFRSF 작용제는 제2 및/또는 최종 확장 동안 첨가된다.

일부 측면에서, TIL은 4-1BB 작용제를 추가로 포함하는 배양 배지에서 확장된다. 임의의 4-1BB 작용제가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 4-1BB 작용제는 4-1BB 항체를 포함한다. 4-1BB 작용제의 비제한적 예는, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 US20200032209A1에서 찾을 수 있다. 일부 측면에서, 4-1BB 작용제는 초기 배양 후 첨가된다. 일부 측면에서, 4-1BB 작용제는 제2 또는 최종 확장 동안 추가된다.

일부 측면에서, TIL은 아데노신 a2a 수용체 길항제를 추가로 포함하는 배양 배지에서 확장된다. 임의의 아데노신 a2a 수용체 길항제가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 아데노신 a2a 수용체 길항제의 비제한적 예는, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 US20210137930A1에서 찾을 수 있다. 일부 측면에서, 아데노신 a2a 수용체 길항제는 비파데난트(vipadenant), CPI-444(시포라데난트(ciforadenant)), SCH58261, ZM241385, SCH420814, SYN115, 8-CSC, KW-6002, A2A 수용체 길항제 1, ADZ4635, ST4206, KF21213, SCH412348 및 7MMG-49, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 공결정 또는 전구약물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 아데노신 a2a 수용체 길항제는 초기 배양 동안 첨가된다. 일부 측면에서, 아데노신 a2a 수용체 길항제는 제2 및/또는 최종 확장 동안 첨가된다.

일부 측면에서, TIL은 AKT 경로 억제제(AKT pathway inhibitor, AKTi)를 추가로 포함하는 배양 배지에서 확장된다. 임의의 AKTi가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 본 개시내용에서 사용될 수 있는 AKTi의 비제한적 예는, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 WO2020096927에서 찾을 수 있다. 일부 측면에서, AKTi는 아푸레서팁(afuresertib), 유프로서팁(uprosertib), 이파타서팁(ipatasertib), AT7867, AT13148, 및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 공결정 또는 전구약물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, AKTi는 mTOR 억제제, 예를 들어, AZD8055, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 공결정 또는 전구약물이다. 일부 측면에서, AKTi는 PI3K 억제제, 예를 들어, LY294002, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 공결정 또는 전구약물이다. 일부 측면에서, AKTi는 초기 배양 동안 첨가된다. 일부 측면에서, AKTi는 제2 및/또는 최종 확장 동안 첨가된다.

일부 측면에서, 확장된 세포는 확장된 TIL을 하나 이상의 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 재활성화되거나 자극된다. 임의의 항원 제시 세포가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 항원 제시 세포는 유전적으로 변형된 세포이다. 일부 측면에서, 항원 제시 세포는 세포 표면에 종양 항원 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 측면에서, 확장된 TIL은 세포 표면에 하나 이상의 종양 항원 또는 이의 단편을 포함하는 항원 제시 세포와 접촉된다.

일부 측면에서, 항원 제시 세포(APC)는 유전적으로 조작된다. 일부 측면에서, APC는 하나 이상의 전이유전자(transgene), 예를 들어, 항원 또는 자극 신호의 조정 가능한 발현을 위해 유전적으로 조작된다. 일부 측면에서, APC는 전문이 본원에 참조로 포함된 WO2020/086742에 개시된 방법에 따라 유전적으로 조작된다. 일부 측면에서, APC는 하나 이상의 자극 분자를 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 측면에서, APC는 CD86, OC40L, 4-1BBL 또는 이들의 임의의 조합을 발현하도록 유전적으로 조작된다. 일부 측면에서, APC는 전문이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제10,415,015호에 개시된 APC이다.

일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 1×10⁷ 내지 적어도 약 50×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷ 내지 적어도 약 40×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷ 내지 적어도 약 30×10⁷개, 적어도 약 4×10⁷ 내지 적어도 약 25×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개, 적어도 약 1×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개 또는 적어도 약 4×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 5×10⁷ 내지 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 1×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷개, 적어도 약 4×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷개, 적어도 약 6×10⁷개, 적어도 약 7×10⁷개, 적어도 약 8×10⁷개, 적어도 약 9×10⁷개, 적어도 약 10×10⁷개, 적어도 약 11×10⁷개, 적어도 약 12×10⁷개, 적어도 약 13×10⁷개, 적어도 약 14×10⁷개, 적어도 약 15×10⁷개, 적어도 약 16×10⁷개, 적어도 약 17×10⁷개, 적어도 약 18×10⁷개, 적어도 약 19×10⁷개 또는 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 5×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 6×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 7×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 TIL 배지에서 세포 수율이 적어도 약 8×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 확장에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 TIL 배지에서 세포 수율이 적어도 약 9×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 확장에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 10×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 15×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배지에서 배양된다. 일부 측면에서, TIL은 2차 확장에서 세포 수율이 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 TIL 배지에서 배양된다.

일부 측면에서, TIL은 최종 확장된다. 일부 측면에서, TIL은 폐쇄형 시스템(예를 들어, GREX 폐쇄형 시스템)을 개방하지 않고 2차 확장에서 최종 확장으로 전환된다. 일부 측면에서, 최종 확장 단계는 하나 이상의 기체 투과성 플라스크(예를 들어, GREX 플라스크)에서 수행된다. 일부 측면에서, 2차 확장은 REP 프로토콜의 제1 단계(즉, 세포가 분할될 때까지의 REP 프로토콜)에 상응하고, 최종 확장은 REP 프로토콜의 제2 단계(즉, 세포 분할 후의 REP 프로토콜)에 상응한다. 이와 같이, 일부 측면에서, 2차 확장은 지속 기간이 약 3 내지 7일(예를 들어, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일)이고, 최종 확장은 지속 기간이 약 3 내지 7일(예를 들어, 약 5일, 약 6일 또는 약 7일)이다.

일부 측면에서, 최종 확장 동안 배지는 IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 측면에서, 최종 확장 동안 배지는 IL-2, IL-15 및 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 배지에서 IL-2의 농도는 초기 배양 동안 배지에서 IL-2의 농도보다 낮다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 300ng/ml 미만이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 50ng/ml, 약 55ng/ml, 약 60ng/ml, 약 65ng/ml, 약 70ng/ml, 약 73.6ng/ml, 약 75ng/ml, 약 80ng/ml, 약 85ng/ml, 약 90ng/ml, 약 95ng/ml, 약 100ng/ml, 약 105ng/ml, 약 110ng/ml, 약 115ng/ml, 약 120ng/ml, 약 125ng/ml, 약 130ng/ml, 약 135ng/ml, 약 140ng/ml, 약 145ng/ml, 약 150ng/ml, 약 175ng/ml, 약 200ng/ml, 약 225ng/ml, 약 250ng/ml 또는 약 275ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 50ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 55ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 60ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 65ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 70ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 73.6ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 75ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 80ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 85ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 90ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 95ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-2의 농도는 약 100ng/ml이다.

일부 측면에서, 최종 확장 동안 배지에서 IL-21의 농도는 초기 배양 동안 배지에서 IL-21의 농도보다 낮다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 30ng/ml 미만이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 1ng/ml, 약 2ng/ml, 약 3ng/ml, 약 4ng/ml, 약 5ng/ml, 약 6ng/ml, 약 7ng/ml, 약 8ng/ml, 약 9ng/ml, 약 10ng/ml, 약 11ng/ml, 약 12ng/ml, 약 13ng/ml, 약 14ng/ml, 약 15ng/ml, 약 16ng/ml, 약 17ng/ml, 약 18ng/ml, 약 19ng/ml, 약 20ng/ml, 약 21ng/ml, 약 22ng/ml, 약 23ng/ml, 약 24ng/ml, 약 25ng/ml, 약 26ng/ml, 약 27ng/ml, 약 28ng/ml 또는 약 29ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 5ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 6ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 7ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 8ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 9ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 10ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 11ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 12ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 13ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 14ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-21의 농도는 약 15ng/ml이다.

일부 측면에서, 최종 확장 동안 배지에서 IL-15의 농도는 약 0.1ng/ml, 약 0.2ng/ml, 약 0.3ng/ml, 약 0.4ng/ml, 약 0.5ng/ml, 약 0.6ng/ml, 약 0.7ng/ml, 약 0.8ng/ml, 약 0.9ng/mL, 약 1.0ng/ml, 약 1.1ng/ml, 약 1.2ng/ml, 약 1.3ng/ml, 약 1.4ng/ml, 약 1.5ng/ml, 약 1.6ng/ml, 약 1.7ng/ml, 약 1.8ng/ml, 약 1.9ng/ml, 약 2.0ng/ml, 약 2.25ng/ml, 약 2.5ng/ml, 약 2.75ng/ml, 약 3.0ng/ml, 약 3.5ng/ml, 약 4.0ng/ml, 약 4.5ng/ml 또는 약 5.0ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.1ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.2ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.3ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.4ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.5ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.6ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.7ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.8ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-15의 농도는 약 0.9ng/ml이다. 일부 측면에서, 최종 확장 동안 IL-15의 농도는 약 1.0ng/ml이다.

일부 측면에서 최종 확장은 자극을 포함한다. 일부 측면에서 자극은 2차 확장 동안 사용된 자극과 동일하다. 일부 측면에서, TIL은 TRANSACT™, 4-1BBL, CD27L 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 MRM에서 세포를 배양함으로써 최종 확장 동안 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 TRANSACT™ 및 선택적으로 4-1BBL 및/또는 CD27L을 포함하는 MRM에서 세포를 배양함으로써 최종 확장 동안 자극된다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 약 1:100 TRANSACT™, 적어도 약 1μg/ml의 4-1BBL 및 적어도 약 5μg/ml의 CD27L을 포함하는 MRM에서 세포를 배양함으로써 최종 확장 동안 자극된다.

일부 측면에서, 최종 확장 단계는 정적 GREX에서 수행된다. 일부 측면에서 최종 확장은 교반 탱크에서 수행된다. 일부 측면에서 최종 확장 단계는 생물반응기에서 수행된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배지에서의 세포 수율이 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 100×10⁹개, 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 90×10⁹개, 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 80×10⁹개. 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 70×10⁹개, 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 60×10⁹개, 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 50×10⁹개, 적어도 약 10×10⁹ 내지 적어도 약 100×10⁹개, 적어도 약 20×10⁹ 내지 적어도 약 100×10⁹개, 적어도 약 30×10⁹ 내지 적어도 약 100×10⁹개, 적어도 약 30×10⁹ 내지 적어도 약 50×10⁹개 또는 적어도 약 35×10⁹ 내지 적어도 약 45×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배지에서 세포 수율이 적어도 약 40×10⁹ 내지 적어도 약 100×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배지에서의 세포 수율이 적어도 약 40×10⁹개, 적어도 약 45×10⁹개, 적어도 약 50×10⁹개, 적어도 약 55×10⁹개, 적어도 약 60×10⁹개, 적어도 약 65×10⁹개, 적어도 약 70×10⁹개, 적어도 약 75×10⁹개, 적어도 약 80×10⁹개, 적어도 약 85×10⁹개, 적어도 약 90×10⁹개, 적어도 약 95×10⁹개 또는 적어도 약 100×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배지에서 세포 수율이 적어도 약 40×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배지에서 세포 수율이 적어도 약 50×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배지에서 세포 수율이 적어도 약 60×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배지에서 세포 수율이 적어도 약 70×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배지에서 세포 수율이 적어도 약 80×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배지에서 세포 수율이 적어도 약 90×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 최종 TIL 배지에서 세포 수율이 적어도 약 100×10⁹개의 세포에 도달할 때까지 계속된다.

일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 7일 내지 적어도 약 21일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 7일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 8일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 9일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 10일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 11일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 12일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 13일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 14일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 15일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 16일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 17일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 18일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 19일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 20일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다. 일부 측면에서, 최종 확장은 적어도 약 21일 동안 최종 TIL 배지에서 세포가 수득될 때까지 계속된다.

일부 측면에서, 2차 확장 및 최종 확장은 단일 2차 확장으로 병합된다. 일부 측면에서, 단일 2차 확장은 2차 확장 및 최종 확장의 모든 측면을 포함한다. 일부 측면에서, 단일 2차 확장은 폐쇄형 시스템(예를 들어, GREX 폐쇄형 시스템)에서 발생하며, 폐쇄형 시스템은 단일 2차 확장 기간 동안 개방되지 않는다. 일부 측면에서, 일단 세포가 높은 컨플루언스에 도달하면 세포는 단일 2차 확장 동안 분할된다.

일부 측면에서, 확장 과정의 전체 기간(예를 들어, (ⅰ) 초기 확장 과정, 2차 확장 과정 및 최종 확장 과정; 또는 (ⅱ) 초기 확장 과정 및 단일 2차 확장 과정)은 22일 이하이다. 더 짧은 확장 과정을 사용하는 덜 성숙한 TIL 생성은 생성된 TIL 구성에 다양한 이점을 부여한다. 이와 같이, 본원에 개시된 배양 조건 및 방법은 덜 성숙한 TIL에 대해 이미 확인된 것들에 추가 이점, 예를 들어, 증가된 줄기 유사 특성, 확장된 클론 다양성, 개선된 세포용해 활성 및/또는 증가된 CD8⁺ 세포 확장을 부여한다.

II.I.2.b. 정적 REP 및 동적 REP에 의한 2차 확장

일부 측면에서, 2차 확장은 정적 REP 단계에 이어 동적 REP 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "정적 REP"는 예를 들어 본원에 개시된 바와 같이 사전 REP 또는 초기 확장으로부터 수확된 TIL이 4mM 초과의 칼륨 이온, 예를 들어 본원에 개시된 MRM, CD3 작용제(예를 들어, OKT3) 및 항원 제시 세포(예를 들어, 조사된 동종 PBMC)을 포함하는 배지에서 추가로 확장되는 확장 단계를 지칭한다.

일부 측면에서, 정적 REP 동안 배양물의 교반이 적용되지 않는다. 본원에 사용된 "동적 REP"는 정적 REP로부터의 TIL이 치료적 수의 TIL에 도달할 때까지 4mM 초과의 칼륨 이온을 포함하는 배지에서 추가로 확장되는 확장 단계를 지칭하며, 여기서 배양은 교반 하에 발생한다. 일부 측면에서, 방법은 (a) 4mM 초과의 칼륨 이온, CD3 작용제 및 항원 제시 세포("정적 REP")를 포함하는 배지에서 TIL을 배양하는 것; 및 (b) 4mM 초과의 칼륨 이온을 포함하는 배지를 정적 REP 단계로부터의 TIL에 첨가하는 것을 포함하고("동적 REP 단계"), 여기서 교반은 배양물에 적용되는, 인간 대상으로부터 얻은 TIL의 집단을 확장하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 다이나미드-REP 동안에는 CD3 작용제가 첨가되지 않는다. 일부 측면에서, 동적 REP 단계 동안 항원 제시 세포가 추가되지 않는다. 일부 측면에서, 동적 REP 단계 동안 CD3 작용제 및 항원 제시 세포가 첨가되지 않는다.

일부 측면에서, 정적 REP 동안 얻은 TIL은 동적 REP에 직접 첨가된다. 일부 측면에서 TIL은 정적 REP와 동적 REP 간에 분할되지 않는다. 일부 측면에서, TIL은 정적 REP 다음과 동적 REP 이전에 동결보존된다.

일부 측면에서, 확장된 TIL을 포함하는 정적 REP 배지는 동적 REP에 직접 적용된다. 따라서, 일부 측면에서, 동적 REP의 0일에는 CD3 작용제 및 항원 제시 세포를 포함하는 배지에 존재하는 TIL이 포함되며, 이는 TIL과 함께 정적 REP에서 동적 REP로 이전되었다. 그러나 일부 측면에서는 동적 REP 단계 동안 추가적인 CD3 작용제 또는 항원 제시 세포가 추가되지 않는다. 시간이 지남에 따라 정적 REP에서 이전된 증가하는 농도의 CD3 작용제는 분해되거나 손실되어 동적 REP 단계 동안 CD3 작용제의 농도가 감소한다.

또한, 동적 REP 단계는 배양물에 교반을 적용하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 교반은 배양물을 흔드는 것을 포함한다. 전통적인 REP 배양에는 조사된 PBMC와 같은 항원 제시 세포의 존재 하에서 TIL을 배양하는 것이 포함된다. 그러나 PBMC는 흔들림과 같은 교반을 받을 때 배양에서 생존력이 감소한다. 따라서 전통적인 REP 배양은 세포를 흔들거나 교반하지 않고 수행된다. 그러나, 본 개시는 놀랍게도 교반을 포함하는 동적 REP 단계를 포함하는 본원에 개시된 방법이 생성된 TIL 생성물의 수율을 증가시키고 특성을 개선한다는 것을 발견하였다. 본원에 개시된 동적 REP 단계는 REP 방법의 특징인 두 가지 요소인 TIL 확장 동안의 CD3 작용제와 항원 제시 세포 모두의 존재를 점진적으로 감소시키기 때문에 이는 예상되지 않았을 것이다.

일부 측면에서, 동적 REP 단계는 관류를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "관류"는 세포, 예를 들어 TIL을 배양하는 방법을 지칭하며, 여기서 배양 배지의 일부는 배양된 세포, 예를 들어 TIL을 제거하지 않고 신선한 배지로 지속적으로 교체된다. 관류 비율은 신중하게 제어할 수 있다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55% 또는 약 60%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 5% 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 10% 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 15% 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 20% 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 25% 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 30%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 35%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 40%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 45%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 50%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 55%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다. 일부 측면에서, 관류는 매 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 60%의 비율로 연속 배지 교환을 포함한다.

일부 측면에서, 관류 비율은 동적 REP 단계 전체에 걸쳐 일정하다. 일부 측면에서, 관류 비율은 동적 REP 단계 동안 다양하다. 일부 측면에서, 관류는 동적 REP 배양의 처음 48시간 동안 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 25%의 비율로 연속 배지 교환을 포함하고, 여기서 관류는 동적 REP 배양의 나머지 부분에 대해 24시간마다 배양 용기 작업 부피의 약 50% 비율로 연속 배지 교환을 포함한다.

일부 측면에서, 배양 배지의 부피는 동적 REP 단계 전체에 걸쳐 일정하게 유지된다. 일부 측면에서, 배양 배지의 부피는 동적 REP 단계 동안 다양하다. 일부 측면에서, 배양 배지의 부피는 동적 REP 단계 동안 증가된다. 일부 측면에서, 관류는 제거되는 것보다 더 많은 배지를 배양물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 배양 배지의 부피는 동적 REP 단계의 0시간부터 48시간까지 증가된다. 일부 측면에서, 배양 배지의 부피는 동적 REP 단계의 0시간부터 48시간까지 증가하고, 배양물의 부피는 유지되며, 즉, 48시간부터 동적 REP 단계가 완료될 때까지 10%를 초과하여 부피가 증가하지도, 10%를 초과하여 부피가 감소하지도 않는다. 일부 측면에서, 배지의 부피는 처음 48시간 동안 24시간마다 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50% 증가한다. 일부 측면에서, 배지의 부피는 동적 REP 단계의 0시간부터 48시간까지 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75% 증가한다. 일부 측면에서, 배지의 부피는 동적 REP 단계의 0시간부터 48시간까지 적어도 약 25% 증가한다. 일부 측면에서, 배지의 부피는 동적 REP 단계의 0시간부터 48시간까지 적어도 약 33% 증가한다. 일부 측면에서, 배지의 부피는 동적 REP 단계의 0시간부터 48시간까지 적어도 약 50% 증가한다. 일부 측면에서, 배지의 부피는 동적 REP 단계의 0시간부터 48시간까지 적어도 약 65% 증가한다. 일부 측면에서, 배지의 부피는 동적 REP 단계의 0시간부터 48시간까지 적어도 약 66% 증가한다. 일부 측면에서, 배지의 부피는 동적 REP 단계의 0시간부터 48시간까지 적어도 약 75% 증가한다.

일부 측면에서, 관류 동안 적용되는 새로운 배지는 4mM 초과의 칼륨 이온, 예를 들어 본원에 개시된 MRM을 포함한다. 일부 측면에서, 관류 동안 적용되는 새로운 배지는 4mM 초과의 칼륨 이온, 예를 들어 본원에 개시된 MRM을 포함하고, CD3 작용제, 예를 들어 OKT-3을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 관류 동안 적용된 신선한 배지는 4mM 초과의 칼륨 이온, 예를 들어 본원에 개시된 MRM을 포함하고, 항원 제시 세포, 예를 들어 조사된 PBMC를 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 관류 동안 적용되는 새로운 배지는 4mM 초과의 칼륨 이온, 예를 들어 본원에 개시된 MRM을 포함하고, CD3 작용제(예를 들어, OKT-3) 또는 항원 제시 세포(예를 들어, 조사된 PBMC)를 포함하지 않는다.

관류는 배지의 일부를 CD3 작용제를 포함하지 않는 새로운 배지로 지속적으로 교체하는 것을 포함하므로, 시작 배지(즉, 동적 REP 단계의 0일째) 중 임의의 CD3 작용제의 농도는 동적 REP 단계 전반에 걸쳐 감소할 것이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양물 중 CD3 작용제의 농도는 24시간마다 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55% 또는 약 60%의 비율로 감소한다. 일부 측면에서, 배양물에서 CD3 작용제가 감소하는 속도는 관류 비율과 연관될 것이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP 개시 후 적어도 약 24시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 75% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP 개시 후 적어도 약 48시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 45% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양물 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP 개시 후 적어도 약 72시간에 정적 REP 배양물 중 CD3 작용제 농도의 약 35% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP 개시 후 적어도 약 96시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 27% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP 개시 후 적어도 약 120시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 21% 미만이다.

관류는 배지의 일부를 추가 항원 제시 세포(예를 들어, 조사된 PBMC)를 포함하지 않는 신선한 배지로 지속적으로 교체하는 것을 포함하므로, 시작 배지(즉, 동적 REP 단계의 0일째)에 존재하는 생존 가능한 항원 제시 세포의 수는 동적 REP 기간에 걸쳐 감소하게 된다. 또한, PBMC는 배양물이 교반, 예를 들어 흔들림을 받을 때 배양물 내 생존율이 낮다. 동적 REP는 배양물을 교반하는 것으로 이루어지므로, 정적 REP에서 수행된 임의의 PBMC는 동적 REP 중에 그 수가 감소하기 시작한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양물에서 생존 가능한 항원 제시 세포, 예를 들어 방사선 조사된 PBMC의 수는 동적 REP 개시 후 적어도 약 24시간에 정적 REP의 항원 제시 세포 수의 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP에서 생존 가능한 항원 제시 세포의 수는 동적 REP 개시 후 적어도 약 48시간에 정적 REP에서 항원 제시 세포의 수의 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양물 중 생존 가능한 항원 제시 세포의 수는 동적 REP 개시 후 적어도 약 72시간에 정적 REP의 항원 제시 세포 수의 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만이다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양물 중 생존 가능한 항원 제시 세포의 수는 동적 REP 개시 후 적어도 약 96시간에 정적 REP의 항원 제시 세포 수의 약 10% 미만이다.

일부 측면에서 정적 REP 기간은 약 5일이다. 일부 측면에서, 동적 REP의 지속기간은 약 9일 내지 약 13일이다. 일부 측면에서, 동적 REP의 지속 기간은 약 9일이다. 일부 측면에서, 동적 REP의 지속 기간은 약 10일이다. 일부 측면에서, 동적 REP의 지속 기간은 약 11일이다. 일부 측면에서, 동적 REP의 지속 기간은 약 12일이다. 일부 측면에서, 동적 REP의 지속 기간은 약 13일이다. 일부 측면에서, 정적 REP의 지속기간은 약 5일이고, 동적 REP의 지속기간은 약 9일이다. 일부 측면에서, 정적 REP의 지속기간은 약 5일이고, 동적 REP의 지속기간은 약 10일이다. 일부 측면에서, 정적 REP의 지속기간은 약 5일이고, 동적 REP의 지속기간은 약 11일이다. 일부 측면에서, 정적 REP의 지속기간은 약 5일이고, 동적 REP의 지속기간은 약 12일이다. 일부 측면에서, TIL은 동적 REP 단계가 완료된 후 동결보존된다.

일부 측면에서, 정적 REP의 배지는 IL-2, 예를 들어 재조합 인간 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양의 배지는 적어도 약 1000IU, 적어도 약 1100IU, 적어도 약 1200IU, 적어도 약 1300IU, 적어도 약 1400IU, 적어도 약 1500IU, 적어도 약 1600IU, 적어도 약 1700IU, 적어도 약 1800IU, 적어도 약 1900IU, 또는 적어도 약 2000IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1000IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1100IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1200IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1300IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1400IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1500IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1600IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1700IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1800IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1900IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 2000IU IL-2를 포함한다.

일부 측면에서, 정적 REP의 배지는 IL-21, 예를 들어 재조합 인간 IL-21을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 적어도 약 5ng/mL, 적어도 약 6ng/mL, 적어도 약 7ng/mL, 적어도 약 8ng/mL 이상, 적어도 약 9ng/mL, 적어도 약 10ng/mL, 적어도 약 11ng/mL, 적어도 약 12ng/mL, 적어도 약 13ng/mL, 적어도 약 14ng/mL, 또는 적어도 약 15ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 5ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 6ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 7ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 8ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 9ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 10ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 11ng/mL의 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 12ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 13ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 14ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 15ng/mL IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 IL-15, 예를 들어 재조합 인간 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 적어도 약 0.1ng/mL, 적어도 약 0.2ng/mL, 적어도 약 0.3ng/mL, 적어도 약 0.4ng/mL, 적어도 약 0.5ng/mL, 적어도 약 0.6ng/mL, 적어도 약 0.7ng/mL, 적어도 약 0.8ng/mL, 적어도 약 0.9ng/mL, 또는 적어도 약 1ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 0.1ng/mL의 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 0.2ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 0.3ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 0.4ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 0.5ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 0.6ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 0.7ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 0.8ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 0.9ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1ng/mL의 IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 IL-2 및 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양물은 약 1500IU IL-2 및 약 10ng/mL IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 IL-2 및 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1500IU IL-2 및 약 0.4ng/mL IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 IL-2, IL-21 및 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양 배지는 약 1500IU IL-2, 약 10ng/mL IL-21, 및 약 0.4ng/mL IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP의 관류된 신선한 배지는 IL-2, 예를 들어 재조합 인간 IL-2를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 적어도 약 1000IU, 적어도 약 1100IU, 적어도 약 1200IU, 적어도 약 1300IU, 적어도 약 1400IU, 적어도 약 1500IU, 적어도 약 1600IU, 적어도 약 1700IU, 적어도 약 1800IU, 적어도 약 1900IU, 또는 적어도 약 2000IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1000IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1100IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1200IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1300IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1400IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1500IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1600IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1700IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1800IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1900IU IL-2를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 2000IU IL-2를 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP의 관류된 신선한 배지는 IL-21, 예를 들어 재조합 인간 IL-21을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 적어도 약 5ng/mL, 적어도 약 6ng/mL, 적어도 약 7ng/mL, 적어도 약 8ng/mL, 적어도 약 9ng/mL, 적어도 약 10ng/mL, 적어도 약 11ng/mL, 적어도 약 12ng/mL, 적어도 약 13ng/mL, 적어도 약 14ng/mL, 또는 적어도 약 15ng/mL IL-21를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 5ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 6ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 7ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 8ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 9ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 10ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 11ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 12ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 13ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 14ng/mL IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 15ng/mL IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 IL-15, 예를 들어 재조합 인간 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 적어도 약 0.1ng/mL, 적어도 약 0.2ng/mL, 적어도 약 0.3ng/mL, 적어도 약 0.4ng/mL, 적어도 약 0.5ng/mL, 적어도 약 0.6ng/mL, 적어도 약 0.7ng/mL, 적어도 약 0.8ng/mL, 적어도 약 0.9ng/mL, 또는 적어도 약 1ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 0.1ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 0.2ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 0.3ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 0.4ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 0.5ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 0.6ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 0.7ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 0.8ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 0.9ng/mL IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1ng/mL IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 IL-2 및 IL-21을 포함한다. 일부 측면에서, 정적 REP 배양은 약 1500IU IL-2 및 약 10ng/mL IL-21을 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 IL-2 및 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1500IU IL-2 및 약 0.4ng/mL IL-15를 포함한다.

일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 IL-2, IL-21 및 IL-15를 포함한다. 일부 측면에서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지는 약 1500IU IL-2, 약 10ng/mL IL-21, 및 약 0.4ng/mL IL-15를 포함한다.

II.I.3. 수확 및 동결보존

일부 측면에서, 확장된 TIL이 수확된다. TIL은 원심분리를 포함한 모든 방법을 사용하여 수확할 수 있다. 일부 측면에서 TIL은 자동화 시스템을 사용하여 수집된다. 세포 수확기 및/또는 세포 처리 시스템은 다양한 공급원에서 시판되며, 임의의 세포 기반 수확기가 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 세포 수확기 및/또는 세포 처리 시스템은 막 기반 세포 수확기이다. 일부 측면에서, 세포 수확은 세포 처리 시스템, 예를 들어, LOVO 시스템(Fresenius Kabi)을 사용하여 수행된다. 일부 측면에서, 세포 수확기 및/또는 세포 처리 시스템은 폐쇄형 멸균 시스템에서 세포 분리, 세척, 유체 교환, 농축 및/또는 다른 세포 처리 단계를 수행할 수 있다.

일부 측면에서, 수확은 폐쇄형 시스템 생물반응기에서 수행된다. 일부 측면에서, TIL 확장을 위해 폐쇄형 시스템이 사용된다. 일부 측면에서, 단일 생물반응기가 사용된다. 일부 측면에서, 폐쇄형 시스템 생물반응기는 단일 생물반응기이다. 개방형 및 폐쇄형 시스템에서 생체 외 TIL을 확장하는 방법의 예는, 예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 제10,166,257호에서 찾을 수 있다.

일부 측면에서, 확장된 TIL은 동결보존된다. TIL은 모든 방법을 사용하여 동결보존될 수 있다. TIL을 포함하는 다양한 포유동물 세포의 동결보존 방법은, 예를 들어, 각각의 전문이 본원에 참조로 포함된 (ⅰ) unclineberger.org/tissueculture/protocols/general-protocol-for-the-cryopreservation-of-mammalian-cells/에서 이용 가능한 General Protocol for the Cryopreservation of Mammalian Cells, UNC (2007); 및 (ⅱ) sigmaaldrich.com/catalog/papers/19499402에서 이용 가능한 Clarke 등, Improved post-thaw recovery of peripheral blood stem/progenitor cells using a novel intracellular-like cryopreservation solution, Cytotherapy 2009-6-6에 기술되어 있다.

일부 측면에서, TIL은 다음에 따라 배양된다:

(1) 대상체로부터 종양 샘플을 단리하고, 종양을 단편으로 절단하고/하거나 기계적으로 또는 화학적으로 분해한다.

(2) 이어서 생성된 종양 샘플 또는 이의 단편을 300ng/mL 또는 6000IU/ml의 IL-2 및 30ng/ml의 IL-21이 추가로 보충된 본원에 개시된 대사 재프로그래밍 배지를 포함하는 초기 배양물에서 배양한다.

(3) 선택적으로, 초기 배양 시작 후 5일째에 TIL을 TRANSACT™(1:200) 및 100ng/mL의 4-1BB 리간드와 접촉시킨 후, TIL을 추가로 5-9일 동안 배양하거나 약 10×10⁶ 내지 약 200×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 배양한다. 이어서 TIL이 풀링된다.

(4) 이어서 단계 3으로부터의 적어도 0.5×10⁶개의 TIL을 100-200배 과량의 조사된 PBMC 피더 세포와 혼합하고 30ng/ml의 항-CD3 항체(예를 들어, OKT3), 75ng/mL의 IL-2, 10ng/mL의 IL-21 및 0.4ng/mL의 IL-15가 보충된 배지(예를 들어, 본원에 개시된 대사 재프로그래밍 배지)에서 배양한다. 이 2차(REP) 배양은 본원에 기술된 바와 같이 치료적 유효량의 TIL이 얻어질 때까지 계속된다.

III. 개시내용의 구성

본 개시내용의 일부 측면은 CD8⁺ TIL이 농축된, TIL 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 측면에서, 상기 조성물은 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 배양된 TIL 집단을 포함한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 20%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 30%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 40%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 50%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 60%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 70%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 80%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 90%는 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 95%는 CD8⁺ TIL이다.

본 개시내용의 일부 측면은 확장된 TIL 집단을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 확장된 TIL 집단은 대조군 방법(예를 들어, 약 5mM 미만의 농도의 칼륨 이온을 포함하는 배지에서 배양)을 사용하여 확장된 TIL 집단의 클론 다양성에 비해 증가된 클론 다양성을 갖는다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성과 동일한 클론 다양성을 갖는다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 99% 내지 약 100%, 적어도 약 98% 내지 약 100%, 적어도 약 97% 내지 약 100%, 적어도 약 96% 내지 약 100%, 적어도 약 95% 내지 약 100%, 적어도 약 94% 내지 약 100%, 적어도 약 93% 내지 약 100%, 적어도 약 92% 내지 약 100%, 적어도 약 91% 내지 약 100%, 적어도 약 90% 내지 약 100%, 적어도 약 85% 내지 약 100%, 적어도 약 80% 내지 약 100%, 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 70% 내지 약 100%, 적어도 약 65% 내지 약 100%, 적어도 약 60% 내지 약 100%, 적어도 약 55% 내지 약 100%, 적어도 약 50% 내지 약 100%, 적어도 약 45% 내지 약 100% 또는 적어도 약 40% 내지 약 100%의 클론 다양성을 갖는다. 특정 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 95%의 클론 다양성을 갖는다. 특정 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 90%의 클론 다양성을 갖는다. 특정 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 85%의 클론 다양성을 갖는다. 특정 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 80%의 클론 다양성을 갖는다. 특정 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 75%의 클론 다양성을 갖는다. 특정 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 70%의 클론 다양성을 갖는다. 특정 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 60%의 클론 다양성을 갖는다. 특정 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 50%의 클론 다양성을 갖는다. 특정 측면에서, 확장된 TIL 집단은 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 40%의 클론 다양성을 갖는다.

일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.5 미만, 약 0.45 미만, 약 0.4 미만, 약 0.35 미만, 약 0.3 미만, 약 0.275 미만, 약 0.25 미만, 약 0.225 미만, 약 0.2 미만, 약 0.175 미만, 약 0.15 미만, 약 0.125 미만, 약 0.1 미만, 약 0.075 미만, 약 0.07 미만, 약 0.06 미만 또는 약 0.05 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.5 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.4 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.3 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.275 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.25 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.24 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.23 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.22 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.21 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.2 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.19 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.18 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.17 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.16 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.15 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.14 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.13 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.12 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.11 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.1 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.09 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.08 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.07 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.06 미만이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단은 클론 다양성이 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.05 미만이다.

일부 측면에서, 본원에 기술된 방법은 종양 반응성 TIL 클론의 확장을 (예를 들어, 40mM 미만의 칼륨 이온, 예를 들어, 4mM 칼륨 이온을 포함하는 배지에서) 대조군 방법을 사용하여 확장되거나 배양된 종양 반응성 TIL 클론의 선택적 확장과 비교하여 약 2배 내지 약 500배, 약 2배 내지 약 250배, 약 2배 내지 약 200배, 약 2배 내지 약 150배, 약 2배 내지 약 100배, 약 2배 내지 약 90배, 약 2배 내지 약 80배, 약 2배 내지 약 70배, 약 2배 내지 약 60배, 약 2배 내지 약 50배, 약 2배 내지 약 40배, 약 2배 내지 약 30배, 약 2배 내지 약 20배, 약 2배 내지 약 10배, 약 5배 내지 약 200배, 약 5배 내지 약 150배, 약 5배 내지 약 100배, 약 5배 내지 약 90배, 약 5배 내지 약 80배, 약 5배 내지 약 70배, 약 5배 내지 약 60배, 약 5배 내지 약 50배, 약 5배 내지 약 40배, 약 5배 내지 약 30배, 약 5배 내지 약 20배, 약 5배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 150배, 약 10배 내지 약 100배, 약 10배 내지 약 90배, 약 10배 내지 약 80배, 약 10배 내지 약 70배, 약 10배 내지 약 60배, 약 10배 내지 약 50배, 약 10배 내지 약 40배, 약 10배 내지 약 30배 또는 약 10배 내지 약 20배까지 선택적으로 증가시킨다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 방법은 종양 반응성 TIL 클론의 확장을 약 2배까지 선택적으로 증가시킨다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 방법은 종양 반응성 TIL 클론의 확장을 약 5배까지 선택적으로 증가시킨다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 방법은 종양 반응성 TIL 클론의 확장을 약 10배까지 선택적으로 증가시킨다.

일부 측면에서, 본원에 기술된 방법은 종양 반응성 TIL 클론의 확장을 선택적으로 증가시키며, 클론 다양성은 유지된다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 방법은 종양 반응성 TIL 클론의 확장을 약 2배 내지 약 50배까지 선택적으로 증가시키며, 클론 다양성은 약 70% 내지 약 100% 유지된다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 방법은 종양 반응성 TIL 클론의 확장을 약 2배까지 선택적으로 증가시키며, 클론 다양성은 약 70% 내지 약 100% 유지된다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 방법은 종양 반응성 TIL 클론의 확장을 약 5배까지 선택적으로 증가시키며, 클론 다양성은 약 70% 내지 약 100% 유지된다. 일부 측면에서, 본원에 기술된 방법은 종양 반응성 TIL 클론의 확장을 약 10배까지 선택적으로 증가시키며, 클론 다양성은 약 70% 내지 약 100% 유지된다.

일부 측면에서, TIL은 덜 분화된 표현형을 나타내는 하나 이상의 바이오마커의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, TIL은 TCF7의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 TCF7의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배 또는 적어도 약 50배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 TCF7의 발현에서 적어도 약 40배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ TCF7⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 TCF7⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD45RO의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD45RO의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD45RO의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ CD45RO⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD45RO⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD62L의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD62L의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD62L의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ CD62L⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD62L⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD27의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ CD27⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD27⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD62L 및 CD27의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD62L 및 CD27의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺/CD62L⁺/CD27⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD62L⁺ CD27⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD28의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD28의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD28의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺/CD28⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD28⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD27 및 CD28의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27 및 CD28의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27 및 CD28의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ CD27⁺ CD28⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD27⁺ CD28⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD27, CD28, PD1 및 CD103의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27, CD28, PD1 및 CD103의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27, CD28, PD1 및 CD103의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ CD27⁺ CD28⁺ PD1⁺ CD103⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD27⁺ CD28⁺ PD1⁺ CD103⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD27, CD28, PD1 및 TCF7의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27, CD28, PD1 및 TCF7의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27, CD28, PD1 및 TCF7의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ CD27⁺ CD28⁺ PD1⁺ TCF7⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD27⁺ CD28⁺ PD1⁺ TCF7⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD27, CD28, PD1, CD103 및 TCF7의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27, CD28, PD1, CD103 및 TCF7의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD27, CD28, PD1, CD103 및 TCF7의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ CD27⁺ CD28⁺ PD1⁺ CD103⁺ TCF7⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD27⁺ CD28⁺ PD1⁺ CD103⁺ TCF7⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD39의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD39의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD39의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ CD39⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD39⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD39 및 PD1의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD39 및 PD1의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 e TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD39 및 PD1의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ CD39⁺ PD1⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD39⁺ PD1⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 PD1의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 PD1의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 PD1의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 면역 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺/PD1⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 PD1⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 PD1 및 CD27의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 PD1 및 CD27의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 PD1 및 CD27의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺ PD1⁺ CD27⁺. TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 PD1⁺ CD27⁺이다.

일부 측면에서, TIL은 CD103의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD103의 발현에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배 또는 적어도 약 15배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD103의 발현에서 적어도 약 10배 증가를 나타낸다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%는 CD8⁺/CD103⁺ TIL이다. 일부 측면에서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%는 CD103⁺이다.

일부 측면에서, 본 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 통상적인 방법에 따라 배양된 유사한 면역 세포와 비교하여 덜 분화된 세포의 수가 증가한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 줄기 유사 표현형의 전형적인 하나 이상의 마커의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 대사 재프로그래밍 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL) 집단은 통상적인 방법에 따라 배양된, 예를 들어, 5mM 미만의 K⁺를 함유하는 배지에서 배양된 유사한 세포와 비교하여 이펙터 유사 세포의 수가 증가한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 대사 재프로그래밍 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL) 집단은 통상적인 방법에 따라 배양된, 예를 들어, 5mM 미만의 K⁺를 함유하는 배지에서 배양된 유사한 세포와 비교하여 줄기 유사 세포 및 이펙터 유사 세포의 수가 둘 다 증가한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 통상적인 방법에 따라 배양된 세포와 비교하여 더 큰 증식 가능성을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 대상체에서 이식 시 증가된 생체 내 생존력을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 증가된 세포 효능을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 감소된 세포 고갈을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 대상체에서 이식 시 증가된 생체 내 지속성을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 대상체에서 이식 시 증가된 생체 내 활성을 나타낸다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 대상체에 이식 시 더 지속적인 생체 내 반응을 나타낸다. 일부 측면에서, 대상체는 인간이다.

일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 5%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 10%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 15%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 20%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 25%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 30%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 35%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 40%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 45%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 50%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 55%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 60%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 65%는 줄기 유사 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 조성물 중 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 적어도 약 70%는 줄기 유사 표현형을 갖는다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 배양 후, 줄기 유사 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 배양물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 총 수의 적어도 약 10% 내지 적어도 약 70%를 구성한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 배양 후, 줄기 유사 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 배양물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 총 수의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 적어도 약 70%를 구성한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 배양 후, 줄기 유사 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 배양물에서 CD8⁺ TIL의 총 수의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 적어도 약 70%를 구성한다.

일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 1.5배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 2.0배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 2.5배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 3.0배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 3.5배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 4.0배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 세포의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 4.5배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 5.0배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 5.5배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 6.0배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 6.5배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 세포의 수와 비교하여 적어도 약 7.0배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 세포의 수와 비교하여 적어도 약 7.5배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 8.0배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 9.0배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 세포의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 10배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 세포의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 15배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 세포의 수는 배양 전 조성물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수와 비교하여 적어도 약 20배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL의 수는 배양 전 조성물에서 TIL의 수와 비교하여 적어도 약 30배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL의 수는 배양 전 조성물에서 세포의 수와 비교하여 적어도 약 40배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL의 수는 배양 전 조성물에서 TIL의 수와 비교하여 적어도 약 50배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL의 수는 배양 전 조성물에서 TIL의 수와 비교하여 적어도 약 75배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL의 수는 배양 전 조성물에서 TIL의 수와 비교하여 적어도 약 100배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL의 수는 배양 전 조성물에서 TIL의 수와 비교하여 적어도 약 500배 증가된다. 일부 측면에서, 조성물에서 줄기 유사 표현형을 갖는 TIL의 수는 배양 전 조성물에서 TIL의 수와 비교하여 적어도 약 1000배 증가된다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 배양 후, 배양물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 총 수의 적어도 약 10% 내지 적어도 약 70%는 CD39^-/TCF7⁺T 세포이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 배양 후, 배양물에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 총 수의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35% 또는 적어도 약 40%는 CD39^-/TCF7⁺ TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)이다.

일부 측면에서, 세포 조성물은 CD95를 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD45R0을 발현하지 않는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD45RA를 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CCR7을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD62L을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 TCF7을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD3을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD27을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD45RA를 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD95 및 CD45RA를 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD45RA 및 CCR7을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD95, CD45RA 및 CCR7을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD45RA, CCR7 및 CD62L을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD95, CD45RA, CCR7 및 CD62L을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD45RA, CCR7, CD62L 및 TCF7을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD95, CD45RA, CCR7, CD62L 및 TCF7을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD45RA, CCR7, CD62L, TCF7 및 CD27을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD95, CD45RA, CCR7, CD62L, TCF7 및 CD27을 발현하는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD45RA, CCR7, CD62L, TCF7 및 CD27을 발현하고 CD45RO^low인 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD95, CD45RA, CCR7, CD62L, TCF7 및 CD27을 발현하고 CD45RO^low인 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD45RA, CCR7, CD62L, TCF7 및 CD27을 발현하고 CD45RO를 발현하지 않는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD95, CD45RA, CCR7, CD62L, TCF7 및 CD27을 발현하고 CD45RO를 발현하지 않는 TIL의 증가된 백분율을 포함한다.

일부 측면에서, 세포 조성물은 CD39 및 CD69를 발현하지 않는 TIL의 백분율 증가를 포함한다. 일부 측면에서, 세포 조성물은 CD8을 발현하고 CD39 및 CD69를 발현하지 않는 TIL의 백분율 증가를 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL의 배양 후, 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 10% 내지 적어도 약 40%는 CD39^-/CD69^- TIL이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따른 TIL의 배양 후, 배양물에서 TIL의 총 수의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35% 또는 적어도 약 40%는 CD39^-/CD69^- TIL이다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 적어도 2개의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 적어도 3개의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 적어도 4개의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 적어도 2개의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 약 100%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 40%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 50%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 60%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 70%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 75%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 80%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 85%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 90%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 95%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 96%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 97%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 98%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL의 적어도 약 99%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다.

일부 측면에서, 줄기 유사 마커는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+ 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 측면에서 줄기 유사 마커는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+ 및 TCF7+ 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 CD45RO^low를 발현한다. 일부 측면에서, 줄기 유사 마커는 유전자 시그니처의 일부로서 본원에 열거된 하나 이상의 유전자를 포함한다(상기 참조; 예를 들어, Gattinoni, L., 등, Nat Med 17(10):1290-1297 (2011) 또는 Galletti 등, Nat Immunol 21, 1552-1562 (2020) 참조). 일부 측면에서, 이펙터 유사 마커는 pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+, STAT3+ 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 이펙터 유사 마커는 AKT1, AKT2, AKT3, BCL2L1, CBL, CBLB, CBLC, CCND1, CCND2, CCND3, CISH, CLCF1, CNTF, CNTFR, CREBBP, CRLF2, CSF2, CSF2RA, CSF2RB, CSF3, CSF3R, CSH1, CTF1, EP300, EPO, EPOR, GH1, GH2, GHR, GRB2, IFNA1, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNAR1, IFNAR2, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNGR1, IFNGR2, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNLR1, IFNW1, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL19, IL2, IL20, IL20RA, IL20RB, IL21, IL21R, IL22, IL22RA1, IL22RA2, IL23A, IL23R, IL24, IL26, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL3RA, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL7R, IL9, IL9R, IRF9, JAK1, JAK2, JAK3, LEP, LEPR, LIF, LIFR, MPL, MYC, OSM, OSMR, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PIK3CG, PIK3R1, PIK3R2, PIK3R3, PIK3R5, PIM1, PRL, PRLR, PTPN11, PTPN6, SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS7, SOS1, SOS2, SPRED1, SPRED2, SPRY1, SPRY2, SPRY3, SPRY4, STAM, STAM2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, TPO, TSLP, TYK2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 STAT 표적을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD45RA+, STAT5+ 및 STAT3+이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD62L+, STAT5+ 및 STAT3+이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 TCF7+, STAT5+ 및 STAT3+이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, STAT5+ 및 STAT3+이다. 일부 측면에서 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+이다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 및/또는 본원에 개시된 배지에서 배양된 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)은 CD45RA+, CD45RO^low, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+이다.

일부 측면에서, TIL은 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+ 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 마커와 pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+, STAT3+ 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+ 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 마커와 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 하나 이상의 줄기 유사 마커와 pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+, STAT3+ 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 포함한다. 일부 측면에서, 이펙터 유사 마커는 AKT1, AKT2, AKT3, BCL2L1, CBL, CBLB, CBLC, CCND1, CCND2, CCND3, CISH, CLCF1, CNTF, CNTFR, CREBBP, CRLF2, CSF2, CSF2RA, CSF2RB, CSF3, CSF3R, CSH1, CTF1, EP300, EPO, EPOR, GH1, GH2, GHR, GRB2, IFNA1, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17, IFNA2, IFNA21, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNAR1, IFNAR2, IFNB1, IFNE, IFNG, IFNGR1, IFNGR2, IFNK, IFNL1, IFNL2, IFNL3, IFNLR1, IFNW1, IL10, IL10RA, IL10RB, IL11, IL11RA, IL12A, IL12B, IL12RB1, IL12RB2, IL13, IL13RA1, IL13RA2, IL15, IL15RA, IL19, IL2, IL20, IL20RA, IL20RB, IL21, IL21R, IL22, IL22RA1, IL22RA2, IL23A, IL23R, IL24, IL26, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3, IL3RA, IL4, IL4R, IL5, IL5RA, IL6, IL6R, IL6ST, IL7, IL7R, IL9, IL9R, IRF9, JAK1, JAK2, JAK3, LEP, LEPR, LIF, LIFR, MPL, MYC, OSM, OSMR, PIAS1, PIAS2, PIAS3, PIAS4, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PIK3CG, PIK3R1, PIK3R2, PIK3R3, PIK3R5, PIM1, PRL, PRLR, PTPN11, PTPN6, SOCS1, SOCS2, SOCS3, SOCS4, SOCS5, SOCS7, SOS1, SOS2, SPRED1, SPRED2, SPRY1, SPRY2, SPRY3, SPRY4, STAM, STAM2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, STAT6, TPO, TSLP, TYK2 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 STAT 표적을 포함한다.

일부 측면에서, 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 TIL은 T 줄기/이펙터(T_SE) 세포이다. 일부 측면에서, T_SE 세포는 덜 분화된 상태를 유지하고(예를 들어, 하나 이상의 줄기 유사 마커를 발현하거나, 증식할 수 있거나, 분화할 수 있거나, 이들의 임의의 조합이 가능함) 상기 세포는 이펙터 기능을 갖는다(예를 들어, 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하거나, 종양 세포를 표적화 및/또는 살해할 수 있거나, 다기능성을 나타내거나, 이들의 조합이 가능함). 일부 측면에서, 본원에 개시된 T_SE 세포는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+를 발현한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 T_SE 세포는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, TCF7+, pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+를 발현한다. 일부 측면에서, T_SE 세포는 CD45RO^low이다.

본 개시내용의 일부 측면은 하나 이상의 T_SE 세포를 포함하는 확장된 TIL 집단에 관한 것이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 약 100%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 40%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 50%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 60%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 70%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 75%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 80%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 85%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 90%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 95%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 98%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL 집단의 적어도 약 99%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 집단에서 TIL의 확장된 집단의 약 100%는 T_SE 세포이다.

본 개시내용의 일부 측면은 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 TIL에 관한 것이다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 2개의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 3개의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 4개의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, TIL은 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 적어도 2개의 이펙터 유사 마커를 발현한다. 일부 측면에서, 줄기 유사 마커는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+ 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 줄기 유사 마커는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, TCF7+ 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 줄기 유사 마커는 유전자 시그니처의 일부로서 본원에 열거된 하나 이상의 유전자를 포함한다(상기 참조; 예를 들어, Gattinoni, L., 등, Nat Med 17(10): 1290-1297(2011) 또는 Galletti 등, Nat Immunol 21, 1552-1562(2020) 참조). 일부 측면에서, 이펙터 유사 마커는 pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+, STAT3+ 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 측면에서, TIL은 CD45RA+, STAT5+ 및 STAT3+를 발현한다. 일부 측면에서, TIL은 CD62L+, STAT5+ 및 STAT3+를 발현한다. 일부 측면에서, TIL은 TCF7+, STAT5+ 및 STAT3+를 발현한다. 일부 측면에서, TIL은 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, STAT5+ 및 STAT3+를 발현한다. 일부 측면에서, TIL은 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+를 발현한다. 일부 측면에서, TIL은 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, CD45RO^low, pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+를 발현한다.

본 개시내용의 일부 측면은 TIL 집단을 포함하는 세포 조성물에 관한 것으로, TIL 집단은 (ⅰ) 하나 이상의 줄기 유사 마커(예를 들어, 줄기 유사 TIL)를 발현하는 TIL의 제1 하위집단 및 (ⅱ) 하나 이상의 이펙터 유사 마커(예를 들어, 이펙터 유사 TIL)를 발현하는 TIL의 제2 하위집단을 포함하고, TIL 집단은 대조군 배지에서 배양된 TIL 집단과 비교하여 하나 이상의 줄기 유사 마커를 발현하는 TIL의 제1 하위 집단의 더 높은 백분율(즉, 줄기 유사 TIL의 수/총 TIL 수)을 포함한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL은 이러한 세포 조성물을 생성한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 방법에 따라 배양된 TIL은 증가된 발현, 예를 들어, GZMB, MHC-Ⅱ, LAG3, TIGIT 및/또는 NKG7을 발현하는 TIL의 더 높은 백분율, 및 감소된 발현, 예를 들어, IL-32를 발현하는 TIL의 더 낮은 백분율을 갖는다. NKG7이 가장 높은 세포는 더 나은 킬러인 것으로 나타난 반면(Malarkannan 등, 2020 Nat. Immuno.), IL-32가 더 높은 세포는 활성화 유도된 세포 사멸을 나타내는 것으로 나타났다(Goda 등, 2006 Int. Immuno.). 일부 측면에서 GZMB, MHC-Ⅱ, LAG3, TIGIT 및/또는 NKG7이 더 높게 발현된 TIL은 이펙터 유사 마커를 발현하는 CD8+ TIL이다. 일부 측면에서 IL-32가 더 낮게 발현된 TIL은 이펙터 유사 마커를 발현하는 CD8+ TIL이다.

본 개시내용의 일부 측면은 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 TIL을 포함하는 세포 조성물에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 TIL, 예를 들어, 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 TIL을 포함하는 세포 집단에 관한 것이다. 일부 측면에서, 세포 조성물의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 약 100%는 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 TIL을 포함한다.

일부 측면에서, 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 TIL은 T 줄기/이펙터(T_SE) 세포이다. 일부 측면에서, T_SE 세포는 덜 분화된 상태를 유지하고(예를 들어, 하나 이상의 줄기 유사 마커를 발현하거나, 증식할 수 있거나, 분화할 수 있거나, 이들의 임의의 조합이 가능함) 상기 세포는 이펙터 기능을 갖는다(예를 들어, 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하거나, 종양 세포를 표적화 및/또는 살해할 수 있거나, 이들의 조합이 가능함). 일부 측면에서, 본원에 개시된 T_SE 세포는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+를 발현한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 T_SE 세포는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, STAT5+ 및 STAT3+를 발현한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 T_SE 세포는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+를 발현한다. 일부 측면에서, 본원에 개시된 T_SE 세포는 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, CD45RO^low, pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+ 및 STAT3+를 발현한다. 본 개시내용의 일부 측면은 하나 이상의 T_SE 세포를 포함하는 확장된 TIL 집단에 관한 것이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 약 100%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 40%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 50%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 60%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 70%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 75%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 80%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 85%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 90%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 95%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 98%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 적어도 약 99%는 T_SE 세포이다. 일부 측면에서, 확장된 TIL의 약 100%는 T_SE 세포이다.

본원에 추가로 설명된 바와 같이(예를 들어, 실시예 14 참조), 일부 측면에서, 세포(예를 들어, TIL)의 특징은 줄기 유사 세포(예를 들어, 표 3, 패널 1-4 참조), 고갈(예를 들어, 표 3, 패널 5-10 참조) 및 대사 적합성(예를 들어, 표 3, 패널 11-19 참조)과 연관된 유전자의 상이한 세트의 상향 조절 및/또는 하향 조절을 비교함으로써 전사체 분석을 사용하여 평가될 수 있다.

일부 측면에서, 최종적으로 고갈된 T 세포는 문헌[Oliveira 등, Nature 596: 119-125(2021)]에 설명된 TTE-연관 유전자 세트를 사용하여 특성규명된다. 일부 측면에서, TTE 세포에 대한 유전자 서명은 KRT86, RDH10, ACP5, CXCR6, HMOX1, LAYN, CLIC3, HAVCR2, AC243829.4, PRF1, SLC2A8, CHST12, GALNT2, ENTPD1, LAG3, GZMB, PDCD1, CARD16, CTLA4, SLA2, CD27, RALA, VCAM1, SYNGR2, NKG7, LSP1, CCL5, RARRES3, CD7, CTSW, MTSS1, PTMS, BATF, KIR2DL4, AKAP5, CD38, RAB27A, GZMH, IGFLR1, ATP8B4, CD63, HOPX, TNFRSF18, ADGRG1, PLPP1, CSF1, TNFSF10, SNAP47, LINC01871, MYO1E, ZBED2, AHI1, ABI3, FASLG, TYMP, ZBTB38, CTSB, PLSCR1, AFAP1L2, ITGAE, TNS3, DUSP16, CASP1, CARS, DUSP5, IFIT1, SLC1A4, GOLIM4, RSAD2, DNPH1, NBL1, ACOT9, ABHD6, OAS1, SLC27A2, ZBP1, CD200R1, OAS3, CMPK2, TNFSF4, POLR1E, CADM1, HELZ2, SYTL2, AGPAT2, UBE2F, GIMAP6, ZBTB32, RIN3, PLEKHF1, CHPF, PACSIN2, ABCB1, SPATS2L, USP18, TMEM9, KLRC1, MPST을 포함한다.

일부 측면에서, TIL은 조작된 TIL이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "조작된" TIL은 천연 발생 TIL의 특성이 아닌 하나 이상의 물리적 및/또는 기능적 특성을 TIL에 부여하는, 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따른 방식으로 조작된 TIL을 지칭한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 조작된 TIL은 조작된 TIL이 천연 발생이지 않도록 세포에 대해 이종성인 하나 이상의 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체)을 발현하도록 TIL을 변형함으로써 생성될 수 있다. 일부 측면에서, 조작된 TIL은 특정 방식으로 TIL을 배양함으로써, 예를 들어, 고칼륨성 배지에서 배양함으로써 생성될 수 있으며, 생성된 조작된 TIL은 천연 발생 세포에서 보이지 않는 하나 이상의 물리적 및/또는 기능적 특성을 갖는다.

일부 측면에서, 초기 배양 후 세포 조성물은 적어도 약 2×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개 또는 적어도 약 10×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양 후 세포 조성물은 약 2×10⁶ 내지 약 10×10⁶개, 예를 들어, 약 2×10⁶개, 약 3×10⁶개, 약 4×10⁶개, 약 5×10⁶개, 약 6×10⁶개, 약 7×10⁶개, 약 8×10⁶개, 약 9×10⁶개 또는 약 10×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양 후 조성물은 약 2×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL) 내지 약 3×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양 후 조성물은 약 3×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL) 내지 약 4×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양 후 조성물은 약 4×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL) 내지 약 5×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양 후 조성물은 약 5×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL) 내지 약 6×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양 후 조성물은 약 6×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL) 내지 약 7×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양 후 조성물은 약 7×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL) 내지 약 8×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양 후 조성물은 약 8×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL) 내지 약 9×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 초기 배양 후 조성물은 약 9×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL) 내지 약 10×10⁶개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다.

일부 측면에서, 제2 TIL 확장 후 세포 조성물은 적어도 약 5×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷개, 적어도 약 4×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷개, 적어도 약 6×10⁷개, 적어도 약 7×10⁷개, 적어도 약 8×10⁷개, 적어도 약 9×10⁷개, 적어도 약 10×10⁷개, 적어도 약 11×10⁷개, 적어도 약 12×10⁷개, 적어도 약 13×10⁷개, 적어도 약 14×10⁷개, 적어도 약 15×10⁷개, 적어도 약 16×10⁷개, 적어도 약 17×10⁷개, 적어도 약 18×10⁷개, 적어도 약 19×10⁷개 또는 적어도 약 20×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 세포 조성물은 약 5×10⁷ 내지 약 20×10⁷개, 예를 들어, 약 5×10⁷개, 약 6×10⁷개, 약 7×10⁷개, 약 8×10⁷개, 약 9×10⁷개, 약 10×10⁷개, 약 11×10⁷개, 약 12×10⁷개, 약 13×10⁷개, 약 14×10⁷개, 약 15×10⁷개, 약 16×10⁷개, 약 17×10⁷개, 약 18×10⁷개, 약 19×10⁷개 또는 약 20×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 5×10⁷내지 약 6×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 6×10⁷ 내지 약 7×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 7×10⁷ 내지 약 8×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 8×10⁷ 내지 약 9×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 9×10⁷ 내지 약 10×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 10×10⁷ 내지 약 11×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 11×10⁷ 내지 약 12×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 12×10⁷ 내지 약 13×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 13×10⁷ 내지 약 14×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 14×10⁷ 내지 약 15×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 15×10⁷내지 약 16×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 16×10⁷ 내지 약 17×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 17×10⁷ 내지 약 18×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL), 약 18×10⁷ 내지 약 19×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL) 또는 약 19×10⁷ 내지 약 20×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 5×10⁷ 내지 약 6×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 6×10⁷ 내지 약 7×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 7×10⁷ 내지 약 8×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 8×10⁷ 내지 약 9×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 9×10⁷ 내지 약 10×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 10×10⁷ 내지 약 11×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 11×10⁷ 내지 약 12×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 12×10⁷ 내지 약 13×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 13×10⁷ 내지 약 14×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 14×10⁷ 내지 약 15×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 15×10⁷ 내지 약 16×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 16×10⁷ 내지 약 17×10⁷개의세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 17×10⁷ 내지 약 18×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 18×10⁷ 내지 약 19×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 제2 확장 후 조성물은 약 19×10⁷ 내지 약 20×10⁷개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다.

일부 측면에서, 최종 TIL 확장 후 세포 조성물은 적어도 약 40×10⁹개, 적어도 약 50×10⁹개, 적어도 약 60×10⁹개, 적어도 약 70×10⁹개, 적어도 약 80×10⁹개, 적어도 약 90×10⁹개 또는 적어도 약 100×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 최종 확장 후 세포 조성물은 약 40×10⁹ 내지 약 100×10⁹개, 예를 들어, 약 40×10⁹개, 약 50×10⁹개, 약 60×10⁹개, 약 70×10⁹개, 약 80×10⁹개, 약 90×10⁹개 또는 약 100×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 최종 확장 후 조성물은 약 40×10⁹ 내지 약 50×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 50×10⁹ 내지 약 60×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 60×10⁹ 내지 약 70×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 70×10⁹ 내지 약 80×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 80×10⁹ 내지 약 90×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL) 또는 약 90×10⁹ 내지 약 100×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 최종 확장 후 조성물은 약 40×10⁹ 내지 약 50×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 최종 확장 후 조성물은 약 50×10⁹ 내지 약 60×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 최종 확장 후 조성물은 약 60×10⁹ 내지 약 70×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 최종 확장 후 조성물은 약 70×10⁹ 내지 약 80×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 최종 확장 후 조성물은 약 80×10⁹ 내지 약 90×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다. 일부 측면에서, 최종 확장 후 조성물은 약 90×10⁹ 내지 약 100×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 포함한다.

일부 측면에서, 대상체에게 투여하기에 적합한 세포 조성물은 적어도 약 2×10⁹개, 적어도 약 3×10⁹개, 적어도 약 4×10⁹개, 적어도 약 5×10⁹개, 적어도 약 6×10⁹개, 적어도 약 7×10⁹개, 적어도 약 8×10⁹개, 적어도 약 9×10⁹개 또는 적어도 약 1×10¹⁰개, 또는 적어도 약 10×10¹⁰개, 또는 적어도 약 15×10¹⁰개, 또는 적어도 약 20×10¹⁰개, 또는 적어도 약 25×10¹⁰개, 또는 적어도 약 30×10¹⁰개의 CD8⁺ TIL을 포함한다. 일부 측면에서, 대상체에게 투여하기에 적합한 세포 조성물은 적어도 약 2×10⁹개의 CD8⁺ TIL을 포함한다. 일부 측면에서, 대상체에게 투여하기에 적합한 세포 조성물은 적어도 약 5×10⁹개의 CD8⁺ TIL을 포함한다. 일부 측면에서, 대상체에게 투여하기에 적합한 세포 조성물은 적어도 약 9×10⁹개의 CD8⁺ TIL을 포함한다. 일부 측면에서, 대상에게 투여하기에 적합한 세포 조성물은 적어도 약 1×10¹⁰개의 CD8⁺ TIL을 포함한다. 일부 측면에서, 대상체에게 투여하기에 적합한 세포 조성물은 적어도 약 10×10¹⁰개의 CD8⁺ TIL을 포함한다. 일부 측면에서, 대상체에게 투여하기에 적합한 세포 조성물은 적어도 약 20×10¹⁰개의 CD8⁺ TIL을 포함한다. 일부 측면에서, 대상체에게 투여하기에 적합한 세포 조성물은 적어도 약 30×10¹⁰개의 CD8⁺ TIL을 포함한다.

일부 측면에서, 본원에 개시된 방법은 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99% 생존 가능한 TIL을 포함하는 조성물을 제공한다.

IV. 치료 방법

본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 배양된 TIL 집단에 관한 것이다. 일부 측면에서, TIL은 종양 침윤 T 세포이다. 일부 측면에서, TIL은 CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포 둘 다를 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 CD8⁺ T 세포를 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 종양 반응성(예를 들어, 종양 특이적) TIL이 농축되어 있다. 일부 측면에서, TIL은 줄기 유사 TIL이 농축되어 있다.

일부 측면에서, TIL 집단을 포함하는 조성물은 이것이 필요한 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서 본원에 개시된 방법을 사용하여 제조된 TIL은 암, 예를 들어, 종양을 치료하기 위해 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 치료 방법은 유효량의 본 개시내용의 TIL 조성물, 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단, 예를 들어, CD8⁺ TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 줄기 유사 TIL이 농축된 TIL 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 치료 가능한 종양의 비제한적인 예는 본 개시의 다른 부분에 더 설명되어 있다. 일부 측면에서, 종양은 체크포인트 억제제에 불응성이다. 체크포인트 억제제의 비제한적인 예로는 PD-1 길항제(예를 들어, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체), CTLA-4 길항제(예를 들어, 항-CTLA-4 항체), TIM3 길항제(예를 들어, 항-TIM3 항체), GITR 길항제(예를 들어, 항-GITR 항체), KIR 길항제(예를 들어, 항-KIR 항체), LAG3 길항제(예를 들어, 항-LAG3 항체) 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 일부 측면에서, 종양은 재발된다. 어떤 측면에서는 종양이 전이된 경우도 있다. 일부 측면에서, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 종양은 체크포인트 억제제에 불응성이고 재발된다. 일부 측면에서, 종양은 체크포인트 억제제에 불응성이고 전이성이다. 일부 측면에서, 종양은 체크포인트 억제제에 불응성이고, 재발되며, 전이성이다.

본 개시내용은 또한 유효량의 본 개시내용의 TIL 조성물, 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단, 예를 들어, CD8⁺ TIL이 농축된 TIL 집단을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포 매개 면역 반응을 자극하는 방법을 제공한다.

일부 측면에서, 본 개시내용의 세포 조성물로 투여되는 TIL 집단은 자가 TIL을 포함한다.

일부 측면에서, 상기 방법은 적어도 약 1×10⁴개, 적어도 약 5×10⁴개, 적어도 약 1×10⁵개, 적어도 약 5×10⁵개, 적어도 약 1×10⁶개, 적어도 약 2×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개, 적어도 약 1×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷개, 적어도 약 1×10⁸개의 TIL을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 적어도 약 1×10⁴개, 적어도 약 5×10⁴개, 적어도 약 1×10⁵개, 적어도 약 5×10⁵개, 적어도 약 1×10⁶개, 적어도 약 2×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개, 적어도 약 1×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷개, 적어도 약 1×10⁸개, 적어도 약 1×10⁹개, 적어도 약 2×10⁹개, 적어도 약 3×10⁹개, 적어도 약 4×10⁹개, 적어도 약 5×10⁹개, 적어도 약 6×10⁹개, 적어도 약 7×10⁹개, 적어도 약 8×10⁹개, 적어도 약 9×10⁹개, 적어도 약 1×10¹⁰개, 적어도 약 10×10¹⁰개, 적어도 약 15×10¹⁰개, 적어도 약 20×10¹⁰개, 적어도 약 25×10¹⁰개 또는 적어도 약 30×10¹⁰개의 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 세포는 TIL이다. 일부 측면에서, TIL은 CD8⁺ TIL이다.

일부 측면에서, 상기 방법은 적어도 약 5×10⁹개, 10×10⁹개, 적어도 약 20×10⁹개, 적어도 약 30×10⁹개, 적어도 약 40×10⁹개, 적어도 약 50×10⁹개, 적어도 약 60×10⁹개, 적어도 약 70×10⁹개, 적어도 약 80×10⁹개, 적어도 약 90×10⁹개 또는 적어도 약 100×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 10×10⁹ 내지 약 100×10⁹개, 예를 들어, 약 10×10⁹개, 약 20×10⁹개, 약 30×10⁹개, 약 40×10⁹개, 약 50×10⁹개, 약 60×10⁹개, 약 70×10⁹개, 약 80×10⁹개, 약 90×10⁹개 또는 약 100×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 10×10⁹ 내지 약 20×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 20×10⁹ 내지 약 30×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 30×10⁹ 내지 약 40×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 40×10⁹ 내지 약 50×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 50×10⁹ 내지 약 60×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 60×10⁹ 내지 약 70×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 70×10⁹ 내지 약 80×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL), 약 80×10⁹ 내지 약 90×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL) 또는 약 90×10⁹ 내지 약 100×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 10×10⁹ 내지 약 20×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 20×10⁹ 내지 약 30×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 30×10⁹ 내지 약 40×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 40×10⁹ 내지 약 50×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 50×10⁹ 내지 약 60×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 60×10⁹ 내지 약 70×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 70×10⁹ 내지 약 80×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 80×10⁹ 내지 약 90×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 약 90×10⁹ 내지 약 100×10⁹개의 세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, TIL은 CD8⁺ TIL이다. 일부 측면에서, 방법은 약 5x10⁹내지 약 8x10⁹세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 약 10x10⁹내지 약 30x10⁹세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 약 10x10⁹내지 약 40x10⁹세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 약 40x10⁹내지 약 80x10⁹세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 약 50x10⁹내지 약 80x10⁹세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 방법은 약 90x10⁹내지 약 110x10⁹세포(예를 들어, TIL)를 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, TIL은 적어도 약 2:1, 적어도 약 2.5:1, 적어도 약 3:1, 적어도 약 3.5:1 또는 적어도 약 4:1의 TIL 대 종양 세포의 비율로 투여된다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 약 2:1의 TIL 대 종양 세포의 비율로 투여된다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 약 2.5:1의 TIL 대 종양 세포의 비율로 투여된다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 약 3:1의 TIL 대 종양 세포의 비율로 투여된다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 약 3.5:1의 TIL 대 종양 세포의 비율로 투여된다. 일부 측면에서, TIL은 적어도 약 4:1의 TIL 대 종양 세포의 비율로 투여된다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 줄기 유사 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물의 투여는 기준 종양 부피와 비교하여 대상체에서 종양 부피를 감소시킨다. 일부 측면에서, 기준 종양 부피는 조작된 세포의 투여 전 대상체의 종양 부피이다. 추가 측면에서, 기준 종양 부피는 투여를 받지 않은 상응하는 대상체의 종양 부피이다. 일부 측면에서, 대상체의 종양 부피는 기준 종양 부피와 비교하여 투여 후 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100% 감소된다.

일부 측면에서, 종양 치료는 대상체에서 종양 중량을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 줄기 유사 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물의 투여는 대상체에게 투여되었을 때 대상체의 종양 무게를 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 종양 중량은 기준 종양 중량과 비교하여 투여 후 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100% 감소된다. 일부 측면에서, 기준 종양 중량은 본 개시내용의 세포 조성물의 투여 전 대상체의 종양 중량이다. 추가 측면에서, 기준 종양 중량은 투여를 받지 않은 상응하는 대상체의 종양 중량이다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 줄기 유사 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물을, 예를 들어, 종양을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것은 대상체의 종양 및/또는 종양 미세환경(TME)에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수 및/또는 백분율을 증가시킬 수 있다. 일부 측면에서, 종양 및/또는 TME에서 TIL(예를 들어, CD8⁺ TIL)의 수 및/또는 백분율은 기준(예를 들어, 본 개시내용의 세포 조성물을 투여받지 않은 대상체 또는 본 개시내용의 세포 조성물의 투여 전의 동일한 대상체에서 상응하는 값)과 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 적어도 약 200%, 적어도 약 210%, 적어도 220%, 적어도 약 230%, 적어도 약 240%, 적어도 약 250%, 적어도 약 260%, 적어도 약 270%, 적어도 약 280%, 적어도 약 290% 또는 적어도 약 300% 이상 증가된다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 줄기 유사 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물을, 예를 들어, 종양을 앓고 있는 대상체에게 투여하는 것은 통상적인 방법에 따라 제조된 세포, 예를 들어, 적어도 약 40mM 내지 적어도 약 90mM 칼륨 이온 농도, 예를 들어, 적어도 50mM 칼륨 이온 농도를 포함하지 않는 배지에서 배양된 세포를 포함하는 유사한 세포 요법이 투여된 대상체에서의 면역 반응의 지속 기간에 비해 대상체에서 면역 반응의 지속 기간을 증가시킬 수 있다. 일부 측면에서, 면역 반응의 지속시간은 기준(예를 들어, 통상적인 방법에 따라 제조된 세포, 예를 들어, 적어도 50mM 칼륨 이온 농도를 포함하지 않는 배지에서 배양된 세포를 포함하는 유사한 세포 요법이 투여된 대상체)에 비해 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 300%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500% 또는 적어도 약 1000% 이상 증가된다. 일부 측면에서, 면역 반응의 지속 시간은 기준(예를 들어, 통상적인 방법에 따라 제조된 세포, 예를 들어, 적어도 약 40mM 내지 적어도 약 90mM 칼륨 이온 농도, 예를 들어, 적어도 50mM 칼륨 이온 농도를 포함하지 않는 배지에서 배양된 세포를 포함하는 유사한 세포 요법이 투여된 대상체)에 비해 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배 또는 적어도 약 10배 이상 증가된다.

상기에 더하여, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 줄기 유사 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물의 투여는 종양 치료에 도움이 되는 다른 효과가 있을 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 다양한 암 유형, 예를 들어, 유방암, 두경부암, 자궁암, 뇌암, 피부암, 신장암, 폐암, 결장직장암, 전립선암, 간암, 방광암, 신장암, 췌장암, 갑상선암, 식도암, 눈암, 위암, 위장관암, 난소암, 암종, 육종, 백혈병, 림프종, 골수종 또는 이들의 조합을 포함하는 암에서 유래된 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 암은 고형 종양을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 흑색종, 결장암, 폐암, 자궁경부암, 위장관암, 유방암, 전립선암, 간암, 골암, 췌장암, 두경부의 소세포 암종, 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 췌장 선암종, 두경부 편평 세포 암종, 고환 생식 세포 종양, 위 선암종, 피부 흑색종, 중피종, 신장 투명 세포 암종, 자궁 경부 편평 세포 암종 및 내경부 선암종, 식도 암종, 방광 요로상피 암종, 유방 침윤성 암종, 신장 유두 세포 암종, 결장 선암종 또는 이들의 임의의 조합에서 유래된 고형 종양을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 흑색종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 결장직장암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 결장암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 췌장암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 두경부암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 자궁경부암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 난소암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 폐암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 위장관암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 유방암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 전립선암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 간암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 골암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 두경부의 소세포 암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 폐 편평 세포 암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 폐 선암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 췌장 선암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 두경부 편평 세포 암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 고환 생식 세포 종양을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 위 선암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 피부 흑색종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 중피종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 신장 투명 세포 암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 자궁경부 편평 세포 암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 자궁경부 선암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 식도 암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 방광 요로상피 암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 유방 침윤성 암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 신장 유두 세포 암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 결장 선암종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 자궁암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 뇌를 포함한다. 일부 측면에서, 암은 갑상선암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 식도암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 눈암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 위암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 위장관암을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 육종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 백혈병을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 림프종을 포함한다. 일부 측면에서, 암은 골수종을 포함한다.

이와 같이, 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 흑색종 치료가 필요한 대상체에서 흑색종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 결장직장암 치료가 필요한 대상체에서 결장직장암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 결장암 치료가 필요한 대상체에서 결장암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 췌장암 치료가 필요한 대상체에서 췌장암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 두경부암 치료가 필요한 대상체에서 두경부암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부암 치료가 필요한 대상체에서 자궁경부암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 난소암 치료가 필요한 대상체에서 난소암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 폐암 치료가 필요한 대상체에서 폐암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 위장관암 치료가 필요한 대상체에서 위장관암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 유방암 치료가 필요한 대상체에서 유방암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 전립선암 치료가 필요한 대상체에서 전립선암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 간암 치료가 필요한 대상체에서 간암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 골암 치료가 필요한 대상체에서 골암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 두경부의 소세포 암종 치료가 필요한 대상체에서 두경부의 소세포 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 폐 편평 세포 암종 치료가 필요한 대상체에서 폐 편평 세포 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 폐 선암종 치료가 필요한 대상체에서 폐 선암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 췌장 선암종 치료가 필요한 대상체에서 췌장 선암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 두경부 편평 세포 암종 치료가 필요한 대상체에서 두경부 편평 세포 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 고환 생식 세포 종양 치료가 필요한 대상체에서 고환 생식 세포 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 위 선암종 치료가 필요한 대상체에서 위 선암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 피부 흑색종 치료가 필요한 대상체에서 피부 흑색종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 중피종 치료가 필요한 대상체에서 중피종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신장 투명 세포 암종 치료가 필요한 대상체에서 신장 투명 세포 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁경부 편평 세포 암종 치료가 필요한 대상체에서 자궁경부 편평 세포 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 내경부 선암종 치료가 필요한 대상체에서 내경부 선암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 식도 암종 치료가 필요한 대상체에서 식도 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방광 요로상피 암종 치료가 필요한 대상체에서 방광 요로상피 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 유방 침윤성 암종 치료가 필요한 대상체에서 유방 침윤성 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신장 유두 세포 암종 치료가 필요한 대상체에서 신장 유두 세포 암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 결장 선암종 치료가 필요한 대상체에서 결장 선암종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 자궁암 치료가 필요한 대상체에서 자궁암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 뇌종양 치료가 필요한 대상체에서 뇌종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 식도암 치료가 필요한 대상체에서 식도암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 갑상선암 치료가 필요한 대상체에서 갑상선암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 눈암 치료가 필요한 대상체에서 눈암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 위암 치료가 필요한 대상체에서 위암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 위장관암 치료가 필요한 대상체에서 위장관암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 육종 치료가 필요한 대상체에서 육종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 백혈병 치료가 필요한 대상체에서 백혈병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 림프종 치료가 필요한 대상체에서 림프종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 개시된 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 골수종 치료가 필요한 대상체에서 골수종을 치료하는 방법에 관한 것이다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 다른 치료제(예를 들어, 항암제 및/또는 면역조절제)와 조합하여 사용할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본원에 개시된 종양을 치료하는 방법은 본 개시내용의 세포 조성물을 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 면역 경로의 다중 요소가 표적화될 수 있도록 하나 이상의 항암제와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 항암제는 면역 체크포인트 억제제(즉, 특정 면역 체크포인트 경로를 통한 신호전달을 차단함)를 포함한다.

본 방법에 사용될 수 있는 면역 체크포인트 억제제의 비제한적인 예는 CTLA-4 길항제(예를 들어, 항-CTLA-4 항체), PD1 길항제(예를 들어, 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체), TIM-3 길항제(예를 들어, 항-TIM-3 항체) 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 길항제의 비제한적인 예는 본 개시내용의 기타 부분에서 제공된다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 PD1 길항제이다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 항-PD1 항체이다. 병용 치료의 포괄적이고 비제한적인 목록은 본 출원의 다른 곳에 상세히 개시되어 있다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 추가 치료제의 투여 전 또는 후에 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 추가 치료제와 동시에 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물 및 추가 치료제는 약제학적으로 허용되는 담체 중의 단일 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 다른 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물 및 추가 치료제는 별개의 조성물로서 동시에 투여된다.

일부 측면에서, 대상체는 래트 또는 마우스와 같은 비인간 동물이다. 일부 측면에서, 대상체는 인간이다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 다른 치료제(예를 들어, 항암제 및/또는 면역조절제)와 조합하여 사용할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본원에 개시된 종양을 치료하는 방법은 (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물을 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 제제는, 예를 들어, 화학요법 약물, 표적 항암 요법, 종양용해 약물, 세포독성제, 면역 기반 요법, 사이토카인, 수술 절차, 방사선 절차, 공동자극 분자의 활성화제, 면역 체크포인트 억제제, 백신, 세포 면역요법 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물을 표준 케어 치료(예를 들어, 수술, 방사선 및 화학 요법)와 조합하여 사용할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 유지 요법, 예를 들어, 종양의 발생 또는 재발을 방지하기 위한 요법으로서도 사용될 수 있다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 면역 경로의 여러 요소가 표적이 될 수 있도록 하나 이상의 항암제와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 조합의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 종양 항원 제시를 향상시키는 요법(예를 들어, 수지상 세포 백신, GM-CSF 분비 세포 백신, CpG 올리고뉴클레오티드, 이미퀴모드(imiquimod)); 예를 들어, CTLA-4 및/또는 PD1/PD-L1/PD-L2 경로를 억제하고/하거나 Treg 또는 다른 면역 억제 세포(예를 들어, 골수 유래 억제 세포)를 고갈 또는 차단함으로써 음성 면역 조절을 억제하는 요법; 예를 들어, CD-137, OX-40 및/또는 CD40 또는 GITR 경로를 자극하고/하거나 T 세포 이펙터 기능을 자극하는 작용제로 양성 면역 조절을 자극하는 요법; 항종양 T 세포의 빈도를 전신적으로 증가시키는 요법; 예를 들어, CD25의 길항제(예를 들어, 다클리주맙(daclizumab))를 사용하거나 생체 외 항-CD25 비드 고갈에 의해 종양에서의 Treg와 같은 Treg를 고갈시키거나 억제하는 요법; 종양에서 억압인자(suppressor) 골수 세포의 기능에 영향을 미치는 요법; 종양 세포의 면역원성을 강화하는 요법(예를 들어, 안트라사이클린(anthracycline)); 유전적으로 조작된 세포, 예를 들어, 키메라 항원 수용체를 발현하도록 조작된 세포를 포함하는 추가의 입양 T 세포 또는 NK 세포 전달(CAR-T 요법); 인돌아민 디옥시게나제(indoleamine dioxigenase, IDO), 디옥시게나제, 아르기나제 또는 산화질소 합성효소(nitric oxide synthetase)와 같은 대사 효소를 억제하는 요법; T 세포 아네르기(anergy) 또는 고갈을 반전시키는/예방하는 요법; 종양 부위에서 선천적 면역 활성화 및/또는 염증을 촉발하는 요법; 면역 자극 사이토카인의 투여; 면역 억제성 사이토카인의 차단; 또는 이들의 조합.

일부 측면에서, 항암제는 면역 체크포인트 억제제(즉, 특정 면역 체크포인트 경로를 통한 신호 전달을 차단함)를 포함한다. 본 방법에 사용될 수 있는 면역 체크포인트 억제제의 비제한적 예는 CTLA-4 길항제(예를 들어, 항-CTLA-4 항체), PD1 길항제(예를 들어, 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체), TIM-3 길항제(예를 들어, 항-TIM-3 항체) 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 면역 체크포인트 억제제의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 항-PD1 항체(예를 들어, 니볼루맙(nivolumab)(OPDIVO^®), 펨브롤리주맙(pembrolizumab)(KEYTRUDA®; MK-3475), 피딜리주맙(pidilizumab)(CT-011), PDR001, MEDI0680(AMP-514), TSR-042, REGN2810, JS001, AMP-224(GSK-2661380), PF-06801591, BGB-A317, BI 754091, SHR-1210 및 이들의 조합); 항-PD-L1 항체(예를 들어, 아테졸리주맙(atezolizumab)(TECENTRIQ^®; RG7446; MPDL3280A; RO5541267), 더발루맙(durvalumab)(MEDI4736, IMFINZI^®), BMS-936559, 아벨루맙(avelumab)(BAVENCIO^®), LY3300054, CX-072(Proclaim-CX-072)), FAZ053, KN035, MDX-1105 및 이들의 조합); 및 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 이필리무맙(ipilimumab)(YERVOY^®), 트레멜리무맙(tremelimumab)(티실리무맙(ticilimumab); CP-675,206), AGEN-1884, ATOR-1015 및 이들의 조합). 본 개시내용에 유용한 면역 체크포인트 억제제에 대한 추가 설명은 하기에 제공된다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 PD1 길항제와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 항-PD1 항체와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 니볼루맙과 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 펨브롤리주맙과 조합하여 대상체에게 투여된다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 PD-L1 길항제와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 항-PD-L1 항체와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 아테졸리주맙과 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 더발루맙과 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 아벨루맙과 조합하여 대상체에게 투여된다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 CTLA-4 길항제와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 항-CTLA-4 항체와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 이필리무맙과 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 트레멜리무맙과 조합하여 대상체에게 투여된다.

일부 측면에서, 항암제는 면역 체크포인트 활성화제(즉, 특정 면역 체크포인트 경로를 통한 신호 전달을 촉진함)를 포함한다. 일부 측면에서, 면역 체크포인트 활성화제는 OX40 작용제(예를 들어, 항-OX40 항체), LAG-3 작용제(예를 들어, 항-LAG-3 항체), 4-1BB(CD137) 작용제(예를 들어, 항-CD137 항체), GITR 작용제(예를 들어, 항-GITR 항체), TIM3 작용제(예를 들어, 항-TIM3 항체) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 추가 치료제는 사이토카인을 포함한다. 일부 측면에서, 사이토카인은 IL-2, IL-21, IL-7, IL-15 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 추가 치료제의 투여 전 또는 후에 대상체에게 투여된다. 다른 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 추가 치료제와 동시에 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물 및 추가적인 치료제는 약제학적으로 허용되는 담체 중의 단일 조성물로서 동시에 투여될 수 있다. 다른 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물 및 추가 치료제는 별개의 조성물로서 동시에 투여된다. 일부 측면에서, 추가 치료제 및 (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 순차적으로 투여된다.

일부 측면에서, (예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL 집단을 포함하는(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 나이브 TIL이 농축되어 있는)) 본 개시내용의 세포 조성물은 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-PD1 항체)와 조합하여 대상체에게 투여된다. 일부 측면에서, 상기 세포 조성물은 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-PD1 항체) 전에 투여된다. 일부 측면에서, 상기 세포 조성물은 체크포인트 억제제(예를 들어, 항-PD1 항체) 후에 투여된다.

일부 측면에서, 대상체는 상기 세포 조성물을 받기 전에 림프구 고갈 요법을 투여받는다. 임의의 림프구 고갈 요법이 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 림프구 고갈 요법은 화학요법을 포함한다. 일부 측면에서, 림프구 고갈 요법은 사이클로포스파미드를 포함한다. 일부 측면에서, 림프구 고갈 요법은 플루다라빈을 포함한다. 일부 측면에서, 림프구 고갈 요법은 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 포함한다. 일부 측면에서, 림프구 고갈 요법은 상기 세포 조성물 전 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일 또는 적어도 약 14일에 투여된다.

본원에 개시된 바와 같이, 본원에 개시된 세포 조성물(예를 들어, 본원에 개시된 방법에 따라 제조된 TIL의 집단을 포함함(예를 들어, CD8⁺ TIL, 줄기 유사 TIL, 종양 특이적 TIL 및/또는 순수 TIL이 강화됨)) 다양한 유형의 종양을 치료하는 데 사용할 수 있다. 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 특정 종양은 현재 이용 가능한 항암 치료(예를 들어, 상기 기술된 바와 같음)에 반응성이 낮다. 예를 들어, 일부 종양은 체크포인트 억제제에 반응하지 않는다. 본원에 사용된 용어 "불응성"은 치료에 반응하지 않는 질병 또는 병태를 지칭한다. 종양(예를 들어, "불응성 종양")을 기술하기 위해 용어가 사용되는 경우, 용어는 치료에 반응하지 않는 종양을 의미하며, 치료 시작 시 종양이 저항성이 있거나 치료 중에 종양이 저항성을 갖게 되는 상황을 포함한다.

따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 본원에 기재된 임의의 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양의 치료가 필요한 대상체에서 종양을 치료하는 방법에 관한 것이며, 본원에서 종양은 하나 이상의 체크포인트 억제제에 불응성이다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 체크포인트 억제제는 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 종양은 PD-1 길항제(예를 들어, 항-PD-1 항체)에 불응성이다. 일부 측면에서, 종양은 CTLA-4 길항제(예를 들어, 항-CTLA-4 항체)에 불응성이다. 일부 측면에서, 종양은 PD-1 길항제(예를 들어, 항-PD-1 항체) 및 CTLA-4 길항제(예를 들어, 항-CTLA-4 항체)에 불응성이다. 일부 측면에서, 종양은 TIM3 길항제(예를 들어, 항-TIM3 항체)에 대해 불응성이다. 일부 측면에서, 종양은 GITR 길항제(예를 들어, 항-GITR 항체)에 불응성이다. 일부 측면에서, 종양은 KIR 길항제(예를 들어, 항-KIR 항체)에 대해 불응성이다. 일부 측면에서, 종양은 LAG3 길항제(예를 들어, 항-LAG3 항체)에 대해 불응성이다. 일부 측면에서, 종양은 PD-1 길항제, B-raf 효소 억제제 및 MEK 단백질 억제제에 불응성이다. 일부 측면에서, 종양은 하나 이상의 PD-1 길항제, 방사선, B-raf 효소 억제제 및/또는 MEK 단백질 억제제에 불응성이다. 일부 측면에서, 종양은 하나 이상의 PD-1 길항제, 방사선 및/또는 종양용해성 바이러스에 불응성이다.

일부 측면에서, 본원에 기술된 세포 조성물 중 임의의 것을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양의 치료가 필요한 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 본원에서 종양은 PD-1 길항제에 불응성이다.

일부 측면에서, PD-1 길항제는 항-PD-1 항체이다. 일부 측면에서, PD-1 길항제는 당업계에 공지된 임의의 항-PD1 항체를 포함한다. 높은 친화도로 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, 인간 항체)는 미국 특허 번호 8,008,449 및 8,779,105에 개시되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다. 다른 항-PD-1 mAb는 예를 들어 미국 특허 번호 6,808,710, 7,488,802, 8,168,757 및 8,354,509, 및 PCT 공개 번호 WO 2012/145493에 기재되어 있으며, 이들 각각은 본원에 참고로 포함된다. 항-PD-1 항체의 추가 예에는 WO 2008/156712에 기술된 람브롤리주맙(MK-3475), 및 WO 2012/145493에 기술된 AMP-514가 포함되며, 이의 교시 내용은 이로써 본원에 참고로 포함된다. 추가로 공지된 항-PD-1 항체 및 다른 PD-1 억제제에는 WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335 및 WO 2011/161699에 기술된 것들이 포함되며, 이의 교시 내용은 이로써 본원에 참고로 포함된다. 일부 측면에서, 항-PD-1 항체는 WO 2006/121168에 기술된 단클론성 항체 5C4(본원에서는 니볼루맙 또는 BMS-936558로 지칭됨), 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3 및 5F4를 포함하며, 이에 대한 교시는 본원에 이로써 참조로 포함되어 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 항-PD-1 항체는 피딜리주맙(CT-011)이다. 임의의 이들 항체 또는 억제제와 경쟁하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편도 본 개시내용과 관련이 있다.

일부 측면에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙과 교차 경쟁한다. 일부 측면에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙과 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 측면에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙과 동일한 CDR을 갖는다. 일부 측면에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙이다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 이를 필요로 하는 대상체에서 니볼루맙에 불응성인 종양을 치료하는 방법에 관한 것이며, 본원에서 방법은 대상체에게 본원에 기재된 임의의 세포 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서 항 PD-1 항체는 펨브롤리주맙과 교차 경쟁한다. 일부 측면에서 항 PD-1 항체는 펨브롤리주맙과 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 측면에서 항 PD-1 항체는 펨브롤리주맙과 동일한 CDR을 가지고 있다. 일부에서는 항 PD-1 항체가 펨브롤리주맙이다. 펨브롤리주맙("키트루다^®", 램브롤리주맙 및 MK-3475라고도 함)은 인간 세포 표면 수용체 PD-1(프로그램된 사멸-1 또는 프로그램된 세포 사멸-1)에 작용하는 인간화 단일 클론 IgG4 항체이다. 펨브롤리주맙은 예를 들어 미국 특허 8,354,509호 및 8,900,587호에 설명되어 있으며, worldwideweb.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=695789(최종 접속: 2017년 5월 25일)에도 각각 참조로 통합되어 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 펨브롤리주맙에 불응성인 종양을 필요로 하는 대상체에서 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 대상체에 본원에 기재된 임의의 세포 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서 항 PD-1 항체는 MEDI0608과 교차 경쟁한다. 일부 측면에서 항-PD-1 항체는 MEDI0608과 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 측면에서 항 PD-1 항체는 MEDI0608과 동일한 CDR을 가지고 있다. 일부 측면에서 항 PD-1 항체는 단일 클론 항체인 MEDI0608(이전 AMP-514)이다. MEDI0608은 예를 들어, 미국 특허 8,609,089호 또는 worldwideweb.cancer.gov/drugdictionary?cdrid=756047(2017년 5월 25일 최종 접속)에 기술되어 있으며, 각 특허는 여기에 참조로 통합되어 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 MEDI0608에 불응성인 종양을 이를 필요로 하는 대상체에서 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 대상체에 본원에 기재된 세포 조성물 중 임의의 세포 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서 항 PD-1 항체는 BGB-A317과 교차 경쟁한다. 일부 측면에서 항 PD-1 항체는 BGB-A317과 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 측면에서 항-PD-1 항체는 BGB-A317과 동일한 CDR을 가지고 있다. 일부 측면에서 항 PD-1 항체는 인간화 단일 클론 항체인 BGB-A317이다. BGB-A317은 미국 공개 번호 2015/0079109에 기술되어 있으며, 이에 참조로 통합되어 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 BGB-A317에 불응성인 종양을 필요로 하는 대상체에서 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 대상체에게 본 명세서에 기재된 임의의 세포 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, PD-1 길항제는 항-PD-L1 항체이다. 일부 측면들에서, PD-1 길항제는 당업계에 공지된 임의의 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일부 측면에서, 인간 항-PD-L1 항체는 미국 특허 7,943,743호에 개시된 인간 항-PD-L1 항체 -그 내용이 본원에 참조로 통합되어 있음-가 본 개시내용의 범위 내에 있다. 이러한 항-PD-L1 항체에는 3G10, 12A4(BMS-936559라고도 함), 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 및 13G4가 포함된다. 기타 업계에서 인정되는 항-PD-L1 항체에는 예를 들어, 미국 특허 7,635,757호 및 8,217,149호, 미국 공개 번호 2009/0317368, PCT 공개 번호 WO 2011/066389 및 WO 2012/145493에 기술된 것들도 여기에 참조로 통합되어 있다. 항 PD-L1 항체의 다른 예로는 아테졸리주맙(테센트릭^®, RG7446) 또는 더발루맙(임핀지^®, MEDI4736) 등이 있다. PD-L1에 결합하기 위해 당업자가 인정하는 이들 항체 또는 억제제와 경쟁하는 항체 또는 이들의 항원 결합 단편도 본 개시와 관련이 있다.

일부 측면에서 항-PD-L1 항체는 BMS-936559(이전의 12A4 또는 MDX-1105)와 교차 경쟁한다(예를 들어, 미국 특허 제7,943,743호, WO 2013/173223 참조, 모두 본원에 참조로 통합됨). 일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 BMS-936559와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 BMS-936559와 동일한 CDR을 가지고 있다. 일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 BMS-936559이다. 따라서, 본 개시의 일부 측면은 BMS-936559에 불응성인 종양을 필요로 하는 대상체에서 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 대상체에게 본원에 기술된 임의의 세포 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 MPDL3280A(RG7446 및 아테졸리주맙으로도 알려져 있음)(예를 들어, Herbst 등 2013 J Clin Oncol 31(suppl):3000; 미국 특허번호 8,217,149 -모두 참조로 본원에 통합됨-을 참조), MEDI4736 (Khleif, 2013, In: Proceedings from the European Cancer Congress 2013; September 27-October 1, 2013; Amsterdam, The Netherlands. Abstract 802, 본원에 참조로 통합됨)와 교차 경쟁한다. 일부 측면에서 항-PD-L1 항체는 MPDL3280A와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 MPDL3280A와 동일한 CDR을 가지고 있다. 일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 MPDL3280A이다. 따라서, 본 개시의 일부 측면은 MPDL3280A에 불응성인 종양을 필요로 하는 대상체에서 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 대상체에게 본원에 기술된 임의의 세포 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 MSB0010718C(아벨루맙이라고도 함; 본 출원에 참조로 통합된 미국 2014/0341917참조) 와 교차 경쟁한다. 일부 측면에서 항-PD-L1 항체는 MSB0010718C와 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 MSB0010718C와 동일한 CDR을 갖는다. 일부 측면에서, 항-PD-L1 항체는 MSB0010718C이다. 따라서, 본 개시의 일부 측면은 이를 필요로 하는 대상체에서 MSB0010718C에 불응성인 종양을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 대상체에게 본원에 기재된 임의의 세포 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

일부 측면에서, 본원에 기술된 임의의 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양 치료가 필요한 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 종양은 CTLA-4 길항제에 불응성이다.

일부 측면에서, CTLA-4 길항제는 항-CTLA-4 항체이다. 일부 측면에서, CTLA-4 길항제는 당업계에 공지된 항-CTLA-4 항체를 포함한다. 예를 들어, 높은 친화력으로 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 인간 항체는 미국 특허번호 6,984,720 및 7,605,238에 공개되었으며, 각각은 본원에 참조로 통합된다. 항-CTLA-4 항체의 추가적인 예는, 예를 들어 미국 특허 5,977,318, 6,051,227, 6,682,736 및 7,034,121에 기술되어 있으며, 각각은 참조로 본원에 통합된다. 본 개시내용의 범위 내에 있는 항-CTLA-4 항체의 다른 비제한적인 예는 MK-1308(Merck) 및 AGEN-1884(Agenus Inc., WO 2016/196237 참조)를 포함한다. 본 개시내용과 관련된 항-CTLA-4 항체는 또한 인간 CTLA-4에 특이적으로 결합하고 본원에 개시된 하나 이상의 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 이필리무맙, 트레멜리무맙, MK-1308 또는 AGEN-1884)와 동일한 에피토프 영역에 결합하기 위해 교차 경쟁하고/하거나 결합하는 단리된 항체를 포함한다.

일부 측면에서 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙과 교차 경쟁한다. 일부 측면에서 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙과 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 측면에서 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙과 동일한 CDR을 가지고 있습니다. 일부 측면에서 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙이다. 이필리무맙(10D1이라고도 하며 YERVOY^®로 판매)은 CTLA-4와 B7 리간드의 결합을 차단하는 완전 인간 IgG1 단일 클론 항체이다. 이필리무맙은 미국 특허 제 6,984,720호에 자세히 설명되어 있으며, 본원에 참조로 통합되어 있다. 따라서, 본 개시내용의 일부 측면은 이필리무맙에 불응성인 종양을 필요로 하는 대상체에서 치료하는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 대상체에게 본원에 기술된 임의의 세포 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.

적어도 상기 개시로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 본원은 본원이 필요로 하는 대상체에서TIM3 길항제(예를 들어, 항-TIM3 항체)에 불응성인 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 본원에 기재된 세포 조성물 중 임의의 것을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면들에서, 본 명세서는, 본 명세서에 기술된 세포 조성물 중 임의의 것을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, GITR 길항제(예컨대, 항-GITR 항체)에 불응성인 종양을 치료하는 방법을 필요로 하는 대상체에서 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명은 본 발명이 필요로 하는 대상체에서 KIR 길항제에 불응성인 종양을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 본 발명에 기술된 세포 조성물 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명은 본 발명이 필요로 하는 대상체에서 LAG3 길항제에 불응성인 종양을 치료하는 방법으로서, 본 발명에 기술된 세포 조성물 중 임의의 것을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

상기에서 기술한 임의의 치료 방법에 대해, 일부 측면에서 종양은 재발된다. 일부 측면에서 종양은 전이성이다. 일부 측면에서, 종양은 재발성이고 전이성이다.

본원에 기술되고 입증된 바와 같이, 일부 측면에서, 본원에 기술된 배양 과정(예를 들어, MRM에서 세포를 확장 및 배양하는 것)은 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제에 불응성인 종양의 TIL의 하나 이상의 특성을 개선할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본원에 기술된 MRM 공정을 사용하여 이러한 TIL을 배양하면 TIL의 줄기세포능을 증가시킬 수 있다(즉, TIL은 배양 전 TIL에 비해 및/또는 비 MRM 공정을 사용하여 배양된 상응하는 TIL에 비해 줄기와 더 유사함). 일부 측면에서, MRM 공정으로 배양한 후, 불응성 종양으로부터의 TIL의 줄기세포능은 기준 TIL과 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100% 증가한다(예를 들어, MRM 공정으로 배양하기 전의 TIL 및/또는 비-MRM 공정을 사용하여 배양된 상응하는 TIL). 일부 측면에서, MRM 공정으로 배양한 후, 불응성 종양으로부터의 TIL의 줄기세포능은 참조 TIL과 비교하여 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 또는 적어도 약 50배 증가한다. 따라서, 본 개시내용으로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 본원에 기술된 MRM 과정은 이전에 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제로 치료받은 종양으로부터 TIL의 줄기세포능을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.

TIL의 줄기세포능을 측정하는 예시적인 방법은 본 개시내용의 다른 곳에서 제공된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 줄기세포능은 하나 이상의 줄기 유사 마커, 예를 들어 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+, CD39-, CD69- 또는 그 조합의 발현을 결정함으로써 측정될 수 있다. 일부 측면에서, TIL의 줄기세포능은 TIL 상의 CD39 및 CD69의 발현을 측정함으로써 측정될 수 있다. 본 개시내용의 다른 곳에서 추가로 기술된 바와 같이, 줄기 유사 세포는 CD39- 및 CD69-이다. 따라서, 일부 측면에서, MRM 공정으로 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제에 불응성인 종양으로부터 TIL을 배양한 후, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 또는 적어도 약 70% 확장된 TIL은 CD39- 및 CD69-이다.

실시예

실시예 1. 방법

배지 제조: T 세포 배양액(TCM)에 면역 세포 혈청 대체물(Thermo Fisher), 2mM L-글루타민(Gibco), 2mM 글루타맥스(Gibco), MEM 비필수 아미노산 용액(Gibco), 나트륨 피루베이트(Gibco), IL-2, 200IU/mL; IL-7, 120IU/ml; IL-15, 20IU/ml를 보충하였다.

저장성 배양액의 경우, 다양한 농도의 나트륨, 칼륨, 글루코스 및 칼슘을 함유하는 TCM 배지에 NaCl, 글루코스 및 칼슘 비함유 RPMI를 첨가하여 조정하였다. 정의된 NaCl 비함유 RPMI를 TCM에 첨가한 후, 최종 농도는 다음과 같은 범위였다: NaCl(40-80mM), KCl(40-80mM), 칼슘(0.5-2.8mM), 글루코스(10-24mM) 및 삼투질농도(~250-260mOsmol). 표 1 참조.

또한, 다양한 칼륨 농도로 일정한 장성 조건(250mOsmol - 저장성, 280mOsmol - 등장성, 320mOsmol - 고장성)을 유지함으로써 T 세포에 대한 장성 효과를 테스트하였다. 저장성 조건에서의 최종 농도 NaCl(35-75mM), KCl(50-90mM), 등장성 조건에서의 최종 농도 NaCl(50-90mM), KCl(50-90mM), 고장성 조건에서의 최종 농도 NaCl(70-110mM), KCl(50-90mM). 표 2 참조.

세포 배양 및 형질도입: 건강한 공여자의 동결보존된 인간 CD4 및 CD8 세포를 T 세포 배양액-TCM, 기초 배지 또는 저장성 배양액에서 TransAct(Miltenyi)로 활성화시켰다. TCM, 기초 배지 또는 저장성 배양액에서 24시간 활성화한 후, T 세포를 Grex 플레이트(Wilson Wolf)에서 렌티바이러스 입자로 형질도입하여 키메라 항원 수용체(항-CD19 CAR)를 도입하였다. 형질도입 다음 날, T 세포에 신선한 배지를 보충하여 TransAct를 희석하고 T 세포 활성화를 종료하였다. 세포 성장 및 밀도에 따라, T 세포는 Grex 플레이트에서 배지의 절반을 흡입하여 따뜻한 2X 사이토카인 배지로 공급되었다. 7일째에, 세포를 수확하고, 계수하고, 유세포분석으로 줄기세포능 마커의 발현에 대해 분석하였다.

세포 내 사이토카인 검정: 7일째에, T 세포를 세척하고 대조군 배지에 넣고 브레펠딘(brefeldin) A의 존재하에 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myrystate acetate, PMA) 및 이오노마이신(ionomycin)으로 5시간 재자극시켜 세포 내 사이토카인, IL-2, IFNγ 및 TNFα를 측정하였다. FACS 버퍼 함유 고정 가능한 살아있는/죽은 용액에서 표면 항체 염색으로 T 세포를 염색하였다. 고정 및 투과화 후 세포 내 사이토카인에 대한 각각의 항체로 세포를 염색하였다. 세포 내 사이토카인 발현의 정량화는 유세포분석을 사용하여 평가하였다.

유세포분석을 통한 줄기세포능 표현형 CAR 발현 측정: 7일째에, 각각의 처리로부터의 살아있는 T 세포를 유세포분석을 통해 평가하였다. 세포를 먼저 세포 염색 버퍼로 세척하고 37℃에서 15분 동안 항-CCR7로 염색하였다. 그 다음, 몇 가지 다른 항원에 대한 항체의 2x 마스터 믹스(아래에 자세히 설명됨)를 세포에 첨가하고 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세포 염색 버퍼로 세척하고 제조업체의 프로토콜에 따라 foxp3 염색 키트(ebioscience)로 투과화하였다. 고정 후, 세포를 4℃에서 20분 동안 TCF7에 대해 염색한 다음, 세포를 aurora(cytek)에서 유세포분석으로 분석하였다. 다음은 줄기세포능 마커를 평가하는 데 사용되는 항체 목록이다: CD8(BD-#563795), CD4(BD-#612936), CD27(BD-#612829), CD3(Thermo-#612893), CD28(Biolegend-#302936), CD62L, CAR-EGFR(Thermo-#352911), CD45RO(BD#564290), CD39(Biolegend-#328236), TCF7(Cell signaling-#14456), CCR7(BD-#562381), CD127(Bio legend-#351324), CD45RA(BD-#560673).

실시예 2. 배지 제조 방법 및 TIL 배양 방법

대조군 배지: 시판되는 T 세포 배지(예를 들어, CTS™ OPTIMIZER™, IMMUNOCULT™ 또는 TEXMACS™).

대사 재프로그래밍 배지("MRM"): NaCl 비함유 T 세포 배지를 사용하여 T 세포 배지의 무기염 이온 농도를 조정하였다. MRM의 최종 농도는 다음과 같다: NaCl(40-80mM), KCl(40-90mM), 칼슘(0.5-2.8mM), 글루코스(10-24mM) 및 삼투질농도(~250-340mOsmol).

초기 배양과 2차 및 최종 TIL 확장에 사용되는 TIL 배지 제조: 대조군 배지 또는 MRM에 2.5% 혈청 보충제(CTS™ Immune Cell SR, Thermo Fisher), 2mM L-글루타민(Gibco), 2mM L-글루타맥스(Gibco), MEM 비필수 아미노산 용액(Gibco), Pen-strep(Gibco), 20μg/ml FUNGIN™(InvivoGen), 나트륨 피루베이트(Gibco) 및 1mM O-아세틸- L-카르니틴 하이드로클로라이드(Sigma)를 보충하였다.

초기 TIL 배양: 도 1은 본원에 기술된 TIL 배양 방법의 특정 측면을 일반적으로 도시하는 개략도이다. 평균 크기가 1-10㎣인 다양한 종양 유형(결장, 폐, 간세포 암종, 신장, 췌장, 유방, 흑색종 및 전립선)으로부터 외과적으로 절제된 다수의 종양을 IL-2(300ng/mL) 및 IL-21(30ng/ml)이 보충된, 상술한 바와 같은 대조군 배지 또는 MRM 2ml에 24웰 플레이트에서 시딩하였다. 콜로니 형성이 보일 때까지 5% CO₂가 있는 37℃ 인큐베이터에서 열 재킷 인큐베이터 내에 종양 단편을 배양하였다. IL-2(300ng/mL) 및 IL-21(30ng/ml)이 보충된 신선한 배지(대조군 또는 MRM)를 세포 성장에 따라 3일마다 보충하였다. 이 방법은 초기 배양이 끝날 때 단편당 약 2×10⁶-10×10⁶개의 세포의 수율을 초래하였다. 분석을 위한 세포의 하위세트를 40μm 스트레이너에 통과시키고 CD62L, CD27, CD28, CD45RO, CD39, TIM3, CD127, PD1, CD103, CD45RA 및 TCF7을 포함한 다양한 바이오마커를 사용하여 다색 유세포분석으로 표현형을 결정하였다.

2차 TIL 확장: 초기 배양으로부터의 세포 수율이 배양된 단편당 약 2×10⁶-10×10⁶개의 세포에 도달했을 때(보통 약 14일 내지 19일), IL-2(73.6ng/ml), IL-21(10ng/ml) 및 IL-15(0.4ng/ml)가 보충된 대조군 배지 또는 MRM에서 배양된 TIL에 1:100 T 세포 TRANSACT™(Miltenyi Biotec), 5μg/ml의 재조합 인간 CD27 리간드(R&D systems) 및 1μg/ml의 재조합 인간 4-1BB 리간드/TNFSF9(R&D systems)를 첨가하여 자극하였다. 약 5×10⁷ 내지 20×10⁷개의 세포를 얻을 때까지(자극 후 약 7 내지 11일) 세포를 배양물에서 유지하였다. 2차 확장 기간의 종료 시 TIL은 CD62L, CD27, CD28, CD45RO, CD39, TIM3, CD127, PD1, CD103, CD45RA 및 TCF7을 포함한 다양한 바이오마커를 사용하여 다색 유동세포분석으로 분석하였다. 살아있는 세포와 CD3⁺ 세포만 분석하였다.

최종 TIL 확장: 배양물이 약 5×10⁷ 내지 20×10⁷개의 세포 수율에 도달했을 때, 대조군 배지 또는 MRM에서 배양된 TIL을 IL-2(73.6ng/ml), IL-21(10ng/ml) 및 IL-15(0.4ng/ml)가 보충된 새로운 대조군 배지로 옮겼다. TIL을 1:100 TRANSACT™(Miltenyi Biotec), 5μg/ml의 재조합 인간 CD27 리간드(R&D systems) 및 1μg/ml의 재조합 인간 4-1BB 리간드/TNFSF9(R&D systems)로 두 번째 자극하였다. 세포를 단편당 약 10×10⁹-100×10⁹개의 세포 수율이 달성될 때까지(약 14일) 정적 GREX 또는 교반 탱크에서 배양하였고, CD62L, CD27, CD28, CD45RO, CD39, TIM3, CD127, PD1, CD103, CD45RA 및 TCF7을 포함한 다양한 바이오마커에 대해 다색 유동세포분석으로 분석하였다. 세포의 다기능성을 확인하기 위해, 생성된 TIL을 PMA/이오노마이신(1:500)으로 4시간 동안 자극하고 다음 마커를 사용하여 세포 내 염색을 수행하였다: CD4, CD8, CD27, IL2, IFNγ, TNFα 및 TCF7. 살아있는 세포와 CD3⁺ 세포만 분석하였다.

실시예 3. MRM은 CD8+, 종양 반응성, 덜 분화된 TIL의 확장을 초래한다

실시예 1에 기술된 바와 같이 TIL을 성장시켰다(도 1). 초기 TIL 배양(즉, 14일) 후, 세포 배양물에 존재하는 CD4⁺ 및 CD8⁺ TIL의 백분율을 정량화하기 위해 멀티파라미터(multiparameter) 유세포분석을 수행하였다. MRM에서 배양된 세포는 대조군 배지에서 배양된 세포와 비교하여 CD8⁺ TIL이 ~20-80%까지 상당히 농축되었다(도 2a-2c 및 데이터는 나타내지 않음). CD4⁺ TIL이 고형 종양을 박멸할 수 있지만 종양에 대한 우수한 세포용해 활성은 주로 CD8⁺ TIL에 의해 매개된다. 종양 세포는 CD8⁺ TIL에 의해 인식되는 MHC 클래스 Ⅰ 관련 종양 항원을 주로 발현한다. 따라서, TIL 요법 주입 생성물에서 CD8+ TIL 비율이 더 큰 것이 치료적으로 유익하다. TIL을 배양하기 위한 MRM의 사용은 대조군 배지에서 배양된 TIL과 비교하여 예상외로 CD8+ TIL을 농축시켰다(도 2c).

또한, MRM에서 초기 배양 종료 시(약 14일) 얻은 TIL은 종양 반응성 TIL의 여러 세포 표면 마커(예를 들어, CD39, CD103, CD226 및/또는 PD1)의 일관된 발현을 입증하였다. MRM에서의 초기 배양은 대조군 배지에서 배양된 TIL과 비교하여 CD39 및 PD1의 발현이 강화된(20% 초과) TIL을 생성하였다(도 2a-2b). 이전에 사용된 방법은 초기 TIL 배양 동안 PD1 하위세트에서 PD1 발현이 완전히 손실됨을 보여주며, 이는 종양 반응성 TIL의 바람직하지 않은 손실을 나타낸다(예를 들어, Poschke 등, Oncoimmunology 5(12):e1240859 (2016); 및 Gros 등, JCI 124(5):2246-59 (2014) 참조). T 세포 자극 후 PD1 발현의 유지가 공여자에 의존한다는 것을 관찰하였다(데이터는 나타내지 않음). CD39 및 CD103을 포함하는 종양 반응성의 다른 마커의 발현에 대해서도 유사한 결과를 얻었다(도 2a-2b 및 5a-5b 참조, 데이터는 나타내지 않음). 그러나 14일째에 관찰된 클론 레퍼토리는 전체 TIL 과정에 걸쳐 유지된다(데이터는 나타내지 않음).

MRM에서 배양된 CD4⁺ 및 CD8⁺ TIL 둘 다에서 PD1(종양 반응성 대사 상태를 나타냄) 및 CD27의 동시 발현도 관찰하였다(도 3a-3e). 나이브한 기억 수임 T 세포(memory committed T-cell)에서 구성적으로 발현되는 CD27 발현은 T 세포에서 줄기 유사 표현형을 나타낸다. 이전 보고서는 T 세포 자극 후 세포 확장 동안 CD8⁺ T 세포에서 CD27 발현이 감소함을 나타낸다(예를 들어, Tran 등, J. Immunotherapy 31(8):742-51(2008); 및 Rosenberg 등, Clinical Cancer Research 17(13):4550-557(2011), Huang 등, J. Immunology 176(12):7726-35(2006) 참조). 대조적으로, 본원에 개시된 MRM에서 배양된 TIL은 배양 과정 전반에 걸쳐 CD27 발현을 보존하여 줄기 유사 종양 반응성 클론의 선택적 확장을 가능하게 한다. 예상대로, 14일째에 모든 CD27⁺ 세포가 PD1을 공동 발현하는 것은 아니었으며, 이는 모든 줄기 유사 세포가 종양 반응성 대사 상태를 나타내지 않았음을 나타낸다.

TIL의 항종양 기능 및 생존은 TCR, 사이토카인 및 공동자극 수용체에 의해 수신되는 통합된 신호에 의존한다. 이러한 신호 중 임의의 것의 부적절한 노출은 TIL의 아네르기와 위축(atrophy)을 초래한다. TIL을 배양하고 확장하는 이전에 사용된 방법은 TIL에서 CD27 발현의 손실을 초래한다. 그러나 주입 생성물에서, 예를 들어, 최소로 확장된 TIL에서 CD27 발현을 유지하는 TIL은 입양 T 세포 요법 후 종양 퇴행과 관련이 있는 것으로 나타났다(예를 들어, Tran 등, J. Immunotherapy 31(8):742-51(2008); 및 Rosenberg 등, Clinical Cancer Research 17(13):4550-557(2011) 참조). 또한, 공동자극 수용체, 예를 들어, CD27 및 CD28의 상승된 발현은 생체 내 치료 효능과 관련이 있다(Tran 등, J. Immunotherapy 31(8):742-51(2008), Geltink 등, Cell 171, 385-397(2017)). 이러한 공동자극 수용체의 발현은 미성숙 TIL 배양과 상관관계가 있는 줄기세포능 및 더 긴 말단소체(telomere) 길이와도 관련이 있다. 이전에 사용된 방법, 예를 들어, 대조군 배지와는 대조적으로, 본원에 기술된 MRM의 사용은 CD27 및 CD28 발현이 있는 TIL을 여러 종양 유형에 걸쳐 총 TIL 수의 약 20% 내지 약 80%까지 농축시켰다(도 4, 데이터는 나타내지 않음). CD27 및 CD28의 농축은 CD8⁺ T 세포 하위세트에 대해 고유하지 않았고 CD4⁺ 하위세트에서도 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).

CD27 및 CD62L의 발현은 덜 분화된 T 세포와 상관관계가 있으며 종양 조직 및 림프절로의 T 세포의 효율적인 트래피킹(trafficking)과 관련이 있다. CD27, CD28 및 CD62L의 발현은 더 긴 말단소체 길이와도 연결되며, 이는 TIL의 수명 및 생체 내 치료 효능과 간접적으로 연결된다(예를 들어, Tran 등, J. Immunotherapy 31(8):742-51(2008); 및 Rosenberg 등, Clinical Cancer Research 17(13):4550-557(2011) 참조). 그러나 본원에 개시된 바와 같이 MRM에서 배양된 TIL은 최소로 배양된 TIL과 유사하게 과정 전반에 걸쳐 CD27 및 CD62L 발현 둘 다 유지하였다. 대조군 배지에서 배양된 것과 비교하여 MRM에서 배양된 TIL에서 CD27 및 CD62L 발현이 ~50% 증가하는 것을 관찰하였다(데이터는 나타내지 않음).

면역 체크포인트 차단 후 종양 퇴행을 매개하는 종양 반응성 클론은 PD1 및 전사 인자 TCF-7을 발현하는 CD8⁺ T 세포에서 유래되는 것으로 여겨진다(Im 등, Nature 537:417-21(2016); 및 Feldman 등, Cell 175(4):998-1013(2018)). 본원에 개시된 MRM에서 배양된 TIL은 동시에 4배 내지 50배 더 높은 수준의 TCF7 발현과 함께 종양 반응성 TIL 바이오마커(PD1 및 CD103)의 농축을 나타냈다(도 5a-5c, 6d, 6h, 10). TCF7의 발현은 더 많은 줄기 유사 세포를 나타낸다. PD1의 발현에도 불구하고 이들 세포는 증식 능력을 유지하였고 추가 자극 시 덜 분화된 세포를 유지하였다(도 6a-6h).

실시예 4: MRM은 TIL의 종양 반응성을 보존한다

종양은 본질적으로 이질적이며 종종 KRAS, P53 및 BRAF(공개 신생항원(public neoantigen))와 같은 유전자에 공통적인 돌연변이를 함유한다. 본원에 개시된 바와 같은 MRM을 사용하는 방법은 이러한 신생항원을 인식하는 TIL을 농축시킨다.

KRAS^G12V, KRAS^G12C 및 KRAS^G12D 돌연변이를 갖는 종양 세포를 주로 갖는 암인 췌장 선암종 환자로부터 종양을 절제하였다. 위에서 언급한 KRAS 핫스팟 돌연변이의 HPLC 정제된 9mer, 10mer 및 25mer 펩티드를 정제하여 환자와 일치하는 말초 혈액 단핵구로부터 생성된 미성숙 수지상 세포(DC)를 펄싱하는 데 사용하였다. 이들 펩티드 풀 펄싱된 DC를 동일한 췌장 선암종 환자로부터 얻은 TIL과 함께 공동 배양하였고 상기 실시예에 기술된 방법에 따라 배양하였다. MRM에서 TIL의 배양은 CD27, CD28, PD1 및 TCF-7의 유의한 동시발현과 함께 약 30% 더 많은 CD8⁺ T 세포를 생성하였다(도 7a-7h). 이러한 결과는 본원에 개시된 MRM이 공개 항원을 인식하는 종양 반응성 TCR 클론을 보존함을 나타낸다.

예상대로, 야생형 KRAS 펩티드로 펄싱된 TIL은 KRAS 특이적 TIL의 특이적 확장을 초래하지 않았다. 그러나 MRM에서 배양된 TIL에 의한 CD27, CD28, PD1 및 TCF7 발현의 증가된 발현을 지속적으로 관찰하였다. 이러한 결과는 MRM에서의 세포 배양이 희귀한 공개 신생항원을 인식하는 TIL의 성장 및 증식을 보존함을 나타낸다(도 8a-8h).

종양 반응성과 관련된 마커(CD39 및 PD1) 및 CD8⁺ TIL의 우선적인 강화는 이러한 확장 과정 동안 유지되었다(도 9a-9b). 이러한 결과는 MRM이 초기 배양 후에도 종양 반응성 TIL에서 PD1 발현을 추가로 강화한다는 것을 보여준다. 또한, 본원에 개시된 방법에 따라 MRM에서 배양된 TIL은 qPCR로 측정했을 때 TCF7 발현이 50배 넘게 증가한 것으로 나타났다(도 10). 이러한 데이터는 재자극 후 TIL의 자가 재생 및 증식 폭발에 필요한 마스터 전사 조절자(master transcriptional regulator)인 TCF7의 역할과 일치한다.

TIL에서 CD103의 발현은 돌연변이 항원 부하가 높은 종양에서 TIL 침윤과 상관관계가 있는 것으로 보고된다. CD39 및 PD1 발현에 더하여, 데이터는 MRM에서 TIL의 확장이 PD1⁺CD39⁺CD103⁺ 세포의 수를 증가시키면서(도 11a-11L) 줄기세포능 관련 유전자의 발현도 증가시킨다는 것을 입증하였다. 따라서, MRM에서 TIL의 배양은 생성된 확장된 세포 생성물에서 종양 반응성 및 더 높은 비율의 줄기 유사 세포를 가진 세포의 수를 증가시키기에 충분할 수 있다.

본원에 제시된 데이터는 MRM에서 TIL의 확장이 줄기세포능이 증가할 뿐만 아니라 종양 반응성과 관련된 여러 세포 표면 마커의 발현이 증가된 세포 집단을 생성함을 입증한다. MRM을 사용하는 본원에 기술된 방법은 개선된 치료제의 특징 및 특성을 지닌 TIL을 생성한다.

실시예 5. 치료 방법

주입에 사용되는 TIL은 원발성 또는 전이성 종양 또는 림프절로부터 절제된 환자의 종양에서 유래된다. TIL 배양은 실시예 1에 상술된 바와 같이 MRM을 함유하는 24개의 웰 플레이트에 작은 종양 단편(~1-10㎣)을 플레이팅함으로써 개시된다. 이들 단편은 약 2×10⁶ 내지 약 10×10⁶개의 세포/종양 단편이 수득될 때까지 성장한다(전형적으로 약 2-3주). 모든 단편으로부터 생성된 세포를 풀링하고 T 세포 자극을 위해, 예를 들어, TRANSACT™ 및 선택적으로 CD27 작용제, 41BB 작용제 및/또는 OX-40 작용제를 첨가함으로써 2×10⁶/웰의 밀도로 플레이팅한다. 세포는 약 5×10⁷ 내지 약 20×10⁷개의 세포를 얻을 때까지 배양물에서 유지한다. 이들 세포는, 예를 들어, TRANSACT™ 및 선택적으로 CD27 작용제, 41BB 작용제 및/또는 OX-40 작용제를 사용하여 추가로 자극하여 주입 생성물을 위한 세포 수의 약 1000-2000배 증가(~1-150×10⁹개의 TIL)를 달성한다.

TIL 주입 생성물의 투여 전에, 환자에게, 예를 들어, 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 포함하는 림프구 고갈 치료가 투여된다. TIL 주입에 더하여, 환자는 본원에 개시된 바와 같이 배양된 TIL 주입 후 항-PD1 체크포인트 억제제(예를 들어, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)도 받을 수 있다.

실시예 6. 클론 다양성의 분석

MRM에서 배양된 TIL의 클론 다양성을 평가하기 위해, 상기 개시된 방법에 따라, 종양 단편 및 종양 단편으로부터 얻은 TIL을 대조군 배지 또는 대사 재프로그래밍 배지(MRM)에서 배양하였다. 전체 게놈 DNA를 DNeasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN)를 사용하여 종양 및 TIL 샘플로부터 단리하고 TCRβ 및 CDR3 영역에 대해 Immuno-seq(Adaptive Biotechnologies, Seattle, WA)를 사용하여 시퀀싱하였다.

샘플의 다양성 측정기준는 심슨 클론성 √∑pi2로 평가하였으며, 여기서 pi는 주어진 샘플에서 클론 i의 비례 풍부도이다. 심슨 클론성 및 생산적인 재배열을 종양 단편("종양"), 대조군 배지에서 배양된 TIL("대조군") 및 MRM에서 배양된 TIL("MRM")에서 조사하였다(도 12). MRM에서 배양된 TIL(확장 후)은 대략 0.04의 심슨 클론성을 나타냈으며, 이는 종양 단편에서 보이는 것과 유사하게 높은 클론 다양성을 나타낸다(도 12). TCRβ 다양성의 유지는 종양에 침투했고 종양 반응성인 TIL 클론형의 보존을 나타낸다. 대조적으로, 대조군 배지에서 배양된 TIL은 클론 다양성을 상당히 상실하고 대략 0.4의 심슨 클론성을 나타냈다(즉, 상당히 덜 다양한 클론성을 나타내며, 이는 대조군 배지를 사용하는 배양 과정에서 많은 종양 반응성 클론이 손실됨을 나타냄)(도 12).

차등 풍부도(DA) 플롯을 도 12에 제시된 데이터를 사용하여 생성하였다(ImmunoSeq, Adaptive Biotechnolgies). 이러한 DA 분석은 임의의 샘플 쌍에 대해 TCR 중복(예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 Emerson 등, J. Path.(2013) 참조), 모리시타 지수(Morisita's Index) 및 자카드 지수(Jaccard Index)를 계산한다. 이들 플롯은 종양 대 MRM에서 확장된 TIL(도 13b)과 비교하여 종양 대 대조군 배지에서 확장된 TIL(도 13a) 사이에서 클론의 차등 풍부도가 상당히 상이하다는 것을 보여준다.

종양 단편에 존재하는 TIL 레퍼토리는 대조군 배지에서 배양된 TIL과 비교하여 MRM 공정에서 배양된 TIL에서 대략 4배 더 많이 나타났다. 확장 시 TIL은 전형적으로 우선적인 증식 가능성을 갖는 드문 클론형에 의해 성장하지 않는다(이러한 클론은 도 13a-13b에서 y-축을 따라 확장된 것으로 나타남). 대조적으로, MRM에서 배양된 TIL은 종양에 존재하는 더 넓은 클론형 레퍼토리의 훨씬 더 나은 보존 및 확장을 보였다. TIL 집단의 클론 다양성의 보존 및 확장은 효과적인 치료를 위한 최적화에 중요하다.

TIL 클론 다양성을 추가로 분석하기 위해, 초기 종양 분해물에서 상위 50개의 가장 우세한 일반적인 TCR을 대조군 배지 대 MRM에서 확장된 TIL과 비교하였다. MRM에서의 배양은 우세한(즉, 일반적인) TIL 클론형 및 희귀 TIL 클론형을 둘 다 보존한다. 도 13d에서 선의 밀도는 MRM에서 확장된 대부분의 T 세포 클론이 종양 항원을 인식하지만 대조군 배지에서 배양된 T 세포 클론에서는 인식하지 않는다는 것을 보여준다(도 13c). 우세한 종양 클론의 대부분은 대조군 배지에서 배양된 T 세포 클론(도 13c)과 비교하여 도 13d의 점선 위의 연결에 의해 표시된 바와 같이 MRM에서 확장된 T 세포 클론에 의해 인식된다. 상위 50개의 우세한 종양 TCR 중에서, MRM에서 배양된 TIL에서의 57%(도 13d)와 비교하여 대조군 배지에서 배양된 TIL에서 2%가 보존된다(도 13c). 이러한 데이터는 MRM 확장된 TIL이 대조군 배지에서 확장된 TIL보다 초기 종양 TCR 클론형의 더 충실한 표현을 유지함을 입증한다.

실시예 7. MRM은 TIL의 종양 반응성을 보존한다

KRAS 돌연변이체 반응성을 보존하기 위해 본원에 기술된 방법을 사용하여 생성된 TIL의 능력을 평가하였다. 대조군 배지 또는 MRM에서 확장된 TIL을 돌연변이체 KRAS 펩티드로 펄싱된 자가 수지상 세포(DC)와 혼합하였다. 10일 후 총 게놈 DNA를 DNeasy Blood and Tissue Kit(Qiagen)를 사용하여 TIL로부터 단리하고 TCR-Vb CDR3 모티프를 시퀀싱하고 TCRβ 및 CDR3 영역에 대해 Immuno-seq(Adaptive Biotechnologies, Seattle, WA)를 사용하여 분석하였다. 도 14는 MRM에서 배양된 TIL이 KRAS 돌연변이체 반응성을 보존하는 반면, 대조군 배지에서 배양된 TIL은 그렇게 할 수 없음을 보여준다. 구체적으로, MRM에서 배양된 TIL은 종양 단편의 TIL에서 볼 수 있는 유사한 CDR3 아미노산 모티프를 공유하였다. 이들은 대조군 배지에서 배양된 TIL에서는 검출되지 않았다. 따라서, 본 데이터는 MRM에서의 배양이 원래 종양 단편에서 나타나는 TIL 클론형을 보존한다는 것을 보여준다.

실시예 8. MRM을 사용하여 생성된 TIL은 증가된 종양 인식 및 종양 살해를 나타낸다

흑색종 종양으로부터 TIL을 얻고 상술된 바와 같이 대조군 배지 또는 MRM으로 확장시켰다. 자가 종양 세포주는 TIL과 동일한 흑색종 샘플에서 유래되었다. 간단히 말하면, 흑색종 단편을 효소적으로 분해(콜라게나제 및 DNAse 사용)하고, 생성된 단일 세포 현탁액을 플레이팅한 다음, 성장하는 세포를 연속적으로 계대배양함으로써 흑색종 세포주를 생성하였다. 흑색종 유래 세포주에 반응하여 염증성 사이토카인을 생성하는 흑색종 종양에서 유래된 TIL의 능력을 평가하였다. 대조군 배지 또는 MRM을 사용하여 생성된 TIL을 자가 흑색종 세포주와 24시간 동안 공동 배양하였다. 자가 흑색종 세포주로부터의 100,000개의 종양 세포를 300ul의 완전 RPMI 배지(w/10% FBS)에 48웰 플레이트에서 플레이팅하고 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 상청액을 제거하고 TIL을 첨가하였다(일부 TIL은 대조군으로서 종양 세포의 부재하에 플레이팅하였다). 24시간 후, 웰로부터 배지 상청액을 수집하고 분비된 인터페론 감마 및 TNF-알파를 MSD를 사용하여 측정하였다. 또한, MRM으로 생성된 TIL을 대조군 배지에서 밤새 인큐베이션하고 IL-2 분비를 MSD로 평가하였다. 이러한 데이터는 MRM을 사용하여 확장된 TIL이 염증성 사이토카인 생성 측면에서 자가 종양 세포에 반응하는 상당히 증가된 능력을 나타냄을 보여준다(도 15a-15b). 또한, MRM을 사용하여 생성된 TIL은 자극 없이 정상 상태에서 훨씬 더 많은 IL-2를 분비하며 이는 이러한 세포가 더 적합하다는 것을 나타낸다.

흑색종 유래 세포주를 살해하는 흑색종 종양에서 유래된 TIL의 능력도 평가하였다. 공동 배양 후 남아있는 살아있는 종양 세포의 수는 트립신으로 종양 세포를 분리하고 유세포분석으로 살아있는 세포를 계수함으로써 평가하였다. 이러한 살아있는 종양 세포 수에 기초하여, TIL에 의한 종양 살해 백분율(TIL 공동 배양을 경험하지 않은 종양 세포의 웰로 정규화됨)을 계산하였다. MRM을 사용하여 생성된 TIL은 종양 세포를 살해하는 상당히 우수한 능력을 보여준다(도 15c).

상기 실험을 상술된 바와 같이 반복하였지만, HLA 클래스 Ⅰ 상호작용을 차단하기 위해 일부 웰을 W6/32 항체로 처리하였다. 도 15d는 클래스 Ⅰ 차단이 인터페론 감마 생성의 증가를 제거하기 때문에 MRM을 사용하여 생성된 TIL에 의한 자가 종양 세포의 인식이 HLA 클래스 Ⅰ 상호작용에 의존한다는 것을 입증한다.

실시예 9. 생체 외 종양 세포의 TIL 클리어런스

환자 자가 흑색종 종양 세포를 xCELLigence 임피던스 검정 웰 플레이트에 10,000개의 세포/웰로 플레이팅하였다. 다음날, 대조군 배지 또는 MRM에서 확장된 일치하는 TIL을 1:1, 2:1 및 4:1을 포함하는 다양한 이펙터 T 세포(E) 대 종양 세포(T) 비율로 플레이트에 첨가하였다. 종양 세포의 TIL 클리어런스를 시간 경과에 따라 모니터링하였다. 도 16은 MRM에서 배양된 TIL이 상대 용량 범위에 걸쳐 대조군 배지에서 배양된 TIL과 비교하여 생체 외 검정에서 우수한 종양 세포 용해를 나타냈으며, MRM에서 배양된 이펙터 T 세포 대 종양 세포의 비율이 4:1인 경우 완전한 종양 박멸을 초래함을 보여준다.

실시예 10. 생체 외 종양 세포의 줄기세포능 분석

표준 TIL 확장 방법에 따라 생성된 비소세포 폐암(NSCLC) TIL을 본원에 개시된 방법에 따라 MRM에서 생성된 TIL과 비교하였다. 대조군 공정이 CD8+ T 세포에 대해 고도로 농축된 TIL을 생성하는 반면, 이들 세포는 줄기 유사 CD8+CD39-CD69- T 세포 집단에 대해 농축되지 않았고 낮은 수준의 중앙 기억 마커 및 공동자극 수용체 CD27을 발현하였다(도 17a-17d). 대조군 확장 과정은 줄기 유사 CD8+CD39-CD69- T 세포가 농축되고 공동자극 수용체 CD27이 더 높게 발현된 T 세포 생성물을 생성하였지만, CD8+ T 세포의 확장은 감소하였다. MRM에서 배양된 TIL은 강화된 CD8+CD39-CD69- 줄기 유사 T 세포 풍부도, 중앙 기억 마커(CD45RO+CD62L+) 및 공동자극 수용체 CD27의 현저하게 더 높은 발현을 하는 CD8+ T 세포의 고도로 농축된 집단을 생성한다(도 17e-17h). 총체적으로 이러한 마커는 임상 반응과 상관관계가 있는 줄기 유사 세포의 속성을 나타낸다.

주요 공동자극 수용체 CD27의 보유, 연장된 말단소체, 기억 세포 표현형 및 CD39^-/CD69^-CD8⁺ T 세포가 농축된 세포 집단의 존재를 포함하는 강화된 줄기 유사 특성을 갖는 TIL 생성물은 개선된 임상 반응과 관련이 있다. 다기능성 사이토카인을 분비하는 능력 및 공동자극 수용체 CD28의 발현을 포함하는 T 세포의 추가적인 분화 상태 연계 특성은 항종양 효능과도 상관관계가 있다. MRM에서 확장된 TIL은 흑색종, NSCLC 및 결장직장암에서 대조군 TIL 확장 과정과 비교할 때 CD8⁺CD39^-CD69^- T 세포의 증가된 풍부도를 포함하여 유리한 표현형 속성을 나타낸다(도 18a-18c).

실시예 11. MRM에서의 TIL 배양

본원에 제시된 데이터는 증가된 칼륨을 포함하는 배양 배지에서 TIL을 배양하면 더 낮은 수준의 칼륨(예를 들어, 약 40mM 미만의 칼륨 이온, 예를 들어, 5mM 칼륨 이온)을 함유하는 배지에서 배양된 TIL에 비해 CD8⁺ TIL의 확장이 증가하고 줄기세포능이 증가한 TIL 집단을 생성함을 보여준다. 추가로, 데이터는 배양 배지에서 매우 높은 수준의 칼륨(예를 들어, 약 80mM 초과, 약 90mM 초과 또는 약 100mM 초과의 칼륨 이온)이 감소된 TIL 성장 및 확장으로 인해 감소된 TIL 수율을 초래할 수 있음을 시사하며 데이터는 나타내지 않았다. TIL 배양에 대한 MRM의 효과를 추가로 특성화하기 위해, (1) TIL은 초기 확장 단계 동안 대조군 배지(55mM 칼륨 이온을 포함하는 등장성 RPMI 제형)에서 배양된 후 최종 확장 단계 동안 50-70mM(예를 들어, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM 또는 70mM) 칼륨 이온과 50-70mM(예를 들어, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM 또는 70mM) NaCl을 포함하는 MRM 배지에서 배양될 것이고; (2) TIL은 초기 확장 단계 동안 50-70mM(예를 들어, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM 또는 70mM) 칼륨 이온과 50-70mM(예를 들어, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM, 또는 70mM) NaCl을 포함하는 MRM 배지에서 배양된 후 최종 확장 단계 동안 대조군 배지에서 배양될 것이며; (3) TIL은 초기 확장 단계 동안 50-70mM(예를 들어, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM 또는 70mM) 칼륨 이온과 50-70mM NaCl을 포함하는 MRM 배지에서 배양된 후 최종 확장 단계 동안 50-70mM(예를 들어, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM 또는 70mM) 칼륨 이온과 50-70mM(예를 들어, 50mM, 55mM, 60mM, 65mM 또는 70mM) NaCl을 포함하는 MRM 배지에서 배양될 것이다. 모든 실험에서, 초기 배양 조건은 6000IU/mL IL-2를 추가로 포함할 것이고, 최종 배양 조건은 3000IU/mL IL-2를 추가로 포함할 것이다. 이 방법에 따라 배양된 TIL은 줄기세포능 및 이펙터 마커, 세포독성 및 수율의 발현을 특징으로 한다.

실시예 12 클론 다양성의 분석

MRM에서 배양된 TIL의 클론 다양성을 평가하기 위해, 상기 개시된 방법에 따라, 종양 단편 및 종양 단편(예를 들어, 해리된 종양 단편)으로부터 얻은 TIL을 대조군 배지 또는 대사 재프로그래밍 배지(MRM)에서 배양/확장하였다. 전체 게놈 DNA를 DNeasy Blood and Tissue Kit(QIAGEN)를 사용하여 종양 및 TIL 샘플로부터 단리하고 TCRβ 및 CDR3 영역에 대해 Immuno-seq(Adaptive Biotechnologies, Seattle, WA)를 사용하여 시퀀싱하였다.

비소세포 폐암(NSCLC) 및 흑색종 샘플의 다양성 측정기준은 심슨 클론성 √Σpi2로 평가하였으며, 여기서 pi는 주어진 샘플에서 클론 i의 비례 풍부도이다. 심슨 클론성 및 생산적인 재배열을 NSCLC 및 흑색종에 대해 종양 단편("종양"), 대조군 배지에서 배양된 TIL("대조군") 및 MRM에서 배양된 TIL("MRM")에서 조사하였다(각각 도 19a 및 도 19b). MRM에서 배양된 TIL(확장 후)은 NSCLC에 대해 대략 0.28 및 흑색종에 대해 대략 0.38의 심슨 클론성을 나타냈으며, 이는 높은 클론 다양성을 나타낸다(도 19a 및 도 19b). TCRβ 다양성의 유지는 종양에 침투했고 종양 반응성인 TIL 클론형의 보존을 나타낸다. 대조적으로, 대조군 배지에서 배양된 TIL은 클론 다양성을 상당히 상실하고 NSCLC의 경우 대략 0.65, 흑색종의 경우 대략 0.8의 심슨 클론성을 나타냈다(즉, 상당히 덜 다양한 클론성을 나타내며, 이는 대조군 배지를 사용하는 배양 과정에서 많은 종양 반응성 클론이 손실됨을 나타냄)(도 19a 및 도 19b).

실시예 13: TIL의 대규모 확장

본 실시예에서는 덜 분화된 TIL의 대규모 생산을 위한 샘플 프로토콜을 제공한다. 종양 단편은 MRM 배지(본원에 기술된 바와 같이)에서 거칠게 잘린다. 잘게 잘린 종양 단편은 MRM 배지에서 gMACS 기계를 사용하여 해리된다. 해리된 세포는 여과된 다음 동결보존되거나 사전 REP로 직접 이동된다.

해리된 종양 단편의 모든 세포는 제조 공정 0일에 사용된다. 0일에 환자의 종양에서 단리된 모든 세포를 웰당 2mL, 0.5x10⁶/mL의 밀도로 접종한다.그런 다음 세포를 6000IU/mL의 IL-2 및 30ng/mL의 IL-21 로 보충한 MRM에서 배양한다. 사전 REP 4일에 pH가 < 7.1인 경우 세포를 분할(1:1 vol:vol)하고, 배양 배지에 MRM 2mL당 10mL의 TRANSACT^TM 및 1μL/mL의 4-1BBL을 보충한다. 사전 REP 7일, 8일 또는 9일에 pH가 < 7.1인 경우 세포를 분할(1:1)한다. 사전 REP 10일에 세포를 계수한다. 약 3천만 개의 세포가 존재하는 경우, 세포가 2차 확장으로 진행된다. 세포 수가 3천만 개 미만의 세포가 존재하는 경우 pH가 <7.1이면 세포를 분할(1:1)하고 사전 REP를 하루 더 지속한다. 사전 REP는 14일을 초과할 수 없다.

2차 확장은 정적 REP와 동적 REP의 두 단계로 구성된다. 간략하게, TIL은 위에서 기술한 대로 종양의 기계적 및/또는 화학적 해리에 이어 사전 REP 확장을 통해 종양 샘플로부터 단리되었다. 사전 REP 4일에 4-1BB 리간드와 TRANSACT™를 배양 배지에 첨가한다. 세포는 10일에 수확된다. 10일에 3천만 개 미만의 세포가 얻어지면 사전 REP 단계에서 세포를 1 내지 2일 더 배양한다.

사전 REP에 이어 TIL은 정적 REP를 위해 PL750 배양 백으로 이송된다. TIL은 조사된 PBMC(1:200) 및 OKT-3의 존재 하에서 배양된다. 세포 배양 백을 부드럽게 혼합하고 5일 목표 동안 37℃ 및 5% CO₂의 고정 인큐베이터에 넣는다.정적 REP가 완료되면 세포는 동적 REP로 전달 처리된다.

동적 REP 단위 작업은 생물반응기 접종과 세포 배양 배지(MRM)를 사용한 확장을 포함한다. 동적 REP 단위 작업은 용량 요구 사항을 달성하기 위해 TIL 수를 확장하기 위해 수행된다. 확장을 위해 흔들림 모션 생물반응기(BIOSTAT^®RM TX, Sartorius)를 사용한다.

정적 REP에 시딩된 부피를 기준으로 세포 배양 배지가 생물반응기에 추가되고 생물반응기 컨트롤이 미리 정의된 값으로 설정된다.

생물반응기 설정 후, 정적 REP 세포를 생물반응기에 접종하여 2 내지 3L 사이의 작업 부피를 달성한다. 배양물은 공정 중 테스트의 일부로 샘플링 및 테스트된다. 접종이 완료되면 생물반응기의 관류 및 부피 추가를 제어하는 다기능 제어 소프트웨어(MFCS) 프로그램에서 확장 레시피가 개시된다.

관류 프로그램은 초기 확장 48시간 동안 24시간마다 작업 부피의 25%를 관류하는 것으로 시작된다. 샘플링 및 테스트는 동적 REP 기간 동안 매일 발생한다. 2일 후에는 생물반응기에서 달성된 생존 세포 밀도에 따라 부피가 증가하고 관류 부피의 증가가 시작될 수 있다. 이러한 부피 증가는 미리 결정된 새 설정값을 MFCS 프로그램에 입력함으로써 발생하며, 관류 부피는 작업 부피의 25% 관류 비율을 유지하기 위해 증가된다.

반응기가 최대 작업 용량 5L에 도달하면 팽창 기간 동안 관류 비율이 작업 용량의 50%로 증가한다.

9일 확장 후, 총 생존 가능한 세포 수를 사용하여 추가로 3일 또는 4일 확장 연장을 적용할지 여부를 결정하여 의도된 용량을 충족하는 데 필요한 세포 수를 달성하는 데 도움을 준다. 동적 REP 확장이 완료된 후 세포는 수확을 진행한다.

수확 단위 작업 목표는 공정의 세포 확장 단계를 종료하고 제형화 및 충전을 위해 세포를 제조하는 것이다. 공정 제어 전략에 따라 수확 기준이 충족되면 MFCS 프로토콜이 종료되어 프로그래밍된 관류 일정이 마무리된다. Sartorius RMTX 수확 장치를 사용하면 반응기 백을 중력에 따라 삽입하여 전체 세포 배양물을 이송 백으로 배출할 수 있다. 일단 이송되면, 중량과 세포 수를 포착하여 수확된 배양 TVC를 결정한다. 제형화를 위한 전처리 과정에 앞서 세포에 HSA(2% w/v)를 스파이크한다.

의약품 제형화 단위 작업은 확장된 TIL 생성물의 세척, 완충액 교환 및 재현탁으로 이루어진다. Sefia S-2000 및 각각의 멸균 일회용 키트는 확장된 세포 배양의 자동화된 농축, 세척 및 완충액 교환을 허용하는 데 사용된다. 장비와 키트가 설정되면 세포의 부피가 줄어들어 최대 5.5L의 배양액이 200mL 미만으로 줄어들고 사용한 세포 배양 배지는 폐기물로 이송된다. 그런 다음 세포를 2%(w/v) HSA를 함유하는 Plasmalyte로 세척한 후 세포를 1x10⁹세포/mL로 농축하고 6%-7% DMSO 동결보존 완충액(CryoStor CS10 및 Cryostor 5의 혼합물)으로 희석한다. 최종 의약품 부피는 200x10⁶세포/mL의 제형화된 의약품 세포 밀도를 달성하기 위해 계산되며, 목표 제형화 부피가 Sefia의 300mL 최대 출력 부피를 초과하는 경우 실행되는 6%-7% DMSO 동결보존 완충액을 사용하여 추가 수동 희석을 통해 실행된다. Sefia와 필요에 따라 추가 희석이 완료되면 제형화된 의약품의 무게를 측정하고 샘플 계획에 따라 방출 검정을 위해 샘플링한 후 CryoMACS 250 백으로 이송한다. CryoMACS 250 백은 목표 충전량 50mL로 채워지고 최종 백 충전량은 30 내지 70mL이다. 각 백이 채워지면 백에서 여분의 공기가 제거되고 EVA 튜브용으로 설계된 밀봉 장치를 사용하여 밀봉된다. 밀봉된 백을 카세트에 개별적으로 넣고 제어 속도 냉동 보존을 통해 세포를 -100℃로 상승시키기 위해 냉동한다. 제어 속도 냉동기 프로파일이 완료되면 냉동 의약품 카세트와 바이알을 온도 제어 저장 장치를 통해 옮기고 치료적 의약품이 환자에게 투여될 때까지 LN2에 보관한다.

본 발명자는 연구(소규모) 규모 및 대규모에서 생성된 MRM TIL 생성물이 비교 가능한지 여부를 평가했다. 3개의 전이성 흑색종 종양의 TIL은 소규모 및 대규모 모두에서 MRM 생산을 거쳤다. TIL 생성물은 CD8+ T 세포의 CD4+:CD8+ T 세포 조성, 줄기 특성(%CD39-CD69- 및 %CD27+) 및 고갈(%PD1+) 및 CD4+ T 세포의 줄기 특성(%CD39-CD69-)에 대해 분석되었으며, 유의한 차이는 관찰되지 않았다(데이터는 표시되지 않음). 추가적으로, 대량 RNAseq 분석은 소규모 및 대규모 Epi-R 샘플 사이에서 줄기세포능 및 고갈 마커의 일관된 유전자 발현을 보여주었다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 결과는 소규모 및 대규모 MRM 절차를 사용하여 확장된 TIL이 비슷한 표현형을 가지고 있음을 나타낸다.

실시예 14: CITE-Seq에 의한 D0 gMACS 및 TIL 생성물의 전사 프로파일링

동결보존된 D0 gMACS(즉, 단일 세포 현탁액) 및 TIL 생성물(소규모 및 대규모 모두)은 시퀀싱(CITE-Seq) 분석에 의한 전사체 및 에피토프의 세포 색인화를 위해 해동 후 처리되었다. CITE-Seq을 사용하면 단일 세포 RNA와 세포 표면 단백질을 동시에 측정할 수 있다.

동결보존된 D0 gMACS 및 TIL 생성물은 별도의 일자에 CITE-seq를 위해 해동 및 처리되었다. Cellometer K2 Cell Counter(Nexcelom)를 사용하여 세포 생존력과 개수를 평가했다. 분류를 위해 세포를 RT에서 10분간 Live/Dead eFluor780 시약으로 염색하고, 4℃에서 10분간 10% Human TruStain FcX 차단 시약으로 차단한 후 CD45, CD4 및 CD8에 대한 형광 크롬 결합 항체, 여러 세포 표면 단백질에 대한 DNA 결합 Total-SeqC 항체 및 DNA 바코드가 포함된 고유 해시태그 항체를 혼합하여 4℃에서 30분 동안 염색했다. D0 gMACS의 LiveCD45+ T 세포와 TIL 생성물의 동일한 비율의 LiveCD45+ CD4+ 및 LiveCD45+ CD8+ T 세포를 BD FACSAria™ 융합 세포 분류기(BD Biosciences)를 사용하여 2% BSA가 포함된 PBS로 FACS 분류했다. 해시태그 항체가 있는 모든 고유 바코드 샘플에서 분류된 세포를 한데 모은 다음 Cellometer K2 Cell Counter(Nexcelom)를 사용하여 카운팅했다. 풀링된 세포는 Chromium Next GEM 단일 세포 5′ v2 시약 키트(10x Genomics)를 사용하여 Chromium Next GEM Chip K의 각 채널에 로딩되었다. 단일 세포 포획 및 용해 후, 세포 표면 단백질에 결합된 항체에 결합된 DNA와 함께 제조업체의 프로토콜에 따라 13주기에 걸쳐 증폭된 cDNA를 합성했다(10x Genomics). 폴리아데닐화된 mRNA에서 증폭된 cDNA와 세포 표면 단백질 항체 바코드에서 증폭된 DNA는 각각 독립적인 바코드 5' 유전자 발현(GEX) 라이브러리와 항체 유래 태그(ADT) 라이브러리를 생성하기 위해 크기 선택을 통해 분리되었다. Chromium Next GEM Chip K의 여러 채널에서 준비된 GEX 및 ADT 라이브러리는 NovaSeq 6000 시스템(Illumina)을 사용하여 함께 정량화, 풀링 및 시퀀싱되었다. GEX 라이브러리의 경우 셀당 최소 30,000개, ADT 라이브러리의 경우 셀당 최소 5,000개의 평균 시퀀싱 깊이를 얻었다.

MRM에서 본원에 개시된 방법에 따라 얻은 CD8+ TIL 생성물은 대량 및 단일 세포 RNA-seq 분석 모두에 의해 줄기 유사 표현형에 대해 농축된 것으로 밝혀졌다. MRM에서의 배양으로부터 생성된 TIL은 일반적으로 줄기 유사 표현형과 관련된 유전자의 더 높은 발현을 가졌고, 이는 일반적으로 AIM V 또는 대조군 배지를 사용하여 생성된 TIL에 의해 더 낮은 수준으로 발현되었다(도 20a). CITEseq + scTCRseq도 각 생성물에 대해 수행되었다. 본 발명자는 Rosenberg DN 줄기 점수와 CD39 및 CD69 단백질 발현을 사용하여 본 발명자는 각 생성물에서 줄기 유사 집단을 식별했다. TMRM 생성물은 1면 t-검정으로 계산한 바와 같이 대조군과 AIM V 둘 다보다 훨씬 더 많은 줄기 유사 세포를 가지고 있다(도 20b). 줄기 유사 세포의 비율은 대조군 또는 AIM V와 비교하여 MRM을 사용하여 얻은 CD8+ TIL 생성물에서 일반적으로 더 높았다(도 20c; 각 데이터 세트는 개별 공여자를 나타냄). CD4+ TIL 생성물에서도 유사한 효과가 관찰되었다(도 20g-20i).

본 실시예에 기술된 분석에 사용된 유전자 세트는 표 3에 표시되어 있다.

표 3: 유전자 세트.

Caushi 등, Nature 2021;596:126-132. Jansenet 등, Nature 2019. Zhang 등, Nature 2018;564:268-272. Oliveira 등, Nature 2022. Moshe Sade-Feldman 등, Cell 2018;175:998-1013.e20. Krishna 등, Science 2020;370:1328-1334. Subramanian 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005;102:15545-15550.

대사 표현형 및 세포주기

MRM에서 본원에 개시된 방법에 따라 얻은 CD8+ TIL 생성물은 또한 덜 고갈된 표현형을 갖는 것으로 밝혀졌다. MRM에서의 배양으로부터 생성된 TIL은 일반적으로 고갈과 관련된 유전자의 발현이 더 낮았으며, 이는 일반적으로 AIM V 또는 대조군 배지를 사용하여 생성된 TIL에 의해 더 높은 수준으로 발현되었으며(도 20d-20e), 고갈된 세포의 비율은 일반적으로 대조군 또는 AIM V와 비교하여 MRM을 사용하여 얻은 CD8+ TIL 생성물이 더 낮았다(도 20f; 개별 공여자를 나타내는 각 데이터 세트). CD4+ TIL 생성물에서도 유사한 효과가 관찰되었다(도 20g, 20h 및 20j).

T 세포 대사 및 면역학적 기능은 밀접하게 연결되어 있다. 줄기 유사 T 세포는 에너지 생산을 위해 주로 산화적 인산화(OXPHOS)를 사용하는 반면, 이펙터 T 세포에서는 해당작용이 우선적으로 사용된다(Pearce 등, 2013, Bourgeois 등, 2018). 따라서 OXPHOS는 T세포 생성물에 더 유리한 것으로 간주된다. 또한 Vardhana 등(2020)은 지속적인 항원 노출로 인해 대사가 변경되어 종양 내 T 세포 증식과 자가 재생이 제한된다는 사실을 입증했다. 이러한 변화된 신진대사의 특징은 산화적 인산화에 참여하는 T 세포의 능력을 제한하는 미토콘드리아 산화 스트레스의 급속한 유도로, 그 결과 T 세포 증식을 차단하기에 충분한 생체에너지 제한이 발생한다.

생성물의 대사 적합성을 평가하기 위해 MRM 및 대조군 생성물에서 분류된 CD45+CD8+TIL에 대해 대량 RNA-Seq 분석을 수행했다. MRM 생성물과 대조군 생성물 간의 비교는 4명의 공여자로부터 얻은 대량 RNA-seq 데이터를 사용하여 수행되었다. 유전자 세트 농축 분석은 MRM TIL 생성물에서 상향조절된 유전자가 대조군 TIL 생성물과 비교했을 때 OXPHOS, 호흡 전자 수송 및 콜레스테롤 유전자 세트에 대해 상당히 농축되었음을 보여주었다(도 21a-21b). 또한, MRM TIL 생성물에서 하향조절된 유전자는 해당과정 유전자 세트에 대해 유의하게 농축되었다. 또한, 대조군 TIL 생성물과 비교했을 때 MRM TIL 생성물에서도 세포 주기 관련 유전자 세트의 농축이 나타났으며 이는 MRM 생성물이 향상된 증식이 가능함을 나타낸다.

종양 반응성 클론

CITEseq + scTCRseq는 6명의 공여자로부터 0일 gMACS t 세포에 대해 수행되었다. R 패키지 Seurat를 사용한 클러스터링은 먼저 NormalizeData 함수를 사용하여 라이브러리 크기별로 세포를 정규화하여 수행되었다. 세포는 단백질 CD4 및 CD8의 asinh 규모 발현을 기반으로 CD4 및 CD8로 분류되었다. CD4 및 CD8의 이중 양성 또는 이중 음성 발현을 갖는 세포는 제외되었다. 또한, 개수가 500개 미만이고 CD3 단백질 발현이 없는 세포는 제외되었다. 그런 다음 FindVariableFeatures 기능을 사용하여 세포 주기, TCR, IG 복합체, 미토콘드리아 및 리보솜과 관련된 유전자를 제외하고 매우 가변적인 유전자를 선택했다. 또한 세포주기의 G2M 및 S 단계와 밀접한 상관 관계가 있는 유전자(피어슨 상관 관계 > .25)도 가변 기능 목록에서 제외되었다. 나머지 변수 특징의 정규화된 표현을 확장하고 ScaleData 함수를 사용하여 각 세포의 G2M 및 S 점수를 회귀 분석했다. RunPCA 기능을 사용하여 PCA를 실행한 후 RunHarmony 기능을 사용하여 6명의 공여자에 걸쳐 세포를 통합했다. 조화 벡터는 RunUMAP 기능을 사용하여 UMAP을 생성하는 데 사용되었으며 FindNeighbors 및 FindClusters 기능을 사용하여 클러스터를 식별하는 데에도 사용되었다. 클러스터 8 및 12는 고갈 관련 마커의 이종 발현으로 인해 FindSubcluster 기능을 사용하여 하위클러스터화되었다(도 22a-22h).

상기에 인용된 간행물에서 확인된 고갈 관련 마커(CXC13, CD137(4-1BB), CD279(PD-1) 및 TIGIT(VSTM3))의 발현을 기반으로 추정되는 종양 반응 클러스터를 확인했다.

0일 gMAC 샘플도 적응형 대량TCR 시퀀싱의 조사 깊이를 사용하여 시퀀싱되었다. 추정 종양 반응성 클론을 식별하기 위한 방법으로 고갈 표현형을 사용하는 것 외에도, 연구자는 대량TCR 시퀀싱을 사용하여 측정된 가장 빈번한 상위 100개 클론을 사용한다.

도 23b 및 23d는 0일 5' CITEseq 데이터 및 대량 TCR 빈도(상위 100개 클론)의 고갈 표현형을 기반으로 각 샘플에서 확인된 추정 종양 반응성 클론의 수를 보여준다. 각 생성물의 대량TCR 데이터를 사용하여 각 공정에서 보존된 종양 반응성 클론의 수를 평가했다. 각 공여자는 초기에 다양한 수의 종양 반응성 클론을 갖고 있지만 세 가지 공정은 유사한 수의 추정 종양 반응성 클론을 보존한다.

대량TCR 생성물에서 확인된 추정 종양 반응성 클론의 모든 빈도를 합산하여 추정 종양 반응성 클론에서 나오는 생성물의 비율을 추정한다. 본 발명자는 추정되는 종양 반응성 클론인 생성물의 백분율이 공정 간에 상대적으로 일관적이라는 것을 확인한다(도 23a-23c). CD8 추정 종양 반응성 클론(도 23a)은 CD4 추정 종양 반응성 클론(도 23c)보다 더 큰 백분율의 생성물을 구성한다.

다음으로, 본 발명자는 생성물에 줄기 유사 표현형이 있고 0일 샘플에 추정 종양 반응성 표현형이 모두 있는 클론을 식별하여 줄기 유사 추정 종양 반응성 세포의 존재를 평가했다. 각 공여자에서 확인된 클론의 양은 다양한 공정 간에 일관된다(도 23e).

본 발명자는 고갈 표현형을 사용하여 식별한 추정 종양 반응성 클론 및 가장 빈번한 클론을 사용하여, MRM, 대조군 및 AIM-V의 3가지 공정 간의 유사 대량 차등 발현을 수행하여 TMRM 생성물에 대해 종양 반응성 세포가 풍부한 유전자 및 기능 프로그램을 식별했다. 본 발명자는 DESeq2를 사용하여 생성물 간의 발현 차이를 모델링 하고 테스트 통계 출력을 fgsea에 대한 입력으로 사용하여 GSEA(유전자 세트 농축 분석)를 수행했다. GSEA는 AIM-V 및 TCM 추정 종양 반응성 세포와 비교할 때 TMRM 추정 종양 반응성 세포가 기억 표현형을 상향 조절한다는 것을 보여주었다. 추가로, MRM 추정 종양 반응성 세포는 고갈 관련 유전자 세트의 발현이 더 낮다(도 24b). 히트맵은 고갈 및 이펙터 기억 표현형과 연관된 유의하게 차등적으로 발현된 유전자를 보여준다(도 24a). CD39 및 CD69 단백질은 MRM 추정 종양 반응성 클론에서 하향조절되고 SELL 및 IL7R RNA는 상향조절된다(도 24c). 이는 MRM 추정 종양 반응성 클론이 다른 공정보다 줄기와 더 유사하다는 것을 나타낸다. 이중 음성(줄기 유사) 및 이중 양성(고갈) 세포를 식별하기 위해 CD39 및 CD69 단백질 발현에 대한 추정 종양 반응성 세포를 게이팅하면 MRM 추정 종양 반응성 세포가 대조군 및 AIM V보다 이중 양성 추정 종양 반응성 세포의 비율이 더 낮다는 것을 알 수 있다(도 24d-24f).

자가 TIL 공동 배양

멸균 메스를 사용하여 종양 분획을 2 내지 3개의 작은 단편으로 절단하여 환자 종양 샘플의 자가 종양 세포주를 생성했다. 그런 다음 종양 단편을 50ml 원뿔형 튜브에 담긴 100ul의 효소 H, 50ul의 효소 R 및 12.5ul의 효소 A(Tumor Dissociation Kit, Miltenyi, # 130-095-929)를 첨가한 미리 예열된 2.2ml의 플레인 RPMI/글루타맥스에서 배양하였다. 종양과 효소 혼합물을 배지가 혼탁해지고 종양 분획이 더욱 분해될 때까지(1 내지 2시간) 가끔씩 와동시키면서 37℃ 인큐베이터에서 배양했다. 인큐베이션 시간 후, 미리 예열된 RPMI/글루타맥스 8ml를 15ml 원뿔형 튜브에 첨가하여 효소를 희석하고 종양 해리물을 70μm 필터를 통해 새로운 50ml 원뿔형 튜브로 여과했다. 세포를 300xg에서 7분 동안 회전시킨 다음 미리 데워진 RPMI/글루타맥스+ 10% FBS+ 1% Pen/Strep 10ml에 재현탁하고 10cm 조직 배양 접시에 도말하고 37℃에서 배양했다. 도말 후 1 내지 2일 동안 세포를 관찰하여 종양 세포 부착을 확인하고 배지를 교체했다. 간질 성장 시(도말 후 1-2주), 세포를 NCCD 코팅된 10cm 접시에 다시 도말하고 Primary Cancer Cell Medium D-ACF(Primary Cancer Culture System, PromoCell, # C-28081). 배지를 5일마다 교체하고 종양 세포 성장에 대해 세포를 관찰했다. 4 내지 6주 후 종양 세포 콜로니가 존재하면 세포를 차등 트립신화를 통해 새로운 NCCD 코팅 접시에 다시 접종했다. 이는 간질 세포가 더 이상 존재하지 않을 때까지 계속되었다. 마지막에, 종양 세포를 1차 암 배양 시스템에서 분리하고 분석에 필요할 때까지 RPMI/글루타맥스+ 10% FBS+ 1% Pen/Strep에서 배양하거나 생존 가능하게 동결보존했다.

TIL 공동 배양 실험 24시간 전에 자가 종양 세포를 웰당 30,000개 세포로 96웰 E-플레이트(Agilent, #300600910)에 도말하고 xCELLigence RTCA 제조업체의 권장 프로토콜을 사용하여 공동 배양 실험을 수행했다. 간단히 말하면, 미리 예열된 RPMI/글루타맥스(+10% FBS) 50μl를 96웰 E-플레이트의 각 웰에 첨가했다. xCELLigence RTCA MP(Agilent)에서 웰의 초기 스캔을 수행한 후 종양 세포를 플레이트의 웰에 접종했다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양하여 세포가 가라앉도록 했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 다시 xCELLigence에 놓고 15분마다 임피던스 측정값을 얻었다. 세포 지수가 1-1.5에 도달할 때까지(90-100% 컨플루언스를 나타냄) 플레이트를 xCELLigence 플랫폼에서 밤새 인큐베이션했다. 다음날, IL-2가 보충된 대조군 배지에 밤새 방치된 TIL을 RPMI/글루타맥스(+10% FBS)로 2회 세척하고 계수한 후 RPMI/글루타맥스(+10% FBS)에서 1:1, 5:1 및 10:1의 E:T 비율(도 25a) 또는 10:1의 E:T 비율(AIM-V, MRM, 4-1BB 리간드 및 TRANSACT^TM을 이용한 사전 REP 부스트 없는 MRM, 및 대조군, 도 25b)로 종양 세포에 도말했다. 종양 세포용해 판독값은 실험이 끝날 때까지(~30시간) 15분마다 xCELLigence에 의해 얻어졌다.

세포독성은 모든 공정에서 용량 의존적 방식으로 관찰되었으며(도 25a), 이는 항종양 기능성이 보존되었음을 나타낸다(도 25b). 비부스트 MRM은 대조군, MRM 및 AIM-V에 비해 가장 우수한 종양 사멸을 나타냈다(도 25b). 이러한 데이터는 모든 배지 조건에서 인식이 확인되었지만 MRM 확장된 TIL이 AIM-V보다 인식 성능이 뛰어났음을 나타낸다. 추가적으로, 비부스트 MRM 조건은 두 대조군보다 실질적으로 더 나은 종양 반응성을 나타냈다.

MRM, MRM 부스트 없음, AIM-V 및 대조군의 생성물 세포를 상응하는 자가 종양 세포주와 4시간 동안 공동 배양한 후 대조군 생성물과 함께 시퀀싱했다. 종양 반응성으로 확인된 클론은 4-1BB(TNFRSF9) 발현에 의해 확인되었으며, 이는 배경 대조군 발현보다 큰 것으로 정의되었다(41BB에 대해 > 2로 표시; 도 26a-26c). 각 공동배양 생성물에서 확인된 종양 반응성 클론의 양은 도 1과 일치하였다. MRM 부스트가 가장 많이 나타나지 않은 25a에서는 종양 반응성 클론도 가장 많았다. 대조군 생성물에서 종양 반응성 클론 사이의 차등 발현은 추정 종양 반응성 클론으로 나타난 차등 발현과 유사하게 MRM에서 강화된 이펙터 기억(GNLY, ZNF683, PRF1) 및 감소된 고갈 표현형(LAG3)을 확인했다(도 26d). Seurat의 FindMarkers 기능을 사용하여 차등 표현을 수행했다.

실시예 15: MRM에서 배양된 TIL의 특성화

전이성 흑색종, NSCLC 및 대장 전이성 종양으로부터 제조된 신선하거나 생존 가능하게 동결보존된 단일 세포 현탁액은 표준, 대조군 및 MRM 과정을 사용하여 TIL 확장을 거쳤다. 두 공정 변형 모두 (A) 사전 급속 확장 프로토콜(REP) 배양 및 (B) REP 배양의 2단계를 포함한다. 역사적으로 TIL의 사전 REP 확장은 3 내지 5주에 걸쳐 고농도의 IL2(6000IU/ml)를 활용하여 수행되었다. 기능 장애가 있는 TIL의 확장을 촉진하려면 높은 수준의 IL2가 필요한 것으로 생각된다. 이 전통적인 사전 REP TIL 확장에는 하나의 활성화 신호만 포함되므로 2차 REP 확장을 시작하기 위한 충분한 세포 수를 달성하기 위해 확장 기간이 길어진다. 본원에 설명된 MRM TIL 확장 공정에는 사전 REP 부스팅 단계가 포함되어 있으며, 여기서 TIL은 배양 4일에 TRANSACT^TM 및 4-1BB 리간드로 자극되어 T 세포 증식을 촉진한다. 표준 및 대조군 TIL은 이러한 부스팅 단계를 거치지 않았으며 IL2 함유 배지에서 확장되었다. MRM 공정은 제어 공정에 비해 TIL 확장 성공률이 더 높았다. 1.5배보다 큰 사전 REP TIL 확장은 성공적인 확장으로 간주된다. 연구된 모든 종양 전반에서, TIL 배양의 사전 REP 확장의 전반적인 성공률은 AIM-V 배지에서 41%(7/17), TCM 배지에서 75%(12/17), MRM 공정(도 27a-27c)에서 100%(17/17)였다. 연구된 종양 적응증(흑색종, NSCLC 및 CRM) 각각에서 각 확장 과정의 성과를 평가하기 위해 추가 분석을 수행했다(도 27d-27f). REP 이전 TIL 확장의 전반적인 성공률은 CRM에 비해 전이성 흑색종 및 NSCLC 환경에서 더 높았는데, 이는 이러한 암 유형의 T 세포 침윤이 더 높기 때문일 가능성이 높다. 중요한 것은 각 종양 유형에서 MRM 공정이 성공적인 사전 REP TIL 확장에서 향상된 성과를 나타냈다는 것이다.

REP 배수 확장은 대조군과 MRM 공정 사이에서 유사하였고, 둘 다 표준보다 높았다(도 27g). 건강한 공여자로부터 조사된 PBMC(공급 세포)를 REP 과정에 사용하여 세포 생존력을 유지하면서 TIL 증식을 향상시켰다. 이러한 동종 영양 세포는 최종 생성물에서 잠재적인 오염 위험을 나타내므로 조사 후 이러한 세포가 증식할 수 없도록 하는 것이 중요하다. 조사된 피더 세포 및 조사되지 않은 건강한 공여자 풀링된 PBMC를 세포 추적 보라색(CTV) 염료로 표지하여 α-CD3 자극 시 증식을 추적했다. 1500IU/ml IL2를 함유한 배지에서 30ng/ml α-CD3(OKT3 클론)을 사용하여 세포를 자극했다. 방사선 조사되지 않은 건강한 공여자 PBMC는 증식할 수 있었던 반면, 방사선 조사된 영양 세포는 CTV 희석 분석에 기초하여 증식할 수 없었다(도 27h-27i).

게이팅 전략

생성물의 표현형 분석을 수행하기 위해 유세포 분석을 위해 세포를 염색하여 관련 단백질 마커의 세포 표면 발현을 측정했다. 림프구는 먼저 FSC-A 대 SSC-A에 의해 게이팅된 다음 FSC-A 대 FSC-H에 의해 단일항, FSC-A에 대한 배제 염료에 의해 살아있는 세포, CD3 대 FSC-A에 의해 CD3+ T 세포로 게이팅되었다. 일부 생성물 분석에서는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 하위 게이팅화하여 조건 간에 별도로 비교했다. CD8+ T 세포는 CD69에 대해 CD39를 플롯팅하고 이중 양성 집단(CD39+CD69+) 및 이중 음성 집단(CD39-CD69-)에 대한 게이팅을 통해 줄기 특성에 대해 분석되었다. CD39-CD69-T 세포는 이전 문헌에서 정의된 바와 같이 줄기 유사 세포이다. CD39+CD69+ T 세포는 고도로 분화된 세포이다. CD8+ T 세포 하위세트의 공동자극 양성 줄기 유사 세포 집단의 경우, CD62L과 CD27 또는 CD27과 CD127을 서로에 대해 플롯팅했다. CD62L+CD27+CD8+ 및 CD27+CD127+ CD8+ T 세포는 공동자극 양성 줄기 유사 세포로 정의되었다(도 28). 유리한 표현형 속성에는 CD39^낮음 /CD69^낮음,CD27 ^높음/CD62L^높음,CD27^높음 /CD127^높음,CD39^희미함 /CD69^낮음 및 CD39^높음 /CD69^낮음이 포함되었다.

MRM 공정은 CD8+ T 세포 우세 생성물을 촉진한다.

성숙한 인간 알파-베타 T 세포는 독점적인 공동 수용체 발현을 기준으로 광범위하게 분류될 수 있다. CD4 발현(CD4+) 또는 CD8 발현(CD8+) 중 하나이다. CD4+ T 세포는 전문 항원 제시 세포(pAPC)에 의해 HLA 클래스 II에 제시된 항원을 인식하고 Th2 하위 집합, CD8+ T 세포 기능을 촉진하는 CD4+ 보조 T 세포, 면역 반응을 억제하는 조절 T 세포 등 여러 가지 하위 집합으로 분류될 수 있다. CD8+ T 세포는 주로 HLA 클래스 I 분자에 의해 제시된 동족 항원의 특정 인식을 통해 표적 세포 살해 세포용해를 유도한다. 종양 면역요법의 맥락에서, CD4+ T 세포에 의한 종양 항원의 직접적인 인식은 때때로 HLA 클래스 II의 종양 발현 부족으로 인해 제한되는 반면, CD8+ T 세포는 HLA 클래스 I의 맥락에서 (pAPC)뿐만 아니라 종양 세포에 직접적으로 제시되는 종양 항원을 인식할 수 있다. 따라서 종양 세포를 직접적으로 죽일 수 있는 능력을 지닌 CD8+ T 세포를 다량 주입하는 것은 인간 흑색종 환자에서 입증된 바와 같이 개선된 임상적 항종양 반응과 연관될 수 있다(Tran 등, 2014).

본 발명자는 유세포 분석을 사용하여 TIL 생성물의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 비율을 평가했다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 비율은 환자 샘플에 따라 다양하지만, 본 발명자들은 TIL의 MRM 확장이 CD8+ T 세포의 풍부도 증가(도 29a) 및 이에 상응하는 CD4+ T 세포 풍부도의 감소(도 29b)를 촉진한다는 것을 관찰했다. 표준 및 제어 확장 공정과 관련된 MRM 생성물의

MRM 공정은 줄기 유사 수용체 양성 TIL을 더 잘 유지한다.

항원 인식 시, 나이브 T 세포는 활성화 및 분화 경로를 거쳐 지속적인 이펙터 면역 반응을 위한 기능을 획득한다. 일부 T 세포는 단기 효과 세포로 분화되어 죽기 전에 강력한 면역 반응을 일으킨다. 다른 T 세포는 기억 표현형을 획득하여 장기간 생존할 수 있고 항원을 다시 만날 경우 상대적으로 빠른 회상 반응을 부여받게 된다. 기억 T 세포 풀 내에는 분화 경로가 있어 여러 기억 T 세포 하위 집합이 생성된다. 이러한 기억 T 세포 하위 집합의 계통에 관한 많은 가설이 존재하지만, 일반적으로 더 젊거나 줄기와 유사한 T 메모리 세포는 최종 분화 하위 집합으로 점진적으로 분화한 후 소멸되는 것으로 생각된다. 각 하위 집합에는 표 4에 요약된 고유한 속성과 표면 마커가 있다.

표 4: 기억 T 세포 특성 및 표면 마커 요약.

TCR 신호 강도, 항원 풍부도 및 노출, 염증 환경과 같은 요인은 구성 T 세포 기억 풀에 영향을 미칠 것이다. 종양의 대부분의 T 기억 세포가 반복적인 항원 노출을 경험하고 있다는 점을 고려하면 TIL 배양에서 가장 줄기와 유사한 기억 T 세포 하위 집합이 TCM일 것으로 예상된다.

각 하위 집합 내에서 일정 범위의 줄기세포능이 유지될 수 있으며, 즉, TCM은 더 높거나 낮은 수준의 CD27을 나타낼 수 있다. 그러나 세포의 줄기 유사 품질은 줄기 유사 마커의 조합을 사용할 때 가장 잘 관찰된다. 예를 들어, CD62L 단독은 기억 방관자 또는 나이브 T 세포 모두에 대한 마커가 될 수 있지만, CD45RO와 함께 사용하면 줄기와 유사한 TCM 세포를 더 많이 표시할 수 있다. 본 발명자는 MRM TIL 생성물과 대조군 TIL 생성물의 줄기 유사 특성을 비교하기 위해 이러한 줄기 유사 수용체 양성 세포의 비율을 평가한다.

TIL에서 특정 줄기 유사 수용체 양성 집단의 증가된 존재는 유리한 임상 반응과 상관관계가 있다. 예를 들어, 체크포인트 요법으로 치료받은 흑색종 환자의 경우, CD8+ TIL에서 CD27 및 CD62L 발현은 무반응 환자에 비해 완전 관해 및 부분 반응이 있는 환자에서 더 높았다(van den Berg 등, 2020). 마찬가지로, TIL ACT를 받은 전이성 흑색종 환자에 대한 또 다른 연구에서는 반응 정도(완전, 부분, 무반응)가 주입 생성물의 CD8+ T 세포에서 CD27의 발현과 강한 상관관계가 있음을 보여주었다(Rosenberg 등, 2011). IL7 수용체로도 알려진 CD127은 주요 병리학적 반응이 없는 NSCLC 환자에 비해 주요 병리학적 반응이 있는 NSCLC 환자의 신생항원 특이적 T 세포에서 더 고도로 발현되는 것으로 밝혀졌다(Caushi 등, 2021).

본 발명자는 MRM TIL 생성물이 상당히 높은 비율의 CD62L+CD27+(도 30b-30c) 및 CD27+CD127+(도 30d) CD8 T 세포를 보유한다는 것을 발견했다. 더욱이, MRM TIL 생성물은 또한 CD8 T 세포 상에서 단독으로 더 높은 CD27+를 가졌다(도 30a). 종합해 보면, 대조군 생성물과 비교하여 MRM TIL 생성물의 CD8 T 세포에서 이러한 줄기 유사 수용체의 발현이 높다는 것은 본 발명자는 주입 생성물이 표준 TIL 생성물에 비해 임상 반응을 향상시킬 준비가 되어 있음을 시사한다.

MRM 공정은 덜 분화된 TIL을 강화한다.

CD8 TIL에서 CD39와 CD69의 공동 발현은 최근 흑색종 환자의 줄기세포능, 지속성 및 궁극적으로 ACT 치료에 대한 유리한 임상 반응에 대한 판독으로 확인되었다. 반응자 및 비반응자 환자의 TIL ACT 생성물을 분석한 결과, 반응자의 TIL 생성물이 CD39-CD69-CD8 T 세포에 풍부하다는 사실이 밝혀졌다. 결과적으로, 풍부한 CD39-CD69-CD8 T 세포로 환자를 계층화하면 생존 환자를 효과적으로 구분할 수 있으며, 더 높은 CD39-CD69-CD8 T 세포가 생존 환자를 식별한다. 이 집단에 대한 추가 분석에서는 주입 후 자가 재생 능력 지속성을 포함한 줄기 특성이 나타났다. 반면, CD39+CD69+ TIL은 더욱 차별화되고 고갈된 표현형을 나타냈다. 종양 항원 반응성 T 세포는 두 집단 모두에서 검출되었지만 CD39+CD69+ 하위 집합에서 눈에 띄게 더 높았다(Krishna, 2020).

본 발명자는 MRM TIL 생성물에 더 높은 비율의 CD39-CD69-CD8 T 세포가 포함되어 있는지, 그리고 대조군 생성물과 비교하여 더 낮은 비율의 CD39+CD69+ CD8 T 세포가 포함되어 있는지 평가하기 위해 흐름 분석을 사용했다. MRM TIL 생성물은 대조군 생성물과 비교하여 적어도 3배 더 많은 CD39-CD69-CD8 T 세포를 나타냈다(도 31a-31b). 반대로, MRM 생성물은 2배 이상 적은 CD39+CD69+ CD8 T 세포를 함유했다(도 31c).

MRM TIL 생산의 효과는 CD8 T 세포에만 국한되지 않는다. 연구자는 대조군 생성물과 MRM 생성물 모두에서 CD4+ T 세포를 분석하고 CD8+ T 세포에 대해 유사한 패턴을 발견했으며, 이에 따라 MRM은 CD39-CD69- 하위 집합을 농축되게 하고(도 32a) CD39+CD69+ 개체군을 감소시켰다(도 32b). 컨트롤 생성물. CD4 T 세포는 종양 반응성 클론을 보유하고 T 세포가 CD8+ T 세포 세포용해를 개선하는 데 도움을 주기 때문에 MRM TIL 생성물의 존재 및 줄기 특성은 대다수 CD8 T 세포 집단의 항종양 반응을 향상시킬 수 있다.

MRM 생성물은 TIL 다클론성을 유지한다.

MRM 공정에 의한 줄기 유사 공동 수용체 양성 TIL의 확장 성공과 농축으로 인해 T세포 레퍼토리에 미치는 영향을 조사하게 되었다. 초기 종양 물질은 다양한 빈도로 다양한 TCR 레퍼토리를 가질 수 있다. 초기 종양 물질에 다수의 종양 반응성 T 세포가 존재하기 때문에 생체 외 확장 동안 다양한 TCR 레퍼토리를 유지하는 것이 필요하다. 각 T 세포 클론은 서로 다른 증식 능력을 가지고 있다는 점은 주목할 가치가 있다. 이러한 세포의 다양성을 이해하고 해석하는 데 사용되는 측정 기준 중 하나는 클론성이다. 확장 후 MRM TIL의 다클론성을 평가하기 위해 MRM, 표준 및 대조군 TIL에서 TCR의 CDR3 가변 영역에 대한 차세대 시퀀싱을 수행했다. T 세포 다클론성을 정량적으로 측정하기 위해 각 샘플에 대해 심슨 클론성 계수를 계산했다. 이 계산에서 값 0은 완전히 균일하게 분포된 샘플을 나타내고 1은 단일클론 샘플을 나타낸다. 따라서 TIL 생성물에는 0에 가까운 심슨 클론성 계수 값이 더 바람직하다. 심슨 클론성은 대조군 공정과 MRM 공정 모두에서 유사했으며(도 33), 이는 MRM TIL 확장에 의해 유도된 줄기 유사 속성을 갖는 CD8+ T 세포의 증가가 심슨 공정에서 최종 TIL 집단 내 클론 다양성의 손실을 희생하지 않았음을 시사한다.

실시예 16: 대규모 및 연구 규모에 대한 MRM으로 확장된 TIL의 TCR 다양성 분석

연구 및 대규모로 MRM에서 확장된 NSCLC, 흑색종 및 결장암의 TIL의 클론 다양성을 평가하기 위해, 상기 개시된 방법에 따라 종양 단편(예컨대, 해리된 종양 단편)에서 얻은 종양 단편 및 TIL을 대사 재프로그램 배지(MRM)에서 확장했다. DNeasy 혈액 및 조직 키트(QIAGEN)를 사용하여 종양 및 TIL 샘플에서 총 게놈 DNA를 분리하고 TCRβ 및 CDR3 영역에 대해 Immuno-seq(Adaptive Biotechnologies, 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 시퀀싱했다.

다양성 측정 기준은 심슨 클론성 로 평가되었다. 여기서 pi는 주어진 샘플에서 클론 i의 비례적 존재비이다. NSCLC, 흑색종 및 결장암에 대해 해리된 종양 단편("종양") 및 MRM("MRM")에서 배양된 TIL에서 심슨 클론성 및 생산적 재배열을 조사하였다(도 35a). 도 35a에 도시된 바와 같이, 연구 규모의 MRM에서 확장된 TIL은 소스 종양 조직의 클론 다양성과 비교할 때 보존된 다클론성(비교 가능한 심슨 클론성 계수에 의해 입증됨)을 나타냈다. 도 35b에 도시된 바와 같이, 대규모 생성물을 생산하기 위해 본원에 기술된 MRM 공정을 사용하여 배양된 TIL은 연구 규모에서 MRM을 사용하여 배양된 TIL보다 훨씬 더 많은 다클론성을 나타낸다.

실시예 17: 세포용해 활성 및 전염증성 및 면역억제성 사이토카인 분비 분석

또한, MRM 공정으로 확장된 TIL의 특이성과 종양 사멸을 평가하기 위해 자가 종양 세포를 MRM 확장된 TIL과 공동 배양했다. 자가 종양 세포주는 상기 기재된 바와 같이 얻어졌다. 세포를 1:1, 1:5 및 10:1의 E:T 비율로 도말했다. 종양 세포만을 대조군으로 사용했다. MRM으로 생산된 TIL은 자가 종양 세포주를 사용하여 시험관 내에서 측정했을 때 항-CD3/CD28에 의한 자극에 반응하여 용량 의존적 세포용해 활성 및 전염증성 사이토카인 분비를 포함하여 강력한 항종양 기능을 나타냈다(도 36a-36b). 항-CD3/CD28을 사용한 항원 자극 시 면역억제성 사이토카인을 생성하는 능력을 평가한 결과, MRM으로 확장된 TIL과 대조군 공정으로 확장된 TIL 사이에 유의미한 차이가 나타났다. 도 36c에 도시된 바와 같이, MRM에서 확장되고 배양된 TIL은 대조군 공정을 사용하여 생산된 TIL과 비교하여 훨씬 더 적은 양의 면역억제성 IL-4, IL-5 및 IL-13을 생산했다.

위의 결과는 여기에 설명된 MRM 공정(연구 및 대규모 및 다양한 암의 종양 모두에 대해)이 매우 다양하고 강력한 항종양 활성을 나타내는 TIL을 생성하는 데 유용할 수 있음을 더욱 강조한다.

실시예 18: MRM에서 배양된 TIL의 다클론성 및 항종양 활성 분석

종양 반응성 T 세포 클론이 고도로 풍부한 TIL은 치료에 대한 반응을 중재하는 것으로 나타났다(van den Berg JH, Heemskerk B, van Rooij N, 등 J Immunother Cancer. 2020;8:e000848, Tran E, Turcotte S, Gros A, 등 Clin Cancer Res. 2014;344:641-645, Zacharakis N, Chinnasamy H, Black M, 등 Nat Med. 2018;24:724-730). 기존 TIL 생성물은 광범위하게 분화된 T 세포와 낮은 수준의 줄기 유사 세포의 혼합물로 구성된다. 줄기 유사 T 세포의 비율이 높을수록 TIL 치료를 받은 환자의 결과가 개선되었다(Krishna S, Lowery FJ, Copeland AR. Science. 2020;370:1328-1334). 본원에 기술된(예를 들어, MRM에서) 배양 과정이 TIL의 하나 이상의 특성을 개선할 수 있는지 여부를 추가로 평가하기 위해, 다음 방법을 사용했다.

추정 종양 반응성 클론의 식별, 추적 및 분석

추정 종양 반응성 클론을 분석하기 위한 검증된 방법 사용(Krishna S, Lowery FJ, Copeland AR. Science. 2020;370:1328-1334. Oliviera G, Stromhaug K, Klaeger S, 등 Nature. 2021;596:119-125), 0일 종양 샘플(흑색종, 폐암 또는 결장직장암)의 해리된 종양 현탁액에서 빈도가 높고 고갈된 특성을 나타내는 클론은 추정 종양 반응성으로 확인되었다(도 34). 고갈된 표현형을 가진 클론을 식별하면 종양 반응성이 가장 높은 클론을 포착할 수 있지만, 이러한 클론은 최종 확장된 TIL(예를 들어, 생성물)에서 분화 상태가 다를 수 있다. 상위 100개 고주파 TCR 클론은 대량 RNA-seq을 사용하여 식별되었다. 고갈된 세포 TCR 클론은 단일 세포 RNA-seq 및 단일 세포 TCR-seq를 사용하여 식별되었다. 역시 "고갈"된 100개의 고주파 클론의 하위 집합이 추정 종양 반응성 세포로 확인되었다. 대량 TCR-seq는 확장된 TIL에서 추정 종양 반응성 클론의 존재 및 비율을 결정하는 데 사용되었다. 그런 다음 단일 세포 RNA와 TCR-seq를 사용하여 확장된 TIL에서 종양 반응성 클론의 표현형을 평가했다.

추정 종양 반응성 클론 분석

추정 종양 반응성 클론의 종양 반응성을 입증하기 위해, 추정 종양 반응성 TCR을 건강한 공여자 CD8+ T 세포에 형질도입하고 형질도입된 세포를 선택된 TCR에 해당하는 자가 종양 세포와 공동 배양했다. 종양만이 대조군으로 사용되었다. 종양 반응성은 공동 배양 24시간 후 세포용해 및 IFN _γ 분비로 측정되었다.

또한, 연구 규모 및 대규모로 생산된 MRM 확장 TIL 생성물에서 확인된 추정 종양 반응성 클론에서 종양 반응성이 입증되었다. 확장된 TIL 생성물은 상응하는 해리된 종양 현탁액 또는 상응하는 종양 세포주와 함께 공동 배양되었다. 종양 반응성은 단일 세포 RNA/TCR-seq에서 41BB 및 IFN _γ 발현으로 측정되었다.

실시예 19: 초기 종양 샘플에서 확인된 추정 종양 반응성 클론 보존에 대한 MRM 효과 분석

MRM에서 확장된 각 종양(흑색종, 폐암 및 대장암)의 추정 종양 반응성 클론은 고주파 클론을 식별하기 위해 위에서 설명한 대로 대량 TCR-seq를 사용하여 분리된 종양의 단일 세포 현탁액으로부터 식별되었다. 단일 세포 RNA/TCR-seq를 사용하여 흑색종, 폐암 및 결장암의 종양 반응성 클론(고갈된 표현형을 갖는 클론)을 CXCL13, 4-1BB, PD-1 및 TIGIT에 의해 식별했다(도 37a-37c). 종양 반응성 표현형 및 대량 TCR-seq의 높은 빈도로 확인된 세포는 추정 종양 반응성으로 특성화되었으며 CD8+ 쪽으로 편향되었다(도 37d).

위에서 설명한 대로 MRM에서 확장된 TIL의 확인된 추정 종양 반응성 클론의 종양 반응성을 입증하기 위해 상위 3개의 추정 종양 반응성 TCR을 건강한 공여자 T 세포에 복제하고 해당 자가 종양 세포주와 공동 배양했다. 도 38a에 도시된 바와 같이, 5:1의 E:T 비율에서 3개의 TCR 중 2개가 100% 세포용해를 나타냈다. 세포용해 데이터는 도 38b에 도시된 바와 같이 IFNγ의 특정 분비와 상관관계가 있었다.

연구 규모 및 대규모로 MRM에서 배양 및 확장된 TIL의 추정 종양 반응성 클론은 확장된 TIL을 자가 종양 세포주 또는 해리된 종양 현탁액의 해당 표적과 함께 배양하고 4-1BB+/IFNγ+ 표현형에 기반한 활성화를 측정하여 종양 반응성으로 확인되었다. 도 39의 결과는 대규모 및 연구 규모 과정을 모두 사용하여 MRM에서 확장된 추정 종양 반응성 클론이 높은 빈도로 포착될 때 종양 반응성이 있음을 입증한다.

또한 위에서 설명한 검증된 추정 종양 반응 접근법에 따라, (a) 제어 공정, (b) 연구 규모의 MRM 공정 또는 (c) 흑색종, 결장 및 NSCLC 종양 유형의 대규모 MRM 공정을 사용하여 확장된 TIL의 대량 TCR-seq 분석은 위에서 설명한 방법에 따라 수행되었다. 대량TCR-seq는 연구 규모에서 TIL을 확장하기 위한 MRM 공정과 제어 공정이 비슷한 수의 추정 종양 반응성 클론을 보존한다는 것을 보여주었지만, 대규모 MRM 공정은 확인된 추정 종양 반응성 클론의 평균 94%를 보존했다(데이터 표시되지 않음).

추정 종양 반응성 클론은 종양 반응성 표현형(CXCL13, 4-1BB, PD-1 및 TIGIT)에 의해 0일 분리된 종양 샘플에서 확인되었다(Pasetto 등 CIR 2016, Lowrey 등 Science 2022, Oliveira 등 Nature 2021). 이러한 추정 종양 반응성 클론은 표 5에 표시된 대로 제어 공정 또는 MRM 대규모 공정을 사용하여 확장 후 보존된 클론의 수를 확인하기 위해 본원에 기술된 대로 scRNAseq로 분석되었다.

표 5: 추정 반응성 클론 수

상기 결과는 본원에 기술된 MRM 과정이 초기 TIL 집단 내에 존재하는 추정 종양 반응성 클론을 보존하고 이러한 추정 종양 반응성 클론이 실제로 종양 반응성임을 종합적으로 입증한다.

실시예 20: 초기 종양 샘플에서 확인된 추정 종양 반응성 세포의 줄기세포능에 대한 MRM의 효과 분석

다음으로, MRM 공정이 TIL의 다양한 특성을 개선하는 데 미치는 영향을 추가로 평가하기 위해 (a) 대조군 공정, (b) 연구 규모 MRM 공정 또는 (c) 대규모 MRM 공정을 사용하여 TIL을 확장 및 배양했다. 단일 세포 RNA/TCR-seq 분석을 수행하여 23개의 TIL 생성물(대조군 9개, MRM 연구 규모 9개, MRM 대규모 6개)에서 반응성 추정 종양의 표현형을 특성화했다. (a), (b), (c) 조건에서 확장된 모든 TIL에 대한 균일 다양체 근사 및 투영(UMAP)은 도 40a에 나와 있다. 모든 조건에서 확장된 모든 TIL의 줄기 유사 클러스터는 표 3에 나열된 SELL+, CD39-, CD69- 및 유전자 세트의 발현으로 확인되었으며, 도 40b에 발현 수준의 그라데이션으로 표시되어 있다. 도 40c-40d는 예상대로 종양 반응성 클론이 일반적으로 비-줄기 유사 클러스터에서 농축되어 있음을 보여준다. 그리고 도 41a와 41b에서 각각 줄기세포능 또는 고갈과 관련된 다양한 유전자의 차등 발현에서 알 수 있듯이, 대규모와 소규모 모두에서 MRM으로 확장된 종양 반응성 추정 TIL은 대조군과 비교했을 때 줄기세포능이 증가하고 소진이 감소한 것으로 나타났다. 이를 추가적으로 뒷받침하기 위해 GSEA는 다양한 유전자 세트에 대한 정규화 농축 점수(NES)를 통해 연구(도 41c)와 대규모(도 41d) 모두에서 MRM을 사용하여 확장된 TIL에서 줄기 관련 유전자 세트의 상향 조절과 고갈 관련 유전자에 대한 하향 조절을 확인했다. 또한 도 42에서 볼 수 있듯이, 연구용 및 대규모로 MRM에서 배양 및 확장된 TIL은 대조 공정으로 배양된 TIL에 비해 CD8+ 줄기 유사 세포의 백분율이 더 높았다.

종합적으로, 위의 결과는 본 문서에 제공된 MRM 공정이 TIL에 미치는 전반적인 효과(예를 들어, 줄기세포능 증가 및 고갈 감소)가 생성물의 검증된 종양 반응성 세포 집단 내에서 구체적으로 나타난다는 것을 추가로 입증한다. 여기에 제공된 결과는 여기에 설명된 MRM 공정이 종양 반응성 및 줄기세포능을 비롯한 향상된 특성을 가진 TIL 생성물을 생성하는 데 유용하다는 것을 확인시켜 준다.

실시예 21: 면역 체크포인트 억제제로 처리된 종양 및 나이브 종양에 대한 MRM 효과 분석

면역 체크포인트 억제제의 발전은 암치료에 상당한 영향을 미쳤다. 그러나 점점 더 많은 연구에서 특정 종양이 면역 체크포인트 요법에 저항성을 갖거나 치료를 통해 보다 저항성을 갖게 될 수 있다는 사실이 제시되었다. 예를 들어, Levi 등, Clin Cancer Res 28(14): 3042-3052 (2022년 7월)를 참조한다. 본원에 기술된 세포 조성물(예를 들어, MRM에서 확장되고 배양된 TIL)이 성공적으로 확장될 수 있고 면역 체크포인트 억제제에 불응성인 종양에 대해 필적할 만한 치료 효과를 가질 수 있음을 입증하기 위해, 나이브 종양(즉, 이전에 면역 체크포인트 억제제로 치료되지 않은) 또는 이전에 하나 이상의 면역 체크포인트 억제제로 치료된 종양의 TIL을 본원에 기술된 대조군 공정 또는 MRM 공정을 사용하여 확장시키고 배양했다. 그런 다음, 생성된 TIL의 줄기세포능과 다클론성 모두 이전 실시예에 설명된 방법 중 하나 이상을 사용하여 평가되었다.

도 43b 및 43c에 도시된 바와 같이, MRM 공정을 사용하여 TIL은 대조군 공정과 비교하여 증가된 줄기세포능을 나타냈고(CD39-CD69- 세포의 백분율 증가로 입증됨) CD8+ T 세포 쪽으로 더 기울어졌다. 이는 TIL이 나이브 종양에서 나온 것인지, 이전에 면역 체크포인트 억제제로 치료받은 종양에서 나온 것인지와 무관한 사실이었다. 그리고, 도 43a에 도시된 바와 같이, 대조군 공정과 비교하여 MRM 공정을 사용하면 모든 ICB 샘플이 대조군 그룹의 샘플 중 단 하나에 비해 추가 확장을 위한 충분한 사전 Rep 수율을 생산했다.

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발명의 내용 및 요약서 섹션이 아니라 상세한 설명 섹션이 청구범위를 해석하는 데 사용되도록 의도됨을 이해해야 한다. 과제의 해결 수단 및 요약서 섹션은 발명자(들)에 의해 고려된 바와 같이 본 개시내용의 하나 이상의, 그러나 모두는 아닌 예시적 실시양태를 제시할 수 있으며, 따라서 어떤 방식으로든 본 개시내용 및 첨부된 청구범위를 제한하도록 의도되지 않는다.

본 개시내용은 명시된 기능 및 그 관계의 구현을 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움으로 위에서 설명되었다. 이러한 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본원에서 임의로 정의되었다. 명시된 기능과 그 관계가 적절하게 수행되는 한 대체 경계가 정의될 수 있다.

특정 실시양태에 대한 전술한 설명은 다른 사람들이 본 발명의 일반적인 개념에서 벗어나지 않으면서 과도한 실험 없이 그러한 특정 실시양태를 다양한 적용을 위해 당업계 내의 지식을 적용함으로써 쉽게 수정 및/또는 적응할 수 있도록 본 개시내용의 일반적인 특성을 완전히 드러낼 것이다. 따라서, 그러한 적응 및 수정은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 실시양태의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원의 어법 또는 용어는 설명을 위한 것이며 제한이 아닌 것으로 이해해야 하며, 따라서 본 명세서의 용어 또는 어법은 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 한다.

본 발명의 폭과 범위는 상술된 예시적인 실시양태에 의해 제한되어서는 안 되며, 다음 청구범위 및 그 등가물에 따라서만 한정되어야 한다.

본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 인용 참고문헌(문헌 참고문헌, 미국 또는 외국 특허 또는 특허 출원, 및 웹사이트 포함)의 내용은 거기에 인용된 참고문헌과 같이 임의의 목적을 위해 전문이 본원에 기록된 것처럼 명시적으로 참조로 포함된다. 불일치가 발생하는 경우 문자 그대로 본원에 개시된 자료가 우선한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

약 30mM 내지 약 100mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 대사 재프로그래밍 배지(metabolic reprogramming medium)("MRM")에 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)의 이종 집단을 배치하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 TIL을 배양하는 방법.
제1항에 있어서, TIL의 이종 집단이 MRM에 배치된 후 CD8⁺ TIL이 농축되는 방법.
약 30mM 내지 약 100mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 MRM에서 TIL의 이종 집단을 배양하는 것을 포함하는, 생체 외 또는 시험관 내에서 CD8⁺ TIL의 수 또는 백분율을 증가시키는 방법.
약 30mM 내지 약 100mM 농도의 칼륨 이온을 포함하는 MRM에서 생체 외 또는 시험관 내에서 TIL의 이종 집단을 배양하는 것을 포함하는, CD8⁺ 농축 TIL 집단을 제조하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 이종 집단이 CD4⁺ TIL 및 CD8⁺ TIL을 포함하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 이종 집단이 대상체로부터 얻은 하나 이상의 종양 샘플로부터 얻은 것인 방법.
제6항에 있어서, 종양 샘플이 초기 TIL 배양된 것인 방법.
제7항에 있어서, 초기 TIL 배양이 MRM에서 종양 샘플을 배양하는 것을 포함하는 방법.
제8항에 있어서, MRM이 초기 TIL 배양 동안 IL-2를 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서, MRM이 초기 TIL 배양 동안 IL-7, IL-15, IL-21 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, MRM이 초기 TIL 배양 동안 IL-2 및 IL-21을 포함하는 것인 방법.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양이 적어도 약 14-19일간 지속되는 방법.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양이 적어도 약 14일간 지속되는 방법.
제7항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL의 비율이 초기 TIL 배양 이전의 비-CD8⁺ TIL에 대한 CD8⁺ TIL의 비율과 비교하여 초기 TIL 배양 후 증가되는 방법.
제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 초기 TIL 배양 후 자극되는 방법.
제15항에 있어서, TIL이 CD3 작용제(agonist) 및/또는 CD28 작용제와 함께 TIL을 배양함으로써 자극되는 방법.
제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 샘플이 종양 생검을 포함하는 방법.
제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 샘플이 배양 전에 단편화되는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 이종 집단의 배양 후, 집단 내 TIL의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%가 CD8⁺ TIL인 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 이종 집단의 배양 후, 집단 내 TIL의 적어도 약 50%가 CD8⁺ TIL인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, MRM이 나트륨 이온, 칼슘 이온, 글루코스 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, MRM이 세포 확장제를 추가로 포함하는 방법.
제22항에 있어서, 세포 확장제가 GSK3B 억제제, ACLY 억제제, PI3K 억제제, AKT 억제제 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제23항에 있어서, PI3K 억제제가 LY294002, 픽틸리십(pictilisib), CAL101, IC87114 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제24항에 있어서, AKT 억제제가 MK2206, A443654, AKTi-VIII 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제3항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 칼륨 이온의 농도가 적어도 약 30mM, 적어도 약 35mM, 적어도 약 40mM, 적어도 약 45mM, 적어도 약 50mM, 적어도 약 55mM, 적어도 약 60mM, 적어도 약 65mM, 적어도 약 70mM, 적어도 약 75mM, 적어도 약 80mM, 적어도 약 85mM, 적어도 약 90mM, 적어도 약 95mM 또는 적어도 약 100mM인 방법.
제3항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 칼륨 이온의 농도가 약 30mM 내지 약 100mM, 약 30mM 내지 약 90mM, 약 30mM 내지 약 80mM, 약 30mM 내지 약 70mM, 약 30mM 내지 약 60mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 100mM, 약 40mM 내지 약 90mM, 약 40mM 내지 약 80mM, 약 40mM 내지 약 70mM, 약 40mM 내지 약 60mM 또는 약 40mM 내지 약 50mM인 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 칼륨 이온의 농도가 약 40mM 내지 약 90mM인 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 칼륨 이온의 농도가 약 50mM 내지 약 90mM인 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 칼륨 이온의 농도가 약 50mM 내지 약 80mM인 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, MRM이 나트륨 이온을 추가로 포함하는 방법.
제31항에 있어서, 나트륨 이온의 농도가 약 25mM 내지 약 100mM인 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서, 나트륨 이온의 농도가 약 30mM 내지 약 40mM, 약 30mM 내지 약 50mM, 약 30mM 내지 약 60mM, 약 30mM 내지 약 70mM, 약 30mM 내지 약 80mM, 약 40mM 내지 약 50mM, 약 40mM 내지 약 60mM, 약 40mM 내지 약 70mM, 약 40mM 내지 약 80mM, 약 50mM 내지 약 55mM, 약 50mM 내지 약 60mM, 약 50mM 내지 약 65mM, 약 50mM 내지 약 70mM, 약 50mM 내지 약 75mM, 약 50mM 내지 약 80mM, 약 55mM 내지 약 60mM, 약 55mM 내지 약 65mM, 약 55mM 내지 약 70mM, 약 55mM 내지 약 75mM, 약 55mM 내지 약 80mM, 약 60mM 내지 약 65mM, 약 60mM 내지 약 70mM, 약 60mM 내지 약 75mM, 약 60mM 내지 약 80mM, 약 70mM 내지 약 75mM, 약 70mM 내지 약 80mM 또는 약 75mM 내지 약 80mM인 방법.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 나트륨 이온의 농도가 약 30mM, 약 35mM, 약 40mM, 약 45mM, 약 50mM, 약 55mM, 약 60mM, 약 65mM, 약 70mM, 약 75mM 또는 약 80mM인 방법.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 나트륨 이온의 농도가 약 55mM인 방법.
제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 나트륨 이온의 농도가 약 60mM인 방법.
제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 나트륨 이온의 농도가 약 65mM인 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, MRM이 글루코스를 추가로 포함하는 방법.
제38항에 있어서, 글루코스의 농도가 약 10mM 초과인 방법.
제38항 또는 제39항에 있어서, 글루코스의 농도가 약 10mM 내지 약 25mM, 약 10mM 내지 약 20mM, 약 15mM 내지 약 25mM, 약 15mM 내지 약 20mM, 약 15mM 내지 약 19mM, 약 15mM 내지 약 18mM, 약 15mM 내지 약 17mM, 약 15mM 내지 약 16mM, 약 16mM 내지 약 20mM, 약 16mM 내지 약 19mM, 약 16mM 내지 약 18mM, 약 16mM 내지 약 17mM, 약 17mM 내지 약 20mM, 약 17mM 내지 약 19mM 또는 약 17mM 내지 약 18mM인 방법.
제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스의 농도가 약 10mM, 약 11mM, 약 12mM, 약 13mM, 약 14mM, 약 15mM, 약 16mM, 약 17mM, 약 18mM, 약 19mM, 약 20mM, 약 21mM, 약 22mM, 약 23mM, 약 24mM 또는 약 25mM인 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, MRM이 칼슘 이온을 추가로 포함하는 방법.
제42항에 있어서, 칼슘 이온의 농도가 약 0.4mM 초과인 방법.
제42항 또는 제43항에 있어서, 칼슘 이온의 농도가 약 0.4mM 내지 약 2.5mM, 약 0.5mM 내지 약 2.0mM, 약 1.0mM 내지 약 2.0mM, 약 1.1mM 내지 약 2.0mM, 약 1.2mM 내지 약 2.0mM, 약 1.3mM 내지 약 2.0mM, 약 1.4mM 내지 약 2.0mM, 약 1.5mM 내지 약 2.0mM, 약 1.6mM 내지 약 2.0mM, 약 1.7mM 내지 약 2.0mM, 약 1.8mM 내지 약 2.0mM, 약 1.2 내지 약 1.3mM, 약 1.2 내지 약 1.4mM, 약 1.2 내지 약 1.5mM, 약 1.2 내지 약 1.6mM, 약 1.2 내지 약 1.7mM, 약 1.2 내지 약 1.8mM, 약 1.3 내지 약 1.4mM, 약 1.3 내지 약 1.5mM, 약 1.3 내지 약 1.6mM, 약 1.3 내지 약 1.7mM, 약 1.3 내지 약 1.8mM, 약 1.4 내지 약 1.5mM, 약 1.4 내지 약 1.6mM, 약 1.4 내지 약 1.7mM, 약 1.4 내지 약 1.8mM, 약 1.5 내지 약 1.6mM, 약 1.5 내지 약 1.7mM, 약 1.5 내지 약 1.8mM, 약 1.6 내지 약 1.7mM, 약 1.6 내지 약 1.8mM 또는 약 1.7 내지 약 1.8mM인 방법.
제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 칼슘 이온의 농도가 약 1.0mM, 약 1.1mM, 약 1.2mM, 약 1.3mM, 약 1.4mM, 약 1.5mM, 약 1.6mM, 약 1.7mM, 약 1.8mM, 약 1.9mM 또는 약 2.0mM인 방법.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, MRM이 약 40mM 내지 약 90mM 칼륨 이온 및
(ⅰ) 약 40mM 내지 약 80mM 나트륨 이온;
(ⅱ) 약 10mM 내지 약 24mM 글루코스;
(ⅲ) 약 0.5mM 내지 약 2.8mM 칼슘 이온; 또는
(ⅳ) (ⅰ)-(ⅲ)의 임의의 조합
을 포함하는 방법.
a. 초기 TIL 배양 배지에서 TIL을 배양하는 단계;
b. 2차 TIL 배양 배지에서 TIL을 배양하는 단계;
c. 3차(또는 최종) TIL 배양 배지에서 TIL을 배양하는 단계
를 포함하는 인간 대상체로부터 얻은 TIL을 확장하는 방법으로서,
상기 초기 TIL 배양 배지, 2차 TIL 확장 배지 및/또는 3차 TIL 확장 배지가 MRM인 방법.
제47항에 있어서, 초기 TIL 배양 배지 및 2차 TIL 확장 배지가 고칼륨성(hyperkalemic)이고 3차 TIL 확장 배지가 고칼륨성이 아닌 방법.
제47항 또는 제48항에 있어서, 초기 TIL 배양 배지가 IL-2를 추가로 포함하는 방법.
제49항에 있어서, 초기 TIL 배양 배지가 IL-21을 추가로 포함하는 방법.
제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양 배지가 T 세포 보충제, 혈청 대체물, 글루타민, 글루타민 대체물(예를 들어, 글루타맥스(L-알라닌-L-글루타민)), 비필수 아미노산, 항생제(예를 들어, 페니실린, 스트렙토마이신 또는 둘 다), 항진균제(예를 들어, FUNGIN™) 및/또는 나트륨 피루베이트를 추가로 포함하는 방법.
제47항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 적어도 약 1주, 적어도 약 2주 또는 적어도 약 3주 동안 초기 TIL 배양 배지에서 배양되는 방법.
제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 초기 배양에서 세포 수율이 단편당 적어도 약 1×10⁵개, 적어도 약 2×10⁵개, 적어도 약 3×10⁵개, 적어도 약 4×10⁵개, 적어도 약 5×10⁵개, 적어도 약 6×10⁵개, 적어도 약 7×10⁵개, 적어도 약 8×10⁵개, 적어도 약 9×10⁵개, 적어도 약 1×10⁶개, 적어도 약 2×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개 또는 적어도 약 10×10⁶개의 세포에 도달할 때까지 초기 TIL 배양 배지에서 배양되는 방법.
제47항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 (b)의 2차 TIL 배양 배지에서 또는 그 이전에 CD3 작용제, CD28 작용제 또는 둘 다로 자극되는 방법.
제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 2차 TIL 배양 배지에서 또는 그 이전에 CD27 작용제로 추가로 자극되는 방법.
제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 2차 TIL 배양 배지에서 또는 그 이전에 4-1BB 작용제로 추가로 자극되는 방법.
제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 자극 후 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일, 적어도 약 21일, 적어도 약 22일, 적어도 약 23일, 적어도 약 24일, 적어도 약 25일 또는 적어도 약 26일 동안 배양되는 방법.
제47항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, TIL은 세포 수율이 적어도 약 1×10⁷개, 적어도 약 2×10⁷개, 적어도 약 3×10⁷개, 적어도 약 4×10⁷개, 적어도 약 5×10⁷개, 적어도 약 6×10⁷개, 적어도 약 7×10⁷개, 적어도 약 8×10⁷개, 적어도 약 9×10⁷개, 적어도 약 10×10⁷개, 적어도 약 11×10⁷개, 적어도 약 12×10⁷개, 적어도 약 13×10⁷개, 적어도 약 14×10⁷개, 적어도 약 15×10⁷개, 적어도 약 16×10⁷개, 적어도 약 17×10⁷개, 적어도 약 18×10⁷개, 적어도 약 19×10⁷개 또는 적어도 약 20×10⁷개의 세포에 도달할 때까지 2차 배양 배지에서 배양되는 방법.
제47항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 3차 TIL 배양 배지에서 CD3 작용제, CD28 작용제, CD27 작용제 및/또는 4-1BB 작용제로 자극되는 방법.
제59항에 있어서, 3차 TIL 배양 배지가 고칼륨성이 아닌 방법.
제59항 또는 제60항에 있어서, TIL이 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 15일, 적어도 약 16일, 적어도 약 17일, 적어도 약 18일, 적어도 약 19일, 적어도 약 20일 또는 적어도 약 21일 동안 3차 TIL 배양 배지에서 배양되는 방법.
다음을 포함하는, 종양 반응성 TIL을 증가시키는 방법:
a. 고칼륨성이고 IL-2 및 선택적으로 IL-21을 포함하는 초기 TIL 배양 배지에서 하나 이상의 종양 단편을 최대 약 14 내지 19일간 배양함으로써 종양 단편으로부터 TIL을 얻는 단계;
b. (ⅰ) CD3 작용제 및 (ⅱ) CD28 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제 또는 이들의 임의의 조합을 첨가한 후, 고칼륨성인 2차 TIL 배양 배지에서 TIL을 약 7일 내지 적어도 약 14일 동안 배양하는 단계;
c. (ⅰ) CD3 작용제 및 (ⅱ) CD28 작용제, CD27 작용제, 4-1BB 작용제 또는 이들의 임의의 조합을 첨가한 후, 고칼륨성이 아닌 3차 TIL 배양 배지에서 TIL을 약 14일 내지 적어도 약 21일 동안 배양하는 단계.
제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 고칼륨성이 아닌 대조군 배지에서 배양한 후 TIL 집단에서 TCF7 발현에 비해 MRM에서 배양한 후 TCF7의 증가된 발현을 나타내는 방법.
제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, TIL 집단이 고칼륨성이 아닌 대조군 배지에서 배양한 후 CD8⁺ CD62L⁺ TIL의 비율에 비해 MRM에서 배양한 후 CD8⁺ CD62L⁺ TIL의 증가된 비율을 포함하는 방법.
제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, TIL 집단이 고칼륨성이 아닌 대조군 배지에서 배양한 후 CD8⁺ PD1⁺ TIL의 비율에 비해 MRM에서 배양한 후 CD8⁺ PD1⁺ TIL의 증가된 비율을 포함하는 방법.
제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 종양을 앓고 있는 대상체에게 TIL 집단을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제66항에 있어서, 종양이 체크포인트 억제제에 불응성인 방법.
제67항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 재발되는 방법.
제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 전이성인 방법.
제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 방법에 따라 배양된 하나 이상의 CD8⁺ TIL을 포함하는, 면역 세포의 조성물.
제72항에 있어서, 면역 세포의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%가 CD8⁺ TIL인 조성물.
면역 세포 집단을 포함하는 조성물로서, 면역 세포의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%가 CD8⁺ TIL인 조성물.
제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 적어도 약 50%가 CD8⁺ TIL인 조성물.
제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 고칼륨성이 아닌 대조군 배지에서 배양한 후 면역 세포 집단에서 TCF7 발현에 비해 MRM에서 배양한 후 TCF7의 증가된 발현을 나타내는 조성물.
제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%가 CD8⁺/CD62L⁺ TIL인 조성물.
제72항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양 종료 시 얻은 CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 PD1⁺인 조성물.
제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양 종료 시 얻은 CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 CD39⁺인 조성물.
제72항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 CD27⁺인 조성물.
제72항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, CD8+ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 CD28⁺인 조성물.
제72항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양 종료 시 얻은 CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 PD1⁺CD39⁺인 조성물.
제72항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양 종료 시 얻은 CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 PD1⁺ CD27⁺인 조성물.
제72항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 CD27⁺ CD62L⁺인 조성물.
제72항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양 종료 시 얻은 CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 CD28⁺ CD103⁺ PD1⁺ TCF7⁺인 조성물.
제72항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 2×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개 또는 적어도 약 1×10⁷개의 세포를 포함하는 조성물.
제72항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 1×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개 또는 적어도 약 1×10⁷개의 CD8⁺ 세포를 포함하는 조성물.
제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 방법에 따라 배양되는 TIL 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양의 치료가 필요한 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
제88항에 있어서, 종양이 체크포인트 억제제에 불응성인 방법.
제89항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제89항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 재발되는 방법.
제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 전이성인 방법.
제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, TIL 집단은 CD8⁺ TIL이 농축되어 있는 방법.
제88항 또는 제94항에 있어서, TIL 집단에서 TIL의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%가 CD8⁺ TIL인 방법.
제88항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, TIL 집단에서 TIL의 적어도 약 50%가 CD8⁺ TIL인 방법.
제72항 내지 제87항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양의 치료가 필요한 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
제97항에 있어서, 종양이 체크포인트 억제제에 불응성인 방법.
제98항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제99항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 재발되는 방법.
제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 전이성인 방법.
제88항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 고형 종양을 포함하는 방법.
제88항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 흑색종, 결장암, 폐암, 자궁경부암, 위장관암, 유방암, 전립선암, 간암, 골암, 췌장암, 두경부의 소세포 암종(small cell carcinoma of the head and neck), 폐 편평 세포 암종(lung squamous cell carcinoma), 폐 선암종(lung adenocarcinoma), 췌장 선암종(pancreatic adenocarcinoma), 두경부 편평 세포 암종(head and neck squamous cell carcinoma), 고환 생식 세포 종양(testicular germ cell tumor), 위 선암종(stomach adenocarcinoma), 피부 흑색종(skin cutaneous melanoma), 중피종(mesothelioma), 신장 투명 세포 암종(kidney renal clear cell carcinoma), 자궁경부 편평 상피세포 암종(cervical squamous cell carcinoma) 및 자궁경내 선암종(endocervical adenocarcinoma), 식도 암종(esophageal carcinoma), 방광 요로상피 암종(bladder urothelial carcinoma), 유방 침윤성 암종(breast invasive carcinoma), 신장 유두 세포 암종(kidney renal papillary cell carcinoma), 결장 선암종(colon adenocarcinoma) 또는 이들의 임의의 조합에서 유래된 고형 종양을 포함하는 방법.
제88항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 유효량의 TIL 집단이 대상체에 대해 적어도 약 2×10⁹개, 적어도 약 3×10⁹개, 적어도 약 4×10⁹개, 적어도 약 5×10⁹개, 적어도 약 6×10⁹개, 적어도 약 7×10⁹개, 적어도 약 8×10⁹개, 적어도 약 9×10⁹개, 또는 적어도 약 1×10¹⁰개, 또는 적어도 약 10×10¹⁰개, 또는 적어도 약 15×10¹⁰개, 또는 적어도 약 20×10¹⁰개, 또는 적어도 약 25×10¹⁰개, 또는 적어도 약 30×10¹⁰개의 세포인 방법.
제88항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 유효량의 TIL 집단이 대상체에 대해 적어도 약 1×10⁹개, 적어도 약 3×10⁹개, 적어도 약 4×10⁹개, 적어도 약 5×10⁹개, 적어도 약 6×10⁹개, 적어도 약 7×10⁹개, 적어도 약 8×10⁹개, 적어도 약 9×10⁹개 또는 적어도 약 1×10⁹개의 CD8⁺ 세포인 방법.
제88항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제107항에 있어서, 체크포인트 억제제가 세포 집단을 투여한 후 대상체에게 투여되는 방법.
제107항 또는 제108항에 있어서, 체크포인트 억제제가 CTLA-4 길항제, PD1 길항제, TIM-3 길항제 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-CTLA-4 항체, 항-PD1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM-3 항체 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
제107항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제가 TIL의 집단을 투여한 이후에 대상체에게 투여되는 방법.
제88항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제112항에 있어서, 체크포인트 활성화제가 OX40 작용제, LAG-3 작용제, 4-1BB(CD137) 작용제, GITR 작용제, TIM3 작용제 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
제112항 또는 제113항에 있어서, 체크포인트 활성화제가 항-OX40 항체, 항-LAG-3 항체, 항-CD137 항체, 항-GITR 항체, 항-TIM3 항체 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
제88항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제115항에 있어서, 사이토카인이 TIL 집단을 투여한 후 대상체에게 투여되는 방법.
제115항 또는 제116항에 있어서, 사이토카인이 IL-2인 방법.
제88항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단을 투여하기 전에 대상체에게 림프구고갈 요법(lymphodepleting therapy)을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제118항에 있어서, 림프구고갈 요법이 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 플루다라빈(fludarabine), 또는 사이클로포스파미드와 플루다라빈 모두를 포함하는 방법.
제1항 내지 제71항 및 제88항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, TIL의 이종 집단이 대조군 배지에 배치된 TIL의 이종 집단의 클론 다양성과 비교하여 MRM에 배치된 후 증가된 클론 다양성을 갖는 방법.
제1항 내지 제71항 및 제88항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성이 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 99% 내지 약 100%, 적어도 약 98% 내지 약 100%, 적어도 약 97% 내지 약 100%, 적어도 약 96% 내지 약 100%, 적어도 약 95% 내지 약 100%, 적어도 약 94% 내지 약 100%, 적어도 약 93% 내지 약 100%, 적어도 약 92% 내지 약 100%, 적어도 약 91% 내지 약 100%, 적어도 약 90% 내지 약 100%, 적어도 약 85% 내지 약 100%, 적어도 약 80% 내지 약 100%, 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 70% 내지 약 100%, 적어도 약 65% 내지 약 100%, 적어도 약 60% 내지 약 100%, 적어도 약 55% 내지 약 100%, 적어도 약 50% 내지 약 100%, 적어도 약 45% 내지 약 100% 또는 적어도 약 40% 내지 약 100%인 방법.
제1항 내지 제71항 및 제88항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성 점수가 심슨 클론성(Simpsons clonality)으로 측정했을 때 약 0.5 미만, 약 0.45 미만, 약 0.4 미만, 약 0.35 미만, 약 0.3 미만, 약 0.275 미만, 약 0.25 미만, 약 0.225 미만, 약 0.2 미만, 약 0.175 미만, 약 0.15 미만, 약 0.125 미만, 약 0.1 미만, 약 0.075 미만, 약 0.07 미만, 약 0.06 미만 또는 약 0.05 미만인 방법.
제1항 내지 제71항 및 제88항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.3 미만인 방법.
제1항 내지 제71항 및 제88항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.25 미만인 방법.
제1항 내지 제71항 및 제88항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.2 미만인 방법.
제1항 내지 제71항 및 제88항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, MRM에 배치된 후 TIL의 이종 집단의 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.1 미만인 방법.
제72항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성이 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 99% 내지 약 100%, 적어도 약 98% 내지 약 100%, 적어도 약 97% 내지 약 100%, 적어도 약 96% 내지 약 100%, 적어도 약 95% 내지 약 100%, 적어도 약 94% 내지 약 100%, 적어도 약 93% 내지 약 100%, 적어도 약 92% 내지 약 100%, 적어도 약 91% 내지 약 100%, 적어도 약 90% 내지 약 100%, 적어도 약 85% 내지 약 100%, 적어도 약 80% 내지 약 100%, 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 70% 내지 약 100%, 적어도 약 65% 내지 약 100%, 적어도 약 60% 내지 약 100%, 적어도 약 55% 내지 약 100%, 적어도 약 50% 내지 약 100%, 적어도 약 45% 내지 약 100% 또는 적어도 약 40% 내지 약 100%인 조성물.
제72항 내지 제87항 및 제127항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.5 미만, 약 0.45 미만, 약 0.4 미만, 약 0.35 미만, 약 0.3 미만, 약 0.275 미만, 약 0.25 미만, 약 0.225 미만, 약 0.2 미만, 약 0.175 미만, 약 0.15 미만, 약 0.125 미만, 약 0.1 미만, 약 0.075 미만, 약 0.07 미만, 약 0.06 미만 또는 약 0.05 미만인 조성물.
제72항 내지 제87항, 제127항 및 제128항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.3 미만인 조성물.
제72항 내지 제87항 및 제127항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.25 미만인 조성물.
제72항 내지 제87항 및 제127항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.2 미만인 조성물.
제72항 내지 제87항 및 제127항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.1 미만인 조성물.
클론 다양성이 종양 샘플에서 TIL의 클론 다양성의 적어도 약 99% 내지 약 100%, 적어도 약 98% 내지 약 100%, 적어도 약 97% 내지 약 100%, 적어도 약 96% 내지 약 100%, 적어도 약 95% 내지 약 100%, 적어도 약 94% 내지 약 100%, 적어도 약 93% 내지 약 100%, 적어도 약 92% 내지 약 100%, 적어도 약 91% 내지 약 100%, 적어도 약 90% 내지 약 100%, 적어도 약 85% 내지 약 100%, 적어도 약 80% 내지 약 100%, 적어도 약 75% 내지 약 100%, 적어도 약 70% 내지 약 100%, 적어도 약 65% 내지 약 100%, 적어도 약 60% 내지 약 100%, 적어도 약 55% 내지 약 100%, 적어도 약 50% 내지 약 100%, 적어도 약 45% 내지 약 100% 또는 적어도 약 40% 내지 약 100%인 확장된 TIL 집단.
클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.5 미만, 약 0.45 미만, 약 0.4 미만, 약 0.35 미만, 약 0.3 미만, 약 0.275 미만, 약 0.25 미만, 약 0.225 미만, 약 0.2 미만, 약 0.175 미만, 약 0.15 미만, 약 0.125 미만, 약 0.1 미만, 약 0.075 미만, 약 0.07 미만, 약 0.06 미만 또는 약 0.05 미만인 확장된 TIL 집단.
제133항 또는 제134항에 있어서, 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.3 미만인 확장된 TIL 집단.
제133항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.25 미만인 확장된 TIL 집단.
제133항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.2 미만인 확장된 TIL 집단.
제133항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 클론 다양성 점수가 심슨 클론성으로 측정했을 때 약 0.1 미만인 확장된 TIL 집단.
제133항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 2×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개 또는 적어도 약 1×10⁷개의 세포를 포함하는 확장된 TIL 집단.
제133항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 약 1×10⁶개, 적어도 약 3×10⁶개, 적어도 약 4×10⁶개, 적어도 약 5×10⁶개, 적어도 약 6×10⁶개, 적어도 약 7×10⁶개, 적어도 약 8×10⁶개, 적어도 약 9×10⁶개 또는 적어도 약 1×10⁷개의 CD8⁺ 세포를 포함하는 확장된 TIL 집단.
제133항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 TIL의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80%가 CD8⁺ TIL인 확장된 TIL 집단.
제133항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 TIL의 적어도 약 50%가 CD8⁺ TIL인 확장된 TIL 집단.
제133항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 TIL이 고칼륨성이 아닌 대조군 배지에서 배양한 후 면역 세포 집단에서 TCF7 발현에 비해 MRM에서 배양한 후 TCF7의 증가된 발현을 나타내는 확장된 TIL 집단.
제133항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 확장된 TIL의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70% 또는 적어도 약 75%가 CD8⁺/CD62L⁺ TIL인 확장된 TIL 집단.
제141항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 PD1⁺인 확장된 TIL 집단.
제141항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 CD39⁺인 확장된 TIL 집단.
제141항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 CD27⁺인 확장된 TIL 집단.
제141항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 CD28⁺인 확장된 TIL 집단.
제141항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 PD1⁺ CD39⁺인 확장된 TIL 집단.
제141항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 PD1⁺ CD27⁺인 확장된 TIL 집단.
제141항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 CD27⁺ CD62L⁺인 확장된 TIL 집단.
제141항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, CD8⁺ TIL의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50%가 CD27⁺ CD28⁺ CD103⁺ PD1⁺ TCF7⁺인 확장된 TIL 집단.
제127항 내지 제132항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제133항 내지 제152항 중 어느 한 항의 확장된 TIL 집단을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법.
제153항에 있어서, 종양이 체크포인트 억제제에 불응성인 방법.
제154항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제154항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제153항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 재발되는 방법.
제153항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 전이성인 방법.
제72항 내지 제87항 및 제127항 내지 제132항 중 어느 한 항, 또는 제133항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 적어도 하나의 면역 세포를 포함하는 조성물 또는 확장된 TIL 집단.
제72항 내지 제87항, 제127항 내지 제132항 및 제159항 중 어느 한 항, 또는 제133항 내지 제152항 및 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기 유사 마커가 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+ 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물 또는 확장된 TIL 집단.
제72항 내지 제87항, 제127항 내지 제132항, 제159항 및 제160항 중 어느 한 항, 또는 제133항 내지 제152항, 제159항 및 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 유사 마커가 pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+, STAT3+ 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 조성물 또는 확장된 TIL 집단.
제72항 내지 제87항, 제127항 내지 제132항, 제159항, 제160항 및 제161항 중 어느 한 항, 또는 제133항 내지 제152항, 제159항, 제160항 및 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 집단에서 확장된 TIL의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 약 100%가 하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 발현하는 적어도 하나의 면역 세포를 포함하는 조성물 또는 확장된 TIL 집단.
하나 이상의 줄기 유사 마커 및 하나 이상의 이펙터 유사 마커를 포함하는 TIL.
제163항에 있어서, 줄기 유사 마커가 CD45RA+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, BACH2+, LEF1+, TCF7+ 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 TIL.
제163항 또는 제164항에 있어서, 이펙터 유사 마커가 pSTAT5+, STAT5+, pSTAT3+, STAT3+ 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 TIL.
제163항 내지 제165항 중 어느 한 항의 TIL을 포함하는 확장된 TIL 집단.
제166항에 있어서, 확장된 TIL 세포의 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 약 100%가 제163항 내지 제166항 중 어느 한 항의 TIL을 포함하는 확장된 TIL 집단.
제163항 내지 제165항 중 어느 한 항의 TIL 또는 제166항 또는 제167항의 확장된 TIL 집단 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제163항 내지 제165항 중 어느 한 항의 TIL, 제166항 또는 제167항의 확장된 TIL 집단, 또는 제168항의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 병태의 치료가 필요한 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
제169항에 있어서, 질환 또는 병태가 종양인 방법.
제170항에 있어서, 종양이 체크포인트 억제제에 불응성인 방법.
제171항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제171항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제171항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 재발되는 방법.
제171항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 전이성인 방법.
제169항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 흑색종, 결장직장암, 췌장암, 두경부암, 자궁경부암, 난소암 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
적합한 조건 하에서 배양 배지에서 면역 세포를 배양하는 것을 포함하는, 제163항 내지 제165항 중 어느 한 항의 TIL을 제조하는 방법.
제1항 내지 제71항, 제88항 내지 제126항, 제153항 내지 제158항, 및 제169항 내지 제177항 중 어느 한 항, 제72항 내지 제87항, 제127항 내지 제132항 및 제159항 내지 제162항 중 어느 한 항, 또는 제133항 내지 제152항, 제166항 및 제167항 중 어느 한 항에 있어서, MRM이 NaCl을 포함하고, 여기서 칼륨 이온 및 NaCl의 총 농도가 110mM 내지 140mM인 방법, 조성물 또는 확장된 TIL 집단.
제1항 내지 제71항, 제88항 내지 제126항, 제153항 내지 제158항 및 제169항 내지 제178항 중 어느 한 항, 제72항 내지 제87항, 제127항 내지 제132항 및 제159항 내지 제162항 중 어느 한 항, 또는 제133항 내지 제152항, 제166항 및 제167항 중 어느 한 항에 있어서, TIL 집단이 대조군 배지에서 배양한 후 CD39^-/CD69^- TIL의 비율에 비해 MRM에서 배양한 후 CD39^-/CD69^- TIL의 증가된 비율을 포함하는 방법, 조성물 또는 확장된 TIL 집단.
제1항 내지 제71항, 제88항 내지 제126항, 제153항 내지 제158항 및 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항, 제72항 내지 제87항, 제127항 내지 제132항, 제159항 내지 162항 및 제178항 내지 제179항 중 어느 한 항, 또는 제133항 내지 제152항, 제166항, 제167항 및 제178항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, TIL 집단에서 총 TIL 수의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35% 또는 적어도 약 40%가 CD39^-/CD69^-인 방법, 조성물 또는 확장된 TIL 집단.
제7항 내지 제71항, 제88항 내지 제126항, 제153항 내지 제158항 및 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 배양이 적어도 약 11일간 지속되는 방법.
제47항 내지 제71항, 제88항 내지 제126항, 제153항 내지 제158항 및 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 2차 TIL 배양 배지에서 TIL의 배양은 하나 이상의 기체 투과성 용기에서 수행되는 것인 방법.
제47항 내지 제71항, 제88항 내지 제126항, 제153항 내지 제158항 및 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 제3(또는 최종) TIL 배양 배지에서 TIL의 배양이 하나 이상의 기체 투과성 용기에서 수행되지 않는 방법.
제47항 내지 제71항, 제88항 내지 제126항, 제153항 내지 제158항 및 제169항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 2차 TIL 배양 배지에서의 TIL 배양과 3차(또는 최종) TIL 배양 배지에서의 TIL 배양 사이에 분할되는 방법.
다음을 포함하는, 인간 대상체로부터 얻은 TIL을 확장하는 방법:
a. 4mM 초과의 칼륨 이온, CD3 작용제 및 항원 제시 세포를 포함하는 배지에서 TIL을 배양하는 단계("정적 REP 단계"); 및
b. 4mM 초과의 칼륨 이온을 포함하는 배지를 정적 REP 단계로부터의 TIL에 첨가하는 단계로서, 여기서 교반을 배양에 적용하는, 단계("동적 REP 단계").
제185항에 있어서, 동적 REP 단계 동안 CD3 작용제 및 항원 제시 세포가 첨가되지 않는 방법.
제185항 또는 제186항에 있어서, 교반은 흔들림을 포함하는 방법.
제185항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 단계는 관류를 포함하는 방법.
제188항에 있어서, 관류는 24시간마다 배양 작업 부피의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55% 또는 약 60%의 비율로 연속 배지 교환을 포함하는 방법.
제188항 또는 제189항에 있어서, 관류는 24시간마다 배양 작업 부피의 약 25%의 비율로 연속 배지 교환을 포함하는 방법.
제188항 또는 제189항에 있어서, 관류는 24시간마다 배양 작업 부피의 약 50% 비율로 연속 배지 교환을 포함하는 방법.
제190항 또는 제191항에 있어서, 관류는 동적 REP 배양의 최초 48시간 동안 배양 24시간마다 작업 부피의 약 25%의 비율로 연속 배지 교환을 포함하고, 여기서 관류는 동적 REP 배양의 나머지 부분에 대해 배양 24시간마다 작업 부피의 약 50% 비율로 연속 배지 교환을 포함하는 방법.
제189항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 연속 배지 교환은 신선한 MRM의 배양에 대한 첨가를 포함하며, 여기서 신선한 MRM은 항-CD-3 항체를 포함하지 않는 방법.
제189항 내지 제193항 중 어느 한 항에 있어서, 연속 배지 교환은 신선한 MRM의 배양에 대한 첨가를 포함하며, 여기서 신선한 MRM은 항원 제시 세포를 포함하지 않는 방법.
제189항 내지 제194항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도가 24시간마다 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 또는 약 60%의 비율로 감소하는 방법.
제189항 내지 제195항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도가 동적 REP의 개시 후 적어도 약 24시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 75% 미만인 방법.
제189항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP의 개시 후 적어도 약 48시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 45% 미만인 방법.
제189항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP의 개시 후 적어도 약 72시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 35% 미만인 방법.
제189항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP의 개시 후 적어도 약 96시간에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 27% 미만인 방법.
제189항 내지 제199항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양 중 CD3 작용제의 농도는 동적 REP의 개시 후 적어도 120시간 후에 정적 REP 배양 중 CD3 작용제 농도의 약 21% 미만인 방법.
제189항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양 중 생존 가능한 항원 제시 세포의 수가 동적 REP의 개시 후 적어도 약 24시간에 정적 REP의 항원 제시 세포의 수의 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만인 방법.
제189항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양 중 생존 가능한 항원 제시 세포의 수가 동적 REP 개시 후 적어도 약 48시간에 정적 REP의 항원 제시 세포 수의 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만인 방법.
제189항 내지 제202항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양 중 생존 가능한 항원 제시 세포의 수가 동적 REP 개시 후 적어도 약 72시간에 정적 REP의 항원 제시 세포 수의 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만인 방법.
제189항 내지 제203항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양 중 생존 가능한 항원 제시 세포의 수가 동적 REP의 개시 후 적어도 약 96시간에 정적 REP의 항원 제시 세포 수의 약 10% 미만인 방법.
제185항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD3 항체가 OKT-3을 포함하는 방법.
제185항 내지 제205항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제시 세포가 조사된 PBMC를 포함하는 방법.
제185항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, TIL은 정적 REP 후 및 동적 REP 전에 동결보존되는 방법.
제185항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, TIL은 동적 REP 후 동결보존되는 방법.
제185항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 약 5일 동안 정적 REP에 적용되는 방법.
제185항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 약 9일 내지 약 12일 동안 동적 REP에 적용되는 방법.
제185항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 약 5일 동안 정적 REP에 적용된 후 약 9일 동안 동적 REP에 적용되는 방법.
제185항 내지 제208항 중 어느 한 항에 있어서, TIL이 약 5일 동안 정적 REP에 적용된 후 약 12일 동안 동적 REP를 지속하는 방법.
제185항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 배양의 배지가 IL-2를 포함하는 방법.
제185항 내지 제213항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 배양의 배지가 적어도 약 1000IU, 적어도 약 1100IU, 적어도 약 1200IU, 적어도 약 1300IU, 적어도 약 1400IU, 적어도 약 1500IU, 적어도 약 1600IU, 적어도 약 1700IU, 적어도 약 1800IU, 적어도 약 1900IU, 또는 적어도 약 2000IU IL-2을 포함하는 방법.
제185항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 배양의 배지가 약 1500IU IL-2를 포함하는 방법.
제185항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 배양의 배지가 IL-21을 포함하는 방법.
제185항 내지 제216항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 배양의 배지가 적어도 약 5ng/mL, 적어도 약 6ng/mL, 적어도 약 7ng/mL, 적어도 약 8ng/mL, 적어도 약 9ng/mL, 적어도 약 10ng/mL, 적어도 약 11ng/mL, 적어도 약 12ng/mL, 적어도 약 13ng/mL, 적어도 약 14ng/mL 또는 적어도 약 15ng/mL IL-21을 포함하는 방법.
제185항 내지 제217항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 배양의 배지가 약 10ng/mL IL-21을 포함하는 방법.
제185항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 배양의 배지가 IL-15를 포함하는 방법.
제185항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 배양의 배지가 적어도 약 0.1ng/mL, 적어도 약 0.2ng/mL, 적어도 약 0.3ng/mL, 적어도 약 0.4ng/mL, 적어도 약 0.5ng/mL, 적어도 약 0.6ng/mL, 적어도 약 0.7ng/mL, 적어도 약 0.8ng/mL, 적어도 약 0.9ng/mL, 또는 적어도 약 1ng/mL IL-15를 포함하는 방법.
제185항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 배양의 배지가 약 0.4ng/mL IL-15를 포함하는 방법.
제185항 내지 제221항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 배양의 배지가 약 1500IU IL-2, 약 10ng/mL IL-21, 및 약 0.4ng/mL IL-15를 포함하는 방법.
제185항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지 중 배지가 IL-2를 포함하는 방법.
제185항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지가 적어도 약 1000IU, 적어도 약 1100IU, 적어도 약 1200IU, 적어도 약 1300IU, 적어도 약 1400IU, 적어도 약 1500IU, 적어도 약 1600IU, 적어도 약 1700IU, 적어도 약 1800IU, 적어도 약 1900IU, 또는 적어도 약 2000IU IL-2를 포함하는 방법.
제185항 내지 제224항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지가 약 1500IU IL-2를 포함하는 방법.
제185항 내지 제225항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지가 IL-21을 포함하는 방법.
제185항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지가 적어도 약 5ng/mL, 적어도 약 6ng/mL, 적어도 약 7ng/mL, 적어도 약 8ng/mL, 적어도 약 9ng/mL, 적어도 약 10ng/mL, 적어도 약 11ng/mL, 적어도 약 12ng/mL, 적어도 약 13ng/mL, 적어도 약 14ng/mL, 또는 적어도 약 15ng/mL IL-21을 포함하는 방법.
제185항 내지 제227항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지가 약 10ng/mL IL-21을 포함하는 방법.
제185항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지가 IL-15를 포함하는 방법.
제185항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지가 적어도 약 0.1ng/mL, 적어도 약 0.2ng/mL, 적어도 약 0.3ng/mL, 적어도 약 0.4ng/mL, 적어도 약 0.5ng/mL, 적어도 약 0.6ng/mL, 적어도 약 0.7ng/mL, 적어도 약 0.8ng/mL, 적어도 약 0.9ng/mL, 또는 적어도 약 1ng/mL IL-15를 포함하는 방법.
제185항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지가 약 0.4ng/mL IL-15를 포함하는 방법.
제185항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 REP 배양의 관류된 신선한 배지가 약 1500IU IL-2, 약 10ng/mL IL-21, 및 약 0.4ng/mL IL-15를 포함하는 방법.
제185항 내지 제232항 중 어느 한 항에 있어서, 정적 REP 이전에, TIL은 초기 TIL 확장에 적용되는 방법.
제233항에 있어서, 초기 TIL 확장이 종양 샘플 또는 이의 일부를 MRM에서 배양하는 것을 포함하며, 여기서 MRM이 IL-2를 추가로 포함하는 방법.
제233항 또는 제234항에 있어서, MRM이 초기 TIL 확장 동안 IL-7, IL-15, IL-21, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 방법.
제233항 내지 제235항 중 어느 한 항에 있어서, MRM이 초기 TIL 배양 동안 IL-2 및 IL-21을 포함하는 방법.
제233항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, MRM이 초기 TIL 배양 동안 약 6000IU/mL IL-2 및 약 30ng/mL IL-21을 포함하는 방법.
제233항 내지 제237항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양이 약 11일 내지 약 15일 동안 지속되는 방법.
제233항 내지 제238항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양이 적어도 약 11일 지속되는 방법.
제233항 내지 제238항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양이 적어도 약 13일 지속되는 방법.
제233항 내지 제238항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양이 적어도 약 15일 동안 지속되는 방법.
제233항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양은 초기 TIL 배양에서의 세포 수율이 적어도 약 10x10⁶ 내지 50x10⁶ 세포에 도달할 때까지 지속되는 방법.
제233항 내지 제242항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양은 초기 배양에서의 세포 수율이 적어도 약 10x10⁶, 적어도 약 15x10⁶, 적어도 약 20x10⁶, 적어도 약 25x10⁶, 적어도 약 30x10⁶, 적어도 약 35x10⁶, 적어도 약 40x10⁶, 적어도 약 45x10⁶, 또는 적어도 약 50x10⁶ 세포에 도달할 때까지 지속되는 방법.
제233항 내지 제243항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 배양은 초기 배양에서의 세포 수율이 적어도 약 30x10⁶ 세포에 도달할 때까지 지속되는 방법.
제233항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 확장이 TIL을 TRANSACT™와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제245항에 있어서, TIL을 초기 TIL 배양의 약 3일째, 약 4일째, 약 5일째, 약 6일째, 또는 약 7일째에 TRANSACT™와 접촉시키는 방법.
제245항 또는 제246항에 있어서, TIL을 초기 TIL 배양의 약 4일째에 TRANSACT™와 접촉시키는 방법.
제233항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 확장이 TIL을 4-1BB 리간드와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
제248항에 있어서, TIL을 초기 TIL 배양의 약 3일째, 약 4일째, 약 5일째, 약 6일째, 또는 약 7일째에 4-1BB 리간드와 접촉시키는 방법.
제248항 또는 제249항에 있어서, TIL을 초기 TIL 배양의 약 4일째에 4-1BB 리간드와 접촉시키는 방법.
제233항 내지 제250항 중 어느 한 항에 있어서, 초기 TIL 확장이 초기 TIL 배양의 약 4일째에 TIL을 TRANSACT™ 및 4-1BB 리간드와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
제185항 내지 제251항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻은 TIL의 집단.
제252항의 TIL 집단을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료가 필요한 대상체를 치료하는 방법.
제253항에 있어서, 대상체는 종양을 앓고 있는 방법.
제254항에 있어서, 종양은 고형 종양을 포함하는 방법.
제254항 또는 제255항에 있어서, 종양이 흑색종, 결장암, 폐암, 자궁경부암, 위장관암, 유방암, 전립선암, 간암, 골암, 췌장암, 두경부의 소세포암종, 폐 편평 세포 암종, 폐 선암종, 췌장 선암종, 두경부 편평 세포 암종, 고환 생식 세포 종양, 위 선암종, 피부 흑색종, 중피종, 신장 투명 세포 암종, 자궁 경부 편평 세포 암종 및 내경부 선암종, 식도 암종, 방광 요로상피 암종, 유방 침윤성 암종, 신장 유두 세포 암종, 결장 선암종, 또는 이들의 임의의 조합에서 유래된 고형 종양을 포함하는 방법.
제256항에 있어서, 종양이 체크포인트 억제제에 불응성인 방법.
제257항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1 길항제, CTLA-4 길항제, TIM3 길항제, GITR 길항제, KIR 길항제, LAG3 길항제, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제257항에 있어서, 체크포인트 억제제가 항-PD1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-GITR 항체, 항-KIR 항체, 항-LAG3 항체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제253항 내지 제259항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 재발되는 방법.
제253항 내지 제260항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 전이성인 방법.
제252항에 있어서, CD8+ TIL의 약 20% 내지 약 80%가 줄기 유사 TIL인 TIL 집단.
제252항에 있어서, CD8+ 세포의 적어도 50% 내지 90%가 추정 종양 반응성 TIL인 TIL 집단.
제252항에 있어서, TIL의 적어도 35% 내지 90%가 종양 반응성 TIL인 TIL 집단.