CN117480246A - 用于t细胞共培养物效力测定和配合细胞疗法产品使用的方法和组合物 - Google Patents
用于t细胞共培养物效力测定和配合细胞疗法产品使用的方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117480246A CN117480246A CN202280037095.7A CN202280037095A CN117480246A CN 117480246 A CN117480246 A CN 117480246A CN 202280037095 A CN202280037095 A CN 202280037095A CN 117480246 A CN117480246 A CN 117480246A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- til
- cells
- fold
- cell
- hours
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 277
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 304
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 title claims description 119
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 title description 3
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 825
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 135
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 91
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 84
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 78
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 25
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000013255 MILs Substances 0.000 claims abstract 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 1040
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 353
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 135
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims description 133
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims description 133
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 99
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 82
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 77
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 67
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 63
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 63
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 58
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 58
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 58
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 claims description 55
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 claims description 55
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 51
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 51
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 48
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 40
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 40
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 40
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 40
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 40
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 39
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 39
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 39
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 claims description 38
- 239000012275 CTLA-4 inhibitor Substances 0.000 claims description 37
- 239000012271 PD-L1 inhibitor Substances 0.000 claims description 37
- 229940121656 pd-l1 inhibitor Drugs 0.000 claims description 37
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 35
- -1 IL-14 Proteins 0.000 claims description 32
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000012270 PD-1 inhibitor Substances 0.000 claims description 27
- 239000012668 PD-1-inhibitor Substances 0.000 claims description 27
- 229940121655 pd-1 inhibitor Drugs 0.000 claims description 27
- 238000001802 infusion Methods 0.000 claims description 25
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 23
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 20
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 20
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 19
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 19
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 17
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 17
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 17
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 claims description 15
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 14
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 14
- 239000011325 microbead Substances 0.000 claims description 14
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 14
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 13
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 13
- 102100027268 Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Human genes 0.000 claims description 13
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 claims description 12
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 claims description 12
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 claims description 12
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 claims description 12
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims description 11
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 claims description 11
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 11
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 claims description 11
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 claims description 11
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 claims description 11
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 claims description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 11
- 102000001326 Chemokine CCL4 Human genes 0.000 claims description 10
- 108010055165 Chemokine CCL4 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000853002 Homo sapiens Interleukin-25 Proteins 0.000 claims description 10
- 101000853000 Homo sapiens Interleukin-26 Proteins 0.000 claims description 10
- 101001128431 Homo sapiens Myeloid-derived growth factor Proteins 0.000 claims description 10
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 claims description 10
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000049772 Interleukin-16 Human genes 0.000 claims description 10
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 claims description 10
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 claims description 10
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 claims description 10
- 102100036679 Interleukin-26 Human genes 0.000 claims description 10
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 10
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 10
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 10
- 108010074109 interleukin-22 Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 claims description 10
- 101000971533 Homo sapiens Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100021457 Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1 Human genes 0.000 claims description 9
- 102100029215 Signaling lymphocytic activation molecule Human genes 0.000 claims description 9
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 9
- 101000679851 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 8
- 108700025316 aldesleukin Proteins 0.000 claims description 8
- 229960005310 aldesleukin Drugs 0.000 claims description 8
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 8
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 claims description 8
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 claims description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- 101000633780 Homo sapiens Signaling lymphocytic activation molecule Proteins 0.000 claims description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 6
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 claims description 5
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 5
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 5
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 claims description 5
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 4
- 206010017993 Gastrointestinal neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 102000017578 LAG3 Human genes 0.000 claims description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 4
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 claims description 4
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 102100021260 Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100034458 Hepatitis A virus cellular receptor 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000894906 Homo sapiens Galactosylgalactosylxylosylprotein 3-beta-glucuronosyltransferase 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001068133 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000831007 Homo sapiens T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Proteins 0.000 claims description 3
- 102100024834 T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains Human genes 0.000 claims description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 3
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 2
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010041067 Small cell lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005969 Uveal melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000062 kidney sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 208000000587 small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 claims 1
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N isosorbide mononitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@@H](O)CO[C@@H]21 YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 abstract 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 144
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 101
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 78
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 59
- 230000008859 change Effects 0.000 description 56
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 49
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 47
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 46
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 37
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 33
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 33
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 32
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 32
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 31
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 31
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 30
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 29
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 29
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 25
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 22
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 22
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 22
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 21
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 20
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 20
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 18
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 230000006870 function Effects 0.000 description 17
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 17
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 17
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 16
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 15
- 238000011198 co-culture assay Methods 0.000 description 15
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 14
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 14
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 14
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 12
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 12
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 229950007217 tremelimumab Drugs 0.000 description 11
- 229950005972 urelumab Drugs 0.000 description 11
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 10
- 229940126625 tavolimab Drugs 0.000 description 10
- 239000005660 Abamectin Substances 0.000 description 9
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 9
- RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N avermectin B1a Chemical compound C1=C[C@H](C)[C@@H]([C@@H](C)CC)O[C@]11O[C@H](C\C=C(C)\[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](OC)C3)[C@@H](OC)C2)[C@@H](C)\C=C\C=C/2[C@]3([C@H](C(=O)O4)C=C(C)[C@@H](O)[C@H]3OC\2)O)C[C@H]4C1 RRZXIRBKKLTSOM-XPNPUAGNSA-N 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 9
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 8
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 8
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 8
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 7
- 102100031789 Myeloid-derived growth factor Human genes 0.000 description 7
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000000306 component Substances 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 description 7
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 7
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 7
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 208000037841 lung tumor Diseases 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 102100030704 Interleukin-21 Human genes 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M hexanoate Chemical compound CCCCCC([O-])=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 229960004390 palbociclib Drugs 0.000 description 6
- AHJRHEGDXFFMBM-UHFFFAOYSA-N palbociclib Chemical compound N1=C2N(C3CCCC3)C(=O)C(C(=O)C)=C(C)C2=CN=C1NC(N=C1)=CC=C1N1CCNCC1 AHJRHEGDXFFMBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 206010000871 Acute monocytic leukaemia Diseases 0.000 description 5
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 description 5
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 208000035489 Monocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 238000003390 bioluminescence detection Methods 0.000 description 5
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 5
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000003144 genetic modification method Methods 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 4
- 101001010621 Homo sapiens Interleukin-21 Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 4
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 4
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 4
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 4
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 4
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 4
- 101100519207 Mus musculus Pdcd1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229960000106 biosimilars Drugs 0.000 description 4
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 4
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 4
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RBAFCMJBDZWZIV-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-azido-2-hydroxybenzoate Chemical compound OC1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O RBAFCMJBDZWZIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LWAVGNJLLQSNNN-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-azidobenzoate Chemical compound C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LWAVGNJLLQSNNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=C(F)C=C1F VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 101001043807 Homo sapiens Interleukin-7 Proteins 0.000 description 3
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 3
- 102000004473 OX40 Ligand Human genes 0.000 description 3
- 108010042215 OX40 Ligand Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 3
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 3
- NXVYSVARUKNFNF-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2,3-dihydroxybutanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)C(O)C(O)C(=O)ON1C(=O)CCC1=O NXVYSVARUKNFNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 3
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 3
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 3
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 3
- 102000052622 human IL7 Human genes 0.000 description 3
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 3
- 201000010225 mixed cell type cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000029638 mixed neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 229960000402 palivizumab Drugs 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FXYPGCIGRDZWNR-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[[3-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-3-oxopropyl]disulfanyl]propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O FXYPGCIGRDZWNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 2
- GAJBPZXIKZXTCG-VIFPVBQESA-N (2s)-2-amino-3-[4-(azidomethyl)phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(CN=[N+]=[N-])C=C1 GAJBPZXIKZXTCG-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- GERXSZLDSOPHJV-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) 2-iodoacetate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(=O)CI)C=C1 GERXSZLDSOPHJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 1-[1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(CCCCC)N1C(=O)C=CC1=O AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CALIYGMVBZRBLV-UHFFFAOYSA-N 2-(4-azidophenyl)-2-oxoacetaldehyde Chemical compound [N-]=[N+]=NC1=CC=C(C(=O)C=O)C=C1 CALIYGMVBZRBLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JPTXVWCBMWCZEP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-8-oxononanoic acid Chemical compound CC(=O)CCCCCC(N)C(O)=O JPTXVWCBMWCZEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NITXODYAMWZEJY-UHFFFAOYSA-N 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanehydrazide Chemical compound NNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 NITXODYAMWZEJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BMUXFZXYGDXKJY-UHFFFAOYSA-N 4-azido-2-hydroxybenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1O BMUXFZXYGDXKJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YRLKXQVDEQEYSN-UHFFFAOYSA-N 4-azidobenzohydrazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 YRLKXQVDEQEYSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 102100021266 Alpha-(1,6)-fucosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000036364 Cullin Ring E3 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108091007045 Cullin Ring E3 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010019236 Fucosyltransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 206010066476 Haematological malignancy Diseases 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 2
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 2
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 2
- 101000611023 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Proteins 0.000 description 2
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 2
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 2
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 108010038498 Interleukin-7 Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000010782 Interleukin-7 Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 241000382301 Isoplexis Species 0.000 description 2
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108700031757 NKTR-214 Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010071690 Prealbumin Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108010092262 T-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 102000009190 Transthyretin Human genes 0.000 description 2
- 102100040403 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 6 Human genes 0.000 description 2
- 238000011467 adoptive cell therapy Methods 0.000 description 2
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 2
- 229940064734 aminobenzoate Drugs 0.000 description 2
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 2
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 2
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 2
- 229950002916 avelumab Drugs 0.000 description 2
- 229940121413 bempegaldesleukin Drugs 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) pentanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O LNQHREYHFRFJAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 210000003690 classically activated macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 101150023212 fut8 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 2
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 2
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 102000008616 interleukin-15 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040002039 interleukin-15 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- RNVCVTLRINQCPJ-UHFFFAOYSA-N o-toluidine Chemical compound CC1=CC=CC=C1N RNVCVTLRINQCPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- MTZWHHIREPJPTG-UHFFFAOYSA-N phorone Chemical compound CC(C)=CC(=O)C=C(C)C MTZWHHIREPJPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229920000765 poly(2-oxazolines) Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 2
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 2
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 2
- XSWBNALIBMCQED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-phenyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)C(C=1C=CC=CC=1)(C)SSC1=CC=CC=N1 XSWBNALIBMCQED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHZVREGLAPRBDI-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) cyclohexanecarboxylate Chemical compound C1CCCCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O CHZVREGLAPRBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGGWFDNPHKLBBV-YUMQZZPRSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-5-(carbamoylamino)pentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=O AGGWFDNPHKLBBV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YYTDJPUFAVPHQA-VKHMYHEASA-N (2s)-2-amino-3-(2,3,4,5,6-pentafluorophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=C(F)C(F)=C(F)C(F)=C1F YYTDJPUFAVPHQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- PEMUHKUIQHFMTH-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-3-(4-bromophenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(Br)C=C1 PEMUHKUIQHFMTH-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- JSXMFBNJRFXRCX-NSHDSACASA-N (2s)-2-amino-3-(4-prop-2-ynoxyphenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OCC#C)C=C1 JSXMFBNJRFXRCX-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- BJOQKIKXKGJLIJ-NSHDSACASA-N (2s)-2-amino-3-(4-prop-2-ynylphenyl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(CC#C)C=C1 BJOQKIKXKGJLIJ-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- NEMHIKRLROONTL-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-azaniumyl-3-(4-azidophenyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 NEMHIKRLROONTL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- VIYKYVYAKVNDPS-HKGPVOKGSA-N (2s)-2-azanyl-3-[3,4-bis(oxidanyl)phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 VIYKYVYAKVNDPS-HKGPVOKGSA-N 0.000 description 1
- IBCKYXVMEMSMQM-JTQLQIEISA-N (2s)-3-(3-acetylphenyl)-2-aminopropanoic acid Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=C1 IBCKYXVMEMSMQM-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- ZXSBHXZKWRIEIA-JTQLQIEISA-N (2s)-3-(4-acetylphenyl)-2-azaniumylpropanoate Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C=C1 ZXSBHXZKWRIEIA-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 125000000027 (C1-C10) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- XKSOTQXTPALQMY-UHFFFAOYSA-N 1-[3-[(4-azidophenyl)disulfanyl]propanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 XKSOTQXTPALQMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOTJUWBJENROFB-UHFFFAOYSA-N 1-[3-[[3-(2,5-dioxo-3-sulfopyrrolidin-1-yl)oxy-3-oxopropyl]disulfanyl]propanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCSSCCC(=O)ON1C(=O)C(S(O)(=O)=O)CC1=O VOTJUWBJENROFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQQBUTMELIQJNY-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(2,5-dioxo-3-sulfopyrrolidin-1-yl)oxy-2,3-dihydroxy-4-oxobutanoyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1CC(S(O)(=O)=O)C(=O)N1OC(=O)C(O)C(O)C(=O)ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O WQQBUTMELIQJNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VCRPKWLNHWPCSR-UHFFFAOYSA-N 1-diazonio-3-(4-nitrophenoxy)-3-oxoprop-1-en-2-olate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(=O)C(=O)C=[N+]=[N-])C=C1 VCRPKWLNHWPCSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KHAWDEWNXJIVCJ-UHFFFAOYSA-N 1-fluoro-4-(4-fluoro-3-nitrophenyl)sulfonyl-2-nitrobenzene Chemical compound C1=C(F)C([N+](=O)[O-])=CC(S(=O)(=O)C=2C=C(C(F)=CC=2)[N+]([O-])=O)=C1 KHAWDEWNXJIVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLPJNCYCZORXHG-UHFFFAOYSA-N 1-morpholin-4-ylprop-2-en-1-one Chemical compound C=CC(=O)N1CCOCC1 XLPJNCYCZORXHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASNTZYQMIUCEBV-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-[6-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]hexanoyloxy]pyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 ASNTZYQMIUCEBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YYDMSFVTLYEPOH-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-propanoyloxypyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O YYDMSFVTLYEPOH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDPOCFDNTVUOKD-UHFFFAOYSA-N 2-(7-azido-4-methyl-2-oxochromen-3-yl)acetamide Chemical compound C1=C(N=[N+]=[N-])C=CC2=C1OC(=O)C(CC(N)=O)=C2C BDPOCFDNTVUOKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCIROCUCLQDUBL-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[2-[(3-oxo-3-phenylmethoxypropyl)amino]ethylselanyl]propanoic acid Chemical compound NC(C(=O)O)C[Se]CCNCCC(=O)OCC1=CC=CC=C1 BCIROCUCLQDUBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PFLVUZBNZZOUSS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-phenylselanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)C[Se]C1=CC=CC=C1 PFLVUZBNZZOUSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QYRPOQGYNAOMIK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-8-oxooctanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCCCC=O QYRPOQGYNAOMIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVYRKTXQJJKRJG-UHFFFAOYSA-N 2-iodo-n-[6-[(2-iodoacetyl)amino]hexyl]acetamide Chemical compound ICC(=O)NCCCCCCNC(=O)CI YVYRKTXQJJKRJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZRBSTONIYRNRI-VIFPVBQESA-N 3-methylphenylalanine Chemical compound CC1=CC=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=C1 JZRBSTONIYRNRI-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- IRZQDMYEJPNDEN-UHFFFAOYSA-N 3-phenyl-2-aminobutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C)C1=CC=CC=C1 IRZQDMYEJPNDEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXZGLTYKKZKGLN-UHFFFAOYSA-N 4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O QXZGLTYKKZKGLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMRMMAOBSFSXLN-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanehydrazide Chemical compound C1=CC(CCCC(=O)NN)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O ZMRMMAOBSFSXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 4-amino-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N)C=C1 CMUHFUGDYMFHEI-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- NXLBAOLUZNMYKG-UHFFFAOYSA-N 4-azido-2-hydroxy-n-[4-[(2-iodoacetyl)amino]butyl]benzamide Chemical compound OC1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1C(=O)NCCCCNC(=O)CI NXLBAOLUZNMYKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BCJVBDBJSMFBRW-UHFFFAOYSA-N 4-diphenylphosphanylbutyl(diphenyl)phosphane Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(C=1C=CC=CC=1)CCCCP(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 BCJVBDBJSMFBRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PZNQZSRPDOEBMS-QMMMGPOBSA-N 4-iodo-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(I)C=C1 PZNQZSRPDOEBMS-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- WKGGTEFWVLVCGO-UHFFFAOYSA-N 8-(2,5-dioxo-3-sulfopyrrolidin-1-yl)oxy-8-oxooctanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O WKGGTEFWVLVCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 101710146120 Alpha-(1,6)-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102100021631 B-cell lymphoma 6 protein Human genes 0.000 description 1
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 241001062954 Clinopodium Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 102220473613 Cytochrome b5_R67A_mutation Human genes 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006471 Fucosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101150063370 Gzmb gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000021519 Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000819490 Homo sapiens Alpha-(1,6)-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000971234 Homo sapiens B-cell lymphoma 6 protein Proteins 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000987586 Homo sapiens Eosinophil peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000920686 Homo sapiens Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 101100188801 Homo sapiens HCRT gene Proteins 0.000 description 1
- 101000864089 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000930802 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000968032 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000872170 Homo sapiens Polycomb complex protein BMI-1 Proteins 0.000 description 1
- NRSPOJRMDVHRCX-UHFFFAOYSA-N IC=1C(C(C=CC1C)(C)S(=O)(=O)O)I Chemical compound IC=1C(C(C=CC1C)(C)S(=O)(=O)O)I NRSPOJRMDVHRCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 206010052178 Lymphocytic lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101150076359 Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- KFDFRWUYFLUTBO-JEDNCBNOSA-N N[C@@H](CCCCN)C(=O)O.CC=1N=NN=NC1 Chemical compound N[C@@H](CCCCN)C(=O)O.CC=1N=NN=NC1 KFDFRWUYFLUTBO-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- OJYRJTUKEXSKOS-ZETCQYMHSA-N N[C@@H](CCCCNOCCN=[N+]=[N-])C(O)=O Chemical compound N[C@@H](CCCCNOCCN=[N+]=[N-])C(O)=O OJYRJTUKEXSKOS-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- GEYBMYRBIABFTA-VIFPVBQESA-N O-methyl-L-tyrosine Chemical compound COC1=CC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C=C1 GEYBMYRBIABFTA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100024894 PR domain zinc finger protein 1 Human genes 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-STQMWFEESA-N Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 229920001389 Poly(hydroxyalkylmethacrylamide) Polymers 0.000 description 1
- 102100033566 Polycomb complex protein BMI-1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108010009975 Positive Regulatory Domain I-Binding Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010070308 Refractory cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101710163413 Signaling lymphocytic activation molecule Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000000662 T-lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- HSRXSKHRSXRCFC-WDSKDSINSA-N Val-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSRXSKHRSXRCFC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN JKHXYJKMNSSFFL-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000005006 adaptive immune system Anatomy 0.000 description 1
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940061720 alpha hydroxy acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001280 alpha hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 150000001502 aryl halides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 1
- FCCCRBDJBTVFSJ-UHFFFAOYSA-N butanehydrazide Chemical compound CCCC(=O)NN FCCCRBDJBTVFSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N carbonyl dihydrazine Chemical compound NNC(=O)NN XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N di-tert-butyl peroxide Chemical compound CC(C)(C)OOC(C)(C)C LSXWFXONGKSEMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012969 di-tertiary-butyl peroxide Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 229950009791 durvalumab Drugs 0.000 description 1
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 1
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002085 enols Chemical class 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000002446 fucosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O1)C)* 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009033 hematopoietic malignancy Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 125000003104 hexanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007236 host immunity Effects 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 239000005414 inactive ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 229940060367 inert ingredients Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- RQUGVTLRYOAFLV-UHFFFAOYSA-N n-(4-aminobutyl)-4-azido-2-hydroxybenzamide Chemical compound NCCCCNC(=O)C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1O RQUGVTLRYOAFLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODTZGFFHYPHJNS-UHFFFAOYSA-N n-(4-benzoylphenyl)-2-iodoacetamide Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 ODTZGFFHYPHJNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 229960003301 nivolumab Drugs 0.000 description 1
- JFNLZVQOOSMTJK-KNVOCYPGSA-N norbornene Chemical compound C1[C@@H]2CC[C@H]1C=C2 JFNLZVQOOSMTJK-KNVOCYPGSA-N 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- TVIDEEHSOPHZBR-AWEZNQCLSA-N para-(benzoyl)-phenylalanine Chemical compound C1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 TVIDEEHSOPHZBR-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 229960002621 pembrolizumab Drugs 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N phosphonotyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001390 poly(hydroxyalkylmethacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 230000002483 superagonistic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 229950010127 teplizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 229950004393 visilizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 229940121638 zalifrelimab Drugs 0.000 description 1
- JPZXHKDZASGCLU-LBPRGKRZSA-N β-(2-naphthyl)-alanine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC=C21 JPZXHKDZASGCLU-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供新的工艺、组合物和方法，其用于分析或测定用于疗法(包括人类癌症疗法)的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)产物的效力和/或功能，以及用于分析或测定其他多克隆产物(例如骨髓浸润淋巴细胞(MIL)和外周血淋巴细胞(PBL)产物)的效力和/或功能。还提供了使用TIL、MIL和PBL产物制备和治疗癌症的组合物、方法和套件。
Description
背景技术
使用过继性自体转移肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte；TIL)治疗大型(bulky)、难治性癌症表示对于不良预后患者的一种强大的治疗方案。Gattinoni等人，《自然免疫学评论(Nat.Rev.Immunol.)》2006，6，383-393。TIL是由T细胞主导，基于IL-2的TIL扩增和随后的“快速扩增过程”(REP)已因其速度和效率而成为TIL扩增的优选方法。Dudley等人，《科学(Science)》2002，298，850-54；Dudley等人，《临床肿瘤学杂志(J.Clin.Oncol.)》2005，23，2346-57；Dudley等人，《临床肿瘤学杂志》2008，26，5233-39；Riddell等人，《科学》1992，257，238-41；Dudley等人，《免疫疗法杂志(J.Immunother.)》2003，26，332-42。已探究许多改善黑色素瘤对TIL疗法的反应且将TIL疗法扩展至其他肿瘤类型的方法，但成效有限，该领域仍然具有挑战性。Goff等人，《临床肿瘤学杂志》2016，34，2389-97；Dudley等人，《临床肿瘤学杂志》2008，26，5233-39；Rosenberg等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》2011，17，4550-57。也已描述单一免疫检查点抑制剂的组合研究，但其他研究正在进行中且需要额外治疗方法(Kverneland等人，《肿瘤标靶(Oncotarget)》，2020，11(22)，2092-2105)。
此外，当前的TIL制造和治疗过程受到长度、成本、无菌性问题和本文所描述的其他因素的限制，使得对于其他检查点抑制剂疗法难治的患者的治疗潜力受到严重限制。迫切需要为TIL制造工艺和基于此类工艺的疗法提供质量控制方法，此类工艺适合用于治疗剩余极少治疗选择方案或无可行的治疗选择方案的患者。本发明通过提供一种缩短的用于产生TIL的制造工艺来满足此需要，该缩短的制造工艺具有额外步骤，该额外步骤提供了用于评估扩增的TIL的效力和/或功能的机制。
本发明提供用于制备和评估T细胞(包括TIL)的效力和/或功能的改进方法、方法和组合物，以便例如制备治疗功效提高的治疗性TIL群来治疗癌症。相较于本领域中已知的测定，这些效力测定能够提供更好的表达、对T细胞产物效力的更好控制和增加的生物相关性以及其他改进。也描述了使用效力测定的制造工艺、施用方法和药物组合物。这些工艺和方法可另外用于施用TIL与如本文所描述的CTLA-4抑制剂和PD-1抑制剂和/或PD-L1抑制剂的组合。
发明内容
本文提供用于评估扩增的TIL和其他多克隆T细胞产物(包括骨髓浸润淋巴细胞(MIL)和外周血淋巴细胞(PBL))的效力和/或功能的方法，然后可以通过施用由这些方法评估的TIL、MIL、PBL或其他多克隆T细胞产物来将所述扩增的TIL和其他多克隆T细胞产物用于治疗癌症。
在一个方面，本发明提供一种确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力。
在一些实施方案中，该方法包括以下其他步骤：
d.将阴性对照与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，该阴性对照包含(i)阴性对照细胞或(ii)人类白细胞抗原(HLA)阻断抗体和目标细胞；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力。
在一些实施方案中，T细胞产物选自下组：肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)产物、骨髓浸润淋巴细胞(MIL)产物或外周血淋巴细胞(PBL)产物。
在一些实施方案中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤获得并通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增工艺制造。
在一些实施方案中，该方法包括放行(release)T细胞产物以用于治疗人类患者的步骤。
在一些实施方案中，目标细胞为经辐照的Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，阴性对照细胞缺乏I类MHC或HLA和II类MHC或HLA表达。
在一些实施方案中，阴性对照细胞为经辐照的K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，HLA阻断抗体包括HLA-I阻断抗体、HLA-II阻断抗体或它们的组合。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与目标细胞的数目之间的比率在5:1与1:5之间。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率在5:1与1:5之间。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与目标细胞的数目之间的比率在3:1与1:3之间。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率在3:1与1:3之间。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与目标细胞的数目之间的比率在1:2与1:4之间。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率在1:2与1:4之间。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与目标细胞的数目之间的比率在1:25与1:35之间。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率在1:25与1:35之间。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与目标细胞的数目之间的比率为约1:2。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率为约1:2。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与目标细胞的数目之间的比率为约1:3。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率为约1:3。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与目标细胞的数目之间的比率为约1:4。
在一些实施方案中，TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率为约1:4。
在一些实施方案中，在解冻冷冻保存的TIL产物、MIL产物或PBL产物且使解冻的TIL产物、MIL产物或PBL产物在孵育一段时间复苏之后进行共培养，该一段时间选自：12小时、24小时、36小时、48小时、60小时和72小时。
在一些实施方案中，第一时间段为约6小时至约48小时。
在一些实施方案中，第二时间段为约6小时至约48小时。
在一些实施方案中，第一时间段选自下组：约12小时、约18小时和约24小时。
在一些实施方案中，第二时间段选自下组：约12小时、约18小时和约24小时。
在一些实施方案中，第一时间段和第二时间段为相同持续时间。
在一些实施方案中，T细胞产物上的一种以上标记物选自下组：CD25、CD69、CD134、CD137、CD150、KLRG1或它们的组合。
在一些实施方案中，T细胞产物分泌的一种以上分析物选自下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25、IL-26、MIP-1β以及它们的组合。
在一些实施方案中，TIL产物分泌的一种以上分析物选自下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25、IL-26、MIP-1β以及它们的组合，其中，对于一种以上分析物中的每一种分析物，将观测值的数量相对于对照值的数量进行归一化，并且，一种以上分析物中的每一种分析物的观测值相对于对照值的增加选自下组：至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍和至少5倍。
在一些实施方案中，TIL产物是由肿瘤制造的，该肿瘤通过手术切除、穿刺活检、核心活检、小型活检或其他从人类患者获取含有肿瘤和TIL细胞混合物的样本的方法获得。
在另一方面，本发明提供一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗有需要患者的癌症的方法，该方法包括以下步骤：
(a)通过将获自患者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物，从肿瘤获得和/或接收第一TIL群，该肿瘤通过手术切除、穿刺活检、核心活检、小型活检或其他手段自患者切除；
(b)将该第一TIL群添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养该第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中，该第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，该第一次扩增进行约3至14天以获得该第二TIL群，并且，由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充该第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中该第二次扩增进行约7至14天以获得该第三TIL群，其中该第三TIL群为治疗性TIL群，其中该第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(e)收集由步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(f)通过以下确定该治疗性TIL群的效力：
i.将目标细胞与一部分的治疗性TIL群进行持续第一时间段的共培养；
ii.由该共培养获得收集物；
iii.评估收集物中(1)该部分的治疗性TIL群上一种以上标记物的表达或(2)该部分的治疗性TIL群分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定治疗性TIL群的效力；
iv.将阴性对照细胞或(i)阴性对照细胞或(ii)人类白细胞抗原阻断抗体与第二部分的治疗性TIL群进行持续第二时间段的第二次共培养；
v.由该第二次共培养获得第二收集物；
vi.评估第二收集物中(1)第二部分的治疗性TIL群上一种以上标记物的表达或(2)第二部分的治疗性TIL群分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
vii.将一个以上观测值与一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定治疗性TIL群的效力；
(g)将来自步骤(e)的治疗性TIL群转移至输注袋，其中由步骤(e)转移至步骤(g)在不开放该系统的情况下进行；
(h)可选地，使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(g)的包含治疗性TIL群的输注袋；以及
(i)若确定治疗性TIL群有效，则向患者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)或(h)中的输注袋的治疗性TIL群。
在一些实施方案中，检查收集的TIL的效力和/或功能在冷冻保存之后进行，或可选地，在冷冻保存步骤之前和之后进行。
在一些实施方案中，患者具有不可切除、转移性、耐药或难以用CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗的肿瘤，且可选地，其中患者先前已用CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂进行治疗。
在一些实施方案中，步骤(c)中的第二TIL群在数目上比第一TIL群多至少50倍。
在一些实施方案中，第一次扩增在约10至约12天的时间段内进行。
在一些实施方案中，第二次扩增在约10至约12天的时间段内进行。
在一些实施方案中，第一次扩增在约11天的时间段内进行。
在一些实施方案中，第二次扩增在约11天的时间段内进行。
在一些实施方案中，在第一次扩增中，IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于细胞培养基中。
在一些实施方案中，在第二次扩增步骤中，IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在且OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
在一些实施方案中，该方法进一步包括在向患者施用TIL之前用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗患者的步骤。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨(fludarabine)五天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：在向患者施用治疗性TIL群的第二天开始用IL-2方案治疗患者。
在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤：在向患者施用治疗性TIL群的同一天开始用IL-2方案治疗患者。
在一些实施方案中，在完成向患者施用治疗性TIL群之后约3至约24小时施用IL-2方案。
在一些实施方案中，IL-2方案为包括600,000或720,000IU/kg阿地白介素(aldesleukin)或其生物类似物或变体的高剂量IL-2方案，其以每八小时15分钟的推注静脉内输注形式施用直至耐受为止。
在一些实施方案中，在步骤(a)中将获自患者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物进一步包括在酶培养基(enzymatic media)中孵育肿瘤样本。
在一些实施方案中，在步骤(a)中将获自患者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物进一步包括以机械方式破坏肿瘤样本以便分解肿瘤样本。
在一些实施方案中，在步骤(a)中将获自患者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物进一步包括使用密度梯度分离纯化经分解的肿瘤样本。
在一些实施方案中，酶培养基包含DNase。
在一些实施方案中，酶培养基包含约30单位/毫升的DNase。
在一些实施方案中，酶培养基包含胶原蛋白酶。
在一些实施方案中，酶培养基包含约1.0mg/mL的胶原蛋白酶。
在一些实施方案中，癌症选自下组：黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、神经胶母细胞瘤、胃肠癌、肾癌、肉瘤和肾细胞癌。
在一些实施方案中，该方法包括向患者施用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂的步骤。
在另一方面，本发明提供一种确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次共培养；
b.将目标细胞与T细胞参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中T细胞产物细胞和T细胞参考标准细胞分泌的细胞因子，以获得剂量浓度，从而确定T细胞产物的效力；
其中，目标细胞为单核细胞。
在一些实施方案中，T细胞产物为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)产物、骨髓浸润淋巴细胞(MIL)产物或外周血淋巴细胞(PBL)产物。
在一些实施方案中，单核细胞为U937或Thp1细胞，或其衍生物、变体、修饰物或后代，且其中细胞因子为干扰素-γ。
在一些实施方案中，共培养进行选自下组的时间段：约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时和约48小时。
在一些实施方案中，T细胞产物为TIL产物，且其中使用约4×105、约2×105、约1×105和约0.5×105个目标细胞每孔的四种目标细胞浓度和约1.5×106个TIL每孔的单一TIL细胞浓度。
在一些实施方案中，使用目标细胞与T细胞产物细胞的至少四种共培养物以及目标细胞与T细胞参考标准细胞的至少四种共培养物，进行平行线分析，并且丢弃一个离群值目标细胞剂量浓度。
在一些实施方案中，该方法是效力测定矩阵(matrix)的组成部分。
在一些实施方案中，效力测定矩阵包括一种以上选自下组的测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激并报告干扰素γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。
在另一方面，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，包括：
(a)将肿瘤消化物或肿瘤碎片添加至密闭系统中，其中该肿瘤消化物或肿瘤碎片包括第一TIL群且获自从受试者切除的肿瘤；
(b)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养该第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中该第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中该第一次扩增进行约3至11天以获得该第二TIL群，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(c)通过补充包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的额外细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中该第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群，其中该第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)收集由步骤(c)获得的第三TIL群，其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(e)将由步骤(d)收集的第三TIL群转移至输注袋，其中由步骤(d)至(e)的转移在不开放系统的情况下进行；
(f)使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(e)的包含收集的TIL群的输注袋；以及
(g)向受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(f)中的输注袋的第三TIL群。
其中，APC选自下组：Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，癌症选自下组：黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤)、卵巢癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、食道癌、食管胃结合部癌、胃癌、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。
在一些实施方案中，步骤(a)中的第一次扩增和步骤(b)中的第二次扩增各自单独地在11天的时间段内进行。
在一些实施方案中，步骤(a)至(d)在约10天至约22天内进行。
在一些实施方案中，已使用如本文所描述的方法确定TIL的效力。
在一些实施方案中，已使用如本文所描述的方法确定TIL的效力。
附图说明
图1：示例性Gen 2(过程2A)图表，其提供步骤A至F的概述。
图2A至2C：用于TIL制造的Gen 2(过程2A)的实施方案的过程流程图。
图3：显示冷冻保存的TIL示例性制造工艺(约22天)的实施方案的图表。
图4：显示Gen 2(过程2A)的实施方案的图表，这是一个用于TIL制造的22天过程。
图5：过程1C和用于TIL制造的Gen 2(过程2A)的示例性实施方案的步骤A至F的比较表。
图6：用于TIL制造的过程1C的实施方案和Gen 2(过程2A)的实施方案的详细比较。
图7：示例性Gen 3型TIL制造工艺。
图8A至8D：A)显示用于TIL制造的2A过程(大约22天过程)与Gen 3过程(大约14天至16天过程)的实施方案之间的比较。B)示例性过程Gen 3图表，其提供步骤A至F的概述(大于14天至16天过程)。C)提供三种示例性Gen 3过程的图表，其中概述了三种过程变化中的每一种的步骤A至F(大约14天或16天过程)。D)示例性经修改的类Gen 2过程，其提供步骤A至F的概述(大约22天过程)。
图9：提供Gen 2(过程2A)与Gen 3过程之间的可比较性的实验流程图。
图10：显示各种Gen 2(过程2A)与Gen 3.1过程实施方案之间的比较。
图11：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3.0过程的实施方案的各种特征的表。
图12：Gen 3过程的实施方案(被称作Gen 3.1)的培养基条件的概述。
图13：描述Gen 2、Gen 2.1和Gen 3.0过程的实施方案的各种特征的表。
图14：比较Gen 2和Gen 3.0过程的实施方案的各种特征的表。
图15：提供所描述扩增过程的各种实施方案中的培养基使用的表。
图16：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施方案的示意图。
图17：使用Gen 3扩增平台扩增来自造血系统恶性肿瘤的T细胞的方法的示例性实施方案的示意图。
图18：提供结构I-A和I-B。圆柱体是指单独的多肽结合域。结构I-A和I-B包括三个线性连接的衍生自例如4-1BBL或结合4-1BB的抗体的TNFRSF结合域，其折叠形成三价蛋白质，该三价蛋白质接着通过IgG1-Fc(包括CH3和CH2结构域)与第二个三价蛋白质连接，该IgG1-Fc随后通过二硫键(细长的椭圆形)将两个三价蛋白质连接在一起，从而稳定结构并提供能够将六个受体的细胞内信号传导结构域与信号蛋白集合在一起以形成信号传导复合物的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合域可为包括例如由接头连接的VH和VL链的scFv结构域，该接头可包含亲水性残基和提供柔性的Gly与Ser序列以及提供溶解性的Glu与Lys。
图19：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施方案的示意图。
图20：提供Gen 3.1过程(16天过程)的示例性实施方案的过程概述。
图21：Gen 3.1测试过程(16天至17天过程)的示例性实施方案的示意图。
图22：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施方案的示意图。
图23：示例性Gen 2和示例性Gen 3过程的比较表。
图24：Gen 3过程(16天至17天过程)制备时间线的示例性实施方案的示意图。
图25：Gen 3过程(14天至16天过程)的示例性实施方案的示意图。
图26A至26B：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施方案的示意图。
图27：Gen 3过程(16天过程)的示例性实施方案的示意图。
图28：Gen 2、Gen 2.1与Gen 3过程(16天过程)的实施方案的比较。
图29：Gen 2、Gen 2.1与Gen 3过程(16天过程)的实施方案的比较。
图30：Gen 3实施方案组成部分。
图31：Gen 3实施方案流程图比较(Gen 3.0、Gen 3.1对照、Gen 3.1测试)。
图32：显示Gen 3过程(16天至17天过程)的示例性实施方案的组成部分。
图33：接受标准表。
图34：使用TIL-K562阴性对照和MLR(患者匹配的PBMC)以及基于微珠的阳性对照的TIL-Raji共培养测定的实施方案的图表。
图35：使用TIL-Raji共培养测定，通过流式细胞术观测到的不同共培养期的CD25水平(CD3的％)以及针对肺肿瘤(L4224)和黑色素瘤(M1152)的TIL：目标细胞比率。
图36：使用TIL-Raji共培养测定，通过流式细胞术观测到的不同共培养期的CD69水平(CD3的％)以及针对肺肿瘤(L4224)和黑色素瘤(M1152)的TIL：目标细胞比率。
图37：使用TIL-Raji共培养测定，通过流式细胞术观测到的不同共培养期的CD137(4-1BB)水平(CD3的％)以及针对肺肿瘤(L4224)和黑色素瘤(M1152)的TIL：目标细胞比率。
图38：使用TIL-Raji共培养测定，通过流式细胞术观测到的不同共培养期的CD134(OX40)水平(CD3的％)以及针对肺肿瘤(L4224)和黑色素瘤(M1152)的TIL：目标细胞比率。
图39：使用TIL-Raji共培养测定，不同共培养期的IFN-γ分泌以及针对肺肿瘤(L4224)和黑色素瘤(M1152)的TIL：目标细胞比率。
图40：使用TIL-Raji共培养测定，不同共培养期的CCL4分泌以及针对肺肿瘤(L4224)和黑色素瘤(M1152)的TIL：目标细胞比率。
图41：使用TIL-Raji共培养测定，不同共培养期的颗粒酶B分泌和不同共培养期的TIL：目标细胞比率以及针对肺肿瘤(L4224)和黑色素瘤(M1152)的TIL：目标细胞比率。
图42：使用TIL-K562阴性对照的TIL-Raji共培养测定的实施方案的图表。
图43：基于TIL-Raji细胞的效力测定的示例性实施方案的共培养实验设定。
图44：TIL-Raji共培养测定中活化标记物的表型表达。
图45：在CD69(Gen 2TIL：301-001)TIL-Raji共培养中的表型表达。
图46：以pg/mL为单位的IFN-γ分泌水平。
图47：以pg/mL为单位的颗粒酶B分泌水平。
图48：IFN-γ和颗粒酶B分泌水平。
图49：IFN-γ释放的倍数变化：TIL+细胞株/单独的TIL。
图50：颗粒酶的倍数变化:TIL+细胞株/单独的TIL。
图51：细胞因子释放的倍数变化：TIL+细胞株/单独的TIL。
图52：IFN-γ释放的倍数变化：TIL+细胞株/TIL+K562。
图53：颗粒酶B释放的倍数变化：TIL+细胞株/TIL+K562。
图54：细胞因子释放的倍数变化：TIL+细胞株/TIL+K562。
图55：IFN-γ和颗粒酶B分泌汇总表。
图56：基于TIL-Raji细胞的效力测定的实施方案的示意图，其显示通过MHC显性识别活化TIL。
图57：基于TIL-Raji细胞的效力测定的示例性实施方案的共培养实验培养板设定。
图58：使用可选的TIL-K562阴性对照的TIL-Raji共培养测定的实施方案的图表。
图59：TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次的IFN-γ分泌(pg/mL)。以pg/mL为单位的分泌水平显示于y轴上，且TIL：目标细胞比率显示于x轴上。
图60：TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次的IFN-γ分泌(pg/mL)。以pg/mL为单位的分泌水平显示于y轴上，且TIL：目标细胞比率显示于x轴上。
图61：TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次的IFN-γ分泌(pg/mL)。以pg/mL为单位的分泌水平显示于y轴上，且TIL：目标细胞比率显示于x轴上。
图62：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的IFN-γ释放相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图63：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的IFN-γ释放相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图64：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的IFN-γ释放相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图65：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的IFN-γ释放相对于TIL加K562细胞的IFN-γ释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图66：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的IFN-γ释放相对于TIL加K562细胞的IFN-γ释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图67：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的IFN-γ释放相对于TIL加K562细胞的IFN-γ释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图68：孵育时间为12和18小时的TIL加Raji或K562细胞的IFN-γ释放相对于单独的TIL的倍数变化，显示TIL:Raji或TIL:K562细胞比为1:3时的累积数据集，其中*表示p值≤0.05；**表示p值≤0.01；且***表示p值≤0.001。
图69：孵育时间为12和18小时的TIL加Raji或K562细胞的IFN-γ释放相对于单独的TIL或相对于K562细胞的倍数变化，显示TIL:Raji或TIL:K562细胞比为1:3时的累积数据集，其中*表示p值≤0.05；**表示p值≤0.01；且***表示p值≤0.001。
图70：孵育时间为12和18小时的TIL加Raji细胞的IFN-γ释放相对于TIL加K562细胞或相对于TIL的倍数变化，显示TIL:Raji或TIL:K562细胞比为1:3时的累积数据集，*表示p值≤0.05且NS表示不显著，在全尺度上。
图71：孵育时间为12和18小时的TIL加Raji细胞的IFN-γ释放相对于TIL加K562细胞或相对于TIL的倍数变化，显示TIL:Raji或TIL:K562细胞比为1:3时的累积数据集，其经扩展以显示较低倍数变化水平的详情。
图72：TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次的颗粒酶B分泌(pg/mL)。以pg/mL为单位的分泌水平显示于y轴上，且TIL：目标细胞比率显示于x轴上。
图73：TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次的颗粒酶B分泌(pg/mL)。以pg/mL为单位的分泌水平显示于y轴上，且TIL：目标细胞比率显示于x轴上。
图74：TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次的颗粒酶B分泌(pg/mL)。以pg/mL为单位的分泌水平显示于y轴上，且TIL：目标细胞比率显示于x轴上。
图75：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的颗粒酶B释放相对于单独TIL的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图76：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的颗粒酶B释放相对于单独TIL的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图77：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的颗粒酶B释放相对于单独TIL的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图78：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的颗粒酶B释放相对于TIL加K562细胞的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图79：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的颗粒酶B释放相对于TIL加K562细胞的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图80：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的颗粒酶B释放相对于TIL加K562细胞的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图81：孵育时间为12和18小时的TIL的颗粒酶B释放，以pg/mL/TIL为单位。
图82：孵育时间为12和18小时的TIL加Raji或K562细胞相对于单独TIL的颗粒酶B释放，显示TIL:Raji或TIL:K562细胞比为1:3时的累积数据集，其中***表示p值≤0.001且****表示p值≤0.0001。
图83：孵育时间为12和18小时的TIL加Raji或K562细胞相对于K562细胞的颗粒酶B释放，显示TIL:Raji或TIL:K562细胞比为1:3时的累积数据集，其中****表示p值≤0.0001。
图84：孵育时间为12和18小时的TIL加Raji细胞的颗粒酶B释放相对于TIL加K562细胞或相对于TIL的倍数变化，显示TIL:Raji或TIL:K562细胞比为1:3时的累积数据集，其中**表示p值≤0.01且NS表示不显著。
图85：TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次的TNF-α分泌(pg/mL)。以pg/mL为单位的分泌水平显示于y轴上，且TIL：目标细胞比率显示于x轴上。
图86：TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次的TNF-α分泌(pg/mL)。以pg/mL为单位的分泌水平显示于y轴上，且TIL：目标细胞比率显示于x轴上。
图87：TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次的TNF-α分泌(pg/mL)。以pg/mL为单位的分泌水平显示于y轴上，且TIL：目标细胞比率显示于x轴上。
图88：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的TNF-α释放相对于单独TIL的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图89：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的TNF-α释放相对于单独TIL的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图90：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的TNF-α释放相对于单独TIL的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图91：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的TNF-α释放相对于TIL加K562细胞的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图92：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的TNF-α释放相对于TIL加K562细胞的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图93：对于TIL:Raji或TIL:K562比为3:1、1:1和1:3的黑色素瘤TIL批次，TIL加Raji或K562细胞的TNF-α释放相对于TIL加K562细胞的颗粒酶B释放的倍数变化。y轴上显示倍数变化且x轴上显示TIL：目标细胞比率。
图94：孵育时间为18小时的TIL加Raji或K562细胞的TNF-α释放相对于单独的TIL的倍数变化，显示TIL:Raji或TIL:K562细胞比为1:3时的累积数据集，其中****表示p值≤0.0001。
图95：孵育时间为18小时的TIL加Raji或K562细胞的TNF-α释放相对于K562细胞的倍数变化，显示TIL:Raji或TIL:K562细胞比为1:3时的累积数据集，其中****表示p值≤0.0001。
图96：孵育时间为18小时的TIL加Raji细胞的TNF-α释放相对于单独的TIL或相对于TIL加K562细胞的倍数变化，显示TIL:Raji或TIL:K562细胞比为1:3时的累积数据集，其中****表示p值≤0.0001。
图97：使用Raji细胞共培养测定的实施方案测试的22个样本的颗粒酶B和IFN-γ结果的汇总表。
图98：使用可选的TIL-K562阴性对照的TIL-Raji共培养测定的实施方案的图表。
图99：TIL批次M1173的测定结果。
图100：TIL批次M1152的测定结果。
图101：TIL批次M1187的测定结果。
图102：TIL批次M1179的测定结果。
图103：TIL批次M1183的测定结果。
图104：IFN-γ的细胞因子分泌结果，其显示在不同的解冻后复苏时间，TIL加K562或Raji细胞相对于单独的TIL的倍数变化。
图105：IFN-γ的细胞因子分泌结果，其显示在不同的解冻后复苏时间，TIL加K562或Raji细胞相对于TIL加K562细胞的倍数变化。
图106：颗粒酶B的细胞因子分泌结果，其显示在不同的解冻后复苏时间，TIL加K562或Raji细胞相对于单独的TIL的倍数变化。
图107：颗粒酶B的细胞因子分泌结果，其显示在不同的解冻后复苏时间，TIL加K562或Raji细胞相对于TIL加K562细胞的倍数变化。
图108：同种异体识别测定的实施方案。
图109：同种异体识别测定检测方法的实施方案。
图110：解冻后条件1的结果(在解冻后静置过夜18至24小时)。所测试的效应子：目标细胞(E:T)比在35:1至2.5:1范围内，且所测试的共培养持续时间为4小时、8小时、16小时和36小时。
图111：解冻后条件2的结果(解冻后不静置)。所测试的效应子：目标细胞(E:T)比在10:1至1:10范围内，且共培养持续时间是过夜(16至24小时)。测试由卵巢癌肿瘤(OV8178)和黑色素瘤肿瘤(M1203)产生的TIL。
图112：基于TIL-Raji细胞的效力测定的示例性实施方案。
图113：总活细胞(TVC，上图)和存活率％(下图)与静置时间的关系。
图114：在存在和不存在300IU/mL IL-2的情况下使用两种TIL细胞株的Raji与K562共培养实验的结果，其显示以pg/mL为单位的IFN-γ分泌。
图115：在存在和不存在300IU/mL IL-2的情况下使用两种TIL细胞株的Raji与K562共培养实验的结果，其显示以倍数变化为单位的IFN-γ分泌。
图116：在不同共培养条件下使用两种TIL细胞株的Raji与K562共培养实验的结果，其显示以pg/mL为单位的IFN-γ分泌。
图117：在不同共培养条件下使用两种TIL细胞株的Raji与K562共培养实验的结果，其显示以倍数变化为单位的IFN-γ分泌。
图118：在不同共培养条件下使用两种TIL细胞株的Raji与K562共培养实验的结果，用于评估在TIL解冻后复苏期延长时的细胞因子分泌效果，显示以pg/mL为单位的IFN-γ分泌。
图119：在作为本发明的实施方案的不同共培养条件下使用两种TIL细胞株的Raji与K562共培养实验的结果，用于评估在TIL解冻后复苏期延长时的细胞因子分泌效果，显示以倍数变化为单位的IFN-γ分泌。
图120：在72小时静置期的共培养条件的两个实施方案中，对TIL细胞株M1179的亲本活群的残余细胞群的流式细胞术分析。
图121：Raji细胞株的增殖图谱。
图122：K562细胞株的增殖图谱。
图123：TIL:肿瘤细胞株共培养测定的实验计划图，其也作为本发明的实施方案。
图124：所测试目标(Raji、Ramos、Thp1和U937)细胞株和阴性对照(K562)细胞株在三种TIL：目标细胞比率(3:1、1:1和1:3)下的IFN-γ分泌(pg/mL，绝对值)，其作为本发明的实施方案。
图125：所测试目标(Raji、Ramos、Thp1和U937)细胞株和阴性对照(K562)细胞株(pg/mL，绝对值)在三种TIL：目标细胞比率(3:1、1:1和1:3)下的IFN-γ分泌([TIL+目标]/[单独的TIL]的倍数变化)，其作为本发明的实施方案。
图126：所测试目标(Raji、Ramos、Thp1和U937)细胞株和阴性对照(K562)细胞株在三种TIL：目标细胞比率(3:1、1:1和1:3)下的IFN-γ分泌([TIL+目标]/[TIL+K562]的倍数变化)，其作为本发明的实施方案。
图127：所测试目标(Raji、Ramos、Thp1和U937)细胞株和阴性对照(K562)细胞株在三种TIL：目标细胞比率(3:1、1:1和1:3)下的TNF-α分泌(pg/mL，绝对值)，其作为本发明的实施方案。
图128：所测试目标(Raji、Ramos、Thp1和U937)细胞株和阴性对照(K562)细胞株在三种TIL：目标细胞比率(3:1、1:1和1:3)下的TNF-α分泌([TIL+目标]/[单独的TIL]的倍数变化)，其作为本发明的实施方案。
图129：所测试目标(Raji、Ramos、Thp1和U937)细胞株和阴性对照(K562)细胞株在三种TIL：目标细胞比率(3:1、1:1和1:3)下的TNF-α分泌([TIL+目标]/[TIL+K562]的倍数变化)，其作为本发明的实施方案。
图130：TIL:肿瘤细胞株共培养测定的实验计划图，其也作为本发明的实施方案。
图131：所测试目标和阴性对照(K562)细胞株的IFN-γ分泌(pg/mL)，其作为本发明的实施方案。
图132：所测试目标和阴性对照(K562)细胞株的IFN-γ分泌([TIL+目标]/[单独的TIL]的倍数变化)，其作为本发明的实施方案。
图133：所测试目标和阴性对照(K562)细胞株的IFN-γ分泌([TIL+目标]/[TIL+K562]的倍数变化)，其作为本发明的实施方案。
图134：TIL+目标细胞株(或组合)相对于单独的TIL的变化倍数的平均值和范围(左图)以及TIL+目标细胞株(或组合)相对于TIL+K562的变化倍数的平均值和范围(右图)。
图135：对于黑色素瘤TIL细胞株M1152、M1187、M1198和M1200，所测试目标细胞株和阴性对照细胞(包括组合目标细胞株)的TNF-α分泌(pg/mL)。
图136：对于黑色素瘤TIL细胞株M1152、M1187、M1198和M1200，所测试目标细胞株和阴性对照细胞(包括组合目标细胞株)的TNF-α分泌([TIL+肿瘤细胞株或组合]/[单独的TIL]的倍数变化)。
图137：对于黑色素瘤TIL细胞株M1152、M1187、M1198和M1200，所测试目标细胞株和阴性对照细胞(包括组合目标细胞株)的TNF-α分泌([TIL+肿瘤细胞株或组合]/[TIL+K562]的倍数变化)。
图138：对于黑色素瘤TIL细胞株M1152、M1187、M1198和M1200，所测试目标细胞株和阴性对照细胞(包括组合的目标细胞株)的颗粒酶B分泌(pg/mL)。
图139：对于黑色素瘤TIL细胞株M1152、M1187、M1198和M1200，所测试目标细胞株和阴性对照细胞(包括组合的目标细胞株)的颗粒酶B分泌([TIL+肿瘤细胞株或组合]/[单独的TIL]的倍数变化)。
图140：对于黑色素瘤TIL细胞株M1152、M1187、M1198和M1200，所测试目标细胞株和阴性对照细胞(包括组合的目标细胞株)的颗粒酶B分泌([TIL+肿瘤细胞株或组合]/[TIL+K562]的倍数变化)。
图141：TIL:肿瘤细胞株共培养测定的实验计划图，其也作为本发明的实施方案。
图142：对于研究NSCLCTIL细胞株L4253、L4254、L4262和L4270，所测试目标细胞株和阴性对照细胞(包括组合目标细胞株)的IFN-γ分泌(pg/mL)。黑色虚线：单独的3:1TIL。灰色虚线：单独的1:1TIL。
图143：对于研究NSCLCTIL细胞株L4253、L4254、L4262和L4270，所测试目标NSCLC细胞株(包括组合目标细胞株)的IFN-γ分泌倍数(TIL+肿瘤细胞株/单独的TIL)。
图144：对于研究NSCLC TIL细胞株L4253、L4254、L4262和L4270，所测试目标NSCLC细胞株(包括组合目标细胞株)的IFN-γ分泌倍数(TIL+肿瘤细胞株/[TIL+K562])。
图145：对于临床NSCLC TIL细胞株1013-304、1036-307、1057-304、1004-303、1057-302和1088-303，所测试目标细胞株和阴性对照细胞株(包括组合目标细胞株)的IFN-γ分泌(pg/mL)。黑色虚线：单独的TIL。以1:1TIL：目标细胞比率获得数据。
图146：对于临床NSCLC TIL细胞株1013-304、1036-307、1057-304、1004-303、1057-302和1088-303，所测试目标细胞株和阴性对照细胞株(包括组合目标细胞株)的IFN-γ分泌倍数(TIL+肿瘤细胞株/单独的TIL)。黑色虚线：单独的TIL。以1:1TIL：目标细胞比率获得数据。
图147：对于临床NSCLC TIL细胞株1013-304、1036-307、1057-304、1004-303、1057-302和1088-303，所测试目标细胞株和阴性对照细胞株(包括组合目标细胞株)的IFN-γ分泌倍数(TIL+肿瘤细胞株/[TIL+K562])。黑色虚线：单独的TIL。以1:1TIL：目标细胞比率获得数据。
图148：对于临床NSCLC TIL细胞株1013-304、1036-307、1057-304、1004-303、1057-302和1088-303，所测试目标细胞株和阴性对照细胞株的IFN-γ分泌的倍数变化(TIL+肿瘤细胞株/单独的TIL)的汇总。实心红色符号代表临床部分反应，而其余符号代表临床稳定的疾病反应。
图149：对于临床NSCLC TIL细胞株1013-304、1036-307、1057-304、1004-303、1057-302和1088-303，所测试目标细胞株和阴性对照细胞株的IFN-γ分泌的倍数变化(TIL+肿瘤细胞株/[TIL+K562])的汇总。实心红色符号代表临床部分反应，而其余符号代表临床稳定的疾病反应。
图150：对于19个研究和临床黑色素瘤和NSCLC TIL细胞株，所测试目标细胞株和阴性对照细胞株的IFN-γ分泌倍数变化(TIL+肿瘤细胞株/单独的TIL)的概述。方框代表平均值两边的一个标准偏差，其由一条线表示。
图151：对于19个研究和临床黑色素瘤和NSCLC TIL细胞株，所测试目标细胞株和阴性对照细胞株的IFN-γ分泌倍数变化(TIL+肿瘤细胞株/[TIL+K562])的概述。方框代表平均值两边的一个标准偏差，其由一条线表示。
图152：在24小时的共培养期间辐照对Raji和K562细胞的增殖(总活细胞，TVC)的影响。
图153：两个子宫颈癌TIL批次在与未经辐照和经辐照的Raji细胞共培养后分泌的IFN-γ的浓度。
图154：通过流式细胞术测定经辐照(“Irr.”)和未经辐照(“Non-irr.”)的三种标记物在K562和Raji细胞上的表面标记物表达。
图155：对于三种黑色素瘤、两种子宫颈和一种NSCLC TIL细胞株，相对于使用单独的TIL的IFN-γ倍数变化(一式三份样本)与测定共培养时间(小时)的关系。
图156：TIL:肿瘤细胞株共培养测定的实验计划图，其也作为本发明的实施方案。
图157：对于12种黑色素瘤TIL细胞株，针对1.0×106个TVC/孔，肿瘤细胞株加TIL相对于单独TIL的IFN-γ平均倍数变化。方框代表平均值两边的一个标准偏差，其由一条线表示。
图158：对于12种黑色素瘤TIL细胞株，针对2.0×106个TVC/孔，肿瘤细胞株加TIL相对于单独TIL的IFN-γ平均倍数变化。方框代表平均值两边的一个标准偏差，其由一条线表示。
图159：对于12种黑色素瘤TIL细胞株，针对1.0×106个TVC/孔，肿瘤细胞株加TIL相对于K562阴性对照细胞的IFN-γ平均倍数变化。方框代表平均值两边的一个标准偏差，其由一条线表示。
图160：对于12种黑色素瘤TIL细胞株，针对2.0×106个TVC/孔，肿瘤细胞株加TIL相对于K562阴性对照细胞的IFN-γ平均倍数变化。方框代表平均值两边的一个标准偏差，其由一条线表示。
图161：用于两种类型的Thp1(THP-1)单核细胞株(野生型(WT)和经基因修饰)的TIL：肿瘤细胞株共培养测定的实验计划图，其也作为本发明的实施方案。
图162：针对WT和经基因修饰的Thp1目标细胞获得的IFN-γ值(pg/mL)的比较。
图163：针对WT和经基因修饰的Thp1目标细胞获得的相对于单独TIL的IFN-γ倍数变化值的比较。
图164：显示HLA阻断的图，HLA阻断在某些实施方案中是用于本发明测定的阴性对照。
图165：HLA-I阻断在不同抗体浓度下对Thp1(THP1)和U937单核细胞株的影响，通过每个单核细胞株的存活百分比来测量。
图166：HLA-II阻断在不同抗体浓度下对Thp1(THP1)和U937单核细胞株的影响，通过每个单核细胞株的存活百分比来测量。
图167：HLA-II阻断在不同抗体浓度下对Raji细胞的影响，通过Raji细胞和经基因修饰的Raji细胞(B2M KO)的存活百分比来测量。
图168：HLA-I(aMHC I)和HLA-II(aMHC II)抗体阻断对TIL细胞株M1213的影响。
图169：HLA-I(aMHC I)和HLA-II(aMHC II)抗体阻断对TIL细胞株M1214的影响。
图170：HLA-I(aMHC I)和HLA-II(aMHC II)抗体阻断对TIL细胞株PD-LIM-20-08的影响。
图171：HLA(MHC)I类和II类抗体剂量滴定的结果。使用20μg/mL HLA-I阻断抗体和10μg/mL HLA-II阻断抗体进行HLA阻断阴性对照方法的实施方案I。使用10μg/mL HLA-I阻断抗体和5μg/mL HLA-II阻断抗体进行HLA阻断阴性对照方法的实施方案II。
图172：在添加抗HLA-I抗体(表示为αMHC I)和抗HLA-II抗体(表示为αMHC II)之后来自十个TIL细胞株的背景IFN-γ分泌的结果，各自一式三份地进行。实施方案I和实施方案II分别是指图173和图184中所示且本文别处所描述的实验实施方案，包括实施方案I中使用20μg/mL HLA-I阻断抗体和10μg/mL HLA-II阻断抗体，实施方案II中使用10μg/mLHLAI阻断抗体和5μg/mL HLA-II阻断抗体。
图173：使用HLA阻断抗体作为阴性对照代替阴性对照细胞株的TIL:肿瘤细胞株共培养测定的实验计划图，这些共培养测定在适用时在本文中统称为“实施方案I”且也为本发明的实施方案。
图174：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1152的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为pg/mL IFN-γ。
图175：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1187的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为pg/mL IFN-γ。
图176：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1164的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为pg/mL IFN-γ。
图177：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1213的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为pg/mL IFN-γ。
图178：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1214的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为pg/mL IFN-γ。
图179：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1152的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数增加。
图180：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1187的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数增加。
图181：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1164的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数增加。
图182：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1213的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数增加。
图183：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1214的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数增加。
图184：使用HLA阻断抗体作为阴性对照代替阴性对照细胞株的TIL:肿瘤细胞株共培养测定的实验计划图，这些共培养测定在适用时在本文中统称为“实施方案II”且也为本发明的实施方案。
图185：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1161的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为pg/mL IFN-γ。通过流式细胞术测定M1161的CD4+和CD8+群分别为1.4％和97.6％。
图186：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1163的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为pg/mL IFN-γ。通过流式细胞术测定M1163的CD4+和CD8+群分别为60.6％和34.9％。
图187：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1172的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为pg/mL IFN-γ。通过流式细胞术测定M1172的CD4+和CD8+群分别为71.8％和22.2％。
图188：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1173的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为pg/mL IFN-γ。通过流式细胞术测定M1173的CD4+和CD8+群分别为13.4％和81.6％
图189：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1174的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为pg/mL IFN-γ。通过流式细胞术测定M1174的CD4+和CD8+群分别为92.3％和6.2％。
图190：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1161的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数增加。通过流式细胞术测定M1161的CD4+和CD8+群分别为1.4％和97.6％。
图191：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1163的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数增加。通过流式细胞术测定M1163的CD4+和CD8+群分别为60.6％和34.9％。
图192：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1172的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数增加。通过流式细胞术测定M1172的CD4+和CD8+群分别为71.8％和22.2％。
图193：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1173的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数增加。通过流式细胞术测定M1173的CD4+和CD8+群分别为13.4％和81.6％
图194：与目标细胞和作为对照的K562细胞共培养的黑色素瘤TIL细胞株M1174的HLA阻断阴性对照实验的结果，报告为相对于单独TIL的IFN-γ释放的倍数增加。通过流式细胞术测定M1174的CD4+和CD8+群分别为92.3％和6.2％。
图195：使用HLA阻断抗体作为阴性对照来代替阴性对照细胞株或除了单独TIL对照实验之外还使用HLA阻断抗体作为阴性对照的TIL:肿瘤细胞株共培养测定的实验计划图，这些共培养测定也均为本发明的实施方案。使用十五种黑色素瘤细胞株。
图196：与U937目标细胞共培养的15种黑色素瘤TIL细胞株的HLA阻断阴性对照实验的结果。
图197：与Thp1(THP-1)目标细胞共培养的15种黑色素瘤TIL细胞株的HLA阻断阴性对照实验的结果。
图198：确定Thp1细胞的有效TIL浓度。星号指示在2×106TVC下TIL:Thp1比率为3:1。
图199：测定U937细胞的有效TIL浓度。星号指示在2×106TVC下TIL:U937比率为3:1。
图200：使用Thp1和U937目标细胞的三个TIL批次(M1164、M1163和M1169)的剂量响应曲线。
图201：使用Thp1和U937目标细胞的三个额外TIL批次(M1218、M1174和M1150A)的剂量响应曲线。
图202：对使用U937目标细胞的六个TIL批次的平行线分析。所有六个TIL均表现出明确的剂量反应。
图203：对使用Thp1目标细胞的六个TIL批次的平行线分析。TIL M1173和TILM1213表现出明显的剂量反应。
图204：在存在和不存在HLA阻断抗体下，使用U937目标细胞的1.5×106TIL浓度的三个TIL批次(M1145、M1161和M1173)的剂量反应曲线。所有三个TIL批次均表现出明显的剂量反应，并且还显示出抗体处理对信号的完全抑制(特异性抑制)。
图205：在存在和不存在HLA阻断抗体下，使用U937目标细胞的1.5×106TIL浓度的三个TIL批次(M1197、M1213和M1214)的剂量反应曲线。所有三个TIL批次均表现出明显的剂量反应，并且还显示出抗体处理对信号的完全抑制(特异性抑制)。
图206：黑色素瘤TIL临床样本通过流式细胞术得到的LAG3表达的直方图。
图207：黑色素瘤TIL临床样本通过流式细胞术得到的KLRG1表达的直方图。
图208：使用U937同种异体反应性共培养测定对28个历史临床批次的相对效力直方图的对数分布评估。针对各TIL批次计算的相对效力测量值经对数变换，所得分布为正态分布，表明基础分布呈对数正态分布。
图209：在REP期间与U937细胞或同种异体PBMC一起孵育的TIL的扩增。
图210：在用U937细胞或同种异体PBMC进行REP之后，用抗CD3和抗CD28微珠刺激的TIL中的IFN-γ分泌。
图211：本发明的同种异体反应性共培养测定(表示为“allo-pMHC-TCR相互作用诱导的T细胞”)的实施方案与用于T细胞效力测试的传统的基于抗体微珠的测定的比较。
序列表的简要说明
SEQ ID NO:1为莫罗单抗(muromonab)的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2为莫罗单抗的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3为重组人类IL-2蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4为阿地白介素的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是一种IL-2形式。
SEQ ID NO:6是一种IL-2形式。
SEQ ID NO:7是一种IL-2形式。
SEQ ID NO:8为粘蛋白结构域多肽。
SEQ ID NO:9为重组人类IL-4蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10为重组人类IL-7蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11为重组人类IL-15蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12为重组人类IL-21蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13为IL-2序列。
SEQ ID NO:14为IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO:15为IL-2突变蛋白序列。
SEQ ID NO:16为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2。
SEQ ID NO:17为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2。
SEQ ID NO:18为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3。
SEQ ID NO:19为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2kabat。
SEQ ID NO:20为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 kabat。
SEQ ID NO:21为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 kabat。
SEQ ID NO:22为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2clothia。
SEQ ID NO:23为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 clothia。
SEQ ID NO:24为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 clothia。
SEQ ID NO:25为IgG.IL2R67A.H1的HCDR1_IL-2IMGT。
SEQ ID NO:26为IgG.IL2R67A.H1的HCDR2 IMGT。
SEQ ID NO:27为IgG.IL2R67A.H1的HCDR3 IMGT。
SEQ ID NO:28为IgG.IL2R67A.H1的VH链。
SEQ ID NO:29为IgG.IL2R67A.H1的重链。
SEQ ID NO:30为IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 kabat。
SEQ ID NO:31为IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 kabat。
SEQ ID NO:32为IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 kabat。
SEQ ID NO:33为IgG.IL2R67A.H1的LCDR1 chothia。
SEQ ID NO:34为IgG.IL2R67A.H1的LCDR2 chothia。
SEQ ID NO:35为IgG.IL2R67A.H1的LCDR3 chothia。
SEQ ID NO:36为VL链。
SEQ ID NO:37为轻链。
SEQ ID NO:38为轻链。
SEQ ID NO:39为轻链。
SEQ ID NO:40为人类4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO:41为鼠类4-1BB的氨基酸序列。
SEQ ID NO:42为4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(utomilumab)(PF-05082566)的重链。
SEQ ID NO:43为4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链。
SEQ ID NO:44为4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:45为4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:46为4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR1。
SEQ ID NO:47为4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR2。
SEQ ID NO:48为4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的重链CDR3。
SEQ ID NO:49为4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR1。
SEQ ID NO:50为4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR2。
SEQ ID NO:51为4-1BB激动剂单克隆抗体乌托鲁单抗(PF-05082566)的轻链CDR3。
SEQ ID NO:52为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞芦单抗(urelumab)(BMS-663513)的重链。
SEQ ID NO:53为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞芦单抗(BMS-663513)的轻链。
SEQ ID NO:54为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞芦单抗(BMS-663513)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:55为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞芦单抗(BMS-663513)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:56为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞芦单抗(BMS-663513)的重链CDR1。
SEQ ID NO:57为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞芦单抗(BMS-663513)的重链CDR2。
SEQ ID NO:58为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞芦单抗(BMS-663513)的重链CDR3。
SEQ ID NO:59为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞芦单抗(BMS-663513)的轻链CDR1。
SEQ ID NO:60为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞芦单抗(BMS-663513)的轻链CDR2。
SEQ ID NO:61为4-1BB激动剂单克隆抗体乌瑞芦单抗(BMS-663513)的轻链CDR3。
SEQ ID NO:62为TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO:63为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:64为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:65为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:66为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:67为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:68为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:69为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:70为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:71为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:72为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:73为TNFRSF激动剂融合蛋白的Fc结构域。
SEQ ID NO:74为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:75为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:76为TNFRSF激动剂融合蛋白的接头。
SEQ ID NO:77为4-1BB配体(4-1BBL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:78为4-1BBL多肽的可溶部分。
SEQ ID NO:79为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:80为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本1的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:81为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:82为4-1BB激动剂抗体4B4-1-1版本2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:83为4-1BB激动剂抗体H39E3-2的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:84为4-1BB激动剂抗体H39E3-2的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:85为人类OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO:86为鼠类OX40的氨基酸序列。
SEQ ID NO:87为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(tavolixizumab)(MEDI-0562)的重链。
SEQ ID NO:88为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链。
SEQ ID NO:89为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:90为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:91为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR1。
SEQ ID NO:92为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR2。
SEQ ID NO:93为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的重链CDR3。
SEQ ID NO:94为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR1。
SEQ ID NO:95为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR2。
SEQ ID NO:96为OX40激动剂单克隆抗体塔沃西单抗(MEDI-0562)的轻链CDR3。
SEQ ID NO:97为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链。
SEQ ID NO:98为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链。
SEQ ID NO:99为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:100为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:101为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR1。
SEQ ID NO:102为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR2。
SEQ ID NO:103为OX40激动剂单克隆抗体11D4的重链CDR3。
SEQ ID NO:104为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR1。
SEQ ID NO:105为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR2。
SEQ ID NO:106为OX40激动剂单克隆抗体11D4的轻链CDR3。
SEQ ID NO:107为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链。
SEQ ID NO:108为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链。
SEQ ID NO:109为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:110为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:111为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR1。
SEQ ID NO:112为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR2。
SEQ ID NO:113为OX40激动剂单克隆抗体18D8的重链CDR3。
SEQ ID NO:114为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR1。
SEQ ID NO:115为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR2。
SEQ ID NO:116为OX40激动剂单克隆抗体18D8的轻链CDR3。
SEQ ID NO:117为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:118为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:119为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR1。
SEQ ID NO:120为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR2。
SEQ ID NO:121为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的重链CDR3。
SEQ ID NO:122为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR1。
SEQ ID NO:123为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR2。
SEQ ID NO:124为OX40激动剂单克隆抗体Hu119-122的轻链CDR3。
SEQ ID NO:125为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:126为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:127为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR1。
SEQ ID NO:128为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR2。
SEQ ID NO:129为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的重链CDR3。
SEQ ID NO:130为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR1。
SEQ ID NO:131为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR2。
SEQ ID NO:132为OX40激动剂单克隆抗体Hu106-222的轻链CDR3。
SEQ ID NO:133为OX40配体(OX40L)氨基酸序列。
SEQ ID NO:134为OX40L多肽的可溶部分。
SEQ ID NO:135为OX40L多肽的替代性可溶部分。
SEQ ID NO:136为OX40激动剂单克隆抗体008的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:137为OX40激动剂单克隆抗体008的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:138为OX40激动剂单克隆抗体011的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:139为OX40激动剂单克隆抗体011的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:140为OX40激动剂单克隆抗体021的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:141为OX40激动剂单克隆抗体021的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:142为OX40激动剂单克隆抗体023的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:143为OX40激动剂单克隆抗体023的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:144为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:145为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:146为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:147为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:148为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:149为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:150为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:151为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:152为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:153为人源化OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:154为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:155为人源化OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:156为OX40激动剂单克隆抗体的重链可变区(VH)。
SEQ ID NO:157为OX40激动剂单克隆抗体的轻链可变区(VL)。
SEQ ID NO:158为PD-1抑制剂纳武利尤单抗(nivolumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:159为PD-1抑制剂纳武利尤单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:160为PD-1抑制剂纳武利尤单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:161为PD-1抑制剂纳武利尤单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:162为PD-1抑制剂纳武利尤单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:163为PD-1抑制剂纳武利尤单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:164为PD-1抑制剂纳武利尤单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:165为PD-1抑制剂纳武利尤单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:166为PD-1抑制剂纳武利尤单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:167为PD-1抑制剂纳武利尤单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:168为PD-1抑制剂帕博利珠单抗(pembrolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:169为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:170为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:171为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:172为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:173为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:174为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:175为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:176为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:177为PD-1抑制剂帕博利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:178为PD-L1抑制剂度伐利尤单抗(durvalumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:179为PD-L1抑制剂度伐利尤单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:180为PD-L1抑制剂度伐利尤单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:181为PD-L1抑制剂度伐利尤单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:182为PD-L1抑制剂度伐利尤单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:183为PD-L1抑制剂度伐利尤单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:184为PD-L1抑制剂度伐利尤单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:185为PD-L1抑制剂度伐利尤单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:186为PD-L1抑制剂度伐利尤单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:187为PD-L1抑制剂度伐利尤单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:188为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗(avelumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:189为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:190为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:191为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:192为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:193为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:194为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:195为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:196为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:197为PD-L1抑制剂阿维鲁单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:198为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗(atezolizumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:199为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:200为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:201为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:202为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:203为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:204为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:205为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:206为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:207为PD-L1抑制剂阿替利珠单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:208为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗(ipilimumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:209为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:210为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:211为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:212为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:213为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:214为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:215为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:216为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:217为CTLA-4抑制剂伊匹木单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:218为CTLA-4抑制剂曲美木单抗(tremelimumab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:219为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:220为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:221为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:222为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:223为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:224为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:225为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:226为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:227为CTLA-4抑制剂曲美木单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:228为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗(zalifrelimab)的重链氨基酸序列。
SEQ ID NO:229为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链氨基酸序列。
SEQ ID NO:230为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链可变区(VH)氨基酸序列。
SEQ ID NO:231为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链可变区(VL)氨基酸序列。
SEQ ID NO:232为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:233为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:234为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的重链CDR3氨基酸序列。
SEQ ID NO:235为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR1氨基酸序列。
SEQ ID NO:236为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR2氨基酸序列。
SEQ ID NO:237为CTLA-4抑制剂泽弗利单抗的轻链CDR3氨基酸序列。
具体实施方式
I.介绍
利用通过快速扩增方案(REP)离体培养的TIL的过继性细胞疗法已在患有例如黑色素瘤的癌症的患者的宿主免疫抑制之后产生成功的过继性细胞疗法。目前的输注接受参数依赖于TIL组成的读数(例如，CD28、CD8或CD4阳性)、各种细胞因子和其他标记物在基于微珠的效力测定(例如IFN-γ)中受刺激时的表达，以及REP产物的扩增数值倍数和存活率。本文描述的是与本领域已知的测定相比，能够提供优异的性能、对T细胞产物效力的更好控制、以及增加的生物学相关性以及其他改进的效力测定。
II.定义
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文所提及的所有专利和出版物均以全文引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“共同施用(co-administration/co-administering)”、“与…组合施用(administered in combination with/administering in combination with)”、“同时(simultaneous/concurrent)”涵盖向受试者或患者施用两种以上活性药物成分(在本发明的一个优选实施方案中，例如多个TIL)，以使得活性药物成分和/或其代谢物两者同时存在于受试者或患者中。共同施用包括以分开的组合物同时施用、以分开的组合物在不同时间施用或以其中存在两种以上活性药物成分的组合物的形式施用。以分开的组合物同时施用和以其中存在两种试剂的组合物的形式施用为优选的。
术语“体内”是指发生于受试者体内或患者体内的事件。
术语“体外”是指发生于受试者体外或患者体外的事件。体外测定涵盖采用活细胞或死细胞的基于细胞的测定，且也可涵盖不采用完整细胞的不含细胞的测定。
术语“离体”是指涉及对已从受试者体内或患者体内移除的细胞、组织和/或器官进行治疗或进行手术的事件。适当地，细胞、组织和/或器官可利用手术或治疗方法返回至受试者体内或患者体内。
术语“快速扩增”是指抗原特异性TIL的数目在一周时间内增加至少约3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更优选地在一周时间内增加至少约10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，或最优选在一周时间内增加至少约100倍。本文描述多种快速扩增方案。
本文中“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”是指最初作为已离开受试者血流且迁移至肿瘤中的白细胞获得的细胞群。TIL包括(但不限于)CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+ T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括初代TIL和继代TIL两者。“初代TIL”是如本文所概述的获自患者组织样本的TIL(有时称为“新鲜获得”或“新鲜分离”)，“继代TIL”是任何如本文所讨论的扩增的或增殖的TIL细胞群，包括(但不限于)主体TIL(bulk TIL)和扩增的TIL(“REP TIL”或“REP后TIL”)。TIL细胞群可包括经基因修饰的TIL。
本文中的“细胞群”(包括TIL)是指许多具有共同特质的细胞。通常，群数目通常在1×106至1×1010的范围内，其中不同的TIL群包括不同数目。例如，初代TIL在IL-2的存在下的初始生长产生大约1×108个细胞的主体TIL群。通常进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞群用于输注。
本文中“冷冻保存的TIL”是指在约-150℃至-60℃的范围内处理且储存TIL，无论是初代的、主体的或扩增的(REP TIL)。用于冷冻保存的通用方法也描述于本文别处，包括在实施例中描述。为了清楚起见，“冷冻保存的TIL”可与可用作初代TIL来源的冷冻组织样本区分。
本文中“解冻的冷冻保存的TIL”是指先前经冷冻保存且随后处理以恢复至室温或更高温度(包括但不限于细胞培养温度或可向患者施用TIL的温度)的TIL群。
TIL通常可以使用细胞表面标记物从生化角度进行定义，也可以通过其浸润肿瘤和实现治疗的能力从功能角度进行定义。TIL通常可通过表达以下生物标记物中的一种或多种进行分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外和替代地，TIL可通过重新引入患者中后浸润实体肿瘤的能力来进行功能定义。
术语“冷冻保存培养基(cryopreservation media/cryopreservation medium)”是指可用于冷冻保存细胞的任何培养基。此类培养基可包括包含7％至10％DMSO的培养基。示例性培养基包括CryoStor CS10、HypoThermosol以及其组合。术语“CS10”是指获自干细胞科技公司(Stemcell Technologies)或Biolife Solutions的冷冻保存培养基。CS10培养基可以商品名“CS10”来指代。CS10培养基为包含DMSO的无血清、无动物成分的培养基。
术语“中枢记忆T细胞(central memory T cell/central memory T-cell)”或“TCM”是指在人类中为CD45R0+且组成性表达CCR7(CCR7hi或CCR7+)和CD62L(CD62hi)的T细胞子集。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BCL-6、BCL-6B、MBD2和BMI1。中枢记忆T细胞在TCR引发之后主要分泌IL-2和CD40L作为效应分子。中枢记忆T细胞主要存在于血液的CD4区室中，且在人类中按比例富集于淋巴结和扁桃体中。自我更新的干记忆T细胞或“TSCM”是可以分化为TCM或TEM细胞的子集，并在Gattinoni等人，《自然医学(Nature Med)》2011，17，1290-97中进行了描述。
术语“效应记忆T细胞(effector memory T cell/effector memory T-cell)”或“TEM”是指人类或哺乳动物T细胞的子集，其与中枢记忆T细胞一样是CD45R0+，但已经失去对CCR7的组成性表达(CCR7lo或CCR-)并且对于CD62L表达而言为异质的或低的(CD62Llo)。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)和IL-15R。中枢记忆T细胞的转录因子包括BLIMP1。效应记忆T细胞在抗原刺激之后快速分泌高水平炎症细胞因子，包括干扰素-γ、IL4-和IL-5。效应记忆T细胞主要存在于血液的CD8区室中，且在人类中按比例富集于肺、肝脏和肠道中。CD8+效应记忆T细胞携带大量的穿孔素。再表达CD45RA标记物的终末分化的TEM细胞称为“TEMRA”或“TEMRA”细胞。
术语“密闭系统”是指对外部环境密闭的系统。适用于细胞培养方法的任何密闭系统均可用于本发明的方法。密闭系统包括例如(但不限于)密闭G容器。一旦将肿瘤片段添加至密闭系统中，该系统不对外部环境开放，直至TIL准备好向患者施用为止。
如本文所用，术语“破碎(fragmenting)”、“碎片(fragment)”和“破碎的(fragmented)”描述将肿瘤破坏的过程，包括机械破碎方法，例如压碎、切片、分割和粉碎肿瘤组织，以及任何其他用于破坏肿瘤组织的物理结构的方法。
术语“外周血单核细胞”和“PBMC”是指具有圆形细胞核的外周血细胞，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)和单核细胞。当用作抗原呈递细胞(PBMC是抗原呈递细胞的一种)时，外周血单核细胞优选地是经辐照的同种异体外周血单核细胞。
术语“外周血淋巴细胞”和“PBL”是指自外周血扩增的T细胞。在一些实施方案中，PBL分离自来自供体的全血或单采术产物。在一些实施方案中，PBL是通过正向或负向选择T细胞表型(例如CD3+CD45+的T细胞表型)而与来自供体的全血或单采术产物分离。
术语“主要组织相容性复合物”或“MHC”是指脊椎动物DNA上的一个大基因座，该大基因座含有编码细胞表面蛋白的一组紧密连接的多态性基因(称为MHC分子)，其对于适应性免疫系统的功能至关重要。MHC基因具有高度多态性，并产生两种主要产物：MHC I类和MHC II类分子。MHC I类蛋白呈递源自细胞质的内源性抗原。MHC II类蛋白呈递源自细胞外异物(例如细菌)的外源性抗原。
术语“MHC显性识别”是指T细胞的TCR复合物与目标细胞的HLA-肽复合物的同种异体相互作用。MHC显性识别描述于Felix和Allen，《自然免疫学评论》，2007，7(12)，942-53；Matzinger和Bevan，《细胞免疫学(Cell Immunol.)》，1977，29(1)，1-5，和Janeway，《主要组织相容性复合物和其在免疫生物学方面的功能：健康与疾病免疫系统(The MajorHistocompatibility Complex and Its Functions in Immunobiology:The ImmuneSystem in Health and Disease)》，第5版，《加兰科学(Garland Science)》，2001中，这些文献中的每一篇的公开内容是以引用的方式并入本文中。在MHC显性识别中，同种异体MHC分子可以更好地适应T细胞受体，从而提供较少依赖于与MHC分子结合的肽的紧密结合。
术语“人类白细胞抗原”或“HLA”或“HLA复合物”是指在人类细胞表面上表达的MHC分子。人类白细胞抗原由人类中的MHC基因复合物编码。
术语“目标细胞”和“目标细胞株”是指作为T细胞(例如TIL、MIL或PBL)的测定目标的细胞。在一个实施方案中，目标细胞表达MHC I类和/或II类。在一个实施方案中，目标细胞包括Raji细胞和其衍生物、变体、修饰和后代，以及表达MHC I类和/或II类的其他细胞。在一个实施方案中，目标细胞包括Thp1细胞和其衍生物、变体、修饰和后代。在一个实施方案中，目标细胞包括Ramos细胞和其衍生物、变体、修饰和后代。在一个实施方案中，目标细胞包括U937细胞和其衍生物、变体、修饰和后代。在一个实施方案中，目标细胞包括Daudi细胞和其衍生物、变体、修饰和后代。在一个实施方案中，目标细胞经辐照。在一个实施方案中，目标细胞未经辐照。在一个实施方案中，目标细胞株为Raji细胞株、Thp1细胞株、Ramos细胞株、U937细胞株和Daudi细胞株中的任两者的组合。在一个实施方案中，目标细胞株为Raji细胞株、Thp1细胞株、Ramos细胞株、U937细胞株和Daudi细胞株中的任三者的组合。在一个实施方案中，目标细胞株为Raji细胞株、Thp1细胞株、Ramos细胞株、U937细胞株和Daudi细胞株中的任四者的组合。在一个实施方案中，目标细胞株为Raji细胞株、Thp1细胞株、Ramos细胞株、U937细胞株和Daudi细胞株的组合。在一个实施方案中，目标细胞株为混合肿瘤目标细胞株。在一个实施方案中，目标细胞株为同种异体反应性目标细胞株。在一个实施方案中，目标细胞株为混合肿瘤同种异体反应性目标细胞株。在一个实施方案中，目标细胞株为包括以下细胞株中的至少两者的组合的混合肿瘤同种异体反应性目标细胞株：Raji细胞株、Ramos细胞株、Thp1细胞株、U937细胞株和Daudi细胞株。
术语“Raji细胞”或“Raji细胞株”是指具有B细胞特征的伯基特氏淋巴瘤细胞株(其获自多个供应商，包括美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(Manassas，VA，USA))和其衍生物、变体、修饰和后代。Raji细胞描述于Theofilopoulos等人《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》1976，57，169-182；Sobel和Bokisch，《美国实验生物学联合会会报(Fed.Proc.)》1975，34，965；和Theofilopoulos等人，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》1974，140，1230-1244；这些文献中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。Raj细胞缺乏膜结合免疫球蛋白，但具有IgG Fc、C3b、C3d和Clq受体。在一个实施方案中，Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代为目标细胞。在一个实施方案中，Raji细胞经基因修饰以表达荧光、磷光、化学发光或生物发光标记，使得当其细胞膜被破坏时，荧光、磷光、化学发光或生物发光标记被释放至培养基中以便有可能用于检测中。例如，美国专利第10,415,015号中描述的用于生物发光检测的基因修饰方法可用于修饰Raji细胞，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“Thp1细胞”或“Thp1细胞株”是指人类急性单核细胞白血病细胞株(也称为“THP-1细胞”或“THP-1细胞株”且可购自多个供应商，包括美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA))和其衍生物、变体、修饰和后代。Thp1细胞株描述于Tsuya等人，《国际癌症期刊(Int.J.Cancer)》1980，26，171-176以及Bosshart和Heinzelmann，《转化医学年鉴(Ann.Transl.Med.)》2016，4(21)，438中，这些文献中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代为目标细胞。在一个实施方案中，Thp1细胞经基因修饰以表达荧光、磷光、化学发光或生物发光标记，使得当其细胞膜被破坏时，荧光、磷光、化学发光或生物发光标记被释放至培养基中以便有可能用于检测中。例如，美国专利第10,415,015号中描述的用于生物发光检测的基因修饰方法可用于修饰Thp1细胞，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“Ramos细胞”或“Ramos细胞株”是指人类伯基特氏淋巴瘤细胞株(其获自多个供应商，包括美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA))和其衍生物、变体、修饰和后代。Ramos细胞株描述于Benjamin等人《免疫学杂志(J.Immunol.)》1982，129，1336-1342，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，Ramos细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代为目标细胞。在一个实施方案中，Ramos细胞经基因修饰以表达荧光、磷光、化学发光或生物发光标记，使得当其细胞膜被破坏时，荧光、磷光、化学发光或生物发光标记被释放至培养基中以便有可能用于检测中。例如，美国专利第10,415,015号中描述的用于生物发光检测的基因修饰方法可用于修饰Ramos细胞，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“U937细胞”或“U937细胞株”是指人类组织细胞淋巴瘤细胞株(其获自多个供应商，包括美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA))和其衍生物、变体、修饰和后代。U937细胞株描述于Kraus等人,《临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)》2007，45，3777-3780中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代为目标细胞。在一个实施方案中，U937细胞经基因修饰以表达荧光、磷光、化学发光或生物发光标记，使得当其细胞膜被破坏时，荧光、磷光、化学发光或生物发光标记被释放至培养基中以便有可能用于检测中。例如，美国专利第10,415,015号中描述的用于生物发光检测的基因修饰方法可用于修饰U937细胞，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“Daudi细胞”或“Ramos细胞株”是指人类伯基特氏淋巴瘤细胞株(其获自多个供应商，包括美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA))和其衍生物、变体、修饰和后代。Daudi细胞株描述于Gao等人，《病毒学杂志(J.Virol.)》1997，71，84-94中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代为目标细胞。在一个实施方案中，Daudi细胞经基因修饰以表达荧光、磷光、化学发光或生物发光标记，使得当其细胞膜被破坏时，荧光、磷光、化学发光或生物发光标记被释放至培养基中以便有可能用于检测中。例如，美国专利第10,415,015号中描述的用于生物发光检测的基因修饰方法可用于修饰Daudi细胞，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“阴性对照”、“阴性对照细胞”和“阴性对照细胞株”是指用作T细胞测定(包括TIL、MIL或PBL测定)的阴性对照的细胞。在一个实施方案中，目标细胞缺乏MHC I类和II类表达。在一个实施方案中，目标细胞缺乏MHC I类表达。在一个实施方案中，目标细胞缺乏MHC或HLA I类表达。在一个实施方案中，目标细胞以最低水平表达MHC或HLAI类和/或II类。
术语“K562细胞”或“K562细胞株”是指具有淋巴母细胞形态的人类高加索人慢性髓性白血病细胞株(其可获自多个供应商，包括美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，USA))和其衍生物、变体、修饰和后代。K562细胞描述于Lozzio和Lozzio，《血液(Blood)》，1975，45，321-34中，在一个实施方案中，阴性对照细胞包括K562细胞和其衍生物、变体、修饰和后代，以及不表达MHC或HLA I类或II类的其他细胞。
术语“抗CD3抗体”是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的抗体或其变体，例如单克隆抗体，包括人类、人源化、嵌合或鼠类抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗。抗CD3抗体还包括UHCT1克隆，也称为T3和CD3ε。其他抗CD3抗体包括例如奥昔组单抗(otelixizumab)、替利组单抗(teplizuma)和维西珠单抗(visilizumab)。
术语“OKT-3”(在本文中也被称作“OKT3”)是指针对成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的单克隆抗体或其生物类似物或变体，包括人类、人源化、嵌合或鼠类抗体，且包括市售形式，例如OKT-3(30ng/mL，MACS GMP CD3纯，美国加利福尼亚州圣地亚哥美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech,Inc，San Diego，CA，USA))和莫罗单抗或其变体、保守氨基酸取代、糖化形式或生物类似物。莫罗单抗的重链和轻链的氨基酸序列在表1中给出(SEQID NO:1和SEQ ID NO:2)。能够产生OKT-3的杂交瘤保藏于美国典型培养物保藏中心且所指派的ATCC保藏号为CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤也保藏于欧洲认证细胞培养物保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures；ECACC)且所指派的目录号为86022706。
表1.莫罗单抗的氨基酸序列。
术语“IL-2”(在本文中也称为“IL2”)是指称为白介素-2的T细胞生长因子，且包括所有形式的IL-2，包括人类和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和其变体。IL-2是描述于例如Nelson的《免疫学杂志(J.Immunol.)》2004，172，3983-88和Malek，《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》2008，26，453-79，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的重组人类IL-2的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO:3)。例如，术语IL-2涵盖人类重组形式的IL-2，例如阿地白介素(PROLEUKIN，可购自多个供应商，每单次使用小瓶含22百万IU)以及由美国新罕布什尔州次茅斯的CellGenix，Inc.或美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-209-b)供应的重组IL-2形式和来自其他供应商的其他商业等效物。阿地白介素(去丙氨酰基-1，丝氨酸-125人类IL-2)为分子量大约15kDa的非糖基化人类重组形式的IL-2。适用于本发明的阿地白介素的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO:4)。术语IL-2也涵盖如本文所描述的IL-2的聚乙二醇化形式，包括可购自美国加利福尼亚州南旧金山(South San Francisco，CA，USA)的NektarTherapeutics的聚乙二醇化IL2前药NKTR-214。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化IL-2描述于美国专利申请公开第2014/0328791A1号和国际专利申请公开第WO 2012/065086A1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的替代形式的缀合IL-2描述于美国专利第4,766,106号、第5,206,344号、第5,089,261号和第4902,502号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。适用于本发明的IL-2制剂描述于美国专利第6,706,289号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，适合用于本发明的IL-2形式为THOR-707。适用于本发明的IL-2的其他替代形式描述于美国专利申请公开第2020/0181220A1号和美国专利申请公开第2020/0330601A1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，适合用于本发明的IL-2形式为ALKS-4230。适用于本发明的IL-2的其他替代形式也描述于美国专利申请公开第2021/0038684A1号和美国专利第10,183,979号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为白介素2(IL-2)缀合物，其包括：经分离和纯化的IL-2多肽；和在选自以下的氨基酸位置结合至经分离和纯化的IL-2多肽的缀合部分：K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107，其中氨基酸残基的编号对应于美国专利申请公开第2020/018120号中的SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，氨基酸位置选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方案中，氨基酸位置选自T37、R38、T41、F42、F44、Y45、E61、E62、E68、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方案中，氨基酸位置选自T37、T41、F42、F44、Y45、P65、V69、L72和Y107。在一些实施方案中，氨基酸位置选自R38和K64。在一些实施方案中，氨基酸位置选自E61、E62和E68。在一些实施方案中，氨基酸位置在E62。在一些实施方案中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸残基进一步突变成赖氨酸、半胱氨酸或组氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基突变成半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基突变成赖氨酸。在一些实施方案中，选自K35、T37、R38、T41、F42、K43、F44、Y45、E61、E62、E68、K64、P65、V69、L72和Y107的氨基酸残基进一步突变成非天然氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包括N6-叠氮基乙氧基-L-赖氨酸(AzK)、N6-炔丙基乙氧基-L-赖氨酸(PraK)、BCN-L-赖氨酸、降冰片烯赖氨酸、TCO-赖氨酸、甲基四嗪赖氨酸、烯丙氧基羰基赖氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、2-氨基-8-氧代辛酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)、对碘-L-苯丙氨酸、间乙酰基苯丙氨酸、2-氨基-8-氧代壬酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对溴苯基丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基酪氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、膦酰基酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、2-氨基-3-((2-((3-(苄氧基)-3-氧代丙基)氨基)乙基)硒基)丙酸、2-氨基-3-(苯基硒基)丙酸或硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，IL-2缀合物对IL-2受体α(IL-2Rα)亚基的亲和力降低。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，降低的亲和力是对IL-2Rα的结合亲和力降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在一些实施方案中，相对于野生型IL-2多肽，亲和力降低约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、30倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍或更多。在一些实施方案中，缀合部分削弱或阻断IL-2与IL-2Rα的结合。在一些实施方案中，缀合部分包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，另外的缀合部分包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物各自独立地包括聚乙二醇(PEG)、聚(丙二醇)(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(乙氧基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯吡咯啶酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羟基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚恶唑啉(POZ)、聚(N-丙烯酰吗啉)或它们的组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物各自独立地包括PEG。在一些实施方案中，PEG为直链PEG或支链PEG。在一些实施方案中，水溶性聚合物各自独立地包括多糖。在一些实施方案中，多糖包括葡萄聚糖、聚唾液酸(PSA)、透明质酸(HA)、直链淀粉、肝素、硫酸乙酰肝素(HS)、糊精或羟乙基淀粉(HES)。在一些实施方案中，水溶性聚合物各自独立地包括聚糖。在一些实施方案中，水溶性聚合物各自独立地包括聚胺。在一些实施方案中，缀合部分包括蛋白质。在一些实施方案中，另外的缀合部分包括蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质各自独立地包括白蛋白、转铁蛋白(transferrin)或运甲状腺素蛋白(transthyretin)。在一些实施方案中，蛋白质各自独立地包括Fc部分。在一些实施方案中，蛋白质各自独立地包括IgG的Fc部分。在一些实施方案中，缀合部分包括多肽。在一些实施方案中，另外的缀合部分包括多肽。在一些实施方案中，多肽各自独立地包括XTEN肽、富甘氨酸高氨基酸聚合物(HAP)、PAS多肽、弹性蛋白样多肽(ELP)、CTP肽或明胶样蛋白质(GLK)聚合物。在一些实施方案中，经分离和纯化的IL-2多肽通过谷氨酰化修饰。在一些实施方案中，缀合部分直接结合至经分离和纯化的IL-2多肽。在一些实施方案中，缀合部分通过接头间接结合至经分离和纯化的IL-2多肽。在一些实施方案中，接头包括同种型双官能接头。在一些实施方案中，同种型双官能接头包括罗曼特氏试剂(Lomant'sreagent)二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3'3'-二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺酯)(BS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基DST)、糖基双(琥珀酰亚胺基丁二酸)伸乙酯(EGS)、戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)、碳酸N,N'-二琥珀酰亚胺酯(DSC)、二亚胺代二酸二甲酯(DMA)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、二甲基-3,3'-二硫代双丙酰亚氨酸酯(DTBP)、1,4-二(3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双顺丁烯二酰亚胺基己烷(BMH)、含有芳基卤化物的化合物(DFDNB)(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯)、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨基酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3'-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α'-对二氨基联苯、二碘-对二甲苯磺酸、N,N'-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N'-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。在一些实施方案中，接头包括异型双官能接头。在一些实施方案中，异型双官能接头包括3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(sPDP)、长链3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(LC-sPDP)、水溶性长链3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6--[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间顺丁烯二酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯(sIAB)、(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-顺丁烯二酰亚胺基丁酰氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、6-((碘乙酰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIAX)、6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸琥珀酰亚胺酯(sIAXX)、4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(sIAC)、6-(((((4-碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸琥珀酰亚胺酯(sIACX)、碘乙酸对硝苯酯(NPIA)、羰基反应性和硫氢基反应性交联剂，例如4-(4-N-顺丁烯二酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酰基酰肼(PDPH)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮水杨基酰胺基己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮水杨基酰胺基)乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰氧基丁二酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮苯基)1,3'-二硫丙酸酯(sADP)、(4-叠氮苯基)-1,3'-二硫丙酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sADP)、4-(对叠氮苯基)丁酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAPB)、2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫丙酸磺基琥珀酰亚胺酯(sAED)、7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-sAMCA)、重氮丙酮酸对硝苯酯(ρNPDP)、对硝苯基-2-重氮-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)、1-(对叠氮基水杨基酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺(APDP)、二苯甲酮-4-碘乙酰胺、对叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)、4-(对叠氮基水杨基酰胺基)丁胺(AsBA)或对叠氮苯基乙二醛(APG)。在一些实施方案中，接头包括可裂解接头，可选地，包括二肽接头。在一些实施方案中，二肽接头包括Val-Cit、Phe-Lys、Val-Ala或Val-Lys。在一些实施方案中，接头包括不可裂解接头。在一些实施方案中，接头包括顺丁烯二酰亚胺基，可选地，包括顺丁烯二酰亚胺基己酰基(mc)、琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。在一些实施方案中，接头进一步包括间隔子。在一些实施方案中，间隔子包括对氨基苯甲基醇(PAB)、对氨基苯甲氧基羰基(PABC)、其衍生物或类似物。在一些实施方案中，缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施方案中，另外的缀合部分能够延长IL-2缀合物的血清半衰期。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为本文所描述的任一种IL-2形式的片段。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式是如美国专利申请公开第2020/0181220A1号和美国专利申请公开第2020/0330601A1号中所公开地聚乙二醇化的。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为IL-2缀合物，该IL-2缀合物包括：IL-2多肽，其包括N6-叠氮基乙氧基-赖氨酸(AzK)，其共价连接于包括聚乙二醇(PEG)的缀合部分，其中：IL-2多肽包括与美国专利申请公开第2020/0330601号中的SEQ ID NO:1(在本文中列出为表2中的SEQ ID NO:5)具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；和参照美国专利申请公开第2020/0330601号中的SEQ ID NO:1(在本文中列出为表2中的SEQ ID NO:5)中的氨基酸位置，对位置K35、F42、F44、K43、E62、P65、R38、T41、E68、Y45、V69或L72处的氨基酸的AzK取代物。在一些实施方案中，相对于美国专利申请公开第2020/0330601号中的SEQ ID NO:1(在本文中列出为表2中的SEQ ID NO:5)，IL-2多肽具有N末端的一个残基的缺失。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式缺乏IL-2Rα链接合，但保持与中等亲和力IL-2Rβ-γ信号传导复合物的正常结合。在一些实施方案中，适合用于本发明的IL-2形式为ALKS-4230。适用于本发明的IL-2形式在美国专利申请公开第2021/0038684A1号中描述为SEQ ID NO:1(在本文中列出为表2中的SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为一种融合蛋白，其包含美国专利第10,183,979号中的SEQ ID NO:2(美国专利第10,183,979号中的SEQ ID NO:2，本文列出为表2中的SEQ ID NO:7)的氨基酸24-452。在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为一种融合蛋白，其包含美国专利第10,183,979号中的SEQ ID NO:2的氨基酸24-452；或为一种氨基酸序列，其与美国专利第10,183,979号中的SEQ ID NO:2的氨基酸24-452同源、在美国专利第10,183,979号中的SEQ ID NO:2的氨基酸24-452的全长上具有至少98％氨基酸序列同一性且具有美国专利第10,183,979号中的SEQ ID NO:2的氨基酸24-452的受体拮抗剂活性。可选地，在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式为包含第一融合配偶体的融合蛋白，该第一融合配偶体通过粘蛋白结构域多肽接头与第二融合配偶体连接，其中该第一融合配偶体为IL-1Rα或与IL-1Rα具有至少98％氨基酸序列同一性且具有IL-Rα的受体拮抗剂活性的蛋白质，且其中该第二融合配偶体包含全部或部分包含Fc区的免疫球蛋白，其中该粘蛋白结构域多肽接头包括美国专利第10,183,979号中的SEQ ID NO:14(在本文中列出为表2中的SEQ ID NO:8)或与美国专利第10,183,979号中的SEQ ID NO:14(在本文列出为表2中的SEQ ID NO:8)具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，且其中融合蛋白的半衰期与第一融合配偶体在没有粘蛋白结构域多肽接头的情况下与第二融合配偶体的融合相比有所改善。
表2.白介素的氨基酸序列。
在一些实施方案中，适用于本发明的IL-2形式包括抗体细胞因子植入蛋白，该抗体细胞因子植入蛋白包括：重链可变区(VH)，其包括互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中该抗体细胞因子植入蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括重链可变区(VH)，其包括互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中IL-2分子为突变蛋白，并且其中该抗体细胞因子植入蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞。在一个实施方案中，IL-2方案包括施用美国专利申请公开第2020/0270334A1号中所描述的抗体，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括重链可变区(VH)，其包括互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3；轻链可变区(VL)，其包括LCDR1、LCDR2、LCDR3；和IL-2分子或其片段，其移植至VH或VL的CDR中，其中IL-2分子为突变蛋白，其中该抗体细胞因子植入蛋白优先于调节性T细胞扩增T效应细胞，并且其中抗体进一步包括选自下组的IgG类重链和IgG类轻链：包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:69的IgG类轻链和包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:53的IgG类重链；包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQID NO:37的IgG类轻链和包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:21的IgG类重链；包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:69的IgG类轻链和包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:21的IgG类重链；以及包含SEQID NO:37的IgG类轻链和包含美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:53的IgG类重链。
在一个实施方案中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR1中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一个实施方案中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR2中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一个实施方案中，IL-2分子或其片段移植至VH的HCDR3中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一个实施方案中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR1中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一个实施方案中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR2中，其中IL-2分子为突变蛋白。在一些实施方案中，IL-2分子或其片段移植至VL的LCDR3中，其中IL-2分子为突变蛋白。
IL-2分子的插入可在CDR的N末端区域处或附近，在CDR的中间区域中，或在CDR的C末端区域处或附近。在一些实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白质包括并入CDR中的IL-2分子，其中IL2序列不会将CDR序列框移。在一些实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括并入CDR中的IL-2分子，其中IL-2序列置换CDR序列的全部或一部分。IL-2分子置换可在CDR的N末端区域处，在CDR的中间区域中，或在CDR的C末端区域处或附近。IL-2分子置换可少至CDR序列或整个CDR序列的一个或两个氨基酸。
在一些实施方案中，IL-2分子直接移植至无肽接头的CDR中，其中在CDR序列与IL-2序列之间没有另外的氨基酸。在一些实施方案中，IL-2分子间接移植至具有肽接头的CDR中，其中CDR序列与IL-2序列之间存在一个以上另外的氨基酸。
在一些实施方案中，本文所描述的IL-2分子为IL-2突变蛋白。在一些情况下，IL-2突变蛋白包括R67A取代。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包括美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的氨基酸序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包括美国专利申请公开第2020/0270334A1号中表1中的氨基酸序列，该公开的公开内容以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括选自美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16的HCDR1。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:16的HCDR1和选自美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17的HCDR2。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16的HCDR1、选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:17的HCDR2以及选自美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:18的HCDR3。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括VH区，该VH区包括美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括重链，该重链包括美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括VL区，该VL区包括美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括轻链，该轻链包括美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括VH区，其包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列；和VL区，其包括美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括重链区，其包括SEQ ID NO:21的氨基酸序列；和轻链区，其包括美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗体细胞因子植入蛋白包括美国专利申请公开第2020/0270334A1号中的IgG.IL2R67A.H1。在一个实施方案中，本文所描述的抗体细胞因子植入蛋白的抗体组分包括帕利珠单抗(palivizumab)的免疫球蛋白序列、框架序列或CDR序列。
在一些实施方案中，本文所描述的抗体细胞因子植入蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如但不限于阿地白介素或类似分子)长。
在一个实施方案中，本文所描述的抗体细胞因子植入蛋白具有如表3所示的序列。
表3.示例性帕利珠单抗抗体-IL-2植入蛋白的序列
/>
/>
术语“IL-4”(在本文中也称“IL4”)是指被称为白介素4的细胞因子，其由Th2 T细胞和嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和肥大细胞产生。IL-4调节初始辅助T细胞(Th0细胞)分化成Th2 T细胞。Steinke和Borish，《呼吸研究(Respir.Res.)》2001，2，66-70。在由IL-4活化后，Th2 T细胞随后以正回馈回路产生另外IL-4。IL-4也刺激B细胞增殖和II类MHC表达，且诱导来自B细胞的类别转换至IgE和IgG1表达。适用于本发明的重组人类IL-4可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-211)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific，Inc.)(人类IL-15重组蛋白，目录号Gibco CTP0043)。适用于本发明的重组人类IL-4的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO:9)。
术语“IL-7”(在本文中也称为“IL7”)是指称为白介素7的糖基化的组织衍生性细胞因子，其可获自基质和上皮细胞以及树突状细胞。Fry和Mackall，《血液(Blood)》2002，99，3892-904。IL-7可以刺激T细胞的发育。IL-7与IL-7受体(一种由IL-7受体α和共同γ链受体组成的异二聚体)结合，其属于对于T细胞在胸腺内的发育和在外周内的存活而言重要的一系列信号。适用于本发明的重组人类IL-7可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克(East Brunswick，NJ，USA)的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-254)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA)(人类IL-15重组蛋白，目录号Gibco PHC0071)。适用于本发明的重组人类IL-7的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO:10)。
术语“IL-15”(在本文中也称为“IL15”)是指称为白介素-15的T细胞生长因子，且包括所有形式的IL-2，包括人类和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和其变体。IL-15描述于例如Fehniger和Caligiuri的《血液》2001，97，14-32中，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-15与IL-2共用β和γ信号受体亚基。重组人类IL-15为分子质量为12.8kDa的含有114个氨基酸(和N末端甲硫氨酸)的单一非糖基化多肽链。重组人类IL-15可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-230-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人类IL-15重组蛋白，目录号34-8159-82)。适用于本发明的重组人类IL-15的氨基酸序列于表2中给出(SEQID NO:11)。
术语“IL-21”(在本文中也称为“IL21”)是指称为白介素-21的多效性细胞因子蛋白，且包括所有形式的IL-21，包括人类和哺乳动物形式、保守氨基酸取代、糖化形式、生物类似物和其变体。IL-21描述于例如Spolski和Leonard，《自然综述：药物发现(Nat.Rev.Drug.Disc.)》2014，13，379-95，其公开内容以引用的方式并入本文中。IL-21主要通过自然杀伤T细胞和经活化的人类CD4+ T细胞产生。重组人类IL-21为分子质量为15.4kDa的含有132个氨基酸的单一非糖基化多肽链。重组人类IL-21可购自多个供应商，包括美国新泽西州东不伦瑞克的ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.(目录号CYT-408-b)和美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(人类IL-21重组蛋白，目录号14-8219-80)。适用于本发明的重组人类IL-21的氨基酸序列于表2中给出(SEQ ID NO:12)。
当指示“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，本发明组合物待施用的精确量可由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和病状的个体差异来确定。通常，本文所描述的包含肿瘤浸润淋巴细胞(例如继代TIL或基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)的药物组合物可以104至1011个细胞/公斤体重(例如，105至106、105至1010、105至1011、106至1010、106至1011、107至1011、107至1010、108至1011、108至1010、109至1011或109至1010个细胞/公斤体重)的剂量施用，包括在那些范围内的所有整数值。肿瘤浸润淋巴细胞(在一些情况下包括经基因修饰的细胞毒性淋巴细胞)组合物也可以这些剂量多次施用。肿瘤浸润淋巴细胞(在一些情况下，包括遗传性的)可通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术进行施用(参见例如Rosenberg等人，《新英格兰医学杂志(New Eng.J.of Med.)》319:1676，1988)。特定患者的最优选剂量和治疗方案可容易地由所属药物领域的技术人员通过监测患者的疾病病征且相应地调整治疗来确定。
术语“血液系统恶性肿瘤(hematological malignancy/hematologicmalignancy)”或有相关意义的术语是指哺乳动物造血和淋巴组织(包括但不限于血液、骨髓、淋巴结和淋巴系统的组织)的癌症和肿瘤。血液系统恶性肿瘤也称为“液体肿瘤”。血液系统恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴母细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性淋巴瘤(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性单核细胞白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)和非霍奇金氏淋巴瘤。术语“B细胞血液恶性肿瘤”是指影响B细胞的血液系统恶性肿瘤。
术语“液体肿瘤”是指性质上为流体的异常细胞团块。液体肿瘤癌症包括(但不限于)白血病、骨髓瘤和淋巴瘤，以及其他血液系统恶性肿瘤。获自液体肿瘤的TIL在本文中也可称为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。获自液体肿瘤(包括在外周血中循环的液体肿瘤)的TIL在本文中也可称为PBL。术语MIL、TIL和PBL在本文中可互换使用且仅基于衍生细胞的组织类型而有所不同。
如本文所用，术语“微环境”可指作为整体的实体或血液肿瘤微环境或可指在微环境内的单个细胞子集。如本文所用，肿瘤微环境是指以下的复杂混合物：“促进赘生性转化、支持肿瘤生长和侵袭、保护肿瘤不受宿主免疫力影响、鼓励治疗抗性且提供显性转移茁壮成长的生态栖位(niche)的细胞、可溶因子、信号分子、细胞外基质和机械信号”，如Swartz等人，《癌症研究(Cancer Res.)》，2012，72，2473中所描述。尽管肿瘤表达应由T细胞识别的抗原，但由于微环境的免疫抑制，免疫系统清除肿瘤的情况是罕见的。
在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本发明的TIL之前经非清髓性化疗预治疗。在一些实施方案中，可提供TIL群，其中患者在输注根据本发明的TIL之前经非清髓性化疗预治疗。在一个实施方案中，非清髓性化疗为环磷酰胺60mg/kg/天持续2天(在TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/天持续5天(在TIL输注前第27至23天)。在一个实施方案中，在根据本发明的非清髓性化疗和TIL输注之后(第0天)，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2的静脉内输注以达到生理耐受。
实验发现表明，在过继性转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前，淋巴细胞耗竭通过消除调节性T细胞且竞争免疫系统的组件(“细胞因子库”)在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的TIL之前在患者身上采用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指如本文所描述的化合物或化合物组合的量，其足以实现所预期应用，包括但不限于疾病治疗。治疗有效量可视预期应用(体外或体内)或所治疗的受试者和疾病病状(例如，受试者的体重、年龄和性别)、疾病病状的严重程度或施用方式而变化。该术语也适用于将诱发目标细胞中的特定反应(例如血小板粘附和/或细胞迁移减少)的剂量。特定剂量将视以下而变化：所选特定化合物、所依循的给药方案、化合物是否与其他化合物组合施用、施用时间、其所施用的组织和其中携带化合物的物理递送系统。
术语“治疗(treatment/treating/treat)”和其类似术语是指获得所要的药理学和/或生理学效应。该效应就完全或部分预防疾病或其症状而言可具预防性，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不良影响而言可具治疗性。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物、尤其人类的疾病的任何治疗，包括：(a)预防可能易患疾病但尚未诊断出患有该疾病的受试者中出现该疾病；(b)抑制疾病，即遏制其发展或进展；以及(c)缓解疾病，即，促使疾病消退和/或缓解一种以上疾病症状。“治疗”也意在涵盖递送试剂以便提供药理学效应，即使在不存在疾病或病状的情况下也如此。例如，“治疗”涵盖可在不存在疾病病状的情况下(例如在疫苗的情况下)引发免疫反应或赋予免疫性的组合物的递送。
当参考核酸或蛋白质的部分使用时，术语“异源”表示核酸或蛋白质包含两个以上在自然界中发现彼此之间没有相同关系的子序列。例如，通常以重组方式产生核酸，其具有两个以上来自无关基因的经布置以制造新的功能性核酸序列的序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区或来自不同来源的编码区。类似地，异源蛋白表示蛋白质包含两个以上在自然界中未发现彼此呈相同关系的子序列(例如融合蛋白)。
在两个以上核酸或多肽的上下文中，术语“序列同一性(sequence identity)”、“同一性百分比(percent identity)”和“序列同一性百分比(sequence percentidentity)”(或其同义词，例如“99％同一性”)是指两个以上序列或子序列在进行比较和比对(视需要引入间隔)以达到最大对应性且不将任何保守氨基酸取代视为序列同一性的部分时，该两个以上序列或子序列是相同的或具有相同的特定百分比的核苷酸或氨基酸残基。同一性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查来测量。所属领域中已知可用于获得氨基酸或核苷酸序列的比对的各种算法和软件。用以确定序列同一性百分比的合适的程序包括例如可购自美国政府的国家生物技术信息中心(U.S.Government'sNational Center for Biotechnology Information)BLAST网站的BLAST程序包。两个序列之间的比较可使用BLASTN或BLASTP算法进行。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。ALIGN、ALIGN-2(美国加利福尼亚州南旧金山的基因泰克(Genentech))或MegAlign(可购自DNASTAR)是另外的可用于比对序列的可供大众使用的软件程序。本领域技术人员可以通过特定的比对软件来确定用于最大比对的适当参数。在某些实施方案中，使用比对软件的默认参数。
如本文所用，术语“变体”涵盖(但不限于)包含与参考抗体的氨基酸序列不同的氨基酸序列的抗体或融合蛋白，不同之处在于在参考抗体的氨基酸序列之内或相邻的某些位置有一个以上取代、缺失和/或添加。与参考抗体的氨基酸序列相比，变体可以在其氨基酸序列中包括一个以上保守取代。保守取代可涉及例如类似带电或不带电氨基酸的取代。变体保留与参考抗体的抗原特异性结合的能力。术语变体还包括聚乙二醇化抗体或蛋白质。
本文中“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”是指最初作为已离开受试者血流且迁移至肿瘤中的白细胞而获得的细胞群。TIL包括(但不限于)CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+ T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括初代TIL和继代TIL两者。“初代TIL”是如本文所概述的自患者组织样本获得(有时称为“新鲜收集”)的细胞，“继代TIL”是如本文所讨论的扩增的或增殖的任何TIL细胞群，包括但不限于主体TIL、扩增的TIL(“REP TIL”)以及如本文所讨论的“reREP TIL”。reREP TIL可包括例如第二次扩增TIL或第二次额外扩增TIL(例如图8的步骤D中所描述的TIL，包括称为reREP TIL的TIL)。
TIL通常可经生物化学(使用细胞表面标记物)或功能(根据其浸润肿瘤和实现治疗的能力)定义。TIL通常可通过表达以下生物标记物中的一种或多种分类：CD4、CD8、TCRαβ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1和CD25。另外和替代地，TIL可通过其重新引入患者中后浸润实体肿瘤的能力来进行功能定义。TIL可进一步通过效力表征-例如若例如干扰素(IFN)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，则TIL可视为强效的。
术语“脱氧核糖核苷酸”涵盖天然的和合成的、未经修饰的和经修饰的脱氧核糖核苷酸。修饰包括改变糖部分、碱基部分和/或寡核苷酸中各脱氧核糖核苷酸之间的连接。
术语“RNA”定义包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。术语“核糖核苷酸”定义在b-D-呋喃核糖部分的2'位具有羟基的核苷酸。术语RNA包括双链RNA；单链RNA；分离的RNA，例如部分纯化的RNA、基本上纯RNA、合成RNA、以重组方式产生的RNA；以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个以上核苷酸而不同于天然存在的RNA的经改变的RNA。本文所描述的RNA分子中的核苷酸也可包括非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可称为类似物或天然存在的RNA的类似物。
术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”意在包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂，以及惰性成分。此类药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂用于活性药物成分的用途为本领域所熟知。除非任何常规药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂与活性药物成分不相容，否则考虑其在本发明的治疗性组合物中的用途。例如其他药物的另外活性药物成分也可并入所描述的组合物和方法中。
术语“约”或“大约”是指在值的统计学上有意义的范围内。此范围可在给定值或范围的一个数量级内，优选50％内，更优选20％内，更优选10％内，甚至更优选5％内。由术语“约”或“大约”涵盖的允许差值取决于研究下的特定系统，可由所属领域中具有通常知识者容易地理解。此外，如本文所用，术语“约”和“大约”是指尺寸、大小、制剂、参数、形状和其他数量(quantity)和特征并不精确且不需要精确，而是可以视需要为近似值和/以上或更小的，反映出公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域的技术人员已知的其他因素。通常，无论是否如此明确说明，尺寸、大小、制剂、参数、形状或其他数量或特征均为“约”或“大约”的。应注意，大小、形状和尺寸非常不同的实施方案可采用所描述的设置。
当以原始和修改形式用于所附权利要求中时，过渡术语“包括/包含(comprising)”、“基本上由…组成(consisting essentially of)”和“由…组成(consisting of)”相对于未叙述的另外的权利要求要素或步骤(若存在)被排除在权利要求的范围之外来限定要求保护范围。术语“包括/包含”意在为包括性的或开放性的，不排除任何另外的、未叙述的要素、方法、步骤或材料。术语“由…组成”不包括除权利要求中指定的要素、步骤或材料以外的任何要素、步骤或材料，在后一情况中排除与指定材料通常相关的杂质。术语“基本上由…组成”将权利要求的范围限于所指定要素、步骤或材料和基本上不影响所主张发明的基础和新颖特征的要素、步骤或材料。在替代实施方案中，本文所描述的体现本发明的所有组合物、方法和套件可由任何过渡术语“包括/包含”、“基本上由…组成”和“由…组成”更具体地定义。
术语“抗体(antibody)”及其复数形式“抗体(antibodies)”是指完整的免疫球蛋白和任何抗原结合片段(“抗原结合部分”)或其单链。“抗体”也指包括通过二硫键连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。各重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。各轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。抗体的VH和VL区可进一步细分成高变区，其称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)，其可穿插有更保守的区域，称为框架区(FR)。各VH和VL由自氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与一个以上抗原表位相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，这些宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。
术语“抗原”是指诱导免疫反应的物质。在一些实施方案中，若通过主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递，则抗原为能够与抗体或TCR结合的分子。如本文所用，术语“抗原”也涵盖T细胞抗原表位。抗原另外能够被免疫系统识别。在一些实施方案中，抗原能够诱导使得B淋巴细胞和/或T淋巴细胞活化的体液免疫反应或细胞免疫反应。在一些情况下，其可能需要抗原含有或连接至Th细胞抗原表位。抗原也可具有一个以上抗原表位(例如，B抗原表位和T抗原表位)。在一些实施方案中，抗原优选将通常以高度特异性且选择性方式与其对应抗体或TCR反应，而不与可由其他抗原诱导的多种其他抗体或TCR反应。
术语“单克隆抗体”、“mAb”、“单克隆抗体组合物”或其复数形式是指单分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示针对特定表位的单一结合特异性和亲和力。对某些受体具有特异性的单克隆抗体可使用以下技术中的知识和技术制得：即向测试受试者注射适合抗原，然后分离表达具有所需序列或功能特征的抗体的杂交瘤。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规程序(例如，通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。DNA一经分离，则可置于表达载体中，然后转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。下文将更详细地描述抗体的重组生产。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简言之，“抗体部分”或“片段”)是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个以上片段。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”范围内所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即一种二价片段，其包括在铰链区通过二硫桥键连接的两个Fab片段；(ⅲ)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)单域抗体(dAb)片段(Ward等人，《自然》，1989，341，544-546)，其可由一个VH或一个VL结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由独立基因编码，但其可使用重组方法通过合成接头接合，该合成接头能够将该两个结构域制造成VL与VH区配对以形成单价分子的单一蛋白质链，称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人，《科学(Science)》1988，242，423-426；和Huston等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》1988，85，5879-5883)。此类scFv抗体也意在涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，以与完整抗体相同的方式来筛选使用的片段。
如本文所用，术语“人类抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均来源于人类种系免疫球蛋白序列。另外，若抗体含有恒定区，则该恒定区也来源于人类种系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可包括不由由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过在体外随机或位点特异性突变或通过在体内体细胞突变引入的突变)。如本文所用，术语“人类抗体”并不意在包括来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植至人类框架序列上的抗体。
术语“人类单克隆抗体”是指呈现单一结合特异性且具有可变区的抗体，可变区中框架区与CDR区两者均来源于人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人类单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与永生化细胞融合的自转基因非人类动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，其具有包含人类重链转基因和人类轻链转基因的基因组。
如本文中所用，术语“重组人类抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的全部人类抗体，这些人类抗体例如(a)自对于人类免疫球蛋白基因而言为转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(在下文进一步描述)分离的抗体；(b)自经转化以表达人类抗体的宿主细胞，例如自转染瘤分离的抗体；(c)自重组、组合人类抗体库分离的抗体；和(d)通过涉及将人类免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人类抗体具有框架区和CDR区均来源于人类种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，此类重组人类抗体可进行体外突变(或当使用人类Ig序列的转基因动物时，为体内体细胞突变)，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是如下序列：这些序列虽然来源于人类种系VH和VL序列且与其相关，但可能并非在体内天然存在于人类抗体种系谱系内的序列。
如本文所用，“同种型(isotype)”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
词组“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“与抗原特异性结合的抗体”互换使用。
术语“人类抗体衍生物”是指人类抗体的任何经修饰形式，包括抗体与另一活性药物成分或抗体的缀合物。术语“缀合物”、“抗体-药物缀合物”、“ADC”或“免疫缀合物”是指与另一治疗部分结合的抗体或其片段，该治疗部分可使用本领域中可用的方法与本文所描述的抗体结合。
术语“人源化抗体(humanized antibody/humanized antibodies)”和“人源化”是指来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已移植至人类框架序列上的抗体。在人类框架序列中可进行其他框架区修饰。非人类(例如鼠类)抗体的“人源化”形式是含有来源于非人类免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的高变区的残基经来自具有所需特异性、亲和力和能力的例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的非人类物种(供体抗体)的15个高变区的残基置换。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基置换为相应非人类残基。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体效能。通常，人源化抗体将包括基本上全部的至少一个、通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部高变环对应于非人类免疫球蛋白的高变环，全部或基本上全部FR区为人类免疫球蛋白序列的FR区。可选地，人源化抗体也将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常，人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。关于其他细节，参见Jones等人，《自然》1986，321，522-525；Riechmann等人，《自然》1988，332，323-329；和Presta，《结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)》1992，2，593-596。本文所描述的抗体也可经修饰以采用已知赋予效应功能和/或FcR结合改进(例如降低)的任何Fc变体。Fc变体可包括例如以下所公开的氨基酸取代中的任一种：国际专利申请公开第WO 1988/07089A1号、第WO 1996/14339A1号、第WO 1998/05787A1号、第WO 1998/23289A1号、第WO 1999/51642A1号、第WO 99/58572A1号、第WO 2000/09560A2号、第WO 2000/32767A1号、第WO 2000/42072A2号、第WO2002/44215A2号、第WO 2002/060919 A2号、第WO 2003/074569A2号、第WO 2004/016750 A2号、第WO 2004/029207 A2号、第WO 2004/035752A2号、第WO 2004/063351 A2号、第WO2004/074455 A2号、第WO 2004/099249A2号、第WO 2005/040217 A2号、第WO 2005/070963A1号、第WO 2005/077981A2号、第WO 2005/092925 A2号、第WO 2005/123780 A2号、第WO2006/019447A1号、第WO 2006/047350 A2号和第WO 2006/085967 A2号；和美国专利第5,648,260号；第5,739,277号；第5,834,250号；第5,869,046号；第6,096,871号；第6,121,022号；第6,194,551号；第6,242,195号；第6,277,375号；第6,528,624号；第6,538,124号；第6,737,056号；第6,821,505号；第6,998,253号；和第7,083,784号；其公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“嵌合抗体”是指可变区序列来源于一个物种且恒定区序列来源于另一物种的抗体，例如可变区序列来源于小鼠抗体且恒定区序列来源于人类抗体的抗体。
“双功能抗体“是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。片段包括连接至同一多肽链(VH-VL或VL-VH)中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。通过使用过短而使得同一链上的两个可变结构域之间不能配对的接头，迫使这些可变结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双功能抗体更详细地描述于例如欧洲专利第EP 404,097号；国际专利公开第WO 93/11161号；和Bolliger等人，《美国国家科学院院刊》1993，90，6444-6448中。
术语”糖基化“是指抗体的经修饰的衍生物。去糖基化抗体缺乏糖基化。糖基化可经改变以例如提高抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个以上糖基化位点来完成。例如，可进行一个以上氨基酸取代，以消除一个以上可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。去糖基化可提高抗体对抗原的亲和力，如美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中所描述。另外地或替代地，可产生糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖基残基量降低的低岩藻糖基化抗体或平分型GlcNac结构增加的抗体。已证明此类经改变的糖基化模式会提高抗体的能力。此类碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中已有描述且可用作表达本发明的重组抗体以从而产生糖基化改变的抗体的宿主细胞。例如，细胞株Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因、FUT8(α(1,6)岩藻糖基转移酶)，使得Ms704、Ms705和Ms709细胞株中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞株是通过使用两种置换载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而产生(参见例如美国专利公开第2004/0110704号或Yamane-Ohnuki等人，《生物技术与生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》，2004，87，614-622)。作为另一实例，欧洲专利第EP 1,176,195号描述一种具有功能破坏的FUT8基因的细胞株，该FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得此类细胞株中表达的抗体通过减少或消除α1,6键相关酶而表现出低岩藻糖基化，也描述如下细胞株：具有用于将岩藻糖添加至与抗体Fc区结合的N-乙酰基葡糖胺的低酶活性或不具有酶活性，该细胞株例如为大鼠骨髓瘤细胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)。国际专利公开WO 03/035835描述一种变异型CHO细胞株，即Lec 13细胞，其具有减弱的将岩藻糖连接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力，也导致该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(也参见Shields等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》2002，277，26733-26740。国际专利公开第WO99/54342号描述如下细胞株，其经工程改造以表达糖蛋白修饰型糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰基葡糖胺转移酶III(GnTIII))，以使得在经工程改造的细胞株内表达的抗体表现出增加的平分型GlcNac结构，其使抗体的ADCC活性增加(也参见Umana等人，《自然生物技术(Nat.Biotech.)》1999，17，176-180)。或者，可使用岩藻糖苷酶使抗体的岩藻糖残基裂解。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶自抗体中移除岩藻糖基残基，如Tarentino等人，《生物化学(Biochem.)》1975，14，5516-5523中所描述。
“聚乙二醇化”是指经修饰的抗体或其片段，其通常在使一个以上PEG基团连接至抗体或抗体片段的条件下与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。聚乙二醇化可例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。优选地，聚乙二醇化通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”意在涵盖已用于衍生其他蛋白质的PEG的任何形式，例如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。待聚乙二醇化的抗体可为去糖基化抗体。聚乙二醇化方法是本领域中已知的且可应用于本发明的抗体，如在欧洲专利第EP 0154316号和欧洲专利第EP 0401384号和美国专利第5,824,778号中描述的，其各自的公开内容以引用的方式并入本文中。
术语“生物类似物”是指以下生物产品(包括单克隆抗体或蛋白质)：尽管存在临床非活性成分的少量差异，但其与美国许可的参考生物制品高度相似，且该生物产品与参考产品之间在产品的安全性、纯度和效力方面不存在有临床上有意义的差异。此外，类似生物或“生物类似物”药物是一种与已被欧洲药物管理局(European Medicines Agency)授权使用的另一生物药物类似的生物药物。术语“生物类似物”也被其他国家和地区监管机构以同义使用。生物产品或生物药物是由生物来源(例如细菌或酵母)制成或衍生的药物。其可由相对较小分子(例如人类胰岛素或红细胞生成素)或复杂分子(例如单克隆抗体)组成。例如，若参考IL-2蛋白为阿地白介素(PROLEUKIN)，则由药物监管机构许可的参考阿地白介素的蛋白质为阿地白介素的“生物类似物”或为阿地白介素“其生物类似物”。在欧洲，类似生物或“生物类似物”药物是一种与已被欧洲药物管理局(EMA)授权使用的另一生物药物类似的生物药物。欧洲类似生物应用的相关法律依据是法规(EC)第726/2004号第6条和经修订的指令2001/83/EC第10(4)条，且因此在欧洲，生物类似物可根据法规(EC)第726/2004号第6条和指令2001/83/EC第10(4)条授权、批准授权或作为授权申请的对象。已授权的原始生物药品在欧洲可称为“参考药品”。CHMP关于类似生物药品的指南中概述了产品被视为是生物类似物的一些要求。此外，产品特定指南，包括与单克隆抗体生物类似物相关的指南，由EMA逐项产品提供，且发布在其网站上。如本文所描述，生物类似物可在质量特征、生物活性、作用机制、安全性概况和/或功效方面与参考药品类似。另外，生物类似物可用于或意在用于与参考药品治疗相同病状。因此，可认为如本文所描述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的质量特征。替代地或另外，可认为如本文中所描述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的生物活性。替代地或另外，可认为如本文所描述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的安全性概况。替代地或另外，可认为如本文所描述的生物类似物具有与参考药品类似或高度类似的功效。如本文所描述，欧洲生物类似物与已由EMA授权的参考药品进行比较。然而，在一些情况下，在某些研究中，可将生物类似物与在欧洲经济区(European Economic Area)以外获得授权的生物药品(非EEA授权的“比较物”)相比较。此类研究包括例如某些临床和体内非临床研究。如本文所使用，术语“生物类似物”也涉及已与或可与非EEA授权的比较物比较的生物药品。某些生物类似物是蛋白质，例如抗体、抗体片段(例如抗原结合部分)和融合蛋白。蛋白质生物类似物可具有在氨基酸结构中具有少量修饰(包括例如氨基酸的缺失、添加和/或取代)的氨基酸序列，这些修饰不会显著影响多肽的功能。生物类似物可包括与其参考药物产品的氨基酸序列具有97％或更高(例如97％、98％、99％或100％)序列同一性的氨基酸序列。生物类似物可包含与参考药品的翻译后修饰不同的一种以上翻译后修饰，例如但不限于糖基化、氧化、去酰胺和/或截短，只要这些差异不会引起药品的安全性和/或功效的变化。生物类似物可具有与参考药品相同或不同的糖基化模式。特定地，虽然并非排他性的，但若差异解决或意在解决与参考药品相关的安全性问题，则生物类似物可具有不同糖基化模式。另外，生物类似物可在例如其强度、药物形式、制剂、赋形剂和/或呈现方式等方面不同于参考药品，只要该药品的安全性和功效不受影响。与参考药品相比，生物类似物可包括例如药物动力学(PK)和/或药效动力学(PD)概况的差异，但仍视为与参考药品充分类似，从而可被授权或视为适于授权。在某些情况下，生物类似物呈现与参考药品相比不同的结合特征，其中监管机构(例如EMA)未将这些不同结合特征视为类似生物产品获得授权的障碍。术语“生物类似物”也被其他国家和地区监管机构以同义使用。
III.效力测定方法和组合物
不受任何特定理论的限制，据认为商业上可行的TIL和T细胞效力测定受到以下因素的限制：无法获得表达新抗原的目标细胞、患者与其肿瘤表达的新抗原之间缺乏重叠，以及无法及时鉴别所有相关的新抗原以构建测定。因此，与使用经转导嵌合抗原受体的商业和临床T细胞疗法(其在使用基于目标细胞的测定的一些情况下已获得监管批准)不同，对于多克隆T细胞产物(例如TIL、MIL或PBL疗法或产物)而言，基于目标细胞的测定在有效癌症治疗所需的时间尺度上是不可行的。同时，基于微珠的测定由于无法重现TIL或T细胞的天然活化和杀伤能力而受到限制。例如，基于微珠或基于培养板的测定利用抗CD3涂层结合至TIL或T细胞上的CD3ε链，其与TCR非共价缔合(更优选结合至TCR本身)。因此，采用CD3的基于微珠的测定的缺点在于其不使用TCR的α和β成分进行相互作用。微珠上存在的其他共刺激分子(例如CD28或CD137(4-1BB))也会导致非天然且不太优选的相互作用，至少因为这些共刺激分子的活化产生对肿瘤驻留细胞(例如TIL)具有较低选择性的测定。本发明提供了这些问题的解决方案。不受任何特定理论的限制，据认为目标细胞上的MHC或HLA与T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的TCR之间的相互作用产生分析物，该分析物可与由T细胞(包括TIL、MIL或PBL)产生的分析物进行比较，该T细胞与MHC阴性对照共培养，以评估T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的一种以上特性(例如其效力、身份或其他有用的特征)，以帮助制造或提供癌症疗法。此外，同样不受任何特定理论的限制，据认为，由于在肿瘤部位发现了例如TIL和MIL的T细胞，或者PBL先前已通过肿瘤暴露而活化，因此此类T细胞(包括TIL、MIL和PBL)是已交叉活化的或活化的T细胞，其中CD28和4-1BB已被活化。
在一个实施方案中，本发明包括效力测定组合物，其包括在培养基中共培养的Raji细胞和T细胞(例如TIL)。在一个实施方案中，本发明包括效力测定组合物，其包括在培养基中共培养的Thp1细胞和T细胞(例如TIL)。在一个实施方案中，本发明包括效力测定组合物，其包括在培养基中共培养的Ramos细胞和T细胞(例如TIL)。在一个实施方案中，本发明包括效力测定组合物，其包括在培养基中共培养的U937细胞和T细胞(例如TIL)。在一个实施方案中，本发明包括效力测定组合物，其包括在培养基中共培养的Daudi细胞和T细胞(例如TIL)。在一个实施方案中，效力测定组合物包括在培养基中共培养且用作阴性对照的K562细胞和T细胞(例如TIL)。在一个实施方案中，效力测定组合物包括在培养基中共培养且用作混合淋巴细胞反应(MLR)阳性对照的外周血单核细胞(PBMC)和T细胞(例如TIL)。在一个实施方案中，前述实施方案中的TIL和PBMC来自同一患者。在一个实施方案中，使用Gen2或Gen 3过程或如本文中所描述的其他制造工艺来制造TIL。在一个实施方案中，使用至少一个REP步骤制造TIL。在一个实施方案中，使用利用本文所描述的扩增或制造工艺产生的TIL、MIL或PBL进行效力测定。在一个实施方案中，在用以下描述的过程制造之后，用本文所描述的效力测定测试TIL：美国专利申请公开第2018/0282694A1号或美国专利第10,130,659号、第10,166,257号、第10,272,113号、第10,363,273号、第10,398,734号、第10,420,799号、第10,463,697号、第10,537,595号、第10,646,517号、第10,653,723号、第10,693,330号、第10,695,372号、第10,894,063和第10,905,718号，这些专利中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，在用美国专利第10,918,666号中描述的过程制造之后，用本文所描述的效力测定测试TIL，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，在用美国专利申请公开第2020/0277573A1号中描述的过程制造之后，用本文所描述的效力测定测试TIL，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，在用国际专利申请公开第WO 2019/210131A1号中描述的过程制造之后，用本文所描述的效力测定测试TIL，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，在用国际专利申请公开第WO 2019/136456A1号中描述的过程制造之后，用本文所描述的效力测定测试TIL，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，在用国际专利申请公开第WO 2021/123832A1号中描述的过程制造之后，用本文所描述的效力测定测试TIL，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，在用美国专利申请公开第2020/0224161A1号中描述的过程制造之后，用本文所描述的效力测定测试MIL和PBL，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，在用国际专利申请公开第2019/145711A1号中描述的过程制造之后，用本文所描述的效力测定测试TIL，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，在用国际专利申请公开第WO 2020/152451A1号中描述的过程制造之后，用本文所描述的效力测定测试TIL，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。
A.测定方法
在一个实施方案中，本发明包括一种用于使用能够结合至T细胞受体的目标细胞确定T细胞产物的效力的方法。在一个实施方案中，本发明包括一种基于T细胞或TIL、MIL或PBL TCR复合物与目标细胞的HLA-肽复合物的同种异体相互作用(也称为MHC显性识别)的测定。在一个实施方案中，本发明包括利用T细胞或TIL、MIL或PBL TCR复合物与目标细胞的MHC显性识别来产生分析物的测定，该分析物与由T细胞或TIL与MHC阴性对照的共培养产生的分析物进行比较。在一个实施方案中，T细胞或TIL、MIL或PBL TCR复合物与目标细胞的结合通过其α(α)和β(β)链发生。在一个实施方案中，目标细胞表达HLA。在一个实施方案中，目标细胞为B细胞。在一个实施方案中，目标细胞为B细胞类淋巴母细胞或B类淋巴母细胞。在一个实施方案中，目标细胞为伯基特氏淋巴瘤细胞。在一个实施方案中，目标细胞为骨髓谱系细胞。在一个实施方案中，目标细胞为单核细胞。在一个实施方案中，目标细胞为急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，目标细胞为M5亚型急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，目标细胞为Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，目标细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，目标细胞为Ramos细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，目标细胞为U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，目标细胞为Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，目标细胞为黑色素细胞。在一个实施方案中，目标细胞为HLA-A-02阳性黑色素细胞。在一个实施方案中，目标细胞为黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，目标细胞为HLA-A-02阳性黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，目标细胞为选自下组的黑色素瘤细胞：Sk-MEL-5、Malme-3M、SK-MEL-28、SK-MEL-3、SH-4、SK-MEL-24、RPMI-7951、SK-MEL-1、A375、G-361以及它们的组合。
在一个实施方案中，本发明包括基于在肿瘤细胞与T细胞(例如使用本文所述的扩增或制造工艺生产的TIL、MIL或PBL)之间发生的同种异体反应性TCR或HLA识别的测定。在一个实施方案中，本发明包括基于在Raji、Thp1、Ramos、U937或Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代与T细胞(例如使用本文所描述的扩增或制造工艺产生的TIL、MIL或PBL)之间发生的同种异体反应性TCR或HLA识别的测定。在一个实施方案中，本发明包括将前述实施方案与如本文所描述的阴性对照组合使用。在一个实施方案中，阴性对照充当T细胞(例如TIL、MIL或PBL)的基础或基线活性水平，用于与基于MHC显性识别的T细胞测定相比较。在一个实施方案中，阴性对照为缺乏HLA I类和/或HLA II类表达的细胞株。在一个实施方案中，阴性对照为缺乏MHC I类和/或MHC II类表达的细胞株。在一个实施方案中，阴性对照为缺乏HLA或MHC的细胞株来控制测定的变异性。在一个实施方案中，阴性对照为缺乏HLA或MHC的细胞株，以证明MHC显性识别为效力测定的主要变量。
在一个实施方案中，本发明包括通过将T细胞产物(例如TIL、MIL或PBL产物)与K562细胞共培养而使用K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代作为如本文所描述的阴性对照。使用K562细胞作为阴性对照可用于本文所描述的测定以及微珠和培养板结合的抗体刺激的生物测定(例如针对IFN-γ的抗CD3培养板测定)。
在一个实施方案中，本发明包括通过将T细胞产物(例如TIL、MIL或PBL产物)与目标细胞或目标细胞组合共培养而使用如本文所描述的一种以上HLA阻断抗体或其片段、衍生物、变体或修饰作为阴性对照。使用一种HLA阻断抗体或多种HLA阻断抗体作为阴性对照可以用于本文所描述的测定。
在一些实施方案中，检查通过本文所描述或本领域中已知的方法产生的扩增的TIL的效力和/或功能。检查扩增的TIL的效力和/或功能使得可以表征临床TIL产物批次。在一个实施方案中，TIL效力定义为：可选地与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时的所选表面标记物表达的增加，表示为标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)。或者，可单独培养Raji细胞、K562和TIL。在一些实施方案中，来自获得TIL或MIL的同一患者的PBMC用作对照。在一些实施方案中，基于微珠的CD3/CD28刺激也可用作对照。在一些实施方案中，基于微珠的CD3/CD28/CD137刺激也可用作对照。在一些实施方案中，添加针对CD28的小鼠单克隆抗体用于确保额外共刺激以放大T细胞反应。在一些实施方案中，将PBMC与各TIL批次一起共培养，作为MLR反应的阳性对照。
在一个实施方案中，效力测定包括共培养步骤，其中共培养进行选自下组的时间段：30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时和50小时。在一个实施方案中，效力测定包括共培养步骤，其中共培养进行选自6小时、12小时、18小时、24小时和32小时的时间段。
在一个实施方案中，效力测定包括目标细胞和T细胞(包括TIL、MIL或PBL)共培养步骤，其中共培养进行选自下组的时间段：30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时和50小时。在一个实施方案中，效力测定包括共培养步骤，其中共培养进行选自6小时、12小时、18小时、24小时和32小时的时间段。
在一个实施方案中，效力测定包括阴性对照细胞和T细胞(包括TIL、MIL或PBL)共培养步骤，其中共培养进行选自下组的时间段：30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时和50小时。在一个实施方案中，效力测定包括共培养步骤，其中共培养进行选自6小时、12小时、18小时、24小时和32小时的时间段。
在一个实施方案中，本发明包括用于确定与临床益处相关的TIL、MIL、PBL或其他T细胞产物的效力的效力测定方法。可以多种方式测量临床益处，包括但不限于证实体外细胞功能、疾病控制率、整体反应率、反应持续时间或临床益处或潜在临床益处的其他科学量度。
在一些实施方案中，通过本文所描述的共培养测定来检验扩增的或调配的TIL、MIL和PBL的效力。检查扩增的或调配的TIL、MIL和PBL的效力使得可以表征TIL、MIL或PBL产物批次。TIL、MIL或PBL的效力(也称为活化)定义为：与TIL、MIL或PBL与K562细胞的共培养相比，在TIL、MIL或PBL与Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代的共培养时，所选表面标记物表达的增加，表示为标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)。
在一个实施方案中，本发明包括使用能够结合至T细胞受体的目标细胞来确定T细胞产物的效力的方法，其中用于测定效力的方法为同种异体识别测定。在一个实施方案中，本发明包括使用能够结合至T细胞受体的目标细胞来确定T细胞产物的效力的方法，其中用于测定效力的方法为同种异体识别测定。在一个实施方案中，本发明包括使用能够结合至T细胞受体的Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代来确定T细胞产物的效力的方法，其中用于测定效力的方法为同种异体识别测定。在一个实施方案中，本发明包括使用能够结合至T细胞受体的Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代来确定T细胞产物的效力的方法，其中用于测定效力的方法为同种异体识别测定。在一个实施方案中，本发明包括使用能够结合至T细胞受体的Ramos细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代来确定T细胞产物的效力的方法，其中用于测定效力的方法为同种异体识别测定。在一个实施方案中，本发明包括使用能够结合至T细胞受体的U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代来确定T细胞产物的效力的方法，其中用于测定效力的方法为同种异体识别测定。在一个实施方案中，本发明包括使用能够结合至T细胞受体的Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代来确定T细胞产物的效力的方法，其中用于测定效力的方法为同种异体识别测定。
在一个实施方案中，本发明包括使用能够结合至T细胞受体的目标细胞来确定T细胞产物的效力的方法，其中使用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法来检测蛋白质的分泌或表达。在另一个实施方案中，ELISA方法使用自动化或机器人系统实现自动化，例如ELLA系统(可自美国加利福尼亚州圣荷西BioTechne，Inc.的ProteinSimple部门获得)、ISOPLEXIS系统(可自美国康涅狄格州布兰福德Isoplexis，Inc.获得，或LUNARIS系统(可自德国科隆AYOXA Biosystems GmbH获得)。在一个实施方案中，效力测定检测是使用多重测定检测进行的，例如LUMINEX系统(可自美国明尼苏达州明尼苏达州BioTechne，Inc.的R&DSystems部门获得)。在一个实施方案中，本发明包括使用流式细胞术检测方法的效力测定方法。在一个实施方案中，本发明包括针对分泌蛋白的效力测定方法。在一个实施方案中，本发明包括针对细胞表面或结合蛋白的效力测定方法。在一个实施方案中，本发明包括使用结合测定检测方法的效力测定方法。在一个实施方案中，ELLA系统测量活化本文所描述的共培养测定后的IFN-γ浓度，其中对由共培养收集的上清液进行筛选以便在各多孔(例如72孔)经商业验证的料筒上产生IFN-γ。在一个实施方案中，ELLA自动化系统执行包括动态范围中的四个灵敏度对数的亚皮克级灵敏度。在一个实施方案中，相较于传统ELISA方法，通过使用ELLA系统使程序误差最小化来增加测定的可重复性和精确性。
在一个实施方案中，本发明包括使用能够结合至T细胞受体的目标细胞来确定T细胞产物的效力的方法，其中使用检测方法来检测分析物的分泌或表达。在一个实施方案中，所检测的分析物是蛋白质。在一个实施方案中，所检测的分析物是细胞因子。在一个实施方案中，所检测的分析物是干扰素。在一个实施方案中，所检测的分析物是干扰素-α，也称为IFN-α或IFNα。在一个实施方案中，所检测的分析物是干扰素-α，也称为IFN-β或IFNβ。在一个实施方案中，所检测的分析物是干扰素-γ，也称为IFN-γ或IFNγ。在一个实施方案中，所检测的分析物是颗粒酶B，也称为GzmB。在一个实施方案中，所检测的分析物是穿孔素。在一个实施方案中，所检测的分析物是肿瘤坏死因子α，也称为TNF-α或TNFα。在一个实施方案中，所检测的分析物是白介素。在一个实施方案中，所检测的分析物是IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25或IL-26。在一个实施方案中，所检测的分析物是CD25。在一个实施方案中，所检测的分析物是CD69。在一个实施方案中，所检测的分析物是CD137(4-1BB)。在一个实施方案中，所检测的分析物是CD134(OX40)。在一个实施方案中，所检测的分析物是CCL4。在一个实施方案中，所检测的分析物是CD150，也称为SLAM、SLAM F1或信号淋巴细胞性活化分子1。在一个实施方案中，所检测的分析物是KLRG1。在一个实施方案中，所检测的分析物是KLRG1。在一个实施方案中，所检测的分析物是分泌的MIP-1β。
在一个实施方案中，本发明包括使用能够结合至T细胞受体的目标细胞确定T细胞产物的效力的方法，其中使用检测方法检测分析物的分泌或表达，其中T细胞产物为TIL产物，且其中分析物为选自CD25、CD69、CD134、CD137和CD150的细胞表面标记物。
在一个实施方案中，本发明包括使用能够同种异体结合于T细胞受体的细胞确定T细胞产物的效力的方法，其中使用阴性对照(包括缺乏MHC I和MHC II表达的细胞)来与T细胞产物(例如TIL、MIL或PBL产物)同目标细胞的共培养物进行比较。在一个实施方案中，本发明包括使用能够同种异体结合于T细胞受体的Raji细胞确定TIL产物的效力的方法，其中使用阴性对照(包括缺乏MHC I和MHC II表达的K562细胞)来与TIL产物同Raji细胞的共培养物进行比较。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时所选表面标记物的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时所选表面标记物的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，来自本文所描述的共培养方法的上清液在从共培养物中取出后立即进行测试。在一个实施方案中，来自本文所描述的共培养方法的上清液在从共培养物取出之后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、10小时、12小时、18小时、24小时或48小时进行测试。在一个实施方案中，来自本文所描述的共培养方法的上清液在从共培养物中取出之后冷冻且随后解冻用于测试。在一些实施方案中，评估来自本文所描述的共培养方法的上清液的IFN-γ、颗粒酶B、TNF-α、CCL4和/或MIP-1β分泌。
在一些实施方案中，本发明提供一种确定TIL活性的方法，其包括以下步骤：a)辐照Raji细胞和K562细胞；(b)将经辐照的Raji细胞和经辐照的K562细胞与TIL按以下一种以上目标比率(50:1、25:1、12.5:1、6.25:1、3:1、1:1、1:3、1:6.25、1:12.5、1:25)共培养，可选地与激动性或超激动性抗CD28抗体一起培养；(c)在6至24小时后，从步骤(b)中的共培养细胞中收集上清液；(d)收集步骤(b)中的细胞并测量T细胞活化的表面标记物表达；(e)测定步骤(c)中收集的共培养细胞的上清液中的T细胞活化标记物。
在一些实施方案中，在冷冻保存TIL之前检查扩增的TIL的效力和/或功能。在一些实施方案中，在冷冻保存之后检查扩增的TIL的效力和/或功能。在一个实施方案中，作为药物产品的放行测试的一部分，检查TIL、MIL或PBL产物的效力。在一个实施方案中，作为药物产品的稳定性测试的一部分，例如在冷冻保存的产品解冻之后或在先前解冻或从未冷冻的产品在不同环境条件下储存一段规定的时间后，检查TIL、MIL或PBL产物的效力。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时所选表面标记物的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时所选表面标记物的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时CD25的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时CD25的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时CD69的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时CD69的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时CD134的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时CD134的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时CD137的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时CD137的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时CD150的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时CD150的表达增加，以标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的颗粒酶B的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的颗粒酶B的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的IFN-γ的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的IFN-γ的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的TNF-α的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的TNF-α的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的穿孔素的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的穿孔素的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的CCL4的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的CCL4的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的MIP-1β的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％。
在一些实施方案中，与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时表达或分泌的MIP-1β的表达增加，以ELISA检测的分析物百分比或平均荧光强度(MFI)表示，与K562细胞相比增加了至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少5.5倍、至少6倍、至少6.5倍、至少7倍、至少7.5倍、至少8倍、至少8.5倍、至少9倍、至少9.5倍、至少10倍、至少11倍、至少12倍、至少13倍、至少14倍、至少15倍、至少16倍、至少17倍、至少18倍、至少19倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
在一些实施方案中，与Raji细胞共培养时分泌的颗粒酶B的量为至少20pg/mL、至少30pg/mL、至少40pg/mL、至少50pg/mL、至少60pg/mL、至少70pg/mL、至少80pg/mL、至少90pg/mL、至少100pg/mL、至少150pg/mL、至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少600pg/mL、至少700pg/mL、至少800pg/mL、至少900pg/mL、至少1000pg/mL、至少1100pg/mL或至少1200pg/mL，其中每毫升测试物含有1×105个TIL、2×105个TIL、3×105个TIL、4×105个TIL、5×105个TIL、6×105个TIL、7×105个TIL、8×105个TIL、9×105个TIL或10×105个TIL。
在一些实施方案中，与Raji细胞共培养时分泌的IFN-γ的量为至少20pg/mL、至少30pg/mL、至少40pg/mL、至少50pg/mL、至少60pg/mL、至少70pg/mL、至少80pg/mL、至少90pg/mL、至少100pg/mL、至少150pg/mL、至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少600pg/mL、至少700pg/mL、至少800pg/mL、至少900pg/mL、至少1000pg/mL、至少1100pg/mL或至少1200pg/mL，其中每毫升测试物含有1×105个TIL、2×105个TIL、3×105个TIL、4×105个TIL、5×105个TIL、6×105个TIL、7×105个TIL、8×105个TIL、9×105个TIL或10×105个TIL。
在一些实施方案中，与Raji细胞共培养时分泌的TNF-α的量为至少20pg/mL、至少30pg/mL、至少40pg/mL、至少50pg/mL、至少60pg/mL、至少70pg/mL、至少80pg/mL、至少90pg/mL、至少100pg/mL、至少150pg/mL、至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少600pg/mL、至少700pg/mL、至少800pg/mL、至少900pg/mL、至少1000pg/mL、至少1100pg/mL或至少1200pg/mL，其中每毫升测试物含有1×105个TIL、2×105个TIL、3×105个TIL、4×105个TIL、5×105个TIL、6×105个TIL、7×105个TIL、8×105个TIL、9×105个TIL或10×105个TIL。
在一些实施方案中，与Raji细胞共培养时分泌的穿孔素的量为至少20pg/mL、至少30pg/mL、至少40pg/mL、至少50pg/mL、至少60pg/mL、至少70pg/mL、至少80pg/mL、至少90pg/mL、至少100pg/mL、至少150pg/mL、至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少600pg/mL、至少700pg/mL、至少800pg/mL、至少900pg/mL、至少1000pg/mL、至少1100pg/mL或至少1200pg/mL，其中每毫升测试物含有1×105个TIL、2×105个TIL、3×105个TIL、4×105个TIL、5×105个TIL、6×105个TIL、7×105个TIL、8×105个TIL、9×105个TIL或10×105个TIL。
在一些实施方案中，与Raji细胞共培养时分泌的CCL4的量为至少20pg/mL、至少30pg/mL、至少40pg/mL、至少50pg/mL、至少60pg/mL、至少70pg/mL、至少80pg/mL、至少90pg/mL、至少100pg/mL、至少150pg/mL、至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少600pg/mL、至少700pg/mL、至少800pg/mL、至少900pg/mL、至少1000pg/mL、至少1100pg/mL或至少1200pg/mL，其中每毫升测试物含有1×105个TIL、2×105个TIL、3×105个TIL、4×105个TIL、5×105个TIL、6×105个TIL、7×105个TIL、8×105个TIL、9×105个TIL或10×105个TIL。
在一些实施方案中，与Raji细胞共培养时分泌的MIP-1β的量为至少20pg/mL、至少30pg/mL、至少40pg/mL、至少50pg/mL、至少60pg/mL、至少70pg/mL、至少80pg/mL、至少90pg/mL、至少100pg/mL、至少150pg/mL、至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少600pg/mL、至少700pg/mL、至少800pg/mL、至少900pg/mL、至少1000pg/mL、至少1100pg/mL或至少1200pg/mL，其中每毫升测试物含有1×105个TIL、2×105个TIL、3×105个TIL、4×105个TIL、5×105个TIL、6×105个TIL、7×105个TIL、8×105个TIL、9×105个TIL或10×105个TIL。
在一个实施方案中，目标细胞与T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的比率选自下组：约1:1.1、约1:1.2、约1:1.3、约1:1.4、约1:1.5、约1:1.6、约1:1.7、约1:1.8、约1:1.9、约1:2、约1:2.1、约1:2.2、约1:2.3、约1:2.4、约1:2.5、约1:2.6、约1:2.7、约1:2.8、约1:2.9、约1:3、约1:3.1、约1:3.2、约1:3.3、约1:3.4、约1:3.5、约1:3.6、约1:3.7、约1:3.8、约1:3.9、约1:4、约1:4.1、约1:4.2、约1:4.3、约1:4.4、约1:4.5、约1:4.6、约1:4.7、约1:4.8、约1:4.9、约1:5、约1:5.1、约1:5.2、约1:5.3、约1:5.4、约1:5.5、约1:5.6、约1:5.7、约1:5.8、约1:5.9、约1:6、约1:6.1、约1:6.2、约1:6.25、约1:6.3、约1:6.4、约1:6.5、约1:6.6、约1:6.7、约1:6.8、约1:6.9、约1:7、约1:7.1、约1:7.2、约1:7.3、约1:7.4、约1:7.5、约1:7.6、约1:7.7、约1:7.8、约1:7.9、约1:8、约1:8.1、约1:8.2、约1:8.3、约1:8.4、约1:8.5、约1:8.6、约1:8.7、约1:8.8、约1:8.9、约1:9、约1:9.1、约1:9.2、约1:9.3、约1:9.4、约1:9.5、约1:9.6、约1:9.7、约1:9.8、约1:9.9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:12.5、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19、约1:20、约1:25、约1:30、约1:35、约1:40、约1:45、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90或约1:100。
在一个实施方案中，T细胞(包括TIL、MIL或PBL)与目标细胞的比率选自下组：约1:1.1、约1:1.2、约1:1.3、约1:1.4、约1:1.5、约1:1.6、约1:1.7、约1:1.8、约1:1.9、约1:2、约1:2.1、约1:2.2、约1:2.3、约1:2.4、约1:2.5、约1:2.6、约1:2.7、约1:2.8、约1:2.9、约1:3、约1:3.1、约1:3.2、约1:3.3、约1:3.4、约1:3.5、约1:3.6、约1:3.7、约1:3.8、约1:3.9、约1:4、约1:4.1、约1:4.2、约1:4.3、约1:4.4、约1:4.5、约1:4.6、约1:4.7、约1:4.8、约1:4.9、约1:5、约1:5.1、约1:5.2、约1:5.3、约1:5.4、约1:5.5、约1:5.6、约1:5.7、约1:5.8、约1:5.9、约1:6、约1:6.1、约1:6.2、约1:6.25、约1:6.3、约1:6.4、约1:6.5、约1:6.6、约1:6.7、约1:6.8、约1:6.9、约1:7、约1:7.1、约1:7.2、约1:7.3、约1:7.4、约1:7.5、约1:7.6、约1:7.7、约1:7.8、约1:7.9、约1:8、约1:8.1、约1:8.2、约1:8.3、约1:8.4、约1:8.5、约1:8.6、约1:8.7、约1:8.8、约1:8.9、约1:9、约1:9.1、约1:9.2、约1:9.3、约1:9.4、约1:9.5、约1:9.6、约1:9.7、约1:9.8、约1:9.9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:12.5、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19、约1:20、约1:25、约1:30、约1:35、约1:40、约1:45、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90或约1:100。
在一个实施方案中，Raji细胞与T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的比率选自下组：约1:1.1、约1:1.2、约1:1.3、约1:1.4、约1:1.5、约1:1.6、约1:1.7、约1:1.8、约1:1.9、约1:2、约1:2.1、约1:2.2、约1:2.3、约1:2.4、约1:2.5、约1:2.6、约1:2.7、约1:2.8、约1:2.9、约1:3、约1:3.1、约1:3.2、约1:3.3、约1:3.4、约1:3.5、约1:3.6、约1:3.7、约1:3.8、约1:3.9、约1:4、约1:4.1、约1:4.2、约1:4.3、约1:4.4、约1:4.5、约1:4.6、约1:4.7、约1:4.8、约1:4.9、约1:5、约1:5.1、约1:5.2、约1:5.3、约1:5.4、约1:5.5、约1:5.6、约1:5.7、约1:5.8、约1:5.9、约1:6、约1:6.1、约1:6.2、约1:6.25、约1:6.3、约1:6.4、约1:6.5、约1:6.6、约1:6.7、约1:6.8、约1:6.9、约1:7、约1:7.1、约1:7.2、约1:7.3、约1:7.4、约1:7.5、约1:7.6、约1:7.7、约1:7.8、约1:7.9、约1:8、约1:8.1、约1:8.2、约1:8.3、约1:8.4、约1:8.5、约1:8.6、约1:8.7、约1:8.8、约1:8.9、约1:9、约1:9.1、约1:9.2、约1:9.3、约1:9.4、约1:9.5、约1:9.6、约1:9.7、约1:9.8、约1:9.9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:12.5、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19、约1:20、约1:25、约1:30、约1:35、约1:40、约1:45、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90或约1:100。
在一个实施方案中，T细胞(包括TIL、MIL或PBL)与Raji细胞的比率选自下组：约1:1.1、约1:1.2、约1:1.3、约1:1.4、约1:1.5、约1:1.6、约1:1.7、约1:1.8、约1:1.9、约1:2、约1:2.1、约1:2.2、约1:2.3、约1:2.4、约1:2.5、约1:2.6、约1:2.7、约1:2.8、约1:2.9、约1:3、约1:3.1、约1:3.2、约1:3.3、约1:3.4、约1:3.5、约1:3.6、约1:3.7、约1:3.8、约1:3.9、约1:4、约1:4.1、约1:4.2、约1:4.3、约1:4.4、约1:4.5、约1:4.6、约1:4.7、约1:4.8、约1:4.9、约1:5、约1:5.1、约1:5.2、约1:5.3、约1:5.4、约1:5.5、约1:5.6、约1:5.7、约1:5.8、约1:5.9、约1:6、约1:6.1、约1:6.2、约1:6.25、约1:6.3、约1:6.4、约1:6.5、约1:6.6、约1:6.7、约1:6.8、约1:6.9、约1:7、约1:7.1、约1:7.2、约1:7.3、约1:7.4、约1:7.5、约1:7.6、约1:7.7、约1:7.8、约1:7.9、约1:8、约1:8.1、约1:8.2、约1:8.3、约1:8.4、约1:8.5、约1:8.6、约1:8.7、约1:8.8、约1:8.9、约1:9、约1:9.1、约1:9.2、约1:9.3、约1:9.4、约1:9.5、约1:9.6、约1:9.7、约1:9.8、约1:9.9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:12.5、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19、约1:20、约1:25、约1:30、约1:35、约1:40、约1:45、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90或约1:100。
在一个实施方案中，阴性对照细胞与T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的比率选自下组：约1:1.1、约1:1.2、约1:1.3、约1:1.4、约1:1.5、约1:1.6、约1:1.7、约1:1.8、约1:1.9、约1:2、约1:2.1、约1:2.2、约1:2.3、约1:2.4、约1:2.5、约1:2.6、约1:2.7、约1:2.8、约1:2.9、约1:3、约1:3.1、约1:3.2、约1:3.3、约1:3.4、约1:3.5、约1:3.6、约1:3.7、约1:3.8、约1:3.9、约1:4、约1:4.1、约1:4.2、约1:4.3、约1:4.4、约1:4.5、约1:4.6、约1:4.7、约1:4.8、约1:4.9、约1:5、约1:5.1、约1:5.2、约1:5.3、约1:5.4、约1:5.5、约1:5.6、约1:5.7、约1:5.8、约1:5.9、约1:6、约1:6.1、约1:6.2、约1:6.25、约1:6.3、约1:6.4、约1:6.5、约1:6.6、约1:6.7、约1:6.8、约1:6.9、约1:7、约1:7.1、约1:7.2、约1:7.3、约1:7.4、约1:7.5、约1:7.6、约1:7.7、约1:7.8、约1:7.9、约1:8、约1:8.1、约1:8.2、约1:8.3、约1:8.4、约1:8.5、约1:8.6、约1:8.7、约1:8.8、约1:8.9、约1:9、约1:9.1、约1:9.2、约1:9.3、约1:9.4、约1:9.5、约1:9.6、约1:9.7、约1:9.8、约1:9.9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:12.5、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19、约1:20、约1:25、约1:30、约1:35、约1:40、约1:45、约1:50、约1:60、约1:70、约1:80、约1:90或约1:100。
在一个实施方案中，阴性对照细胞与T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的比率选自下组：约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.25、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9、1:10、1:11、1:12、1:12.5、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100。
在一个实施方案中，K562细胞与T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的比率选自下组：约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.25、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9、1:10、1:11、1:12、1:12.5、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100。
在一个实施方案中，T细胞(包括TIL、MIL或PBL)与K562细胞的比率选自下组：约1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.25、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9、1:10、1:11、1:12、1:12.5、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或1:100。
在一个实施方案中，目标细胞与T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的比率在1:1与1:2之间、在1:2与1:3之间、在1:3与1:4之间、在1:4与1:5之间、在1:5与1:6之间、在1:6与1:7之间、在1:7与1:8之间、在1:8与1:9之间、在1:9与1:10之间、在1:10与1:11之间、在1:11与1:12之间、在1:12与1:13之间、在1:13与1:14之间、在1:14与1:15之间、在1:15与1:16之间、在1:16与1:17之间、在1:17与1:18之间、在1:18与1:19之间、在1:19与1:20之间、在1:20与1:25之间、在1:25与1:30之间、在1:30与1:35之间、在1:35与1:40之间、在1:40与1:45之间、在1:45与1:50之间、在1:50与1:55之间、在1:55与1:60之间、在1:60与1:70之间、在1:70与1:80之间、在1:80与1:90之间、或在1:90与1:100之间、或替代地在1:0.5与1:100之间、在1:0.5与1:50之间、在1:0.5与1:40之间、在1:0.5与1:30之间、在1:0.5与1:25之间、在1:0.5与1:20之间、在1:0.5与1:15之间、在1:0.5与1:10之间、在1:0.5与1:5之间、在1:0.75与1:50之间、在1:0.75与1:40之间、在1:0.75与1:30之间、在1:0.75与1:25之间、在1:0.75与1:20之间、在1:0.75与1:15之间、在1:0.75与1:10之间、在1:0.75与1:5之间、在1:0.5与1:2.5之间、在1:1与1:20之间、在1:1与1:10之间、在1:1与1:5之间、在1:1与1:2.5之间、在1:2与1:5之间、在1:2.5与1:5、或在1:3与1:5之间。
在一个实施方案中，T细胞(包括TIL、MIL或PBL)与目标细胞的比率在1:1与1:2之间、在1:2与1:3之间、在1:3与1:4之间、在1:4与1:5之间、在1:5与1:6之间、在1:6与1:7之间、在1:7与1:8之间、在1:8与1:9之间、在1:9与1:10之间、在1:10与1:11之间、在1:11与1:12之间、在1:12与1:13之间、在1:13与1:14之间、在1:14与1:15之间、在1:15与1:16之间、在1:16与1:17之间、在1:17与1:18之间、在1:18与1:19之间、在1:19与1:20之间、在1:20与1:25之间、在1:25与1:30之间、在1:30与1:35之间、在1:35与1:40之间、在1:40与1:45之间、在1:45与1:50之间、在1:50与1:55之间、在1:55与1:60之间、在1:60与1:70之间、在1:70与1:80之间、在1:80与1:90之间、或在1:90与1:100之间、或替代地在1:0.5与1:100之间、在1:0.5与1:50之间、在1:0.5与1:40之间、在1:0.5与1:30之间、在1:0.5与1:25之间、在1:0.5与1:20之间、在1:0.5与1:15之间、在1:0.5与1:10之间、在1:0.5与1:5之间、在1:0.75与1:50之间、在1:0.75与1:40之间、在1:0.75与1:30之间、在1:0.75与1:25之间、在1:0.75与1:20之间、在1:0.75与1:15之间、在1:0.75与1:10之间、在1:0.75与1:5之间、在1:0.5与1:2.5之间、在1:1与1:20之间、在1:1与1:10之间、在1:1与1:5之间、在1:1与1:2.5之间、在1:2与1:5之间、在1:2.5与1:5、或在1:3与1:5之间。
在一个实施方案中，Raji细胞与T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的比率在1:1与1:2之间、在1:2与1:3之间、在1:3与1:4之间、在1:4与1:5之间、在1:5与1:6之间、在1:6与1:7之间、在1:7与1:8之间、在1:8与1:9之间、在1:9与1:10之间、在1:10与1:11之间、在1:11与1:12之间、在1:12与1:13之间、在1:13与1:14之间、在1:14与1:15之间、在1:15与1:16之间、在1:16与1:17之间、在1:17与1:18之间、在1:18与1:19之间、在1:19与1:20之间、在1:20与1:25之间、在1:25与1:30之间、在1:30与1:35之间、在1:35与1:40之间、在1:40与1:45之间、在1:45与1:50之间、在1:50与1:55之间、在1:55与1:60之间、在1:60与1:70之间、在1:70与1:80之间、在1:80与1:90之间、或在1:90与1:100之间、或替代地在1:0.5与1:100之间、在1:0.5与1:50之间、在1:0.5与1:40之间、在1:0.5与1:30之间、在1:0.5与1:25之间、在1:0.5与1:20之间、在1:0.5与1:15之间、在1:0.5与1:10之间、在1:0.5与1:5之间、在1:0.75与1:50之间、在1:0.75与1:40之间、在1:0.75与1:30之间、在1:0.75与1:25之间、在1:0.75与1:20之间、在1:0.75与1:15之间、在1:0.75与1:10之间、在1:0.75与1:5之间、在1:0.5与1:2.5之间、在1:1与1:20之间、在1:1与1:10之间、在1:1与1:5之间、在1:1与1:2.5之间、在1:2与1:5之间、在1:2.5与1:5、或在1:3与1:5之间。
在一个实施方案中，T细胞(包括TIL、MIL或PBL)与Raji细胞的比率在1:1与1:2之间、在1:2与1:3之间、在1:3与1:4之间、在1:4与1:5之间、在1:5与1:6之间、在1:6与1:7之间、在1:7与1:8之间、在1:8与1:9之间、在1:9与1:10之间、在1:10与1:11之间、在1:11与1:12之间、在1:12与1:13之间、在1:13与1:14之间、在1:14与1:15之间、在1:15与1:16之间、在1:16与1:17之间、在1:17与1:18之间、在1:18与1:19之间、在1:19与1:20之间、在1:20与1:25之间、在1:25与1:30之间、在1:30与1:35之间、在1:35与1:40之间、在1:40与1:45之间、在1:45与1:50之间、在1:50与1:55之间、在1:55与1:60之间、在1:60与1:70之间、在1:70与1:80之间、在1:80与1:90之间、或在1:90与1:100之间、或替代地在1:0.5与1:100之间、在1:0.5与1:50之间、在1:0.5与1:40之间、在1:0.5与1:30之间、在1:0.5与1:25之间、在1:0.5与1:20之间、在1:0.5与1:15之间、在1:0.5与1:10之间、在1:0.5与1:5之间、在1:0.75与1:50之间、在1:0.75与1:40之间、在1:0.75与1:30之间、在1:0.75与1:25之间、在1:0.75与1:20之间、在1:0.75与1:15之间、在1:0.75与1:10之间、在1:0.75与1:5之间、在1:0.5与1:2.5之间、在1:1与1:20之间、在1:1与1:10之间、在1:1与1:5之间、在1:1与1:2.5之间、在1:2与1:5之间、在1:2.5与1:5、或在1:3与1:5之间。
在一个实施方案中，阴性对照细胞与T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的比率在1:1与1:2之间、在1:2与1:3之间、在1:3与1:4之间、在1:4与1:5之间、在1:5与1:6之间、在1:6与1:7之间、在1:7与1:8之间、在1:8与1:9之间、在1:9与1:10之间、在1:10与1:11之间、在1:11与1:12之间、在1:12与1:13之间、在1:13与1:14之间、在1:14与1:15之间、在1:15与1:16之间、在1:16与1:17之间、在1:17与1:18之间、在1:18与1:19之间、在1:19与1:20之间、在1:20与1:25之间、在1:25与1:30之间、在1:30与1:35之间、在1:35与1:40之间、在1:40与1:45之间、在1:45与1:50之间、在1:50与1:55之间、在1:55与1:60之间、在1:60与1:70之间、在1:70与1:80之间、在1:80与1:90之间、或在1:90与1:100之间、或替代地在1:0.5与1:100之间、在1:0.5与1:50之间、在1:0.5与1:40之间、在1:0.5与1:30之间、在1:0.5与1:25之间、在1:0.5与1:20之间、在1:0.5与1:15之间、在1:0.5与1:10之间、在1:0.5与1:5之间、在1:0.75与1:50之间、在1:0.75与1:40之间、在1:0.75与1:30之间、在1:0.75与1:25之间、在1:0.75与1:20之间、在1:0.75与1:15之间、在1:0.75与1:10之间、在1:0.75与1:5之间、在1:0.5与1:2.5之间、在1:1与1:20之间、在1:1与1:10之间、在1:1与1:5之间、在1:1与1:2.5之间、在1:2与1:5之间、在1:2.5与1:5、或在1:3与1:5之间。
在一个实施方案中，T细胞(包括TIL、MIL或PBL)与阴性对照细胞的比率在1:1与1:2之间、在1:2与1:3之间、在1:3与1:4之间、在1:4与1:5之间、在1:5与1:6之间、在1:6与1:7之间、在1:7与1:8之间、在1:8与1:9之间、在1:9与1:10之间、在1:10与1:11之间、在1:11与1:12之间、在1:12与1:13之间、在1:13与1:14之间、在1:14与1:15之间、在1:15与1:16之间、在1:16与1:17之间、在1:17与1:18之间、在1:18与1:19之间、在1:19与1:20之间、在1:20与1:25之间、在1:25与1:30之间、在1:30与1:35之间、在1:35与1:40之间、在1:40与1:45之间、在1:45与1:50之间、在1:50与1:55之间、在1:55与1:60之间、在1:60与1:70之间、在1:70与1:80之间、在1:80与1:90之间、或在1:90与1:100之间、或替代地在1:0.5与1:100之间、在1:0.5与1:50之间、在1:0.5与1:40之间、在1:0.5与1:30之间、在1:0.5与1:25之间、在1:0.5与1:20之间、在1:0.5与1:15之间、在1:0.5与1:10之间、在1:0.5与1:5之间、在1:0.75与1:50之间、在1:0.75与1:40之间、在1:0.75与1:30之间、在1:0.75与1:25之间、在1:0.75与1:20之间、在1:0.75与1:15之间、在1:0.75与1:10之间、在1:0.75与1:5之间、在1:0.5与1:2.5之间、在1:1与1:20之间、在1:1与1:10之间、在1:1与1:5之间、在1:1与1:2.5之间、在1:2与1:5之间、在1:2.5与1:5、或在1:3与1:5之间。
在一个实施方案中，K562细胞与T细胞(包括TIL、MIL或PBL)的比率在1:1与1:2之间、在1:2与1:3之间、在1:3与1:4之间、在1:4与1:5之间、在1:5与1:6之间、在1:6与1:7之间、在1:7与1:8之间、在1:8与1:9之间、在1:9与1:10之间、在1:10与1:11之间、在1:11与1:12之间、在1:12与1:13之间、在1:13与1:14之间、在1:14与1:15之间、在1:15与1:16之间、在1:16与1:17之间、在1:17与1:18之间、在1:18与1:19之间、在1:19与1:20之间、在1:20与1:25之间、在1:25与1:30之间、在1:30与1:35之间、在1:35与1:40之间、在1:40与1:45之间、在1:45与1:50之间、在1:50与1:55之间、在1:55与1:60之间、在1:60与1:70之间、在1:70与1:80之间、在1:80与1:90之间、或在1:90与1:100之间、或替代地在1:0.5与1:100之间、在1:0.5与1:50之间、在1:0.5与1:40之间、在1:0.5与1:30之间、在1:0.5与1:25之间、在1:0.5与1:20之间、在1:0.5与1:15之间、在1:0.5与1:10之间、在1:0.5与1:5之间、在1:0.75与1:50之间、在1:0.75与1:40之间、在1:0.75与1:30之间、在1:0.75与1:25之间、在1:0.75与1:20之间、在1:0.75与1:15之间、在1:0.75与1:10之间、在1:0.75与1:5之间、在1:0.5与1:2.5之间、在1:1与1:20之间、在1:1与1:10之间、在1:1与1:5之间、在1:1与1:2.5之间、在1:2与1:5之间、在1:2.5与1:5、或在1:3与1:5之间。
在一个实施方案中，T细胞(包括TIL、MIL或PBL)与K562细胞的比率在1:1与1:2之间、在1:2与1:3之间、在1:3与1:4之间、在1:4与1:5之间、在1:5与1:6之间、在1:6与1:7之间、在1:7与1:8之间、在1:8与1:9之间、在1:9与1:10之间、在1:10与1:11之间、在1:11与1:12之间、在1:12与1:13之间、在1:13与1:14之间、在1:14与1:15之间、在1:15与1:16之间、在1:16与1:17之间、在1:17与1:18之间、在1:18与1:19之间、在1:19与1:20之间、在1:20与1:25之间、在1:25与1:30之间、在1:30与1:35之间、在1:35与1:40之间、在1:40与1:45之间、在1:45与1:50之间、在1:50与1:55之间、在1:55与1:60之间、在1:60与1:70之间、在1:70与1:80之间、在1:80与1:90之间、或在1:90与1:100之间、或替代地在1:0.5与1:100之间、在1:0.5与1:50之间、在1:0.5与1:40之间、在1:0.5与1:30之间、在1:0.5与1:25之间、在1:0.5与1:20之间、在1:0.5与1:15之间、在1:0.5与1:10之间、在1:0.5与1:5之间、在1:0.75与1:50之间、在1:0.75与1:40之间、在1:0.75与1:30之间、在1:0.75与1:25之间、在1:0.75与1:20之间、在1:0.75与1:15之间、在1:0.75与1:10之间、在1:0.75与1:5之间、在1:0.5与1:2.5之间、在1:1与1:20之间、在1:1与1:10之间、在1:1与1:5之间、在1:1与1:2.5之间、在1:2与1:5之间、在1:2.5与1:5、或在1:3与1:5之间。
在一个实施方案中，目标细胞共培养中的TIL与Raji细胞的比率选自下组：约15:1、约14:1、约13:1、约12:1、约11:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2.5:1、约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:6、约1.7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14和约1:15。
在一个实施方案中，目标细胞共培养中的TIL与K562细胞的比率选自下组：约15:1、约14:1、约13:1、约12:1、约11:1、约10:1、约9:1、约8:1、约7:1、约6:1、约5:1、约4.5:1、约4:1、约3.5:1、约3:1、约2.5:1、约2:1、约1.5:1、约1:1、约1:1.5、约1:2、约1:2.5、约1:3、约1:3.5、约1:4、约1:4.5、约1:5、约1:6、约1.7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14和约1:15。
在一个实施方案中，约1×105至10×105个TIL与约1×105至10×105个Raji细胞共培养。在一个实施方案中，约3×105至7×105个TIL与约1×105至3×105个Raji细胞共培养。在一个实施方案中，约5×105至6×105个TIL与约3×105至7×105个Raji细胞共培养。在一个实施方案中，约4×105个TIL与约5×105个Raji细胞共培养。在一个实施方案中，约5×105个TIL与约5×105个Raji细胞共培养。在一个实施方案中，约5×105个TIL与约4×105个Raji细胞共培养。在一个实施方案中，约3×105至7×105个TIL与约7×105至20×105个Raji细胞共培养。在一个实施方案中，约4×105至4×105个TIL与约10×105至15×105个Raji细胞共培养。在一个实施方案中，约5×105个TIL与约15×105个Raji细胞共培养。
在一些实施方案中，本发明提供一种确定TIL活性的方法，其包括以下步骤：(a)辐照Raji细胞和K562细胞；(b)将经辐照的Raji细胞和经辐照的K562细胞与TIL在选自下组的目标比率下共培养：50:1、25:1、12.5:1、6.25:1、1:1、1:6.25、1:12.5和1:25，此类共培养可选的使用抗CD28抗体进行；(c)在6至24小时后，从步骤(b)中的共培养细胞中收集上清液；(d)收集步骤(b)中的细胞并测量T细胞活化的表面标记物表达；(e)测定步骤(c)中收集的共培养细胞的上清液中的T细胞活化标记物。
在一个实施方案中，效力测定包括复苏步骤，其中将TIL、MIL或PBL冷冻保存产品解冻并使其在环境或冷藏温度下复苏选自下组的时间段：4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、26小时、27小时、28小时、29小时、30小时、31小时、32小时、33小时、34小时、35小时、36小时、37小时、38小时、39小时、40小时、41小时、42小时、43小时、44小时、45小时、46小时、47小时、48小时、49小时、50小时、51小时、52小时、53小时、54小时、55小时、56小时、57小时、58小时、59小时、60小时、61小时、62小时、63小时、64小时、65小时、66小时、67小时、68小时、69小时、70小时、71小时、72小时、73小时、74小时、75小时、76小时、77小时、78小时、79小时、80小时、85小时、90小时、95小时、100小时、110小时和120小时。在一个实施方案中，效力测定包括复苏步骤，其中将TIL、MIL或PBL冷冻保存产品解冻且使其在环境或冷藏温度下复苏选自约12小时、约24小时、约48小时、约72小时和约96小时的时间段。前述持续时间可以从解冻过程完成开始测量或从解冻过程开始开始测量。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力，
其中，前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激并报告干扰素γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。在一个实施方案中，前述测定为流式细胞术测定。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；和
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力，
其中，T细胞产物选自下组：肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)产物、骨髓浸润淋巴细胞(MIL)产物或外周血淋巴细胞(PBL)产物。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力，
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的，且其中目标细胞为经辐照的Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的，其中目标细胞为经辐照的Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，且其中阴性对照细胞缺乏MHC I类和MHC II类表达。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的，其中目标细胞为经辐照Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，且其中阴性对照细胞为经辐照的K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的，其中目标细胞为经辐照的Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中阴性对照细胞为经辐照的K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，且其中TIL产物细胞的数目与目标细胞的数目之间的比率在5:1与1:5之间。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的，其中目标细胞为经辐照的Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中阴性对照细胞为经辐照的K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中TIL产物细胞的数目与目标细胞的数目之间的比率在5:1与1:5之间，并且其中TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率在5:1与1:5之间。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的，其中目标细胞为经辐照的Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中阴性对照细胞为经辐照的K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中第一时间段为约6小时至约48小时，且第二时间段为约6小时至约48小时。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的，且其中目标细胞为经辐照的Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中阴性对照细胞为经辐照的K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中第一时间段选自约12小时、约18小时和约24小时，第二时间段选自约12小时、约18小时和约24小时。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的，其中目标细胞为经辐照的Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中阴性对照细胞为经辐照的K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中T细胞产物上的一种以上标记物选自下组：CD25、CD69、CD134、CD137、CD150、KLRG1或它们的组合。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的，其中目标细胞为经辐照的Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中阴性对照细胞为经辐照的K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中T细胞产物分泌的一种以上分析物选自下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25、IL-26、MIP-1β以及它们的组合。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力；以及
h.放行T细胞产物以用于治疗人类患者。
其中，T细胞产物为来自人类的TIL产物，且该TIL产物是通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得的，并且是通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造的，其中目标细胞为经辐照的Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中阴性对照细胞为经辐照的K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中T细胞产物分泌的一种以上分析物选自下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25、IL-26、MIP-1β以及它们的组合，其中TIL产物分泌的一种以上分析物选自下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25、IL-26、MIP-1β以及它们的组合，其中对于一种以上分析物中的每一种分析物，将观测值的数量相对于对照值的数量进行归一化，并且其中一种以上分析物中的每一种分析物的观测值相对于对照值的增加选自下组：至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍和至少5倍。
在任何前述实施方案中，肿瘤消化可通过本文所描述或本领域中已知的方法进行。在任何前述实施方案中，肿瘤消化是根据国际专利公开WO 2021/123832 A1中描述的方法或使用其中描述的组合物或装置进行的，该专利公开的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于确定TIL多官能活性以评估扩增的TIL和其他多克隆T细胞产物(包括MIL和PBL)的效力和/或功能的方法，该扩增的TIL和其他多克隆T细胞产物(包括MIL和PBL)随后可用于通过施用所评估的TIL、MIL、PBL或其他多克隆T细胞产物来治疗癌症，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的两种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力。
在一些实施方案中，该方法包括以下其他步骤：
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的两种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力，
其中，TIL产物分泌的两种以上分析物选自下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25、IL-26、MIP-1β以及它们的组合，其中对于两种以上分析物中的每一种分析物，将观测值的数量相对于对照值的数量进行归一化，并且其中两种以上分析物中的每一种分析物的观测值相对于对照值的增加选自下组：至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍和至少10倍。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于确定TIL多官能活性以评估扩增的TIL和其他多克隆T细胞产物(包括MIL和PBL)的效力和/或功能的方法，该扩增的TIL和其他多克隆T细胞产物(包括MIL和PBL)随后可用于通过施用所评估的TIL、MIL、PBL或其他多克隆T细胞产物来治疗癌症，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的三种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力。
在一些实施方案中，该方法包括以下其他步骤：
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的三种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力，
其中，TIL产物分泌的三种以上分析物选自下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25、IL-26、MIP-1β以及它们的组合，其中对于三种以上分析物中的每一种分析物，将观测值的数量相对于对照值的数量进行归一化，并且其中三种以上分析物中的每一种分析物的观测值相对于对照值的增加选自下组：至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍和至少10倍。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于确定TIL多官能活性以评估扩增的TIL和其他多克隆T细胞产物(包括MIL和PBL)的效力和/或功能的方法，该扩增的TIL和其他多克隆T细胞产物(包括MIL和PBL)随后可用于通过施用所评估的TIL、MIL、PBL或其他多克隆T细胞产物来治疗癌症，该方法包括以下步骤：
a.将多个目标细胞与多个T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力。
在一些实施方案中，该方法包括以下其他步骤：
d.将多个阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力，
其中，TIL产物分泌的一种以上分析物选自下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25、IL-26、MIP-1β以及它们的组合，其中对于一种以上分析物中的每一种分析物，将观测值的数量相对于对照值的数量进行归一化，并且其中一种以上分析物中的每一种分析物的观测值相对于对照值的增加选自下组：至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍和至少10倍。
在一个实施方案中，本发明包括前述方法，其中目标细胞选自下组：Raji细胞、Thp1细胞、Ramos细胞、U937细胞、Daudi细胞以及它们的组合。在一个实施方案中，目标细胞是两种以上细胞株的组合。在一个实施方案中，目标细胞是两种以上细胞株的1:1组合。在一个实施方案中，目标细胞是两种以上细胞株的1:1组合，其中两种以上细胞株不同且各自独立地选自下组：Raji细胞、Thp1细胞、Ramos细胞、U937细胞和Daudi细胞。在一个实施方案中，目标细胞是三种以上细胞株的1:1:1组合，其中三种以上细胞株不同且各自独立地选自下组：Raji细胞、Thp1细胞、Ramos细胞、U937细胞和Daudi细胞。在一个实施方案中，目标细胞是四种以上细胞株的1:1:1:1组合，其中四种以上细胞株不同且各自独立地选自下组：Raji细胞、Thp1细胞、Ramos细胞、U937细胞和Daudi细胞。在一个实施方案中，目标细胞是两种以上细胞株的1:1:1:1:1组合，其中两种以上细胞株不同且各自独立地选自下组：Raji细胞、Thp1细胞、Ramos细胞、U937细胞和Daudi细胞。
在一个实施方案中，目标细胞为Raji细胞与Thp1细胞的组合，其中Raji细胞与Thp1细胞的比率选自下组：5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5。在一个实施方案中，目标细胞为Raji细胞与Ramos细胞的组合，其中Raji细胞与Ramos细胞的比率选自下组：5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5。在一个实施方案中，目标细胞为Raji细胞与U937细胞的组合，其中Raji细胞与U937细胞的比率选自下组：5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5。在一个实施方案中，目标细胞为Raji细胞与Daudi细胞的组合，其中Raji细胞与Daudi细胞的比率选自下组：5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5。
在一个实施方案中，本发明包括前述方法，其中共培养物包括细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括前述方法，其中共培养物包括CM1培养基。在一个实施方案中，本发明包括前述方法，其中共培养物包含AIM-V培养基(L-谷氨酰胺、50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)，也称为AIM V培养基，其可购自英杰公司(Invitrogen)(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。在一个实施方案中，本发明包括前述方法，其中共培养物和第二次共培养物包括细胞培养基。在一个实施方案中，本发明包括前述方法，其中共培养物和第二次共培养物各自包括CM1培养基。在一个实施方案中，本发明包括前述方法，其中共培养物和第二次共培养物各自包含AIM-V培养基。在一个实施方案中，共培养物包含IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养期间将IL-2的浓度保持在50IU/mL与1000IU/mL之间。在一个实施方案中，共培养物包含IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养期间将IL-2的浓度保持在100IU/mL与500IU/mL之间。在一个实施方案中，共培养物包含IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养期间将IL-2的浓度保持在200IU/mL与400IU/mL之间。在一个实施方案中，共培养物包含IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2，且其中将IL-2的浓度保持在选自下组：约50IU/mL、约100IU/mL、约150IU/mL、约200IU/mL、约250IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL和约500IU/mL。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力，
其中在共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养中将IL-2的浓度保持在选自下组：约50IU/mL、约100IU/mL、约150IU/mL、约200IU/mL、约250IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL和约500IU/mL。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力，
其中在共培养和第二次共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养和第二次共培养中的每一个中将IL-2的浓度保持在选自下组：约50IU/mL、约100IU/mL、约150IU/mL、约200IU/mL、约250IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL和约500IU/mL。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力，
其中在共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养中将IL-2的浓度保持在50IU/mL与1000IU/mL之间。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力，
其中在共培养和第二次共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养和第二次共培养中的每一个中将IL-2的浓度保持在50IU/mL与1000IU/mL之间。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于确定TIL、MIL或PBL活性的方法，其中使用杀伤测定。在一些实施方案中，本发明提供一种用于确定TIL、MIL或PBL活性的方法，其中使用杀伤测定，并且其中检测到细胞溶解终点。在一些实施方案中，本发明提供一种用于确定TIL、MIL或PBL活性的方法，其中使用杀伤测定。在一些实施方案中，本发明提供一种用于确定TIL、MIL或PBL活性的方法，其中使用杀伤测定，并且通过对目标细胞株进行基因修饰以在溶解时表达荧光、化学发光或生物发光蛋白质来检测到细胞溶解终点。合适的基因修饰和测定包括荧光素酶测定，例如美国专利第9,631,225号中所描述的那些测定，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。例如，美国专利第10,415,015号中描述的用于生物发光检测的基因修饰方法可用于修饰目标细胞，例如Raji细胞、K562细胞、Daudi细胞、Ramos细胞、U937细胞或Thp1细胞，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于确定T细胞产物的效力的方法，该方法进一步包括预先辐照目标细胞以遏制增殖的步骤。在一个实施方案中，本发明提供一种用于确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括使用未经辐照以遏制增殖的目标细胞。在一个实施方案中，本发明提供一种用于确定T细胞产物的效力的方法，该方法进一步包括以化学方式或生物方式处理目标细胞以遏制增殖的步骤。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于确定T细胞产物的效力的方法，该方法进一步包括预先辐照阴性对照细胞以遏制增殖的步骤。在一个实施方案中，本发明提供一种用于确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括使用未经辐照以遏制增殖的阴性对照细胞。在一个实施方案中，本发明提供一种用于确定T细胞产物的效力的方法，该方法进一步包括以化学方式或生物方式处理阴性对照细胞以遏制增殖的步骤。
在一个实施方案中，使用X射线或γ射线将目标细胞辐照至以下总辐照吸收剂量：约5Gy、10Gy、15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy、45Gy、50Gy、55Gy、60Gy、65Gy、70Gy、75Gy、80Gy、85Gy、90Gy、95Gy、100Gy、105Gy、110Gy、115Gy、120Gy、125Gy、130Gy、135Gy、140Gy、145Gy、150Gy、155Gy、160Gy、165Gy、170Gy、175Gy、180Gy、185Gy、190Gy或200Gy。
在一个实施方案中，使用X射线或γ射线将目标细胞辐照至以下总辐照吸收剂量：约100rads、200rads、300rads、400rads、500rads、600rads、700rads、800rads、900rads、1000rads、1100rads、1200rads、1300rads、1400rads、1500rads、1600rads、1700rads、1800rads、1900rads、2000rads、2100rads、2200rads、2300rads、2400rads、2500rads、2600rads、2700rads、2800rads、2900rads、3000rads、3100rads、3200rads、3300rads、3400rads、3500rads、3600rads、3700rads、3800rads、3900rads、4000rads、4100rads、4200rads、4300rads、4400rads、4500rads、4600rads、4700rads、4800rads、4900rads、5000rads、5100rads、5200rads、5300rads、5400rads、5500rads、5600rads、5700rads、5800rads、5900rads、6000rads、6100rads、6200rads、6300rads、6400rads、6500rads、6600rads、6700rads、6800rads、6900rads、7000rads、7500rads、8000rads、8500rads、9000rads、9500rads或10000rads。
在一个实施方案中，使用X射线或γ射线按以下辐照吸收剂量速率辐照目标细胞：约20rads/min、40rads/min、60rads/min、80rads/min、100rads/min、120rads/min、140rads/min、160rads/min、180rads/min、200rads/min、220rads/min、240rads/min、260rads/min、280rads/min、300rads/min、320rads/min、340rads/min、360rads/min、380rads/min、400rads/min、420rads/min、440rads/min、460rads/min、480rads/min、500rads/min、520rads/min、540rads/min、560rads/min、580rads/min、600rads/min、620rads/min、640rads/min、660rads/min、680rads/min或700rads/min。在一个实施方案中，使用X射线或γ射线按以下辐照吸收剂量速率辐照目标细胞：约50rads/min、100rads/min、150rads/min、200rads/min、250rads/min、300rads/min、350rads/min、400rads/min、450rads/min、500rads/min、550rads/min、600rads/min、650rads/min、700rads/min、750rads/min、800rads/min、850rads/min、900rads/min、950rads/min、1000rads/min、1050rads/min、1100rads/min、1150rads/min、1200rads/min、1250rads/min、1300rads/min、1350rads/min、1400rads/min、1450rads/min、1500rads/min、1550rads/min、1600rads/min、1650rads/min、1700rads/min、1750rads/min、1800rads/min、1850rads/min、1900rads/min、1950rads/min或2000rads/min
在一个实施方案中，本发明包括一种用于进行混合肿瘤同种异体反应性测定方法公开内容以确定T细胞产物(例如TIL、MIL或PBL产物)的效力的方法。在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将混合肿瘤同种异体反应性细胞株与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力，
其中在共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养中将IL-2的浓度保持在选自下组：约50IU/mL、约100IU/mL、约150IU/mL、约200IU/mL、约250IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL和约500IU/mL。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将混合肿瘤同种异体反应性细胞株与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养，其中该混合肿瘤同种异体反应性细胞株为混合肿瘤细胞株；
b.由该共培养获得收集物；
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力，
其中在共培养和第二次共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养和第二次共培养中的每一个中将IL-2的浓度保持在选自下组：约50IU/mL、约100IU/mL、约150IU/mL、约200IU/mL、约250IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL和约500IU/mL。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将混合肿瘤同种异体反应性细胞株与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力，
其中在共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养中将IL-2的浓度保持在50IU/mL与1000IU/mL之间。
在一个实施方案中，本发明包括确定T细胞产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将混合肿瘤同种异体反应性细胞株与T细胞产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定T细胞产物的效力；
d.将阴性对照细胞与T细胞产物细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
e.由该第二次共培养获得第二收集物；
f.评估该第二收集物中(1)T细胞产物细胞上一种以上标记物的表达或(2)T细胞产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定T细胞产物的效力，
其中在共培养和第二次共培养期间不断添加IL-2，且其中在共培养和第二次共培养中的每一个中将IL-2的浓度保持在50IU/mL与1000IU/mL之间。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株的组合经优化以获得最大HLA多样性。在一个实施方案中，本发明包括一种用于进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株的组合经优化以获得最大异型接合性。在一个实施方案中，本发明包括一种用于进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株的组合经优化以获得最大免疫原性。在一个实施方案中，本发明包括一种用于进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株的组合经优化以获得最大HLA-A2免疫原性。在一个实施方案中，本发明包括一种用于进行效力测定的方法，其中基于HLA特性选择目标细胞株或目标细胞株的组合。在一个实施方案中，本发明包括一种用于进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株的组合表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ(A1)、HLA-DQ(A2)、HLA-DR(B1)、HLA-DP(B1)、HLA-DP(B2)或它们的组合。在一个实施方案中，本发明包括一种用于进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株的组合经优化以获得最大同种异体HLA-TCR相互作用。在一个实施方案中，本发明包括一种用于进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株的组合经优化以获得最大的非抗原特异性HLA-TCR相互作用。
在一个实施方案中，本发明包括一种用于进行效力测定的方法，其中每瓶或每孔的TIL和目标细胞的总数为约1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、1.5×106、2×106、2.5×106、3×106、3.5×106、4×106、4.5×106或5×106。在一个实施方案中，小瓶或孔的体积为约0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL或5mL。
在一些实施方案中，HLA-I阻断抗体以下列浓度用作阴性对照：约0.1μg/mL、约0.2μg/mL、约0.3μg/mL、约0.4μg/mL、约0.5μg/mL、约0.6μg/mL、约0.7μg/mL、约0.8μg/mL、约0.9μg/mL、约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL、约6μg/mL、约7μg/mL、约8μg/mL、约9μg/mL、约10μg/mL、约11μg/mL、约12μg/mL、约13μg/mL、约14μg/mL、约15μg/mL、约16μg/mL、约17μg/mL、约18μg/mL、约19μg/mL、约20μg/mL、约21μg/mL、约22μg/mL、约23μg/mL、约24μg/mL、约25μg/mL、约26μg/mL、约27μg/mL、约28μg/mL、约29μg/mL、约30μg/mL、约35μg/mL、约40μg/mL、约45μg/mL或约50μg/mL。在任何前述实施方案中，HLA-I阻断抗体为购自Biolegend，Inc.(美国加利福尼亚州圣地亚哥)的克隆W6/32(抗HLA-ABC)。
在一些实施方案中，HLA-II阻断抗体以下列浓度用作阴性对照：约0.1μg/mL、约0.2μg/mL、约0.3μg/mL、约0.4μg/mL、约0.5μg/mL、约0.6μg/mL、约0.7μg/mL、约0.8μg/mL、约0.9μg/mL、约1μg/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL、约6μg/mL、约7μg/mL、约8μg/mL、约9μg/mL、约10μg/mL、约11μg/mL、约12μg/mL、约13μg/mL、约14μg/mL、约15μg/mL、约16μg/mL、约17μg/mL、约18μg/mL、约19μg/mL、约20μg/mL、约21μg/mL、约22μg/mL、约23μg/mL、约24μg/mL、约25μg/mL、约26μg/mL、约27μg/mL、约28μg/mL、约29μg/mL、约30μg/mL、约35μg/mL、约40μg/mL、约45μg/mL或约50μg/mL。在任一前述实施方案中，HLA-I阻断抗体为购自BD Biosciences，Inc.(美国新泽西州富兰克林湖)的克隆TU39(HLA-DR、DP、DQ)。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率为约3:1，其中该目标细胞为单核细胞，且其中步骤(a)的共培养中的总细胞为约1×106/mL。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率为约3:1，其中该目标细胞为单核细胞，其中步骤(a)的共培养中的总细胞为约1×106/mL，并且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：基于微珠或基于培养板的细胞因子测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。在一个实施方案中，前述测定为流式细胞术测定。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率为约3:1，其中该目标细胞为单核细胞，且其中步骤(a)的共培养中的总细胞为约2×106/mL。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率为约3:1，其中该目标细胞为单核细胞，其中步骤(a)的共培养中的总细胞为约2×106/mL，并且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激并报告干扰素γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。在一个实施方案中，前述测定为流式细胞术测定。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率为约1:1，其中该目标细胞为单核细胞，且其中步骤(a)的共培养中的总细胞为约1×106/mL。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
其中该目标细胞为单核细胞，其中步骤(a)的共培养中的总细胞为约1×106/mL，并且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激并报告干扰素γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。在一个实施方案中，前述测定为流式细胞术测定。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率为约1:1，其中该目标细胞为单核细胞，且其中步骤(a)的共培养中的总细胞为约2×106/mL。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
d.将包含人类白细胞抗原(HLA)阻断抗体的阴性对照与TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养获得第二收集物或萃取第二上清液；
f.评估(1)第二收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)第二上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中该目标细胞为单核细胞，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二次共培养中的总细胞在0.5×106/mL与3×106/mL之间，且其中该HLA阻断抗体选自HLA-I阻断抗体、HLA-II阻断抗体以及它们的组合。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
d.将包含人类白细胞抗原(HLA)阻断抗体的阴性对照与TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养获得第二收集物或萃取第二上清液；
f.评估(1)第二收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)第二上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二次共培养中的总细胞在0.5×106/mL与3×106/mL之间，且其中HLA阻断抗体选自HLA-I阻断抗体、HLA-II阻断抗体以及它们的组合。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
d.将包含人类白细胞抗原(HLA)阻断抗体的阴性对照与TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养获得第二收集物或萃取第二上清液；
f.评估(1)第二收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)第二上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定TIL的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二次共培养中的总细胞在0.5×106/mL与3×106/mL之间，且其中HLA阻断抗体选自HLA-I阻断抗体、HLA-II阻断抗体以及它们的组合。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
d.将包含人类白细胞抗原I类(HLA-I)阻断抗体和人类白细胞抗原II类(HLA-II)阻断抗体的阴性对照与TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养获得第二收集物或萃取第二上清液；
f.评估(1)第二收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)第二上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二次共培养中的总细胞在0.5×106/mL与3×106/mL之间，且其中HLA-I阻断抗体的浓度在5μg/mL与20μg/mL之间且HLA-II阻断抗体的浓度在5μg/mL与10μg/mL之间。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
d.将包含人类白细胞抗原I类(HLA-I)阻断抗体和人类白细胞抗原II类(HLA-II)阻断抗体的阴性对照与TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养获得第二收集物或萃取第二上清液；
f.评估(1)第二收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)第二上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二次共培养中的总细胞在0.5×106/mL与3×106/mL之间，且其中HLA-I阻断抗体的浓度在5μg/mL与20μg/mL之间且HLA-II阻断抗体的浓度在5μg/mL与10μg/mL之间。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
d.将包含人类白细胞抗原I类(HLA-I)阻断抗体和人类白细胞抗原II类(HLA-II)阻断抗体的阴性对照与TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养获得第二收集物或萃取第二上清液；
f.评估(1)第二收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)第二上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二次共培养中的总细胞在0.5×106/mL与3×106/mL之间，其中HLA-I阻断抗体的浓度在5μg/mL与20μg/mL之间且HLA-II阻断抗体的浓度在5μg/mL与10μg/mL之间，并且其中TIL细胞分泌的一种以上分析物包括干扰素-γ。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力，
d.将包含人类白细胞抗原I类(HLA-I)阻断抗体和人类白细胞抗原II类(HLA-II)阻断抗体的阴性对照与TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养获得第二收集物或萃取第二上清液；
f.评估(1)第二收集物中TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)第二上清液中TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的一个以上观测值与来自步骤f的一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二次共培养中的总细胞在0.5×106/mL与3×106/mL之间，其中HLA-I阻断抗体的浓度在5μg/mL与20μg/mL之间且HLA-II阻断抗体的浓度在5μg/mL与10μg/mL之间，并且其中TIL细胞分泌的一种以上分析物包括干扰素-γ。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养萃取上清液；和
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素γ以获得观测值，
d.将包含人类白细胞抗原I类(HLA-I)阻断抗体和人类白细胞抗原II类(HLA-II)阻断抗体的阴性对照与来自TIL产物的TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养萃取第二上清液；
f.评估第二上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ以获得对照值；以及
g.将来自步骤c的观测值与来自步骤f的对照值进行比较，其中对倍数增加进行计算，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二次共培养中的总细胞在0.5×106/mL与3×106/mL之间，且其中HLA-I阻断抗体的浓度在5μg/mL与20μg/mL之间且HLA-II阻断抗体的浓度在5μg/mL与10μg/mL之间。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养萃取上清液；和
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素γ以获得观测值，
d.将包含人类白细胞抗原I类(HLA-I)阻断抗体和人类白细胞抗原II类(HLA-II)阻断抗体的阴性对照与来自TIL产物的TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养萃取第二上清液；
f.评估第二上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ以获得对照值；以及
g.将来自步骤c的观测值与来自步骤f的对照值进行比较，其中对倍数增加进行计算，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二次共培养中的总细胞在0.5×106/mL与3×106/mL之间，且其中HLA-I阻断抗体的浓度在5μg/mL与20μg/mL之间且HLA-II阻断抗体的浓度在5μg/mL与10μg/mL之间。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养萃取上清液；和
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ以获得观测值，
d.将包含人类白细胞抗原I类(HLA-I)阻断抗体和人类白细胞抗原II类(HLA-II)阻断抗体的阴性对照与来自TIL产物的TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养萃取第二上清液；
f.评估第二上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ以获得对照值；以及
g.将来自步骤c的观测值与来自步骤f的对照值进行比较，其中对倍数增加进行计算，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二共培养中的总细胞在1×106/mL与3×106/mL之间，其中HLA-I阻断抗体的浓度在5μg/mL与20μg/mL之间且HLA-II阻断抗体的浓度在5μg/mL与10μg/mL之间，其中在共培养和第二次共培养期间不断添加IL-2，其中在共培养和第二次共培养中的每一个中将IL-2的浓度保持在100IU/mL与500IU/mL之间，且其中使用AIM-V培养基进行共培养和第二次共培养。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养萃取上清液；和
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ以获得观测值，
d.将包含人类白细胞抗原I类(HLA-I)阻断抗体和人类白细胞抗原II类(HLA-II)阻断抗体的阴性对照与来自TIL产物的TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养萃取第二上清液；
f.评估第二上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ以获得对照值；以及
g.将来自步骤c的观测值与来自步骤f的对照值进行比较，其中对倍数增加进行计算，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二共培养中的总细胞在1×106/mL与3×106/mL之间，其中HLA-I阻断抗体的浓度在5μg/mL与20μg/mL之间且HLA-II阻断抗体的浓度在5μg/mL与10μg/mL之间，其中在共培养和第二次共培养期间不断添加IL-2，其中在共培养和第二次共培养中的每一个中将IL-2的浓度保持在100IU/mL与500IU/mL之间，且其中使用AIM-V培养基进行共培养和第二次共培养。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养萃取上清液；和
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ以获得观测值，
d.将包含人类白细胞抗原I类(HLA-I)阻断抗体和人类白细胞抗原II类(HLA-II)阻断抗体的阴性对照与来自TIL产物的TIL细胞和目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，可选地，所述第二时间段与第一时间段同时发生；
e.由该第二次共培养萃取第二上清液；
f.评估第二上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ以获得对照值；以及
g.将来自步骤c的观测值与来自步骤f的对照值进行比较，其中对倍数增加进行计算，以确定TIL产物的效力，
其中TIL与目标细胞的比率在3:1与1:1之间，其中目标细胞为U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中步骤(a)的共培养和步骤(d)的第二共培养中的总细胞在1×106/mL与3×106/mL之间，其中HLA-I阻断抗体的浓度在5μg/mL与20μg/mL之间且HLA-II阻断抗体的浓度在5μg/mL与10μg/mL之间，其中在共培养和第二次共培养期间不断添加IL-2，其中在共培养和第二次共培养中的每一个中将IL-2的浓度保持在100IU/mL与500IU/mL之间，其中使用AIM-V培养基进行共培养和第二次共培养，并且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激并报告干扰素γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。在一个实施方案中，前述测定为流式细胞术测定。
在一些实施方案中，目标细胞株由传代不超过两次、不超过三次、不超过四次、不超过五次、不超过六次、不超过七次、不超过八次、不超过九次或不超过十次的主细胞库制备。在前述实施方案的另一个实施方案中，总传代次数可通过与目标细胞株的提供者报告的传代次数相比较来确定。
在一些实施方案中，Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞株或它们的组合是由传代不超过两次、不超过三次、不超过四次、不超过五次、不超过六次、不超过七次、不超过八次、不超过九次或不超过十次的主细胞库制备。在前述实施方案的另一个实施方案中，总传代次数可通过与Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞株或它们的组合的提供者报告的传代次数相比较来确定。
在一些实施方案中，阴性对照细胞株由传代不超过两次、不超过三次、不超过四次、不超过五次、不超过六次、不超过七次、不超过八次、不超过九次或不超过十次的主细胞库制备。在前述实施方案的另一个实施方案中，总传代次数可通过与阴性对照细胞株的提供者报告的传代次数相比较来确定。
在一些实施方案中，K562细胞株由传代不超过两次、不超过三次、不超过四次、不超过五次、不超过六次、不超过七次、不超过八次、不超过九次或不超过十次的主细胞库制备。在前述实施方案的另一个实施方案中，总传代次数可通过与K562细胞株的提供者报告的传代次数相比较来确定。
在一些实施方案中，目标细胞株由传代不超过两次、不超过三次、不超过四次、不超过五次、不超过六次、不超过七次、不超过八次、不超过九次或不超过十次的工作细胞库制备。在前述实施方案的另一个实施方案中，总传代次数可通过与由目标细胞株的提供者报告的传代次数相比较来确定。
在一些实施方案中，Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞株或它们的组合是由传代不超过两次、不超过三次、不超过四次、不超过五次、不超过六次、不超过七次、不超过八次、不超过九次或不超过十次的工作细胞库制备。在前述实施方案的另一个实施方案中，总传代次数可通过与由Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞株或它们的组合的提供者报告的传代次数相比较来确定。
在一些实施方案中，阴性对照细胞株由传代不超过两次、不超过三次、不超过四次、不超过五次、不超过六次、不超过七次、不超过八次、不超过九次或不超过十次的工作细胞库制备。在前述实施方案的另一个实施方案中，总传代次数可通过与由阴性对照细胞株的提供者报告的传代次数相比较来确定。
在一些实施方案中，K562细胞株由传代不超过两次、不超过三次、不超过四次、不超过五次、不超过六次、不超过七次、不超过八次、不超过九次或不超过十次的工作细胞库制备。在前述实施方案的另一个实施方案中，总传代次数可通过与K562细胞株的提供者报告的传代次数相比较来确定。
在一些实施方案中，阴性对照细胞株是在与目标细胞株(例如单核细胞株或Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞株)共培养所用的条件下培养之后测试蛋白质(例如IFN-γ或颗粒酶B)分泌或表达的TIL细胞株，不同之处在于目标细胞株不包括在TIL细胞株中。在一些情况下，这些阴性对照实验在本文中称为“单独的TIL”对照实验。倍数增加和平行线分析计算可与单独的TIL阴性对照实验结合使用。例如，TIL细胞株的共培养可根据本文所描述的方法用单核细胞目标细胞株进行，并且在相同条件下同时运行的单独实验中，可以单独培养TIL细胞株。然后可以分析两个实验的IFN-γ表达，并进行比较以对倍数增加进行计算或用于计算平行线分析斜率或其他分析标准。
在一些前述实施方案中，还包括阳性对照TIL细胞株，其使用本文所描述的方法(例如相关前述实施方案中的步骤(a)至(c))来测量以确保在实验之间、每日之间、分析员之间或实验室之间基础上的再现性。
在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用。在一些实施方案中，数据分析步骤是倍数增加计算，如本文别处详细描述的。在一些实施方案中，数据分析步骤是平行线分析计算，如本文别处详细描述的。用于统计分析和通过/失败放行或稳定性确定的平行线分析方法可以与任何前述测定实施方案一起使用，包括结合两个、三个、四个或五个目标细胞浓度(针对单个TIL批次浓度)的测量以确定剂量反应，可选地，去除一个或两个离群值(例如，去除了一个离群值的四个目标细胞浓度)。USP第<1032>章《生物测定的设计和开发(Design and Development of Biological Assays)》也描述了平行线分析。USP药典公约：马里兰州罗克维尔，2013；USP第<111>章《生物测定的设计和分析(Design andAnalysis of Biological Assays)》。美国药典公约：马里兰州罗克维尔，2014；USP第<1033>章《生物测定验证(Biological Assay Validation)》。USP药典公约：马里兰州罗克维尔，2013；USP第<1034>章《生物测定分析(Analysis of Biological Assays)》。美国药典公约：马里兰州罗克维尔，2013；Hauck等人，PDA《药物科学与技术杂志(J.Pharma.Sci.Technol.)》2005，59(2)，127-137；Callahan和Sajjadi，《生物过程杂志(BioProcessing J.)》2003，2(2)，71-77；Findlay等人，《药学与生物分析期刊(J.Pharm.Biomed.Anal.)》2000，21，1249-1273；和Gottschalk和Dunn，《生物药物统计期刊(J.Biopharm.Stat.)》2005，26，453-79，这些文献中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，前述方法与根据USP<1032>《生物测定的设计和开发》进行的数据分析步骤一起使用，该文献的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用，其中根据USP<1032>《生物测定的设计和开发》和USP<1033>《生物测定验证》对数据进行对数转换，以满足在效力范围内测量的对称性、正态分布和变异性均一性的要求，这些文献中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用，其中评估离群值且从分析中省略，如USP<1034>《生物测定分析》中所描述，该文献的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用，其中线性回归在四点剂量曲线上进行，其中由于曲线饱和而掩蔽最高或最低浓度(若需要)。在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用，其中使用至少三种且优选四种相邻的[剂量]浓度。在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用，其中要求线性段的斜率足够陡峭。在一些实施方案中，上述方法与数据分析步骤一起使用，其中要求拟合标准样本和测试样本的线是直的并且线是平行的。在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用，其中根据USP<1032>《生物测定的设计和开发》，在TIL测试物和参考标准之间进行平行线分析，该文献的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用，其中通过平行性所测量的参考标准与TIL测试物之间的统计相似性证明了TIL测试物与参考标准的生物相似性。在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用，其中计算并报告平行斜率比、线性比、回归(R2)以及均方根误差(RMSE)。在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用，其中，对平行度和线性的测定适用性和有效性进行排序并确定“通过”或“未通过”根据USP<1033>《生物分析验证》的限制内的有效性标准，该文献的公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，前述方法与数据分析步骤一起使用，其中作为耐受百分比范围的95％置信区间内的相对效力被确定为“可报告的”或“非决定性的”。虽然不受理论束缚，但根据USP<1032>《生物测定的设计和开发》，相对效力优于源自绝对值的效力，因为相对效力是消除生物样本固有的可变性和细胞行为随时间推移的影响的校准因子。
在一些实施方案中，本发明包括用于确定TIL、MIL或PBL产物效力的前述方法之一，且进一步包括将前述方法之一与其他效力测定和/或身份(identity)测定结合使用以形成效力测定(或效力和身份测定)矩阵。此类矩阵包括用于确定TIL、MIL或PBL产物的效力(或效力和身份)的多个步骤。效力测定矩阵描述于美国食品和药物管理局的《工业指南：细胞和基因疗法产物的效力测定(Guidance for Industry:Potency Tests for Cellularand Gene Therapy Products)》，2011，76，《联邦公报(Fed.Reg.)》9028，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少一种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少两种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少三种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少四种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少五种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少六种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少七种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少八种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少九种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少十种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少十一种另外的测定。在一些实施方案中，本发明包括一种矩阵，其包括同种异体共培养测定，例如使用Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1目标细胞的同种异体共培养测定，以及至少十二种另外的测定。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中IFN-γ、颗粒酶B或TNF-α的水平通过基于微珠或培养板的刺激方法测量，包括通过抗CD3、抗CD28和/或抗CD137抗体刺激。此类方法与本文所描述的同种异体共培养测定正交，因为其通过不同机制检测TIL、MIL或PBL活化且进一步报告TIL、MIL或PBL治疗性产物的功能或活性。因此，此类方法可单独或与本文所描述的同种异体共培养测定组合包括在如本文所描述的效力测定矩阵中。合适的基于微珠和培养板的方法描述于美国专利第10,130,659号、第11,083,752号、第10,918,666号、第11,168,303号和第11,026,974号和美国专利申请公开第2019/0276802A1号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量TCM细胞的数目或百分比。在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量TEM细胞的数目或百分比。在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量TSCM细胞的数目或百分比。在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量TEMRA细胞的数目或百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术通过CD45RA-CCR7-表达细胞的百分比测量TEM细胞来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD45RA-CCR7-的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术通过CD45RA-CCR7+表达细胞的百分比测量TCM细胞来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD45RA-CCR7+的表达。在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中TEM和TCM总细胞群大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD8的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD8的表达。
在一些实施方案中，本发明包括一种用于确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD8的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于2％、大于3％、大于4％、大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD8的表达。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD4的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式动细胞测量术测量CD4。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD4来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD8来确定TIL、MIL或PBL产品效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD4来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD4来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于2％、大于3％、大于4％、大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD4的表达。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD4和CD8两者的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD4和CD8两者。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD4和CD8两者来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD4和CD8两者来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD4和CD8两者来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD4和CD8两者来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD4加CD8的表达。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中总CD4+和CD8+细胞群(包括单阳性CD4、单阳性CD8和双阳性亚群)大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量LAG3的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量LAG3。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量LAG3来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量LAG3来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量LAG3来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量LAG3来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到LAG3的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量LAG3来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到LAG3的表达。在一些实施方案中，通过测量LAG3+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中LAG3+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量KLRG1的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量KLRG1。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量KLRG1来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量KLRG1来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量KLRG1来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量KLRG1来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到KLRG1的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量KLRG1来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到KLRG1的表达。在一些实施方案中，通过测量KLRG1+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中KLRG1+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD101的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD101。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD101来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD101来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD101来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD101来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD101的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD101来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD101的表达。在一些实施方案中，通过测量CD101+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中CD101+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD69的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD69。在一些实施方案中，通过流动式细胞测量术测量CD69来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD69来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD69来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD69来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD69的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD69来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD69的表达。在一些实施方案中，通过测量CD69+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中CD69+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量PD-1的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量PD-1。在一些实施方案中，通过流动式细胞测量术测量PD-1来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量PD-1来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量PD-1来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量PD-1来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到PD-1的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量PD-1来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到PD-1的表达。在一些实施方案中，通过测量PD-1+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中PD-1+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量TIM3的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIM3。在一些实施方案中，通过流动式细胞测量术测量TIM3来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIM3来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIM3来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIM3来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到TIM3的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIM3来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到TIM3的表达。在一些实施方案中，通过测量TIM3+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中TIM3+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD25的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD25。在一些实施方案中，通过流动式细胞测量术测量CD25来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD25来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD25来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD25来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD25的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD25来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD25的表达。在一些实施方案中，通过测量CD25+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中CD25+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD27的百分比表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD27。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD27来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD27来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD27来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD27来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD27的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD27来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD27的表达。在一些实施方案中，通过测量CD27+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中CD27+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD28的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD28。在一些实施方案中，通过流动式细胞测量术测量CD28来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD28来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD28来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD28来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD28的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD28来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD28的表达。在一些实施方案中，通过测量CD28+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中CD28+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD56的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD56。在一些实施方案中，通过流动式细胞测量术测量CD56来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD56来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD56来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD56来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD56的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD56来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD56的表达。在一些实施方案中，通过测量CD56+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中CD56+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CD57的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD57。在一些实施方案中，通过流动式细胞测量术测量CD57来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD57来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD57来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD57来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD57的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CD57来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CD57的表达。在一些实施方案中，通过测量CD57+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中CD57+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量CTLA-4的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CTLA-4。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CTLA-4来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CTLA-4来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CTLA-4来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CTLA-4来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CTLA-4的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量CTLA-4来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到CTLA-4的表达。在一些实施方案中，通过测量CTLA-4+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中CTLA-4+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定T细胞产物的效力的方法，其中测量TIGIT的表达百分比。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIGIT。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIGIT来确定TIL、MIL或PBL产物的效力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIGIT来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIGIT来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中该测量为根据测定矩阵进行的一系列测量的一部分，且另外其中该测定矩阵还包括如本文别处所描述的同种异体反应性共培养测定。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIGIT来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于25％、小于30％、小于35％、小于40％、小于45％、小于50％、小于55％、小于60％、小于65％、小于70％、小于75％、小于80％、小于85％、小于90％或小于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到TIGIT的表达。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量TIGIT来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中在大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％的CD3+细胞或TCRαβ阳性细胞上检测到TIGIT的表达。在一些实施方案中，通过测量TIGIT+细胞的总数来确定TIL、MIL或PBL产物的效力，其中TIGIT+细胞的总数大于50×106、大于100×106、大于150×106、大于200×106、大于250×106、大于300×106、大于350×106、大于400×106、大于450×106、大于500×106、大于550×106、大于600×106、大于650×106、大于700×106、大于750×106、大于800×106、大于850×106、大于900×106、大于950×106、大于1×109、大于1.5×109、大于2.0×109、大于2.5×109、大于3.0×109、大于3.5×109、大于4.0×109、大于5.0×109、大于6.0×109、大于7.0×109、大于8.0×109、大于9.0×109或大于10×109个细胞。
在一些实施方案中，本发明包括一种效力或身份测定矩阵，其包括测量Treg细胞的含量的测定，包括通过如本领域中已知的用于FoxP3+细胞的细胞内染色流式细胞术测定进行测量。
在一个实施方案中，本发明包括一种使用能够结合至T细胞受体的目标细胞确定T细胞产物的效力的方法，其中该方法用于包括至少一种其他效力测定的效力测定矩阵中。在一个实施方案中，本发明包括一种基于T细胞或TIL、MIL或PBL TCR复合物与目标细胞的HLA-肽复合物的同种异体相互作用(也称为MHC显性识别)的测定，其中该测定用于包括至少一种其他效力测定的效力测定矩阵中。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.由每次共培养萃取上清液；以及
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.由每次共培养萃取上清液；以及
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为单核细胞谱系细胞。
在一个实施方案中，本发明包括确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞在至少三种不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
b.由每次共培养萃取上清液；以及
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为Thp1细胞或U937细胞，或其衍生物、变体、修饰物或后代，且其中通过平行线分析，使用TIL参考标准确定相对效力。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞在四种不同目标细胞浓度下进行至少四次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.由每次共培养萃取上清液；以及
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中通过平行线分析，在重复步骤a至c的一系列单独的实验中使用TIL参考标准来确定相对效力。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
d.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞在四种不同目标细胞浓度下进行至少四次持续12至48小时的时间段的共培养；
e.由每次共培养萃取上清液；以及
f.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中通过平行线分析，在重复步骤a至c的一系列单独的实验中使用TIL参考标准来确定相对效力，并且其中使用每孔4×105、2×105、1×105和0.5×105个细胞的四种目标细胞剂量浓度和每孔1.5×106个TIL的单一TIL细胞浓度。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞在四种不同目标细胞浓度下进行至少四次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.由每次共培养萃取上清液；以及
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中通过平行线分析，在重复步骤a至c的一系列单独的实验中使用TIL参考标准来确定相对效力，其中使用每孔4×105、2×105、1×105和0.5×105个细胞的四种目标细胞剂量浓度和每孔1.5×106个TIL的单一TIL细胞浓度，且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：基于微珠或基于培养板的细胞因子测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞在四种不同目标细胞浓度下进行至少四次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.由每次共培养萃取上清液；以及
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中通过平行线分析，在重复步骤a至c的一系列单独的实验中使用TIL参考标准来确定相对效力，其中使用每孔4×105、2×105、1×105和0.5×105个细胞的四种目标细胞剂量浓度和每孔1.5×106个TIL的单一TIL细胞浓度，且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激并报告干扰素-γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞在四种不同目标细胞浓度下进行至少四次持续约24小时的时间段的共培养；
b.由每次共培养萃取上清液；以及
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中通过平行线分析，在重复步骤a至c的一系列单独的实验中使用TIL参考标准来确定相对效力，其中使用每孔4×105、2×105、1×105和0.5×105个细胞的四种目标细胞剂量浓度和每孔1.5×106个TIL的单一TIL细胞浓度，其中可以丢弃一个离群值剂量浓度，且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激并报告干扰素-γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与来自TIL产物的TIL细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.由每次共培养萃取上清液；以及
c.评估上清液中TIL细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为单核细胞谱系细胞，其中通过平行线分析，在重复步骤a至c的一系列单独的实验中使用TIL参考标准来确定相对效力，其中使用每孔4×105、2×105、1×105和0.5×105个细胞的四种目标细胞剂量浓度和每孔1.5×106个TIL的单一TIL细胞浓度，其中可以丢弃一个离群值剂量浓度，且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激并报告干扰素-γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同的目标细胞或TIL产物细胞浓度下进行多次共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同的目标细胞或TIL参考标准细胞浓度下进行多次共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的细胞因子，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为单核细胞谱系细胞。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行多次共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行多次共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的细胞因子，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为单核细胞谱系细胞。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行多次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行多次持续12至48小时的时间段的共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的细胞因子，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为单核细胞谱系细胞。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行多次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行多次持续12至48小时的时间段的共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行多次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行多次持续12至48小时的时间段的共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为单核细胞谱系细胞，且其中前述方法为包括至少一种其他测定的效力测定矩阵的组成部分。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行多次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行多次持续12至48小时的时间段的共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为U937或Thp1细胞，或其衍生物、变体、修饰物或后代，且其中前述方法为包括至少一种其他测定的效力测定矩阵的组成部分。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续12至48小时的时间段的共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续12至48小时的时间段的共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为U937或Thp1细胞，或其衍生物、变体、修饰物或后代，且其中前述方法为包括至少一种其他测定的效力测定矩阵的组成部分。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为U937或Thp1细胞，或其衍生物、变体、修饰物或后代，且其中前述方法为包括至少一种其他测定的效力测定矩阵的组成部分。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中使用每孔4×105、2×105、1×105和0.5×105个细胞的四种目标细胞剂量浓度和每孔1.5×106个TIL的单一TIL细胞浓度，其中可以丢弃一个离群值剂量浓度，且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激和报告干扰素-γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中使用每孔4×105、2×105、1×105和0.5×105个细胞的四种目标细胞剂量浓度和每孔1.5×106个TIL的单一TIL细胞浓度，其中每一个进行至少两次重复，其中可以丢弃一个离群值剂量浓度，且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少一个选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激和报告干扰素-γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中使用每孔4×105、2×105、1×105和0.5×105个细胞的四种目标细胞剂量浓度和每孔1.5×106个TIL的单一TIL细胞浓度，其中每一个进行至少两次重复，其中可以丢弃一个离群值剂量浓度，且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少三种选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激和报告干扰素-γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
b.将目标细胞与TIL参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次持续约24小时的时间段的共培养；
c.由每次共培养萃取上清液；以及
d.评估上清液中TIL产物细胞和TIL参考标准细胞分泌的干扰素-γ，以获得剂量浓度，从而确定TIL产物的效力；
其中目标细胞为U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中使用每孔4×105、2×105、1×105和0.5×105个细胞的四种目标细胞剂量浓度和每孔1.5×106个TIL的单一TIL细胞浓度，其中每一个进行至少两次重复，其中可以丢弃一个离群值剂量浓度，且其中前述方法是效力测定矩阵的组成部分，该效力测定矩阵包括至少五种选自下组的其他测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激和报告干扰素-γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。
在一些实施方案中，本发明包括一种确定TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：使用流式细胞仪(包括多通道和多色流式细胞仪)进行流式细胞术分析。合适的流式细胞仪和方法在本领域中有所描述，包括在美国专利第9,645,010号；第10,816,550号；第10,137,479号；第9,453,791号；第10,935,482号；第10,648,900号；第9,341,562号；第9,677,989号；第4,710,635号；第4,662,742号；第4,660,971号；第4,818,103号；第5,057,413号；第5,641,457号；第5,620,842号；第5,985,216号；第6,079,836号；第6,495,333号；第6,256,096号；第6,482,652号；第6,700,130号；第7,855,078号；第7,990,525号；和第10,436,698号；以及美国专利申请公开第2001/0006416A1和第2002/0186375A1号，其公开内容以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，前述流式细胞术方法与如本文所述的同种异体共培养物测定相结合。在一些实施方案中，前述流式细胞术方法与使用CD3、CD28和/或CD137刺激和通过基于ELISA的方法报告干扰素γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子α的基于微珠或培养板的测定相结合。
在一些实施方案中，前述共培养在孵育箱中进行。在一些实施方案中，前述共培养在约40℃的孵育箱中进行。在一些实施方案中，前述共培养在约35℃的孵育箱中进行。在一些实施方案中，前述共培养在约37℃的孵育箱中进行。在一些实施方案中，前述共培养在具有约5％CO2气体的孵育箱中进行。在一些实施方案中，前述共培养在具有约10％CO2气体的孵育箱中进行。在一些实施方案中，前述共培养在具有约15％CO2气体的孵育箱中进行。在一些实施方案中，前述共培养在具有约20％CO2气体的孵育箱中进行。在一些实施方案中，前述共培养在加湿的孵育箱中进行。
B.测定组合物
在一些实施方案中，本发明包括包含TIL(例如TIL、MIL或PBL产物)和目标细胞的组合物。在一些实施方案中，本发明包括在培养基中包含TIL(例如TIL、MIL或PBL产物)和目标细胞的组合物。在一些实施方案中，本发明包括包含TIL(例如TIL、MIL或PBL产物)和目标细胞的组合物，其中目标细胞为Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一些实施方案中，本发明包括包含TIL(例如TIL、MIL或PBL产物)和阴性对照细胞的组合物。在一些实施方案中，本发明包括在培养基中包含TIL(例如TIL、MIL或PBL产物)和阴性对照细胞的组合物。在一些实施方案中，本发明包括包含TIL(例如TIL、MIL或PBL产物)和目标细胞的组合物，其中阴性对照细胞为K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，本发明包括包含从本文所描述的共培养测定中获得的上清液的组合物(可选地，含有分泌蛋白)。
在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含培养基(例如AIM-V培养基)、至少一种来自选自Raji细胞株、Thp1细胞株、Ramos细胞株、U937细胞株、Daudi细胞株以及它们的组合的细胞株的细胞以及IL-2。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含AIM-V培养基、至少一种来自选自Raji细胞株、Thp1细胞株、Ramos细胞株、U937细胞株、Daudi细胞株以及它们的组合的细胞株的细胞以及IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含AIM-V培养基、至少一种来自选自Raji细胞株、Thp1细胞株、Ramos细胞株、U937细胞株、Daudi细胞株以及它们的组合的细胞株的细胞以及IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2，并且其中在共培养期间将IL-2的浓度保持在50IU/mL与1000IU/mL之间。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含AIM-V培养基、至少一种来自选自Raji细胞株、Thp1细胞株、Ramos细胞株、U937细胞株、Daudi细胞株以及它们的组合的细胞株的细胞以及IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2，并且其中在共培养期间将IL-2的浓度保持在100IU/mL与500IU/mL之间。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含AIM-V培养基、至少一种来自选自Raji细胞株、Thp1细胞株、Ramos细胞株、U937细胞株、Daudi细胞株以及它们的组合的细胞株的细胞以及IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2，并且其中在共培养期间将IL-2的浓度保持在200IU/mL与400IU/mL之间。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含AIM-V培养基、至少一种来自选自Raji细胞株、Thp1细胞株、Ramos细胞株、U937细胞株、Daudi细胞株以及它们的组合的细胞株的细胞以及浓度为选自下组的IL-2：约50IU/mL、约100IU/mL、约150IU/mL、约200IU/mL、约250IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL和约500IU/mL。在一个实施方案中，本发明包括一种包含目标细胞的组合物，其中目标细胞为Raji细胞与Thp1细胞的组合，其中Raji细胞与Thp1细胞的比率选自下组：5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5。在一个实施方案中，本发明包括一种包含目标细胞的组合物，其中目标细胞为Raji细胞与Ramos细胞的组合，其中Raji细胞与Ramos细胞的比率选自下组：5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5。在一个实施方案中，本发明包括一种包含目标细胞的组合物，其中目标细胞为Raji细胞与U937细胞的组合，其中Raji细胞与U937细胞的比率选自下组：5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5。在一个实施方案中，本发明包括一种包含目标细胞的组合物，其中目标细胞为Raji细胞与Daudi细胞的组合，其中Raji细胞与Daudi细胞的比率选自下组：5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4和1:5。
在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含培养基(例如AIM-V培养基)；至少一种来自选自下组的细胞株的细胞：B细胞株、B细胞类淋巴母细胞株、伯基特氏淋巴瘤细胞株、骨髓谱系细胞株、单核细胞株、急性单核细胞白血病细胞、M5亚型急性单核细胞白血病细胞、黑色素细胞株、黑色素瘤细胞株以及它们的组合；以及IL-2。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含AIM-V培养基；至少一种来自选自下组的细胞株的细胞：B细胞株、B细胞类淋巴母细胞株、伯基特氏淋巴瘤细胞株、骨髓谱系细胞株、单核细胞株、急性单核细胞白血病细胞、M5亚型急性单核细胞白血病细胞、黑色素细胞株、黑色素瘤细胞株以及它们的组合；以及IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含AIM-V培养基；至少一种来自选自下组的细胞株的细胞：B细胞株、B细胞类淋巴母细胞株、伯基特氏淋巴瘤细胞株、骨髓谱系细胞株、单核细胞株、急性单核细胞白血病细胞、M5亚型急性单核细胞白血病细胞、黑色素细胞株、黑色素瘤细胞株以及它们的组合；以及IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2，并且其中在共培养期间将IL-2的浓度保持在50IU/mL与1000IU/mL之间。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含AIM-V培养基；至少一种来自选自下组的细胞株的细胞：B细胞株、B细胞类淋巴母细胞株、伯基特氏淋巴瘤细胞株、骨髓谱系细胞株、单核细胞株、急性单核细胞白血病细胞、M5亚型急性单核细胞白血病细胞、黑色素细胞株、黑色素瘤细胞株以及它们的组合；以及IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2，并且其中在共培养期间将IL-2的浓度保持在100IU/mL与500IU/mL之间。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含AIM-V培养基；至少一种来自选自下组的细胞株的细胞：B细胞株、B细胞类淋巴母细胞株、伯基特氏淋巴瘤细胞株、骨髓谱系细胞株、单核细胞株、急性单核细胞白血病细胞、M5亚型急性单核细胞白血病细胞、黑色素细胞株、黑色素瘤细胞株以及它们的组合；以及IL-2，其中在共培养期间不断添加IL-2，并且其中在共培养期间将IL-2的浓度保持在200IU/mL与400IU/mL之间。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含AIM-V培养基；至少一种来自选自下组的细胞株的细胞：B细胞株、B细胞类淋巴母细胞株、伯基特氏淋巴瘤细胞株、骨髓谱系细胞株、单核细胞株、急性单核细胞白血病细胞、M5亚型急性单核细胞白血病细胞、黑色素细胞株、黑色素瘤细胞株以及它们的组合；以及浓度为选自下组的IL-2：约50IU/mL、约100IU/mL、约150IU/mL、约200IU/mL、约250IU/mL、约300IU/mL、约350IU/mL、约400IU/mL、约450IU/mL和约500IU/mL。
在一个实施方案中，目标细胞的任何先前实施方案包括经辐照的目标细胞。在一个实施方案中，目标细胞的任何先前实施方案包括未经辐照的目标细胞。在一个实施方案中，阴性对照细胞的任何先前实施方案包括经辐照的阴性对照细胞。在一个实施方案中，阴性对照细胞的任何先前实施方案包括未经辐照的阴性对照细胞。
在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ(A1)、HLA-DQ(A2)、HLA-DR(B1)、HLA-DP(B1)、HLA-DP(B2)或它们的组合的目标细胞株或目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株组合表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ(A1)、HLA-DQ(A2)、HLA-DR(B1)、HLA-DP(B1)、HLA-DP(B2)或它们的组合，并进一步包含通过本文所描述的方法制备的TIL、MIL或PBL群。在一些实施方案中，本发明包括一种进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株组合表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ(A1)、HLA-DQ(A2)、HLA-DR(B1)、HLA-DP(B1)、HLA-DP(B2)或它们的组合，并进一步包含通过本文所描述的Gen 2过程制备的TIL、MIL或PBL群。在一些实施方案中，本发明包括一种进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株组合表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ(A1)、HLA-DQ(A2)、HLA-DR(B1)、HLA-DP(B1)、HLA-DP(B2)或它们的组合，并进一步包含通过本文所描述的Gen 3过程制备的TIL、MIL或PBL群。在一个实施方案中，本发明包括一种进行效力测定的方法，其中目标细胞株或目标细胞株组合表达HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DQ(A1)、HLA-DQ(A2)、HLA-DR(B1)、HLA-DP(B1)、HLA-DP(B2)或它们的组合，并进一步包含根据美国专利第10,894,063号、第10,398,734号、第10,537,595号、第10,695,372号和第10,653,723号中所公开或要求保护的组合物的TIL、MIL或PBL群，这些专利的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括B细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括B细胞类淋巴母细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括伯基特氏淋巴瘤细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括骨髓谱系细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括单核细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括急性单核细胞白血病细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括M5亚型急性单核细胞白血病细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或目标细胞株组合，该目标细胞株组合包括Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，包括Raji B2M细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或目标细胞株组合，该目标细胞株组合包括Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，包括适合于杀伤测定的经基因修饰的Thp1细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或目标细胞株组合，该目标细胞株组合包括Ramos细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，包括适合于杀伤测定的经基因修饰的Ramos细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或目标细胞株组合，该目标细胞株组合包括U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，包括适合于杀伤测定的经基因修饰的U937细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或目标细胞株组合，该目标细胞株组合包括Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，包括适合于杀伤测定的经基因修饰的Daudi细胞。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括黑色素细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括HLA-A-02阳性黑色素细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括黑色素瘤细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或包括HLA-A-02阳性黑色素瘤细胞的目标细胞株组合。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含目标细胞株或目标细胞株组合，该目标细胞株组合包括选自下组的黑色素瘤细胞：Sk-MEL-5、Malme-3M、SK-MEL-28、SK-MEL-3、SH-4、SK-MEL-24、RPMI-7951、SK-MEL-1、A375、G-361以及它们的组合。
在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含培养基、目标细胞和HLA-I阻断抗体。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含培养基、目标细胞和HLA-II阻断抗体。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含培养基、HLA-I阻断抗体和HLA-II阻断抗体。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含培养基、IL-2、目标细胞和HLA-I阻断抗体。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含培养基、IL-2、目标细胞和HLA-II阻断抗体。在一个实施方案中，本发明包括一种组合物，其包含培养基、IL-2、目标细胞、HLA-I阻断抗体和HLA-II阻断抗体。在任何前述实施方案中，组合物进一步包含分泌的细胞因子，其水平可与在不存在HLA-I和/或HLA-II阻断抗体时获得的水平进行比较。在任何前述实施方案中，HLA-I阻断抗体以1μg/mL与50μg/mL之间的浓度存在。在任何前述实施方案中，HLA-I阻断抗体以5μg/mL与20μg/mL之间的浓度存在。在任何前述实施方案中，HLA-II阻断抗体以1μg/mL与50μg/mL之间的浓度存在。在任何前述实施方案中，HLA-II阻断抗体以5μg/mL与20μg/mL之间的浓度存在。
在一些实施方案中，本文所描述的效力测定可用于确定T细胞组合物(包括TIL、MIL和PBL组合物)的效力，这些组合物描述于美国专利申请公开第2018/0282694A1号；第2020/0224161A1号；和第2020/0277573A1号；国际专利申请公开第WO 2019/210131A1号；第WO 2019/136456 A1号；第WO 2019/145711 A1号；第WO 2019/210131A1号；第WO 2020/152451 A1号；和第WO 2021/123832 A1号；和美国专利第10,130,659号、第10,166,257号、第10,272,113号、第10,363,273号、第10,398,734号、第10,420,799号、第10,463,697号、第10,537,595号、第10,646,517号、第10,653,723号、第10,693,330号、第10,695,372号、第10,894,063号、第10,905,718号、第10,918,666号中，这些专利中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些前述实施方案中，用于效力测定的目标细胞被制备为工作细胞库。在一些前述实施方案中，用于效力测定的目标细胞被制备为主细胞库。
C.测定套件
在一个实施方案中，本发明包括用于测试TIL(例如TIL、MIL或PBL产物)的效力的套件。在一些实施方案中，套件包含如本文所描述的目标细胞。在一个实施方案中，套件包含Raji细胞、Thp1细胞、Ramos细胞、U937细胞、Daudi细胞、其组合或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一些实施方案中，套件包含如本文所描述的阴性对照细胞。在一个实施方案中，套件包含K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一些实施方案中，套件包含培养基、免疫测定试剂、ELISA或自动ELISA系统、包含分泌蛋白的上清液、PBMC、如本文所描述的阳性对照或其他测试组分。
在一些实施方案中，本发明包括用于测试TIL(例如TIL、MIL或PBL产物)的效力的套件，其中套件包含一种至三种目标细胞、培养基和共培养容器。在一些实施方案中，一种至三种目标细胞选自下组：Raji细胞、Thp1细胞、Ramos细胞、U937细胞、Daudi细胞以及它们的组合、衍生物、变体、修饰和后代。在一些实施方案中，培养基包含AIM-V培养基。在一些实施方案中，培养基包含IL-2。
在一些实施方案中，套件包含单核细胞性目标细胞株。在一些实施方案中，套件包含骨髓谱系目标细胞株。在一些实施方案中，套件包含B细胞目标细胞株。在一些实施方案中，套件包含B细胞类淋巴母细胞目标细胞株。在一些实施方案中，套件包含伯基特氏淋巴瘤细胞目标细胞株。在一些实施方案中，套件包含急性单核细胞白血病细胞株。在一些实施方案中，套件包含M5亚型急性单核细胞白血病细胞株。
在一个实施方案中，套件的任何先前实施方案包含经辐照的目标细胞。在一个实施方案中，套件的任何先前实施方案包含未经辐照的目标细胞。在一个实施方案中，套件的任何先前实施方案包含经辐照的阴性对照细胞。在一个实施方案中，套件的任何先前实施方案包含未经辐照的阴性对照细胞。在一个实施方案中，套件的任何先前实施方案包含未经辐照的K562阴性对照细胞。在一个实施方案中，套件的任何先前实施方案包含经辐照的K562阴性对照细胞。
所提出的用于确定T细胞(包含TIL、MIL和PBL)的效力或功能的方法的示例性实施方案也可见于本文所包括的实施例和附图中。
在任何前述实施方案中，套件还包含HLA-I阻断抗体。在任何前述实施方案中，套件还包含HLA-II阻断抗体。
在任何前述实施方案中，套件还包含阳性对照TIL细胞株。合适的阳性对照TIL细胞株包括那些已充分表征、扩增至较大细胞计数、显示在本发明的效力测定中可再现地响应，并在冷冻条件下小心储存以供后续使用的阳性对照TIL细胞株。
IV.Gen 2TIL制造工艺
图1和图2中描绘含有一些这些特征的示例性TIL过程系列，称为Gen 2(又称为过程2A)。Gen 2的一个实施方案显示于图2中。本发明的此实施方案相对于过程1C的一些优点描述于国际专利公开第WO 2018/081473 A1中，其以引用的方式并入本文。
如本文所讨论，本发明可以包括涉及在移植到患者体内之前重新刺激冷冻保存的TIL以增加其代谢活性并因此增加相对健康状况的步骤，以及测试所述代谢健康状况的方法。如本文概述的，TIL通常取自患者样本并在移植到患者体内之前进行操作以扩大其数量。在一些实施方案中，TIL可以任选地进行基因操作，如下文所讨论的。
在一些实施方案中，TIL可经冷冻保存。解冻后，它们也可以在输注到患者体内之前被重新刺激以增加其代谢。
在一些实施方案中，将第一次扩增(包括称为预REP的过程以及图1中显示为步骤A的过程)缩短至3至14天，且将第二次扩增(包括称为REP的过程以及图1中显示为步骤B的过程)缩短至7至14天，如下文以及实施例和附图中所详细讨论的。在一些实施方案中，将第一次扩增(例如图1中步骤B所描述的扩增)缩短至11天，且将第二次扩增(例如图1中步骤D中所描述的扩增)缩短至11天。在一些实施方案中，将第一次扩增和第二次扩增(例如，在图1中描述为步骤B和步骤D的扩增)的组合缩短至22天，如下文和实施方案和附图中所详细讨论。
以下“步骤”名称A、B、C等参照图1且参照本文所描述的某些实施方案。以下和图1中的步骤顺序为示例性的，且本申请和本文中所公开的方法涵盖步骤的任何组合或顺序，以及另外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样本
通常，TIL最初获自患者肿瘤样本(“初代TIL”)，然后扩增成较大群以进行如本文所描述的进一步操作，可选地经冷冻保存，如本文所概述进行再刺激，并且可选地评估表型和作为TIL健康指标的代谢参数。
患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，通常通过手术切除、穿刺活检、核心活检、小型活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的方式获得。在一些实施方案中，使用多病灶取样。在一些实施方案中，手术切除、穿刺活检、核心活检、小型活检或其他用于获得含有肿瘤与TIL细胞的混合物的样本的手段包括多病灶取样(即，自患者的一个以上肿瘤部位和/或位置以及同一位置或附近的一个以上肿瘤获得样本)。通常，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可为液体肿瘤，例如获自血液系统恶性肿瘤的肿瘤。实体肿瘤可以是皮肤组织的实体肿瘤。在一些实施方案中，有用的TIL自黑色素瘤中获得。
一旦获得，肿瘤样本通常使用锐器分割破碎成1mm3至约8mm3之间的小块，其中约2mm3至3mm3为尤其适用的。使用酶促肿瘤消化物培养从这些碎片培养TIL。此类肿瘤消化物可通过在酶培养基(例如罗斯威尔公园癌症研究所(Roswell Park Memorial Institute；RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素(gentamicine)、30单位/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，接着进行机械解离(例如使用组织解离器)来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤置于酶培养基中且机械解离肿瘤大约1分钟，随后在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，随后在前述条件下重复机械解离和孵育循环，直至仅存在小组织块。在此过程结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用FICOLL支链亲水性多糖的密度梯度分离以移除这些细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开第2012/0244133A1号中所描述的方法，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。任何前述方法可用于本文所描述的任何实施方案中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。在一些实施方案中，根据国际专利公开第WO 2021/123832 A1中描述的方法或组合物的形式消化肿瘤，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。
如上文所指出，在一些实施方案中，TIL来源于实体肿瘤。在一些实施方案中，实体肿瘤未经破碎。在一些实施方案中，实体肿瘤未经破碎且以整个肿瘤进行酶促消化。在一些实施方案中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化。在一些实施方案中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施方案中，肿瘤在37℃、5％CO2下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施方案中，肿瘤在37℃、5％CO2、旋转下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施方案中，肿瘤在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，肿瘤在37℃、5％CO2、恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施方案中，在无菌缓冲液中用冻干酶重构肿瘤。在一些实施方案中，缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施方案中，酶混合物包含胶原蛋白酶。在一些实施方案中，胶原蛋白酶为胶原蛋白酶IV。在一些实施方案中，胶原蛋白酶的工作储备溶液为100mg/mL 10×工作储备溶液。
在一些实施方案中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施方案中，DNA酶的工作储备溶液为10,000IU/mL 10×工作储备溶液。
在一些实施方案中，酶混合物包含透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶的工作储备溶液为10mg/mL 10×工作储备溶液。
在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、1000IU/mL DNA酶和1mg/mL透明质酸酶。
在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、500IU/mL DNA酶和1mg/mL透明质酸酶。
通常，收集的细胞悬浮液被称为”初代细胞群”或”新鲜收集的“细胞群。
在一些实施方案中，破碎包括物理破碎，包括例如分割以及消化。在一些实施方案中，破碎为物理破碎。在一些实施方案中，破碎为分割。在一些实施方案中，通过消化进行破碎。在一些实施方案中，TIL最初可自获自患者的酶促肿瘤消化物和肿瘤碎片培养。在一个实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶促肿瘤消化物和肿瘤碎片培养。
在一些实施方案中，当肿瘤为实体肿瘤时，在例如步骤A(如图1中所提供)中获得肿瘤样本之后，对肿瘤进行物理破碎。在一些实施方案中，破碎发生在冷冻保存之前。在一些实施方案中，破碎发生在冷冻保存之后。在一些实施方案中，破碎发生在获得肿瘤之后并且在不进行任何冷冻保存的情况下。在一些实施方案中，将肿瘤破碎且将10、20、30、40或更多个碎片或块置于各容器中进行第一次扩增。在一些实施方案中，将肿瘤破碎且将30或40个碎片或块置于各容器中进行第一次扩增。在一些实施方案中，将肿瘤破碎且将40个碎片或块置于各容器中进行第一次扩增。在一些实施方案中，多个碎片包括约4个至约50个碎片，其中各碎片的体积为约27mm3。在一些实施方案中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方案中，多个碎片包括约50个碎片，其总体积为约1350mm3。在一些实施方案中，多个碎片包括约50个碎片，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方案中，多个碎片包括约4个碎片。
在一些实施方案中，TIL获自肿瘤碎片。在一些实施方案中，肿瘤碎片通过锐器分割获得。在一些实施方案中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤碎片在约1mm3与8mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施方案中，肿瘤为1-4mm×1-4mm×1-4mm。在一些实施方案中，肿瘤为1mm×1mm×1mm。在一些实施方案中，肿瘤为2mm×2mm×2mm。在一些实施方案中，肿瘤为3mm×3mm×3mm。在一些实施方案中，肿瘤为4mm×4mm×4mm。
在一些实施方案中，切除肿瘤以使各片上出血性、坏死和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施方案中，切除肿瘤以使各片上出血性组织的量减至最小。在一些实施方案中，切除肿瘤以使各片上坏死组织的量减至最小。在一些实施方案中，切除肿瘤以使各片上脂肪组织的量减至最小。
在一些实施方案中，进行肿瘤破碎以维持肿瘤内部结构。在一些实施方案中，在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行肿瘤破碎。在一些实施方案中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离大约1分钟。随后可将溶液在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，然后再次机械破坏大约1分钟。在37℃下在5％CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏大约1分钟。在一些实施方案中，如果在第三次机械破坏后大块组织仍存在，则向样本施加1或2次另外的机械解离，不论是否再在37℃下在5％CO2中孵育30分钟。在一些实施方案中，在最终孵育结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可使用Ficoll进行密度梯度分离以移除这些细胞。
在一些实施方案中，将在第一次扩增步骤之前收集的细胞悬浮液称为“初代细胞群”或“新鲜获得的”细胞群。
在一些实施方案中，细胞可可选地在样本收集之后冷冻且在进入步骤B(其在下文进一步详细描述以及图1和图8中所例示)中所描述的扩增之前冷冻储存。
1.胸腔积液TIL
在一些实施方案中，样本为胸膜液样本。在一些实施方案中，用于根据本文所描述的过程扩增的TIL的来源为胸膜液样本。在一些实施方案中，样本为源于胸腔积液的样本。在一些实施方案中，用于根据本文所描述的过程扩增的TIL的来源为源于胸腔积液的样本。参见例如美国专利公开US2014/0295426中所描述的方法，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可以采用疑似和/或含有TIL的任何胸膜液或胸腔积液。此类样本可来源于原发性或转移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。在一些实施方案中，样本可为来源于另一器官(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺)的继发转移性癌细胞。在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法中的样本为胸膜渗出物(pleural exudate)。在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法中的样本为胸膜溢出物(pleural transudate)。其他生物样本可包括含有TIL的其他浆液，包括例如来自腹部的腹水液或胰囊肿液。腹水液和胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部和肺两者在相同的恶性肿瘤事件中于胸腔和腹腔中均具有间皮细胞株和流体形式，且在一些实施方案中，此类流体含有TIL。在本发明例示胸膜液的一些实施方案中，可以使用含有TIL的腹水或其他囊肿液进行相同的方法以得到类似结果。
在一些实施方案中，胸膜液呈未经处理的形式直接自患者移除。在一些实施方案中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准血液收集管(例如EDTA或肝素管)中。在一些实施方案中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准管(Veridex)中。在一些实施方案中，在自患者收集之后立即将样本置于CellSave管中，以避免活TIL的数目减少。若保留在未经处理的胸膜液中，即使在4℃下，活TIL的数目可能在24小时内显著降低。在一些实施方案中，样本在自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。在一些实施方案中，样本在4℃下自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。
在一些实施方案中，可以稀释来自所选受试者的胸膜液样本。在一个实施方案中，稀释度为1:10胸膜液比稀释剂。在另一个实施方案中，稀释度为1:9胸膜液比稀释剂。在另一个实施方案中，稀释度为1:8胸膜液比稀释剂。在另一个实施方案中，稀释度为1:5胸膜液比稀释剂。在另一个实施方案中，稀释度为1:2胸膜液比稀释剂。在另一个实施方案中，稀释度为1:1胸膜液比稀释剂。在一些实施方案中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施方案中，样本在自患者收集和稀释之后立即置于CellSave管中，以避免活TIL减少，若保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL可能在24至48小时内显著减少。在一些实施方案中，胸膜液样本在自患者移除且稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。在一些实施方案中，胸膜液样本在自患者移除且在4℃下稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。
在又一个实施方案中，在进一步的处理步骤之前，通过常规手段浓缩胸膜液样本。在一些实施方案中，在胸膜液必须冷冻保存以便运送至进行该方法的实验室或用于后续分析(例如，在收集后24至48小时之后)的情形下，对胸膜液进行预处理是优选的。在一些实施方案中，通过在将胸膜液样本自受试者中取出后将其离心并将离心液或沉淀物再悬浮于缓冲液中来制备胸膜液样本。在一些实施方案中，对胸膜液样本进行多次离心和再悬浮，随后将其冷冻保存以用于运输或以后的分析和/或处理。
在一些实施方案中，在进一步处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样本。在一些实施方案中，在接触步骤中使用的胸膜液样本通过将流体通过含有已知且基本均匀的孔径的过滤器过滤而制备，该孔径允许胸膜液通过膜但保留肿瘤细胞。在一些实施方案中，膜中的孔的直径可为至少4μM。在另一个实施方案中，孔径可为5μM以上，且在其他实施方案中，可为6μM、7μM、8μM、9μM或10μM中的任一种。过滤之后，可将被膜保留的细胞(包括TIL)自膜上冲出至合适的生理学上可接受的缓冲液中。然后可以将以此方式浓缩的细胞(包括TIL)用于该方法的接触步骤中。
在一些实施方案中，使胸膜液样本(包括例如未经处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或再悬浮的细胞沉淀物与溶解试剂接触，该溶解试剂差异性地溶解样本中存在的无核红细胞。在一些实施方案中，在胸膜液含有大量RBC的情形下，此步骤在进一步的处理步骤之前进行。合适的溶解试剂包括单一溶解试剂或溶解试剂和淬灭试剂，或溶解试剂、淬灭试剂和固定试剂。合适的溶解系统为市售的，包括BD Pharm LyseTM系统(碧迪医疗公司(BectonDickenson))。其他溶解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(碧迪医疗公司)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter，Inc.))或氯化铵系统。在一些实施方案中，溶解试剂可随主要需求而变化，这些需求为红细胞的有效溶解和TIL的保守性和胸膜液中TIL的表型特性。除采用单一试剂用于溶解之外，适用于本文所描述的方法的溶解系统可包括第二试剂，例如在该方法的剩余步骤期间淬灭或延迟溶解试剂的作用的试剂，例如StabilyseTM试剂(贝克曼库尔特公司)。视溶解试剂的选择或该方法的优选实施而定，也可采用常规固定试剂。
在一些实施方案中，在约-140℃的温度下冷冻保存如上文所描述的未经处理、稀释或多次离心或处理的胸膜液样本，随后如本文所提供进行进一步处理和/或扩增。
B.步骤B：第一次扩增
在一些实施方案中，本发明的方法提供获得年轻TIL，其与更老TIL(即，在向受试者/患者施用之前进一步经历更多轮复制的TIL)相比，在向受试者/患者施用时能够实现增加的复制循环且因此可提供额外治疗益处。年轻TIL的特征已在文献中描述，例如Donia等人，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scandinavian Journal of Immunology)》，75:157-167(2012)；Dudley等人，《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》，16:6122-6131(2010)；Huang等人，《免疫疗法杂志》，28(3):258-267(2005)；Besser等人，《临床癌症研究》，19(17):OF1-OF9(2013)；Besser等人，《免疫疗法杂志》32:415-423(2009)；Robbins等人，《免疫学杂志(JImmunol)》2004；173:7125-7130；Shen等人，《免疫疗法杂志》，30:123-129(2007)；Zhou等人，《免疫疗法杂志》，28:53-62(2005)；和Tran等人，《免疫疗法杂志》，31:742-751(2008)，其均以全文引用的方式并入本文中。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供一种产生表现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL表现出增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文中提供的方法以外的其他方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL表现出增加的T细胞贮库多样性，这些其他方法包括例如除图1中实施的方法以外的方法。在一些实施方案中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用如图5和/或图6中例示的称为过程1C的方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL表现出增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，在第一次扩增中获得的TIL表现T细胞贮库多样性增加。在一些实施方案中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性增加。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自α、β、γ和δ受体的T细胞受体中的一种中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在例如图1的步骤A中所描述将肿瘤碎片解剖或消化之后，所得细胞在含有IL-2的血清中在相对于肿瘤和其他细胞有利于TIL生长的条件下培养。在一些实施方案中，在2mL孔中在包括具有6000IU/mL IL-2的灭活人类AB血清的培养基中孵育肿瘤消化物。将此初代细胞群培养数天的时间段，通常3至14天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，将此初代细胞群培养7至14天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，将此初代细胞群培养10至14天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，将此初代细胞群培养约11天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。
在优选实施方案中，TIL的扩增可使用如下文和本文所描述的初始主体TIL扩增步骤(例如图1的步骤B中所描述的那些步骤，其可包括称为预REP的过程)进行，接着进行如下文步骤D和本文所描述的第二次扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后进行可选的冷冻保存，然后进行如下文和本文所描述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。获自此过程的TIL可可选地针对如本文所描述的表型特征和代谢参数进行表征。
在TIL培养在24孔板中开始的实施方案中，例如，使用平底Costar 24孔细胞培养簇(康宁公司(Corning Incorporated)，Corning，NY)，在具有IL-2(6000IU/mL；加利福尼亚州的爱莫利维尔Chiron Corp.)的2mL完全培养基(CM)中，每个孔可以接种1×106个肿瘤消化物细胞或一个肿瘤碎片。在一些实施方案中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。
在一些实施方案中，第一次扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，步骤B的CM由补充有10％人类AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气培养瓶(例如G-Rex 10；明尼苏达州新布莱顿市的Wilson Wolf Manufacturing)中开始培养的实施方案中，各培养瓶装载有在10-40mL含IL-2的CM中的10-40×106个活肿瘤消化物细胞或5至30个肿瘤碎片。G-Rex10和24孔板均在含湿气孵育箱中在37℃和5％CO2下孵育，在培养开始后第5天，移除一半培养基且更换为新鲜的CM和IL-2，且在第5天之后，每2至3天更换一半培养基。
在制备肿瘤碎片后，将所得细胞(即碎片)在含有IL-2的血清中在相对于肿瘤和其他细胞有利于TIL生长的条件下培养。在一些实施方案中，将肿瘤消化物在2mL孔中，在包含灭活人类AB血清(或在一些情况下，如本文所概述，在存在aAPC细胞群的情况下)和6000IU/mL IL-2的培养基中孵育。将此初代细胞群培养数天的时间段，通常10至14天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，在第一次扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体。在一些实施方案中，IL为重组人类IL-2(rhIL-2)。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有20至30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有4至8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有5至7×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，如实施例5中所描述制备IL-2储备溶液。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mL IL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mLIL-2。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含IL-2。在优选实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或约8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含IL-15。在优选实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第一次扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含IL-21。在优选实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一个实施方案中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间和50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基不包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂于细胞培养基中。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，且该4-1BB激动剂选自下组：乌瑞芦单抗、乌托鲁单抗、EU-101、融合蛋白和其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到0.1μg/mL至100μg/mL的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到20μg/mL至40μg/mL的浓度。
在一些实施方案中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，且其中该一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，第一次扩增培养基称为”CM“(培养基的缩写)。在一些实施方案中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施方案中，CM由补充有10％人类AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在具有40mL容量和10cm2透气硅底的透气培养瓶(例如G-Rex 10；明尼苏达州新布莱顿市的Wilson Wolf Manufacturing)中开始培养的实施方案中，各培养瓶装载有在10-40mL含IL-2的CM中的10-40×106个活肿瘤消化物细胞或5至30个肿瘤碎片。G-Rex 10和24孔板均在含湿气孵育箱中在37℃和5％CO2下孵育，在培养开始后第5天，移除一半培养基且更换为新鲜的CM和IL-2，且在第5天之后，每2至3天更换一半培养基。在一些实施方案中，CM为实施例中所描述的CM1，参见实施例1。在一些实施方案中，第一次扩增在初始细胞培养基或第一细胞培养基中进行。在一些实施方案中，初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2。
在一些实施方案中，第一次扩增过程(包括例如描述于图1的步骤B中的过程，其可包括有时称为预REP的过程)缩短至3至14天，如实施例和附图中所讨论。在一些实施方案中，第一次扩增(包括例如图1的步骤B中所描述的过程，其可包括有时称为预REP的过程)缩短至7至14天，如实施例中所讨论和图4和5中所示，以及包括例如图1的步骤B中所描述的扩增。在一些实施方案中，步骤B的第一次扩增缩短至10至14天。在一些实施方案中，如例如图1的步骤B中所描述的扩增中所讨论，第一次扩增缩短至11天。
在一些实施方案中，第一次TIL扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行9天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行10天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行11天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行12天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行13天至14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行14天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行9天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行10天至11天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行11天。
在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第一次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及其任何组合可包括在第一次扩增期间，包括例如在根据图1以及本文所描述的步骤B过程期间。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第一次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-15和IL-21以及其任何组合可包括在根据图1以及如本文所描述的步骤B过程期间。
在一些实施方案中，第一次扩增(包括称为预REP的过程；例如，根据图1的步骤B)过程被缩短至3至14天，如实施方案和附图中所讨论的。在一些实施方案中，步骤B的第一次扩增缩短至7至14天。在一些实施方案中，步骤B的第一次扩增缩短至10至14天。在一些实施方案中，第一次扩增缩短至11天。
在一些实施方案中，第一次扩增(例如根据图1的步骤B)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如G-Rex10或G-Rex 100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
C.步骤C：第一次扩增至第二次扩增的转变
在一些情况下，由第一次扩增获得的主体TIL群，包括例如自例如图1中所示的步骤B获得的TIL群，可使用下文所讨论的方案立即冷冻保存。或者，由第一次扩增获得的TIL群，称为第二TIL群，可经历第二次扩增(其可包括有时称为REP的扩增)然后如下文所讨论冷冻保存。类似地，在将经基因修饰的TIL用于疗法的情况下，第一TIL群(有时称为主体TIL群)或第二TIL群(在一些实施方案中，其可包括称为REP TIL群的群)可在扩增之前或在第一次扩增之后且在第二次扩增之前进行基因修饰以用于合适的治疗。
在一些实施方案中，储存由第一次扩增(例如自如图1中所指示的步骤B)获得的TIL直至进行表型分析以供选择。在一些实施方案中，由第一次扩增(例如自如图1中所指示的步骤B)获得的TIL未经储存直接进行至第二次扩增。在一些实施方案中，获自第一次扩增的TIL在第一次扩增之后、在第二次扩增之前不经冷冻保存。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后约3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后约3天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后约4天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后约4天至10天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后约7天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后约14天发生。
在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后1天至14天发生。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至14天。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后3天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后4天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后5天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后6天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后7天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后8天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后9天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后10天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后11天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后12天到14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后13天至14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后14天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后1天至11天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后2天至11天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后3天至11天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后4天至11天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后5天至11天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后6天至11天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后7天至11天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后8天至11天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后9天至11天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后10天至11天发生。在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后11天发生。
在一些实施方案中，TIL在第一次扩增之后、在第二次扩增之前不进行储存，且TIL直接进行第二次扩增(例如在一些实施方案中，在如图1中所显示的步骤B至步骤D的转变期间不进行储存)。在一些实施方案中，转变在如本文所描述的密闭系统中发生。在一些实施方案中，来自第一次扩增的TIL(第二TIL群)直接进行第二次扩增而无转变期。
在一些实施方案中，第一次扩增至第二次扩增的转变(例如根据图1的步骤C)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如G-Rex 10或G-Rex 100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
1.细胞因子
本文所描述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知的。
或者，也可以使用细胞因子的组合进行TIL的快速扩增和/或第二次扩增，其中IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合描述于美国专利申请公开第2017/0107490A1号和国际专利申请公开第WO 2015/189357号中，这些专利中的每一种以全文引用的方式明确并入本文。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如本文所描述的T细胞。
D.步骤D：第二次扩增
在一些实施方案中，TIL细胞群在收集和初始批量处理之后(例如在步骤A和步骤B之后以及称为步骤C的转变之后，如图1中所示)在数目上有所扩大。此进一步扩增在本文中称为第二次扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(REP；以及如图1的步骤D中所指示的过程)的扩增过程。第二次扩增通常使用包含多种组分(包括饲养细胞、细胞因子源和抗CD3抗体)的培养基在透气容器中完成。
在一些实施方案中，TIL的第二次扩增或第二次TIL扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图1的步骤D中所指示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL培养瓶或容器进行。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可进行约7天至约14天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可进行约8天至约14天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可进行约9天至约14天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可进行约10天至约14天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可进行约11天至约14天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可进行约12天至约14天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可进行约13天至约14天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可进行约14天。
在一个实施方案中，第二次扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图1的步骤D中所指示的过程)进行。例如，TIL可在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/ml OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本市的美天旎生物技术公司)或UHCT-1(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥市的BioLegend)。TIL可通过在第二次扩增期间引入一种以上癌症的抗原(包括其抗原部分，例如表位)来诱导进一步TIL体外刺激进行扩增，这些抗原可以可选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下可选地由载体表达，该载体为例如人类白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μΜMART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他合适的抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或其抗原部分。TIL也可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激而快速扩增。替代地，TIL可进一步用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方案中，再刺激作为第二次扩增的一部分发生。在一些实施方案中，第二次扩增在经辐照的自体淋巴细胞或经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2的存在下发生。
在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或8000IU/mL之间的IL-2。
在一个实施方案中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间和50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基不包括OKT-3抗体。在一些实施方案中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂于细胞培养基中。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，且该4-1BB激动剂选自下组：乌瑞芦单抗、乌托鲁单抗、EU-101、融合蛋白和其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到0.1μg/mL至100μg/mL的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到20μg/mL至40μg/mL的浓度。
在一些实施方案中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，且其中该一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及其任何组合可包括在第二次扩增期间，包括例如在根据图1以及本文所描述的步骤D过程期间。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-15和IL-21以及其任何组合可包括在根据图1和如本文所描述的步骤D过程期间。
在一些实施方案中，第二次扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞且可选地包含TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施方案中，第二次扩增在补充细胞培养基中发生。在一些实施方案中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方案中，第二次扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中进行。
在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包括IL-15。在优选实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含IL-21。在优选实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：300或约1：500。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL与PBMC的比率在1：50与1：300之间。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL与PBMC的比率在1：100与1：200之间。
在一个实施方案中，REP和/或第二次扩增在培养瓶中进行，其中在150mL培养基中混合主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mLIL-2。更换培养基(通常通过抽吸用新鲜培养基更换2/3培养基)直至细胞转移至替代生长箱室。替代生长箱室包括G-Rex培养瓶和透气容器，如下文更充分讨论。
在一些实施方案中，第二次扩增(其可包括称为REP过程的过程)缩短至7至14天，如实施例和附图中所讨论。在一些实施方案中，第二次扩增缩短至11天。
在一些实施方案中，REP和/或第二次扩增可使用如先前所述的T-175培养瓶和透气袋(Tran等人，《免疫疗法杂志》2008，31，742-51；Dudley等人，《免疫疗法杂志》2003，26，332-42)或透气性培养皿(G-Rex培养瓶)进行。在一些实施方案中，第二次扩增(包括称为快速扩增的扩增)在T-175培养瓶中进行，可以将悬浮于150mL培养基中的约1×106个TIL添加至各T-175培养瓶中。TIL可在补充有3000IU/mL IL-2和30ng/ml抗CD3的CM与AIM-V培养基的1：1混合物中培养。可以将T-175培养瓶在37℃下在5％CO2中孵育。可在第5天使用具有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方案中，在第7天，可将来自两个T-175培养瓶的细胞在一个3L袋中合并，并将300mL含5％人类AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至300mL TIL悬浮液中。每天或每两天对每个袋中的细胞数目计数，并添加新鲜培养基以使细胞计数保持在0.5与2.0×106个细胞/毫升之间。
在一些实施方案中，第二次扩增(其可包括称为REP的扩增，以及在图1的步骤D中提及的扩增)可在500mL容量的具有100cm透气硅底的透气培养瓶(G-Rex 100，可购自美国明尼苏达州新布莱顿市的Wilson Wolf Manufacturing Corporation)中进行，5×106或10×106个TIL可与PBMC在400mL的补充有5％人类AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-Rex 100培养瓶可在37℃下在5％CO2中孵育。在第5天，可将250mL上清液移除并放入离心瓶中以1500rpm(491×g)离心10分钟。可以用150mL的含有5％人类AB血清、3000IU/mL IL-2的新鲜培养基使TIL沉淀物再悬浮，并添加回原来的G-Rex100培养瓶中。当TIL在G-Rex 100培养瓶中连续扩增时，在第7天，各G-Rex 100中的TIL可悬浮于各培养瓶中存在的300mL培养基中，且细胞悬浮液可分成可用于接种3个G-Rex 100培养瓶的3个100mL等分试样。随后可将150mL具有5％人类AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至各培养瓶中。可将G-Rex 100培养瓶在37℃下在5％CO2中孵育且在4天之后，可将具有3000IU/mL IL-2的150mL AIM-V添加至各G-Rex 100培养瓶中。细胞可在培养的第14天收集。
在一个实施方案中，第二次扩增(包括称为REP的扩增)在培养瓶中进行，其中在150mL培养基中将主体TIL与100倍或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2混合。在一些实施方案中，更换培养基直至细胞转移至替代生长箱室。在一些实施方案中，通过抽吸用新鲜培养基更换2/3的培养基。在一些实施方案中，替代生长箱室包括G-REX培养瓶和透气容器，如下文更充分讨论。
在一个实施方案中，进行第二次扩增(包括称为REP的扩增)，其进一步包括其中选择具有优异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开第2016/0010058A1号(其公开内容以引用的方式并入本文)中所描述的方法可用于选择具有优异肿瘤反应性的TIL。
可选地，可在第二次扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后使用本领域中已知的标准测定来进行细胞存活率测定。例如，可在主体TIL样本上进行台盼蓝排除测定，其选择性标记死细胞且允许存活率评估。在一些实施方案中，TIL样本可使用Cellometer K2自动化细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯市的Nexcelom Bioscience)计算和确定存活率。在一些实施方案中，存活率根据标准Cellometer K2 Image Cytometer自动化细胞计数器方案确定。
在一些实施方案中，TIL的第二次扩增(包括称为REP的扩增)可使用如先前所述的T-175培养瓶和透气袋(Tran KQ、Zhou J、Durflinger KH等人，2008，《免疫疗法杂志》，31:742-751，和Dudley ME，Wunderlich JR，Shelton TE等人2003，《免疫疗法杂志》26:332-342)或透气的G-Rex培养瓶进行。在一些实施方案中，使用培养瓶进行第二次扩增。在一些实施方案中，使用透气的G-Rex培养瓶进行第二次扩增。在一些实施方案中，在T-175培养瓶中进行第二次扩增，将约1×106个TIL悬浮于约150mL培养基中并将其添加至各T-175培养瓶中。将TIL与作为“饲养”细胞的经辐照(50Gy)的同种异体PBMC以1：100的比率一起培养，细胞在补充有3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3的CM与AIM-V培养基的1：1混合物(50/50培养基)中培养。将T-175培养瓶在37℃下在5％CO2中孵育。在一些实施方案中，在第5天使用具有3000IU/mL IL-2的50/50培养基更换一半培养基。在一些实施方案中，在第7天，将来自2个T-175培养瓶的细胞在3L袋中合并且将具有5％人类AB血清和3000IU/mL IL-2的300mLAIM-V添加至300mL TIL悬浮液中。可每天或每两天对各袋中的细胞数目进行计数，可添加新鲜培养基以保持细胞计数在约0.5与约2.0×106个细胞/毫升之间。
在一些实施方案中，在具有100cm2透气硅底的500mL容量培养瓶(G-Rex100，Wilson Wolf)中进行第二次扩增(包括称为REP的扩增)，将约5×106或10×106个TIL与经辐照的同种异体PBMC以1：100的比率在补充有3000IU/mL的IL-2和30ng/mL的抗CD3的400mL50/50培养基中一起培养。将G-Rex 100培养瓶在37℃下在5％CO2中孵育。在一些实施方案中，在第5天，取出250mL上清液并放入离心瓶中以1500rpm(491g)离心10分钟。随后可以用150mL含3000IU/mL IL-2的新鲜50/50培养基使TIL沉淀物再悬浮并添加回原来的G-Rex100培养瓶中。在TIL在G-Rex 100培养瓶中连续扩增的实施方案中，在第7天，使各G-Rex100中的TIL悬浮于各培养瓶中存在的300mL培养基中，且将细胞悬浮液分成三个用于接种3个G-Rex 100培养瓶的100mL等分试样。随后将150mL具有5％人类AB血清和3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至各培养瓶中。将G-Rex100培养瓶在37℃下于5％CO2中孵育且在4天之后，将150mL含3000IU/mL IL-2的AIM-V添加至各G-Rex 100培养瓶中。在培养的第14天收集细胞。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供一种用于产生表现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL表现出增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，在第二次扩增中获得的TIL表现出增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性增加。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自α、β、γ和δ受体的T细胞受体中的一种中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在一些实施方案中，第二次扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及如下文更详细讨论的抗原呈递饲养细胞(APC)。
在一些实施方案中，第二次扩增(例如根据图1的步骤D)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如G-Rex10或G-Rex 100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序(例如包括例如图1的步骤D中所述的扩增，以及称为REP的扩增)在REP TIL扩增期间和/或在第二次扩增期间需要过量饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞是从健康血液供体的标准全血单位中获得的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
通常，同种异体PBMC通过辐照或热处理灭活，并用于REP程序，如实施例中所述，其提供了用于评估经辐照同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施方案中，若第14天活细胞总数小于在REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。
在一些实施方案中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，若在OKT3和IL-2存在下培养的第7天和第14天的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在5至60ng/mL OKT3抗体和1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在10至50ng/mL OKT3抗体和2000至5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在20至40ng/mL OKT3抗体和2000至4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在25至35ng/mL OKT3抗体和2500至3500IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：300或约1：500。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率在1：50与1：300之间。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率在1：100与1：200之间。
在一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在另一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在另一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约2.5×109个饲养细胞至约25×106个TIL。
在一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序在第二次扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞是从健康血液供体的标准全血单位中获得的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一个实施方案中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
通常，同种异体PBMC通过辐照或热处理灭活，且用于本文所描述的TIL扩增程序，包括附图和实施例中所描述的示例性程序。
在一个实施方案中，aAPC在第二次扩增中用作PBMC的替代物或与PBMC组合使用。
在一个实施方案中，Gen 2过程的第二次扩增中所用的抗原呈递细胞为单核细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为B细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为B细胞类淋巴母细胞或B类淋巴母细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为伯基特氏淋巴瘤细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为骨髓谱系细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为单核细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为HLA-A-02阳性单核细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为M5亚型急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Ramos细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为黑色素细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为HLA-A-02阳性黑色素细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为HLA-A-02阳性黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞选自下组：Sk-MEL-5、Malme-3M、SK-MEL-28、SK-MEL-3、SH-4、SK-MEL-24、RPMI-7951、SK-MEL-1、A375、G-361以及它们的组合，或其衍生物、变体、修饰物或后代。在任何前述实施方案中，抗原呈递细胞可如本文中别处所描述经辐照或未经辐照。
在一个实施方案中，aAPC用于Gen 2过程的第二次扩增。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的单核细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的B细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的B细胞类淋巴母细胞或B类淋巴母细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的伯基特氏淋巴瘤细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的骨髓谱系细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的单核细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的HLA-A-02阳性单核细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的M5亚型急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Ramos细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的黑色素细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的HLA-A-02阳性黑色素细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的HLA-A-02阳性黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，aAPC选自下组的经基因修饰的抗原呈递细胞：Sk-MEL-5、Malme-3M、SK-MEL-28、SK-MEL-3、SH-4、SK-MEL-24、RPMI-7951、SK-MEL-1、A375、G-361以及它们的组合，或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，经基因修饰的细胞经修饰以表达CD86、OX40L、4-1BBL、OX-40激动性抗体(agonistic antibody)、4-1BB激动性抗体、能够结合OKT-3的Fc链的抗体和/或ICOS-L，如美国专利第10,415,015号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。在任何前述实施方案中，经基因修饰的aAPC可如本文中别处所描述的经辐照或未经辐照。
2.细胞因子
本文所描述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，也可以使用细胞因子组合进行TIL的快速扩增和/或第二次扩增，其中IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合描述于美国专利申请公开第2017/0107490A1号和国际专利申请公开第WO 2015/189357号中，这些专利中的每一种以全文引用的方式明确并入本文中。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如本文所描述的T细胞。
E.步骤E：收集TIL
在第二次扩增步骤之后，可收集细胞。在一些实施方案中，在例如如图1中所提供的一个、两个、三个、四个或更多个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施方案中，在例如如图1中所提供的两个扩增步骤之后收集TIL。
TIL可以任何适当且无菌的方式收集，包括例如离心。收集TIL的方法为本领域中熟知的且任何此类已知方法均可与本发明过程一起使用。在一些实施方案中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如费森尤斯卡比(Fresenius Kabi)、Tomtec Life Science、珀金埃尔默(Perkin Elmer)和InotechBiosystems International，Inc.。本发明方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施方案中，细胞收集器和/或细胞处理系统为基于膜的细胞收集器。在一些实施方案中，细胞收集通过细胞处理系统，例如LOVO系统(由费森尤斯卡比制造)进行。术语”LOVO细胞处理系统“也指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包含细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动和细胞处理以移除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施方案中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施方案中，收集，例如根据图1的步骤E，在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如G-Rex 10或G-Rex100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。
在一些实施方案中，根据图1的步骤E根据实施例14中描述的过程进行。在一些实施方案中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施方案中，采用如实施例14中所描述的密闭系统。
在一些实施方案中，根据实施例14中所描述的方法收集TIL。在一些实施方案中，使用如本文所描述的方法(在实施例14中称作第11天TIL收集)收集第1天与第11天之间的TIL。在一些实施方案中，使用如本文所描述的方法(在实施例14中称作第22天TIL收集)收集第12天与第22天之间的TIL。
F.步骤F：扩增的TIL的测定
在一些实施方案中，使用本文所描述的测定方法之一检查来自上文提供的步骤的扩增的TIL的效力和/或功能。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定如本文所描述的Gen 2TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与Gen 2TIL产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)Gen 2TIL产物上一种以上标记物的表达或(2)Gen 2TIL产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定Gen 2TIL产物的效力。
或者，在一些实施方案中，使用组合测定来分析扩增的TIL，该组合测定包括基于CD3或CD3/CD28微珠的刺激以及对至少两种分析物的ELISA或自动ELISA(例如，ELLA)检测，该至少两种分析物选自IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素和TNF-α。在一个实施方案中，此类组合测定的规格为：对于至少两种所选择的分析物为至少500pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少600pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少700pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少800pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少900pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少1000pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少1100pg/mL；或对于至少两种所选择的分析物为至少1200pg/mL；其中每毫升测试物含有1×105个TIL、2×105个TIL、3×105个TIL、4×105个TIL、5×105个TIL、6×105个TIL、7×105个TIL、8×105个TIL、9×105个TIL或10×105个TIL。
G.步骤G：最终调配并转移至输注容器
在完成如图1中以示例性顺序提供的步骤A至E以及如上文和本文中所概述的步骤F之后，将细胞转移至容器以用于向患者施用。在一些实施方案中，一旦使用上文所描述的扩增方法获得治疗上足够数量的TIL，则将其转移至容器(可包括输注袋或无菌小瓶)中以用于以药物组合物(包括本文所描述的药物组合物)的形式向患者施用。可在转移到这样的容器之后评估TIL的效力，这可以在转移后立即进行或在容器储存一段时间后进行，例如用于稳定性测试。
在一个实施方案中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施方案中，T细胞以单次动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
V.Gen 3TIL制造工艺
在不受任何特定理论限制的情况下，据认为如本发明方法中所描述的启动T细胞活化的初始第一次扩增和随后的加强T细胞活化的快速第二次扩增，允许制备保留“较年轻”表型的扩增的T细胞，因此预期本发明的扩增的T细胞相较于通过其他方法扩增的T细胞可对癌细胞显示更高的细胞毒性。特别地，据认为如本发明方法所教导的通过暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)、IL-2和可选的抗原呈递细胞(APC)来启动T细胞的活化，然后通过后续暴露于另外的抗CD-3抗体(例如OKT-3)、IL-2和APC来加强，其限制或避免培养基中的T细胞的成熟，从而产生具有较不成熟表型的T细胞群，这些T细胞因培养扩增而耗竭较少且对癌细胞显示更高的细胞毒性。示例性过程显示于图8中。在一些实施方案中，快速第二次扩增的步骤分为多个步骤以通过以下实现培养规模纵向扩大(scaling up)：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二次扩增；然后(b)实现将小规模培养中的T细胞转移至比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)，在第二容器中的更大规模培养中培养来自小规模培养的T细胞约4天至7天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大(scaling out)：(a)通过在第一容器(例如G-Rex100MCS容器)中的第一小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二次扩增；然后(b)将来自第一小规模培养的T细胞转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个大小与第一容器等同的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的T细胞部分在第二小规模培养中培养约4天至7天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约3天至4天的时间段来进行快速第二次扩增；然后(b)将来自小规模培养中的T细胞转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的T细胞部分在更大规模培养中培养约4天至7天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养T细胞约4天的时间段来进行快速第二次扩增；然后(b)将来自小规模培养中的T细胞转移并分配至2、3或4个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，将转移至此类第二容器的来自小规模培养的T细胞部分在更大规模培养中培养约5天的时间段。
在一些实施方案中，快速第二次扩增在通过初始第一次扩增所实现的T细胞活化开始降低、趋缓、衰退或消退之后进行。
在一些情况下，快速第二次扩增在通过初始第一次扩增实现的T细胞活化已降低(约)(at or about)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％之后进行。
在一些实施方案中，快速第二次扩增在通过初始第一次扩增所实现的T细胞活化已降低(约)1％至100％的范围中的百分比之后进行。
在一些实施方案中，快速第二次扩增在通过初始第一次扩增实现的T细胞活化已降低(约)1％至10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％或90％至100％的范围中的百分比之后进行。
在一些实施方案中，快速第二次扩增在通过初始第一次扩增实现的T细胞活化已降低至少或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％之后进行。
在一些情况下，快速第二次扩增在通过初始第一次扩增实现的T细胞活化已降低(约)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％之后进行。
在一些实施方案中，通过初始第一次扩增实现的T细胞活化的降低通过T细胞响应于抗原刺激而释放的干扰素γ的量的减少来确定。
在一些实施方案中，T细胞的初始第一次扩增在至多(约)7天或大约8天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的初始第一次扩增在至多(约)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的初始第一次扩增在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的快速第二次扩增在至多(约)11天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的快速第二次扩增在至多(约)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的快速第二次扩增在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的初始第一次扩增在(约)1天至(约)7天的时间段内进行，T细胞的快速第二次扩增在(约)1天至(约)11天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的初始第一次扩增在至多(约)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天的时间段内进行，T细胞的快速第二次扩增在至多(约)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的初始第一次扩增在(约)1天至(约)8天的时间段内进行，T细胞的快速第二次扩增在(约)1天至(约)9天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的初始第一次扩增在8天的时间段内进行，T细胞的快速第二次扩增在9天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的初始第一次扩增在(约)1天至处于或约7天的时间段内进行，T细胞的快速第二次扩增在处于或约1天至处于或约9天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞的初始第一次扩增在7天的时间段内进行，T细胞的快速第二次扩增在9天的时间段内进行。
在一些实施方案中，T细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在一些实施方案中，T细胞为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
在一些实施方案中，T细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。
在一些实施方案中，T细胞获自患癌症的供体。
在一些实施方案中，T细胞是从患癌症的患者切除的肿瘤获得的TIL。
在一些实施方案中，T细胞是从患黑色素瘤的患者切除的肿瘤获得的TIL。
在一些实施方案中，T细胞是从患血液系统恶性肿瘤的患者的骨髓获得的MIL。
在一些实施方案中，T细胞是从供体的外周血单核细胞(PBMC)获得的PBL。在一些实施方案中，供体患癌症。在一些实施方案中，癌症选自下组：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症选自下组：黑色素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，供体患肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为液体肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为实体肿瘤。在一些实施方案中，供体患血液系统恶性肿瘤。
在本发明的某些方面，免疫效应细胞(例如T细胞)可使用本领域技术人员已知的任何数目的技术(例如FICOLL分离)自收集自受试者的血液单元获得。在一个优选方面，通过单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他成核白细胞、红细胞和血小板。在一个方面，通过单采术收集的细胞可经洗涤以移除血浆级分，可选地，将细胞置于适当缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一个实施方案中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在一替代实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，可能缺乏镁或可能缺乏许多(若并非全部)二价阳离子。在一个方面，通过溶解红细胞和例如通过PERCOLL梯度离心或通过逆流离心淘析耗竭单核细胞，自外周血淋巴细胞分离T细胞。
在一些实施方案中，T细胞为自供体的全血或富含淋巴细胞的单采术产物分离的PBL。在一些实施方案中，供体患癌症。在一些实施方案中，癌症选自下组：黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，癌症选自下组：黑色素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，供体患肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为液体肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤为实体肿瘤。在一些实施方案中，供体患血液系统恶性肿瘤。在一些实施方案中，PBL通过使用正向或负向选择方法而自全血或富含淋巴细胞的单采产物分离，即使用T细胞表型标记物(例如CD3+CD45+)移除PBL，或移除非T细胞表型细胞而留下PBL。在其他实施方案中，PBL通过梯度离心分离。在自供体组织分离PBL后，PBL的初始第一次扩增可根据本文所描述的任何方法的初始第一次扩增步骤，通过将适合数目的经分离PBL(在一些实施方案中，约1×107个PBL)接种在初始第一次扩增培养物中来开始。
含有一些这些特征的称为过程3(在本文中也称为Gen 3)的示例性TIL过程描绘于图8(特别是例如图8B和/或图8C)中，本发明的此实施方案相对于过程2A的一些优势描述于图1、图2、图8、图30和图31(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中。过程3(Gen3)的实施方案显示于图8和图30(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中。过程2A或Gen 2描述于美国专利公开第2018/0280436号中，其以全文引用的方式并入本文中。Gen 3过程也描述于国际专利公开WO 2020/096988中。
如本文中所讨论和大体上概述，TIL取自患者样本，并且使用本文所描述且称为Gen 3的TIL扩增过程操作以在移植至患者中之前扩增其数目。在一些实施方案中，TIL可可选地如下文所讨论经基因操作。在一些实施方案中，TIL可在扩增之前或之后冷冻保存。解冻后，其也可经再刺激以在输注至患者中之前增加其代谢。
在一些实施方案中，初始第一次扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤B的过程)缩短为1至8天，快速第二次扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图1(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤D的过程)缩短为1至9天，如以下和实施例和附图中所详细讨论。在一些实施方案中，初始第一次扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤B的过程)缩短为1至8天，快速第二次扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤D的过程)缩短为1至8天，如以下和实施例和附图中所详细讨论。在一些实施方案中，初始第一次扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤B的过程)缩短为1至7天，快速第二次扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤D的过程)缩短为1至9天，如以下和实施例和附图中所详细讨论。在一些实施方案中，初始第一次扩增(包括本文中称为预快速扩增(预REP)的过程，以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤B的过程)缩短为1至7天，快速第二次扩增(包括在本文中称为快速扩增方案(REP)的过程以及图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中示为步骤D的过程)为1至10天，如以下和实施例和附图中所详细讨论。在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短为8天，快速第二次扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为7天至9天。在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为8天，快速第二次扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为8天至9天。在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短为7天，快速第二次扩增(例如，如图1(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为7天至8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短为8天，快速第二次扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为8天，快速第二次扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为9天。在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为8天，快速第二次扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为10天。在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为7天，快速第二次扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为7天至10天。在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为7天，快速第二次扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为8天至10天。在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)为7天，快速第二次扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为9天至10天。在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如，图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B的扩增)缩短为7天，快速第二次扩增(例如，如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的步骤D中所描述的扩增)为7天至9天。在一些实施方案中，初始第一次扩增和快速第二次扩增(例如，在图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中描述为步骤B和步骤D的扩增)的组合为14天至16天，如以下和实施例和附图中所详细讨论。特定地，认为本发明的某些实施方案包括初始第一次扩增步骤，其中TIL通过在IL-2存在下暴露于抗CD3抗体(例如OKT-3)或在至少IL-2和抗CD3抗体(例如OKT-3)存在下暴露于抗原而活化。在某些实施方案中，在如上文所描述的初始第一次扩增步骤中活化的TIL为第一TIL群，即，其为初代细胞群。
以下的”步骤“标识A、B、C等参考图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的非限制性实例且参考本文所描述的某些非限制性实施方案。以下和图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D{2)中的步骤顺序为示例性的，本申请和本文中所公开的方法涵盖步骤的任何组合或顺序，以及另外的步骤、步骤重复和/或步骤省略。
A.步骤A：获得患者肿瘤样本
通常，TIL最初获自患者肿瘤样本(“初代TIL”)或获自循环淋巴细胞，例如外周血淋巴细胞，包括具有TIL样特征的外周血淋巴细胞，然后将其扩增成较大群以进行如本文中所描述的进一步操作，可选地经冷冻保存，且可选地评估表型和作为TIL健康指标的代谢参数。
患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，通常通过手术切除、穿刺活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的手段获得。通常，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可为液体肿瘤，例如获自血液系统恶性肿瘤的肿瘤。实体肿瘤可为任何癌症类型，包括但不限于皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施方案中，癌症为黑色素瘤。在一些实施方案中，适用的TIL获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为报告指出这些肿瘤具有特别高水平的TIL。
一旦获得，肿瘤样本通常使用锐器分割破碎成1mm3至约8mm3之间的小块，其中约2mm3至3mm3为尤其适用的。TIL自这些碎片使用酶促肿瘤消化物培养。此类肿瘤消化物可通过在酶培养基(例如罗斯威尔公园癌症研究所(Roswell Park Memorial Institute；RPMI)1640缓冲液、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30单位/毫升的DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，接着(例如使用组织解离器)进行机械解离来产生。肿瘤消化物可通过以下产生：将肿瘤置于酶培养基中且机械解离肿瘤大约1分钟，随后在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，随后在前述条件下重复机械解离和孵育循环，直至仅存在小组织块。在此过程结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用FICOLL支链亲水性多糖的密度梯度分离以移除这些细胞。可使用本领域中已知的替代方法，例如美国专利申请公开第2012/0244133A1号中所描述的方法，该公开的公开内容以引用的方式并入本文中。任何前述方法可用于本文所描述的任何实施方案中扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
肿瘤解离酶混合物可包括一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何胶原蛋白酶的混合物或类型)、AccutaseTM、AccumaxTM、透明质酸酶(hyaluronidase)、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain)、胰蛋白酶(trypsin)、酪蛋白酶(caseinase)、弹性蛋白酶(elastase)、木瓜蛋白酶(papain)、XIV型蛋白酶(链霉蛋白酶(pronase))、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，解离酶由冻干酶重构。在一些实施方案中，冻干酶在一定量的无菌缓冲液(例如HBSS)中重构。
在一些情况下，胶原蛋白酶(例如无动物源1型胶原蛋白酶)在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度可为每小瓶2892PZ U。在一些实施方案中，胶原蛋白酶在5mL至15mL缓冲液中重构。在一些实施方案中，在重构后，胶原蛋白酶储备液的范围为约100PZ U/mL至约400PZ U/mL，例如，约100PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL至约350PZ U/mL、约100PZ U/mL至约300PZ U/mL、约150PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZ U/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZU/mL、约250PZ U/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZ U/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施方案中，中性蛋白酶在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度可为每小瓶175DMC U。冻干储备酶的浓度可为175DMC/mL。在一些实施方案中，在重构后，中性蛋白酶储备液的范围为约100DMC/mL至约400DMC/mL，例如约100DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL至约350DMC/mL、约100DMC/mL至约300DMC/mL、约150DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施方案中，DNA酶I在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施方案中，在重构后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施方案中，酶储备溶液会发生变化，因此请验证冻干储备溶液的浓度，并相应地修改添加至消化混合物中的酶的最终量。
在一些实施方案中，酶混合物包含约4.7mL无菌HBSS中的约10.2μl中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μl胶原蛋白酶(1.2PZ/mL)和250μl DNA酶I(200U/mL)。
如上文所指出，在一些实施方案中，TIL来源于实体肿瘤。在一些实施方案中，实体肿瘤未经破碎。在一些实施方案中，实体肿瘤未经破碎且以整个肿瘤进行酶促消化。在一些实施方案中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化。在一些实施方案中，肿瘤在包含胶原蛋白酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施方案中，肿瘤在37℃、5％CO2下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施方案中，肿瘤在37℃、5％CO2、旋转下在包含胶原蛋白酶、DNA酶和透明质酸酶的酶混合物中消化1至2小时。在一些实施方案中，肿瘤在恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，肿瘤在37℃、5％CO2、恒定旋转下消化过夜。在一些实施方案中，整个肿瘤与酶组合以形成肿瘤消化反应混合物。
在一些实施方案中，在无菌缓冲液中用冻干酶重构肿瘤。在一些实施方案中，缓冲液为无菌HBSS。
在一些实施方案中，酶混合物包含胶原蛋白酶。在一些实施方案中，胶原蛋白酶为胶原蛋白酶IV。在一些实施方案中，胶原蛋白酶的工作储备液为100mg/mL 10×工作储备液。
在一些实施方案中，酶混合物包含DNA酶。在一些实施方案中，DNA酶的工作储备液为10,000IU/mL 10×工作储备液。
在一些实施方案中，酶混合物包含透明质酸酶。在一些实施方案中，透明质酸酶的工作储备液为10mg/mL 10×工作储备液。
在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、1000IU/mL DNA酶和1mg/mL透明质酸酶。
在一些实施方案中，酶混合物包含10mg/mL胶原蛋白酶、500IU/mL DNA酶和1mg/mL透明质酸酶。
通常，获自肿瘤的细胞悬浮液称为“初代细胞群”或“新鲜获得的”或“新鲜分离的”细胞群。在某些实施方案中，新鲜获得的TIL细胞群暴露于包含抗原呈递细胞、IL-12和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方案中，破碎包括物理破碎，包括例如分割以及消化。在一些实施方案中，破碎为物理破碎。在一些实施方案中，破碎为分割。在一些实施方案中，通过消化进行破碎。在一些实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶促肿瘤消化物和肿瘤碎片培养。在一个实施方案中，TIL最初可从获自患者的酶促肿瘤消化物和肿瘤碎片培养。
在一些实施方案中，当肿瘤为实体肿瘤时，在例如步骤A(如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所提供)中获得肿瘤样本之后，对肿瘤进行物理破碎。在一些实施方案中，破碎发生在冷冻保存之前。在一些实施方案中，破碎发生在冷冻保存之后。在一些实施方案中，破碎在获得肿瘤之后并且在不进行任何冷冻保存的情况下发生。在一些实施方案中，破碎步骤是体外或离体过程。在一些实施方案中，将肿瘤破碎且将10、20、30、40或更多个碎片或块置于各容器中进行初始第一次扩增。在一些实施方案中，将肿瘤破碎且将30或40个碎片或块置于各容器中进行初始第一次扩增。在一些实施方案中，将肿瘤破碎且将40个碎片或块置于各容器中进行初始第一次扩增。在一些实施方案中，多个碎片包括约4个至约50个碎片，其中各碎片的体积为约27mm3。在一些实施方案中，多个碎片包括约30个至约60个碎片，其总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方案中，多个碎片包括约50个碎片，其总体积为约1350mm3。在一些实施方案中，多个碎片包括约50个碎片，其总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方案中，多个碎片包括约4个碎片。
在一些实施方案中，TIL获自肿瘤碎片。在一些实施方案中，肿瘤碎片通过锐器分割获得。在一些实施方案中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤碎片在约1mm3与8mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约1mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约2mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约3mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约4mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约5mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约6mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约7mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约8mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约9mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为约10mm3。在一些实施方案中，肿瘤碎片为1至4mm×1至4mm×1至4mm。在一些实施方案中，肿瘤碎片为1mm×1mm×1mm。在一些实施方案中，肿瘤碎片为2mm×2mm×2mm。在一些实施方案中，肿瘤碎片为3mm×3mm×3mm。在一些实施方案中，肿瘤碎片为4mm×4mm×4mm。
在一些实施方案中，肿瘤经破碎以使各块上出血性、坏死和/或脂肪组织的量减至最小。在一些实施方案中，肿瘤经破碎以使各块上出血性组织的量减至最小。在一些实施方案中，肿瘤经破碎以使各块上坏死组织的量减至最小。在一些实施方案中，肿瘤经破碎以使各块上脂肪组织的量减至最小。在某些实施方案中，肿瘤破碎步骤是体外或离体方法。
在一些实施方案中，进行肿瘤破碎以便维持肿瘤内部结构。在一些实施方案中，在不使用解剖刀进行锯切动作的情况下进行肿瘤破碎。在一些实施方案中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离大约1分钟。随后可将溶液在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，然后再次机械破坏大约1分钟。在37℃下在5％CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏大约1分钟。在一些实施方案中，在第三次机械破坏后若大块组织仍存在，则对样本应用1或2次另外的机械解离，不论是否再在37℃下在5％CO2中孵育30分钟。在一些实施方案中，在最终孵育结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用Ficoll的密度梯度分离以移除这些细胞。
在一些实施方案中，将初始第一次扩增步骤之前的细胞悬浮液称为”初代细胞群”或”新鲜获得的“或”新鲜分离的“细胞群。
在一些实施方案中，细胞可可选地在样本分离之后(例如在获得肿瘤样本后和/或在由肿瘤样本获得细胞悬浮液后)冷冻，且在进入步骤B中所描述的扩增之前冷冻储存，该步骤B进一步详细描述于下文且例示于图8(特别是例如图8B)中。
1.来源于粗针/小型活检的TIL
在一些实施方案中，TIL最初获自通过核心活检或类似程序获得的患者肿瘤样本(”初代TIL“)且随后扩增成较大群以进行如本文所描述的进一步操作，可选地经冷冻保存，且可选地评估表型和代谢参数。
在一些实施方案中，患者肿瘤样本可使用本领域中已知的方法获得，通常通过小型活检、核心活检、穿刺活检或其他用于获得含有肿瘤和TIL细胞的混合物的样本的手段获得。通常，肿瘤样本可来自任何实体肿瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移性肿瘤。肿瘤样本也可为液体肿瘤，例如获自血液系统恶性肿瘤的肿瘤。在一些实施方案中，样本可来自多个小肿瘤样本或活检体。在一些实施方案中，样本可包括来自同一患者的单一肿瘤的多个肿瘤样本。在一些实施方案中，样本可包括来自同一患者的一个、两个、三个或四个肿瘤的多个肿瘤样本。在一些实施方案中，样本可包括来自同一患者的多个肿瘤的多个肿瘤样本。实体肿瘤是黑色素瘤。
通常，获自肿瘤核心或碎片的细胞悬浮液称为“初代细胞群”或“新鲜获得的”或“新鲜分离”的细胞群。在某些实施方案中，新鲜获得的TIL细胞群暴露于包含抗原呈递细胞、IL-2和OKT-3的细胞培养基。
在一些实施方案中，若肿瘤为转移性肿瘤且在过去已有效治疗/移除原发性病灶，则可能需要移除一个转移性病灶。在一些实施方案中，若可用，侵入性最小的方法是移除皮肤病灶或颈部或腋窝区域上的淋巴结。在一些实施方案中，移除皮肤病灶或移除其小型活检。在一些实施方案中，移除淋巴结或其小型活检。在一些实施方案中，肿瘤为黑色素瘤。在一些实施方案中，黑色素瘤的小型活检体包括痣或其一部分。
在一些实施方案中，小型活检为穿刺活检。在一些实施方案中，通过将圆形刀片压入皮肤来获得穿刺活检。在一些实施方案中，通过将圆形刀片压入可疑痣周围的皮肤来获得穿刺活检。在一些实施方案中，通过将圆形刀片压入皮肤来获得穿刺活检，并且移除一块圆形皮肤。在一些实施方案中，小型活检为穿刺活检且移除圆形部分的肿瘤。
在一些实施方案中，小型活检为切除式活检。在一些实施方案中，小型活检为切除式活检且移除整个痣或生长物。在一些实施方案中，小型活检为切除式活检并且整个痣或生长物连同正常外观皮肤的小边界一起被去除。
在一些实施方案中，小型活检为切开式活检。在一些实施方案中，小型活检为切开式活检且仅采集痣或生长物的最不规则部分。在一些实施方案中，小型活检为切开式活检，且该切开式活检在其他技术无法完成时使用，例如当可疑痣非常大时使用。
术语”实体肿瘤“是指通常不含囊肿或液体区域的异常组织团块。实体肿瘤可为良性或恶性的。术语”实体肿瘤癌症“是指恶性、赘生性或癌性实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症为黑色素瘤。实体肿瘤的组织结构包括相互依赖的组织区室，包括实质(癌细胞)和有癌细胞分散其中且可提供支持性微环境的支持性基质细胞。
在一些实施方案中，来自肿瘤的样本以细针抽吸物(FNA)、核心活检、小型活检(包括例如穿刺活检)形式获得。在一些实施方案中，首先将样本置于G-Rex 10中。在一些实施方案中，当有1个或2个核心活检和/或小型活检样本时，首先将样本置于G-Rex10中。在一些实施方案中，当有3个、4个、5个、6个、8个、9个或10个或更多个核心活检和/或小型活检样本时，首先将样本置于G-Rex 100中。在一些实施方案中，当有3个、4个、5个、6个、8个、9个或10个或更多个核心活检和/或小型活检样本时，首先将样本置于G-Rex 500中。
FNA可获自皮肤肿瘤，包括例如黑色素瘤。在一些情况下，黑色素瘤患者先前已经受手术治疗。
本文所描述的TIL可获自FNA样本。在一些情况下，使用范围从18号针头到25号针头的细规格针头从患者获取或分离FNA样本。细号规针头可为18号、19号、20号、21号、22号、23号、24号或25号。在一些实施方案中，来自患者的FNA样本可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。
在一些情况下，本文所描述的TIL获自核心活检样本。在一些情况下，使用范围从11号针头到16号针头的外科或医用针头从患者获得或分离核心活检样本。针头可为11号、12号、13号、14号、15号或16号。在一些实施方案中，来自患者的核心活检样本可含有至少400,000个TIL，例如400,000个TIL、450,000个TIL、500,000个TIL、550,000个TIL、600,000个TIL、650,000个TIL、700,000个TIL、750,000个TIL、800,000个TIL、850,000个TIL、900,000个TIL、950,000个TIL或更多。
通常，经收集的细胞悬浮液被称为“初代细胞群”或“新鲜收集的”细胞群。
在一些实施方案中，TIL并非获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，实体肿瘤核心未经破碎。
在一些实施方案中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在将肿瘤置于酶培养基中之后，可以机械方式将肿瘤解离大约1分钟。随后可将溶液在37℃下在5％CO2中孵育30分钟，然后再次机械破坏大约1分钟。在37℃下在5％CO2中再孵育30分钟之后，可将肿瘤第三次机械破坏大约1分钟。在一些实施方案中，在第三次机械破坏后若大块组织仍存在，则对样本应用1或2次另外的机械解离，不论是否再在37℃下在5％CO2中孵育30分钟。在一些实施方案中，在最终孵育结束时，若细胞悬浮液含有大量红细胞或死细胞，则可进行使用Ficoll的密度梯度分离以移除这些细胞。
在一些实施方案中，获得第一TIL群包括多病灶取样方法。
肿瘤解离酶混合物可包含一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何胶原蛋白酶的混合物或类型)、AccutaseTM、AccumaxTM、透明质酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、XIV型蛋白酶(链霉蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，解离酶由冻干酶重构。在一些实施方案中，冻干酶在一定量的无菌缓冲液(例如HBSS)中重构。
在一些情况下，胶原蛋白酶(例如无动物源1型胶原蛋白酶)在10mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度可为每小瓶2892PZ U。在一些实施方案中，胶原蛋白酶在5mL至15mL缓冲液中重构。在一些实施方案中，在重构后，胶原蛋白酶储备液的范围为约100PZ U/mL至约400PZ U/mL，例如，约100PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL至约350PZ U/mL、约100PZ U/mL至约300PZ U/mL、约150PZ U/mL至约400PZ U/mL、约100PZ U/mL、约150PZ U/mL、约200PZ U/mL、约210PZ U/mL、约220PZ U/mL、约230PZ U/mL、约240PZU/mL、约250PZ U/mL、约260PZ U/mL、约270PZ U/mL、约280PZ U/mL、约289.2PZ U/mL、约300PZ U/mL、约350PZ U/mL或约400PZ U/mL。
在一些实施方案中，中性蛋白酶在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度可为每小瓶175DMC U。冻干储备酶的浓度可为175DMC/mL。在一些实施方案中，在重构后，中性蛋白酶储备液的范围为约100DMC/mL至约400DMC/mL，例如，约100DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL至约350DMC/mL、约100DMC/mL至约300DMC/mL、约150DMC/mL至约400DMC/mL、约100DMC/mL、约110DMC/mL、约120DMC/mL、约130DMC/mL、约140DMC/mL、约150DMC/mL、约160DMC/mL、约170DMC/mL、约175DMC/mL、约180DMC/mL、约190DMC/mL、约200DMC/mL、约250DMC/mL、约300DMC/mL、约350DMC/mL或约400DMC/mL。
在一些实施方案中，DNA酶I在1mL无菌HBSS或另一缓冲液中重构。冻干储备酶的浓度为每小瓶4KU。在一些实施方案中，在重构后，DNA酶I储备液的范围为约1KU/mL至10KU/mL，例如约1KU/mL、约2KU/mL、约3KU/mL、约4KU/mL、约5KU/mL、约6KU/mL、约7KU/mL、约8KU/mL、约9KU/mL或约10KU/mL。
在一些实施方案中，酶储备溶液会发生变化，因此请验证冻干储备溶液的浓度，并相应地修改添加至消化混合物中的酶的最终量。
在一些实施方案中，酶混合物包含约4.7mL无菌HBSS中的约10.2μl中性蛋白酶(0.36DMC U/mL)、21.3μl胶原蛋白酶(1.2PZ/mL)和250μl DNA酶I(200U/mL)。
2.胸腔积液TIL
在一些实施方案中，样本为胸膜液样本。在一些实施方案中，用于根据本文所描述的过程的扩增的TIL的来源为胸膜液样本。在一些实施方案中，样本为源于胸腔积液的样本。在一些实施方案中，根据本文所描述的过程的用于扩增的TIL的来源为源于胸腔积液的样本。参见例如美国专利公开US2014/0295426中所描述的方法，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可以采用疑似和/或含有TIL的任何胸膜液或胸腔积液。此类样本可来源于原发性或转移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。在一些实施方案中，样本可为来源于另一器官(例如乳房、卵巢、结肠或前列腺)的继发转移性癌细胞。在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法中的样本为胸膜渗出物(pleural exudate)。在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法中的样本为胸膜溢出物(pleural transudate)。其他生物样本可包括含有TIL的其他浆液，包括例如来自腹部的腹水液或胰囊肿液。腹水液和胸膜液涉及非常类似的化学系统；腹部和肺两者在相同的恶性肿瘤事件中于胸腔和腹腔中均具有间皮细胞株和流体形式，且在一些实施方案中，此类流体含有TIL。在本发明例示胸膜液的一些实施方案中，可以使用含有TIL的腹水或其他囊肿液进行相同的方法以得到类似结果。
在一些实施方案中，胸膜液呈未经处理的形式直接自患者移除。在一些实施方案中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准血液收集管(例如EDTA或肝素管)中。在一些实施方案中，在接触步骤之前，将未经处理的胸膜液置于标准管(Veridex)中。在一些实施方案中，在自患者收集之后立即将样本置于CellSave管中，以避免活TIL的数目减少。若保留在未经处理的胸膜液中，即使在4℃下，活TIL的数目可能在24小时内显著降低。在一些实施方案中，样本在自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。在一些实施方案中，样本在4℃下自患者移除之后1小时、5小时、10小时、15小时或至多24小时内置于适当收集管中。
在一些实施方案中，可以稀释来自所选受试者的胸膜液样本。在一个实施方案中，稀释度为1:10胸膜液比稀释剂。在另一个实施方案中，稀释度为1:9胸膜液比稀释剂。在另一个实施方案中，稀释度为1:8胸膜液比稀释剂。在另一个实施方案中，稀释度为1:5胸膜液比稀释剂。在另一个实施方案中，稀释度为1:2胸膜液比稀释剂。在另一个实施方案中，稀释度为1:1胸膜液比稀释剂。在一些实施方案中，稀释剂包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、另一缓冲液或生理学上可接受的稀释剂。在一些实施方案中，样本在自患者收集和稀释之后立即置于CellSave管中，以避免活TIL减少，若保留在未经处理的胸膜液中，则即使在4℃下，活TIL可能在24至48小时内显著减少。在一些实施方案中，胸膜液样本在自患者移除且稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。在一些实施方案中，胸膜液样本在自患者移除且在4℃下稀释之后1小时、5小时、10小时、15小时、24小时、36小时、至多48小时内置于适当收集管中。
在又一个实施方案中，在进一步的处理步骤之前，通过常规手段浓缩胸膜液样本。在一些实施方案中，在胸膜液必须冷冻保存以便运送至进行该方法的实验室或用于后续分析(例如，在收集后24至48小时之后)的情形下，对胸膜液进行预处理是优选的。在一些实施方案中，通过在将胸膜液样本自受试者中取出后将其离心并将离心液或沉淀物再悬浮于缓冲液中来制备胸膜液样本。在一些实施方案中，对胸膜液样本进行多次离心和再悬浮，随后将其冷冻保存以用于运输或以后的分析和/或处理。
在一些实施方案中，在进一步处理步骤之前，通过使用过滤方法浓缩胸膜液样本。在一些实施方案中，在接触步骤中使用的胸膜液样本通过将流体通过含有已知且基本均匀的孔径的过滤器过滤而制备，该孔径允许胸膜液通过膜但保留肿瘤细胞。在一些实施方案中，膜中的孔的直径可为至少4μM。在另一个实施方案中，孔径可为5μM以上，且在其他实施方案中，可为6μM、7μM、8μM、9μM或10μM中的任一种。过滤之后，可将被膜保留的细胞(包括TIL)自膜上冲出至合适的生理学上可接受的缓冲液中。然后可以将以此方式浓缩的细胞(包括TIL)用于该方法的接触步骤中。
在一些实施方案中，使胸膜液样本(包括例如未经处理的胸膜液)、经稀释的胸膜液或再悬浮的细胞沉淀物与溶解试剂接触，该溶解试剂差异性地溶解样本中存在的无核红细胞。在一些实施方案中，在胸膜液含有大量RBC的情形下，此步骤在进一步的处理步骤之前进行。合适的溶解试剂包括单一溶解试剂或溶解试剂和淬灭试剂，或溶解试剂、淬灭试剂和固定试剂。合适的溶解系统为市售的，包括BD Pharm LyseTM系统(碧迪医疗公司(BectonDickenson))。其他溶解系统包括VersalyseTM系统、FACSlyseTM系统(碧迪医疗公司)、ImmunoprepTM系统或Erythrolyse II系统(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter，Inc.))或氯化铵系统。在一些实施方案中，溶解试剂可随主要需求而变化，这些需求为红细胞的有效溶解和TIL的保守性和胸膜液中TIL的表型特性。除采用单一试剂用于溶解之外，适用于本文所描述的方法的溶解系统可包括第二试剂，例如在该方法的剩余步骤期间淬灭或延迟溶解试剂的作用的第二试剂，例如StabilyseTM试剂(贝克曼库尔特公司)。视溶解试剂的选择或该方法的优选实施而定，也可采用常规固定试剂。
在一些实施方案中，在约-140℃的温度下冷冻保存如上文所描述的未经处理、稀释或多次离心或处理的胸膜液样本，随后如本文所提供进行进一步处理和/或扩增。
3.扩增来自外周血的外周血淋巴细胞(PBL)的方法
PBL方法1。在本发明的一个实施方案中，PBL使用本文所描述的过程来扩增。在本发明的一个实施方案中，该方法包括获得来自全血的PBMC样本。在一个实施方案中，该方法包括通过使用非CD19+级分的负向选择以自PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。在一个实施方案中，该方法包括通过使用非CD19+级分的基于磁珠的负向选择以自PBMC中分离纯T细胞来富集T细胞。
在本发明的一个实施方案中，PBL方法1如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻且计算PBMC的数目。使用人类泛T细胞分离试剂盒与LS管柱(美天旎生物技术)分离T细胞。
PBL方法2。在本发明的一个实施方案中，PBL使用PBL方法2扩增，该方法包括获得来自全血的PBMC样本。通过在37℃下孵育PBMC至少三小时然后分离非贴壁细胞来富集来自PBMC的T细胞。
在本发明的一个实施方案中，PBL方法2如下进行：在第0天，将经冷冻保存的PMBC样本解冻，且将PBMC细胞以每孔6百万个细胞接种于CM-2培养基中的6孔板中并且在37℃下孵育3小时。3小时后，移除非贴壁细胞(其为PBL)并计算其数目。
PBL方法3。在本发明的一个实施方案中，PBL使用PBL方法3扩增，该方法包括获得来自外周血的PBMC样本。B细胞使用CD19+选择分离，T细胞使用负向选择PBMC样本的非CD19+级分来选择。
在本发明的一个实施方案中，PBL方法3如下进行：在第0天，将来源于外周血的冷冻保存的PBMC解冻并计算其数目。使用人CD19 Multisort试剂盒(美天旎生物技术)分选CD19+B细胞。在非CD19+细胞级分中，使用人类泛T细胞分离试剂盒和LS管柱(美天旎生物技术)纯化T细胞。
在一个实施方案中，PBMC自全血样本分离。在一个实施方案中，使用PBMC样本作为扩增PBL的起始物质。在一个实施方案中，样本在扩增过程之前经冷冻保存。在另一个实施方案中，使用新鲜样本作为扩增PBL的起始物质。在本发明的一个实施方案中，使用本领域中已知的方法自PBMC分离T细胞。在一个实施方案中，使用人类泛T细胞分离试剂盒和LS管柱分离T细胞。在本发明的一个实施方案中，使用本领域中已知的抗体选择方法(例如CD19负向选择)自PBMC分离T细胞。
在本发明的一个实施方案中，PBMC样本在有效鉴别非贴壁细胞的所需温度下孵育一段时间。在本发明的一个实施方案中，孵育时间为约3小时。在本发明的一个实施方案中，温度为约37℃。接着使用上述过程扩增非贴壁细胞。
在一些实施方案中，PBMC样本来自可选地，已经用包括激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施方案中，肿瘤样本来自已经用包括激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者。在一些实施方案中，PBMC样本来自已经用包括激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗的受试者或患者，其已进行治疗至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或1年或更长。在另一个实施方案中，PBMC来源于当前进行ITK抑制剂方案(例如伊布替尼(ibrutinib))的患者。
在一些实施方案中，PBMC样本来自已用包括激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗且难以用激酶抑制剂或ITK抑制剂(例如伊布替尼)治疗的受试者或患者。
在一些实施方案中，PBMC样本来自已经用包括激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗的受试者或患者。在一些实施方案中，PBMC样本来自已经用包括激酶抑制剂或ITK抑制剂的方案进行预治疗但不再进行激酶抑制剂或ITK抑制剂治疗并且尚未进行治疗达至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或至少1年或更长的受试者或患者。在另一个实施方案中，PBMC来源于先前暴露于ITK抑制剂但在至少3个月、至少6个月、至少9个月或至少1年内尚未经治疗的患者。
在本发明的一个实施方案中，在第0天，针对CD19+选择细胞且据此分选。在本发明的一个实施方案中，使用抗体结合微珠进行选择。在本发明的一个实施方案中，在第0天自PBMC分离纯T细胞。
在本发明的一个实施方案中，对于未经伊布替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，10mL至15mL血沉棕黄层将产生约5×109个PBMC，其又将产生约5.5×107个PBL。
在本发明的一个实施方案中，对于经伊布替尼或其他ITK抑制剂预治疗的患者，扩增过程将产生约20×109个PBL。在本发明的一个实施方案中，40.3×106个PBMC将产生约4.7×105个PBL。
在任何前述实施方案中，PBMC可来源于全血样本，通过单采术获得，来源于血沉棕黄层，或自本领域中已知用于获得PBMC的任何其他方法获得。
1.从骨髓来源的PBMC扩增骨髓浸润淋巴细胞(MIL)的方法
MIL方法3。在本发明的一个实施方案中，该方法包括获得来自骨髓的PBMC。在第0天，针对CD3+/CD33+/CD20+/CD14+选择PBMC并分选，对非CD3+/CD33+/CD20+/CD14+细胞级分进行超声处理且将一部分经超声处理的细胞级分添加回所选细胞级分中。
在本发明的一个实施方案中，MIL方法3如下进行：在第0天，将冷冻保存的PBMC样本解冻且计算PBMC的数目。将细胞用CD3、CD33、CD20和CD14抗体染色且使用S3e细胞分选器(Bio-Rad)分选。将细胞分选成两种级分：免疫细胞级分(MIL部分)(CD3+CD33+CD20+CD14+)和AML胚细胞级分(非CD3+CD33+CD20+CD14+)。
在本发明的一个实施方案中，PBMC获自骨髓。在一个实施方案中，PBMC通过单采术、抽吸、穿刺活检或本领域中已知的其他类似手段获自骨髓。在一个实施方案中，PBMC为新鲜的。在另一个实施方案中，PBMC经冷冻保存。
在本发明的一个实施方案中，MIL自10mL至50mL骨髓抽吸物扩增。在本发明的一个实施方案中，自患者获得10mL骨髓抽吸物。在另一个实施方案中，自患者获得20mL骨髓抽吸物。在另一个实施方案中，自患者获得30mL骨髓抽吸物。在另一个实施方案中，自患者获得40mL骨髓抽吸物。在另一个实施方案中，自患者获得50mL骨髓抽吸物。
在本发明的一个实施方案中，自约10mL至50mL骨髓抽吸物产生的PBMC的数目为约5×107至约10×107个PBMC。在另一个实施方案中，产生的PMBC的数目为约7×107个PBMC。
在本发明的一个实施方案中，约5×107至约10×107个PBMC产生约0.5×106至约1.5×106个MIL。在本发明的一个实施方案中，产生约1×106个MIL。
在本发明的一个实施方案中，来源于骨髓抽吸物的12×106个PBMC产生大约1.4×105个MIL。
在任何前述实施方案中，PBMC可来源于全血样本、骨髓、通过单采术获得，来源于血沉棕黄层，或自本领域中已知的用于获得PBMC的任何其他方法获得。
B.步骤B：初始第一次扩增
在一些实施方案中，本发明方法提供较年轻TIL，这些较年轻TIL相较于较老TIL(即，在向受试者/患者施用之前已进一步进行更多次复制的TIL)可能提供额外治疗益处。年轻TIL的特征已在文献中描述，例如Donia等人，《斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scandinavian Journal of Immunology)》，75:157-167(2012)；Dudley等人，《临床癌症研究(Clin Cancer Res)》，16:6122-6131(2010)；Huang等人，《免疫疗法杂志》，28(3):258-267(2005)；Besser等人，《临床癌症研究》，19(17):OF1-OF9(2013)；Besser等人，《免疫疗法杂志》32:415-423(2009)；Robbins等人，《免疫学杂志(J Immunol)》2004；173:7125-7130；Shen等人，《免疫疗法杂志》，30:123-129(2007)；Zhou等人，《免疫疗法杂志》，28:53-62(2005)；和Tran等人，《免疫疗法杂志》，31:742-751(2008)，其均以全文引用的方式并入本文中。
在例如图1(特别是例如图1B和/或图8C)的步骤A中所描述进行肿瘤碎片分割和/或肿瘤碎片消化之后，将所得细胞在含有IL-2、OKT-3和饲养细胞(例如抗原呈递饲养细胞)的血清中在相对于肿瘤和其他细胞有利于TIL生长的条件下培养。在一些实施方案中，IL-2、OKT-3和饲养细胞在培养开始时(例如在第0天)与肿瘤消化物和/或肿瘤碎片一起添加。在一些实施方案中，肿瘤消化物和/或肿瘤碎片以每容器至多60个碎片和6000IU/mL IL-2孵育于容器中。在一些实施方案中，将此初代细胞群培养数天的时间段，通常1至8天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，将此初代细胞群培养数天的时间段，通常1至7天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，初始第一次扩增进行1至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，初始第一次扩增进行1至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，此初始第一次扩增发生5至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，此初始第一次扩增发生5至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，此初始第一次扩增发生约6至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，此初始第一次扩增发生约6至7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，此初始第一次扩增发生约7至8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，此初始第一次扩增发生约7天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，此初始第一次扩增发生约8天的时间段，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。
在优选实施方案中，TIL的扩增可使用如下文和本文所描述的初始第一次扩增步骤(例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)的步骤B中所描述的那些步骤，其可包括称为预REP或初始REP的过程且其自第0天和/或自培养开始含有饲养细胞)进行，接着进行如下文步骤D和本文所描述的快速第二次扩增(步骤D，包括称为快速扩增方案(REP)步骤的过程)，随后可选地冷冻保存，然后进行如下文和本文所描述的第二步骤D(包括称为再刺激REP步骤的过程)。自此过程获得的TIL可可选地针对如本文所描述的表型特征和代谢参数进行表征。在一些实施方案中，肿瘤碎片在约1mm3与10mm3之间。
在一些实施方案中，第一次扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，步骤B的CM由补充有10％人类AB血清、25mM Hepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。
在一些实施方案中，有少于或等于240个肿瘤碎片。在一些实施方案中，有少于或等于240个肿瘤碎片被放入少于或等于4个容器中。在一些实施方案中，容器为G-Rex100MCS培养瓶。在一些实施方案中，少于或等于60个肿瘤碎片被放入1个容器中。在一些实施方案中，各容器包含每容器少于或等于500mL培养基。在一些实施方案中，培养基包含IL-2。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，培养基包含抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在一些实施方案中，培养基包含每容器2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含OKT-3。在一些实施方案中，培养基包含每容器30ng/mL OKT-3。在一些实施方案中，容器为G-Rex 100MCS培养瓶。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在制备肿瘤碎片之后，在含有IL-2、抗原呈递饲养细胞和OKT-3的培养基中，在相对于肿瘤和其他细胞有利于TIL生长并允许自第0天培养起始开始TIL启动和加速生长的条件下，培养所得细胞(即，为初代细胞群的碎片)。在一些实施方案中，肿瘤消化物和/或肿瘤碎片与6000IU/mL IL-2以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3一起孵育。将此初代细胞群培养数天的时间段，通常1至8天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，初始第一次扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3。在一些实施方案中，将此初代细胞群培养数天的时间段，通常1至7天，产生通常约1×108个主体TIL细胞的主体TIL群。在一些实施方案中，初始第一次扩增期间的生长培养基包含IL-2或其变体以及抗原呈递饲养细胞和OKT-3。在一些实施方案中，IL-2为重组人类IL-2(rhIL-2)。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有20至30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有20×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有25×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，1mg小瓶的IL-2储备溶液具有30×106IU/mg的比活性。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有4至8×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有5至7×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2储备溶液具有6×106IU/mg IL-2的最终浓度。在一些实施方案中，IL-2储备溶液如实施例C中所描述制备。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约10,000IU/mL IL-2、约9,000IU/mL IL-2、约8,000IU/mL IL-2、约7,000IU/mLIL-2、约6000IU/mL IL-2或约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约9,000IU/mL IL-2至约5,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约8,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约7,000IU/mL IL-2至约6,000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约6,000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基进一步包含IL-2。在优选实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或约8000IU/mL的IL-2。
在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mLIL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一个实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基进一步包括IL-15。在优选实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mLIL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mLIL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含约1IU/mLIL-21。在一些实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含IL-21。在优选实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一个实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3抗体。在一个实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间、和50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含15ng/mL与30ng/mL之间的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含30ng/mL OKT-3抗体。在一些实施方案中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施方案中，初始第一次扩增细胞培养基在细胞培养基中包含一种以上TNFRSF激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，且该4-1BB激动剂选自下组：乌瑞芦单抗、乌托鲁单抗、EU-101、融合蛋白，以及它们的片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到0.1μg/mL至100μg/mL的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到20μg/mL至40μg/mL的浓度。
在一些实施方案中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，初始第一次扩增细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，且其中该一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方案中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，初始第一次扩增细胞培养基进一步包含初始浓度约6000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，且其中该一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基称为“CM”(培养基的缩写)。在一些实施方案中，其称为CM1(培养基1)。在一些实施方案中，CM由补充有10％人类AB血清、25mMHepes和10mg/mL庆大霉素的含GlutaMAX的RPMI 1640组成。在一些实施方案中，CM为实施例(参见实施例A)中所描述的CM1。在一些实施方案中，初始第一次扩增在初始细胞培养基或第一细胞培养基中发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增培养基或初始细胞培养基或第一细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(在本文中也称为饲养细胞)。
在一些实施方案中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或成分确定培养基。在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，基础细胞培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改进伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)、最低必需培养基(Minimal EssentialMedium；MEM)、伊格尔氏基础培养基(Basal Medium Eagle；BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(Glasgow'sMinimal EssentialMedium；G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改进达尔伯克氏培养基(Iscove'sModified Dulbecco's Medium)。
在一些实施方案中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白替代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素替代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上抗生素和一种以上微量元素。在一些实施方案中，成分确定培养基包含白蛋白和一种以上选自下组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3 +、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方案中，成分确定培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，该常规生长培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改进伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改进达尔伯克氏培养基。
在一些实施方案中，以无血清培养基或成分确定培养基的总体积计，无血清培养基或成分确定培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清培养基或成分确定培养基的总体积的约3％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清培养基或成分确定培养基的总体积的约5％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清培养基或成分确定培养基的总体积的约10％。
在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，且2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施方案中，成分确定培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1LCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，且进一步包括约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，且进一步包括约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，且进一步包括约6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，且进一步包括约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，且进一步包括约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，且进一步包括约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，且进一步包括约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，且进一步包括约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，且进一步包括约6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)，且2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即)。在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基补充有浓度约2mM的谷氨酰胺(即/>)。
在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM，或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，2-巯基乙醇在培养基中的最终浓度为55μM。
在一些实施方案中，以引用的方式并入本文中的国际PCT公开第WO/1998/030679号中所描述的成分确定培养基可用于本发明。在该公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包括补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包括一种以上选自下组的成分，或通过组合一种以上选自下组的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白替代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素替代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素和一种以上抗生素。在一些实施方案中，成分确定培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，成分确定培养基包含白蛋白或白蛋白替代物和一种以上选自下组的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素替代物、一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在一些实施方案中，成分确定培养基包含白蛋白和一种以上选自下组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方案中，基础细胞培养基选自下组：达尔伯克氏改进伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改进达尔伯克氏培养基。
在一些实施方案中，成分确定培养基中甘氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-组氨酸的浓度为约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5至500mg/L，硫胺素的浓度为约1至20mg/L，还原型谷胱甘肽的浓度为约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1至200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度为约1至50mg/L，胰岛素的浓度为约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001至0.0001mg/L，且白蛋白(例如I)的浓度为约5000至50,000mg/L。
在一些实施方案中，成分确定培养基中的非微量元素部分成分以下文表4中标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施方案中，成分确定培养基中的非微量元素部分成分以下文表3中标题“1X培养基的优选实施方案”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施方案中，成分确定培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施方案中，无血清补充剂包含下文表4中标题“补充剂的优选实施方案”栏中列出的类型和浓度的非微量部分成分。
表4.非微量元素部分成分的浓度
在一些实施方案中，成分确定培养基的渗透压在约260与350mOsmol之间。在一些实施方案中，渗透压在约280与310mOsmol之间。在一些实施方案中，成分确定培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。成分确定培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施方案中，Smith等人，“使用新颖无Xeno CTS免疫细胞血清替代物离体扩增人类T细胞以用于过继免疫疗法(Ex vivo expansion of human T cells foradoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell SerumReplacement)”，《临床转化免疫学》，4(1)2015(doi:10.1038/cti.2014.31)中所描述的成分确定培养基可用于本发明。简言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一个实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一个实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为1至8天，如实施例和附图中所讨论。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为2至8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为3至8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为4至8天，如实施例和附图中所讨论。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为1至7天，如实施例和附图中所讨论。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为2至8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为2至7天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为3至8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为3至7天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为4至8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为4至7天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为5至8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为5至7天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为6至8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为6至7天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图1和/或图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所提供的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为7至8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所提供的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为8天。在一些实施方案中，初始第一次扩增过程(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所提供的那些过程，其可包括有时称为预REP或初始REP的那些过程)为7天。
在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行1天至8天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行1天至7天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行2天至8天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行2天至7天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行3天至8天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行3天至7天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行4天至8天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行4天至7天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行5天至8天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行5天至7天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行6天至8天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行6天至7天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行7至8天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行8天。在一些实施方案中，初始第一TIL扩增可在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后进行7天。
在一些实施方案中，TIL的初始第一次扩增可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行1天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行2天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行3天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行4天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行5天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行6天至7天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天至8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行8天。在一些实施方案中，第一TIL扩增可进行7天。
在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在初始第一次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及其任何组合可包括在初始第一次扩增期间，包括例如在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及本文所描述的步骤B过程期间。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在初始第一次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-15和IL-21以及其任何组合可包括在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及如本文所描述的步骤B过程期间。
在一些实施方案中，初始第一次扩增(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用生物反应器。在一些实施方案中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为例如G-Rex-10或G-Rex-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-Rex-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-Rex-10。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图1(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在初始第一次扩增期间添加。在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在初始第一次扩增期间第4至8天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在初始第一次扩增期间第4至7天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在初始第一次扩增期间第5至8天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在初始第一次扩增期间第5至7天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在初始第一次扩增期间第6至8天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在初始第一次扩增期间第6至7天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在初始第一次扩增期间第7或8天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在初始第一次扩增期间第7天期间的任何时间添加。在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时不需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)，而是在初始第一次扩增期间第8天期间的任何时间添加。
在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8B)的步骤B中所描述的那些扩增以及称为预REP或初始REP的那些扩增)在TIL扩增开始时和初始第一次扩增期间需要饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)。在许多实施方案中，饲养细胞是从同种异体健康血液供体的标准全血单位中获得的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一些实施方案中，初始第一次扩增期间使用2.5×108个饲养细胞。在一些实施方案中，初始第一次扩增期间使用每容器2.5×108个饲养细胞。在一些实施方案中，初始第一次扩增期间使用每GREX-10 2.5×108个饲养细胞。在一些实施方案中，初始第一次扩增期间使用每GREX-100 2.5×108个饲养细胞。
通常，同种异体PBMC通过辐照或热处理灭活，并用于REP程序，如实施例中所述，其提供了用于评估经辐照同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施方案中，若第14天活细胞总数小于在初始第一次扩增的第0天放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。
在一些实施方案中，若第7天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在初始第一次扩增的第0天放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，若第7天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在初始第一次扩增的第0天放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在5至60ng/mLOKT3抗体和1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在10至50ng/mLOKT3抗体和2000至5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在20至40ng/mLOKT3抗体和2000至4000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在25至35ng/mLOKT3抗体和2500至3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在15ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在15ng/mL OKT3抗体和6000IU/mLIL-2存在下培养。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：300或约1：500。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率在1：50与1：300之间。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率在1：100与1：200之间。
在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序需要约2.5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在另一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序需要约2.5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在又一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增需要约2.5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在又一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增需要约2.5×108个饲养细胞。在又一个实施方案中，初始第一次扩增需要快速第二次扩增中所用饲养细胞数目的四分之一、三分之一、十二分之一或二分之一。
在一些实施方案中，初始第一次扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施方案中，初始第一次扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，初始第一次扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，初始第一次扩增中的培养基包含每容器2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，初始第一次扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施方案中，培养基包含每容器30ng OKT-3。在一些实施方案中，容器为G-Rex 100MCS培养瓶。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器每2.5×108个抗原呈递饲养细胞500mL培养基和15μg OKT-3。在一些实施方案中，培养基包含每容器500mL培养基和15μg OKT-3。在一些实施方案中，容器为G-Rex 100MCS培养瓶。在一些实施方案中，培养基包含500mL培养基和6000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器500mL培养基、6000IU/mL IL-2、15μgOKT-3和2.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器每2.5×108个抗原呈递饲养细胞500mL培养基和15μg OKT-3。
在一个实施方案中，本文所描述的初始第一次扩增程序在第二次扩增期间需要相对于TIL过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞是从同种异体健康血液供体的标准全血单位中获得的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法(例如Ficoll-Paque梯度分离法)获得。在一个实施方案中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。
通常，同种异体PBMC通过辐照或热处理灭活，且用于本文所描述的TIL扩增程序，包括附图和实施例中所描述的示例性程序。
在一个实施方案中，在初始第一次扩增中使用人工抗原呈递细胞来替代PBMC或与PBMC组合使用。
在一个实施方案中，Gen 3处理的初始第一次扩增中所用的抗原呈递细胞为单核细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为B细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为B细胞类淋巴母细胞或B类淋巴母细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为伯基特氏淋巴瘤细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为骨髓谱系细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为单核细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为HLA-A-02阳性单核细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为M5亚型急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Ramos细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为黑色素细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为HLA-A-02阳性黑色素细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为HLA-A-02阳性黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞选自下组：Sk-MEL-5、Malme-3M、SK-MEL-28、SK-MEL-3、SH-4、SK-MEL-24、RPMI-7951、SK-MEL-1、A375、G-361以及它们的组合，或其衍生物、变体、修饰物或后代。在任何前述实施方案中，抗原呈递细胞可如本文中别处所描述经辐照或未经辐照。
在一个实施方案中，aAPC用于Gen 3过程的初始第一次扩增中。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的单核细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的B细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的B细胞类淋巴母细胞或B类淋巴母细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的伯基特氏淋巴瘤细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的骨髓谱系细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的单核细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的HLA-A-02阳性单核细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的M5亚型急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Ramos细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的黑色素细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的HLA-A-02阳性黑色素细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的HLA-A-02阳性黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，aAPC选自下组的经基因修饰的抗原呈递细胞：Sk-MEL-5、Malme-3M、SK-MEL-28、SK-MEL-3、SH-4、SK-MEL-24、RPMI-7951、SK-MEL-1、A375、G-361以及它们的组合，或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，经基因修饰的细胞被修饰以表达CD86、OX40L、4-1BBL、OX-40激动性抗体、4-1BB激动性抗体、能够结合OKT-3的Fc链的抗体和/或ICOS-L，如美国专利第10,415,015号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。在任何前述实施方案中，经基因修饰的aAPC可如本文中别处所描述经辐照或未经辐照。
2.细胞因子
本文所描述的扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
或者，也可以使用细胞因子的组合进行TIL的初始第一次扩增，其中IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合描述于美国专利申请公开第2017/0107490A1号和国际专利申请公开第WO 2015/189357号中，这些专利中的每一种以全文引用的方式明确并入本文。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如本文所描述的T细胞。
C.步骤C：初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变
在一些情况下，获自初始第一次扩增(其可包括有时称为预REP的扩增)的主体TIL群，包括例如获自例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B的TIL群，可经历快速第二次扩增(其可包括有时称为快速扩增方案(REP)的扩增)然后如下文所讨论冷冻保存。类似地，在经基因修饰的TIL将用于疗法的情况下，来自初始第一次扩增的扩增的TIL群或来自快速第二次扩增的扩增的TIL群可在扩增步骤之前或在初始第一次扩增之后且在快速第二次扩增之前进行基因修饰以用于合适的治疗。
在一些实施方案中，获自初始第一次扩增(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B)的TIL经储存直至为了选择而测定表型。在一些实施方案中，获自初始第一次扩增(例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的步骤B)的TIL不经储存而直接进行快速第二次扩增。在一些实施方案中，获自初始第一次扩增的TIL在初始第一次扩增之后且在快速第二次扩增之前不经冷冻保存。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在肿瘤破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约3天至7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约3天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约4天至7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约4天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约5天至7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约5天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约6天至7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约6天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约7天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后约8天发生。
在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后1天至7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后1天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后2天至7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后2天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后3天至7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后3天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后4天至7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后4天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后5天至7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后5天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后6天至7天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后6天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后7天至8天发生。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后7天发生在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变在破碎发生后和/或第一初始扩增步骤开始后8天发生。
在一些实施方案中，TIL在初级(primary)第一次扩增之后且在快速第二次扩增之前不经储存，且TIL直接进行快速第二次扩增(例如在一些实施方案中，在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所显示的步骤B至步骤D的转变期间不经储存)。在一些实施方案中，转变在如本文所描述的密闭系统中发生。在一些实施方案中，来自初始第一次扩增的TIL(第二TIL群)直接进行快速第二次扩增而无转变期。
在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤C)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用单一生物反应器。在一些实施方案中，所采用的单一生物反应器为例如GREX-10或GREX-100。在一些实施方案中，密闭系统生物反应器为单一生物反应器。在一些实施方案中，初始第一次扩增至快速第二次扩增的转变涉及容器尺寸的扩大。在一些实施方案中，初始第一次扩增与快速第二次扩增相比在较小容器中进行。在一些实施方案中，初始第一次扩增在GREX-100中进行且快速第二次扩增在GREX-500中进行。
D.步骤D：快速第二次扩增
在一些实施方案中，TIL细胞群在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所指示的收集和初始第一次扩增(步骤A和步骤B)和称为步骤C的转变之后进一步扩增数目。此进一步扩增在本文中称为快速第二次扩增，其可包括在本领域中通常称为快速扩增过程(快速扩增方案或REP)的扩增过程；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所指示的过程。快速第二次扩增通常使用包含多种组分(包括饲养细胞、细胞因子源和抗CD3抗体)的培养基在透气容器中完成。在一些实施方案中，在快速第二次扩增开始后1天、2天、3天或4天(即，在整体Gen 3过程的第8、9、10或11天)，将TIL转移至较大体积的容器。
在一些实施方案中，TIL的快速第二次扩增(其可包括有时称为REP的扩增；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所指示的过程)可使用本领域技术人员已知的任何TIL培养瓶或容器进行。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约1天至约9天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约1天至约10天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约2天至约9天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约2天至约10天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约3天至约9天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约3天至约10天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约4天至约9天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约4天至约10天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约5天至约9天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约5天至约10天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约6天至约9天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约6天至约10天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约7天至约9天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约7天至约10天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约8天至约9天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约8天至约10天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约9天至约10天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约1天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约2天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约3天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约4天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约5天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约6天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约7天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约8天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约9天。在一些实施方案中，第二次TIL扩增可在快速第二次扩增开始后进行约10天。
在一些实施方案中，快速第二次扩增可在透气容器中使用本公开的方法(包括例如称为REP的扩增；以及如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所指示的过程)进行。在一些实施方案中，TIL在快速第二次扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞(在本文中也称为“抗原呈递细胞”)存在下扩增。在一些实施方案中，TIL在快速第二次扩增中在IL-2、OKT-3和饲养细胞存在下扩增，其中将饲养细胞添加至最终浓度，该最终浓度为存在于初始第一次扩增中的饲养细胞浓度的2倍、2.4倍、2.5倍、3倍、3.5倍或4倍。例如，TIL可在白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)存在下使用非特异性T细胞受体刺激而快速扩增。非特异性T细胞受体刺激物可包括例如抗CD3抗体，例如约30ng/mL OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦市的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本的美天旎生物技术公司)或UHCT-1(可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend)。TIL可通过在第二次扩增期间引入一种以上癌症的抗原(包括其抗原部分，例如表位)来诱导进一步TIL体外刺激进行扩增，这些抗原可以可选地在T细胞生长因子(例如300IU/mL IL-2或IL-15)存在下可选地由载体表达，该载体例如人类白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μΜMART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M)。其他适合抗原可包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌症抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2或其抗原部分。TIL也可通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激而快速扩增。或者，TIL可进一步用例如经辐照的自体淋巴细胞或用经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方案中，再刺激作为第二次扩增的一部分发生。在一些实施方案中，第二次扩增在经辐照的自体淋巴细胞或经辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2的存在下发生。
在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含IL-2。在一些实施方案中，细胞培养基包含约3000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含约1000IU/mL、约1500IU/mL、约2000IU/mL、约2500IU/mL、约3000IU/mL、约3500IU/mL、约4000IU/mL、约4500IU/mL、约5000IU/mL、约5500IU/mL、约6000IU/mL、约6500IU/mL、约7000IU/mL、约7500IU/mL或约8000IU/mL IL-2。在一个实施方案中，细胞培养基包含1000与2000IU/mL之间、2000与3000IU/mL之间、3000与4000IU/mL之间、4000与5000IU/mL之间、5000与6000IU/mL之间、6000与7000IU/mL之间、7000与8000IU/mL之间或8000IU/mL之间的IL-2。
在一个实施方案中，细胞培养基包含OKT-3抗体。在一些实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mLOKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含约0.1ng/mL、约0.5ng/mL、约1ng/mL、约2.5ng/mL、约5ng/mL、约7.5ng/mL、约10ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约30ng/mL、约35ng/mL、约40ng/mL、约50ng/mL、约60ng/mL、约70ng/mL、约80ng/mL、约90ng/mL、约100ng/mL、约200ng/mL、约500ng/mL和约1μg/mL OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含0.1ng/mL与1ng/mL之间、1ng/mL与5ng/mL之间、5ng/mL与10ng/mL之间、10ng/mL与20ng/mL之间、20ng/mL与30ng/mL之间、30ng/mL与40ng/mL之间、40ng/mL与50ng/mL之间、和50ng/mL与100ng/mL之间的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含15ng/mL与30ng/mL之间的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含30ng/mL与60ng/mL之间的OKT-3抗体。在一个实施方案中，细胞培养基包含约30ng/mL OKT-3。在一个实施方案中，细胞培养基包含约60ng/mL OKT-3。在一些实施方案中，OKT-3抗体为莫罗单抗。
在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含每容器7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和30μg OKT-3。在一些实施方案中，容器为G-Rex 100MCS培养瓶。在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2、60ng/mL OKT-3和7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器500mL培养基和6000IU/mL IL-2、30μg OKT-3和7.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含IL-2。在一些实施方案中，培养基包含6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，培养基包含每容器5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含OKT-3。在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和30μg OKT-3。在一些实施方案中，容器为G-Rex 100MCS培养瓶。在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含6000IU/mL IL-2、60ng/mL OKT-3和5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，快速第二次扩增中的培养基包含每容器500mL培养基和6000IU/mL IL-2、30μg OKT-3和5×108至7.5×108个抗原呈递饲养细胞。
在一些实施方案中，细胞培养基包含一种以上TNFRSF激动剂于细胞培养基中。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂为4-1BB激动剂，且该4-1BB激动剂选自下组：乌瑞芦单抗、乌托鲁单抗、EU-101、融合蛋白和其片段、衍生物、变体、生物类似物和组合。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到0.1μg/mL至100μg/mL的浓度。在一些实施方案中，TNFRSF激动剂的添加浓度足以在细胞培养基中达到20μg/mL至40μg/mL的浓度。
在一些实施方案中，除了一种以上TNFRSF激动剂之外，细胞培养基进一步包含初始浓度约3000IU/mL的IL-2和初始浓度约30ng/mL的OKT-3抗体，且其中该一种以上TNFRSF激动剂包括4-1BB激动剂。
在一些实施方案中，采用IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的组合作为在第二次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21以及其任何组合可包括在第二次扩增期间，包括例如在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)以及本文所描述的步骤D过程期间。在一些实施方案中，采用IL-2、IL-15和IL-21的组合作为在第二次扩增期间的组合。在一些实施方案中，IL-2、IL-15和IL-21以及其任何组合可包括在根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)和如本文所描述的步骤D过程期间。
在一些实施方案中，第二次扩增可在包含IL-2、OKT-3、抗原呈递饲养细胞和可选的TNFRSF激动剂的补充细胞培养基中进行。在一些实施方案中，第二次扩增在补充细胞培养基中发生。在一些实施方案中，补充细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞。在一些实施方案中，第二细胞培养基包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC；也称为抗原呈递饲养细胞)。在一些实施方案中，第二次扩增在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞(即抗原呈递细胞)的细胞培养基中进行。
在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约500IU/mL IL-15、约400IU/mL IL-15、约300IU/mL IL-15、约200IU/mL IL-15、约180IU/mL IL-15、约160IU/mL IL-15、约140IU/mL IL-15、约120IU/mL IL-15或约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约500IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约400IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约300IU/mL IL-15至约100IU/mL IL-15。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约200IU/mL IL-15。在一些实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包括IL-15。在优选实施方案中，细胞培养基包含约180IU/mL IL-15。
在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约20IU/mL IL-21、约15IU/mL IL-21、约12IU/mL IL-21、约10IU/mL IL-21、约5IU/mL IL-21、约4IU/mL IL-21、约3IU/mL IL-21、约2IU/mL IL-21、约1IU/mL IL-21或约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约20IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约15IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约12IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约10IU/mL IL-21至约0.5IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约5IU/mL IL-21至约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，第二次扩增培养基包含约2IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。在一些实施方案中，细胞培养基包含约0.5IU/mL IL-21。在一个实施方案中，细胞培养基进一步包含IL-21。在优选实施方案中，细胞培养基包含约1IU/mL IL-21。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞(APC)为PBMC。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为约1：10、约1：15、约1：20、约1：25、约1：30、约1：35、约1：30、约1：35、约1：50、约1：75、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：300、或约1：500。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL与PBMC的比率在1：50与1：300之间。在一个实施方案中，在快速扩增和/或第二次扩增中TIL与PBMC的比率在1：100与1：200之间。
在一个实施方案中，REP和/或快速第二次扩增在培养瓶中进行，其中主体TIL在150mL培养基中与100或200倍过量的灭活饲养细胞(其中饲养细胞浓度为初始第一次扩增中的饲养细胞浓度的至少1.1倍(1.1×)、1.2×、1.3×、1.4×、1.5×、1.6×、1.7×、1.8×、1.8×、2×、2.1×、2.2×、2.3×、2.4×、2.5×、2.6×、2.7×、2.8×、2.9×、3.0×、3.1×、3.2×、3.3×、3.4×、3.5×、3.6×、3.7×、3.8×、3.9×或4.0×)、30ng/mL OKT3抗CD3抗体和6000IU/mL IL-2混合。更换培养基(通常通过抽取2/3用过的培养基且用相等体积的新鲜培养基替换来更换2/3培养基)直至细胞转移至替代生长箱室。替代生长箱室包括G-Rex培养瓶和透气容器，如下文更充分讨论。
在一些实施方案中，快速第二次扩增(其可包括称为REP过程的过程)为7至9天，如实施例和附图中所讨论。在一些实施方案中，第二次扩增为7天。在一些实施方案中，第二次扩增为8天。在一些实施方案中，第二次扩增为9天。
在一个实施方案中，第二次扩增(其可包括称为REP的扩增，以及在图8(特别是例如图8B和/或图8C)的步骤D中提及的那些)可在500mL容量的具有100cm透气硅底的透气培养瓶(G-Rex 100，可购自美国明尼苏达州新布莱顿的Wilson Wolf ManufacturingCorporation)中进行，5×106或10×106个TIL可与PBMC在400mL的补充有5％人类AB血清、3000IU/mL IL-2和30ng/mL抗CD3(OKT3)的50/50培养基中培养。G-Rex 100培养瓶可在37℃下在5％CO2中孵育。在第5天，可将250mL上清液移除并放入离心瓶中且以1500rpm(491×g)离心10分钟。可将TIL沉淀物用150mL的含有5％人类AB血清、6000IU/mL IL-2的新鲜培养基再悬浮，并添加回原来的GREX-100培养瓶中。当TIL在GREX-100培养瓶中连续扩增时，在第10或11天可将TIL移至更大的培养瓶，例如GREX-500。细胞可在培养的第14天收集。细胞可在培养的第15天收集。细胞可在培养的第16天收集。在一些实施方案中，更换培养基直至细胞转移至替代生长箱室。在一些实施方案中，通过抽取用过的培养基且用相等体积的新鲜培养基替换来更换2/3培养基。在一些实施方案中，替代生长箱室包括GREX培养瓶和透气容器，如下文更充分讨论。
在一些实施方案中，本文公开的扩增过程中使用的培养基为无血清培养基或成分确定培养基。在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基用于防止和/或减少部分因含血清培养基的批次间变化所致的实验变化。
在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基包含基础细胞培养基和血清补充剂和/或血清替代物。在一些实施方案中，基础细胞培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CTSTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改进伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改进达尔伯克氏培养基。
在一些实施方案中，血清补充剂或血清替代物包括但不限于以下中的一种以上：CTSTMOpTmizer T细胞扩增血清补充剂、CTSTM免疫细胞血清替代物、一种以上白蛋白或白蛋白替代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素替代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上抗生素和一种以上微量元素。在一些实施方案中，成分确定培养基包含白蛋白和一种以上选自下组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3 +、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方案中，成分确定培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或2-巯基乙醇。
在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞免疫细胞血清替代物与常规生长培养基一起使用，该常规生长培养基包括但不限于CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基、CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM、CTSTMAIM-V培养基、CSTTMAIM-V SFM、LymphoONETMT细胞扩增无Xeno培养基、达尔伯克氏改进伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改进达尔伯克氏培养基。
在一些实施方案中，以无血清培养基或成分确定培养基的总体积计，无血清培养基或成分确定培养基中的总血清替代物浓度(vol％)为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清培养基或成分确定培养基的总体积的约3％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清培养基或成分确定培养基的总体积的约5％。在一些实施方案中，总血清替代物浓度为无血清培养基或成分确定培养基的总体积的约10％。
在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1L CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施方案中，成分确定培养基为CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM(赛默飞世尔科技)。任何CTSTMOpTmizerTM制剂均可用于本发明。CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM为1LCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基和26mL CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂在使用前混合在一起的组合。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)以及55mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％的CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM的2-巯基乙醇和2mM的L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，且进一步包括约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，且进一步包括约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)、55mM 2-巯基乙醇和2mM L-谷氨酰胺，且进一步包括约6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，且进一步包括约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，且进一步包括约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和55mM 2-巯基乙醇，且进一步包括约1000IU/mL至约6000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，且进一步包括约1000IU/mL至约8000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，且进一步包括约3000IU/mL IL-2。在一些实施方案中，CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM补充有约3％CTSTM免疫细胞血清替代物(SR)(赛默飞世尔科技)和约2mM谷氨酰胺，且进一步包括约6000IU/mL IL-2。
在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基补充有浓度为约0.1mM至约10mM、0.5mM至约9mM、1mM至约8mM、2mM至约7mM、3mM至约6mM或4mM至约5mM的谷氨酰胺(即)。在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基补充有浓度约2mM的谷氨酰胺(即/>)。
在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基补充有浓度为约5mM至约150mM、10mM至约140mM、15mM至约130mM、20mM至约120mM、25mM至约110mM、30mM至约100mM、35mM至约95mM、40mM至约90mM、45mM至约85mM、50mM至约80mM、55mM至约75mM、60mM至约70mM，或约65mM的2-巯基乙醇。在一些实施方案中，无血清培养基或成分确定培养基补充有浓度约55mM的2-巯基乙醇。
在一些实施方案中，以引用的方式并入本文中的国际专利公开第WO 1998/030679号中所描述的成分确定培养基可用于本发明。在该公开中，描述了无血清真核细胞培养基。无血清真核细胞培养基包含补充有能够支持细胞在无血清培养中生长的无血清补充剂的基础细胞培养基。无血清真核细胞培养基补充剂包括一种以上选自下组的成分，或通过组合一种以上选自下组的成分而获得：一种以上白蛋白或白蛋白替代物、一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素替代物、一种以上胶原蛋白前体、一种以上微量元素和一种以上抗生素。在一些实施方案中，成分确定培养基进一步包含L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和/或β-巯基乙醇。在一些实施方案中，成分确定培养基包含白蛋白或白蛋白替代物和一种以上选自下组的成分：一种以上氨基酸、一种以上维生素、一种以上转铁蛋白或转铁蛋白替代物、一种以上抗氧化剂、一种以上胰岛素或胰岛素替代物、一种以上胶原蛋白前体和一种以上微量元素。在一些实施方案中，成分确定培养基包含白蛋白和一种以上选自下组的成分：甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、硫胺素、还原型谷胱甘肽、L-抗坏血酸-2-磷酸盐、铁饱和转铁蛋白、胰岛素和含有微量元素部分Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br、T、Mn2+、P、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+和Zr4+的化合物。在一些实施方案中，基础细胞培养基选自下组：达尔伯克氏改进伊格尔氏培养基(DMEM)、最低必需培养基(MEM)、伊格尔氏基础培养基(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、最低必需培养基(αMEM)、格拉斯哥氏最低必需培养基(G-MEM)、RPMI生长培养基和伊斯科夫氏改进达尔伯克氏培养基。
在一些实施方案中，成分确定培养基中甘氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-组氨酸的浓度为约5至250mg/L，L-异亮氨酸的浓度为约5至300mg/L，L-甲硫氨酸的浓度为约5至200mg/L，L-苯丙氨酸的浓度为约5至400mg/L，L-脯氨酸的浓度为约1至1000mg/L，L-羟基脯氨酸的浓度为约1至45mg/L，L-丝氨酸的浓度为约1至250mg/L，L-苏氨酸的浓度为约10至500mg/L，L-色氨酸的浓度为约2至110mg/L，L-酪氨酸的浓度为约3至175mg/L，L-缬氨酸的浓度为约5至500mg/L，硫胺素的浓度为约1至20mg/L，还原型谷胱甘肽的浓度为约1至20mg/L，L-抗坏血酸-2-磷酸盐的浓度为约1至200mg/L，铁饱和转铁蛋白的浓度为约1至50mg/L，胰岛素的浓度为约1至100mg/L，亚硒酸钠的浓度为约0.000001至0.0001mg/L，且白蛋白(例如I)的浓度为约5000至50,000mg/L。
在一些实施方案中，成分确定培养基中的非微量元素部分成分以参见上文表4中标题“1X培养基中的浓度范围”栏中列出的浓度范围存在。在其他实施方案中，成分确定培养基中的非微量元素部分成分以参见上文表4中标题“1X培养基的优选实施方案”栏中列出的最终浓度存在。在其他实施方案中，成分确定培养基为包含无血清补充剂的基础细胞培养基。在一些这些实施方案中，无血清补充剂包含参见上文表4中标题“补充剂的优选实施方案”栏中列出的类型和浓度的非微量部分成分。
在一些实施方案中，成分确定培养基的渗透压在约260与350mOsmol之间。在一些实施方案中，渗透压在约280与310mOsmol之间。在一些实施方案中，成分确定培养基补充有至多约3.7g/L或约2.2g/L碳酸氢钠。成分确定培养基可进一步补充有L-谷氨酰胺(最终浓度为约2mM)、一种以上抗生素、非必需氨基酸(NEAA；最终浓度为约100μM)、2-巯基乙醇(最终浓度为约100μM)。
在一些实施方案中，Smith等人，《使用新颖无Xeno CTS免疫细胞血清替代物离体扩增人类T细胞以用于过继免疫疗法》，《临床转化免疫学》，4(1)2015(doi：10.1038/cti.2014.31)中所描述的成分确定培养基可用于本发明。简言之，RPMI或CTSTMOpTmizerTM用作基础细胞培养基且补充有0、2％、5％或10％CTSTM免疫细胞血清替代物。
在一个实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一个实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME或βME；也称为2-巯基乙醇，CAS 60-24-2)。
在一个实施方案中，进行快速第二次扩增(包括称为REP的扩增)，且其进一步包括选择具有优异肿瘤反应性的TIL的步骤。可使用本领域中已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公开第2016/0010058A1号(其公开内容以引用的方式并入本文)中所描述的方法可用于选择具有优异肿瘤反应性的TIL。
可选地，可在快速第二次扩增(包括称为REP的扩增)之后使用本领域中已知的标准分析来进行细胞存活率分析。例如，可在主体TIL样本上进行台盼蓝排除测定，其选择性标记死细胞且允许存活率评估。在一些实施方案中，TIL样本可使用Cellometer K2自动化细胞计数器(马萨诸塞州劳伦斯市的Nexcelom Bioscience)计算和确定存活率。在一些实施方案中，存活率根据标准Cellometer K2 Image Cytometer自动化细胞计数器方案确定。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供一种用于产生表现且增加T细胞贮库多样性的TIL的方法。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL表现出增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，在第二次扩增中获得的TIL表现出增加的T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性的增加。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自α、β、γ和δ受体的T细胞受体中的一种中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRab(即，TCRα/β)的表达增加。
在一些实施方案中，快速第二次扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细讨论。在一些实施方案中，快速第二次扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30μg/培养瓶OKT-3以及7.5×108个抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细讨论。在一些实施方案中，快速第二次扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含IL-2、OKT-3以及抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细讨论。在一些实施方案中，快速第二次扩增培养基(例如有时称为CM2或第二细胞培养基)包含6000IU/mL IL-2、30μg/培养瓶OKT-3以及5×108个抗原呈递饲养细胞(APC)，如下文更详细讨论。
在一些实施方案中，快速第二次扩增(例如根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用生物反应器。在一些实施方案中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为例如G-Rex-100或G-Rex-500。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-Rex-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-Rex-500。
1.饲养细胞和抗原呈递细胞
在一个实施方案中，本文所描述的快速第二次扩增程序(例如包括如下扩增：例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤D中所描述的那些扩增以及称为REP的那些扩增)在REP TIL扩增期间和/或在快速第二次扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞是从健康血液供体的标准全血单位中获得的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。
通常，同种异体PBMC通过辐照或热处理灭活，并用于REP程序，如实施例中所述，其提供了用于评估经辐照同种异体PBMC的复制机能不全的示例性方案。
在一些实施方案中，若第7或14天活细胞总数小于在REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)放入培养的初始活细胞数目，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。
在一些实施方案中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在60ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在60ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，若第7天和第14天在OKT3和IL-2存在下培养的活细胞总数与在REP的第0天和/或第二次扩增的第0天(即第二次扩增的开始日)放入培养的初始活细胞数目相比并未增加，则认为PBMC是复制机能不全的且可接受其用于本文所描述的TIL扩增程序。在一些实施方案中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体和1000至6000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体和2000至5000IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体和2000至4000IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体和2500至3500IU/mL IL-2存在下培养。在一些实施方案中，PBMC在30至60ng/mL OKT3抗体和6000IU/mL IL-2存在下培养。
在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为PBMC。在一些实施方案中，抗原呈递饲养细胞为人工抗原呈递饲养细胞。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率为约1：10、约1：25、约1：50、约1：100、约1：125、约1：150、约1：175、约1：200、约1：225、约1：250、约1：275、约1：300、约1：325、约1：350、约1：375、约1：300或约1：500。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率在1：50与1：300之间。在一个实施方案中，在第二次扩增中TIL与抗原呈递饲养细胞的比率在1：100与1：200之间。
在一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约100×106个TIL的比率。在另一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在另一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约50×106个TIL的比率。在又一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在又一个实施方案中，本文所描述的第二次扩增程序需要约7.5×108个饲养细胞与约25×106个TIL。在又一个实施方案中，快速第二次扩增需要快速第二次扩增的两倍数目的饲养细胞。在又一个实施方案中，当本文所描述的初始第一次扩增需要约2.5×108个饲养细胞时，快速第二次扩增需要约5×108个饲养细胞。在又一个实施方案中，当本文所描述的初始第一次扩增需要约2.5×108个饲养细胞时，快速第二次扩增需要约7.5×108个饲养细胞。在又一个实施方案中，快速第二次扩增需要初始第一次扩增的2倍(2.0×)、2.5×、3.0×、3.5×或4.0×数目的饲养细胞。
在一个实施方案中，本文所描述的快速第二次扩增程序在快速第二次扩增期间需要过量的饲养细胞。在许多实施方案中，饲养细胞是从同种异体健康血液供体的标准全血单位中获得的外周血单核细胞(PBMC)。PBMC使用标准方法，例如Ficoll-Paque梯度分离法获得。在一个实施方案中，使用人工抗原呈递细胞(aAPC)代替PBMC。在一些实施方案中，PBMC以添加至初始第一次扩增的PBMC浓度两倍的浓度添加至快速第二次扩增。
通常，同种异体PBMC通过辐照或热处理灭活，且用于本文所描述的TIL扩增程序，包括附图和实施例中所描述的示例性程序。
在一个实施方案中，在快速第二次扩增中使用人工抗原呈递细胞来替代PBMC或与PBMC组合使用。
在一个实施方案中，Gen 3过程的快速第二次扩增中所用的抗原呈递细胞为单核细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为B细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为B细胞类淋巴母细胞或B类淋巴母细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为伯基特氏淋巴瘤细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为骨髓谱系细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为单核细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为HLA-A-02阳性单核细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为M5亚型急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Ramos细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为黑色素细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为HLA-A-02阳性黑色素细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞为HLA-A-02阳性黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，抗原呈递细胞选自下组：Sk-MEL-5、Malme-3M、SK-MEL-28、SK-MEL-3、SH-4、SK-MEL-24、RPMI-7951、SK-MEL-1、A375、G-361以及它们的组合，或其衍生物、变体、修饰物或后代。在任何前述实施方案中，抗原呈递细胞可如本文中别处所描述经辐照或未经辐照。
在一个实施方案中，aAPC用于Gen 3过程的快速第二次扩增。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的单核细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的B细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的B细胞类淋巴母细胞或B类淋巴母细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的伯基特氏淋巴瘤细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的骨髓谱系细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的单核细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的HLA-A-02阳性单核细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的M5亚型急性单核细胞白血病细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Raji细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Ramos细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的U937细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的Daudi细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的黑色素细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的HLA-A-02阳性黑色素细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，aAPC是经基因修饰的HLA-A-02阳性黑色素瘤细胞。在一个实施方案中，aAPC选自下组的经基因修饰的抗原呈递细胞：Sk-MEL-5、Malme-3M、SK-MEL-28、SK-MEL-3、SH-4、SK-MEL-24、RPMI-7951、SK-MEL-1、A375、G-361以及它们的组合，或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一个实施方案中，经基因修饰的细胞经修饰以表达CD86、OX40L、4-1BBL、OX-40激动性抗体、4-1BB激动性抗体、能够结合OKT-3的Fc链的抗体和/或ICOS-L，如美国专利第10,415,015号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。在任何前述实施方案中，经基因修饰的aAPC可如本文中别处所描述经辐照或未经辐照。
2.细胞因子
本文所描述的快速第二次扩增方法通常使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基，如本领域中所已知。
替代地，也可以使用细胞因子的组合进行TIL的快速第二次扩增，其中IL-2、IL-15和IL-21中的两种以上的组合如WO 2015/189356和WO 2015/189357中大体上所概述，这些文献在此明确地以全文引用的方式并入。因此，可能的组合包括IL-2和IL-15、IL-2和IL-21、IL-15和IL-21以及IL-2、IL-15和IL-21，其中后者在许多实施方案中具有特定用途。使用细胞因子的组合特别有利于产生淋巴细胞，特别是如本文所描述的T细胞。
D.步骤E：收集TIL
在快速第二次扩增步骤之后，可收集细胞。在一些实施方案中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的一个、两个、三个、四个或更多个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施方案中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的两个扩增步骤之后收集TIL。在一些实施方案中，在例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所提供的两个扩增步骤(一个初始第一次扩增和一个快速第二次扩增)之后收集TIL。
TIL可以任何适当且无菌的方式收集，包括例如离心。收集TIL的方法为本领域中熟知的且任何此类已知方法均可与本发明过程一起使用。在一些实施方案中，使用自动化系统收集TIL。
细胞收集器和/或细胞处理系统可购自各种来源，包括例如费森尤斯卡比(Fresenius Kabi)、Tomtec Life Science、珀金埃尔默(Perkin Elmer)和InotechBiosystems International，Inc.。本发明方法可采用任何基于细胞的收集器。在一些实施方案中，细胞收集器和/或细胞处理系统为基于膜的细胞收集器。在一些实施方案中，细胞收集通过细胞处理系统，例如LOVO系统(由费森尤斯卡比制造)进行。术语“LOVO细胞处理系统”也是指由任何供应商制造的任何可在无菌和/或密闭系统环境中将包括细胞的溶液泵送通过膜或过滤器(例如旋转膜或旋转过滤器)的仪器或装置，从而允许连续流动和细胞处理以移除上清液或细胞培养基而不发生团块化。在一些实施方案中，细胞收集器和/或细胞处理系统可在密闭无菌系统中进行细胞分离、洗涤、流体交换、浓缩和/或其他细胞处理步骤。
在一些实施方案中，快速第二次扩增(例如根据图8(特别是例如图8B和/或图8C)的步骤D)在密闭系统生物反应器中进行。在一些实施方案中，采用密闭系统进行如本文所描述的TIL扩增。在一些实施方案中，采用生物反应器。在一些实施方案中，采用生物反应器作为容器。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为例如G-Rex-100或G-Rex-500。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-Rex-100。在一些实施方案中，所采用的生物反应器为G-Rex-500。
在一些实施方案中，根据图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)的步骤E根据本文所描述的过程进行。在一些实施方案中，在无菌条件下通过注射器进入密闭系统，以维持系统的无菌性和密闭性质。在一些实施方案中，采用如本文所描述的密闭系统。
在一些实施方案中，根据本文所描述的方法收集TIL。在一些实施方案中，使用如本文所描述的方法收集第14与16天之间的TIL。在一些实施方案中，使用如本文所描述的方法在第14天收集TIL。在一些实施方案中，使用如本文所描述的方法在第15天收集TIL。在一些实施方案中，使用如本文所描述的方法在第16天收集TIL。
E.步骤F：扩增的TIL的测定
在一些实施方案中，使用本文所描述的测定方法中的一种检查来自上文提供的步骤的扩增的TIL的效力和/或功能。
在一个实施方案中，本发明包括一种确定如本文所描述的Gen 3TIL产物的效力的方法，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与Gen 3TIL产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)Gen 3TIL产物上一种以上标记物的表达或(2)Gen 3TIL产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定Gen 3TIL产物的效力。
或者，在一些实施方案中，使用组合测定分析扩增的TIL，该组合测定包括基于CD3或CD3/CD28微珠的刺激以及对至少两种分析物的ELISA或自动ELISA(例如，ELLA)检测，该至少两种分析物选自IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素和TNF-α。在一个实施方案中，此类组合测定的产物放行规格为：对于至少两种所选择的分析物为至少500pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少600pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少700pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少800pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少900pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少1000pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少1100pg/mL；或对于至少两种所选择的分析物为至少1200pg/mL；其中每毫升测试物含有1×105个TIL、2×105个TIL、3×105个TIL、4×105个TIL、5×105个TIL、6×105个TIL、7×105个TIL、8×105个TIL、9×105个TIL或10×105个TIL。
F.步骤G：最终调配并转移至输注容器
在如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中以示例性顺序提供且如上文和本文中所概述的步骤A至E完成之后，将细胞转移至容器(例如输注袋或无菌小瓶)以用于向患者施用。在一些实施方案中，一旦使用上文所描述的扩增方法获得治疗充足数目的TIL，则将其转移至可包括输注袋或无菌小瓶的容器中以用于以药物组合物(包括本文所描述的药物组合物)的形式向患者施用。可在转移至此容器之后评估TIL的效力，其可紧接在转移之后或在容器已储存一段时间之后进行，例如用于稳定性测试。
在一个实施方案中，使用本发明的方法扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一个实施方案中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。如本文所公开扩增的TIL可通过如本领域中已知的任何合适途径施用。在一些实施方案中，TIL以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
II.其他Gen 2、Gen 3和其他TIL制造工艺实施方案
A.PBMC饲养细胞比率
在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法(参见例如图8(特别是例如图8B和/或图8C))的培养基包含抗CD3抗体，例如OKT-3。抗CD3抗体与IL-2的组合在TIL群中诱导T细胞活化和细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab和F(ab')2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人，《免疫学杂志》1985，135，1719，其以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，PBMC饲养细胞层的数目如下计算：
A.T细胞体积(直径10μm)：V＝(4/3)πr3＝523.6μm3
B.具有40μm(4个细胞)高度的G-Rex 100(M)容积：V＝(4/3)πr3＝4×1012μm3
C.填满容积B所需的细胞数目：4×1012μm3/523.6μm3＝7.6×108μm3*0.64＝4.86×108
D.可在4D空间中被最佳活化的细胞数目：4.86×108/24＝20.25×106
E.外推至G-Rex 500的饲养细胞和TIL的数目：TIL：100×106，饲养细胞：2.5×109
在此计算中，使用在具有100cm2基底的圆柱体中提供TIL活化的二十面体几何学所需的单核细胞近似数目。计算导出的T细胞临界值活化的实验结果为约5×108，其与NCI实验资料密切相关，如Jin等人，《免疫疗法杂志》2012，35，283-292中所描述。在(C)中，乘数(0.64)是等效球体的随机堆积密度，由Jaeger和Nagel，《科学》，1992，255，1523-3计算得出。在(D)中，除数24系4维空间中可接触类似物体的等效球体的数目或“牛顿数(Newtonnumber)”，如Musin，《俄罗斯数学调查(Russ.Math.Surv.2003，58，794-795中所描述。
在一个实施方案中，在初始第一次扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞的数目大约为在快速第二次扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞的数目的一半。在某些实施方案中，方法包括在细胞培养基中进行初始第一次扩增，该细胞培养基包含比快速第二次扩增的细胞培养基少约50％的抗原呈递细胞。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的抗原呈递饲养细胞(APC)的数目大于在初始第一次扩增期间外源供应的APC的数目。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)20:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)10:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)9:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)8:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)7:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)6:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)5:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)4:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)3:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.9:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.8:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.7:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.6:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.5:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.4:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.3:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.2:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.1:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)10:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)5:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)4:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)3:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.9:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.8:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.7:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.6:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.5:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.4:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.3:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.2:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.1:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率为(约)2:1。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目与在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目的比率为(约)1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目为(约)1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目为(约)3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目选自(约)1.5×108个APC至(约)3×108个APC的范围，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目选自(约)4×108个APC至(约)7.5×108个APC的范围。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目选自(约)2×108个APC至(约)2.5×108个APC的范围，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目选自(约)4.5×108个APC至(约)5.5×108个APC的范围。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增期间外源供应的APC数目为(约)2.5×108个APC，在快速第二次扩增期间外源供应的APC数目为(约)5×108个APC。
在一个实施方案中，在初始第一次扩增的第0天添加的APC(包括例如PBMC)的数目是在初始第一次扩增的第7天(例如方法的第7天)添加的PBMC数目的大约一半。在某些实施方案中，方法包括在初始第一次扩增的第0天添加抗原呈递细胞至第一TIL群且在第7天添加抗原呈递细胞至第二TIL群，其中在第0天添加的抗原呈递细胞的数目是在初始第一次扩增的第7天(例如方法的第7天)添加的抗原呈递细胞数目的大约50％。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)的数目大于在初始第一次扩增的第0天外源供应的PBMC的数目。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增中外源供应的APC以选自(约)1.0×106个APC/cm2至(约)4.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增中外源供应的APC以选自(约)1.5×106个APC/cm2至(约)3.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增中外源供应的APC以选自(约)2×106个APC/cm2至(约)3×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增中外源供应的APC以(约)2×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增中外源供应的APC以(约)1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106或4.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增中外源供应的APC以选自(约)2.5×106个APC/cm2至(约)7.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增中外源供应的APC以选自(约)3.5×106个APC/cm2至(约)6.0×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增中外源供应的APC以选自(约)4.0×106个APC/cm2至(约)5.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增中外源供应的APC以选自(约)4.0×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增中外源供应的APC以(约)2.5×106个APC/cm2、2.6×106个APC/cm2、2.7×106个APC/cm2、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106、4.5×106、4.6×106、4.7×106、4.8×106、4.9×106、5×106、5.1×106、5.2×106、5.3×106、5.4×106、5.5×106、5.6×106、5.7×106、5.8×106、5.9×106、6×106、6.1×106、6.2×106、6.3×106、6.4×106、6.5×106、6.6×106、6.7×106、6.8×106、6.9×106、7×106、7.1×106、7.2×106、7.3×106、7.4×106或7.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增中外源供应的APC以(约)1.0×106、1.1×106、1.2×106、1.3×106、1.4×106、1.5×106、1.6×106、1.7×106、1.8×106、1.9×106、2×106、2.1×106、2.2×106、2.3×106、2.4×106、2.5×106、2.6×106、2.7×106、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106或4.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中，在快速第二次扩增中外源供应的APC以(约)2.5×106个APC/cm2、2.6×106个APC/cm2、2.7×106个APC/cm2、2.8×106、2.9×106、3×106、3.1×106、3.2×106、3.3×106、3.4×106、3.5×106、3.6×106、3.7×106、3.8×106、3.9×106、4×106、4.1×106、4.2×106、4.3×106、4.4×106、4.5×106、4.6×106、4.7×106、4.8×106、4.9×106、5×106、5.1×106、5.2×106、5.3×106、5.4×106、5.5×106、5.6×106、5.7×106、5.8×106、5.9×106、6×106、6.1×106、6.2×106、6.3×106、6.4×106、6.5×106、6.6×106、6.7×106、6.8×106、6.9×106、7×106、7.1×106、7.2×106、7.3×106、7.4×106或7.5×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增中外源供应的APC以选自(约)1.0×106个APC/cm2至(约)4.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中，在快速第二次扩增中外源供应的APC以选自(约)2.5×106个APC/cm2至(约)7.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增中外源供应的APC以选自(约)1.5×106个APC/cm2至(约)3.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中，在快速第二次扩增中外源供应的APC以选自(约)3.5×106个APC/cm2至(约)6×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在其他实施方案中，在初始第一次扩增中外源供应的APC以选自(约)2×106个APC/cm2至(约)3×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中，在快速第二次扩增中外源供应的APC以选自(约)4×106个APC/cm2至(约)5.5×106个APC/cm2的范围的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增中外源供应的APC以(约)2×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中，在快速第二次扩增中外源供应的APC以(约)4×106个APC/cm2的密度接种于培养瓶中。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的PBMC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)20:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的PBMC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)10:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的PBMC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)9:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)8:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)7:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)6:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)5:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)4:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)3:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.9:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.8:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.7:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.6:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.5:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.4:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.3:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.2:1的范围。
在其他实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.1:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)10:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)5:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)4:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)3:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)2.9:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)2.8:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)2.7:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)2.6:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)2.5:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)2.4:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)2.3:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)2.2:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率选自(约)2:1至(约)2.1:1的范围。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率为(约)2:1。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目与在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目的比率为(约)1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为(约)1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC(包括例如PBMC)，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为(约)3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC(包括例如PBMC)。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自(约)1×108个APC(包括例如PBMC)至(约)3.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自(约)3.5×108个APC(包括例如PBMC)至(约)1×109个APC(包括例如PBMC)的范围。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自(约)1.5×108个APC至(约)3×108个APC(包括例如PBMC)的范围，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自(约)4×108个APC(包括例如PBMC)至(约)7.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自(约)2×108个APC(包括例如PBMC)至(约)2.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围，且在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目选自(约)4.5×108个APC(包括例如PBMC)至(约)5.5×108个APC(包括例如PBMC)的范围。
在另一个实施方案中，在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为(约)2.5×108个APC(包括例如PBMC)，且在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)数目为(约)5×108个APC(包括例如PBMC)。
在一个实施方案中，在初始第一次扩增的第0天添加的APC(包括例如PBMC)层数是在快速第二次扩增的第7天添加的APC(包括例如PBMC)层数的大约一半。在某些实施方案中，方法包括在初始第一次扩增的第0天添加抗原呈递细胞层至第一TIL群并在第7天添加抗原呈递细胞层至第二TIL群，其中在第0天添加的抗原呈递细胞层数是在第7天添加的抗原呈递细胞层数的大约50％。
在另一个实施方案中，在快速第二次扩增的第7天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数大于在初始第一次扩增的第0天外源供应的APC(包括例如PBMC)层数。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在平均厚度为(约)2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在平均厚度为(约)4个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在平均厚度为(约)一个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在平均厚度为(约)3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在平均厚度为(约)1.5个细胞层至(约)2.5个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在平均厚度为(约)3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在平均厚度为(约)1个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在平均厚度为(约)2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在平均厚度为(约)1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在平均厚度为(约)3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在平均厚度为(约)1个细胞层至(约)2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在平均厚度为(约)3个细胞层至(约)10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在平均厚度为(约)2个细胞层至(约)3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在平均厚度为(约)4个细胞层至(约)8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在平均厚度为(约)2个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在平均厚度为(约)4个细胞层至(约)8个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在平均厚度为(约)1、2或3个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在平均厚度为(约)3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:10的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:8的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:7的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:6的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:5的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:4的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:3的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:2的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.2至(约)1:8的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.3至(约)1:7的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.4至(约)1:6的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.5至(约)1:5的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.6至(约)1:4的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.7至(约)1:3.5的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.8至(约)1:3的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.9至(约)1:2.5的范围。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率为(约)1:2。
在另一个实施方案中，初始第一次扩增的第0天在具有等于APC(包括例如PBMC)第一层数的第一平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，快速第二次扩增的第7天在具有等于APC(包括例如PBMC)第二层数的第二平均厚度的层状APC(包括例如PBMC)存在下发生，其中APC(包括例如PBMC)第一层数与APC(包括例如PBMC)第二层数的比率选自(约)1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在一些实施方案中，初始第一次扩增中的APC数目选自约1.0×106个APC/cm2至约4.5×106个APC/cm2的范围，快速第二次扩增中的APC数目选自约2.5×106个APC/cm2至约7.5×106个APC/cm2的范围。
在一些实施方案中，初始第一次扩增中的APC数目选自约1.5×106个APC/cm2至约3.5×106个APC/cm2的范围，快速第二次扩增中的APC数目选自约3.5×106个APC/cm2至约6.0×106个APC/cm2的范围。
在一些实施方案中，初始第一次扩增中的APC数目选自约2.0×106个APC/cm2至约3.0×106个APC/cm2的范围，快速第二次扩增中的APC数目选自约4.0×106个APC/cm2至约5.5×106个APC/cm2的范围。
B.可选的细胞培养基组分
1.抗CD3抗体
在一些实施方案中，用于本文所描述的扩增方法(包括称为REP的那些扩增，参见例如图1和图8(特别是例如图8B))的培养基包含抗CD3抗体。抗CD3抗体与IL-2的组合在TIL群中诱导T细胞活化和细胞分裂。此效应可见于全长抗体以及Fab和F(ab')2片段，前者通常优选；参见例如Tsoukas等人，《免疫学杂志》1985，135，1719，特此以全文引用的方式并入。
如本领域技术人员将理解的，存在许多可用于本发明的合适的抗人CD3抗体，包括来自各种哺乳动物的抗人类CD3多克隆和单克隆抗体，包括但不限于鼠类、人类、灵长类动物、大鼠和犬科动物抗体。在特定实施方案中，使用OKT3抗CD3抗体(可购自新泽西州拉里坦的Ortho-McNeil或加利福尼亚州奥本的美天旎生物技术公司)。
2.4-1BB(CD137)激动剂
在一个实施方案中，初始第一次扩增和/或快速第二次扩增的细胞培养基包含TNFRSF激动剂。在一个实施方案中，TNFRSF激动剂为4-1BB(CD137)激动剂。4-1BB激动剂可为本领域中已知的任何4-1BB结合分子。4-1BB结合分子可为能够与人类或哺乳动物4-1BB结合的单克隆抗体或融合蛋白。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可包括免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的免疫球蛋白重链。4-1BB激动剂或4-1BB结合分子可具有重链和轻链。如本文所使用，术语“结合分子”还包括与4-1BB结合的抗体(包括全长抗体)；单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)；多克隆抗体；多特异性抗体(例如双特异性抗体)；人类、人源化或嵌合抗体；以及抗体片段，例如Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、上述任一项的抗原表位结合片段，以及抗体的经工程改造形式，例如scFv分子。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是抗原结合蛋白，其是完全人抗体。在一个实施方式中，4-1BB激动剂是抗原结合蛋白，其是人源化抗体。在一些实施方案中，用于本发明所公开的方法和组合物中的4-1BB激动剂包括抗4-1BB抗体、人类抗4-1BB抗体、小鼠抗4-1BB抗体、哺乳动物抗4-1BB抗体、单克隆抗4-1BB抗体、多克隆抗4-1BB抗体、嵌合抗4-1BB抗体、抗4-1BB纤连蛋白(adnectin)、抗4-1BB结构域抗体、单链抗4-1BB片段、重链抗4-1BB片段、轻链抗4-1BB片段、抗4-1BB融合蛋白，以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。已知激动性抗4-1BB抗体诱导强烈的免疫反应。Lee等人，《公共科学图书馆·综合(PLOS One)》2013，8，e69677。在优选实施方案中，4-1BB激动剂为激动性抗4-1BB人源化或全人单克隆抗体(即，源自单一细胞株的抗体)。在一个实施方案中，4-1BB激动剂为EU-101(Eutilex Co.Ltd.)、乌托鲁单抗或乌瑞芦单抗，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在优选实施方案中，4-1BB激动剂为乌托鲁单抗或乌瑞芦单抗或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。
在优选实施方案中，4-1BB激动剂或4-1BB结合分子也可以是融合蛋白。在优选实施方案中，相较于通常具有两个配体结合域的激动性单克隆抗体，多聚体4-1BB激动剂，例如三聚体或六聚体4-1BB激动剂(具有三个或六个配体结合域)可以诱导更高的受体(4-1BBL)聚集和内部细胞信号传导复合物的形成。例如Gieffers等人，《分子癌症治疗学》2013，12，2735-47描述了三聚体(三价)或六聚体(或六价)或更高聚体融合蛋白，其包含三个TNFRSF结合域和IgG1-Fc并可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白。
已知激动性4-1BB抗体和融合蛋白诱导强烈的免疫反应。在优选实施方案中，4-1BB激动剂是以足以减少毒性的方式与4-1BB抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(例如NK细胞的细胞毒性)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是消除Fc区功能的激动性4-1BB单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，4-1BB激动剂的特征在于以高亲和力和激动剂活性与人类4-1BB(SEQ ID NO:40)结合。在一个实施方案中，4-1BB激动剂为与人类4-1BB(SEQ ID NO:40)结合的结合分子。在一个实施方案中，4-1BB激动剂为与鼠类4-1BB(SEQ ID NO:41)结合的结合分子。4-1BB激动剂或结合分子所结合的4-1BB抗原的氨基酸序列概述于表5中。
表5.4-1BB抗原的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所描述的组合物、工艺和方法包括如下4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约100pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约90pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约80pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约70pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约60pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约50pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、以约40pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB、或以约30pM或更低的KD结合人类或鼠类4-1BB。
在一些实施方案中，所描述的组合物、工艺和方法包括如下4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约7.5×1051/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约8×105l/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约9×1051/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类4-1BB结合、或以约1×106 1/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类4-1BB结合。
在一些实施方案中，所描述的组合物、工艺和方法包括如下4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合、或以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.8×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合、或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类4-1BB结合。
在一些实施方案中，所描述的组合物、工艺和方法包括如下4-1BB激动剂，该4-1BB激动剂以约10nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约9nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约8nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约7nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约6nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约5nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约4nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约3nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、以约2nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合、或以约1nM或更低的IC50与人类或鼠类4-1BB结合。
在优选实施方案中，4-1BB激动剂为乌托鲁单抗(也称为PF-05082566或MOR-7480)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌托鲁单抗可购自辉瑞公司(Pfizer，Inc.)。乌托鲁单抗为免疫球蛋白G2-λ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(全人)单克隆抗体。乌托鲁单抗的氨基酸序列列于表6中。乌托鲁单抗包括位于Asn59和Asn292的糖基化位点；位于位置22-96(VH-VL)、143-199(CH1-CL)、256-316(CH2)和362-420(CH3)的重链链内二硫键；位于位置22'-87'-(VH-VL)和136'--195'-(CH1-CL)的轻链链内二硫键；位于IgG2A同工型位置218-218、219-219、222-222和225-225、位于IgG2A/B同工型位置218-130、219-219、222-222和225-225和位于IgG2B同工型位置219-130(2)、222-222和225-225的链间重链-重链二硫键；以及位于IgG2A同工型位置130-213'-(2)、IgG2A/B同工型位置218-213'-和130-213'-和位于IgG2B同工型位置218-213'-(2)的链间重链-轻链二硫键。乌托鲁单抗及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利第8,821,867、8,337,850和9,468,678号和国际专利申请公开第WO 2012/032433 A1号中，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。乌托鲁单抗的临床前特征描述于Fisher等人，《癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunolog.&Immunother.)》2012，61，1721-33中。目前乌托鲁单抗在多种血液和实体肿瘤适应症的临床试验包括美国国家卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)clinicaltrials.gov识别号NCT02444793、NCT01307267、NCT02315066和NCT02554812。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括SEQ ID NO:42所示的重链和SEQ ID NO:43所示的轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别具有SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43中所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别与SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别与SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别与SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别与SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别与SEQ IDNO:42和SEQ ID NO:43所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括乌托鲁单抗的重链和轻链的CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:44所示的序列，且4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:45所示的序列，以及它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括VH和VL区，其分别与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列具有至少99％同一性。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括VH和VL区，其分别与SEQID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列具有至少98％同一性。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括VH和VL区，其分别与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列具有至少97％同一性。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括VH和VL区，其分别与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列具有至少96％同一性。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括VH和VL区，其分别与SEQ IDNO:44和SEQ ID NO:45所示序列具有至少95％同一性。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括含有VH和VL区的scFv抗体，这些区分别与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示序列具有至少99％同一性。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别具有SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂为药品监管机构参考乌托鲁单抗许可的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包括4-1BB抗体，该4-1BB抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其与该参考药品或参考生物制品相比包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为乌托鲁单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中4-1BB激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中参考药品或参考生物制品为乌托鲁单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为乌托鲁单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中所包含的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为乌托鲁单抗。
表6.与乌托鲁单抗相关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列。
在优选实施方案中，4-1BB激动剂为单克隆抗体乌瑞芦单抗(也称为BMS-663513和20H4.9.h4a)或其片段、衍生物、变体或生物类似物。乌瑞芦单抗可购自百时美施贵宝公司和Creative Biolabs，Inc.。乌瑞芦单抗为免疫球蛋白G4-κ抗[智人TNFRSF9(肿瘤坏死因子受体超家族成员9，4-1BB，T细胞抗原ILA，CD137)]智人(全人)单克隆抗体。乌瑞芦单抗的氨基酸序列列于表7中。乌瑞芦单抗包括位于位置298(和298”)的N-糖基化位点；位于位置22-95(VH-VL)、148-204(CH1-CL)、262-322(CH2)和368-426(CH3)(和位于位置22”-95”、148”-204”、262”-322”和368”-426”)的重链链内二硫键；位于位置23'-88'(VH-VL)和136'-196'(CH1-CL)(和位于位置23”'-88”'和136”'-196”')的轻链链内二硫键；位于位置227-227”和230-230”的链间重链-重链二硫键；和位于135-216'和135”-216”'的链间重链-轻链二硫键。乌瑞芦单抗及其变体和片段的制备和性质描述于美国专利第7,288,638和8,962,804号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。乌瑞芦单抗的临床前和临床特征描述于Segal等人，《临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)》2016，可访问http:/dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272。目前乌瑞芦单抗在多种血液和实体肿瘤适应症的临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT01775631、NCT02110082、NCT02253992和NCT01471210。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括SEQ ID NO:52所示的重链和SEQ ID NO:53所示的轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别具有SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别与SEQ IDNO:52和SEQ ID NO:53所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括乌瑞芦单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，4-1BB激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:54所示的序列，且4-1BB激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:55所示的序列，以及它们的保守氨基酸取代。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括VH和VL区，其分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列具有至少99％同一性。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括VH和VL区，其分别与SEQID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列具有至少98％同一性。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括VH和VL区，其分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列具有至少97％同一性。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括VH和VL区，其分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列具有至少96％同一性。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括VH和VL区，其分别与SEQ IDNO:54和SEQ ID NO:55所示序列具有至少95％同一性。在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括含有VH和VL区的scFv抗体，这些区分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列具有至少99％同一性。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂包括分别具有SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂为药品监管机构参考乌瑞芦单抗许可的4-1BB激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包括4-1BB抗体，该4-1BB抗体包括与参考药品或参考生物学产品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为乌瑞芦单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的4-1BB激动剂抗体，其中4-1BB激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为乌瑞芦单抗。4-1BB激动剂抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为乌瑞芦单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为乌瑞芦单抗。
表7.与乌瑞芦单抗相关的4-1BB激动剂抗体的氨基酸序列。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂选自下组：1D8、3Elor、4B4(BioLegend309809)、H4-1BB-M127(BD Pharmingen 552532)、BBK2(赛默飞世尔MS621PABX)、145501(LeincoTechnologies B591)、通过保藏为ATCC第HB-11248号的细胞株产生且美国专利第6,974,863号中公开的抗体、5F4(BioLegend 31 1503)、C65-485(BD Pharmingen559446)、美国专利申请公开第2005/0095244号中公开的抗体、美国专利第7,288,638号中公开的抗体(例如20H4.9-IgGl(BMS-663031))、美国专利第6,887,673号中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利第7,214,493号中公开的抗体、美国专利第6,303,121号中公开的抗体、美国专利第6,569,997号中公开的抗体、美国专利第6,905,685号中公开的抗体(例如4E9或BMS-554271)、美国专利第6,362,325号中公开的抗体(例如1D8或BMS-469492；3H3或BMS-469497；或3El)、美国专利第6,974,863号中公开的抗体(例如53A2)；美国专利第6,210,669号中公开的抗体(例如1D8、3B8或3El)、美国专利第5,928,893号中描述的抗体、美国专利第6,303,121号中公开的抗体、美国专利第6,569,997号中公开的抗体、国际专利申请公开第WO 2012/177788、WO 2015/119923和WO 2010/042433号中公开的抗体，以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物，其中前述专利或专利申请公开中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂为以下中描述的4-1BB激动融合蛋白：国际专利申请公开第WO 2008/025516 A1号、第WO 2009/007120 A1号、第WO 2010/003766 A1号、第WO 2010/010051 A1号和第WO 2010/078966 A1号；美国专利申请公开第2011/0027218A1号、第2015/0126709A1号、第2011/0111494A1号、第2015/0110734A1号和第2015/0126710A1号；和美国专利第9,359,420号、第9,340,599，8,921,519号和第8,450,460号，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂为如结构I-A(C末端Fc抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N末端Fc抗体片段融合蛋白)所描绘的4-1BB激动融合蛋白(参见图18)或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在结构I-A和I-B中，圆柱指单个多肽结合域。结构I-A和I-B包括三个线性连接的TNFRSF结合域，这些TNFRSF结合域源自例如4-1BBL(4-1BB配体、CD137配体(CD137L)或肿瘤坏死因子超家族成员9(tumor necrosis factor superfamilymember 9；TNFSF9)或结合4-1BB的抗体，这些TNFRSF结合域折叠形成三价蛋白质，接着该三价蛋白质通过IgG1-Fc(包括CH3和CH2结构域)与第二个三价蛋白质连接，随后该IgG1-Fc用于通过二硫键(细长小椭圆)将两个三价蛋白质连接在一起，从而使结构稳定且提供能够将六个受体的细胞内信号传导结构域和信号传导蛋白质结合在一起形成信号传导复合物的激动剂。表示为圆柱体的TNFRSF结合域可以是scFv结构域，scFv结构域包含例如通过接头连接的VH链和VL链，该接头可包括亲水性残基和提供柔性的Gly与Ser序列以及提供溶解性的Glu与Lys。可使用任何scFv结构域设计，例如以下中描述的那些scFv结构域：de Marco，《微生物细胞工厂(Microbial Cell Factories)》，2011，10，44；Ahmad等人，《临床和发育免疫学(Clin&Dev.Immunol.)》2012，980250；Monnier等人，《抗体(Antibodies)》，2013，2，193-208；或本文中别处并入的参考文献。此种形式的融合蛋白结构描述于美国专利第9,359,420号、第9,340,599号、第8,921,519号和第8,450,460号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
图18中所给出的结构I-A的其他多肽结构域的氨基酸序列见于表8中。Fc结构域优选包括完整的恒定结构域(SEQ ID NO:62的氨基酸17-230)、完整的铰链结构域(SEQ IDNO:62的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO:62的氨基酸4-16)。用于连接C末端Fc抗体的优选接头可选自SEQ ID NO:63至SEQ ID NO:72中给出的实施方案，包括适合于融合其他多肽的接头。
表8.具有C末端Fc抗体片段融合蛋白质设计(结构I-A)的TNFRSF激动剂融合蛋白(包括4-1BB激动剂融合蛋白)的氨基酸序列。
图18中所提供的结构I-B的其他多肽结构域的氨基酸序列见于表9中。若Fc抗体片段融合至TNRFSF融合蛋白的N-末端(如结构I-B)，则Fc模块的序列优选为SEQ ID NO:73所示的序列，接头序列优选选自SED ID NO:74至SEQ ID NO:76所示的实施方案。
表9.具有N末端Fc抗体片段融合蛋白设计(结构I-B)的TNFRSF激动剂融合蛋白(包括4-1BB激动剂融合蛋白)的氨基酸序列。
在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包括一个以上选自下组的4-1BB结合域：乌托鲁单抗的可变重链和可变轻链、乌瑞芦单抗的可变重链和可变轻链、乌托鲁单抗的可变重链和可变轻链、选自表10中描述的可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、前述可变重链和可变轻链的任何组合，及它们的片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包括一个以上包括4-1BBL序列的4-1BB结合域。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包括一个以上包括根据SEQ ID NO:77的序列的4-1BB结合域。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包括一个以上包括可溶性4-1BBL序列的4-1BB结合域。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包括一个以上包括根据SEQ ID NO:78的序列的4-1BB结合域。
在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包括一个以上4-1BB结合域，该4-1BB结合域为scFv结构域，其包括分别与SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包括一个以上4-1BB结合域，该4-1BB结合域为scFv结构域，其包括分别与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的4-1BB激动剂融合蛋白包括一个以上4-1BB结合域，该4-1BB结合域为scFv结构域，其包括分别与表10中给出的VH和VL序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。
表10.适用作融合蛋白中4-1BB结合域或适用作scFv 4-1BB激动剂抗体的其他多肽结构域。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂为4-1BB激动性单链融合多肽，其包括(i)第一可溶性4-1BB结合域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1BB结合域、(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性4-1BB结合域，进一步包括在N末端和/或C末端的其他结构域，且其中该其他结构域为Fab或Fc片段结构域。在一个实施方案中，4-1BB激动剂为4-1BB激动性单链融合多肽，其包括(i)第一可溶性4-1BB结合域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性4-1BB结合域、(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性4-1BB结合域，进一步包括在N末端和/或C末端的其他结构域，且其中该其他结构域为Fab或Fc片段结构域，其中每个可溶性4-1BB结构域均缺少茎(stalk)区(有助于三聚化作用并提供与细胞膜的一定距离，但不是4-1BB结合结构域的一部分)，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂为4-1BB激动性单链融合多肽，其包括(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子域、(ii)第一肽接头、(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子域、(iv)第二肽接头，和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子域，其中每个可溶性TNF超家族细胞因子结构域均缺乏茎区，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度，其中每个TNF超家族细胞因子结构域均是4-1BB结合结构域。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂为4-1BB激动scFv抗体，其包括与任一前述VL结构域连接的任一前述VH结构域。
在一个实施方案中，4-1BB激动剂为BPS Bioscience 4-1BB激动剂抗体，目录号79097-2，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BPS Bioscience。在一个实施方案中，4-1BB激动剂为Creative Biolabs 4-1BB激动剂抗体，目录号MOM-18179，可购自美国纽约州雪利市的Creative Biolabs(Creative Biolabs，Shirley，NY，USA)。
3.OX40(CD134)激动剂
在一个实施方案中，TNFRSF激动剂为OX40(CD134)激动剂。OX40激动剂可为本领域已知的任何OX40结合分子。OX40结合分子可以为能够与人类或哺乳动物OX40结合的单克隆抗体或融合蛋白。OX40激动剂或OX40结合分子可包括免疫球蛋白分子的任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类的免疫球蛋白重链。OX40激动剂或OX40结合分子可具有重链和轻链。如本文所用，术语结合分子还包括与OX40结合的抗体(包括全长抗体)、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人类抗体、人源化或嵌合抗体和抗体片段(例如Fab片段、F(ab')片段、由Fab表达文库产生的片段、以上任一项的抗原表位-结合片段)和抗体的经工程改造形式(例如scFv分子)。在一个实施方案中，OX40激动剂为一种全人抗体的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，OX40激动剂为一种人源化抗体的抗原结合蛋白。在一些实施方案中，用于本公开方法和组合物中的OX40激动剂包括抗OX40抗体、人类抗OX40抗体、小鼠抗OX40抗体、哺乳动物抗OX40抗体、单克隆抗OX40抗体、多克隆抗OX40抗体、嵌合抗OX40抗体、抗OX40纤连蛋白(adnectin)、抗OX40域抗体、单链抗OX40片段、重链抗OX40片段、轻链抗OX40片段、抗OX40融合蛋白，以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。在优选实施方案中，OX40激动剂为激动性抗OX40人源化或全人单克隆抗体(即，源自单一细胞株的抗体)。
在优选实施方案中，OX40激动剂或OX40结合分子也可为融合蛋白。包括与OX40L融合的Fc结构域的OX40融合蛋白描述于例如Sadun等人，《免疫疗法杂志》2009，182，1481-89。在优选实施方案中，相较于通常具有两个配体结合域的激动性单克隆抗体，多聚体OX40激动剂，例如三聚体或六聚体OX40激动剂(具有三个或六个配体结合域)可诱导更高的受体(OX40L)聚集和内部细胞信号传导复合物的形成。例如Gieffers等人，《分子癌症治疗学》2013，12，2735-47描述了三聚体(三价)或六聚体(或六价)或更高聚体融合蛋白，其包括三个TNFRSF结合域和IgG1-Fc并可选地进一步连接两个以上这些融合蛋白。
已知激动性OX40抗体和融合蛋白可诱导强烈的免疫反应。Curti等人，《癌症研究》2013，73，7189-98。在优选实施方案中，OX40激动剂为以足以减少毒性的方式与OX40抗原特异性结合的单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂为消除抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，例如NK细胞毒性的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂为消除抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂为消除补体依赖性细胞毒性(CDC)的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，OX40激动剂为消除Fc区功能的激动性OX40单克隆抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，OX40激动剂的特征在于以高亲和力和激动剂活性与人类OX40(SEQ ID NO:85)结合。在一个实施方案中，OX40激动剂为与人类OX40(SEQ ID NO:85)结合的结合分子。在一个实施方案中，OX40激动剂为与鼠类OX40(SEQ ID NO:86)结合的结合分子。表11中概述了与OX40激动剂或结合分子结合的OX40抗原的氨基酸序列。
表11.OX40抗原的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所描述组合物、工艺和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约100pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约90pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约80pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约70pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约60pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约50pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40、以约40pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40或以约30pM或更低的KD结合人类或鼠类OX40。
在一些实施方案中，所描述的组合物、工艺和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类OX40结合、以约7.5×1051/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类OX40结合、以约8×105 1/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类OX40结合、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类OX40结合、以约9×1051/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类OX40结合、以约9.5×105 1/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类OX40结合或以约1×106 1/M·s或更快的kassoc与人类或鼠类OX40结合。
在一些实施方案中，所描述的组合物、工艺和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合、以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合、以约2.8×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc与人类或鼠类OX40结合。
在一些实施方案中，所描述的组合物、工艺和方法包括如下OX40激动剂，该OX40激动剂以约10nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约9nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约8nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约7nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约6nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约5nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约4nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约3nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合、以约2nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合或以约1nM或更低的IC50与人类或鼠类OX40结合。
在一些实施方案中，OX40激动剂为塔沃西单抗，也称为MEDI0562或MEDI-0562。塔沃西单抗可获自阿斯利康公司(AstraZeneca，Inc.)的医学免疫子公司(MedImmunesubsidiary)。塔沃西单抗为免疫球蛋白G1-κ抗[智人TNFRSF4(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员4，OX40，CD134)]人源化和嵌合单克隆抗体。塔沃西单抗的氨基酸序列列于表12中。塔沃西单抗包括在位置301和301”处的N-糖基化位点，具有岩藻糖基化复合物二触角CHO型聚糖；在位置22-95(VH-VL)、148-204((CH1-CL)、265-325(CH2)和371-429(CH3)处(和在位置22”-95”、148”-204”、265”-325”和371”-429”处)的重链链内二硫键；在位置23'-88'(VH-VL)和134'-194'(CH1-CL)处(和在位置23”'-88”'和134”'-194”'处)的轻链链内二硫键；在位置230-230”和233-233”处的链间重链-重链二硫键；和在224-214'和224”-214”'处的链间重链-轻链二硫键。塔沃西单抗在各种实体肿瘤适应症中的当前临床试验包括美国国家卫生研究院clinicaltrials.gov识别号NCT02318394和NCT02705482。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括SEQ ID NO:87所示的重链和SEQ ID NO:88所示的轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别具有SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括塔沃西单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:89所示的序列及其保守氨基酸酸取代，OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:90所示的序列及其保守氨基酸酸取代。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ IDNO:89和SEQ ID NO:90所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括scFv抗体，该scFv抗体包括分别与SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括：分别具有SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:96所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方案中，OX40激动剂为药品监管机构参考塔沃西单抗许可的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包括OX40抗体，该OX40抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为塔沃西单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为塔沃西单抗。OX40激动剂抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为塔沃西单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为塔沃西单抗。
表12.与塔沃西单抗相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂为11D4，其为可获自辉瑞公司的全人抗体。11D4的制备和特性描述于美国专利第7,960,515号、第8,236,930号和第9,028,824号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。11D4的氨基酸序列列于表13中。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括SEQ ID NO:97所示的重链和SEQ ID NO:98所示的轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别具有SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:98所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括11D4的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:99所示的序列及其保守氨基酸取代，且OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:100所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:99和SEQ IDNO:100所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括：分别具有SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方案中，OX40激动剂为药品监管机构参考11D4许可的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包括OX40抗体，该OX40抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为11D4。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为11D4。OX40激动剂抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为11D4。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为11D4。
表13.与11D4相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂为18D8，其为可获自辉瑞公司的全人抗体。18D8的制备和特性描述于美国专利第7,960,515号、第8,236,930号和第9,028,824号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。18D8的氨基酸序列列于表14中。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括SEQ ID NO:107所示的重链和SEQ ID NO:108所示的轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别具有SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ IDNO:107和SEQ ID NO:108所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括18D8的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:109所示的序列及其保守氨基酸取代，且OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:110所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括：分别具有SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方案中，OX40激动剂为药品监管机构参考18D8许可的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包括OX40抗体，该OX40抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为18D8。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为18D8。OX40激动剂抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为18D8。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为18D8。
表14.与18D8相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂为Hu119-122，其为可获自葛兰素史克公共有限公司(GlaxoSmithKline plc)的人源化抗体。Hu119-122的制备和特性描述于美国专利第9,006,399号和第9,163,085号以及国际专利公开第WO 2012/027328号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。Hu119-122的氨基酸序列列于表15中。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括Hu119-122的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:117所示的序列及其保守氨基酸取代，且OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:118所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQID NO:117和SEQ ID NO:118所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:118所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ IDNO:117和SEQ ID NO:118所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括：分别具有SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方案中，OX40激动剂为药品监管机构参考Hu119-122许可的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包括OX40抗体，该OX40抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为Hu119-122。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为Hu119-122。OX40激动剂抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为Hu119-122。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为Hu119-122。
表15.与Hu119-122相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，OX40激动剂为Hu106-222，其为可获自葛兰素史克公共有限公司的人源化抗体。Hu106-222的制备和特性描述于美国专利第9,006,399号和第9,163,085号以及国际专利公开第WO 2012/027328号中，其公开内容以引用的方式并入本文中。Hu106-222的氨基酸序列列于表16中。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括Hu106-222的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，OX40激动剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:125所示的序列及其保守氨基酸取代，且OX40激动剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:126所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示序列具有至少99％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQID NO:125和SEQ ID NO:126所示序列具有至少98％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示序列具有至少97％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126所示序列具有至少96％同一性的VH和VL区。在一个实施方案中，OX40激动剂包括分别与SEQ IDNO:125和SEQ ID NO:126所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区。
在一个实施方案中，OX40激动剂包括：分别具有SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。
在一个实施方案中，OX40激动剂为药品监管机构参考Hu106-222许可的OX40激动剂生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物单克隆抗体包括OX40抗体，该OX40抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为Hu106-222。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的OX40激动剂抗体，其中OX40激动剂抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为Hu106-222。OX40激动剂抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为Hu106-222。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为Hu106-222。
表16.与Hu106-222相关的OX40激动剂抗体的氨基酸序列。
/>
在一些实施方案中，OX40激动剂抗体为MEDI6469(也称为9B12)。MEDI6469为鼠类单克隆抗体。Weinberg等人,《免疫疗法杂志》2006，29，575-585。在一些实施方案中，OX40激动剂是由Biovest Inc.(Malvern，马萨诸塞州，美国)保藏的9B12杂交瘤产生的抗体，如Weinberg等人,《免疫疗法杂志》2006，29，575-585中所描述，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，抗体包括MEDI6469的CDR序列。在一些实施方案中，抗体包括MEDI6469的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。
在一个实施方案中，OX40激动剂为L106 BD(Pharmingen，产品号340420)。在一些实施方案中，OX40激动剂包括抗体L106(BD Pharmingen，产品号340420)的CDR。在一些实施方案中，OX40激动剂包括抗体L106(BD Pharmingen，产品号340420)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一个实施方案中，OX40激动剂为ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)。在一些实施方案中，OX40激动剂包括抗体ACT35(Santa CruzBiotechnology，目录号20073)的CDR。在一些实施方案中，OX40激动剂包括抗体ACT35(Santa Cruz Biotechnology，目录号20073)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。在一个实施方案中，OX40激动剂为鼠类单克隆抗体抗mCD134/mOX40(克隆OX86)，可购自新罕布什尔州西黎巴嫩的BioXcell Inc的InVivoMAb。
在一个实施方案中，OX40激动剂选自以下中描述的OX40激动剂：国际专利申请公开第WO 95/12673号、第WO 95/21925号、第WO 2006/121810号、第WO 2012/027328号、第WO2013/028231号、第WO 2013/038191号和第WO 2014/148895号；欧洲专利申请第EP 0672141号；美国专利申请公开第2010/136030号、第2014/377284号、第2015/190506号和第2015/132288号(包括克隆20E5和12H3)；和美国专利第7,504,101号、第7,550,140号、第7,622,444号、第7,696,175号、第7,960,515号、第7,961,515号、第8,133,983号、第9,006,399号和第9,163,085号，其中每一篇的公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，OX40激动剂为如结构I-A(C末端Fc抗体片段融合蛋白)或结构I-B(N末端Fc抗体片段融合蛋白)中所描绘的OX40激动融合蛋白，或其片段、衍生物、缀合物、变体或生物类似物。结构I-A和I-B的特性已在上文和美国专利第9,359,420号、第9,340,599号、第8,921,519号和第8,450,460号中描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。图18中所提供的结构I-A的多肽结构域的氨基酸序列见于表9中。Fc结构域优选包括完整的恒定结构域(SEQ ID NO:62的氨基酸17-230)、完整的铰链结构域(SEQ ID NO:62的氨基酸1-16)或铰链结构域的一部分(例如SEQ ID NO:62的氨基酸4-16)。用于连接C末端Fc抗体的优选的接头可选自SEQ ID NO:63至SEQ ID NO:72中给出的实施方案，包括适合于融合其他多肽的接头。同样，图18中所提供的结构I-B的多肽结构域的氨基酸序列见于表10中。如果Fc抗体片段融合至TNRFSF融合蛋白的N-末端(如结构I-B)，则Fc模块的序列优选为SEQID NO:73所示的序列，且接头序列优选选自SED ID NO:74至SEQ ID NO:76中所示的那些实施方案。
在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上选自下组的OX40结合域：塔沃西单抗的可变重链和可变轻链、11D4的可变重链和可变轻链、18D8的可变重链和可变轻链、Hu119-122的可变重链和可变轻链、Hu106-222的可变重链和可变轻链、选自表17中描述的可变重链和可变轻链的可变重链和可变轻链、前述的可变重链和可变轻链的任何组合，以及它们的片段、衍生物、缀合物、变体和生物类似物。
在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上包括OX40L序列的OX40结合域。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上包括根据SEQ ID NO:133的序列的OX40结合域。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上包括可溶性OX40L序列的OX40结合域。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上包括根据SEQ ID NO:134的序列的OX40结合域。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上包括根据SEQ ID NO:135的序列的OX40结合域。
在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上OX40结合域，该OX40结合域为scFv结构域，该scFv结构域包括分别与SEQ ID NO:89和SEQ IDNO:90所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上OX40结合域，该OX40结合域为scFv结构域，该scFv结构域包括分别与SEQ ID NO:99和SEQ ID NO:100所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上OX40结合域，该OX40结合域为scFv结构域，该scFv结构域包括分别与SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上OX40结合域，该OX40结合域为scFv结构域，该scFv结构域包括分别与SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上OX40结合域，该OX40结合域为scFv结构域，该scFv结构域包括分别与SEQID NO:125和SEQ ID NO:126所示序列具有至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。在一个实施方案中，根据结构I-A或I-B的OX40激动剂融合蛋白包括一个以上OX40结合域，该OX40结合域为scFv结构域，该scFv结构域包括各自与表17中给出的VH和VL序列至少95％同一性的VH和VL区，其中VH和VL结构域由接头连接。
表17.适用作融合蛋白中OX40结合域(例如结构I-A和I-B)或适用作scFv OX40激动剂抗体的其他多肽结构域。
/>
在一个实施方案中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包括：(i)第一可溶性OX40结合域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性OX40结合域；(iv)第二肽接头；和(v)第三可溶性OX40结合域，进一步包括在N末端和/或C末端的其他结构域，且其中该其他结构域为Fab或Fc片段结构域。在一个实施方案中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包括：(i)第一可溶性OX40结合域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性OX40结合域；(iv)第二肽接头；和(v)第三可溶性OX40结合域，进一步包括在N末端和/或C末端的其他结构域，且其中该其他结构域为Fab或Fc片段结构域，其中每个可溶性OX40结构域均缺少茎(stalk)区(有助于三聚化作用并提供与细胞膜的一定距离，但不是OX40结合结构域的一部分)，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度。
在一些实施方案中，OX40激动剂为OX40激动性单链融合多肽，其包括：(i)第一可溶性肿瘤坏死因子(TNF)超家族细胞因子域；(ii)第一肽接头；(iii)第二可溶性TNF超家族细胞因子域；(iv)第二肽接头；和(v)第三可溶性TNF超家族细胞因子域，其中每个可溶性TNF超家族细胞因子结构域均缺乏茎区，第一肽接头和第二肽接头独立地具有3至8个氨基酸的长度，其中每个TNF超家族细胞因子结构域均是OX40结合结构域。
在一些实施方案中，OX40激动剂为MEDI6383。MEDI6383为OX40激动性融合蛋白且可如美国专利第6,312,700号中所描述来制备，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，OX40激动剂为OX40激动性scFv抗体，其包括与任一前述VL结构域连接的任一前述VH结构域。
在一个实施方案中，OX40激动剂为Creative Biolabs OX40激动剂单克隆抗体MOM-18455，可购自美国纽约州雪利市的Creative Biolabs，Inc.。
在一个实施方案中，OX40激动剂为OX40激动性抗体克隆Ber-ACT35，可购自美国加利福尼亚州圣地亚哥的BioLegend，Inc.。
C.可选的细胞存活率分析
可选地，在初始第一次扩增(有时称为初始主体扩增(initial bulk expansion))之后，可使用本领域已知的标准分析进行细胞存活率分析。因此，在某些实施方案中，方法包括在初始第一次扩增之后进行细胞存活率分析。例如，可在主体TIL样本上进行台盼蓝排除测定，其选择性标记死细胞且允许存活率评估。其他用于测试存活率的分析可包括但不限于阿尔玛蓝(Alamar blue)分析和MTT分析。
1.细胞计数、存活率、流式细胞术
在一些实施方案中，测量细胞计数和/或存活率。标记物(例如但不限于CD3、CD4、CD8和CD56以及本文所公开或描述的任何其他标记物)的表达可通过流式细胞术，使用FACSCanto流式细胞仪(美国新泽西州富兰克林湖的BD Biosciences)，用抗体(例如但不限于可购自BD Biosciences，Inc.(加利福尼亚州圣荷西)的抗体)来进行测量。细胞可使用一次性c-芯片血细胞计数器(VWR，伊利诺伊州巴达维亚)手动计数，且存活率可使用本领域中已知的任何方法(包括但不限于台盼蓝染色)来评估。细胞存活率也可基于美国专利申请公开第2018/0282694号测定，其以全文引用的方式并入本文中。细胞存活率也可基于美国专利申请公开第2018/0280436号或国际专利申请公开第WO/2018/081473号测定，两者全文均出于所有目的并入本文中。
在一些情况下，主体TIL群可使用下文讨论的方案立即冷冻保存。或者，主体TIL群可进行REP然后如下文所讨论冷冻保存。类似地，在经基因修饰的TIL将会用于治疗的情况下，主体或REP TIL群可进行基因修饰以用于合适的治疗。
2.细胞培养
在一个实施方案中，用于扩增TIL的方法(包括上文所讨论以及图1和图8，特别是例如图8B和/或图8C中例示的那些方法)可包括使用约5,000mL至约25,000mL的细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基或约5,800mL至约8,700mL的细胞培养基。在一些实施方案中，培养基为不含血清培养基。在一些实施方案中，初始第一次扩增中的培养基不含血清。在一些实施方案中，第二次扩增中的培养基不含血清。在一些实施方案中，初始第一次扩增和第二次扩增(也称为快速第二次扩增)中的培养基均不含血清。在一个实施方案中，扩增TIL数目使用不超过一种类型的细胞培养基。可使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基，也被称作AIM V培养基(可购自加利福尼亚州喀斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad CA))。就此而言，本发明方法有利地减少了扩增TIL数目所需的培养基的量和培养基类型的数目。在一个实施方案中，扩增TIL的数量可包括以不超过每三天一次或每四天一次的频率饲养细胞。在透气容器中扩增细胞数目通过减少扩增细胞所需的饲养频率来简化扩增细胞数目所需的程序。
在一个实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基为未经过滤的。使用未经过滤的细胞培养基可简化扩增细胞数目所需的程序。在一个实施方案中，第一和/或第二透气容器中的细胞培养基缺乏β-巯基乙醇(BME)。
在一个实施方案中，持续一定时间的方法包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样本；在第一透气容器中培养肿瘤组织样本持续约1至8天(例如约7天)的时间作为初始第一次扩增或持续约8天的时间作为初始第一次扩增，该第一透气容器含有包含IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器且在第二透气容器中扩增TIL的数目持续约7至9天(例如约7天、约8天或约9天)的时间，该第二透气容器含有包含IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一个实施方案中，持续一定时间的方法包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样本；在第一透气容器中培养肿瘤组织样本持续约1至7天(例如约7天)的时间作为初始第一次扩增，该第一透气容器含有包含IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器且在第二透气容器中扩增TIL的数目持续约7至14天或约7至9天(例如约7天、约8天、约9天、约10天或约11天)的时间，该第二透气容器含有包含IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一个实施方案中，持续一定时间的方法包括：从哺乳动物获得肿瘤组织样本；在第一透气容器中培养肿瘤组织样本持续约1至7天(例如约7天)的时间作为初始第一次扩增，该第一透气容器含有包含IL-2、1X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基；将TIL转移至第二透气容器且在第二透气容器中扩增TIL的数目持续约7至11天(例如约7天、约8天、约9天、约10天或约11天)的时间，该第二透气容器含有包含IL-2、2X抗原呈递饲养细胞和OKT-3的细胞培养基。
在一个实施方案中，TIL在透气容器中扩增。透气容器已用于使用本领域已知的方法、组合物和装置使用PBMC来扩增TIL，包括美国专利申请公开第2005/0106717A1号中描述的那些，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，TIL在透气袋中扩增。在一个实施方案中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统(例如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare))扩增。在一些实施方案中，TIL使用在透气袋中扩增TIL的细胞扩增系统(例如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare))扩增。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括透气细胞袋，该透气细胞袋的容积选自下组：约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L。
在一个实施方案中，TIL可在G-Rex培养瓶(可购自Wilson Wolf Manufacturing)中扩增。此类实施方案允许细胞群从约5×105个细胞/cm2扩增至10×106与30×106个细胞/cm2之间。在一个实施方案中，在不进行饲养的情况下进行。在一个实施方案中，在不进行饲养的情况下进行，只要G-Rex培养瓶中的培养基停留在约10cm的高度。在一个实施方案中，不进行饲养但添加一种以上细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子可以以丸剂形式添加而无需将细胞因子与培养基进行任何混合。此类容器、装置和方法为本领域中已知的且已用于扩增TIL，且包括以下中描述的那些：美国专利申请公开第2014/0377739A1号、国际公开第WO 2014/210036 A1号、美国专利申请公开第2013/0115617A1号、国际公开第WO 2013/188427 A1号、美国专利申请公开第2011/0136228A1号、美国专利第8,809,050B2号、国际公开第WO 2011/072088 A2号、美国专利申请公开第2016/0208216A1号、美国专利申请公开第2012/0244133A1号、国际公开第WO 2012/129201 A1号、美国专利申请公开第2013/0102075A1号、美国专利第8,956,860B2号、国际公开第WO 2013/173835 A1号、美国专利申请公开第2015/0175966A1号，其公开内容以引用的方式并入本文中。此类过程也描述于Jin等人，《免疫疗法杂志》，2012，35:283-292中。
D.可选的TIL的基因工程改造
在一些实施方案中，在扩增步骤之前、期间或之后，包括在密闭无菌制造工艺期间(各自如本文所提供)进一步操作本发明的扩增的TIL，以用暂时性方式改变蛋白质表达。在一些实施方案中，暂时性改变的蛋白质表达是由于暂时性基因编辑。在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL用转录因子(transcription factor；TF)和/或其他能够暂时性改变TIL中的蛋白质表达的分子处理。在一些实施方案中，TF和/或其他能够暂时性改变蛋白质表达的分子提供TIL群中肿瘤抗原表达的改变和/或肿瘤抗原特异性T细胞数目的改变。
在某些实施方案中，方法包括基因编辑TIL群。在某些实施方案中，方法包括基因编辑第一TIL群、第二TIL群和/或第三TIL群。
在一些实施方案中，本发明包括通过核苷酸插入，例如通过核糖核酸(RNA)插入，包括插入信使RNA(mRNA)或小(或短)干扰RNA(siRNA)至TIL群中进行基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达或抑制一种以上蛋白质的表达，以及同时促进一组蛋白质与抑制另一组蛋白质的组合。
在一些实施方案中，本发明的扩增的TIL经历蛋白质表达的暂时性改变。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第一次扩增之前的主体TIL群，包括例如获自例如如图8(尤其图8B和/或图8C)中所指示的步骤A的TIL群中。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第一次扩增期间，包括例如在例如如图8(例如图8B和/或图8C)中所指示的步骤B中扩增的TIL群中。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第一次扩增之后，包括例如在第一与第二次扩增之间转变的TIL群(例如如本文所描述的第二TIL群)、获自例如如图8中所指示的步骤B且包括在步骤C中的TIL群中。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第二次扩增之前的主体TIL群中，包括例如在获自例如如图8中所指示的步骤C且在步骤D中其扩增之前的TIL群中。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第二次扩增期间，包括例如在例如如图8中所指示的步骤D中扩增的TIL群(例如第三TIL群)中。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变发生在第二次扩增之后，包括例如在获自例如如图8中所指示的步骤D中的扩增的TIL群中。
在一个实施方案中，暂时性改变TIL群的蛋白质表达的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法为本领域中已知的，且描述于例如以下中：Tsong，《生物理杂志》1991，60，297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，暂时性改变TIL群中的蛋白质表达的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包覆和胞吞作用)为本领域中已知的且描述于以下中：Graham和van der Eb，《病毒学》1973，52，456-467；Wigler等人，《美国国家科学院院刊》1979，76，1373-1376；和Chen和Okayarea，《分子细胞生物学》1987，7，2745-2752；和美国专利第5,593,875号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，暂时性改变TIL群中的蛋白质表达的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)在过滤水中的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域中已知的且描述于以下中：Rose等人，《生物技术》1991，10，520-525和Felgner等人，《美国国家科学院院刊》，1987，84，7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，暂时性改变TIL群中的蛋白质表达的方法包括使用以下中描述的方法的转染步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致干记忆T细胞(Stem Memory Tcell；TSCM)增加。TSCM是经历过抗原的中央记忆T细胞的早期祖细胞。TSCM通常表现出干细胞的长期存活、自我更新和多能性能力，并且通常是产生有效TIL产物所需要的。在过继细胞移植小鼠矩阵中，与其他T细胞亚群相比，TSCM表现出增强的抗肿瘤活性(Gattinoni等人《自然医学》2009，2011；Gattinoni，《自然癌症综述(Nature Rev.Cancer)》，2012；Cieri等人《血液》2013)。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致具有TIL群具有包含高比例TSCM的组成。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致TSCM百分比增加至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致TIL群中的TSCM增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致具有至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％TSCM的TIL群。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致具有至少5％、至少10％、至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％TSCM的治疗性TIL群。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致经历过抗原的T细胞的活力恢复(rejuvenation)。在一些实施方案中，活力恢复包括例如增殖增加、T细胞活化增加和/或抗原识别增加。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变会改变大部分T细胞的表达，以保留肿瘤来源的TCR库。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变不改变肿瘤来源的TCR库。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变维持了肿瘤来源的TCR库。
在一些实施方案中，蛋白质的暂时性改变导致特定基因的表达改变。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向包括但不限于以下的基因：PD-1(也称为PDCD1或CC279)、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受体(chimeric co-stimulatoryreceptor；CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1和/或cAMP蛋白激酶A(protein kinase A；PKA)。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向选自下组的基因：PD-1、TGFBR2、CCR4/5、CBLB(CBL-B)、CISH、嵌合共刺激受体(CCR)、IL-2、IL-12、IL-15、IL-21、NOTCH 1/2ICD、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CSCR3、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1/CXCL8、CCL22、CCL17、CXCL1/CXCL8、VHL、CD44、PIK3CD、SOCS1、和/或cAMP蛋白激酶A(PKA)。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向PD-1。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向TGFBR2。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCR4/5。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CBLB。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CISH。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCR(嵌合共刺激受体)。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向IL-2。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向IL-12。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向IL-15。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向IL-21。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向NOTCH 1/2ICD。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向TIM3。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向LAG3。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向TIGIT。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向TGFβ。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCR1。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCR2。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCR4。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCR5。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CXCR1。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CXCR2。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CSCR3。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCL2(MCP-1)。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCL3(MIP-1α)。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCL4(MIP1-β)。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCL5(RANTES)。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CXCL1。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CXCL8。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCL22。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CCL17。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向VHL。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向CD44。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向PIK3CD。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向SOCS1。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变靶向cAMP蛋白激酶A(PKA)。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致趋化因子受体增加和/或过度表达。在一些实施方案中，因暂时性蛋白质表达而过度表达的趋化因子受体包括具有配体的受体，该配体包括但不限于CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP1-β)、CCL5(RANTES)、CXCL1、CXCL8、CCL22和/或CCL17。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβR2和/或TGFβ的表达降低和/或减少(包括导致例如TGFβ通路阻断)。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致CBLB(CBL-B)的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致CISH的表达降低和/或减少。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致趋化因子受体增加和/或过度表达，以例如改善TIL运输或移动至肿瘤部位。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致嵌合共刺激受体(CCR)增加和/或过度表达。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致选自下组的趋化因子受体增加和/或过度表达：CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2和/或CSCR3。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致白介素增加和/或过度表达。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致选自下组的白介素增加和/或过度表达：IL-2、IL-12、IL-15和/或IL-21。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致NOTCH 1/2ICD增加和/或过度表达。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致VHL增加和/或过度表达。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致CD44增加和/或过度表达。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致PIK3CD增加和/或过度表达。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致SOCS1增加和/或过度表达，
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致cAMP蛋白激酶A(PKA)的表达降低和/或减少。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致选自下组的分子的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致选自下组的两种分子的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致PD-1和选自下组的一种分子的表达降低和/或减少：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致以下的表达降低和/或减少：PD-1、LAG3、CISH、CBLB、TIM3以及它们的组合。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致PD-1和以下中的一种的表达降低和/或减少：LAG3、CISH、CBLB、TIM3以及它们的组合。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致PD-1和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致PD-1和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致PD-1和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致LAG3和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致LAG3和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致CISH和CBLB的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致TIM3和PD-1的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致TIM3和LAG3的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致TIM3和CISH的表达降低和/或减少。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致TIM3和CBLB的表达降低和/或减少。
在一些实施方案中，通过γ逆转录病毒或慢病毒方法将选自CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1以及它们的组合的粘附分子插入第一TIL群、第二TIL群或收集的TIL群中(例如粘附分子的表达增加)。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致选自PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合的分子的表达降低和/或减少，并且CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1以及它们的组合的表达增加和/或增强。在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变导致选自PD-1、LAG3、TIM3、CISH、CBLB以及它们的组合的分子的表达降低和/或减少，并且CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1以及它们的组合的表达增加和/或增强。
在一些实施方案中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％。在一些实施方案中，表达减少至少约90％。在一些实施方案中，表达减少至少约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约99％。
在一些实施方案中，表达增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约80％。在一些实施方案中，表达增加至少约85％。在一些实施方案中，表达增加至少约90％。在一些实施方案中，表达增加至少约95％。在一些实施方案中，表达增加至少约99％。
在一些实施方案中，通过用转录因子(TF)和/或其他能够暂时性改变TIL中的蛋白质表达的分子处理TIL来诱导蛋白质表达的暂时性改变。在一些实施方案中，采用无SQZ载体的微流体平台进行转录因子(TF)和/或其他能够暂时性改变蛋白质表达的分子的细胞内递送。此类方法展示了将蛋白质(包括转录因子)递送至多种原代人类细胞(包括T细胞)的能力(Sharei等人.《美国国家科学院院刊(PNAS)》2013，以及Sharei等人.《公共科学图书馆·综合(PLOS ONE)》2015和Greisbeck等人.《免疫学杂志》第195卷，2015)已描述；参见，例如，国际专利公开WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1和WO 2017/123663A1，以上全部均以全文引用的方式并入本文中。描述于国际专利公开WO 2013/059343A1、WO 2017/008063A1和WO 2017/123663A1的此类方法可用于本发明中，以将TIL群暴露于转录因子(TF)和/或其他能够诱导暂时性蛋白质表达的分子，其中这些TF和/或其他能够诱导暂时性蛋白质表达的分子使TIL群中的肿瘤抗原的表达增加和/或肿瘤抗原特异性T细胞的数目增加，从而导致TIL群的重编程(reprogram)并且重编程的TIL群的治疗功效相较于非重编程的TIL群增加。在一些实施方案中，重编程导致相对于起始或先前TIL群(即，在重编程之前)，效应T细胞和/或中枢记忆T细胞亚群增加，如本文所描述。
在一些实施方案中，转录因子(TF)包括但不限于TCF-1、NOTCH 1/2ICD和/或MYB。在一些实施方案中，转录因子(TF)为TCF-1。在一些实施方案中，转录因子(TF)为NOTCH 1/2ICD。在一些实施方案中，转录因子(TF)为MYB。在一些实施方案中，转录因子(TF)与诱导性多能干细胞培养物(iPSC)，例如市售KNOCKOUT血清替代品(Gibco/赛默飞世尔)一起施用，以诱导另外TIL重编程。在一些实施方案中，转录因子(TF)与iPSC混合物一起施用，以诱导另外TIL重编程。在一些实施方案中，转录因子(TF)不与iPSC混合物一起施用。在一些实施方案中，重编程导致TSCM的百分比增加。在一些实施方案中，重编程导致TSCM的百分比增加约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％TSCM。
在一些实施方案中，如上文所描述的暂时性改变蛋白质表达的方法可与基因修饰TIL群的方法组合，包括稳定掺入基因以产生一种以上蛋白质的步骤。在某些实施方案中，方法包括基因修饰TIL群的步骤。在某些实施方案中，方法包括基因修饰第一TIL群、第二TIL群和/或第三TIL群。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括逆转录病毒转导的步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括慢病毒转导的步骤。慢病毒转导系统为本领域中已知的且描述于例如以下中：Levine等人，《美国国家科学院院刊》2006，103，17372-77；Zufferey等人，《自然生物技术学》1997，15，871-75；Dull等人，《病毒学杂志》1998，72，8463-71和美国专利第6,627,442号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括γ-逆转录病毒转导的步骤。γ-逆转录病毒转导系统为本领域中已知的且描述于例如Cepko和Pear，《分子生物学中的当前方案(Cur.Prot.Mol.Biol.)》1996，9.9.1-9.9.16，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括转座子介导的基因转移的步骤。转座子介导的基因转移系统为本领域中已知的，且包括其中转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得转座酶的长期表达不发生在转基因细胞中，例如作为mRNA(例如包括帽和多腺苷酸尾的mRNA)提供的转座酶。包括类鲑鱼型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶)，例如SB10、SB11和SB100x；以及经工程改造的酶活性增加的酶的合适的转座子介导的基因转移系统描述于例如以下中：Hackett等人，《分子疗法》2010，18，674-83和美国专利第6,489,458号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，蛋白质表达的暂时性改变是由自递送RNA干扰(self-delivering RNAinterference；sdRNA)诱导的表达减少，该自递送RNA干扰为具有高百分比的2'-OH取代(通常氟或-OCH3)的化学上合成的不对称siRNA双螺旋，其包括20个核苷酸的反义(向导)链和使用四乙基乙二醇(TEG)接头在其3'端处与胆固醇结合的13至15个碱基有义(随从)链。在一些实施方案中，该方法包括暂时性改变TIL群中的蛋白质表达，包括使用自递送RNA干扰(sdRNA)，其为具有高百分比的2'-OH取代(通常氟或-OCH3)的化学上合成的不对称siRNA双螺旋，其包括20个核苷酸的反义(向导)链和使用四乙基乙二醇(TEG)接头在其3'端处与胆固醇结合的13至15个碱基有义(随从)链。使用sdRNA的方法已描述于以下中：Khvorova和Watts，《自然生物技术学》2017，35，238-248；Byrne等人，《眼药理学与治疗学杂志(J.Ocul.Pharmacol.Ther.)》2013，29，855-864；和Ligtenberg等人，《分子疗法》2018(印制中)，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，将sdRNA递送至TIL群无需使用电穿孔、SQZ或其他方法，而是使用1至3天的时间，将TIL群暴露于在培养基中浓度为1μM/10,000个TIL的sdRNA。在某些实施方案中，该方法包括递送sdRNA至TIL群，其包括将TIL群暴露于在培养基中浓度为1μM/10,000个TIL的sdRNA持续1至3天之间的时间段。在一个实施方案中，将sdRNA递送至TIL群使用1至3天的时间段完成，其中使TIL群暴露于在培养基中浓度为10μM/10,000个TIL的sdRNA。在一个实施方案中，将sdRNA递送至TIL群使用1至3天的时间段完成，其中使TIL群暴露于在培养基中浓度为50μM/10,000个TIL的sdRNA。在一个实施方案中，将sdRNA递送至TIL群使用1至3天的时间段完成，其中使TIL群暴露于在培养基中浓度在0.1μM/10,000个TIL与50μM/10,000个TIL之间的sdRNA。在一个实施方案中，将sdRNA递送至TIL群使用1至3天的时间段完成，其中使TIL群暴露于在培养基中浓度在0.1μM/10,000个TIL与50μM/10,000个TIL之间的sdRNA，其中该暴露于sdRNA通过将新鲜sdRNA添加至培养基中来进行两次、三次、四次或五次。其他合适过程描述于例如以下：美国专利申请公开第2011/0039914A1号、第2013/0131141A1号和第2013/0131142A1号，和美国专利第9,080,171号，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，在制造期间将sdRNA插入TIL群中。在一些实施方案中，sdRNA编码干扰以下的RNA：NOTCH 1/2ICD、PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3、TIGIT、TGFβ、TGFBR2、cAMP蛋白激酶A(PKA)、BAFF BR3、CISH和/或CBLB。在一些实施方案中，表达的减少基于例如如通过流式细胞术和/或qPCR评估的基因沉默的百分比而确定。在一些实施方案中，表达减少约5％、约10％、约10％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约80％。在一些实施方案中，表达减少至少约85％。在一些实施方案中，表达减少至少约90％。在一些实施方案中，表达减少至少约95％。在一些实施方案中，表达减少至少约99％。
基于化学修饰siRNA的自递送RNAi技术可用于本发明的方法中，以成功递送sdRNA至如本文所描述的TIL。主链修饰与不对称siRNA结构和疏水性配体的组合(参见例如Ligtenberg等人，《分子疗法》2018和US20160304873)允许sdRNA通过简单地添加至培养基中，利用sdRNA的核酸酶稳定性而穿透经培养的哺乳动物细胞，无需另外的制剂和方法。此稳定性允许仅通过维持培养基中sdRNA的活性浓度来支持恒定水平的RNAi介导的靶基因活性降低。尽管不受理论束缚，但sdRNA的主链稳定化使得基因表达减少效应延长，其在非分裂细胞中可持续数月。
在一些实施方案中，超过95％的TIL转染效率和目标的表达减少通过各种特定sdRNA发生。在一些实施方案中，将含有若干未经修饰的核糖残基的sdRNA替换为完全修饰的序列，以增加RNAi效应的效力和/或持久性。在一些实施方案中，表达减少效应维持12小时、24小时、36小时、48小时、5天、6天、7天或8天或更长时间。在一些实施方案中，表达减少效应在sdRNA处理TIL后10天或更长时间时降低。在一些实施方案中，目标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施方案中，TIL中的目标表达维持超过70％的表达减少。在一些实施方案中，PD-1/PD-L1通路中的表达减少允许TIL表现更强效的体内效应，这在一些实施方案中是因为避免了PD-1/PD-L1通路的抑制效应。在一些实施方案中，由sdRNA引起的PD-1表达减少使得TIL增殖增加。
小干扰RNA(siRNA)，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一种双链RNA分子，长度通常为19-25个碱基对。siRNA用于RNA干扰(RNAinterference；RNAi)中，其中siRNA干扰具有互补核苷酸序列的特定基因的表达。
双链DNA(dsRNA)可通常用于定义包括一对互补RNA链(通常是有义(乘客)和反义(向导)链)的任何分子，且可包括单链突出区。与siRNA不同，术语dsRNA通常是指包括siRNA分子序列的前体分子，该前体分子通过裂解酶系统(包括Dicer)的作用从较大的dsRNA分子中释放。
sdRNA(自递送RNA)是一类新的经共价修饰的RNAi化合物，其与传统siRNA相比，不需要递送载体即可进入细胞，且具有改进的药理学。“自递送RNA”或“sdRNA”系一种疏水经修饰的RNA干扰-反义杂合体，其在体外初代细胞和体内局部施用后经证明为高度有效的。已证明无毒性下的稳固吸收和/或沉默。sdRNA通常是具有极小双链区的不对称化学修饰的核酸分子。sdRNA分子通常含有单链区和双链区，可在分子的单链和双链区内含有多种化学修饰。此外，如本文所描述，sdRNA分子可连接至疏水性缀合物，例如常规和高级的固醇型分子。sdRNAs和用于制造此类sdRNAs的相关方法也已在例如US20160304873、WO2010033246、WO2017070151、WO2009102427、WO2011119887、WO2010033247A2、WO2009045457、WO2011119852中广泛描述，以上所有的全部内容出于所有目的以引用的方式并入本文中。为了优化sdRNA结构、化学性质、靶向位置、序列偏好等，已开发了专有算法并用于sdRNA效力预测(参见例如US20160304873)。基于这些分析，功能性sdRNA序列通常定义为在1μM浓度下表达减少超过70％，其中有可能超过40％。
在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出目标基因的表达降低70％。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出目标基因的表达降低75％。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出目标基因的表达降低80％。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出目标基因的表达降低85％。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出目标基因的表达降低90％。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出目标基因的表达降低95％。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列表现出目标基因的表达降低99％。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.25μM至约4μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.25μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.5μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约0.75μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.0μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.25μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.5μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约1.75μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.0μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.25μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.5μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约2.75μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.0μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.25μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.5μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约3.75μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。在一些实施方案中，本发明中使用的sdRNA序列当以约4.0μM的浓度递送时显示出目标基因表达减少。
在一些实施方案中，寡核苷酸剂具有一种以上修饰以增加治疗剂的稳定性和/或有效性和实现寡核苷酸至待治疗的细胞或组织的有效递送。此类修饰可包括2'-O-甲基修饰、2'-O-氟修饰、二硫代磷酸酯修饰、2'F修饰的核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸和/或2'脱氧核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸经修饰以具有一个以上疏水性修饰，包括例如固醇、胆固醇、维生素D、萘基、异丁基、苯甲基、吲哚、色氨酸和/或苯基。在另一特定实施方案中，化学修饰的核苷酸为硫代磷酸酯、2'-O-甲基、2'脱氧、疏水性修饰和硫代磷酸酯的组合。在一些实施方案中，糖可经修饰且经修饰的糖可包括但不限于D-核糖、2'-O-烷基(包括2'-O-甲基和2'-O-乙基)，即2'-烷氧基、2'-氨基、2'-S-烷基、2'-卤基(包括2'-氟)、T-甲氧基乙氧基、2'-烯丙氧基(-OCH2CH＝CH2)、2'-炔丙基、2'-丙基、乙炔基、乙烯基、丙烯基和氰基，及其类似物。在一个实施方案中，糖部分可为己糖且并入寡核苷酸中，如Augustyns等人，《核酸研究(Nucl.Acids.Res.)》1992，18，4711中所描述。
在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在其整个长度上为双链，即在分子的任一末端处无突出的单链序列，即为平末端。在一些实施方案中，单个核酸分子可具有不同长度。换言之，本发明的双链寡核苷酸在其整个长度上并非双链。例如，当使用两个独立的核酸分子时，其中一个分子(例如包括反义序列的第一分子)可比与其杂交的第二分子长(留下一部分的分子为单链)。在一些实施方案中，当使用单个核酸分子时，在任一末端处的该分子的一部分可保持单链。
在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸含有错配和/或环或凸起，但在至少约70％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在至少约80％的寡核苷酸长度上为双链的。在另一个实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在至少约90％-95％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸在至少约96％-98％的寡核苷酸长度上为双链的。在一些实施方案中，本发明的双链寡核苷酸含有至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个错配。
在一些实施方案中，寡核苷酸可例如通过修饰3'或5'键联而基本上受到保护以免受核酸酶的影响(例如美国专利第5,849,902号和WO 98/13526)。例如，寡核苷酸可通过包含“封闭基团”而具有抗性。如本文所用的术语“封闭基团”是指可作为合成时的保护基或偶合基团与寡核苷酸或核单体连接的取代基(例如除OH基团以外)(例如FITC、丙基(CH2-CH2-CH3)、二醇(-O-CH2-CH2-O-)磷酸根(PO3 2")、氢膦酸盐或亚磷酰胺)。“封闭基团”也可包括保护寡核苷酸的5'和3'端的“末端封闭基团”或“核酸外切酶封闭基团”，其包括经修饰的核苷酸和非核苷酸核酸外切酶抗性结构。
在一些实施方案中，sdRNA内的连续多核苷酸的至少一部分通过取代键例如硫代磷酸酯键连接。
在一些实施方案中，化学修饰可导致细胞摄取增强至少1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500。在一些实施方案中，C或U残基中的至少一个包括疏水性修饰。在一些实施方案中，多个C和U含有疏水性修饰。在一些实施方案中，至少10％、15％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的C和U可含有疏水性修饰。在一些实施方案中，所有C和U均含有疏水性修饰。
在一些实施方案中，sdRNA或sd-rxRNAs通过并入可质子化胺而表现增强的sd-rxRNA分子的胞内体释放。在一些实施方案中，将可质子化胺并入有义链中(在RISC装载后被舍弃的分子部分中)。在一些实施方案中，本发明的sdRNA化合物包括不对称化合物，该不对称化合物包括双螺旋区(有效RISC进入所需，10-15个碱基长)和4-12个核苷酸长的单链区；具有13个核苷酸的双螺旋。在一些实施方案中，采用6个核苷酸的单链区。在一些实施方案中，sdRNA的单链区包括2-12个硫代磷酸酯核苷酸间键联(称为硫代磷酸酯修饰)。在一些实施方案中，采用6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一些实施方案中，本发明的sdRNA化合物还包括独特的化学修饰模式，其提供稳定性且与RISC进入相容。
例如，向导链也可通过任何证实稳定性而不干扰RISC进入的化学修饰来修饰。在一些实施方案中，向导链中的化学修饰模式包括大部分为2'F修饰且5'端经磷酸化的C和U核苷酸。
在一些实施方案中，sdRNA或sd-rxRNA中至少30％的核苷酸为经修饰的。在一些实施方案中，sdRNA或sd-rxRNA中至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸为经修饰的。在一些实施方案中，sdRNA或sd-rxRNA中100％的核苷酸为经修饰的。
在一些实施方案中，sdRNA分子具有最小的双链区。在一些实施方案中，分子的双链区为8-15个核苷酸长度。在一些实施方案中，分子的双链区为8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸长度。在一些实施方案中，双链区为13个核苷酸长度。向导链与随从链之间可有100％互补性，或向导链与随从链之间可存在一个以上错配。在一些实施方案中，在双链分子的一端上，分子为平末端或具有一个核苷酸突出。在一些实施方案中，分子的单链区为4-12个核苷酸长度。在一些实施方案中，单链区可为4、5、6、7、8、9、10、11或12个核苷酸长度。在一些实施方案中，单链区也可小于4个核苷酸或大于12个核苷酸长度。在某些实施方案中，单链区为6或7个核苷酸长度。
在一些实施方案中，sdRNA分子具有增加的稳定性。在一些情况下，化学修饰的sdRNA或sd-rxRNA分子在培养基中的半衰期大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或超过24小时，包括任何中间值。在一些实施方案中，sd-rxRNA在培养基中的半衰期大于12小时。
在一些实施方案中，对sdRNA进行优化以增加效力和/或减少毒性。在一些实施方案中，向导链和/或随从链的核苷酸长度和/或向导链和/或随从链中硫代磷酸酯修饰的数目在一些方面可影响RNA分子的效力，而用2'-0-甲基(2'OMe)修饰置换2'-氟(2'F)修饰在一些方面可影响分子的毒性。在一些实施方案中，预期减少分子的2'F含量将减少分子的毒性。在一些实施方案中，RNA分子中硫代磷酸酯修饰的数目可影响该分子进入细胞的摄取，例如该分子被动摄取进入细胞的效率。在一些实施方案中，sdRNA不具有2'F修饰，但其特征在于细胞摄取与组织渗透方面的功效相等。
在一些实施方案中，向导链的长度为大约18-19个核苷酸且具有大约2-14个磷酸酯修饰。例如，向导链可含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或超过14个经磷酸酯修饰的核苷酸。向导链可含有一个以上赋予增加的稳定性而不干扰RISC进入的修饰。磷酸酯修饰的核苷酸，例如硫代磷酸酯修饰的核苷酸，可在3'端、5'端或遍布于整个向导链中。在一些实施方案中，向导链的3'端的10个核苷酸含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个硫代磷酸酯修饰的核苷酸。向导链也可含有2'F和/或2'OMe修饰，其可位于整个分子中。在一些实施方案中，向导链中位置1的核苷酸(向导链的最5'位置的核苷酸)经2'OMe修饰和/或磷酸化。向导链内的C和U核苷酸可经2'F修饰。例如，19个核苷酸的向导链的位置2-10(或不同长度的向导链中的对应位置)中的C和U核苷酸可经2'F修饰。向导链内的C和U核苷酸也可经2'OMe修饰。例如，19个核苷酸的向导链的位置11-18(或不同长度的向导链中的对应位置)中的C和U核苷酸可经2'OMe修饰。在一些实施方案中，在向导链的最3'端处的核苷酸未经修饰。在某些实施方案中，向导链内的大部分C和U经2'F修饰，且向导链的5'端经磷酸化。在其他实施方案中，位置1和位置11-18中的C或U经2'OMe修饰，且向导链的5'端经磷酸化。在其他实施方案中，位置1和位置11-18中的C或U经2'OMe修饰，向导链的5'端经磷酸化，且位置2-10中的C或U经2'F修饰。
自递送RNAi技术提供了用RNAi剂直接转染细胞而无需另外的制剂或技术的方法。转染难以转染细胞株的能力、高体内活性和使用简单是这些组合物和方法的特征，其相对于基于siRNA的传统技术存在显著的功能优势，因此在关于减少本发明的TIL中目标基因表达的方法的若干实施方案中采用sdRNA方法。sdRNAi方法可以将化学合成的化合物直接递送至各种原代细胞和组织，无论是离体还是体内。在本文中本发明的一些实施方案中描述的sdRNA可购自美国马萨诸塞州伍斯特的Advirna LLC。
sdRNA形成为疏水性修饰的siRNA-反义寡核苷酸杂交结构，且公开于例如Byrne等人，2013年12月，《眼科药理学和治疗杂志(J.Ocular Pharmacology and Therapeutics)》，29(10):855-864中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可以使用无菌电穿孔将sdRNA寡核苷酸递送至本文所述的TIL。在某些实施方案中，该方法包括对TIL群进行无菌电穿孔以递送sdRNA寡核苷酸。
在一些实施方案中，寡核苷酸可与跨膜递送系统组合递送至细胞。在一些实施方案中，此跨膜递送系统包括脂质、病毒载体等。在一些实施方案中，寡核苷酸剂为不需要任何递送剂的自递送RNAi剂。在某些实施方案中，该方法包括使用跨膜递送系统来递送sdRNA寡核苷酸至TIL群。
使寡核苷酸和寡核苷酸组合物与本文所描述的TIL接触(例如使其接触，在本文中也称为施用或递送)并被本文所述的TIL摄取，包括通过TIL被动摄取。sdRNA可在以下时期添加至如本文所描述的TIL：在第一次扩增期间(例如步骤B)、在第一次扩增之后(例如在步骤C期间)、在第二次扩增之前或期间(例如在步骤D之前或期间)、在步骤D之后且在步骤E中收集之前、在步骤F中收集期间或之后、在步骤F中最终调配和/或转移至输注袋之前或期间，以及在步骤F中任何可选的冷冻保存步骤之前。此外，sdRNA可在由步骤F中任何冷冻保存步骤解冻之后添加。在一个实施方案中，可将一个以上靶向如本文中所描述的基因(包括PD-1、LAG3、TIM3、CISH和CBLB)的sdRNA，以选自100nM至20mM、200nM至10mM、500nm至1mM、1μM至100μM和1μM至100μM的浓度，添加至包含TIL和其他试剂的细胞培养基。在一个实施方案中，可将一个以上靶向如本文中所描述的基因(包括PD-1、LAG3、TIM3、CISH和CBLB)的sdRNA，以选自下组的量添加至包含TIL和其他试剂的细胞培养基：0.1μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、0.75μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.25μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、1.5μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、2μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基、5μ MsdRNA/10,000个TIL/100μL培养基，或10μM sdRNA/10,000个TIL/100μL培养基。在一个实施方案中，可将一个以上靶向如本文中所描述的基因(包括PD-1、LAG3、TIM3、CISH和CBLB)的sdRNA，在前REP(pre-REP)或REP阶段期间一天两次、一天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次或每七天一次添加至TIL培养物。
本发明的寡核苷酸组合物，包括sdRNA，可在扩增过程期间，例如通过将高浓度sdRNA溶解在细胞培养培养基中并允许有足够的时间进行被动摄取而与如本文所描述的TIL接触。在某些实施方案中，本发明方法包括使TIL群与如本文所描述的寡核苷酸组合物接触。在某些实施方案中，该方法包括将寡核苷酸(例如sdRNA)溶解于细胞培养基中，并使细胞培养基与TIL群接触。TIL可以是如本文所描述的第一群、第二群和/或第三群。
在一些实施方案中，可以通过合适的本领域认可的方法，包括磷酸钙、DMSO、甘油或葡聚糖、电穿孔，或通过转染，例如使用阳离子、阴离子或中性脂质组合物或脂质体，使用本领域已知的方法来增强寡核苷酸向细胞中的递送(参见例如WO 90/14074、WO 91/16024、WO 91/17424、美国专利第4,897,355号；Bergan等人1993.《核酸研究》21:3567)。
在一些实施方案中，使用超过一种sdRNA来减少目标基因的表达。在一些实施方案中，靶向sdRNA的PD-1、TIM3、CBLB、LAG3和/或CISH中的一种以上一起使用。在一些实施方案中，PD-1sdRNA与TIM3、CBLB、LAG3和/或CISH中的一种以上一起使用，以减少超过一种基因目标的表达。在一些实施方案中，LAG3 sdRNA与靶向sdRNA的CISH组合使用，以减少两种目标的基因表达。在一些实施方案中，本文中靶向PD-1、TIM3、CBLB、LAG3和/或CISH中的一种以上的sdRNA可购自美国马萨诸塞州伍斯特的Advirna LLC(Advirna LLC，Worcester，MA，USA)。
在一些实施方案中，sdRNA靶向选自下组的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方案中，sdRNA靶向选自下组的基因：PD-1、LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向PD-1，且另一种sdRNA靶向选自下组的基因：LAG3、TIM3、CTLA-4、TIGIT、CISH、TGFβR2、PKA、CBLB、BAFF(BR3)以及它们的组合。在一些实施方案中，sdRNA靶向选自以下的基因：PD-1、LAG3、CISH、CBLB、TIM3以及它们的组合。在一些实施方案中，sdRNA靶向选自PD-1和以下中的一种的基因：LAG3、CISH、CBLB、TIM3以及它们的组合。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向PD-1并且一种sdRNA靶向LAG3。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向PD-1并且一种sdRNA靶向CISH。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向PD-1并且一种sdRNA靶向CBLB。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向LAG3并且一种sdRNA靶向CISH。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向LAG3并且一种sdRNA靶向CBLB。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向CISH并且一种sdRNA靶向CBLB。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向TIM3并且一种sdRNA靶向PD-1。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向TIM3并且一种sdRNA靶向LAG3。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向TIM3并且一种sdRNA靶向CISH。在一些实施方案中，一种sdRNA靶向TIM3并且一种sdRNA靶向CBLB。
如上文所讨论，本发明的实施方案提供：已通过基因编辑进行基因修饰以增强其治疗作用。本发明的实施方案涵盖通过核苷酸插入(RNA或DNA)TIL群中进行的基因编辑，以促进一种以上蛋白质的表达和抑制一种以上蛋白质的表达以及其组合。本发明的实施方案还提供用于将TIL扩增为治疗性群的方法，其中这些方法包括基因编辑TIL。存在若干种可用于基因修饰TIL群的基因编辑技术，这些基因编辑技术适合于根据本发明使用。
在一些实施方案中，方法包括基因修饰TIL群的方法，该方法包括稳定掺入用于产生一种以上蛋白质的基因的步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括逆转录病毒转导的步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括慢病毒转导的步骤。慢病毒转导系统为本领域中已知的且描述于例如以下中：Levine等人，《美国国家科学院院刊》2006，103，17372-77；Zufferey等人，《自然生物技术学》1997，15，871-75；Dull等人，《病毒学杂志》1998，72，8463-71和美国专利第6,627,442号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括γ-逆转录病毒转导的步骤。γ-逆转录病毒转导系统为本领域中已知的且描述于例如Cepko和Pear，《分子生物学中的当前方案(Cur.Prot.Mol.Biol.)》1996，9.9.1-9.9.16，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括转座子介导的基因转移的步骤。转座子介导的基因转移系统为本领域中已知的，且包括其中转座酶作为DNA表达载体或作为可表达的RNA或蛋白质提供，使得转座酶的长期表达不发生在转基因细胞中，例如提供为mRNA(例如包括帽和多腺苷酸尾的mRNA)的转座酶。包括类鲑鱼型Tel样转座酶(SB或睡美人转座酶)，例如SB10、SB11和SB100x；和酶活性增加的经工程改造酶的合适的转座子介导的基因转移系统描述于例如以下中：Hackett等人，《分子疗法》2010，18，674-83和美国专利第6,489,458号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，该方法包括基因修饰TIL群的方法，该TIL群例如如本文所描述的第一群、第二群和/或第三群。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括稳定掺入用于产生或抑制(例如沉默)一种以上蛋白质的基因的步骤。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括电穿孔的步骤。电穿孔方法为本领域中已知的，且描述于例如以下中：Tsong，《生物理杂志》1991，60，297-306和美国专利申请公开第2014/0227237A1号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。可使用本领域中已知的其他电穿孔方法，例如以下中描述的那些电穿孔方法：美国专利第5,019,034号、第5,128,257号、第5,137,817号、第5,173,158号、第5,232,856号、第5,273,525号、第5,304,120号、第5,318,514号、第6,010,613号和第6,078,490号，其公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，电穿孔方法为无菌电穿孔方法。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制、独立编程的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立编程的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同。在一些实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立编程的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以改变、操纵或引起TIL中的限定和受控制的永久性或暂时性变化的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个单一、操作者控制的独立编程的DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中第一组该至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同。在一个实施方案中，电穿孔方法为脉冲电穿孔方法，其包括用脉冲电场处理TIL以诱导TIL中孔形成的步骤，包括向TIL施加一系列至少三个DC电脉冲的步骤，场强度等于或大于100V/cm，其中该一系列至少三个DC电脉冲具有一个、两个或三个以下特征：(1)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲振幅上彼此不同；(2)该至少三个脉冲中的至少两者在脉冲宽度上彼此不同；和(3)第一组该至少三个脉冲中两者的第一脉冲间隔与第二组该至少三个脉冲中两者的第二脉冲间隔不同，使得所诱导的孔持续相对长的时间段，和使得维持TIL的存活率。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括磷酸钙转染的步骤。磷酸钙转染方法(磷酸钙DNA沉淀、细胞表面包覆和胞吞作用)为本领域中已知的且描述于以下中：Graham和van der Eb，《病毒学》1973，52，456-467；Wigler等人，《美国国家科学院院刊》1979，76，1373-1376；和Chen和Okayarea，《分子细胞生物学》1987，7，2745-2752；和美国专利第5,593,875号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括脂质体转染的步骤。脂质体转染方法，例如采用阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)在过滤水中的1:1(w/w)脂质体制剂的方法为本领域中已知的且描述于以下中：Rose等人，《生物技术》1991，10，520-525和Felgner等人，《美国国家科学院院刊》，1987，84，7413-7417以及美国专利第5,279,833号、第5,908,635号、第6,056,938号、第6,110,490号、第6,534,484号和第7,687,070号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，基因修饰TIL群的方法包括使用以下中描述的方法进行转染的步骤：美国专利第5,766,902号、第6,025,337号、第6,410,517号、第6,475,994号和第7,189,705号，其中每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。TIL可为如本文所描述的第一TIL群、第二TIL群和/或第三TIL群。
根据一个实施方案，基因编辑方法可包括使用介导在一个以上免疫检查点基因处产生双链或单链断裂的可编程核酸酶。此类可编程核酸酶通过在特定基因组位点引入断裂来实现精确的基因组编辑，即其依赖于识别基因组内的特定DNA序列以将核酸酶结构域靶向此位置且介导在目标序列处产生双链断裂。DNA中的双链断裂随后将内源性修复机制募集至断裂位点，以通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)来介导基因组编辑。因此，断裂的修复可导致插入/缺失突变的引入，从而破坏(例如，沉默、抑制或增强)目标基因产物。
已开发用于实现位点特异性基因组编辑的核酸酶的主要类别包括锌指核酸酶(zinc finger nuclease；ZFN)、转录活化因子样核酸酶(transcription activator-likenucleases；TALEN)和CRISPR相关核酸酶(例如CRISPR/Cas9)。这些核酸酶系统可基于其DNA识别模式而大致分类为两类：ZFN和TALEN通过蛋白质-DNA相互作用实现特定DNA结合，而CRISPR系统(例如Cas9)则通过与目标DNA直接碱基配对的短RNA引导分子和通过蛋白质-DNA相互作用而靶向特定DNA序列。参见例如Cox等人,《自然医学(Nature Medicine)》，2015，第21卷，第2期。
可根据本发明的TIL扩增方法使用的基因编辑方法的非限制性实例包括CRISPR方法、TALE方法和ZFN方法，这些方法在下文更详细地描述。根据一个实施方案，将TIL扩增为治疗性群的方法可根据本文所描述的方法(例如GEN 3过程)的任一个实施方案或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述进行，其中该方法进一步包括通过CRISPR方法、TALE方法或ZFN方法中的一种以上基因编辑至少一部分的TIL，以产生可提供增强治疗效果的TIL。根据一个实施方案，可通过体外比较基因编辑的TIL与未经修饰的TIL，例如通过评估相较于未经修饰的TIL的体外效应功能、细胞因子概况等，来评估基因编辑的TIL的改善的治疗效果。在某些实施方案中，方法包括使用CRISPR、TALE和/或ZFN方法来基因编辑TIL群。
在本发明的一些实施方案中，使用电穿孔来递送基因编辑系统，例如CRISPR、TALEN和ZFN系统。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统为流式电穿孔系统。适用于本发明的一些实施方案的合适的流式电穿孔系统的实施例为市售MaxCyte STX系统。有若干种可能适用于本发明的替代性市售电穿孔仪器，例如可获自BTX-Harvard Apparatus的AgilePulse系统或ECM 830、Cellaxess Elektra(Cellectricon)、Nucleofector(龙沙(Lonza)/Amaxa)、GenePulser MXcell(伯乐(BIORAD)、iPorator-96(Primax)或siPORTer96(Ambion)。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。在本发明的一些实施方案中，电穿孔系统为如本文中所描述的脉冲电穿孔系统，且与TIL扩增方法的其余部分一起形成密闭无菌系统。
用于将TIL扩增为治疗性群的方法可根据本文所描述的方法(例如过程GEN 3)的任何实施方案或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633号中所描述进行，其中该方法进一步包括通过CRISPR方法(例如CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1)基因编辑至少一部分的TIL。根据特定实施方案，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用CRISPR方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
CRISPR代表“成簇规则间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats)”。使用CRISPR系统进行基因编辑的方法在本文中也称为CRISPR方法。有三种类型的掺入RNA和Cas蛋白且可根据本发明使用的CRISPR系统：I、II和III型。II型CRISPR(以Cas9为例)为最充分表征的系统之一。
CRISPR技术改编自细菌和古细菌(单细胞微生物领域)的天然防御机制。这些生物体使用CRISPR衍生的RNA和各种Cas蛋白(包括Cas9)，通过切碎和破坏外来入侵者的DNA来阻止病毒和其他外来体的攻击。CRISPR是DNA的一个特殊区域，具有两个独特的特征：核苷酸重复和间隔区的存在。核苷酸的重复序列分布在整个CRISPR区域，其中短片段的外源DNA(间隔区)散布在重复序列之间。在II型CRISPR/Cas系统中，间隔区整合在CRISPR基因组位点内，且转录并加工成短CRISPR RNA(crRNA)。这些crRNA退火成反式活化crRNA(tracrRNA)，且引导Cas蛋白进行序列特异性裂解和沉默病原性DNA。Cas9蛋白的靶标识别需要crRNA内的“种子”序列以及crRNA结合区上游的保守的包含二核苷酸的原型间隔子相邻基序(PAM)序列。因此，通过重新设计crRNA，CRISPR/Cas系统可以重新定位以切割几乎任何DNA序列。天然系统中的crRNA和tracrRNA可以简化为大约100个核苷酸的单向导RNA(sgRNA)，用于基因工程。CRISPR/Cas系统通过共同递送表达Cas9核酸内切酶和必要的crRNA成分的质粒，可直接移植到人体细胞。Cas蛋白的不同变体可用于减少靶向限制(例如Cas9的直系同源物，如Cpf1)。
可通过CRISPR方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括：PD-1、CTLA-4、LAG3、HAVCR2(TIM3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
可通过CRISPR方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15和IL-21。
通过CRISPR方法来改变目标基因序列的表达且可根据本发明的实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第8,697,359号；第8,993,233号；第8,795,965号；第8,771,945号；第8,889,356号；第8,865,406号；第8,999,641号；第8,945,839号；第8,932,814号；第8,871,445号；第8,906,616号；和第8,895,308号中，其以引用的方式并入本文中。用于进行CRISPR方法的资源，例如用于表达CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1的质粒，可购自公司，例如金斯瑞(GenScript)。
在一个实施方案中，基因修饰如本文中所描述的TIL群可使用如美国专利第9790490号中所描述的CRISPR/Cpf1系统进行，其公开内容以引用的方式并入本文中。
将TIL扩增为治疗性群的方法可根据本文所描述的方法(例如Gen 2)的任一个实施方案或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述进行，其中该方法进一步包括通过TALE方法基因编辑至少一部分的TILL。根据特定实施方案，在TIL扩增过程期间使用TALE方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用TALE方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
TALE代表“转录活化因子样效应”蛋白，其包括TALEN(“转录活化因子样效应核酸酶”)。使用TALE系统来基因编辑的方法在本文中也称为TALE方法。TALE为来自植物病原细菌黄单孢菌属(Xanthomonas)的天然存在蛋白质，且含有由一系列各自识别单碱基对的33-35个氨基酸的重复域构成的DNA结合域。TALE特异性通过被称为重复可变二残基(repeat-variabledi-residue；RVD)的两个高变氨基酸确定。模块化TALE重复序列连接在一起以识别连续DNA序列。DNA结合域中的特异性RVD识别目标基因座中的碱基，从而提供结构特征以组装可预测的DNA结合域。将TALE的DNA结合域与IIS型FokI核酸内切酶的催化域融合，以制备可靶向的TALE核酸酶。为了诱导位点特异性突变，由14-20个碱基对间隔区域分开的两个单个TALEN臂将FokI单体拉近以二聚合和产生靶向的双链断裂。
若干个利用各种组装方法的大的系统性研究指示，可并入TALE重复序列以识别几乎任何使用者定义的序列。定制设计的TALE阵列也由Cellectis Bioresearch(法国巴黎)、Transposagen Biopharmaceuticals(美国肯塔基州列克星敦(Lexington，KY，USA))和LifeTechnologies(美国纽约州格兰德岛(Grand Island，NY，USA))市售。适用于本发明的TALE和TALEN方法描述于以下中：美国专利申请公开第2011/0201118A1号、第2013/0117869A1号、第2013/0315884A1号、第2015/0203871A1号和第2016/0120906A1号，其公开内容以引用的方式并入本文中。
可通过TALE方法永久性基因编辑TIL而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括：PD-1、CTLA-4、LAG3、HAVCR2(TIM3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
可通过TALE方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15和IL-21。
通过TALE方法来改变目标基因序列的表达且可根据本发明的实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于美国专利第8,586,526号中，其以引用的方式并入本文中。
用于将TIL扩增为治疗性群的方法可根据本文所描述的方法(例如过程GEN 3)的任一个实施方案或如PCT/US2017/058610、PCT/US2018/012605或PCT/US2018/012633中所描述进行，其中该方法进一步包括通过锌指或锌指核酸酶方法基因编辑至少一部分TIL。根据特定实施方案，在TIL扩增过程期间使用锌指方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达沉默或减少。替代地，在TIL扩增过程期间使用锌指方法引起至少一部分的治疗性TIL群中一种以上免疫检查点基因的表达增强。
呈保守ββα构型的单个锌指含有大约30个氨基酸。α-螺旋表面上的几个氨基酸通常以不同的选择性水平接触DNA大沟中的3bp。锌指具有两个蛋白结构域。第一结构域为DNA结合域，其包括真核转录因子且含有锌指。第二结构域为核酸酶结构域，其包括FokI限制酶且负责催化裂解DNA。
单个ZFN的DNA结合域通常包含三个至六个单个锌指重复序列，每个可识别9至18个碱基对。若锌指域对其预期目标位点具有特异性，则甚至一对识别总共18个碱基对的3指ZFN理论上可靶向哺乳动物基因组中的单个基因座。一个产生新的锌指阵列的方法为组合具有已知特异性的较小锌指“模块”。最常见的模块组装过程涉及组合三个分开的可各自识别3个碱基对DNA序列的锌指，以产生可识别9个碱基对目标位点的3指阵列。替代地，可使用基于选择的方法，例如寡聚池工程改造(oligomerized pool engineering；OPEN)，来自随机分组文库选择新的锌指阵列，这些随机分组文库考虑在邻近指之间的上下文依赖性相互作用(context-dependent interaction)。工程改造的锌指为可商购的；SangamoBiosciences(美国加利福尼亚州里奇蒙(Richmond))已与西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich)(美国密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO，USA))合作开发一种用于锌指构建的专用平台/>
可通过锌指方法对TIL进行永久性基因编辑而沉默或抑制的基因的非限制性实例包括：PD-1、CTLA-4、LAG3、HAVCR2(TIM3)、Cish、TGFβ、PKA、CBL-B、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
可通过锌指方法永久性基因编辑TIL而增强的基因的非限制性实例包括：CCR2、CCR4、CCR5、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、IL-2、IL12、IL-15和IL-21。
通过锌指方法来改变目标基因序列的表达且可根据本发明的实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于以下中：美国专利第6,534,261号、第6,607,882号、第6,746,838号、第6,794,136号、第6,824,978号、第6,866,997号、第6,933,113号、第6,979,539号、第7,013,219号、第7,030,215号、第7,220,719号、第7,241,573号、第7,241,574号、第7,585,849号、第7,595,376号、第6,903,185号和第6,479,626号，其以引用的方式并入本文中。
通过锌指方法来改变目标基因序列的表达且可根据本发明的其他实施方案使用的系统、方法和组合物的实例描述于Beane等人，《分子疗法》，2015，23 1380-1390中，其公开内容以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，TIL可选地经基因工程改造以具有另外的功能，该功能包括但不限于：高亲和力T细胞受体(T cell receptor；TCR)，例如靶向肿瘤相关抗原(MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)处的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系限制性细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor；CAR)。在一些实施方案中，描述于国际专利公开第WO 2019/160829 A1号(其公开内容以引用的方式并入本文中)的基因工程改造方法可用于基因编辑TIL，包括基因剔除特异性目标基因，例如编码PD-1和CTLA-4的基因。在某些实施方案中，该方法包括基因工程改造TIL群以包括高亲和力T细胞受体(TCR)，例如靶向肿瘤相关抗原(例如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1)处的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如间皮素)或谱系限制性细胞表面分子(例如CD19)结合的嵌合抗原受体(CAR)。适当地，TIL群可为如本文所描述的第一群、第二群和/或第三群。
E.用于TIL制造的密闭系统
本发明提供了在TIL培养过程期间使用密闭系统。此类密闭系统使得可以预防和/或减少微生物污染、使得可以使用较少培养瓶，并且使得可以降低成本。在一些实施方案中，密闭系统使用两个容器。
此类密闭系统为本领域中熟知的且可见于例如http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm和https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm076779.htm。
无菌连接装置(Sterile connecting device；STCD)在两根兼容管之间产生无菌熔接部分(weld)。此程序允许无菌连接多个容器和管径。在一些实施方案中，密闭系统包括鲁尔锁(luer lock)和热封系统，如例如实施例14中所描述。在一些实施方案中，密闭系统在无菌条件下通过注射器进入以维持系统的无菌性和密闭性。在一些实施方案中，采用如实施例14中所描述的密闭系统。在一些实施方案中，根据实施例14“最终调配和填充”部分中所描述的方法，将TIL调配至最终产物调配容器中。
在一些实施方案中，自获得肿瘤碎片的时间至准备向患者施用TIL或冷冻保存，密闭系统使用一个容器。在一些实施方案中，当使用两个容器时，第一容器为密闭G容器，且在不打开第一密闭G容器的情况下离心TIL群且将其转移至输注袋。在一些实施方案中，当使用两个容器时，输注袋为含有HypoThermosol的输注袋。密闭系统或密闭TIL细胞培养系统的特征在于，一旦已添加肿瘤样本和/或肿瘤碎片，则系统就与外界紧密密封以形成密闭环境，不受细菌、真菌和/或任何其他微生物污染入侵。
在一些实施方案中，微生物污染减少在约5％与约100％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少在约5％与约95％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少在约5％与约90％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少在约10％与约90％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少在约15％与约85％之间。在一些实施方案中，微生物污染减少为约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％。
密闭系统允许TIL在不存在微生物污染和/或微生物污染显著减少的情况下生长。
此外，TIL细胞培养环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压各自随细胞培养而变化。因此，即使循环了适合于细胞培养的培养基，仍需要使密闭的环境不断保持为TIL增殖的最佳环境。为此，期望通过传感器来监测密闭环境的培养液中的pH、二氧化碳分压和氧气分压的物理因素，该传感器的信号用于控制安装在培养环境入口处的气体交换器。根据培养液的变化实时调节密闭环境的气体分压，以优化细胞培养环境。在一些实施方式中，本发明提供了密闭细胞培养系统，该系统在密闭环境的入口处结合有配备有监测装置的气体交换器，该监测装置测量封闭环境的pH、二氧化碳分压和氧气分压，并通过根据来自监测设备的信号自动调节气体浓度来优化细胞培养环境。
在一些实施方案中，连续地或间歇地控制密闭环境内的压力。即，密闭环境中的压力可借助于例如压力维持装置来改变，从而确保空间在正压力状态下适合于TIL生长或促进在负压力状态下渗出流体且因此促进细胞增殖。此外，通过间歇性地施加负压力，有可能借助于暂时性缩小密闭环境的容积而均匀且有效地置换密闭环境中的循环液体。
在一些实施方案中，可替换或添加TIL增殖的最佳培养物组分，可添加包括例如IL-2和/或OKT3以及其组合的因子。
F.可选进行的TIL的冷冻保存
主体TIL群(例如第二TIL群)或扩增的TIL群(例如第三TIL群)可以可选地进行冷冻保存。在一些实施方案中，冷冻保存发生于治疗性TIL群。在一些实施方案中，冷冻保存发生于在第二次扩增后收集的TIL。在一些实施方案中，冷冻保存发生于图1和/或图8(特别是例如图8B和/或图8C)的示例性步骤F中的TIL。在一些实施方案中，TIL冷冻保存于输注袋中。在一些实施方案中，TIL在置于输注袋中之前冷冻保存。在一些实施方案中，冷冻保存TIL且不将其置于输注袋中。在一些实施方案中，使用冷冻保存培养基进行冷冻保存。在一些实施方案中，冷冻保存培养基含有二甲基亚砜(DMSO)。此通常通过将TIL群置于冷冻溶液(例如85％补体灭活AB血清和15％二甲基亚砜(DMSO))中来完成。将溶液中的细胞置于低温小瓶中且储存在-80℃24小时，其中可选地转移至气态氮冷冻器用于冷冻保存。参见Sadeghi等人，《肿瘤学报(Acta Oncologica)》2013，52，978-986。
在适当时，自冷冻器取出细胞且在37℃水浴中解冻直至大约4/5的溶液解冻。通常将细胞再悬浮于完全培养基中且可选地洗涤一次或多次。在一些实施方案中，可计算解冻的TIL且如本领域中已知的来评估存活率。
在优选实施方案中，TIL群使用CS10冷冻保存培养基(CryoStor 10，BioLifeSolutions)冷冻保存。在优选实施方案中，TIL群使用含有二甲基亚砜(DMSO)的冷冻保存培养基冷冻保存。在优选实施方案中，TIL群使用1:1(vol:vol)比率的CS10与细胞培养基冷冻保存。在优选实施方案中，TIL群使用约1:1(vol:vol)比率的CS10与细胞培养基(进一步包含另外的IL-2)冷冻保存。
如上文所讨论且如图1和/或图8(特别是例如图8B和/或图8C)中提供的步骤A至E中所例示，冷冻保存可发生在TIL扩增过程中的多个时间点。在一些实施方案中，在的第一次扩增之后(如例如根据步骤B所提供)的扩增的TIL群或在根据图1或图8(特别是例如图8B和/或图8C)的步骤D的一次或多次第二次扩增之后的扩增的TIL群可经冷冻保存。冷冻保存通常可通过将TIL群置于冷冻溶液(例如85％补体灭活AB血清和15％二甲基亚砜(DMSO))中来完成。将溶液中的细胞置于低温小瓶中且储存在-80℃24小时，其中可选地，转移至气态氮冷冻器用于冷冻保存。参见Sadeghi等人，《肿瘤学报》2013，52，978-986。在一些实施方案中，TIL冷冻保存于5％DMSO中。在一些实施方案中，TIL冷冻保存于细胞培养基加5％DMSO中。在一些实施方案中，TIL根据实施例6中提供的方法冷冻保存。
在适当时，自冷冻器取出细胞且在37℃水浴中解冻直至大约4/5的溶液解冻。通常将细胞再悬浮于完全培养基中且可选地，洗涤一次或多次。在一些实施方案中，可计算解冻的TIL且如本领域中已知的来评估存活率。
在一些情况下，步骤B TIL群可使用下文讨论的方案立即冷冻保存。替代地，主体TIL群可进行步骤C和步骤D然后在步骤D后冷冻保存。类似地，在其中基因修饰TIL将用于疗法中的情况下，步骤B或步骤D TIL群可进行基因修饰以用于合适的治疗。
G.扩增的TIL的测定和表型特征
在一些实施方案中，使用本文所描述的测定方法中的一种检查来自上述过程的TIL的效力和/或功能。
在一个实施方案中，本发明包括一种测定如上文所描述的TIL产物的效力的方法，该TIL产物包括经基因工程改造的TIL产物和使用CD134(OX40)和/或CD137(4-1BB)激动剂产生的TIL产物，该方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL产物细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由该共培养获得收集物；以及
c.评估收集物中(1)TIL产物上一种以上标记物的表达或(2)TIL产物细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定TIL产物的效力。
或者，在一些实施方案中，使用组合测定分析来自上述过程的TIL，该组合测定包括基于CD3或CD3/CD28微珠的刺激以及对至少两种分析物的ELISA或自动ELISA(例如，ELLA)检测，该至少两种分析物选自IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素和TNF-α。在一个实施方案中，此类组合测定的产物放行规格为：对于至少两种所选择的分析物为至少500pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少600pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少700pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少800pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少900pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少1000pg/mL；对于至少两种所选择的分析物为至少1100pg/mL；或对于至少两种所选择的分析物为至少1200pg/mL；其中每毫升测试物含有1×105个TIL、2×105个TIL、3×105个TIL、4×105个TIL、5×105个TIL、6×105个TIL、7×105个TIL、8×105个TIL、9×105个TIL或10×105个TIL。
在一些实施方案中，分析TIL在扩增后的多种表型标记物的表达，这些标记物包括本文和实施例中所描述的那些。在一个实施方案中，检查一种以上表型标记物的表达。在一些实施方案中，在步骤B中的第一次扩增后分析TIL的表型特征。在一些实施方案中，在步骤C中的转变期间分析TIL的表型特征。在一些实施方案中，在根据步骤C的转变期间和在冷冻保存后分析TIL的表型特征。在一些实施方案中，在根据步骤D的第二次扩增后分析TIL的表型特征。在一些实施方案中，在根据步骤D的两次以上扩增后分析TIL的表型特征。
在一些实施方案中，标记物选自CD8和CD28。在一些实施方案中，检查CD8的表达。在一些实施方案中，检查CD28的表达。在一些实施方案中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD8和/或CD28的表达更高。在一些实施方案中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8B)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD8的表达更高。在一些实施方案中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL上的CD28的表达更高。在一些实施方案中，高CD28表达指示较年轻、更持久的TIL表型。在一个实施方案中，测量一种以上调节标记物的表达。
在一个实施方案中，在用于扩增本文所描述的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法的任一步骤期间，不进行基于CD8和/或CD28表达的第一TIL群、第二TIL群、第三TIL群或收集的TIL群的选择。
在一些实施方案中，相较于其他过程(例如如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中提供的Gen 3过程)，相较于如例如图8(特别是例如图8A)中提供的2A过程，根据本发明过程产生的TIL的中枢记忆细胞的百分比更高。在一些实施方案中，中枢记忆细胞的记忆标记物选自CCR7和CD62L。
在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+ T IL记忆子集可分为不同记忆子集。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+ TIL包括初始(CD45RA+CD62L+)TIL。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+ TIL包括中枢记忆(central memory，CM；CD45RA-CD62L+)TIL。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+ TIL包括效应记忆(effector memory，EM；CD45RA-CD62L-)TIL。在一些实施方案中，CD4+和/或CD8+ TIL包括RA+效应记忆/效应(TEMRA/TEFF；CD45RA+CD62L+)TIL。
在一些实施方案中，TIL表达一种以上选自下组的标记物：颗粒酶B、穿孔蛋白和颗粒溶解素。在一些实施方案中，TIL表达颗粒酶B。在一些实施方案中，TIL表达穿孔蛋白。在一些实施方案中，TIL表达颗粒溶解素。
在一个实施方案中，还可以使用细胞因子释放测定来评估再刺激的TIL的细胞因子释放。在一些实施方案中，可评估TIL的干扰素-γ(IFN-γ)分泌。在一些实施方案中，通过ELISA测定来测量IFN-γ分泌。在一些实施方案中，在快速第二次扩增步骤之后，在如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)所提供的步骤D之后，通过ELISA测定来测量IFN-γ分泌。在一些实施方案中，通过IFN-γ(IFN-γ)分泌来测量TIL健康。在一些实施方案中，IFN-γ分泌指示活性TIL。在一些实施方案中，采用针对IFN-γ产生的效力测定。IFN-γ产生是细胞毒性潜力的另一种量度。IFN-γ产生可通过测定经抗CD3、CD28和CD137/4-1BB的抗体刺激的TIL培养基中的细胞因子IFN-γ的含量来测量。来自这些受刺激TIL的培养基中的IFN-γ含量可通过测量IFN-γ释放来测定。在一些实施方案中，例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所提供的Gen 3过程中的步骤D相较于例如图8(特别是例如图8A)中所提供的2A过程中的步骤D的IFN-γ产生增加，指示步骤D TIL的细胞毒性潜力增加。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方案中，IFN-γ的分泌增加三倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方案中，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方案中，使用Quantikine ELISA试剂盒测量IFN-γ。在一些实施方案中，测量离体TIL中的IFN-γ。在一些实施方案中，测量离体TIL中的IFN-γ，包括通过本发明的方法(包括例如图8B方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于一倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于两倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于三倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于四倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少多于五倍的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少100pg/mL至约1000pg/mL或更多的IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，在能够分泌至少200pg/mL、至少250pg/mL、至少300pg/mL、至少350pg/mL、至少400pg/mL、至少450pg/mL、至少500pg/mL、至少550pg/mL、至少600pg/mL、至少650pg/mL、至少700pg/mL、至少750pg/mL、至少800pg/mL、至少850pg/mL、至少900pg/mL、至少950pg/mL或至少1000pg/mL或更多IFN-γ的TIIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少300pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少400pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少500pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少600pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少700pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少800pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少900pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少1000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少2000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少3000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少4000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少5000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少6000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少7000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少8000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少9000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少10,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少15,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少20,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少25,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少30,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少35,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少40,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少45,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少50,000pg/mL IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少100pg/mL/5×105个细胞至约1000pg/mL/5×105个细胞或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL/5×105个细胞、至少250pg/mL/5×105个细胞、至少300pg/mL/5×105个细胞、至少350pg/mL/5×105个细胞、至少400pg/mL/5×105个细胞、至少450pg/mL/5×105个细胞、至少500pg/mL/5×105个细胞、至少550pg/mL/5×105个细胞、至少600pg/mL/5×105个细胞、至少650pg/mL/5×105个细胞、至少700pg/mL/5×105个细胞、至少750pg/mL/5×105个细胞、至少800pg/mL/5×105个细胞、至少850pg/mL/5×105个细胞、至少900pg/mL/5×105个细胞、至少950pg/mL/5×105个细胞或至少1000pg/mL/5×105个细胞或更多IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少300pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少400pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少500pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少600pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少700pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少800pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少900pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少1000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少2000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少3000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D中描绘的方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少4000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少5000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少6000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少7000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少8000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少9000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少10,000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少15,000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少20,000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少25,000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少30,000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少35,000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少40,000pg/mL/×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少45,000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少50,000pg/mL/5×105个细胞IFN-γ的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
T和B淋巴细胞的多种抗原受体通过有限但大量的基因区段的体细胞重组产生。这些基因区段：V(可变区)、D(多变区)、J(连接区)和C(恒定区)决定免疫球蛋白和T细胞受体(TCR)的结合特异性和下游应用。本发明提供一种用于产生TIL的方法，该TIL表现出并增加了T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，通过本发明方法获得的TIL表现出T细胞贮库多样性增加。在一些实施方案中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用除本文所提供的方法以外的其他方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL表现出T细胞贮库多样性增加，这些其他方法包括例如除图8(特别是例如图8B和/或图8C)中体现的方法以外的方法。在一些实施方案中，相较于新鲜收集的TIL和/或使用如图8(特别是例如图8A)中例示的称为Gen 2的方法制备的TIL，通过本发明方法获得的TIL表现T细胞贮库多样性增加。在一些实施方案中，在第一次扩增中获得的TIL表现T细胞贮库多样性增加。在一些实施方案中，多样性增加是免疫球蛋白多样性和/或T细胞受体多样性增加。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白重链中。在一些实施方案中，多样性存在于免疫球蛋白中，存在于免疫球蛋白轻链中。在一些实施方案中，多样性存在于T细胞受体中。在一些实施方案中，多样性存在于选自α、β、γ和δ受体的T细胞受体中的一种中。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α和/或β的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)α的表达增加。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)β的表达增加。在一些实施方案中，TCRαβ(即TCRα/β)的表达增加。在一些实施方案中，如本文所描述的过程(例如Gen 3过程)相较于其他过程(例如称为Gen2的过程)，基于样本内独特肽CDR的数目，显示更高的克隆多样性(参见例如图12-14)。
在一些实施方案中，TIL的活化和耗竭可通过检查一种以上标记物确定。在一些实施方案中，活化和耗竭可使用多色流式细胞术确定。在一些实施方案中，标记物的活化和耗竭包括但不限于一种以上选自下组的标记物：CD3、PD-1、2B4/CD244、CD8、CD25、BTLA、KLRG、TIM3、CD194/CCR4、CD4、TIGIT、CD183、CD69、CD95、CD127、CD103和/或LAG3。在一些实施方案中，标记物的活化和耗竭包括但不限于一种以上选自下组的标记物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG3、PD-1、TIGIT和/或TIM3。在一些实施方案中，标记物的活化和耗竭包括但不限于一种以上选自下组的标记物：BTLA、CTLA-4、ICOS、Ki67、LAG3、CD103+/CD69+、CD103+/CD69-、PD-1、TIGIT和/或TIM3。在一些实施方案中，可确定和/或分析T细胞标记物(包括活化和耗竭标记物)以检查T细胞活化、抑制或功能。在一些实施方案中，T细胞标记物可包括但不限于一种以上选自下组的标记物：TIGIT、CD3、FoxP3、TIM3、PD-1、CD103、CTLA-4、LAG3、BTLA-4、ICOS、Ki67、CD8、CD25、CD45、CD4和/或CD59。
在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于3000pg/106个TIL、高于5000pg/106个TIL、高于7000pg/106个TIL、高于9000pg/106个TIL、高于11000pg/106个TIL、高于13000pg/106个TIL、高于15000pg/106个TIL、高于17000pg/106个TIL、高于19000pg/106个TIL、高于20000pg/106个TIL、高于40000pg/106个TIL、高于60000pg/106个TIL、高于80000pg/106个TIL、高于100000pg/106个TIL、高于120000pg/106个TIL、高于140000pg/106个TIL、高于160000pg/106个TIL、高于180000pg/106个TIL、高于200000pg/106个TIL、高于220000pg/106个TIL、高于240000pg/106个TIL、高于260000pg/106个TIL、高于280000pg/106个TIL、高于300000pg/106个TIL或更多的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于3000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于5000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于7000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于9000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于11000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于13000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于15000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于17000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于19000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于20000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于40000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于60000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于80000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于100000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于120000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于140000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于160000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于180000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于200000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于220000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于240000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于260000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于280000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于300000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于3000pg/106个TIL至300000pg/106个TIL或更多的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于3000pg/106个TIL、高于5000pg/106个TIL、高于7000pg/106个TIL、高于9000pg/106个TIL、高于11000pg/106个TIL、高于13000pg/106个TIL、高于15000pg/106个TIL、高于17000pg/106个TIL、高于19000pg/106个TIL、高于20000pg/106个TIL、高于40000pg/106个TIL、高于60000pg/106个TIL、高于80000pg/106个TIL、高于100000pg/106个TIL、高于120000pg/106个TIL、高于140000pg/106个TIL、高于160000pg/106个TIL、高于180000pg/106个TIL、高于200000pg/106个TIL、高于220000pg/106个TIL、高于240000pg/106个TIL、高于260000pg/106个TIL、高于280000pg/106个TIL、高于300000pg/106个TIL或更多的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于3000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于5000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于7000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于9000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于11000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于13000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于15000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于17000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于19000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于20000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于40000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于60000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于80000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于100000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于120000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于140000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于160000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于180000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于200000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于220000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于240000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于260000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于280000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于300000pg/106个TIL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。
在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于1000pg/mL至300000pg/mL或更多的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于1000pg/mL、高于2000pg/mL、高于3000pg/mL、高于4000pg/mL、高于5000pg/mL、高于6000pg/mL，更大的TIL。大于7000pg/mL、高于8000pg/mL、高于9000pg/mL、高于10000pg/mL、高于20000pg/mL、高于30000pg/mL、高于40000pg/mL、高于50000pg/mL、高于60000pg/mL、高于70000pg/mL、高于80000pg/mL、高于90000pg/mL、高于100000pg/mL或更多的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于1000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于2000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于3000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于4000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于5000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于6000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于7000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于8000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于9000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于10000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于20000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于30000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于40000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于50000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于60000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于70000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于80000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于90000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，表现出高于100000pg/mL颗粒酶B的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于120000pg/mL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于140000pg/mL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于160000pg/mL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于180000pg/mL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于200000pg/mL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于220000pg/mL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于240000pg/mL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于260000pg/mL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于280000pg/mL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。在一些实施方案中，显示出颗粒酶B分泌高于300000pg/mL的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)产生的TIL。
在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增方法产生的扩增的TIL群(包括例如如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D中提供的TIL)表现出增加的体外颗粒酶B分泌。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少一倍至五十倍或更多。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，IFN-γ分泌增加至少一倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍、至少六倍、至少七倍、至少八倍、至少九倍、至少十倍、至少二十倍、至少三十倍、至少四十倍、至少五十倍或更多。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少一倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少两倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少三倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少四倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少五倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少六倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少七倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少八倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少九倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少十倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少二十倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少三十倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少四十倍。在一些实施方案中，相较于未扩增的TIL群，本发明的扩增的TIL群的颗粒酶B分泌增加至少五十倍。
在一些实施方案中，TNF-α(即，TNF-alpha)分泌比IFN-γ分泌水平低至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍以上的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，TNF-α分泌比IFN-γ分泌水平低至少一倍的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，TNF-α分泌比IFN-γ分泌水平低至少两倍的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，TNF-α分泌比IFN-γ分泌水平低至少三倍的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，TNF-α分泌比IFN-γ分泌水平低至少四倍的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，TNF-α分泌比IFN-γ分泌水平低至少五倍的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，能够分泌至少200pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α(即，TNF-alpha)的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少500pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少1000pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少2000pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少3000pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少4000pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少5000pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少6000pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少7000pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少8000pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。在一些实施方案中，能够分泌至少9000pg/mL/5×105个细胞至约10,000pg/mL/5×105个细胞或更多TNF-α的TIL为通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL。
在一些实施方案中，测量IFN-γ和颗粒酶B含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方案中，测量IFN-γ和TNF-α含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方案中，测量颗粒酶B和TNF-α含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。在一些实施方案中，测量IFN-γ、颗粒酶B和TNF-α含量以确定通过本发明的扩增方法(包括例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D方法)产生的TIL的表型特征。
在一些实施方案中，在冷冻保存之后进行表型表征。
H.其他工艺的实施方案
在一些实施方案中，本发明提供一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群来进行初始第一次扩增，其中该初始第一次扩增进行约1至7天或约1至8天以获得第二TIL群，其中第二TIL群在数目上大于第一TIL群；(c)通过使第二TIL群与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二次扩增，产生第三TIL群，其中该快速第二次扩增进行约1至11天或约1天至10天以获得第三TIL群，其中第三TIL群为治疗性TIL群；和(d)收集由步骤(c)获得的治疗性TIL群。在一些实施方案中，快速第二次扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天或约2至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群转移至比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)，其中在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群在更大规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群部分在第二小规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天或约2至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在更大规模培养中培养约4至7天或约4至8天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移并分配到至少2、3或4个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在更大规模培养中培养约5至7天的时间段。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群来进行初始第一次扩增，其中该初始第一次扩增进行约1至8天以获得第二TIL群，其中第二TIL群在数目上大于第一TIL群；(c)通过使第二TIL群与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二次扩增，产生第三TIL群，其中该快速第二次扩增进行约1至8天以获得第三TIL群，其中第三TIL群为治疗性TIL群；和(d)收集由步骤(c)的治疗性TIL群。在一些实施方案中，快速第二次扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约2至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群转移至比第一容器大的第二容器(例如G-REX 500MCS容器)，其中在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群在更大规模培养中培养约4至8天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群约2至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群部分在第二小规模培养中培养约4至6天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约2至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在更大规模培养中培养约4至6天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移并分配到至少2、3或4个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在更大规模培养中培养约4至5天的时间段。
在一些实施方案中，本发明提供一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；(b)通过在包含IL-2和OKT-3的细胞培养基中培养第一TIL群来进行初始第一次扩增，其中该初始第一次扩增进行约1至7天以获得第二TIL群，其中第二TIL群在数目上大于第一TIL群；(c)通过使第二TIL群与包含IL-2、OKT-3和外源性抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基接触来进行快速第二次扩增，产生第三TIL群，其中该快速第二次扩增进行约1至11天以获得第三TIL群，其中第三TIL群为治疗性TIL群；和(d)收集由步骤(c)的治疗性TIL群。在一些实施方案中，快速第二次扩增的步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自小规模培养的第二TIL群转移至比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)，其中在第二容器中，来自小规模培养的第二TIL群在更大规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第二TIL群部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在更大规模培养中培养约4至7天的时间段。在一些实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(1)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第二TIL群约4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(2)实现将来自第一小规模培养的第二TIL群转移并分配到至少2、3或4个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，自小规模培养转移至此类第二容器的第二TIL群部分在更大规模培养中培养约5天的时间段。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过使第一TIL群与进一步包括外源性抗原呈递细胞(APC)的培养基接触来进行初始第一次扩增，其中步骤(c)中培养基中的APC数目大于步骤(b)中培养基中的APC数目。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，培养基补充有另外的外源性APC。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)20:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)10:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)9:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)8:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)7:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)6:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)5:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)4:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)3:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.9:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.8:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.7:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.6:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.5:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.4:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.3:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.2:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2.1:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)1.1:1至(约)2:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)10:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)5:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)4:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)3:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.9:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.8:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.7:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.6:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.5:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.4:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.3:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.2:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率选自(约)2:1至(约)2.1:1的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率为(约)2:1。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在快速第二次扩增中添加的APC数目与在步骤(b)中添加的APC数目的比率为(约)1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:1、2.1:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.6:1、2.7:1、2.8:1、2.9:1、3:1、3.1:1、3.2:1、3.3:1、3.4:1、3.5:1、3.6:1、3.7:1、3.8:1、3.9:1、4:1、4.1:1、4.2:1、4.3:1、4.4:1、4.5:1、4.6:1、4.7:1、4.8:1、4.9:1或5:1。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在初始第一次扩增中添加的APC数目为(约)1×108、1.1×108、1.2×108、1.3×108、1.4×108、1.5×108、1.6×108、1.7×108、1.8×108、1.9×108、2×108、2.1×108、2.2×108、2.3×108、2.4×108、2.5×108、2.6×108、2.7×108、2.8×108、2.9×108、3×108、3.1×108、3.2×108、3.3×108、3.4×108或3.5×108个APC，且其中在快速第二次扩增中添加的APC数目为(约)3.5×108、3.6×108、3.7×108、3.8×108、3.9×108、4×108、4.1×108、4.2×108、4.3×108、4.4×108、4.5×108、4.6×108、4.7×108、4.8×108、4.9×108、5×108、5.1×108、5.2×108、5.3×108、5.4×108、5.5×108、5.6×108、5.7×108、5.8×108、5.9×108、6×108、6.1×108、6.2×108、6.3×108、6.4×108、6.5×108、6.6×108、6.7×108、6.8×108、6.9×108、7×108、7.1×108、7.2×108、7.3×108、7.4×108、7.5×108、7.6×108、7.7×108、7.8×108、7.9×108、8×108、8.1×108、8.2×108、8.3×108、8.4×108、8.5×108、8.6×108、8.7×108、8.8×108、8.9×108、9×108、9.1×108、9.2×108、9.3×108、9.4×108、9.5×108、9.6×108、9.7×108、9.8×108、9.9×108或1×109个APC。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在初始第一次扩增中添加的APC数目选自(约)1×108个APC至(约)3.5×108个APC的范围，且其中在快速第二次扩增中添加的APC数目选自(约)3.5×108个APC至(约)1×109个APC的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在初始第一次扩增中添加的APC数目选自(约)1.5×108个APC至(约)3×108个APC的范围，且其中在快速第二次扩增中添加的APC数目选自(约)4×108个APC至(约)7.5×108个APC的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在初始第一次扩增中添加的APC数目选自(约)2×108个APC至(约)2.5×108个APC的范围，且其中在快速第二次扩增中添加的APC数目选自(约)4.5×108个APC至(约)5.5×108个APC的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：(约)2.5×108个APC被添加至初始第一次扩增，且(约)5×108个APC被添加至快速第二次扩增。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：抗原呈递细胞为外周血单核细胞(PBMC)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：将多个肿瘤碎片分配到多个单独的容器中，在每个单独的容器中，第一TIL群在步骤(a)中获得，第二TIL群在步骤(b)中获得，且第三TIL群在步骤(c)中获得，且将来自步骤(c)中多个容器的治疗性TIL群合并以产生来自步骤(d)的经收集的TIL群。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：将多个肿瘤均匀分配到多个单独的容器中。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个单独的容器包括至少两个单独的容器。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个单独的容器包括两个至二十个单独的容器。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个单独的容器包括两个至十五个单独的容器。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个单独的容器包括两个至十个单独的容器。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个单独的容器包括两个至五个单独的容器。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个单独的容器包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个单独的容器。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在各容器中对步骤(b)中的第一TIL群进行初始第一次扩增，在同一容器中对由该第一TIL群产生的第二TIL群进行步骤(c)中的快速第二次扩增。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：每个单独的容器包括第一透气表面区域。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：将多个肿瘤碎片分配到单个容器中。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：单个容器包括第一透气表面区域。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中在步骤(b)中，APC以(约)一个细胞层至(约)三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，APC以(约)1.5个细胞层至(约)2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，APC以(约)2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，APC以(约)以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)3个细胞层至(约)10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)4个细胞层至(约)8个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，在包括第一透气表面区域的第一容器中进行初始第一次扩增，且在步骤(c)中，在包括第二透气表面区域的第二容器中进行快速第二次扩增。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第二容器大于第一容器。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中在步骤(b)中，APC以(约)一个细胞层至(约)三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，APC以(约)1.5个细胞层至(约)2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，APC以(约)2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如适用的任何前述段落中描述的方法，其中在步骤(b)中，APC以(约)以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)3个细胞层至(约)10个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)4个细胞层至(约)8个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第二透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)以下的平均厚度层叠至第二透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，在包括第一透气表面区域的第一容器中进行初始第一次扩增，且在步骤(c)中，在第一容器中进行快速第二次扩增。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中在步骤(b)中，APC以(约)一个细胞层至(约)三个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，APC以(约)1.5个细胞层至(约)2.5个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，APC以(约)2个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，APC以(约)以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3个细胞层。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)3个细胞层至(约)10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)4个细胞层至(约)8个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)3、4、5、6、7、8、9或10个细胞层的平均厚度层叠至第一透气表面区域上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中，APC以(约)以下的平均厚度层叠至第一透气表面区域上：4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8个细胞层。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中在步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:10的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:9的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:8的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:7的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:6的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:5的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:4的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:3的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.1至(约)1:2的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.2至(约)1:8的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.3至(约)1:7的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.4至(约)1:6的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.5至(约)1:5的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.6至(约)1:4的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.7至(约)1:3.5的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.8至(约)1:3的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.9至(约)1:2.5的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:2的范围。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，通过用另外的抗原呈递细胞(APC)补充第一TIL群的细胞培养基进行初始第一次扩增，其中在步骤(c)中添加的APC数目大于在步骤(b)中添加的APC数目，且其中步骤(b)中层叠的APC的平均层数与在步骤(c)中层叠的APC的平均层数的比率选自(约)1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、1:3、1:3.1、1:3.2、1:3.3、1:3.4、1:3.5、1:3.6、1:3.7、1:3.8、1:3.9、1:4、1:4.1、1:4.2、1:4.3、1:4.4、1:4.5、1:4.6、1:4.7、1:4.8、1:4.9、1:5、1:5.1、1:5.2、1:5.3、1:5.4、1:5.5、1:5.6、1:5.7、1:5.8、1:5.9、1:6、1:6.1、1:6.2、1:6.3、1:6.4、1:6.5、1:6.6、1:6.7、1:6.8、1:6.9、1:7、1:7.1、1:7.2、1:7.3、1:7.4、1:7.5、1:7.6、1:7.7、1:7.8、1:7.9、1:8、1:8.1、1:8.2、1:8.3、1:8.4、1:8.5、1:8.6、1:8.7、1:8.8、1:8.9、1:9、1:9.1、1:9.2、1:9.3、1:9.4、1:9.5、1:9.6、1:9.7、1:9.8、1:9.9或1:10。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第二TIL群中的TIL数目与第一TIL群中的TIL数目的比率为(约)1.5:1至(约)100:1。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第二TIL群中的TIL数目与第一TIL群中的TIL数目的比率为(约)50:1。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第二TIL群中的TIL数目与第一TIL群中的TIL数目的比率为(约)25:1。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第二TIL群中的TIL数目与第一TIL群中的TIL数目的比率为(约)20:1。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第二TIL群中的TIL数目与第一TIL群中的TIL数目的比率为(约)10:1。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第二TIL群在数目上比第一TIL群多至少(约)50倍。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第二TIL群在数目上比第一TIL群多至少(约)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50倍。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中的第二时间段开始后(约)2天或(约)3天，对细胞培养基补充另外的IL-2。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改以进一步包括使用冷冻保存过程冷冻保存步骤(d)中的经收集的TIL群的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改以包括在步骤(d)之后执行额外步骤(e)：将来自步骤(d)的经收集的TIL群转移至可选地含有HypoThermosol的输注袋中。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改以包括使用冷冻保存过程冷冻保存步骤(e)中包含经收集的TIL群的输注袋的步骤。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：使用1:1比率的经收集的TIL群与冷冻保存培养基来进行冷冻保存过程。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：抗原呈递细胞为外周血单核细胞(PBMC)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：PBMC为经辐照且同种异体的。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中添加至细胞培养物的APC总数为2.5×108个。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中添加至细胞培养物的APC总数为5×108个。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：APC为PBMC。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：PBMC为经辐照且同种异体的。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：抗原呈递细胞为人工抗原呈递细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：使用基于膜的细胞处理系统来进行步骤(d)中的收集。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：使用LOVO细胞处理系统来进行步骤(d)中的收集。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)5至(约)60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)10至(约)60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)15至(约)60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)20至(约)60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)25至(约)60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)30至(约)60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)35至(约)60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)40至(约)60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)45至(约)60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)50至(约)60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括在步骤(b)中每容器(约)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个碎片。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：各碎片具有(约)27mm3的体积。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：各碎片具有(约)20mm3至(约)50mm3的体积。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：各碎片具有(约)21mm3至(约)30mm3的体积。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：各碎片具有(约)22mm3至(约)29.5mm3的体积。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：各碎片具有(约)23mm3至(约)29mm3的体积。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：各碎片具有(约)24mm3至(约)28.5mm3的体积。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：各碎片具有(约)25mm3至(约)28mm3的体积。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：各碎片具有(约)26.5mm3至(约)27.5mm3的体积。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：各碎片具有(约)以下体积：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50mm3。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括(约)30至(约)60个碎片，其中总体积为(约)1300mm3至(约)1500mm3。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括(约)50个碎片，其中总体积为(约)1350mm3。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：多个碎片包括(约)50个碎片，其中总质量为(约)1克至(约)1.5克。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在容器中提供细胞培养基，该容器为G容器或Xuri细胞袋。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：细胞培养基中的IL-2浓度为约10,000IU/mL至约5,000IU/mL。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：细胞培养基中的IL-2浓度为约6,000IU/mL。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：冷冻保存培养基包含二甲基亚砜(DMSO)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：冷冻保存培养基包含7％至10％DMSO。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(b)中的第一时间段在(约)1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(c)中的第二时间段在(约)1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或11天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段分别在(约)1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段分别在(约)5天、6天或7天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(b)中的第一时间段和步骤(c)中的第二时间段分别在(约)7天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)14天至(约)18天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)15天至(约)18天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)16天至(约)18天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)17天至(约)18天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)14天至(约)17天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)15天至(约)17天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)16天至(约)17天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)14天至(约)16天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)15天至(约)16天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)14天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)15天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)16天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)17天中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)18天中进行。
在其他实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)14天或更短时间中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)15天或更短中时间进行。
在其他实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)16天或更短中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)至(d)在总共(约)18天或更短时间中进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(d)中收集的治疗性TIL群包括足以达到TIL的治疗有效剂量的TIL。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：足以达到治疗有效剂量的TIL的数目为(约)2.3×1010至(约)13.7×1010。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(c)中的第三TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：相较于通过长于16天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：相较于通过长于17天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：相较于通过长于18天的过程来制备的TIL，步骤(c)中的第三TIL群提供至少一倍至五倍或更多的干扰素-γ产生。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：相对于从步骤(b)第二细胞群获得的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞，从步骤(c)第三TIL群获得的效应T细胞和/或中枢记忆T细胞表现增加的CD8和CD28表达。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：方法中所述的各容器为密闭容器。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：方法中所述的各容器为G容器。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：方法中所述的各容器为GREX-10。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：方法中所述的各容器为GREX-100。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：方法中所述的各容器为GREX-500。
在另一个实施方案中，本发明提供通过如上适用的任何前述段落中描述的方法制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群。
在另一个实施方案中，本发明提供一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中相较于通过其中TIL的第一次扩增在未添加任何抗原呈递细胞(APC)或OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中相较于通过其中TIL的第一次扩增在未添加任何抗原呈递细胞(APC)的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中相较于通过其中TIL的第一次扩增在未添加任何OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中相较于通过其中TIL的第一次扩增在未添加抗原呈递细胞(APC)和未添加OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中相较于通过过程长于16天的过程制备的TIL，治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中相较于通过过程长于17天的过程制备的TIL，治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在另一个实施方案中，本发明提供一种自患者的肿瘤组织制备的治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中相较于通过过程长于18天的过程制备的TIL，治疗性TIL群提供增加的功效、增加的干扰素-γ产生和/或增加的多克隆性。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群提供增加的干扰素-γ产生。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群提供增加的多克隆性。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，该治疗性TIL群提供增加的功效。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其中相较于通过长于16天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出一倍。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其中相较于通过长于17天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出一倍。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其中相较于通过长于18天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出一倍。在一些实施方案中，由于本文中描述(例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述)的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所示)，使得TIL的干扰素-γ产量至少高出一倍。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其中相较于通过长于16天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出两倍。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其中相较于通过长于17天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出两倍。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其中相较于通过长于18天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出两倍。在一些实施方案中，由于本文中描述(例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述)的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所示)，使得TIL的干扰素-γ产量至少高出两倍。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其中相较于通过长于16天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出三倍。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其中相较于通过长于17天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出三倍。在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上适用的任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其中相较于通过长于18天的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出三倍。在一些实施方案中，由于本文中描述(例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述)的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所示)，使得TIL的干扰素-γ产量至少高出三倍。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，相较于通过其中TIL的第一次扩增在未添加任何抗原呈递细胞(APC)的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性肿瘤浸润淋巴细胞群的干扰素-γ产量至少高出一倍。在一些实施方案中，由于本文中描述(例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述)的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所示)，使得TIL的干扰素-γ产量至少高出一倍。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗性肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，相较于通过其中TIL的第一次扩增在未添加任何OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性肿瘤浸润淋巴细胞群的干扰素-γ产量至少高出一倍。在一些实施方案中，由于本文中描述(例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述)的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所示)，使得TIL的干扰素-γ产量至少高出一倍。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗性TIL群，相较于通过其中TIL的第一次扩增在未添加任何APC的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出两倍。在一些实施方案中，由于本文中描述(例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述)的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所示)，使得TIL的干扰素-γ产量至少高出两倍。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗性TIL群，相较于通过其中TIL的第一次扩增在未添加任何OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出两倍。在一些实施方案中，由于本文中描述(例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述)的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所示)，使得TIL的干扰素-γ产量至少高出两倍。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗性TIL群，相较于通过其中TIL的第一次扩增在未添加任何APC的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出三倍。在一些实施方案中，由于本文中描述(例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述)的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所示)，使得TIL的干扰素-γ产量至少高出一倍。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗性TIL群，相较于通过其中TIL的第一次扩增在未添加任何OKT3的情况下进行的过程制备的TIL，该治疗性TIL群的干扰素-γ产量至少高出三倍。在一些实施方案中，由于本文中描述(例如如上文步骤A至F中或根据上文步骤A至F描述)的扩增过程(也如例如图8(特别是例如图8B和/或图8C)中所示)，使得TIL的干扰素-γ产量至少高出三倍。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：肿瘤碎片为小型活检体(包括例如穿刺活检体)、核心活检体、芯针活检体或细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：肿瘤碎片为核心活检体。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：肿瘤碎片为细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：肿瘤碎片为小型活检体(包括例如穿刺活检体)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：肿瘤碎片为芯针活检体。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：(i)该方法包括自一个以上来自受试者的肿瘤组织的小型活检体(包括例如穿刺活检体)、核心活检体、芯针活检或体细针抽吸物获得第一TIL群；(ii)该方法包括在进行初始第一次扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群约3天的时间段；(iii)该方法包括进行初始第一次扩增约8天的时间段；和(iv)该方法包括进行快速第二次扩增约11天的时间段。在一些前述实施方案中，方法的这些步骤在约22天内完成。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：(i)该方法包括自一个以上来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)、核心活检、芯针活检或细针抽吸物获得第一TIL群；(ii)该方法包括在进行初始第一次扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群约3天的时间段；(iii)该方法包括进行初始第一次扩增约8天的时间段；和(iv)该方法包括通过以下方式进行快速第二次扩增：培养第二TIL群的培养物约5天，将培养物分成至多5个继代培养物，以及培养这些继代培养物约6天。在一些前述实施方案中，在与在快速第二次扩增中开始培养第二TIL群的容器相同大小或更大的容器中，分别培养至多5个继代培养物。在一些前述实施方案中，第二TIL群的培养物平均分在至多5个继代培养物中。在一些前述实施方案中，方法的这些步骤在约22天内完成。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)、核心活检、芯针活检或细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)、核心活检、芯针活检或细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)、核心活检、芯针活检或细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)、核心活检、芯针活检或细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的核心活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的核心活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的核心活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的核心活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的芯针活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的芯针活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的芯针活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的芯针活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1至约20个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一TIL群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自受试者的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：(i)该方法包括自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的核心活检获得第一TIL群；(ii)该方法包括在进行初始第一次扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群约3天的时间段；(iii)该方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的培养基中培养第一TIL群约8天的时间段来进行初始第一次扩增步骤，以获得第二TIL群；且(iv)该方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和APC的培养基中培养第二TIL群约11天的时间段来进行快速第二次扩增步骤。在一些前述实施方案中，方法的这些步骤在约22天内完成。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：(i)该方法包括自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的核心活检获得第一TIL群；(ii)该方法包括在进行初始第一次扩增步骤之前进行以下步骤：在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群约3天的时间段；(iii)该方法包括通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的培养基中培养第一TIL群约8天的时间段来进行初始第一次扩增步骤，以获得第二TIL群；且(iv)该方法包括通过以下方式进行快速第二次扩增：在包含IL-2、OKT-3和APC的细胞培养基中培养第二TIL群的培养物约5天，将培养物分成至多5个继代培养物，以及在包含IL-2的培养基中培养这些继代培养物中的每一种约6天。在一些前述实施方案中，在与在快速第二次扩增中开始培养第二TIL群的容器相同大小或更大的容器中，分别培养至多5个继代培养物。在一些前述实施方案中，第二TIL群的培养物平均分在至多5个继代培养物中。在一些前述实施方案中，方法的这些步骤在约22天内完成。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：(i)该方法包括自1至约10个来自受试者的肿瘤组织的核心活检获得第一TIL群；(ii)该方法包括在进行初始第一次扩增步骤之前进行以下步骤：在G-Rex 100M培养瓶中在包括含6000IU IL-2/mL的0.5L CM1培养基的细胞培养基中培养第一TIL群约3天的时间段；(iii)该方法包括通过以下方式进行初始第一次扩增：添加含有6000IU/ml IL-2、30ng/mlOKT-3和约108个饲养细胞的0.5L CM1培养基，且培养约8天的时间段；且(iv)该方法包括通过以下方式进行快速第二次扩增：(a)将第二TIL群转移至含有5L CM2培养基的G-Rex500MCS培养瓶中且培养约5天，该CM2培养基含有3000IU/mL IL-2、30ng/mL OKT-3和5×109个饲养细胞；(b)通过将109个TIL转移至含有具有3000IU/mL IL-2的5L AIM-V培养基的至多5个G-Rex 500MCS培养瓶中的每一个中而将培养物分成至多5个继代培养物，且培养这些继代培养物约6天。在一些前述实施方案中，方法的这些步骤在约22天内完成。
在另一个实施方案中，本发明提供一种扩增T细胞的方法，其包括：(a)通过培养获自供体的第一T细胞群来进行该第一T细胞群的初始第一次扩增，以实现第一T细胞群的生长并启动第一T细胞群的活化；(b)在步骤(a)中启动的第一T细胞群的活化开始衰退后，通过培养第一T细胞群进行第一T细胞群的快速第二次扩增以实现第一T细胞群的生长并增强第一T细胞群的活化，以获得第二T细胞群；和(c)收集第二T细胞群。在另一个实施方案中，快速第二次扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移至大于第一容器的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)，并在第二容器中的更大规模培养中培养来自小规模培养的第一T细胞群约4至7天的时间段。在另一个实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自第一小规模培养的第一T细胞群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群部分在第二小规模培养中培养约4至7天的时间段。在另一个实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在更大规模培养中培养约4至7天的时间段。在另一个实施方案中，快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移并分配到至少2、3或4个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在更大规模培养中培养约5天的时间段。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：快速第二次扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约2至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移至大于第一容器的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，并在第二容器中的更大规模培养中培养来自小规模培养的第一T细胞群约5至7天的时间段。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的第一小规模培养中培养第一T细胞群约2至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自第一小规模培养的第一T细胞群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个与第一容器大小相等的第二容器中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自第一小规模培养的第一T细胞群部分在第二小规模培养中培养约5至7天的时间段。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约2至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移并分配到至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在更大规模培养中培养约5至7天的时间段。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移并分配至2、3或4个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在更大规模培养中培养约5至6天的时间段。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移并分配至2、3或4个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在更大规模培养中培养约5天的时间段。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移并分配至2、3或4个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在更大规模培养中培养约6天的时间段。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：快速扩增步骤分为多个步骤以通过以下方式实现培养规模横向扩大和规模纵向扩大：(a)通过在第一容器(例如G-Rex 100MCS容器)中的小规模培养中培养第一T细胞群约3至4天的时间段进行快速第二次扩增；然后(b)实现将来自小规模培养的第一T细胞群转移并分配至2、3或4个尺寸比第一容器大的第二容器(例如G-Rex 500MCS容器)中，其中在每个第二容器中，转移至此类第二容器的来自小规模培养的第一T细胞群部分在更大规模培养中培养约7天的时间段。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)的初始第一次扩增在至多7天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(b)的快速第二次扩增在至多8天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(b)的快速第二次扩增在至多9天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(b)的快速第二次扩增在至多10天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(b)的快速第二次扩增在至多11天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)中的初始第一次扩增在7天的时间段内进行，且步骤(b)的快速第二次扩增在至多9天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)中的初始第一次扩增在7天的时间段内进行，且步骤(b)的快速第二次扩增在至多10天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)中的初始第一次扩增在7天或8天的时间段内进行，且步骤(b)的快速第二次扩增在至多9天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)中的初始第一次扩增在7天或8天的时间段内进行，且步骤(b)的快速第二次扩增在至多10天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)中的初始第一次扩增在8天的时间段内进行，且步骤(b)的快速第二次扩增在至多9天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：步骤(a)中的初始第一次扩增在8天的时间段内进行，且步骤(b)的快速第二次扩增在至多8天的时间段内进行。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一T细胞群在包含OKT-3和IL-2的第一培养基中培养。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3和IL-2。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一培养基包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，第一T细胞群在包含OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)的第二培养基中培养。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和抗原呈递细胞(APC)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一T细胞群在包括第一透气表面的容器中的第一培养基中培养，其中第一培养基包含OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群，其中第一APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，且第一APC群层叠至第一透气表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群在容器中的第二培养基中培养，其中第二培养基包含OKT-3、IL-2和第二APC群，其中第二APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，且第二APC群层叠至第一透气表面上，且其中第二APC群比第一APC群大。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一T细胞群在包括第一透气表面的容器中的第一培养基中培养，其中第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群，其中第一APC群对于第一T细胞群供体为外源性的，且第一APC群层叠至第一透气表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群在容器中的第二培养基中培养，其中第二培养基包含OKT-3、IL-2和第二APC群，其中第二APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，且第二APC群层叠至第一透气表面上，且其中第二APC群比第一APC群大。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一T细胞群在包括第一透气表面的容器中的第一培养基中培养，其中第一培养基包含OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群，其中第一APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，且第一APC群层叠至第一透气表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群在容器中的第二培养基中培养，其中第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第二APC群，其中第二APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，且第二APC群层叠至第一透气表面上，且其中第二APC群比第一APC群大。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一T细胞群在包括第一透气表面的容器中的第一培养基中培养，其中第一培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第一抗原呈递细胞(APC)群，其中第一APC群对于第一T细胞群供体为外源性的，且第一APC群层叠至第一透气表面上，其中在步骤(b)中，第一T细胞群在容器中的第二培养基中培养，其中第二培养基包含4-1BB激动剂、OKT-3、IL-2和第二APC群，其中第二APC群对于第一T细胞群的供体为外源性的，且第二APC群层叠至第一透气表面上，且其中第二APC群比第一APC群大。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第二APC群中的APC的数目与第一APC群中的APC的数目的比率为约2:1。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一APC群中的APC的数目为约2.5×108，且第二APC群中的APC的数目为约5×108。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一APC群以2层APC的平均厚度层叠至第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，第二APC群以4至8层APC的平均厚度层叠至第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中层叠至第一透气表面上的APC的平均层数与在步骤(a)中层叠至第一透气表面上的APC的平均层数之比为2:1。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一APC群以(约)1.0×106个APC/cm2至(约)4.5×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一APC群以(约)1.5×106个APC/cm2至(约)3.5×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一APC群以(约)2.0×106个APC/cm2至(约)3.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一APC群以(约)2.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，第二APC群以(约)2.5×106个APC/cm2至(约)7.5×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，第二APC群以(约)3.5×106个APC/cm2至(约)6.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，第二APC群以(约)4.0×106个APC/cm2至(约)5.5×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(b)中，第二APC群以(约)4.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一APC群以(约)1.0×106个APC/cm2至(约)4.5×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上，且在步骤(b)中，第二APC群以(约)2.5×106个APC/cm2至(约)7.5×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一APC群以(约)1.5×106个APC/cm2至(约)3.5×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上，且在步骤(b)中，第二APC群以(约)3.5×106个APC/cm2至(约)6.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一APC群以(约)2.0×106个APC/cm2至(约)3.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上，且在步骤(b)中，第二APC群以(约)4.0×106个APC/cm2至(约)5.5×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(a)中，第一APC群以(约)2.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上，且在步骤(b)中，第二APC群以(约)4.0×106个APC/cm2的密度接种在第一透气表面上。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：APC为外周血单核细胞(PBMC)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：PBMC经辐照且对于第一T细胞群的供体为外源性的。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：T细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：T细胞为骨髓浸润淋巴细胞(MIL)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：T细胞为外周血淋巴细胞(PBL)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群通过自供体的全血分离而获得。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群通过自供体的单采术产物分离而获得。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群通过T细胞表型的正向或负向选择自供体的全血或单采术产物分离。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：T细胞表型为CD3+和CD45+。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在进行第一T细胞群的初始第一次扩增之前，自NK细胞分离T细胞。在另一个实施方案中，通过自第一T细胞群移除CD3-CD56+细胞来将第一T细胞群中的T细胞与NK细胞分离。在另一个实施方案中，通过使用门控策略对第一T细胞群进行细胞分选，移除CD3-CD56+细胞级分且回收阴性级分，从而从第一T细胞群中除去CD3-CD56+细胞。在另一个实施方案中，前述方法是用于以高百分比的NK细胞为特征的第一T细胞群中的T细胞扩增。在另一个实施方案中，前述方法是用于以高百分比的CD3-CD56+细胞为特征的第一T细胞群中的T细胞扩增。在另一个实施方案中，前述方法用于以存在大量NK细胞为特征的肿瘤组织中的T细胞扩增。在其他实施方案中，前述方法是用于以大量CD3-CD56+细胞为特征的肿瘤组织中的T细胞扩增。在另一个实施方案中，前述方法是用于自患有以存在大量NK细胞为特征的肿瘤的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。在另一个实施方案中，前述方法是用于自患有以存在大量CD3-CD56+细胞为特征的肿瘤的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。在另一个实施方案中，前述方法是用于自患有卵巢癌的患者获得的肿瘤组织中的T细胞扩增。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：将(约)1×107个来自第一T细胞群的T细胞接种于容器中，以在该容器中开始初始第一次扩增培养。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：将第一T细胞群分配到多个容器中，并在各容器中接种(约)1×107个来自第一T细胞群的T细胞，以在该容器中开始初始第一次扩增培养。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在步骤(c)中收集的第二T细胞群为治疗性TIL群。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自一个以上来自供体的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)、核心活检、芯针活检或细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1至20个来自供体的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)、核心活检、芯针活检或细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1至10个来自供体的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)、核心活检、芯针活检或细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)、核心活检、芯针活检或细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)、核心活检、芯针活检或细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自一个以上来自供体的肿瘤组织的核心活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1至20个来自供体的肿瘤组织的核心活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1至10个来自供体的肿瘤组织的核心活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织的核心活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织的核心活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自一个以上来自供体的肿瘤组织的细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1至20个来自供体的肿瘤组织的细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1至10个来自供体的肿瘤组织的细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织的细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织的细针抽吸物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自一个以上来自供体的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1至20个来自供体的肿瘤组织小型活检(包括例如穿刺活检)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1至10个来自供体的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织的小型活检(包括例如穿刺活检)。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自一个以上来自供体的肿瘤组织的芯针活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1至20个来自供体的肿瘤组织的芯针活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1至10个来自供体的肿瘤组织的芯针活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个来自供体的肿瘤组织的芯针活检。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：第一T细胞群获自1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个来自供体的肿瘤组织的芯针活检。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：i)通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养自受试者肿瘤的一个以上小型活检、核心活检或穿刺活检获得的肿瘤样本约3天而自该肿瘤样本获得和/或接受第一TIL群；(ii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群来进行初始第一次扩增以产生第二TIL群，其中该初始第一次扩增在包括第一透气表面区域的容器中进行，其中该初始第一次扩增进行约7天或8天的第一时间段以获得第二TIL群，其中第二TIL群在数目上大于第一TIL群；(iii)通过用另外的IL-2、OKT-3和APC补充第二TIL群的第二细胞培养基来进行快速第二次扩增以产生第三TIL群，其中在快速第二次扩增中添加的APC数目为在步骤(ii)中添加的APC数目的至少两倍，其中该快速第二次扩增进行约11天的第二时间段以获得第三TIL群，其中第三TIL群为治疗性TIL群，其中该快速第二次扩增在包括第二透气表面区域的容器中进行；(iv)收集由步骤(iii)获得的治疗性TIL群；和(v)将来自步骤(iv)的经收集的TIL群转移至输注袋。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增为治疗性TIL群的方法，其包括：(i)通过在包含IL-2的第一细胞培养基中培养自受试者肿瘤的一个以上小型活检、核心活检或穿刺活检获得的肿瘤样本约3天而自该肿瘤样本获得和/或接受第一TIL群；(ii)通过在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的第二细胞培养基中培养第一TIL群来进行初始第一次扩增以产生第二TIL群，其中该初始第一次扩增进行约7天或8天的第一时间段以获得第二TIL群，其中第二TIL群在数目上大于第一TIL群；(iii)通过使第二TIL群与包含IL-2、OKT-3和APC的第三细胞培养基接触来进行快速第二次扩增以产生第三TIL群，其中该快速第二次扩增进行约11天的第二时间段以获得第三TIL群，其中第三TIL群为治疗性TIL群；和(iv)收集由步骤(iii)获得的治疗性TIL群。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在第二时间段的第5天后，将培养物分成2个以上继代培养物，且向各继代培养物补充另外数量的第三培养基并培养约6天。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在第二时间段的第5天后，将培养物分成2个以上继代培养物，且向各继代培养物补充包含IL-2的第四培养基并培养约6天。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：在第二时间段的第5天后，将培养物分成至多5个继代培养物。
在另一个实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：方法中的所有步骤在约22天内完成。
在另一个实施方案中，本发明提供一种扩增T细胞的方法，其包括：(i)通过培养来自肿瘤样本的第一T细胞群来进行该第一T细胞群的初始第一次扩增，以实现第一T细胞群的生长并启动第一T细胞群的活化，该肿瘤样本自供体肿瘤的一个以上小型活检、核心活检或穿刺活检获得；(ii)在步骤(a)中启动的第一T细胞群的活化开始衰退后，通过培养第一T细胞群进行第一T细胞群的快速第二次扩增以实现第一T细胞群的生长并增强第一T细胞群的活化，以获得第二T细胞群；和(iv)收集第二T细胞群。在一些实施方案中，肿瘤样本自多个核心活检获得。在一些实施方案中，多个核心活检选自下组：2、3、4、5、6、7、8、9和10个核心活检。
在一些实施方案中，本发明提供如上适用的任何前述段落中描述的方法，其经修改使得：T细胞或TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，通过在酶培养基(例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原蛋白酶)中孵育肿瘤，随后进行机械解离(加利福尼亚州奥本美天旎生物技术的GentleMACS)来产生肿瘤消化物。在一些实施方案中，将肿瘤置于肿瘤解离酶混合物中，该肿瘤解离酶混合物包含一种以上解离(消化)酶，例如但不限于胶原蛋白酶(包括任何胶原蛋白酶的混合物或类型)、AccutaseTM、AccumaxTM、透明质酸酶、中性蛋白酶(分散酶)、胰凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、酪蛋白酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶型XIV(链霉蛋白酶)、脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)、胰蛋白酶抑制剂、任何其他解离或蛋白分解酶，以及它们的任何组合。在其他实施方案中，将肿瘤置于肿瘤解离酶混合物中，该肿瘤解离酶混合物包含胶原蛋白酶(包括任何胶原蛋白酶的混合物或类型)、中性蛋白酶(分散酶)和脱氧核糖核酸酶I(DNA酶)。
药物组合物、剂量和给药方案
在一个实施方案中，使用本公开的方法扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一个实施方案中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施方案中，T细胞以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可施用任何适合剂量的TIL。在一些实施方案中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为黑色素瘤的情况下。在一个实施方案中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010个。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为黑色素瘤的情况下。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的数目为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一个实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的数目在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度小于药物组合物的例如100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度为药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度为药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
在本发明的药物组合物中提供的TIL在广泛剂量范围内有效。准确剂量将根据施用途径、化合物施用形式、待治疗受试者的性别和年龄、待治疗受试者的体重和主治医师的偏好和经验而定。适当时也可使用TIL的临床确定剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量将根据所治疗的人类或哺乳动物、病症或病状的严重程度、施用速率、活性药物成分的配置和开处方医师的判断而定。
在一些实施方案中，TIL可以单次剂量施用。此类施用可通过例如静脉内注射的注射进行。在一些实施方案中，TIL可以多次剂量施用。给药可为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。给药可为每月一次、每两周一次、一周一次或每隔一天一次。TIL的施用可视需要而继续。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施方案中，TIL的有效剂量在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg的范围内。
有效量的TIL可通过具有类似效用的任何可接受的药剂施用模式，包括鼻内和经皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、局部、通过移植或通过吸入，以单次或多次剂量施用。
在其他实施方案中，本发明提供一种输注袋，其包含如上适用的在任何前述段落中描述的治疗性TIL群。
在其他实施方案中，本发明提供一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)组合物，其包括如上适用的在任何前述段落中描述的治疗性TIL群和药学上可接受的载体。
在其他实施方案中，本发明提供一种输注袋，其包括如上适用的在任何前述段落中描述的TIL组合物。
在其他实施方案中，本发明提供一种如上适用的在任何前述段落中描述的治疗性TIL群的冷冻保存制剂。
在另一个实施方案中，本发明提供一种肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)组合物，其包括在如上任何前述段落中描述的治疗性TIL群和冷冻保存培养基。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上任何前述段落中描述的TIL组合物，其中冷冻保存培养基含有DMSO。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的如上任何前述段落中描述的TIL组合物，其中冷冻保存培养基含有7％至10％DMSO。
在另一个实施方案中，本发明提供一种如上任何前述段落中描述的TIL组合物的冷冻保存制剂。
在一个实施方案中，使用本公开的方法扩增的TIL以药物组合物的形式向患者施用。在一个实施方案中，药物组合物为TIL在无菌缓冲液中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可通过本领域中已知的任何适合途径施用。在一些实施方案中，T细胞以单一动脉内或静脉内输注的形式施用，其优选持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴管内施用。
可施用任何适合剂量的TIL。在一些实施方案中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为黑色素瘤的情况下。在一个实施方案中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是在癌症为黑色素瘤的情况下。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的数目为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一个实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的数目在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度小于药物组合物的例如100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％、19％、18.75％、18.50％、18.25％、18％、17.75％、17.50％、17.25％、17％、16.75％、16.50％、16.25％、16％、15.75％、15.50％、15.25％、15％、14.75％、14.50％、14.25％、14％、13.75％、13.50％、13.25％、13％、12.75％、12.50％、12.25％、12％、11.75％、11.50％、11.25％、11％、10.75％、10.50％、10.25％、10％、9.75％、9.50％、9.25％、9％、8.75％、8.50％、8.25％、8％、7.75％、7.50％、7.25％、7％、6.75％、6.50％、6.25％、6％、5.75％、5.50％、5.25％、5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度为药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度为药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的量等于或小于10g、9.5g、9.0g、8.5g、8.0g、7.5g、7.0g、6.5g、6.0g、5.5g、5.0g、4.5g、4.0g、3.5g、3.0g、2.5g、2.0g、1.5g、1.0g、0.95g、0.9g、0.85g、0.8g、0.75g、0.7g、0.65g、0.6g、0.55g、0.5g、0.45g、0.4g、0.35g、0.3g、0.25g、0.2g、0.15g、0.1g、0.09g、0.08g、0.07g、0.06g、0.05g、0.04g、0.03g、0.02g、0.01g、0.009g、0.008g、0.007g、0.006g、0.005g、0.004g、0.003g、0.002g、0.001g、0.0009g、0.0008g、0.0007g、0.0006g、0.0005g、0.0004g、0.0003g、0.0002g或0.0001g。
在一些实施方案中，在本发明的药物组合物中提供的TIL的量大于0.0001g、0.0002g、0.0003g、0.0004g、0.0005g、0.0006g、0.0007g、0.0008g、0.0009g、0.001g、0.0015g、0.002g、0.0025g、0.003g、0.0035g、0.004g、0.0045g、0.005g、0.0055g、0.006g、0.0065g、0.007g、0.0075g、0.008g、0.0085g、0.009g、0.0095g、0.01g、0.015g、0.02g、0.025g、0.03g、0.035g、0.04g、0.045g、0.05g、0.055g、0.06g、0.065g、0.07g、0.075g、0.08g、0.085g、0.09g、0.095g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g、0.55g、0.6g、0.65g、0.7g、0.75g、0.8g、0.85g、0.9g、0.95g、1g、1.5g、2g、2.5、3g、3.5、4g、4.5g、5g、5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g、8g、8.5g、9g、9.5g或10g。
在本发明的药物组合物中提供的TIL在广泛剂量范围内有效。准确剂量将根据施用途径、化合物施用形式、待治疗受试者的性别和年龄、待治疗受试者的体重和主治医师的偏好和经验而定。适当时也可使用TIL的临床确定剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，例如TIL的剂量将根据所治疗的人类或哺乳动物、病症或病状的严重程度、施用速率、活性药物成分的配置和开处方医师的判断而定。
在一些实施方案中，TIL可以单次剂量施用。此类施用可通过例如静脉内注射的注射进行。在一些实施方案中，TIL可以多次剂量施用。给药可为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或超过六次。给药可为每月一次、每两周一次、一周一次或每隔一天一次。TIL的施用可视需要而继续。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013。在一些实施方案中，TIL的有效剂量在1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013的范围内。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约0.01mg/kg至约4.3mg/kg、约0.15mg/kg至约3.6mg/kg、约0.3mg/kg至约3.2mg/kg、约0.35mg/kg至约2.85mg/kg、约0.15mg/kg至约2.85mg/kg、约0.3mg至约2.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1.7mg/kg、约0.15mg/kg至约1.3mg/kg、约0.3mg/kg至约1.15mg/kg、约0.45mg/kg至约1mg/kg、约0.55mg/kg至约0.85mg/kg、约0.65mg/kg至约0.8mg/kg、约0.7mg/kg至约0.75mg/kg、约0.7mg/kg至约2.15mg/kg、约0.85mg/kg至约2mg/kg、约1mg/kg至约1.85mg/kg、约1.15mg/kg至约1.7mg/kg、约1.3mg/kgmg至约1.6mg/kg、约1.35mg/kg至约1.5mg/kg、约2.15mg/kg至约3.6mg/kg、约2.3mg/kg至约3.4mg/kg、约2.4mg/kg至约3.3mg/kg、约2.6mg/kg至约3.15mg/kg、约2.7mg/kg至约3mg/kg、约2.8mg/kg至约3mg/kg或约2.85mg/kg至约2.95mg/kg的范围内。
在一些实施方案中，TIL的有效剂量在约1mg至约500mg、约10mg至约300mg、约20mg至约250mg、约25mg至约200mg、约1mg至约50mg、约5mg至约45mg、约10mg至约40mg、约15mg至约35mg、约20mg至约30mg、约23mg至约28mg、约50mg至约150mg、约60mg至约140mg、约70mg至约130mg、约80mg至约120mg、约90mg至约110mg、或约95mg至约105mg、约98mg至约102mg、约150mg至约250mg、约160mg至约240mg、约170mg至约230mg、约180mg至约220mg、约190mg至约210mg、约195mg至约205mg或约198至约207mg的范围内。
有效量的TIL可通过具有类似效用的任何可接受的药剂施用模式，包括鼻内和经皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌内、皮下、局部、通过移植或通过吸入，以单次或多次剂量施用。
I.改进的人工抗原呈递细胞过程实施方案
在一些实施方案中，本发明包括一种使用APC扩增TIL、MIL或PBL的方法，这些APC选自下组：Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞、Thp1细胞和其衍生物、变体、修饰物或后代。在一些实施方案中，本发明包括一种使用APC扩增TIL、MIL或PBL的方法，其中APC是经辐照或未经辐照的单核细胞谱系细胞，例如U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。在一些实施方案中，APC为人工APC。在一些实施方案中，如本文中别处所描述对APC进行基因修饰，例如以表达4-1BBL或OX40L。在一个实施方案中，经基因修饰的细胞经修饰以表达CD86、OX40L、4-1BBL、OX-40激动性抗体、4-1BB激动性抗体、能够结合OKT-3的Fc链的抗体和/或ICOS-L，如美国专利第10,415,015号中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。在任何前述实施方案中，经基因修饰的aAPC可如本文中别处所描述经辐照或未经辐照。可采用前述Gen2、Gen 3以及其他TIL制造工艺，包括基于细胞表面标记物的选择的过程。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，该方法包括：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中第一次扩增进行约3至11天以获得第二TIL群，其中第二TIL群在数目上比第一TIL群多至少10倍，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群，其中第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(e)收集由步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的收集的TIL群转移至输注袋，其中由步骤(e)至(f)的转移在不开放该系统的情况下进行；
(g)使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含收集的TIL群的输注袋；以及
(h)向该受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群；
其中APC选自下组：Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞、Thp1细胞和其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，该方法包括：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中第一次扩增进行约3至11天以获得第二TIL群，其中第二TIL群在数目上比第一TIL群多至少10倍，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群，其中第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(e)收集由步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的收集的TIL群转移至输注袋，其中由步骤(e)至(f)的转移在不开放该系统的情况下进行；
(g)使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含收集的TIL群的输注袋；以及
(h)向该受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群；
其中APC为经辐照或未经辐照的单核细胞谱系细胞，例如U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，本发明包括一种扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中该扩增的TIL群是可通过包括以下步骤的方法获得的第三TIL群：
(a)通过将获自患者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养该第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中该第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中该第一次扩增进行约3至11天以获得该第二TIL群，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中该第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群，其中该第三TIL群为治疗性TIL群，其中该第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；以及
(e)收集由步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
其中APC选自下组：Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞、Thp1细胞和其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，本发明包括一种扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群，其中该扩增的TIL群是可通过包括以下步骤的方法获得的第三TIL群：
(a)通过将获自患者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养该第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中该第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中该第一次扩增进行约3至11天以获得该第二TIL群，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中该第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群，其中该第三TIL群为治疗性TIL群，其中该第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；以及
(e)收集由步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
其中APC为经辐照或未经辐照的单核细胞谱系细胞，例如U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，本发明包括一种经冷冻保存的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)组合物，其包含治疗性浸润淋巴细胞(TIL)群，其中经冷冻保存的TIL组合物通过包括以下步骤的方法产生：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中第一次扩增进行约7至11天以获得第二TIL群，其中第二TIL群在数目上比第一TIL群多至少10倍，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行快速第二次扩增，产生第三TIL群，其中该第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群，其中该第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；(e)收集由步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(e)将来自步骤(e)的收集的TIL群转移至输注袋，其中由步骤(e)至(f)的转移在不开放该系统的情况下进行；和
(f)使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含收集的TIL群的输注袋，以获得经冷冻保存的TIL组合物；
其中APC选自下组：Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞、Thp1细胞和其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，本发明包括一种经冷冻保存的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)组合物，其包含治疗性浸润淋巴细胞(TIL)群，其中经冷冻保存的TIL组合物通过包括以下步骤的方法产生：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成多个肿瘤碎片而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养第一TIL群进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中第一次扩增进行约7至11天以获得第二TIL群，其中第二TIL群在数目上比第一TIL群多至少10倍，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行快速第二次扩增，产生第三TIL群，其中该第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群，其中该第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；(e)收集由步骤(d)获得的治疗性TIL群，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(e)将来自步骤(e)的收集的TIL群转移至输注袋，其中由步骤(e)至(f)的转移在不开放该系统的情况下进行；和
(f)使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含收集的TIL群的输注袋，以获得经冷冻保存的TIL组合物；
其中APC为经辐照或未经辐照的单核细胞谱系细胞，例如U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，该方法包括：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；
(b)将肿瘤消化物添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养该第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中该第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中该第一次扩增进行约3至11天以获得该第二TIL群，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群，其中第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(e)收集由步骤(d)获得的第三TIL群，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的收集的第三TIL群转移至输注袋，其中由步骤(e)至(f)的转移在不开放该系统的情况下进行；
(g)使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含收集的TIL群的输注袋；以及
(h)向该受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群；
其中APC选自下组：Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞、Thp1细胞和其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，该方法包括：
(a)通过将获自受试者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物而获得来自该受试者所切除的肿瘤的第一TIL群；
(b)将肿瘤消化物添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养该第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中该第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中该第一次扩增进行约3至11天以获得该第二TIL群，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群，其中第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(e)收集由步骤(d)获得的第三TIL群，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的收集的第三TIL群转移至输注袋，其中由步骤(e)至(f)的转移在不开放该系统的情况下进行；
(g)使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(f)的包含收集的TIL群的输注袋；以及
(h)向该受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(g)中的输注袋的第三TIL群；
其中APC为经辐照或未经辐照的单核细胞谱系细胞，例如U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，该方法包括：
(a)通过将获自患者的肿瘤样本处理成肿瘤碎片而获得来自该患者所切除的肿瘤的第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3以及可选的抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养该第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中该第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中该第一次扩增进行约3至14天以获得第二TIL群，其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和APC补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中第二次扩增进行约4至6天以获得第三TIL群，其中第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(e)将该第三TIL群分成第一多个2至5个TIL亚群，其中每各亚群中存在至少1.0×109个TIL，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(f)通过可选地用另外的IL-2、OKT-3和APC补充各TIL亚群的细胞培养基来进行第一多个TIL亚群的第三次扩增，产生第二多个TIL亚群，其中第三次扩增进行约5至7天，其中各亚群的第三次扩增在提供第三透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(e)至步骤(f)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(g)收集由步骤(f)获得的第二多个TIL亚群，其中由步骤(f)至步骤(g)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(h)将来自步骤(g)的经收集的TIL亚群转移至一个以上输注袋中，其中由步骤(g)至(h)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(i)使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(h)的包含收集的TIL亚群的一个以上输注袋；和
(j)向该受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(i)中的一个以上输注袋的收集的TIL亚群；
其中APC选自下组：Raji细胞、Ramos细胞、Daudi细胞、U937细胞、Thp1细胞和其衍生物、变体、修饰物或后代。
在一些实施方案中，本发明包括一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，该方法包括：
(a)通过将获自患者的肿瘤样本处理成肿瘤碎片而获得来自该患者所切除的肿瘤的第一TIL群；
(b)将肿瘤碎片添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2和可选的OKT-3以及可选的抗原呈递细胞(APC)的细胞培养基中培养该第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中该第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中该第一次扩增进行约3至14天以获得第二TIL群，其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(d)通过用另外的IL-2、OKT-3和APC补充第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中第二次扩增进行约4至6天以获得第三TIL群，其中第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(e)将该第三TIL群分成第一多个2至5个TIL亚群，其中每各亚群中存在至少1.0×109个TIL，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(f)通过可选地用另外的IL-2、OKT-3和APC补充各TIL亚群的细胞培养基来进行第一多个TIL亚群的第三次扩增，产生第二多个TIL亚群，其中第三次扩增进行约5至7天，其中各亚群的第三次扩增在提供第三透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(e)至步骤(f)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(g)收集由步骤(f)获得的第二多个TIL亚群，其中由步骤(f)至步骤(g)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(h)将来自步骤(g)的经收集的TIL亚群转移至一个以上输注袋中，其中由步骤(g)至(h)的转变在不开放该系统的情况下进行；
(i)使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(h)的包含收集的TIL亚群的一个以上输注袋；和
(j)向该受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(i)中的一个以上输注袋的收集的TIL亚群；
其中APC为经辐照或未经辐照的单核细胞谱系细胞，例如U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
III.治疗患者的方法
治疗方法始于原始TIL收集和TIL培养。此类方法均已描述于本领域中的例如Jin等人，《免疫疗法杂志》，2012，35(3):283-292中，其以全文引用的方式并入本文中。治疗方法的实施方案在以下部分中进行描述，包括实施例。
发现根据本文所描述的方法，包括例如如上文步骤A至F中所描述或根据上文步骤A至F(也如例如图1和或图8中所示)而产生的扩增的TIL在治疗癌症患者方面的特殊用途(例如，如Goff等人，《临床肿瘤学杂志》，2016，34(20):2389-239以及补充内容中所描述)；其全文以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，如先前描述自经切除的转移性黑色素瘤沉积物生长TIL(参见Dudley等人,《免疫疗法杂志》，2003，26:332-342；其以全文引用的方式并入本文中)。可在无菌条件下分割新鲜肿瘤。可收集代表样本以用于正式病理分析。可使用2mm3至3mm3的单个碎片。在一些实施方案中，自每位患者获得5、10、15、20、25或30个样本。在一些实施方案中，自每位患者获得20、25或30个样本。在一些实施方案中，自每位患者获得20、22、24、26或28个样本。在一些实施方案中，自每位患者获得24个样本。可将样本置于24孔板的各个孔中，维持在含高剂量IL-2(6,000IU/mL)的生长培养基中，并监测肿瘤的破坏和/或TIL的增殖。如本文所描述，可将在处理后剩余活细胞的任何肿瘤酶消化成单细胞悬浮液并冷冻保存。
在一些实施方案中，可对成功生长的TIL进行取样以用于表型分析(CD3、CD4、CD8和CD56)，并在可用时针对自体肿瘤进行测试。若过夜共培养产生的干扰素-γ(IFN-γ)含量＞200pg/mL且为背景的两倍，则可认为TIL具反应性。(Goff等人，《免疫疗法杂志》，2010，33，840-847；以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，可选择证明具有自体反应性或充足生长模式的培养物用于第二次扩增(例如根据图1和/或图8的步骤D中所提供的第二次扩增)，包括有时称为快速扩增(REP)的第二次扩增。在一些实施方案中，选择具有高自体反应性(例如在第二次扩增期间高度增殖)的扩增的TIL用于另外的第二次扩增。在一些实施方案中，选择具高自体反应性(例如在如图1和/或图8的步骤D中所提供的第二次扩增期间高度增殖)的TIL用于根据图1和/或图8的步骤D的另外的第二次扩增。
可通过针对表面标记物CD3、CD4、CD8、CCR7和CD45RA的流式细胞术(例如FlowJo)(BD BioSciences))以及通过本文所描述的任一种方法分析输注袋TIL的冷冻保存样本的细胞表型。通过使用标准酶联免疫吸附分析技术测量血清细胞因子。血清IFN-g的升高定义为＞100pg/mL和大于43的基线水平。
在一些实施方案中，通过本文所提供的方法(例如图1和/或图8中例示的方法)产生的TIL实现TIL的临床功效的惊人改进。在一些实施方案中，相较于通过除本文所描述的方法以外的方法(包括例如除图1中和/或图8中例示的方法以外的方法)产生的TIL，通过本文所提供的方法(例如图1和/或图8中例示的方法)产生的TIL表现增加的临床功效。在一些实施方案中，除本文所描述的方法以外的方法包括称作过程1C和/或第1代(Gen 1)的方法。在一些实施方案中，通过DCR、ORR和/或其他临床反应测量增加的功效。在一些实施方案中，相较于通过除本文所描述的方法以外的方法(包括例如除图1中和/或图8中例示的方法以外的方法，例如Gen 1过程)产生的TIL，通过本文所提供的方法(例如图1中例示的方法)产生的TIL表现类似的反应时间和安全性概况。
在一些实施方案中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方案中，采用针对IFN-γ产生的效力测定。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。可以通过测定用由本发明方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或离体TIL中的细胞因子IFN-γ含量来测量IFN-γ产生。在一些实施方案中，IFN-γ的增加表明用本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方案中，使用Quantikine ELISA试剂盒测量IFN-γ。在一些实施方案中，IFN-γ在用通过本发明方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的离体TIL中测量。在一些实施方案中，IFN-γ在用通过本发明方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的血液中测量。在一些实施方案中，IFN-γ在用通过本发明方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的血清中的TIL测量。
在一些实施方案中，IFN-γ指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方案中，采用针对IFN-γ产生的效力测定。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。可以通过测定用由本发明方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL治疗的受试者的血液、血清或其他组织中的细胞因子IFN-γ含量来测量IFN-γ产生。在一些实施方案中，IFN-γ增加指示对用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。
在一些实施方案中，相较于通过其他方法(包括未在图1和/或图8中例示的方法，包括例如称为过程1C方法的方法)产生的TIL，通过本发明的方法(包括如例如图1和/或图8中所描述的方法)制备的TIL表现增加的多克隆性。在一些实施方案中，显著提高的多克隆性和/或增加的多克隆性指示治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，多克隆性是指T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方案中，相较于使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL，多克隆性增加一倍、两倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加十倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用除本文中提供的方法以外的方法(包括例如除图1和/或图8中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
疗效衡量标准可包括疾病控制率(DCR)以及总体缓解率(ORR)，如本领域已知以及本文所描述。
1.治疗癌症和其他疾病的方法
本文所描述的组合物和方法可用于治疗疾病的方法中。在一个实施方案中，其用于治疗过度增殖性疾病。其也可用于治疗如本文和以下段落中所描述的其他病症。
在一些实施方案中，过度增殖性疾病为癌症。在一些实施方案中，过度增殖性疾病为实体肿瘤癌症。在一些实施方案中，实体肿瘤癌症选自下组：肉瘤、胰脏癌、肝癌、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、胃肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌、前列腺癌和肾细胞癌。在一些实施方案中，过度增殖性疾病为血液系统恶性肿瘤。在一些实施方案中，实体肿瘤癌症选自下组：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，实体肿瘤癌症选自下组：肛门癌、膀胱癌、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、骨癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症(HPV)、中枢神经系统相关癌症(包括室管膜瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、松果体母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)、子宫颈癌(包括鳞状细胞子宫颈癌、腺鳞状子宫颈癌和子宫颈腺癌)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、食管胃结合部癌、胃癌、胃肠癌、胃肠基质瘤、神经胶母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、口咽癌和咽癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌)、黑色素瘤(包括葡萄膜黑色素瘤、脉络膜黑色素瘤、睫状体黑色素瘤或虹膜黑色素瘤)、间皮瘤(包括恶性胸膜间皮瘤)、卵巢癌、胰脏癌(包括胰管腺癌)、阴茎癌、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、肉瘤(包括尤文氏肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤以及其他骨和软组织肉瘤)、甲状腺癌(包括退行性甲状腺癌)、子宫癌和阴道癌。
在一些实施方案中，癌症为黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是黑色素瘤IIB至IV期。
在一些实施方案中，本发明提供一种治疗患有癌症的受试者的方法，其中该癌症为黑色素瘤、卵巢癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、神经胶母细胞瘤(包括GBM)、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有本文所描述的癌症的受试者的方法，其中该癌症为黑色素瘤、HNSCC、子宫颈癌、NSCLC、神经胶母细胞瘤(包括GBM)和胃肠癌。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有本文所描述的癌症的受试者的方法，其中该癌症为黑色素瘤。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有本文所描述的癌症的受试者的方法，其中该癌症为HNSCC。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有本文所描述的癌症的受试者的方法，其中该癌症为子宫颈癌。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有本文所描述的癌症的受试者的方法，其中该癌症为NSCLC。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有本文所描述的癌症的受试者的方法，其中该癌症为神经胶母细胞瘤(包括GBM)。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有本文所描述的癌症的受试者的方法，其中该癌症为胃肠癌。
在另一个实施方案中，本发明提供一种治疗患有本文所描述的癌症的受试者的方法，其中该癌症为超突变癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有本文所描述的癌症的受试者的方法，其中该癌症为小儿超突变癌症。
在一些实施方案中，过度增殖性疾病为血液系统恶性肿瘤。在一些实施方案中，血液系统恶性肿瘤选自下组：慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中，本发明包括一种治疗癌症患者的方法，其中该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些实施方案中，本发明包括使用经修饰以表达一种以上CCR的TIL、MIL或PBL治疗癌症患者的方法，其中该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些实施方案中，本发明包括一种使用经修饰以表达一种以上CCR的MIL或PBL治疗癌症患者的方法，其中该癌症是血液系统恶性肿瘤。
在一些实施方案中，癌症为超突变癌症或超突变癌症表型。超突变癌症充分描述于Campbell等人，《细胞》2017，171，1042-1056中；其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，超突变肿瘤包括每兆碱基(Mb)9至10个突变。在一些实施方案中，小儿超突变肿瘤包括每兆碱基(Mb)9.91个突变。在一些实施方案中，成人超突变肿瘤包括每兆碱基(Mb)9个突变。在一些实施方案中，增强超突变肿瘤包括每兆碱基(Mb)10至100个突变。在一些实施方案中，增强小儿超突变肿瘤包括每兆碱基(Mb)10至100个突变。在一些实施方案中，增强成人超突变肿瘤包括每兆碱基(Mb)10至100个突变。在一些实施方案中，超超突变肿瘤包括每兆碱基(Mb)大于100个突变。在一些实施方案中，小儿超超突变肿瘤包括每兆碱基(Mb)大于100个突变。在一些实施方案中，成人超超突变肿瘤包括每兆碱基(Mb)超过100个突变。
在一些实施方案中，超突变肿瘤的复制修复途径发生突变。在一些实施方案中，超突变肿瘤的复制修复相关DNA聚合酶发生突变。在一些实施方案中，超突变肿瘤具有微卫星不稳定性。在一些实施方案中，超超突变肿瘤的复制修复相关DNA聚合酶发生突变且具有微卫星不稳定性。在一些实施方案中，肿瘤的超突变与对免疫检查点抑制剂的反应相关。在一些实施方案中，超突变肿瘤对免疫检查点抑制剂治疗具有抗性。在一些实施方案中，超突变肿瘤可使用本发明的TIL治疗。在一些实施方案中，肿瘤的超突变是由环境因素(外在暴露)引起。例如，UV光可为恶性黑色素瘤中大量突变的主要原因(参见例如Pfeifer等人《突变研究(Mutat.Res.)》2005，571，19-31；Sage，《光化学与光生物学(Photochem.Photobiol.)》1993，57，163-174)。在一些实施方案中，肿瘤的超突变可归因于直接暴露于突变原而由烟草烟雾中大于60种的肺和喉肿瘤以及其他肿瘤致癌物引起(参见例如Pleasance等人《自然》2010，463，184-190)。在一些实施方案中，肿瘤中的超突变是由载脂蛋白B mRNA编辑酶(催化多肽样(APOBEC)家族成员)的失调引起的，这已被证明会导致多种癌症中C至T转变水平的增加(参见例如Roberts等人，《自然遗传学(Nat.Genet.)》2013，45，970-976)。在一些实施方案中，肿瘤的超突变是由缺陷性DNA复制修复引起的，该缺陷性DNA复制修复是由损害主要复制酶Pol3和Pold1所进行的校读的突变造成。在一些实施方案中，肿瘤的超突变是由DNA错配修复缺陷引起，这些缺陷与结肠直肠癌、子宫内膜癌和其他癌症中的超突变相关(参见例如Kandoth等人，《自然》2013，497，67-73.；Muzny等人，《自然》2012，487，330-337)。在一些实施方案中，DNA复制修复突变也发现于癌症易感症候群，例如组成性或双对偶错配修复缺陷(constitutional or biallelic mismatch repair deficiency；CMMRD)、林奇症候群(Lynch syndrome)和聚合酶校读相关息肉病(PPAP)中。
在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群治疗癌症的方法，其中癌症为超突变癌症。在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群治疗癌症的方法，其中癌症为增强超突变癌症。在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群治疗癌症的方法，其中癌症为超超突变(ultra-hypermutated)癌症。
在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本公开的TIL之前经非清髓性化疗预治疗。在一个实施方案中，非清髓性化疗为环磷酰胺60mg/kg/天持续2天(在TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/天持续5天(在TIL输注前第27至23天)。在一些实施方案中，非清髓性化疗为环磷酰胺60mg/kg/天持续2天(在TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/天持续3天(在TIL输注前第27至25天)。在一些实施方案中，非清髓性化疗为环磷酰胺60mg/kg/天持续2天(在TIL输注前第27和26天)，然后为氟达拉滨25mg/m2/天持续3天(在TIL输注前第25至23天)。在一个实施方案中，在根据本公开的非清髓性化疗和TIL输注之后(第0天)，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2的静脉内输注以达到生理耐受。
可使用本领域已知的为人类疾病治疗提供指南的各种矩阵来测试本文所描述的化合物和化合物组合在治疗、预防和/或控制所指示疾病或病症中的功效。例如，用于测定卵巢癌治疗功效的矩阵描述于例如Mullany等人，《内分泌学(Endocrinology)》2012，153，1585-92；和Fong等人，《卵巢研究杂志(J.Ovarian Res.)》2009，2，12中。用于测定胰脏癌治疗功效的矩阵描述于Herreros-Villanueva等人，《世界胃肠病学杂志(WorldJ.Gastroenterol.)》2012，18，1286-1294中。用于测定乳腺癌治疗功效的矩阵描述于例如Fantozzi，《乳腺癌研究(Breast Cancer Res.)》2006，8，212中。用于测定黑色素瘤治疗功效的矩阵描述于例如Damsky等人，《色素细胞和黑色素瘤研究(Pigment Cell&MelanomaRes.)》2010，23,853-859中。用于测定肺癌治疗功效的矩阵描述于例如Meuwissen等人，《基因与发育(Genes&Development)》，2005，19，643-664中。用于测定肺癌治疗功效的矩阵描述于例如Kim，《临床与实验耳鼻喉科学(Clin.Exp.Otorhinolaryngol.)》2009，2，55-60；和Sano，《头颈癌肿瘤学(Head Neck Oncol.)》2009，1，32中。
在一些实施方案中，IFN-γ指示过度增殖性疾病治疗的治疗功效。在一些实施方案中，用TIL治疗的受试者的血液中的IFN-γ指示活性TIL。在一些实施方案中，采用针对IFN-γ产生的效力测定。IFN-γ产生为细胞毒性潜力的另一种量度。通过测定由本发明方法制备的TIL治疗的受试者的血液中的细胞因子IFN-γ含量，可测量IFN-γ产生，这些方法包括如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所描述的方法。在一些实施方案中，相较于用使用如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)和整个本申请所例示的称作Gen 3过程的方法制备的TIL治疗的受试者，通过本发明方法获得的TIL在用本发明方法的TIL治疗的受试者的血液中提供增加的IFN-γ。在一些实施方案中，IFN-γ增加指示对用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的治疗功效。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ增加一倍、两倍、三倍、四倍或五倍或更多倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加三倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加四倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中体现的方法以外的方法)制备的TIL治疗的患者，IFN-γ分泌增加五倍。在一些实施方案中，使用Quantikine ELISA试剂盒测量IFN-γ。在一些实施方案中，使用Quantikine ELISA试剂盒测量IFN-γ。在一些实施方案中，测量来自用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的离体TIL中的IFN-γ。在一些实施方案中，测量用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的血液中的IFN-γ。在一些实施方案中，测量用通过本发明方法产生的TIL治疗的患者的血清中的IFN-γ。
在一些实施方案中，相较于通过其他方法(包括例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中未例示的方法，例如称作过程1C方法的方法)产生的TIL，通过本发明方法(包括如例如图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中所描述的方法)制备的TIL表现增加的多克隆性。在一些实施方案中，显著提高的多克隆性和/或增加的多克隆性指示对癌症治疗的治疗功效和/或增加的临床功效。在一些实施方案中，多克隆性是指T细胞贮库多样性。在一些实施方案中，多克隆性增加可指示关于施用通过本发明方法产生的TIL的治疗功效。在一些实施方案中，相较于使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的方法外的方法)制备的TIL，多克隆性增加一倍、两倍、十倍、100倍、500倍或1000倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加一倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加两倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加十倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加100倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加500倍。在一些实施方案中，相较于未治疗患者和/或相较于用使用不同于本文所提供方法的方法(包括例如除体现于图8(特别是例如图8A和/或图8B和/或图8C和/或图8D)中的方法外的方法)制备的TIL治疗的患者，多克隆性增加1000倍。
2.与PD-1和PD-L1抑制剂的组合
在一些实施方案中，提供给癌症患者的TIL疗法可包括单独用治疗性TIL群治疗，或可包括组合治疗，所述组合治疗包括TIL和一种以上PD-1和/或PD-L1抑制剂。例如，靶向PD-1且可与本发明的TIL共同施用的抗体包括例如但不限于纳武利尤单抗(BMS-936558，百时美施贵宝；)、帕博利珠单抗(兰立珠单抗、MK03475或MK-3475，默克公司；)、人源化抗PD-1抗体JS001(上海君实)、单克隆抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro，Inc.)、匹地利珠单抗(抗PD-1mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1单克隆抗体BGB-A317(百济神州)，和/或抗PD-1抗体SHR-1210(上海恒瑞)、人类单克隆抗体REGN2810(再生元(Regeneron))、人类单克隆抗体MDX-1106(百时美施贵宝)和/或人源化抗PD-1IgG4抗体PDR001(诺华公司)。在一些实施方案中，PD-1抗体来自克隆：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目录号BP0146。适合与如本文所描述根据步骤A至F产生的TIL一起用于共同施用方法中的其他适合抗体为公开于美国专利第8,008,449号(以引用的方式并入本文)中的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分特异性结合至PD-L1且抑制其与PD-1的相互作用，从而增加免疫活性。本领域已知的结合至PD-L1且破坏PD-1与PD-L1的相互作用并刺激抗肿瘤免疫反应的任何抗体均适合与如本文所描述根据步骤A至F产生的TIL一起用于共同施用方法中。例如，靶向PD-L1且处于临床试验中的抗体包括BMS-936559(百时美施贵宝)和MPDL3280A(基因泰克)。靶向PD-L1的其他合适的抗体公开于美国专利第7,943,743号(以引用的方式并入本文)中。普通技术人员应理解，结合至PD-1或PD-L1、破坏PD-1/PD-L1相互作用且刺激抗肿瘤免疫反应的任何抗体均适合与如本文所描述根据步骤A至F产生的TIL一起用于共同施用方法中。在一些实施方案中，当患者患有单独施用抗PD-1抗体难以治疗的癌症类型时，向施用根据步骤A至F产生的TIL的组合的受试者共同施用抗PD-1抗体。在一些实施方案中，当患者患有难治性黑色素瘤时，向患者施用TIL与抗PD-1的组合。
程序性死亡1(PD-1)是一种由288个氨基酸组成的跨膜免疫检查点受体蛋白，由T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)T细胞、活化单核细胞和树突状细胞表达。PD-1，也称为CD279，属于CD28家族，在人类中由2号染色体上的Pdcd1基因编码。PD-1由一个免疫球蛋白(Ig)超家族域、跨膜区和细胞内域组成，该细胞内域含有免疫受体酪氨酸抑制模体(ITIM)和免疫受体酪氨酸切换模体(ITSM)。已知PD-1和其配体(PD-L1和PD-L2)在免疫耐受性中起重要作用，如Keir等人，《免疫学年度评论》2008，26，677-704中所描述。PD-1提供负向调节T细胞免疫反应的抑制信号。PD-L1(也称为B7-H1或CD274)和PD-L2(也称为B7-DC或CD273)在肿瘤细胞和基质细胞上表达，其可能遇到表达PD-1的活化T细胞，导致对T细胞的免疫抑制。PD-L1为由人类9号染色体上的Cd274基因编码的290个氨基酸跨膜蛋白。通过使用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂和/或PD-L2抑制剂阻断PD-1与其配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用，可克服免疫抗性，如近期临床研究，例如Topalian等人，《新英格兰医学杂志(N.Eng.J.Med.)》2012，366，2443-54中所描述的研究所显示。PD-L1在许多肿瘤细胞株上表达，而PD-L2主要在树突状细胞和一些肿瘤株上表达。除T细胞(其在活化后诱导性表达PD-1)以外，PD-1也在B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、活化单核细胞和树突状细胞上表达。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂可为本领域已知的任何PD-1抑制剂或PD-1阻断剂。详细地，其为在以下段落中更详细描述的PD-1抑制剂或阻断剂之一。关于PD-1抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的PD-1抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及PD-1抑制剂时也可指代小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
在优选实施方案中，PD-1抑制剂为抗体(即抗PD-1抗体)、其片段，包括其Fab片段或单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为多克隆抗体。在优选实施方案中，PD-1抑制剂为单克隆抗体。在一些实施方案中，PD-1抑制剂竞争结合PD-1，和/或结合至PD-1上的抗原表位。在一个实施方案中，抗体竞争结合PD-1，和/或结合至PD-1上的抗原表位。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约100pM或更低的KD结合人类PD-1、以约90pM或更低的KD结合人类PD-1、以约80pM或更低的KD结合人类PD-1、以约70pM或更低的KD结合人类PD-1、以约60pM或更低的KD结合人类PD-1、以约50pM或更低的KD结合人类PD-1、以约40pM或更低的KD结合人类PD-1、以约30pM或更低的KD结合人类PD-1、以约20pM或更低的KD结合人类PD-1、以约10pM或更低的KD结合人类PD-1，或以约1pM或更低的KD结合人类PD-1。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约7.5×105l/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-1、以约7.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-1、以约8×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-1、以约8.5×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-1、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-1、以约9.5×105l/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-1，或以约1×106l/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-1。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.4×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.6×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1，或以约2.7×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.8×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.9×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1，或以约3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为如下PD-1抑制剂，该PD-1抑制剂以约10nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约9nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约8nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约7nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约6nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约5nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约4nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约3nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约2nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合，或以约1nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂为纳武利尤单抗(可自百时美施贵宝公司以OPDIVO商购)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。纳武利尤单抗为阻断PD-1受体的全人IgG4抗体。在一个实施方案中，抗PD-1抗体为免疫球蛋白G4κ抗(人类CD274)抗体。纳武利尤单抗经指派化学文摘社(CAS)登记号946414-94-4且也称为5C4、BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538。纳武利尤单抗的制备和特性描述于美国专利第8,008,449号和国际专利公开第WO 2006/121168号中，这些专利的公开内容以引用的方式并入本文中。纳武利尤单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效已描述于Wang等人，《癌症免疫学研究》2014，2，846-56；Page等人,《年度医学评论(Ann.Rev.Med.)》，2014，65，185-202；和Weber等人，《临床肿瘤学杂志》，2013，31，4311-4318中，这些文献的公开内容以引用的方式并入本文中。纳武利尤单抗的氨基酸序列列于表18中。纳武利尤单抗在22-96、140-196、254-314、360-418、22”-96”、140”-196”、254”-314”和360”-418”处具有重链内二硫键；在23'-88'、134'-194'、23”'-88”'和134”'-194”'处具有轻链内二硫键；在127-214'、127”-214”'处具有重链-轻链间二硫键；在219-219”和222-222”处具有重链-重链间二硫键；且在290、290”处具有N-糖基化位点(H CH2 84.4)。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括SEQ ID NO:158所示的重链和SEQ ID NO:159所示的轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ IDNO:158和SEQ ID NO:159所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:159所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:463和SEQ ID NO:159所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括纳武利尤单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:160所示的序列及其保守氨基酸取代，且PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:161所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:160和SEQ IDNO:161所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:160和SEQ ID NO:161所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163和SEQ ID NO:164所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:167所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一个实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-1上与任何前述抗体相同的抗原表位。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂为药品监管机构参考纳武利尤单抗许可的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包括抗PD-1抗体，该抗PD-1抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为纳武利尤单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-1抗体，其中该抗PD-1抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为纳武利尤单抗。抗PD-1抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为纳武利尤单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为纳武利尤单抗。
表18.与纳武利尤单抗相关的PD-1抑制剂的氨基酸序列。
/>
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武利尤单抗或其生物类似物，且纳武利尤单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武利尤单抗或其生物类似物，且纳武利尤单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武利尤单抗或其生物类似物，且纳武利尤单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武利尤单抗或其生物类似物，且纳武利尤单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为纳武利尤单抗或其生物类似物，且每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，且每2周以约240mg进行施用。在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，且每4周以约480mg进行施用。在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤，且每3周施用约1mg/kg纳武利尤单抗，然后在同一天施用3mg/kg伊匹木单抗，持续4次剂量，随后每2周施用240mg或每4周施用480mg纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武利尤单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武利尤单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，每2周以约3mg/kg施用纳武利尤单抗且每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，每3周以约360mg施用纳武利尤单抗，加上每6周1mg/kg伊匹木单抗与2个周期的含铂双重化疗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg或每4周以480mg施用纳武利尤单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武利尤单抗以治疗小细胞肺癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，每3周以约360mg施用纳武利尤单抗且每6周施用1mg/kg伊匹木单抗，以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武利尤单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武利尤单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，每3周以约3mg/kg施用纳武利尤单抗，然后在同一天以约1mg/kg施用伊匹木单抗，持续4次剂量，随后每2周施用240mg纳武利尤单抗，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，每3周以约3mg/kg施用纳武利尤单抗，然后在同一天以约1mg/kg施用伊匹木单抗，持续4次剂量，随后每2周施用240mg、每4周施用480mg纳武利尤单抗，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武利尤单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武利尤单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武利尤单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武利尤单抗以治疗复发性或转移性头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武利尤单抗以治疗局部晚期或转移性尿道上皮癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武利尤单抗以治疗局部晚期或转移性尿道上皮癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武利尤单抗以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武利尤单抗以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，每2周以约3mg/kg施用纳武利尤单抗以治疗<40kg的小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，每3周以约3mg/kg施用纳武利尤单抗，然后在同一天施用1mg/kg伊匹木单抗，持续4次剂量，随后每2周施用240mg纳武利尤单抗，以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，每3周以约3mg/kg施用纳武利尤单抗，然后在同一天施用1mg/kg伊匹木单抗，持续4次剂量，随后每4周施用480mg纳武利尤单抗，以治疗≥40kg的成人和小儿患者的高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武利尤单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武利尤单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，每3周以约1mg/kg施用纳武利尤单抗，然后在同一天施用3mg/kg伊匹木单抗，持续4次剂量，随后每2周施用纳武利尤单抗240mg，以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，每3周以约1mg/kg施用纳武利尤单抗，然后在同一天施用3mg/kg伊匹木单抗，持续4次剂量，随后每4周施用480mg纳武利尤单抗，以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在一些实施方案中，施用纳武利尤单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方案中，每2周以约240mg施用纳武利尤单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方案中，每4周以约480mg施用纳武利尤单抗以治疗食道鳞状细胞癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用纳武利尤单抗。
在另一个实施方案中，PD-1抑制剂包括帕博利珠单抗(可自美国新泽西州凯尼尔沃思的默克公司以KEYTRUDA商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。帕博利珠单抗经指派CAS登记号1374853-91-4且也称为兰立珠单抗、MK-3475和SCH-900475。帕博利珠单抗具有免疫球蛋白G4抗(人类蛋白PDCD1(程序性细胞死亡1))抗体，含(人类小家鼠单克隆重链)二硫键与人类小家鼠单克隆轻链二聚体结构。帕博利珠单抗的结构也可描述为免疫球蛋白G4抗(人类程序性细胞死亡1)抗体；含人源化小鼠单克隆[228-L-脯氨酸(H10-S>P)]γ4重链(134-218')二硫键与人源化小鼠单克隆κ轻链二聚体(226-226”:229-229”)双二硫键。帕博利珠单抗的特性、用途和制备描述于国际专利公开第WO 2008/156712 A1号、美国专利第8,354,509号以及美国专利申请公开第2010/0266617A1号、第2013/0108651A1号和第2013/0109843A2号中，这些专利的公开内容以引用的方式并入本文中。帕博利珠单抗在各种形式的癌症中的临床安全性和功效描述于Fuerst，《肿瘤学时报(Oncology Times)》，2014，36，35-36；Robert等人，《柳叶刀(Lancet)》，2014，384，1109-17；和Thomas等人，《生物治疗专家意见(Exp.Opin.Biol.Ther.)》，2014，14，1061-1064中。帕博利珠单抗的氨基酸序列列于表19中。帕博利珠单抗包括以下二硫键：22-96、22”-96”、23'-92'、23”'-92”'、134-218'、134”-218”'、138'-198'、138”'-198”'、147-203、147”-203”、226-226”、229-229”、261-321、261”-321”、367-425和367”-425”；以及以下糖基化位点(N)：Asn-297和Asn-297”。帕博利珠单抗为在Fc区中含稳定化S228P突变的IgG4/κ同种型；IgG4铰链区中此突变的插入防止形成IgG4抗体通常观测到的半分子。帕博利珠单抗在各重链的Fc结构域内于Asn297处异质糖基化，使得完整抗体的分子量为大约149kDa。帕博利珠单抗的主要糖型为岩藻糖基化去半乳糖基双线聚糖形式(G0F)。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括SEQ ID NO:168所示的重链和SEQ ID NO:169所示的轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ IDNO:168和SEQ ID NO:169所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括帕博利珠单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，PD-1抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:170所示的序列及其保守氨基酸取代，PD-1抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:171所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQID NO:170和SEQ ID NO:171所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173和SEQ ID NO:174所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:177所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一个实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-1上与任何前述抗体相同的抗原表位。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂为药品监管机构参考帕博利珠单抗许可的抗PD-1生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包括抗PD-1抗体，该抗PD-1抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为帕博利珠单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-1抗体，其中该抗PD-1抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为帕博利珠单抗。抗PD-1抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为帕博利珠单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为帕博利珠单抗。
表19.与帕博利珠单抗相关的PD-1抑制剂的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，且帕博利珠单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，且帕博利珠单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中帕博利珠单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，且纳武利尤单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，PD-1抑制剂为帕博利珠单抗或其生物类似物，其中每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗黑色素瘤。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗NSCLC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，施用帕博利珠单抗以治疗小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗SCLC。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗SCLC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，施用帕博利珠单抗以治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗HNSCC。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗HNSCC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方案中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方案中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗典型霍奇金氏淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗尿道上皮癌。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗尿道上皮癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)癌。在一些实施方案中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR癌。在一些实施方案中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷结肠直肠癌(dMMR CRC)。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MSI-H或dMMR CRC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗胃癌。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗胃癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗食道癌。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗食道癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗子宫颈癌。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗子宫颈癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗肝细胞癌(HCC)。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗HCC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，成人每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗默克氏细胞癌(Merkel cell carcinoma；MCC)。在一些实施方案中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗MCC。在一些实施方案中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗MCC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗肾细胞癌(RCC)。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗且每天两次口服阿西替尼5mg以治疗RCC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗子宫内膜癌。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗，且每天一次口服乐伐替尼20mg(对于非MSI-H或dMMR的肿瘤)，以治疗子宫内膜癌。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，成人每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗高肿瘤突变负荷(TMB-H)癌症。在一些实施方案中，成人每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗TMB-H癌症。在一些实施方案中，小儿每3周以约2mg/kg(至多200mg)施用帕博利珠单抗以治疗TMB-H癌症。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗皮肤鳞状细胞癌(cSCC)。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗cSCC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一些实施方案中，每3周以约200mg施用帕博利珠单抗以治疗三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，每6周以约400mg施用帕博利珠单抗以治疗TNBC。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一个实施方案中，若患者或受试者为成人，即治疗成人适应症，则可采用另外的每6周400mg的给药方案。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2、3、4或5天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，在IL-2施用后1、2或3天开始施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周施用帕博利珠单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周施用帕博利珠单抗。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂或抗PD-1抗体为西米普利单抗(cemiplimab)或其片段、变体、缀合物或生物类似物，其可购自再生元公司。在一个实施方案中，PD-1抑制剂或抗PD-1抗体为替雷利珠单抗(tislelizumab)或其片段、变体、缀合物或生物类似物，其可购自诺华AG和百济神州有限公司(Beigene Co.，Ltd)。在一个实施方案中，PD-1抑制剂或抗PD-1抗体为斯迪利单抗(sintilimab)或其片段、变体、缀合物或生物类似物，其可购自礼来公司(Eli Lilly and Co)。在一个实施方案中，PD-1抑制剂或抗PD-1抗体为特瑞普利单抗(toripalimab)或其片段、变体、缀合物或生物类似物，其可购自君实生物技术有限公司(Junshi Biosciences Co.，Ltd.)和Coherus BioSciences,Inc.。在一个实施方案中，PD-1抑制剂或抗PD-1抗体为多斯利单抗(dostarlimab)或其片段、变体、缀合物或生物类似物，其可获自葛兰素史克(GlaxoSmithKline plc)。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂为可商购抗PD-1单克隆抗体，例如抗m-PD-1克隆J43(目录号BE0033-2)和RMP1-14(目录号BE0146)(美国新罕布什尔州西黎巴嫩的Bio XCell，Inc.)。多种可商购抗PD-1抗体为本领域普通技术人员已知的。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂为公开于美国专利第8,354,509号或美国专利申请公开第2010/0266617A1号、第2013/0108651A1号、第2013/0109843A2号中的抗体，这些专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，PD-1抑制剂为描述于美国专利第8,287,856号、第8,580,247号和第8,168,757号以及美国专利申请公开第2009/0028857A1号、第2010/0285013A1号、第2013/0022600A1号和第2011/0008369A1号中的抗PD-1抗体，这些专利的教导内容以引用的方式并入本文中。在另一个实施方案中，PD-1抑制剂为公开于美国专利第8,735,553B1号中的抗PD-1抗体，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，PD-1抑制剂为匹地利珠单抗，也称为CT-011，其描述于美国专利第8,686,119号中，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，PD-1抑制剂可为小分子或肽或肽衍生物，例如美国专利第8,907,053号、第9,096,642号和第9,044,442号以及美国专利申请公开第2015/0087581号中所描述的小分子或肽或肽衍生物；1,2,4-恶二唑化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第2015/0073024号中所描述的1,2,4-恶二唑化合物和衍生物；环状模拟肽化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第2015/0073042号中所描述的环状模拟肽化合物和衍生物；环状化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第2015/0125491中所描述的环状化合物和衍生物；1,3,4-恶二唑和1,3,4-噻二唑化合物和衍生物，例如国际专利申请公开第WO 2015/033301号中所描述的1,3,4-恶二唑和1,3,4-噻二唑化合物和衍生物；基于肽的化合物和衍生物，例如国际专利申请公开第WO 2015/036927号和第WO 2015/04490号中所描述的基于肽的化合物和衍生物；或基于肽的巨环化合物和衍生物，例如美国专利申请公开第2014/0294898号中所描述的基于肽的巨环化合物和衍生物；这些专利中的每一篇的公开内容以全文引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，PD-1抑制剂为西米普利单抗，其可购自再生元公司。在一个实施方案中，PD-1抑制剂为替雷利珠单抗，其可购自诺华AG和百济神州有限公司。在一个实施方案中，PD-1抑制剂为斯迪利单抗，其可购自礼来公司。在一个实施方案中，PD-1抑制剂为特瑞普利单抗，其可购自君实生物技术有限公司和CoherusBioSciences,Inc.。
在一个实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂可为本领域已知的任何PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂。详细地，其为在以下段落中更详细描述的PD-L1或PD-L2抑制剂、拮抗剂或阻断剂之一。关于PD-L1和PD-L2抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的PD-L1或PD-L2抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及PD-L1或PD-L2抑制剂时也可指代化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
在一些实施方案中，本文所描述的组合物、工艺和方法包括PD-L1或PD-L2抑制剂。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂为小分子。在优选实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂为抗体(即抗PD-1抗体)、其片段，包括其Fab片段或单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂为多克隆抗体。在优选实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂为单克隆抗体。在一些实施方案中，PD-L1或PD-L2抑制剂竞争结合PD-L1或PD-L2和/或结合至PD-L1或PD-L2上的抗原表位。在一个实施方案中，抗体竞争结合PD-L1或PD-L2，和/或结合至PD-L1或PD-L2上的抗原表位。
在一些实施方案中，本文提供的PD-L1抑制剂对PD-L1具有选择性，因为化合物与PD-L1结合或相互作用的浓度显著低于其与包括PD-L2受体的其他受体结合或相互作用的浓度。在某些实施方案中，化合物以如下结合常数结合至PD-L1受体，该结合常数为比结合至PD-L2受体的浓度高至少约2倍的浓度、高约3倍的浓度、高约5倍的浓度、高约10倍的浓度、高约20倍的浓度、高约30倍的浓度、高约50倍的浓度、高约100倍的浓度、高约200倍的浓度、高约300倍的浓度或高约500倍的浓度。
在一些实施方案中，本文提供的PD-L2抑制剂对PD-L2具有选择性，因为化合物与PD-L2结合或相互作用的浓度显著低于其与包括PD-L1受体的其他受体结合或相互作用的浓度。在某些实施方案中，化合物以如下结合常数结合至PD-L2受体，该结合常数为比结合至PD-L1受体的浓度高至少约2倍的浓度、高约3倍的浓度、高约5倍的浓度、高约10倍的浓度、高约20倍的浓度、高约30倍的浓度、高约50倍的浓度、高约100倍的浓度、高约200倍的浓度、高约300倍的浓度或高约500倍的浓度。
不受任何理论束缚，据认为肿瘤细胞表达PD-L1，且T细胞表达PD-1。然而，肿瘤细胞对PD-L1的表达不为PD-1或PD-L1抑制剂或阻断剂的功效所需。在一个实施方案中，肿瘤细胞表达PD-L1。在另一个实施方案中，肿瘤细胞并不表达PD-L1。在一些实施方案中，方法可包括PD-1和PD-L1抗体(例如本文所描述的PD-1和PD-L1抗体)与TIL的组合。可同时或依序施用PD-1和PD-L1抗体与TIL的组合。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约100pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约90pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约80pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约70pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约60pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约50pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2、以约40pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2，或以约30pM或更低的KD结合人类PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约7.5×105l/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-L1和/或PD-L2、以约8×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-L1和/或PD-L2、以约8.5×1051/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-L1和/或PD-L2、以约9×105 1/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-L1和/或PD-L2、以约9.5×105l/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-L1和/或PD-L2，或以约1×106 1/M·s或更快的kassoc结合至人类PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约2×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-L1或PD-L2、以约2.1×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.2×10-5l/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.3×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.4×10-5l/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.5×10-5 1/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.6×10-5l/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-1、以约2.7×10-5l/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-L1或PD-L2，或以约3×10-5l/s或更慢的kdissoc结合至人类PD-L1或PD-L2。
在一些实施方案中，PD-L1和/或PD-L2抑制剂为如下PD-L1和/或PD-L2抑制剂，该PD-L1和/或PD-L2抑制剂以约10nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约9nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约8nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约7nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约6nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约5nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约4nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约3nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合、以约2nM或更低的IC50阻断或抑制人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合，或以约1nM或更低的IC50阻断人类PD-1或阻断人类PD-L1或人类PD-L2与人类PD-1的结合。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂为度伐利尤单抗，也称为MEDI4736(其可购自马里兰州盖瑟斯堡阿斯特捷利康制药公司子公司Medimmune，LLC)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利第8,779,108号或美国专利申请公开第2013/0034559号中的抗体，这些专利的公开内容以引用的方式并入本文中。度伐利尤单抗的临床功效已描述于Page等人，《年度医学评论》，2014，65，185-202；Brahmer等人，《临床肿瘤学杂志》2014，32，5s(增刊，摘要8021)；和McDermott等人，《癌症治疗评论(Cancer Treatment Rev.)》，2014，40，1056-64中。度伐利尤单抗的制备和特性描述于美国专利第8,779,108号中，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。度伐利尤单抗的氨基酸序列列于表20中。度伐利尤单抗单克隆抗体包括22-96、22”-96”、23'-89'、23”'-89”'、135'-195'、135”'-195”'、148-204、148”-204”、215'-224、215”'-224”、230-230”、233-233”、265-325、265”-325”、371-429和371”-429'处的二硫键；和Asn-301和Asn-301”处的N-糖基化位点。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括SEQ ID NO:178所示的重链和SEQ ID NO:179所示的轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:178和SEQ IDNO:179所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQID NO:178和SEQ ID NO:179所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:178和SEQ IDNO:179所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:179所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括度伐利尤单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:180所示的序列及其保守氨基酸取代，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:181所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:181所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:184所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:187所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一个实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的抗原表位。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂为药品监管机构参考度伐利尤单抗许可的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包括抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为度伐利尤单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中该抗PD-L1抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为度伐利尤单抗。抗PD-L1抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为度伐利尤单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为度伐利尤单抗。
表20.与度伐利尤单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂为阿维鲁单抗，也称为MSB0010718C(可自默克集团/雪兰诺商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。阿维鲁单抗的制备和特性描述于美国专利申请公开第2014/0341917A1号中，该专利的公开内容特别以引用的方式并入本文中。阿维鲁单抗的氨基酸序列列于表21中。阿维鲁单抗具有22-96、147-203、264-324、370-428、22”-96”、147”-203”、264”-324”和370”-428”处的重链内二硫键(C23-C104)；22'-90'、138'-197'、22”'-90”'和138”'-197”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；223-215'和223”-215”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL 126)；229-229”和232-232”处的重链-重链内二硫键(h11，h 14)；300、300”处的N-糖基化位点(H CH2 N84.4)；岩藻糖基化复合物双线CHO类聚糖；和450和450'处的H CHS K2 C末端赖氨酸裁剪。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括SEQ ID NO:188所示的重链和SEQ ID NO:189所示的轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:188和SEQ IDNO:189所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQID NO:188和SEQ ID NO:189所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:188和SEQ IDNO:189所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:189所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包括阿维鲁单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:190所示的序列及其保守氨基酸取代，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:191所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:190和SEQID NO:191所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:191所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:194所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:196和SEQ ID NO:197所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一个实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的抗原表位。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂为药品监管机构参考阿维鲁单抗许可的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包括抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为阿维鲁单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中该抗PD-L1抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为阿维鲁单抗。抗PD-L1抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为阿维鲁单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为阿维鲁单抗。
表21.与阿维鲁单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂为阿替利珠单抗，也称为MPDL3280A或RG7446(其可自瑞士巴塞尔罗氏的子公司基因泰克公司以TECENTRIQ商购)或其抗原结合片段、缀合物或变体。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利第8,217,149号中的抗体，该专利的公开内容特别以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂为公开于美国专利申请公开第2010/0203056 A1号、第2013/0045200 A1号、第2013/0045201 A1号、第2013/0045202 A1号或第2014/0065135 A1号中的抗体，这些专利的公开内容特别以引用的方式并入本文中。阿替利珠单抗的制备和特性描述于美国专利第8,217,149号中，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。阿替利珠单抗的氨基酸序列列于表22中。阿替利珠单抗具有22-96、145-201、262-322、368-426、22”-96”、145”-201”、262”-322”和368”-426”处的重链内二硫键(C23-C104)；23'-88'、134'-194'、23”'-88”'和134”'-194”'处的轻链内二硫键(C23-C104)；221-214'和221”-214”'处的重链-轻链内二硫键(h 5-CL126)；227-227”和230-230”处的重链-重链内二硫键(h 11，h 14)；和298和298'处的N-糖基化位点(H CH2N84.4>A)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括SEQ ID NO:198所示的重链和SEQ ID NO:199所示的轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:198和SEQ IDNO:199所示序列的重链和轻链，或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQID NO:198和SEQ ID NO:199所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:198和SEQ IDNO:199所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:198和SEQ ID NO:199所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括阿替利珠单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:200所示的序列及其保守氨基酸取代，PD-L1抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:201所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别与SEQ ID NO:200和SEQ ID NO:201所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203和SEQ ID NO:204所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206和SEQ ID NO:207所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一个实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：PD-L1上与任何前述抗体相同的抗原表位。
在一个实施方案中，抗PD-L1抗体为药品监管机构参考阿替利珠单抗许可的抗PD-L1生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包括抗PD-L1抗体，该抗PD-L1抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为阿替利珠单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗PD-L1抗体，其中该抗PD-L1抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为阿替利珠单抗。抗PD-L1抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为阿替利珠单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为阿替利珠单抗。
表22.与阿替利珠单抗相关的PD-L1抑制剂的氨基酸序列。
/>
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂或抗PD-L1抗体为瑞弗利单抗(retifanlimab)或其片段、变体、缀合物或生物类似物，其可购自英赛德公司(Incyte，Inc)。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂包括美国专利申请公开第2014/0341917A1号中所描述的那些抗体，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在另一个实施方案中，还包括与这些抗体中的任一种竞争结合至PD-L1的抗体。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体为MDX-1105，也称为BMS-935559，其公开于美国专利第7,943,743号中，该专利的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体选自公开于美国专利第7,943,743号中的抗PD-L1抗体，该专利以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，PD-L1抑制剂为可商购单克隆抗体，例如INVIVOMAB抗m-PD-L1克隆10F.9G2(目录号BE0101，美国新罕布什尔州西黎巴嫩的Bio X Cell，Inc.)。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体为可商购单克隆抗体，例如AFFYMETRIX EBIOSCIENCE(MIH1)。多种可商购抗PD-L1抗体为本领域普通技术人员已知的。
在一个实施方案中，PD-L2抑制剂为可商购单克隆抗体，例如BIOLEGEND24F.10C12小鼠IgG2aκ同种型(目录号329602，加利福尼亚圣地亚哥Biolegend，Inc.)、SIGMA抗PD-L2抗体(目录号SAB3500395，密苏里州圣路易斯西格玛奥瑞奇公司)或本领域普通技术人员已知的其他可商购抗PD-L2抗体。
3.与CTLA-4抑制剂的组合
在一些实施方案中，提供给癌症患者的TIL疗法可包括单独用治疗性TIL群治疗，或可包括组合治疗，该组合治疗包括TIL和一种以上CTLA-4抑制剂。
细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)为免疫球蛋白超家族成员且在辅助T细胞表面上表达。CTLA-4为CD28依赖性T细胞活化的负向调节因子且充当适应性免疫反应的检查点。类似于T细胞共刺激蛋白CD28，CTLA-4结合抗原在细胞上呈递CD80和CD86。CTLA-4将抑制因子信号递送至T细胞，而CD28递送刺激信号。针对人类CTLA-4的人类抗体已描述为许多疾病病状的免疫刺激调节剂，例如治疗或预防病毒和细菌感染且治疗癌症(WO 01/14424和WO00/37504)。已在临床试验中针对治疗各种类型的实体肿瘤研究了多种全人抗人类CTLA-4单克隆抗体(mAb)，这些抗体包括但不限于伊匹木单抗(MDX-010)和曲美木单抗(CP-675,206)。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂可为本领域已知的任何CTLA-4抑制剂或CTLA-4阻断剂。详细地，其为在以下段落中更详细描述的CTLA-4抑制剂或阻断剂之一。关于CTLA-4抑制剂，术语“抑制剂”、“拮抗剂”和“阻断剂”在本文中可互换使用。为了避免疑问，本文中提及作为抗体的CTLA-4抑制剂时可指代化合物或其抗原结合片段、变体、缀合物或生物类似物。为了避免疑问，本文中提及CTLA-4抑制剂时也可指代小分子化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂合物、水合物、共晶体或前药。
适用于本发明的方法的CTLA-4抑制剂包括但不限于抗CTLA-4抗体、人类抗CTLA-4抗体、小鼠抗CTLA-4抗体、哺乳动物抗CTLA-4抗体、人源化抗CTLA-4抗体、单克隆抗CTLA-4抗体、多克隆抗CTLA-4抗体、嵌合抗CTLA-4抗体、MDX-010(伊匹木单抗)、曲美木单抗、抗CD28抗体、抗CTLA-4纤连蛋白、抗CTLA-4域抗体、单链抗CTLA-4片段、重链抗CTLA-4片段、轻链抗CTLA-4片段、激动共刺激通路的CTLA-4抑制剂、公开于PCT公开第WO 2001/014424号中的抗体、公开于PCT公开第WO 2004/035607号中的抗体、公开于美国公开第2005/0201994号中的抗体和公开于授权的欧洲专利第EP 1212422 B1号中的抗体，这些专利中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。另外的CTLA-4抗体描述于美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号和第6,984,720号中；PCT公开第WO 01/14424号和第WO 00/37504号中；和美国公开第2002/0039581号和第2002/086014号中，这些专利中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。可用于本发明方法中的其他抗CTLA-4抗体包括例如公开于以下中的抗体：WO 98/42752；美国专利第6,682,736号和第6,207,156号；Hurwitz等人，《美国国家科学院院刊》，95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人,《临床肿瘤学杂志》，22(145):摘要号2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人，《癌症研究》，58:5301-5304(1998)；和美国专利第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号和第7,132,281号，这些专利中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。
另外的CTLA-4抑制剂包括但不限于以下：通常由于被活化而能够破坏CD28抗原结合至其同源配体的能力、抑制CTLA-4结合至其同源配体的能力、增强通过共刺激通路的T细胞反应、破坏B7结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏B7活化共刺激通路的能力、破坏CD80结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏CD80活化共刺激通路的能力、破坏CD86结合至CD28和/或CTLA-4的能力、破坏CD86活化共刺激通路的能力和破坏共刺激通路的任何抑制剂。这必然包括：CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激通路的其他成员的小分子抑制剂；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激通路的其他成员的抗体；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激通路的其他成员的反义分子；针对CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激通路的其他成员的纤连蛋白；CD28、CD80、CD86、CTLA-4以及共刺激通路的其他成员的RNAi抑制剂(单链和双链)；以及其他CTLA-4抑制剂。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂以如下Kd结合至CTLA-4，该Kd为约10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小，例如10-13M与10-16M之间，或在以前述值中的任意两个作为端点的任何范围内。在一些实施方案中，当使用相同测定进行比较时，CTLA-4抑制剂结合至CTLA-4的Kd不超过伊匹木单抗的Kd的10倍。在一些实施方案中，当使用相同测定进行比较时，CTLA-4抑制剂结合至CTLA-4的Kd与伊匹木单抗的Kd大致相同或更小(例如低至多10倍或低至多100倍)。在一些实施方案中，当使用相同测定进行比较时，与伊匹木单抗介导的CTLA-4分别与CD80或CD86结合的抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值高不超过10倍。在一些实施方案中，当使用相同测定进行比较时，与伊匹木单抗介导的CTLA-4分别与CD80或CD86结合的抑制的IC50值相比，CTLA-4抑制剂抑制CTLA-4与CD80或CD86的结合的IC50值大致相同或更小(例如，低至多10倍或低至多100倍)。
在一些实施方案中，以如下量使用CTLA-4抑制剂，该量足以抑制CTLA-4的表达和/或使CTLA-4的生物活性相对于合适的对照降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如50％与75％、75％与90％或90％与100％之间。在一些实施方案中，以如下量使用CTLA-4通路抑制剂，该量足以通过使CTLA-4与CD80、CD86或两者的结合相对于合适的对照降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，例如相对于合适的对照降低50％与75％、75％与90％或90％与100％之间来降低CTLA-4的生物活性。在评估或量化所关注的药剂的效应的上下文中，合适的对照通常为尚未暴露于所关注的药剂(例如CTLA-4通路抑制剂)或用该药剂处理的相当的生物体系(例如细胞或受试者)(或已暴露于可忽略量或用可忽略量进行处理)。在一些实施方案中，生物体系可充当其自身的对照，例如可在暴露于药剂或用药剂处理之前评估生物体系并与暴露或处理开始或结束之后的状态进行比较。在一些实施方案中，可使用历史对照。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗(可自百时美施贵宝公司以Yervoy商购)或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。如本领域中已知，伊匹木单抗是指抗CTLA-4抗体，一种来源于具有编码重链和轻链的人类基因以产生功能性人类谱系的转基因小鼠的全人IgG1κ抗体。伊匹木单抗也可通过其CAS登记号477202-00-9和在PCT公开第WO 01/14424中提及，该公开出于所有目的以全文引用的方式并入。其以抗体10DI的形式公开。具体言的，伊匹木单抗含有轻链可变区和重链可变区(具有包括SEQ ID NO:211的轻链可变区且具有包括SEQ ID NO:210的重链可变区)。伊匹木单抗的药物组合物包括含有伊匹木单抗和一种以上稀释剂、载体或赋形剂的所有药学上可接受的组合物。含有伊匹木单抗的药物组合物的实例描述于国际专利申请公开第WO 2007/67959号中。伊匹木单抗可静脉内(IV)施用。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括SEQ ID NO:208所示的重链和SEQ ID NO:209所示的轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:208和SEQ IDNO:209所示序列的重链和轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:208和SEQID NO:209所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:208和SEQ ID NO:209所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括伊匹木单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:210所示的序列及其保守氨基酸取代，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:211所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:210和SEQ ID NO:211所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213和SEQ ID NO:214所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216和SEQ ID NO:217所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一个实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的抗原表位。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂为药品监管机构参考伊匹木单抗许可的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包括抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为伊匹木单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。伊匹木单抗的氨基酸序列列于表23中。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中该抗CTLA-4抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为伊匹木单抗。抗CTLA-4抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为伊匹木单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为伊匹木单抗。
表23.伊匹木单抗的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，且伊匹木单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，且伊匹木单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，其中伊匹木单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，且伊匹木单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方案中，在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为伊匹木单抗或其生物类似物，且每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用伊匹木单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹木单抗以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施方案中，每3周以约mg/kg施用伊匹木单抗，持续最多4次剂量，以治疗不可切除性或转移性黑色素瘤。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹木单抗以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施方案中，每3周以约10mg/kg施用伊匹木单抗，持续4次剂量，然后每12周施用10mg/kg，持续至多3年，以辅助治疗黑色素瘤。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹木单抗以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，每3周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，紧接着在同一天施用3mg/kg纳武利尤单抗，持续4次剂量，以治疗晚期肾细胞癌。在一些实施方案中，在完成组合的4次剂量之后，可根据晚期肾细胞癌和/或肾细胞癌的标准给药方案，以单药(single agent)形式施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹木单抗以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，每3周经30分钟以约1mg/kg静脉内施用伊匹木单抗，紧接着在同一天经30分钟静脉内施用3mg/kg纳武利尤单抗，持续4次剂量，以治疗高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌。在一些实施方案中，在完成组合物的4次剂量之后，根据高微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)转移性结肠直肠癌的标准给药方案所推荐的，以单药形式施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹木单抗以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，每3周经30分钟以约3mg/kg静脉内施用伊匹木单抗，紧接着在同一天经30分钟静脉内施用1mg/kg纳武利尤单抗，持续4次剂量，以治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，在完成组合的4次剂量之后，根据肝细胞癌的标准给药方案，以单药形式施用纳武利尤单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹木单抗以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗且每2周施用3mg/kg纳武利尤单抗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗，加上每3周360mg纳武利尤单抗与2个周期的含铂双重化疗，以治疗转移性非小细胞肺癌。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
在一些实施方案中，施用伊匹木单抗以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方案中，每6周以约1mg/kg施用伊匹木单抗且每3周施用360mg纳武利尤单抗，以治疗恶性胸膜间皮瘤。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始伊匹木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始伊匹木单抗施用。
曲美木单抗(也称为CP-675,206)为全人IgG2单克隆抗体且CAS编号为745013-59-6。曲美木单抗以抗体11.2.1形式公开于美国专利第6,682,736号(以引用的方式并入本文)中。曲美木单抗的重链和轻链的氨基酸序列分别示于SEQ IND NO:218和219中。曲美木单抗已在临床试验中研究用于治疗多种肿瘤，包括黑色素瘤和乳腺癌；其中曲美木单抗以单剂量或多剂量每4或12周静脉内给药，剂量范围为0.01与15mg/k。在本发明提供的方案中，局部施用，尤其是皮内或皮下施用曲美木单抗。皮内或皮下施用的曲美木单抗的有效量通常在每人5-200毫克/剂的范围内。在一些实施方案中，曲美木单抗的有效量在每人每剂10-150毫克/剂的范围内。在一些特定实施方案中，曲美木单抗的有效量为每人约10、25、37.5、40、50、75、100、125、150、175或200毫克/剂。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括SEQ ID NO:218所示的重链和SEQ ID NO:219所示的轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:218和SEQ IDNO:219所示序列的重链和轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:218和SEQID NO:219所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:218和SEQ ID NO:219所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括曲美木单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:220所示的序列及其保守氨基酸取代，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:221所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:220和SEQ ID NO:221所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223和SEQ ID NO:224所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226和SEQ ID NO:227所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一个实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的抗原表位。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂为药品监管机构参考曲美木单抗许可的抗CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包括抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为曲美木单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。曲美木单抗的氨基酸序列列于表24中。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中该抗CTLA-4抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为曲美木单抗。抗CTLA-4抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为曲美木单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为曲美木单抗。
表24.曲美木单抗的氨基酸序列。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为曲美木单抗或其生物类似物，且曲美木单抗以约0.5mg/kg至约10mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为曲美木单抗或其生物类似物，且曲美木单抗以如下剂量施用：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约3.5mg/kg、约4mg/kg、约4.5mg/kg、约5mg/kg、约5.5mg/kg、约6mg/kg、约6.5mg/kg、约7mg/kg、约7.5mg/kg、约8mg/kg、约8.5mg/kg、约9mg/kg、约9.5mg/kg或约10mg/kg。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美木单抗施用。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为曲美木单抗或其生物类似物，其中曲美木单抗以约200mg至约500mg的剂量施用。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为曲美木单抗或其生物类似物，且曲美木单抗以如下剂量施用：约200mg、约220mg、约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg或约500mg。在一些实施方案中，在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美木单抗施用。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为曲美木单抗或其生物类似物，且每2周、每3周、每4周、每5周或每6周施用曲美木单抗。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2、3、4或5周开始曲美木单抗施用。在一些实施方案中，也可在切除前(即，在自受试者或患者获得肿瘤样本之前)1、2或3周开始曲美木单抗施用。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂为来自Adgenus的泽弗利单抗或其生物类似物、抗原结合片段、缀合物或变体。泽弗利单抗为全人单克隆抗体。泽弗利单抗经指派化学文摘社(CAS)登记号2148321-69-9且也称为也称为AGEN1884。泽弗利单抗的制备和特性描述于美国专利第10,144,779号和美国专利申请公开第US2020/0024350A1号中，这些专利的公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括SEQ ID NO:228所示的重链和SEQ ID NO:229所示的轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:228和SEQ IDNO:229所示序列的重链和轻链或其抗原结合片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)、变体或缀合物。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229所示序列具有至少99％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229所示序列具有至少98％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229所示序列具有至少97％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:228和SEQID NO:229所示序列具有至少96％同一性的重链和轻链。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:228和SEQ ID NO:229所示序列具有至少95％同一性的重链和轻链。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括泽弗利单抗的重链CDR和轻链CDR或可变区(VR)。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂重链可变区(VH)包括SEQ ID NO:230所示的序列及其保守氨基酸取代，CTLA-4抑制剂轻链可变区(VL)包括SEQ ID NO:231所示的序列及其保守氨基酸取代。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231所示序列具有至少99％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231所示序列具有至少98％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231所示序列具有至少97％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231所示序列具有至少96％同一性的VH区和VL区。在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别与SEQ ID NO:230和SEQ ID NO:231所示序列具有至少95％同一性的VH区和VL区。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂包括分别具有SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:233和SEQ ID NO:234所示的序列及其保守氨基酸取代的重链CDR1、CDR2和CDR3结构域；和分别具有SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236和SEQ ID NO:237所示的序列及其保守氨基酸取代的轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域。在一个实施方案中，抗体竞争以与以下结合和/或结合至以下：CTLA-4上与任何前述抗体相同的抗原表位。
在一个实施方案中，CTLA-4抑制剂为药品监管机构参考泽弗利单抗许可的CTLA-4生物类似物单克隆抗体。在一个实施方案中，生物类似物包括抗CTLA-4抗体，该抗CTLA-4抗体包括与参考药品或参考生物制品的氨基酸序列具有至少97％序列同一性，例如97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，且其相较于该参考药品或参考生物制品包括一种以上翻译后修饰，其中该参考药品或参考生物制品为泽弗利单抗。在一些实施方案中，一种以上翻译后修饰选自以下中的一种以上：糖基化、氧化、脱酰胺作用和截短。泽弗利单抗的氨基酸序列列于表25中。在一些实施方案中，生物类似物为获得授权或申请授权的抗CTLA-4抗体，其中该抗CTLA-4抗体提供于一种与参考药品或参考生物制品的制剂不同的制剂中，其中该参考药品或参考生物制品为泽弗利单抗。抗CTLA-4抗体可获得药品监管机构，例如美国FDA和/或欧盟EMA授权。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为泽弗利单抗。在一些实施方案中，生物类似物作为组合物提供，该组合物还包含一种以上赋形剂，其中该一种以上赋形剂与参考药品或参考生物制品中包括的赋形剂相同或不同，其中该参考药品或参考生物制品为泽弗利单抗。
表25.泽弗利单抗的氨基酸序列。
/>
另外的抗CTLA-4抗体的实施例包括但不限于：AGEN1181、BMS-986218、BCD-145、ONC-392、CS1002、REGN4659和ADG116，其为本领域普通技术人员已知的。
在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体是以下任何专利出版物(以引用的方式并入本文)中公开的抗CTLA-4：US 2019/0048096 A1；US 2020/0223907；US 2019/0201334；US2019/0201334；US 2005/0201994；EP 1212422 B1；WO 2018/204760；WO 2018/204760；WO2001/014424；WO 2004/035607；WO 2003/086459；WO 2012/120125；WO 2000/037504；WO2009/100140；WO 2006/09649；WO2005092380；WO 2007/123737；WO 2006/029219；WO 2010/0979597；WO 2006/12168；和WO1997020574。另外的CTLA-4抗体描述于以下中：美国专利第5,811,097号、第5,855,887号、第6,051,227号和第6,984,720号；PCT公开第WO 01/14424号和第WO 00/37504号；以及美国公开第2002/0039581号和第2002/086014号；和/或美国专利第5,977,318号、第6,682,736号、第7,109,003号和第7,132,281号(以引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体为例如公开于以下中的抗体：WO 98/42752；美国专利第6,682,736号和第6,207,156号；Hurwitz等人，《美国国家科学院院刊》，95(17):10067-10071(1998)；Camacho等人,《临床肿瘤学杂志》，22(145):摘要号2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr等人，《癌症研究》，58:5301-5304(1998)(以引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为如WO1996040915(以引用的方式并入本文)中所公开的CTLA-4配体。
在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为CTLA-4表达的核酸抑制剂。例如，抗CTLA-4RNAi分子可呈Mello和Fire在以下中描述的分子形式：PCT公开第WO 1999/032619号和第WO 2001/029058号；美国公开第2003/0051263号、第2003/0055020号、第2003/0056235号、第2004/265839号、第2005/0100913号、第2006/0024798号、第2008/0050342号、第2008/0081373号、第2008/0248576号和第2008/055443号；和/或美国专利第6,506,559号、第7,282,564号、第7,538,095号和第7,560,438号(以引用的方式并入本文中)。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子呈由Tuschl在欧洲专利第EP 1309726号(以引用的方式并入本文)中描述的双链RNAi分子形式。在一些情况下，抗CTLA-4RNAi分子呈由Tuschl在美国专利第7,056,704号和第7,078,196号(以引用的方式并入本文)中描述的双链RNAi分子形式。在一些实施方案中，CTLA-4抑制剂为PCT公开第WO2004081021号(以引用的方式并入本文)中所描述的适体。
在其他实施方案中，本发明的抗CTLA-4RNAi分子为Crooke在美国专利第5,898,031号、第6,107,094号、第7,432,249号和第7,432,250号以及欧洲申请第EP 0928290号(以引用的方式并入本文)中描述的RNA分子。
4.患者的可选的淋巴细胞耗竭预处理
在一个实施方案中，本发明包括一种用TIL群治疗癌症的方法，其中患者在输注根据本公开的TIL之前经非清髓性化疗预治疗。在一个实施方案中，本发明包括一种用于治疗已用非清髓性化疗预治疗的患者的癌症的TIL群。在一个实施方案中，TIL群通过输注施用。在一个实施方案中，非清髓性化疗为环磷酰胺60mg/kg/天持续2天(在TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/天持续5天(在TIL输注前第27至23天)。在一些实施方案中，非清髓性化疗为环磷酰胺60mg/kg/天持续2天(在TIL输注前第27和26天)和氟达拉滨25mg/m2/天持续3天(在TIL输注前第27至25天)。在一些实施方案中，非清髓性化疗为环磷酰胺60mg/kg/天持续2天(在TIL输注前第27和26天)，然后氟达拉滨25mg/m2/天持续3天(在TIL输注前第25至23天)。在一个实施方案中，在根据本公开的非清髓性化疗和TIL输注(第0天)之后，患者每8小时以720,000IU/kg静脉内接受IL-2(阿地白介素，可以PROLEUKIN商购)的静脉内输注以达到生理耐受。在某些实施方案中，TIL群用于与IL-2组合治疗癌症，其中IL-2在TIL群之后施用。
实验发现表明，在肿瘤特异性T淋巴细胞过继性转移之前进行淋巴细胞耗竭，通过消除调节性T细胞和免疫系统的竞争组件(“细胞因子库”)，在增强治疗功效方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的TIL之前在患者身上采用淋巴细胞耗竭步骤(有时也称为“免疫抑制性调节”)。
通常，使用氟达拉滨或环磷酰胺(活性形式称作马磷酰胺)以及它们的组合的施用实现淋巴细胞耗竭。此类方法描述于Gassner等人，《癌症免疫学和免疫治疗》2011，60，75-85、Muranski等人，《自然临床实践肿瘤学》,2006，3，668-681、Dudley等人，《临床肿瘤学杂志》2008，26，5233-5239和Dudley等人，《临床肿瘤学杂志》2005，23，2346-2357中，所有这些文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，氟达拉滨以0.5μg/mL至10μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，氟达拉滨以1μg/mL氟达拉滨的浓度施用。在一些实施方案中，施用氟达拉滨治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方案中，氟达拉滨以10毫克/公斤/天、15毫克/公斤/天、20毫克/公斤/天、25毫克/公斤/天、30毫克/公斤/天、35毫克/公斤/天、40毫克/公斤/天或45毫克/公斤/天的剂量施用。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以35毫克/公斤/天施用2至7天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以35毫克/公斤/天施用4至5天。在一些实施方案中，氟达拉滨治疗以25毫克/公斤/天施用4至5天。
在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺获得浓度为0.5μg/mL至10μg/mL的马磷酰胺(环磷酰胺的活性形式)。在一些实施方案中，通过施用环磷酰胺获得浓度为1μg/mL的马磷酰胺，即环磷酰胺的活性形式。在一些实施方案中，施用环磷酰胺治疗1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在一些实施方案中，环磷酰胺以100mg/m2/天、150mg/m2/天、175mg/m2/天、200mg/m2/天、225mg/m2/天、250mg/m2/天、275mg/m2/天或300mg/m2/天的剂量施用。在一些实施方案中，静脉内(即i.v.)施用环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗以35毫克/公斤/天施用2至7天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉内施用4至5天。在一些实施方案中，环磷酰胺治疗以250mg/m2/天静脉内施用4天。
在一些实施方案中，通过将氟达拉滨和环磷酰胺一起施用给患者进行淋巴细胞耗竭。在一些实施方案中，以25mg/m2/天静脉内施用氟达拉滨且以250mg/m2/天静脉内施用环磷酰胺，持续4天。
在一个实施方案中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天，来进行淋巴细胞耗竭。
在一个实施方案中，通过以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一个实施方案中，通过以约50mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天并以约25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一个实施方案中，通过以约50mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天并以约20mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一个实施方案中，通过以约40mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天并以约20mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一个实施方案中，通过以约40mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天并以约15mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天来进行淋巴细胞耗竭，其中在前两天施用环磷酰胺和氟达拉滨两者，且其中在总计五天中进行淋巴细胞耗竭。
在一个实施方案中，通过持续两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天，来进行淋巴细胞耗竭。
在一个实施方案中，环磷酰胺与美司钠(mesna)一起施用。在一个实施方案中，美司钠以15mg/kg施用。在一个实施方案中，当输注美司钠时，如果连续输注，则历经24小时，伴随各自环磷酰胺剂量开始，美司钠可经大约2小时与环磷酰胺一起输注(第-5天和/或第-4天)，随后在剩余22小时以3毫克/千克/小时的速率输注。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗竭包括以下步骤：在向患者施用第三TIL群后的第二天开始用IL-2方案治疗患者。
在一个实施方案中，淋巴细胞耗竭包括以下步骤：在向患者施用第三TIL群的同一天开始用IL-2方案治疗患者。
在一些实施方案中，淋巴细胞耗竭包括5天的预处理治疗。在一些实施方案中，天数指示为第-5天至第-1天，或第0天至第4天。在一些实施方案中，该方案包括第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的环磷酰胺。在一些实施方案中，该方案包括第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的静脉内环磷酰胺。在一些实施方案中，该方案包括第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的60mg/kg静脉内环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺与美司钠一起施用。在一些实施方案中，该方案进一步包括氟达拉滨。在一些实施方案中，该方案进一步包括静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，该方案进一步包括25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，该方案进一步包括第-5天和第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，该方案进一步包括第-5天和第-1天(即第0天至第4天)的25mg/m2静脉内氟达拉滨。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，以及以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨一天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，以及以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，以及以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括5天的预处理治疗。在一些实施方案中，天数指示为第-5天至第-1天，或第0天至第4天。在一些实施方案中，该方案包括第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的环磷酰胺。在一些实施方案中，该方案包括第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的静脉内环磷酰胺。在一些实施方案中，该方案包括第-5天和第-4天(即第0天和第1天)的300mg/kg静脉内环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺系与美司钠一起施用。在一些实施方案中，该方案进一步包括氟达拉滨。在一些实施方案中，该方案进一步包括静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，该方案进一步包括30mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，该方案进一步包括第-5天和第-1天(即第0天至第4天)的30mg/m2静脉内氟达拉滨。在一些实施方案中，该方案进一步包括第-5天和第-1天(即第0天至第4天)的30mg/m2静脉内氟达拉滨。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以300mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，然后以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，然后以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，以及以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨一天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以300mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，以及以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以300mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，以及以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨两天，然后以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案根据表26施用。
表26.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺60mg/kg | X | X | ||||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||||
| 氟达拉滨25mg/m2/天 | X | X | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案根据表27施用。
表27.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺60mg/kg | X | X | |||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | |||||||
| 氟达拉滨25mg/m2/天 | X | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案根据表28施用。
表28.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺60mg/kg | X | X | ||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||
| 氟达拉滨25mg/m2/天 | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案根据表29施用。
表29.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺60mg/kg | X | X | ||||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||||
| 氟达拉滨25mg/m2/天 | X | X | X | |||||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案根据表30施用。
表30.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺300mg/kg | X | X | ||||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||||
| 氟达拉滨30mg/m2/天 | X | X | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案根据表31施用。
表32.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺300mg/kg | X | X | |||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | |||||||
| 氟达拉滨30mg/m2/天 | X | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案根据表32施用。
表32.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺300mg/kg | X | X | ||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||
| 氟达拉滨30mg/m2/天 | X | X | X | |||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案根据表33施用。
表33.示例性淋巴细胞耗竭和治疗方案。
| 天 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 环磷酰胺300mg/kg | X | X | ||||||||
| 美司钠(按需要) | X | X | ||||||||
| 氟达拉滨30mg/m2/天 | X | X | X | |||||||
| TIL输注 | X |
在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括在TIL输注当天之前1、2或3天的过程中以100mg/m2的总剂量施用美法仑。在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括在TIL输注当天之前1、2或3天的过程中以200mg/m2的总剂量施用美法仑。在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括在TIL输注当天之前1、2或3天的过程中以100mg/m2的总剂量施用美法仑和以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨。在一些实施方案中，非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括在TIL输注当天之前1、2或3天的过程中以200mg/m2的总剂量施用美法仑和以30mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨。
在一些实施方案中，与清髓性淋巴细胞耗竭方案的前述实施方案一起使用的TIL输注可为本文所描述的任何TIL组合物且也可包括代替TIL输注的MIL和PBL输注，以及添加IL-2方案和施用如本文所描述的共同疗法(例如PD-1和/或PD-L1抑制剂)。
5.IL-2方案
在一个实施方案中，IL-2方案包括高剂量IL-2方案，其中高剂量IL-2方案包括阿地白介素或其生物类似物或变体，其在施用治疗性TIL群的治疗有效部分之后的第二天开始静脉内施用，其中阿地白介素或其生物类似物或变体每八小时使用15分钟推注静脉内输注以0.037mg/kg或0.044mg/kg IU/kg(患者体重)的剂量施用直至耐受，最多为14个剂量。在休止9天后，可重复此流程再施用14次剂量，最多总计28次剂量。在一些实施方案中，IL-2以1、2、3、4、5或6次剂量施用。在一些实施方案中，IL-2以至多6次剂量的最大剂量施用。在一些实施方案中，高剂量IL-2方案适用于小儿用途。在一些实施方案中，使用每8至12小时剂量为600,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8至12小时剂量为500,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8至12小时剂量为400,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8至12小时剂量为500,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8至12小时剂量为300,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8至12小时剂量为200,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。在一些实施方案中，使用每8至12小时剂量为100,000国际单位(IU)/kg的阿地白介素，达最多6次剂量。
在一个实施方案中，IL-2方案包括递减IL-2方案。递减IL-2方案已描述于O'Day等人，《临床肿瘤学杂志》1999，17，2752-61和Eton等人，《癌症》2000，88，1703-9，这些文献的公开内容以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，递减IL-2方案包括经6小时静脉内施用18×106IU/m2，然后经12小时静脉内施用18×106IU/m2，然后经24小时静脉内施用18×106IU/m2，然后经72小时静脉内施用4.5×106IU/m2。此治疗周期可每28天重复，达最多四个周期。在一个实施方案中，递减IL-2方案包括第1天18,000,000IU/m2、第2天9,000,000IU/m2以及第3天和第4天4,500,000IU/m2。
在一个实施方案中，IL-2方案包括每1、2、4、6、7、14或21天以0.10毫克/天至50毫克/天的剂量施用聚乙二醇化IL-2。
在一个实施方案中，IL-2方案包括施用移植至抗体主链上的IL-2片段。在一个实施方案中，IL-2方案包括施用缀合IL-2低亲和力受体的抗体细胞因子植入蛋白。在一个实施方案中，IL-2方案包括施用与阿地白介素相比表现出与IL-2Rβ和/或IL-2Rγ受体结合增强的抗体-细胞因子植入蛋白，而不影响与IL-2Rα受体的结合。
在一些实施方案中，本文所描述的抗体细胞因子植入蛋白的血清半衰期比野生型IL-2分子(例如但不限于阿地白介素或可比分子)长。
6.另外的治疗方法
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用治疗有效剂量的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群。
在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用治疗有效剂量的上文任何前述段落中描述的TIL组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中在分别施用治疗有效剂量的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群和TIL组合物之前，已向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其进一步包括以下步骤：在向受试者施用TIL细胞后的第二天开始用高剂量IL-2方案治疗受试者。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症为实体肿瘤。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症为黑色素瘤。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中癌症为小儿超突变癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群。
在另一个实施方案中，本发明提供上文任何前述段落中描述的TIL组合物，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或上文任何前述段落中描述的TIL组合物，其中在向受试者施用治疗有效剂量的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或上文任何前述段落中描述的TIL组合物之前，已向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其中非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其进一步包括以下步骤：始于在向患者施用TIL细胞之后当天，用高剂量IL-2方案治疗患者。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其中高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟推注静脉内输注形式施用600,000或720,000IU/kg直至耐受。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其中癌症为实体肿瘤。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其中癌症为黑色素瘤。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其中癌症为超突变癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供经修改的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或TIL组合物，其中癌症为小儿超突变癌症。
在另一个实施方案中，本发明提供上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群在用于治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的治疗性TIL群。
在另一个实施方案中，本发明提供上文任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用治疗有效剂量的TIL组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或上文任何前述段落中描述的TIL组合物在治疗受试者的癌症的方法中的用途，该方法包括向受试者施用非清髓性淋巴细胞耗竭方案且随后向受试者施用治疗有效剂量的上文任何前述段落中描述的治疗性TIL群或治疗有效剂量的上文任何前述段落中描述的TIL组合物。
实施例
现参考以下实施例描述本文中涵盖的实施方案。这些实施例仅出于说明的目的提供且本公开决不应理解为限于这些实施例，而应理解为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化形式。
实施例1：制备用于预REP和REP过程的培养基
此实施例描述用于制备适用于涉及衍生自包括黑色素瘤的各种肿瘤类型的TIL的培养物的方案中的组织培养基的程序。此培养基可用于制备本申请和实施例中所描述的任一TIL。
制备CM1。自冷藏库取出以下试剂并使其在37℃水浴中升温：(RPMI1640、人类AB血清、200mM L-谷氨酰胺)。根据下表34，通过将每种成分添加到适合于待过滤体积的0.2μm过滤器单元的顶部来制备CM1培养基。储存于4℃下。
表34.制备CM1
| 成分 | 最终浓度 | 最终体积500mL | 最终体积IL |
| RPMI1640 | NA | 450mL | 900mL |
| 人AB血清，加热灭活10％ | 50mL | 100mL | |
| 200mM L-谷氨酰胺 | 2mM | 5mL | 10mL |
| 55mM BME | 55μM | 0.5mL | 1mL |
| 50mg/mL硫酸庆大霉素 | 50μg/mL | 0.5mL | 1mL |
使用当天，将所需量的CM1在37℃水浴中预热并添加6000IU/mL IL-2。
根据表35，可按需要进行额外补充。
表35.按需要对CM1的额外补充。
制备CM2。自冰箱取出已制备的CM1或制备新鲜CM1。自冰箱取出 且通过在无菌培养基瓶中混合已制备的CM1与等体积/>来制备所需量的CM2。在使用当天向CM2培养基中添加3000IU/mL IL-2。在使用当天用3000IU/mL IL-2制成足够量的CM2。将CM2培养基瓶标记上名称、制备者首字母缩写、过滤/制备日期、两周的过期日期，且在需要用于组织培养之前储存于4℃下。
制备CM3。在需要使用的当天，制备CM3。CM3与培养基相同，但在使用当天补充3000IU/mL IL-2。通过向AIM-V瓶或袋中直接添加IL-2储备溶液，制备满足实验需求的量的CM3。通过轻微振荡进行充分混合。添加AIM-V之后，立即将瓶子标记上“3000IU/mL IL-2”。若存在过量CM3，则将其储存于处于4℃下的瓶子中，标记上培养基名称、制备者名字缩写、制备培养基的日期和其过期日期(制备后7天)。储存于4℃下7天后，舍弃补充有IL-2的培养基。
制备CM4。CM4与CM3相同，但另外补充2mM GlutaMAXTM(最终浓度)。每1L CM3添加10ml的200mM GlutaMAXTM。通过向AIM-V瓶或袋直接添加IL-2储备溶液和GlutaMAXTM储备溶液，制备满足实验需求的量的CM4。通过轻微振荡进行充分混合。添加AIM-V之后，立即将瓶子标记上“3000IL/mL IL-2和GlutaMAX”。若存在过量CM4，则将其储存于处于4℃下的瓶子中，标记上培养基名称、“GlutaMAX”和其过期日期(制备后7天)。储存于4℃下7天后，舍弃补充有IL-2的培养基。
实施例2：使各个批次的经伽马射线辐照的外周单核细胞合格(QUALIFY)
本实施例描述用于使各个批次的经γ辐照的外周单核细胞(PBMC，也称为单核细胞或MNC)合格的简化程序，该经γ辐照的外周单核细胞在本文所描述的示例性方法中用作同种异体饲养细胞。
每个经辐照的MNC饲养细胞批次均由单独供体制备。在存在经纯化的抗CD3(克隆OKT3)抗体和白介素-2(IL-2)的情况下，针对各批次或供体在REP中扩增TIL的能力进行单独筛选。此外，每个批次的饲养细胞均在不添加TIL的情况下进行测试，以验证所接受的γ辐照剂量足以使其不能复制。
TIL的REP需要经γ辐照的生长停滞的MNC饲养细胞。饲养细胞MNC上的膜受体与抗CD3(克隆OKT3)抗体结合且与REP培养瓶中的TIL交联，从而刺激TIL扩增。饲养细胞批次由采集自受试者供体的全血的白细胞清除术制备。将白细胞清除术产物在Ficoll-Hypaque上进行离心、洗涤、辐照且在GMP条件下冷冻保存。
重要的是，接受TIL疗法的患者不输注活的饲养细胞，因为这可能导致移植物抗宿主病(GVHD)。因此，通过对细胞进行伽马射线照射来抑制饲养细胞的生长，导致双链DNA断裂，并在重新培养时导致MNC细胞丧失细胞活力。
根据两个标准评估饲养细胞批次：(1)其在共同培养中使TIL扩增>100倍的能力，和(2)其复制能力不足。
利用在立式T25组织培养瓶中生长的两个主要预REP TIL细胞株，以微型REP版本测试饲养细胞批次。针对两个不同的TIL细胞株测试饲养细胞批次，因为各TIL细胞株在其响应REP中活化而增殖的能力方面都是独一无二的。作为对照，与测试批次一起运行了许多历来已证明满足上述标准的经辐照的MNC饲养细胞。
为确保在单一实验中测试的所有批次都接受等效测试，可使用相同预REP TIL细胞株的足够储备液来测试所有条件和所有饲养细胞批次。
对于测试的各批次饲养细胞，总共存在六个T25培养瓶：预REP TIL细胞株#1(2个培养瓶)；预REP TIL细胞株#2(2个培养瓶)；和饲养细胞对照组(2个培养瓶)。含有TIL细胞株#1和#2的培养瓶用于评估饲养细胞批次扩增TIL的能力。饲养细胞对照组培养瓶评估饲养细胞批次的复制能力不足。
A.实验方案
第-2/3天，TIL细胞株解冻。制备CM2培养基且使CM2在37℃水浴中升温。制备40mL补充有3000IU/mL IL-2的CM2。保持温热直至使用。将20mL不含IL-2的预温热CM2置于用所使用的TIL细胞株的名称标记的两个50mL锥形管中的每一个中。自LN2储存器取出两个指定的预REP TIL细胞株且将小瓶转移至组织培养室中。通过将小瓶于拉链密封的储存袋内置于37℃水浴中解冻直至保留少量冰。
使用无菌移液管，将各小瓶的内容物立即转移至准备好的经标记的50mL锥形管中的20mL CM2中。补足至40mL，使用不含IL-2的CM2来洗涤细胞，且在400×CF下离心5分钟。抽吸上清液且再悬浮于补充有3000IU/mL IL-2的5mL温热的CM2中。
一式两份取出小等分试样(20μL)，使用自动细胞计数器进行细胞计数。记录计数。在计数时，将含有TIL细胞的50mL锥形管置于潮湿的37℃、5％CO2孵育箱中，并将盖松开以允许气体交换。测定细胞浓度，且将TIL在补充有3000IU/mL IL-2的CM2中稀释至1×106个细胞/毫升。
在潮湿的37℃孵育箱中，视需要在24孔组织培养板中的多个孔中以2毫升/孔进行培养，直至微型REP的第0天。不同TIL细胞株在单独的24孔组织培养板中培养以避免混淆和潜在的交叉污染。
第0天，开始微型REP。针对待测试的饲养细胞批次的数目制备足够的CM2培养基。(例如，为了一次测试4个饲养细胞批次，制备800mL CM2培养基)。将上述制备的CM2的一部分等分，且对其补充3000IU/mL IL-2用于细胞培养。(例如，为了一次测试4个饲养细胞批次，制备具有3000IU/mL IL-2的500mL CM2培养基)。
用各TIL细胞株独立地操作以防止交叉污染，自孵育箱取出具有TIL培养物的24孔板，并转移至BSC。
使用无菌移液管或100-1000μL移液管和吸头，自待使用的TIL的各孔移除约1mL培养基，并将其置于24孔组织培养板的未使用孔中。
使用新鲜的无菌移液管或100-1000μL移液管和吸头，将剩余培养基与孔中的TIL混合以使细胞再悬浮，然后将细胞悬浮液转移至标记有TIL批次名称的50mL锥形管中且记录体积。
用保留的培养基清洗孔且将该体积转移至相同的50mL锥形管中。以400×CF旋转细胞以收集细胞沉淀物。抽取出培养基上清液且将细胞沉淀物再悬浮于2-5mL含有3000IU/mL IL-2的CM2培养基中，所使用的体积基于收集的孔的数目和沉淀物的大小，即，体积应足以确保浓度>1.3×106个细胞/毫升。
使用血清移液管将细胞悬浮液彻底混合且记录体积。取出200μL，使用自动化细胞计数器进行细胞计数。在计数时，将具有TIL细胞的50mL锥形管置于潮湿的5％CO2 37℃孵育箱中，其中盖松开以允许气体交换。记录计数。
自孵育箱取出含有TIL细胞的50mL锥形管，且使其细胞以1.3×106个细胞/毫升的浓度再悬浮于补充有3000IU/mL IL-2的温热CM2中。将50mL锥形管放回孵育箱中且将盖子松开。
对于第二TIL细胞株重复以上步骤。
在将TIL接种到T25培养瓶中进行实验之前即刻，如下所示将TIL以1:10稀释至最终浓度为1.3×105个细胞/毫升。
制备MACSGMPCD3纯(OKT3)工作溶液。自4℃冰箱中取出OKT3(1mg/mL)的储备溶液且置于BSC中。在微型REP的培养基中使用最终浓度为30ng/mL的OKT3。
在用于实验的各T25培养瓶中，每20mL需要600ng OKT3；这相当于每20mL需要60μL的10μg/mL溶液，或对于各饲养细胞批次，所测试的全部6个培养瓶需要360μL。
对于所测试的各饲养细胞批次，对于10μg/mL的工作浓度，制备400μL的1mg/mLOKT3的1:100稀释液(例如为了一次测试4个饲养细胞批次，制备1600μL的1mg/mL OKT3的1:100稀释液：16μL的1mg/mL OKT3+1.584mL具有3000IU/mL IL-2的CM2培养基)。
准备T25培养瓶。在准备饲养细胞之前，标记各培养瓶且用CM2培养基填充培养瓶。将培养瓶置于37℃潮湿的5％CO2孵育箱中以保持培养基温热，同时等待添加剩余组分。在准备饲养细胞后，将组分添加至各培养瓶中的CM2中。
表36.溶液
准备饲养细胞。对于此方案，所测试的每个批次需要至少78×106个饲养细胞。由SDBB冷冻的每个1mL小瓶在冷冻时具有100×106个活细胞。假设自液态N2储存器解冻后的回收率为50％，建议每批次至少解冻两个1mL小瓶的饲养细胞，向各REP提供估计100×106个活细胞。或者，如果以1.8mL小瓶提供，则仅一个小瓶即提供足够的饲养细胞。
在解冻饲养细胞之前，对于待测试的各饲养细胞批次，预温热约50mL不含IL-2的CM2。自LN2储存器取出指定的饲养细胞批次小瓶，置于拉链储存袋中，并置于冰上。将小瓶在封闭的拉链储存袋中通过浸没于37℃水浴中来解冻。自拉链袋取出小瓶，用70％EtOH喷洒或擦拭，并转移至BSC。
使用移液管，将饲养细胞小瓶的内容物立即转移至50mL锥形管中的30mL温热CM2中。用小体积CM2洗涤小瓶以移除小瓶中的任何残余细胞且以400×CF离心5分钟。抽吸上清液且再悬浮于4mL温热的CM2加3000IU/mL IL-2中。取出200μL，使用自动细胞计数器进行细胞计数。记录计数。
将细胞以1.3×107个细胞/毫升再悬浮于温热CM2加3000IU/mL IL-2中。将TIL细胞自1.3×106个细胞/毫升稀释至1.3×105个细胞/毫升。
设定共培养。将TIL细胞自1.3×106个细胞/毫升稀释至1.3×105个细胞/毫升。将4.5mL CM2培养基添加至15mL锥形管。自孵育箱取出TIL细胞且使用10mL血清移液管使其充分再悬浮。自1.3×106个细胞/毫升TIL悬浮液移出0.5mL细胞且添加至15mL锥形管中的4.5mL培养基中。将TIL储备液瓶放回孵育箱中。充分混合。对第二TIL细胞株重复上述操作。
将具有用于单一饲养细胞批次的预温热培养基的培养瓶自孵育箱转移至BSC。通过用1mL移液管吸头上下移液数次来混合饲养细胞，然后将1mL(1.3×107个细胞)转移至该饲养细胞批次的各培养瓶中。向各培养瓶中添加60μL OKT3工作储备液(10μg/mL)。将两个对照培养瓶放回孵育箱。
将1mL(1.3×105)的各TIL批次转移至相应标记的T25培养瓶中。将培养瓶放回孵育箱中且直立孵育。自第5天开始进行干预。对于所测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
第5天，培养基更换。制备具有3000IU/mL IL-2的CM2。每个培养瓶需要10mL。利用10mL移液管，将具有3000IU/mL IL-2的10mL温热的CM2转移至各培养瓶中。将培养瓶放回孵育箱中且直立孵育至第7天。对测试的所有饲养细胞批次重复操作。
第7天：收集。自孵育箱中取出培养瓶且转移至BSC，注意不要破坏在培养瓶底部上的细胞层。在不破坏在培养瓶底部上生长的细胞的情况下，自各测试培养瓶取出10mL培养基且自各对照培养瓶取出15mL培养基。
使用10mL血清移液管，将细胞再悬浮于剩余培养基中且充分混合以打散任何细胞团块。在通过移液充分混合细胞悬浮液之后，移出200μL以进行细胞计数。结合自动细胞计数器设备使用适当标准操作程序对TIL进行计数。在第7天记录计数。对于所测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
评估饲养细胞对照培养瓶的复制能力不足，且自第0天起评估含有TIL的培养瓶的扩增倍数。
第7天，继续操作饲养细胞对照培养瓶至第14天。在完成第7天饲养细胞对照培养瓶的计数之后，将15mL含有3000IU/mL IL-2的新鲜CM2培养基添加至各对照培养瓶中。将对照培养瓶放回孵育箱中且以直立位置孵育至第14天。
第14天，饲养细胞对照培养瓶的非增殖期延长。自孵育箱中取出培养瓶且转移至BSC，注意不要破坏在培养瓶底部上的细胞层。在不破坏在培养瓶底部上生长的细胞的情况下，自各对照培养瓶取出大约17mL培养基。使用5mL血清移液管，将细胞再悬浮于剩余培养基中且充分混合以打散任何细胞团块。记录各培养瓶的体积。
通过移液充分混合细胞悬浮液之后，取出200μL用于细胞计数。使用适当标准操作程序结合自动细胞计数器设备对TIL进行计数且记录下计数。对于所测试的所有饲养细胞批次重复此程序。
B.结果和接受标准方案
结果。伽马辐照的剂量足以使饲养细胞无法复制。所有批次均预计满足评估标准，并且与第0天相比，REP培养第7天剩余的饲养细胞的总活细胞数目减少。预计所有饲养细胞批次均符合以下评估标准：到REP培养的第7天，TIL的生长扩增100倍。预计饲养细胞对照培养瓶的第14天计数将持续在第7天发现的非增殖趋势。
接受标准。测试的各批次饲养细胞的每个TIL细胞株复本均满足以下接受标准。如下表37中所示，接受标准为双重的，其可以与使用本文所示的方法的效力测定接受标准相结合。
表37.接受标准
当在30ng/mL OKT3抗体和3000IU/mL IL-2存在下培养时，评估照射剂量是否足以使MNC饲养细胞无法复制。如通过在REP的第7天和第14天通过自动细胞计数测定的总活细胞计数(TVC)来评估复制无能。
接受标准为“无生长”，是指在第7天和第14天，总活细胞数目与在REP的第0天放入培养物中的初始活细胞数目相比未增加。
评估饲养细胞支持TIL扩增的能力。TIL生长是根据从REP第0天培养开始到REP第7天活细胞的倍数扩增来测量的。根据自动细胞计数的评估，第7天，TIL培养物至少实现了100倍的扩增(即，大于第0天进行REP培养的活TIL细胞总数的100倍)。
不符合接受标准的MNC饲养细胞批次的应急测试。在MNC饲养细胞批次不满足以上概述的接受标准中的任一种的情况下，将采取以下步骤对该批次进行再测试，以排除造成此情形的简单实验者错误。
若该批次存在两个以上剩余卫星测试小瓶，则再测试该批次。若该批次存在一个或不存在剩余卫星测试小瓶，则根据上文所列的接受标准，该批次不合格。
为了合格，所讨论批次和对照批次必须达成以上接受标准。在符合这些标准之后，放行该批次以供使用。
实施例3：使各个批次的经γ照射的外周单核细胞合格
此实施例描述了用于使各个批次的经γ辐照的外周单核细胞(PBMC)合格的新颖简化程序，该经γ辐照的外周单核细胞在本文所描述的示例性方法中用作同种异体饲养细胞。此实施例提供用于评估经辐照PBMC细胞批次以用于生产TIL的临床批次的方案。每个经辐照的PBMC批次均由单个供体制备。在超过100个合格方案的过程中，已显示在所有情况下，来自SDBB(圣地亚哥血库)经辐照的PBMC批次在REP的第7天TIL扩增>100倍。此经修改的合格方案旨在应用于来自SDBB的经辐照供体PBMC批次，接着对其进行进一步测试，以验证所接收的γ辐照剂量足以使其无法复制。一旦证实其在14天过程内维持复制无能，供体PBMC批次就视为“合格的”以用于生产临床批次TIL。
TIL的现行标准REP需要经γ辐照的生长停滞的PBMC。PBMC上的膜受体与抗CD3(克隆OKT3)抗体结合并且与培养物中的TIL交联，从而刺激TIL扩增。PBMC批次由采集自单个供体的全血的白细胞清除术制备。将白细胞清除术产物在Ficoll-Hypaque上进行离心、洗涤、辐照且在GMP条件下冷冻保存。
重要的是，接受TIL疗法的患者不输注活的PBMC，因为这可能导致移植物抗宿主病(GVHD)。因此，通过对细胞进行伽马射线照射来抑制供体PBMC的生长，导致双链DNA断裂，并且在重新培养时PBMC的细胞活力丧失。
经辐照PBMC批次的评估标准为其复制无能。
使用在立式T25组织培养瓶中微型REP计划来测试饲养细胞批次，如同其与TIL共培养一样。对照批次是一批辐照过的PBMC，历史上已证明符合评估标准，与实验批次一起作为对照运行。对于所测试的各批次的辐射供体PBMC，运行一式两份的培养瓶。
实验方案-第0天。针对待测试的供体PBMC各批次制备约90mL CM2培养基。使CM2在37℃水浴中保持温热。解冻6×106IU/ml IL-2的等分试样。将CM2培养基放回BSC，用70％EtOH擦拭，随后置于通风橱中。对于各测试批次的PBMC，将约60mL CM2移出至单独的无菌瓶中。将解冻的6×106IU/mL储备溶液中的IL-2添加至此培养基中，最终浓度为3000IU/mL。将此瓶子标记为“CM2/IL2”(或类似名称)以将其与未补充CM2区分开。
准备OKT3。自4℃冰箱中取出抗CD3(OKT3)的储备溶液且置于BSC中。在微型REP的培养基中使用最终浓度为30ng/mL的OKT3。由1mg/mL储备溶液制备10μg/mL抗CD3(OKT3)工作溶液。将其置于冰箱中直至需要。
对于所测试的各PBMC批次，制备150μL的1:100稀释度的抗CD3(OKT3)储备液。例如，为了一次测试4个PBMC批次，通过添加6μL的1mg/mL储备溶液至594μl的补充有3000IU/ml IL-2的CM2来制备600μl的l10μg/mL抗CD3(OKT3)。
准备培养瓶。将每培养瓶19mL的CM2/IL-2添加至经标记的T25培养瓶中，且将培养瓶置于37℃、潮湿、5％CO2孵育箱中，同时制备细胞。
准备经辐照的PBMC。自LN2储存器取出待测试的PBMC批次小瓶。将这些物置于-80℃下或在解冻之前保持在干冰上。将30mL CM2(无IL-2补充)置于50mL锥形管中进行各批次解冻。用不同批次数目的待解冻PBMC标记每个试管。在使用之前将试管紧紧地加盖且置于37℃水浴中。按需要，将50mL锥形管放回BSC，用70％EtOH擦拭，随后置于通风橱中。
自冷藏库移出小瓶PBMC，且将其置于在37℃水浴中的浮管套管架中以解冻。继续解冻直至小瓶中残留少量冰。使用无菌移液管，将小瓶的内容物立即转移至50mL锥形管中的30mL CM2中。自试管中取出约1mL培养基以冲洗小瓶；将冲洗液返回至50mL锥形管中。紧紧地加盖且平缓地旋动以洗涤细胞。
在室温下在400×g下离心5分钟。使用1000μL移液管吸头将上清液抽吸且使细胞沉淀物再悬浮于1mL温热CM2/IL-2中。或者，在添加培养基之前，通过沿空管架拖动加盖的试管来使细胞沉淀物再悬浮。再悬浮细胞沉淀物之后，使用CM2/IL-2培养基使体积达到4mL。记录体积。
取出小等分试样(例如100μL)，使用自动细胞计数器进行细胞计数。根据特定自动化细胞计数器SOP一式两份地进行计数。在进行细胞计数之前，很可能需要对PBMC进行稀释。推荐的起始稀释度为1:10，但其取决于所用细胞计数器的类型。记录计数。
使用CM2/IL-2培养基将PBMC的浓度调整至1.3×107个细胞/毫升。通过轻轻旋动或使用血清移液管轻轻上下吸液充分混合。
设定培养瓶。将两个经标记的T25培养瓶自组织培养孵育箱放回BSC。将10μg/mL的抗CD3/OKT3小瓶放回BSC。将1mL 1.3×107个PBMC细胞悬浮液添加至各培养瓶。添加60μL的10μg/mL的抗CD3/OKT3至各烧瓶。将加盖的培养瓶返回至组织培养孵育箱中进行14天的无干扰生长。将抗CD3/OKT3小瓶置于冰箱中直至下一批次需要。对各批次待评估的PBMC进行重复。
第14天，测量PBMC的非增殖。将一式两份T25培养瓶返回至BSC。对于各培养瓶，使用新鲜10mL血清移液管自每一个培养瓶取出约17mL，接着小心地向上拉起剩余培养基以测量培养瓶中剩余的体积。记录体积。
通过使用相同的血清移液管上下移液来充分混合样本。
自各培养瓶移出200μL样本用于计数。使用自动细胞计数器对细胞进行计数。针对所评估的各批次PBMC重复各步骤。
结果。预计伽马辐照的剂量足以使饲养细胞无法复制。预计所有批次符合评估标准，表现出与第0天相比，REP培养第14天剩余的饲养细胞总存活数有所减少。
接受标准。对于所测试的每个经辐照供体PBMC批次满足以下接受标准：“无生长”是指第14天活细胞的总数小于REP的第0天放入培养物中的初始活细胞数目。
不符合接受标准的MNC饲养细胞批次的应急测试。在经辐照供体PBMC批次不满足以上接受标准的情况下，采取以下步骤重新测试批次，以排除简单的实验者错误作为其失败的原因。若该批次中存在两个以上剩余卫星小瓶，则再测试该批次。若该批次中存在一或不存在剩余卫星小瓶，则根据上文的接受标准，该批次不合格。
为了合格，经历应急测试的PBMC批次的对照批次和相关批次的两个复本均达到了接受标准。在符合此标准之后，随后放行该批次以供使用。
实施例4：制备IL-2储备溶液
此实施例描述将经纯化的冻干重组人类白介素-2溶解于适合用于其他组织培养方案(包括本申请和实施例中所描述的所有那些方案)的储备样本中的过程，包括涉及使用rhIL-2的那些过程。
程序。制备0.2％乙酸溶液(HAc)。将29mL无菌水转移至50mL锥形管中。向50mL锥形管中添加l mL 1N乙酸。通过倒转管2至3次进行充分混合。通过使用Steriflip过滤器对HAc溶液进行灭菌。
制备含1％HSA的PBS。在150mL无菌过滤器单元中，向96mL PBS中添加4mL 25％HSA储备溶液。过滤溶液。储存于4℃下。针对制备的每一小瓶rhIL-2，填写表格。
制备rhIL-2储备溶液(6×106IU/mL最终浓度)。每一批次的rhIL-2不同，且所需信息见于制造商的分析证书(COA)，例如：1)每小瓶rhIL-2的质量(mg)、2)rhIL-2的比活性(IU/mg)和3)推荐的0.2％HAc重构体积(mL)。
使用以下公式计算rhIL-2批次所需的1％HSA的体积：
例如，根据rhIL-2批次10200121(Cellgenix)的COA，1mg小瓶的比活性为25×106IU/mg。推荐在2mL 0.2％HAc中重构rhIL-2。
用酒精擦拭物擦拭IL-2小瓶的橡胶塞。使用连接于3mL注射器的16G针头，将推荐体积的0.2％HAc注入小瓶中。请小心不要在拔出针头时移开塞子。将小瓶倒转3次并旋动直至所有粉末均溶解。小心地取下塞子并置于酒精擦拭物上。向小瓶中添加所计算体积的1％HSA。
rhIL-2溶液的储存：对于短期储存(<72小时)，将小瓶储存在4℃。对于长期储存(>72小时)，将小瓶等分成较小体积，且在准备使用之前储存于-20℃下的冷冻小瓶中。避免冷冻/解冻循环。在制备日期之后6个月过期。RhIL-2卷标包括供应商和目录号、批号、过期日期、操作员姓名缩写、浓度和等分体积。
实施例5：冷冻保存过程
此实施例描述使用CryoMed受控速率冷冻机型号7454(Thermo Scientific)对利用本文所描述的程序制备的TIL进行冷冻保存过程的方法。
所用设备如下：铝制卡盒支架(与CS750冷冻袋相容)、用于750mL袋的冷冻盒、低压(22psi)液氮罐、冰箱、热电偶传感器(带式袋)和CryoStore CS750冷冻袋(OriGenScientific)。
冷冻程序提供从成核以0.5℃速率达到-20℃，且以1℃/min的冷却速率达到-80℃终点温度。程序参数如下：步骤1-在4℃下等待；步骤2：1.0℃/min(样本温度)达至-4℃；步骤3：20.0℃/min(箱室温度)达至-45℃；步骤4：10.0℃/min(箱室温度)达至-10.0℃；步骤5：0.5℃/min(箱室温度)达至-20℃；且步骤6：1.0℃/min(样本温度)达至-80℃。
实施例6：GEN 2和GEN 3示例性过程
此实施例说明Gen 2和Gen 3过程。过程Gen 2和Gen 3TIL通常由来源于单个患者(通过手术切除肿瘤)的自体TIL构成，然后离体扩增。Gen 3过程的初始第一次扩增步骤在白介素-2(IL-2)和单克隆抗体OKT3存在下进行细胞培养，该单克隆抗体OKT3靶向经辐照的外周血单核细胞(PBMC)的支架上的T细胞共受体CD3。示例性Gen 2过程描述于美国专利第11,083,752号和第11,168,304号中，其公开内容以引用的方式并入本文中，且其中其公开内容可经修改以用本文中别处所描述的aAPC或抗原呈递细胞(例如可选地经基因修饰且可选地经辐照的Thp1或U937细胞)替换PBMC。
Gen 2TIL产物的制造由两个阶段组成：1)预快速扩增(预REP)和2)快速扩增方案(REP)。在预REP期间，将切除的肿瘤切割成≤50个各尺寸为2-3mm的碎片，将这些碎片用含血清培养基(含有补充的10％HuSAB的RPMI 1640培养基)和6,000IU/mL白介素-2(IL-2)培养11天的时间段。在第11天，收集TIL且将其引入大规模二级REP扩增中。REP由在5×109个经辐照的同种异体PBMC饲养细胞(或本文别处描述的aAPC或抗原呈递细胞，例如Thp1或U937，其可选地经基因修饰且可选地经辐照)的共培养物中活化≤200×106个来自预REP的活细胞5天组成，这些饲养细胞在补充有3000IU/mL rhIL-2的5L体积的CM2中负载有150μg单克隆抗CD3抗体(OKT3)。在第16天，将培养物体积减少90％且将细胞级分以≥1×109个活淋巴细胞/培养瓶分至多个G-Rex-500培养瓶中，且用CM4补足至5L。将TIL再孵育6天。REP在第22天收集，洗涤，调配并冷冻保存，随后在-150℃下运送至临床站点进行输注。
Gen 3TIL产物的制造由三个阶段组成：1)初始第一次扩增方案；2)快速第二次扩增方案(也称作快速扩增阶段或REP)；和3)继代培养物分瓶。为了实现初始第一次扩增TIL增殖，将切除的肿瘤切成≤120个各尺寸为2-3mm的碎片。在初始第一次扩增的第0天，在3个100MCS容器的每一个中，在大约100cm2的表面区域上建立约2.5×108个负载有OKT-3的经辐照的同种异体PBMC饲养细胞的饲养细胞层。将肿瘤片段分布在3个100MCS容器中且在每个容器中用500mL含血清的CM1培养基和6,000IU/mL的白介素-2(IL-2)和15μg OKT-3培养7天的时间段。在第7天，通过以下来开始REP：将约5×108个负载有OKT-3的同种异体辐照的PBMC饲养细胞的额外饲养细胞层并入三个100MCS容器的每一个中的肿瘤破碎化培养阶段中，并用500mL CM2培养基和6,000IU/mL IL-2和30μgOKT-3进行培养。通过使用密闭系统将装载有OKT3的饲养细胞流体转移至100MCS容器中来活化同一容器中的整个初始第一次扩增培养来促进REP开始。对于Gen 3，TIL规模纵向扩大或分瓶涉及以下过程步骤：将整个细胞培养物通过密闭系统流体转移而按比例调整至更大的容器并转移(从100M培养瓶转移至500M培养瓶)并添加额外4L CM4培养基。在第16天收集REP细胞，洗涤、调配并冷冻保存，随后在-150℃下运送至临床站点进行输注。可采用本文别处所描述的aAPC或抗原呈递细胞(例如Thp1或U937细胞，其可选地经基因修饰且可选地经辐照)来代替PBMC。
总体而言，Gen 3过程是一个更短、可缩放性更高且易于修改的扩增平台，可适应稳健的制造和过程可比较性。
表38.示例性Gen 2与示例性Gen 3制造工艺的比较。
在第0天，对于两种过程，将肿瘤洗涤3次，并将碎片随机分组，分成两个池；每个过程一个池。对于Gen 2过程，将碎片转移至一个具有含有6,000IU/mL rhIL-2的1L CM1培养基的GREX 100MCS培养瓶中。对于Gen 3过程，将碎片转移至一个具有含有6,000IU/mLrhIL-2、15μg OKT-3和2.5×108个饲养细胞的500mL CM1的G-Rex 100MCS培养瓶中。根据各过程在不同的日子进行Rep开始日的TIL接种。对于Gen 2过程，其中G-Rex 100MCS培养瓶的体积减少了90％，将收集的细胞悬浮液转移至新的G-Rex 500MCS中，在第11天在含有IL-2(3000IU/mL)外加5×109个饲养细胞和OKT-3(30ng/mL)的CM2培养基中开始REP起始。根据方案，将细胞扩增并在第16天分至多个具有含有IL-2(3000IU/mL)的CM4培养基的G-Rex500MCS培养瓶中。接着，根据方案，在第22天收集培养物并冷冻保存。对于Gen 3过程，REP开始发生在第7天，其中相同G-Rex 100MCS用于REP开始。简言之，向各培养瓶中添加500mL含有IL-2(6000IU/mL)和5×108个饲养细胞和30ug OKT-3的CM2培养基。第9-11天，将培养物的规模纵向扩大。将整个体积的G-Rex 100M(1L)转移至G-Rex 500MCS中，并添加4L含有IL-2(3000IU/mL)的CM4。将培养瓶培养5天。在第16天收集培养物并冷冻保存。
比较中包括三种不同的肿瘤，即两种肺肿瘤(L4054和L4055)和一种黑素瘤(M1085T)。
对于L4054和L4055，CM1(培养基1)、CM2(培养基2)和CM4(培养基4)培养基是预先制备的且保持在4℃下。在不进行过滤的情况下制备CM1和CM2培养基，以比较在进行和不进行培养基过滤的情况下的细胞生长情况。
对于L4055肿瘤，在REP开始和规模纵向扩大时，将培养基在37℃下提前加热至多24小时。
结果。对于所达到的总活细胞，Gen 3的结果在Gen 2结果的30％以内。在再刺激之后，Gen 3最终产物表现更高的IFN-γ产量。如通过存在的总独特CDR3序列所测量的，Gen 3最终产物表现出增加的克隆多样性。Gen 3最终产物表现出较长的平均端粒长度。
Gen 2和Gen 3过程的预REP和REP扩增遵循上文所描述的程序。对于每个肿瘤，两个池包括相同数目的碎片。由于肿瘤的大小较小，故无法实现每个培养瓶的最大碎片数目。在Gen 2过程的第11天和Gen 3过程的第7天收集总预REP细胞(TVC)并进行计数。为比较两个预REP组，将细胞计数除以培养物中所提供的碎片的数目，以计算每个碎片的活细胞的平均值。如下表39中所指示，与Gen 3过程相比，Gen 2过程始终使每个碎片生长出更多细胞。外推计算Gen 3过程第11天预期的TVC数目，TVC数目用预REP TVC除以7然后乘以11来计算。
表39.预REP细胞计数
*L4055，未过滤的培养基。
对于Gen 2和Gen 3过程，根据过程条件对TVC进行计数，并在过程的每天产生活细胞百分比。在收集时，收集第22天(Gen 2)和第16天(Gen 3)细胞并确定TVC计数。然后将TVC除以第0天提供的碎片数目，以计算每个碎片的活细胞的平均值。通过将收集的TVC除以REP开始TVC来计算扩增倍数。如表40中所现，比较Gen 2与Gen3，L4054的扩增倍数类似；在L4055的情况下，Gen 2过程的扩增倍数更高。具体而言，在此情况下，在REP开始日之前使培养基升温24。在Gen 3中也观测到M1085T的更高倍数扩增。外推计算Gen 3过程第22天预期的TVC数目，该TVC数目将REP TVC除以16然后乘以22来计算。
表40.TIL最终产物的总活细胞计数和倍数扩增
*L4055，未过滤的培养基。
在收集后，将最终TIL REP产物与存活％的放行标准进行比较。Gen 2和Gen3过程的所有条件均超过70％存活标准，且在各过程和肿瘤之间具有可比性。
表41.REP(TIL最终产物)的存活％
由于每个培养瓶的碎片数目低于最大所需数目，故计算各肿瘤在收集日的估计细胞计数。该估计是基于以下预期：临床肿瘤足够大以在第0天接种2个或3个培养瓶。
表42.将估计的细胞计数计算值外推至Gen 3过程的全标度(2个和3个培养瓶)。
免疫表型-TIL最终产物的表型标记物比较。三种肿瘤L4054、L4055和M1085T在Gen2和Gen 3过程中均经历TIL扩增。在收集后，对REP TIL最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化和记忆标记物。对于所有条件，TCR a/b+细胞的百分比超过90％。
与从Gen 2过程收集的TIL相比，从Gen 3过程收集的TIL显示出更高的CD8和CD28的表达。Gen 2过程显示出更高百分比的CD4+。
与从Gen 2过程收集的TIL相比，从Gen 3过程收集的TIL显示出更高的中枢记忆区室表达。
在来自两种肿瘤L4054和L4055的TIL中分析活化和耗竭标记物，以比较来自Gen 2和Gen 3TIL扩增过程的最终TIL产物。Gen 2与Gen 3过程的活化和耗竭标记物具有可比性。
再刺激后的干扰素γ分泌。在收集日，即Gen 2的第22天和Gen 3的第16天，对于L4054和L4055，使用经涂布的抗CD3板对TIL进行再刺激过夜。使用抗CD3、CD28和CD137微珠对M1085T进行再刺激。在所有条件下再刺激24小时后收集上清液并冷冻上清液。使用相同的ELISA板同时对两种过程的上清液评估通过ELISA进行的IFN-γ分析。在所分析的三种肿瘤中观测到Gen 3过程的IFN-γ产量更高。
培养基中IL-2含量的测量。为了比较Gen 2和Gen 3过程之间的IL-2消耗，在REP开始、规模纵向扩大和收集日，在肿瘤L4054和L4055上收集细胞上清液。通过来自R&D的Quantitate ELISA试剂盒测量细胞培养物上清液中的IL-2的量。总体趋势指示，当与Gen 2过程相比较时，Gen 3过程中保持更高的IL-2浓度。这可能归因于Gen 3在REP开始时的IL-2浓度更高(6000IU/mL)以及整个过程中培养基的残留。
代谢底物和代谢物分析。测量代谢底物(例如D-葡萄糖和L-谷氨酰胺)的含量作为整体培养基消耗的代替物。测量其互逆代谢物，例如乳酸和氨。葡萄糖是培养基中的一种单糖，粒线体利用其以ATP的形式产生能量。当葡萄糖被氧化时，会产生乳酸(乳酸酯是乳酸的酯)。在细胞指数生长期期间大量产生乳酸酯。高水平的乳酸酯会对细胞培养过程产生负面影响。
在Gen 2和Gen 3过程的REP开始、规模纵向扩大和收集日收集L4054和L4055的用过的培养基。在Gen 2的第11天、第16天和第22天，在Gen 3的第7天、第11天和第16天，收集用过的培养基。在CEDEX生物分析仪上分析上清液中葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、GlutaMax和氨的浓度。
L-谷氨酰胺是细胞培养基调配中所需的一种不稳定的必需氨基酸。谷氨酰胺含有胺，该酰胺结构基团可向细胞输送和递送氮。当L-谷氨酰胺氧化时，细胞会产生有毒的氨副产物。为了抵消L-谷氨酰胺的降解，Gen 2和Gen 3过程的培养基添加了GlutaMax，其在水溶液中更稳定且不会自发降解。在两个肿瘤株中，Gen 3组在过程期间显示L-谷氨酰胺和Glutamax的减少，以及整个REP中氨的增加。在Gen 2组中，观测到恒定的L-谷氨酰胺和GlutaMax浓度，以及氨产量略微增加。对于氨，Gen 2和Gen 3过程在收集日时是类似的，且显示L-谷氨酰胺降解的略微差异。
Flow-FISH检测端粒重复。使用Flow-FISH技术测量Gen 2和Gen 3过程中L4054和L4055上端粒重复的平均长度。使用来自DAKO的用于流式细胞术分析的端粒PNA试剂盒/FITC计算相对端粒长度(RTL)的测定结果。Gen 3显示与Gen 2相当的端粒长度。
CD3分析。为了确定在每个过程中产生的细胞产物的克隆多样性，对收集的L4054和L4055的TIL最终产物进行取样，并通过T细胞受体的CDR3部分的测序进行克隆多样性的分析。
表43显示了Gen 2和Gen 3之间在TIL收集的细胞产物上的L4054上共有独特CDR3序列百分比的比较。Gen 3与Gen 2最终产物共有199个序列，对应于Gen 2最终产物中前80％的独特CDR3序列中的97.07％是与Gen 3最终产物共有的。
表43.L4054上在Gen 2与Gen 3过程之间共有uCDR3序列的比较。
表44显示了Gen 2和Gen 3之间在TIL收集的细胞产物上的L4055上共有独特CDR3序列百分比的比较。Gen 3与Gen 2最终产物共有1833个序列，对应于Gen 2最终产物中前80％的独特CDR3序列中的99.45％是与Gen 3最终产物共有的。
表44.L4055上在Gen 2与Gen 3过程之间共有uCDR3序列的比较。
CM1和CM2培养基在未过滤的情况下预先制备且保持在4℃，直至使用肿瘤L4055以用于Gen 2和Gen 3过程。
对于肿瘤L4055，在REP开始日，在37℃下提前加热培养基24小时以用于Gen 2和Gen 3过程。
在过程中收集的上清液中未测量到LDH。
用K2 cellometer细胞计数器进行M1085T TIL细胞计数。
在肿瘤M1085T上无法获得样本，例如用于代谢分析的上清液、用于活化和耗竭标记物分析、端粒长度和CD3-TCR vb分析的TIL产物。
结论此实施例在功能质量属性以及Gen 2和Gen 3过程中的扩展表达型表征和培养基消耗方面比较了3个独立的供体肿瘤组织。
Gen 2和Gen 3预REP和REP扩增比较根据所产生的总活细胞数和总成核细胞群的存活率来评估。收集日时的TVC细胞剂量在Gen 2(22天)与Gen 3(16天)之间无可比性。Gen3细胞剂量低于Gen 2，为在收集时收集的总活细胞的约40％。
假设在第11天而非第7天进行预REP收集且在第22天而非第16天进行REP收集，计算Gen 3过程的外推细胞数目。在此两种情况下，与Gen 2过程相比，Gen 3在TVC上显示出更接近的数目，表明早期活化可对TIL生长产生总体优选效能。
在Gen 3过程中额外(2或3个)培养瓶的外推值的情况下，假设处理的肿瘤尺寸更大，且达到如所描述的每个过程所需的最大碎片数目。观测到与在第22天的Gen 2过程相比，Gen 3过程在第16天收集的TVC上可达类似剂量。此观测结果为至关重要的且指示培养物的早期活化可允许在较少处理时间中更好地表达TIL。
Gen 2和Gen 3预REP和REP扩增比较根据所产生的总活细胞数和总成核细胞群的存活率来评估。收集日时的TVC细胞剂量在Gen 2(22天)与Gen 3(16天)之间无可比性。Gen3细胞剂量低于Gen 2，为在收集时收集的总活细胞的约40％。
就表型表征而言，与Gen 2过程相比，在Gen 3过程中的三个肿瘤上观测到更高的CD8+和CD28+表达。此数据指示Gen 3过程相较于Gen 2具有最终TIL产物的改进属性。
与Gen 2过程相比，Gen 3过程显示出略微更高的中枢记忆区室。
Gen 2和Gen 3过程显示出相当的活化和耗竭标记物，尽管Gen 3过程的持续时间更短。
在所分析的三个肿瘤中，Gen 3最终产物上的IFNγ(IFN gamma)产量比Gen2高3倍。该数据表明，与Gen 2过程相比，Gen 3过程产生了功能强大且更有效的TIL产物，这可能是由于Gen 3上CD8和CD28的表达更高。表型表征表明，与Gen 2过程相比，Gen 3在三个肿瘤上的CD8+、CD28+表达呈正向趋势。
Gen 2与Gen 3之间的TIL最终产物的端粒长度相当。
Gen 2和Gen 3最终产物的葡萄糖和乳酸酯含量类似，表明Gen 3过程的培养基上的营养物含量未受到影响，因为与Gen 2相比，在过程中的每一天均未进行减量移除且过程中的整体培养基体积较小。
与Gen 2过程相比，整个Gen 3过程的处理时间减少约两倍，这将显著降低通过Gen3过程扩展的TIL产物的商品成本(COG)。
IL-2消耗表明Gen 2过程中IL-2消耗的总体趋势，且在Gen 3过程中，由于未移除旧培养基，故IL-2更高。
Gen 3过程显示通过CDR3 TCRab序列分析测量的更高的克隆多样性。
在预REP的第0天添加饲养细胞和OKT-3可以使TIL早期活化并使得可以使用Gen 3过程实现总体上更好的生长TIL性能。
表45描述了与当前Gen 2过程相比，Gen 3过程的各种实施方案和结果。
表45.示例性Gen 3过程特征。
实施例7：第0天GEN 3扩增过程的示例性实施方案
制备肿瘤洗涤培养基。在开始之前加热培养基。将5mL庆大霉素(50mg/mL)添加至500mL HBSS瓶中。将5mL肿瘤洗涤培养基添加至15mL锥形管中，用于OKT3稀释。储存在室温(RT)下。
准备饲养细胞(PBMC)袋。将饲养细胞无菌转移至饲养细胞袋且在37℃下储存直至使用或冷冻。若在37℃下，则对饲养细胞计数。若冷冻，则解冻然后对饲养细胞计数。可采用本文别处所描述的aAPC或抗原呈递细胞(例如Thp1或U937细胞，其可选地经基因修饰且可选地经辐照)来代替PBMC。
饲养细胞浓度的最优选范围在5×104和5×106个细胞/毫升之间。准备四个具有4.5mL AIM-V的锥形管。对于每次细胞计数，添加0.5mL细胞级分。
若总活饲养细胞数≥1×109个细胞，则进行下一步骤以调节饲养细胞浓度。计算自第一饲养细胞袋中移出的饲养细胞体积，以便将1×109个细胞添加至第二饲养细胞袋中。
使用p1000微量吸液器，将900μL的肿瘤洗涤培养基转移至OKT3等分试样(100μL)中。使用注射器和无菌技术，吸取0.6mL的OKT3且添加至第二个饲养细胞袋中。将培养基体积调整至2L的总体积。将第二个饲养细胞袋转移至孵育箱中。
OKT3制剂详情：OKT3可以从自小瓶(1mg/mL)中以100μL等分试样的原始储备浓度进行等分和冷冻。每个1mL小瓶约10×等分试样。储存于-80℃下。第0天：15μg/培养瓶，即30ng/mL在500mL-60μL最大约1个等分试样中。
制备肿瘤样本。获得6孔板和100mm皮氏培养皿(总共4个)。将6孔板标记为“多余肿瘤块”。将四个100mm皮氏培养皿中的每一个标记为“洗涤01”、“洗涤02”、“洗涤03”、“洗涤04”和“保持”。
将5mL肿瘤洗涤培养基添加至标记为多余肿瘤块的6孔板的所有孔中。保持肿瘤洗涤培养基可用，以进一步用于使肿瘤在分割期间保持含水。
将50mL肿瘤洗涤培养基添加至每个100mm的标有洗涤01、洗涤02、洗涤03和保持的皮氏培养皿中。使用标记物将每个皮氏培养皿标记为分割1至分割4。在环境温度下在洗涤01中孵育肿瘤≥3min。在环境温度下在洗涤02中孵育肿瘤≥3min。在环境温度下在洗涤03中孵育肿瘤≥3min。洗涤完成后，将肿瘤移至“保持”板，以确保组织保持水分。
当肿瘤孵育正在进行中，将10mL肿瘤运送培养基转移至标有肿瘤运送培养基的试管中。将10mL肿瘤运送培养基抽吸至注射器中且用5mL肿瘤运送培养基接种各一个厌氧和好氧无菌性瓶。
在整个分割过程中将直尺放在皮氏培养皿的盖下方。测量且记录肿瘤长度和碎片数目。将肿瘤分割成四个中间块或分成四组等同体积并保存每个中间块的肿瘤结构。保持肿瘤块含水。
将没有被主动分割的任何中间肿瘤块转移至保持板以保持组织水分。
使用分割板盖下的直尺作为参考，将肿瘤分割成27mm3的碎片(3×3×3mm)。分割中间碎片，直至达到60个碎片。根据所产生的最终碎片的数目(每个培养瓶通常60个碎片)对最终碎片的总数目进行计数并准备G-Rex 100MCS培养瓶。
在标记为碎片管1至碎片管4的锥形管中保留有利的组织碎片。根据起始碎片管的数目计算用饲养细胞悬浮液接种的G-Rex 100MCS培养瓶的数目。
自孵育箱中取出饲养细胞袋并接种G-Rex 100MCS。标签为D0(第0天)。
向G-Rex100MCS中的培养物中添加肿瘤碎片。在无菌条件下，拧下标有肿瘤碎片培养(D0)1的G-Rex 100MCS和标有碎片管的50mL锥形管的盖子。旋转打开的碎片管1，同时轻轻抬起G-Rex 100MCS的盖子。在旋转的同时将带有碎片的培养基添加至G-Rex 100MCS。记录转移至G-Rex 100MCS的碎片数目。
一旦碎片位于G-REX瓶的底部，抽取7mL培养基并产生七个1mL等分试样，5mL用于扩展表征，2mL用于无菌样本。将用于扩展表征的5个等分试样(最终碎片培养上清液)储存在-20℃下，直至需要为止。
分别为一个厌氧BacT/Alert瓶和一个好氧BacT/Alert瓶接种1mL最终碎片培养物上清液。对采样的每个培养瓶进行重复。
实施例8：第7至8天GEN 3扩增过程的示例性实施方案
准备饲养细胞袋。在冷冻时，将饲养细胞袋在37℃水浴中解冻3-5分钟。若冷冻，则对饲养细胞进行计数。
饲养细胞浓度的最优选范围在5×104和5×106个细胞/毫升之间。准备四个具有4.5mL AIM-V的锥形管。对于每次细胞计数，将0.5mL细胞级分添加至新的冷冻小瓶管中。将样本充分混合并进行细胞计数。
当活饲养细胞总数为≥2×109个细胞时，进行下一步以调整饲养细胞浓度。计算自第一饲养细胞袋移出的饲养细胞的体积，以便将2×109个细胞添加至第二饲养细胞袋中。
使用p1000微量移液管，将900μL HBSS转移至100μL OKT3等分试样中。通过上下移液3次混合。制备两个等分试样。
OKT3制剂详情：OKT3可以从自小瓶(1mg/mL)中以100μL等分试样的原始储备浓度进行等分和冷冻。每个1mL小瓶约10×等分试样。储存于-80℃下第7/8天：30μg/培养瓶，即60ng/mL在500mL-120μl最大约2等分试样中。
使用注射器和无菌技术，吸取0.6mL OKT3且添加至饲养细胞袋中，确保全部添加。将培养基体积调整至2L的总体积。用第二个OKT3等分试样重复上述操作且添加至饲养细胞袋中。将第二个饲养细胞袋转移至孵育箱中。
制备具有饲养细胞悬浮液的G-Rex100MCS培养瓶。根据第0天生成的G-Rex培养瓶的数目记录要处理的G-Rex 100MCS培养瓶的数目。自孵育箱移出G-Rex培养瓶且自孵育箱移出第二饲养细胞袋。
在添加饲养细胞悬浮液之前移除上清液。将一个10mL注射器连接至G-Rex100培养瓶且抽取5mL培养基。创建五个1mL等分试样-5mL用于扩展表征，且将5个等分试样(最终碎片培养上清液)储存在-20℃用于扩展表征，直至要求分析。对各G-Rex 100培养瓶进行标记和重复。
制备5-20×1mL用于表征的样本，其取决于培养瓶数目：
·5mL＝1个培养瓶
·10mL＝2个培养瓶
·15mL＝3个培养瓶
·20mL＝4个培养瓶
继续将饲养细胞接种至G-Rex 100MCS中，且针对各G-Rex 100MCS培养瓶重复。使用无菌转移方法，将500mL第二饲养细胞袋按重量(假设1g＝1mL)通过重力转移至各G-Rex100MCS培养中且记录转移量。标记为第7天培养且对各G-Rex 100培养瓶进行重复。将G-Rex100MCS培养瓶转移至孵育箱。
实施例9：第10-11天GEN 3扩增过程的示例性实施方案
取出第一个G-Rex 100MCS培养瓶，使用无菌条件使用10mL注射器取出7mL预处理培养物上清液。创建七个1mL等分试样：5mL用于扩展表征，2mL用于无菌样本。
小心地混合培养瓶并使用新的10mL注射器取出10mL上清液，并转移至标记为D10/11支原体上清液的15mL管中。
小心地混合培养瓶并使用新注射器根据待处理的培养瓶数量取出以下体积：
·1个培养瓶＝40mL
·2个培养瓶＝20mL/培养瓶
·3个培养瓶＝13.3mL/培养瓶
·4个培养瓶＝10mL/培养瓶
应自所有培养瓶抽吸总共40mL，汇集在标有『第10/11天QC样本』的50mL锥形管中，储存在孵育箱中直至需要为止。进行细胞计数且分配细胞。
将用于扩展表征的5个等分试样(预处理培养物上清液)储存在≤-20℃下直至需要为止。分别为一个厌氧BacT/Alert瓶和一个好氧BacT/Alert瓶接种1mL预处理培养物上清液。
继续将细胞悬浮液转移至G-Rex 500MCS且针对各G-Rex 100MCS进行重复。使用无菌条件，将各G-Rex 100MCS的内容物转移至G-Rex 500MCS中，每次监测约100mL液体转移。当G-Rex 100MCS的体积减小至500mL时停止转移。
在转移步骤期间，使用10mL注射器，自G-Rex 100MCS抽吸10mL细胞悬浮液至注射器中。根据培养中的培养瓶数目，遵循说明书进行操作。若仅有1个培养瓶：使用两个注射器总共取出20mL。若有2个培养瓶：每个培养瓶取出10mL。若有3个培养瓶：每个培养瓶取出7mL。若有4个培养瓶：每个培养瓶取出5mL。将细胞悬浮液转移至一个常见的50mL锥形管中。保持在孵育箱中直至细胞计数步骤和QC样本。QC所需的细胞总数为约20×106个细胞：4×0.5mL细胞计数(细胞计数起初未经稀释)。
测定所需的细胞量如下：
·最少10×106个细胞用于效力测定，例如本文所描述的那些测定，或用于IFN-γ或颗粒酶B测定
·1×106个细胞用于支原体
·5×106个细胞用于针对CD3+/CD45+的流式细胞术
将G-Rex 500MCS培养瓶转移至孵育箱。
制备QC样本。本实施例中的测定至少需要15×108个细胞。测定包括：细胞计数和存活率；支原体(1×106个细胞/平均存活浓度)；流动(5×106个细胞/平均存活浓度)；和IFN-γ测定(5×106个细胞-1×106个细胞；IFN-γ测定需要8-10×106个细胞。
计算以10×106个细胞/毫升冷冻保存的细胞级分的体积，计算需准备的小瓶的数目。
实施例10：第16至17天GEN 3扩增过程的示例性实施方案
洗涤缓冲液制备(1％HAS/PlasmaLyteA)。将HSA和Plasmalyte转移至5L袋中以制作LOVO洗涤缓冲液。使用无菌条件，转移125mL总体积的25％HSA至5L袋中，储存在室温下。
取出10mL或40mL洗涤缓冲液并转移至“IL-2 6×104IU/mL”管中(若预先制备IL-2，则为10mL，或若新鲜制备IL-2，则为40mL)。
计算添加至Plasmalyte+1％HSA中的经重构IL-2的体积：经重构IL-2的体积＝(IL-2的最终浓度×最终体积)/IL-2的比活性(基于标准测定)。IL-2的最终浓度为6×104IU/mL。最终体积为40mL。
取出所计算的经重构的IL-2所需的初始体积的IL-2且转移至“IL-2 6×104IU/mL”管中。将来自预先制备的等分试样的100μL的6×106IU/mL IL-2添加至含有10mL LOVO洗涤缓冲液的标记为“IL-2 6×104IU/mL”的管中。
自G-Rex 500MCS培养瓶取出约4500mL上清液。旋转剩余的上清液，将细胞转移至细胞收集池袋中。对所有G-Rex 500MCS培养瓶重复上述操作。
取出60mL上清液且添加至上清液试管中用于质量对照测定，包括支原体检测。储存于+2-8℃下。
样本收集。对细胞进行计数。准备四个具有4.5mL AIM-V的15mL锥形管。这些锥形管可提前准备。最优选范围＝在5×104与5×106个细胞/毫升之间。(推荐1:10稀释度)。对于1:10稀释度，向先前制备的4500μL AIM V中添加500μL CF。记录稀释因子。
计算预LOVO(活+死)的TC(总细胞)＝
平均总细胞
浓度(预LOVO TC浓度)
(活+死)
X
来源袋的体积
计算预LOVO(活)的TVC(总活细胞)＝
平均总活细胞
浓度(预LOVO TVC)
(活)
X
LOVO来源袋的体积
当总细胞(TC)数目>5×109时，取出5×108个细胞进行冷冻保存，作为MDA保留样本。5×108÷平均TC浓度(步骤14.44)＝要取出的体积。
当总细胞(TC)数为≤5×109，取出4×106个细胞进行冷冻保存，作为MDA保留样本。4×106÷平均TC浓度＝要取出的体积。
使用恰当大小的注射器自LOVO来源袋中取出所需体积。在冷冻保存步骤之前保存于孵育箱中。
当总细胞数目确定时，要取出的细胞数目应允许保留150×109个活细胞。确认预LOVO TVC 5×108或4×106或不适用。计算要取出细胞的体积。
计算袋中剩余的剩余细胞总数。计算预LOVO TC(总细胞)为[平均总细胞浓度×剩余体积＝预LOVO剩余TC]。
根据剩余的细胞总数，选择表46中的相应过程。
表46.细胞总数。
| 总细胞 | 渗余物(mL) |
| 0<细胞总数≤31×109 | 115 |
| 31×109<细胞总数≤71×109 | 165 |
| 71×109<细胞总数≤110×109 | 215 |
| 110×109<细胞总数≤115×109 | 265 |
选择与所用过程相对应的IL-2添加量。体积计算为：保留物体积×2×300IU/mL＝所需IL-2的IU。所需IL-2的IU/6×104IU/mL＝LOVO后的袋中添加的IL-2的体积。记录所有添加的体积。获得冷冻小瓶中的样本用于进一步分析。
将细胞产物充分混合。密封所有袋以用于进一步处理，适当时包括冷冻保存。
按需要对获得的冷冻小瓶样本进行内毒素、IFN-γ、无菌和其他测定。
实施例11：示例性GEN 3过程(也称为GEN 3.1)
此实施例描述关于“Gen 2与Gen 3过程之间针对TIL扩增的可比较性”的其他研究。Gen 3过程经修改以在该过程早期包括活化步骤，其目标为增加最终总活细胞(TVC)输出以与Gen 2中的总活细胞(TVC)输出相当(或更好)，同时维持如先前所见的表型和功能概况。
该实施例的范围涉及通过在第0天对培养的肿瘤碎片引入活化步骤来评估TVC输出；在两个独立的患者肿瘤中证明在功能和扩展表型表征方面与Gen 3标准以及对照组的可比性；并分析培养基消耗和代谢物产生，以确认处理参数保持在生理条件下。
此实施例的所有操作均使用市售供体肿瘤组织作为起始材料以全尺寸平台进行。
Gen 3实施方案经修改为另一个实施方案且在本文中在此实施例中被称作Gen3.1。
在一个实施方案中，Gen 3.1TIL制造工艺具有四个操作员干预：
1.肿瘤碎片分离和活化：在该过程的第0天，分割肿瘤且产生各自为约3×3mm的最终碎片(总计至多240个碎片)，在1至4个G-Rex 100MCS培养瓶中培养。各培养瓶含有至多60个碎片、500mL CM1或DM1培养基，补充有6,000IU rhIL-2、15μg OKT3和2.5×108个经辐照的同种异体单核细胞(PBMC)。将培养物在37℃下孵育6至8天。可采用本文别处所描述的aAPC或抗原呈递细胞(例如Thp1或U937细胞，其可选地经基因修饰且可选地经辐照)来代替PBMC。
2.TIL培养物再活化：在第7-8天，在两种情况下，培养物通过缓慢添加补充有6,000IU rhIL-2、30μg OKT3和5×108个经辐照的同种异体单核细胞的CM2或DM1培养基进行补充。注意不要破坏培养瓶底部的现有细胞。将培养物在37℃下孵育3-4天。
3.培养规模纵向扩大：在第10-11天进行。在培养规模纵向扩大期间，在两种情况下，将G-Rex 100MCS的全部内容物转移至含有4L补充有3,000IU/mL IL-2的CM4或DM2的G-Rex 500MCS培养瓶中。将培养瓶在37℃下孵育5-6天直至收集。
4.收集/洗涤/调配：在第16-17天，将培养瓶体积减小且汇集起来。将细胞浓缩且用含有1％HSA的PlasmaLyte A pH 7.4洗涤。将洗涤的细胞悬浮液与CryoStor10以1:1的比率调配，且补充rhIL-2，达到最终浓度300IU/mL。
通过受控速率冷冻将DP冷冻保存并储存在气相液氮中。完全标准TIL培养基1、2或4(CM1、CM2、CM4)可替代CTSTMOpTmizerTMT细胞无血清扩增培养基，其称为成分确定培养基(DM1或DM2)，如上文所提及。
过程描述。在第0天，将肿瘤洗涤3次，然后破碎成3×3×3的最终碎片。整个肿瘤经破碎后，随后将最后碎片同等地随机化且分成三个池。将一个随机化碎片池引入各组，每个三个实验矩阵添加相同数目的碎片。
在整个TIL扩增过程中，用标准培养基进行肿瘤L4063扩增，且用成分确定培养基(CTS OpTmizer)进行肿瘤L4064扩增。培养基的组分描述于本文中。
CM1完全培养基1：RPMI+谷氨酰胺，补充有2mM Glutamax、10％人类AB血清、庆大霉素(50ug/mL)、2-巯基乙醇(55μM)。补充有6000IU/mL IL-2的最终培养基制剂。
CM2完全培养基2：50％CM1培养基+50％AIM-V培养基。补充有6000IU/mL IL-2的最终培养基制剂。
CM4完全培养基4：补充有Glutamax(2mM)的AIM-V。补充有3000IU/mL IL-2的最终培养基制剂。
补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)的CTS OpTmizerCTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。
DM1：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)和CTSTM免疫细胞SR(3％)以及Glutamax(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。补充有6,000IU/mL IL-2的最终制剂。
DM2：补充有CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增补充剂(26mL/L)和CTSTM免疫细胞SR(3％)以及Glutamax(2mM)的CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增基础培养基。补充有3,000IU/mL IL-2的最终制剂。
所使用的所有类型的培养基，即完全培养基(CM)和成分确定培养基(DM)，保持在4℃直至使用前一天，且在处理日之前，在孵育箱中在37℃下提前升温，持续至多24小时。
在第7天进行两种肿瘤的TIL培养物再活化。L4063在第10天且L4064在第11天进行规模纵向扩大。收集两种培养物且在第16天冷冻保存。
实现的结果。确定Gen 3.0和Gen 3.1过程的细胞计数和存活％。所有条件下的扩增遵循描述于此实施例中的细节。
对于每个肿瘤，碎片被分成三个数量相等的池。归因于肿瘤的较小尺寸，无法实现每个培养瓶的最大碎片数目。对于三种不同的过程，评估在各条件下的总活细胞和细胞存活率。细胞计数确定为在第7天用于再活化的TVC、在第10天(L4064)或在第11天(L4063)用于规模纵向扩大的TVC，以及在第16/17天收集的TVC。
第7天和第10/11天的细胞计数视为FIO。通过将第16/17天收集日TVC除以第7天再活化日TVC来计算扩增倍数。为了比较三个组，将收集日的TVC除以在第0天添加至培养物中的碎片的数目，以便计算每个碎片的活细胞的平均值。
对L4063和L4064进行细胞计数和存活率测定。Gen 3.1-对于两个肿瘤，测试过程每个碎片产生的细胞比Gen 3.0过程要多。
总活细胞计数和倍数扩增；该过程期间的存活％。在再活化、规模纵向扩大和收集后，在所有条件下执行存活率百分比。在第16/17天收集时，将最终TIL与存活率％的放行标准进行比较。所评估的所有条件均超过70％的存活率标准，且在过程和肿瘤方面具有可比性。
免疫表型分析-TIL最终产物的表型表征。对最终产物进行流式细胞术分析，以测试纯度、分化和记忆标记物。在所有条件下，TCRα/β、CD4+和CD8+细胞的群百分比系恒定的。
进行了REP TIL的扩展表型分析。在两个肿瘤中TIL产物显示，与Gen 3.0相比，Gen3.1条件下CD4+细胞的百分比更高，且在两种条件下，与Gen 3.1条件相比，Gen3.0中来自CD8+群的CD28+细胞百分比更高。
自Gen 3.0和Gen 3.1过程中收集的TIL显示出与CD4+和CD8+细胞上的CD27和CD56表达相当的表型标记物，以及CD4+门控细胞群上相当的CD28表达。TIL最终产物上的记忆标记物比较：
对在第16天收集的TIL的冷冻样本染色以进行分析。TIL记忆状态在Gen 3.0与Gen3.1过程之间系相当的。TIL最终产物上的活化和耗竭标记物比较：
活化和耗竭标记物在CD4+和CD8+细胞上门控的Gen 3.0和Gen 3.1过程之间具有可比性。
再刺激后的干扰素γ分泌。对于L4063和L4064，使用经涂布的抗CD3板对收集的TIL进行再刺激过夜。在所分析的两个肿瘤中，与Gen 3.0过程相比，观测到来自Gen3.1过程的IFN-γ产量更高。
培养基中IL-2含量的测量。为比较所有条件与过程之间的IL-2消耗量，在第7天再活化开始、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模纵向扩大和第16天/第17天收集日，收集细胞上清液并冷冻。随后将上清液解冻，然后进行分析。通过制造商方案测量细胞培养物上清液中的IL-2的量。
总体而言，在相同培养基条件下评估的整个过程中，Gen 3和Gen 3.1过程在IL-2消耗方面具有可比性。对收集的L4063和L4064的用过的培养基进行IL-2浓度(pg/mL)分析。
代谢物分析。对于每种条件，在L4063和L4064第7天再活化开始、第10天(L4064)/第11天(L4063)规模纵向扩大和第16天/第17天收集日，自L4063和L4064收集用过的培养基上清液。在CEDEX生物分析仪上分析上清液中葡萄糖、乳酸酯、谷氨酰胺、GlutaMax和氨的浓度。
与完全培养基(2g/L)相比，成分确定培养基中的葡萄糖浓度更高，为4.5g/L。总体而言，在各培养基类型中，Gen 3.0和Gen 3.1过程的葡萄糖的浓度和消耗是相当的。
对于所有测试条件，观测到两个肿瘤L4063和L4064的乳酸酯增加。乳酸酯增加在Gen 3.0与Gen 3.1条件之间和在用于再活化扩增的两个培养基(用于L4063的完全培养基和用于L4064的成分确定培养基)之间相当。
在L4063的情况下，标准基础培养基含有2mM L-谷氨酰胺且补充有2mM GlutaMax以补偿L-谷氨酰胺在培养条件下自然降解为L-谷氨酸和氨。
对于L4064肿瘤，所使用的成分确定(无血清)培养基在基础培养基上不含L-谷氨酰胺，且仅补充有GlutaMax，达到最终浓度2mM。GlutaMax是含L-丙氨酸和L-谷氨酰胺的二肽，在水溶液中比L-谷氨酰胺更稳定，且不会自发降解为谷氨酸和氨。实际上，二肽逐渐解离成单个氨基酸，由此维持较低但足够浓度的L-谷氨酰胺，以保持稳健的细胞生长。
对于L4063，谷氨酰胺和GlutaMax的浓度在规模纵向扩大日略有下降，但在收集日显示出与再活化日相比增加至类似或更接近的含量。对于L4064，在整个过程期间，谷氨酰胺和GlutaMax浓度在不同条件之间显示以类似速率略微降低。
如所预期，L4063的氨浓度(在含有2mM谷氨酰胺+2mM GlutaMax的标准培养基中生长)比L4064(在含有2mM GlutaMax的成分确定培养基中生长)更高。此外，正如预期的，在培养过程中，氨逐渐增加或积聚。在三种不同测试条件下，不存在氨浓度的差异。
Flow-FISH检测端粒重复。使用Flow-FISH技术测量Gen 3和Gen 3.1过程中L4063和L4064上端粒重复的平均长度。使用来自DAKO的用于流式细胞术分析的端粒PNA试剂盒/FITC计算相对端粒长度(RTL)的测定结果。进行端粒测定。将L4063和L4064的样本中的端粒长度与对照细胞株(1301白血病)进行比较。对照细胞株是具有允许计算相对端粒长度的长稳定端粒的四倍体细胞株。在两种肿瘤中评估的Gen 3和Gen 3.1过程显示出相当的端粒长度。TCR Vβ贮库分析
为了确定各过程中产生的细胞产物的克隆多样性，通过对T细胞受体的CDR3部分进行测序来确定TIL最终产物的克隆多样性分析。
在三种条件之间比较三个参数：
·独特CDR3(uCDR3)的多样性指数
·共有uCDR3的％
·对于uCDR3之前80％：
о比较共有uCDR3拷贝的％
о比较独特克隆型的频率
对照和Gen 3.1测试，在TIL收集的细胞产物上L4063的共享独特CDR3序列的百分比：975个序列在Gen 3和Gen 3.1测试最终产物之间共享，相当于与Gen 3.1测试最终产物共享的来自Gen 3的独特CDR3序列之前80％的88％。
对照和Gen 3.1测试，在TIL收集的细胞产物上L4064的共享独特CDR3序列的百分比：2163个序列在Gen 3和Gen 3.1测试最终产物之间共享，相当于与Gen 3.1测试最终产物共享的来自Gen 3独特CDR3序列之前80％的87％。
来自收集第16天收集的1×106个细胞中鉴别的独特CD3序列的数目，用于不同的过程。基于样本内独特肽CDR的数目，Gen 3.1测试条件显示相较于Gen 3.0略微更高的克隆多样性。
香侬熵(Shannon entropy)多样性指数为一个可靠和常用的比较度量，因为在两种肿瘤中，Gen 3.1条件与Gen 3过程相比展示略微更高的多样性，表明Gen 3.1测试条件的TCR Vβ贮库的多克隆性高于Gen 3.0过程。
此外，Gen 3.1测试条件的TCRVβ贮库与Gen 3.0过程的相应贮库在肿瘤L4063和L4064上显示超过87％的重叠。
在再活化日，用于Gen 3.1测试L4064的用过的培养基的IL-2浓度值低于预期值(与Gen 3.1对照和Gen 3.0条件类似)。
该低值可能归因于移液误差，但由于采集的样本极少，故不可能重复该分析。
未收集样本L4064上来自规模纵向扩大第10/11天的用过的培养基，且不包括在对上清液的IL-2浓度分析和代谢物分析中。
结论。与Gen 3.0和Gen 3.1对照相比，第0天的Gen 3.1测试条件(包括饲养细胞和OKT-3)在收集第16天显示出细胞剂量的更高TVC。在Gen 3.1测试条件下最终产物的TVC比Gen 3.0要高约2.5倍。
对于L4063和L4064两个肿瘤，在第0天添加OKT-3和饲养细胞的Gen 3.1测试条件在收集时达到培养瓶的最大容量。在这些条件下，若在第0天开始最多4个培养瓶，则最终细胞剂量可在80-100×109个TIL之间。
在Gen 3.1测试和Gen 3.0过程之间保持所有质量属性且具有可比性，例如表型表征，包括最终TIL产物的纯度、耗竭、活化和记忆标记物。在Gen 3.0与Gen 3.1过程之间，TIL最终产物上的端粒长度和用过的培养基上的IL-2消耗量相当。
在所分析的两个肿瘤中，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1上的最终TIL产物的IFN-γ产生比Gen 3.0高3倍，表明Gen 3.1过程产生有效的TIL产物。
在各测试条件下未观测到葡萄糖或乳酸酯含量的差异。在各种培养基条件下，未观测到Gen 3.0与Gen 3.1过程之间的谷氨酰胺和氨的差异。培养基上的较低含量的谷氨酰胺不限制细胞生长，表明仅在培养基中添加GlutaMax就足以给予细胞增殖所需的营养。
L4063和L4064的规模纵向扩大日分别为第11天和第10天，在过程的收集日所达到的细胞数目方面未显示出重大差异，在两种情况下，在整个过程期间的代谢物消耗均具有可比性。此观测结果表明Gen 3.0优化过程可在处理天数方面具有灵活性，由此促进制造时程的灵活性。
通过CDR3 TCRab序列分析所测量，与Gen 3.0相比，在第0天添加饲养细胞和OKT-3的Gen 3.1过程显示更高的克隆多样性。
图32描述了Gen 3过程(Gen 3优化过程)的实施方案。可使用标准培养基和CTSOptimizer无血清培养基进行Gen 3优化过程TIL扩增。在使用CTS Optimizer无血清培养基的情况下，建议将培养基上的GlutaMax的最终浓度增加至4mM。
在所有实验中建立所有研究条件的可行性。在所有实验和条件以及供体肿瘤组织之间，所有实验均使用相同批次的关键原材料进行，例如IL-2、人类血清AB、同种异体饲养细胞、OKT-3。
通过任何研究组根据冷冻保存第22天TIL产物的先前规格满足临床产品放行标准的能力来确定可比较性。
实施例12：利用成分确定培养基的肿瘤扩增过程。
用成分确定培养基(例如CTSTMOpTmizerTMT细胞扩增SFM，赛默飞世尔，包括例如DM1和DM2)替代CM1和CM2培养基来进行以上公开的过程。
实施例13：冷冻保存的TIL细胞疗法的示例性生产
此实施例描述一种根据当前组织优良操作规范(current Good TissuePractices)和当前优良制造规范(current Good Manufacturing Practices)在G-Rex培养瓶中进行TIL细胞疗法过程的示例性cGMP制造。
表47.过程扩增示例性计划
表48.培养瓶体积
第0天CM1培养基制备。在BSC中，向RPMI 1640培养基瓶添加试剂。添加以下试剂t，每瓶添加：加热灭活人AB血清(100.0mL)；GlutaMax(10.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(1.0mL)；2-巯基乙醇(1.0mL)。
自BSC取出不必要的材料。自BSC分发培养基试剂，将硫酸庆大霉素和HBSS保留在BSC以用于调配洗涤培养基制备。
解冻IL-2等分试样。解冻一个1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化为止。记录IL-2：批号和有效期。
将IL-2储备溶液转移至培养基中。在BSC中，将1.0mL IL-2储备溶液转移至准备的CM1第0天培养基瓶中。添加CM1第0天培养基1瓶和IL-2(6×106IU/mL)1.0mL。
将G-Rex 100MCS传递至BSC中。将G-Rex 100MCS(W3013130)无菌传递至BSC中。
将所有完全CM1第0天培养基泵吸至G-Rex 100MCS培养瓶中。锥形组织碎片或G-Rex 100MCS。
第0天肿瘤洗涤培养基制备。在BSC中，将5.0mL庆大霉素(W3009832或W3012735)添加至1×500mL HBSS培养基(W3013128)瓶中。每瓶添加：HBSS(500.0mL)；硫酸庆大霉素，50mg/mL(5.0mL)。通过1L 0.22微米过滤器单元(W1218810)制备含有庆大霉素的经过滤HBSS。
第0天肿瘤处理。获得肿瘤样本且立即转移至2-8℃的套件中进行处理。
等分肿瘤洗涤培养基。使用8”镊子(W3009771)进行肿瘤洗涤1。自样本瓶取出肿瘤且转移至所制备的“洗涤1”培养皿中。随后为肿瘤洗涤2和肿瘤洗涤3。
测量且评估肿瘤。评估是否观测到整个肿瘤面积的>30％坏死和/或为脂肪组织。适用时，进行清除性分割。若肿瘤较大且观测到>30％组织外表坏死/为脂肪，则通过使用解剖刀和/或镊子的组合移除坏死/脂肪组织并同时保留肿瘤内部结构来进行“清除性分割”。
分割肿瘤。使用解剖刀和/或镊子的组合，将肿瘤样本切割成偶数个适当大小的碎片(至多6个中间碎片)。转移中间肿瘤碎片。将肿瘤碎片分割成大小大约3×3×3mm的碎片。储存中间碎片以防脱水。
重复中间碎片分割。测定收集的小块数目。若仅保留所需组织，则自“有利中间碎片”6孔板选择另外的有利肿瘤碎片来填充丢弃碎片，使得最多达50个碎片。
准备锥形管。将肿瘤块转移至50mL锥形管中。制备BSC用于G-Rex 100MCS。自孵育箱中取出G-Rex 100MCS。将G-Rex 100MCS培养瓶无菌传递至BSC中。将肿瘤碎片添加至G-Rex 100MCS培养瓶中。使小块均匀分布。
按以下参数使G-Rex 100MCS保温：使G-Rex培养瓶保温：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。计算：保温时间；下限＝保温时间+252小时；上限＝保温时间+276小时。
过程完成后，舍弃所有剩余已升温培养基并解冻IL-2的等分试样。
第11天-培养基制备。监测孵育箱。孵育箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
在孵育箱中使3×1000mL RPMI 1640培养基(W3013112)瓶和3×1000mL AIM-V(W3009501)瓶升温≥30分钟。自孵育箱取出RPMI 1640培养基瓶。准备RPMI 1640培养基瓶。过滤培养基。解冻3x 1.1mL等分的IL-2(6×106IU/mL)(BR71424)。自孵育箱中取出AIM-V培养基。将IL-2添加至AIM-V中。将10L Labtainer袋和中继泵转移装置无菌转移至BSC中。
准备10L Labtainer培养基袋。准备Baxa泵。准备10L Labtainer培养基袋。将培养基泵入10L Labtainer。自Labtainer袋取下自动泵吸管。
混合培养基。轻缓地揉按袋子以进行混合。依据取样计划对培养基进行取样。取出20.0mL培养基并置于50mL锥形管中。制备细胞计数稀释管。在BSC中，向四个的15mL锥形管中添加4.5mL已标记有“用于细胞计数稀释”和批号的AIM-V培养基。将试剂自BSC转移至2至8℃下。准备1L转移包。在BSC外部，将1L转移包熔接(依据过程注释5.11)至附接于所准备的“完全CM2第11天培养基”袋的转移装置上。准备饲养细胞转移包。孵育完全CM2第11天培养基。
第11天-TIL收集。预处理表格。孵育箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。自孵育箱中取出G-Rex 100MCS。准备300mL转移包。将转移包熔接至G-Rex 100MCS。
准备用于TIL收集的培养瓶并开始TIL收集。收集TIL。使用GatheRex泵，透过血液过滤器将细胞悬浮液转移至300mL转移包中。检查膜上的粘附细胞。
冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex 100MCS上的夹子确保所有夹子闭合。热封TIL和“上清液”转移包。计算TIL悬浮液的体积。准备用于取样的上清液转移包。
抽取Bac-T样本。在BSC中，自1L“上清液”转移包中吸取约20.0mL上清液，并分配至无菌的50mL锥形管中。
依据取样计划接种BacT。使用适当大小的注射器自准备的标记有BacT的50mL锥形管取出1.0mL样本并接种于厌氧瓶。
孵育TIL。在需要之前将TIL转移包置于孵育箱中。进行细胞计数和计算。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。存活率÷2。活细胞浓度÷2。确定计数的上限和下限。下限：活细胞浓度平均值×0.9。上限：活细胞浓度平均值×1.1。确认两个计数在可接受界限内。根据进行的所有四次计数确定平均活细胞浓度。
调整TIL悬浮液的体积：计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积(A)。取出的细胞计数样本的体积(4.0mL)(B)。经调整TIL细胞总体积C＝A-B。
计算活TIL细胞总数。平均活细胞浓度：总体积；活细胞总数：C＝A×B。
流式细胞术的计算：若活TIL细胞总计数为≥4.0×107，则计算获得用于流式细胞术样本的1.0×107个细胞的体积。
流式细胞术所需的活细胞总数：1.0×107个细胞。流式细胞术所需的细胞体积：活细胞浓度除以1.0×107个细胞A。
计算等于2.0×108个活细胞的TIL悬浮液的体积。按需要，计算待取出的过量TIL细胞体积，且取出过量TIL并按需要将TIL置于孵育箱中。计算按需要取出的过量TIL总量。
将以供冷冻的目标细胞浓度添加至过量TIL细胞的CS-10培养基的计算量为1.0×108个细胞/毫升。按需要使过量TIL离心。观测锥形管并添加CS-10。
填充小瓶。将1.0mL细胞悬浮液等分至适当大小的冷冻小瓶中。将剩余体积等分至适当大小的冷冻小瓶中。如果体积≤0.5mL，将CS10添加至小瓶中，直至体积为0.5mL。
计算获得用于冷冻保存的1×107个细胞所需的细胞体积。取出样本以进行冷冻保存。将TIL置于孵育箱中。
样本的冷冻保存。观测锥形管，且缓慢添加CS-10并记录添加0.5mL CS10后的体积。
第11天-饲养细胞。获得饲养细胞。自LN2冷冻机获得至少两个不同批号的3袋饲养细胞。在准备解冻之前将细胞保存于干冰上。准备水浴或cryotherm。在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解冻饲养细胞约3至5分钟或直至冰刚好消失为止。自孵育箱取出培养基。合并解冻的饲养细胞。将饲养细胞添加至转移包。将饲养细胞自注射器分配至转移包中。对合并饲养细胞进行混合，且标记转移包。
计算转移包中的饲养细胞悬浮液的总体积。取出细胞计数样本。针对每个样本使用单独的3mL注射器，使用无针注入口自饲养细胞悬浮液转移包抽取4×1.0mL细胞计数样本。将每个样本等分至经标记的冷冻小瓶中。进行细胞计数，且确定乘数选定方案且输入乘数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。确定计数的上限和下限，并确认其在界限内。
调整饲养细胞悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。计算活饲养细胞总数。按需要获得另外的饲养细胞。按需要解冻另外的饲养细胞。将第4饲养细胞袋置于拉链袋中，且在37.0±2.0℃水浴或cytotherm中解冻约3至5分钟并合并另外的饲养细胞。测量体积。测量注射器中饲养细胞的体积并记录在下面(B)。计算饲养细胞的新的总体积。将饲养细胞添加至转移包。
按需要制备稀释液，将4.5mL AIM-V培养基添加至四个15mL锥形管中。准备计算细胞数目。针对每个样本使用单独的3mL注射器，使用无针注入口自饲养细胞悬浮液转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。进行细胞计数和计算。根据进行的所有四次计数确定平均活细胞浓度。调整饲养细胞悬浮液的体积，且计算取出细胞计数样本后饲养细胞悬浮液的经调整体积。饲养细胞总体积减去取出的4.0mL。计算获得5×109个活饲养细胞所需的饲养细胞悬浮液的体积。计算过量饲养细胞体积。计算待取出的过量饲养细胞的体积。取出过量饲养细胞。
使用1.0mL注射器和16G针头，吸取0.15mL OKT3且添加OKT3。热封饲养细胞悬浮液转移包。
第11天G-Rex填充和接种设定G-Rex500MCS。自孵育箱取出“完全CM2第11天培养基”并将培养基泵吸至G-Rex500MCS中。将4.5L培养基泵吸至G-Rex500MCS中，填充至培养瓶上标示的线处。按需要热封并使培养瓶保温。将饲养细胞悬浮液转移包熔接至G-Rex500MCS。将饲养细胞添加至G-Rex500MCS。热封。将TIL悬浮液转移包熔接至培养瓶。将TIL添加至G-Rex500MCS。热封。将G-Rex500MCS在37.0±2.0℃下保温，CO2百分比：5.0±1.5％CO2。
计算保温范围。进行计算以确定在第16天自孵育箱取出G-Rex500MCS的适当时间。下限：保温时间+108小时。上限：保温时间+132小时。
第11天过量TIL冷冻保存。适用：冷冻过量TIL小瓶。核实在冷冻前已设定CRF。进行冷冻保存。将小瓶自速率受控冷冻机转移至适当储存件中。完成冷冻后，将小瓶自CRF转移至适当储存容器。将小瓶转移至适当储存件中。记录在LN2中的储存位置。
第16天培养基制备。预热AIM-V培养基。针对培养基袋1、2和3计算使培养基升温的时间。确保所有袋子已升温12至24小时的持续时间。设定用于上清液的10LLabtainer。使用鲁尔接头将流体泵转移装置的较大直径端附接至10L Labtainer袋的一个凹形端口。设定用于上清液的10L Labtainer并进行标记。设定用于上清液的10L Labtainer。确保在自BSC之前取出前闭合所有夹子。注意：在TIL收集期间使用上清液袋，该TIL收集可与培养基制备并行地进行。
解冻IL-2。每袋CTS AIM-V培养基解冻5×1.1mL IL-2等分试样(6×106IU/mL)(BR71424)，直至所有冰融化为止。等分100.0mL GlutaMax。将IL-2添加至GlutaMax。准备用于调配的CTS AIM-V培养基袋。准备用于调配的CTS AIM V培养基袋。多级Baxa泵。准备调配培养基。将GlutaMax+IL-2泵吸至袋子中。监测的参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。使完全CM4第16天培养基升温。制备稀释液。
第16天REP分瓶。监测孵育箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。自孵育箱取出G-Rex500MCS。准备1L转移包且标记为TIL悬浮液并称重为1L。
G-Rex500MCS的体积减少。将约4.5L培养物上清液自G-Rex500MCS转移至10LLabtainer。
准备用于TIL收集的培养瓶。取出上清液后，闭合通向红色管线的所有夹子。
开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以使细胞剥离且确保所有细胞剥落。
TIL收集。松开通向TIL悬浮液转移包的所有夹子。使用GatheRex，将细胞悬浮液转移至TIL悬浮液转移包中。注意：确保维持边缘倾斜，直至收集到所有细胞和培养基为止。检查膜上的粘附细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex500MCS上的夹子。热封含有TIL的转移包。热封含有上清液的10L Labtainer。记录含细胞悬浮液的转移包的重量并计算悬浮液体积。准备用于样本取出的转移包。自细胞上清液取出测试样本。
无菌和BacT测试取样。自所准备的15mL标记有BacT的锥形管取出1.0mL样本。取出细胞计数样本。在BSC中，针对每个样本使用单独的3mL注射器，自“TIL悬浮液”转移包取出4×1.0mL细胞计数样本。
取出支原体样本。使用3mL注射器，自TIL悬浮液转移包取出1.0mL并置于准备的标记有“支原体稀释剂”的15mL锥形管中。
准备用于接种的转移包。将TIL置于孵育箱中。自BSC取出细胞悬浮液，且在需要之前置于孵育箱中。进行细胞计数和计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至所制备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释，得到稀释度为1:10。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。确定计数的上限和下限。注意：稀释可以根据预期的细胞浓度进行调整。自进行的所有四次计数中确定平均活细胞浓度。调整TIL悬浮液的体积。计算取出细胞计数样本后TIL悬浮液的经调整体积。总TIL细胞体积减去取出以用于测试的5.0mL。
计算活TIL细胞总数。计算待接种的培养瓶的总数。注意：待接种的G-Rex500MCS培养瓶的最大数目为五。若计算的待接种培养瓶的数目超过五，则使用可用的所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。
计算用于继代培养的培养瓶数目。计算除所准备的袋子以外还需要的培养基袋的数目。按计算需要每两个G-Rex-500M培养瓶准备一个10L“CM4第16天培养基“袋。继续接种第一GREX-500M培养瓶，同时准备另外的培养基并使其升温。准备确定的所计算数目的其他培养基袋并使其升温。填充G-Rex500MCS。准备泵吸培养基并将4.5L培养基泵吸至G-Rex500MCS中。热封。重复填充。使培养瓶保温。计算待添加至新G-Rex500MCS培养瓶中的TIL悬浮液的目标体积。若计算的培养瓶数目超过五，则使用所有体积的细胞悬浮液接种仅五个培养瓶。准备用于接种的培养瓶。自孵育箱取出G-Rex500MCS。准备用于泵吸的G-Rex500MCS。除较大过滤器管线外，闭合所有夹子。自孵育箱取出TIL。制备用于接种的细胞悬浮液。将”TIL悬浮液“转移包无菌熔接(依据过程注释5.11)至泵入口管线。将TIL悬浮液袋置于称上。
用TIL悬浮液接种培养瓶。泵吸所计算体积的TIL悬浮液至培养瓶中。热封。填充剩余培养瓶。
监测孵育箱。孵育箱参数：温度LED显示器：37.0±2.0℃；CO2百分比：5.0±1.5％CO2。使培养瓶保温。
测定在第22天自孵育箱取出G-Rex500MCS的时间范围。
第22天洗涤缓冲液制备。准备10L Labtainer袋。在BSC中，通过鲁尔接头将4”血浆转移装置附接至10L Labtainer袋。准备10L Labtainer袋。在转移出BSC之前，闭合所有夹子。注意：为待进行收集的每两个G-Rex500MCS培养瓶准备一个10L Labtainer袋。将Plasmalyte泵吸至3000mL袋中，且通过翻转泵并操纵袋子的位置而自3000mL Origen袋移除空气。将25％的人类白蛋白添加至3000mL袋中。获得最终体积为120.0mL的25％人类白蛋白。
制备IL-2稀释剂。使用10mL注射器，使用LOVO洗涤缓冲液袋上的无针注入口取出5.0mL LOVO洗涤缓冲液。将LOVO洗涤缓冲液分配至50mL锥形管中。
等分CRF空白袋LOVO洗涤缓冲液。使用100mL注射器，自无针注入口吸取70.0mLLOVO洗涤缓冲液。
解冻一份1.1mL IL-2(6×106IU/mL)，直至所有冰融化为止。将50μL IL-2储备液(6×106IU/mL)添加至标记为”IL-2稀释剂“的50mL锥形管中。
冷冻保存准备。将5个冷冻盒置于2至8℃下，以对其进行预处理，以便用于最终产物冷冻保存。
制备细胞计数稀释液。在BSC中，向4个单独的15mL锥形管中添加4.5mL已标记有批号和”用于细胞计数稀释液“的AIM-V培养基。准备计算细胞数目。将4个冷冻小瓶标记上小瓶编号(1至4)。将小瓶保存在BSC以供使用。
第22天TIL收集。监测孵育箱。孵育箱参数：温度LED显示器：37±2.0℃，CO2百分比：5％±1.5％。自孵育箱取出G-Rex500MCS培养瓶。准备TIL收集袋并进行标记。封闭额外的接头。体积减少：将约4.5L上清液自G-Rex500MCS转移至上清液袋。
准备用于TIL收集的培养瓶。开始TIL收集。剧烈敲击培养瓶并旋动培养基以剥离细胞。确保所有细胞剥落。开始TIL收集。松开通向TIL悬浮液收集袋的所有夹子。TIL收集。使用GatheRex，将TIL悬浮液转移至3000mL收集袋中。检查膜上的粘附细胞。冲洗培养瓶膜。闭合G-Rex500MCS上的夹子，并确保闭合所有夹子。将细胞悬浮液转移至LOVO来源袋中。闭合所有夹子。热封。取出4×1.0mL细胞计数样本。
进行细胞计数。利用NC-200和过程注释5.14进行细胞计数和计算。首先通过将0.5mL细胞悬浮液添加至所制备的4.5mL AIM-V培养基中来对细胞计数样本进行稀释。得到1:10稀释度。测定进行计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度和总成核细胞浓度。确定计数的上限和下限。测定进行计数的细胞的平均存活率、活细胞浓度和总成核细胞浓度。称量LOVO来源袋。计算活TIL细胞总数。计算成核细胞总数。
制备支原体稀释剂。通过鲁尔样本口自一个上清液袋取出10.0mL并置于15mL锥形管中。
进行”TIL G-Rex收集“方案并测定最终产物目标体积。装载一次性套件。取出滤液袋。输入滤液容量。将滤液容器置于实验台上。附接PlasmaLyte。核实已附接PlasmaLyte，且观测到PlasmaLyte正在移动。将来源容器附接至导管，且核实已附接来源容器。确认PlasmaLyte正在移动。
最终调配和填充。目标体积/袋子计算。计算待调配于空白袋中的CS-10和LOVO洗涤缓冲液的体积。准备CRF空白袋。
计算待添加至最终产物的IL-2的体积。所需最终IL-2浓度(IU/mL)-300IU/mL。IL-2工作储备液：6×104IU/mL。组装连接设备。将4S-4M60无菌熔接至CC2单元接头。将CS750冷冻袋无菌熔接至制备的线束上。将CS-10袋熔接至4S-4M60的尖端上。用IL-2制备TIL。使用适当大小的注射器，自”IL-2 6×104“等分试样取出所测定量的IL-2。标记经调配TIL袋。将经调配TIL袋添加至设备。添加CS10。切换注射器。将约10mL空气吸取至100mL注射器中并替换设备上的60mL注射器。添加CS10。准备CS-750袋。分配细胞。
自最终产物袋移除空气并获得保留物。一旦已填充最后一个最终产物袋，即闭合所有夹子。将10mL空气吸取至新的100mL注射器中且更换设备上的注射器。将保留物分配至50mL锥形管中，且将管标记为”保留物“和批号。针对每个袋子重复空气移除步骤。
准备用于冷冻保存的最终产物，包括目视检查。在冷冻保存之前将冷冻袋保存于降温包上或2至8℃下。
取出细胞计数样本。使用适当大小的吸液管，取出2.0mL保留物并置于15mL锥形管中以用于细胞计数。进行细胞计数和计算。注意：仅将一个样本稀释至核实稀释度足够的适当稀释度。将另外的样本稀释至适当稀释因子并继续进行计数。测定进行细胞计数的细胞的活细胞浓度平均值和存活率平均值。确定计数的上限和下限。注意：可根据预期细胞浓度调整稀释度。测定活细胞浓度平均值和存活率平均值。确定计数的上限和下限。计算IFN-γ。热封最终产物袋。
依据以下示例性取样计划标记并收集样本。
表49.样本计划。
无菌性和BacT测试。测试取样。在BSC中，从使用适当大小的注射器收集的保留细胞悬浮液中取出1.0mL样本，并接种厌氧瓶。对好氧瓶重复以上操作。
最终产物冷冻保存准备受控速率冷冻机(CRF)。核实已设定CRF。设定CRF探针。将最终产物和样本置于CRF中。测定要达至4℃±1.5℃所需的时间并继续进行CRF运行。完成CRF并储存。完成运行后停止CRF。自CRF取出盒子和小瓶。将盒子和小瓶转移至气相LN2进行储存。记录储存位置。
最终药品的后处理和分析包括以下测试：(第22天)通过流式细胞术确定第22天REP的CD3+细胞；(第22天)革兰氏染色法(GMP)；(第22天)通过凝胶凝块LAL测定(GMP)进行细菌内毒素测试；(第16天)BacT无菌性测定(GMP)；(第16天)通过TD-PCR(GMP)检测支原体DNA；可接受的外观属性；(第22天)BacT无菌性测定(GMP)(第22天)；(第22天)IFN-γ测定。如本文中所描述的其他效力测定也用于分析TIL产物。
实施例14：TIL效力测定前导研究
此实施例描述了用于表征临床TIL产物批次的效力测定。此实施例中所描述的方案应用于由Gen 2制造工艺产生的两个TIL样本，其由肺肿瘤(L4224)和黑色素瘤肿瘤(M1154)制备。将TIL与经辐照的Raji细胞共培养。K562细胞和PBMC微珠分别用作阴性和阳性对照。通用实验方案示于图34中。用抗CD3/抗CD28/抗4-1BB涂布微珠检验TIL的功能。还测试了添加抗CD28抗体以提供共刺激，从而确定其是否提供任何益处或没有效果。观测到不同的共培养持续时间。
将K562和Raji细胞解冻、计数，并在6孔板或T25培养瓶中扩增10至14天。一旦细胞数目达到>160×106，将细胞在35Gy下辐照，等分且回冷以供后续使用。将Gen 2扩增的TIL解冻且计数，并置于培养物中用于在共培养之前复苏48至72小时。
将经辐照的Raji细胞和经辐照的K562对照解冻，在+/-抗CD28抗体的情况下使用以下TIL：目标细胞比率与TIL共培养：50:1、25:1、12.5:1、6.25:1、1:1、1:6.25、1:12.5和1:25。还用涂布有抗CD3/CD28/4-1BB的磁性微珠刺激TIL以提供阳性活化对照。还包含TIL和仅肿瘤细胞株对照。
在共培养开始后6至24小时收集上清液并冷冻于-80℃。在相同时间点收集细胞并染色以便表达T细胞活化的表面标记物。使用Ella平台评估经解冻上清液的细胞因子。使用Ze5仪器，通过流式细胞术分析染色样本。
使用三种不同细胞株与TIL共培养。野生型Raji(目录号CCL-86)和K562(目录号CCL-243)细胞可购自ATCC。Raji细胞为来源于患有伯基特氏淋巴瘤的患者的人类B淋巴母细胞瘤细胞株，K562为骨髓性白血病细胞株。经辐照的人类PBMC接收自圣地亚哥血库(SanDiego Blood Bank)。
在与经辐照的Raji细胞、K562细胞和PBMC细胞共培养后测试两个Gen 2TIL批次的活化。TIL活化经定义为与K562细胞相比，在与Raji细胞共培养时的所选表面标记物的表达增加，表示为标记物阳性细胞百分比或平均荧光强度(MFI)。或者，可单独培养Raji细胞、K562和TIL。若使用PBMC作为对照，则也可使用CD3/CD28。预期TIL活化是由目标细胞与效应细胞之间的不同MHC表达引起。TIL TCR复合物与目标细胞HLA-肽复合物的同种异体相互作用称为MHC显性识别。Felix和Allen，《自然免疫学评论》，2007，7(12)，942-53；Matzinger和Bevan，《细胞免疫学(Cell Immunol.)》1977，29，1-5；和Janeway，《主要组织相容性复合物和其在免疫生物学方面的功能：健康与疾病免疫系统》，第5版，《加兰科学》，编，2001，《加兰科学》。
由于缺乏MHC I和II表达，K562细胞提供将与TIL同Raji细胞的共培养进行比较的基线活化水平。添加针对CD28的小鼠单克隆抗体以提供共刺激以扩增T细胞反应。将PBMC与各TIL批次一起共培养，作为MLR反应的阳性对照。
使Raji细胞在辐照之前扩增至超过160×106百万，以确保有足够细胞可用于前导实验。
肿瘤细胞样本的解冻和培养。将K562和Raji肿瘤细胞解冻且培养10至14天以使细胞解冻后复苏，适应培养基，且在实验之前扩增至适当数目。使200mL培养基在37℃水浴中升温持续15±5min。对于肿瘤细胞样本中的每一个，准备具有10mL温热培养基的50mL锥形管且其标有肿瘤细胞株名称。
在37℃水浴中解冻单个细胞小瓶(每1mL小瓶含有在2×106至10×106之间的细胞)直至仅剩下少量冰为止。将部分解冻的小瓶转移至BSC中。将解冻的肿瘤细胞的内容物转移至指定锥形管。将0.5mL温热培养基缓慢地逐滴添加至冷冻小瓶中，在添加培养基进行混合的同时涡旋小瓶。通过轻轻地上下吸液5至6次来混合冷冻小瓶的内容物。将小瓶的内容物转移至50mL锥形管。
在室温(RT)下以400×g将锥形管一起离心5分钟。自每个管取出上清液，避免细胞沉淀。通过抵靠管架轻轻刮擦管来使细胞沉淀物松散。每天检查细胞并在细胞约70-80％汇合时按1:4分离。
肿瘤细胞收集。自培养瓶或培养板中取出悬浮液中的肿瘤细胞，并添加至具有肿瘤培养基的50mL锥形管中。用1×PBS或肿瘤培养基冲洗培养瓶，且将内容物添加至50mL锥形管中。
在室温下以400×g将锥形管一起离心5分钟。小心地自每个管中取出上清液，避免细胞沉淀。通过抵靠管架轻轻刮擦管来使细胞沉淀物松散。使用1mL移液管，将TIL再悬浮于1mL培养基中且轻轻地上下移液以进一步使沉淀物破裂。使用血清移液管，用培养基使细胞悬浮液达到5mL。用血清移液管上下吸取细胞悬浮液以充分混合。取出两个200μL细胞悬浮液等分试样以在K2细胞计数器上进行计数。
K562和Raji细胞的辐照。一旦肿瘤细胞已扩增至大于160×106个细胞，则使用标准操作程序在35Gy下辐照细胞。
辐照后，使用K2细胞计数器对细胞计数且评估存活率。然后将细胞在杜瓦瓶中以10×106个细胞/毫升冷冻在CryoStor CS10冷冻培养基(BioLife Solutions，Washington，目录号210373)中。
TIL的解冻和复苏。将200mL TIL培养基(CM1)在37℃水浴中加热15±5分钟，然后放入BSC中。制备IL-2储备溶液(6×106IU/mL)。将温热培养基和IL-2储备溶液转移至BSC。通过将10μL IL-2储备溶液(6×106IU/mL)添加至培养基中，用300IU/mL IL-2补充培养基。
对于各TIL批次，准备具有10mL温热培养基的50mL锥形管。为管标记上TIL数目。基于TIL产物的可用性和每个小瓶的细胞数目，解冻足够小瓶以获得每个TIL批次60×106个总细胞。
在37℃水浴中解冻冷冻的TIL小瓶，直至仅剩下小冰块。将解冻的小瓶转移至BSC中。将解冻的TIL小瓶和PBMC的内容物转移至指定的锥形管。将0.5mL温热培养基缓慢地逐滴添加至TIL小瓶中，在添加培养基进行混合的同时涡旋小瓶。通过轻轻地上下吸液5至6次来混合TIL小瓶的内容物。将TIL小瓶内容物转移至50mL锥形管中。
在室温下以400×g将锥形管一起离心5分钟。小心地自每个管取出上清液，避免细胞沉淀。通过抵靠管架轻轻刮擦管来使细胞沉淀物松散。使用1mL移液管，将TIL再悬浮于1mL TIL培养基中且轻轻地上下移液以进一步使沉淀物破裂。使用血清移液管，用培养基使细胞悬浮液达到5mL。
用血清移液管上下吸细胞悬浮液以充分混合。取出两个200μL细胞悬浮液等分试样以在K2细胞计数器上进行计数。在CM1培养基和3000IU/mL IL-2中再悬浮TIL以达到1.5×106/3×106个细胞/毫升的浓度。使用G-Rex 10培养瓶或G-Rex 6孔板使细胞在37℃/5％CO2下复苏48至72小时。
准备TIL进行共培养。将200mL培养基在37℃水浴中加热15±5分钟，然后放入BSC中。制备具有10mL温热培养基的50mL锥形管。自G-Rex 10培养瓶或G-Rex 6孔板收集TIL且将细胞转移至指定锥形管中。在室温下以400×g将锥形管一起离心5分钟。
小心地自每个管取出上清液，避免细胞沉淀。通过抵靠管架轻轻刮擦管来使细胞沉淀物松散。使用1mL移液管，将TIL再悬浮于1mL培养基中且轻轻地上下移液以进一步使沉淀物破裂。使用血清移液管，用培养基使细胞悬浮液达到2mL。用血清移液管上下吸取细胞悬浮液以充分混合。取出两个200μL细胞悬浮液等分试样以在K2细胞计数器上进行计数。
按5×105个细胞/毫升使TIL再悬浮于TIL培养基中。解冻经辐照的K562细胞、Raji细胞和PBMC进行共培养。将200mL培养基在37℃水浴中加热15±5min。将温热培养基转移至BSC。对于每个细胞株，制备具有10mL温热培养基的50mL锥形管。
在37℃水浴中解冻冷冻的肿瘤细胞株，直至仅剩下小冰块。将解冻的卫星小瓶转移至BSC中。将解冻的肿瘤细胞株的内容物转移至指定锥形管。将0.5mL温热培养基缓慢地逐滴添加至冷冻小瓶中，在添加培养基进行混合的同时涡旋小瓶。通过轻轻地上下吸液5至6次来混合小瓶的内容物。将细胞内容物转移至50mL锥形管。
在室温(RT)下以400×g将锥形管一起离心5分钟。小心地自每个管取出上清液，避免细胞沉淀。通过抵靠管架轻轻刮擦管来使细胞沉淀物松散。使用1mL移液管，将TIL再悬浮于1mL培养基中且轻轻地上下移液以进一步使沉淀物破裂。使用血清移液管，用培养基使细胞悬浮液达到5mL。用血清移液管上下吸取细胞悬浮液以充分混合。取出两个200μL细胞悬浮液等分试样以在K2细胞计数器上进行计数。将细胞以5×105个细胞/毫升的浓度再悬浮于肿瘤培养基中且在制备TIL后置于孵育箱中以供共培养。
TIL和肿瘤细胞共培养设定。使用下文所指示的TIL：目标细胞比率和细胞数+/-抗CD28(5μg/mL)抗体，将每个TIL批次分别与经辐照的K562细胞、Raji细胞和PBMC(3至4个供体)共培养或进行微珠刺激。将总共1×106个细胞以1mL涂铺在48孔板的1个孔中。前导和主要研究的实验设定相同。每个TIL批次需要一个培养板，另外的对照孔将在另一培养板上运行，如图47中可见。
·50:1(9.8×105TIL:2×104个目标细胞)
·25:1(9.6×105TIL:4×104个目标细胞)
·12.5:1(9.2×105TIL:8×104个目标细胞)
·6.25:1(8.4×105TIL:1.5×105个目标细胞)
·1:1(5×105TIL:5×105个目标细胞)
·1:6.25(1.5×105TIL:8.4×105个目标细胞)
·1:12.5(8×104TIL:9.2×105个目标细胞)
·1:25(4×104TIL:9.6×105个目标细胞)
添加5mg/mL抗CD28至指定孔。用TIL培养基使孔的体积达到1000μL。对于含有αCD3/αCD28/α4-1BB微珠的孔，根据制造商的说明洗涤、制备并添加微珠。每个TIL批次需要约27.0×106个TIL和9×106个目标细胞。
将培养板在孵育箱(5％CO2，37℃)中保温所选的培养持续时间。对于使用两个Gen2研究样本的前导研究，将培养板在不同时间点(即6、12、18和24小时)保温。最优选共培养持续时间定义为产生最高Raji/K562活化值且应用于六个Gen 2TIL临床样本的持续时间。
收集细胞以评估活化标记物的表达。自48孔板移出细胞悬浮液，置于经预标记的FACS管中。将约3mL 1×PBS添加至各管中。将试管在室温下在400×g、高加速度和制动下旋转5分钟。倒出上清液。将细胞用表50中所示的示例性抗体小组染色。
表50.活化(DIG1)流式细胞术抗体和染色剂。
染色完成后，将样本储存在40℃的暗处，直至准备在流式细胞仪上收集，并在24小时内获取关于Ze5的数据。使用FlowJo软件分析流式细胞术数据。结果表示为活CD3+CD4+和CD3+CD8+胞的标记物阳性细胞百分比。
收集上清液和针对细胞因子的评估。自孵育箱中取出培养板。不要破坏培养板底部的细胞。自各孔的顶部取出80μL上清液且将80μL样本转移至96孔U形板中。使用另外两个96孔板重复此步骤，以产生两个备用培养板。用粘合密封件密封各96孔板且将培养板储存于-80℃冷冻器中。结果显示于图35至图38中。
随后使用ELLA平台评估上清液的IFN-γ、CCL4、颗粒酶B、TNF-α和MIP-1β分泌。IFN-γ的结果显示于图39中。CCL4的结果显示于图40中。颗粒酶B的结果显示于图41中。培养板布局显示于图42中。
实施例15：用于6个TIL样本的TIL效力评估
如实施例14中所描述，基于Raji细胞的共培养系统用于评估总共六个Gen 2黑色素瘤TIL批次。K562细胞用作HLA阴性对照。分析TIL样本的活化和分泌细胞因子的表型标记物。可使用ELISA或自动ELISA方法监测多种另外的细胞因子或其他分泌蛋白。通用实验方案显示于图42中。
图43至图54显示对此组TIL样本进行共培养效力测定的实验的结果。有临床反应的患者按照伴随研究中使用的标准与没有反应的患者分开；然而，患者的反应状态并不限制数据测定或分析的使用。这些实验证明了该测定检测在与Raji细胞共培养时的IFN-γ和颗粒酶B分泌的能力。在六个Gen 2TIL样本中，由TIL-Raji细胞共培养测定确定的IFN-γ范围为42.1pg/mL(301-001)至3708pg/mL(患者008-002)。通过TIL-Raji细胞共培养测定确定的颗粒酶B的范围为568.3pg/mL(301-001)至8721.33pg/mL(008-002)。
实施例16：用于22个TIL样本的多功能TIL效力评估
在此实施例中，使用基于Raji细胞的共培养系统结合基于K562细胞的阴性对照共培养系统来评估TIL批次的效力，表现多功能TIL效力测定的各种实施方案。将K562和Raji细胞解冻、计数并在6孔板或T25培养瓶中扩增10至14天。一旦细胞数目达到>160×106，将细胞在35Gy下辐照，等分并回冷以供后续使用。将Gen 2TIL批次解冻且计数，并置于培养物中用于在共培养之前复苏48至72小时。将经辐照的K562和Raji细胞解冻并使用三种TIL：目标细胞比率(3:1、1:1、1:3)与TIL共培养，其中TIL数目恒定(500,000个细胞)。TIL批次也用涂布有抗CD3/CD28/41BB的磁珠刺激以提供可选的阳性活化对照。也包含TIL和仅肿瘤细胞株对照。在共培养开始后第12和18小时收集上清液。使用ELLA自动化基于ELISA的平台评估上清液的细胞因子。两个细胞株与TIL共培养。野生型Raji(目录号CCL-86)和K562(目录号CCL-243)细胞可购自ATCC。Raji细胞为来源于患有伯基特氏淋巴瘤的患者的人类B类淋巴母细胞瘤细胞株。K562是一种骨髓性白血病细胞株。在使用之前验证Raji细胞的HLA类型。
除了本领域技术人员已知的通常可用的实验室材料之外，以下材料用于该示例：RPMI 1640培养基(ATCC，VA，USA，目录号ATCC 30-2001)；谷氨酸(Gibco，MA，USA，目录号30050-061)；β-巯基乙醇(Gibco，MA，USA，目录号21985-023)；用于TIL的人类AB血清(Gemini，CA，USA，目录号100-512)；用于肿瘤细胞株的胎牛血清(ATCC，VA，USA，目录号ATCC30-2020)；庆大霉素(gentamycin)(Gibco，MA，USA，目录号15750-060)；GMP重组IL-2(CellGenix，Germany，目录号1020-1000)；汉克氏平衡盐溶液，或HBSS(Gibco，MA，USA，目录号14175-095)；CELLSTAR T25培养瓶(Fisher Scientific，MA，USA，目录号07-000-225)；G-Rex 6、24孔板和10个培养瓶(Wilson Wolf，MN，USA，目录号P/N 80240M，P/N 80192M；#80040S)；用于IFN-γ(第三代)、颗粒酶B、TNF-α(第二代)和MIP-1α(BioAgilytix，NC，USA，套件ID 127725)的ELLA人体多分析物试剂盒；人类细胞因子冻干对照(BioAgilytix，NC，USA，目录号89077)；和CryoStor CS10冷冻培养基(BioLife Solutions，WA，USA，目录号210373)。
除了本领域技术人员已知的通常可用的实验室设备之外，以下设备用于该实施例：Protein Simple ELLA(BioAgilytix，NC，USA，目录号500-140)；K2细胞计数器(Nexcelom，MA，USA)；K2计数室(Nexcelom，MA，USA，目录号SD100)；JUN-AIR，84R-RP型真空泵(Sony，NY，USA)；以及Steri-Cycle i160 CO2孵育箱(ThermoFisher Scientific，MA，USA，目录号51030301)。
测试22个随机选择的黑色素瘤Gen 2TIL批次，以在与经辐照的Raji和K562细胞共培养时进行活化。
不受理论束缚，在本发明的一个实施方案中，TIL TCR复合物与目标细胞HLA-肽复合物的同种异体相互作用作为MHC显性识别，如图56中所描绘且也如本文别处所描述。由于缺乏MHC I和II表达，预期K562细胞会提供可与TIL同Raji细胞的共培养进行比较的基线活化水平。单独的TIL培养物也可用作基线。
肿瘤细胞样本的解冻和培养。将K562和Raji肿瘤细胞解冻且培养10至14天以使细胞解冻后复苏，适应培养基，在研究之前扩增至适当数目。将培养基(200mL)在37℃水浴中加热15±5分钟，然后放入BSC中。对于每个肿瘤细胞样本，制备具有10mL温热培养基的50mL锥形管。这些管标记有肿瘤株名称。在37℃水浴中解冻单个细胞小瓶(每1mL小瓶含有在2×106至10×106之间的细胞)，直至仅剩下小冰块为止。将部分解冻的小瓶转移至生物安全柜中。将解冻的肿瘤细胞的内容物转移至指定锥形管，且将0.5mL温热培养基逐滴缓慢添加至冷冻小瓶中，旋动小瓶，同时添加培养基进行混合。随后通过轻轻地上下吸液5至6次来混合冷冻小瓶的内容物。将小瓶的内容物转移至50mL锥形管。在室温(RT)下以400×g将锥形管离心5分钟。小心地自每个管取出上清液，避免细胞沉淀。通过抵靠管架轻轻刮擦管来使细胞沉淀物松散。每天检查细胞并在细胞约70-80％汇合时按1:4分瓶。
收集肿瘤细胞。将悬浮液中的肿瘤细胞自培养瓶或培养板中取出且添加至具有肿瘤培养基的50mL锥形管中。用1×PBS或肿瘤培养基冲洗培养瓶，且将内容物添加至50mL锥形管中。在室温下以400×g将锥形管一起离心5分钟。小心地自每个管取出上清液，避免细胞沉淀。通过抵靠管架轻轻刮擦管来使细胞沉淀物松散。使用1mL移液管，将TIL再悬浮于1mL培养基中且轻轻地上下移液以进一步使沉淀物破裂。使用血清移液管，用培养基使细胞悬浮液达到5mL。用血清移液管上下吸取细胞悬浮液以充分混合。随后取出两个200μL细胞悬浮液等分试样以在K2细胞计数器上进行计数。
K562和Raji细胞的辐照。一旦Raji和K562细胞已扩增至>160×106个细胞，则在35Gy下辐照细胞。辐照后，使用K2细胞计数器对细胞计数且评估存活率。将细胞以10×106个细胞/毫升冷冻于CryoStor CS10中。
TIL的解冻和复苏。将200mL TIL培养基(CM1)在37℃水浴中加热15±5分钟，随后置于生物安全柜(BSC)中。制备IL-2储备溶液(6×106IU/mL)并将其与温热培养基一起转移至BSC中。通过将10μL IL-2储备溶液(6×106IU/mL)添加至培养基中，为培养基补充300IU/mL IL-2。对于每个TIL批次，制备具有用10mL温热培养基的50mL锥形管且其标记有TIL批号基于TIL产物的可用性和每个小瓶的细胞数目，解冻足够小瓶以获得每个TIL批次60×106个总细胞。在37℃水浴中解冻冷冻的TIL小瓶，直至仅剩下小冰块。将解冻的小瓶转移至BSC中。随后将解冻的TIL小瓶和PBMC(后者用作MLR阳性对照)的内容物转移至指定锥形管。将温热培养基(0.5mL)逐滴缓慢添加至TIL小瓶中，同时旋动小瓶且添加培养基进行混合。通过轻轻地上下吸液5至6次来混合每个TIL小瓶的内容物。将TIL小瓶内容物转移至50mL锥形管中。在室温下以400×g将锥形管一起离心5分钟。小心地自每个管取出上清液，避免细胞沉淀。通过抵靠管架轻轻刮擦管来使细胞沉淀物松散。使用1mL移液管，将TIL批次再悬浮于1mL TIL培养基中且轻轻地上下移液以进一步使沉淀物破裂。使用血清移液管，用培养基使细胞悬浮液达到5mL，且上下吸移悬浮液以充分混合。取出两个200μL细胞悬浮液等分试样以在K2细胞计数器上进行计数。在CM1培养基和3000IU/mL IL-2中再悬浮TIL批次以达到1.5×106/3×106个细胞/毫升的浓度。使用G-Rex 10培养瓶或G-Rex 6孔板使细胞在37℃/5％CO2下复苏48至72小时。
准备TIL进行共培养。将200mL培养基在37℃水浴中加热15±5分钟，然后放入BSC中。制备具有10mL温热培养基的50mL锥形管。自G-Rex 10培养瓶或G-Rex 6孔板收集TIL样本且转移至指定锥形管中。在室温下以400×g将锥形管一起离心5分钟。小心地自每个管取出上清液，避免细胞沉淀。通过抵靠管架轻轻刮擦管来使细胞沉淀物松散。使用1mL移液管，将TIL批次再悬浮于1mL培养基中且轻轻地上下移液以进一步使沉淀物破裂。使用血清移液管，用培养基使细胞悬浮液达到2mL，且上下移液以充分混合。取出两个200μL细胞悬浮液等分试样以在K2细胞计数器上进行计数。按5×105个细胞/毫升使TIL批次再悬浮于TIL培养基中。
解冻经辐照的K562细胞、Raji细胞和PBMC进行共培养。将200mL培养基在37℃水浴中加热15±5min，然后放入BSC中。将温热培养基转移至BSC。对于每个细胞株，准备具有10mL温热培养基的50mL锥形管且对其恰当标记。在37℃水浴中解冻冷冻的K562和Raji细胞，直至仅剩下小冰块。将解冻的卫星小瓶转移至BSC中。将解冻的K562和Raji细胞株的内容物转移至指定锥形管，且将0.5mL温热培养基逐滴缓慢添加至冷冻小瓶中，旋动小瓶，同时添加培养基进行混合。通过轻轻地上下吸液5至6次来混合小瓶的内容物。将细胞内容物转移至50mL锥形管。在室温下以400×g将锥形管一起离心5分钟。小心地自每个管取出上清液，避免细胞沉淀。通过抵靠管架轻轻刮擦管来使细胞沉淀物松散。使用1mL移液管，将TIL再悬浮于1mL培养基中且轻轻地上下移液以进一步使沉淀物破裂。使用血清移液管，用培养基使细胞悬浮液达到5mL，且用血清移液管上下移液以充分混合。取出两个200μL细胞悬浮液等分试样以在K2细胞计数器上进行计数。将细胞以5×105个细胞/毫升的浓度再悬浮于肿瘤培养基中且在制备TIL样本后置于孵育箱中进行共培养。
TIL和肿瘤细胞共培养设定。使用以下TIL：目标细胞比率将每个TIL批次分别与经辐照的K562细胞和Raji细胞共培养：3:1(5.0×105:1.67×105)；1:1(5.0×105:5.0×105)；和1:3(5.0×105:1.5×106)。对于所有条件，将用于共培养的TIL样本以1mL中500,000个细胞接种到48孔板的1个孔中，一式三份，总共24个条件，如下所示。每个培养板可以运行两个Gen 2TIL株。一次最多设定3个培养板。添加1mL培养基，每孔总共2mL。对于含有αCD3/αCD28/α41BB微珠的孔(用作如本文别处所描述的可选的对照)，根据制造商说明洗涤、制备和添加微珠。将培养板保温(5％CO2，37℃)所选培养持续时间。培养板布局显示于图57中且通常实验方案显示于图58中。
收集上清液和针对细胞因子的评估。自孵育箱中取出培养板而不破坏培养板底部的细胞。在共培养12和18小时后，取出50μL上清液且转移至埃本多夫管(Eppendorf tube)或96孔U形板中。用另外两个96孔板重复此步骤，以产生两个备用培养板。标记培养板以鉴别样本。备用培养板储存于-80℃。将每个96孔板用粘合密封件来密封且储存在4℃直至使用。使用ELLA平台评估上清液的IFN-γ和颗粒酶B。可进行另外的流式细胞术实验以评估如本文所描述的所关注标记物，例如CD25、CD69、CD134、CD137或CD150。
结果。22个TIL样本的结果显示于图59至图97中。除了样本007-016(进行一次，除了在1:3比率条件下使用Raji和K562细胞一式两份地进行以外)、样本019-006(在所有条件下一式两份地进行)，以及022-001(在所有条件下进行一次)，所有实验均一式三份地进行。显示了12小时和18小时共培养期的IFN-γ和颗粒酶B结果，且显示了18小时共培养期的TNF-α结果。结果表明，该检测对于各种TIL样品具有令人惊讶的良好性能，包括与K562阴性对照细胞株一起使用时，显示IFN-γ和颗粒酶的产量成倍增加，并证明共培养系统用于通过同种异体MHC-TCR接合活化TIL，并在Gen 2制造、冷冻保存和解冻之后提供对TIL产物的效力的量度。该测定在本质上是多功能的，从而允许以高效方式选择一种分析物或分析物组合。通常，当考虑IFN-γ和颗粒酶B时，18小时共培养时间点是较稳健的时间点。也可在12小时时间点评估TNF-α且若适合则利用TNF-α。在此实施例中，1:3(TIL:目标)比引起最大细胞因子分泌。TNF-α在TIL：目标细胞比率范围内的剂量反应出人意料地显著。TIL：目标细胞比率可以增加，例如增加至1:5、1:10或1:20。
实施例17：复苏时间评估
在此实施例中，研究冷冻TIL产物的解冻后的复苏时间。也为本发明的一个实施方案的实验方案描绘于图98中。使用Gen 2过程制备的五个研究TIL批次解冻且在解冻之后复苏72、48或24小时，且使用实施例16中所描述的方法在与Raji和K562细胞以1:3TIL：目标细胞比率共培养后评估IFN-γ和颗粒酶B。图99中显示关于批次M1173的结果，图100显示关于批次M1152的结果，图101显示关于批次M1187的结果，图102显示关于批次M1179的结果，图103显示关于批次M1183的结果。IFN-γ的结果概述于图104和105中，颗粒酶B的结果概述于图106和107中。IFN-γ的全部三个读数(绝对值、相对于TIL的倍数和相对于TIL加上K562细胞的倍数)在复苏条件下是类似的。对于颗粒酶B分泌，72小时的TIL复苏导致TIL加Raji相对于TIL加K562的倍数诱导更大。在24小时复苏样本中观测到降低的细胞产率和存活率。
实施例18：主细胞库准备
在此实施例中，主细胞库是针对Raji和K562细胞株准备的。此类主细胞库适用于供人类使用的TIL、MIL或PBL产物的放行和/或稳定性测试的测定，其中此类产物由例如美国食品和药物管理局等卫生当局监管。首先使用25个小瓶进行前导研究，然后评估其在本发明的一种以上效力测定中的表达。然后使用500个小瓶制备Raji和K562细胞株的主细胞库，每小瓶含有在5×106与5×106之间的细胞，每小瓶体积为1mL。必要时进行细胞培养扩增。然后进行表征和放行，包括直接接种测试方法适用性、通过直接接种测试无菌性、通过DNA扩增快速检测支原体的干扰测试、通过DNA扩增快速检测支原体、或体外外来病毒测定检测(细胞株MRC-5、Vero和HeLa、病毒PIV-5)，以及通过细胞色素C氧化酶亚基1进行鉴定。准备分析证书和批次记录。Raji和K562细胞株随后经适当限定，以适用于方法验证和测试程序。可以类似地制备用于Ramos、U937、Thp1和Daudi细胞的主细胞库。
实施例19：使用THP1细胞的同种异体反应性共培养测定
在此实施例中，展示了使用TIL与Thp1(也称为THP-1)目标细胞株(人类单核细胞白血病细胞株)的共培养物的同种异体反应性共培养测定的实施方案。不受理论束缚，据认为TIL活化是在TCR对Thp1细胞表面不匹配的肽-MHC复合物(MHCp)的同种异体识别时诱导的，如图108中所示。该测定的读数是目标细胞的杀伤，其可以通过报告化学发光蛋白的释放来检测。该测定需要使用在GMP条件下产生的目标细胞株以产生主细胞库和工作细胞库，例如，如本文别处所描述。目标细胞经工程改造以稳定表达用(ePL)标记的管家蛋白，其是一种β-gal酶片段。在与T细胞(包含TIL、MIL或PBL)共培养后，并在细胞毒性介导的膜破裂后，ePLβ-gal片段被释放至培养基中。共培养后，添加β-gal酶的酶受体片段，形成活性β-gal酶，其水解添加的底物，产生与死目标细胞数目成比例的化学发光信号。读数特定于目标细胞死亡并直接测量目标细胞死亡，例如，Thp1或Raji细胞的细胞死亡。前述过程在图109中说明。该测定的作用机制是同种异体反应(例如，混合淋巴细胞反应，或MLR)，例如T细胞识别肽-同种异体MHC复合物的能力。
使用两种TIL解冻后条件(从冷冻的TIL批次开始)测试经基因修饰的Thp1细胞株：(1)解冻后静置过夜18至24小时，(2)解冻后不静置。测试的效应子：目标细胞(E：T)比率对于第一个条件为35:1至2.5:1，对于第二个条件为10:1至1:10。两种条件使用每孔10,000个目标细胞。测试的共培养持续时间对于第一个条件是4小时、8小时、16小时和36小时，对于第二个条件是过夜(16至24小时)。通过第一个条件的剂量和时间依赖性反应以及第二个条件的剂量依赖性反应观察细胞毒性。图110显示了第一个条件的结果。显示的数据是3次实验的平均值。图111显示了第二个条件的结果。对于该两种条件，0％细胞毒性信号对应于无效应细胞，100％细胞毒性信号对应于完全裂解的目标细胞。
实施例20：在共培养期间使用IL-2的TIL效力方法
在此实施例中，相较于如上文所描述且如图112中说明为实施方案A的最初添加了3000IU/mL IL-2的CM1培养基，使用在共培养期间连续添加了300IU/mL IL-2的AIM-V培养基(如在图112中说明为实施方案B、C、D和E)进一步评估本发明的效力方法。实施方案B、C、D和E包括在共培养期间添加含300IU/mL IL-2的AIM-V，其匹配最终Gen 2和Gen 3产物制剂的实施方案且提供较好系统适用性。AIM-V培养基不含血清，以匹配最终的细胞扩增，并提供更好的系统适用性。在共培养期间添加IL-2会增加细胞因子浓度。解冻后立即开始共培养(即TIL复苏没有静置期)也可能提供优势，因为它更接近地代表给药时的TIL药品。较长的静置时间会促进TIL的复苏，但可能无法表明稳定性，还可能掩盖制造工艺的故障。
图113显示了两种不同TIL细胞株M1179和M1183在不同共培养基条件下的总活细胞计数(TVC)和存活百分比的评估结果，作为TIL细胞株解冻后静置期的函数。在前24小时期间观测到存活百分比降低，且在静置>24小时(约1倍/天)的TIL中观测到TVC和增殖增加。这些结果表明，静置24小时后复苏的TIL可能不代表药品的相同细胞群。对于该两种TIL细胞株，在解冻后观测到轻微的减少，然后开始复苏。
在存在和不存在300IU/mL IL-2下与Raji和K562细胞共培养的比较结果在表51、图114和图115中给出。在TIL株M1179和M1183解冻后立即在AIM-V培养基中进行实验(即没有静置期)。结果表明，添加IL-2可增强IFN-γ分泌。IFN-γ的绝对浓度值和倍数变化随着添加IL-2而增加。观测到IL-2增加了使用单独的TIL进行的对照的基线。在这些实验中，对共培养复制品的可重复性进行了评估。获得了单个小瓶变异系数(CV)％为11％。
表51.使用两种TIL细胞株在存在和不存在300IU/mL IL-2的情况下Raji与K562共培养实验的结果。
也探索了不同的培养条件和静置期，结果在表52、图116和图117中给出。结果显示当AIM-V和IL-2用于共培养基中时，不需要72小时的复苏即可获得良好的IFN-γ分泌。
表52.两种TIL细胞株(M1179和M1183)在不同培养基培养条件下的Raji和K562共培养实验结果，包括在TIL解冻后不静置(”0小时静置“)；在具有300IU/mL IL-2的AIM-V培养基中静置72小时后(”AIM-V+IL2中静置72小时“)；在具有300IU/mL IL-2的CM1培养基中静置72小时后(”CM1+IL2中静置72小时“)；在不含300IU/mL IL-2的CM1培养基中静置72小时后(”在CM1-IL2中静置72小时“)。
进行用于测定在解冻后复苏期延长时的细胞因子分泌效果的实验，结果概述于表53、图118和图119中。在这些实验中，静置培养基为具有3000IU/mL IL-2的CM1，共培养基为具有300IU/mL IL-2的AIM-V。在与Raji细胞共培养的所有条件下检测到绝对IFN-γ分泌。在所有静置条件下，IFN-γ相对于单独的TIL的倍数变化是一致的。在大于24小时的时间点观测到单独的TIL与使用K562阴性对照之间倍数变化的差异，这可能表明细胞群的变化。
表53.用不同的TIL解冻后复苏期的两种TIL细胞株(M1179和M1183)进行的Raji和K562共培养实验的结果。
进行流式细胞术分析以确定72小时时间段内的细胞群特征。在两个实验中进行时间研究，如表54和表55中所提供。
表54.实验1设计。
表55.实验2设计。
按照这些设计，将细胞以1×106/mL的浓度接种在24孔板中，并在37℃和5％CO2下静置。在每个特定时间点+/-1小时收集细胞。在每个时间点进行存活率和TVC。使用具有FMO对照的合格残留流测定法(qualified residual flow assay)对细胞进行染色，并在同一天采集的情况下在BD FACSCanto流式细胞仪(美国新泽西州富兰克林湖的BDBiosciences，Inc.)上采集这些细胞。结果概述于表56和表57中，其中对来自实验1和实验2的AIM-V+IL2结果取平均值。
表56.T淋巴细胞群在静置条件下(0至72小时，IL-2和血清)变化。
结果显示，在所有培养基中，72小时内，总细胞群中的CD45+细胞群百分比和CD3+细胞群百分比与IL-2一致。然而，在所有条件下静置24小时后，活群的CD45+和CD3+群百分比降低了约50％。在静置超过24小时的情况下，结果因培养基条件(IL-2、血清)而异。
表57.残余细胞(B细胞、NK细胞和单核细胞)在静置条件(0至72小时、IL-2和血清)之间有所变化。
观测到残余细胞群随着解冻后静置时间的延长而增加。例如，在没有IL-2的情况下，B细胞群在静置72小时后增加了约20％，而NK细胞在静置24小时后增加了4-5％。药品的平均残余细胞群通常<1％。
图120显示了TIL株M1179的亲本活体群的残余细胞群的流式细胞术分析。图121和122分别显示了Raji和K562细胞株的增殖概况。
总的来说，与不含IL-2的培养基相比，在共培养中添加300IU/mL的IL-2会增加细胞因子信号和IFN-γ的倍数变化。在静置24小时之后，观测到共培养中的细胞群在CM1培养基中发生变化(包括生长、分化和异质性)，因此在解冻后和开始共培养测定之前，TIL静置72小时会使此版本测定对制造工艺失效的敏感性较低，因为产物能够在复苏期间复苏和扩增。AIM-V和IL-2更适合于Gen 2和Gen 3TIL产物的矩阵适用性。由于有干扰，在配体结合测定中不推荐使用血清。
实施例21：黑色素瘤TIL细胞株与RAJI、THP1、RAMOS和U937目标细胞的同种异体反应性共培养测定
本实施例探讨了多种目标细胞株(包括Raji、Thp1、Ramos和U937目标细胞株)在本发明的效力测定中的使用，包括与K562细胞株阴性对照一起使用。实验方案概述于图123中。
共培养系统用于通过同种异体MHC-TCR接合活化TIL。评估了四种研究性黑色素瘤Gen 2TIL产物在与Raji、Ramos、Thp1和U937细胞以及K562细胞以3:1、1:1和1:3的比率(TIL与肿瘤细胞的比率)共培养后的IFN-γ和TNF-α。结果显示于图124至图129中。TNF-α和IFN-γ的细胞因子分泌和倍数诱导在所评估的肿瘤细胞中存在差异。通常，这里选择的四种TIL细胞株对肿瘤株的反应性自最大至最小如下：Thp1、U937、Raji和Ramos。相较于单独的TIL或K562细胞，四个所评估的Gen 2TIL株中的两者对Raji细胞作出反应而分泌相似量的IFN-γ，在U937或Thp1存在下共培养时分泌更多的细胞因子。观测到在没有TIL的情况下共培养时，Raji、Ramos、Thp1和U937细胞分泌TNF-α，但K562细胞不分泌TNF-α。肿瘤株分泌的TNF-α的量在不同株中有所不同且随肿瘤细胞数目增加而增加，其中在此实施例中在1:3下观测到最显著作用。
用于本发明的效力测定的示例性目标细胞株的HLA特性提供于表58中。通过使用这些细胞株和本领域中已知的其他合适的目标细胞株可以获得不同程度的HLA多样性和/或免疫原性。
表58.示例性效力测定目标细胞株的HLA-A、HLA-B和HLA-C特性。
| 肿瘤株 | HLA-A | HLA-B | HLA-C |
| Raji | 03:01，03:01 | 15:10，15:10 | 04:01，03:04 |
| Ramos | 03:01，03:01 | 44:03，51:01 | 16:01,16:01 |
| Daudi | 66:01，01:02 | 58:01，35:01 | 03:02，06:02 |
| THP-1 | 02:01；24:02 | 15:11，35:01 | 03:03 |
| U937 | 03:01，31:01 | 18:01，51:01 | 01:02，07:02 |
图134概述了四种所测试的黑色素瘤TIL细胞株的不同目标细胞株和细胞株组合的IFN-γ效能。
图135显示，对于黑色素瘤TIL细胞株M1152、M1187、M1198和M1200，所测试目标细胞株和阴性对照细胞(包括目标细胞株组合)的TNF-α分泌(pg/mL)。对于相同的四个黑色素瘤TIL细胞株，图136显示了作为(TIL+肿瘤细胞株或组合)/(单独TIL)的倍数变化形式的TNF-α分泌，图137显示了作为(TIL+肿瘤细胞株或组合)/(TIL+K562)的倍数变化形式的TNF-α分泌。
图138显示了对于黑色素瘤TIL细胞株M1152、M1187、M1198和M1200，所测试的目标细胞株和阴性对照细胞(包括目标细胞株组合)的颗粒酶B分泌(pg/mL)。对于相同的四个黑色素瘤TIL细胞株，图139显示了作为(TIL+肿瘤细胞株或组合)/(单独TIL)的倍数变化形式的颗粒酶B分泌，而图140显示了作为(TIL+肿瘤细胞株或组合)/(TIL+K562)的倍数变化形式的颗粒酶B分泌。
结果证明了不同目标细胞株以及它们的组合在评估TIL效力中的有效性。
实施例22：非小细胞肺癌TIL细胞株与RAJI、THP1、RAMOS和U937目标细胞的同种异体反应性共培养测定
使用图141的实验方案，使用不同的目标细胞株和目标细胞株的组合来评估十个非小细胞肺癌(NSCLC)TIL细胞株。
十个NSCLC TIL细胞株中有四个是自商业来源的供体肿瘤生长的研究细胞株。来自这四个TIL细胞株的结果显示于图142至图144中。
在用Iovance Biotherapeutics,Inc.赞助的抗PD-1抗体治疗之后的NSCLC患者中的TIL疗法的非注册研究中，十个NSCLC TIL细胞株中的其他六个获自临床试验参与者的临床细胞株。来自这六个TIL株的结果显示于图145至147中。
关于IFN-γ分泌的临床NSCLC结果的概述呈相对于单独TIL的倍数形式显示于图148中，关于IFN-γ分泌的临床NSCLC结果的概述呈相对于与K562阴性对照细胞共培养的TIL的倍数形式显示于图149中。
19个批次(包括此实施例的十个NSCLC批次和九个黑色素瘤批次)的概述呈相对于单独TIL的倍数形式显示于图150中，IFN-γ分泌的概述呈相对于与K562阴性对照细胞共培养的TIL的倍数形式显示于图151中。
实施例23：经辐照目标细胞与未经辐照目标细胞的比较
通过观测增殖(总活细胞)、使用实施例20中所描述的使用300IU/mL IL-2和AIM-V培养基的共培养方法的IFN-γ分泌和流式细胞测量术特性(包括依据散射和细胞表面标记物以及针对细胞凋亡的磷脂结合蛋白V染色的形态)来比较经辐照的Raji和K562细胞与未经辐照的Raji和K562细胞。使用X-Rad 160辐照器(美国康涅狄格州北布兰福德的Precision X-ray)在30cm处5000rads和420rads/min的条件下进行辐照。
图152显示在24小时的共培养时间内，Raji和K562细胞的辐照对增殖的影响通常最小。在24小时培养中，经辐照的Raji细胞在各浓度下的增殖增加了18至27％。在24小时培养中，未经辐照的Raji细胞在不同浓度下的增殖增加了2％至14％。在24小时培养中，经辐照的K562细胞在各浓度下具有15％减少至8％增加的变化。在24小时培养中，未经辐照的K562细胞在各浓度下的增殖增加了14至34％。
图153显示了，使用所测试的两个子宫颈癌TIL批次，发现相比用未经辐照的Raji细胞刺激，在用未经辐照的Raji细胞刺激时TIL细胞株会分泌更大浓度的IFN-γ。
表59和图154中的流式细胞术结果表明，观测到辐照会减少两种监测的细胞表面标记物以及HLAI类表达。
表59.辐照对细胞表面标记物和HLA I类表达的影响。
结果表明，未经辐照的Raji和K562细胞的增殖在24小时(适用于进行效力测定的共培养期)内可以忽略不计。24小时内未经辐照的Raji细胞的增殖(<14％)小于经辐照Raji细胞的增殖(<27％)，因此辐照在24小时培养期内对Raji细胞和此处使用的TIL细胞株的增加的增殖具有极小影响。相较于未经辐照，IFN-γ分泌在辐照条件下减少，其通常与经辐照的Raji细胞上HLA-ABC的下调相关(以MFI计为-26％)。通过流式细胞术，使用正向散射观测对比侧向散射观测，也观测到辐照会诱导K562和Raji两者的形态变化。最后，与未辐照条件相比，使用Raji细胞的辐照条件增加了晚期细胞凋亡且其在K562的所有细胞凋亡阶段中均有所增加，如通过磷脂结合蛋白V染色所观测。
总体而言，结果表明，未经辐照的Raji和K562细胞可用于本发明的效力测定，或者，仅Raji(或其他目标细胞)可经辐照，或仅K562细胞可经辐照。
实施例24：共培养条件的评估
使用实施例20中所描述的利用300IU/mL IL-2和AIM-V培养基的共培养方法，其中使用未经辐照的Raji目标细胞、以1×106至2×106个TIL/孔范围内的密度接种的TIL和特定于1:1和3:1比率的中点的浓度范围的Raji细胞(500,000个细胞)。一式三份地评估18、24和30小时的三个共培养期的IFN-γ释放。结果在表60和图155中给出。
表60.辐照对细胞表面标记物和HLA I类表达的影响。以”M“、”L“和”C“开头的TIL批次分别代表黑色素瘤、NSCLC和子宫颈TIL细胞株。
结果显示，在30小时时无信号饱和迹象，且相对于TIL值的倍数变化对时间点相对不敏感。来自单独的TIL的IFN-γ信号在30小时显示出最小的增加。
实施例25：肿瘤目标细胞株的比较
使用整体上在实施例20中所描述的利用300IU/mL IL-2和AIM-V培养基的共培养方法，在此实施例中进行肿瘤目标细胞株的另外比较。使用未经辐照的Thp1、U937和Raji细胞株。基于本文所提供的教导内容，可使用其他方法、肿瘤目标细胞株和阴性对照进行类似比较。图156显示用于研究十二个黑色素瘤TIL细胞株的实验设计。表61概述用于每个实验的TIL和目标细胞的数目。
表61.用于实验设计的每孔TIL和目标细胞的数目和每孔总活细胞(TVC)。
图157中概述了1.0×106个TVC/孔的结果(单独的TIL作为对照)，图158中概述了2.0×106个TVC/孔的结果(单独的TIL作为对照)，图159中概述了1.0×106个TVC/孔的结果(K562细胞作为对照)，图160中概述了2.0×106个TVC/孔的结果(K562细胞作为对照)。通常，使每孔总TIL增加会增强IFN-γ信号。对于所测试的大部分TIL批次，3:1比率显示所测试的所有三种肿瘤细胞株的IFN-γ的最大信号。发现此研究中的最优接种密度为约2×106(TVC/孔或每孔总细胞)。通常，Thp1出人意料地需要更少的TIL细胞和更低的TVC来诱导稳定的IFN-γ信号。
还进行了野生型和经基因修饰的Thp1(也称为THP-1)细胞的比较。经基因修饰的Thp1细胞可用于杀伤测定，如实施例19中所描述。执行图161中所示的实验程序。关于七个TIL细胞株的以pg/mL为单位的IFN-γ的绝对值的结果显示于图162中，关于相对于单独TIL的倍数变化的结果显示于图163中。结果表明，野生型和经基因修饰的Thp1在使用共培养方法时表现相似，并且均可用于分析TIL样本，其取决于是否要测量IFN-γ或其他细胞因子，或者是否要测量通过发光进行的细胞杀灭(使用如本文别处描述的或本领域已知的基因修饰)。
实施例26：使用HLA阻断抗体的阴性对照
代替K562细胞的使用、目标细胞的基因剔除或其他基于细胞的阴性对照或除了使用K562细胞、目标细胞的基因剔除或其他基于细胞的阴性对照以外，本发明的共培养测定也可以通过使用HLA阻断抗体的阴性对照来补充或支援。此实施例展示了HLA阻断抗体的使用。不受理论束缚，所提出的本发明测定中的HLA阻断描绘于图164中。
此实施例中所用的HLA-I阻断抗体是获自Biolegend，Inc.(美国加利福尼亚州圣地亚哥)的克隆W6/32(抗HLA-ABC)并且呈超叶纯化版本。此实施例中所用的HLA-II阻断抗体是获自BD Biosciences，Inc.(美国新泽西州富兰克林湖)的克隆TU39(HLA-DR、DP、DQ)并且呈功能级版本，不含叠氮化物且内毒素含量低(≤0.01EU/μg(≤0.001ng/μg))，其以不含防腐剂的缓冲水溶液形式提供并经过0.2μm无菌过滤。
通常实验程序如下。接种目标细胞加上HLA I类和/或II类抗体，且孵育至少1至2小时，随后添加TIL。TIL：目标细胞比率为3:1(1.5×106个TIL至5×105个目标细胞)，但初始实验以1:1TIL：目标细胞比率进行。每种条件一式三份地进行。将目标细胞解冻且再悬浮于AIM-V中，并且用NC200或K2细胞计数器计数。将细胞以1×106在1mL具有300IU/mL IL-2的AIM-V培养基中接种至48孔板中。按下列段落中提及的浓度立即添加HLA阻断抗体(在1-20μg/mL的范围内；储备浓度为1mg/mL)。将细胞在37℃下孵育24小时。接着收集细胞并用磷酸盐缓冲盐水洗掉未结合的抗体。如下文所指示，针对HLA抗体结合或细胞凋亡对细胞染色，并在BD FACSCanto II流式细胞仪(美国新泽西州富兰克林湖的BD Biosciences，Inc.)上进行分析。
首先评估HLA-I和HLA-II阻断抗体对测定目标细胞存活率的影响。添加HLA-I阻断抗体至如上文所描述的Thp1和U937细胞的培养物以及关于用固定活/死活力染料染色细胞的另一步骤的结果显示于图165中。结果表明存活率无损失。类似地，添加HLA-II阻断抗体至如上文所描述的Thp1和U937细胞的培养物以及同样关于用固定活/死活力染料染色细胞的另一步骤的结果显示于图166中，且也表明存活率无损失。在图167中，观测到Raji野生型细胞在添加抗HLA-II抗体和活/死活力染色后显示出活力损失。然而，未表达HLA-I的RajiB2M(β-2微球蛋白)基因剔除细胞株(美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥瑞奇)在添加抗HLA-II抗体和用活/死活力染料染色后未显示出相同效应。
使用前述通用程序，接着评估HLA-I和HLA-II阻断抗体对TIL存活率的影响。在对7AAD和磷脂结合蛋白V染色之后，通过流式细胞术检测细胞凋亡：通过7AAD+磷脂结合蛋白V-检测坏死细胞；通过7AAD+磷脂结合蛋白V+检测晚期凋亡细胞；通过7AAD-磷脂结合蛋白V+检测早期凋亡细胞；通过7AAD-磷脂结合蛋白V-检测活细胞。结果显示于图168、169和170中。对于三种不同的TIL细胞株，在与HLA I类和II类阻断抗体共培养的TIL中未观测到毒性。
针对与1×106个TIL/1mL的目标细胞浓度相比浓度为0至20μg/mL的Thp1和U937细胞株进行用以评估HLA-I和HLA-II抗体的浓度的滴定实验。通过使用表62中的试剂，用与阻断抗体属于相同克隆的荧光团结合抗体染色细胞来分析HLA抗体的结合。
表62.用于HLA结合研究的小组。
| 染色剂 | 荧光团 |
| CD45 | PerCP-Cy5.5 |
| CD19 | APC-H7 |
| CD47 | APC |
| HLA-I(W6/32) | BB515 |
| HLA-II(TU39) | PE |
结果显示于图171中。流动抗体的结合损失(如通过平均荧光强度或MFI所报告)表明阻断抗体所占据的结合位点的量。图171中的红色虚线表示荧光减一级。
具有HLA-I和HLA-II阻断抗体的TIL培养物的IFN-γELLA结果显示于图172中。图172中的顶部图描绘了在孵育18小时之后具有1×106个TIL的培养物的结果，而底部图描绘在孵育24小时之后来自1.5×106个TIL的结果。结果也表明，HLA-II阻断抗体对TIL细胞株的影响在5μg/mL下不太明显。
使用HLA-I、HLA-II或两种阻断抗体作为阴性对照的本发明的效力测定的某些实施方案说明于图173中，此方法的关于IFN-γ的绝对值的结果显示于图174至图178中，并且关于相对于单独TIL的倍数增加的结果显示于图179至图183中。使用HLA-I、HLA-II或两种阻断抗体作为阴性对照的本发明的效力测定的其他实施方案说明于图184中，此方法的关于IFN-γ的绝对值的结果显示于图185至图189中，并且关于相对于单独TIL的倍数增加的结果显示于图190至图194中。结果说明HLA-I和HLA-II阻断抗体作为阴性对照的有效性。用抗HLA-I(A、B、C)阻断导致在TIL与THP-1或U937目标细胞共培养时(类似于单独的TIL加抗HLA A、B、C抗体对照)终止IFN-γ分泌，且证明阴性对照可用于效力测定。用抗HLA-II(DP、DQ、DR)处理也会使自U937和THP-1目标细胞分泌的IFN-γ减少。单独的抗HLA-I处理(10μg/mL)足以下调通过U937和THP-1目标细胞诱导的TIL活化；然而，添加抗HLA-II作为阴性对照也表达良好。CD4+/CD8+比率在所评估的TIL细胞株中是可变的(参见关于图185至图194的图表说明)。HLA-I和HLA-II阻断对TIL的影响与CD4+和CD8+TIL的比率无关。添加HLA阻断抗体对TIL样本的毒性可以忽略不计，其也不会引起对培养物中单独的TIL的有害活化。RajiB2M细胞单独或与HLA-II抗体阻断组合也可用作有用的阴性对照。
在15种黑色素瘤TIL细胞株中进一步评估HLA阻断(I类和II类)作为阴性对照的有效性，以及本文所描述的效力测定对通过TCR复合物对TIL进行的MHC-肽活化的惊人特异性。图195显示使用抗HLA-I、抗HLA-II或两种阻断抗体作为阴性对照的本发明的效力测定的进一步实施方案。用10μg/mL HLA I类(抗HLA A、B、C)和/或+/-5μg/mL HLA II类(抗HLADP、DQ、DR)阻断抗体预处理肿瘤细胞株1至2小时。全部使用Gen 2过程生产的15种黑色素瘤TIL细胞株与未经辐照的Raji、Rajiβ2M KO、THP1和U937肿瘤细胞以3:1TIL：目标细胞比率在2×106个TVC下共培养24小时。
关于U937的结果概述于图196中，关于Thp1的结果概述于图197中。用抗HLAA、B、C抗体阻断导致在TIL与THP-1或U937共培养时(类似于单独的TIL加抗HLAA、B、C对照)终止IFN-γ分泌。发现单独的抗HLAA、B、C处理(10μg/mL)足以终止U937和THP-1诱导的TIL活化。用抗HLADP、DQ、DR抗体(5μg/mL)处理引起：THP-1细胞中IFN-γ的分泌减少，但未达到抗HLAA、B、C阻断的程度；以及完全阻断U937细胞中的IFN-γ分泌，类似于用抗HLA A、B、C阻断。CD4+/CD8+比率在所评估的TIL细胞株中是可变的。HLAI类和II类阻断的作用与CD4+/CD8+细胞的比率无关，表明TIL在与同种异体肿瘤细胞株共培养时的活化不受HLA限制。使用HLA阻断终止IFNγ分泌表明，非自体肿瘤细胞株诱导的TIL活化是通过TCR-HLA接合直接介导的。
实施例27：单核细胞株测定数据的平行线分析
在此实施例中，平行线分析的使用被证明用于作为本发明实施方案的若干测定和测定条件。此研究使用了六个黑色素瘤TIL批次：M1150A、M1164、M1174、M1163、M1169和M1218。针对两个目标细胞(U937和Thp1细胞)中的每一个，以七种目标细胞浓度(1e6、5e5、2.5e5、1.25e5、6.25e4、3.13×104或3.13e4、1.56×104或1.56e4)测试了各TIL批次的七种浓度(2×106或2e6、1.5×106或1.5e6、1×106或1e6、5×105或5e5、2.5×105或2.5e5、1.25×105或1.25e5和6.25×104或6.25e4)。进行统计分析以确定测定方法的最优TIL浓度。使用四参数逻辑(4PL)分析测定Hills斜率、范围和EC50。平行线分析(PLA)用于回归(线性)。
PLA方法的细节可见于文献中，包括USP第<1032>章《生物测定的设计和开发》。USP药典公约：马里兰州罗克维尔，2013；USP第<111>章《生物测定的设计和分析》。美国药典公约：马里兰州罗克维尔，2014USP第<1033>章《生物测定验证》。USP药典公约：马里兰州罗克维尔，2013；USP第<1034>章《生物测定分析》。美国药典公约：马里兰州罗克维尔，2013；Hauck等人，PDA《药物科学与技术杂志》2005，15(3)，437-463；Callahan和Sajjadi，《生物过程杂志》2003，2(2)，71-77；Findlay等人，《药学与生物分析期刊》2000，21，1249-1273；和Gottschalk和Dunn，《生物药物统计期刊》2005，15(3)，437-463，这些文献中的每一篇的公开内容以引用的方式并入本文中。
为了确定TIL产物对两种目标细胞株(U937和Thp1)的刺激条件，考虑两种非限制性因素：(i)在剂量曲线的线性部分上具有最大数目的浓度的可重复性和线性，和(ii)IFN-γ的最大信号，其可能也导致最优信杂比。IFN-γ依据针对Thp1(图198)和U937(图199)的有效TIL浓度来测量。对于所有6个TIL批次，均观测到与目标浓度相关的信号显著减少。仅1.5×106和2.0×106TIL浓度显示出剂量反应，其中超过四(4)种浓度的目标细胞浓度在线性范围内。U937显示出比Thp1更高的IFN-γ信号和更大的信杂比。
图200和图201显示使用测定法的六个黑色素瘤TIL细胞株的剂量反应曲线。1.5×106或2.0×106的TIL浓度提供用于测定方法中的可接受结果。其基于线性剂量曲线提供了增加的信号、更好的信杂比和更大数目的目标浓度。图202显示在1.5×106个细胞的TIL浓度下使用U937目标细胞对六个TIL批次的平行线分析，发现所有六个TIL均显示出对此目标细胞株的明确剂量反应。在图203中，显示了使用Thp1目标细胞在相同条件下对相同六个TIL批次的平行线分析，其中只有TIL M1173和TIL M1213显示出明显的剂量反应。图204和图205说明了阻断抗体在六个TIL批次中与抗HLA-I(10μg/mL)和抗HLA-II(5μg/mL)一起显示出对U937细胞的测定特异性。令人惊讶的是，U937细胞株的表达优于Thp1细胞株。对于给定的目标浓度，在测定方法的此实施方案中，与Thp1细胞相比，U937细胞提供更大的IFN-γ信号。U937细胞也在剂量反应曲线的线性部分上提供更大浓度。4点剂量曲线可与线性拟合一起使用，其中选择去除每条曲线的一个离群值并掩蔽曲线饱和度(如此将提供最终分析所需的曲线上的至少三个点)。可以进行筛选和去除离群值以及掩蔽曲线饱和度，如USP第<1032>章《生物测定的设计和开发》，美国药典公约：马里兰州罗克维尔，2013所描述般进行，其公开内容以引用的方式并入本文中。另外，用Thp1细胞测试的TIL批次需要在较低浓度下进行掩蔽，才能在大多数TIL批次上呈线性，而U937细胞则没有此要求。Thp1细胞并不总是能解决上渐近线问题；因此，在使用Thp1细胞测试的TIL批次中可能无法定义上限范围。
实施例28：效力和身份测定矩阵
在此实施例中，展示了效力和身份测定矩阵的使用。效力和身份分析矩阵可用于TIL、MIL和PBL产物的放行和稳定性测试，且可包括本文中描述为矩阵的组成部分的效力测定。示例性和非限制性测定矩阵在表63中给出，表63也为本发明的实施方案且可经修改以移除或添加矩阵的成员。在适当和/或需要的情况下，测定的精密度、准确度、特异性和线性均合格。
表63.示例性非限制性效力和身份测定矩阵。
本文例如实施例14至27中所描述的同种异体共培养测定用于评估TCR-HLA相互作用。表63中所示的矩阵呈现一个实施例，其使用U937或Thp1细胞结合针对阳性对照的相对效力和如实施例27和本文中其他处所描述的平行线分析方法。使用HLA阻断抗体的阴性对照用以证明在检核期间针对TCR-HLA相互作用的特异性且也可在常规测试期间用作相对效力量度与如本文所描述的阳性对照参考标准的替代方案。使用已知的TIL、MIL或PBL细胞株制备阳性对照，这些细胞株已为此目的进行存储和表征。
例如，使用U937共培养测定，使用以下程序。U937细胞来自ATCC，用于创建两层GMP细胞库(MCB，250小瓶和WCB，500小瓶)。WCB被制造为用于生物测定的即用型(RTU)GMP非生产库，其中将直接自小瓶解冻的细胞用于测定中，由此消除对细胞扩增的需要和相关的污染或变异风险。测试MCB的活细胞计数、存活百分比、身份、无菌性、支原体和体外外来病原(adventitious agent)。测试WCB的活细胞计数、存活百分比、无菌性、支原体和体外外来病原。在稳健性资格参数内评估了MCB和WCB对共培养效力测定的传代依赖性影响，结果发现没有显著差异。阳性对照TIL批次是根据GMP使用与临床TIL产品相同的Gen 2制造过程制造的，也将用作参考标准。在调配之后，将参考标准的整个药品填充至小瓶中，接着使用用于临床TIL药品制造的相同设备和程序以受控速率冷冻小瓶。将小瓶冷冻保存在气相液氮中。测试代表性小瓶的若干属性，包括无菌性、支原体、细胞计数、存活率、身份和效力，并确定TIL批次是否可用作参考标准。一旦合格，参考标准的一次性使用小瓶将被解冻，并在每次测定时与测试物一起进行测试。该测定在每孔1.5×106个TIL的限定设定值下评估TIL产物批次与参考标准TIL批次的相对效力，并以可靠且剂量依赖性方式对与U937细胞的四种剂量浓度(每孔4×105、2×105、1×105和0.5×105个细胞；在每个剂量浓度下一式三份)的持续24小时时间段的共培养作出反应。测量在各U937剂量浓度下自各复制物释放至上清液中的IFN-γ的浓度。ELLA系统(如本文其他地方所述)用于测量TIL产物和U937的共培养测定的活化后IFN-γ浓度。使用Simple Plex 72孔IFN-γ第3代第5版料筒(可自美国加利福尼亚州圣何塞的BioTechne，Inc.的ProteinSimple部门获得，目录号#SPCKB-CS-002697)。在共培养之前立即进行培养基的孵育和储存，以便随后测量分泌的IFN-γ。将上清液转移至三个重复的96孔板中并储存在<60℃。随后解冻培养板且针对IFN-γ进行测量。在每个经过商业验证的72孔料筒上筛选自共培养中收集的上清液以用于IFN-γ生产。按照USP<1032>，USP药典公约：马里兰州罗克维尔，2013进行数据分析。根据USP<1032>和USP<1033>《生物测定验证》，USP药典公约：马里兰州罗克维尔，2013对数据进行对数转换，以满足在效力范围内测量的对称性、正态分布和变异性均一性的要求。如USP<1034>《生物测定分析》USP药典公约:马里兰州罗克维尔，2013中所述，对离群值进行评估并自分析中省略。在四点剂量曲线上进行线性回归，其中由于曲线饱和而掩蔽最高或最低浓度(若需要)。根据USP<1032>，建议”使用至少三个，优选四个相邻的[剂量]浓度；要求线性段的斜率足够陡峭；并要求符合标准和测试样本的线是笔直的，并且线是平行的“。根据USP<1032>，在TIL测试物与RS之间进行平行线分析。通过平行度测量的参考标准与TIL测试物之间的统计相似性证明了TIL测试物与参考标准的生物学相似性。计算并报告平行度斜率比、线性比、回归(R2)和均方根误差(RMSE)。对平行度和线性的测定适用性和有效性进行排名并确定”通过“或”未通过“根据USP<1033>的限制内的有效性标准。作为耐受百分比范围的95％置信区间内的相对效力被确定为”可报告的“或”非决定性的”。根据USP<1032>，相对效力可能优于源自绝对值的效力，因为相对效力是一种消除生物样本固有的可变性和细胞行为随时间推移的影响的校准因子。最后，在每个U937细胞密度下报告预测的IFN-γ浓度。评估TIL在与U937细胞共培养中产生的绝对IFN-γ浓度与单独的TIL(未刺激)相比的倍数增加，以用作每个TIL批次的替代或另外的可报告值。使用来自JMP Statistical Discovery LLC(美国北卡罗来纳州卡瑞)的JMP软件进行分析，并进行适当的验证。本发明的其他测定细节和实施方案还提供于表64中。
表64.共培养方法条件和本发明的实施方案的示例性非限制性概述。
表63中所示的矩阵还包括正交活化测定，该测定使用由TIL响应于用抗CD3/CD28/CD137抗体包被的微珠进行的活化而分泌的IFN-γ的测量值。当TIL产物暴露于这些微珠时，抗体将结合CD3信号传导复合物内所含的CD3ε和T细胞共刺激受体CD28和CD137。使用抗CD3有丝分裂原抗体OKT3刺激TIL来评估TIL产物的功能，如Borovsky等人《生物化学杂志》2002，277，21529-36中所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。已知抗CD28活性会增强体外T细胞增殖和细胞因子产生。CD137(4-1BB)为肿瘤坏死因子家族的成员。激动性抗CD137抗体充当活化共刺激分子，对于效应和记忆T细胞尤其重要且促进T淋巴细胞存活和增殖。基于微珠的IFN-γ测定的设计因此意在通过利用与抗原特异性T细胞的生理再刺激和扩增有关的三个活化信号来模拟对由专业抗原呈递细胞进行的体内T细胞活化有反应的TIL细胞的生物活性。
总活细胞和活细胞百分比还包括在表63中。文献中活细胞总数是与TIL产物输注的客观肿瘤反应相关的参数。Seitter等人《临床癌症研究》2021，27，5289-98。细胞生存力是总活细胞计数固有的参数。细胞维持或恢复存活率的能力是TIL功能的必需前提条件，且对细胞存活率的证明因此充当额外的活性量度。这些参数对TIL产物效能的重要性得到了临床前研究以及在迄今为止已招募了数百名转移性黑色素瘤患者的研究中使用TIL疗法的大量临床经验的支持。在这些研究中，尽管研究人员已报导了客观肿瘤反应率与所施用的总活细胞之间存在统计学上显著的正相关，但在有反应者与无反应者之间的总细胞数分布中仍存在实质性重叠：Seitter等人《临床癌症研究》2021，27，5289-98；Goff等人《临床肿瘤学杂志》2016，34，2389-97。总活细胞计数和存活率百分比的示例性结果在表65中给出。
表65.临床黑色素瘤TIL批次的总活细胞和存活率百分比的概况统计数据。
| 属性 | N | 均值 | 标准偏差 | 最小值 | 中值 | 最大值 |
| 总活细胞 | 149 | 25.74 | 17.54 | 1.19 | 21.89 | 99.60 |
| 存活率(％) | 149 | 89.55 | 4.20 | 74.70 | 87.50 | 90.50 |
表63的矩阵中的谱系标记物包括总的活CD4+和CD8+细胞群、CD4+细胞百分比和CD8+细胞百分比，其通过流式动细胞测量术和细胞计数器测量。TIL由淋巴细胞(包括CD4+和CD8+ T细胞)的混合物构成。CD8+和CD4+ T细胞以可变比例存在于TIL产物中，且两种细胞谱系似乎均会促成抗肿瘤免疫反应。Topalian等人《免疫学方法杂志(J.ImmunologicalMethods)》1987，102，127-41；Andersen等人《临床癌症研究》2016，22，3734-45；Goff等人《临床肿瘤学杂志》2016，34，2389-97。CD8+ T细胞与肿瘤消退相关，而CD4+ T细胞对于免疫系统的功能至关重要，且通过促进CD8+ T细胞增殖和IFN-γ分泌来增强CD8+ T细胞功能。Shedlock和Shen，《科学》2003，300，337-9；Sun和Bevan，《科学》2003，300，339-42。Seitter等人分析了迄今为止已招募数百名转移性黑色素瘤患者的TIL治疗研究的综合数据，并显示客观肿瘤反应率与所施用的总活CD8+细胞之间存在统计学上显著的正相关，以及在有反应者与无反应者之间的总细胞数分布中存在实质性重叠。Seitter等人《临床癌症研究》2021，27，5289-98。不受理论束缚，具有CD8+和CD4+ T细胞群的TIL产物可能是过继细胞疗法最有利的产品，并且是最有可能具有临床功效的产品。临床黑色素瘤TIL批次的CD4+和CD8+表达的示例性结果在表66中给出。
表66.临床黑色素瘤TIL批次的CD4+和CD8+表达的概况统计数据。
1％CD8+和％CD4+细胞以CD3+细胞的百分比表示
表63还包括若干记忆标记物，总的活中枢记忆(TCM)和效应记忆(TEM)细胞群、TCM细胞百分比和TEM细胞百分比，其通过流式细胞术和细胞计数器测量。记忆T细胞以多个亚群形式存在，其迁移模式、功能能力和谱系关系不同。Farber等人《自然免疫学评论》2014，14，24-35；Sallusto等人，《免疫学年度评论》2004，22，745-63。主要亚群包括TCM细胞，其保留了向淋巴组织运输的能力；和TEM细胞，其迁移至外周组织部位。两个亚群均具有效应能力。通过流式细胞术将TEM细胞定义为CD45RA-CCR7-且将TCM细胞定义为CD45RA-CCR7+。TIL产物中的大部分细胞具有与高级功能一致的效应记忆T细胞表型。Goff等人《临床肿瘤学杂志》2016，34，2389-97。类似地，TEM细胞常常是由Gen 2过程在第22天样本中产生的TIL样本中的主要群，因为其在第22天过程中有效扩增。临床黑色素瘤TIL批次中TEM和TCM含量的示例性结果在表67中给出。
表67.临床黑色素瘤TIL批次的TEM和TCM细胞的概况统计数据。
1％TEM和％TCM细胞以CD3+细胞的百分比表示
具有LAG3表达的细胞的百分比还包括在表63的矩阵中，作为最终TIL产物中的耗竭标记物且因此作为效力标记物。通过流式细胞术测量LAG3表达。例如，LAG3水平通常由Gen 2过程上调。此上调与T细胞活化和效应功能相关，表明LAG3可能是用于监测的敏感且具有代表性的耗竭标记物。Annunziato等人《美国生物实验学学会联合会会刊(FASEB J.)》1996，10，769-76。临床黑色素瘤TIL批次的示例性统计数据在表68中给出。
表68.临床黑色素瘤TIL批次的LAG3表达的概括统计数据。
| 属性 | N | 均值 | 标准偏差 | 最小值 | 中值 | 最大值 |
| ％LAG3+ | 147 | 15.15 | 8.63 | 1.31 | 13.00 | 45.20 |
1％LAG3+细胞以CD3+细胞的百分比表示
这些临床数据集的LAG3表达的直方图显示于图206中。
具有KLRG1表达的细胞的百分比还包括在表63的矩阵中，作为最终lifileucel产物中的分化标记物且因此作为效力标记物。通过流式细胞术测量KLRG1表达。KLRG1是T细胞终末分化和衰老的标记物，显示为在记忆T细胞分化时下调。Henson等人,《血液》2009，113，6619-28；Herndler-Brandstetter等人，《免疫学》2018，48，716-729。临床黑色素瘤TIL批次的示例性统计数据在表69中给出。
表69.临床黑色素瘤TIL批次的KLRG1表达的概况统计数据。
| 属性 | N | 均值 | 标准偏差 | 最小值 | 中值 | 最大值 |
| ％KLRG1+ | 141 | 13.19 | 13.32 | 0.76 | 8.48 | 58.30 |
1％KLRG1+细胞以CD3+细胞的百分比表示
临床数据集的KLRG1表达直方图显示于图207中。
CD14+/CD19+/CD16+/CD56+流式细胞术测定可替代表63中所示的CD16+/CD56+测定以检测NK细胞、NKT细胞、B细胞和单核细胞。
本文所描述且并入表63的矩阵中的U937共培养物用于评估如上文所描述的临床黑色素瘤TIL批次的相对效力。结果显示于表70中，其中观测到若干批次没有表现出剂量依赖性反应，表明潜在的效力损失。
表70.临床黑色素瘤TIL批次的相对效力结果。
1批次未显示出剂量依赖性反应
表70的结果在图208中标绘为直方图，其中观测到对数正态分布。
可利用额外标记物和对应的流式细胞术测定，包括CD101+细胞含量测定、CD69+细胞含量测定、TSCM细胞含量测定、TEMRA细胞含量测定、Treg细胞测定含量、PD-1+细胞含量测定、TIM3+细胞含量测定、CD25+细胞含量测定、CD27+细胞含量测定、CD28+细胞含量测定、CD56+细胞测定含量、CTLA-4+细胞含量测定、TIGIT+细胞含量测定和/或CD57+细胞含量测定。TIL产物在Gen 2制造工艺期间再生的某些标记物的统计显著性描述于Simpson-Abelson等人，《肿瘤学年鉴(Ann.Oncol.,)》，2020，31，S720和Simpson-Abelson等人，《Iovance第2代肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)产物在制造工艺内再生(Iovance Generation-2Tumor-infiltratingLymphocyte(TIL)Product Is Reinvigorated During the Manufacturing Process)》，ESMO大会，2020年9月19日至21日，海报1053P，每篇参考文献的公开内容均以引用的方式并入本文。
实施例29：使用U937细胞扩增TIL产物
经辐照的U937细胞可用作人工抗原处理细胞(aAPC)，用于Gen 2过程或类似过程的REP阶段(或Gen 3或类似过程的启动阶段，或经基因编辑TIL过程和经选定TIL过程中的类似阶段)。将三个黑色素瘤预REP TIL批次解冻，并使用如本文别处所描述的程序(例如实施例6)与经辐照的U937细胞或同种异体PBMC饲养细胞(三个供体)以及抗CD3(OKT-3)一起孵育11天且针对扩增进行评估。结果示于图209中。U937细胞能够诱导TIL细胞的扩增。在刺激CD3和CD28微珠后，TIL分泌IFN-γ作为反应，如图210中所示，表明其能够活化。使用U937细胞作为aAPC可支持较低频率TCR克隆的生长或保存，如通过TCR贮库分析(例如针对独特CDR3结构域)评估。在本发明的一些实施方案中，通过使用U937 aAPC(包括经基因修饰的U937 aAPC)使用Gen 2、Gen 3或本文所描述的其他方法扩增的TIL、MIL或PBL可显示较低频率TCR克隆的生长增加或保持。
***
提供上文所示的实施例以向本领域中通常本领域技术人员提供如何制得和使用本发明的组合物、工艺、测定、系统和方法的实施方案的完整公开内容和描述，且并不意在限制本发明人视作其发明的范围。对于本领域技术人员来说显而易见的用于进行本发明的上述模式的修改旨在落入所附权利要求的范围内。说明书中提到的所有专利、专利申请和出版物均表明了本发明所属领域技术人员的技术水平。
所有标题和章节名称仅用于清晰和参考目的，且不应视为以任何方式具限制性。例如，本领域技术人员应了解根据本文所描述的本发明的精神和范围按需要组合来自不同标题和章节的各种方面的有用性。
本文引用的所有参考文献特此通过引用整体并入本文并用于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请被具体且单独地指示为通过引用整体并入用于所有目的。
在不脱离本申请的精神和范围的情况下，可以对本申请进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文描述的具体实施方案和实施例仅以示例的方式提供，并且本申请仅由所附权利要求的权项以及权利要求所赋予的等同物的完整范围来限制。
Claims (58)
1.一种确定TIL的效力的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将目标细胞与TIL细胞进行持续第一时间段的共培养；
b.由所述共培养获得收集物或萃取上清液；以及
c.评估(1)所述收集物中所述TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)所述上清液中所述TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定所述TIL的所述效力。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括以下另外的步骤：
d.将包含(i)阴性对照细胞的阴性对照与所述目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，或将包含(ii)人类白细胞抗原(HLA)阻断抗体的阴性对照与所述TIL细胞和所述目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养，所述第二时间段可选地与所述第一时间段同时发生；
e.由所述第二次共培养获得第二收集物或萃取第二上清液；
f.评估(1)所述第二收集物中所述TIL细胞上一种以上标记物的表达或(2)所述第二上清液中所述TIL细胞分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；以及
g.将来自步骤c的所述一个以上观测值与来自步骤f的所述一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值或观测值集合与对应的对照值或对照值集合进行比较，以确定所述TIL的所述效力。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中，所述TIL选自下组：肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)产物、骨髓浸润淋巴细胞(MIL)产物或外周血淋巴细胞(PBL)产物，所述方法可选地进一步包括将冷冻保存的TIL产物、MIL产物或PBL产物解冻的步骤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述TIL为来自人类的TIL产物，所述TIL产物通过切除肿瘤或破碎或消化肿瘤而获得，并且所述TIL产物通过包括快速扩增方案步骤的TIL扩增过程制造。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括放行所述TIL以用于治疗人类患者的步骤。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述目标细胞选自下组：单核细胞、B类淋巴母细胞、伯基特氏淋巴瘤细胞、Raji细胞、Thp1细胞、Ramos细胞、U937细胞、Daudi细胞及其衍生物、变体、修饰物或后代以及它们的组合，其中所述目标细胞或它们的组合可选地经辐照，并且其中所述目标细胞或它们的组合可选地对所述TIL、MIL或PBL产物具有同种异体反应性。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中，所述阴性对照细胞缺乏MHC或HLA I类和MHC或HLA II类表达。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述阴性对照细胞为K562细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代，其中所述阴性对照细胞可选地经辐照。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中，TIL产物细胞的数目与目标细胞的数目之间的比率在5:1与1:5之间，且其中TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率在5:1与1:5之间。
10.根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中，TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率在1:2与1:4之间，且其中TIL产物细胞的数目与阴性对照细胞的数目之间的比率在1:2与1:4之间。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述第一时间段为约6小时至约48小时。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述第二时间段为约6小时至约48小时。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述第一时间段选自下组：约12小时、约18小时和约24小时。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述第二时间段选自下组：约12小时、约18小时和约24小时。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中，所述TIL上的所述一种以上标记物选自下组：CD25、CD69、CD134、CD137、CD150、KLRG1或它们的组合。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述TIL分泌的所述一种以上分析物选自下组：2]IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25、IL-26、MIP-1β以及它们的组合。
17.根据权利要求4至15中任一项所述的方法，其中，所述TIL产物分泌的所述一种以上分析物选自下组：IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-14、IL-16、IL-17、IL-18、IL-22、IL-25、IL-26、MIP-1β以及它们的组合，其中对于所述一种以上分析物中的每一种分析物，将所述观测值的数量相对于所述对照值的数量进行归一化，并且其中所述一种以上分析物中的每一种分析物的所述观测值相对于所述对照值的增加选自下组：至少1倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍和至少5倍。
18.根据权利要求4至17中任一项所述的方法，其中，所述TIL产物是由肿瘤制造的，所述肿瘤通过手术切除、穿刺活检、核心活检、小型活检或其他从人类患者获取含有肿瘤和TIL细胞混合物的样本的方法获得。
19.一种用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群治疗有需要患者的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过将获自所述患者的肿瘤样本处理成(i)多个肿瘤碎片或(ii)肿瘤消化物，从肿瘤获得和/或接收第一TIL群，所述肿瘤通过手术切除、穿刺活检、核心活检、小型活检或其他手段自所述患者切除；
(b)将所述第一TIL群添加至密闭系统中；
(c)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中，所述第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，所述第一次扩增进行约3至14天以获得所述第二TIL群，并且由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(d)通过用额外的IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)补充所述第二TIL群的细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中，所述第二次扩增进行约7至14天以获得所述第三TIL群，所述第三TIL群为治疗性TIL群，所述第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，并且由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(e)收集由步骤(d)获得的所述治疗性TIL群，其中由步骤(d)至步骤(e)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(f)将来自步骤(e)的所述治疗性TIL群转移至输注袋，其中由步骤(e)至(f)的转移在不开放所述系统的情况下进行；
(g)可选地，冷冻保存来自步骤(f)的包含所述治疗性TIL群的所述输注袋；
(h)通过以下方式确定所述治疗性TIL群的效力：
i.若包含治疗性TIL群的所述输注袋在步骤(g)中可选地冷冻保存，则可选地解冻包含所述治疗性TIL群的所述输注袋；
ii.将目标细胞与一部分的所述治疗性TIL群进行持续第一时间段的共培养；
iii.由所述共培养获得收集物或上清液；
iv.评估(1)所述收集物中所述部分的治疗性TIL群上一种以上标记物的表达或(2)所述上清液中所述部分的治疗性TIL群分泌的一种以上分析物，以获得一个以上观测值，从而确定所述治疗性TIL群的效力；
v.将(i)阴性对照细胞与所述部分的治疗性TIL群进行持续第二时间段的第二次共培养，或将(ii)人类白细胞抗原(HLA)阻断抗体与第二部分的所述治疗性TIL群和所述目标细胞进行持续第二时间段的第二次共培养；
vi.由所述第二次共培养获得第二收集物或第二上清液；
vii.评估(1)所述第二收集物中所述第二部分的治疗性TIL群上一种以上标记物的表达或(2)所述第二上清液中所述第二部分的治疗性TIL群分泌的一种以上分析物，以获得一个以上对照值；和
viii.将所述一个以上观测值与所述一个以上对照值进行比较，其中将每个观测值与其对应的对照值进行比较，以确定所述治疗性TIL群的效力；以及
(i)若确定所述治疗性TIL群有效，则向所述患者施用治疗有效剂量的来自步骤(f)或(g)中的所述输注袋的所述治疗性TIL群。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，检查收集的所述TIL的效力和/或功能在冷冻保存之后进行，或可选地，在冷冻保存步骤之前和之后进行。
21.根据权利要求19至20中任一项所述的方法，其中，所述患者具有不可切除、转移性、耐药或难以用CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗的肿瘤，且可选地，所述患者先前已用CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂进行治疗。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中，步骤(c)中的所述第二TIL群在数目上比所述第一TIL群多至少50倍。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，其中，所述第一次扩增在约10天至约12天的时间段内进行。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中，所述第二次扩增在约10天至约12天的时间段内进行。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的方法，其中，所述第一次扩增在约11天的时间段内进行。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的方法，其中，所述第二次扩增在约11天的时间段内进行。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的方法，其中，在所述第一次扩增中，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在于所述细胞培养基中。
28.根据权利要求19至27中任一项所述的方法，其中，在所述第二次扩增步骤中，所述IL-2以1000IU/mL与6000IU/mL之间的初始浓度存在且所述OKT-3抗体以约30ng/mL的初始浓度存在。
29.根据权利要求19至28中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：在向所述患者施用所述TIL之前，用非清髓性淋巴细胞耗竭方案治疗所述患者。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述非清髓性淋巴细胞耗竭方案包括以下步骤：持续两天以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺并以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨三天。
32.根据权利要求19至31中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：在向所述患者施用所述治疗性TIL群的第二天开始用IL-2方案治疗所述患者。
33.根据权利要求19至31中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤：在向所述患者施用所述治疗性TIL群的同一天开始用IL-2方案治疗所述患者。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，在完成向所述患者施用所述治疗性TIL群之后约3至约24小时施用所述IL-2方案。
35.根据权利要求33至34中任一项所述的方法，其中，所述IL-2方案为包括600,000或720,000IU/kg阿地白介素或其生物类似物或变体的高剂量IL-2方案，其以每八小时15分钟的推注静脉内输注形式施用直至耐受为止。
36.根据权利要求19至35中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中将获自所述患者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物进一步包括在酶培养基中孵育所述肿瘤样本。
37.根据权利要求19至36中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中将获自所述患者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物进一步包括以机械方式破坏所述肿瘤样本以便分解所述肿瘤样本。
38.根据权利要求19至37中任一项所述的方法，其中，在步骤(a)中将获自所述患者的肿瘤样本处理成肿瘤消化物进一步包括使用密度梯度分离纯化经分解的肿瘤样本。
39.根据权利要求36所述的方法，其中，所述酶培养基包含DNase。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述酶培养基包含约30单位/毫升的DNase。
41.根据权利要求36所述的方法，其中，所述酶培养基包含胶原蛋白酶。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述酶培养基包含约1.0mg/mL的胶原蛋白酶。
43.根据权利要求19至42中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自下组：黑色素瘤、卵巢癌、胰脏癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、神经胶母细胞瘤、胃肠癌、肾癌、肉瘤和肾细胞癌。
44.根据权利要求19至43中任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括向所述患者施用PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂或CTLA-4抑制剂的步骤。
45.一种确定T细胞产物的效力的方法，所述方法包括以下步骤：
e.将目标细胞与T细胞产物细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次共培养；
f.将目标细胞与T细胞参考标准细胞在不同目标细胞浓度下进行至少三次共培养；
g.由每次共培养萃取上清液；以及
h.评估所述上清液中所述T细胞产物细胞和T细胞参考标准细胞分泌的细胞因子，以获得剂量浓度，从而确定所述T细胞产物的所述效力；
其中，所述目标细胞为单核细胞。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述T细胞产物为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)产物、骨髓浸润淋巴细胞(MIL)产物或外周血淋巴细胞(PBL)产物。
47.根据权利要求45至46中任一项所述的方法，其中，所述单核细胞为U937或Thp1细胞，或其衍生物、变体、修饰物或后代，且其中所述细胞因子为干扰素-γ。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述共培养物进行选自下组的时间段：约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时和约48小时。
49.根据权利要求48所述的方法，其中，所述T细胞产物为TIL产物，且其中使用约4×105、约2×105、约1×105和约0.5×105个目标细胞/孔的四种目标细胞剂量浓度和约1.5×106个TIL/孔的单一TIL细胞浓度。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，使用目标细胞与T细胞产物细胞的至少四种共培养物以及目标细胞与T细胞参考标准细胞的至少四种共培养物，进行平行线分析，并且丢弃一个离群值目标细胞剂量浓度。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述方法是效力测定矩阵的组成部分。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述效力测定矩阵包括一种以上选自下组的测定：使用CD3、CD28和/或CD137刺激并报告干扰素γ、颗粒酶B或肿瘤坏死因子-α的基于微珠或基于培养板的测定；总活细胞测定；活细胞百分比测定；CD4+细胞含量测定；CD8+细胞含量测定；TEM细胞含量测定；TCM细胞含量测定；LAG3+细胞含量测定；和KLRG1+细胞含量测定；CD101+细胞含量测定；CD69+细胞含量测定；TSCM细胞含量测定；TEMRA细胞含量测定；Treg细胞含量测定；PD-1+细胞含量测定；TIM3+细胞含量测定；CD25+细胞含量测定；CD27+细胞含量测定；CD28+细胞含量测定；CD56+细胞含量测定；CTLA-4+细胞含量测定；TIGIT+细胞含量测定；以及CD57+细胞含量测定。
53.一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用扩增的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，所述方法包括：
(a)将肿瘤消化物或肿瘤碎片添加至密闭系统中，其中所述肿瘤消化物或肿瘤碎片包括第一TIL群且获自从所述受试者切除的肿瘤；
(b)通过在包含IL-2的细胞培养基中培养所述第一TIL群来进行第一次扩增，产生第二TIL群，其中所述第一次扩增在提供第一透气表面区域的密闭容器中进行，其中所述第一次扩增进行约3至11天以获得所述第二TIL群，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(c)通过补充包含IL-2、OKT-3和抗原呈递细胞(APC)的额外细胞培养基来进行第二次扩增，产生第三TIL群，其中所述第二次扩增进行约7至11天以获得第三TIL群，其中所述第二次扩增在提供第二透气表面区域的密闭容器中进行，且其中由步骤(b)至步骤(c)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(d)收集由步骤(c)获得的所述第三TIL群，其中由步骤(c)至步骤(d)的转变在不开放所述系统的情况下进行；
(e)将由步骤(d)收集的所述第三TIL群转移至输注袋，其中由步骤(d)转移至(e)在不开放所述系统的情况下进行；
(f)使用冷冻保存过程冷冻保存来自步骤(e)的包含所述收集的TIL群的所述输注袋；以及
(g)向所述受试者施用治疗有效剂量的来自步骤(f)中的所述输注袋的所述第三TIL群；
其中，所述APC选自下组：Raji、Ramos、Daudi、U937或Thp1细胞或其衍生物、变体、修饰物或后代。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，所述癌症选自下组：黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤)、卵巢癌、子宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、由人类乳头状瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌(HNSCC))、食道癌、食管胃结合部癌、胃癌、胃肠癌、肾癌和肾细胞癌。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，步骤(a)中的所述第一次扩增和步骤(b)中的所述第二次扩增各自单独地在11天的时间段内进行。
56.根据权利要求54所述的方法，其中，步骤(a)至(d)在约10天至约22天内进行。
57.根据权利要求53至56中任一项所述的方法，其中，所述TIL的效力已使用权利要求1至18中任一项所述的方法或权利要求45至52中任一项所述的方法测定。
58.根据权利要求19至44中任一项所述的方法，其中，所述TIL的效力已使用权利要求1至18中任一项所述的方法或权利要求45至52中任一项所述的方法测定。
Applications Claiming Priority (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63/166,210 | 2021-03-25 | ||
| US63/189,829 | 2021-05-18 | ||
| US63/212,933 | 2021-06-21 | ||
| US63/233,035 | 2021-08-13 | ||
| US63/246,890 | 2021-09-22 | ||
| US63/286,145 | 2021-12-06 | ||
| US202263309919P | 2022-02-14 | 2022-02-14 | |
| US63/309,919 | 2022-02-14 | ||
| PCT/US2022/022030 WO2022204564A2 (en) | 2021-03-25 | 2022-03-25 | Methods and compositions for t-cell coculture potency assays and use with cell therapy products |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117480246A true CN117480246A (zh) | 2024-01-30 |
Family
ID=89633418
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202280037095.7A Pending CN117480246A (zh) | 2021-03-25 | 2022-03-25 | 用于t细胞共培养物效力测定和配合细胞疗法产品使用的方法和组合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117480246A (zh) |
-
2022
- 2022-03-25 CN CN202280037095.7A patent/CN117480246A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113272421A (zh) | 用于产生肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在免疫疗法中的用途 | |
| JP2023523855A (ja) | 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用 | |
| JP2024506557A (ja) | 修飾された腫瘍浸潤リンパ球を作製する方法及び養子細胞療法におけるそれらの使用 | |
| JP2022512899A (ja) | 抗ｐｄ－１抗体に対して不応性のｎｓｃｌｃ患者の治療 | |
| JP2024510505A (ja) | Ｃｄ３９／ｃｄ６９選択に関連した腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）拡張及びｔｉｌにおける遺伝子ノックアウトのための方法 | |
| TW202239415A (zh) | 腫瘤浸潤性淋巴球療法與ｃｔｌａ－４及ｐｄ－１抑制劑組合之治療 | |
| JP2024519029A (ja) | Ｐｄ－１遺伝子編集された腫瘍浸潤リンパ球及び免疫療法におけるその使用 | |
| JP2023524108A (ja) | 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択 | |
| JP2024501845A (ja) | 腫瘍浸潤リンパ球の自動化された産生のためのデバイス及びプロセス | |
| JP2024500403A (ja) | 腫瘍浸潤リンパ球によるがんの治療 | |
| TW202241468A (zh) | 用腫瘤浸潤性淋巴球療法與ｂｒａｆ抑制劑及／或ｍｅｋ抑制劑組合治療癌症患者 | |
| KR20240032711A (ko) | T-세포 공배양 효능 검정 및 세포 치료제와 함께 사용하기 위한 방법 및 조성물 | |
| TW202327631A (zh) | 利用腫瘤浸潤性淋巴球療法與ｋｒａｓ抑制劑組合治療癌症患者 | |
| CN117279506A (zh) | 肿瘤储存及细胞培养组合物 | |
| CN117480246A (zh) | 用于t细胞共培养物效力测定和配合细胞疗法产品使用的方法和组合物 | |
| CN116829156A (zh) | 使用肿瘤浸润性淋巴细胞疗法与ctla-4及pd-1抑制剂组合的治疗 | |
| CN117940557A (zh) | 制备经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞的方法及其在过继性细胞治疗中的应用 | |
| WO2024098027A1 (en) | Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection | |
| WO2023049862A1 (en) | Expansion processes and agents for tumor infiltrating lymphocytes | |
| TW202310745A (zh) | 實體腫瘤片段之冷凍保存方法 | |
| TW202346573A (zh) | 細胞介素相關之腫瘤浸潤性淋巴球組合物及方法 | |
| KR20240109615A (ko) | Pd-1 talen 녹다운을 사용한 til 생성물의 생성 방법 | |
| AU2022388729A1 (en) | Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes | |
| CN117835991A (zh) | 嵌合共刺激性受体、趋化因子受体及其在细胞免疫治疗中的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |