JP2024501845A - 腫瘍浸潤リンパ球の自動化された産生のためのデバイス及びプロセス - Google Patents

Abstract

本発明は、新規の組織培養デバイスを含む、ＴＩＬを拡張し、治療的ＴＩＬ集団を産生するための自動化された方法、ならびに低下した微生物汚染及び減少したコストを可能にしつつ、改善された有効性、改善された表現型、及び増加したＴＩＬの代謝健康を短期間でもたらす、閉鎖系においてＴＩＬ集団を拡張するための自動化された方法を提供する。【選択図】図１１４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月３１日に出願された米国仮特許出願第６３／１３２，８９９号、２０２１年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２１２，０３７号、２０２１年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２１７，２４４号、及び２０２１年１１月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／２８２，８３７号に対する優先権及びその利益を主張し、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

現在のＴＩＬ製造プロセスは、期間、コスト、滅菌性に関する懸念、及び本明細書に記載の他の因子によって限定される。製造における改善された費用対効果、滅菌性、及びスケーラビリティ、ならびに複数の臨床施設でヒト患者を治療するために生産されたＴＩＬ調製物のより強力な抗がん表現型を特徴とする、ＴＩＬ製造プロセス、及びそのプロセスに基づく療法を提供することが緊急に必要である。本発明は、ＴＩＬ拡張を、最小限のヒト介入を伴い、及び／またはステップの間に組織培養デバイスを開くことなく行うことができる、新規な組織培養デバイス及び自動化／半自動化されたプロセスを提供することによって、この必要性を満たす。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスであって、細胞を培養するための第１のガス透過性表面、細胞を培養するための第２のガス透過性表面、及び少なくとも第１のガス透過性表面から第２のガス透過性表面まで延在する１つ以上の側壁を有するデバイス本体と、ふるいであって、第１のガス透過性表面と第２のガス透過性表面との間でデバイス本体内に配置され、それによって、デバイスを、（ｉ）第１のガス透過性表面、１つ以上の側壁、及びふるいによって画定される第１の区画、及び（ｉｉ）第２のガス透過性表面、１つ以上の側壁、及びふるいによって画定される第２の区画に分離する、ふるいと、第１の区画と流体連通しているアクセスポートと、を備え、第２のガス透過性表面の断面積が、第１のガス透過性表面の断面積よりも大きい、組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面は、実質的に平行である。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、外部環境と気体連通したエアフィルタをさらに備える。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第１の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成されたフレームをさらに備える。いくつかの実施形態では、フレームは、平面に対して第２の方向であって、ふるいが、平面と第１のガス透過性表面との間で第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第２の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成される。いくつかの実施形態では、フレームは、平面に対して第３の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる第３の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成される。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画と流体連通した細胞採取出口をさらに備え、細胞採取出口は、第３の方向での組織培養デバイスの重心と平面との間に配置される。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、組織培養デバイスを第１の方向、第２の方向、及び第３の方向に向けるように構成され、寸法決定される組織培養デバイス位置コントローラをさらに備え、第１の方向で、第１のガス透過性表面が、固定された平面及び第２のガス透過性表面に対して平行に、かつ固定された平面の上かつ第２のガス透過性表面の下に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、第２の方向で、ふるいが、平面と第１のガス透過性表面との間で第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、第３の方向で、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画と流体連通した培地入口をさらに備える。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画と流体連通した廃棄出口をさらに備える。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画と流体連通した細胞採取出口をさらに備える。

いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン、約２００ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、約４０ミクロン、約３０ミクロン、または約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、腫瘍断片が第１の区画から第２の区画へと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が第１の区画から第２の区画へと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成される。

いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面の断面積は、第１のガス透過性表面の断面積よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい。

いくつかの実施形態では、第１の区画の体積は、少なくとも約５０ｍＬである。いくつかの実施形態では、第２の区画の体積は、少なくとも約１００ｍＬである。いくつかの実施形態では、第２の区画の体積の、第１の区画の体積に対する比率は、少なくとも約２：１である。

いくつかの実施形態では、第１のガス透過性表面とふるいとの間の距離は、少なくとも約５ｃｍである。いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面とふるいとの間の距離は、少なくとも約５ｃｍである。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、アクセスポートを備えるネック部分をさらに備え、ネック部分は、第１のガス透過性表面とふるいとの間に配置される。

いくつかの実施形態では、ふるいは、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体がふるいを介して通過するのを防止する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスであって、第１の細胞培養容器であって、第１の細胞培養容器の第１の区画と流体連通している第１のアクセスポートを備え、第１の区画が、第１の内部体積及び細胞を培養するための第１のガス透過性表面によって少なくとも部分的に画定される、第１の細胞培養容器と、第２の細胞培養容器であって、第１の区画に流体的に接続された第２の区画を含み、第２の区画が、細胞を培養するための第２のガス透過性表面によって少なくとも部分的に画定され、第２の区画が、制限された体積及び拡張された体積で構成可能であり、制限された体積が、第２の区画内の第２のガス透過性表面の第１の利用可能な表面積に曝露された流体を保持するように構成され、拡張された体積が、第２の区画内の第２のガス透過性表面の第２の利用可能な表面積に曝露された流体を保持するように構成され、第１の利用可能な表面積が、第２の利用可能な表面積よりも小さい、第２の細胞培養容器と、を備える、組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第１の細胞培養容器と第２の細胞培養容器との間の流体接続へのアクセスを提供するために第１の細胞培養容器内に配置された第２のアクセスポートと、第２のアクセスポートを横切って配置されたふるいと、をさらに備える。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体がふるいを介して通過するのを防止する。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の細胞培養デバイスに連結された制限手段をさらに備え、制限手段は、第２の区画を制限された体積に制限する第１の構成と、拡張された体積に対応する第２の構成と、を有する。いくつかの実施形態では、制限手段は、１つ以上のクランプを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のクランプは、第２の区画の内部体積を制限された体積から拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、第２の区画の内部体積における漸増が、第２のガス透過性表面の領域における第１の利用可能な表面積から第２の利用可能な表面積までの漸増に対応する。

いくつかの実施形態では、制限手段は、制限された体積の位置から、拡張された全体積の位置へと移行可能な障壁を含む。いくつかの実施形態では、障壁は、トレイ摺動蓋を含む。

いくつかの実施形態では、第２の細胞培養デバイスは、可撓性側壁と、可撓性側壁を支持するように構成された基部と、を備え、障壁は、摺動する構成で基部に連結される。

いくつかの実施形態では、トレイ摺動蓋は、第２の区画の内部体積を制限された体積から拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、第２の区画の内部体積における漸増が、第２のガス透過性表面の領域における第１の利用可能な表面積から第２の利用可能な表面積までの漸増に対応する。

いくつかの実施形態では、障壁は、１つ以上の調整可能なスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、障壁は、第２の区画の内部体積を制限された体積から拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、第２の区画の内部体積における漸増が、第２のガス透過性表面の領域における第１の利用可能な表面積から第２の利用可能な表面積までの漸増に対応する。いくつかの実施形態では、第１の利用可能な表面積の、制限された体積に対する第１の比率は、第２の利用可能な表面積の、拡張された体積に対する第２の比率と実質的に同一である。

いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面は、第２の細胞培養容器の表面全体を覆う。

いくつかの実施形態では、第２の細胞培養容器は、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第１の方向で、基部によって支持される。いくつかの実施形態では、基部は、トレイ及びフレームのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、基部は、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる第２の方向で、第２の細胞培養容器を支持するように構成される。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画と流体連通した採取出口をさらに備え、採取出口は、第２の細胞培養容器の表面に沿って配置される。

いくつかの実施形態では、第１のガス透過性表面は、第１の断面積を有し、第２のガス透過性表面は、第２の断面積を有し、第２の断面積は、第１の断面積よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい。

いくつかの実施形態では、第１の内部体積は、少なくとも約５０ｍＬである。いくつかの実施形態では、第２の区画の制限された体積は、少なくとも約１００ｍＬである。いくつかの実施形態では、制限された体積は、第１の内部体積よりも少なくとも約２倍大きい。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、プライミングによる第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第１の期間及び第２の期間に分割された急速な第２の拡張を行うことであって、第１の期間中に、急速な第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、急速な第２の拡張を行うことと、（ｅ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過することであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、濾過することと、（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において急速な第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、急速な第２の拡張の第２の期間が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われ、ここで、ステップ（ｄ）、ステップ（ｅ）、及びステップ（ｆ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｇ）ステップ（ｆ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｈ）ステップ（ｇ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、第１のアクセスポートを介して組織培養デバイスの第１の区画に添加することと、（ｃ）細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第２のＴＩＬ集団の急速な第２の拡張を行うことであって、急速な第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間行われ、本方法が、（Ｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第１のガス透過性表面上で急速な第２の拡張の第１の期間を行うことと、（ＩＩ）急速な第２の拡張の第１の期間の後にＴＩＬを数えあげることと、（ＩＩＩ）１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することと、（ＩＶ）第２のＴＩＬ集団を第２の区画に移すことと、（Ｖ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２のガス透過性表面の使用可能な部分上で急速な第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することと、をさらに含み、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、ステップ（ｄ）（ＩＶ）からステップ（ｄ）（Ｖ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、急速な第２の拡張を行うことと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過することであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、濾過することと、（ｅ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われ、ここで、ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｆ）ステップ（ｅ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｇ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うことであって、第１の期間中に、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張を行うことと、（ｅ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過することであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、濾過することと、（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われ、ここで、ステップ（ｄ）、ステップ（ｅ）、及びステップ（ｆ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、第２の拡張の第２の期間を行うことと、（ｇ）ステップ（ｆ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｈ）ステップ（ｇ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過することであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、濾過することと、（ｅ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うことであって、第１の期間中に、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の細胞培養培地、ＡＰＣ及びＩＬ－２を補充し、第２の区画において第２の拡張の第１の期間、第２のＴＩＬ集団を培養することによって、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張を行うことと、（ｆ）使用済み細胞培養培地を第２の区画から除去することと、（ｇ）ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地を第２の区画に導入することと、（ｈ）第２のＴＩＬ集団を、第２の区画において第２の拡張の第２の期間培養して、第３のＴＩＬ集団を産生し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の期間中に、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｄ）、ステップ（ｅ）、ステップ（ｆ）、ステップ（ｇ）及びステップ（ｈ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、培養することと、（ｉ）ステップ（ｈ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｊ）ステップ（ｉ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地が、第２のＴＩＬ集団の第２の細胞培養培地にＩＬ－２またはＯＫＴ－３のうちの少なくとも１つを添加することを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本方法が、組織培養デバイス位置コントローラを使用して、組織培養デバイスを、第１の方向、第２の方向、及び第３の方向に向けることをさらに含み、第１の方向で、第１のガス透過性表面が、固定された平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、ふるいが、第１のガス透過性表面の上にあり、第２の方向で、第２のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、ふるいが、第１のガス透過性表面の下にあり、第３の方向で、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、ＩＬ－２を含み、及び任意選択でＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で行われ、第２のＴＩＬ集団を産生するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団を取得するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも５０倍多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張の第１の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、第２の拡張の第２の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２を補充することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、第１のアクセスポートを介して組織培養デバイスの第１の区画に添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）１つ以上の制限手段を使用して、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することと、（ｅ）第２のＴＩＬ集団を第２の区画に移すことであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、移すことと、（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することことと、（ｇ）ステップ（ｆ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｈ）ステップ（ｇ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、第１のアクセスポートを介して組織培養デバイスの第１の区画に添加することと、（ｃ）細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第２のＴＩＬ集団の第２の拡張を行うことであって、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間行われ、本方法が、（Ｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第１のガス透過性表面上で第２の拡張の第１の期間を行うことと、（ＩＩ）第１の期間の後にＴＩＬを数えあげることと、（ＩＩＩ）１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することと、（ＩＶ）第２のＴＩＬ集団を第２の区画に移すことと、（Ｖ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２のガス透過性表面の使用可能な部分上で第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することと、をさらに含み、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、ステップ（ｄ）（ＩＶ）からステップ（ｄ）（Ｖ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２の拡張を行うことと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、第１のアクセスポートを介して組織培養デバイスの第１の区画に添加することと、（ｃ）細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第２のＴＩＬ集団の第２の拡張を行うことであって、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間行われ、本方法が、（Ｉ）第１の拡張の後にＴＩＬの第１の数えあげを行うことと、（ＩＩ）１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの第１の数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することと、（ＩＩＩ）第２のＴＩＬ集団を第２の区画に移すことと、（ＩＶ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の細胞培養培地、ＡＰＣ及びＩＬ－２を補充することによって、第１の透過性表面の第１の使用可能な部分上で第２の拡張の第１の期間を行うことと、（Ｖ）第１の期間の後にＴＩＬの第２の数えあげを行うことと、（ＶＩ）１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの第２の数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その第２の使用可能な部分に構成することと、（ＶＩＩ）第２の区画中に位置する廃棄出口から使用済み細胞培養培地を除去することと、（ＶＩＩＩ）ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地を、第２の区画中に位置する入口を介して導入することと、（ＩＸ）第２のガス透過性表面の第２の使用可能な部分上で第２の拡張の第２の期間、第２のＴＩＬ集団を培養して、第３のＴＩＬ集団を産生することと、をさらに含み、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行、及びステップ（ｄ）（Ｉ）からステップ（ｄ）（ＩＸ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２の拡張を行うことと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、（１）組織培養デバイスの第１の培養容器が、外部環境へのアクセスを提供するために配置された第３のアクセスポートと、第３のアクセスポートを横切って配置された第２のふるいと、をさらに備え、第２のふるいが、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体が第２のふるいを介して通過するのを防止し、（２）腫瘍断片が、第１のアクセスポートを介して第１の区画に添加され、（３）第１の拡張が、第１のステップ及び第２のステップに分割され、本方法が、ＩＬ－２を含有する細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張の第１のステップを行って、腫瘍断片から出るＴＩＬ及び腫瘍断片中に残存するＴＩＬを生成することをさらに含み、（４）腫瘍断片から出たＴＩＬを含む培養培地を、第３のアクセスポートを介して外部環境へと通過させることによって、腫瘍断片中に残存したＴＩＬを、ステップ（３）において腫瘍断片から出たＴＩＬから分離しつつ、第３のアクセスポートを横切って配置された第２のふるいが、腫瘍断片が第３のアクセスポートへと通過するのを遮断し、腫瘍断片中に残存したＴＩＬを、第１の区画中に保持させ、（５）腫瘍断片が、任意選択で消化され、腫瘍消化物を産生し、（６）第１の拡張の第２のステップが、腫瘍断片または腫瘍消化物中に残存するＴＩＬの細胞培養培地を補充して、第２のＴＩＬ集団を産生することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本方法が、組織培養デバイス位置コントローラを使用して、組織培養デバイスを、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第１の方向に、ならびに平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる第２の方向に向けることをさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、ＩＬ－２を含み、及び任意選択でＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団を取得するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも５０倍多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張の第１の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、第２の拡張の第２の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、約７～１４日間行われ、第３のＴＩＬ集団を取得するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本方法が、凍結乾燥プロセスを使用して、採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結乾燥するステップをさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスが、採取されたＴＩＬ集団の、凍結保存培地に対する１：１の比率を使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが、放射線照射されており、同種異系であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが、第２の拡張の９～１４日目のいずれかで細胞培養物に添加されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が、人工抗原提示細胞であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取が、膜ベースの細胞処理システムを使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取が、ＬＯＶＯ細胞処理システムを使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が、約４～約５０個の断片を含み、各断片が、約２７ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が、約３０～約６０個の断片を含み、約１３００ｍｍ^３～約１５００ｍｍ^３の総体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が、約５０個の断片を含み、約１３５０ｍｍ^３の総体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が、約５０個の断片を含み、約１グラム～約１．５グラムの総質量を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が、約４個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張における細胞培養培地が、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－２１をさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＩＬ－２濃度が、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＩＬ－１５濃度が、約５００ＩＵ／ｍＬ～約１００ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＩＬ－２１濃度が、約２０ＩＵ／ｍＬ～約０．５ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、注入バッグが、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌを含有する注入バッグであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存培地が、７％～１０％のＤＭＳＯを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張及び第２の拡張が、各々１０日間、１１日間、または１２日間の期間内に個別に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張及び第２の拡張が、各々１１日間の期間内に個別に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１０日間～約２２日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約２０日間～約２２日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１５日間～約２０日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１０日間～約２０日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１０日間～約１５日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、２２日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、２０日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、１５日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、１０日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべて及び凍結保存が、２２日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２日間の期間内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１８日間～約２１日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、約１１日間の期間内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、約１１日間の期間内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、約７または８日間の期間内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張の第１の期間が、約３または４日間以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張の第２の期間が、約５または６日間以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、約７または８日間の期間内で行われ、第２の拡張の第１の期間が、約３または４日間以内で行われ、第２の拡張の第２の期間が、約５または６日間以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１６または１７日間以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取ステップにおいて採取された治療的ＴＩＬ集団が、治療上有効な投与量のＴＩＬに十分なＴＩＬを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取ステップにおいて採取された治療的ＴＩＬ集団が、約２．３×１０^１０～約１３．７×１０^１０個である治療上有効な投与量のＴＩＬを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間に分割され、第１の期間中に、第２の拡張が、第２の区画の制限された体積中で行われ、第２の期間中に、第２の拡張が、第２の区画の拡張された体積中で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間に分割され、第２のＴＩＬ集団に、第１の期間中に、抗原提示細胞が補充され、系を開くことなく第２の期間中に追加の培養培地及びＩＬ－２が補充されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間に分割され、第２のＴＩＬ集団に、第１の期間中にＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充され、系を開くことなく第２の期間中に追加の培養培地及びＩＬ－２が補充されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、開放系と比較して、微生物汚染のリスクが低下するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、注入バッグ中のＴＩＬが、患者に注入されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本方法が、１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することをさらに含み、構成することが、第２の細胞培養容器の少なくとも一部分を広げることを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本方法が、１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することをさらに含み、構成することが、第２の細胞培養容器の内側表面が、構成の前に画定された内側表面よりも大きな体積を画定し、異なる構成で１つ以上の制限手段を用いて画定することができる内側表面よりも小さな体積を画定するように、細胞培養デバイスに１つ以上の制限手段を適用することを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、バイオリアクターシステムであって、（ａ）上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスと、（ｂ）組織培養デバイスの第１の区画及び第２の区画の一方または両方に流体的に接続された新鮮培地容器と、（ｃ）組織培養デバイスの第２の区画に流体的に接続された廃棄培地容器と、（ｄ）１つ以上のポンプであって、（ｉ）新鮮培地容器から、組織培養デバイスの第１の区画及び第２の区画の一方または両方へと、新鮮培地を圧送し、（ｉｉ）第２の区画から廃棄材料容器へと廃棄培地を圧送し、及び／または（ｉｉｉ）第２の区画から注入バッグへと細胞を圧送するように構成された、１つ以上のポンプと、を備える、バイオリアクターシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、バイオリアクターシステムであって、（ａ）上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスと、（ｂ）組織培養デバイスの第１の区画及び第２の区画の一方または両方に流体的に接続された新鮮培地容器と、（ｄ）１つ以上のポンプであって、（ｉ）新鮮培地容器から、組織培養デバイスの第１の区画及び第２の区画の一方または両方へと、新鮮培地を圧送し、及び／または（ｉｉ）第２の区画から、細胞を細胞培養廃棄材料から濾過し、濾過した細胞を残存物容器に、細胞培養廃棄材料を廃棄材料容器に堆積させるように構成されたインラインタンジェンシャルフロー濾過デバイスに細胞を圧送するように構成された、１つ以上のポンプと、を備える、バイオリアクターシステムを提供する。

別の実施形態では、本発明は、１つ以上のポンプが、吸引、圧力差、または強制空気を介して作用する材料を移動させるように構成されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のバイオリアクターシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、インキュベーター内に配置されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のバイオリアクターシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、組織培養デバイスの撹拌を行うように少なくとも二次元で移動するように構成された基部によるものであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のバイオリアクターシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、新鮮培地容器、廃棄材料容器、及び１つ以上のポンプのうちの１つ以上が、インキュベーターの外側に配置されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のバイオリアクターシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、第１の壁と第２の壁との間に画定された内部空間と、内部空間の第１のチャンバと第２のチャンバとの間に配置されたダイアフラムと、を有する、細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、ダイアフラムは、内部空間の遠位端から境界まで延在する第１のセクションであって、第１のセクションが、液体が第１のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを防止するために液体不透過性である、第１のセクションと、境界から内部空間の近位端に向かって延在する第２のセクションであって、第２のセクションが、液体が第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にするために液体透過性である、第２のセクションと、を備える。いくつかの実施形態では、ダイアフラムの第１のセクション及び第１の壁は、細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに所定の体積までの液体を保持するように構成される、第１のチャンバ中のウェルを画定し、所定の体積は、第１のチャンバの最大充填体積未満である。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞培養デバイスであって、細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、内部空間の近位端が、内部空間の遠位端の上に垂直に位置決めされる、細胞培養デバイスを提供する。さらなる実施形態では、第１のチャンバは、第１の壁とダイアフラムとの間に配置され、第２のチャンバは、第２の壁とダイアフラムとの間に配置される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞培養デバイスであって、細胞培養デバイスが、第１のチャンバに流体的に接続された少なくとも１つの入口ポートと、ウェルに流体的に接続された第１の出口ポートと、第２のチャンバに流体的に接続された第２の出口ポートと、をさらに有する、細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの入口ポート、第１の出口ポート、及び第２の出口ポートの各々は、液体がそれらを介して通過することを可能にする開放構成と、液体がそれらを介して通過することを防止する閉鎖構成と、を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの入口ポートは、内部空間の近位端に、またはそれに近接して位置決めされ、第１の出口ポート及び第２の出口ポートは、内部空間の遠位端に、またはそれに近接して位置決めされる。

いくつかの実施形態では、本開示は、第１の壁及び／または第２の壁が、ガス透過性材料を含む、上述の細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、第１の壁及び／または第２の壁は、可撓性材料を含む。いくつかの実施形態では、第１の壁及び／または第２の壁は、剛性材料を含む。いくつかの実施形態では、第１の壁の内側表面は、細胞（例えば、ＴＩＬ）を培養するために構成された領域を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、ダイアフラムの第２のセクションが、５μｍ未満である孔径を有するふるいを備える、上述の細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、ダイアフラムは、可撓性である。他の実施形態では、ダイアフラムは、剛性である。

いくつかの実施形態では、本開示は、ダイアフラムが、内部空間の遠位端から内部空間の近位端まで延在する、上述の細胞培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ダイアフラムが、内部空間の近位端から空間的に離れている近位縁部で終端する、上述の細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、ダイアフラムは、内部空間の遠位端から近位縁部まで延在する。いくつかの実施形態では、近位縁部は、第２の壁に取り付けられている。いくつかの実施形態では、ダイアフラムは、遠位端と近位端との間の距離の半分未満まで延在する。いくつかの実施形態では、ダイアフラムの第２のセクションは、境界から近位縁部まで延在する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞培養デバイスであって、細胞培養デバイスが、所定の体積を超える過剰量の液体が第１のチャンバに導入された場合に、過剰量の液体の少なくとも一部分が、細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバまで流れることを可能にするように構成されている、細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、第１のチャンバの最大充填体積の、所定の体積に対する比率は、約１．５～約１５である。

いくつかの実施形態では、本開示は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の少なくとも１つの細胞培養デバイスを備える細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞処理システムは、細胞をインビトロで培養するために構成された１つ以上の容器であって、１つ以上の容器が、細胞培養デバイスの内部空間に流体的に接続される、１つ以上の容器と、をさらに備えていてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の容器は、１つ以上の培養フラスコ、１つ以上の培養バッグ、及び／または１つ以上の培養プレートを含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、インキュベーターをさらに備える、上述の細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス及び１つ以上の容器は、所定の大気条件で（例えば、３７℃及び５％ＣＯ２で）インキュベーター内に封入されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のような細胞処理システムであって、細胞培養デバイスの第１の壁及び第２の壁が、可撓性であり、細胞処理システムが、第１の壁及び第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて細胞培養デバイスの内部空間中を液体が流れるのを防止するように構成される１つ以上の解放可能な固定具をさらに備える、細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具の場所は、細胞培養デバイスの入口ポートとダイアフラムとの間にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、クランプ、クリップ、ストラップ、弾性バンド、タイ、及び／または磁気固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、細胞培養デバイスに沿った所定の場所にそれぞれ位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、細胞培養デバイス上の第１の位置から細胞培養デバイス上の第２の位置まで摺動するように構成される摺動固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、摺動固定具とダイアフラムとの間に位置決めされた固定位置固定具をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞培養デバイスが、水平方向から垂直方向まで回転可能である、上述の細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスが水平方向にあるときに、ダイアフラムは、第１のチャンバの上に垂直に位置決めされ、第２のチャンバは、ダイアフラムの上に垂直に位置決めされるいくつかの実施形態では、細胞処理システムは、細胞培養デバイスを水平方向から垂直方向まで回転させるように構成された可動プラットフォームを備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞培養デバイスの第１の壁が、ガス透過性である、上述の細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞処理システムは、ガス透過性トレイをさらに備え、細胞培養デバイスは、細胞培養デバイスの第１の壁がガス透過性トレイに対して入れられるように、ガス透過性トレイ上に配置される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞処理システムであって、細胞培養デバイスの第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスと、細胞培養デバイスの第２のチャンバに流体的に接続された透過物収集デバイスと、をさらに備える、細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の構成要素を備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞懸濁液を濃縮する方法であって、本方法が、上記の前段落のうちのいずれかに従って記載される組織培養デバイスの第１のチャンバに、液体中に懸濁された細胞を含む細胞懸濁液を導入することであって、細胞懸濁液が、細胞培養デバイスのウェル中に保持することができる所定の体積の液体よりも大きい初期体積を有する、導入することと、細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、細胞懸濁液の液体の一部分が、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、細胞懸濁液の体積を、初期体積から低下させることと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、初期体積の細胞懸濁液を第１のチャンバに導入する前に、細胞培養デバイスを垂直方向に向けることを含む。他の実施形態では、本方法は、初期体積の細胞懸濁液を第１のチャンバに導入した後に、細胞培養デバイスを垂直方向に向けることを含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞懸濁液を濃縮する方法であって、細胞懸濁液の細胞が、細胞培養デバイスの第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを防止する、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞懸濁液の体積が、初期体積から最終体積まで低下する、上述の細胞懸濁液を濃縮する方法を提供する。いくつかの実施形態では、最終体積は、ウェル中に保持することができる液体の所定の体積とほぼ等しい。いくつかの実施形態では、初期体積の、最終体積に対する比率が、約１．５～約１５である。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞懸濁液の体積が最終体積まで低下した後に、細胞培養デバイスの第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することは、第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに細胞懸濁液を移すことを含む。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の構成要素を備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞懸濁液を濃縮する方法であって、細胞培養デバイスの第１のチャンバに細胞懸濁液を導入することが、細胞培養デバイスの内部空間に流体的に接続される１つ以上の容器から細胞培養デバイスに細胞懸濁液を移すことを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の容器は、１つ以上の培養フラスコ、１つ以上の培養バッグ、及び／または１つ以上の培養プレートを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の容器及び細胞培養デバイスは、所定の大気条件で（例えば、３７℃及び５％ＣＯ２で）、インキュベーター内に封入されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞を拡張する方法であって、本方法が、上記の前段落のうちのいずれかに従って記載される組織培養デバイスの内部空間に、初期量の細胞を播種することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、細胞を拡張する方法は、細胞培養デバイスが水平方向にある間に、細胞培養デバイスの第１の壁の内部表面上で細胞培養培地中の細胞を培養して、拡張された量の細胞を産生することと、拡張された量の細胞を、細胞培養培地に懸濁させて、初期体積を有する細胞懸濁液を形成することと、細胞培養デバイスを水平方向から垂直方向まで回転させることであって、細胞懸濁液が、細胞培養デバイスの第１のチャンバを少なくとも部分的に充填する、回転させることと、細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、細胞懸濁液の体積を、初期体積から低下させることと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスの第１の壁は、ガス透過性である。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を拡張する方法であって、細胞培養培地が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞のうちの１つ以上を含有する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、約４日間～約１１日間の期間にわたって培養される。いくつかの実施形態では、初期量の細胞は、１０６～１０９個の細胞を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を拡張する方法であって、１つ以上の容器中の第１の細胞集団を拡張して、第２の細胞集団を産生することをさらに含み、初期量の細胞が、第２の細胞集団の少なくとも一部分である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を拡張する方法であって、細胞培養デバイスの第１の壁及び第２の壁が、可撓性であり、本方法が、１つ以上の解放可能な固定具を適用して、第１の壁及び第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて細胞培養デバイスの内部空間中を細胞及び／または細胞培養培地が流れるのを防止することをさらに含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具を適用することは、初期量の細胞を細胞培養デバイスの内部空間に播種する前に行われる。いくつかの実施形態では、細胞は、内部空間の近位端と１つ以上の解放可能な固定具の場所との間に配置される第１の壁の内側表面の領域上で培養される。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、内部空間の近位端とダイアフラムとの間の細胞培養デバイスに沿って所定の場所に各々位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む。いくつかの実施形態では、細胞を拡張する方法は、所定の順序で複数の解放可能な固定具を解放して、細胞を培養するために利用可能である第１の壁の内側表面の領域を徐々に増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の解放可能な固定具は、細胞懸濁液の体積を低下させる前に解放される。いくつかの実施形態では、複数の解放可能な固定具は、細胞培養デバイスを水平方向から垂直方向に回転させる前に解放される。

いくつかの実施形態では、拡張された量の細胞を細胞培養培地に懸濁させて、細胞懸濁液を形成するステップを行う前に、細胞を拡張する方法は、１つ以上の固定具を解放するステップと、細胞培養デバイスの第１の出口ポートを開放し、内部空間中の細胞培養培地の流体レベルが、内部空間中の第１の出口ポートの位置にほぼ等しくなるまで、使用済み細胞培養培地を第１の出口ポートを介して排出させるステップと、細胞培養デバイスの入口ポートを開放し、ＩＬ－２が補充され、任意選択でＯＫＴ－３が補充された追加の細胞培養培地を内部空間に供給するステップと、細胞を培養して、拡張された量の細胞よりも多い量の細胞を産生するステップと、を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスが水平方向に位置決めされるとき、内部空間中の入口ポートの位置が、第１の出口ポートの位置より上に垂直に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２が補充され、任意選択でＯＫＴ－３が補充された追加の細胞培養培地中で約４～約８日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２が補充され、任意選択でＯＫＴ－３が補充された追加の細胞培養培地中で約５～約７日間培養される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を拡張する方法であって、細胞懸濁液の体積を低下させている間、または低下させた後に、液体を細胞培養デバイスの第２のチャンバから除去することをさらに含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液の体積は、初期体積から最終体積まで低下する。いくつかの実施形態では、最終体積は、細胞培養デバイスのウェル中に保持することができる液体の所定の体積とほぼ等しい。いくつかの実施形態では、初期体積の、最終体積に対する比率が、約１．５～約１５である。いくつかの実施形態では、細胞を拡張する方法は、細胞懸濁液の体積が最終体積まで低下した後に、細胞培養デバイスの第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することは、第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに細胞懸濁液を移すことを含む。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の構成要素を備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞を培養するためのシステムであって、本システムが、ａ）組織培養デバイスであって、細胞を培養するための第１のガス透過性表面、細胞を培養するための第２のガス透過性表面、及び少なくとも第１のガス透過性表面から第２のガス透過性表面まで延在する１つ以上の側壁を有するデバイス本体と、ふるいであって、第１のガス透過性表面と第２のガス透過性表面との間でデバイス本体内に配置され、それによって、デバイス本体を、（ｉ）第１のガス透過性表面、１つ以上の側壁、及びふるいによって画定される第１の区画、及び（ｉｉ）第２のガス透過性表面、１つ以上の側壁、及びふるいによって画定される第２の区画に分離する、ふるいと、第１の区画と流体連通しているアクセスポートと、第２の区画と流体連通した細胞採取出口と、を備える、組織培養デバイスと、ｂ）上記の前段落のうちのいずれかに記載の少なくとも１つの細胞培養デバイスと、を備える、システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスは、細胞培養デバイスの第１のチャンバと流体連通した入口ポートを備え、入口ポートは、組織培養デバイスの第２の区画と流体連通した細胞採取出口に流体的に接続している。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスは、垂直方向にある。

いくつかの実施形態では、本開示は、第２のガス透過性表面の断面積が、第１のガス透過性表面の断面積よりも大きい、上述の細胞を培養するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面の断面積は、第１のガス透過性表面の断面積よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい。いくつかの実施形態では、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面は、実質的に平行である。

いくつかの実施形態では、本開示は、組織培養デバイスが、外部環境と気体連通したエアフィルタをさらに備える、上述の細胞を培養するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画と流体連通した培地入口をさらに備える。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画と流体連通した廃棄出口をさらに備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を培養するためのシステムであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第１の方向に組織培養デバイスを支持するように構成されたフレームをさらに備える、システムを提供する。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスが第１の方向にあるときに、第２のガス透過性表面は、第１のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる。いくつかの実施形態では、フレームは、平面に対して第２の方向であって、ふるいが、平面と第１のガス透過性表面との間で第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第２の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成される。いくつかの実施形態では、フレームは、平面に対して第３の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる第３の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成される。いくつかの実施形態では、細胞採取出口は、第３の方向での組織培養デバイスの重心と平面との間に配置される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を培養するためのシステムであって、組織培養デバイスが、組織培養デバイスを第１の方向、第２の方向、及び第３の方向に向けるように構成され、寸法決定される組織培養デバイス位置コントローラをさらに備え、第１の方向で、第１のガス透過性表面が、固定された平面及び第２のガス透過性表面に対して平行に、かつ固定された平面の上に、かつ第２のガス透過性表面の下に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、第２の方向で、ふるいが、平面と第１のガス透過性表面との間の第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、第３の方向で、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる、システムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を培養するためのシステムであって、ふるいが、腫瘍断片が第１の区画から第２の区画へと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が第１の区画から第２の区画へと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成される、システムを提供する。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン、約２００ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、約４０ミクロン、約３０ミクロン、または約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体がふるいを介して通過するのを防止するように構成される。

いくつかの実施形態では、本開示は、第２の区画の体積が、少なくとも約１００ｍＬである、上述の細胞を培養するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、第２の区画の体積の、第１の区画の体積に対する比率は、少なくとも約２：１である。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を培養するためのシステムであって、デバイス本体が、アクセスポートを備えるネック部分をさらに備え、ネック部分が、第１のガス透過性表面とふるいとの間に配置される、システムを提供する。いくつかの実施形態では、第１のガス透過性表面とふるいとの間の距離は、少なくとも約５ｃｍである。いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面とふるいとの間の距離は、少なくとも約５ｃｍである。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を培養するためのシステムであって、細胞培養デバイスが、ウェルと流体連通した第１の出口ポートと、第２のチャンバと流体連通した第２の出口ポートと、を備える、システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞を培養するためのシステムは、第１の出口ポートに流体的に接続された残存物収集デバイス、及び／または第２の出口ポートに流体的に接続された透過物収集デバイスをさらに備える。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の構成要素を備える。いくつかの実施形態では、細胞を培養するためのシステムは、細胞培養デバイスの細胞採取出口を細胞培養デバイスの入口ポートに接続するチューブをさらに備える。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、細胞培養デバイスよりも垂直に高く位置決めされ、細胞懸濁液が、組織培養デバイスの細胞採取出口から細胞培養デバイスの入口ポートまで重力によって運ばれることを可能にする。

いくつかの実施形態では、本開示は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の細胞を培養するためのシステムを使用して、ＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）（１）以下のステップ：（ｉ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過し、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、濾過するステップ、（ｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張を行うステップ、ここで、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、あるいは（２）以下のステップ：（ｉｉｉ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うステップであって、第１の期間中に、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張を行うステップ、（ｉｖ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過し、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、及び（ｖ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張の第２の期間が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、ここで、ステップ（ｉｉｉ）、ステップ（ｉｖ）、及びステップ（ｖ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、のうちのいずれかを行うことと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療的ＴＩＬ集団を採取することは、（３）細胞培養培地に治療的ＴＩＬ集団を懸濁させ、第２の区画において初期体積を有する細胞懸濁液を形成する、懸濁させるステップと、（４）細胞採取出口を介して第２の区画から細胞培養デバイスの入口ポートに細胞懸濁液を移すステップと、（５）細胞懸濁液を細胞培養デバイスの第１のチャンバに導入するステップと、（６）細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、細胞懸濁液の体積を、初期体積から低下させるステップと、を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の細胞を培養するためのシステムを使用して、ＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）（１）以下のステップ：（ｉ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過し、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、（ｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、ここで、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、あるいは（２）以下のステップ：（ｉｉｉ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過し、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、（ｉｖ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うステップであって、第１の期間中に、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張を行うステップ、及び（ｖ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、ここで、ステップ（ｉｉｉ）、ステップ（ｉｖ）、及びステップ（ｖ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、のうちのいずれかを行うことと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、採取することは、（３）細胞培養培地に治療的ＴＩＬ集団を懸濁させ、第２の区画において初期体積を有する細胞懸濁液を形成する、懸濁させるステップと、（４）細胞採取出口を介して第２の区画から細胞培養デバイスの入口ポートに細胞懸濁液を移すステップと、（５）細胞懸濁液を細胞培養デバイスの第１のチャンバに導入するステップと、（６）細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、細胞懸濁液の体積を、初期体積から低下させるステップと、を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、細胞懸濁液を第１のチャンバに導入する前に、細胞培養デバイスを垂直方向に向けることをさらに含む、方法を提供する。他の実施形態では、本方法は、細胞懸濁液を第１のチャンバに導入した後に、細胞培養デバイスを垂直方向に向けることを含む。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液の細胞が、第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを防止する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを拡張する方法は、細胞培養培地を細胞培養デバイスの第２のチャンバから除去することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞懸濁液の体積が、初期体積から最終体積まで低下する、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法を提供する。いくつかの実施形態では、最終体積は、細胞培養デバイスのウェル中に保持することができる液体の所定の体積とほぼ等しい。いくつかの実施形態では、初期体積の、最終体積に対する比率が、約１．５～約１５である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法は、細胞懸濁液の体積が最終体積まで低下した後に、細胞培養デバイスの第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することは、第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに細胞懸濁液を移すことを含む。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の構成要素を備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、ステップ（ｅ）が、細胞培養培地に治療的ＴＩＬ集団を懸濁させる前に、第２の区画と流体連通した廃棄出口を介して第２の区画から細胞培養培地の一部分を除去することをさらに含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養培地の一部分を除去することは、組織培養デバイスが第２の方向にある間に、廃棄出口の場所に基づいて細胞培養培地を所定のレベルまで排出させることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｅ）は、第２の区画から細胞培養デバイスの入口ポートに細胞懸濁液を移す前に、組織培養デバイスを平面に対して第３の方向に回転させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスが第３の方向にあるときに、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面は、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスが第３の方向にある間に、細胞懸濁液は、第２の区画から細胞培養デバイスの入口ポートに重力によって移される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、ステップ（ｄ）（１）において、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、ステップ（ｄ）（２）において、第２の拡張の第１の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、第２の拡張の第２の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２を補充することによって行われる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、ステップ（ｄ）（２）において、第２の拡張の第１の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、第２の拡張の第２の期間を開始する前に、細胞培養培地の少なくとも一部分が、第２の区画から除去され、ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地が、第２の区画に導入され、第３のＴＩＬ集団が、第２の拡張の第２の期間培養される、方法を提供する。

さらなる実施形態では、本開示は、組織培養デバイスであって、第１の細胞培養容器であって、第１の細胞培養容器の第１の区画と流体連通している第１のアクセスポートを備え、第１の区画が、第１の内部体積及び細胞を培養するための第１のガス透過性表面によって少なくとも部分的に画定される、第１の細胞培養容器と、上記の前段落のうちのいずれかに記載の少なくとも１つの細胞培養デバイスと、を備える、組織培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスの内部空間は、第１の区画に流体的に接続され、細胞培養デバイスの第１の壁の内側表面は、細胞を培養するために構成された第２のガス透過性表面を備える。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第１の細胞培養容器と細胞培養デバイスとの間の流体接続へのアクセスを提供するために第１の細胞培養容器内に配置された第２のアクセスポートを備える。いくつかの実施形態では、ふるいは、第２のアクセスポートを横切って配置される。いくつかの実施形態では、ふるいは、腫瘍断片が第１の区画から細胞培養デバイスへと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が第１の区画から細胞培養デバイスへと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成される。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン、約２００ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、約４０ミクロン、約３０ミクロン、または約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の組織培養デバイスであって、細胞培養デバイスの第１の壁及び第２の壁が、可撓性であり、組織培養デバイスが、第１の壁及び第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて細胞培養デバイスの内部空間中を液体が流れるのを防止するように構成される１つ以上の解放可能な固定具をさらに備える、組織培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具の場所は、細胞培養デバイスの入口ポートとダイアフラムとの間にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、クランプ、クリップ、ストラップ、弾性バンド、タイ、及び／または磁気固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、細胞培養デバイスに沿った所定の場所にそれぞれ位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、細胞培養デバイス上の第１の位置から細胞培養デバイス上の第２の位置まで摺動するように構成される摺動固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、摺動固定具とダイアフラムとの間に位置決めされた固定位置固定具をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞培養デバイスが、水平方向から垂直方向まで回転可能である、上述の組織培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスが水平方向にあるときに、ダイアフラムは、第１のチャンバの上に垂直に位置決めされ、第２のチャンバは、ダイアフラムの上に垂直に位置決めされる。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の組織培養デバイスであって、細胞培養デバイスの第１のチャンバが、残存物収集デバイスに流体的に接続され、細胞培養デバイスの第２のチャンバが、透過物収集デバイスに流体的に接続される、組織培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の構成要素を備える。

さらなる実施形態では、本開示は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、ＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、第１のアクセスポートを介して組織培養デバイスの第１の区画に添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第２のＴＩＬ集団を細胞培養デバイスの内部空間に移すことであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、細胞培養デバイス中の第２のＴＩＬ集団から分離する、移すことと、（ｅ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、細胞培養デバイスが水平方向にある間に、第２の拡張が、第２のガス透過性表面上で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｆ）ステップ（ｅ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、組織培養デバイスを開くことなく行われ、及び／またはステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、組織培養デバイスを開くことなく行われ、及び／またはステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、組織培養デバイスを開くことなく行われ、及び／またはステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、組織培養デバイスを開くことなく行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行、及びステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、組織培養デバイスを開くことなく行われる。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法であって、ステップ（ｆ）において治療的ＴＩＬ集団を採取することは、（１）細胞培養培地に治療的ＴＩＬ集団を懸濁させ、初期体積を有する細胞懸濁液を形成する、懸濁させるステップと、（２）細胞培養デバイスを水平方向から垂直方向まで回転させるステップであって、細胞懸濁液が、細胞培養デバイスの第１のチャンバを少なくとも部分的に充填する、回転させるステップと、（３）細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、細胞懸濁液の体積を、初期体積から低下させるステップと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法であって、細胞培養デバイスの第１の壁及び第２の壁が、可撓性であり、本方法が、１つ以上の解放可能な固定具を適用して、第１の壁及び第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて細胞培養デバイスの内部空間中をＴＩＬ及び／または細胞培養培地が流れるのを防止することも含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具を適用することは、上述の方法ステップ（ａ）～（ｄ）のうちのいずれか１つの前に行われる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、内部空間の近位端と１つ以上の解放可能な固定具の場所との間に配置される第２のガス透過性表面上で行われる。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、内部空間の近位端とダイアフラムとの間の細胞培養デバイスに沿って所定の場所に各々位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、所定の順序で複数の解放可能な固定具を解放して、第２の拡張中にＴＩＬを拡張するために利用可能である第２のガス透過性表面の領域を増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、少なくとも第１の期間及び第２の期間行われ、複数の解放可能な固定具のうちの第１のものは、第１の期間の後に解放され、複数の解放可能な固定具のうちの第２のものは、第２の期間の後に解放される。いくつかの実施形態では、第２の拡張の第１の期間は、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、複数の解放可能な固定具のうちの第１のものが解放される前に、第２の拡張の第１の期間からの細胞培養培地の少なくとも一部分は、細胞培養デバイスの内部空間から除去され、複数の解放可能な固定具のうちの第１のものが解放された後に、ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地は、細胞培養デバイスの内部空間に導入され、第３のＴＩＬ集団が、第２の拡張の第２の期間培養される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法であって、１つ以上の解放可能な固定具が、細胞培養デバイス上の第１の位置から細胞培養デバイス上の第２の位置まで摺動するように構成される摺動固定具を含み、第２の拡張中にＴＩＬを拡張するために利用可能である第２のガス透過性表面の領域を増加させる、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、少なくとも第１の期間及び第２の期間行われ、摺動固定具は、第１の期間の後に第１の位置から第２の位置まで摺動し、第２の期間は、摺動固定具が第２の位置まで摺動した後に行われる。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、摺動固定具とダイアフラムとの間に位置決めされた固定位置固定具をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能なファスナーの各々は、細胞懸濁液の体積を低下させる前に解放される。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具の各々は、細胞培養デバイスを水平方向から垂直方向に回転させる前に解放される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法であって、本方法が、細胞懸濁液の体積を低下させている間、または低下させた後に、液体を細胞培養デバイスの第２のチャンバから除去することも含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液の体積は、初期体積から最終体積まで低下する。いくつかの実施形態では、最終体積は、ウェル中に保持することができる液体の所定の体積とほぼ等しい。いくつかの実施形態では、初期体積の、最終体積に対する比率が、約１．５～約１５である。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞懸濁液の体積が最終体積まで低下した後に、細胞培養デバイスの第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することは、第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに細胞懸濁液を移すことを含む。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の構成要素を備える。

２Ａプロセスの実施形態（およそ２２日間のプロセス）と、ＴＩＬ製造のためのＧｅｎ３プロセスの実施形態（およそ１４日間～１６日間のプロセス）との比較を示す。 ステップＡ～Ｆ（およそ１４日間～１６日間のプロセス）の概要を提供する例示的なプロセスＧｅｎ３チャート。 ３つのプロセスバリエーションの各々について、ステップＡ～Ｆ（およそ１４日間～１６日間のプロセス）の概要と共に３つの例示的なＧｅｎ３プロセスを提供するチャート。 ステップＡ～Ｆ（およそ２２日間のプロセス）の概要を提供する例示的な修正されたＧｅｎ２類似プロセス。 複数のＧ－Ｒｅｘフラスコを使用する、Ｇｅｎ２（プロセス２Ａ）とＧｅｎ３との間の同等性についての実験フローチャートを提供する。本開示の実施形態を使用して、組織培養のための複数のガス透過性表面を有する組織培養デバイスを有する様々なＧ－Ｒｅｘフラスコで置換してもよい。 Ａ）Ｌ４０５４－Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスでのＴＩＬ産物に対する表現型特性決定。Ｂ）Ｌ４０５５－Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスでのＴＩＬ産物に対する表現型特性決定。Ｃ）Ｍ１０８５Ｔ－Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスでのＴＩＬ産物に対する表現型特性決定。 Ａ）Ｌ４０５４－Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスからのＴＩＬ産物に対するメモリーマーカー分析。Ｂ）Ｌ４０５５－Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスからのＴＩＬ産物に対するメモリーマーカー分析。Ｃ）Ｍ１０８５Ｔ－Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスからのＴＩＬ産物に対するメモリーマーカー分析。 （Ａ）ＣＤ４＋上でゲートされた、（Ｂ）ＣＤ８＋上でゲートされた、Ｌ４０５４活性化及び疲弊マーカー。 （Ａ）ＣＤ４＋上でゲートされた、（Ｂ）ＣＤ８＋上でゲートされた、Ｌ４０５５活性化及び疲弊マーカー。 ＩＦＮγ産生（ｐｇ／ｍＬ）：Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのための（Ａ）Ｌ４０５４、（Ｂ）Ｌ４０５５、及び（Ｃ）Ｍ１０８５Ｔ：ここに表される各々の棒グラフは、刺激を受けたもの、刺激を受けていないもの、及び培地対照のＩＦＮγレベルの平均＋ＳＥＭである。４５０ｎｍで測定された光学密度。 細胞培養上清中のＩＬ－２濃度のＥＬＩＳＡ分析：（Ａ）Ｌ４０５４及び（Ｂ）Ｌ４０５５。ここに表される各々の棒グラフは、使用済み培地に対するＩＬ－２レベルの平均＋ＳＥＭである。４５０ｎｍで測定された光学密度。 使用済み培地中のグルコース及び乳酸塩の定量化（ｇ／Ｌ）：（Ａ）グルコース及び（Ｂ）乳酸塩：２つの腫瘍系統、及び両方のプロセスにおいて、ＲＥＰ拡張全体でグルコースの減少が観察された。逆に、予想されるように、乳酸塩の増加が観察された。グルコースの減少及び乳酸塩の増加は両方とも、Ｇｅｎ２プロセスとＧｅｎ３プロセスとの間で同等であった。 Ｌ４０５４及びＬ４０５５についての使用済み培地中のＬ－グルタミンの定量化。 Ｌ４０５４及びＬ４０５５についての使用済み培地中のＧｌｕｔａｍａｘの定量化。 Ｌ４０５４及びＬ４０５５についての使用済み培地中のアンモニアの定量化。 テロメア長分析。相対テロメア長（ＲＴＬ）値は、ＤＡＫＯキットを使用した対照細胞株（１３０１白血病細胞株）における染色体／ゲノムあたりのテロメア蛍光のＧｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスにおける染色体／ゲノムあたりの平均テロメア蛍光を示す。 Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセス下でのＬ４０５４及びＬ４０５５のＴＩＬ最終産物の固有のＣＤＲ３配列分析。棒グラフは、採取日Ｇｅｎ２（例えば、２２日目）及びＧｅｎ３プロセス（例えば、１４～１６日目）に収集された１×１０^６個の細胞から特定された固有のＴＣＲ Ｂクロノタイプの数を示す。Ｇｅｎ３は、試料内の固有のペプチドＣＤＲの数に基づいて、Ｇｅｎ２と比較して、高いクローン多様性を示した。 Ｌ４０５４ ＩＬで採取された最終細胞産物（Ｇｅｎ ２（例えば、２２日目）及びＧｅｎ３プロセス（例えば、１４～１６日目））での固有のＣＤＲ３配列の頻度。 Ｌ４０５５ ＴＩＬで採取された最終細胞産物（Ｇｅｎ ２（例えば、２２日目）及びＧｅｎ３プロセス（例えば、１４～１６日目））での固有のＣＤＲ３配列の頻度。 Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセス下でのＬ４０５４及びＬ４０５５のＴＩＬ最終製品の固有の多様性指数。シャノンエントロピー多様性指数は、比較のためのより信頼性の高い一般的な測定基準である。Ｇｅｎ３ Ｌ４０５４及びＬ４０５５は、Ｇｅｎ２よりもわずかに高い多様性を示した。 表５１に提示される７日目－Ｇｅｎ３ ＲＥＰ開始の細胞数の生データ。 表５１に提示される１１日目－Ｇｅｎ２ ＲＥＰ開始及びＧｅｎ３スケールアップの細胞数の生データ。 表５２に提示される１６日目－Ｇｅｎ２スケールアップ及びＧｅｎ３採取（例えば、１６日目）の細胞数の生データ。 表５２に提示される２２日目－Ｇｅｎ２採取（例えば、２２日目）の細胞数の生データ。Ｌ４０５４ Ｇｅｎ２の場合、ＬＯＶＯ後の数は、研究の総数であっため、４つのフラスコに外挿された。１つのフラスコが汚染され、合計＝６．６７Ｅ＋１０について外挿が行われた。 図３Ａ、４Ａ、及び４Ｂに示されるフローサイトメトリー結果についての生データ。 図３Ｃ及び４Ｃに示されるフローサイトメトリー結果についての生データ。 図５Ａ～５Ｂ及び６Ａ～６Ｂに示されるフローサイトメトリー結果についての生データ。 図７Ａに示されるＬ４０５４試料のＩＦＮγ産生アッセイ結果についての生データ。 図７Ａに示されるＬ４０５４試料のＩＦＮγ産生アッセイ結果についての生データ。 図７Ｂに示されるＬ４０５５試料のＩＦＮγ産生アッセイ結果についての生データ。 図７Ｂに示されるＬ４０５５試料のＩＦＮγ産生アッセイ結果についての生データ。 図７Ｃに示されるＭ１０８５Ｔ試料のＩＦＮγ産生アッセイ結果についての生データ。 図７Ｃに示されるＭ１０８５Ｔ試料のＩＦＮγ産生アッセイ結果についての生データ。 図８Ａ～８Ｂに示されるＩＬ－２ ＥＬＩＳＡアッセイ結果についての生データ。 図８Ａ～８Ｂに示されるＩＬ－２ ＥＬＩＳＡアッセイ結果についての生データ。 図９Ａ～９Ｂ及び１０Ａ～１０Ｃに提示される代謝基質および代謝分析結果についての生データ。 図１１に提示される相対テロメア長分析結果についての生データ。 図１２及び１５に提示される固有のＣＤ３配列及びクローン多様性分析結果についての生データ。 様々なＧｅｎ２（プロセス２Ａ）とＧｅｎ３．１プロセス実施形態との間の比較を示す。 Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ２．１及びＧｅｎ３．０プロセスの実施形態の様々な特徴を説明する表。 Ｇｅｎ３．１と称される、Ｇｅｎ３プロセスの実施形態のための培地条件の概要。 Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ２．１及びＧｅｎ３．０プロセスの実施形態の様々な特徴を説明する表。 Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３．０プロセスの実施形態の様々な特徴を比較する表。 記載された拡張プロセスの様々な実施形態における培地の使用を提供する表。 表現型比較：プロセスのＧｅｎ３．０及びＧｅｎ３．１の実施形態は、同等のＣＤ２８、ＣＤ２７、及びＣＤ５７発現を示した。Ｇｅｎ３．１試験（０日目のＯＫＴ－３及びフィーダーの添加を含む）は、採取時にフラスコの最大容量に達した。 Ｇｅｎ３最終産物でのＩＦＮγの産生の増加。培養凍結上清においてＩＦＮγ分析（ＥＬＩＳＡによる）を評価して、両方のプロセスを比較した。各腫瘍について、各Ｇｅｎ２（例えば、２２日目）及びＧｅｎ３プロセス（例えば、１６日目）で新鮮なＴＩＬ産物を使用して、コーティングされた抗ＣＤ３プレートで一晩刺激。ここに表される各々の棒グラフは、刺激を受けたもの、刺激を受けていないもの、及び培地対照のＩＦＮγレベルである。 Ａ）ＴＩＬ最終産物についての固有のＣＤＲ３配列分析：棒グラフは、Ｇｅｎ２（例えば、２２日目）及びＧｅｎ３プロセス（例えば、１４～１６日目）に収集された１×１０^６個の細胞から特定された固有のＴＣＲ Ｂクロノタイプの数を示す。Ｇｅｎ３は、試料内の固有のペプチドＣＤＲの数に基づいて、Ｇｅｎ２と比較して、高いクローン多様性を示した。Ｂ）ＴＩＬ最終産物の多様性指数：シャノンエントロピー多様性指数は、比較のためのより信頼性の高い一般的な測定基準である。Ｇｅｎ３は、Ｇｅｎ２よりもわずかに高い多様性を示した。Ｃ）Ｇｅｎ３、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験プロセスにおけるＬ４０６３及びＬ４０６４のＴＩＬ最終産物の固有のＣＤＲ３配列分析。棒グラフは、Ｇｅｎ３及びＧｅｎ３．１プロセスの採取日１６日目に収集された１×１０^６個の細胞から特定された固有のＴＣＲ Ｂクロノタイプの数を示す。Ｇｅｎ３．１は、試料内の固有のペプチドＣＤＲの数に基づいて、Ｇｅｎ３と比較して、わずかに高いクローン多様性を示した。Ｄ）Ｇｅｎ３におけるＬ４０６３及びＬ４０６４のＴＩＬ最終産物の多様性指数。Ｇｅｎ３．１対照及びＧｅｎ３．１試験プロセス。シャノンエントロピー多様性指数は、比較のためのより信頼性の高い一般的な測定基準である。Ｌ４０６３及びＬ４０６４に対するＧｅｎ３．１条件は、Ｇｅｎ３プロセスよりもわずかに高い多様性を示した。 １９９個の配列がＧｅｎ３最終産物とＧｅｎ２最終産物との間で共有され、Ｇｅｎ３最終産物と共有されるＧｅｎ２からの固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の９７．０７％に相当する。 １８３３個の配列がＧｅｎ３最終産物とＧｅｎ２最終産物との間で共有され、Ｇｅｎ３最終産物と共有されるＧｅｎ２からの固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の９９．４５％に相当する。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３プロセスを使用して造血器悪性腫瘍からＴＩＬを拡張するための方法の例示的な実施形態の概略図。０日目に、正または負の選択法を使用して、すなわち、Ｔ細胞マーカー（ＣＤ２、ＣＤ３などを使用してＴ細胞を除去するか、または他の細胞を除去してＴ細胞を残して）、あるいは勾配遠心分離を使用して、リンパ球、全血、または腫瘍消化物（新鮮または解凍）が濃縮されたアフェレーシス産物からＴ細胞画分（ＣＤ３＋、ＣＤ４５＋）を単離する。 複数のＧ－Ｒｅｘフラスコを使用する、Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。本開示の実施形態を使用して、組織培養のための複数のガス透過性表面を有する組織培養デバイスを有する様々なＧ－Ｒｅｘフラスコで置換してもよい。 Ｇｅｎ３．１プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態（Ｇｅｎ３．１試験）のプロセス概要を提供する。 Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態について、ＴＩＬ増殖からのデータ、腫瘍断片当たりの平均総生細胞数、採取日の生存率、及び採取日の総生細胞数（ＴＶＣ）を提供する。Ｇｅｎ３．１試験（０日目のＯＫＴ－３及びフィーダーの添加を含む）は、採取時にフラスコの最大容量に達した。０日目に最大４つのフラスコを開始する場合は、各ＴＶＣ採取量に４を掛けるべきである。 １６日プロセスであるＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態について、総生細胞数（ＴＶＣ）及び存率を示す棒グラフ。 Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態が、同等のＣＤ２８、ＣＤ２７、及びＣＤ５７発現を示した細胞を得たことを示すデータを提供する。 ＴＩＬメモリーステータスが、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態によって得られた細胞間で同等であったことを示すデータを提供する。ＲＥＰ ＴＩＬのメモリーステータスは、次のように示される。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＴＩＬメモリーサブセットを、異なるメモリーサブセットに分割した。ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）、ＣＭ：セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋）、ＥＭ：エフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－）、ＴＥＭＲＡ／ＴＥＦＦ：ＲＡ＋エフェクターメモリー／エフェクター（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）。提示された棒グラフは、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋上でゲートされた場合の陽性ＣＤ４５＋／－ＣＤ６２Ｌ＋／－のパーセンテージである。 ＴＩＬ活性化／疲弊マーカーが、ＣＤ４＋上でゲートされた場合に、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態によって得られた細胞間で同等であったことを示すデータを提供する。ＲＥＰ ＴＩＬの活性化及び疲弊は、マルチカラーフローサイトメトリーによって決定された。採取したＴＩＬ試料を、フローサイトメトリー抗体（ＣＤ３－ＢＵＶ３９５、ＰＤ－１－ＢＶ４２１、２Ｂ４／ＣＤ２４４－ＰＢ、ＣＤ８－ＢＢ５１５、ＣＤ２５－ＢＵＶ５６３、ＢＴＬＡ－ＰＥ、ＫＬＲＧ１－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ ５９４、ＴＩＭ－３－ＢＶ６５０、ＣＤ１９４／ＣＣＲ４－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＶｉｏＧｒｅｅｎ、ＴＩＧＩＴ－ＰｅｒＣＰ－ｅＦｌｕｏｒ ７１０、ＣＤ１８３－ＢＶ７１１、ＣＤ６９－ＡＰＣ－Ｒ７００、ＣＤ９５－ＢＵＶ７３７、ＣＤ１２７－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ１０３－ＢＶ７８６、ＬＡＧ－３－ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ ７８０）で染色した。提示される棒グラフは、ＲＥＰ ＴＩＬのＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＴＩＬのパーセンテージである。 ＴＩＬ活性化／疲弊マーカーが、ＣＤ８＋上でゲートされた場合に、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１）の例示的な実施形態によって得られた細胞間で同等であったことを示すデータを提供する。ＲＥＰ ＴＩＬの活性化及び疲弊は、マルチカラーフローサイトメトリーによって決定された。ＴＩＬ採取試料を、フローサイトメトリー抗体（ＣＤ３－ＢＵＶ３９５、ＰＤ－１－ＢＶ４２１、２Ｂ４／ＣＤ２４４－ＰＢ、ＣＤ８－ＢＢ５１５、ＣＤ２５－ＢＵＶ５６３、ＢＴＬＡ－ＰＥ、ＫＬＲＧ１－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ ５９４、ＴＩＭ－３－ＢＶ６５０、ＣＤ１９４／ＣＣＲ４－ＡＰＣ、ＣＤ４－ＶｉｏＧｒｅｅｎ、ＴＩＧＩＴ－ＰｅｒＣＰ－ｅＦｌｕｏｒ ７１０、ＣＤ１８３－ＢＶ７１１、ＣＤ６９－ＡＰＣ－Ｒ７００、ＣＤ９５－ＢＵＶ７３７、ＣＤ１２７－ＰＥ－Ｃｙ７、ＣＤ１０３－ＢＶ７８６、ＬＡＧ－３－ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ ７８０）で染色した。提示される棒グラフは、ＲＥＰ ＴＩＬのＣＤ４＋またはＣＤ８＋ＴＩＬのパーセンテージである。 Ｇｅｎ３．１最終産物によって示されるＩＦＮ－γの産生量が多いことを示すデータを提供する。培養凍結上清においてＩＦＮγ分析ＥＬＩＳＡを評価して、両方のプロセスを比較した。各腫瘍について、各採取日に新鮮なＴＩＬ産物を使用して、コーティングされた抗ＣＤ３プレートで一晩刺激。ここに表される各々の棒グラフは、刺激を受けたもの、刺激を受けていないもの、及び培地対照のＩＦＮ－γレベルである。 上清のＩＬ－２濃度が、標準培地を使用したＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態にわたって同等であったことを示すデータを提供する。左パネル：Ｌ４０６３－Ｇｅｎ２標準培地。右パネル：Ｌ４０６４－ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地。＊ＥＬＩＳＡはＡＩＭ Ｖ希釈液で行った 代謝物濃度が、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態にわたって上清で同等であったことを示すデータを提供する。Ｌ４０６３ ＴＩＬは、標準培地中で拡張された。Ｌ４０６４ ＴＩＬは、ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ培地中で拡張された。 Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態に関するテロメア長分析。腫瘍識別番号Ｌ４０６３及びＬ４０６４によって得られた細胞のテロメア長分析：相対テロメア長（ＲＴＬ）値は、ＤＡＫＯキットを使用した対照細胞株（１３０１白血病細胞株）の染色体／ゲノム当たりのテロメア蛍光を超える、Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験プロセスによって産生された細胞における染色体／ゲノム当たりの平均テロメア蛍光を示す。 Ｇｅｎ３．１試験（最適化されたＧｅｎ３．１）プロセス（１６～１７日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 例示的なＧｅｎ２プロセス及び例示的なＧｅｎ３プロセスの比較表であり、例示的な差は強調されている。 例示的なＧｅｎ２プロセス及び例示的なＧｅｎ３プロセスの比較表であり、例示的な差は強調されている。 Ｇｅｎ３プロセス（１６／１７日プロセス）調製タイムラインの例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３プロセス（１４～１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 例示的なＧｅｎ３プロセス実施形態の３回の操作試行の１６／１７日目からのデータの要約。 ＴＩＬの拡張された表現型に関するデータ：例示的なＧｅｎ３プロセス実施形態の２回の操作試行によって産生された細胞のＴＩＬ同一性（ＩＤ）仕様に対する分化特徴が示される。 肺腫瘍から拡張されたＴＩＬの拡張された表現型に関するデータ：肺腫瘍組織を使用した例示的なＧｅｎ３プロセス実施形態の２つのプロセス開発（ＰＤ）試行によって産生された細胞のＴＩＬ同一性（ＩＤ）仕様に対する分化特徴が示される。 卵巣腫瘍から拡張されたＴＩＬの拡張された表現型（純度、同一性、及びメモリーに関するデータ：例示的なＧｅｎ２、Ｇｅｎ３．１、及びＦＲＥＲ（凍結腫瘍、早期ＲＥＰ）プロセスの実施形態を使用して卵巣腫瘍から拡張された細胞の純度、同一性、及びメモリー表現型特徴が示され、^＊は、試験されていない条件を示し、^Ｙは、サンプリングの問題、低いＴＶＣ数、または解凍中の生存不能な細胞を示す。 ＴＩＬの特徴付けのためのゲーティング戦略（ゲーティング階層が示される）、及び例示的なＧｅｎ３プロセス実施形態の２回の操作試行によって産生された細胞の拡張された表現型特徴に関するデータが示される。 ＴＩＬの特徴付けのためのゲーティング戦略（ゲーティング階層が示される）、及び例示的なＧｅｎ３プロセス実施形態の２回の操作試行によって産生された細胞のＣＤ４＋亜集団及びＣＤ８＋亜集団の拡張された表現型特徴に関するデータが示される。 例示的なＧｅｎ３プロセス実施形態の２回の操作試行によって産生された細胞のグランザイムＢ ＥＬＩＳＡ分析に関するデータが示される。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の例示的な実施形態の概略図。 Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ２．１、及びＧｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の実施形態の比較。 Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ２．１、及びＧｅｎ３プロセス（１６日プロセス）の実施形態の比較。 Ｇｅｎ３実施形態の成分。 Ｇｅｎ３実施形態のフローチャート比較（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）。 標準細胞培養培地及び無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３実施形態（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）について、総生細胞数及び倍率拡張が提示される。 標準細胞培養培地及び無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３実施形態（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）について、再活性化、培養スケールアップ及びＴＩＬ採取時の生存率スコア％が提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することによって産生された最終ＴＩＬ産物の表現型特徴が提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することによって産生されたＴＩＬ産物のメモリーマーカー分析が提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）、その後、ＣＤ４＋ゲーティングされた細胞選別においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することによって産生されたＴＩＬの活性化及び疲弊マーカーが提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）、その後、ＣＤ８＋ゲーティングされた細胞選別においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することによって産生されたＴＩＬの活性化及び疲弊マーカーが提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することによって産生された最終ＴＩＬ産物のＩＦＮ－γ産生（ｐｇ／ｍＬ）スコアが提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することからの使用済み培地（再活性化、培養スケールアップ、及びＴＩＬ採取時に収集された）のＩＬ－２濃度（ｐｇ／ｍＬ）分析が提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することからの使用済み培地（再活性化、培養スケールアップ、及びＴＩＬ採取時に収集された）のグルコース濃度（ｇ／Ｌ）が提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することからの使用済み培地（再活性化、培養スケールアップ、及びＴＩＬ採取時に収集された）の乳酸塩濃度（ｇ／Ｌ）が提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することからの使用済み培地（再活性化、培養スケールアップ、及びＴＩＬ採取時に収集された）のグルタミン濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）が提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することからの使用済み培地（再活性化、培養スケールアップ、及びＴＩＬ採取時に収集された）のｇｌｕｔａｍａｘ濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）が提示される。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、例示的なＧｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験）においてＬ４０６３及びＬ４０６４腫瘍試料を処理することからの使用済み培地（再活性化、培養スケールアップ、及びＴＩＬ採取時に収集された）のアンモニア濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）が提示される。Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態に関するテロメア長分析。腫瘍識別番号Ｌ４０６３及びＬ４０６４によって得られた細胞のテロメア長分析：相対テロメア長（ＲＴＬ）値は、ＤＡＫＯキットを使用した対照細胞株（１３０１白血病細胞株）の染色体／ゲノム当たりのテロメア蛍光を超える、Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験プロセスによって産生された細胞における染色体／ゲノム当たりの平均テロメア蛍光を示す。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態によって産生されたＴＩＬに関するテロメア長分析。腫瘍識別番号Ｌ４０６３及びＬ４０６４によって得られた細胞のテロメア長分析：相対テロメア長（ＲＴＬ）値は、ＤＡＫＯキットを使用した対照細胞株（１３０１白血病細胞株）の染色体／ゲノム当たりのテロメア蛍光を超える、Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験プロセスによって産生された細胞における染色体／ゲノム当たりの平均テロメア蛍光を示す。 標準細胞培養培地及びＣＴＳ無血清細胞培養培地を使用した、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態によって産生されたＴＩＬのＴＣＲ Ｖβレパートリーの要約。固有のＣＤＲ３配列のＴＣＲ Ｖβレパートリーによって測定される場合の、Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、及びＧｅｎ３．１試験プロセスによって産生された腫瘍識別番号Ｌ４０６３及びＬ４０６４によって得られた最終ＴＩＬ製品のＴＩＬのクローン性について説明される。 Ｌ４０６３腫瘍試料の処理から採取されたＴＩＬ産物における固有のＣＤＲ３配列の頻度に関して、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態によって産生されたＴＩＬの比較。 Ｌ４０６３腫瘍試料の処理から採取されたＴＩＬ細胞産物における共有される固有のＣＤＲ３配列のパーセンテージに関して、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態によって産生されたＴＩＬの比較：９７５個の配列が、Ｇｅｎ３．０試験最終産物とＧｅｎ３．１試験最終産物との間で共有され、Ｇｅｎ３．１試験最終産物と共有されるＧｅｎ３．０由来の固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の８８％に相当する。 Ｌ４０６４腫瘍試料の処理から採取されたＴＩＬ細胞産物における共有される固有のＣＤＲ３配列のパーセンテージに関して、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態によって産生されたＴＩＬの比較：２１６３個の配列が、Ｇｅｎ３．０試験最終産物とＧｅｎ３．１試験最終産物との間で共有され、Ｇｅｎ３．１試験最終産物と共有されるＧｅｎ３．０由来の固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の８７％に相当する。 Ｌ４０６４腫瘍試料の処理から採取されたＴＩＬ産物における固有のＣＤＲ３配列の頻度に関して、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３．０、Ｇｅｎ３．１対照、Ｇｅｎ３．１試験）の例示的な実施形態によって産生されたＴＩＬの比較。 Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３－最適化されたもの、１６～１７日プロセス）の例示的な実施形態の成分が示される。 承認基準表 細胞数再活性化日。 細胞数スケールアップ日。 細胞数採取Ｌ４０６３。 細胞数採取Ｌ４０６４。 フローデータ。 フローデータ。 フローデータ。 フローデータ。 ＩＦＮ－γ産生データ図７－Ｌ４０６３。 ＩＦＮ－γ産生データ図７－Ｌ４０６３。 データＩＦＮ－γ産生図７－Ｌ４０６４。 データＩＦＮ－γ産生図７－Ｌ４０６４。 ＩＬ－２濃度データのＥＬＩＳＡ分析。 ＩＬ－２濃度データのＥＬＩＳＡ分析。 代謝データ要約表。 要約データ。 要約データ。 シャノン多様性指数。 ステップＡ～Ｆの概要を提供する例示的なプロセス２Ａチャート。 構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂを提供し、円筒は、個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂは、例えば、４－１ＢＢＬまたは４－１ＢＢに結合する抗体に由来する３つの直線的に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これらが折り重なって三価タンパク質を形成し、その後、これがＩｇＧ１－Ｆｃ（ＣＨ３及びＣＨ２ドメインを含む）によって第２の三価タンパク質に連結され、その後、これを使用して、三価タンパク質のうちの２つをジスルフィド結合（小さく長細い楕円）によって一緒に連結し、構造を安定化し、６つの受容体及びシグナル伝達タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを一緒にして、シグナル伝達複合体を形成することができるアゴニストを提供する。円筒として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基及び柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列、ならびに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーによって結合されたＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む、ｓｃＦｖドメインであり得る。 本開示の一実施形態による、生検試料を使用するＧｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの概要。 複数のＧ－Ｒｅｘフラスコを使用するＧｅｎ３プロセスの例示的な実施形態。本開示の一実施形態によれば、本開示の実施形態を使用して、組織培養のための複数のガス透過性表面を有する組織培養デバイスを有する様々なＧ－Ｒｅｘフラスコで置換してもよい。 本開示の一実施形態による、ＴＩＬ培養で使用するための例示的なバイオリアクターシステム。 本開示の一実施形態による、細胞を培養するための第１のガス透過性表面１０１、細胞を培養するための第２のガス透過性表面１０２、第１及び第２のガス透過性表面を接続する１つ以上の側壁１０３と、腫瘍断片または嵩高い消化物が第１の区画から第２の区画へと移動することを制限するために第１のガス透過性表面と第２のガス透過性表面との間に配置される、ふるい１０４と、１つ以上の方向にフレームを支持するためのフレーム１０９と、を備える、自動化されたＴＩＬ培養のための例示的な組織培養デバイス。 本開示の一実施形態による、第１の方向１１３（例えば、第１のガス透過性表面上で細胞を培養するための）、第２の方向１１４（例えば、第２のガス透過性表面上で細胞を培養するための）、及び第３の方向１１５（例えば、細胞を採取するための）例示的な組織培養デバイスを示す図。 本明細書に開示される１つ以上の実施形態による、自動化されたＴＩＬ培養のための例示的な組織培養デバイス。 ＴＩＬ拡張のためのプロセス（例えば、Ｇｅｎ２またはＧｅｎ３）における、本発明の１つ以上の実施形態による本開示の組織培養デバイスを使用するための例示的な方法。 ＴＩＬ拡張のためのプロセス（例えば、Ｇｅｎ２またはＧｅｎ３）における、本発明の１つ以上の実施形態による本開示の組織培養デバイスを使用するための例示的な方法。 ＴＩＬ拡張のためのプロセス（例えば、Ｇｅｎ２またはＧｅｎ３）における、本発明の１つ以上の実施形態による本開示の組織培養デバイスを使用するための例示的な方法。 ＴＩＬ拡張のためのプロセス（例えば、Ｇｅｎ２またはＧｅｎ３）における、本発明の１つ以上の実施形態による本開示の組織培養デバイスを使用するための例示的な方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、自動化されたＴＩＬ培養（例えば、Ｇｅｎ２、Ｇｅｎ３プロセスを使用する）のための例示的な組織培養デバイス。 本発明の１つ以上の実施形態による、細胞を培養するための第１のガス透過性表面２０４を有する第１の容器２０１と、細胞を培養するための第２のガス透過性表面２０６を有する拡張可能な第２の細胞培養容器２０５と、第１の容器中の第１の区画２０３と第２の容器中の第２の区画２０７との間にあり、それらの間をＴＩＬを移すための流体接続２１０と、第１の区画内のその開口部に、またはそれに近接して流体接続中に配置され、腫瘍断片または嵩高い消化物材料が第１の区画から第２の区画へと移動することを制限する、ふるい２１４と、を備える、自動化されたＴＩＬ培養のための例示的な組織培養デバイス。 本発明の１つ以上の実施形態による、自動化されたＴＩＬ培養（例えば、Ｇｅｎ２プロセスを使用する）、ならびに細胞培養に利用可能な第２の細胞培養容器の体積及び／または第２のガス透過性表面の領域を調節するための制限手段（例えば、バッグクランプ）のための例示的な組織培養デバイス及びバイオリアクター。 本発明の１つ以上の実施形態による、ＴＩＬ拡張のためのＧｅｎ２プロセスにおいて、本開示の組織培養デバイス及び制限手段（例えば、バッグクランプ）を使用するための例示的な方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、ＴＩＬ拡張のためのＧｅｎ２プロセスにおいて、本開示の組織培養デバイス及び制限手段（例えば、バッグクランプ）を使用するための例示的な方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、ＴＩＬ拡張のためのＧｅｎ２プロセスにおいて、本開示の組織培養デバイス及び制限手段（例えば、バッグクランプ）を使用するための例示的な方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、ＴＩＬ拡張のためのＧｅｎ２プロセスにおいて、本開示の組織培養デバイス及び制限手段（例えば、バッグクランプ）を使用するための例示的な方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、自動化されたＴＩＬ培養（例えば、Ｇｅｎ２プロセスを使用する）、ならびに細胞培養に利用可能な第２の細胞培養容器の体積及び／または第２のガス透過性表面の領域を調節するためのトレイ摺動蓋のための例示的な組織培養デバイス、バイオリアクター、及び方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、自動化されたＴＩＬ培養（例えば、Ｇｅｎ２プロセスを使用する）、ならびに細胞培養に利用可能な第２の細胞培養容器の体積及び／または第２のガス透過性表面の領域を調節するためのトレイ調整可能なスペーサーのための例示的な組織培養デバイス、バイオリアクター、及び方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、（例えば、Ｇｅｎ３プロセス）を使用する自動化されたＴＩＬ培養のための例示的な組織培養デバイス。 本発明の１つ以上の実施形態による、（例えば、ＴＩＬ拡張のためにＧｅｎ３プロセスを使用する）本開示の組織培養デバイスを使用するための例示的な方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、（例えば、ＴＩＬ拡張のためにＧｅｎ３プロセスを使用する）本開示の組織培養デバイスを使用するための例示的な方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、（例えば、ＴＩＬ拡張のためにＧｅｎ３プロセスを使用する）本開示の組織培養デバイスを使用するための例示的な方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、（例えば、ＴＩＬ拡張のためにＧｅｎ３プロセスを使用する）本開示の組織培養デバイスを使用するための例示的な方法。 本発明の１つ以上の実施形態による、自動化されたＴＩＬ培養（例えば、Ｇｅｎ３プロセスを使用する）、ならびに、（ｉ）培養のために利用可能な第１の細胞培養容器の体積及び／または第１のガス透過性表面の領域、及び／または（ｉｉ）細胞培養のために利用可能な第２の細胞培養容器の体積及び／または第２のガス透過性表面の領域を調節するための制限手段（例えば、バッグクランプ）のための例示的な組織培養デバイス及びバイオリアクター。 本発明の１つ以上の実施形態による、本開示の組織培養デバイス及びバッグクランプを使用するための例示的な方法（例えば、ＴＩＬ拡張のためのＧｅｎ３プロセスを使用する）。 本発明の１つ以上の実施形態による、本開示の組織培養デバイス及びバッグクランプを使用するための例示的な方法（例えば、ＴＩＬ拡張のためのＧｅｎ３プロセスを使用する）。 本発明の１つ以上の実施形態による、本開示の組織培養デバイス及びバッグクランプを使用するための例示的な方法（例えば、ＴＩＬ拡張のためのＧｅｎ３プロセスを使用する）。 本発明の１つ以上の実施形態による、本開示の組織培養デバイス及びバッグクランプを使用するための例示的な方法（例えば、ＴＩＬ拡張のためのＧｅｎ３プロセスを使用する）。 本発明の１つ以上の実施形態による、自動化されたＴＩＬ培養（例えば、Ｇｅｎ３プロセスを使用する）、ならびに細胞培養に利用可能な第２の細胞培養容器の体積及び／または第２のガス透過性表面の領域を調節するためのトレイ摺動蓋のための例示的な組織培養デバイス、バイオリアクター、及び方法。 本発明の一実施形態による、自動化されたＴＩＬ培養（例えば、Ｇｅｎ３プロセスを使用する）、ならびに細胞培養に利用可能な第２の細胞培養容器の体積及び／または第２のガス透過性表面の領域を調節するためのトレイ調整可能なスペーサーのための例示的な組織培養デバイス、バイオリアクター、及び方法。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞を培養し、及び／または細胞懸濁液を濃縮するために使用され得る細胞培養デバイスの正面図を示す概略図。 図１３０Ａに示される細胞培養デバイスの断面側面図。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３０Ａに示される細胞培養デバイスの変形例の正面図を示す概略図。 図１３１Ａに示される細胞培養デバイスの断面側面図。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３０Ａに示される細胞培養デバイスのさらなる変形例の正面図を示す概略図であり、細胞培養デバイスは、細胞培養デバイスの内部空間の近位端まで延在しないダイアフラムを備える。 図１３１Ｃに示される細胞培養デバイスの断面側面図。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３１Ｃに示される細胞培養デバイスの変形例の正面図を示す概略図であり、ダイアフラムは、細胞培養デバイスの内部空間の遠位部分または遠位の半分内に全体的に位置する。 図１３１Ｅに示される細胞培養デバイスの断面側面図。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３０Ａに示される細胞培養デバイスのさらなる変形例の正面図を示す概略図であり、ダイアフラムの第２のセクションは、ダイアフラムの幅全体に延在しない。 図１３１Ｃに示される細胞培養デバイスのさらなる変形例の正面図を示す概略図であり、ダイアフラムの第２のセクションは、ダイアフラムの幅全体に延在しない。 図１３１Ｅに示される細胞培養デバイスの変形例の正面図を示す概略図であり、ダイアフラムの第２のセクションは、ダイアフラムの幅全体に延在しない。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３０Ａに示される細胞培養デバイスのさらなる変形例の正面図を示す概略図であり、ダイアフラムの第２のセクションは、複数の部分に分割される。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３１Ｃに示される細胞培養デバイスのさらなる変形例の正面図を示す概略図であり、ダイアフラムの第２のセクションは、複数の部分に分割される。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３１Ｅに示される細胞培養デバイスのさらなる変形例の正面図を示す概略図であり、ダイアフラムの第２のセクションは、複数の部分に分割される。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３０Ａに示される細胞培養デバイスのさらなる変形例の正面図を示す概略図であり、細胞培養デバイスの内部空間の少なくとも一部は、遠位端に向かってテーパー状である。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３０Ａに示される細胞培養デバイスのさらなる変形例の正面図を示す概略図であり、細胞培養デバイスの内部空間の少なくとも一部は、遠位端に向かって湾曲している。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞懸濁液が図１３０Ａの細胞培養デバイスを使用して濃縮される連続的なステップを示す断面図。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３０Ａの細胞培養デバイスを備える細胞培養システムの成分を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態による、チューブに接続された複数の別個の入口ポートを備える図１３０Ａの細胞培養デバイスのさらなる変形例の正面図を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態による、図１３０Ａの細胞培養デバイスとの使用における図１１４～１１５の組織培養デバイスの実施形態を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞が、図１３０Ａの細胞培養デバイス中で培養され、それによって濃縮される連続的なステップを示す断面図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞が、図１３０Ａの細胞培養デバイス中で培養され、それによって濃縮される連続的なステップを示す断面図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞が、図１３０Ａの細胞培養デバイス中で培養され、それによって濃縮される連続的なステップを示す断面図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞が、図１３０Ａの細胞培養デバイス中で培養され、それによって濃縮される連続的なステップを示す断面図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞が、図１３０Ａの細胞培養デバイス中で培養され、それによって濃縮される連続的なステップを示す断面図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞が、図１３０Ａの細胞培養デバイス中で培養され、それによって濃縮される連続的なステップを示す断面図。 本発明のいくつかの実施形態によって細胞培養物を培養し、濃縮するための、図１３０Ａの細胞培養デバイスを備える図１１９の組織培養デバイスの実施形態を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態によって細胞培養物を培養し、濃縮するための、図１３０Ａの細胞培養デバイスを備える図１１９の組織培養デバイスの実施形態を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態によって細胞培養物を培養し、濃縮するための、図１３０Ａの細胞培養デバイスを備える図１１９の組織培養デバイスの実施形態を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態によって細胞培養物を培養し、濃縮するための、図１３０Ａの細胞培養デバイスを備える図１１９の組織培養デバイスの実施形態を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞培養デバイス、及び細胞培養デバイスの体積を制限するための体積選択手段の実施形態の概略図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞培養デバイス及び複数の体積選択手段のさらなる実施形態、ならびにその使用を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞培養デバイス及び複数の体積選択手段のさらなる実施形態、ならびにその使用を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞培養デバイス及び複数の体積選択手段のさらなる実施形態、ならびにその使用を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞培養デバイス及び複数の体積選択手段のさらなる実施形態、ならびにその使用を示す概略図。 本発明のいくつかの実施形態による、細胞培養デバイス及び複数の体積選択手段のさらなる実施形態、ならびにその使用を示す概略図。 細胞培養デバイス及び摺動体積選択手段のさらなる実施形態を示す概略図。 細胞培養デバイスのさらなる実施形態を示す概略図。 ＴＩＬ製造のためのＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の一実施形態のプロセスフローチャート。 ＴＩＬ製造のためのＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の一実施形態のプロセスフローチャート。 ＴＩＬ製造のためのＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の一実施形態のプロセスフローチャート。 凍結保存されたＴＩＬの例示的な製造プロセス（約２２日間）の実施形態の図を示す。 ＴＩＬ製造のための２２日プロセスであるＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の実施形態の図を示す。 ＴＩＬ製造のためのプロセス１Ｃ及びＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の例示的な実施形態からのステップＡ～Ｆの比較表。 ＴＩＬ製造のためのプロセス１Ｃの実施形態及びＧｅｎ２（プロセス２Ａ）の実施形態の詳細な比較。 例示的なＧｅｎ３型ＴＩＬ製造プロセス。

配列表の簡単な説明
配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。

配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。

配列番号３は、組換えヒトＩＬ－２タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。

配列番号５は、ＩＬ－２形態である。

配列番号６は、ネムバロイキンアルファのアミノ酸配列である。

配列番号７は、ＩＬ－２形態である。

配列番号８は、ムチンドメインポリペプチドである。

配列番号９は、組換えヒトＩＬ－４タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１０は、組換えヒトＩＬ－７タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１１は、組換えヒトＩＬ－１５タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１２は、組換えヒトＩＬ－２１タンパク質のアミノ酸配列である。

配列番号１３は、ＩＬ－２配列である。

配列番号１４は、ＩＬ－２ムテイン配列である。

配列番号１５は、ＩＬ－２ムテイン配列である。

配列番号１６は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２である。

配列番号１７は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２である。

配列番号１８は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３である。

配列番号１９は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２カバットである。

配列番号２０は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２カバットである。

配列番号２１は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３カバットである。

配列番号２２は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２クロチアである。

配列番号２３は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２クロチアである。

配列番号２４は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３クロチアである。

配列番号２５は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ１＿ＩＬ－２ ＩＭＧＴである。

配列番号２６は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ２ ＩＭＧＴである。

配列番号２７は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＨＣＤＲ３ ＩＭＧＴである。

配列番号２８は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＶ_Ｈ鎖である。

配列番号２９は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１の重鎖である。

配列番号３０は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ１カバットである。

配列番号３１は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ２カバットである。

配列番号３２は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ３カバットである。

配列番号３３は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ１クロチアである。

配列番号３４は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ２クロチアである。

配列番号３５は、ＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１のＬＣＤＲ３クロチアである。

配列番号３６は、Ｖ_Ｌ鎖である。

配列番号３７は、軽鎖である。

配列番号３８は、軽鎖である。

配列番号３９は、軽鎖である。

配列番号４０は、ヒト４－１ＢＢのアミノ酸配列である。

配列番号４１は、マウス４－１ＢＢのアミノ酸配列である。

配列番号４２は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖である。

配列番号４３は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖である。

配列番号４４は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号４５は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号４６は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ１である。

配列番号４７は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ２である。

配列番号４８は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の重鎖ＣＤＲ３である。

配列番号４９は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ１である。

配列番号５０は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ２である。

配列番号５１は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）の軽鎖ＣＤＲ３である。

配列番号５２は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖である。

配列番号５３は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖である。

配列番号５４は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖可変領域（ＶＨ）である。

配列番号５５は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖可変領域（ＶＬ）である。

配列番号５６は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ１である。

配列番号５７は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ２である。

配列番号５８は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の重鎖ＣＤＲ３である。

配列番号５９は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ１である。

配列番号６０は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ２である。

配列番号６１は、４－１ＢＢアゴニストモノクローナル抗体ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）の軽鎖ＣＤＲ３である。

配列番号６２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。

配列番号６３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号６４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号６５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号６６は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号６７は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号６８は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号６９は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号７０は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号７１は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号７２は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号７３は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のＦｃドメインである。

配列番号７４は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号７５は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号７６は、ＴＮＦＲＳＦアゴニスト融合タンパク質のリンカーである。

配列番号７７は、４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）アミノ酸配列である。

配列番号７８は、４－１ＢＢＬポリペプチドの可溶性部分である。

配列番号７９は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン１の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号８０は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン１の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号８１は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン２の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号８２は、４－１ＢＢアゴニスト抗体４Ｂ４－１－１バージョン２の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号８３は、４－１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３－２の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号８４は、４－１ＢＢアゴニスト抗体Ｈ３９Ｅ３－２の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号８５は、ヒトＯＸ４０のアミノ酸配列である。

配列番号８６は、マウスＯＸ４０のアミノ酸配列である。

配列番号８７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖である。

配列番号８８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖である。

配列番号８９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号９０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号９１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ１である。

配列番号９２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ２である。

配列番号９３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の重鎖ＣＤＲ３である。

配列番号９４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ１である。

配列番号９５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ２である。

配列番号９６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体タボリキシズマブ（ＭＥＤＩ－０５６２）の軽鎖ＣＤＲ３である。

配列番号９７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖である。

配列番号９８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖である。

配列番号９９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１００は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１０１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ１である。

配列番号１０２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ２である。

配列番号１０３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の重鎖ＣＤＲ３である。

配列番号１０４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ１である。

配列番号１０５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ２である。

配列番号１０６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１１Ｄ４の軽鎖ＣＤＲ３である。

配列番号１０７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖である。

配列番号１０８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖である。

配列番号１０９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１１０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１１１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ１である。

配列番号１１２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ２である。

配列番号１１３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の重鎖ＣＤＲ３である。

配列番号１１４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ１である。

配列番号１１５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ２である。

配列番号１１６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体１８Ｄ８の軽鎖ＣＤＲ３である。

配列番号１１７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１１８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１１９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ１である。

配列番号１２０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ２である。

配列番号１２１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の重鎖ＣＤＲ３である。

配列番号１２２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ１である。

配列番号１２３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ２である。

配列番号１２４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１１９－１２２の軽鎖ＣＤＲ３である。

配列番号１２５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１２６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１２７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ１である。

配列番号１２８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ２である。

配列番号１２９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の重鎖ＣＤＲ３である。

配列番号１３０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ１である。

配列番号１３１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ２である。

配列番号１３２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体Ｈｕ１０６－２２２の軽鎖ＣＤＲ３である。

配列番号１３３は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）アミノ酸配列である。

配列番号１３４は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの可溶性部分である。

配列番号１３５は、ＯＸ４０Ｌポリペプチドの代替可溶性部分である。

配列番号１３６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１３７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体００８の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１３８は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１３９は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０１１の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１４０は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１４１は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２１の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１４２は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１４３は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体０２３の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１４４は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１４５は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１４６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１４７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１４８は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１４９は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１５０は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１５１は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１５２は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１５３は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１５４は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１５５は、ヒト化ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１５６は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）である。

配列番号１５７は、ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）である。

配列番号１５８は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖アミノ酸配列である。

配列番号１５９は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖アミノ酸配列である。

配列番号１６０は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列である。

配列番号１６１は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列である。

配列番号１６２は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号１６３は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号１６４は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号１６５は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号１６６は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号１６７は、ＰＤ－１阻害剤ニボルマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号１６８は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの重鎖アミノ酸配列である。

配列番号１６９は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの軽鎖アミノ酸配列である。

配列番号１７０は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列である。

配列番号１７１は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列である。

配列番号１７２は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号１７３は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号１７４は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号１７５は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号１７６は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号１７７は、ＰＤ－１阻害剤ペムブロリズマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号１７８は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖アミノ酸配列である。

配列番号１７９は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖アミノ酸配列である。

配列番号１８０は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列である。

配列番号１８１は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列である。

配列番号１８２は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号１８３は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号１８４は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号１８５は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号１８６は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号１８７は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤デュルバルマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号１８８は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖アミノ酸配列である。

配列番号１８９は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖アミノ酸配列である。

配列番号１９０は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列である。

配列番号１９１は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列である。

配列番号１９２は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号１９３は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号１９４は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号１９５は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号１９６は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号１９７は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アベルマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号１９８は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖アミノ酸配列である。

配列番号１９９は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖アミノ酸配列である。

配列番号２００は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列である。

配列番号２０１は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列である。

配列番号２０２は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号２０３は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号２０４は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号２０５は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号２０６は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号２０７は、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号２０８は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの重鎖アミノ酸配列である。

配列番号２０９は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの軽鎖アミノ酸配列である。

配列番号２１０は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列である。

配列番号２１１は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列である。

配列番号２１２は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号２１３は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号２１４は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号２１５は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号２１６は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号２１７は、ＣＴＬＡ－４阻害剤イピリムマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号２１８は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの重鎖アミノ酸配列である。

配列番号２１９は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの軽鎖アミノ酸配列である。

配列番号２２０は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列である。

配列番号２２１は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列である。

配列番号２２２は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号２２３は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号２２４は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号２２５は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号２２６は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号２２７は、ＣＴＬＡ－４阻害剤トレメリムマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号２２８は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの重鎖アミノ酸配列である。

配列番号２２９は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの軽鎖アミノ酸配列である。

配列番号２３０は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）アミノ酸配列である。

配列番号２３１は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）アミノ酸配列である。

配列番号２３２は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号２３３は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号２３４は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

配列番号２３５は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列である。

配列番号２３６は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列である。

配列番号２３７は、ＣＴＬＡ－４阻害剤ザリフレリマブの軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列である。

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じである。本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

本明細書で使用される「同時投与」、「同時投与すること」、「～と組み合わせて投与される」、「～と組み合わせて投与すること」、「同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」、及び「同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）」という用語は、対象への２つ以上の医薬品有効成分（本発明のいくつかの実施形態では、例えば、複数のＴＩＬ）の投与を包含し、医薬品有効成分及び／またはそれらの代謝物の両方が、対象において同時に存在するようにする。同時投与には、別々の組成物での同時投与、別々の組成物での異なる時間での投与、または２つ以上の医薬品有効成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。

「インビボ」という用語は、対象の体内で起こる事象を指す。

「インビトロ」という用語は、対象の体外で起こる事象を指す。インビトロアッセイには、生きている細胞または死んでいる細胞が用いられる細胞ベースのアッセイが包含され、無傷の細胞が用いられない無細胞アッセイも包含され得る。

「エクスビボ」という用語は、対象の体から除去された細胞、組織、及び／または臓器に対する治療または処置の実施を伴う事象を指す。適切には、細胞、組織、及び／または臓器は、外科手術または治療の方法で対象の体に戻され得る。

「急速拡張」という用語は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（または４、５、６、７、８、もしくは９倍）、より好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（または２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０倍）、あるいは最も好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。本明細書では、いくつかの急速拡張プロトコルが説明されている。本明細書では、いくつかの急速拡張プロトコルが説明されている。

本明細書における「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍に移動した白血球として最初に取得された細胞の集団を意味する。ＴＩＬには、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、ならびにＭ１マクロファージが含まれるが、これらに限定されない。ＴＩＬには、一次ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「一次ＴＩＬ」は、本明細書に概説されるように患者組織試料から取得されるもの（「新たに取得された」または「新たに単離された」または「新たに採取された」と呼ばれることもある）であり、「二次ＴＩＬ」は、本明細書で考察される拡張または増殖された任意のＴＩＬ細胞集団であり、バルクＴＩＬ及び拡張ＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」または「ＲＥＰ後ＴＩＬ」）が含まれるが、これらに限定されない。ＴＩＬ細胞集団には、遺伝子修飾ＴＩＬが含まれ得る。

本明細書における「細胞の集団」（ＴＩＬを含む）とは、共通の形質を共有するいくつかの細胞を意味する。一般に、集団は、概して１×１０^６～１×１０^１０の数の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は、異なる数を含む。例えば、ＩＬ－２の存在下での一次ＴＩＬの初期成長は、およそ１×１０^８細胞のバルクＴＩＬの集団をもたらす。ＲＥＰ拡張は、一般に、注入用の１．５×１０^９～１．５×１０^１０細胞の集団を提供するために行われる。いくつかの実施形態では、ＲＥＰ拡張は、２．３×１０^１０～１３．７×１０^１０個の集団を提供するために行われる。

本明細書における「凍結保存されたＴＩＬ」とは、一次、バルク、または拡張（ＲＥＰ ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが、約－１５０℃～－６０℃の範囲で処理及び保管されることを意味する。凍結保存のための一般的な方法は、実施例を含む本明細書の他の場所にも記載されている。明確にするために、「凍結保存されたＴＩＬ」は、一次ＴＩＬのソースとして使用される可能性のある凍結組織試料と区別することができる。

本明細書における「解凍された凍結保存ＴＩＬ」とは、以前に凍結保存され、その後、細胞培養温度またはＴＩＬが患者に投与され得る温度を含むがこれらに限定されない、室温以上に戻るように処理されたＴＩＬの集団を意味する。

ＴＩＬは、一般に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義されるか、または腫瘍に浸潤して治療を達成するそれらの能力によって機能的に定義されるかのいずれかであり得る。ＴＩＬは、一般に、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５のうちの１つ以上のバイオマーカーの発現によって分類され得る。さらに及び代替的に、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤する能力により機能的に定義され得る。

「凍結保存培地（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ）」または「凍結保存培地（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）」という用語は、細胞の凍結保存に使用できる任意の培地を指す。かかる培地は、７％～１０％のＤＭＳＯを含む培地を含むことができる。例示的な培地には、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍａｓｏｌ、及びそれらの組み合わせが含まれる。「ＣＳ１０」という用語は、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓから入手した凍結保存培地を指す。ＣＳ１０培地は、商品名「ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０」と称され得る。ＣＳ１０培地は、ＤＭＳＯを含む無血清の動物成分を含まない培地である。

「セントラルメモリーＴ細胞」という用語は、ヒトではＣＤ４５Ｒ０＋であり、ＣＣＲ７（ＣＣＲ７^高）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２^高）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＣＬ－６、ＢＣＬ－６Ｂ、ＭＢＤ２、及びＢＭＩ１が含まれる。セントラルメモリーＴ細胞は、ＴＣＲトリガー後、エフェクター分子としてＩＬ－２及びＣＤ４０Ｌを主に分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血液中のＣＤ４コンパートメントで優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺において比例して濃縮される。

「エフェクターメモリーＴ細胞」という用語は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現を失い（ＣＣＲ７^低）、ＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるかまたは低い（ＣＤ６２Ｌ^低）、ヒトまたは哺乳動物Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型には、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ－７Ｒ）、及びＩＬ－１５Ｒも含まれる。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子には、ＢＬＩＭＰ１が含まれる。エフェクターメモリーＴ細胞は、インターフェロンガンマ、ＩＬ－４、及びＩＬ－５を含む、抗原刺激後に高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血液中のＣＤ８コンパートメントで優勢であり、ヒトでは肺、肝臓、及び腸において比例して濃縮される。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は、大量のパーフォリンを担持する。

「閉鎖系」という用語は、外部環境に対して閉鎖されている系を指す。細胞培養法に適した任意の閉鎖系を、本発明の方法で用いることができる。閉鎖系には、例えば、密閉Ｇ容器が含まれるが、これに限定されない。腫瘍セグメントが閉鎖系に付加されると、ＴＩＬを患者に投与する準備ができるまで、系は外部環境に開かれない。

腫瘍を破壊するためのプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化すること」、「断片」、及び「断片化された」という用語は、腫瘍組織を破砕、スライス、分割、及び細切するなどの機械的断片化法、ならびに腫瘍組織の物理的構造を破壊するための任意の他の方法を含む。

「細針吸引物」またはＦＮＡという用語は、試料を採取するが腫瘍を除去または切除しない、腫瘍サンプリングを含むサンプリングまたは診断手順に用いることができる生検手順の一種を指す。細針吸引では、例えば２５～１８ゲージの中空針を腫瘍または腫瘍を含有する領域に挿入し、本明細書に記載されるようなさらなる分析または拡張のために、体液及び細胞（組織を含む）を取得する。ＦＮＡの場合、組織細胞の組織学的構造を維持することなく、細胞を除去する。ＦＮＡには、ＴＩＬが含まれ得る。いくつかの事例では、細針吸引生検は、超音波ガイド下細針吸引生検針を使用して行われる。ＦＮＡ針は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｃｏｖｉｄｉｅｎなどから市販されている。

「コア生検」または「コア針生検」という用語は、試料を採取するが腫瘍を除去または切除しない、腫瘍サンプリングを含むサンプリングまたは診断手順に用いることができる生検手順の一種を指す。コア生検では、例えば１６～１１ゲージの中空針を腫瘍または腫瘍を含有する領域に挿入し、本明細書に記載されるようなさらなる分析または拡張のために、体液及び細胞（組織を含む）を取得する。コア生検の場合、ＦＮＡと比較して針のサイズが大きいため、組織細胞の組織学的構造をある程度維持しながら、細胞を除去することができる。コア生検針は、一般に、腫瘍の組織学的構造の少なくともいくらかを維持することが可能なゲージサイズである。コア生検には、ＴＩＬが含まれ得る。いくつかの事例では、コア針生検は、生検器具、真空支援コア針生検器具、定位固定法ガイド下コア針生検器具、超音波ガイド下コア針生検器具、ＭＲＩガイド下コア針生検器具を使用して行われ、これらは、Ｂａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎなどから市販されている。

「末梢血単核細胞」及び「ＰＢＭＣ」という用語は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含む、丸い核を有する末梢血細胞を指す。抗原提示細胞として使用される場合（ＰＢＭＣは抗原提示細胞の一種である）、末梢血単核細胞は、好ましくは、照射された同種異系末梢血単核細胞である。

「末梢血リンパ球」及び「ＰＢＬ」という用語は、末梢血から拡張したＴ細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＰＢＬは、ドナーからの全血またはアフェレーシス産物から分離される。いくつかの実施形態では、ＰＢＬは、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋のＴ細胞表現型などのＴ細胞表現型の正または負の選択によって、ドナー由来の全血またはアフェレーシス産物から分離される。

「抗ＣＤ３抗体」という用語は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ、またはマウス抗体を含む、抗体またはそのバリアント、例えば、モノクローナル抗体を指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ－３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３εとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビシリズマブが含まれる。

「ＯＫＴ－３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）という用語は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト、ヒト化、キメラ、またはマウス抗体を含む、モノクローナル抗体またはそのバイオシミラーもしくはバリアントを指し、市販の形態、例えば、ＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ、ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＣＤ３ ｐｕｒｅ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びムロモナブ、またはそれらのバリアント、保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、またはバイオシミラーを含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ－３を産生することができるハイブリドーマは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）にも寄託され、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。

「ＩＬ－２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）という用語は、インターロイキン－２として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、バイオシミラー、及びバリアントを含む、ＩＬ－２のすべての形態を含む。ＩＬ－２は、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２，３９８３－８８及びＭａｌｅｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，４５３－７９に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－２のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号３）。例えば、ＩＬ－２という用語は、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、単回使用バイアル当たり２２００万ＩＵで複数の供給業者から市販されている）などのヒト組換えＩＬ－２形態、ならびにＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ，ＵＳＡ（ＣＥＬＬＧＲＯ ＧＭＰ）またはＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡによって市販されている組換えＩＬ－２形態（カタログ番号ＣＹＴ－２０９－ｂ）及び他のベンダーからの他の商用同等物を包含する。アルデスロイキン（デス－アラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は、およそ１５ｋＤａの分子量を有する非グリコシル化ヒト組換えＩＬ－２形態である。本発明での使用に好適なアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に示す（配列番号４）。ＩＬ－２という用語はまた、ペグ化ＩＬ２プロドラッグベンペガルデスロイキン（ＮＫＴＲ－２１４、平均６個のリジン残基が［（２，７－ビス｛［メチルポリ（オキシエチレン）］カルバモイル｝－９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ］カルボニル）で置換されたＮ^６である、配列番号４のようなペグ化ヒト組換えＩＬ－２）を含む、本明細書に記載のＩＬ－２のペグ化形態も包含し、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能であるか、または国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／１３２４９６ Ａ１号の実施例１９に記載の方法、または米国特許出願公開第ＵＳ２０１９／０２７５１３３ Ａ１号の実施例１に記載の方法など、当該技術分野で知られている方法によって調製することができ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適なベンペガルデスロイキン（ＮＫＴＲ－２１４）及び他のペグ化ＩＬ－２分子は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３２８７９１ Ａ１号及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０６５０８６ Ａ１号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適な複合化ＩＬ－２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号、及び同第４，９０２，５０２号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適なＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、Ｓｙｎｔｈｏｒｘ，Ｉｎｃ．から入手可能なＴＨＯＲ－７０７である。本発明での使用に好適なＴＨＯＲ－７０７及びＩＬ－２の追加の代替形態の調製ならびに特性は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０１８１２２０ Ａ１号及び同第ＵＳ２０２０／０３３０６０１ Ａ１号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、単離及び精製ＩＬ－２ポリペプチドと、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択されるアミノ酸位置で単離及び精製ＩＬ－２ポリペプチドに結合する複合部分と、を含む、インターロイキン２（ＩＬ－２）複合体であり、アミノ酸残基の番号付けは配列番号５に対応する。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｔ３７、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｒ３８及びＫ６４から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｅ６１、Ｅ６２、及びＥ６８から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸位置は、Ｅ６２である。いくつかの実施形態では、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択されるアミノ酸残基は、リジン、システイン、またはヒスチジンにさらに変異する。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、システインに変異する。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基は、リジンに変異する。いくつかの実施形態では、Ｋ３５、Ｔ３７、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｅ６８、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｖ６９、Ｌ７２、及びＹ１０７から選択されるアミノ酸残基は、非天然アミノ酸にさらに変異する。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｎ６－アジドエトキシ－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）、Ｎ６－プロパルギルエトキシ－Ｌ－リジン（ＰｒａＫ）、ＢＣＮ－Ｌ－リジン、ノルボルネンリジン、ＴＣＯ－リジン、メチルテトラジンリジン、アリルオキシカルボニルリジン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、２－アミノ－８－オキソオクタン酸、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジドメチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、２－アミノ－８－オキソノナン酸、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、ホスホノチロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、２－アミノ－３－（（２－（（３－（ベンジルオキシ）－３－オキソプロピル）アミノ）エチル）セラニル）プロパン酸、２－アミノ－３－（フェニルセラニル）プロパン酸、またはセレノシステインを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２複合体は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα）サブユニットに対する減少した親和性を有する。いくつかの実施形態では、減少した親和性は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、ＩＬ－２Ｒαに対する結合親和性の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９％を超える減少である。いくつかの実施形態では、減少した親和性は、野生型ＩＬ－２ポリペプチドと比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、３０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、５００倍、１０００倍以上である。いくつかの実施形態では、複合部分は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαとの結合を損なうかまたは遮断する。いくつかの実施形態では、複合部分は、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、追加の複合部分は、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各々は、独立して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）（ＰＰＧ）、エチレングリコール及びプロピレングリコールのコポリマー、ポリ（オキシエチル化ポリオール）、ポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α－ヒドロキシ酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各々は、独立して、ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、直鎖状ＰＥＧまたは分岐状ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各々は、独立して、ポリサッカライドを含む。いくつかの実施形態では、ポリサッカライドは、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、アミロース、ヘパリン、ヘパランサルフェート（ＨＳ）、デキストリン、またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各々は、独立して、グリカンを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーの各々は、独立して、ポリアミンを含む。いくつかの実施形態では、複合部分は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、追加の複合部分は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の各々は、独立して、アルブミン、トランスフェリン、またはトランスサイレチンを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の各々は、独立して、Ｆｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の各々は、独立して、ＩｇＧのＦｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、複合部分は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、追加の複合部分は、ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質の各々は、独立して、ＸＴＥＮペプチド、グリシンリッチホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）、ＰＡＳポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）、ＣＴＰペプチド、またはゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、単離及び精製ＩＬ－２ポリペプチドは、グルタミル化によって修飾される。いくつかの実施形態では、複合部分は、単離及び精製ＩＬ－２ポリペプチドと直接的に結合される。いくつかの実施形態では、複合部分は、リンカーを介して単離及び精製されたＩＬ－２ポリペプチドと間接的に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ホモ二官能性リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ホモ二官能性リンカーは、ロマント試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３’３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベラート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルタータラート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタータラート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタラート（ＤＳＧ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボナート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデート（ＤＴＢＰ）、１，４－ジ－（３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンまたは１，３－ジフルオロ－４，６－ジニトロベンゼン、４，４’－ジフルオロ－３，３’－ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス－［β－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ－トルイジン、３，３’－ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’－ｐ－ジアミノジフェニル、ジヨード－ｐ－キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’－エチレン－ビス（ヨードアセトアミド）、またはＮ，Ｎ’－ヘキサメチレンビス（ヨードアセトアミド）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ヘテロ二官能性リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二官能性リンカーは、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ－ｓＰＤＰ）、水溶性長鎖Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ－ＬＣ－ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル－６－［α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ－ＬＣ－ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＭＢ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ－ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＭＰＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＧＭＢ）、スクシンイミジル ６－（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル ６－［６－（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノエート（ｓｌＡＸＸ）、スクシンイミジル ４－（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６－（（（（（４－ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボニル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ－ニトロフェニル ヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性及びスルフヒドリル反応性架橋剤、例えば、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシル－ヒドラジド－８（Ｍ２Ｃ２Ｈ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（ＮＨｓ－ＡｓＡ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（スルホ－ＮＨｓ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイ


ミジル－（４－アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ－ＮＨｓ－ＬＣ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－２－（ｐ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（スルホ－ＨｓＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ－ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ－ＮＯ）、スルホスクシンイミジル－２－（ｍ－アジド－ｏ－ニトロベンズアミド）－エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ－スクシンイミジル－４（４－アジドフェニル）１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ－スルホスクシンイミジル（４－アジドフェニル）－１，３’－ジチオプロピオネート（スルホ－ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル４－（ｐ－アジドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル ２－（７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセトアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル ７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセテート（スルホ－ｓＡＭＣＡ）、ｐ－ニトロフェニル ジアゾピルベート（ｐＮＰＤＰ）、ｐ－ニトロフェニル－２－ジアゾ－３，３，３－トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ－ＤＴＰ）、１－（ρ－アジドサリチルアミド）－４－（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ－［４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチル］－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン－４－ヨードアセトアミド、ｐ－アジドベンゾイル ヒドラジド（ＡＢＨ）、４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、またはｐ－アジドフェニル グリオキサール（ＡＰＧ）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、任意選択でジペプチドリンカーを含む、切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ジペプチドリンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｌａ、またはＶａｌ－Ｌｙｓを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、切断不可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、任意選択で、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、またはスルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）を含むマレイミド基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、スペーサーをさらに含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ｐ－アミノベンジルアルコール（ＰＡＢ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢＣ）、その誘導体、または類似体を含む。いくつかの実施形態では、複合部分は、ＩＬ－２複合体の血清半減期を延長することができる。いくつかの実施形態では、追加の複合部分は、ＩＬ－２複合体の血清半減期を延長することができる。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、本明細書に記載のＩＬ－２形態のうちのいずれかの断片である。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０１８１２２０ Ａ１号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０３３０６０１ Ａ１号に開示されているようにペグ化されている。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む複合部分に共有結合したＮ６－アジドエトキシ－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を含むＩＬ－２ポリペプチドを含む、ＩＬ－２複合体であり、ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡｚＫは、配列番号５内のアミノ酸位置に関して、Ｋ３５位、Ｆ４２位、Ｆ４４位、Ｋ４３位、Ｅ６２位、Ｐ６５位、Ｒ３８位、Ｔ４１位、Ｅ６８位、Ｙ４５位、Ｖ６９位、またはＬ７２位でアミノ酸を置換する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号５に対して１残基のＮ末端欠失を含む。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ＩＬ－２Ｒアルファ鎖会合を欠いているが、中間親和性ＩＬ－２Ｒベータ－ガンマシグナル伝達複合体との正常な結合を保持している。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む複合部分に共有結合したＮ６－アジドエトキシ－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を含むＩＬ－２ポリペプチドを含む、ＩＬ－２複合体であり、ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡｚＫは、配列番号５内のアミノ酸位置に関して、Ｋ３５位、Ｆ４２位、Ｆ４４位、Ｋ４３位、Ｅ６２位、Ｐ６５位、Ｒ３８位、Ｔ４１位、Ｅ６８位、Ｙ４５位、Ｖ６９位、またはＬ７２位でアミノ酸を置換する。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む複合部分に共有結合したＮ６－アジドエトキシ－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を含むＩＬ－２ポリペプチドを含む、ＩＬ－２複合体であり、ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡｚＫは、配列番号５内のアミノ酸位置に関して、Ｋ３５位、Ｆ４２位、Ｆ４４位、Ｋ４３位、Ｅ６２位、Ｐ６５位、Ｒ３８位、Ｔ４１位、Ｅ６８位、Ｙ４５位、Ｖ６９位、またはＬ７２位でアミノ酸を置換する。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む複合部分に共有結合したＮ６－アジドエトキシ－Ｌ－リジン（ＡｚＫ）を含むＩＬ－２ポリペプチドを含む、ＩＬ－２複合体であり、ＩＬ－２ポリペプチドは、配列番号５と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＡｚＫは、配列番号５内のアミノ酸位置に関して、Ｋ３５位、Ｆ４２位、Ｆ４４位、Ｋ４３位、Ｅ６２位、Ｐ６５位、Ｒ３８位、Ｔ４１位、Ｅ６８位、Ｙ４５位、Ｖ６９位、またはＬ７２位でアミノ酸を置換する。

いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ＡＬＫＳ－４２３０（配列番号６）としても知られるネムバロイキンアルファであり、Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である。ネムバロイキンアルファは、ペプチジルリンカー（^６０ＧＧ^６１）を介してヒトインターロイキン２断片（６２－１３２）と融合し、ペプチジルリンカー（^１３３ＧＳＧＧＧＳ^１３８）を介してヒトインターロイキン２受容体α鎖断片（１３９－３０３）と融合し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生され、グリコシル化されている、ヒトインターロイキン２断片（１－５９）、バリアント（Ｃｙｓ^１２５＞Ｓｅｒ^５１）；Ｇ^２ペプチドリンカー（６０－６１）を介してヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）（４－７４）－ペプチド（６２－１３２）と融合し、ＧＳＧ_３Ｓペプチドリンカー（１３３－１３８）を介してヒトインターロイキン２受容体α鎖（ＩＬ２Ｒサブユニットアルファ、ＩＬ２Ｒα、ＩＬ２ＲＡ）（１－１６５）－ペプチド（１３９－３０３）と融合し、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生され、アルファグリコシル化されている、ヒトインターロイキン２（ＩＬ－２）（７５－１３３）－ペプチド［Ｃｙｓ^１２５（５１）＞Ｓｅｒ］－変異体（１－５９）としても知られている。ネムバロイキンアルファのアミノ酸配列は、配列番号６に示されている。いくつかの実施形態では、ネムバロイキンアルファは、以下の翻訳後修飾を示す：以下の位置でのジスルフィド架橋：３１－１１６、１４１－２８５、１８４－２４２、２６９－３０１、１６６－１９７、または１６６－１９９、１６８－１９９または１６８－１９７（配列番号６の番号付けを使用する）、及び以下の位置でのグリコシル化部位：配列番号６の番号付けを使用する、Ｎ１８７、Ｎ２０６、Ｔ２１２。ネムバルイキン アルファの調製及び特性、ならびに本発明での使用に好適な追加の代替形態のＩＬ－２は、米国特許出願公開第２０２１／００３８６８４ Ａ１号及び米国特許第１０，１８３，９７９号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、配列番号６と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９０％の配列同一性を有するタンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、配列番号６で示されるアミノ酸配列またはその保存的アミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、配列番号７のアミノ酸２４～４５２、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、配列番号７のアミノ酸２４～４５２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはそのバリアント、断片、もしくは誘導体を含む融合タンパク質である。本発明での使用に好適な他のＩＬ－２形態は、米国特許第１０，１８３，９７９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。任意選択で、いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、ムチンドメインポリペプチドリンカーによって第２の融合パートナーと連結された第１の融合パートナーを含む融合タンパク質であり、第１の融合パートナーは、ＩＬ－１Ｒα、またはＩＬ－１Ｒαと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有し、ＩＬ－Ｒαの受容体アンタゴニスト活性を有するタンパク質であり、第２の融合パートナーは、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンの全部または一部を含み、ムチンドメインポリペプチドリンカーは、配列番号８、または配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、融合タンパク質の半減期は、ムチンドメインポリペプチドリンカーの非存在下での第２の融合パートナーとの第１の融合パートナーの融合と比較して改善される。

いくつかの実施形態では、本発明での使用に好適なＩＬ－２形態は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）と、Ｖ_ＨまたはＶ_ＬのＣＤＲに移植されたＩＬ－２分子またはその断片と、を含む抗体サイトカイン移植タンパク質を含み、抗体サイトカイン移植タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させる。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）と、Ｖ_ＨまたはＶ_ＬのＣＤＲに移植されたＩＬ－２分子またはその断片と、を含み、ＩＬ－２分子は、ムテインであり、抗体サイトカイン移植タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４ Ａ１号に記載されている抗体の投与を含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、Ｖ_ＨまたはＶ_ＬのＣＤＲに移植されたＩＬ－２分子またはその断片と、を含み、ＩＬ－２分子は、ムテインであり、抗体サイトカイン移植タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させ、抗体は、配列番号３９を含むＩｇＧクラス軽鎖及び配列番号３８を含むＩｇＧクラス重鎖、配列番号３７を含むＩｇＧクラスの軽鎖及び配列番号２９を含むＩｇＧクラスの重鎖、配列番号３９を含むＩｇＧクラス軽鎖及び配列番号２９を含むＩｇＧクラス重鎖、配列番号３７を含むＩｇＧクラス軽鎖及び配列番号３８を含むＩｇＧクラス重鎖からなる群から選択されるＩｇＧクラスの重鎖及びＩｇＧクラスの軽鎖をさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、Ｖ_ＨのＨＣＤＲ１に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、Ｖ_ＨのＨＣＤＲ２に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、Ｖ_ＨのＨＣＤＲ３に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、Ｖ_ＬのＬＣＤＲ１に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、Ｖ_ＬのＬＣＤＲ２に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子またはその断片は、Ｖ_ＬのＬＣＤＲ３に移植され、ＩＬ－２分子は、ムテインである。

ＩＬ－２分子の挿入は、ＣＤＲのＮ末端領域もしくはその近く、ＣＤＲの中間領域、またはＣＤＲのＣ末端領域もしくはその近くであり得る。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、ＣＤＲに組み込まれたＩＬ－２分子を含み、ＩＬ２配列はＣＤＲ配列をフレームシフトしない。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、ＣＤＲに組み込まれたＩＬ－２分子を含み、ＩＬ－２配列はＣＤＲ配列のすべてまたは一部を置き換える。ＩＬ－２分子による置き換えは、ＣＤＲのＮ末端領域、ＣＤＲの中間領域、またはＣＤＲのＣ末端領域もしくはその近くであり得る。ＩＬ－２分子による置き換えは、ＣＤＲ配列のわずか１個もしくは２個のアミノ酸、またはＣＤＲ配列全体であり得る。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子は、ペプチドリンカーなしで、ＣＤＲ配列とＩＬ－２配列との間に追加のアミノ酸なしで、ＣＤＲに直接的に移植される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２分子は、ペプチドリンカーを用いて、ＣＤＲ配列とＩＬ－２配列との間に１つ以上の追加のアミノ酸を伴って、ＣＤＲに間接的に移植される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＬ－２分子は、ＩＬ－２ムテインである。いくつかの事例では、ＩＬ－２ムテインは、Ｒ６７Ａ置換を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、配列番号１４または配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ムテインは、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２７０３３４ Ａ１号の表１のアミノ酸配列を含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２及び配列番号２５からなる群から選択されるＨＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号７、配列番号１０、配列番号１３及び配列番号１６からなる群から選択されるＨＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、及び配列番号２６からなる群から選択されるＨＣＤＲ２からなる群から選択されるＨＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２４、及び配列番号２７からなる群から選択されるＨＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈ領域及び配列番号３６のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖領域及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号２９のアミノ酸配列を含む重鎖領域及び配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖領域及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖領域及び配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、米国特許出願公開第２０２０／０２７０３３４ Ａ１号のＩｇＧ．ＩＬ２Ｆ７１Ａ．Ｈ１もしくはＩｇＧ．ＩＬ２Ｒ６７Ａ．Ｈ１、またはそのバリアント、誘導体、もしくは断片、またはその保存的アミノ酸置換体、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体サイトカイン移植タンパク質の抗体成分は、免疫グロブリン配列、フレームワーク配列、またはパリビズマブのＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体サイトカイン移植タンパク質は、アルデスロイキンまたは同等の分子などであるがこれらに限定されない野生型ＩＬ－２分子よりも長い血清半減期を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体サイトカイン移植タンパク質は、表３に記載される配列を有する。

「ＩＬ－４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）という用語は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これは、Ｔｈ２ Ｔ細胞、ならびに好酸球、好塩基球、及び肥満細胞によって産生される。ＩＬ－４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）からＴｈ２ Ｔ細胞への分化を調節する。Ｓｔｅｉｎｋｅ ａｎｄ Ｂｏｒｉｓｈ，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．２００１，２，６６－７０。ＩＬ－４によって活性化されると、Ｔｈ２ Ｔ細胞は、その後、正のフィードバックループで追加のＩＬ－４を産生する。ＩＬ－４は、Ｂ細胞増殖及びクラスＩＩ ＭＨＣ発現も刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ_１発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－４は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２１１）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＣＴＰ００４３）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－４のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号９）。

「ＩＬ－７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）という用語は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来のサイトカインを指し、これは、間質細胞及び上皮細胞、ならびに樹状細胞から得ることができる。Ｆｒｙ ａｎｄ Ｍａｃｋａｌｌ，Ｂｌｏｏｄ ２００２，９９，３８９２－９０４。ＩＬ－７は、Ｔ細胞の発達を刺激することができる。ＩＬ－７は、ＩＬ－７受容体アルファ及び共通ガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ－７受容体に結合し、これは、胸腺内でのＴ細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルである。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－７は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２５４）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号Ｇｉｂｃｏ ＰＨＣ００７１）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－７のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号１０）。

「ＩＬ－１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）という用語は、インターロイキン－１５として知られるＴ細胞成長因子を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、バイオシミラー、及びバリアントを含む、ＩＬ－２のすべての形態を含む。ＩＬ－１５は、例えば、Ｆｅｈｎｉｇｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，Ｂｌｏｏｄ ２００１，９７，１４－３２に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ－２と共有する。組換えヒトＩＬ－１５は、１２．８ｋＤａの分子量を有する１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－１５は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－２３０－ｂ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－１５組換えタンパク質、カタログ番号３４－８１５９－８２）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号１１）。

「ＩＬ－２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）という用語は、インターロイキン－２１として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物形態、保存的アミノ酸置換物、グリコフォーム、バイオシミラー、及びバリアントを含む、ＩＬ－２１のすべての形態を含む。ＩＬ－２１は、例えば、Ｓｐｏｌｓｋｉ ａｎｄ Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃ．２０１４，１３，３７９－９５に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ－２１は、１５．４ｋＤａの分子量を有する１３２個のアミノ酸を含む単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ－２１は、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ，ＵＳＡ（カタログ番号ＣＹＴ－４０８－ｂ）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ（ヒトＩＬ－２１組換えタンパク質、カタログ番号１４－８２１９－８０）を含む、複数の供給業者から市販されている。本発明での使用に好適な組換えヒトＩＬ－２１のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号１２）。

「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示される場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、及び健康状態の個人差を考慮して、医師によって決定され得る。一般に、本明細書に記載される腫瘍浸潤リンパ球（例えば、二次ＴＩＬまたは遺伝子改変された細胞傷害性リンパ球）は、体重１ｋｇ当たり１０^４～１０^１１細胞（例えば、体重１ｋｇ当たり１０^５～１０^６、１０^５～１０^１０、１０^５～１０^１１、１０^６～１０^１０、１０^６～１０^１１、１０^７～１０^１１、１０^７～１０^１０、１０^８～１０^１１、１０^８～１０^１０、１０^９～１０^１１、または１０^９～１０^１０細胞）（それらの範囲内のすべての整数値を含む）の投与量で投与され得る。ＴＩＬ（場合によっては、遺伝子修飾細胞傷害性リンパ球を含む）組成物もまた、これらの投与量で複数回投与され得る。ＴＩＬ（場合によっては、遺伝子操作されたＴＩＬを含む）は、免疫療法で一般的に知られている注入技法を使用することにより投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．１９８８，３１９，１６７６を参照されたい）。特定の患者に最適な投薬量及び治療計画は、患者を疾患の兆候について監視し、適宜に治療を調整することによって、医学分野の技術者によって容易に決定され得る。

「血液学的悪性腫瘍」、「血液系悪性腫瘍」という用語または相関する意味の用語は、血液、骨髄、リンパ節、及びリンパ系の組織を含むが、これらに限定されない、哺乳動物の造血組織及びリンパ組織のがん及び腫瘍を指す。血液学的悪性腫瘍は、「液体腫瘍」とも称される。血液学的悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫が含まれ得るが、これらに限定されない。「Ｂ細胞血液学的悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞を冒す血液学的悪性腫瘍を指す。

「固形腫瘍」という用語は、通常、嚢胞または液体領域を含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、腫瘍性、またはがん性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌には、肉腫、癌腫、及びリンパ腫、例えば、肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌が含まれるが、これらに限定されない。固形腫瘍の組織構造には、実質（がん細胞）を含む相互依存的組織区画、及びがん細胞が分散しており、かつ支持微小環境を提供し得る支持間質細胞が含まれる。

「液体腫瘍」という用語は、本来流体である異常な細胞塊を指す。液体腫瘍癌には、白血病、骨髄腫、及びリンパ腫、ならびに他の血液学的悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。液体腫瘍から取得されたＴＩＬは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称され得る。末梢血中で循環する液体腫瘍を含む液体腫瘍から得られるＴＩＬは、本明細書ではＰＢＬとも称され得る。ＭＩＬ、ＴＩＬ、及びＰＢＬという用語は、本明細書で互換的に使用され、細胞が由来する組織タイプに基づいてのみ異なる。

本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形もしくは血液学的腫瘍微小環境、または微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Ｓｗａｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０１２，７２，２４７３に記載されるように、「腫瘍性形質転換を促進し、腫瘍成長及び浸潤を支持し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を助長し、かつ優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、及び機械的手がかり」の複合混合物を指す。腫瘍はＴ細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、微小環境による免疫抑制のため、免疫系による腫瘍クリアランスはまれである。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、患者は、本発明によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前治療される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団が提供され得、患者は、本発明によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前治療される。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日で５日間（ＴＩＬ注入の２７日前～２３日前）である。いくつかの実施形態では、本発明による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的許容範囲まで８時間毎に７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ－２の静脈内注入を受ける。

実験的発見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、制御性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって治療有効性を増強する上で重要な役割を果たすことを示す。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に、患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」と称されることもある）を利用する。

「有効量」または「治療有効量」という用語は、疾患治療を含むが、これに限定されない、意図された用途を達成するのに十分である、本明細書に記載の化合物または化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロもしくはインビボ）、または治療される対象及び病状（例えば、対象の体重、年齢、及び性別）、病状の重症度、または投与方法に応じて異なり得る。この用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板粘着及び／または細胞遊走の低減）を誘導する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投薬レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるか、投与のタイミング、それが投与される組織、及び化合物が運ばれる物理的送達系に応じて異なる。

「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、その疾患または症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用される場合、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるが、まだ疾患を有すると診断されていない対象に疾患が生じるのを予防すること、（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その発症または進行を抑止すること、及び（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退行を引き起こし、及び／または１つ以上の疾患症状を軽減することを含む。「治療」は、疾患または状態がない場合でさえも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含するようにも意図されている。例えば、「治療」は、病状がない場合、例えば、ワクチンの場合に免疫応答を誘発するか、または免疫を与えることができる組成物の送達を包含する。

「異種」という用語は、核酸またはタンパク質の一部に関して使用される場合、核酸またはタンパク質が、自然界では互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、組換え的に産生され、新たな機能的核酸、例えば、ある供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコード領域、または異なる供給源からのコード領域を作製するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、自然界では互いに同じ関係では見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。

２つ以上の核酸またはポリペプチドの文脈における「配列同一性」、「同一性パーセント」、及び「配列同一性パーセント」（もしくはそれらの同義語、例えば「９９％同一」）という用語は、同じであるか、または配列同一性の一部としていかなる保存的アミノ酸置換も考慮せずに、最大一致のために比較し整列させた場合（必要に応じてギャップを導入する）、特定のパーセンテージの同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを取得するために使用され得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当該技術分野で知られている。配列同一性パーセントの決定に好適なプログラムには、例えば、米国政府の国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式が含まれる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。ＤＮＡＳＴＡＲから入手可能なＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはＭｅｇＡｌｉｇｎは、配列を整列させるために使用することができる追加の公的に入手可能なソフトウェアプログラムである。当業者であれば、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントに適切なパラメータを決定することができる。ある特定の実施形態では、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。

本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、参照抗体、タンパク質、または融合タンパク質のアミノ酸配列内または隣接する特定の位置における１つ以上の置換、欠失、及び／または付加により、参照タンパク質、抗体、または融合タンパク質のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む抗体または融合タンパク質を包含するが、これらに限定されない。バリアントは、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電したまたは非荷電のアミノ酸の置換を含み得る。バリアントは、参照抗体、タンパク質、または融合タンパク質の抗原に特異的に結合する能力を保持している。バリアントという用語は、ペグ化抗体またはタンパク質も含む。

本明細書における「腫瘍浸潤リンパ球」または「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍に移動した白血球として最初に取得された細胞の集団を意味する。ＴＩＬには、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７ ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、ならびにＭ１マクロファージが含まれるが、これらに限定されない。ＴＩＬには、一次ＴＩＬ及び二次ＴＩＬの両方が含まれる。「一次ＴＩＬ」は、本明細書に概説されるように患者組織試料から取得されるもの（「新たに取得された」、または「新たに単離された」、または「新たに採取された」と称されることもある）であり、「二次ＴＩＬ」は、本明細書で考察されるように拡張または増殖された任意のＴＩＬ細胞集団であり、本明細書で考察されるバルクＴＩＬ、拡張されたＴＩＬ（「ＲＥＰ ＴＩＬ」）、ならびに「ｒｅＲＥＰ ＴＩＬ」が含まれるが、これらに限定されない。ｒｅＲＥＰ ＴＩＬは、例えば、第２の拡張ＴＩＬまたは第２の追加の拡張ＴＩＬ（例えば、ｒｅＲＥＰ ＴＩＬと称されるＴＩＬを含む、図１のステップＤに記載されているものなど）を含み得る。

ＴＩＬは、一般に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に定義されるか、または腫瘍に浸潤して治療を達成するそれらの能力によって機能的に定義されるかのいずれかであり得る。ＴＩＬは、一般に、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲαβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ－１、及びＣＤ２５のうちの１つ以上のバイオマーカーの発現によって分類され得る。さらに及び代替的に、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤する能力により機能的に定義され得る。ＴＩＬは、効力によってさらに特徴付けられ得、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）放出が、約５０ｐｇ／ｍＬを超える、約１００ｐｇ／ｍＬを超える、約１５０ｐｇ／ｍＬを超える、または約２００ｐｇ／ｍＬを超える場合、ＴＩＬは強力であるとみなされ得る。例えば、インターフェロン（ＩＦＮγ）放出が、約５０ｐｇ／ｍＬを超える、約１００ｐｇ／ｍＬを超える、約１５０ｐｇ／ｍＬを超える、または約２００ｐｇ／ｍＬを超える、約３００ｐｇ／ｍＬを超える、約４００ｐｇ／ｍＬを超える、約５００ｐｇ／ｍＬを超える、約６００ｐｇ／ｍＬを超える、約７００ｐｇ／ｍＬを超える、約８００ｐｇ／ｍＬを超える、約９００ｐｇ／ｍＬ、約１０００ｐｇ／ｍＬを超える場合、ＴＩＬは強力であるとみなされ得る。

「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、天然及び合成の、未修飾及び修飾デオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾には、糖部分、塩基部分、及び／またはオリゴヌクレオチド中のデオキシリボヌクレオチド間の結合への変更が含まれる。

「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を定義する。「リボヌクレオチド」という用語は、ｂ－Ｄ－リボフラノース部分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを定義する。ＲＮＡという用語には、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え的に産生されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／または変化によって天然に存在するＲＮＡとは異なる変化したＲＮＡが含まれる。本明細書に記載のＲＮＡ分子のヌクレオチドはまた、非天然に存在するヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含み得る。これらの変化したＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。

「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、ならびに不活性成分を含むよう意図されている。医薬品有効成分のためのかかる薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤の使用は、当該技術分野で周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体または薬学的に許容される賦形剤が医薬品有効成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の医薬品有効成分を、記載された組成物及び方法に組み込むこともできる。

「約」及び「およそ」という用語は、値の統計的に有意な範囲内を意味する。かかる範囲は、所与の値または範囲の１桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、なおより好ましくは１０％以内、さらにより好ましくは５％以内であり得る。「約」または「およそ」という用語によって包含される許容偏差は、研究中の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。さらに、本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状、ならびに他の量及び特徴が正確でなく、かつ正確である必要はないが、公差、変換係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に知られている他の要因を反映して、必要に応じて、およそであってもよく、及び／またはそれよりも大きくても小さくてもよいことを意味する。一般に、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状、または他の量もしくは特徴は、そのように明示的に述べられているかにかかわらず、「約」または「およそ」である。非常に異なるサイズ、形状、及び寸法の実施形態が記載された配置を採用し得ることに留意されたい。

添付の特許請求の範囲で使用される場合、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という移行用語は、元の形式及び補正された形式で、存在する場合、列挙されていない追加のクレーム要素またはステップが特許請（複数可）求の範囲から除外されるかに関して特許請求の範囲を定義する。「含む」という用語は、包括的または自由形式であるよう意図されており、いずれの追加の列挙されていない要素、方法、ステップ、または材料も除外しない。「からなる」という用語は、特許請求の範囲で指定されたもの以外のいずれの要素、ステップ、または材料も除外し、後者の場合、指定された材料（複数可）に通常関連する不純物も除外する。「から本質的になる」という用語は、特許請求の範囲を、特定の要素、ステップ、または材料（複数可）、及び特許請求された本発明の基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさないに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載のすべての組成物、方法、及びキットは、代替の実施形態では、「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」という移行用語のうちのいずれかによってより具体的に定義され得る。

「抗体」及びその複数形の「抗体」という用語は、免疫グロブリン全体及び任意の抗原結合断片（「抗原結合部分」）またはその一本鎖を指す。「抗体」はさらに、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重鎖（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ_Ｌで構成される。抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在し得る、超可変性の領域にさらに細分化することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、１つまたは複数の抗原エピトープと相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的な補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

「抗原」という用語は、免疫応答を誘導する物質を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合、抗体またはＴＣＲによって結合されることができる分子である。本明細書で使用される「抗原」という用語はまた、Ｔ細胞エピトープを包含する。抗原は、追加として免疫系によって認識されることができる。いくつかの実施形態では、抗原は、体液性免疫応答または細胞性免疫応答を誘導することができ、Ｂリンパ球及び／またはＴリンパ球の活性化につながる。場合によっては、これは、抗原がＴｈ細胞エピトープを含むか、またはそれに結合されることを必要とし得る。抗原はまた、１つ以上のエピトープ（例えば、Ｂ－及びＴ－エピトープ）を有し得る。いくつかの実施形態では、抗原は、好ましくは、典型的には非常に特異的かつ選択的な方法で、対応する抗体またはＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘導され得る多数の他の抗体またはＴＣＲとは反応しない。

「モノクローナル抗体」、「ｍＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」という用語、またはそれらの複数形は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。特定の受容体に特異的なモノクローナル抗体は、試験対象に好適な抗原を注入し、次いで、所望の配列または機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離するという当該技術分野における知識及び技術を使用して作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として機能する。一旦単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに入れられ、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を取得することができる。抗体の組換え産生については、以下でより詳細に説明する。

本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」（または単に「抗体部分」もしくは「断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_Ｌ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｖ_Ｈ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_Ｌ及びＶ_ＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインからなり得るドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４１，５４４－５４６）、ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。Ｆｖ断片の２つのドメイン、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組み換え方法を使用して、Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈ領域が対合して、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成する単一タンパク質鎖としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって接合され得、例えば、Ｂｉｒｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８，２４２，４２３－４２６、及びＨｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８８，８５，５８７９－５８８３）を参照されたい。かかるｓｃＦｖ抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」という用語に包含されることを意図している。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来の技法を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖタンパク質ドメインは、Ｖ_Ｈ部分及びＶ_Ｌ部分を含む。ｓｃＦｖ分子は、Ｖ_ＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部分である場合、Ｖ_Ｌ－Ｌ－Ｖ_Ｈ、またはＶ_ＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部分である場合、Ｖ_Ｈ－Ｌ－Ｖ_Ｌのいずれかとして示される。ｓｃＦｖ分子を作製し、好適なペプチドリンカーを設計するための方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．Ｒａａｇ ａｎｄ Ｍ．Ｗｈｉｔｌｏｗ，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｆｖｓ．”ＦＡＳＥＢ Ｖｏｌ ９：７３－８０（１９９５）及びＲ．Ｅ．Ｂｉｒｄ ａｎｄ Ｂ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ，Ｖｏｌ ９：１３２－１３７（１９９１）に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。

「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。いくつかの実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから取得されたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。

本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作成、または単離されるすべてのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製されたハイブリドーマ（以下でさらに説明される）についてトランスジェニックまたはトランス染色体である動物（マウスなど）から単離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む、任意の他の手段によって調製、発現、作成、または単離された抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、かかる組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発）に供され得、したがって、組換え抗体のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ配列に由来し、関連しているが、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に自然に存在しない可能性がある配列である。

本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。

「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。

「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体と別の医薬品有効成分または抗体とのコンジュゲートを含む、ヒト抗体の任意の修飾形態を指す。「コンジュゲート」、「抗体薬物コンジュゲート」、「ＡＤＣ」、または「免疫コンジュゲート」という用語は、別の治療部分にコンジュゲートされた抗体またはその断片を指し、これは当該技術分野において使用可能な方法を使用して、本明細書に記載の抗体にコンジュゲートされ得る。

「ヒト化抗体」、「ヒト化抗体（複数）」、及び「ヒト化」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すことを意図している。追加のフレームワーク領域の修飾は、ヒトフレームワーク配列内で行うことができる。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）または非ヒト霊長類の１５超可変領域からの残基によって置き換えられる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的すべてを含むことになる。ヒト化抗体はまた、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８６，３２１，５２２－５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８８，３３２，３２３－３２９、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９２，２，５９３－５９６を参照されたい。本明細書に記載される抗体はまた、エフェクター機能及び／またはＦｃＲ結合の改善（例えば、低減）を与えることが知られている任意のＦｃバリアントを用いるように修飾され得る。Ｆｃバリアントは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ１９８８／０７０８９Ａ１号、同第ＷＯ１９９６／１４３３９Ａ１号、同第ＷＯ１９９８／０５７８７Ａ１号、同第ＷＯ１９９８／２３２８９Ａ１号、同第ＷＯ１９９９／５１６４２Ａ１号、同第ＷＯ９９／５８５７２Ａ１号、同第ＷＯ２０００／０９５６０Ａ２号、同第ＷＯ２０００／３２７６７Ａ１号、同第ＷＯ２０００／４２０７２Ａ２号、同第ＷＯ２００２／４４２１５Ａ２号、同第ＷＯ２００２／０６０９１９Ａ２号、同第ＷＯ２００３／０７４５６９Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０１６７５０Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０２９２０７Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０３５７５２Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０６３３５１Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０７４４５５Ａ２号、同第ＷＯ２００４／０９９２４９Ａ２号、同第ＷＯ２００５／０４０２１７Ａ２号、同第ＷＯ２００５／０７０９６３Ａ１号、同第ＷＯ２００５／０７７９８１Ａ２号、同第ＷＯ２００５／０９２９２５Ａ２号、同第ＷＯ２００５／１２３７８０Ａ２号、同第ＷＯ２００６／０１９４４７Ａ１号、同第ＷＯ２００６／０４７３５０Ａ２号、及び同第ＷＯ２００６／０８５９６７Ａ２号、ならびに米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，７３９，２７７号、同第５，８３４，２５０号、同第５，８６９，０４６号、同第６，０９６，８７１号、同第６，１２１，０２２号、同第６，１９４，５５１号、同第６，２４２，１９５号、同第６，２７７，３７５号、同第６，５２８，６２４号、同第６，５３８，１２４号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，９９８，２５３号、及び同第７，０８３，７８４号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるアミノ酸置換のうちのいずれか１つを含み得る。

「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことを意図している。

「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片である。断片は、同じポリペプチド鎖（Ｖ_Ｈ－Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｈ）中に軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。同じ鎖上の２つのドメインをペアリングするには短すぎるリンカーを使用すると、ドメインは別のチェーンの相補ドメインとペアリングさせられ、２つの抗原結合部位が作成される。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許第ＥＰ４０４，０９７号、国際特許公開第ＷＯ９３／１１１６１号、及びＢｏｌｌｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３，９０，６４４４－６４４８においてより完全に記載されている。

「グリコシル化」という用語は、抗体の修飾誘導体を指す。非グリコシル化抗体は、グリコシル化を欠いている。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化され得る。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変化させることによって達成され得る。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の排除をもたらす、１つ以上のアミノ酸置換を行ない、それによってその部位でのグリコシル化を排除することができる。米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号に記載されているように、非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させる可能性がある。加えてまたは代替的に、改変した種類のグリコシル化を有する抗体、例えば、フコシル残基の量が低減した低フコシル化抗体または二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体が作製され得る。かかるグリコシル化パターンの変化は、抗体の能力を増加させることが実証されている。かかる炭水化物修飾は、例えば、抗体をグリコシル化機構が変化した宿主細胞で発現させることによって達成され得る。グリコシル化機構が変化した細胞については、当該技術分野で説明されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が変化した抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株で発現される抗体が、それらの炭水化物上のフコースを欠くように、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠く。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ ＦＵＴ８－／－細胞株は、２つの置換ベクターを使用したＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって作成された（例えば、米国特許公開第２００４／０１１０７０４号またはＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００４，８７，６１４－６２２を参照）。別の例として、欧州特許第ＥＰ１，１７６，１９５号は、フコシルトランスフェラーゼをコードし、それによりかかる細胞株で発現される抗体が、アルファ１，６結合関連酵素を低減または排除することによって低フコシル化を示す、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株を説明しており、抗体のＦｃ領域に結合するＮ－アセチルグルコサミンにフコースを付加するための酵素活性が低いか、または酵素活性を有しない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）についても説明している。国際特許公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）結合型炭水化物に付着させる能力が低減し、さらにその宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化ももたらすバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞について説明している（Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７，２６７３３－２６７４０も参照）。国際特許公開第ＷＯ９９／５４３４２号は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作され、それにより操作された細胞株で発現される抗体が、二分性ＧｌｃＮａｃ構造の増加を示し、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす、細胞株について記載している（Ｕｍａｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９９，１７，１７６－１８０も参照）。代替てきに、フコシダーゼ酵素を使用して、抗体のフコース残基を切断でき得る。例えば、フコシダーゼアルファ－Ｌ－フコシダーゼは、Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７５，１４，５５１６－５５２３に記載されているように、抗体からフコシル残基を除去する。

「ペグ化」は、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる、修飾抗体またはその断片を指す。ペグ化は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させることができる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実行される。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ_１～Ｃ_１０）アルコキシ－もしくはアリールオキシ－ポリエチレングリコール、またはポリエチレングリコール－マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包含することが意図される。ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体であり得る。ペグ化のための方法は、当該技術分野で知られており、例えば欧州特許第ＥＰ０１５４３１６号及び同第ＥＰ０４０１３８４号、ならびに米国特許第５，８２４，７７８号（各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、本発明の抗体に適用することができる。

「バイオシミラー」という用語は、モノクローナル抗体またはタンパク質を含む、臨床的に不活性な成分にわずかな違いがあるにもかかわらず、米国で認可された参照バイオ製品と非常に類似しており、製品の安全性、純度、及び効力に関してバイオ製品と参照製品との間に臨床的に意味のある差異がない、バイオ製品を意味する。さらに、類似のバイオまたは「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁によって既に使用が許可されている別のバイオ医薬品に類似したバイオ医薬品である。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用されている。バイオ製品またはバイオ医薬品は、細菌または酵母などの生物源によって作製された、またはそれに由来する医薬品である。それらは、ヒトインスリンもしくはエリスロポエチンなどの比較的小さな分子、またはモノクローナル抗体などの複雑な分子からなり得る。例えば、参照ＩＬ－２タンパク質がアルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ）である場合、アルデスロイキンに関して薬物規制当局によって承認されたタンパク質は、アルデスロイキンの「バイオシミラー」であるか、またはアルデスロイキンの「そのバイオシミラー」である。欧州では、類似のバイオまたは「バイオシミラー」医薬品は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって既に使用が許可されている別のバイオ医薬品に類似したバイオ医薬品である。欧州における同様の生物学的用途に関連する法的根拠は、補正されたＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）Ｎｏ ７２６／２００４の第６条及びＤｉｒｅｃｔｉｖｅ ２００１／８３／ＥＣの第１０（４）条であり、したがって欧州では、バイオシミラーは、Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）Ｎｏ ７２６／２００４の第６条及びＤｉｒｅｃｔｉｖｅ ２００１／８３／ＥＣの第１０（４）条の下で、認可または認可申請の対象について認可、承認され得る。すでに認可されているオリジナルのバイオ医薬品は、欧州では「参照医薬品」と称されることがある。バイオシミラーとみなされる製品に対する要件のうちのいくつかは、バイオシミラー医薬品に関するＣＨＭＰガイドラインに概説されている。さらに、モノクローナル抗体バイオシミラーに関連するガイドラインを含む製品固有のガイドラインは、ＥＭＡによって製品毎に提供され、そのウェブサイトで公開されている。本明細書に記載のバイオシミラーは、品質特徴、生物活性、作用機序、安全性プロファイル、及び／または有効性の点で、参照医薬品に類似している可能性がある。さらに、バイオシミラーは、参照医薬品と同じ状態を治療するために使用され得るか、または使用を意図され得る。したがって、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した品質特徴を有するとみなされ得る。代替的に、またはさらに、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した生物活性を有するとみなされ得る。代替的に、またはさらに、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した安全性プロファイルを有するとみなされ得る。代替的に、またはさらに、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似または非常に類似した効力を有するとみなされ得る。本明細書に記載されているように、欧州におけるバイオシミラーは、ＥＭＡによって認可された参照医薬品と比較される。しかしながら、場合によっては、バイオシミラーは、特定の研究で欧州経済領域外で認可されたバイオ医薬品（ＥＥＡ認可されていない「コンパレーター」）と比較される場合がある。かかる研究には、例えば、特定の臨床研究及びインビボ非臨床研究が含まれる。本明細書で使用される場合、「バイオシミラー」という用語は、ＥＥＡ認可されていないコンパレーターと比較された、または比較され得るバイオ医薬品にも関する。特定のバイオシミラーは、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合部分）、及び融合タンパク質などのタンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に有意な影響を及ぼさない、アミノ酸構造にわずかな修飾（例えば、アミノ酸の欠失、付加、及び／または置換を含む）を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その参照医薬品のアミノ酸配列に対して９７％以上、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、その違いが医薬品の安全性及び／または有効性の変化をもたらさないならば、１つ以上の翻訳後修飾、例えば、限定されないが、参照医薬品の翻訳後修飾とは異なる、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び／または切断を含み得る。バイオシミラーは、参照医薬品と同一または異なるグリコシル化パターンを有し得る。特に、排他的ではないが、バイオシミラーは、その違いが参照医薬品に関連する安全性の懸念に対処するか、対処することを意図している場合、異なるグリコシル化パターンを有し得る。加えて、バイオシミラーは、医薬品の安全性及び有効性が損なわれないならば、例えば、その強度、剤形、製剤、賦形剤、及び／または提示において参照医薬品から逸脱する可能性がある。バイオシミラーは、参照医薬品と比較して、例えば薬物動態（ＰＫ）及び／または薬力学的（ＰＤ）プロファイルの違いを含み得るが、それでも、認可される、または認可に適しているとみなされるように、参照医薬品と十分に類似しているとみなされる。特定の状況において、バイオシミラーは、参照医薬品と比較して異なる結合特徴を示し、異なる結合特徴は、ＥＭＡなどの規制当局によって類似のバイオ製品としての認可の障壁ではないとみなされる。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用されている。

自動化されたＴＩＬ製造のための組織培養デバイス及びバイオリアクター
本開示は、ＴＩＬ製造のための例示的な組織培養デバイスを記載する。本開示の組織培養デバイスは、半自動化及び自動化されたＴＩＬ製造のためのバイオリアクターシステムに組み込まれ得る。図１１３は、組織培養デバイス１００がインキュベーター１１６内に収容され得るシステム１１３０を図示する。システム１１３０のいくつかの実施形態では、ＴＩＬ産生は、新鮮培地を組織培養デバイス１００に導入することができ、使用済み培地を、インキュベーター１１６を開放することなく、または他の方法でＴＩＬ産生中にインキュベーターの内部を外気にさらすことなく、組織培養デバイス１００から抽出することができるように、（例えば、本明細書に記載のＧｅｎ２またはＧｅｎ３を利用して）実行され得る。図１１３の実施形態では、組織培養デバイス１００は、インキュベーター１１６に入れられる。１つ以上の第１のポンプ１１９を使用して、新鮮培地容器１１７からの新鮮培地を培地入口１１０を介して組織培養デバイス１００に圧送してもよい。いくつかの実施形態では、新鮮培地容器は、（例えば、培地の温度及び酸素／ＣＯ２飽和度を維持するために）インキュベーター内に位置し得る。他の実施形態では、新鮮培地容器は、インキュベーターの外側に位置し得る。新鮮培地容器と組織培養デバイスとを接続する導路が、インキュベーターを介して通過するため、チューブの長さは、組織培養デバイスに入る前に、導路中の培地の温度及び酸素／ＣＯ２飽和度を、インキュベーターの内部条件を用いて較正することを可能にするように調整することができることが企図される。１つ以上の第２のポンプ１１９を使用して、使用済み培地を廃棄培地出口１１１を介して廃棄培地容器１１８へと引き込んでもよい。

図１１４及び１１５に示されるように、いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、ふるい１０４によって分離される２つ以上の区画（例えば、第１の区画１０５及び第２の区画１０６）を備えていてもよい。各区画は、細胞を培養するための少なくとも１つのガス透過性表面（例えば、第１のガス透過性表面１０１及び第２のガス透過性表面１０２）を備えていてもよい。ガス透過性表面は、（ｉ）組織培養デバイスが第１の方向１１３にある場合、細胞は、第１のガス透過性表面１０１上で培養されてもよく、（ｉｉ）組織培養デバイスが第２の方向１１４にある場合、細胞は、第２のガス透過性表面１０２上で培養されてもよく、（ｉｉｉ）組織培養デバイスが第３の方向１１５にある場合、細胞は、細胞採取出口１１２を介して採取されてもよいように構築され、整列されてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、少なくとも第１のガス透過性表面から第２のガス透過性表面まで延在する１つ以上の側壁１０３を備えていてもよい。フレーム１０９を使用して、組織培養デバイス１００を様々な方向に維持するのを補助してもよい。組織培養デバイス１００は、一般に、第２のガス透過性表面１０２に近接して位置するより大きな直径の端部と、第１のガス透過性表面１０１に近接して位置するより小さな直径の端部とを有する、漏斗構成で構成され得る。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、第１のガス透過性表面１０１から延在するネック１２１を備える。いくつかの実施形態では、ネック１２１は、第１のガス透過性表面１０１と側壁１０３との間に延在する。ネック１２１は、ほぼ第１のガス透過性表面１０１の直径である直径を有する円筒形構成で構成されてもよい。側壁１０３は、ネック１２１に対して平行ではない角度及び／または直交ではない角度に向けられてもよい。いくつかの実施形態では、側壁１０３は、ほぼ第１のガス透過性表面１０１の直径である最小直径を有する。いくつかの実施形態では、側壁１０３は、ほぼ第２のガス透過性表面１０２の直径である最大内径を有する。側壁１０３は、第２のガス透過性表面１０２と側壁１０３との間に配置される、基部となる円筒形側壁１２２で終端してもよい。基部円筒形側壁１２２は、ほぼ第２のガス透過性表面１０２の直径である内径を有していてもよい。

一般に、腫瘍断片または腫瘍消化物は、アクセスポート１０７を介して組織培養デバイス１００の第１の区画１０５内に堆積し、組織培養デバイスが第１の方向１１３にある状態で、第１のガス透過性表面上で培養されてもよい。（例えば、Ｇｅｎ２またはＧｅｎ３に関して本明細書に記載されるように）細胞の第１の拡張の後、デバイス１００を、第２の方向１１４に回転させてもよく、それによって、ふるい１０４を介して、破片（例えば、腫瘍残存物及び／または腫瘍消化物の嵩高い部分）から細胞を濾過する。ふるい１０４の多孔率は、腫瘍残存物及び／または嵩高い消化物を第１の区画１０５中に保持しつつ、第１の拡張からの細胞が第１の区画１０５から第２の区画１０６へと通過することを可能にするように選択される。第１の拡張からの細胞は、その後に、採取の前に、第２のガス透過性表面１０２上で拡張されてもよい。いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面の断面積は、第１の拡張室からの細胞を拡張させるために、第１のガス透過性表面の断面積と少なくとも同じであるか、またはより大きい。

図１１６及び１２４は、図１１４及び１１５に示される組織培養デバイス１００の実施形態を図示する。図１１６の実施形態では、組織培養デバイス１００は、１００ｃｍ^２の第１の細胞培養表面積を有する第１のガス透過性表面１０１を有する第１の区画１０５を備える。図１１６は、５００ｃｍ^２の第２の細胞培養表面積を有する第２のガス透過性表面１０２を有する第２の区画１０６を含む。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、約１００ｃｍ^２ の第１の細胞培養表面積を有する第１のガス透過性表面１０１と、約５００ｃｍ^２の第２の細胞培養表面積を有する第２のガス透過性表面１０２と、を備える。図１２４の実施形態では、組織培養デバイス１００は、１００ｃｍ^２～４００ｃｍ^２の第１の細胞培養表面積を有する第１のガス透過性表面１０１を有する第１の区画１０５を備える。図１２４のデバイスは、５００ｃｍ^２～２０００ｃｍ^２の第２の細胞培養表面積を有する第２のガス透過性表面１０２を有する第２の区画１０６を備える。いくつかの実施形態では、図１２４の組織培養デバイス１００は、約１００ｃｍ^２～約４００ｃｍ^２の第１の細胞培養表面積を有する第１のガス透過性表面１０１と、約５００ｃｍ^２～約２０００ｃｍ^２の第２の細胞培養表面積を有する第２のガス透過性表面１０２と、を備える。図１１６の組織培養デバイス１００は、約２００ミクロンの開口部（例えば、細孔）を有するふるい１０４を備える。図１２４の組織培養デバイス１００は、約２００ミクロンの開口部（例えば、細孔）を有するふるい１０４を備える。図１１６及び１２４のふるい１０４は、プラスチックであり、腫瘍断片を濾過するように構成されてもよい。図１１６及び１２４のふるい１０４は、それぞれ第１の区画１０５及び第２の区画１０６を分離する限界を画定する境界に配置されてもよい。

図１１６及び１２４の組織培養デバイス１００は、第２の区画内に配置された培地入口１１０をさらに備える。培地入口１１０は、培地を組織培養デバイス１００に灌流させるように構成される蠕動ポンプ１１９及び培地バッグ１１７にさらに連結されてもよい。組織培養デバイス１００は、エアフィルタ１０８に連結される第２の区画１０６中に配置されたエアフィルタポートをさらに備えていてもよい。いくつかの実施形態では、エアフィルタポート及び培地入口１１０は、第２の区画１０６へのアクセスを共有する。

図１１６及び１２４の組織培養デバイス１００は、細胞採取出口１１２を介する細胞及び培地の採取を可能にするように構成された細胞採取出口１１２をさらに示す。いくつかの実施形態では、細胞採取は、ＬＯＶＯシステム（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉによって製造されたもの）などの細胞処理システムによるものである。「ＬＯＶＯ細胞処理システム」という用語は、細胞を含む溶液を、滅菌及び／または閉鎖系環境で回転膜または回転フィルターなどの膜またはフィルターを通して圧送し、連続フローを可能にし、細胞を処理して、ペレット化せずに上清または細胞培養培地を除去する、任意の機器またはデバイスも指す。「ＬＯＶＯバッグ」という用語は、細胞を採取するためにＬＯＶＯ細胞処理システムと組み合わせて使用される任意の容器を指す。いくつかの実施形態では、細胞採取機および／または細胞処理システムは、閉鎖された無菌システムにおいて、細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／または他の細胞処理ステップを行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞採取出口１１２は、採取される細胞の予想されるサイズ及び寸法に基づいて、事前に選択される直径の比較的広いチューブを備える。細胞採取出口１１２は、示されるように、第２のガス透過性表面１０２及び第２の区画１０６のより広い端部に近接して位置決めされてもよい。

図１１６及び１２４の組織培養デバイス１００は、アクセスポート１０７をさらに示す。アクセスポート１０７は、第１の区画１０５に連結される。いくつかの実施形態では、アクセスポート１０７は、腫瘍断片を第１の区画１０５内に直接的に入れることを可能にするように構成されるキャップが取り付けられている。キャップは、（所望な場合に）腫瘍断片及び／または消化物の挿入を可能にするようにサイズ決めされ、寸法決めされたアクセスポート導路１２３をさらに備えていてもよい。

図１１６及び１２４に示される各々の組織培養デバイス１００は、第２の区画１０６と連通した廃棄出口１１１をさらに備える。いくつかの実施形態では、廃棄出口１１１は、第２のガス透過性表面１０２に近接して位置決めされる。いくつかの実施形態では、廃棄出口１１１は、廃棄出口１１１が開放されているときに、組織培養デバイス１００からの使用済み培地が、下側に廃棄出口１１１を介して、第２の区画１０６中に残存する使用済み培地の最小レベルまで重力によって排出され、第２のガス透過性表面１０２上に沈降するか、または付着する細胞が廃棄出口１１１を介して失われないような第２の区画１０６に対する位置で、組織培養デバイス１００に連結される。

図１１７Ａ～Ｄは、図１１４及び１１５に示される組織培養デバイスを使用するＧｅｎ２プロセスにおいて有用な例示的な方法を図示する。いくつかの実施形態では、Ｇｅｎ２プロセスは、図１１４及び１１５に示される組織培養デバイスを使用して行われてもよい。図１１７Ａ～Ｂに示されるように、組織培養デバイス１００が、第１の方向１１３であって、第１のガス透過性表面１０１、第２のガス透過性表面１０２、及びふるい１０４が、平面１２０に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向１１３にある場合、第１の細胞集団を含む腫瘍断片及び／または腫瘍消化物を、０日目（Ｄ０）に組織培養デバイスの第１の区画１０５に添加して、ＴＩＬ活性化／拡張を開始し、第１の細胞集団を培養して、第２の細胞集団を取得してもよい。腫瘍断片及び／または腫瘍消化物は、アクセスポート１０７を介して第１の区画１０５に直接的に添加されてもよい。培地を第１の方向１１３にある組織培養デバイス１００の第１の区画１０５に灌流させるために、第１の区画１０５に流体的に接続されたアクセスポート導路１２３は、新鮮培地容器１１７に対して滅菌溶接されてもよく、培地は、アクセスポート導路１２３を介して、新鮮培地容器１１７から、第１の方向１１３にある組織培養デバイス１００の第１の区画１０５に重力によって排出されてもよい。同様に、図１１７Ｃに示されるように、第２の方向１１４にある組織培養デバイス１００の第２の区画１０６から廃棄物を排出させるために、廃棄出口１１１を介して第２の区画１０６に流体的に接続された廃棄培地導路は、第２の区画１０６からの廃棄培地が、廃棄培地導路を介して廃棄培地容器１１８に排出され得るように、廃棄培地容器１１８に対して滅菌溶接されてもよい。図１１７Ａ～Ｂに示されるように、組織培養デバイスは、第１の方向１１３にある間に、第１のガス透過性表面１０１から細胞を解離させるように振動が加えられてもよい。組織培養デバイス１００を開くことなく、組織培養デバイスを、第２の方向１１４に回転させてもよく、それによって、細胞をふるい１０４を介して第２の区画１０６に濾過するが、腫瘍断片または腫瘍消化物からの嵩高い材料を第１の区画１０５中に保持する。図１１７Ｂに示されるように、第２の区画１０６に流体的に接続されたアクセスポート１１０は、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３が事前に配合された培地に懸濁された放射線照射されたフィーダー細胞を含有する容器に対して滅菌溶接されてもよく、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３が事前に配合された培地中の放射線照射されたフィーダー細胞は、第２の区画１０６に重力によって排出されてもよく、第２の区画１０６に流体的に接続されたアクセスポート１１０は、新鮮培地容器１１７に対して滅菌溶接されてもよく、培地は、新鮮培地容器１１７から第２の区画１０６に重力によって排出されてもよく、急速拡張（例えば、第２の拡張）は、第２のガス透過性表面１０２上で開始されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＭ２に再懸濁された放射線照射されたフィーダー細胞を含む培地を用いて、第２のガス透過性表面１０２上で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地と称されることがある）は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地と称されることがある）は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇ／フラスコのＯＫＴ－３、及び７．５×１０^８個の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地と称されることがある）は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地と称されることがある）は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇ／フラスコのＯＫＴ－３、及び５×１０^８個の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。図１１７Ｃに示されるように、廃棄ライン上の１つ以上のクランプは、開放されていてもよく、組織培養デバイスを開くことなく、使用済み培地は、所定の量まで（例えば、廃棄出口の場所に対応する高さまで）排出されてもよく、ＩＬ－２が補充された新鮮培地は、組織培養デバイス１００の第２の区画１０６に灌流され、細胞を拡張して、第３の細胞集団（例えば、治療的ＴＩＬ集団）を取得してもよい。図１１７Ｄに示されるように、組織培養デバイス１００は、第２の方向１１４にある間に、第２のガス透過性表面１０２から細胞を解離させるように振動が加えられてもよく、組織培養デバイス１００を、第３の方向１１５に回転させてもよく、第３のＴＩＬ集団は、さらなる処理または使用のために、採取され、容器（例えば、ＬＯＶＯ前バッグ、または患者の使用のための注入バッグ）に移されてもよい。図１１８に示されるように、組織培養デバイス１００は、ふるい１０４によって分離される２つ以上の区画（例えば、第１の区画１０５及び第２の区画１０６）を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、図１１４及び１１５に示されるように、ふるい１０４は、ふるい１０４の縁部が組織培養デバイス１００の側壁１０３に密封可能に接続されるように、第１の区画１０５と第２の区画１０６との間の境界に構築され、整列されてもよい。他の実施形態では、図１１８に示されるように、ふるい１０４は、第１のガス透過性表面１０１の領域に等しいか、またはほぼ等しい領域を有し、第１の区画１０５が第２の区画１０６の内部に突出して、ネック１２１の円筒形延長部及び第２の区画１０６が共通の壁を共有するように、側壁１０３、ネック１２１、その接続部で、または組織培養デバイス１００内に配置されるネック１２１の円筒形延長部の頭部で、組織培養デバイス１００に接続される。図１１８に示されるように、ふるい１０４の表面積を低下させることで、培地表面張力を低下させ、ふるい１０４中に閉じ込められたままである細胞に利用可能な表面積を低下させることによって、細胞の消失を低下させることができることが企図される。

いくつかの実施形態では、Ｇｅｎ３プロセスは、図１１４及び１１５に示される組織培養デバイスを使用して行われてもよい。図１２５Ａ～Ｂに示されるように、組織培養デバイス１００が、第１の方向１１３であって、第１のガス透過性表面１０１、第２のガス透過性表面１０２、及びふるい１０４が、平面１２０に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向１１３にある場合、第１の細胞集団を含む腫瘍断片及び／または腫瘍消化物を、０日目（Ｄ０）に組織培養デバイスの第１の区画１０５に添加して、ＴＩＬ活性化／拡張を開始し、第１の細胞集団を培養してもよい。腫瘍断片は、アクセスポート１０７を介して第１の区画１０５に直接的に添加されてもよい。培地を組織培養デバイス１００の第１の区画１０５に灌流させるために、第１の区画１０５に流体的に接続されたアクセスポート導路１２３は、新鮮培地容器１１７に対して滅菌溶接されてもよく、培地は、アクセスポート導路１２３を介して、新鮮培地容器１１７から、第１の方向１１３にある組織培養デバイス１００の第１の区画１０５に重力によって排出されてもよい。同様に、図１２５Ｄに示されるように、組織培養デバイス１００から廃棄物を排出させるために、廃棄出口１１１を介して第２の区画１０６に流体的に接続された廃棄培地導路は、第２の区画１０６からの廃棄培地が、廃棄培地導路を介して廃棄培地容器１１８に排出され得るように、廃棄培地容器１１８に対して滅菌溶接されてもよい。図１２５Ｂに示されるように、第２の区画１０６に流体的に接続されたアクセスポート１１０は、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３が事前に配合された培地に懸濁された放射線照射されたフィーダー細胞を含有する容器に対して滅菌溶接されてもよく、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３が事前に配合された培地中の放射線照射されたフィーダー細胞は、アクセスポート１１０を介して、第１の方向１１３にある組織培養デバイス１００の第１の区画１０６に重力によって排出されてもよく、細胞は、急速な（第２の）活性化を受け、第２の細胞集団を取得してもよい。ふるい１０４を介して細胞を濾過するための細胞解離及び組織培養デバイスの回転の前に、培地体積低下ステップを行い、細胞の上にある培地の高さを約２ｃｍ～２．５ｃｍまで低下させてもよい。第１の区画１０５に流体的に接続されたアクセスポート導路１２３は、廃棄容器１１８に対して滅菌溶接されてもよく、使用済み培地は、第１のガス透過性表面上の細胞の上にある培地の高さが、約２ｃｍ～２．５ｃｍになるまで、第１の区画１０５から重力によって排出されてもよい。組織培養デバイスは、第１のガス透過性表面から細胞を解離させるように振動が加えられてもよい。図１２５Ｃに示されるように、組織培養デバイスを開くことなく、組織培養デバイスを、第２の方向１１４に回転させてもよく、それによって、細胞をふるい１０４を介して第２の区画１０６に濾過するが、腫瘍断片または腫瘍消化物からの嵩高い材料を第１の区画１０５中に保持し、ＩＬ－２が補充された新鮮培地は、アクセスポート１１０を介して培地容器１１７から重力によって排出させることによって、組織培養デバイス１００の第２の区画１０６に灌流され、第２のガス透過性表面１０２上で細胞を拡張して、第３の細胞集団（例えば、治療的ＴＩＬ集団）を取得してもよい。図１２５Ｄに示されるように、任意選択で、廃棄出口１１１が開放され、使用済み培地は、第２のガス透過性表面上の細胞の上にある培地の高さが約１ｃｍ～１．５ｃｍになるまで、廃棄出口１１１を介して第２の区間１０６から重力によって排出されてもよい。図１２５Ｄに示されるように、組織培養デバイス１００は、第２のガス透過性表面から細胞を解離させるように振動が加えられてもよく、組織培養デバイス１００を、第３の方向１１５に回転させてもよく、第３のＴＩＬ集団（例えば、治療的ＴＩＬ集団）は、さらなる処理または使用のために、採取され、容器（例えば、ＬＯＶＯ前バッグ、または患者の使用のための注入バッグ）に移されてもよい。

いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うことであって、第１の期間中に、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張を行うことと、（ｉｉ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過することであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、濾過することと、（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張の第２の期間を行うことと、を含み得る。

本明細書に記載のガス透過性材料は、可撓性、気密性を確保する密封性、細胞成長の顕微鏡的検査を可能にする良好な透明度、細胞に有害であり得る可塑剤（例えば、フタル酸ジオクチル及びフタル酸ジイソデシル）が存在しないこと、水蒸気透過、細胞との所望の細胞相互作用のために変更される能力、光学的透明度、物理的強度などのうちの１つ以上を含む特徴に基づいて選択され得る。ガス透過性表面は、例えば、本明細書に記載の組織培養デバイス１００の実施形態において使用するためのガス透過性表面の設計において、個別に、または組み合わせてすべてが使用され得るエラストマー、ポリマー、及びシリコーンを含み得る好適な材料を含んでいてもよい。

エラストマーは、粘弾性及び非常に弱い分子間力を有するポリマーであり、一般に、他の材料と比較して低いヤング係数および高い破壊ひずみを有する。エラストマーという用語は、ゴムという用語と互換的に使用され得るが、加硫物を指す場合、ゴムが好ましい。エラストマーは、炭素、水素、酸素、及び／またはケイ素のモノマーから構築された非晶質ポリマーである。エラストマーは、硫黄加硫によって硬化させることができる不飽和ゴム、例えば、天然（ＮＲ）及び合成ポリイソプレン（ＩＲ）、ポリブタジエン（ＢＲ）、クロロペンゴム（ＣＲ）、ブチルゴム（ＩＩＲ）、ハロゲン化ブチルゴム（ＣＩＩＲ、ＢＩＩＲ）、スチレン－ブタジエンゴム（ＳＢＲ）、ニトリル（ＮＢＲ）、及び水素化ニトリルゴム（ＨＮＢＲ）を含む。エラストマーは、硫黄加硫によって硬化することができない不飽和ゴム、例えば、エチレンプロピレンゴム（ＥＰＭ）、エチレンプロピレンジエンゴム（ＥＰＤＭ）、エピクロロヒドリンゴム（ＥＣＯ）、ポリアクリルゴム（ＡＣＭ、ＡＢＲ）、シリコーンゴム（ＳＩ、Ｑ、ＶＭＱ）、フルオロシリコーンゴム（ＦＳＲ、ＦＶＭＱ）、フルオロエラストマー（ＦＫＭ、ＦＥＰＭ）、ペルフルオロエラストマー（ＦＦＫＭ）、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡ）、クロロスルホン化ポリエチレン（ＣＳＭ）、例えば、ＧＥＮＩＯＭＥＲ（登録商標）などの熱可塑性シリコーンを含む、熱可塑性ウレタン（ＴＰＵ５）、環状オレフィンコポリマー、ポリオレフィンエラストマー、エラストマー性ＰＥＴ、及びエチレン－酢酸ビニル（ＥＶＡ）を含む。

熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）は、当該技術分野で知られている。典型的には、熱可塑性ポリウレタンは、ポリオールをイソシアネートと反応させることによって形成される。ポリウレタンの全体的な特性は、ポリオール及びイソシアネートの種類、ポリウレタン中の結晶性、ポリウレタンの分子量、ならびにポリウレタン骨格の化学構造に依存するであろう。ポリウレタンは、存在する架橋の程度に応じて、熱可塑性であってもよく、または熱硬化性であってもよい。熱可塑性ウレタン（ＴＰＵ）は、一級架橋を有しておらず、一方で、熱硬化性ポリウレタンは、反応剤の官能性に応じて、様々な架橋度を有する。熱可塑性ポリウレタンは、一般に、メチレンジイソシアネート（ＭＤＩ）またはトルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）のいずれかに基づいており、ポリオールのポリエステルグレード及びポリエーテルグレードの両方を含む。熱可塑性ポリウレタンは、イソシアネートとポリオールとの間の「ワンショット」反応によって、または「プレポリマー」系によって形成することができ、硬化剤を、部分的に反応させたポリオリソシアネート複合体に添加してポリウレタン反応を完了させる。「プレポリマー」に基づくいくつかの一般的な熱可塑性ポリウレタンエラストマーの例は、Ｂａｙｅｒ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅの商標である「ＴＥＸＩＮ」、Ｌｕｂｒｉｚｏｌの商標である「ＥＳＴＡＮＥ」、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．の商標である「ＰＥＬＬＥＴＨＡＮＥ」、及びＢＡＳＦ，Ｉｎｃ．の商標である「ＥＬＡＳＴＯＬＬＡＮ」である。

シリコーンゴムは、ガス透過性表面にとって特に良好な材料であることが証明されている。十分な酸素と二酸化炭素の交換を保証するために、可能な限り薄いガス交換表面が好ましい。０．１ｍｍ～１ｍｍの厚さを有する表面が、うまくいくことがわかっている。シリコーン表面は、射出成形によって任意の所望の形状で経済的に製造され得る。シリコーンは、多くの厚さ、形状、および特定のガス透過性で市販されている。シリコーンは、細胞培養で通常使用される培地に対して高い引裂抵抗及び良好な化学耐性を有しており、したがって、特に取扱が容易でもある。ガス透過性シリコーン表面を滅菌する能力もまた、特に有利である。特に、形状に実質的な変化がなく、オートクレーブ内で効果的に滅菌することができ、数回再利用することができる。使用されるシリコーンゴムは、可能な限り低い浸出可能プロファイル及び抽出可能プロファイルを有することが好ましい。

熱可塑性樹脂（エラストマー及び非エラストマー）の他の構成、ならびにフルオロポリマーの構成を使用して、低ＴＯＣ流体接触層を含有しつつ、複合材のガス透過性を制御することもできることにも留意されたい。ガス透過性の制御は、高ガス透過性または低ガス透過性のいずれかの複合材を作製するためのものであってもよい。熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）の例としては、スチレンブロックコポリマー（ＴＰＥ－ｓ）、オレフィン（ＴＰＥ－ｏ）、アロイ（ＴＰＥ－ｖまたはＴＰＶ）、ポリウレタン（ＴＰＵ）、コポリエステル、及びポリアミドが挙げられる。非エラストマー熱可塑性樹脂の例としては、アクリル、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ナイロン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリベンズイミダゾール（ＰＢＩ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、及びポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、ならびにそのモノマーアーキテクチャが結晶性を減少させ、可撓性を増加させるために修正された任意の伝統的な剛性ポリマーが挙げられる。

微多孔性疎水性フルオロポリマー、例えば、３Ｍ（商標）Ｄｙｎｅｏｎ（商標）ＴＦＭ（商標）改質ＰＴＦＥ、ＨＴＥ、またはＴＨＶも、ガス交換膜の材料として有利であることがわかっている。フルオロポリマーの疎水性は、ガス交換膜が水性媒体に対して不透過性であることを確実にする。所与のガス透過性の場合、ガス交換膜の必要な幾何形状は、細胞呼吸の結果として生じるガス要件、及び細胞呼吸に関与するガスの分圧、特に外部からの細胞呼吸に作用する酸素分圧に依存する。ガス透過性表面は、任意の厚さのものであってもよく、いくつかの実施形態では、約２５～２５０ミクロンであってもよい。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、ふるい１０４（例えば、フィルター、及び／またはメッシュを完全に、または部分的に含み得る）を備える。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、組織培養デバイス１００の第１の区画１０５を組織培養デバイス１００の第２の区画１０６から分離するように構成され、寸法決定される、ふるい１０４を備える。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、組織培養デバイス１００の第１の区画１０５を組織培養デバイス１００の第２の区画１０６から分離する、ふるい１０４を備えており、ふるい１０４、フィルター、またはメッシュは、腫瘍断片または腫瘍断片の消化物からの嵩高い材料を、腫瘍断片から取得された第１の細胞集団の拡張から取得された第２の細胞集団から分離するように構成される。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、組織培養デバイス１００の第１の区画１０５を組織培養デバイスの第２の区画１０６から分離する、ふるい１０４を備えており、ふるい１０４は、組織培養デバイスの第２の区画１０６に第２の細胞集団が出るのを可能にし、腫瘍断片または腫瘍断片の消化物から取得された嵩高い材料が出るのを遮断することによって、組織培養デバイスの第１の区画１０５中の腫瘍断片または腫瘍断片の消化物から取得された嵩高い材料を、腫瘍断片または消化物から取得された第１の細胞集団の拡張から取得された第２の細胞集団から分離するように構成される。

いくつかの実施形態では、ふるいは、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリテトラフルオロエチリン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｉｎｅ）、ポリフルオロエチレンプロピレン、ポリビニル、ポリスルホン、ポリフッ化ビニル、ポリクロロトリフルオロエチレン、エチレンテトラフルオロエチレン、アルミニウム、ベース（ｂａｓｓ）、銅、ニッケル、青銅、鋼、ステンレス鋼、チタン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される材料から製造される。一例では、ふるい１０４は、ナイロンから製造される。メッシュは、多孔質材料、いくつかの実施形態では、細胞材料に対する親和性が低く、それによって、処理中（例えば、組織培養デバイスの第１の区画から組織培養デバイスの第２の区画へと細胞を移す間）の細胞の消失を低減する材料から製造することができることを理解されたい。

一般に、ふるいは、腫瘍断片及び／または腫瘍断片の消化物からの嵩高い材料が第１の区画から第２の区画へと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が第１の区画から第２の区画へと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成される。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン未満、約２７５ミクロン未満、約２５０ミクロン未満、約２２５ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１７５ミクロン未満、約１５０ミクロン未満、約１２５ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン、約２７５ミクロン、約２５０ミクロン、約２２５ミクロン、約２００ミクロン、約１７５ミクロン、約１５０ミクロン、約１２５ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、または約４０ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいの平均孔径は、前述の値の任意の組み合わせの範囲内であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ふるい１０４は、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約１０ミクロンより大きな、約１５ミクロンより大きな、約２０ミクロンより大きな、約２５ミクロンより大きな、約３０ミクロンより大きな、約３５ミクロンより大きな、約４０ミクロンより大きな、約４５ミクロンより大きな、約５０ミクロンより大きな、約６０ミクロンより大きな、約７０ミクロンより大きな、約８０ミクロンより大きな、約９０ミクロンより大きな、または約１００ミクロンより大きな平均粒径を有する任意の物体が、（例えば、第１の区画から第２の区画へと）ふるいを介して通過することを防止する。

いくつかの実施形態では、第１のガス透過性表面１０１は、約１０平方センチメートル（ｃｍ^２）、約２０ｃｍ^２、約３０ｃｍ^２、約４０ｃｍ^２、約５０ｃｍ^２、約６０ｃｍ^２、約７０ｃｍ^２、約８０ｃｍ^２、約９０ｃｍ^２、約１００ｃｍ^２、約１２５ｃｍ^２、約１５０ｃｍ^２、約１７５ｃｍ^２、約２００ｃｍ^２、約２２５ｃｍ^２、約２５０ｃｍ^２、約２７５ｃｍ^２、約３００ｃｍ^２、約３２５ｃｍ^２、約３５０ｃｍ^２、約３７５ｃｍ^２、約４００ｃｍ^２、約４２５ｃｍ^２、約４５０ｃｍ^２、約４７５ｃｍ^２、約５００ｃｍ^２の断面積を有する。

いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面は、少なくとも約１０平方センチメートル（ｃｍ^２）、少なくとも約２０ｃｍ^２、少なくとも約３０ｃｍ^２、少なくとも約４０ｃｍ^２、少なくとも約５０ｃｍ^２、少なくとも約６０ｃｍ^２、少なくとも約７０ｃｍ^２、少なくとも約８０ｃｍ^２、少なくとも約９０ｃｍ^２、少なくとも約１００ｃｍ^２、少なくとも約１２５ｃｍ^２、少なくとも約１５０ｃｍ^２、少なくとも約１７５ｃｍ^２、少なくとも約２００ｃｍ^２、少なくとも約２２５ｃｍ^２、少なくとも約２５０ｃｍ^２、少なくとも約２７５ｃｍ^２、少なくとも約３００ｃｍ^２、少なくとも約３２５ｃｍ^２、少なくとも約３５０ｃｍ^２、少なくとも約３７５ｃｍ^２、少なくとも約４００ｃｍ^２、少なくとも約４２５ｃｍ^２、少なくとも約４５０ｃｍ^２、少なくとも約４７５ｃｍ^２、少なくとも約５００ｃｍ^２、少なくとも約５５０ｃｍ^２、少なくとも約６００ｃｍ^２、少なくとも約６５０ｃｍ^２、少なくとも約７００ｃｍ^２、少なくとも約７５０ｃｍ^２、少なくとも約８００ｃｍ^２、少なくとも約８５０ｃｍ^２、少なくとも約９００ｃｍ^２、少なくとも約９５０ｃｍ^２、少なくとも約１０００ｃｍ^２、少なくとも約１５００ｃｍ^２、少なくとも約２０００ｃｍ^２、少なくとも約２５００ｃｍ^２、少なくとも約３０００ｃｍ^２、少なくとも約４０００ｃｍ^２、少なくとも約５０００ｃｍ^２、少なくとも約６０００ｃｍ^２、少なくとも約７０００ｃｍ^２、少なくとも約８０００ｃｍ^２、少なくとも約９０００ｃｍ^２、または少なくとも約１００００ｃｍ^２の断面積を有する。

いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面１０２の断面積の、第１のガス透過性表面１０１の断面積に対する比率は、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０であるか、または約５０より大きい。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、第１の区画１０５を備えており、第１の区画１０５は、約２５ミリリットル（ｍＬ）、約５０ｍＬ、約７５ｍＬ、約１００ｍＬ、約１２５ｍＬ、約１５０ｍＬ、約１７５ｍＬ、約２００ｍＬ、約２２５ｍＬ、約２５０ｍＬ、約３００ｍＬ、約３５０ｍＬ、約４００ｍＬ、約４５０ｍＬ、約５００ｍＬ、または約５００ｍＬより大きい体積を有する。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、第２の区画１０６を含み、第２の区画は、少なくとも約２５ミリリットル（ｍＬ）、少なくとも約５０ｍＬ、少なくとも約７５ｍＬ、少なくとも約１００ｍＬ、少なくとも約１２５ｍＬ、少なくとも約１５０ｍＬ、少なくとも約１７５ｍＬ、少なくとも約２００ｍＬ、少なくとも約２２５ｍＬ、少なくとも約２５０ｍＬ、少なくとも約３００ｍＬ、少なくとも約３５０ｍＬ、少なくとも約４００ｍＬ、少なくとも約４５０ｍＬ、少なくとも約５００ｍＬ、少なくとも約６００ｍＬ、少なくとも約７００ｍＬ、少なくとも約８００ｍＬ、少なくとも約９００ｍＬ、少なくとも約１０００ｍＬ、少なくとも約１２５０ｍＬ、少なくとも約１５００ｍＬ、少なくとも約１７５０ｍＬ、少なくとも約２０００ｍＬ、少なくとも約２２５０ｍＬ、少なくとも約２５００ｍＬ、少なくとも約３０００ｍＬ、少なくとも約３５００ｍＬ、少なくとも約４０００ｍＬ、少なくとも約４５００ｍＬ、少なくとも約５０００ｍＬ、少なくとも約６０００ｍＬ、少なくとも約７０００ｍＬ、少なくとも約８０００ｍＬ、少なくとも約９０００ｍＬ、または少なくとも約１００００ｍＬの体積を有する。

いくつかの実施形態では、第２の区画１０６の体積の、第１の区画１０５の体積に対する比率は、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０であるか、または約５０より大きい。

いくつかの実施形態では、第１のガス透過性表面１０１とふるい１０４との間の距離は、約１センチメートル（ｃｍ）、約２ｃｍ、約３ｃｍ、約４ｃｍ、約５ｃｍ、約６ｃｍ、約７ｃｍ、約８ｃｍ、約９ｃｍ、約１０ｃｍ、約１１ｃｍ、約１２ｃｍ、約１３ｃｍ、約１４ｃｍ、約１５ｃｍ、約１６ｃｍ、約１７ｃｍ、約１８ｃｍ、約１９ｃｍ、約２０ｃｍであるか、または約２０ｃｍより大きい。

いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面１０２とふるい１０４との間の距離は、少なくとも約１センチメートル（ｃｍ）、少なくとも約２ｃｍ、少なくとも約３ｃｍ、少なくとも約４ｃｍ、少なくとも約５ｃｍ、少なくとも約６ｃｍ、少なくとも約７ｃｍ、少なくとも約８ｃｍ、少なくとも約９ｃｍ、少なくとも約１０ｃｍ、少なくとも約１１ｃｍ、少なくとも約１２ｃｍ、少なくとも約１３ｃｍ、少なくとも約１４ｃｍ、少なくとも約１５ｃｍ、少なくとも約１６ｃｍ、少なくとも約１７ｃｍ、少なくとも約１８ｃｍ、少なくとも約１９ｃｍ、少なくとも約２０ｃｍである。

いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面１０２とふるい１０４との間の距離の、第１のガス透過性表面１０１とふるい１０４との間の距離に対する比率は、正確に１である。いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面１０２とふるい１０４との間の距離の、第１のガス透過性表面１０１とふるい１０４との間の距離に対する比率は、約１である。いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面１０２とふるい１０４との間の距離の、第１のガス透過性表面１０１とふるい１０４との間の距離に対する比率は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０であるか、または約１０より大きい。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、組織培養デバイス１００を１つ以上の方向に支持する（例えば、２つの方向、３つの方向、またはそれより多くの方向に支持される）ための１つ以上のフレーム１０９を有する基部を備えていてもよい。フレーム１０９は、組織培養デバイス１００が使用されるときに、第１のガス透過性表面も第２のガス透過性表面も、表面に対して直接的に位置決めされないことを確実にするように、さらに構成されてもよい。いくつかの実施形態では、フレーム１０９は、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、組織培養デバイス１００が位置決めされる表面より上の選択された距離に位置決めされることを確実にするように構成される。フレームは、３Ｄ印刷（例えば、連続的な液体界面印刷）または射出成形などの例示的な方法を使用して製造することができる。いくつかの実施形態では、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第１の方向に組織培養デバイスを支持するように構成されたフレーム。いくつかの実施形態では、第１の方向で、第２のガス透過性表面は、第１のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる。いくつかの実施形態では、フレームは、平面に対して第２の方向であって、ふるいが、平面と第１のガス透過性表面との間で第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第２の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成される。いくつかの実施形態では、フレームは、平面に対して第３の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる第３の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成される。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、（例えば、腫瘍断片もしくは組織消化物を組織培養デバイス内に堆積させるための）１つ以上の入口ポート、または（例えば、廃棄培地を吸引するため、もしくは組織培養デバイスから細胞を採取するための）１つ以上の出口ポートを備えていてもよい。一般に、入口または出口は、組織培養デバイスの１つ以上の側壁にそって配置され、１つ以上の構成要素（例えば、第１の区画及び第２の区画の一方または両方）と流体連結していてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画１０６と流体連通した培地入口１１０を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、第２の区画１０６と流体連通した廃棄出口１１１を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、第２の区画１０６と流体連通した細胞採取出口１１２を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、入口または出口ポートを備えるネック部分を備えていてもよく、ネック部分は、１つ以上の側壁に沿って（例えば、第１のガス透過性表面とふるいとの間に、または第２のガス透過性表面とふるいとの間に）配置される。

図１１９に示されるように、組織培養デバイス１００は、組織培養デバイス２０８／２０９によって具現化されており、（例えば、チューブによって）流体的に接続される２つ以上の構成要素（例えば、第１の区画２０３及び第２の区画２０７）を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、第１の区画２０３及び第２の区画２０７は、別個の区画である。いくつかの実施形態では、第１の区画２０３及び第２の区画２０７は、共通の壁を共有しない別個の区画である。いくつかの実施形態では、第１の区画２０３及び第２の区画２０７は、共通の連続する内側表面を共有しない別個の区画である。第１の区画２０３及び／または第２の区画２０７は、拡張可能な区画（図１１９に点線で示される）であってもよく、例えば、本明細書に記載の拡張可能な組織培養デバイス（例えば、細胞培養バッグ）のうちの１つ以上であってもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスの拡張可能な区画は、容器がガス透過性トレイ中に位置決めされる場合、可撓性区画内の細胞及び培地の重量によって、容器をガス透過性トレイの形状に適合させるように、可撓性材料から製造され得る。いくつかの実施形態では、第２の区画２０７の体積は、例えば、１つ以上のクランプ、または本明細書に開示されるその他のもの（例えば、可動障壁、トレイ摺動蓋、またはスペーサー）などの制限手段を使用して、その使用可能な体積に制限されてもよい。各区画は、細胞を培養するためのガス透過性表面（例えば、第１のガス透過性表面２０４及び第２のガス透過性表面２０６）を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、容器全体（例えば、第１の容器２０１または第２の容器２０５）は、ガス透過性材料を使用して製造されてもよい。他の実施形態では、容器の一部分は、ガス透過性材料を使用して製造されてもよい。いくつかの実施形態では、容器の底面（例えば、容器中に堆積した細胞が重力下で沈降し得る表面）のみが、ガス透過性材料を使用して製造される。いくつかの実施形態では、ふるい２１４は、第１の区画２０３との接合部にあるチューブ２１０の入口に位置決めされ、第１の区画２０３における第１の拡張からの細胞を第２の区画２０７へと通過させるときに、第１の区画２０３からの細胞及び培地をふるい２１４を介して濾過することによって、細胞を、細胞培養破片（例えば、腫瘍断片残存物及び／または腫瘍消化物から残存する嵩高い材料）を分離してもよい。ふるい２１４の多孔率は、第１の拡張からの細胞が、第１の区画２０３から第２の区画２０７へと通過することを可能にしつつ、第１の区画２０３中に腫瘍残存物及び／または腫瘍消化物から残存する嵩高い材料を保持するように選択される。

図１２０～１２３、及び１２６～１２９の実施形態に図示されるように、組織培養デバイス２０８／２０９は、インキュベーター１１６に入れられてもよい。１つ以上の第１のポンプ１１９を使用して、新鮮培地容器１１７からの新鮮培地を培地入口２１２を介して組織培養デバイス２０８／２０９に圧送してもよい。いくつかの実施形態では、新鮮培地容器１１７は、（例えば、培地の温度及び酸素／ＣＯ２飽和度を維持するために）インキュベーター内に位置し得る。他の実施形態では、新鮮培地容器１１７は、インキュベーターの外側に位置し得る。新鮮培地容器と組織培養デバイスとを接続する導路が、インキュベーターを介して通過するため、チューブの長さは、組織培養デバイス２０８／２０９に入る前に、導路中の培地の温度及び酸素／ＣＯ２飽和度を、インキュベーターの内部条件を用いて較正することを可能にするように調整することができることが企図される。１つ以上の第２のポンプ１１９を使用して、使用済み培地を廃棄培地出口２１３を介して廃棄培地容器１１８へと引き込んでもよい。１つ以上の第２のポンプ１１９を使用して、細胞採取出口２１３を介して、さらなる処理または使用のための容器（例えば、ＬＯＶＯ前バッグまたは注入バッグ）に細胞を採取してもよい。

いくつかの実施形態では、第１の容器２０１及び／または第２の容器２０５は、それぞれの容器中に細胞の試料及び培地を収集するためのサンプリングチューブ２１１を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、容器中の細胞の試料及び培地は、容器中の細胞を数えあげるために、サンプリングチューブ２１１を介して取得されてもよい。例えば、細胞を第１の容器２０１から第２の容器２０５へと圧送する前に、細胞の試料及び培地は、サンプリングチューブ２１１を介して、第１の容器２０１から取得され、第１の容器２０１中の細胞を数えあげ、数えあげに基づき、第２の容器２０５の体積を、所望の細胞密度が得られるように制限してもよい。別の例では、第２の拡張の間に、細胞の試料及び培地は、サンプリングチューブ２１１を介して、第２の容器２０５から取得され、第２の容器中の細胞を数えあげ、数えあげに基づき、第２の容器２０５の体積を、第２の拡張の残りの間にわたって、第２の容器において所望の細胞密度が得られるように増加させてもよい。

ガス透過性トレイ及び／または２Ｄロッカーを使用して、組織培養デバイスを様々な方向に維持するのを補助してもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍断片または腫瘍消化物は、アクセスポート２０２を介して組織培養デバイス２０８／２０９の第１の区画２０３内に堆積し、第１のガス透過性表面２０４上で培養される。

Ｇｅｎ２プロセスと組み合わせて図１２１Ｂに記載されるように、腫瘍断片または腫瘍消化物から取得された細胞の第１の拡張の後、細胞を、流体接続２１０を介して、さらに拡張される第２の区画２０７に移してもよい。ふるい２１４（任意選択で第１の区画２０３の内部に、流体接続２１０のライン中に、及び／または第１の区画２０３と流体接続２１０の界面に配置される）は、第１の拡張からの細胞を、破片（例えば、腫瘍断片残存物及び／または腫瘍消化物からの嵩高い材料）から濾過するために使用することができる。ふるい２１４の多孔率は、第１の拡張からの細胞が、第１の区画２０３から第２の区画２０７へと通過することを可能にしつつ、第１の区画２０３中に腫瘍断片残存物及び／または腫瘍消化物からの嵩高い材料を保持するように選択される。第１の拡張からの細胞は、その後に、採取の前に、第２のガス透過性表面２０６上で拡張される。一般に、第２のガス透過性表面２０６の断面積は、第１の拡張から取得された細胞培地のスケールアップを提供するために、第１のガス透過性表面２０４の断面積よりも大きいだろう。

Ｇｅｎ３プロセスと組み合わせて図１２７Ｂに記載されるように、腫瘍断片または腫瘍消化物から取得された細胞の第１の拡張の後、細胞を、培養物に追加の培養培地及びＩＬ－２を補充した後、第１の区画２０３において第２の拡張に供してもよい。第１の区画２０３における第２の拡張から取得された細胞を、流体２１０接続を介して、さらに拡張される第２の区画２０７に移してもよい。ふるい２１４は、第２の拡張からの細胞を、第１の区画２０３において、破片（例えば、腫瘍断片残存物及び／または腫瘍消化物からの嵩高い材料）から濾過するために使用することができる。ふるい２１４の多孔率は、第２の拡張からの細胞が、第１の区画２０３から第２の区画２０７へと通過することを可能にしつつ、第１の区画２０３中に腫瘍断片残存物及び／または腫瘍消化物からの嵩高い材料を保持するように選択される。第２の拡張からの細胞は、その後に、採取の前に、第２のガス透過性表面２０６上で拡張される。一般に、第２のガス透過性表面２０６の断面積は、第２の拡張から取得された細胞培地のスケールアップを提供するために、第１のガス透過性表面２０４の断面積よりも大きいだろう。

図１２０及び１２６は、図１１９に示される組織培養デバイスであり得る、組織培養デバイスのいくつかの実施形態を図示する。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第１のガス透過性表面を有する第１の区画を備える第１の容器と、第１のガス糖化性表面と同じか、またはそれより大きい表面積を有する細胞培養表面積を有する第２のガス透過性表面を有する第２の区画を備える第２の容器と、を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、２つの区画は、約２００ミクロンの平均直径を有する細孔を有する導路及びふるいによって分離されてもよい。第１の容器及び第２の容器は、可撓性容器（例えば、第１の容器及び／または第２の容器）を支持するように構成され、寸法決定されたトレー中に置かれてもよい。いくつかの実施形態では、第１の容器及び／または第２の容器は、トレイの形状に適合するように構成される（例えば、そのような容器内の材料の重量が、容器の可撓性側壁をトレイ内で歪ませる場合）。いくつかの実施形態では、トレイは、ガス透過性トレイである。いくつかの実施形態では、トレイは、第１の容器が、第２の容器に対して上昇するように構成され、整列されてもよい。いくつかの実施形態では、トレイは、第１の容器が第２の容器に対して上昇するように構成され、整列されてもよく、第１の容器の第１の区画と第２の容器の第２の区画との間の流体接続が、開放されると、細胞及び培地が第１の区画から第２区画へと（例えば、受動的、またはポンプで補助しつつ能動的に）移されることを可能にする排出部として作用する。

いくつかの実施形態では、第１の容器２０１及びまたは第２の容器２０５は、第１の容器及び／または第２の容器の内部体積を選択的に制限するように調整可能である制限手段を備える。いくつかの実施形態では、制限手段は、容器の内部体積を選択的に制限するために、第１の容器２０１及び／または第２の容器２０５に直接的に適用される。例えば、制限手段は、材料が、クランプを介して第１の容器２０１及び／または第２の容器２０５の制限された内部体積から、カットオフされる第１の容器及び／または第２の容器の任意の部分へと流れることができないように、第１の容器２０１及び／または第２の容器２０５の可撓性外壁を圧縮するように構成される１つ以上のクランプを備えていてもよい。いくつかの実施形態では、クランプは、第１の容器２０１及び／または第２の容器２０５の体積を選択的に制限するために容易に追加され、または取り外すことができる調節可能なクランプである。いくつかの実施形態では、１つ以上のクランプを使用して、細胞を培養するためのガス透過性表面（例えば、第１のガス透過性表面２０４及び／または第２のガス透過性表面２０６）の一部分のみが使用のために利用可能であるように、所定の期間、第２の容器２０５の体積を制限してもよい。組織培養デバイスは、インキュベーター１１６中に入れられてもよく、細胞及び／または培地は、１つ以上のポンプ１１９を使用して、自動化された方法で、第１の容器２０１から第２の容器２０５へと（またはその逆に）移されてもよい。同様に、新鮮な培地は、第１の容器２０１または第２の容器２０５に移されてもよく、細胞は、１つ以上のポンプ１１９を使用して、第２の容器２０５からポンプを介して採取されてもよい。ロッカーを使用して、第１の容器２０１及び／または第２の容器２０５を傾けてもよく、それによって、第２の容器２０５中の採取時の細胞を、細胞採取出口２１３を介して排出させることを可能にする。

図１２１Ａ～Ｄ及び１２７Ａ～Ｄは、いくつかの実施形態では図１１９に示される組織培養デバイスを使用した、それぞれＧｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの例示的な方法を図示する。

いくつかの実施形態では、Ｇｅｎ２プロセスは、図１１９に示される組織培養デバイスを使用して行われてもよい。図１２１Ａ～Ｂに示されるように、第１の細胞集団を含む腫瘍断片及び／または腫瘍消化物を、０日目（Ｄ０）に組織培養デバイス２０８／２０９の第１の区画２０３に添加して、ＴＩＬ拡張を開始させ、第１の細胞集団を培養して、第２の細胞手段を取得してもよい。第２の集団中の細胞の数は、サンプリングチューブ２１１を介して試料を取得することによって数えあげられてもよく、数えあげに基づき、第２の区画２０７の体積（及びガス透過性表面２０６の利用可能な表面積）を調整して、所望の細胞密度を得てもよい。第２の区画２０７を所望の体積に調整した後、組織培養デバイスを開くことなく、細胞及び培地は、流体接続２１０及びふるい２１４を介して第２の区画２０７に圧送されてもよく、それによって、細胞をふるい２１４を介して第２の区画２０７に濾過するが、任意の残存する腫瘍断片または腫瘍消化物からの嵩高い材料を第１の区画２０３中に保持する。急速拡張（例えば、第２の拡張）は、第２のガス透過性表面２０６上で開始されてもよい。組織培養デバイスを開くことなく、使用済み培地は、ロッカーを使用して組織培養デバイスを傾けることによって排出されてもよく、新鮮培地は、組織培養デバイスに灌流され、細胞を拡張して、第３の細胞集団（例えば、治療的ＴＩＬ集団）を取得してもよい。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、２つの期間に分割されてもよく、第１の期間の後に、細胞は、第２の区画２０７から延在するサンプリングチューブ２１１を介して試料を取得することによって数えあげられ、数えあげに基づき、第２の区画２０７の体積を、第２の拡張の第２の期間の開始時に所望の細胞密度が得られるように拡張する。第２の細胞集団に、第２の区画２０７に接続された培地入口２１２を介して、追加の培地及びＩＬ－２を補充し、第２の拡張の第２の期間培養して、第３のＴＩＬ集団を産生する。第３のＴＩＬ集団を採取し、患者の使用のための注入バッグに移してもよい。

いくつかの実施形態では、Ｇｅｎ３プロセスは、図１１９に示される組織培養デバイスを使用して行われてもよい。図１２７Ａ～Ｂに示されるように、第１の細胞集団を含む腫瘍断片及び／または腫瘍消化物を、０日目（Ｄ０）に組織培養デバイス２０８／２０９の第１の区画２０３に添加して、フィーダー細胞、ＯＫＴ－３及びＩＬ－２が補充された培地を、ＴＩＬ拡張の開始及び活性化のために、培地入口２１２を介して培地容器１１７から第１の区画２０３へと重力によって排出させ、第１の細胞集団を培養して、第２の細胞集団を産生してもよい。次に、第２の細胞集団を、第１の区画２０３に接続されたサンプリングチューブ２１１から取得された試料から数えあげてもよい。第２の細胞集団は、第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を受ける。第２の拡張の第１の期間は、追加のフィーダー細胞、ＯＫＴ－３及びＩＬ－２を培地入口２１２を介して第１の区画２０３に導入することによって開始される。第２の拡張の第１の期間の完了時に、細胞は、第１の区画２０３に接続されたサンプリングチューブ２１１から取得された試料から数えあげられる。数えあげに基づき、第２の区画の体積（及びガス透過性表面の利用可能な表面積）を調整して、第２の拡張の第２の期間の開始時に、所望の細胞密度を得る。第２の区画を所望の体積に調整した後、組織培養デバイスを開くことなく、細胞及び培地は、流体接続２１０及びふるい２１４を介して第２の区画に圧送されてもよく、それによって、細胞をふるい２１４を介して第２の区画２０７に濾過するが、任意の残存する腫瘍断片または腫瘍消化物から残存する嵩高い材料を第１の区画２０３中に保持する。第２の拡張の第２の期間は、第２のガス透過性表面２０６上で開始されてもよい。第２の細胞集団に、第２の区画２０７に接続された培地入口２１２を介して、追加の培地及びＩＬ－２を補充し、第２の拡張の第２の期間培養して、第３のＴＩＬ集団を産生する。第３のＴＩＬ集団を採取し、患者の使用のための注入バッグに移してもよい。

図１２２及び１２８に示されるように、いくつかの実施形態では、外部フレームを使用して、第１の容器または第２の容器の内部体積を選択的に調整してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、第１の容器及び／または第２の容器を変形または圧縮するためにクランプを適用する代わりに、容器は、第１の容器及び／または第２の容器内の材料の重量が拡張し、それぞれの容器の壁を屈曲させ、それによって、選択された限定された空間を充填するように、フレームによって囲まれた限定された空間中に入れられてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、トレイ摺動蓋を使用して、細胞培養に利用可能な第２の区画中の第２のガス透過性表面の表面積を制限してもよい。トレイ摺動蓋は、支持部材にヒンジによって取り付けられた平面部材を備えていてもよい。支持部材は、第２の容器が位置するガス透過性トレイにヒンジによって取り付けられ、ヒンジの周りを回転して、ガス透過性トレイの長さに沿ってトレイ摺動蓋を延在させてもよい。トレイ摺動蓋は、ガス透過性トレイと接触する第２のガス透過性表面の表面積を制限してもよく、それによって、第２の容器内に堆積した細胞が沈降し、それに対して付着する第２のガス透過性表面の水平領域を制限する。図１２３及び１２９に示されるように、いくつかの実施形態では、調整可能なスペーサーを使用して、細胞培養に利用可能な第１及び／または第２のガス透過性表面の表面積を制限してもよい。調整可能スペーサーは、ガス透過性トレイに取り外し可能に取り付けられている平面部材を備えていてもよい。ガス透過性トレイは、調整可能なスペーサーを位置決めすることができるガス透過性トレイの長さに沿って複数の凹部を含んでいてもよく、それによって、ガス透過性トレイと接触した第１及び／または第２のガス透過性表面の表面積を管理し、容器内に堆積した細胞が沈降し、それに対して付着し得る第１及び／または第２のガス透過性表面の水平領域を制限する。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、１つ以上の容器を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、容器のうちの１つ以上は、ガス透過性材料から部分的に、または実質的に完全に製造される可撓性側壁を備える。いくつかの実施形態では、１つ以上の容器は、ガス透過性材料から実質的に完全に製造することができる（例えば、容器は、バッグであってもよく、バッグの表面全体が、ガス透過性材料を使用して製造され、必要な非透過性継ぎ手を取り付けることができる）。他の実施形態では、容器の一部分を、ガス透過性材料を使用して製造することができる。いくつかの実施形態では、容器の表面積の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、または約５０％より多くを、ガス透過性材料を使用して製造することができる。当業者は、ガス透過性材料が、可撓性、気密性を確保する密封性、細胞成長の顕微鏡的検査を可能にする良好な透明度、細胞に有害であり得る可塑剤（例えば、フタル酸ジオクチル及びフタル酸ジイソデシル）が存在しないこと、水蒸気透過、細胞との所望の細胞相互作用のために変更される能力、光学的透明度、物理的強度などのうちの少なくとも１つを含む特徴に基づいて選択されてもよいことを認識するだろう。ガス透過性表面は、例えば、本開示の組織培養デバイスに使用するためのガス透過性表面の設計において、個別に、または組み合わせてすべてが使用され得るエラストマー、ポリマー、及びシリコーンを含み得る好適な材料を含んでいてもよい。

エラストマーは、粘弾性及び非常に弱い分子間力を有するポリマーであり、一般に、他の材料と比較して低いヤング係数および高い破壊ひずみを有する。エラストマーという用語は、ゴムという用語と互換的に使用され得るが、加硫物を指す場合、ゴムが好ましい。エラストマーは、炭素、水素、酸素、及び／またはケイ素のモノマーから構築された非晶質ポリマーである。エラストマーは、硫黄加硫によって硬化させることができる不飽和ゴム、例えば、天然（ＮＲ）及び合成ポリイソプレン（ＩＲ）、ポリブタジエン（ＢＲ）、クロロペンゴム（ＣＲ）、ブチルゴム（ＩＩＲ）、ハロゲン化ブチルゴム（ＣＩＩＲ、ＢＩＩＲ）、スチレン－ブタジエンゴム（ＳＢＲ）、ニトリル（ＮＢＲ）、及び水素化ニトリルゴム（ＨＮＢＲ）を含む。エラストマーは、硫黄加硫によって硬化することができない不飽和ゴム、例えば、エチレンプロピレンゴム（ＥＰＭ）、エチレンプロピレンジエンゴム（ＥＰＤＭ）、エピクロロヒドリンゴム（ＥＣＯ）、ポリアクリルゴム（ＡＣＭ、ＡＢＲ）、シリコーンゴム（ＳＩ、Ｑ、ＶＭＱ）、フルオロシリコーンゴム（ＦＳＲ、ＦＶＭＱ）、フルオロエラストマー（ＦＫＭ、ＦＥＰＭ）、ペルフルオロエラストマー（ＦＦＫＭ）、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡ）、クロロスルホン化ポリエチレン（ＣＳＭ）、例えば、ＧＥＮＩＯＭＥＲ（登録商標）などの熱可塑性シリコーンを含む、熱可塑性ウレタン（ＴＰＵ５）、環状オレフィンコポリマー、ポリオレフィンエラストマー、エラストマー性ＰＥＴ、及びエチレン－酢酸ビニル（ＥＶＡ）を含む。

熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）は、当該技術分野で知られている。典型的には、熱可塑性ポリウレタンは、ポリオールをイソシアネートと反応させることによって形成される。ポリウレタンの全体的な特性は、ポリオール及びイソシアネートの種類、ポリウレタン中の結晶性、ポリウレタンの分子量、ならびにポリウレタン骨格の化学構造に依存するであろう。ポリウレタンは、存在する架橋の程度に応じて、熱可塑性であってもよく、または熱硬化性であってもよい。熱可塑性ウレタン（ＴＰＵ）は、一級架橋を有しておらず、一方で、熱硬化性ポリウレタンは、反応剤の官能性に応じて、様々な架橋度を有する。熱可塑性ポリウレタンは、一般に、メチレンジイソシアネート（ＭＤＩ）またはトルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）のいずれかに基づいており、ポリオールのポリエステルグレード及びポリエーテルグレードの両方を含む。熱可塑性ポリウレタンは、イソシアネートとポリオールとの間の「ワンショット」反応によって、または「プレポリマー」系によって形成することができ、硬化剤を、部分的に反応させたポリオリソシアネート複合体に添加してポリウレタン反応を完了させる。「プレポリマー」に基づくいくつかの一般的な熱可塑性ポリウレタンエラストマーの例は、Ｂａｙｅｒ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅの商標である「ＴＥＸＩＮ」、Ｌｕｂｒｉｚｏｌの商標である「ＥＳＴＡＮＥ」、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．の商標である「ＰＥＬＬＥＴＨＡＮＥ」、及びＢＡＳＦ，Ｉｎｃ．の商標である「ＥＬＡＳＴＯＬＬＡＮ」である。

シリコーンゴムは、ガス透過性表面にとって特に良好な材料であることが証明されている。十分な酸素と二酸化炭素の交換を保証するために、可能な限り薄いガス交換表面が好ましい。０．１ｍｍ～１ｍｍの厚さを有する表面が、うまくいくことがわかっている。シリコーン表面は、射出成形によって任意の所望の形状で経済的に製造され得る。シリコーンは、多くの厚さ、形状、および特定のガス透過性で市販されている。シリコーンは、細胞培養で通常使用される培地に対して高い引裂抵抗及び良好な化学耐性を有しており、したがって、特に取扱が容易でもある。ガス透過性シリコーン表面を滅菌する能力もまた、特に有利である。特に、形状に実質的な変化がなく、オートクレーブ内で効果的に滅菌することができ、数回再利用することができる。使用されるシリコーンゴムは、可能な限り低い浸出可能プロファイル及び抽出可能プロファイルを有することが好ましい。

熱可塑性樹脂（エラストマー及び非エラストマー）の他の構成、ならびにフルオロポリマーの構成を使用して、低ＴＯＣ流体接触層を含有しつつ、複合材のガス透過性を制御することもできることにも留意されたい。ガス透過性の制御は、高ガス透過性または低ガス透過性のいずれかの複合材を作製するためのものであってもよい。熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）の例としては、スチレンブロックコポリマー（ＴＰＥ－ｓ）、オレフィン（ＴＰＥ－ｏ）、アロイ（ＴＰＥ－ｖまたはＴＰＶ）、ポリウレタン（ＴＰＵ）、コポリエステル、及びポリアミドが挙げられる。非エラストマー熱可塑性樹脂の例としては、アクリル、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ナイロン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリベンズイミダゾール（ＰＢＩ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、及びポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、ならびにそのモノマーアーキテクチャが結晶性を減少させ、可撓性を増加させるために修正された任意の伝統的な剛性ポリマーが挙げられる。

微多孔性疎水性フルオロポリマー、例えば、３Ｍ（商標）Ｄｙｎｅｏｎ（商標）ＴＦＭ（商標）改質ＰＴＦＥ、ＨＴＥ、またはＴＨＶも、ガス交換膜の材料として有利であることがわかっている。フルオロポリマーの疎水性は、ガス交換膜が水性媒体に対して不透過性であることを確実にする。所与のガス透過性の場合、ガス交換膜の必要な幾何形状は、細胞呼吸の結果として生じるガス要件、及び細胞呼吸に関与するガスの分圧、特に外部からの細胞呼吸に作用する酸素分圧に依存する。ガス透過性表面は、任意の厚さのものであってもよく、いくつかの実施形態では、約２５～２５０ミクロンであってもよい。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、ふるい２１４（例えば、フィルター、またはメッシュ）を備える。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス２０８／２０９は、組織培養デバイス２０８／２０９の第２の区画２０７から組織培養デバイス２０８／２０９の第１の区画２０３を流体的に接続する導路に沿って配置されたふるいを備える。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、組織培養デバイス２０８／２０９の第２の区画２０７から組織培養デバイス２０８／２０９の第１の区画２０３を流体的に接続する導路に沿って配置されたふるい２１４（例えば、フィルター、またはメッシュ）を備え、ふるい２１４（例えば、フィルター、またはメッシュ）は、腫瘍断片または腫瘍断片の消化物からの嵩高い材料を、腫瘍断片または消化物から取得された第１の細胞集団の拡張から取得された第２の細胞集団から分離するように構成される。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、組織培養デバイス２０８／２０９の第２の区画２０７から組織培養デバイス２０８／２０９の第１の区画２０３を流体的に接続する導路に沿って配置されたふるい２１４を備え、ふるい２１４（例えば、フィルター、またはメッシュ）は、組織培養デバイス２０８／２０９の第２の区画２０７に第２の細胞集団が出るのを可能にし、腫瘍断片または腫瘍断片の消化物から取得された嵩高い材料が出るのを遮断することによって、組織培養デバイス２０８／２０９の第１の区画２０３中の腫瘍断片または腫瘍断片の消化物からの嵩高い材料を、腫瘍断片または消化物から取得された第１の細胞集団の拡張から取得された第２の細胞集団から分離するように構成される。

いくつかの実施形態では、ふるいは、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリテトラフルオロエチリン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｉｎｅ）、ポリフルオロエチレンプロピレン、ポリビニル、ポリスルホン、ポリフッ化ビニル、ポリクロロトリフルオロエチレン、エチレンテトラフルオロエチレン、アルミニウム、ベース（ｂａｓｓ）、銅、ニッケル、青銅、鋼、ステンレス鋼、チタン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される材料から製造される。一例では、ふるいは、ナイロンから製造される。メッシュは、任意の多孔質材料、いくつかの実施形態では、細胞材料に対する親和性が低く、それによって、処理中（例えば、組織培養デバイスの第１の区画から組織培養デバイスの第２の区画へと細胞を移す間）の細胞の消失を低下させる材料から製造することができることを理解されたい。

一般に、ふるいは、腫瘍断片が第１の区画から第２の区画へと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が第１の区画から第２の区画へと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成される。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン未満、約２７５ミクロン未満、約２５０ミクロン未満、約２２５ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１７５ミクロン未満、約１５０ミクロン未満、約１２５ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン、約２７５ミクロン、約２５０ミクロン、約２２５ミクロン、約２００ミクロン、約１７５ミクロン、約１５０ミクロン、約１２５ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、または約４０ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいの平均孔径は、本明細書で提供される任意の値の範囲内であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約１０ミクロンより大きな、約１５ミクロンより大きな、約２０ミクロンより大きな、約２５ミクロンより大きな、約３０ミクロンより大きな、約３５ミクロンより大きな、約４０ミクロンより大きな、約４５ミクロンより大きな、約５０ミクロンより大きな、約６０ミクロンより大きな、約７０ミクロンより大きな、約８０ミクロンより大きな、約９０ミクロンより大きな、または約１００ミクロンより大きな平均粒径を有する任意の物体が、（例えば、第１の区画から第２の区画へと）ふるいを介して通過することを防止する。

いくつかの実施形態では、第１のガス透過性表面は、約１０平方センチメートル（ｃｍ^２）、約２０ｃｍ^２、約３０ｃｍ^２、約４０ｃｍ^２、約５０ｃｍ^２、約６０ｃｍ^２、約７０ｃｍ^２、約８０ｃｍ^２、約９０ｃｍ^２、約１００ｃｍ^２、約１２５ｃｍ^２、約１５０ｃｍ^２、約１７５ｃｍ^２、約２００ｃｍ^２、約２２５ｃｍ^２、約２５０ｃｍ^２、約２７５ｃｍ^２、約３００ｃｍ^２、約３２５ｃｍ^２、約３５０ｃｍ^２、約３７５ｃｍ^２、約４００ｃｍ^２、約４２５ｃｍ^２、約４５０ｃｍ^２、約４７５ｃｍ^２、約５００ｃｍ^２の断面積を有する。

いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面は、少なくとも約１０平方センチメートル（ｃｍ^２）、少なくとも約２０ｃｍ^２、少なくとも約３０ｃｍ^２、少なくとも約４０ｃｍ^２、少なくとも約５０ｃｍ^２、少なくとも約６０ｃｍ^２、少なくとも約７０ｃｍ^２、少なくとも約８０ｃｍ^２、少なくとも約９０ｃｍ^２、少なくとも約１００ｃｍ^２、少なくとも約１２５ｃｍ^２、少なくとも約１５０ｃｍ^２、少なくとも約１７５ｃｍ^２、少なくとも約２００ｃｍ^２、少なくとも約２２５ｃｍ^２、少なくとも約２５０ｃｍ^２、少なくとも約２７５ｃｍ^２、少なくとも約３００ｃｍ^２、少なくとも約３２５ｃｍ^２、少なくとも約３５０ｃｍ^２、少なくとも約３７５ｃｍ^２、少なくとも約４００ｃｍ^２、少なくとも約４２５ｃｍ^２、少なくとも約４５０ｃｍ^２、少なくとも約４７５ｃｍ^２、少なくとも約５００ｃｍ^２、少なくとも約５５０ｃｍ^２、少なくとも約６００ｃｍ^２、少なくとも約６５０ｃｍ^２、少なくとも約７００ｃｍ^２、少なくとも約７５０ｃｍ^２、少なくとも約８００ｃｍ^２、少なくとも約８５０ｃｍ^２、少なくとも約９００ｃｍ^２、少なくとも約９５０ｃｍ^２、少なくとも約１０００ｃｍ^２、少なくとも約１５００ｃｍ^２、少なくとも約２０００ｃｍ^２、少なくとも約２５００ｃｍ^２、少なくとも約３０００ｃｍ^２、少なくとも約４０００ｃｍ^２、少なくとも約５０００ｃｍ^２、少なくとも約６０００ｃｍ^２、少なくとも約７０００ｃｍ^２、少なくとも約８０００ｃｍ^２、少なくとも約９０００ｃｍ^２、または少なくとも約１００００ｃｍ^２の断面積を有する。

いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面の断面積の、第１のガス透過性表面の断面積に対する比率は、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０であるか、または約５０より大きい。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第１の区画を備えており、第１の区画は、約２５ミリリットル（ｍＬ）、約５０ｍＬ、約７５ｍＬ、約１００ｍＬ、約１２５ｍＬ、約１５０ｍＬ、約１７５ｍＬ、約２００ｍＬ、約２２５ｍＬ、約２５０ｍＬ、約３００ｍＬ、約３５０ｍＬ、約４００ｍＬ、約４５０ｍＬ、約５００ｍＬ、または約５００ｍＬより大きい体積を有する。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画を含み、第２の区画は、少なくとも約２５ミリリットル（ｍＬ）、少なくとも約５０ｍＬ、少なくとも約７５ｍＬ、少なくとも約１００ｍＬ、少なくとも約１２５ｍＬ、少なくとも約１５０ｍＬ、少なくとも約１７５ｍＬ、少なくとも約２００ｍＬ、少なくとも約２２５ｍＬ、少なくとも約２５０ｍＬ、少なくとも約３００ｍＬ、少なくとも約３５０ｍＬ、少なくとも約４００ｍＬ、少なくとも約４５０ｍＬ、少なくとも約５００ｍＬ、少なくとも約６００ｍＬ、少なくとも約７００ｍＬ、少なくとも約８００ｍＬ、少なくとも約９００ｍＬ、少なくとも約１０００ｍＬ、少なくとも約１２５０ｍＬ、少なくとも約１５００ｍＬ、少なくとも約１７５０ｍＬ、少なくとも約２０００ｍＬ、少なくとも約２２５０ｍＬ、少なくとも約２５００ｍＬ、少なくとも約３０００ｍＬ、少なくとも約３５００ｍＬ、少なくとも約４０００ｍＬ、少なくとも約４５００ｍＬ、少なくとも約５０００ｍＬ、少なくとも約６０００ｍＬ、少なくとも約７０００ｍＬ、少なくとも約８０００ｍＬ、少なくとも約９０００ｍＬ、または少なくとも約１００００ｍＬの体積を有する。

いくつかの実施形態では、第２の区画を備える第２の容器の体積は、（例えば、細胞を培養するために利用可能なガス透過性表面の領域を調節するために）拡張可能である。第２の容器の体積を、例えば、クランプなどの１つ以上の制限手段、または本明細書に開示されるその他の制限手段（例えば、トレイ摺動蓋、または調整可能なスペーサー）を使用して、容器の最大体積に対して制限することができる。いくつかの実施形態では、第２の容器の体積を、第２の容器において（例えば、最適な細胞成長のために）所望の細胞密度が得られるように制限してもよい。第２の容器の所望の体積は、例えば、第１の拡張の後であるが、第２の容器に移す前に、第１の容器における細胞の数えあげに基づき、決定されてもよい。別の例では、第２の容器の体積は、第２の拡張中であるが、第２の容器から細胞を採取する前に、第２の容器における細胞の数えあげに基づき、第２の容器における細胞の第２の拡張中に所望の体積まで拡張することができる。いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面の第１の利用可能な表面積の、第２の区画の制限された体積に対する第１の比率は、第２のガス透過性表面の第２の利用可能な表面積の、拡張された体積または第２の区画に対する第２の比率と正確に同一である。いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面の第１の利用可能な表面積の、第２の区画の制限された体積に対する第１の比率は、第２のガス透過性表面の第２の利用可能な表面積の、第２の区画の拡張された体積に対する第２の比率と実質的に同一である。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、第２の容器の体積を制限するための手段を備える。制限手段は、１つ以上のクランプを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のクランプは、第２の区画の内部体積を制限された体積から拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、第２の区画の内部体積における漸増が、第２のガス透過性表面の領域における第１の利用可能な表面積から第２の利用可能な表面積までの漸増に対応する。いくつかの実施形態では、制限手段は、制限された体積の位置から、拡張された全体積の位置へと移行可能な障壁を含む。いくつかの実施形態では、障壁は、（例えば、図１２２に関連して記載されるように）トレイ摺動蓋を含む。いくつかの実施形態では、第２の細胞培養デバイスは、可撓性側壁と、可撓性側壁を支持するように構成された基部と、を備え、障壁は、摺動する構成で基部に連結される。いくつかの実施形態では、トレイ摺動蓋は、第２の区画の内部体積を制限された体積から拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、第２の区画の内部体積における漸増が、第２のガス透過性表面の領域における第１の利用可能な表面積から第２の利用可能な表面積までの漸増に対応する。いくつかの実施形態では、障壁は、１つ以上の調整可能なスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、障壁は、第２の区画の内部体積を制限された体積から拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、第２の区画の内部体積における漸増が、第２のガス透過性表面の領域における第１の利用可能な表面積から第２の利用可能な表面積までの漸増に対応する。

いくつかの実施形態では、第２の区画の体積の、第１の区画の体積に対する比率は、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０であるか、または約５０より大きい。他の実施形態では、第２の区画の制限された体積の、第１の区画の体積に対する比率は、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約６、約７、約８ 約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０であるか、または約５０より大きい。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、（例えば、腫瘍断片もしくは組織消化物を組織培養デバイス内に堆積させるための）１つ以上の入口ポート、または（例えば、廃棄培地を除去するため、もしくは組織培養デバイスから細胞を採取するための）１つ以上の出口ポートを備えていてもよい。一般に、入口または出口は、組織培養デバイスの第１の容器または第２の容器の表面に沿って配置されてもよく、それぞれ、第１の区画または第２の区画と流体連通していてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第１の区画または第２の区画と流体連通した培地入口を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第１の区画または第２の区画と流体連通した廃棄出口を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第１の区画または第２の区画と流体連通した細胞採取出口を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、入口または出口ポートを有するネック部分を備えていてもよい。ネック部分は、第１のガス透過性表面の表面に沿って配置されていてもよい。

図１３０Ａ及び１３０Ｂは、本開示の追加の実施形態による細胞培養デバイス３００を示す概略図である。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００の物理的特徴、操作的特徴、及び／または構成、及び／または本明細書に記載されるものと同じものを使用する方法は、本明細書に開示されるシステム及び方法のうちの１つ以上に組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、本明細書に記載の任意の他の細胞培養デバイス（例えば、培養フラスコまたはバッグ）に置き換えられてもよく、またはそれらと組み合わせられてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞を培養するか、または細胞を濃縮する１つ以上の方法は、細胞培養デバイス３００、または細胞培養デバイス３００と、本明細書に記載の他の細胞培養デバイスのうちの１つ以上との組み合わせを使用して、これらの細胞培養デバイスのうちの１つ以上に関連するものとして本明細書に記載される１つ以上の方法、操作特徴、及び／または構成に従って行われる。

細胞培養デバイス３００は、いくつかの実施形態では、細胞（例えば、ＴＩＬ）が培養され得る内部空間を提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、代替的または追加的に、細胞培養培地及び／または他の液体培地の一部分を、懸濁液から分離することを可能にすることによって、細胞懸濁液を所定の体積まで濃縮するために使用されてもよい。特定の実施形態によれば、細胞培養デバイス３００は、ＴＩＬ製造のために本明細書で記載されるシステム及びプロセス（例えば、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセス）に使用されるように特定的に構成され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、本明細書に記載のプロセスのいずれかに含まれる他の細胞培養バッグまたはフラスコ（例えば、Ｇ－ＲＥＸフラスコ）に加えて、またはその代わりに使用されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、細胞（例えば、ＴＩＬ）の集団を拡張するために、組織培養デバイス１００の代わりにシステム１１３０に使用されてもよい。他の実施形態では、細胞培養デバイス３００は、組織培養デバイス１００に加えて使用されてもよい。例えば、いくつかのそのような実施形態では、細胞培養デバイス３００は、（例えば、組織培養デバイス１００からの）拡張された細胞の集団を受け入れ、さらなる処理（例えば、ＬＯＶＯ処理）の前に、細胞を濃縮するために使用されるように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、前述の「ＬＯＶＯ前バッグ」として使用されてもよい。細胞培養デバイス３００は、特定の実施形態では、自動化されたＴＩＬ製造システムまたはプロセスにも組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、例えば、細胞培養デバイス３００は、組織培養デバイス２０８／２０９の第２の区画２０７に使用されてもよい（例えば、図１１９に示される）。

いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、１つ以上の周囲の壁３０４によって画定される内部空間３０２を含む。壁３０４は、少なくとも第１の壁３０４ａと、第２の壁３０４ｂとを備えていてもよく、第１の壁３０４ａと第２の壁３０４ｂとの間に内部空間３０２が画定される。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、剛性フラスコとして構成される。いくつかのそのような実施形態では、壁３０４は、剛性材料、例えば、ガラスまたは剛性プラスチック（例えば、剛性ポリスチレンまたは剛性ポリカーボネート）から形成される。他の実施形態では、細胞培養デバイス３００は、可撓性である壁３０４を有するバッグとして構成される。壁３０４は、例えば、いくつかの実施形態によれは、１つ以上の液体不透過性プラスチックフィルムまたはシートから形成されてもよい。いくつかの実施形態では、壁３０４のすべて、または少なくともいくつかは、内部空間３０２と細胞培養デバイス３００の周囲の環境との間のガス交換を可能にするように構成される、液体不透過性であるがガス透過性の材料から形成され得る。

壁３０４を形成するために使用されるガス透過性材料は、組織培養デバイス１００のために記載されたガス透過性材料のいずれかであり得る。例えば、壁３０４のためのガス透過性材料は、可撓性、気密性を確保する密封性、細胞成長の顕微鏡的検査を可能にする良好な透明度、細胞に有害であり得る可塑剤（例えば、フタル酸ジオクチル及びフタル酸ジイソデシル）が存在しないこと、水蒸気透過、細胞との所望の細胞相互作用のために変更される能力、光学的透明度、物理的強度などのうちの１つ以上を含む特徴に基づいて選択され得る。壁３０４は、例えば、すべてが個別にまたは組み合わせて使用され得るエラストマー、ポリマー、およびシリコーンを含み得る好適な材料を含み得る。

エラストマーは、粘弾性及び非常に弱い分子間力を有するポリマーであり、一般に、他の材料と比較して低いヤング係数および高い破壊ひずみを有する。エラストマーという用語は、ゴムという用語と互換的に使用され得るが、加硫物を指す場合、ゴムが好ましい。エラストマーは、炭素、水素、酸素、及び／またはケイ素のモノマーから構築された非晶質ポリマーである。エラストマーは、硫黄加硫によって硬化させることができる不飽和ゴム、例えば、天然（ＮＲ）及び合成ポリイソプレン（ＩＲ）、ポリブタジエン（ＢＲ）、クロロペンゴム（ＣＲ）、ブチルゴム（ＩＩＲ）、ハロゲン化ブチルゴム（ＣＩＩＲ、ＢＩＩＲ）、スチレン－ブタジエンゴム（ＳＢＲ）、ニトリル（ＮＢＲ）、及び水素化ニトリルゴム（ＨＮＢＲ）を含む。エラストマーは、硫黄加硫によって硬化することができない不飽和ゴム、例えば、エチレンプロピレンゴム（ＥＰＭ）、エチレンプロピレンジエンゴム（ＥＰＤＭ）、エピクロロヒドリンゴム（ＥＣＯ）、ポリアクリルゴム（ＡＣＭ、ＡＢＲ）、シリコーンゴム（ＳＩ、Ｑ、ＶＭＱ）、フルオロシリコーンゴム（ＦＳＲ、ＦＶＭＱ）、フルオロエラストマー（ＦＫＭ、ＦＥＰＭ）、ペルフルオロエラストマー（ＦＦＫＭ）、ポリエーテルブロックアミド（ＰＥＢＡ）、クロロスルホン化ポリエチレン（ＣＳＭ）、例えば、ＧＥＮＩＯＭＥＲ（登録商標）などの熱可塑性シリコーンを含む、熱可塑性ウレタン（ＴＰＵ５）、環状オレフィンコポリマー、ポリオレフィンエラストマー、エラストマー性ＰＥＴ、及びエチレン－酢酸ビニル（ＥＶＡ）を含む。

熱可塑性ポリウレタン（ＴＰＵ）は、当該技術分野で知られている。典型的には、熱可塑性ポリウレタンは、ポリオールをイソシアネートと反応させることによって形成される。ポリウレタンの全体的な特性は、ポリオール及びイソシアネートの種類、ポリウレタン中の結晶性、ポリウレタンの分子量、ならびにポリウレタン骨格の化学構造に依存するであろう。ポリウレタンは、存在する架橋の程度に応じて、熱可塑性であってもよく、または熱硬化性であってもよい。熱可塑性ウレタン（ＴＰＵ）は、一級架橋を有しておらず、一方で、熱硬化性ポリウレタンは、反応剤の官能性に応じて、様々な架橋度を有する。熱可塑性ポリウレタンは、一般に、メチレンジイソシアネート（ＭＤＩ）またはトルエンジイソシアネート（ＴＤＩ）のいずれかに基づいており、ポリオールのポリエステルグレード及びポリエーテルグレードの両方を含む。熱可塑性ポリウレタンは、イソシアネートとポリオールとの間の「ワンショット」反応によって、または「プレポリマー」系によって形成することができ、硬化剤を、部分的に反応させたポリオリソシアネート複合体に添加してポリウレタン反応を完了させる。「プレポリマー」に基づくいくつかの一般的な熱可塑性ポリウレタンエラストマーの例は、Ｂａｙｅｒ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅの商標である「ＴＥＸＩＮ」、Ｌｕｂｒｉｚｏｌの商標である「ＥＳＴＡＮＥ」、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．の商標である「ＰＥＬＬＥＴＨＡＮＥ」、及びＢＡＳＦ，Ｉｎｃ．の商標である「ＥＬＡＳＴＯＬＬＡＮ」である。

シリコーンゴムは、ガス透過性表面にとって特に良好な材料であることが証明されている。十分な酸素と二酸化炭素の交換を保証するために、可能な限り薄いガス交換表面が好ましい。０．１ｍｍ～１ｍｍの厚さを有する表面が、うまくいくことがわかっている。シリコーン表面は、射出成形によって任意の所望の形状で経済的に製造され得る。シリコーンは、多くの厚さ、形状、および特定のガス透過性で市販されている。シリコーンは、細胞培養で通常使用される培地に対して高い引裂抵抗及び良好な化学耐性を有しており、したがって、特に取扱が容易でもある。ガス透過性シリコーン表面を滅菌する能力もまた、特に有利である。特に、形状に実質的な変化がなく、オートクレーブ内で効果的に滅菌することができ、数回再利用することができる。使用されるシリコーンゴムは、可能な限り低い浸出可能プロファイル及び抽出可能プロファイルを有することが好ましい。

熱可塑性樹脂（エラストマー及び非エラストマー）の他の構成、ならびにフルオロポリマーの構成を使用して、低い総酸化可能炭素（ＴＯＣ）流体接触層を含有しつつ、複合材のガス透過性を制御することもできることにも留意されたい。ガス透過性の制御は、高ガス透過性または低ガス透過性のいずれかの複合材を作製するためのものであってもよい。熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）の例としては、スチレンブロックコポリマー（ＴＰＥ－ｓ）、オレフィン（ＴＰＥ－ｏ）、アロイ（ＴＰＥ－ｖまたはＴＰＶ）、ポリウレタン（ＴＰＵ）、コポリエステル、及びポリアミドが挙げられる。非エラストマー熱可塑性樹脂の例としては、アクリル、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、ナイロン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリベンズイミダゾール（ＰＢＩ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリフェニレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリフェニレンスルフィド（ＰＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、及びポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、エチレンビニルアルコール（ＥＶＯＨ）、ならびにそのモノマーアーキテクチャが結晶性を減少させ、可撓性を増加させるために修正された任意の伝統的な剛性ポリマーが挙げられる。

微多孔性疎水性フルオロポリマー、例えば、３Ｍ（商標）Ｄｙｎｅｏｎ（商標）ＴＦＭ（商標）改質ＰＴＦＥ、ＨＴＥ、またはＴＨＶも、ガス交換膜の材料として有利であることがわかっている。フルオロポリマーの疎水性は、ガス交換膜が水性媒体に対して不透過性であることを確実にする。所与のガス透過性の場合、ガス交換膜の必要な幾何形状は、細胞呼吸の結果として生じるガス要件、及び細胞呼吸に関与するガスの分圧、特に外部からの細胞呼吸に作用する酸素分圧に依存する。ガス透過性壁３０４は、任意の厚さのものであってもよく、いくつかの実施形態では、例えば、約２５～２５０ミクロンであってもよい。

ここで図１３０Ｂを参照すると、いくつかの実施形態では、内部空間３０２は、細胞培養デバイス３００内に配置されたダイアフラム３１６によって分離される第１のチャンバ３１０及び第２のチャンバ３１２を備える。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、内部空間３０２の１つ以上の縁部に固定される薄いシートの形態である。さらに説明されるように、いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、選択的障壁、例えば、多孔性膜を少なくとも部分的に備える。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、可撓性であってもよい。他の実施形態では、ダイアフラム３１６は、剛性であってもよい。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、第１のチャンバ３１０と第２のチャンバ３１２との間に配置される。ダイアフラム３１６は、第１の壁３０４ａと第２の壁３０４ｂとの間に位置決めされてもよい。いくつかのそのような実施形態では、第１のチャンバ３１０は、ダイアフラム３１６と第１の壁３０４ａとの間に配置され、第２のチャンバ３１２は、ダイアフラム３１６と第２の壁３０４ｂとの間に配置される。いくつかの実施形態では、第１のチャンバ３１０は、第２のチャンバ３１２の最大充填体積と同じである最大充填体積（本明細書では「公称容量」とも称され得る）を有していてもよい。他の実施形態では、第１のチャンバ３１０は、第２のチャンバ３１２の最大充填体積とは異なる最大充填体積を有していてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、第１のチャンバ３１０は、第２のチャンバ３１２の最大充填体積より大きいか、またはそれより小さい最大充填体積を有していてもよい。本明細書でさらに説明されるように、いくつかの実施形態では、第１のチャンバ３１０は、細胞を含有及び／または培養するように構成されてもよく、一方で、第２のチャンバ３１２は、第１のチャンバ３１０からの透過物の流れを受け入れるように構成されてもよい。

いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６の第１の端部または縁部は、内部空間３０２の遠位端３０６に固定される。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、内部空間３０２の遠位端３０６から近位に延在する。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、内部空間３０２の遠位端３０６から、遠位端３０６の反対側に位置する内部空間３０２の近位端３０８まで、またはそれに向かって延在する。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、遠位端３０６から近位端３０８まで、またはそれに向かって、距離Ｈ１を延在する。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、近位端３０８までのすべての経路を延在していない。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、内部空間３０２の遠位部分にのみ位置していてもよい。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、例えば、ダイアフラム３１６の近位縁部が近位端３０８から空間的に離れているように、遠位端３０６と近位端３０８との間の場所で終端する近位縁部を有していてもよい。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６の近位縁部は、第２の壁３０４ｂに取り付けられていてもよく、または接続していてもよい。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６の近位縁部は、第１の壁３０４ａに取り付けられていてもよく、または接続していてもよい。さらなる実施形態では、ダイアフラム３１６は、幅Ｗを有していてもよい（図１３０Ａ）。いくつかの実施形態では、幅Ｗは、内部空間３０２の最大幅である。

いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、２つ以上の別個のセクションを備えていてもよい。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、少なくとも第１のセクション３１８と、第２のセクション３２０とを備える。いくつかの実施形態では、第１のセクション３１８の少なくとも一部分は、内部空間の遠位端３０６と第２のセクション３２０との間のダイアフラム３１６上に位置する。いくつかの実施形態では、第１のセクション３１８は、遠位端３０６から境界３２２まで延在し、第２のセクション３２０は、境界３２２から近位端３０８に向かって延在する。いくつかの実施形態では、境界３２２は、第２のセクション３２０の最も遠位の縁部を表していてもよい。いくつかの実施形態では、境界３２２は、遠位端３０６から距離Ｈ２に位置していてもよく、距離Ｈ２は、距離Ｈ１未満である。第１のセクション３１８は、境界３２２で第２のセクション３２０に密封可能に接続されてもよい。

いくつかの実施形態では、第１のセクション３１８は、第２のセクション３２０とは異なる１つ以上の物理的特徴、材料的特徴、及び／または化学的特徴を有する。いくつかの実施形態では、第１のセクション３１８は、液体（例えば、細胞培養培地）及び液体中に懸濁した任意の細胞が第１のセクション３１８を介して通過することができないように、液体不透過性である。第１のセクション３１８は、例えば、液体不透過性プラスチックフィルムまたはシートから作製されてもよいが、他の実施形態では、他の液体不透過性材料も第１のセクション３１８に使用されてもよい。いくつかの実施形態では、第１のセクション３１８は、１つ以上の外壁３０４と同じ材料から作製されてもよい。いくつかの実施形態では、第２のセクション３２０は、選択的障壁であるか、または選択的障壁を備える。いくつかの実施形態では、第２のセクション３２０は、液体が第２のセクション３２０を介して通過することができるように、液体透過性である。したがって、いくつかのそのような実施形態では、液体（例えば、細胞培養培地）は、ダイアフラム３１６の第１のセクション３１８を介して第１のチャンバ３１０から通過することを防止されるが、ダイアフラム３１６の第２のセクション３２０を介して第１のチャンバ３１０から第２のチャンバ３１２まで通過することができる。

いくつかの実施形態では、第２のセクション３２０は、液体（例えば、細胞培養培地）の通過を可能にしつつ、細胞が第２のセクション３２０を介して通過するのを防止するように選択された孔径を有するふるいを備える。いくつかの実施形態では、第２のセクション３２０は、例えば、第１のチャンバ３１０において培養されるか、またはその中に含有される細胞のサイズよりも小さな孔径を有する精密濾過膜を備える。第２のセクション３２０の孔径は、例えば、５μｍ未満、４μｍ未満、３μｍ未満、２μｍ未満、または１μｍ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、孔径は、約１μｍ～約２μｍである。精密濾過膜は、１つ以上のポリマー、例えば、酢酸セルロース（ＣＡ）、ポリスルホン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエーテルスルホン、またはポリアミドから作製される有機膜であり得る。

いくつかの実施形態では、第２のセクション３２０は、境界３２２から内部空間３０２の近位端３０８まで延在する。他の実施形態では、例えば、図１３１Ａ及び１３１Ｂの変形例に示されるように、第２のセクション３２０は、必ずしも近位端３０８まで延在しているわけではない。むしろ、いくつかの実施形態では、第２のセクション３２０は、境界３２２から、境界３２２と近位端３０８との間のダイアフラム３１６上に位置する第２の境界３２２ｂまで延在していてもよい。第２の境界３２２ｂは、遠位端３０６から距離Ｈ３に位置決めされていてもよく、距離Ｈ３は、距離Ｈ２より大きいが、距離Ｈ１より小さい。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、近位端３０８と第２のセクション３２０との間に位置決めされた第３のセクション３１８ｂを備える。第３のセクション３１８ｂは、例えば、第１のセクション３１８と同じ材料（例えば、液体不透過性材料）から作製されてもよく、第２の境界３２２ｂで第２のセクション３２０に密封可能に接続されてもよい。他の実施形態では、図１３１Ｃ及び１３１Ｄに示されるように、第２の境界３２２ｂと近位端３０８との間に空間が存在するように、第３のセクション３１８ｂが省略されてもよい。いくつかのそのような実施形態では、第２の境界３２２ｂは、ダイアフラム３１６の最も近位の縁部である。したがって、いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６が延在する距離Ｈ１は、遠位端３０６と近位端３０８との間の距離未満であってもよい。いくつかの実施形態では、距離Ｈ１は、距離Ｈ３に等しい。いくつかの実施形態では、距離Ｈ１は、図１３１Ｅ及び１３１Ｆに示されるように、遠位端３０６と近位端３０８との間の距離の半分未満である。例えば、いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、内部空間３０２の遠位部分にのみ位置していてもよい。

いくつかの実施形態では、図１３０Ａ及び１３１Ａに示されるように、第２のセクション３２０は、ダイアフラム３１６の全幅Ｗと同じである幅を有していてもよく、内部空間３０２の最大幅にわたっていてもよい。他の実施形態では、例えば、図１３２Ａ～１３２Ｃ及び１３３Ａ～１３３Ｃに図示されるように、第１のセクション３１８は、最大幅Ｗを有してもよく、一方で、第２のセクション３２０は、幅Ｗ未満である最大幅を有してもよい。図１３３Ａ～１３３Ｃにさらに示されるように、第２のセクション３２０は、いくつかの実施形態では、２つ以上の別個のセクション３２０ａ、３２０ｂ、３２０ｃに分割されてもよく、それらが各々、境界３２２から近位に延在する。セクション３２０ａ、３２０ｂ、３２０ｃはそれぞれ、同じ材料（例えば、液体透過性膜）から作製されてもよい。いくつかの実施形態では、セクション３２０ａ、３２０ｂ、３２０ｃは、同じまたは異なるサイズ／形状を有し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の別個のセクション３２０ａ、３２０ｂ、３２０ｃは、液体不透過性材料、例えば、第１のセクション３１８に使用される同じ材料によって分離されてもよい。

ここで再び図１３０Ｂを参照すると、ダイアフラム３１６の第１のセクション３１８は、第１のチャンバ３１０の遠位部分でウェル３１４（例えば、その一例が、一点鎖線によって指定される）を部分的に画定してもよい。ウェル３１４は、遠位端３０６及び第１の壁３０４ａの一部分によってさらに境界が決められてもよい。いくつかの実施形態では、ウェル３１４は、遠位端３０６から距離Ｈ２まで近位に延在する。いくつかの実施形態では、ウェル３１４は、さらに幅Ｗにわたる。いくつかの実施形態では、ウェル３１４は、特に、最大で細胞懸濁液の所定の体積を含有するようにサイズ決定され、構成される。ウェル３１４の体積は、部分的に、ダイアフラム３１６の第１のセクション３１８の寸法に基づいて設定され得る。いくつかの実施形態では、ウェル３１４は、オーバーフロー充填体積を特徴とする。オーバーフロー充填体積は、特定の構成で選択された材料（例えば、細胞培養培地または他の液体）がウェル３１４内に保持されない、より上の体積であり得る。例えば、ウェル３１４が、第２の部分３２０を介して通過可能な細胞培養培地を保持するように構成される場合、オーバーフロー充填体積は、例えば、境界３２２（以下でさらに詳細に説明される）で、流出路によって制限され得る。いくつかの実施形態では、ウェル３１４のオーバーフロー充填体積は、例えば、約５００ｍＬ～約５，０００ｍＬであってもよいが、他の実施形態では、より小さい体積、またはより大きい体積が選択されてもよい。いくつかの実施形態では、ウェル３１４は、約１，０００ｍＬ～約３，０００ｍＬ、例えば約２，５００ｍＬのオーバーフロー充填体積を有し得る。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、第１のチャンバ３１０の最大充填体積の、ウェル３１４のオーバーフロー充填体積に対する所定の比率を有する。いくつかの実施形態では、第１のチャンバ３１０の最大充填体積の、ウェル３１４のオーバーフロー充填体積に対する比率は、例えば、約１．５～約１５であってもよい。例えば、第１のチャンバ３１０の最大充填体積の、ウェル３１４のオーバーフロー充填体積に対する比率は、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、約１１、約１１．５、約１２、約１２．５、約１３、約１３．５、約１４、約１４．５、約１５、またはその間の任意の値であり得る。

いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、第１のチャンバ３１０と直接的に流体連通している入口ポート３２４と第１の出口ポート３２６とをさらに備える。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、第２のチャンバ３１２と直接的に流体連通している第２の出口ポート３２８をさらに備える。いくつかの実施形態では、入口ポート３２４は、近位端３０８に、またはそれに近接して位置決めされ、一方で、第１及び第２の出口ポート３２６、３２８は、遠位端３０６に、またはそれに近接して位置決めされる。いくつかの実施形態では、第１の出口ポート３２６は、ウェル３１４に接続する。いくつかの実施形態では、入口ポート３２４ならびに第１及び第２の出口ポート３２６、３２８はそれぞれ、液体または他の材料（例えば細胞）がそれを介して通過することを可能にする開放構成と、液体または他の材料の通過を防止する閉鎖構成と、を有していてもよい。入口ポート３２４ならびに第１及び第２の出口ポート３２６、３２８の各々は、その開放構成及び閉鎖構成から、及びその逆へと移行してもよく、入口ポート３２４ならびに第１及び第２の出口ポート３２６、３２８の各々は、独立して開放または閉鎖され得る。例えば、いくつかの実施形態では、入口ポート３２４ならびに第１及び第２の出口ポート３２６、３２８は各々、閉鎖機構、例えば、バルブ、活栓、チューブクランプ、キャップ、ストッパーなどを有する導路を備える。閉鎖機構は、手動で、またはいくつかの実施形態では、自動的に作動され得る。さらなる実施形態では、入口ポート３２４ならびに第１及び第２の出口ポート３２６、３２８の各々は、チューブまたは他の流体移送ラインに連結するように構成された継手（図示せず）を備えていてもよい。例えば、入口ポート３２４ならびに第１及び第２の出口ポート３２６、３２８の各々は、追加のチューブに取り付けるためのクイック接続継手、ねじ継手、ホースバルブなどを有し得る。いくつかの実施形態では、チューブまたは他の流体移送ラインは、入口ポート３２４及び／または第１及び第２の出口ポート３２６、３２８に滅菌溶接されてもよい。いくつかの実施形態では、内部空間３０２は、第１及び第２の出口ポート３２６、３２８に向かって、液体を向かわせるか、または漏斗状に流すのに役立つように成形され得る。いくつかの実施形態では、内部空間３０２の遠位部分は、例えば、図１３４または図１３５に図示されるように、遠位端３０６及び／または第１及び第２の出口ポート３２６、３２８に向かってテーパー状になっていてもよく、または湾曲していてもよい。

図１３６Ａ～１３６Ｄは、特定の実施形態による、細胞懸濁液を濃縮するための細胞培養デバイス３００の使用を図示する。いくつかのそのような実施形態では、細胞培養デバイス３００は、遠位端３０６が近位端３０８の下に垂直に位置決めされる、第１のほぼ垂直の方向に位置決めされる。図１３６Ａを参照すると、入口ポート３２４は、開放構成に設定され、第１の出口ポート３２６は、閉鎖構成に設定され、液体４０４（例えば、細胞培養培地、生理食塩水、または他の液体担体）に懸濁された細胞４０２（黒色の丸として表される）を含む細胞懸濁液４００は、入口ポート３２４を介して細胞培養デバイス３００の第１のチャンバ３１０に導入される。例えば、いくつかの実施形態では、細胞４０２は、培養されたＴＩＬであってもよく、液体４０４は、細胞培養培地である。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液４００は、例えば、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）、及び／または他の構成要素をさらに含んでもよい。細胞懸濁液４００は、例えば、別個の細胞培養デバイス（図示せず）に接続されたチューブを介して、入口ポート３２４に運ばれてもよい。いくつかの実施形態では、セル懸濁液４００は、入口ポート３２４に重力によって供給されてもよく、または入口ポート３２４に能動的に圧送されてもよい。

細胞懸濁液４００は、いくつかの実施形態では、最大で第１のチャンバ３１０の最大充填体積まで、第１のチャンバ３１０を充填してもよい。いくつかの実施形態では、セル懸濁液４００の液体高さは、初期に、細胞懸濁液４００の一部分がダイアフラム３１６の第２のセクション３２０に接触するように、ダイアフラム３１６の境界３２２の上にある（距離Ｈ２を超える）だろう。議論されるように、いくつかの実施形態では、第２のセクション３２０は、図１３６Ｂに図示されるように、液体４０４及び任意の溶解した化学物質／イオンが第１のチャンバ３１０から第２のチャンバ３１２へと通過すること（浸透流）を可能にする液体透過性ふるい（例えば、精密濾過膜）を備える。一方、第２のセクション３２０は、細胞４０２が第１のチャンバ３１０内に保持されるように、細胞４０２がそれを介して通過することを可能にしない孔径を有し得る。そのような構成は、第１のチャンバ３１０中の細胞４０２の数が、ほぼ一定のままである一方で、第１のチャンバ３１０中の液体４０４の体積が、液体４０４が第２のセクション３２０を介して通過するにつれて減少するため、細胞懸濁液４００中の細胞４０２の濃度を増加させることを可能にする。第１のチャンバ３１０中の液体４０４は、第１のチャンバ３１０内の液体レベルが境界３２２に達するか、または第２のチャンバ３１２中に蓄積する液体４０４のレベルに等しくなるまで、ダイアフラム３１６の第２のセクション３２０を介して通過し続ける。いくつかの実施形態では、液体４０４が境界３２２を上回って第２のチャンバ３１２中に蓄積することを防止するために、第２の出口３２８を開放して、第２のチャンバ３１２が排出されることを可能にしてもよい。例えば、第２のチャンバ３１２中の液体４０４は、第２の出口３２８を介して第２のチャンバ３１２を出て、さらなる分析のために収集容器（図示せず）にチューブを介して運ばれてもよく、及び／または廃棄物として処分されてもよい。

図１３６Ｃに示されるように、第１のチャンバ３１０の細胞懸濁液４００の体積は、細胞懸濁液の液体レベルが境界３２２（距離Ｈ２）に達するまで、減少した。境界３２２の下には、特定の実施形態によって液体不透過性であるダイアフラム３１６の第１のセクション３１８があり、そのため、細胞懸濁液４００’（残存物とも称される）の現時点で低下した体積は、第１のチャンバ３１０の遠位部分でウェル３１４内に保持されてもよい。ウェル３１４の体積に応じて、細胞懸濁液４００’の残存する体積は、例えば、第１のチャンバ３１０に導入された細胞懸濁液４００の元の体積の約２０％～約５０％であり得る。図１３６Ｄに示されるように、次いで、ウェル３１４中の濃縮された細胞懸濁液４００’を、第１の出口ポート３２６を開放することによって、第１のチャンバ３１０から出ることを可能にしてもよい。例えば、細胞懸濁液４００’は、第１の出口３２６を介して出て、チューブを介して、収集容器に、またはさらなる処理ステップ（図示せず）、例えば、ＬＯＶＯ細胞処理へと運ばれてもよい。

図１３７Ａは、細胞培養デバイス３００を備えていてもよい、特定の実施形態による細胞処理システム５００を図示する。細胞培養デバイス３００は、いくつかの実施形態では、別個の構成要素中で培養される細胞の体積を低下させるように構成され得る。いくつかの実施形態では、細胞処理システム５００は、細胞のインビトロ培養及び／または拡張のために構成された組織培養デバイス５０２を備えていてもよい。組織培養デバイス５０２は、例えば、組織培養バッグ、組織培養フラスコ、組織培養プレート、または細胞を成長させるのに好適な他の容器を含んでもよく、インキュベーター（図示せず）内に収容されてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス５０２は、例えば、図１１３～１１８に示されるように、組織培養デバイス１００として構成されてもよく、または組織培養デバイス１００を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス５０２は、例えば、チューブ５０４を介して、細胞培養デバイス３００の入口ポート３２４に流体的に接続されている（例えば、液体連通した）出口５０２ａを有してもよい。いくつかのそのような実施形態では、組織培養デバイス５０２中で培養された細胞を、組織培養デバイス５０２から出口５０２ａ及びチューブ５０４を介して細胞培養デバイス３００の入口ポート３２４及び第１のチャンバ３１０へと運んでもよい。細胞は、チューブ５０４を介して重力によって供給され得るか、または例えば、蠕動ポンプまたは他の圧送デバイス（図示せず）によって能動的に圧送され得る液体懸濁液中にあってもよい。

いくつかの実施形態では、細胞処理システム５００は、各々が細胞培養デバイス３００と液体連通している残存物収集デバイス５０８及び透過物収集デバイス５１２をさらに備えていてもよい。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイス５０８は、さらなる処理のために細胞培養デバイス３００の第１のチャンバ３１０から濃縮された（体積が低下した）細胞懸濁液を受け入れるように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイス５０８は、例えば、ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の構成要素を備えていてもよい（例えば、細胞洗浄のためなど）。いくつかの実施形態では、透過物収集デバイス５１２は、細胞懸濁液から除去された細胞培養デバイス３００の第２のチャンバ３１２からの過剰な液体（例えば、細胞培養培地）を受け入れるように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイス５０８は、チューブ５０６を介して第１の出口ポート３２６に流体的に接続していてもよく、透過物収集デバイス５１２は、チューブ５１０を介して第２の出口ポート３２８に流体的に接続していてもよい。いくつかの実施形態では、細胞及び流体は、細胞培養デバイス３００から残存物収集デバイス５０８及び／または透過物収集デバイス５１２へと重力によって供給されてもよい。他の実施形態では、１つ以上のポンプ（図示せず）を使用して、材料を残存物収集デバイス５０８及び／または透過物収集デバイス５１２へと能動的に運んでもよい。

さらなる実施形態では、細胞処理システム５００は、特に第１の垂直方向で、細胞培養デバイス３００を保持するための１つ以上のデバイスをさらに備えていてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、任意選択で、細胞培養デバイス３００を垂直方向に吊すことを可能にするように構成されるタブ３３０を備えていてもよい。例えば、タブ３３０は、細胞培養デバイス３００をフックまたは他のデバイスから垂直方向に掛けるか、または吊すことを可能にする開口部３３２（図１３０Ａに示される）を含んでいてもよい。例えば、図１３７Ａに示されるように、細胞培養デバイス３００は、垂直要素５１６（例えば、壁、ＩＶポールなど）に取り付けられるか、またはそこから延在するフック５１４から吊されてもよい。細胞培養デバイス３００はまた、他の適切な手段、例えば、ブラケット、クランプ、フレームなどによって垂直方向に保持され得る。

いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、複数の異なる供給源から細胞及び／または液体（例えば、細胞培養培地）を受け入れるように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、細胞培養デバイス３００は、１つより多い組織培養デバイス５０２に流体的に接続されてもよく、その各々が、細胞及び／または細胞培養培地を細胞培養デバイス３００の内部空間３０２に個別に、同時に、または連続して供給するように構成される。いくつかのそのような実施形態では、細胞培養デバイスの内部空間３０２は、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くの別個の培養バッグ、フラスコ、または他の培養デバイスと流体連通されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、１つより多い入口ポート３２４を含んでいてもよく、各入口ポートは、異なる供給源容器（例えば、組織培養デバイス、細胞培養培地容器など）に流体的に接続されるように構成される。いくつかの実施形態では、複数の入口ポート３２４はそれぞれ、液体または他の材料（例えば細胞）がそれを介して通過することを可能にする開放構成と、液体または他の材料の通過を防止する閉鎖構成と、を有していてもよい。いくつかの実施形態では、各入口ポート３２４は、独立して、開放されてもよく、または閉鎖されてもよい。

いくつかの実施形態では、例えば、細胞培養デバイス３００は、２、３、４、５、またはそれより多くの入口ポートを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、最大５つの入口ポートを含む。図１３７Ｂは、複数の入口ポート３２４ａ、３２４ｂ、３２４ｃ、３２４ｄ、及び３２４ｅを有する細胞培養デバイス３００の一例の図を提供する。いくつかの実施形態では、入口ポート３２４ａ～３２４ｅの各々は、内部空間３０２と直接的に流体連通し、近位端３０８に沿って位置してもよい。いくつかの実施形態では、入口ポート３２４ａ～３２４ｅの各々は、細胞培養デバイス３００の第１のチャンバ３１０と流体連通している。いくつかの実施形態では、入口ポート３２４ａ、３２４ｂ、３２４ｃ、３２４ｄ、及び３２４ｅは、それぞれ、チューブ５０４ａ、５０４ｂ、５０４ｃ、５０４ｄ、５０４ｅを介して、異なる供給源容器（例えば、別個の組織培養デバイス５０２）に接続され得る。チューブ５０４ａ、５０４ｂ、５０４ｃ、５０４ｄ、５０４ｅは、例えば、入口ポート３２４ａ、３２４ｂ、３２４ｃ、３２４ｄ、及び３２４ｅに対して滅菌溶接されてもよく、及び／または機械的継手を介して接続されてもよい。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイス５０２は、前述の組織培養デバイス１００を備える。図１３８は、組織培養デバイス１００に関連して使用される細胞培養デバイス３００の例示的な実施形態を示す。いくつかの実施形態では、前述のように、気体透過性表面１０２上の第２の区画１０６内の細胞の拡張（例えば、急速拡張）に続いて、組織培養デバイス１００を第３の方向１１５（図１１５）に回転させて、培養された細胞が細胞採取出口１１２（出口５０２ａに類似し得る）を介して出ることを可能にし得る。培養された細胞は、例えば、重力または能動的なポンプによって、チューブ５０４を介して細胞採取出口１１２から細胞培養デバイス３００の入口ポート３２４及び第１のチャンバ３１０に運ばれてもよい。次いで、細胞培養デバイス３００を使用して、前述のように細胞懸濁液の体積を低下させることができ、過剰な液体は第２のチャンバ３１２に流れ、第２の出口ポート３２８及びチューブ５１０を課しいて細胞培養デバイス３００を出る。次いで、特定の実施形態によれば、第１のチャンバ３１０中に残存する濃縮細胞懸濁液は、さらなる処理（例えば、ＬＯＶＯ細胞処理）のために、第１の出口ポート３２６及びチューブ５０６を介して細胞培養デバイス３００から移されてもよい。前述のように、いくつかの実施形態では、組織培養デバイス１００は、組織培養デバイス１００から細胞を採取する前に、使用済み培地が、廃棄出口１１１を介して所定の最小レベルまで排出され得るように位置決めされる第２の区画１０６と連通する廃棄出口１１１を備える（例えば、図１１７Ｃ）。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００を利用して、組織培養デバイス１００から採取された細胞懸濁液の体積をさらに低下させることによって、組織培養デバイス１００の廃棄出口１１１は、第２のガス透過性表面１０２からさらに離れて位置決めされ、より多い体積の細胞培養培地が第２の区画１０６に残存することを可能にし得る。次いで、このより多い体積の細胞培養培地を使用して、例えば、細胞収穫出口１１２を介して収穫する前に、培養された細胞を再懸濁させ、細胞培養デバイス３００を介して体積を低下させ得る。

さらなる実施形態では、細胞培養デバイス３００は、細胞集団を培養／拡張するために使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞の培養における使用のために、細胞培養デバイス３００は、図１３９Ａに一般的に示される水平方向に向けられてもよい。この水平方向では、ダイアフラム３１６は、第１のチャンバ３１０の上に垂直に位置決めされ、第２のチャンバ３１２は、ダイアフラム３１６の上に垂直に位置決めされる。第１の壁３０４ａは、ガス透過性材料から形成されてもよく、いくつかのそのような実施形態では、内部細胞培養表面を備えていてもよい。いくつかの実施形態では、第１の壁３０４ａの内部細胞培養表面は、前述の組織培養デバイス１００のガス透過性表面１０２に類似して使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、表面３４０、例えば、プラットフォームまたはトレイの表面上に位置決めされてもよい。いくつかの実施形態では、表面３４０は、ガス透過性表面である。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００及び表面３４０は、インキュベーター（例えば、システム１１３０内のインキュベーター１１６）内に位置しており、細胞培養デバイス３００及びその内容物を所望の温度範囲及びガス濃度（例えば、５％ＣＯ_２中で約３７℃）で維持し得る。

細胞集団４０２は、ある体積の液体４０４（例えば、細胞培養培地）と共に、入口ポート３２４を介して第１のチャンバ３１０内に播種されてもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１０^６～少なくとも１０^８個の細胞が第１のチャンバ３１０内に播種される。いくつかの実施形態では、少なくとも１０^９個の細胞が第１のチャンバ３１０内に播種される。いくつかの例では、細胞４０２は、腫瘍断片及び／または腫瘍消化物に由来するＴＩＬであり得る。さらなる例では、細胞４０２は、ＩＬ－２（例えば、６０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２）をさらに含有し、任意選択でＯＫＴ－３（例えば、３０ｎｇ／ｍＬ～６０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ－３）を含有し、さらに任意選択で抗原提示フィーダー細胞を含有する細胞培養培地３１０中で培養される。抗原提示フィーダー細胞は、いくつかの実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得るか、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み得る。いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、放射線照射されたＰＢＭＣであってもよく、またはそれを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、第１のチャンバ３１０に導入された細胞４０２は、別個の容器（例えば、培養デバイス、フラスコ、またはプレート）内で以前に拡張された細胞集団の一部分であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、細胞集団は、別個のフラスコ内で拡張され、その後、さらなる拡張のために、２つ以上（例えば、３つ、４つ、５つ、または６つ）の細胞培養デバイス３００に分割され得る。

細胞集団４０２は、第１のチャンバ３１０内で拡張することが可能である。いくつかの実施形態では、細胞集団４０２は、例えば、約４日間以上、例えば、約４日間～約１１日間の期間にわたって拡張させることが可能である。いくつかの実施形態では、細胞集団４０２は、例えば、約４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、または１１日間の期間にわたって拡張させることが可能である。必要に応じて、追加の細胞培養培地及び／または追加のＩＬ－２が、例えば、入口ポート３２４を介して、または別個の培地ポートを通って、この拡張プロセス中に添加または交換され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、新鮮細胞培養培地及び／またはＩＬ－２を含有する容器（図示せず）は、入口ポート３２４または別のポートに流体的に接続されてもよい。一方、使用された細胞培養培地は、第１の出口ポート３２６または別個の廃棄ポートを介して第１のチャンバ３１０から除去されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００が水平方向にあるとき、入口ポート３２４は、第１の出口ポート３２６よりも高く垂直に位置決めされてもよい。

第１のチャンバ３１０中で拡張した後（図１３９Ｂ）、細胞培養デバイス３００を使用して、細胞４０２を濃縮し、液体体積を低下させてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、近位端３０８が遠位端３０６より上に垂直に位置決めされるように、水平方向から垂直方向への回転のために構成される（図１３９Ｃに示される）。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、第１の壁３０４ａの内側表面から細胞４０２を解離させ、液体４０４に細胞４０２を懸濁させるために、振動が加えられてもよく、または撹拌されてもよい。細胞懸濁液４００は、次いで、図１３９Ｃ～１３９Ｆに図示される体積低下ステップによって進んでもよい。培養デバイス３００の水平方向から垂直方向への回転は、以下でより詳細に説明されるようなものを含む自動化されたプロセスまたは遠隔プロセスによって達成することができる。

図１３９Ｃに示されるように、いくつかの実施形態では、培養デバイス３００が、ほぼ水平からほぼ垂直へと方向が変えられると、細胞懸濁液４００の液体高さは、初期は、細胞懸濁液４００の一部分がダイアフラム３１６の第２のセクション３２０に接触するように、ダイアフラム３１６の境界３２２より上にある（距離Ｈ２を超える）。議論されるように、いくつかの実施形態では、第２のセクション３２０は、図１３９Ｄに図示されるように、液体４０４及び任意の溶解した化学物質／イオンが第１のチャンバ３１０から第２のチャンバ３１２へと通過すること（浸透流）を可能にする液体透過性ふるい（例えば、精密濾過膜）を備える。一方、第２のセクション３２０は、細胞４０２が第１のチャンバ３１０内に保持されるように、細胞４０２がそれを介して通過することを可能にしない孔径を有し得る。そのような構成は、第１のチャンバ３１０中の細胞４０２の数が、ほぼ一定のままである一方で、第１のチャンバ３１０中の液体４０４の体積が減少するため、細胞懸濁液４００中の細胞４０２の濃度を増加させることを可能にする。第１のチャンバ３１０中の液体４０４は、第１のチャンバ３１０内の液体レベルが境界３２２に達するか、または第２のチャンバ３１２中に蓄積する液体４０４のレベルに等しくなるまで、ダイアフラム３１６の第２のセクション３２０を介して通過し続ける。いくつかの実施形態では、液体４０４が境界３２２を上回って第２のチャンバ３１２中に蓄積することを防止するために、第２の出口３２８を開放して、第２のチャンバ３１２が排出されることを可能にしてもよい。例えば、第２のチャンバ３１２中の液体４０４は、第２の出口３２８を介して第２のチャンバ３１２を出て、さらなる分析のために収集容器（図示せず）にチューブを介して運ばれてもよく、及び／または廃棄物として処分されてもよい。

図１３９Ｅに示されるように、第１のチャンバ３１０の細胞懸濁液４００の体積は、細胞懸濁液の液体レベルが境界３２２（距離Ｈ２）に達するまで、減少した。境界３２２の下には、特定の実施形態によって液体不透過性であるダイアフラム３１６の第１のセクション３１８があり、そのため、細胞懸濁液４００’（残存物とも称される）の現時点で低下した体積は、第１のチャンバ３１０の遠位部分でウェル３１４内に保持されてもよい。ウェル３１４の体積に応じて、細胞懸濁液４００’の残存する体積は、例えば、第１のチャンバ３１０に導入された細胞懸濁液４００の元の体積の約２０％～約５０％であり得る。図１３９Ｆに示されるように、次いで、ウェル３１４中の濃縮された細胞懸濁液４００’を、第１の出口ポート３２６を開放することによって、第１のチャンバ３１０から出ることを可能にしてもよい。例えば、細胞懸濁液４００’は、第１の出口３２６を介して出て、チューブを介して、収集容器に、またはさらなる処理ステップ（図示せず）、例えば、ＬＯＶＯ細胞処理、または細胞洗浄へと運ばれてもよい。

さらなる実施形態では、細胞培養デバイス３００は、例えば、図１１９に示される組織培養デバイス２０８または２０９と一体化していてもよい。いくつかのそのような実施形態では、細胞培養デバイス３００は、第２の容器２０５に利用され得る。一例は、図１４０Ａに示されており、いくつかの実施形態によって２０８’と称される組織培養デバイス２０８の変形例を図示する。組織培養デバイス２０８’は、組織培養デバイス２０８について前述した実施形態のうちのいずれかで使用するように構成され得る。いくつかの実施形態では、第１の容器２０１は、チューブ２１０によって細胞培養デバイス３００と流体連通している。より具体的には、いくつかの実施形態では、チューブ２１０は、第１の区画２０３中で培養された細胞が、入口ポート３２４が開放されると、細胞培養デバイス３００の第１のチャンバ３１０を通過し得るように、第１の容器２０１の第１の区画２０３を細胞培養デバイス３００の入口ポート３２４に接続する。第１のチャンバ３１０は、前述の実施形態において第２の区画２０７について説明された機能を発揮し得る。いくつかの実施形態では、新鮮細胞培養培地はまた、培地入口２１２を介して第１の区画３１０に添加されてもよく、これがまた入口ポート３２４または別個の入口ポート（図示せず）に接続していてもよい。さらなる実施形態では、細胞培養デバイス３００は、第１のチャンバ３１０に含まれる細胞及び／または培地の試料を収集するためのサンプリングチューブ２１１を備えていてもよい。サンプリングチューブ２１１は、いくつかの実施形態では、遠位端３０６に近接して位置決めされてもよく、または他の実施形態では、近位端３０８に近接して位置決めされてもよい。いくつかの実施形態では、サンプリングチューブ２１１（または複数のサンプリングチューブ２１１）は、第１のチャンバ３１０に沿って様々な場所に含まれる細胞及び／または培地をサンプリングするように構成され得る。

図１４０Ａに示されるように、細胞培養デバイス３００は、水平方向に向けられてもよい。この水平方向では、ダイアフラム３１６は、第１のチャンバ３１０の上に垂直に位置決めされ、第２のチャンバ３１２は、ダイアフラム３１６の上に垂直に位置決めされる。第１の壁３０４ａは、ガス透過性ポリマーフィルムまたはシートから形成されてもよく、いくつかのそのような実施形態では、細胞培養表面を提供する内側表面を備える。いくつかの実施形態では、第１の壁３０４ａの内側表面は、前述の組織培養デバイス２０８のガス透過性表面２０６に類似して使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、細胞培養デバイス３００を支持するように構成され、寸法決定されるトレイ３５０上にさらに位置決めされ得る。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、トレイ３５０の形状に一致または適合するように構成される（例えば、細胞培養デバイス内の材料の重量が、可撓性外壁３０４をトレイ３５０内へと膨らませるとき）。いくつかの実施形態では、トレイ３５０は、ガス透過性トレイである。いくつかの実施形態では、組織培養デバイス２０８’（またはその一部分）は、インキュベーター内に入れられるように構成され得る。細胞培養デバイス３００及びトレイ３５０を備える組織培養デバイス２０８’は、細胞培養デバイス３００及びその内容物を所望の温度及び／またはガス飽和範囲（例えば、５％ＣＯ_２中で約３７℃）に維持するためにインキュベーター内に入れられるように構成され得る。

いくつかの実施形態では、トレイ３５０は、可動プラットフォーム（図示せず）、例えば、ロッキングプラットフォームを備えていてもよく、またはそれらと一体化していてもよい。細胞培養デバイス３００は、例えば、固定具、クリップ、ストラップなどの１つ以上の保持デバイスによってトレイ３５０を備えていてもよく、またはトレイ３５０内に保持されてもよい。可動プラットフォームは、例えば、入口または出口ポート３２４または３２６のうちの１つ以上に向かって細胞４０２の移動を容易にするために、トレイ３５０及び細胞培養デバイス３００を傾けるように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、可動プラットフォームは、細胞培養デバイス３００を水平方向（図１４０Ａに示される）から垂直方向（図１４０Ｂに示される）まで（例えば、９０°）、及び／またはその逆に回転させるように構成され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、細胞拡張プロセスが所定の完了点に達したときに垂直方向に回転するように構成される。例えば、細胞４０２は、所定の日数（例えば、約４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、または１１日間）、または所定の（例えば、最小の）数の細胞が得られるまで、水平方向にある第１のチャンバ３１０内で成長し得る。いくつかの実施形態では、このプロセス中、使用済み細胞培養培地の少なくとも一部分は、第１の出口ポート３２６を開放し、細胞培養培地が第１の出口ポート３２６から排出されることを可能にすることによって、細胞培養デバイス３００から除去され得る。細胞培養培地が排出されている間、細胞４０２は、第１の壁３０４ａの内側表面上に残存してもよい。新鮮な置換細胞培養培地は、培地入口２１２を介して導入されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００が水平方向にあるとき、第１の出口ポート３２６は、入口ポート３２４よりも低いレベルに位置決めされてもよい。所定の日数、閾値量の細胞、及び／または他の選択された基準に達すると、細胞培養デバイス３００が回転する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００を垂直方向に回転させることで、細胞培養デバイス３００を使用して、細胞懸濁液の体積を低下させることが可能である。いくつかの実施形態では、細胞数は、サンプリングポート２１１を介して定期的に取得され、所望の量の細胞に到達すると、細胞培養デバイス３００の回転が開始される。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００の回転は、選択された回転速度で行われる。回転速度は、ウェル３１４における細胞の濃度を最大化するように選択され得る。

図１４０Ｂに示されるように、細胞培養デバイス３００が垂直方向に回転すると、近位端３０８は、遠位端３０６の上に垂直に位置決めされ、いくつかの実施形態では、細胞懸濁液４００の液体高さは、初期は、細胞懸濁液４００の一部分がダイアフラム３１６の第２のセクション３２０に接触するように、ダイアフラム３１６の境界３２２より上にある。議論されるように、いくつかの実施形態では、第２のセクション３２０は、液体４０４及び任意の溶解した化学物質／イオンが第１のチャンバ３１０から第２のチャンバ３１２へと通過することを可能にする液体透過性ふるい（例えば、精密濾過膜）を備える。一方、第２のセクション３２０は、細胞４０２が第１のチャンバ３１０内に保持されるように、細胞４０２がそれを介して通過することを可能にしない孔径を有し得る。そのような構成は、第１のチャンバ３１０中の細胞４０２の数が、ほぼ一定のままである一方で、第１のチャンバ３１０中の液体４０４の体積が減少するため、細胞懸濁液４００中の細胞４０２の濃度を増加させることを可能にする。第１のチャンバ３１０中の液体４０４は、第１のチャンバ３１０内の液体レベルが境界３２２に達するか、または第２のチャンバ３１２中に蓄積する液体４０４のレベルに等しくなるまで、ダイアフラム３１６の第２のセクション３２０を介して通過し続ける。いくつかの実施形態では、液体４０４が境界３２２を上回って第２のチャンバ３１２中に蓄積することを防止するために、第２の出口３２８を開放して、第２のチャンバ３１２が排出されることを可能にしてもよい。例えば、第２のチャンバ３１２中の液体４０４は、第２の出口３２８を介して第２のチャンバ３１２を出て、さらなる分析のために収集容器（図示せず）にチューブを介して運ばれてもよく、及び／または廃棄物として処分されてもよい。

図１４０Ｃに示されるように、第１のチャンバ３１０の細胞懸濁液４００の体積は、細胞懸濁液の液体レベルが境界３２２に達するまで、減少した。境界３２２の下には、特定の実施形態によって液体不透過性であるダイアフラム３１６の第１のセクション３１８があり、そのため、細胞懸濁液４００’の現時点で低下した体積は、第１のチャンバ３１０の遠位部分でウェル３１４内に保持されてもよい。ウェル３１４の体積に応じて、細胞懸濁液４００’の残存する体積は、例えば、細胞懸濁液４００の元の体積の約２０％～約５０％であり得る。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液４００’の残存する体積は、細胞懸濁液４００の元の体積の２０％未満、１０％未満、または５％未満であり得る。図１４０Ｄに示されるように、次いで、ウェル３１４中の濃縮された細胞懸濁液４００’を、第１の出口ポート３２６を開放することによって、第１のチャンバ３１０から出ることを可能にしてもよい。例えば、細胞懸濁液４００’は、第１の出口３２６を介して出て、チューブを介して、収集容器に、またはさらなる処理ステップ（図示せず）、例えば、ＬＯＶＯ細胞処理へと運ばれてもよい。

特定の実施形態では、組織培養デバイス２０８’は、第１の容器２０１及び／または細胞培養デバイス３００の内部体積を選択的に調整するように調整可能である体積選択手段を備えていてもよい。体積選択手段は、組織培養デバイス２０８の第１の容器２０１及び／または第２の容器２０５に関して前述した制限手段であり得る（例えば、図１２０～１２３及び図１２６～１２７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、体積選択手段は、容器の内部体積を選択するために、第１の容器２０１及び／または細胞培養デバイス３００に直接的に適用される。このような体積選択手段は、細胞培養デバイス３００が可撓性外壁３０４を有するバッグとして構成されている場合に特に使用されてもよい。例えば、体積選択手段は、材料が、第１の容器２０１及び／または第２の容器３００の制限された内部体積から、固定具を介してカットオフされる第１の容器２０１及び／または第２の容器３００の任意の部分へと流れることができないように、第１の容器２０１及び／または第２の容器３００の可撓性外壁を圧縮するように構成される１つ以上の機械的固定具を備えていてもよい。１つ以上の固定具は、例えば、材料の流れを制限するために第１の容器２０１及び／または第２の容器３００の可撓性外壁を圧縮するのに適したクランプ、クリップ、ストラップ、弾性バンド、タイ、磁気固定具、または他のデバイスを含んでいてもよい。１つ以上の固定具は、手動で、または自動化されたプロセスを介して作動され得る。いくつかの実施形態では、固定具は、第１の容器２０１及び／または細胞培養デバイス３００の体積を選択するために容易に追加され、または取り外すことができる調節可能な固定具である。いくつかの実施形態では、固定具は、例えば、固定具が、第１の容器２０１および／または細胞培養デバイス３００上の異なる場所に摺動して、制限される体積、及び所望な場合に細胞培養デバイス３００が拡張され得る体積を調整し得るように、例えば、第１の容器２０１および／または細胞培養デバイス３００に沿って摺動するように構成される。いくつかの実施形態では、１つ以上の固定具を使用して、細胞を培養するためのガス透過性表面（例えば、第１のガス透過性表面２０４及び／または第１の壁３０４ａの内側表面）の一部分のみが使用のために利用可能であるように、所定の期間、第１の容器２０１および／または細胞培養デバイス３００の体積を制限してもよい。

図１４１は、細胞４０２（例えば、ＴＩＬ）を培養するために利用可能である細胞培養デバイス３００の体積を制限するために、細胞培養デバイス３００の一部分の周りに配置された固定具３６０を有する細胞培養デバイス３００を示す例示的な例示を提供する。いくつかのそのような実施形態では、固定具３６０は、近位端３０８と遠位端３０６との間の場所で、互いに向かって第１の壁３０４ａ及び第２の壁３０４ｂを圧縮するように構成されている。固定具３６０は、例えば、上述のようなクランプ、クリップ、ストラップ、または他の好適なデバイスであり得る。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、可撓性であってもよく、固定具３６０によって、少なくとも部分的に第１の壁３０４ａ及び／または第２の壁３０４ｂの内側表面に対して歪ませられ、圧縮され得る。いくつかの実施形態では、近位端３０８と締結具３６０との間にある第１の壁３０４ａの内側表面の一部分のみが、細胞４０２を培養するために利用可能である。いくつかの実施形態では、続いて、固定具３６０を取り外して、細胞４０２を培養するために、または細胞培養デバイス３００を体積低下のために使用することが望ましい場合に、追加の領域を提供してもよい。

図１４２Ａ～１４２Ｅは、可撓性外壁、例えば、第１及び第２の壁３０４ａ、３０４ｂを有するバッグとして構成される細胞培養デバイス３００のさらなる例示的な実施形態を示す。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、細胞培養デバイス３００の遠位部分のみに位置するダイアフラム３１６を備える。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、遠位端３０６から境界３２２まで延在する液体不透過性の第１のセクション３１８と、境界３２２から第２の境界３２２ｂまで延在する液体透過性の第２のセクションとを備える。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、第２の境界３２２ｂがダイアフラム３１６の近位端であるように、第２の境界３２２ｂで終端する。いくつかのそのような実施形態では、ダイアフラム３１６は、近位端３０８までのすべての経路を延在していない。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、遠位端３０６と近位端３０８との間の距離の半分未満まで延在する。いくつかの実施形態では、例えば、ダイアフラム３１６は、遠位端３０６と近位端３０８との間の距離の１０％～４０％である点まで延在する。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、可撓性である。他の実施形態では、ダイアフラム３１６は、実質的に剛性である。

いくつかの実施形態では、細胞４０２（例えば、ＴＩＬ）を培養するために利用可能である細胞培養デバイス３００の第１の壁３０４ａの内側表面の表面積を制限するために、１つ以上の固定具を細胞培養デバイス３００の一部の周りに配置してもよい。図１４２Ａに示されるように、複数の固定具が、遠位端３０６と近位端３０８との間の細胞培養デバイス３００上の異なる位置に位置決めされる。いくつかの実施形態では、複数の固定具は、少なくとも第１の固定具３６０ａと、第２の固定具３６０ｂと、第３の固定具３６０ｃとを含む。第１の固定具３６０ａ、第２の固定具３６０ｂ、及び第３の固定具３６０ｃのそれぞれは、固定具を通過する材料（例えば、細胞培養培地）の流れを防止するために、第１の壁３０４ａ及び第２の壁３０４ｂを一緒に圧縮するように構成される。いくつかの実施形態では、固定具のすべては、ダイアフラム３１６の近位端（例えば、第２の境界３２２ｂ）から近位方向に空間的に離れている。いくつかの実施形態では、第１の固定具３６０ａは、第２の固定具３６０ｂに対して近位に位置決めされ、第２の固定具３６０ｂは、第３の固定具３６０ｃに対して近位に位置決めされる。第３の固定具３６０ｃは、ダイアフラム３１６に対して近位に位置決めされてもよい。いくつかの実施形態では、第１の固定具３６０ａ、第２の固定具３６０ｂ、及び第３の固定具３６０ｃは、均等に空間的に離れていてもよい。図１４１に示される実施形態とは異なり、これらの実施形態では、ダイアフラム３１６は、任意の固定具によってクランプ留めされておらず、したがって、可撓性である必要はない。これらの実施形態によるダイアフラム３１６は、剛性材料から構築されてもよい。いくつかの実施形態では、固定具３６０ａ、３６０ｂ、及び３６０ｃのうちの１つ以上は、細胞培養デバイス３００中の細胞４０２の数に基づき、（例えば、内部空間３０２と連通した１つ以上のサンプリングポート（図示せず）を介して）自動的に空間をあけられてもよい。

議論されるように、いくつかの実施形態では、第１の固定具３６０ａ、第２の固定具３６０ｂ、及び第３の固定具３６０ｃは、細胞４０２を培養するために利用可能である細胞培養デバイス３００の内部空間３０２内の第１の壁３０４ａの内側表面の表面積を選択するように構成される。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液４００は、（例えば、入口ポート３２４から）第１の固定具３６０ａ、第２の固定具３６０ｂ、及び第３の固定具３６０ｃのすべてに近接する内部空間３０２の一部にのみ流れることを可能にし得る。いくつかの実施形態では、第１の固定具３６０ａ、第２の固定具３６０ｂ、及び／または第３の固定具３６０ｃのは、細胞懸濁液４００がダイアフラム３１６と接触し、及び／または第１の出口ポート３２６及び第２の出口ポート３２８に流れることを防止するように位置決めされる。いくつかの実施形態では、第１の固定具３６０ａ、第２の固定具３６０ｂ、及び第３の固定具３６０ｃは、細胞４０２を培養するために利用可能である第１の壁３０４ａの内側表面の表面積を選択するように位置決めされる。例えば、図１４２Ａに示されるように、細胞４０２は、第１の固定具３６０ａによって、一般に領域Ａ１として示される内部空間３０２中の第１の壁３０４ａの内側表面の一部に制限される。領域Ａ１は、近位端３０８から第１の固定具３６０ａまで延在していてもよい。

いくつかの実施形態では、第１の固定具３６０ａ、第２の固定具３６０ｂ、及び／または第３の固定具３６０ｃは、細胞４０２を成長させるために利用可能である内部空間３０２内の面積及び体積を拡張させるために、順に解放され（例えば、開放されるか、または取り外され）てもよい。いくつかの実施形態では、第１の固定具３６０ａ、第２の固定具３６０ｂ、及び／または第３の固定具３６０ｃは、それぞれ、所定の期間後（例えば、所定の日数後）に順に解放される。いくつかの実施形態では、第１の固定具３６０ａ、第２の固定具３６０ｂ、及び／または第３の固定具３６０ｃは、それぞれ、細胞培養デバイス３００内に存在する細胞４０２の数に応答して順に解放される。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、細胞懸濁液４００の試料が分析、例えば細胞計数のために収集され得るように、領域Ａ１と流体連通したサンプリングチューブ２１１を備えていてもよい。第１の固定具３６０ａ、第２の固定具３６０ｂ、及び／または第３の固定具３６０ｃは、段階的に順に解放されてもよい。例えば、固定具の最も近位である（近位端３０８に最も近い）第１の固定具３６０ａは、領域Ａ１中の細胞４０２の数が所定の集団サイズに達したら、または所定の日数が経過した後に、及び／またはいくつかの他の基準を満たした後に、解放（例えば、移動、調整、または取り外し）されてもよい。

第１の固定具３６０ａの解放は、図１４２Ｂに示されるように、細胞４０２を培養するのに利用可能である内部空間３０２内の体積及び第１の壁３０４ａの領域を拡張する。例えば、第１の固定具３６０ａの解放後、細胞４０２は、一般に領域Ａ２として示され、領域Ａ１よりも大きく、より大きな細胞集団を収容することができる、内部空間３０２中の第１の壁３０４ａの内側表面の一部の上で成長させることが可能である。領域Ａ２は、近位端３０８から第２の固定具３６０ｂまで延在していてもよい。いくつかの実施形態では、領域Ａ２は、領域Ａ１の約２倍のサイズであるように選択され得る。追加の細胞培養培地及び／または他の添加剤（例えば、ＩＬ－２）もまた、例えば、入口ポート３２４を介して、または別個の入口（図示せず）を介して、内部空間３０２に添加され得る。第２の固定具３６０ｂは、この時点で、残りの固定具の中で最も近位であり、例えば、領域Ａ２中の細胞４０２の数がさらなる所定の集団サイズに達したら、またはさらなる所定の日数が経過した後に、及び／またはいくつかの他の基準を満たした後に、解放されてもよい。第２の固定具３６０ｂの解放は、図１４２Ｃに示されるように、細胞４０２を培養するのに利用可能である内部空間３０２内の体積及び第１の壁３０４ａの領域をさらに拡張する。例えば、第１の固定具３６０ａ及び第２の固定具３６０ｂの解放後、細胞４０２は、一般に領域Ａ３として示され、領域Ａ２よりも大きく、さらにより大きな細胞集団を収容することができる、内部空間３０２中の第１の壁３０４ａの内側表面の一部の上で成長させることが可能である。領域Ａ３は、近位端３０８から第３の固定具３６０ｃまで延在していてもよい。いくつかの実施形態では、領域Ａ３は、領域Ａ１の約３倍のサイズであってもよい。追加の細胞培養培地及び／または他の添加剤（例えば、ＩＬ－２）は、例えば、入口ポート３２４を介して、または別個の入口（図示せず）を介して、内部空間３０２に添加され得る。第３の固定具３６０ｃは、例えば、領域Ａ３中の細胞４０２の数がさらなる所定の集団サイズに達したら、またはさらなる所定の日数が経過した後に、及び／またはいくつかの他の基準を満たした後に、解放されてもよい。第３の固定具３６０ｃの解放は、細胞４０２の培養のために利用可能である内部空間３０２内の体積及び面積をさらに拡張し得る。第３の固定具３６０ｃの解放時に、細胞を培養するために利用可能である内部空間３０２内の拡張された領域は、最大で領域Ａ１のサイズの少なくとも約５倍であってもよい。この図示された例は、３個の固定具を示しているが、他の実施形態は、合計で３個より多くの固定具（例えば、４個、５個、６個、７個、または８個の固定具など）を備えていてもよい。固定具の総数にかかわらず、各固定具は、所定の順序で、または細胞培養条件に基づいて変化する順序で解放され得る。いくつかの実施形態では、各固定具は、細胞４０２を培養するために利用可能な領域及び体積を拡張させるために一般的に記載されるように解放され、固定具は、最も近位（例えば、近位端３０８及び入口ポート３２４に最も近い）から最も遠位への順序で解放される。１つ以上の固定具は、手動で、または他の実施形態では、自動化されたプロセスによって、解放され得る。

いくつかの実施形態では、図１４２Ｄに示されるように、細胞懸濁液４００が細胞培養デバイス３００の遠位部分でダイアフラム３１６の下のチャンバ３１０に流れることを可能にするために、最後の残りの定具（例えば、図示される実施例では第３の固定具３６０ｃ）が解放されてもよい。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６の近位端（例えば、第２の境界３２２ｂにある）は、細胞懸濁液４００が、細胞懸濁液がダイアフラム３１６の端部の周りを第２のチャンバ３１２へと流れることを可能にすることなく、ダイアフラム３１６の下で流れることができるように上昇してもよい。いくつかの実施形態では、例えば、ダイアフラム３１６は、第１の壁３０４ａ、または細胞培養デバイス３００が支持されるトレイ３５０の表面と少なくとも実質的に平行であるように、最後の固定具（例えば、第３の固定具３０６ｃ）の解放の前に、または解放と同時に、上昇してもよい。いくつかの実施形態では、特に、ダイアフラム３１６が剛性である場合、細胞培養デバイス３００の遠位部分は、ダイアフラム３１６が細胞培養デバイス３００の第１または第２の壁３０４ａ、３０４ｂに対して大きな応力を加えることなく、第１及び／または第２の壁３０４ａ、３０４ｂにおいて、上昇するダイアフラム３１６を収容するのに十分に大きくあるべきか、または十分な弛みがあるべきである。

いくつかの実施形態では、使用済み細胞培養培地の少なくとも一部は、細胞培養デバイス３００の近位端３０８上に位置する第１の出口ポート３２６または廃棄物出口を開放し（図示せず）、細胞培養培地が細胞培養デバイス３００の近位端３０８上に位置する第１の出口ポート３２６または廃棄出口から排出される（図示せず）ことを可能にすることによって除去され得る。いくつかの実施形態では、使用済み細胞培養培地は、内部空間３０２中の細胞培養培地の流体レベルが、第１の出口ポート３２６、または細胞培養デバイス３００の近位端３０８上に位置する廃棄出口（図示せず）の位置にほぼ等しくなるまで（例えば、垂直の場所）、排出され得る。いくつかの実施形態では、第１の出口ポート３２６、及び／または細胞培養デバイス３００の近位端３０８上に位置する廃棄出口（図示せず）は、細胞培養デバイス３００が水平方向にあるときに、入口ポート３２４よりも低いレベルに位置決めされ得る。細胞培養培地が排出されている間、細胞４０２は、第１の壁３０４ａの内側表面上に残存してもよい。いくつかの実施形態では、新鮮な置換細胞培養培地（例えば、ＩＬ－２が補充され、任意選択でＯＫＴ－３が補充された細胞培養培地）を、入口ポート３２４または別の入口（図示せず）を介して導入してもよく、細胞をさらに（例えば、約４～約８日間）培養して、さらに多くの量の細胞を産生してもよい。

図１４２Ｅに示されるように、すべての固定具を解放した後、細胞培養デバイス３００を使用して、以前の実施形態で説明されるように、細胞懸濁液４００の体積を低下させ得るように、細胞培養デバイス３００は、水平方向から垂直方向に、または垂直方向に向かって回転してもよい。いくつかの実施形態では、トレイ３５０は、トレイ３５０及び細胞培養デバイス３００を傾けるように構成され得る可動プラットフォーム上に位置決めされ、細胞４０２を出口ポート３２６に向かって移動させるのを促進する。いくつかの実施形態では、可動プラットフォームは、細胞培養デバイス３００を水平方向から垂直方向まで（例えば、９０°）回転させるように構成され得る。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００は、細胞４０２が第２の境界３２２ｂでダイアフラム３１６の近位端より上にこぼれ、第２のチャンバ３１２に入るのを最小限に抑えるか、または防止するように選択された速度で回転されてもよい。

細胞培養デバイス３００が垂直方向に回転するにつれて、いくつかの実施形態では、細胞懸濁液４００の液体高さは、細胞懸濁液４００の一部分がダイアフラム３１６の第２のセクション３２０に接触するように３１６の境界３２２より上に移動するだろう。議論されるように、いくつかの実施形態では、第２のセクション３２０は、液体４０４及び任意の溶解した化学物質／イオンが第１のチャンバ３１０から第２のチャンバ３１２へと通過することを可能にする液体透過性ふるい（例えば、精密濾過膜）を備える。一方、第２のセクション３２０は、細胞４０２が第１のチャンバ３１０内に保持されるように、細胞４０２がそれを介して通過することを可能にしない孔径（例えば、約１μｍ～約２μｍ）を有し得る。そのような構成は、第１のチャンバ３１０中の細胞４０２の数が、ほぼ一定のままである一方で、第１のチャンバ３１０中の液体４０４の体積が減少するため、細胞懸濁液４００中の細胞４０２の濃度を増加させることを可能にする。いくつかの実施形態では、第２の出口３２８を開放して、第２のチャンバ３１２が排出されることを可能にし得る。例えば、第２のチャンバ３１２中の液体４０４は、第２の出口３２８を介して第２のチャンバ３１２を出て、収集容器（図示せず）にチューブを介して運ばれてもよく、または廃棄物として処分されてもよい。

第１のチャンバ３１０内の細胞懸濁液４００の体積は、細胞懸濁液４００の液体レベルが境界３２２をもはや超えなくなるまで減少し続けてもよい。境界３２２の下には、特定の実施形態によって液体不透過性であるダイアフラム３１６の第１のセクション３１８があり、そのため、細胞懸濁液４００’の現時点で低下した体積は、第１のチャンバ３１０の遠位部分で保持されてもよい。細胞懸濁液４００の残存する体積は、例えば、細胞培養デバイス３００の回転前の細胞懸濁液４００の元の体積の約２０％～約５０％であり得る。次いで、第１のチャンバ３１０中の濃縮された細胞懸濁液４００を、第１の出口ポート３２６を開放することによって、第１のチャンバ３１０から出ることを可能にしてもよい。例えば、細胞懸濁液４００は、第１の出口３２６を介して出て、チューブを介して、収集容器に、またはさらなる処理ステップ（図示せず）、例えば、ＬＯＶＯ細胞処理／細胞洗浄へと運ばれてもよい。

１つ以上の固定具を使用するさらなる実施形態が、図１４３Ａ及び１４３Ｂに図示される。この実施形態では、細胞４０２を培養するために利用可能な体積及び領域の量を増加させるために、第１の位置（図１４３Ａ）から第２の位置（図１４３Ｂ）に向かって摺動するように構成される摺動固定具３６２が提供される。いくつかの実施形態では、細胞４０２が培養され得る領域は、近位端３０８と摺動固定具３６２の位置との間にある第１の壁３０４ａの内側表面の一部分である。摺動固定具３６２は、例えば、材料（例えば、細胞培養培地）がその場所を越えて流れるのを防止するのに十分な圧力を維持しつつ、第１及び第２の壁３０４ａ、３０４ｂの上を摺動するように構成されるクランプまたはクリップであってもよい。いくつかの実施形態では、摺動固定具３６２が、第１の位置から第２の位置まで遠位方向に（遠位端３０６に向かって）摺動するにつれて、細胞４０２が成長し得る領域が拡張する（例えば、領域Ａ１から領域Ａ２）。いくつかの実施形態では、摺動固定具３６２は、細胞４０２が成長し得る領域が徐々に拡張するように、第１の位置から第２の位置まで徐々に（例えば、数日間または数週間の期間にわたって）摺動してもよい。いくつかの実施形態では、さらなる固定位置締結具３６４は、任意選択で提供され得る。いくつかの実施形態では、固定位置固定具３６４は、ダイアフラム３１６と近位端３０８との間の場所での位置に固定され得る。いくつかの実施形態では、摺動固定具３６２は、固定位置固定具３６４が摺動固定具３６２とダイアフラム３１６との間に位置決めされるように、固定位置固定具３６４に対して近位に位置する。いくつかの実施形態では、摺動固定具３６２は、固定位置固定具３６４と近位端３０８との間に位置する。いくつかの実施形態では、摺動固定具３６２は、固定位置固定具３６４が、摺動固定具３６２が遠位方向に摺動し得る距離を制限するように、固定位置固定具３６４を超えて摺動することができない。いくつかの実施形態では、十分な細胞４０２が培養されるか、または他の所望の基準が満たされると、摺動固定具３６２及び固定位置固定具３６４が両方とも解放され、細胞懸濁液４００が細胞培養デバイス３００の遠位部分でダイアフラム３１６の下のチャンバ３１０に流れることを可能にしてもよい。次いで、細胞懸濁液４００は、例えば、図１４２Ｄ及び１４２Ｅに関連して説明されたのと同じプロセスに従って、体積低下を受けてもよい。

図１４４Ａ及び１４４Ｂは、特定の実施形態による細胞培養デバイス３００の変形例を示す。これらの実施形態における細胞培養デバイス３００は、ダイアフラム３１６が遠位端３０６から第２の壁３０４ｂの内側表面に延在することを除き、図１４２Ａ～１４３Ｂの細胞培養デバイス３００に類似していてもよい。そのような構成は、特定の実施形態によれば、細胞４０２が第２のチャンバ３１２内にこぼれるのを防止するのに役立ち得る。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６の第２の境界３２２ｂは、第２の壁３０４ｂの内側表面に取り付けられるか、または密封される。いくつかの実施形態では、ダイアフラム３１６は、第２の壁３０４ｂに向かって角度がつけられていてもよく、または屈曲部を含んでもよい。屈曲部は、例えば、第１のセクション３１８と第２のセクション３２０との間の境界３２２に、または境界３２２と第２の境界３２２ａとの間の場所に位置し得る。

細胞培養デバイス３００の実施形態は、特に、ＴＩＬの培養、製造、及び処理に関連して説明されてきたが、細胞培養デバイス３００は、必ずしもこれらの特定の用途に限定されない。例えば、他の実施形態では、細胞培養デバイス３００は、他の細胞型、例えば、他のリンパ球または白血球、赤血球、血小板、内皮細胞、筋細胞、上皮細胞、線維芽細胞、ニューロン、幹細胞などの培養及び／またはふるい分けにおける使用に適合され得る。細胞培養デバイス３００はまた、いくつかの実施形態では、非哺乳動物細胞、例えば、細菌、昆虫細胞、植物細胞、藻類などとの使用に適合され得る。

Ｇｅｎ２ ＴＩＬ製造プロセス
これらの特徴のうちのいくつかを含む、Ｇｅｎ２として知られる（プロセス２Ａとしても知られる）ＴＩＬプロセスの例示的なファミリーが、図１０９及び１４５Ａ～１４５Ｃに示される。Ｇｅｎ２の実施形態を１４５Ａ～１４５Ｃに示す。

本明細書で考察されるように、本発明は、患者への移植前に凍結保存されたＴＩＬを再刺激して、それらの代謝活性、ひいては相対的健康を増加させることに関するステップ、及びその代謝健康を試験する方法を含み得る。本明細書で一般に概説されるように、ＴＩＬは、一般に、患者試料から採取され、患者への移植前にそれらの数を拡張するように操作される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、以下で考察されるように、任意で遺伝子操作され得る。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、凍結保存され得る。解凍した時点で、それらが再刺激されて、患者への注入前に代謝を高めることができる。

いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図において詳細に考察されるように、第１の拡張（ＲＥＰ前と称されるプロセス及び図１０９においてステップＢとして示されるプロセスを含む）は、３～１４日間に短縮され、第２の拡張（ＲＥＰと称されるプロセス、及び図１０９にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、７～１４日間に短縮される。いくつかの実施形態では、第１の拡張（例えば、図１０９においてステップＢとして記載される拡張）は、１１日間に短縮され、第２の拡張（例えば、図１０９にステップＤとして記載される拡張）は、１１日間に短縮される。いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図で詳細に考察されるように、第１の拡張と第２の拡張との組み合わせ（例えば、図１０９にステップＢ及びステップＤとして記載される拡張）は、２２日間に短縮される。

以下の「ステップ」表記Ａ、Ｂ、Ｃなどは、図１０９を参照し、本明細書に記載の特定の実施形態を参照する。以下及び図１０９におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせまたは順序、ならびに追加のステップ、ステップの繰り返し、及び／またはステップの省略は、本出願及び本明細書に開示される方法によって企図される。

ステップＡ：患者の腫瘍試料を取得する
一般に、ＴＩＬは、最初に患者の腫瘍試料から取得され（「一次ＴＩＬ」）、次いで本明細書に記載されるさらなる操作のためにより大きな集団に拡張され、任意選択で凍結保存され、本明細書に概説されるように再刺激され、任意選択でＴＩＬ健康の指標として表現型及び代謝パラメータについて評価される。

患者の腫瘍試料は、一般に外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するための他の手段を介して、当該技術分野で知られている方法を使用して取得することができる。いくつかの実施形態では、多病変サンプリングが使用される。いくつかの実施形態では、外科的切除、針生検、コア生検、小生検、または腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を取得するための他の手段は、多病変サンプリングを含む（すなわち、患者の１つ以上の腫瘍部位及び／または場所、ならびに同じ場所または近接した１つ以上の腫瘍から試料を取得する）。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍、または転移性腫瘍を含む、任意の固形腫瘍に由来し得る。腫瘍試料は、血液系悪性腫瘍から取得された腫瘍などの液体腫瘍であり得る。固形腫瘍は、肺組織のものであり得る。いくつかの実施形態では、有用なＴＩＬは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）から得られる。固形腫瘍は、皮膚組織のものであり得る。いくつかの実施形態では、有用なＴＩＬは、黒色腫から取得される。

取得された時点で、腫瘍試料は、一般に、鋭的解剖を使用して１～約８ｍｍ^３の小片に断片化され、約２～３ｍｍ^３が特に有用である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、酵素腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。かかる腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（例えば、組織解離機を使用する）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地に入れ、腫瘍をおよそ１分間機械的に解離させ、その後、５％ＣＯ_２中、３７℃で３０分間インキュベートし、続いて、小さい組織片しか存在しなくなるまで、前述の条件下で機械的解離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことによって産生され得る。このプロセスの最後に、細胞懸濁液中に多数の赤血球または死細胞が含まれている場合、ＦＩＣＯＬＬ分岐親水性多糖類を使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどの当該技術分野で知られている代替の方法を使用することができる。前述の方法のうちのいずれかが、ＴＩＬを拡張する方法またはがんを治療する方法について本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかにおいて使用され得る。

腫瘍解離酵素混合物には、１つ以上の解離（消化）酵素、例えば、限定されないが、コラゲナーゼ（任意のブレンドまたはコラゲナーゼの種類を含む）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）、ヒアルロニダーゼ、中性プロテアーゼ（ディスパーゼ）、キモトリプシン、キモパパイン、トリプシン、カゼイナーゼ、エラスターゼ、パパイン、ＸＩＶ型プロテアーゼ（プロナーゼ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）、トリプシン阻害剤、任意の他の解離酵素またはタンパク質分解酵素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。

いくつかの実施形態では、解離酵素は、凍結乾燥酵素から再構成される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥酵素は、ＨＢＳＳなどの滅菌緩衝液の量で再構成される。

いくつかの事例では、コラゲナーゼ（アニマルフリー１型コラゲナーゼなど）を、１０ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液で再構成する。凍結乾燥ストック酵素は、２８９２ＰＺ Ｕ／バイアルの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼは、５ｍＬ～１５ｍＬの緩衝液中で再構成される。いくつかの実施形態では、再構成後のコラゲナーゼストックは、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬの範囲、例えば、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約３５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約３００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２１０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２２０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２３０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２４０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２６０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２７０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２８０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２８９．２ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約３００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約３５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、または約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、中性プロテアーゼは、１ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液中で再構成される。凍結乾燥ストック酵素は、１７５ＤＭＣ Ｕ／バイアルの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、再構成後の中性プロテアーゼストックは、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬの範囲、例えば、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約３５０ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約３００ＤＭＣ／ｍＬ、約１５０ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ、約１１０ＤＭＣ／ｍＬ、約１２０ＤＭＣ／ｍＬ、約１３０ＤＭＣ／ｍＬ、約１４０ＤＭＣ／ｍＬ、約１５０ＤＭＣ／ｍＬ、約１６０ＤＭＣ／ｍＬ、約１７０ＤＭＣ／ｍＬ、約１７５ＤＭＣ／ｍＬ、約１８０ＤＭＣ／ｍＬ、約１９０ＤＭＣ／ｍＬ、約２００ＤＭＣ／ｍＬ、約２５０ＤＭＣ／ｍＬ、約３００ＤＭＣ／ｍＬ、約３５０ＤＭＣ／ｍＬ、または約４００ＤＭＣ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅ Ｉは、１ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液中で再構成される。凍結乾燥したストック酵素は、４ＫＵ／バイアルの濃度であった。いくつかの実施形態では、再構成後のＤＮａｓｅ Ｉストックは、約１ＫＵ／ｍＬ～１０ＫＵ／ｍＬ、例えば、約１ＫＵ／ｍＬ、約２ＫＵ／ｍＬ、約３ＫＵ／ｍＬ、約４ＫＵ／ｍＬ、約５ＫＵ／ｍＬ、約６ＫＵ／ｍＬ、約７ＫＵ／ｍＬ、約８ＫＵ／ｍＬ、約９ＫＵ／ｍＬ、または約１０ＫＵ／ｍＬの範囲である。

いくつかの実施形態では、酵素のストックは可変であり、濃度を決定する必要があり得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥ストックの濃度を検証することができる。いくつかの実施形態では、消化カクテルに添加される酵素の最終量は、決定されたストック濃度に基づいて調整される。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、約４．７ｍｌの滅菌ＨＢＳＳ中に約１０．２ｕｌの中性プロテアーゼ（０．３６ＤＭＣ Ｕ／ｍＬ）、２１．３ｕｌのコラゲナーゼ（１．２ＰＺ／ｍＬ）及び２５０ｕｌのＤＮＡｓｅ Ｉ（２００Ｕ／ｍＬ）を含む。

上に示されるように、いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、固形腫瘍に由来する。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、断片化されない。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は断片化されず、全腫瘍として酵素消化に供される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間、３７℃、５％ＣＯ_２で消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間、３７℃、５％ＣＯ_２で、回転させつつ消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、一定の回転を伴って一晩消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、３７℃、５％ＣＯ_２で一定の回転を伴って一晩消化される。いくつかの実施形態では、全腫瘍が酵素と組み合わされて、腫瘍消化反応混合物が形成される。

いくつかの実施形態では、腫瘍は、滅菌緩衝液中の凍結乾燥酵素で再構成される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、滅菌ＨＢＳＳである。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、コラゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＩＶである。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼの作業ストックは、１００ｍｇ／ｍＬの１０倍作業ストックである。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、ＤＮＡｓｅを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅの作業ストックは、１０，０００ＩＵ／ｍＬの１０倍作業ストックである。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、ヒアルロニダーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヒアルロニダーゼの作業ストックは、１０ｍｇ／ｍＬの１０倍作業ストックである。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、１０００ＩＵ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、５００ＩＵ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。

一般に、採取された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに採取された」細胞集団と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、断片化は、例えば、解剖及び消化を含む物理的断片化を含む。いくつかの実施形態では、断片化は、物理的断片化である。いくつかの実施形態では、断片化は、解剖である。いくつかの実施形態では、断片化は、消化によるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、患者から取得された腫瘍試料を消化または断片化することから取得された酵素腫瘍消化物及び腫瘍断片から最初に培養され得る。

腫瘍が固形腫瘍であるいくつかの実施形態では、腫瘍試料が、例えば、ステップＡ（図１に提供される）で取得された後、腫瘍は物理的断片化を受ける。いくつかの実施形態では、断片化は、凍結保存前に起こる。いくつかの実施形態では、断片化は、凍結保存後に起こる。いくつかの実施形態では、断片化は、腫瘍を得た後に、いずれの凍結保存もない場合に起こる。いくつかの実施形態では、腫瘍は断片化され、１０、２０、３０、４０個またはそれ以上の断片または小片が、第１の拡張のために各容器内に配置される。いくつかの実施形態では、腫瘍は断片化され、３０または４０個の断片または小片が、第１の拡張のために各容器内に配置される。いくつかの実施形態では、腫瘍は断片化され、４０個の断片または小片が、第１の拡張のために各容器内に配置される。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ^３の体積を有する。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約３０～約６０個の断片を含み、約１３００ｍｍ^３～約１５００ｍｍ^３の総体積を有する。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約５０個の断片を含み、約１３５０ｍｍ^３の総体積を有する。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約５０個の断片を含み、約１グラム～約１．５グラムの総質量を有する。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約４個の断片を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍断片から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、鋭的解剖によって取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ^３～１０ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ^３～８ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約２ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約３ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約４ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約５ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約６ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約７ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約８ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約９ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１０ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、１～４ｍｍ×１～４ｍｍ×１～４ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、４ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍである。

いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の出血性、壊死性、及び／または脂肪性組織の量を最小化するために切除される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の出血性組織の量を最小化するために切除される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の壊死性組織の量を最小化するために切除される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の脂肪性組織の量を最小化するために切除される。

いくつかの実施形態では、腫瘍の断片化は、腫瘍の内部構造を維持するために行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍の断片化は、メスでのこ引き動作を行うことなく行われる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍消化物から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、例えば、ＲＰＭＩ １６４０（２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）であるが、これに限定されない酵素培地中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって生成された。腫瘍を酵素培地に入れた後、腫瘍は、およそ１分間機械的に解離され得る。その後、溶液が５％ＣＯ_２中３７°Ｃで３０分間インキュベートされ、その後、およそ１分間再び機械的に破壊され得る。５％ＣＯ_２中３７°Ｃで３０分間再びインキュベートした後、腫瘍は、３回目の機械的破壊がおよそ１分間行われ得る。いくつかの実施形態では、大きい組織片が存在する場合、３回目の機械的破壊後、５％ＣＯ_２中３７°Ｃでさらに３０分間インキュベートするかにかかわらず、１回または２回の追加の機械的解離が試料に適用された。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含む場合、最終インキュベーションの終わりに、Ｆｉｃｏｌｌを使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。

いくつかの実施形態では、第１の拡張ステップの前に採取された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに採取された」細胞集団と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、細胞は、任意選択で、試料採取後に凍結され、ステップＢに記載の拡張に入る前に凍結保存されてもよく、ステップＢは、以下でさらに詳細に説明され、図１０９及び図１Ａにも例示される。

胸水Ｔ細胞及びＴＩＬ
いくつかの実施形態では、試料は、胸腔内液試料である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセスによる拡張のためのＴ細胞またはＴＩＬの供給源は、胸腔内液試料である。いくつかの実施形態では、試料は、胸水由来試料である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセスによる拡張のためのＴＩＬの供給源は、胸水由来試料である。例えば、米国特許公開第２０１４／０２９５４２６号に記載されている方法を参照されたく、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬと思われる、及び／またはＴＩＬを含む任意の胸腔内液または胸水を利用することができる。かかる試料は、ＮＳＣＬＣもしくはＳＣＬＣなどの原発性または転移性肺癌に由来し得る。いくつかの実施形態では、試料は、別の臓器、例えば、乳房、卵巣、結腸、または前立腺に由来する二次転移性がん細胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用する試料は、胸膜浸出液である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用する試料は、胸膜漏出液である。他の生体試料は、例えば、腹部からの腹水または膵嚢胞液を含む、ＴＩＬを含有する他の漿液を含み得る。腹水及び胸腔内液は、非常に類似した化学系を伴い、腹部及び肺の両方が、悪性腫瘍における同じ物質の胸膜空間及び腹部空間に中皮線及び流体形態を有し、いくつかの実施形態では、かかる流体は、ＴＩＬを含有する。開示される方法が胸水を利用するいくつかの実施形態では、同じ方法が、ＴＩＬを含有する他の嚢胞液を使用して同様の結果で行われてもよい。

いくつかの実施形態では、胸腔内液は、患者から直接除去された未処理の形態である。いくつかの実施形態では、未処理の胸腔内液は、さらなる処理ステップの前に、ＥＤＴＡまたはヘパリンチューブなどの標準的な採血管に入れられる。いくつかの実施形態では、未処理の胸腔内液は、更なる処理ステップの前に、標準的なＣｅｌｌＳａｖｅ（登録商標）チューブ（Ｖｅｒｉｄｅｘ）に入れられる。いくつかの実施形態では、試料は、生存ＴＩＬの数の減少を避けるために、患者から採取した直後にＣｅｌｌＳａｖｅチューブに入れられる。生存ＴＩＬの数は、４℃であっても、未処理の胸腔内液中に放置されると、２４時間以内に大幅に減少する可能性がある。いくつかの実施形態では、試料は、患者からの除去後１時間、５時間、１０時間、１５時間、または最大２４時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。いくつかの実施形態では、試料は、４°Ｃで、患者からの除去後１時間、５時間、１０時間、１５時間、または最大２４時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。

いくつかの実施形態では、選択された対象からの胸腔内液試料は、希釈され得る。一実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：１０である。他の実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：９である。他の実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：８である。他の実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：５である。他の実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：２である。他の実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：１である。いくつかの実施形態では、希釈剤には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、別の緩衝液、または生理学的に許容される希釈剤が含まれる。いくつかの実施形態では、試料は、患者からの収集及び希釈の直後にＣｅｌｌＳａｖｅチューブ内に入れられ、生存ＴＩＬの減少を回避し、これは、４℃であっても、未処理の胸腔内液中に放置された場合、２４～４８時間以内に有意に生じ得る。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、患者からの除去及び希釈後１時間、５時間、１０時間、１５時間、２４時間、３６時間、最大４８時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、４°Ｃで、患者からの除去及び希釈後１時間、５時間、１０時間、１５時間、２４時間、３６時間、最大４８時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。

さらに他の実施形態では、胸腔内液試料は、更なる処理ステップの前に、従来の手段によって濃縮される。いくつかの実施形態では、胸腔内液のこの前処理は、方法を実施する実験室への輸送のために、またはその後の分析のために（例えば、採取後２４～４８時間より後に）胸水を凍結保存しなければならない状況において好ましい。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、それが対象から採取された後に胸腔内液試料を遠心分離し、遠心分離物またはペレットを緩衝液中に再懸濁することによって調製される。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、輸送または後の分析及び／または処理のために凍結保存される前に、複数の遠心分離及び再懸濁に供される。

いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、濾過法を使用することによって、さらなる処理ステップの前に濃縮される。いくつかの実施形態では、さらなる処理で使用される胸腔内液試料は、胸腔内液が膜を通過することを可能にするが腫瘍細胞を保持する、既知で本質的に均一な孔径を含むフィルターを通して流体を濾過することによって調製される。いくつかの実施形態では、膜の細孔の直径は、少なくとも４μＭであり得る。他の実施形態では、細孔直径は、５μＭ以上であってもよく、他の実施形態では、６、７、８、９、または１０μＭのうちのいずれかである。濾過後、膜によって保持されたＴＩＬを含む細胞を、膜から適切な生理学的に許容される緩衝液にすすいでもよい。次いで、このように濃縮されたＴＩＬを含む細胞は、方法のさらなる処理ステップで使用することができる。

いくつかの実施形態では、胸腔内液試料（例えば、未処理の胸腔内液を含む）、希釈胸水、または再懸濁細胞ペレットは、試料中に存在する無核赤血球を特異的に溶解する溶解試薬と接触させる。いくつかの実施形態では、このステップは、胸腔内液がかなりの数のＲＢＣを含む状況で、さらなる処理ステップの前に行われる。好適な溶解試薬には、単一の溶解試薬もしくは溶解試薬及びクエンチ試薬、または溶解剤、クエンチ試薬及び固定試薬が含まれる。好適な溶解システムは市販されており、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標）システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）が含まれる。他の溶解システムには、Ｖｅｒｓａｌｙｓｅ（商標）システム、ＦＡＣＳｌｙｓｅ（商標）システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｐ（商標）システム、またはＥｒｙｔｈｒｏｌｙｓｅ ＩＩシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、または塩化アンモニウムシステムが含まれる。いくつかの実施形態では、溶解試薬は、赤血球の効率的な溶解、ならびに胸水におけるＴＩＬ及びＴＩＬの表現型特性の保存のような主要な要件によって異なり得る。溶解のための単一の試薬を利用することに加えて、本明細書に記載の方法に有用な溶解システムは、第２の試薬、例えば、方法の残りのステップ中に溶解試薬の効果をクエンチまたは遅延させるもの、例えばＳｔａｂｉｌｙｓｅ（商標）試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を含むことができる。溶解試薬の選択または方法の好ましい実施に応じて、従来の固定試薬を使用することもできる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、未処理、希釈または多重遠心分離または処理された胸腔内液試料は、本明細書で提供されるようにさらに処理及び／または拡張される前に、約－１４０°Ｃの温度で凍結保存される。

ステップＢ：第１の拡張
いくつかの実施形態では、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルを増加させることができ、したがって、より古いＴＩＬ（すなわち、対象／患者への投与前により多くの複製ラウンドをさらに受けたＴＩＬ）よりも追加の治療的利益を提供し得る、若いＴＩＬを得ることを提供する。若いＴＩＬの特徴は、文献、例えば、Ｄｏｎｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，７５，１５７－１６７、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０，１６，６１２２－６１３１、Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５，２８，２５８－２６７、Ｂｅｓｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３，１９，ＯＦ１－ＯＦ９、Ｂｅｓｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９，３２：４１５－４２３、Ｒｏｂｂｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７３，７１２５－７１３０、Ｓｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００７，３０，１２３－１２９、Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５，２８，５３－６２、及びＴｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００８，３１，７４２－７５１に記載されており、それらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。

Ｔリンパ球及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られた数であるが、多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（接合）、及びＣ（一定）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリー多様性を示し、かつ増加させるＴＩＬを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、新たに採取されたＴＩＬ及び／または例えば、図１に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、新たに採取されたＴＩＬ及び／または図１４８及び／または図１４９に例示されるようにプロセス１Ｃと称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、第１の拡張で取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／またはＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン重鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン軽鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／またはベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。

例えば、図１のステップＡに記載されるものなどの腫瘍断片の解剖または消化後に、結果として得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長を好む条件下で、ＩＬ－２を含む血清中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有する不活性化ヒトＡＢ血清を含む培地中２ｍＬのウェル中でインキュベートされる。この一次細胞集団は、数日間、一般に３～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８バルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、７～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８バルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、１０～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８バルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、約１１日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８バルクＴＩＬ細胞を生じる。

好ましい実施形態では、ＴＩＬの拡張は、以下及び本明細書に記載の初期バルクＴＩＬ拡張ステップ（例えば、ＲＥＰ前と称されるプロセスを含み得る、図１０９のステップＢに記載のものなど）、続いて以下のステップＤ及び本明細書に記載の第２の拡張（ステップＤ、急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、続いて任意の凍結保存、続いて以下及び本明細書に記載の第２のステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用して行われ得る。このプロセスから取得されたＴＩＬは、本明細書に記載の表現型特徴及び代謝パラメータについて任意で特徴付けられ得る。

ＴＩＬ培養物が２４ウェルプレートで開始される実施形態では、例えば、Ｃｏｓｔａｒ ２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を使用して、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ、Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中の１×１０^６個の腫瘍消化細胞または１つの腫瘍断片を、各ウェルに播種することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ^３～１０ｍｍ^３である。

いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、培養培地の略語である「ＣＭ」と称される。いくつかの実施形態では、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ １６４０からなる。培養物が４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ^２ガス透過性シリコン底部（例えば、Ｇ－ＲＥＸ１０、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ）を有するガス透過性フラスコ内で開始される実施形態では、各フラスコに、ＩＬ－２を含む１０～４０ｍＬのＣＭ中の１０～４０×１０^６個の生きた腫瘍消化細胞または５～３０個の腫瘍断片を装填した。Ｇ－ＲＥＸ１０及び２４ウェルプレートの両方を、５％ ＣＯ_２中３７°Ｃの加湿インキュベーター内でインキュベートし、培養開始から５日後、培地の半分を取り除き、新たなＣＭ及びＩＬ－２と交換し、５日後、培地の半分を２～３日毎に交換した。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される拡張プロセスで使用される培地は、無血清培地または合成培地である。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、血清含有培地のロット間の変動に部分的に起因する実験変動を防止及び／または減少させるために使用される。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、血清サプリメントまたは血清代替物には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代用物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代用物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代用物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の抗生物質、及び１つ以上の微量元素のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ^２＋、Ｐ、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋、及びＺｒ^４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／または２－メルカプトエタノールをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔは、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＳＴ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地を含むが、これらに限定されない、従来の成長培地とともに使用される。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地中の総血清代替物濃度（ｖｏｌ％）は、総無血清または合成培地の約１体積％、２体積％、３体積％、４体積％、５体積％、６体積％、７体積％、８体積％、９体積％、１０体積％、１１体積％、１２体積％、１３体積％、１４体積％、１５体積％、１６体積％、１７体積％、１８体積％、１９体積％、または２０体積％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約３％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約５％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約１０％である。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されており、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されており、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．５ｍＭ～約９ｍＭ、１ｍＭ～約８ｍＭ、２ｍＭ～約７ｍＭ、３ｍＭ～約６ｍＭ、または４ｍＭ～約５ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約２ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。

いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、１５ｍＭ～約１３０ｍＭ、２０ｍＭ～約１２０ｍＭ、２５ｍＭ～約１１０ｍＭ、３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３５ｍＭ～約９５ｍＭ、４０ｍＭ～約９０ｍＭ、４５ｍＭ～約８５ｍＭ、５０ｍＭ～約８０ｍＭ、５５ｍＭ～約７５ｍＭ、６０ｍＭ～約７０ｍＭ、または約６５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。いくつかの実施形態では、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開第ＷＯ／１９９８／０３０６７９号に記載されている合成培地は、本発明において有用である。その刊行物には、無血清真核細胞培養培地が記載されている。無血清真核細胞培養培地には、無血清培養下で細胞の成長を支持することができる無血清サプリメントを補充した基礎細胞培養培地が含まれる。無血清真核細胞培養培地サプリメントは、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の微量元素、及び１つ以上の抗生物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含むか、またはそれらを組み合わせることによって取得される。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／またはベータ－メルカプトエタノールをさらに含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンまたはアルブミン代替物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、及び１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ^２＋、Ｐ、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋、及びＺｒ^４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、合成培地中のグリシンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、Ｌ－ヒスチジンの濃度は、約５～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－イソロイシンの濃度は、約５～３００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－メチオニンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－フェニルアラニンの濃度は、約５～４００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－プロリンの濃度は、約１～１０００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－ヒドロキシプロリンの濃度は、約１～４５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－セリンの濃度は、約１～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－スレオニンの濃度は、約１０～５００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－トリプトファンの濃度は、約２～１１０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－チロシンの濃度は、約３～１７５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－バリンの濃度は、約５～５００ｍｇ／Ｌであり、チアミンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、還元型グルタチオンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩の濃度は、約１～２００ｍｇ／Ｌであり、鉄飽和トランスフェリンの濃度は、約１～５０ｍｇ／Ｌであり、インスリンの濃度は、約１～１００ｍｇ／Ｌであり、亜セレン酸ナトリウムの濃度は、約０．０００００１～０．０００１ｍｇ／Ｌであり、アルブミン（例えば、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ）の濃度は、約５０００～５０，０００ｍｇ／Ｌである。

いくつかの実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、表４の「１×培地中の濃度範囲」という見出しの下の列にリストされた濃度範囲で存在する。他の実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、表４の「１×培地の好ましい実施形態」という見出しの下の列にリストされた最終濃度で存在する。他の実施形態では、合成培地は、無血清サプリメントを含む基礎細胞培地である。これらの実施形態のうちのいくつかでは、無血清サプリメントは、以下の表４の「サプリメント中の好ましい実施形態」という見出しの下の列にリストされたタイプ及び濃度の非微量部分成分を含む。

いくつかの実施形態では、合成培地の浸透圧は、約２６０～３５０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、浸透圧は、約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、合成培地には、最大約３．７ｇ／Ｌ、または約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムが補充されている。合成培地には、Ｌ－グルタミン（最終濃度約２ｍＭ）、１つ以上の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、最終濃度約１００μＭ）、２－メルカプトエタノール（最終濃度約１００μＭ）がさらに補充されていてもよい。

いくつかの実施形態では、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（１）２０１５（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．３１）に記載の定義された培地が、本発明において有用である。簡潔には、ＲＰＭＩまたはＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒを基礎細胞培地として使用し、０、２％、５％、または１０％のいずれかのＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを補充した。

いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞の数を拡張するために必要な手順を簡素化することができる。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥまたはβＭＥ、２－メルカプトエタノールとしても知られる、ＣＡＳ６０－２４－２）を欠いている。

腫瘍断片の調製後、結果として得られた細胞（すなわち、断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長を好む条件下で、ＩＬ－２を含む血清中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を有する不活性化ヒトＡＢ血清を含む培地中２ｍＬのウェル中（または、いくつかの事例では、本明細書で概説されるように、ＡＰＣ細胞集団の存在下）でインキュベートされる。この一次細胞集団は、数日間、一般に１０～１４日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８個のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、第１の拡張中の成長培地は、ＩＬ－２またはそのバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬは、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２５×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき３０×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、４～８×１０^６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、５～７×１０^６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、６×１０^６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、実施例４に記載されるように調製される。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、または約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２さらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２さらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。

いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、または約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－１５をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。

いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、または約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２１をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。

いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、抗ＣＤ３アゴニスト抗体、例えば、ＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇの間、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである。例えば、表１を参照されたい。

いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、バリアント、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、細胞培養培地は、ＩＬ－２を約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、培養培地の略語である「ＣＭ」と称される。いくつかの実施形態では、それは、ＣＭ１（培養培地１）と称される。いくつかの実施形態では、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ １６４０からなる。培養物が４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ^２ガス透過性シリコン底部（例えば、Ｇ－ＲＥＸ１０、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ）を有するガス透過性フラスコ内で開始される実施形態では、ＩＬ－２を含む１０～４０ｍＬのＣＭ中の１０～４０×１０^６個の生きた腫瘍消化細胞または５～３０個の腫瘍断片を、各フラスコに入れた。Ｇ－ＲＥＸ１０及び２４ウェルプレートの両方を、５％ ＣＯ_２中３７°Ｃの加湿インキュベーター内でインキュベートし、培養開始から５日後、培地の半分を取り除き、新たなＣＭ及びＩＬ－２と交換し、５日後、培地の半分を２～３日毎に交換した。いくつかの実施形態では、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１であり、実施例１を参照されたい。いくつかの実施形態では、第１の拡張は、初期細胞培養培地または第１の細胞培養培地中で起こる。いくつかの実施形態では、初期細胞培養培地または第１の細胞培養培地は、ＩＬ－２を含む。

いくつかの実施形態では、実施例及び図で考察されるように、第１の拡張（例えば、ＲＥＰ前と称されることもあるものを含み得る、図１０９のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含む）プロセスは、３～１４日間に短縮される。いくつかの実施形態では、第１の拡張（例えば、ＲＥＰ前と称されることもあるものを含み得る、図１０９のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含む）は、実施例において論じられるように、７～１４日間に短縮され、例えば、図１０９のステップＢに記載される拡張を含む。いくつかの実施形態では、ステップＢの第１の拡張は、１０～１４日間に短縮される。いくつかの実施形態では、第１の拡張は、１１日間に短縮される。

いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、２日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、３日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、４日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、５日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、６日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、７日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、８日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、９日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１０日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１１日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１２日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１３日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、２日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、３日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、４日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、５日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、６日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、７日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、８日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、９日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ増殖は、１０日～１１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１１日間続行することができる。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１の組み合わせは、第１の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１０９よる、かつ本明細書に記載されるステップＢのプロセス中を含む、第１の拡張中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせは、第１の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、図１０９による、かつ本明細書に記載されるステップＢのプロセス中に含まれ得る。

いくつかの実施形態では、第１の拡張（ＲＥＰ前と称されるプロセスを含む、例えば、図１０９によるステップＢ）プロセスは、実施例及び図で論じられるように、３～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、ステップＢの第１の拡張は、７～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、ステップＢの第１の拡張は、１０～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、第１の拡張は、１１日に短縮される。

いくつかの実施形態では、第１０９の拡張、例えば、図１によるステップＢは、閉鎖系バイオリアクター内で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０またはＧ－ＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。

サイトカイン及び他の添加物
本明細書に記載の拡張方法は、一般に、当該技術分野で知られているように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。

あるいは、ＴＩＬの急速拡張及び／または第２の拡張のためにサイトカインの組み合わせを使用することは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１０７４９０Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１のうちの２つ以上の組み合わせを用いて追加として可能である。したがって、可能な組み合わせには、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－２及びＩＬ－２１、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１、ならびにＩＬ－２またはＩＬ－１５及びＩＬ－２１が含まれ、後者は、多くの実施形態において特定の用途を見出す。サイトカインの組み合わせの使用は、リンパ球、特にそこに記載されているようにＴ細胞の生成に特に有利に働く。

いくつかの実施形態では、ステップＢはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＯＫＴ－３抗体またはムロモナブの、培養培地への添加を含み得る。いくつかの実施形態では、ステップＢはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、４－１ＢＢアゴニストの、培養培地への添加を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ステップＢはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＯＸ－４０アゴニストの、培養培地への添加を含み得る。他の実施形態では、チアゾリジンジオン化合物などの増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）－ガンマアゴニストを含む、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーターＩ－アルファアゴニストなどの添加剤は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１９／０３０７７９６ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ステップＢ中の培養培地で使用されてもよい。

ステップＣ：第１の拡張から第２の拡張へと移行
いくつかの事例では、例えば、図１０９に示されるステップＢから取得されたＴＩＬ集団を含む、第１の拡張から取得されたバルクＴＩＬ集団は、以下で考察されるプロトコルを使用して、直ちに凍結保存され得る。あるいは、第２のＴＩＬ集団と称される第１の拡張から取得されたＴＩＬ集団は、以下で考察されるように、第２の拡張（ＲＥＰと称されることもある拡張を含み得る）に供され、その後、凍結保存され得る。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが治療に使用される場合、第１のＴＩＬ集団（バルクＴＩＬ集団と称されることもある）または第２のＴＩＬ集団（いくつかの実施形態では、ＲＥＰ ＴＩＬ集団と称される集団を含み得る）は、拡張前または第１の拡張後及び第２の拡張前に、好適な治療のために遺伝子修飾に供され得る。

いくつかの実施形態では、第１の拡張から（例えば、図１０９に示されるステップＢから）取得されたＴＩＬは、選択のために表現型決定されるまで保管される。いくつかの実施形態では、第１の拡張から（例えば、図１０９に示されるステップＢから）取得されたＴＩＬは保管されず、第２の拡張に直接進む。いくつかの実施形態では、第１の拡張から取得されたＴＩＬは、第１の拡張後及び第２の拡張前に凍結保存されない。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約３日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約４日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約４日～１０日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約７日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから約１４日で起こる。

いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、２日～１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから３日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから４日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから５日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから６日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから７日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから８日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから９日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１０日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１１日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１２日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１３日～１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１４日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから３日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第４の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第５の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第６の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第７の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第８の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第９の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第１０の拡張への移行は、断片化が起こってから２日～１１日で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こってから１１日で起こる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、第１の拡張後及び第２の拡張前に保管されず、ＴＩＬは、第２の拡張に直接進む（例えば、いくつかの実施形態では、図１０９に示されるステップＢからステップＤへの移行中に保管されない）。いくつかの実施形態では、移行は、本明細書に記載されるように、閉鎖系内で起こる。いくつかの実施形態では、第１の拡張由来のＴＩＬである第２のＴＩＬ集団は、移行期間なしで第２の拡張に直接進む。

いくつかの実施形態では、第１の拡張から第２の拡張への移行、例えば、図１０９によるステップＣは、閉鎖系バイオリアクター内で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０またはＧ－ＲＥＸ－１００バイオリアクターである。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、組織培養デバイス１００を備える。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、組織培養デバイス２０８及び／または２０９を備える。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、細胞培養デバイス３００を備える。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。

ステップＤ：第２の拡張
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ細胞集団は、採取及び初期バルク処理後、例えば、図１０９に示される、ステップＡ及びステップＢ、ならびにステップＣと称される移行後に数が拡張される）。このさらなる拡張は、本明細書では第２の拡張と称され、これは、当該技術分野で一般に急速拡張プロセス（ＲＥＰ、ならびに図１０９のステップＤに示されるプロセス）と称される拡張プロセスを含み得る。第２の拡張は、一般に、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含むいくつかの構成要素を含む培養培地を使用して、ガス透過性容器内で達成される。

いくつかの実施形態では、第２の拡張または第２のＴＩＬ拡張（ＲＥＰと称されることもある拡張、ならびに図１０９のステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に知られている任意のＴＩＬフラスコまたは容器を使用して行われ得る。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約７日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約８日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約９日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１０日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１１日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１２日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１３日～約１４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、約１４日間続行することができる。

いくつかの実施形態では、第２の拡張は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと称される拡張、ならびに図１０９のステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で行われ得る。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）またはインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して、急速に拡張され得る。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、例えば、抗ＣＤ３抗体、例えば約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪもしくはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡから市販）またはＵＨＣＴ－１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから市販）を含み得る。ＴＩＬは、がんのエピトープ（複数可）などの抗原性部分を含む、第２の増殖中に１つ以上の抗原を含むことによって、インビトロでＴＩＬのさらなる刺激を誘導するように拡張することができ、これは、ベクター、例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μＭ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）またはｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）から、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２またはＩＬ－１５などのＴ細胞成長因子の存在下で任意で発現され得る。他の好適な抗原には、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼがん抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、及びＶＥＧＦＲ２、またはそれらの抗原性部分が含まれ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２を発現する抗原提示細胞にパルスされたがんの同じ抗原（複数可）で再刺激することによっても急速に拡張され得る。あるいは、ＴＩＬは、例えば、例として放射線照射された自己リンパ球または放射線照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２でさらに再刺激され得る。いくつかの実施形態では、再刺激は、第２の拡張の一部として起こる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、放射線照射された自己リンパ球の存在下で、または放射線照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２を用いて起こる。

いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２さらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、または８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。

いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇの間、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである。

いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、バリアント、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、細胞培養培地は、ＩＬ－２を約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１の組み合わせは、第２の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１０９による、かつ本明細書に記載されるステップＤのプロセス中を含む、第２の拡張中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせは、第２の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、図１０９による、かつ本明細書に記載されるステップＤのプロセス中に含まれ得る。

いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、抗原提示フィーダー細胞、及び任意選択でＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む補充された細胞培養培地において実施され得る。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、補充された細胞培養培地中で起こる。いくつかの実施形態では、補充された細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ、抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞（すなわち、抗原提示細胞）を含む細胞培養培地中で起こる。

いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、または約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－１５をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。

いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、または約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２１をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。

いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣ及び／または抗原提示細胞に対する比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。いくつかの実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣに対する比は、１：５０～１：３００である。いくつかの実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣに対する比は、１：１００～１：２００である。

いくつかの実施形態では、ＲＥＰ及び／または第２の拡張は、バルクＴＩＬが１５０ｍＬの培地中の１００倍または２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合されているフラスコ内で行われる。細胞が代替の成長チャンバに移されるまで、培地交換が行われる（一般に、新鮮な培地との呼吸による３分の２の培地交換）。代替の成長チャンバには、以下でより完全に考察されるように、Ｇ－ＲＥＸフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。

いくつかの実施形態では、実施例及び図で考察されるように、第２の拡張（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、７～１４日に短縮される。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、１１日に短縮される。

いくつかの実施形態では、ＲＥＰ及び／または第２の拡張は、以前に記載されたＴ－１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Ｔｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００８，３１，７４２－５１、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００３，２６，３３２－４２）またはガス透過性培養器具（例えば、Ｇ－ＲＥＸフラスコ）を使用して行われ得る。いくつかの実施形態では、第２の拡張（急速拡張と称される拡張を含む）は、Ｔ－１７５フラスコ内で行われ、１５０ｍＬの培地に懸濁された約１×１０^６個のＴＩＬが、各Ｔ－１７５フラスコに添加され得る。ＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充した、１：１のＣＭとＡＩＭ－Ｖ培地との混合物中で培養され得る。Ｔ－１７５フラスコは、５％ ＣＯ_２中３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分を、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して５日目に交換することができる。いくつかの実施形態では、７日目に、２つのＴ－１７５フラスコからの細胞が３Ｌバッグ内で組み合わせられ得、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのＡＩＭ Ｖが、３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加された。各バッグ内の細胞の数を、毎日または隔日カウントし、新鮮な培地を添加して、０．５～２．０×１０^６細胞／ｍＬの間の細胞数を維持した。

いくつかの実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張、ならびに図１のステップＤで参照される拡張を含み得る）は、１００ｃｍのガス透過性シリコン底部を有する５００ｍＬ容量のガス透過性フラスコ（Ｇ－ＲＥＸ１００、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ，ＵＳＡから市販されている）内で行われ得る。５×１０^６または１０×１０^６ＴＩＬは、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）を補充した４００ｍＬの５０／５０培地中、ＰＢＭＣで培養され得る。Ｇ－ＲＥＸ１００フラスコは、５％ＣＯ_２中３７℃でインキュベートされ得る。５日目に、２５０ｍＬの上清が除去され、遠心分離ボトルに入れられ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心分離され得る。ＴＩＬペレットが、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮培地で再懸濁され、元のＧＲＥＸ－１００フラスコに戻し追加され得る。ＴＩＬがＧ－ＲＥＸ－１００フラスコ内で連続的に拡張される場合、７日目に、各Ｇ－ＲＥＸ－１００内のＴＩＬを、各フラスコに存在する３００ｍＬの培地に懸濁させてもよく、細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割してもよく、それを使用して３つのＧ－ＲＥＸ－１００フラスコに播種してもよい。その後、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが各フラスコに添加されてもよい。Ｇ－ＲＥＸ－１００フラスコが５％ＣＯ_２中３７℃でインキュベートされてもよく、４日後に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、各Ｇ－ＲＥＸ－１００フラスコに添加されてもよい。培養１４日目に、細胞が採取されてもよい。

いくつかの実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）は、バルクＴＩＬが１５０ｍＬの培地中の１００倍または２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体、及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２と混合されているフラスコで行われる。いくつかの実施形態では、培地交換は、細胞が代替の成長チャンバに移されるまで行われる。いくつかの実施形態では、培地の３分の２が、新鮮な培地と呼吸によって交換される。いくつかの実施形態では、代替の成長チャンバには、以下でより完全に考察されるように、Ｇ－ＲＥＸフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。

いくつかの実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）が行われ、優れた腫瘍反応性のためにＴＩＬが選択されるステップをさらに含む。当該技術分野で知られている任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法が、優れた腫瘍反応性のためのＴＩＬの選択に使用され得る。

任意選択で、細胞生存率アッセイは、当該技術分野で知られている標準的なアッセイを使用して、第２の拡張（ＲＥＰ拡張と称される拡張を含む）後に行われ得る。例えば、死細胞を選択的に標識し、生存率の評価を可能にするトリパンブルー排除アッセイが、バルクＴＩＬの試料上で行われ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ試料は、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２自動セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）を使用して計数され、生存率が決定され得る。いくつかの実施形態では、生存率は、標準のＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒプロトコルに従って決定される。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）は、以前に記載されているように、Ｔ－１７５フラスコ及びガス透過性バッグ（Ｔｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３１，７４２－７５１、及びＤｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．２００３，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６，３３２－３４２）またはガス透過性フラスコ（例えば、Ｇ－ＲＥＸフラスコ）を使用して行われてもよい。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、フラスコを使用して行われる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ガス透過性Ｇ－ＲＥＸフラスコを使用して行われる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、Ｔ－１７５フラスコ中で行われる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、前述のように、組織培養デバイス１００及び／または２０８、２０９中で行われる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、細胞培養デバイス３００内（例えば、内部空間３０２内、例えば、第１の壁３０４ａの内側表面で培養された細胞）で行われる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、フラスコ（例えば、Ｔ－１７５フラスコ）内で行われ、約１×１０^６個のＴＩＬが約１５０ｍＬの培地に懸濁され、これが各フラスコに添加される。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞として１対１００の比で放射線照射された（５０Ｇｙ）同種異系ＰＢＭＣとともに培養され、細胞が、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充した、１：１のＣＭとＡＩＭ－Ｖ培地との混合物（５０／５０培地）中で培養された。フラスコは、５％ＣＯ_２中３７℃でインキュベートされ得る。いくつかの実施形態では、培地の半分が、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５０／５０培地を使用して５日目に交換される。いくつかの実施形態では、７日目に、２つのフラスコからの細胞が３Ｌバッグ内で組み合わせられ、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む３００ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加される。各バッグ内の細胞の数が毎日または隔日計数され得、新鮮な培地が添加されて、約０．５～約２．０×１０^６細胞／ｍＬの細胞数を維持することができる。

いくつかの実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）は、１００ｃｍ^２のガス透過性シリコン底部を有する５００ｍＬ容量のフラスコ（Ｇ－ＲＥＸ１００、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）内で行われ、約５×１０^６または１０×１０^６ＴＩＬが、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を補充した、４００ｍＬの５０／５０培地中、１対１００の比で放射線照射された同種異系ＰＢＭＣとともに培養される。Ｇ－ＲＥＸ１００フラスコは、５％ＣＯ_２中３７℃でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、５日目に、２５０ｍＬの上清が除去され、遠心分離ボトルに入れられ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心分離される。その後、ＴＩＬペレットが、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮な５０／５０培地に再懸濁され、元のＧ－ＲＥＸ－１００フラスコに戻し添加されてもよい。ＴＩＬがＧ－ＲＥＸ－１００フラスコ内で連続的に拡張される実施形態では、７日目に、各Ｇ－ＲＥＸ－１００内のＴＩＬを、各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割し、それを使用して３つのＧ－ＲＥＸ－１００フラスコに播種する。その後、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが各フラスコに添加される。Ｇ－ＲＥＸ－１００フラスコが５％ＣＯ_２中３７℃でインキュベートされ、４日後に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ－Ｖが、各Ｇ－ＲＥＸ－１００フラスコに添加される。培養１４日目に、細胞が採取される。

Ｔリンパ球及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られた数であるが、多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（接合）、及びＣ（一定）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリー多様性を示し、かつ増加させるＴＩＬを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、第２の拡張において取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／またはＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン重鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン軽鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／またはベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。

いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地とも称される）は、以下でさらに詳細に論じられるように、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、ならびに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される拡張プロセスで使用される培地は、無血清培地または合成培地である。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、血清含有培地のロット間の変動に部分的に起因する実験変動を防止及び／または減少させるために使用される。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、血清サプリメントまたは血清代替物には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代用物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代用物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代用物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の抗生物質、及び１つ以上の微量元素のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ^２＋、Ｐ、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋、及びＺｒ^４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／または２－メルカプトエタノールをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔは、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＳＴ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地を含むが、これらに限定されない、従来の成長培地とともに使用される。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地中の総血清代替物濃度（ｖｏｌ％）は、総無血清または合成培地の約１体積％、２体積％、３体積％、４体積％、５体積％、６体積％、７体積％、８体積％、９体積％、１０体積％、１１体積％、１２体積％、１３体積％、１４体積％、１５体積％、１６体積％、１７体積％、１８体積％、１９体積％、または２０体積％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約３％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約５％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約１０％である。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されており、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されており、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．５ｍＭ～約９ｍＭ、１ｍＭ～約８ｍＭ、２ｍＭ～約７ｍＭ、３ｍＭ～約６ｍＭ、または４ｍＭ～約５ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約２ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。

いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、１５ｍＭ～約１３０ｍＭ、２０ｍＭ～約１２０ｍＭ、２５ｍＭ～約１１０ｍＭ、３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３５ｍＭ～約９５ｍＭ、４０ｍＭ～約９０ｍＭ、４５ｍＭ～約８５ｍＭ、５０ｍＭ～約８０ｍＭ、５５ｍＭ～約７５ｍＭ、６０ｍＭ～約７０ｍＭ、または約６５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。いくつかの実施形態では、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開第ＷＯ／１９９８／０３０６７９号に記載されている合成培地は、本発明において有用である。その刊行物には、無血清真核細胞培養培地が記載されている。無血清真核細胞培養培地には、無血清培養下で細胞の成長を支持することができる無血清サプリメントを補充した基礎細胞培養培地が含まれる。無血清真核細胞培養培地サプリメントは、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の微量元素、及び１つ以上の抗生物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含むか、またはそれらを組み合わせることによって取得される。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／またはベータ－メルカプトエタノールをさらに含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンまたはアルブミン代替物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、及び１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ^２＋、Ｐ、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋、及びＺｒ^４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、合成培地中のグリシンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、Ｌ－ヒスチジンの濃度は、約５～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－イソロイシンの濃度は、約５～３００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－メチオニンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－フェニルアラニンの濃度は、約５～４００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－プロリンの濃度は、約１～１０００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－ヒドロキシプロリンの濃度は、約１～４５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－セリンの濃度は、約１～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－スレオニンの濃度は、約１０～５００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－トリプトファンの濃度は、約２～１１０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－チロシンの濃度は、約３～１７５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－バリンの濃度は、約５～５００ｍｇ／Ｌであり、チアミンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、還元型グルタチオンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩の濃度は、約１～２００ｍｇ／Ｌであり、鉄飽和トランスフェリンの濃度は、約１～５０ｍｇ／Ｌであり、インスリンの濃度は、約１～１００ｍｇ／Ｌであり、亜セレン酸ナトリウムの濃度は、約０．０００００１～０．０００１ｍｇ／Ｌであり、アルブミン（例えば、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ）の濃度は、約５０００～５０，０００ｍｇ／Ｌである。

いくつかの実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、表４の「１×培地中の濃度範囲」という見出しの下の列にリストされた濃度範囲で存在する。他の実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、表４の「１×培地の好ましい実施形態」という見出しの下の列にリストされた最終濃度で存在する。他の実施形態では、合成培地は、無血清サプリメントを含む基礎細胞培地である。これらの実施形態のうちのいくつかでは、無血清サプリメントは、表４の「サプリメント中の好ましい実施形態」という見出しの下の列にリストされたタイプ及び濃度の非微量部分成分を含む。

いくつかの実施形態では、合成培地の浸透圧は、約２６０～３５０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、浸透圧は、約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、合成培地には、最大約３．７ｇ／Ｌ、または約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムが補充されている。合成培地には、Ｌ－グルタミン（最終濃度約２ｍＭ）、１つ以上の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、最終濃度約１００μＭ）、２－メルカプトエタノール（最終濃度約１００μＭ）がさらに補充されていてもよい。

いくつかの実施形態では、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（１）２０１５（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．３１）に記載の定義された培地が、本発明において有用である。簡潔には、ＲＰＭＩまたはＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒを基礎細胞培地として使用し、０、２％、５％、または１０％のいずれかのＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを補充した。

いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞の数を拡張するために必要な手順を簡素化することができる。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥまたはβＭＥ、２－メルカプトエタノールとしても知られる、ＣＡＳ６０－２４－２）を欠いている。

いくつかの実施形態では、第２の拡張、例えば、図１０９によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクター内で行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０またはＧ－ＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。

いくつかの実施形態では、急速なまたは第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）ＴＩＬを、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～７日間培養することによって急速なまたは第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養でのＴＩＬを、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００－ＭＣＳ容器に移し、小規模培養由来のＴＩＬを、第２の容器内でのより大規模な培養で約４～７日間培養することとによって、培養のスケールアップを達成する。いくつかの実施形態では、第２の容器は、細胞培養デバイス３００である（図１３０Ａ～１４４Ｂ）。例えば、いくつかの実施形態では、小規模培養からのＴＩＬが、細胞培養デバイス３００に移され、その中で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００のサイズが、第１の容器のサイズよりも大きいように選択されてもよい。例えば、細胞培養デバイス３００のサイズは、利用可能な細胞培養体積及び／または細胞培養表面積において、Ｇ－ＲＥＸ－５００ ＭＣＳ容器と少なくとも同じサイズであってもよい。

いくつかの実施形態では、急速なまたは第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）ＴＩＬを、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約３～７日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）第１の小規模培養由来のＴＩＬを、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養由来のかかる第２の容器に移されたＴＩＬの一部が、第２の小規模培養で約４～７日間培養される。いくつかの実施形態では、第２の容器は、細胞培養デバイス３００の少なくとも１つであるか、またはそれを備えている（図１３０Ａ～１４４Ｂ）。例えば、いくつかの実施形態では、小規模培養からのＴＩＬが、複数の細胞培養デバイス３００に移され、その中で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、各細胞培養デバイス３００のサイズは、利用可能な細胞培養体積及び／または細胞培養表面積において、第１の容器と同じサイズであるように選択されてもよい。

いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、ＴＩＬの複数の約２～５亜集団に配分される。亜集団はそれぞれ、ほぼ同じ数の細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、亜集団の各々は、次いで、別個の細胞培養デバイス３００中で培養される。

いくつかの実施形態では、急速なまたは第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）ＴＩＬを、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ１００ ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～７日間の期間培養することによって急速なまたは第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からのＴＩＬを、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００ ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移されたＴＩＬの一部が、より大規模な培養で約４～７日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、第２の容器は、１つまたは複数の細胞培養デバイス３００であるか、またはそれを備えている（図１３０Ａ～１４４Ｂ）。例えば、いくつかの実施形態では、小規模培養からのＴＩＬが、複数の細胞培養デバイス３００に移され、その中で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、各細胞培養デバイス３００のサイズが、第１の容器のサイズよりも大きいように選択されてもよい。例えば、各細胞培養デバイス３００のサイズは、利用可能な細胞培養体積及び／または細胞培養表面積において、Ｇ－ＲＥＸ－５００ ＭＣＳ容器と少なくとも同じサイズであってもよい。

いくつかの実施形態では、急速なまたは第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）ＴＩＬを、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約５日間培養することによって急速なまたは第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養由来のＴＩＬを、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養由来のかかる第２の容器に移されたＴＩＬの一部が、より大規模な培養で約６日間培養される。いくつかの実施形態では、第２の容器は、複数の細胞培養デバイス３００であるか、またはそれを備えている（図１３０Ａ～１４４Ｂ）。例えば、いくつかの実施形態では、小規模培養からのＴＩＬが、複数の細胞培養デバイス３００に移され、その中で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、各細胞培養デバイス３００のサイズが、第１の容器のサイズよりも大きいように選択されてもよい。例えば、各細胞培養デバイス３００のサイズは、利用可能な細胞培養体積及び／または細胞培養表面積において、Ｇ－ＲＥＸ－５００ ＭＣＳ容器と少なくとも同じサイズであってもよい。

いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張の分割時に、各第２の容器は、少なくとも１０^８個のＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張の分割時に、各第２の容器は、少なくとも１０^８個のＴＩＬ、少なくとも１０^９個のＴＩＬ、または少なくとも１０^１０個のＴＩＬを含む。例示的な一実施形態では、各第２の容器は、少なくとも１０^１０個のＴＩＬを含む。

いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、複数の亜集団に配分される。いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、複数の約２～５亜集団に配分される。いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、複数の約２、３、４、または５亜集団に配分される。

いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張の完了後、複数の亜集団は、治療有効量のＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張の完了後、１つ以上のＴＩＬの亜集団を一緒にプールして、治療有効量のＴＩＬを産生する。いくつかの実施形態では、急速拡張または第２の拡張の完了後、ＴＩＬの各亜集団は、治療有効量のＴＩＬを含む。

いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張は、複数のステップに分割される前に、約３～７日間行われる。いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張の分裂は、急速または第２の拡張の開始後約３日目、４日目、５日目、６日目、または７日目に起こる。

いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張の分裂は、第１の拡張（すなわち、ＲＥＰ前拡張）の開始後の約７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、または１６日目、１７日目、または１８日目に起こる。例示的な一実施形態では、急速または第２の拡張の分裂は、第１の拡張の開始後約１６日目に起こる。

いくつかの実施形態では、急速拡張は、分割した後に約７～１１日間の期間、さらに行われる。いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張は、分裂後約５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日間、さらに行われる。

いくつかの実施形態では、分裂前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、分裂後の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地と同じ成分を含む。いくつかの実施形態では、分裂前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、分裂後の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地とは異なる成分を含む。

いくつかの実施形態では、分裂前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及びさらに任意選択でＡＰＣを含む。いくつかの実施形態では、分裂前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びさらに任意選択でＡＰＣを含む。いくつかの実施形態では、分裂前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む。

いくつかの実施形態では、分裂前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３及びさらに任意選択でＡＰＣを含む新鮮な培養培地で補充することによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む新鮮な培養培地で補充することによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３及びさらに任意選択でＡＰＣを含む新鮮な培養培地で置き換えることによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む新鮮な細胞培養培地で置き換えることによって生成される。

いくつかの実施形態では、分裂後の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、及び任意選択でＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、分裂後の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、分裂後の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、分裂前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地を、ＩＬ－２及び任意選択でＯＫＴ－３を含む新鮮な培養培地で置き換えることによって生成される。いくつかの実施形態では、分割した後の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地は、分割する前の急速または第２の拡張に使用される細胞培養培地を、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む新鮮培養培地で置き換えることによって生成される

いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張の分割は、閉鎖系において起こる。

いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張中のＴＩＬ培養物のスケールアップは、新鮮な細胞培養培地をＴＩＬ培養物に添加すること（ＴＩＬを供給することとも称される）を含む。いくつかの実施形態では、供給は、新鮮な細胞培養培地をＴＩＬ培養物に頻繁に添加することを含む。いくつかの実施形態では、供給は、新鮮な細胞培養培地をＴＩＬ培養物に一定の間隔で添加することを含む。いくつかの実施形態では、新鮮な細胞培養培地は、一定の流れを介してＴＩＬに供給される。いくつかの実施形態では、Ｘｕｒｉ Ｗ２５などの自動化された細胞拡張システムは、急速拡張及び供給のために使用される。

フィーダー細胞及び抗原提示細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順（例えば、図１０９のステップＤに記載されるような拡張、ならびにＲＥＰと称されるものを含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡張中及び／または第２の拡張中に過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健康な献血者由来の標準の全血単位から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。

一般に、同種異系ＰＢＭＣは、放射線照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用され、これは、放射線照射された同種異系ＰＢＭＣの複製能力がないことを評価するための例示的なプロトコルを提供する。

いくつかの実施形態では、１４日目の総生細胞数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）の培養物に入れられた初期の生細胞数よりも少ない場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。

いくつかの実施形態では、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された総生細胞数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）の培養物に入れられた初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。

いくつかの実施形態では、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された総生細胞数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）の培養物に入れられた初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。

いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。いくつかの実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。いくつかの実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比は、１：５０～１：３００である。いくつかの実施形態では、第２の増殖におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比は、１：１００～１：２００である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約２．５×１０^９フィーダー細胞：約１００×１０^６ＴＩＬの比を必要とする。他の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約２．５×１０^９フィーダー細胞：約５０×１０^６ＴＩＬの比を必要とする。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約２．５×１０^９フィーダー細胞：約２５×１０^６ＴＩＬを必要とする。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、第２の拡張中に過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健康な献血者由来の標準の全血単位から得られる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。いくつかの実施形態では、人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞がＰＢＭＣの代わりに使用される。

一般に、同種異系ＰＢＭＣは、放射線照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載される例示的な手順を含む、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順で使用される。

いくつかの実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替物として、またはＰＢＭＣと組み合わせて、第２の拡張において使用される。

サイトカイン及び他の添加物
本明細書に記載の拡張方法は、一般に、当該技術分野で知られているように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。

あるいは、ＴＩＬの急速拡張及び／または第２の拡張のためにサイトカインの組み合わせを使用することは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１０７４９０Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１のうちの２つ以上の組み合わせを用いて追加として可能である。したがって、可能な組み合わせには、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－２及びＩＬ－２１、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれ、後者は多くの実施形態で特に有用である。サイトカインの組み合わせの使用は、リンパ球、特にそこに記載されているようにＴ細胞の生成に特に有利に働く。

いくつかの実施形態では、ステップＤはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＯＫＴ－３抗体またはムロモナブの、培養培地への添加を含み得る。いくつかの実施形態では、ステップＤはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、４－１ＢＢアゴニストの、培養培地への添加を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ステップＤはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＯＸ－４０アゴニストの、培養培地への添加を含み得る。加えて、チアゾリジンジオン化合物などの増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）－ガンマアゴニストを含む、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーターＩ－アルファアゴニストなどの添加剤は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１９／０３０７７９６ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ステップＤ中の培養培地で使用されてもよい。

ステップＥ：ＴＩＬを採取する
第２の拡張ステップ後、細胞が採取され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図１０９に提供されるように、１、２、３、４つ、またはそれ以上の拡張ステップ後に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図１０９に提供されるように、２つの拡張ステップ後に採取される。

ＴＩＬは、任意の適切な滅菌様式で、例えば、遠心分離によって採取され得る。ＴＩＬを採取するための方法は、当該技術分野で周知であり、いずれかのかかる既知の方法が本プロセスで用いられ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、自動化システムを使用して採取される。

いくつかの実施形態では、拡張ステップの後、ＴＩＬは、濃縮されてもよい。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、体積低下プロセスを介して濃縮される。いくつかの実施形態では、採取は、ＴＩＬを濃縮するために、ＴＩＬを液体（例えば、細胞培養培地）に懸濁させて細胞懸濁液を形成し、続いて体積低下プロセスを行うことを含む。いくつかの実施形態では、体積低下プロセスは、細胞培養デバイス３００を利用してもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００を利用して、液体の一部を細胞懸濁液から分離する。いくつかの実施形態では、例えば、図１３６Ａ～１３６Ｄに図示されるものと同様のプロセスを使用して、体積低下を行ってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、第１の容器（例えば、組織培養デバイス１００）内の液体中に懸濁され、次いで、体積低下のために、第１の容器から細胞培養デバイス３００に運ばれてもよい。他の実施形態では、ＴＩＬは、細胞培養デバイス３００内で拡張されてもよく、次いで、その後に同じ細胞培養デバイス３００を使用して体積を低下させてもよい（例えば、図１３９Ａ～１４４Ｂに関連して説明されるように）。

細胞採取機及び／または細胞処理システムは、例えば、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｔｏｍｔｅｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、及びＩｎｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む、様々な供給源から市販されている。任意の細胞ベースの採取機が本方法とともに用いられ得る。いくつかの実施形態では、細胞採取機及び／または細胞処理システムは、膜ベースの細胞採取機である。いくつかの実施形態では、細胞採取は、ＬＯＶＯシステム（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉによって製造されたもの）などの細胞処理システムによるものである。「ＬＯＶＯ細胞処理システム」という用語は、細胞を含む溶液を、滅菌及び／または閉鎖系環境で回転膜または回転フィルターなどの膜またはフィルターをとおしてポンプ輸送し、連続フローを可能にし、細胞を処理して、ペレット化せずに上清または細胞培養培地を除去する、任意のベンダーによって製造された任意の機器または装置も指す。いくつかの実施形態では、細胞採取機及び／または細胞処理システムは、滅菌閉鎖系内で、細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／または他の細胞処理ステップを行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＬＯＶＯ細胞処理システムの使用前に、細胞培養デバイス３００を介して体積低下を受ける。

いくつかの実施形態では、採取、例えば、図１０９によるステップＥは、閉鎖系バイオリアクターから行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０またはＧ－ＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。

いくつかの実施形態では、図１０９によるステップＥは、本明細書に記載のプロセスに従って行われる。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、閉鎖系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。いくつかの実施形態では、実施例に記載の閉鎖系が用いられる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、実施例に記載の方法に従って採取される。いくつかの実施形態では、１日目～１１日目の間のＴＩＬは、実施例における１１日目のＴＩＬ採取のような、本明細書で言及されるステップにおいて記載される方法を使用して採取される。いくつかの実施形態では、１２日目～２４日目の間のＴＩＬは、実施例における２２日目のＴＩＬ採取のような、本明細書で言及されるステップにおいて記載される方法を使用して採取される。いくつかの実施形態では、１２日目～２２日目の間のＴＩＬは、実施例における２２日目のＴＩＬ採取のような、本明細書で言及されるステップにおいて記載される方法を使用して採取される。

ステップＦ：最終製剤及び輸液容器への移行
図１０９に例示的な順序で提供され、かつ上及び本明細書で詳細に概説されるステップＡ～Ｅが完了した後、細胞は、注入バッグまたは無菌バイアルなどの患者への投与に使用するために容器に移される。いくつかの実施形態では、治療上十分な数のＴＩＬが上記の拡張方法を使用して取得されると、それらは、患者への投与に使用するために容器に移される。いくつかの実施形態では、ステップＥで採取されたＴＩＬの効力及び／または機能性は、任意選択で、患者への投与に使用するために容器に移す前に検査されてもよい。

いくつかの実施形態では、本開示のＡＰＣを使用して拡張されたＴＩＬは、薬学的組成物として患者に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬ懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡張されたＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が含まれる。

Ｇｅｎ３ ＴＩＬ製造プロセス
いかなる特定の理論にも限定されることなく、本発明の方法に記載される、Ｔ細胞の活性化をプライミングする、プライミングによる第１の拡張と、それに続くＴ細胞の活性化を促進する急速な第２の拡張により、「より若い」表現型を保持する拡張されたＴ細胞の調製が可能になると考えられ、したがって、本発明の拡張されたＴ細胞が、他の方法によって拡張されたＴ細胞よりも高いがん細胞に対する細胞傷害性を示すことが予想される。特に、本発明の方法によって教示される、抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）、ＩＬ－２、及び任意選択で抗原提示細胞（ＡＰＣ）への曝露によってプライミングされ、その後、追加の抗ＣＤ－３抗体（例えば、ＯＫＴ－３）、ＩＬ－２、及びＡＰＣへのその後の曝露によって促進されるＴ細胞の活性化が、培養下でＴ細胞の成熟を限定または回避し、成熟度の低い表現型を有するＴ細胞集団を産生し、これらのＴ細胞が、培養下での拡張によってあまり疲弊せず、より高いがん細胞に対する細胞傷害性を示すと考えられる。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）Ｔ細胞を、組織培養デバイスの第１の容器（例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳ容器）、または組織培養デバイスの第１の区画内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養でのＴ細胞を、第１の容器よりも大きい第２の容器（例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００ ＭＣＳ容器に、または第１の区画よりも大きな細胞表面積を有する組織培養デバイスの第２の区画に移し、小規模培養からのＴ細胞を、第２の容器、または第２の区画において、より大規模な培養で約４～７日間培養することとによって、培養のスケールアップを達成する。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）Ｔ細胞を、組織培養デバイスの第１の容器（例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳ容器）、または組織培養デバイスの第１の区画内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養でのＴ細胞を、細胞培養領域を調整可能である第２の容器に移し、小規模培養からのＴ細胞を、第２の容器、または第２の区画において、より大規模な培養で約４～７日間培養することとによって、培養のスケールアップを達成する。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）Ｔ細胞を、組織培養デバイスの第１の容器、または組織培養デバイスの第１の区画内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）細胞を第２の容器に移す前に、小規模培養からのＴ細胞を、細胞培養領域を調整可能であり、かつ小規模培養における細胞の数えあげに基づき調整される第２の容器に移し、小規模培養からのＴ細胞を、第２の容器、または第２の区画において、より大規模な培養で約４～７日間培養することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成する。いくつかの実施形態では、第２の容器は、細胞培養デバイス３００である（例えば、１３０Ａ～１４４Ｂのうちの１つ以上に示されるように）。いくつかの実施形態では、小規模培養からのＴＩＬが、細胞培養デバイス３００に移され、その中で培養されてもよい。細胞培養デバイス３００のサイズは、第１の容器のサイズよりも大きいように選択されてもよい。例えば、第１の容器は、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳ容器のサイズであってもよく、一方で、細胞培養デバイス３００のサイズは、少なくとも細胞培養体積及び／または細胞培養表面積におけるＧ－ＲＥＸ－５００ ＭＣＳ容器のサイズであってもよい。

いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）Ｔ細胞を、第１の容器（例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳ容器）での第１の小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）第１の小規模培養からのＴ細胞を、第１の容器にサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器（例えば、細胞培養デバイス３００）に移して、配分することとによって培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された第１の小規模培養からのＴ細胞の一部が、第２の小規模培養で約４～７日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）Ｔ細胞を、第１の容器（例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳ容器）での小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からのＴ細胞を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器（例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳ容器及び／または細胞培養デバイス３００）に移して、配分することとによって培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小規模培養からのＴ細胞の一部が、より大規模な培養で約４～７日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）Ｔ細胞を、第１の容器（例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳ容器）での小規模培養で約４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からのＴ細胞を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器（例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳ容器及び／または細胞培養デバイス３００）に移して、配分することとによって培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器において、そのような第２の容器に移された小規模培養からのＴ細胞の一部が、より大規模な培養で約５日間の期間培養される。

いくつかの実施形態では、急速拡張の分割時に、各第２の容器は、少なくとも１０^８個のＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、急速拡張の分割時に、各第２の容器は、少なくとも１０^８個のＴＩＬ、少なくとも１０^９個のＴＩＬ、または少なくとも１０^１０個のＴＩＬを含む。例示的な一実施形態では、各第２の容器は、少なくとも１０^１０個のＴＩＬを含む。

いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、複数の亜集団に配分される。いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、複数の約２～５亜集団に配分される。いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、複数の約２、３、４、または５亜集団に配分される。

いくつかの実施形態では、急速拡張の完了後、複数の亜集団は、治療有効量のＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、急速拡張の完了後、１つ以上のＴＩＬの亜集団を一緒にプールして、治療有効量のＴＩＬを産生する。いくつかの実施形態では、急速拡張の完了後、ＴＩＬの各亜集団は、治療有効量のＴＩＬを含む。

いくつかの実施形態では、急速拡張は、複数のステップに分割される前に、約１～５日間の期間行われる。いくつかの実施形態では、急速拡張の分割は、急速拡張の開始後約１日目、２日目、３日目、４日目、または５日目に起こる。

いくつかの実施形態では、急速拡張の分割は、第１の拡張（すなわち、ＲＥＰ前拡張）の開始後約８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、または１３日目に起こる。例示的な一実施形態では、急速拡張の分割は、プライミングによる第１の拡張の開始後約１０日目に起こる。例示的な一実施形態では、急速拡張の分裂は、第１の拡張の開始後約１１日目に起こる。

いくつかの実施形態では、急速拡張は、分割した後に約４～１１日間の期間、さらに行われる。いくつかの実施形態では、急速拡張は、分裂後約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日間、さらに行われる。

いくつかの実施形態では、分割前の急速拡張に使用される細胞培養培地は、分割後の急速拡張に使用される細胞培養培地と同じ構成要素を含む。いくつかの実施形態では、分裂前の急速拡張に使用される細胞培養培地は、分裂後の急速拡張に使用される細胞培養培地とは異なる構成要素を含む。

いくつかの実施形態では、分裂前の急速拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及びさらに任意選択でＡＰＣを含む。いくつかの実施形態では、分裂前の急速拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びさらに任意選択でＡＰＣを含む。いくつかの実施形態では、分裂前の急速拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む。

いくつかの実施形態では、分裂前の急速拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地に、ＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３及びさらに任意選択でＡＰＣを含む新鮮培養培地を補充することによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂前の急速拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む新鮮な培養培地で補充することによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂前の急速拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３及びさらに任意選択でＡＰＣを含む新鮮な培養培地で置き換えることによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂前の急速拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む新鮮な細胞培養培地で置き換えることによって生成される。

いくつかの実施形態では、分裂後の急速拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、及び任意選択でＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、分裂後の急速拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、分裂後の急速拡張に使用される細胞培養培地は、分裂前の急速拡張に使用される細胞培養培地を、ＩＬ－２及び任意選択でＯＫＴ－３を含む新鮮な培養培地で置き換えることによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂後の急速拡張に使用される細胞培養培地は、分裂前の急速拡張に使用される細胞培養培地を、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む新鮮な培養培地で置き換えることによって生成される。

いくつかの実施形態では、急速拡張の分裂は、閉鎖系において起こる。

いくつかの実施形態では、急速拡張中のＴＩＬ培養物のスケールアップは、新鮮細胞培養培地をＴＩＬ培養物に添加すること（ＴＩＬを供給することとも称される）を含む。いくつかの実施形態では、供給は、新鮮な細胞培養培地をＴＩＬ培養物に頻繁に添加することを含む。いくつかの実施形態では、供給は、新鮮な細胞培養培地をＴＩＬ培養物に一定の間隔で添加することを含む。いくつかの実施形態では、新鮮な細胞培養培地は、一定の流れを介してＴＩＬに供給される。いくつかの実施形態では、Ｘｕｒｉ Ｗ２５などの自動化された細胞拡張システムは、急速拡張及び供給のために使用される。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が減少、軽減、衰退、または沈静化し始めた後に行われる。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が、正確にまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％減少した後に行われる。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が、正確にまたは約１％～１００％の範囲のパーセンテージ減少した後に行われる。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が、正確にまたは約１％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、または９０％～１００％の範囲のパーセンテージ減少した後に行われる。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が、少なくとも正確にまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％減少した後に行われる。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化が、最大で正確にまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％減少した後に行われる。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張によってもたらされるＴ細胞の活性化の減少は、抗原による刺激に応答してＴ細胞によって放出されるインターフェロンガンマの量の減少によって決定される。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、最大で正確にまたは約７日または約８日の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、最大で正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、最大で正確にまたは約１１日の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、最大で正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、正確にまたは約１日間～正確にまたは約７日間の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、正確にまたは約１日間～正確にまたは約１１日間の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、最大で正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、最大で正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、正確にまたは約１日間～正確にまたは約８日間の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、正確にまたは約１日間～正確にまたは約９日間の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、８日間の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、９日間の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、正確にまたは約１日間～正確にまたは約７日間の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、正確にまたは約１日間～正確にまたは約９日間の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプライミングによる第１の拡張は、７日間の期間中に行われ、Ｔ細胞の急速な第２の拡張は、９日間の期間中に行われる。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）である。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）である。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、がんに罹患しているドナーから取得される。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、がんに罹患している患者から切除された腫瘍から取得されたＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、血液系悪性腫瘍に罹患している患者の骨髄から取得されたＭＩＬである。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から取得されたＰＢＬである。いくつかの実施形態では、ドナーは、がんに罹患している。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択されるがんである。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ドナーは、腫瘍に罹患している。いくつかの実施形態では、腫瘍は、液体腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、ドナーは、血液系悪性腫瘍に罹患している。

本開示の特定の態様では、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ分離などの当業者に知られている任意の数の技法を使用して対象から収集された血液の単位から得ることができる。好ましい一態様では、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって取得される。アフェレーシス産物は、典型的には、リンパ球、例えば、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、血小板を含む。一態様では、アフェレーシスによって収集された細胞が洗浄されて、血漿画分が除去され、任意選択で、その後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れられ得る。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。代替の実施形態では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るか、またはすべてではないが多くの二価カチオンを欠き得る。一態様では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、かつ単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ勾配による遠心分離によって、または対向流遠心溶出法によって末梢血リンパ球から単離される。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ドナー由来のリンパ球が濃縮された全血またはアフェレーシス産物から分離されたＰＢＬである。いくつかの実施形態では、ドナーは、がんに罹患している。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択されるがんである。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ドナーは、腫瘍に罹患している。いくつかの実施形態では、腫瘍は、液体腫瘍である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、ドナーは、血液系悪性腫瘍に罹患している。いくつかの実施形態では、ＰＢＬは、正または負の選択法を使用することによって、すなわち、Ｔ細胞表現型について、マーカー（複数可）、例えば、ＣＤ３＋ＣＤ４５＋を使用してＰＢＬを除去することによって、または非Ｔ細胞表現型細胞を除去してＰＢＬを残すことによって、リンパ球が濃縮された全血またはアフェレーシス産物から単離される。他の実施形態では、ＰＢＬは、勾配遠心分離によって単離される。ドナー組織からＰＢＬを単離した時点で、ＰＢＬのプライミングによる第１の拡張は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかのプライミングによる第１の拡張ステップに従って、プライミングによる第１の拡張培養下で好適な数の単離されたＰＢＬ（いくつかの実施形態では、およそ１×１０^７ＰＢＬ）を播種することによって開始され得る。

これらの特徴のうちのいくつかを含む、プロセス３として知られる（本明細書ではＧｅｎ３とも称される）例示的なＴＩＬプロセスは、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示され、本発明のこの実施形態の、Ｇｅｎ２を超える利点のうちのいくつかが、図１、２、３０、及び３１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に記載される。プロセス３の２つの実施形態が、図１及び３０（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されている。プロセス２ＡまたはＧｅｎ２またはＧｅｎ２Ａはまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１８／０２８０４３６号にも記載されている。Ｇｅｎ３プロセスはまた、国際特許公開第ＷＯ２０２０／０９６９８８号に記載されている。

本明細書で考察され、かつ一般に概説されるように、ＴＩＬは、患者試料から採取され、本明細書に記載され、かつＧｅｎ３と称されるＴＩＬ拡張プロセスを使用して患者に移植する前に、それらの数を拡張するように操作される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、以下で考察されるように、任意で遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、拡張前または拡張後に凍結保存され得る。解凍した時点で、それらが再刺激されて、患者への注入前に代謝を高めることができる。

いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図において詳細に考察されるように、プライミングによる第１の拡張（本明細書でプレ急速拡張（ＲＥＰ前）と称されるプロセス、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～８日間に短縮され、急速な第２の拡張（本明細書で急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～９日間に短縮される。いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図において詳細に考察されるように、プライミングによる第１の拡張（本明細書でプレ急速拡張（ＲＥＰ前）と称されるプロセス、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～８日間に短縮され、急速な第２の拡張（本明細書で急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～８日間に短縮される。いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図において詳細に考察されるように、プライミングによる第１の拡張（本明細書でプレ急速拡張（ＲＥＰ前）と称されるプロセス、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～７日間に短縮され、急速な第２の拡張（本明細書で急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～９日間に短縮される。いくつかの実施形態では、以下ならびに実施例及び図において詳細に考察されるように、プライミングによる第１の拡張（本明細書でプレ急速拡張（ＲＥＰ前）と称されるプロセス、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）にステップＢとして示されるプロセスを含む）は、１～７日間であり、急速な第２の拡張（本明細書で急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）と称されるプロセス、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）にステップＤとして示されるプロセスを含む）は、１～１０日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢとして記載される拡張）は、８日間に短縮され、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＤとして記載される拡張）は、７～９日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢとして記載される拡張）は、８日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＤとして記載される拡張）は、８～９日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢとして記載される拡張）は、７日間に短縮され、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＤとして記載される拡張）は、７～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢとして記載される拡張）は、８日間に短縮され、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＤとして記載される拡張）は、８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢとして記載される拡張）は、８日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＤとして記載される拡張）は、９日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢとして記載される拡張）は、８日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＤとして記載される拡張）は、１０日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢとして記載される拡張）は、７日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＤとして記載される拡張）は、７～１０日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢとして記載される拡張）は、７日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＤとして記載される拡張）は、８～１０日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢとして記載される拡張）は、７日間であり、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＤとして記載される拡張）は、９～１０日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢとして記載される拡張）は、７日間に短縮され、急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＤとして記載される拡張）は、７～９日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張及び急速な第２の拡張の組み合わせ（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）においてステップＢ及びステップＤとして記載される拡張）は、以下ならびに実施例及び図面において詳細に考察されるように、１４～１６日間である。特に、本発明の特定の実施形態が、ＩＬ－２の存在下での抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ－３への曝露、または少なくともＩＬ－２及び抗ＣＤ３抗体、例えば、ＯＫＴ－３の存在下での抗原への曝露によってＴＩＬが活性化される、プライミングによる第１の拡張ステップを含むと考えられる。特定の実施形態では、上記のようにプライミングによる第１の拡張ステップで活性化されるＴＩＬは、第１のＴＩＬ集団であり、すなわち、一次細胞集団である。

以下の「ステップ」表記Ａ、Ｂ、Ｃなどは、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）における非限定的な例を参照し、本明細書に記載される特定の非限定的な実施形態を参照している。以下及び図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）におけるステップの順序は例示であり、ステップの任意の組み合わせまたは順序、ならびに追加のステップ、ステップの繰り返し、及び／またはステップの省略は、本出願及び本明細書に開示される方法によって企図される。

ステップＡ：患者の腫瘍試料を取得する
一般に、ＴＩＬは、最初に患者の腫瘍試料（「一次ＴＩＬ」）から、またはＴＩＬ様の特徴を有する末梢血リンパ球を含む末梢血リンパ球などの循環リンパ球から得られ、その後、本明細書に記載されるように、さらなる操作のためにより大きな集団に拡張され、任意選択で凍結保存され、任意選択でＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータについて評価される。

患者の腫瘍試料は、一般に、外科的切除、針生検、または腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を得るための他の手段により、当該技術分野で知られている方法を使用して得ることができる。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍、または転移性腫瘍を含む、任意の固形腫瘍に由来し得る。腫瘍試料は、血液系悪性腫瘍から取得された腫瘍などの液体腫瘍であり得る。固形腫瘍は、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌、及び皮膚癌を含むが、これらに限定されない（扁平上皮癌、基底細胞癌、及び黒色腫を含むが、これらに限定されない）、任意の種類のがんであり得る。いくつかの実施形態では、がんは、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、胃腸癌、卵巣癌、肉腫、膵臓癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌から選択される。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫である。いくつかの実施形態では、悪性黒色腫腫瘍が特に高レベルのＴＩＬを有することが報告されているため、有用なＴＩＬは、悪性黒色腫腫瘍から取得される。

取得された時点で、腫瘍試料は、一般に、鋭的解剖を使用して１～約８ｍｍ^３の小片に断片化され、約２～３ｍｍ^３が特に有用である。ＴＩＬは、酵素腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。かかる腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（例えば、組織解離機を使用する）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地に入れ、腫瘍をおよそ１分間機械的に解離させ、その後、５％ＣＯ_２中３７°Ｃで３０分間インキュベートし、続いて、小さい組織片しか存在しなくなるまで、前述の条件下で機械的解離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことによって産生され得る。このプロセスの最後に、細胞懸濁液中に多数の赤血球または死細胞が含まれている場合、ＦＩＣＯＬＬ分岐親水性多糖類を使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなどの当該技術分野で知られている代替の方法を使用することができる。前述の方法のうちのいずれかが、ＴＩＬを拡張する方法またはがんを治療する方法について本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかにおいて使用され得る。

上に示されるように、いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、固形腫瘍に由来する。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、断片化されない。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は断片化されず、全腫瘍として酵素消化に供される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２で消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅ、及びヒアルロニダーゼを含む酵素混合物中で１～２時間、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２で回転を伴って消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、一定の回転を伴って一晩消化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、３７°Ｃ、５％ＣＯ_２で一定の回転を伴って一晩消化される。いくつかの実施形態では、全腫瘍が酵素と組み合わされて、腫瘍消化反応混合物が形成される。

いくつかの実施形態では、腫瘍は、滅菌緩衝液中の凍結乾燥酵素で再構成される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、滅菌ＨＢＳＳである。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、コラゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＩＶである。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼの作業ストックは、１００ｍｇ／ｍＬの１０倍作業ストックである。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、ＤＮＡｓｅを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅの作業ストックは、１０，０００ＩＵ／ｍＬの１０倍作業ストックである。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、ヒアルロニダーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヒアルロニダーゼの作業ストックは、１０ｍｇ／ｍＬの１０倍作業ストックである。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、１０００ＩＵ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、１０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ、５００ＩＵ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼを含む。

一般に、腫瘍から取得された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに取得された」または「新たに単離された」細胞集団と呼ばれる。ある特定の実施形態では、新たに取得されたＴＩＬ細胞集団は、抗原提示細胞、ＩＬ－１２、及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地に曝露される。

いくつかの実施形態では、断片化には、例えば、解剖及び消化を含む物理的断片化が含まれる。いくつかの実施形態では、断片化は、物理的断片化である。いくつかの実施形態では、断片化は、解剖である。いくつかの実施形態では、断片化は、消化によるものである。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、最初に、患者から取得された酵素腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、最初に、患者から取得された酵素腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養され得る。

腫瘍が固形腫瘍であるいくつかの実施形態では、腫瘍試料が、例えば、ステップＡ（図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）で提供されるような）で取得された後、腫瘍は物理的断片化を受ける。いくつかの実施形態では、断片化は、凍結保存前に起こる。いくつかの実施形態では、断片化は、凍結保存後に起こる。いくつかの実施形態では、断片化は、腫瘍を得た後に、いずれの凍結保存もない場合に起こる。いくつかの実施形態では、断片化ステップは、インビトロまたはエクスビボプロセスである。いくつかの実施形態では、腫瘍が断片化され、１０、２０、３０、４０個、またはそれ以上の断片または小片が、プライミングによる第１の拡張のために各容器に入れられる。いくつかの実施形態では、腫瘍が断片化され、３０個または４０個の断片または小片が、プライミングによる第１の拡張のために各容器に入れられる。いくつかの実施形態では、腫瘍が断片化され、４０個の断片または小片が、プライミングによる第１の拡張のために各容器に入れられる。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約４～約５０個の断片を含み、各断片は、約２７ｍｍ^３の体積を有する。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１３００ｍｍ^３～約１５００ｍｍ^３の総体積を伴う約３０～約６０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１３５０ｍｍ^３の総体積を伴う約５０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約１グラム～約１．５グラムの総質量を伴う約５０個の断片を含む。いくつかの実施形態では、複数の断片は、約４個の断片を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍断片から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、鋭的解剖によって取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ^３～１０ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ^３～８ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約２ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約３ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約４ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約５ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約６ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約７ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約８ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約９ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１０ｍｍ^３である。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、１～４ｍｍ×１～４ｍｍ×１～４ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、１ｍｍ×１ｍｍ×１ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、２ｍｍ×２ｍｍ×２ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍである。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、４ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍである。

いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の出血性、壊死性、及び／または脂肪性組織の量を最小限に抑えるために断片化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の出血性組織の量を最小限に抑えるために断片化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の壊死性組織の量を最小限に抑えるために断片化される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、各小片上の脂肪性組織の量を最小限に抑えるために断片化される。ある特定の実施形態では、腫瘍の断片化ステップは、インビトロまたはエクスビボ方法である。

いくつかの実施形態では、腫瘍の断片化は、腫瘍の内部構造を維持するために行われる。いくつかの実施形態では、腫瘍の断片化は、メスでのこ引き動作を行うことなく行われる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍消化物から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、例えば、ＲＰＭＩ １６４０（２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）であるが、これに限定されない酵素培地中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって生成された。腫瘍を酵素培地に入れた後、腫瘍は、およそ１分間機械的に解離され得る。その後、溶液が５％ＣＯ_２中３７°Ｃで３０分間インキュベートされ、その後、およそ１分間再び機械的に破壊され得る。５％ＣＯ_２中３７°Ｃで３０分間再びインキュベートした後、腫瘍は、３回目の機械的破壊がおよそ１分間行われ得る。いくつかの実施形態では、大きい組織片が存在する場合、３回目の機械的破壊後、５％ＣＯ_２中３７°Ｃでさらに３０分間インキュベートするかにかかわらず、１回または２回の追加の機械的解離が試料に適用された。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含む場合、最終インキュベーションの終わりに、Ｆｉｃｏｌｌを使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張ステップ前の細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに取得された」または「新たに単離された」細胞集団と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、細胞は、試料単離後（例えば、腫瘍試料を取得した後及び／または腫瘍試料から細胞懸濁液を取得した後）、任意選択で凍結されてもよく、ステップＢに記載の拡張に入る前に凍結保存されてもよく、これは以下でさらに詳細に説明されるとともに、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に例示される。

コア／小生検由来のＴＩＬ
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、最初に、コア生検または同様の手順によって取得された患者腫瘍試料（「一次ＴＩＬ」）から得られ、その後、本明細書に記載されるように、さらなる操作のためにより大きい集団に拡張され、任意で凍結保存され、任意で表現型及び代謝パラメータについて評価される。

いくつかの実施形態では、患者の腫瘍試料は、一般に、小生検、コア生検、針生検、または腫瘍細胞とＴＩＬ細胞との混合物を含有する試料を得るための他の手段により、当該技術分野で知られている方法を使用して取得することができる。一般に、腫瘍試料は、原発腫瘍、浸潤性腫瘍、または転移性腫瘍を含む、任意の固形腫瘍に由来し得る。腫瘍試料は、血液系悪性腫瘍から取得された腫瘍などの液体腫瘍であり得る。いくつかの実施形態では、試料は、複数の小さい腫瘍試料または生検に由来し得る。いくつかの実施形態では、試料は、同じ患者由来の単一の腫瘍からの複数の腫瘍試料を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料は、同じ患者由来の１、２、３、または４つの腫瘍からの複数の腫瘍試料を含むことができる。いくつかの実施形態では、試料は、同じ患者由来の複数の腫瘍からの複数の腫瘍試料を含むことができる。固形腫瘍は、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌、及び皮膚癌を含むが、これらに限定されない（扁平上皮癌、基底細胞癌、及び黒色腫を含むが、これらに限定されない）、任意の種類のがんであり得る。いくつかの実施形態では、がんは、子宮頸癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、胃腸癌、卵巣癌、肉腫、膵臓癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び／または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）から選択される。いくつかの実施形態では、悪性黒色腫腫瘍が特に高レベルのＴＩＬを有することが報告されているため、有用なＴＩＬは、悪性黒色腫腫瘍から取得される。

一般に、腫瘍コアまたは断片から取得された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに取得された」または「新たに単離された」細胞集団と呼ばれる。ある特定の実施形態では、新たに取得されたＴＩＬ細胞集団は、抗原提示細胞、ＩＬ－２、及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地に曝露される。

いくつかの実施形態では、腫瘍が転移性であり、かつ原発性病変が過去に効率的に治療／除去された場合、転移性病変のうちの１つの除去が必要とされ得る。いくつかの実施形態では、最も侵襲性の低いアプローチは、皮膚病変、または利用可能な場合、首または腋窩領域のリンパ節を除去することである。いくつかの実施形態では、皮膚病変が除去されるか、またはその小生検が除去される。いくつかの実施形態では、リンパ節またはその小生検が除去される。いくつかの実施形態では、肺もしくは肝臓の転移性病変、または腹腔内リンパ節もしくは胸部リンパ節、または小生検が、それらのものであってもよく、使用され得る。

いくつかの実施形態では、腫瘍は、黒色腫である。いくつかの実施形態では、黒色腫の小生検は、ほくろまたはその一部分を含む。

いくつかの実施形態では、小生検は、パンチ生検である。いくつかの実施形態では、パンチ生検は、皮膚に押し込まれた円形の刃で取得される。いくつかの実施形態では、パンチ生検は、疑わしいほくろの周りの皮膚に押し込まれた円形の刃で取得される。いくつかの実施形態では、パンチ生検は、皮膚に押し込まれた円形の刃で得られ、丸い皮膚片が採取される。いくつかの実施形態では、小生検は、パンチ生検であり、腫瘍の丸い部分が採取される。

いくつかの実施形態では、小生検は、切除生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、切除生検であり、ほくろまたは増殖全体が除去される。いくつかの実施形態では、小生検は、切除生検であり、ほくろまたは増殖全体が、正常に見える皮膚の小縁とともに除去される。

いくつかの実施形態では、小生検は、切開生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、切開生検であり、ほくろまたは増殖の最も不規則な部分のみが採取される。いくつかの実施形態では、小生検は、切開生検であり、切開生検は、疑わしいほくろが非常に大きい場合など、他の技法を達成することができない場合に使用される。

いくつかの実施形態では、小生検は、肺生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、気管支鏡検査によって取得される。一般に、気管支鏡検査では、患者は麻酔をかけられ、小さい用具が鼻または口を通り、喉を下って気管支通路に入り、そこで小さい用具を使用していくらかの組織を採取する。気管支鏡検査によって腫瘍または成長に到達できないいくつかの実施形態では、経胸腔針生検が用いられ得る。一般に、経胸腔針生検の場合も、患者は麻酔をかけられ、針が皮膚をとおして疑わしい場所に直接挿入されて、小さい組織試料を採取する。いくつかの実施形態では、経胸壁針生検は、介入放射線医学（例えば、針をガイドするためのＸ線またはＣＴ走査の使用）を必要とし得る。いくつかの実施形態では、小生検は、針生検によって取得される。いくつかの実施形態では、小生検は、超音波内視鏡検査によって得られる（例えば、照明を備えた内視鏡であり、口をとおして食道に配置される）。いくつかの実施形態では、小生検は、外科的に取得される。

いくつかの実施形態では、小生検は、頭頸部生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、切開生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、切開生検であり、小さい組織片が異常に見える領域から切り取られる。いくつかの実施形態では、異常な領域に容易にアクセスできる場合、試料は、入院することなく採取され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍が口または喉のより深くにある場合、生検は、全身麻酔を用いて手術室で行われる必要があり得る。いくつかの実施形態では、小生検は、切除生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、全領域が除去される切除生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、細針吸引（ＦＮＡ）である。いくつかの実施形態では、小生検は、細針吸引（ＦＮＡ）であり、シリンジに取り付けられた非常に細い針を使用して、腫瘍または塊から細胞を抽出（吸引）する。いくつかの実施形態では、小生検は、パンチ生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、パンチ生検であり、パンチ鉗子を使用して、疑わしい領域の一片を採取する。

いくつかの実施形態では、小生検は、子宮頸部生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、膣鏡検査によって取得される。一般に、膣鏡検査は、拡大双眼鏡に取り付けられた照明付き拡大器具（膣鏡）の使用を採用し、その後、これを使用して、子宮頸部の表面の小さい切片を生検する。いくつかの実施形態では、小生検は、円錐切除／錐体生検である。いくつかの実施形態では、小生検は、円錐切除／錐体生検であり、子宮頸部からより大きい組織片を採取するために外来手術が必要になる場合がある。いくつかの実施形態では、錐体生検は、診断の確認を助けることに加えて、錐体生検が初期治療となり得る。

「固形腫瘍」という用語は、通常、嚢胞または液体領域を含まない異常な組織塊を指す。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。「固形腫瘍癌」という用語は、悪性、腫瘍性、またはがん性の固形腫瘍を指す。固形腫瘍癌には、肉腫、癌腫、及びリンパ腫、例えば、肺癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、及び膀胱癌が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、がんは、子宮頸癌、頭頸部癌、神経膠芽細胞腫、卵巣癌、肉腫、膵臓癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、及び非小細胞肺癌から選択される。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫である。いくつかの実施形態では、がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。固形腫瘍の組織構造には、実質（がん細胞）を含む相互依存的組織区画、及びがん細胞が分散しており、かつ支持微小環境を提供し得る支持間質細胞が含まれる。

いくつかの実施形態では、腫瘍由来の試料は、細針吸引物（ＦＮＡ）、コア生検、小生検（例えば、パンチ生検を含む）として取得される。いくつかの実施形態では、試料は、最初に、１０ｃｍ^２の細胞培養表面積を有する第１の容器または第１の区画に入れられる。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのコア生検及び／または小生検試料が存在する場合、試料は、最初に、１０ｃｍ^２の細胞培養表面積を有する第１の容器または第１の区画に入れられる。いくつかの実施形態では、３、４、５、６、８、９、または１０個以上のコア生検及び／または小生検試料が存在する場合、試料は、最初に、１００ｃｍ^２の細胞培養表面積を有する第１の容器または第１の区画に入れられる。いくつかの実施形態では、３、４、５、６、８、９、または１０個以上のコア生検及び／または小生検試料が存在する場合、試料は、最初に、５００ｃｍ^２の細胞培養表面積を有する第１の容器または第１の区画に入れられる。

ＦＮＡは、肺、黒色腫、頭頸部、子宮頸部、卵巣、膵臓、神経膠芽腫、結腸直腸、及び肉腫からなる群から選択される腫瘍から取得することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮＡは、例えば、黒色腫を含む皮膚腫瘍から取得することができる。いくつかの実施形態では、ＦＮＡは、転移性黒色腫を有する患者からの皮膚腫瘍などの皮膚腫瘍から取得される。いくつかの事例では、黒色腫を有する患者は、外科的治療を以前に受けたことがある。いくつかの実施形態では、ＦＮＡは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者からの肺腫瘍など、例えばＮＳＣＬＣを含む肺腫瘍から取得される。いくつかの事例では、ＮＳＣＬＣを有する患者は、外科的治療を以前に受けたことがある。

本明細書に記載のＴＩＬは、ＦＮＡ試料から得られ得る。いくつかの事例では、ＦＮＡ試料は、１８ゲージ針～２５ゲージ針の範囲の細いゲージ針を使用して、患者から得られるか、または単離される。細いゲージ針は、１８ゲージ、１９ゲージ、２０ゲージ、２１ゲージ、２２ゲージ、２３ゲージ、２４ゲージ、または２５ゲージであり得る。いくつかの実施形態では、患者由来のＦＮＡ試料は、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ、またはそれ以上を含み得る。

いくつかの事例では、本明細書に記載のＴＩＬは、コア生検試料から取得される。いくつかの事例では、コア生検試料は、１１ゲージ針～１６ゲージ針の範囲の外科用または医療用針を使用して、患者から得られるか、または単離される。針は、１１ゲージ、１２ゲージ、１３ゲージ、１４ゲージ、１５ゲージ、または１６ゲージであり得る。いくつかの実施形態では、患者由来のコア生検試料は、少なくとも４００，０００個のＴＩＬ、例えば、４００，０００個のＴＩＬ、４５０，０００個のＴＩＬ、５００，０００個のＴＩＬ、５５０，０００個のＴＩＬ、６００，０００個のＴＩＬ、６５０，０００個のＴＩＬ、７００，０００個のＴＩＬ、７５０，０００個のＴＩＬ、８００，０００個のＴＩＬ、８５０，０００個のＴＩＬ、９００，０００個のＴＩＬ、９５０，０００個のＴＩＬ、またはそれ以上を含み得る。

一般に、採取された細胞懸濁液は、「一次細胞集団」または「新たに採取された」細胞集団と呼ばれる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍消化物から得られない。いくつかの実施形態では、固形腫瘍コアは、断片化されない。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、腫瘍消化物から取得される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、例えば、ＲＰＭＩ １６４０（２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ）であるが、これに限定されない酵素培地中でのインキュベーション、続いて、機械的解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって生成された。腫瘍を酵素培地に入れた後、腫瘍は、およそ１分間機械的に解離され得る。その後、溶液が５％ＣＯ_２中３７°Ｃで３０分間インキュベートされ、その後、およそ１分間再び機械的に破壊され得る。５％ＣＯ_２中３７°Ｃで３０分間再びインキュベートした後、腫瘍は、３回目の機械的破壊がおよそ１分間行われ得る。いくつかの実施形態では、大きい組織片が存在する場合、３回目の機械的破壊後、５％ＣＯ_２中３７°Ｃでさらに３０分間インキュベートするかにかかわらず、１回または２回の追加の機械的解離が試料に適用された。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液が多数の赤血球または死細胞を含む場合、最終インキュベーションの終わりに、Ｆｉｃｏｌｌを使用した密度勾配分離が行われて、これらの細胞を除去することができる。

いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ集団を取得することは、多病変サンプリング法を含む。

腫瘍解離酵素混合物には、１つ以上の解離（消化）酵素、例えば、限定されないが、コラゲナーゼ（任意のブレンドまたはコラゲナーゼの種類を含む）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）、ヒアルロニダーゼ、中性プロテアーゼ（ディスパーゼ）、キモトリプシン、キモパパイン、トリプシン、カゼイナーゼ、エラスターゼ、パパイン、ＸＩＶ型プロテアーゼ（プロナーゼ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）、トリプシン阻害剤、任意の他の解離酵素またはタンパク質分解酵素、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。

いくつかの実施形態では、解離酵素は、凍結乾燥酵素から再構成される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥酵素は、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）などの滅菌緩衝液の量で再構成される。

いくつかの事例では、コラゲナーゼ（アニマルフリー１型コラゲナーゼなど）を、１０ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液で再構成する。凍結乾燥ストック酵素は、２８９２ＰＺ Ｕ／バイアルの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、コラゲナーゼは、５ｍＬ～１５ｍＬの緩衝液中で再構成される。いくつかの実施形態では、再構成後のコラゲナーゼストックは、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬの範囲、例えば、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約３５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約３００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ～約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約１５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２１０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２２０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２３０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２４０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２６０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２７０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２８０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約２８９．２ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約３００ＰＺ Ｕ／ｍＬ、約３５０ＰＺ Ｕ／ｍＬ、または約４００ＰＺ Ｕ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、中性プロテアーゼは、１ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液中で再構成される。凍結乾燥ストック酵素は、１７５ＤＭＣ Ｕ／バイアルの濃度であり得る。いくつかの実施形態では、再構成後の中性プロテアーゼストックは、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬの範囲、例えば、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約３５０ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ～約３００ＤＭＣ／ｍＬ、約１５０ＤＭＣ／ｍＬ～約４００ＤＭＣ／ｍＬ、約１００ＤＭＣ／ｍＬ、約１１０ＤＭＣ／ｍＬ、約１２０ＤＭＣ／ｍＬ、約１３０ＤＭＣ／ｍＬ、約１４０ＤＭＣ／ｍＬ、約１５０ＤＭＣ／ｍＬ、約１６０ＤＭＣ／ｍＬ、約１７０ＤＭＣ／ｍＬ、約１７５ＤＭＣ／ｍＬ、約１８０ＤＭＣ／ｍＬ、約１９０ＤＭＣ／ｍＬ、約２００ＤＭＣ／ｍＬ、約２５０ＤＭＣ／ｍＬ、約３００ＤＭＣ／ｍＬ、約３５０ＤＭＣ／ｍＬ、または約４００ＤＭＣ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、ＤＮＡｓｅ Ｉは、１ｍＬの滅菌ＨＢＳＳまたは別の緩衝液中で再構成される。凍結乾燥したストック酵素は、４ＫＵ／バイアルの濃度であった。いくつかの実施形態では、再構成後のＤＮａｓｅ Ｉストックは、約１ＫＵ／ｍＬ～１０ＫＵ／ｍＬ、例えば、約１ＫＵ／ｍＬ、約２ＫＵ／ｍＬ、約３ＫＵ／ｍＬ、約４ＫＵ／ｍＬ、約５ＫＵ／ｍＬ、約６ＫＵ／ｍＬ、約７ＫＵ／ｍＬ、約８ＫＵ／ｍＬ、約９ＫＵ／ｍＬ、または約１０ＫＵ／ｍＬの範囲である。

いくつかの実施形態では、酵素のストックは変化する可能性があるため、凍結乾燥ストックの濃度を確認し、それに応じて消化カクテルに添加される酵素の最終量を修正する。

いくつかの実施形態では、酵素混合物は、約４．７ｍｌの滅菌ＨＢＳＳ中に約１０．２ｕｌの中性プロテアーゼ（０．３６ＤＭＣ Ｕ／ｍＬ）、２１．３ｕｌのコラゲナーゼ（１．２ＰＺ／ｍＬ）及び２５０ｕｌのＤＮＡｓｅ Ｉ（２００Ｕ／ｍＬ）を含む。

胸水Ｔ細胞及びＴＩＬ
いくつかの実施形態では、試料は、胸腔内液試料である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセスによる拡張のためのＴ細胞またはＴＩＬの供給源は、胸腔内液試料である。いくつかの実施形態では、試料は、胸水由来試料である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセスによる拡張のためのＴＩＬの供給源は、胸水由来試料である。例えば、米国特許公開第２０１４／０２９５４２６号に記載されている方法を参照されたく、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬと思われる、及び／またはＴＩＬを含む任意の胸腔内液または胸水を利用することができる。かかる試料は、ＮＳＣＬＣもしくはＳＣＬＣなどの原発性または転移性肺癌に由来し得る。いくつかの実施形態では、試料は、別の臓器、例えば、乳房、卵巣、結腸、または前立腺に由来する二次転移性がん細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用する試料は、胸膜浸出液である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用する試料は、胸膜漏出液である。他の生体試料は、例えば、腹部からの腹水または膵嚢胞液を含む、ＴＩＬを含有する他の漿液を含み得る。腹水及び胸腔内液は、非常に類似した化学系を伴い、腹部及び肺の両方が、悪性腫瘍における同じ物質の胸膜空間及び腹部空間に中皮線及び流体形態を有し、いくつかの実施形態では、かかる流体は、ＴＩＬを含有する。本開示が胸水を例示するいくつかの実施形態では、同じ方法が、胸腔内液またはＴＩＬを含有する他の嚢胞液を使用して同様の結果で実行されてもよい。

いくつかの実施形態では、胸腔内液は、患者から直接除去された未処理の形態である。いくつかの実施形態では、未処理の胸腔内液は、接触ステップの前に、ＥＤＴＡまたはヘパリンチューブなどの標準的な採血管に入れられる。いくつかの実施形態では、未処理の胸腔内液は、接触ステップの前に、標準的なＣｅｌｌＳａｖｅ（登録商標）チューブ（Ｖｅｒｉｄｅｘ）に入れられる。いくつかの実施形態では、試料は、生存ＴＩＬの数の減少を避けるために、患者から採取した直後にＣｅｌｌＳａｖｅチューブに入れられる。生存ＴＩＬの数は、４℃であっても、未処理の胸腔内液中に放置されると、２４時間以内に大幅に減少する可能性がある。いくつかの実施形態では、試料は、患者からの除去後１時間、５時間、１０時間、１５時間、または最大２４時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。いくつかの実施形態では、試料は、４°Ｃで、患者からの除去後１時間、５時間、１０時間、１５時間、または最大２４時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。

いくつかの実施形態では、選択された対象からの胸腔内液試料は、希釈され得る。一実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：１０である。他の実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：９である。他の実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：８である。他の実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：５である。他の実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：２である。他の実施形態では、希釈は、希釈液に対する胸腔内液が１：１である。いくつかの実施形態では、希釈剤には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、別の緩衝液、または生理学的に許容される希釈剤が含まれる。いくつかの実施形態では、試料は、患者からの収集及び希釈の直後にＣｅｌｌＳａｖｅチューブ内に入れられ、生存ＴＩＬの減少を回避し、これは、４℃であっても、未処理の胸腔内液中に放置された場合、２４～４８時間以内に有意に生じ得る。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、患者からの除去及び希釈後１時間、５時間、１０時間、１５時間、２４時間、３６時間、最大４８時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、４°Ｃで、患者からの除去及び希釈後１時間、５時間、１０時間、１５時間、２４時間、３６時間、最大４８時間以内に適切な収集チューブ内に入れられる。

さらに他の実施形態では、胸腔内液試料は、さらなる処理ステップの前に、従来の手段によって濃縮される。いくつかの実施形態では、胸腔内液のこの前処理は、方法を実施する実験室への輸送のために、またはその後の分析のために（例えば、採取後２４～４８時間より後に）胸水を凍結保存しなければならない状況において好ましい。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、それが対象から採取された後に胸腔内液試料を遠心分離し、遠心分離物またはペレットを緩衝液中に再懸濁することによって調製される。いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、輸送または後の分析及び／または処理のために凍結保存される前に、複数の遠心分離及び再懸濁に供される。

いくつかの実施形態では、胸腔内液試料は、濾過法を使用することによって、さらなる処理ステップの前に濃縮される。いくつかの実施形態では、接触ステップで使用される胸腔内液試料は、胸腔内液が膜を通過することを可能にするが腫瘍細胞を保持する、既知で本質的に均一な孔径を含むフィルタをとおして流体を濾過することによって調製される。いくつかの実施形態では、膜の細孔の直径は、少なくとも４μＭであり得る。他の実施形態では、細孔直径は、５μＭ以上であってもよく、他の実施形態では、６、７、８、９、または１０μＭのうちのいずれかである。濾過後、膜によって保持されたＴＩＬを含む細胞を、膜から適切な生理学的に許容される緩衝液にすすいでもよい。次いで、このように濃縮されたＴＩＬを含む細胞は、方法の接触ステップで使用することができる。

いくつかの実施形態では、胸腔内液試料（例えば、未処理の胸腔内液を含む）、希釈胸水、または再懸濁細胞ペレットは、試料中に存在する無核赤血球を特異的に溶解する溶解試薬と接触させる。いくつかの実施形態では、このステップは、胸腔内液がかなりの数のＲＢＣを含む状況で、さらなる処理ステップの前に行われる。好適な溶解試薬には、単一の溶解試薬もしくは溶解試薬及びクエンチ試薬、または溶解剤、クエンチ試薬及び固定試薬が含まれる。好適な溶解システムは市販されており、ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ（商標）システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）が含まれる。他の溶解システムには、Ｖｅｒｓａｌｙｓｅ（商標）システム、ＦＡＣＳｌｙｓｅ（商標）システム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｐ（商標）システム、またはＥｒｙｔｈｒｏｌｙｓｅ ＩＩシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、または塩化アンモニウムシステムが含まれる。いくつかの実施形態では、溶解試薬は、赤血球の効率的な溶解、ならびに胸水におけるＴＩＬ及びＴＩＬの表現型特性の保存のような主要な要件によって異なり得る。溶解のための単一の試薬を利用することに加えて、本明細書に記載の方法に有用な溶解システムは、第２の試薬、例えば、方法の残りのステップ中に溶解試薬の効果をクエンチまたは遅延させるもの、例えばＳｔａｂｉｌｙｓｅ（商標）試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を含むことができる。溶解試薬の選択または方法の好ましい実施に応じて、従来の固定試薬を使用することもできる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、未処理、希釈または多重遠心分離または処理された胸腔内液試料は、本明細書で提供されるようにさらに処理及び／または拡張される前に、約－１４０°Ｃの温度で凍結保存される。

末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡張する方法
ＰＢＬ法１。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＢＬは、本明細書に記載のプロセスを使用して拡張される。本発明のいくつかの実施形態では、方法は、全血からＰＢＭＣ試料を取得することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、非ＣＤ１９＋画分の負の選択を使用して、ＰＢＭＣから純粋なＴ細胞を単離することによってＴ細胞を濃縮することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、非ＣＤ１９＋画分の磁気ビーズベースの負の選択を使用して、ＰＢＭＣから純粋なＴ細胞を単離することによってＴ細胞を濃縮することを含む。

本発明のいくつかの実施形態では、ＰＢＬ法１は、以下のように行われる：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣ試料を解凍し、ＰＢＭＣを計数する。Ｔ細胞を、ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット及びＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離する。

ＰＢＬ方法２。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＢＬは、全血からＰＢＭＣ試料を得ることを含むＰＢＬ法２を使用して拡張される。ＰＢＭＣ由来のＴ細胞は、ＰＢＭＣを３７℃で少なくとも３時間インキュベートし、その後、非接着細胞を単離することによって濃縮される。

本発明のいくつかの実施形態では、ＰＢＬ法２は、以下のように行われる：０日目に、凍結保存されたＰＭＢＣ試料を解凍し、ＰＢＭＣ細胞を、ＣＭ－２培地中の６ウェルプレートに６００万細胞／ウェルで播種し、３７℃で３時間インキュベートする。３時間後、ＰＢＬである非接着細胞を取り出し、計数する。

ＰＢＬ方法３。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＢＬは、末梢血からＰＢＭＣ試料を得ることを含むＰＢＬ法３を使用して拡張される。Ｂ細胞は、ＣＤ１９＋選択を使用して単離され、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ試料の非ＣＤ１９＋画分の負の選択を使用して選択される。

本発明のいくつかの実施形態では、ＰＢＬ法３は、以下のように行われる：０日目に、末梢血から取得された凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、計数する。ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ＣＤ１９ Ｍｕｌｔｉｓｏｒｔキット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して選別する。非ＣＤ１９＋細胞画分のうち、Ｔ細胞を、ヒトＰａｎ Ｔ細胞単離キット及びＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して精製する。

いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、全血試料から単離される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、ＰＢＬを拡張するための出発材料として使用される。いくつかの実施形態では、試料は、拡張プロセス前に凍結保存される。他の実施形態では、新鮮な試料が、ＰＢＬを拡張するための出発材料として使用される。本発明のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、当該技術分野で知られている方法を使用してＰＢＭＣから単離される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトＴ汎細胞単離キット及びＬＳカラムを使用して単離される。本発明のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、当該技術分野で知られている抗体選択方法、例えば、ＣＤ１９の負の選択を使用して、ＰＢＭＣから単離される。

本発明のいくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、非接着細胞を特定するのに有効な所望の温度である期間インキュベートされる。本発明のいくつかの実施形態では、インキュベーション時間は、約３時間である。本発明のいくつかの実施形態では、温度は、約３７℃である。その後、非接着細胞は、上記のプロセスを使用して拡張される。

いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで任意選択で前治療された対象または患者由来のものである。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前治療された対象または患者由来のものである。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前治療されており、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または１年間、またはそれ以上治療を受けた対象または患者由来のものである。他の実施形態では、ＰＢＭＣは、イブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤レジメンを現在受けている患者に由来する。

いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前治療されており、キナーゼ阻害剤またはイブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤での治療に不応性である対象または患者由来のものである。

いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前治療されたが、もはやキナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤での治療を受けていない対象または患者由来のものである。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣ試料は、キナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前治療されたが、もはやキナーゼ阻害剤またはＩＴＫ阻害剤での治療を受けておらず、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間、またはそれ以上治療を受けていない対象または患者由来のものである。他の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＩＴＫ阻害剤に以前に曝露されたが、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、または少なくとも１年以内に治療されていない患者に由来する。

本発明のいくつかの実施形態では、０日目に、細胞がＣＤ１９＋について選択され、それに応じて選別される。本発明のいくつかの実施形態では、選択は、抗体結合ビーズを使用して行われる。本発明のいくつかの実施形態では、純粋なＴ細胞が、０日目にＰＢＭＣから単離される。

本発明のいくつかの実施形態では、イブルチニブまたは他のＩＴＫ阻害剤で前治療されていない患者の場合、１０～１５ｍＬのバフィーコートは、約５×１０^９のＰＢＭＣを産生し、これは、次いで、約５．５×１０^７のＰＢＬを産生する。

本発明のいくつかの実施形態では、イブルチニブまたは他のＩＴＫ阻害剤で前治療された患者の場合、拡張プロセスは、約２０×１０^９のＰＢＬを産生する。本発明のいくつかの実施形態では、４０．３×１０^６のＰＢＭＣは、約４．７×１０^５のＰＢＬを産生する。

前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＰＢＭＣは、全血試料から、アフェレーシスによって、バフィーコートから、またはＰＢＭＣを得るための当該技術分野で知られている任意の他の方法から得られ得る。

いくつかの実施形態では、ＰＢＬは、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０３４７３５０ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用して調製される。

骨髄由来のＰＢＭＣから骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡張する方法
ＭＩＬ方法３。本発明のいくつかの実施形態では、方法は、骨髄からＰＢＭＣを取得することを含む。０日目に、ＰＢＭＣがＣＤ３＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ２０＋／ＣＤ１４＋について選択され、選別され、非ＣＤ３＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ２０＋／ＣＤ１４＋細胞画分が超音波処理され、超音波処理された細胞画分の一部が選択された細胞画分に戻し追加される。

本発明のいくつかの実施形態では、ＭＩＬ法３は、以下のように行われる：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣ試料を解凍し、ＰＢＭＣを計数する。細胞を、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ２０、及びＣＤ１４抗体で染色し、選別されたＳ３ｅ細胞（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して選別する。細胞を、免疫細胞画分（またはＭＩＬ画分）（ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）及びＡＭＬ芽球画分（非ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）の２つの画分に選別する。

本発明のいくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、骨髄から取得される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、アフェレーシス、吸引、針生検、または当該技術分野で知られている他の同様の手段により骨髄から取得される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、新鮮である。他の実施形態では、ＰＢＭＣは、凍結保存される。

本発明のいくつかの実施形態では、ＭＩＬは、１０～５０ｍＬの骨髄穿刺液から拡張される。本発明のいくつかの実施形態では、１０ｍＬの骨髄穿刺液が患者から取得される。他の実施形態では、２０ｍＬの骨髄穿刺液が患者から取得される。他の実施形態では、３０ｍＬの骨髄穿刺液が患者から取得される。他の実施形態では、４０ｍＬの骨髄穿刺液が患者から取得される。他の実施形態では、５０ｍＬの骨髄穿刺液が患者から取得される。

本発明のいくつかの実施形態では、約１０～５０ｍＬの骨髄穿刺液から産生されたＰＢＭＣの数は、約５×１０^７～約１０×１０^７ＰＢＭＣである。他の実施形態では、産生されたＰＭＢＣの数は、約７×１０^７ＰＢＭＣである。

本発明のいくつかの実施形態では、約５×１０^７～約１０×１０^７ＰＢＭＣが、約０．５×１０^６～約１．５×１０^６ＭＩＬを産生する。本発明のいくつかの実施形態では、約１×１０^６ＭＩＬが産生される。

本発明のいくつかの実施形態では、骨髄穿刺液から誘導された１２×１０^６ＰＢＭＣは、およそ１．４×１０^５ＭＩＬを産生する。

前述の実施形態のうちのいずれにおいても、ＰＢＭＣは、全血試料から、骨髄から、アフェレーシスによって、バフィーコートから、またはＰＢＭＣを得るための当該技術分野で知られている任意の他の方法から得られ得る。

いくつかの実施形態では、ＭＩＬは、米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０３４７３５０ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用して調製される。

ＰＤ－１の事前選択
本発明のいくつかの方法によれば、ＴＩＬは、プライミングによる第１の拡張の前に、ＰＤ－１陽性（ＰＤ－１＋）であるように事前選択される。

いくつかの実施形態では、最低３，０００個のＴＩＬが、第１の拡張に播種するために必要とされる。いくつかの実施形態では、事前選択ステップは、最低３，０００個のＴＩＬをもたらす。いくつかの実施形態では、最低４，０００個のＴＩＬが、第１の拡張に播種するために必要とされる。いくつかの実施形態では、事前選択ステップは、最低４，０００個のＴＩＬをもたらす。いくつかの実施形態では、最低５，０００個のＴＩＬが、第１の拡張に播種するために必要とされる。いくつかの実施形態では、事前選択ステップは、最低５，０００個のＴＩＬをもたらす。いくつかの実施形態では、最低６，０００個のＴＩＬが、第１の拡張に播種するために必要とされる。いくつかの実施形態では、事前選択ステップは、最低６，０００個のＴＩＬをもたらす。いくつかの実施形態では、最低７，０００個のＴＩＬが、第１の拡張に播種するために必要とされる。いくつかの実施形態では、事前選択ステップは、最低７，０００個のＴＩＬをもたらす。いくつかの実施形態では、最低８，０００個のＴＩＬが、第１の拡張に播種するために必要とされる。いくつかの実施形態では、事前選択ステップは、最低８，０００個のＴＩＬをもたらす。いくつかの実施形態では、最低９，０００個のＴＩＬが、第１の拡張に播種するために必要とされる。いくつかの実施形態では、事前選択ステップは、最低９，０００個のＴＩＬをもたらす。いくつかの実施形態では、最低１０，０００個のＴＩＬが、第１の拡張に播種するために必要とされる。いくつかの実施形態では、事前選択ステップは、最低１０，０００個個のＴＩＬをもたらす。いくつかの実施形態では、細胞を、２００，０００個の密度まで成長または拡張させる。いくつかの実施形態では、細胞を、２００，０００個の密度まで成長または拡張させて、急速な第２の拡張を開始するための約２ｅ８個のＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、細胞を、１５０，０００個の密度まで成長または拡張させる。いくつかの実施形態では、細胞を、１５０，０００個の密度まで成長または拡張させて、急速な第２の拡張を開始するための約２ｅ８個のＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、細胞を、２５０，０００個の密度まで成長または拡張させる。いくつかの実施形態では、細胞を、２５０，０００個の密度まで成長または拡張させて、急速な第２の拡張を開始するための約２ｅ８個のＴＩＬを提供する。いくつかの実施形態では、最小細胞密度は、急速な第２の拡張を開始するための１０ｅ６個を与えるために、１０，０００個の細胞である。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張を開始するための１０ｅ６個の播種密度は、１ｅ９個を超えるＴＩＬをもたらし得る。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張において使用するためのＴＩＬは、ＰＤ－１陽性（ＰＤ－１＋）である（例えば、事前選択の後、かつプライミングによる第１の拡張の前）。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張において使用するためのＴＩＬは、少なくとも７５％のＰＤ－１陽性、少なくとも８０％のＰＤ－１陽性、少なくとも８５％のＰＤ－１陽性、少なくとも９０％のＰＤ－１陽性、少なくとも９５％のＰＤ－１陽性、少なくとも９８％のＰＤ－１陽性、または少なくとも９９％のＰＤ－１陽性である（例えば、事前選択の後、かつプライミングによる第１の拡張の前）。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１集団は、ＰＤ－１高である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張において使用するためのＴＩＬは、少なくとも２５％のＰＤ－１高、少なくとも３０％のＰＤ－１高、少なくとも３５％のＰＤ－１高、少なくとも４０％のＰＤ－１高、少なくとも４５％のＰＤ－１高、少なくとも５０％のＰＤ－１高、少なくとも５５％のＰＤ－１高、少なくとも６０％のＰＤ－１高、少なくとも６５％のＰＤ－１高、少なくとも７０％のＰＤ－１高、少なくとも７５％のＰＤ－１高、少なくとも８０％のＰＤ－１高、少なくとも８５％のＰＤ－１高、少なくとも９０％のＰＤ－１高、少なくとも９５％のＰＤ－１高、少なくとも９８％のＰＤ－１高、または少なくとも９９％のＰＤ－１高である（例えば、事前選択の後、かつプライミングによる第１の拡張の前）。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１陽性ＴＩＬの事前選択は、一次細胞集団、全腫瘍消化物、及び／または全腫瘍細胞懸濁液ＴＩＬを抗ＰＤ－１抗体で染色することによって行われる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ポリクローナル抗体、例えば、マウス抗ヒトＰＤ－１ポリクローナル抗体、ヤギ抗ヒトＰＤ－１ポリクローナル抗体などである。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体には、例えば、ＥＨ１２．２Ｈ７、ＰＤ１．３．１、Ｍ１Ｈ４、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８，Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ラムブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、Ｈ１２．１、ＰＤ１．３．１、ＮＡＴ １０５、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ＳｈａｎｇＨａｉ ＪｕｎＳｈｉ）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ，Ｉｎｃ．）、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）、及び／または抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ＳｈａｎｇＨａｉ ＨｅｎｇＲｕｉ）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及び／またはヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４（ラットＡ）－ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＰ０１４６に由来する。本明細書に記載されるように、ステップＡ～Ｆにより例示されるように、本発明の方法によるＴＩＬの拡張において使用するためのＰＤ－１陽性ＴＩＬの事前選択において使用するための他の好適な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に開示される抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））とは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、ペムブロリズマブ（ランブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））とは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ＳｈａｎｇＨａｉ ＪｕｎＳｈｉ）とは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ，Ｉｎｃ．）とは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）とは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）とは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ＳｈａｎｇＨａｉ ＨｅｎｇＲｕｉ）とは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）とは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）とは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、ヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）とは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、事前選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、ＲＭＰ１－１４（ラットＩｇＧ）－ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＰ０１４６とは異なるエピトープに結合する。ニボルマブ及びペンブロリズマブのＰＤ－１への結合の結合構造は既知であり、例えば、Ｔａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（Ｔａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，８：１４３６９｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１４３６９（２０１７）、あらゆる目的のために参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＥＨ１２．２Ｈ７である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ１．３．１である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ１．３．１ではない。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、Ｍ１Ｈ４である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、Ｍ１Ｈ４ではない。

いくつかの実施形態では、事前選択で使用するための抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１を発現する細胞の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％に結合する。

いくつかの実施形態では、患者は、抗ＰＤ－１抗体で治療されている。いくつかの実施形態では、対象は、抗ＰＤ－１抗体治療ナイーブである。いくつかの実施形態では、対象は、抗ＰＤ－１抗体で治療されていない。いくつかの実施形態では、対象は、以前に化学療法剤で治療されている。いくつかの実施形態では、対象は、以前に化学療法剤で治療されているが、もはや化学療法剤で治療されていない。いくつかの実施形態では、対象は、化学療法治療後または抗ＰＤ－１抗体治療後である。いくつかの実施形態では、対象は、化学療法治療後であり、かつ抗ＰＤ－１抗体治療後である。いくつかの実施形態では、患者は、抗ＰＤ－１抗体治療ナイーブである。いくつかの実施形態では、対象は、治療ナイーブのがんを有するか、または化学療法治療後であるが、抗ＰＤ－１ナイーブである。いくつかの実施形態では、対象は、治療ナイーブであり、かつ化学療法治療後であるが、抗ＰＤ－１抗体治療ナイーブである。

患者が以前に第１の抗ＰＤ－１抗体で治療されているいくつかの実施形態では、事前選択は、一次細胞集団、全腫瘍消化物、及び／または全腫瘍細胞懸濁液ＴＩＬを、一次ＴＩＬ細胞集団の表面上でＰＤ－１に結合することから第１の抗ＰＤ－１抗体により遮断されていない第２の抗ＰＤ－１抗体で染色することにより行われる。

患者が以前に第１の抗ＰＤ－１抗体で治療されているいくつかの実施形態では、事前選択は、一次ＴＩＬ細胞集団を、一次ＴＩＬ細胞集団の表面上で不溶化された抗ＰＤ－１抗体のＦｃ領域に結合する抗体（「抗Ｆｃ抗体」）で染色することにより行われる。いくつかの実施形態では、抗Ｆｃ抗体は、ポリクローナル抗体、例えば、マウス抗ヒトＦｃポリクローナル抗体、ヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体などである。いくつかの実施形態では、抗Ｆｃ抗体は、モノクローナル抗体である。患者が以前に抗ＰＤ－１ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体で治療されているいくつかの実施形態では、一次ＴＩＬ細胞集団は、抗ヒトＩｇＧ抗体で染色される。患者が以前に抗ＰＤ－１ヒトまたはヒト化ＩｇＧ１抗体で治療されているいくつかの実施形態では、一次ＴＩＬ細胞集団は、抗ヒトＩｇＧ１抗体で染色される。患者が以前に抗ＰＤ－１ヒトまたはヒト化ＩｇＧ２抗体で治療されているいくつかの実施形態では、一次ＴＩＬ細胞集団は、抗ヒトＩｇＧ２抗体で染色される。患者が以前に抗ＰＤ－１ヒトまたはヒト化ＩｇＧ３抗体で治療されているいくつかの実施形態では、一次ＴＩＬ細胞集団は、抗ヒトＩｇＧ３抗体で染色される。患者が以前に抗ＰＤ－１ヒトまたはヒト化ＩｇＧ４抗体で治療されているいくつかの実施形態では、一次ＴＩＬ細胞集団は、抗ヒトＩｇＧ４抗体で染色される。

患者が以前に抗ＰＤ－１抗体で治療されているいくつかの実施形態では、事前選択は、一次ＴＩＬ細胞集団を、同じ抗ＰＤ－１抗体と接触させることと、次いで、一次ＴＩＬ細胞集団を、一次ＴＩＬ細胞集団の表面上で不溶化された抗ＰＤ－１抗体のＦｃ領域に結合する抗Ｆｃ抗体で染色することとにより行われる。

いくつかの実施形態では、事前選択は、細胞選別法を使用して行われる。いくつかの実施形態では、細胞選別法は、フローサイトメトリー法、例えば、フロー活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）である。いくつかの実施形態では、第１の集団及びＰＢＭＣ集団の両方におけるフルオロフォアの強度を使用して、それぞれＰＤ－１陰性ＴＩＬ、ＰＤ－１中間ＴＩＬ、及びＰＤ－１陽性ＴＩＬに対応する低レベル、中レベル、及び高レベルの強度を確立するためのＦＡＣＳゲートを設定する。いくつかの実施形態では、細胞選別方法は、ＰＢＭＣ、ＦＭＯ対照、及び試料自体を使用して３つの集団を区別して、ゲートが高、中（中間とも称される）、及び低（陰性とも称される）に設定されるように行われる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、ゲーティング対照として使用される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１高集団は、ＰＢＭＣにおいて観察されるものを超える、ＰＤ－１に対して陽性である細胞集団として定義される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの中間ＰＤ－１＋集団は、ＰＢＭＣ中のＰＤ－１＋細胞を包含する。いくつかの実施形態では、陰性は、ＦＭＯに基づいてゲーティングされる。いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳゲートは、対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することにより、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受け入れるステップの後に設定される。いくつかの実施形態では、ゲーティングは、選別ごとに設定される。いくつかの実施形態では、ゲーティングは、ＰＢＭＣの各試料に対して設定される。いくつかの実施形態では、ゲーティングは、ＰＢＭＣの各試料に対して設定される。いくつかの実施形態では、ゲーティングテンプレートは、ＰＢＭＣから１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、または６０日毎に設定される。いくつかの実施形態では、ゲーティングテンプレートは、ＰＢＭＣから６０日ごとに設定される。いくつかの実施形態では、ゲーティングテンプレートは、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、または６０日毎にＰＢＭＣの各試料に対して設定される。いくつかの実施形態では、ゲーティングテンプレートは、６０日毎にＰＢＭＣの各試料に対して設定される。

いくつかの実施形態では、事前選択は、第１のＴＩＬ集団からＰＤ－１陽性ＴＩＬを選択して、ＰＤ－１に富むＴＩＬ集団を取得することを伴い、少なくとも１１．２７％～７４．４％がＰＤ－１陽性ＴＩＬである第１のＴＩＬ集団からＴＩＬ集団を選択することを含む。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ集団は、少なくとも２０～８０％がＰＤ－１陽性ＴＩＬ、少なくとも２０～８０％がＰＤ－１陽性ＴＩＬ、少なくとも３０～８０％がＰＤ－１陽性ＴＩＬ、少なくとも４０～８０％がＰＤ－１陽性ＴＩＬ、少なくとも５０～８０％がＰＤ－１陽性ＴＩＬ、少なくとも１０～７０％がＰＤ－１陽性ＴＩＬ、少なくとも２０～７０％がＰＤ－１陽性ＴＩＬ、少なくとも３０～７０％がＰＤ－１陽性ＴＩＬ、または少なくとも４０～７０％がＰＤ－１陽性ＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、選択ステップ（例えば、ＰＤ－１陽性細胞の事前選択及び／または選択）は、
（ｉ）第１のＴＩＬ集団及びＰＢＭＣ集団を、ＰＤ－１のＩｇＶドメインの外側のＮ末端ループによってＰＤ－１に結合する過剰のモノクローナル抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体に曝露するステップと、
（ｉｉ）フルオロフォアにコンジュゲートした過剰の抗ＩｇＧ４抗体を添加するステップと、
（ｉｉｉ）蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）により行われた場合のＰＢＭＣ集団の強度と比較した第１のＴＩＬ集団中のＰＤ－１陽性ＴＩＬのフルオロフォアの強度に基づいて、ＰＤ－１に富むＴＩＬ集団を取得するステップと、を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１陽性ＴＩＬは、ＰＤ－１高ＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１に富むＴＩＬ集団の少なくとも７０％が、ＰＤ－１陽性ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１に富むＴＩＬ集団の少なくとも８０％が、ＰＤ－１陽性ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１に富むＴＩＬ集団の少なくとも９０％が、ＰＤ－１陽性ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１に富むＴＩＬ集団の少なくとも９５％が、ＰＤ－１陽性ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１に富むＴＩＬ集団の少なくとも９９％が、ＰＤ－１陽性ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１に富むＴＩＬ集団の１００％が、ＰＤ－１陽性ＴＩＬである。

異なる抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１内の異なるエピトープに対して異なる結合特徴を示す。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ペンブロリズマブとは異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ１抗体は、ＰＤ－１のＩｇＶドメインの外側のＮ末端ループ内のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ１抗体は、ＰＤ－１のＩｇＶドメインの外側のＮ末端ループによって結合する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１に結合する抗ＰＤ－１抗体であり、ＰＤ－１のＩｇＶドメインの外側のＮ末端ループによって結合する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１に結合するモノクローナル抗ＰＤ－１抗体であり、ＰＤ－１のＩｇＶドメインの外側のＮ末端ループによって結合する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１に結合する抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体であり、ＰＤ－１のＩｇＶドメインの外側のＮ末端ループによって結合する。例えば、Ｔａｎ，Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．Ｖｏｌ ８，Ａｒｇｉｃｌｅ １４３６９：１－１０（２０１７）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、図１のステップＡ２として例示される選択ステップは、（ｉ）第１のＴＩＬ集団を、ＰＤ－１のＩｇＶドメインの外側のＮ末端ループによってＰＤ－１に結合する過剰のモノクローナル抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体に曝露するステップと、（ｉｉ）フルオロフォアにコンジュゲートした過剰の抗ＩｇＧ４抗体を添加するステップと、（ｉｉｉ）フルオロフォアに基づいてフローベースの細胞選別を行って、ＰＤ－１に富むＴＩＬ集団を取得するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体は、ニボルマブ、またはそのバリアント、断片、もしくはコンジュゲートである。いくつかの実施形態では、抗ＩｇＧ４抗体は、クローン抗ヒトＩｇＧ４、クローンＨＰ６０２３である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における選択において使用するための抗ＰＤ－１抗体は、ＥＨ１２．２Ｈ７またはニボルマブと同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、ＷＯ２０１９／１５６５６８のＰＤ－１ゲーティング法が用いられる。腫瘍試料に由来するＴＩＬがＰＤ－１高であるかどうかを決定するために、当業者は、１人以上の健康なヒト対象からの血液試料から取得された末梢Ｔ細胞におけるＰＤ－１の発現レベルに対応する参照値を利用することができる。参照試料中のＰＤ－１陽性細胞は、蛍光から１つの対照を引き算したものと、一致する同位体対照とを使用して定義することができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１の発現レベルは、健康な対象からのＣＤ３＋／ＰＤ－１＋末梢Ｔ細胞（例えば、参照細胞）において測定され、これを使用して、腫瘍から取得されたＴＩＬにおけるＰＤ－１の免疫染色強度の閾値またはカットオフ値を確立する。閾値は、ＰＤ－１高Ｔ細胞のＰＤ－１免疫染色の最小強度として定義することができる。そのため、ＰＤ－１発現が閾値と同じかそれを超えるＴＩＬは、ＰＤ－１高細胞とみなすことができる。いくつかの事例では、ＰＤ－１高ＴＩＬは、全ＣＤ３＋細胞の最大１％以下に相当するＰＤ－１免疫染色の最高強度を有するものを表す。他の事例では、ＰＤ－１高ＴＩＬは、全ＣＤ３＋細胞の最大０．７５％以下に相当するＰＤ－１免疫染色の最高強度を有するものを表す。いくつかの事例では、ＰＤ－１高ＴＩＬは、全ＣＤ３＋細胞の最大０．５０％以下に相当するＰＤ－１免疫染色の最高強度を有するものを表す。１つの事例では、ＰＤ－１高ＴＩＬは、全ＣＤ３＋細胞の最大０．２５％以下に相当するＰＤ－１免疫染色の最高強度を有するものを表す。

フルオロフォア
いくつかの実施形態では、一次ＴＩＬ細胞集団は、フルオロフォアに連結された抗ＰＤ－１抗体及びフルオロフォアに連結された抗ＣＤ３抗体を含むカクテルで染色される。いくつかの実施形態では、一次ＴＩＬ細胞集団は、フルオロフォアに連結された抗ＰＤ－１抗体（例えば、ＰＥ、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄバイオレット）及び抗ＣＤ３－ＦＩＴＣを含むカクテルで染色される。いくつかの実施形態では、一次ＴＩＬ細胞集団は、抗ＰＤ－１－ＰＥ、抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ、及びｌｉｖｅ／ｄｅａｄ青色染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、ＭＡ、カタログ番号Ｌ２３１０５）を含むカクテルで染色される。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ１抗体とのインキュベーション後、ＰＤ－１陽性細胞は、本明細書に記載される、例えば、ステップＢにおけるプライミングによる第１の拡張による拡張のために選択される。

いくつかの実施形態では、フルオロフォアとしては、ＰＥ（フィコエリトリン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質）、ＤｙＬｉｇｈｔ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＤｙＬｉｇｈｔ ５５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、ＤｙＬｉｇｈｔ ６５０、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、フルオロフォアには、ＰＥ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、ＰＥ－Ｃｙ５、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＰＥ－Ｃｙ５．５、ＰＥ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＰＥ－Ｃｙ７、及びＡＰＣ－Ｃｙ７が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、フルロフォアには、フルオレセイン色素が含まれるが、これに限定されない。フルオレセイン色素の例には、５－カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン－５－イソチオシアネート及び６－カルボキシフルオレセイン、５，６－ジカルボキシフルオレセイン、５－（及び６）－スルホフルオレセイン、スルホンフルオレセイン、スクシニルフルオレセイン、５－（及び６）－カルボキシＳＮＡＲＦ－１、カルボキシフルオレセインスルホネート、カルボキシフルオレセイン双性イオン、カルボキシフルオレセイン四級アンモニウム、カルボキシフルオレセインホスホネート、カルボキシフルオレセインＧＡＢＡ、５’（６’）－カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン－ｃｙｓ－Ｃｙ５、ならびにフルオレセイングルタチオンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、蛍光部分は、ローダミン色素である。ローダミン色素の例には、テトラメチルローダミン－６－イソチオシアネート、５－カルボキシテトラメチルローダミン、５－カルボキシロードール誘導体、カルボキシローダミン１１０、テトラメチル及びテトラエチルローダミン、ジフェニルジメチル及びジフェニルジエチルローダミン、ジナフチルローダミン、ローダミン１０１スルホニルクロリド（ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（登録商標）の商品名で販売される）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、蛍光部分は、シアニン色素である。シアニン色素の例には、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７が含まれるが、これらに限定されない。

ステップＢ：プライミングによる第１の拡張
いくつかの実施形態では、本方法は、より古いＴＩＬ（すなわち、対象／患者への投与前により多くの複製ラウンドをさらに受けたＴＩＬ）よりも追加の治療的利益を提供し得る、より若いＴＩＬを提供する。若いＴＩＬの特徴は、文献、例えば、Ｄｏｎｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，７５，１５７－１６７、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０，１６，６１２２－６１３１、Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５，２８，２５８－２６７、Ｂｅｓｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３，１９，ＯＦ１－ＯＦ９、Ｂｅｓｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９，３２，４１５－４２３、Ｒｏｂｂｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７３，７１２５－７１３０、Ｓｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００７，３０，１２３－１２９、Ｚｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５，２８，５３－６２、及びＴｒａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００８，３１，７４２－７５１に記載されており、それらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。

例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＡに記載されるものなどの腫瘍断片及び／または腫瘍断片の解剖または消化後に、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長を好む条件下で、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びフィーダー細胞（例えば、抗原提示フィーダー細胞）を含有する血清中で培養される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びフィーダー細胞は、腫瘍消化物及び／または腫瘍断片とともに培養開始時に（例えば、０日目に）追加される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物及び／または腫瘍断片は、１容器当たり最大６０個の断片及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む容器内でインキュベートされる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、数日間、一般に１～８日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、数日間、一般に１～７日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、１～８日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、１～７日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、５～８日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、５～７日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、約６～８日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に、約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、約６～７日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、約７～８日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に、約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、約７日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。いくつかの実施形態では、このプライミングによる第１の拡張は、約８日間起こり、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞を生じる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの拡張は、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなど、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるプロセスを含んでいてもよく、０日目及び／または培養開始からのフィーダー細胞を含有する）、その後に、以下のステップＤ及び本明細書に記載の急速な第２の拡張（ステップＤ、急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後に、任意選択的な凍結保存、その後に、以下及び本明細書に記載の第２のステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用して行われてもよい。このプロセスから取得されたＴＩＬは、本明細書に記載の表現型特徴及び代謝パラメータについて任意選択で特徴付けられ得る。いくつかの実施形態では、腫瘍断片は、約１ｍｍ^３～１０ｍｍ^３である。

いくつかの実施形態では、第１の拡張培養培地は、培養培地の略語である「ＣＭ」と称される。いくつかの実施形態では、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ １６４０からなる。

いくつかの実施形態では、２４０個以下の腫瘍断片が存在する。いくつかの実施形態では、４つ以下の容器に入れられた２４０個以下の腫瘍断片が存在する。いくつかの実施形態では、容器は、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳフラスコである。いくつかの実施形態では、容器は、組織培養のための１００ｃｍ^２のガス透過性表面積を含む。いくつかの実施形態では、６０個以下の腫瘍断片が１つの容器に入れられる。いくつかの実施形態では、各容器は、１容器当たり５００ｍＬ以下の培地を含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、培地は、抗原提示フィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり２．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、容器は、組織培養のための１００ｃｍ^２のガス透過性表面積を含む。いくつかの実施形態では、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇのＯＫＴ－３、及び２．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び２．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。

腫瘍断片の調製後、結果として得られた細胞（すなわち、一次細胞集団である断片）は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長を好み、かつ０日目の培養開始からＴＩＬプライミング及び加速された成長を可能にする条件下で、ＩＬ－２、抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物及び／または腫瘍断片は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、ならびに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３とインキュベートされる。この一次細胞集団は、数日間、一般に１～８日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張中の成長培地は、ＩＬ－２またはそのバリアント、ならびに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、この一次細胞集団は、数日間、一般に１～７日間培養され、その結果、バルクＴＩＬ集団、一般に約１×１０^８のバルクＴＩＬ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張中の成長培地は、ＩＬ－２またはそのバリアント、ならびに抗原提示フィーダー細胞及びＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０～３０×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２０×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき２５×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、１ｍｇバイアルにつき３０×１０^６ＩＵ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、４～８×１０^６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、５～７×１０^６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、６×１０^６ＩＵ／ｍｇのＩＬ－２の最終濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２ストック溶液は、実施例４に記載されるように調製される。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約１０，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、または約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約９，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約５，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約８，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約７，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２～約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２さらに含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。ある実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、ＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、または約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、ＩＬ－１５をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、または約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２１をさらに含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇの間、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１５ｎｇ／ｍｌ～３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである。例えば、表１を参照されたい。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、バリアント、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、ＩＬ－２を約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３抗体を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、プライミングによる第１の拡張細胞培養培地は、ＩＬ－２を約６０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３抗体を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培養培地は、培養培地の略語である「ＣＭ」と称される。いくつかの実施形態では、それは、ＣＭ１（培養培地１）と称される。いくつかの実施形態では、ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＲＰＭＩ １６４０からなる。いくつかの実施形態では、ＣＭは、実施例に記載されるＣＭ１である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、初期細胞培養培地または第１の細胞培養培地中で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張培地または初期細胞培養培地または第１の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞（本明細書ではフィーダー細胞とも称される）を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される拡張プロセスで使用される培地は、無血清培地または合成培地である。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、血清含有培地のロット間の変動に部分的に起因する実験変動を防止及び／または減少させるために使用される。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、血清サプリメントまたは血清代替物には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代用物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代用物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代用物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の抗生物質、及び１つ以上の微量元素のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ^２＋、Ｐ、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋、及びＺｒ^４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／または２－メルカプトエタノールをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔは、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＳＴ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地を含むが、これらに限定されない、従来の成長培地とともに使用される。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地中の総血清代替物濃度（ｖｏｌ％）は、総無血清または合成培地の約１体積％、２体積％、３体積％、４体積％、５体積％、６体積％、７体積％、８体積％、９体積％、１０体積％、１１体積％、１２体積％、１３体積％、１４体積％、１５体積％、１６体積％、１７体積％、１８体積％、１９体積％、または２０体積％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約３％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約５％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約１０％である。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されており、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されており、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．５ｍＭ～約９ｍＭ、１ｍＭ～約８ｍＭ、２ｍＭ～約７ｍＭ、３ｍＭ～約６ｍＭ、または４ｍＭ～約５ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約２ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。

いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、１５ｍＭ～約１３０ｍＭ、２０ｍＭ～約１２０ｍＭ、２５ｍＭ～約１１０ｍＭ、３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３５ｍＭ～約９５ｍＭ、４０ｍＭ～約９０ｍＭ、４５ｍＭ～約８５ｍＭ、５０ｍＭ～約８０ｍＭ、５５ｍＭ～約７５ｍＭ、６０ｍＭ～約７０ｍＭ、または約６５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。いくつかの実施形態では、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開第ＷＯ／１９９８／０３０６７９号に記載されている合成培地は、本発明において有用である。その刊行物には、無血清真核細胞培養培地が記載されている。無血清真核細胞培養培地には、無血清培養下で細胞の成長を支持することができる無血清サプリメントを補充した基礎細胞培養培地が含まれる。無血清真核細胞培養培地サプリメントは、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の微量元素、及び１つ以上の抗生物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含むか、またはそれらを組み合わせることによって取得される。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／またはベータ－メルカプトエタノールをさらに含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンまたはアルブミン代替物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、及び１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ^２＋、Ｐ、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋、及びＺｒ^４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、合成培地中のグリシンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、Ｌ－ヒスチジンの濃度は、約５～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－イソロイシンの濃度は、約５～３００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－メチオニンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－フェニルアラニンの濃度は、約５～４００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－プロリンの濃度は、約１～１０００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－ヒドロキシプロリンの濃度は、約１～４５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－セリンの濃度は、約１～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－スレオニンの濃度は、約１０～５００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－トリプトファンの濃度は、約２～１１０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－チロシンの濃度は、約３～１７５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－バリンの濃度は、約５～５００ｍｇ／Ｌであり、チアミンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、還元型グルタチオンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩の濃度は、約１～２００ｍｇ／Ｌであり、鉄飽和トランスフェリンの濃度は、約１～５０ｍｇ／Ｌであり、インスリンの濃度は、約１～１００ｍｇ／Ｌであり、亜セレン酸ナトリウムの濃度は、約０．０００００１～０．０００１ｍｇ／Ｌであり、アルブミン（例えば、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ）の濃度は、約５０００～５０，０００ｍｇ／Ｌである。

いくつかの実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、表４の「１×培地中の濃度範囲」という見出しの下の列にリストされた濃度範囲で存在する。他の実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、表４の「１×培地の好ましい実施形態」という見出しの下の列にリストされた最終濃度で存在する。他の実施形態では、合成培地は、無血清サプリメントを含む基礎細胞培地である。これらの実施形態のうちのいくつかでは、無血清サプリメントは、表４の「サプリメント中の好ましい実施形態」という見出しの下の列にリストされたタイプ及び濃度の非微量部分成分を含む。

いくつかの実施形態では、合成培地の浸透圧は、約２６０～３５０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、浸透圧は、約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、合成培地には、最大約３．７ｇ／Ｌ、または約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムが補充されている。合成培地には、Ｌ－グルタミン（最終濃度約２ｍＭ）、１つ以上の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、最終濃度約１００μＭ）、２－メルカプトエタノール（最終濃度約１００μＭ）がさらに補充されていてもよい。

いくつかの実施形態では、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（１），２０１５（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．３１）に記載の合成培地が、本発明において有用である。簡潔には、ＲＰＭＩまたはＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒを基礎細胞培地として使用し、０、２％、５％、または１０％のいずれかのＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを補充した。

いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞の数を拡張するために必要な手順を簡素化することができる。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥまたはβＭＥ、２－メルカプトエタノールとしても知られる、ＣＡＳ６０－２４－２）を欠いている。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、１～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、２～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、３～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、４～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、５～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、６～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、７～８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、８日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、１～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、２～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、３～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、４～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、５～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢに記載されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、６～７日間である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＢにおいて提供されるものなどのプロセスを含み、ＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されることがあるものを含み得る）プロセスは、実施例及び図において考察されるように、７日間である。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから１日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから１日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから２日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから２日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから３日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから３日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから４日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから４日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから５日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから５日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから６日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから６日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから７日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１のＴＩＬ拡張は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから７日間続行することができる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬのプライミングによる第１の拡張は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、１日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、２日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、２日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、３日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、３日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、４日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、４日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、５日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、５日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、６日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、６日～７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、７日～８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第１のＴＩＬ拡張は、７日間続行することができる。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１の組み合わせは、プライミングによる第１の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）による、かつ本明細書に記載されるステップＢのプロセス中を含む、プライミングによる第１の拡張中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせは、プライミングによる第１の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）による、及び本明細書に記載されるステップＢプロセス中に含まれ得る。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）によるステップＢは、閉鎖系バイオリアクターにおいて行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが容器として用いられる。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１０またはＧ－ＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－ＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－ＲＥＸ－１０である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、組織培養デバイス１００または２０８であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、細胞培養デバイス３００であるか、またはそれを含む。

フィーダー細胞及び抗原提示細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に、４～８日目の任意の時間に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に、４～７日目の任意の時間に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に、５～８日目の任意の時間に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に、５～７日目の任意の時間に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に、６～８日目の任意の時間に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に、６～７日目の任意の時間に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に、７または８日目の任意の時間に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に、７日目の任意の時間に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要とせず、むしろプライミングによる第１の拡張中に、８日目の任意の時間に添加される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＢに記載されるもの、ならびにＲＥＰ前またはプライミングＲＥＰと称されるものなどの拡張を含む）は、ＴＩＬ拡張の開始時及びプライミングによる第１の拡張中にフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）を必要する。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、同種異系の健康な献血者由来の標準の全血単位から取得される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。いくつかの実施形態では、２．５×１０^８のフィーダー細胞が、プライミングによる第１の拡張中に使用される。いくつかの実施形態では、容器当たり２．５×１０^８のフィーダー細胞が、プライミングによる第１の拡張中に使用される。いくつかの実施形態では、組織培養のためのガス透過性表面積１０ｃｍ^２当たり２．５×１０^８のフィーダー細胞が、プライミングによる第１の拡張中に使用される。いくつかの実施形態では、組織培養のためのガス透過性表面積１００ｃｍ^２当たり２．５×１０^８のフィーダー細胞が、プライミングによる第１の拡張中に使用される。

一般に、同種異系ＰＢＭＣは、放射線照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用され、これは、放射線照射された同種異系ＰＢＭＣの複製能力がないことを評価するための例示的なプロトコルを提供する。

いくつかの実施形態では、１４日目の総生細胞数が、プライミングによる第１の拡張の０日目に培養された初期の生細胞数よりも少ない場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。

いくつかの実施形態では、７日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された総生細胞数が、プライミングによる第１の拡張の０日目に培養された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。

いくつかの実施形態では、７日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された総生細胞数が、プライミングによる第１の拡張の０日目に培養された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、５～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１０～５０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２０～４０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、２５～３５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、１５ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。

いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。いくつかの実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。いくつかの実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比は、１：５０～１：３００である。いくつかの実施形態では、第２の増殖におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比は、１：１００～１：２００である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順は、約２．５×１０^８フィーダー細胞：約１００×１０^６ＴＩＬの比を必要とする。他の実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順は、約２．５×１０^８フィーダー細胞：約５０×１０^６ＴＩＬの比を必要とする。さらに他の実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順は、約２．５×１０^８フィーダー細胞：約２５×１０^６ＴＩＬを必要とする。さらに他の実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張は、約２．５×１０^８のフィーダー細胞を必要とする。さらに他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、急速な第２の拡張で使用されるフィーダー細胞の数の４分の１、３分の１、１２分の５、または半分を必要とする。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、ＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、容器当たり２．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、ＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり３０ｎｇのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、容器は、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳフラスコである。いくつかの実施形態では、容器は、組織培養のための１００ｃｍ^２のガス透過性表面積を含む。いくつかの実施形態では、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び２．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び２．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地及び２．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞当たり１５μｇのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地及び１５μｇのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、容器は、組織培養のための１００ｃｍ^２のガス透過性表面積を含む。いくつかの実施形態では、培地は、５００ｍＬの培養培地、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び２．５×１０^８個の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、１５μｇのＯＫＴ－３、及び２．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地及び２．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞当たり１５μｇのＯＫＴ－３を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張手順は、第２の拡張中にＴＩＬを超える過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、同種異系の健康な献血者由来の標準の全血単位から取得される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。いくつかの実施形態では、人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞がＰＢＭＣの代わりに使用される。

一般に、同種異系ＰＢＭＣは、放射線照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載される例示的な手順を含む、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順で使用される。

いくつかの実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替物として、またはＰＢＭＣと組み合わせて、プライミングによる第１の拡張において使用される。

サイトカイン及び他の添加物
本明細書に記載の拡張方法は、一般に、当該技術分野で知られているように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。

あるいは、ＴＩＬの急速なプライミングによる第１の拡張のためにサイトカインの組み合わせを使用することは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１０７４９０Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１のうちの２つ以上の組み合わせを用いて追加として可能である。したがって、可能な組み合わせには、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－２及びＩＬ－２１、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれ、後者は多くの実施形態で特に有用である。サイトカインの組み合わせの使用は、リンパ球、特にそこに記載されているようにＴ細胞の生成に特に有利に働く。例えば、表２を参照されたい。

いくつかの実施形態では、ステップＢはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＯＫＴ－３抗体またはムロモナブの、培養培地への添加を含み得る。いくつかの実施形態では、ステップＢはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、４－１ＢＢアゴニストの、培養培地への添加を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ステップＢはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＯＸ－４０アゴニストの、培養培地への添加を含み得る。加えて、チアゾリジンジオン化合物などの増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）－ガンマアゴニストを含む、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーターＩ－アルファアゴニストなどの添加剤は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１９／０３０７７９６ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ステップＢ中の培養培地で使用されてもよい。

ステップＣ：プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行
場合によっては、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるステップＢから取得されたＴＩＬ集団を含む、プライミングによる第１の拡張（ＲＥＰ前と呼ばれることもある拡張を含み得る）から取得されたバルクＴＩＬ母集団は、急速な第２の拡張（これは、急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）と称されることもある拡張を含み得る）に供され、次いで、以下で考察されるように凍結保存され得る。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが療法に使用される場合、プライミングによる第１の拡張由来の拡張ＴＩＬ集団または急速な第２の拡張由来の拡張ＴＩＬ集団は、拡張ステップ前またはプライミングによる第１の拡張後及び急速な第２の拡張前に好適な治療のために遺伝子修飾に供され得る。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるステップＢから取得されたＴＩＬは、選択のために表現型決定されるまで保管される。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるステップＢから取得されたＴＩＬは、保管されず、急速な第２の拡張に直接進む。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から取得されたＴＩＬは、プライミングによる第１の拡張後及び急速な第２の拡張前に凍結保存されない。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、腫瘍の断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約３日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約３日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約４日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約４日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約５日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約５日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約６日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約６日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約７日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから約８日で起こる。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、または８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから１日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから１日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから２日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから２日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから３日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから３日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから４日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから４日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから５日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから５日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから６日～７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから６日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから７日～８日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき、及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから７日で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、断片化が起こったとき、及び／またはプライミングによる第１の拡張ステップが開始されたときから８日で起こる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、一次の第１の拡張後及び第２の拡張前に保管されず、ＴＩＬは、急速な第２の拡張に直接進む（例えば、いくつかの実施形態では、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるステップＢからステップＤへの移行中に保管されない）。いくつかの実施形態では、移行は、本明細書に記載されるように、閉鎖系内で起こる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張由来のＴＩＬである第２のＴＩＬ集団は、移行期間なしで急速な第２の拡張に直接進む。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）によるステップＣ）への移行は、閉鎖系バイオリアクターにおいて行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、単一のバイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、ＧＲＥＸ－１０またはＧＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、組織培養のための１０ｃｍ^２または１００ｃｍ^２のガス透過性表面積を含む組織培養デバイスを備える。いくつかの実施形態では、閉鎖系バイオリアクターは、単一のバイオリアクターである。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張から急速な第２の拡張への移行は、容器サイズのスケールアップを伴う。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、急速な第２の拡張よりも小さい容器内で行われる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、組織培養のための１００ｃｍ^２のガス透過性表面積を含む容器内で行われ、急速な第２の拡張は、組織培養のための５００ｃｍ^２のガス透過性表面積を含む容器内で行われる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張は、ＧＲＥＸ－１００内で行われ、急速な第２の拡張は、ＧＲＥＸ－５００内で行われる。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張及び／または急速な第２の拡張は、細胞培養デバイス３００内で行われる。

ステップＤ：急速な第２の拡張
いくつかの実施形態では、ＴＩＬ細胞集団は、採取及びプライミングによる第１の拡張後、ステップＡ及びステップＢ、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように、ステップＣと称される移行の後に、さらに数が拡張される。このさらなる拡張は、本明細書では急速な第２の拡張と称され、これは、当該技術分野で概して急速拡張プロセス（急速拡張プロトコルまたはＲＥＰと称される拡張プロセス、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＤに示されるプロセス）として示されるプロセスを含み得る。急速な第２の拡張は、一般に、フィーダー細胞、サイトカイン源、及び抗ＣＤ３抗体を含む、いくつかの成分を含む培養培地を使用して、ガス透過性容器内で達成される。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張開始の１日、２日、３日、または４日後（すなわち、Ｇｅｎ３プロセス全体の８、９、１０、または１１日目）に、ＴＩＬは、より大容量の容器に移される。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの急速拡張（ＲＥＰと称されることもある拡張、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＤに示されるプロセスを含み得る）は、当業者に知られている任意のＴＩＬフラスコまたは容器を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約１日間～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約１日間～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日間～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日間～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約３日間～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約３日間～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約４日間～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約４日間～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約５日間～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約５日間～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約６日間～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約６日間～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約７日間～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約７日間～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約８日間～約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約８日間～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約９日間～約１０日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約１日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約２日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約３日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約４日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約５日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約６日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約７日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約８日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約９日間続行することができる。いくつかの実施形態では、第２のＴＩＬ拡張は、急速な第２の拡張の開始後、約１０日間続行することができる。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、本開示の方法（例えば、ＲＥＰと称される拡張、ならびに図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＤに示されるプロセスを含む）を使用して、ガス透過性容器内で行うことができる。いくつかの実施形態では、ガス透過性容器は、細胞培養デバイス３００であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びフィーダー細胞（本明細書では「抗原提示細胞」とも称される）の存在下での急速な第２の拡張において拡張される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びフィーダー細胞の存在下での急速な第２の拡張において拡張され、フィーダー細胞は、プライミングによる第１の拡張において存在するフィーダー細胞の濃度の２倍、２．４倍、２．５倍、３倍、３．５倍、または４倍である最終濃度まで追加される。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）またはインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を使用して、急速に拡張され得る。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、例えば、抗ＣＤ３抗体、例えば約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪもしくはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡから市販）またはＵＨＣＴ－１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから市販）を含み得る。ＴＩＬは、がんのエピトープ（複数可）などの抗原性部分を含む、第２の拡張中に１つ以上の抗原を含むことによって、インビトロでＴＩＬのさらなる刺激を誘導するように拡張することができ、これは、ベクター、例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２）結合ペプチド、例えば、０．３μＭ ＭＡＲＴ－１：２６－３５（２７Ｌ）またはｇｐｌ ００：２０９－２１７（２１０Ｍ）から、任意選択で３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２またはＩＬ－１５などのＴ細胞成長因子の存在下で、任意選択で発現され得る。他の好適な抗原には、例えば、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼがん抗原、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＳＳＸ－２、及びＶＥＧＦＲ２、またはそれらの抗原性部分が含まれ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ－Ａ２を発現する抗原提示細胞にパルスされたがんの同じ抗原（複数可）で再刺激することによっても急速に拡張され得る。あるいは、ＴＩＬは、例えば、例として放射線照射された自己リンパ球または放射線照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２でさらに再刺激され得る。いくつかの実施形態では、再刺激は、第２の拡張の一部として起こる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、放射線照射された自己リンパ球の存在下で、または放射線照射されたＨＬＡ－Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ－２を用いて起こる。

いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２さらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ、または約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、１０００～２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００～３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００～４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００～５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００～６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００～７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００～８０００ＩＵ／ｍＬ、または８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。

いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ、及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ～２０ｎｇ／ｍＬの間、２０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、及び５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１５ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、３０ｎｇ／ｍｌ～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、ＯＫＴ－３抗体は、ムロモナブである。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、ＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、容器当たり７．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、ＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培地中に、容器当たり５００ｍＬの培養培地及び３０μｇのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、容器は、組織培養のための１００ｃｍ^２のガス透過性表面積を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培地中に、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び７．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ－３、及び７．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、ＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、培地は、容器当たり５×１０^８～７．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、ＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地及び３０μｇのＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、容器は、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳフラスコである。いくつかの実施形態では、容器は、細胞培養デバイス３００である。いくつかの実施形態では、容器は、組織培養のための１００ｃｍ^２のガス透過性表面積を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ－３、及び５×１０^８～７．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張における培地は、容器当たり５００ｍＬの培養培地、ならびに６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ－３、及び５×１０^８～７．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞を含む。

いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、細胞培養培地中に１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは４－１ＢＢアゴニストであり、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブ、ウトミルマブ、ＥＵ－１０１、融合タンパク質、ならびにそれらの断片、誘導体、バリアント、バイオシミラー、及び組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、０．１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、２０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの細胞培養培地中濃度を達成するのに十分な濃度で追加される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストに加えて、細胞培養培地は、ＩＬ－２を約３０００ＩＵ／ｍＬの初期濃度で、及びＯＫＴ－３を約３０ｎｇ／ｍＬの初期濃度でさらに含み、１つ以上のＴＮＦＲＳＦアゴニストが、４－１ＢＢアゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１の組み合わせは、第２の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）による、かつ本明細書に記載されるステップＤのプロセス中を含む、第２の拡張中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせは、第２の拡張中に組み合わせとして用いられる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１、ならびにそれらの任意の組み合わせは、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）による、及び本明細書に記載されるステップＤプロセス中に含まれ得る。

いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、抗原提示フィーダー細胞、及び任意選択でＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む補充された細胞培養培地において実施され得る。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、補充された細胞培養培地中で起こる。いくつかの実施形態では、補充された細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞を含む。いくつかの実施形態では、第２の細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ、抗原提示フィーダー細胞とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞（すなわち、抗原提示細胞）を含む細胞培養培地中で起こる。

いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１６０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１４０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、約１２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５、または約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５～約１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－１５をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１８０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－１５を含む。

いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約４ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約３ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１、または約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１～約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張培養培地は、約２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約０．５ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ＩＬ－２１をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、約１ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２１を含む。

いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬの、ＰＢＭＣ及び／または抗原提示細胞に対する比は、約１：１０、約１：１５、約１：２０、約１：２５、約１：３０、約１：３５、約１：４０、約１：４５、約１：５０、約１：７５、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。いくつかの実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣに対する比は、１：５０～１：３００である。いくつかの実施形態では、急速拡張及び／または第２の拡張におけるＴＩＬのＰＢＭＣに対する比は、１：１００～１：２００である。

いくつかの実施形態では、ＲＥＰ及び／または急速な第２の拡張は、バルクＴＩＬを１００倍または２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞と混合してフラスコ内で行われ、フィーダー細胞濃度は、１５０ｍＬ培地中のプライミングによる第１の拡張、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２におけるフィーダー細胞濃度の少なくとも１．１倍（１．１×）、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍または４．０倍である。培地交換（一般に、使用済み培地の３分の２の吸引及び等量の新鮮な培地との交換による、３分の２培地交換）は、細胞が代替の成長チャンバに移されるまで行われる。代替の成長チャンバには、以下でより完全に考察されるように、Ｇ－ＲＥＸフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張（ＲＥＰプロセスと称されるプロセスを含み得る）は、実施例及び図で論じられるように、７～９日間である。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、７日間である。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、８日間である。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、９日間である。

いくつかの実施形態では、第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張、ならびに図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）のステップＤで参照される拡張を含み得る）は、１００ｃｍ^２のガス透過性シリコン底部を有する５００ｍＬ容量のガス透過性フラスコ（Ｇ－ＲＥＸ１００、Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｂｒｉｇｈｔｏｎ，ＭＮ，ＵＳＡから市販）内で行うことができる。５×１０^６または１０×１０^６ＴＩＬは、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）で補充された４００ｍＬの５０／５０培地中でＰＢＭＣとともに培養され得る。Ｇ－ＲＥＸ１００フラスコは、５％ＣＯ_２中３７℃でインキュベートされ得る。５日目に、２５０ｍＬの上清が除去され、遠心分離ボトルに入れられ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心分離され得る。ＴＩＬペレットが、５％ヒトＡＢ血清、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５０ｍＬの新鮮な培地で再懸濁され、元のＧＲＥＸ－１００フラスコに戻し追加され得る。ＴＩＬがＧＲＥＸ－１００フラスコで連続して拡張される場合、１０日目または１１日目に、ＴＩＬは、ＧＲＥＸ－５００または１つ以上の細胞培養デバイス３００などのより大きいフラスコに移動されてもよい。培養１４日目に、細胞が採取され得る。培養１５日目に、細胞が採取され得る。培養１６日目に、細胞が採取され得る。いくつかの実施形態では、培地交換は、細胞が代替の成長チャンバに移されるまで行われる。いくつかの実施形態では、培地の３分の２は、使用済み培地の吸引及び等体積の新鮮な培地との交換によって交換される。いくつかの実施形態では、代替の成長チャンバには、以下でより完全に考察されるように、ＧＲＥＸフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される拡張プロセスで使用される培地は、無血清培地または合成培地である。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、血清含有培地のロット間の変動に部分的に起因する実験変動を防止及び／または減少させるために使用される。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、基礎細胞培地ならびに血清サプリメント及び／または血清代替物を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地が含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、血清サプリメントまたは血清代替物には、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｅｒｕｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代用物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代用物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代用物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の抗生物質、及び１つ以上の微量元素のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３”、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ^２＋、Ｐ、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋、及びＺｒ^４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／または２－メルカプトエタノールをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔは、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＣＴＳ（商標）ＡＩＭ－Ｖ Ｍｅｄｉｕｍ、ＣＳＴ（商標）ＡＩＭ－Ｖ ＳＦＭ、ＬｙｍｐｈｏＯＮＥ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｘｅｎｏ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地を含むが、これらに限定されない、従来の成長培地とともに使用される。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地中の総血清代替物濃度（ｖｏｌ％）は、総無血清または合成培地の約１体積％、２体積％、３体積％、４体積％、５体積％、６体積％、７体積％、８体積％、９体積％、１０体積％、１１体積％、１２体積％、１３体積％、１４体積％、１５体積％、１６体積％、１７体積％、１８体積％、１９体積％、または２０体積％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約３％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約５％である。いくつかの実施形態では、総血清代替物濃度は、無血清または合成培地の総体積の約１０％である。

いくつかの実施形態では、無血清または合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されており、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、合成培地は、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）のいずれの製剤も、本発明において有用である。ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭは、１ＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍと、２６ｍＬのＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせであり、これらは使用前に一緒に混合される。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、５５ｍＭの２－メルカプトエタノールとともに、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されている。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、５５ｍＭの２－メルカプトエタノール、及び２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び５５ｍＭの２－メルカプトエタノールが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約１０００ＩＵ／ｍＬ～約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び約２ｍＭのグルタミンが補充されており、約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭには、約３％のＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＲ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されており、培地中の２－メルカプトエタノールの最終濃度は、５５μＭである。

いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、０．５ｍＭ～約９ｍＭ、１ｍＭ～約８ｍＭ、２ｍＭ～約７ｍＭ、３ｍＭ～約６ｍＭ、または４ｍＭ～約５ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約２ｍＭの濃度でグルタミン（すなわち、ＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標））が補充されている。

いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５ｍＭ～約１５０ｍＭ、１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、１５ｍＭ～約１３０ｍＭ、２０ｍＭ～約１２０ｍＭ、２５ｍＭ～約１１０ｍＭ、３０ｍＭ～約１００ｍＭ、３５ｍＭ～約９５ｍＭ、４０ｍＭ～約９０ｍＭ、４５ｍＭ～約８５ｍＭ、５０ｍＭ～約８０ｍＭ、５５ｍＭ～約７５ｍＭ、６０ｍＭ～約７０ｍＭ、または約６５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。いくつかの実施形態では、無血清培地または合成培地には、約５５ｍＭの濃度で２－メルカプトエタノールが補充されている。

いくつかの実施形態では、国際特許出願公開第ＷＯ／１９９８／０３０６７９号及び米国特許出願公開第ＵＳ２００２／００７６７４７ Ａ１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される合成培地は、本発明において有用である。その刊行物には、無血清真核細胞培養培地が記載されている。無血清真核細胞培養培地には、無血清培養下で細胞の成長を支持することができる無血清サプリメントを補充した基礎細胞培養培地が含まれる。無血清真核細胞培養培地サプリメントは、１つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、１つ以上の微量元素、及び１つ以上の抗生物質からなる群から選択される１つ以上の成分を含むか、またはそれらを組み合わせることによって取得される。いくつかの実施形態では、合成培地は、Ｌ－グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び／またはベータ－メルカプトエタノールをさらに含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンまたはアルブミン代替物と、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、１つ以上の抗酸化剤、１つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、１つ以上のコラーゲン前駆体、及び１つ以上の微量元素からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、合成培地は、アルブミンと、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、チアミン、還元型グルタチオン、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩、鉄飽和トランスフェリン、インスリン、ならびに微量元素部分Ａｇ^＋、Ａｌ^３＋、Ｂａ^２＋、Ｃｄ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｃｒ^３＋、Ｇｅ^４＋、Ｓｅ^４＋、Ｂｒ、Ｔ、Ｍｎ^２＋、Ｐ、Ｓｉ^４＋、Ｖ^５＋、Ｍｏ^６＋、Ｎｉ^２＋、Ｒｂ^＋、Ｓｎ^２＋、及びＺｒ^４＋を含有する化合物からなる群から選択される１つ以上の成分と、を含む。いくつかの実施形態では、基礎細胞培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ－１０、Ｆ－１２、最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ成長培地、及びイスコフ改変ダルベッコ培地からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、合成培地中のグリシンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌの範囲であり、Ｌ－ヒスチジンの濃度は、約５～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－イソロイシンの濃度は、約５～３００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－メチオニンの濃度は、約５～２００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－フェニルアラニンの濃度は、約５～４００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－プロリンの濃度は、約１～１０００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－ヒドロキシプロリンの濃度は、約１～４５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－セリンの濃度は、約１～２５０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－スレオニンの濃度は、約１０～５００ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－トリプトファンの濃度は、約２～１１０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－チロシンの濃度は、約３～１７５ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－バリンの濃度は、約５～５００ｍｇ／Ｌであり、チアミンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、還元型グルタチオンの濃度は、約１～２０ｍｇ／Ｌであり、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸塩の濃度は、約１～２００ｍｇ／Ｌであり、鉄飽和トランスフェリンの濃度は、約１～５０ｍｇ／Ｌであり、インスリンの濃度は、約１～１００ｍｇ／Ｌであり、亜セレン酸ナトリウムの濃度は、約０．０００００１～０．０００１ｍｇ／Ｌであり、アルブミン（例えば、ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）Ｉ）の濃度は、約５０００～５０，０００ｍｇ／Ｌである。

いくつかの実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、表４の「１×培地中の濃度範囲」という見出しの下の列にリストされた濃度範囲で存在する。他の実施形態では、合成培地中の非微量元素部分成分は、表４の「１×培地の好ましい実施形態」という見出しの下の列にリストされた最終濃度で存在する。他の実施形態では、合成培地は、無血清サプリメントを含む基礎細胞培地である。これらの実施形態のうちのいくつかでは、無血清サプリメントは、表４の「サプリメント中の好ましい実施形態」という見出しの下の列にリストされたタイプ及び濃度の非微量部分成分を含む。

いくつかの実施形態では、合成培地の浸透圧は、約２６０～３５０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、浸透圧は、約２８０～３１０ｍＯｓｍｏｌである。いくつかの実施形態では、合成培地には、最大約３．７ｇ／Ｌ、または約２．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムが補充されている。合成培地には、Ｌ－グルタミン（最終濃度約２ｍＭ）、１つ以上の抗生物質、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、最終濃度約１００μＭ）、２－メルカプトエタノール（最終濃度約１００μＭ）がさらに補充されていてもよい。

いくつかの実施形態では、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（１），２０１５（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｔｉ．２０１４．３１）に記載の合成培地が、本発明において有用である。簡潔には、ＲＰＭＩまたはＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒを基礎細胞培地として使用し、０、２％、５％、または１０％のいずれかのＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを補充した。

いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞の数を拡張するために必要な手順を簡素化することができる。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥまたはβＭＥ、２－メルカプトエタノールとしても知られる、ＣＡＳ６０－２４－２）を欠いている。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張（ＲＥＰと称される拡張を含む）が行われ、優れた腫瘍反応性のためにＴＩＬが選択されるステップをさらに含む。当該技術分野で知られている任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法が、優れた腫瘍反応性のためのＴＩＬの選択に使用され得る。

任意選択で、細胞生存率アッセイは、当該技術分野で知られている標準のアッセイを使用して、急速な第２の拡張（ＲＥＰ拡張と称される拡張を含む）後に行われ得る。例えば、死細胞を選択的に標識し、生存率の評価を可能にするトリパンブルー排除アッセイが、バルクＴＩＬの試料上で行われ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ試料は、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２自動セルカウンター（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ＭＡ）を使用して計数され、生存率が決定され得る。いくつかの実施形態では、生存率は、標準のＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｋ２ Ｉｍａｇｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒプロトコルに従って決定される。

Ｔリンパ球及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られた数であるが、多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（接合）、及びＣ（一定）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリー多様性を示し、かつ増加させるＴＩＬを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、第２の拡張において取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／またはＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン重鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン軽鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／またはベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地とも称される）は、以下でさらに詳細に論じられるように、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、ならびに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地とも称される）は、以下でさらに詳細に論じられるように、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇ／フラスコのＯＫＴ－３、ならびに７．５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地とも称される）は、以下でさらに詳細に論じられるように、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、ならびに抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張培養培地（例えば、ＣＭ２または第２の細胞培養培地とも称される）は、以下でさらに詳細に論じられるように、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｕｇ／フラスコのＯＫＴ－３、ならびに５×１０^８の抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）を含む。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターにおいて行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが容器として用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが容器として用いられる。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００またはＧ－ＲＥＸ－５００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－ＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－ＲＥＸ－５００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、細胞培養デバイス３００であるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）ＴＩＬを、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～７日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養でのＴＩＬを、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００－ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移し、小規模培養からのＴＩＬを、第２の容器内でのより大規模な培養で約４～７日間の期間培養することとによって、培養のスケールアップを達成する。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）ＴＩＬを、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約３～７日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）第１の小規模培養由来のＴＩＬを、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養由来のかかる第２の容器に移されたＴＩＬの一部が、第２の小規模培養で約４～７日間培養される。第２の容器は、細胞培養デバイス３００であってもよく、またはそれを含んでもよい。

いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、ＴＩＬの複数の約２～５亜集団に配分される。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）ＴＩＬを、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ１００ ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～７日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からのＴＩＬを、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移されたＴＩＬの一部が、より大規模な培養で約４～７日間の期間培養される。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）ＴＩＬを、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ１００ ＭＣＳ容器内での小規模培養で約５日間の期間培養することによって急速または第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からのＴＩＬを、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移されたＴＩＬの一部が、より大規模な培養で約６日間の期間培養される。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張の分割時に、各第２の容器は、少なくとも１０^８個のＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張の分割時に、各第２の容器は、少なくとも１０^８個のＴＩＬ、少なくとも１０^９個のＴＩＬ、または少なくとも１０^１０個のＴＩＬを含む。例示的な一実施形態では、各第２の容器は、少なくとも１０^１０個のＴＩＬを含む。

いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、複数の亜集団に配分される。いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、複数の約２～５亜集団に配分される。いくつかの実施形態では、第１の小規模ＴＩＬ培養物は、複数の約２、３、４、または５亜集団に配分される。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張の完了後、複数の亜集団は、治療有効量のＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、急速または第２の拡張の完了後、１つ以上のＴＩＬの亜集団を一緒にプールして、治療有効量のＴＩＬを産生する。いくつかの実施形態では、急速拡張の完了後、ＴＩＬの各亜集団は、治療有効量のＴＩＬを含む。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、複数のステップに分割される前に、約３～７日間行われる。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張の分裂は、急速または第２の拡張の開始後約３日目、４日目、５日目、６日目、または７日目に起こる。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張の分裂は、第１の拡張（すなわち、ＲＥＰ前拡張）の開始後の約７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、または１６日目、１７日目、または１８日目に起こる。例示的な一実施形態では、急速または第２の拡張の分裂は、第１の拡張の開始後約１６日目に起こる。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、分裂後約７～１１日間、さらに行われる。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張は、分裂後約５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日間、さらに行われる。

いくつかの実施形態では、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、分裂後の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地と同じ成分を含む。いくつかの実施形態では、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、分裂後の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地とは異なる成分を含む。

いくつかの実施形態では、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及びさらに任意選択でＡＰＣを含む。いくつかの実施形態では、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びさらに任意選択でＡＰＣを含む。いくつかの実施形態では、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む。

いくつかの実施形態では、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３及びさらに任意選択でＡＰＣを含む新鮮な培養培地で補充することによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む新鮮な培養培地で補充することによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３及びさらに任意選択でＡＰＣを含む新鮮な培養培地で置き換えることによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、第１の拡張中の細胞培養培地を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及びＡＰＣを含む新鮮な細胞培養培地で置き換えることによって生成される。

いくつかの実施形態では、分裂後の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２、及び任意選択でＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、分裂後の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む。いくつかの実施形態では、分裂後の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地を、ＩＬ－２及び任意選択でＯＫＴ－３を含む新鮮な培養培地で置き換えることによって生成される。いくつかの実施形態では、分裂後の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地は、分裂前の急速な第２の拡張に使用される細胞培養培地を、ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む新鮮な培養培地で置き換えることによって生成される。

フィーダー細胞及び抗原提示細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される急速な第２の拡張手順（例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）からのステップＤに記載されるような拡張、ならびにＲＥＰと称されるものを含む）は、ＲＥＰ ＴＩＬ拡張中及び／または急速な第２の拡張中に過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、健康な献血者からの標準の全血単位から取得される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。

一般に、同種異系ＰＢＭＣは、放射線照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、実施例に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用され、これは、放射線照射された同種異系ＰＢＭＣの複製能力がないことを評価するための例示的なプロトコルを提供する。

いくつかの実施形態では、７日目または１４日目の総生細胞数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養された初期の生細胞数よりも少ない場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。

いくつかの実施形態では、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された総生細胞数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。

いくつかの実施形態では、７日目及び１４日目のＯＫＴ３及びＩＬ－２の存在下で培養された総生細胞数が、ＲＥＰの０日目及び／または第２の拡張の０日目（すなわち、第２の拡張の開始日）に培養された初期の生細胞数から増加しなかった場合、ＰＢＭＣは、複製能力がないとみなされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順での使用が認められる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び１０００～６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～５０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２０００～４０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び２５００～３５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、３０～６０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養される。

いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、ＰＢＭＣである。いくつかの実施形態では、抗原提示フィーダー細胞は、人工抗原提示フィーダー細胞である。いくつかの実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの、抗原提示フィーダー細胞に対する比は、約１：１０、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００、または約１：５００である。いくつかの実施形態では、第２の拡張におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比は、１：５０～１：３００である。いくつかの実施形態では、第２の増殖におけるＴＩＬの抗原提示フィーダー細胞に対する比は、１：１００～１：２００である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約５×１０^８フィーダー細胞：約１００×１０^６ＴＩＬの比を必要とする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約７．５×１０^８フィーダー細胞：約１００×１０^６ＴＩＬの比を必要とする。他の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約５×１０^８フィーダー細胞：約５０×１０^６ＴＩＬの比を必要とする。他の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約７．５×１０^８フィーダー細胞：約５０×１０^６ＴＩＬの比を必要とする。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約５×１０^８フィーダー細胞：約２５×１０^６ＴＩＬを必要とする。さらに他の実施形態では、本明細書に記載の第２の拡張手順は、約７．５×１０^８フィーダー細胞：約２５×１０^６ＴＩＬを必要とする。さらに他の実施形態では、急速な第２の拡張は、急速な第２の拡張の２倍の数のフィーダー細胞を必要とする。さらに他の実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張が約２．５×１０^８フィーダー細胞を必要とする場合、急速な第２の拡張は、約５×１０^８フィーダー細胞を必要とする。さらに他の実施形態では、本明細書に記載のプライミングによる第１の拡張が約２．５×１０^８フィーダー細胞を必要とする場合、急速な第２の拡張は、約７．５×１０^８フィーダー細胞を必要とする。さらに他の実施形態では、急速な第２の拡張は、プライミングによる第１の拡張の２倍（２．０×）、２．５倍、３．０倍、３．５倍または４．０倍の数のフィーダー細胞を必要とする。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の急速な第２の拡張手順は、急速な第２の拡張中に過剰のフィーダー細胞を必要とする。多くの実施形態では、フィーダー細胞は、同種異系の健康な献血者由来の標準の全血単位から取得される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配分離などの標準の方法を使用して取得される。いくつかの実施形態では、人工抗原提示（ａＡＰＣ）細胞がＰＢＭＣの代わりに使用される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、プライミングによる第１の拡張に追加されたＰＢＭＣの２倍の濃度で、急速な第２の拡張に追加される。

一般に、同種異系ＰＢＭＣは、放射線照射または熱処理のいずれかによって不活性化され、図及び実施例に記載される例示的な手順を含む、本明細書に記載のＴＩＬ拡張手順で使用される。

いくつかの実施形態では、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替物として、またはＰＢＭＣと組み合わせて、急速な第２の拡張において使用される。

サイトカイン及び他の添加物
本明細書に記載の急速な第２の拡張方法は、一般に、当該技術分野で知られているように、高用量のサイトカイン、特にＩＬ－２を含む培養培地を使用する。

あるいは、ＴＩＬの急速な第２の拡張のためにサイトカインの組み合わせを使用することは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１７／０１０７４９０Ａ１号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＩＬ－２、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１のうちの２つ以上の組み合わせを用いて追加として可能である。したがって、可能な組み合わせには、ＩＬ－２及びＩＬ－１５、ＩＬ－２及びＩＬ－２１、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれ、後者は多くの実施形態で特に有用である。サイトカインの組み合わせの使用は、リンパ球、特にそこに記載されているようにＴ細胞の生成に特に有利に働く。

いくつかの実施形態では、ステップＤ（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄから）はまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＯＫＴ－３抗体またはムロモナブの、培養培地への添加を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ステップＤはまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、４－１ＢＢアゴニストの、培養培地への添加を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ステップＤ（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄから）はまた、本明細書の他の箇所に記載されるように、ＯＸ－４０アゴニストの、培養培地への添加を含んでもよい。加えて、チアゾリジンジオン化合物などの増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）－ガンマアゴニストを含む、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーターＩ－アルファアゴニストなどの添加剤は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１９／０３０７７９６ Ａ１号（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ステップＤ（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄから）中の培養培地で使用されてもよい。

ステップＥ：ＴＩＬを採取する
急速な第２の拡張ステップ後、細胞が採取され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に提供されるように、１、２、３、４、またはそれ以上の拡張ステップ後に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に提供されるように、２つの拡張ステップ後に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、２つの拡張ステップ、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に提供されるように、１回のプライミングによる第１の拡張及び１回の急速な第２の拡張の後に採取される。

ＴＩＬは、任意の適切な滅菌様式で、例えば、遠心分離によって採取され得る。ＴＩＬを採取するための方法は、当該技術分野で周知であり、任意のかかる既知の方法が本プロセスとともに用いられ得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、自動化されたシステムを使用して採取される。

いくつかの実施形態では、拡張ステップの後、ＴＩＬは、濃縮されてもよい。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、体積低下プロセスを介して濃縮される。いくつかの実施形態では、採取は、ＴＩＬを濃縮するために、ＴＩＬを液体（例えば、細胞培養培地）に懸濁させて細胞懸濁液を形成し、続いて体積低下プロセスを行うことを含む。いくつかの実施形態では、体積低下プロセスは、細胞培養デバイス３００を利用してもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス３００を利用して、液体の一部を細胞懸濁液から分離する。いくつかの実施形態では、例えば、図１３６Ａ～１３６Ｄに図示されるものと同様のプロセスを使用して、体積低下を行ってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、第１の容器（例えば、組織培養デバイス１００）内の液体中に懸濁され、次いで、体積低下のために、例えば、本明細書に開示される体積低下技術のうちの１つによって、第１の容器から細胞培養デバイス３００に運ばれてもよい。他の実施形態では、ＴＩＬは、細胞培養デバイス３００内で拡張されてもよく、次いで、その後に同じ細胞培養デバイス３００を使用して体積を低下させてもよい（例えば、図１３９Ａ～１４４Ｂに関連して説明されるように）。

細胞採取機及び／または細胞処理システムは、例えば、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ、Ｔｏｍｔｅｃ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、及びＩｎｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む、様々な供給源から市販されている。任意の細胞ベースの採取機が本方法とともに用いられ得る。いくつかの実施形態では、細胞採取機及び／または細胞処理システムは、膜ベースの細胞採取機である。いくつかの実施形態では、細胞採取は、ＬＯＶＯシステム（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉによって製造されたもの）などの細胞処理システムによるものである。「ＬＯＶＯ細胞処理システム」という用語は、細胞を含む溶液を、滅菌及び／または閉鎖系環境で回転膜または回転フィルターなどの膜またはフィルターをとおしてポンプ輸送し、連続フローを可能にし、細胞を処理して、ペレット化せずに上清または細胞培養培地を除去する、任意のベンダーによって製造された任意の機器または装置も指す。いくつかの実施形態では、細胞採取機及び／または細胞処理システムは、滅菌閉鎖系内で、細胞分離、洗浄、流体交換、濃縮、及び／または他の細胞処理ステップを行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＬＯＶＯ細胞処理システムの使用前に本明細書に記載されるものを含む技術に従って、細胞培養デバイス３００を介して体積低下を受ける。

いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）によるステップＤは、閉鎖系バイオリアクターにおいて行われる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、閉鎖系がＴＩＬ拡張のために用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが用いられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターが容器として用いられる。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００またはＧ－ＲＥＸ－５００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－ＲＥＸ－１００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、Ｇ－ＲＥＸ－５００である。いくつかの実施形態では、用いられるバイオリアクターは、細胞培養デバイス３００であるか、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）によるステップＥは、本明細書に記載のプロセスに従って行われる。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、閉鎖系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような閉鎖系が用いられる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載の方法に従って採取される。いくつかの実施形態では、１４～１６日目のＴＩＬが本明細書に記載の方法を使用して採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載の方法を使用して１４日目に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載の方法を使用して１５日目に採取される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載の方法を使用して１６日目に採取される。

ステップＦ：最終製剤及び輸液容器への移行
図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に例示的な順序で提供され、かつ上及び本明細書で詳細に概説されるステップＡ～Ｅが完了した後、細胞は、注入バッグまたは無菌バイアルなどの患者への投与に使用するために容器に移される。いくつかの実施形態では、治療的に十分な数のＴＩＬが上記の拡張方法を使用して取得されると、それらは、患者への投与に使用するために容器に移される。

いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して拡張されたＴＩＬは、薬学的組成物として患者に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬ懸濁液である。本明細書に開示されるように拡張されたＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が含まれる。

さらなるＧｅｎ２、Ｇｅｎ３、及び他のＴＩＬ製造プロセスの実施形態
ＰＢＭＣフィーダー細胞比
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用される培養培地（例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）を参照）は、抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ－３を含む。ＩＬ－２と組み合わせた抗ＣＤ３抗体は、ＴＩＬ集団におけるＴ細胞活性化及び細胞分裂を誘導する。この効果は、全長抗体、ならびにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が一般に好まれ、例えば、Ｔｓｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５，１３５，１７１９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣフィーダー層の数は、以下のように計算される：
Ａ．Ｔ細胞の体積（１０μｍ直径）：Ｖ＝（４／３）πｒ^３＝５２３．６μｍ^３
Ｂ．４０μｍ（４細胞）の高さを有するＧ－ＲＥＸ１００（Ｍ）のカラム：Ｖ＝（４／３）πｒ^３＝４×１０^１２μｍ^３
Ｃ．カラムＢを充填するために必要な細胞数：４×１０^１２μｍ^３／５２３．６μｍ^３＝７．６×１０^８μｍ^３＊０．６４＝４．８６×１０^８
Ｄ．四次元空間で最適に活性化され得る細胞の数：４．８６×１０^８／２４＝２０．２５×１０^６
Ｅ．Ｇ－ＲＥＸ５００に外挿されるフィーダー及びＴＩＬの数：ＴＩＬ：１００×１０^６及びフィーダー：２．５×１０^９

この計算では、１００ｃｍ^２の底部を有するシリンジ中でのＴＩＬの活性化のために二十面体形状を提供するのに必要な単核細胞の数の近似値が使用される。この計算は、Ｊｉｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２，３５，２８３－２９２に記載されているように、ＮＣＩ実験データを密接に反映するＴ細胞の閾値活性化について、約５×１０^８の実験結果を導き出す。（Ｃ）では、乗数（０．６４）は、Ｊａｅｇｅｒ ａｎｄ Ｎａｇｅｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５５，１５２３－３によって計算された等価球のランダム充填密度である。（Ｄ）において、除数２４は、Ｍｕｓｉｎ，Ｒｕｓｓ．Ｍａｔｈ．Ｓｕｒｖ．，２００３，５８，７９４－７９５に記載される、四次元空間内の同様のオブジェクトと接触する可能性のある等価球の数または「ニュートン数」である。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給される抗原提示フィーダー細胞の数は、急速な第２の拡張中に外因的に供給される抗原提示フィーダー細胞の数のおよそ半分である。特定の実施形態では、この方法は、急速な第２の拡張の細胞培養培地と比較しておよそ５０％少ない抗原提示細胞を含む細胞培養培地中でプライミングによる第１の拡張を行うことを含む。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給される抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）の数は、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数よりも多い。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２０：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約９：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約８：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約７：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約６：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数のプライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約２：１である。

他の実施形態では、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４：１、４．１：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１、または５：１である。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約１×１０^８、１．１×１０^８、１．２×１０^８、１．３×１０^８、１．４×１０^８、１．５×１０^８、１．６×１０^８、１．７×１０^８、１．８×１０^８、１．９×１０^８、２×１０^８、２．１×１０^８、２．２×１０^８、２．３×１０^８、２．４×１０^８、２．５×１０^８、２．６×１０^８、２．７×１０^８、２．８×１０^８、２．９×１０^８、３×１０^８、３．１×１０^８、３．２×１０^８、３．３×１０^８、３．４×１０^８、または３．５×１０^８ＡＰＣであり、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約３．５×１０^８、３．６×１０^８、３．７×１０^８、３．８×１０^８、３．９×１０^８、４×１０^８、４．１×１０^８、４．２×１０^８、４．３×１０^８、４．４×１０^８、４．５×１０^８、４．６×１０^８、４．７×１０^８、４．８×１０^８、４．９×１０^８、５×１０^８、５．１×１０^８、５．２×１０^８、５．３×１０^８、５．４×１０^８、５．５×１０^８、５．６×１０^８、５．７×１０^８、５．８×１０^８、５．９×１０^８、６×１０^８、６．１×１０^８、６．２×１０^８、６．３×１０^８、６．４×１０^８、６．５×１０^８、６．６×１０^８、６．７×１０^８、６．８×１０^８、６．９×１０^８、７×１０^８、７．１×１０^８、７．２×１０^８、７．３×１０^８、７．４×１０^８、７．５×１０^８、７．６×１０^８、７．７×１０^８、７．８×１０^８、７．９×１０^８、８×１０^８、８．１×１０^８、８．２×１０^８、８．３×１０^８、８．４×１０^８、８．５×１０^８、８．６×１０^８、８．７×１０^８、８．８×１０^８、８．９×１０^８、９×１０^８、９．１×１０^８、９．２×１０^８、９．３×１０^８、９．４×１０^８、９．５×１０^８、９．６×１０^８、９．７×１０^８、９．８×１０^８、９．９×１０^８、または１×１０^９ＡＰＣである。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約１．５×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約３×１０^８ＡＰＣの範囲から選択され、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約４×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約７．５×１０^８ＡＰＣの範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約２×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約２．５×１０^８ＡＰＣの範囲から選択され、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約４．５×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約５．５×１０^８ＡＰＣの範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約２．５×１０^８ＡＰＣであり、急速な第２の拡張中に外因的に供給されるＡＰＣの数は、正確にまたは約５×１０^８ＡＰＣである。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に添加されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、プライミングによる第１の拡張の７日目（例えば、本方法の７日目）に添加されるＰＢＭＣの数のおよそ半分である。特定の実施形態では、本方法は、プライミングによる第１の拡張の０日目に抗原提示細胞を第１のＴＩＬ集団に添加することと、７日目に抗原提示細胞を第２のＴＩＬ集団に添加することとを含み、０日目に添加される抗原提示細胞の数は、プライミングによる第１の拡張の７日目（例えば、本方法の７日目）に添加される抗原提示細胞の数のおよそ５０％である。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＰＢＭＣの数よりも多い。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約３×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．０×１０^６、１．１×１０^６、１．２×１０^６、１．３×１０^６、１．４×１０^６、１．５×１０^６、１．６×１０^６、１．７×１０^６、１．８×１０^６、１．９×１０^６、２×１０^６、２．１×１０^６、２．２×１０^６、２．３×１０^６、２．４×１０^６、２．５×１０^６、２．６×１０^６、２．７×１０^６、２．８×１０^６、２．９×１０^６、３×１０^６、３．１×１０^６、３．２×１０^６、３．３×１０^６、３．４×１０^６、３．５×１０^６、３．６×１０^６、３．７×１０^６、３．８×１０^６、３．９×１０^６、４×１０^６、４．１×１０^６、４．２×１０^６、４．３×１０^６、４．４×１０^６、または４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約６．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約５．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．６×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．７×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．８×１０^６、２．９×１０^６、３×１０^６、３．１×１０^６、３．２×１０^６、３．３×１０^６、３．４×１０^６、３．５×１０^６、３．６×１０^６、３．７×１０^６、３．８×１０^６、３．９×１０^６、４×１０^６、４．１×１０^６、４．２×１０^６、４．３×１０^６、４．４×１０^６、４．５×１０^６、４．６×１０^６、４．７×１０^６、４．８×１０^６、４．９×１０^６、５×１０^６、５．１×１０^６、５．２×１０^６、５．３×１０^６、５．４×１０^６、５．５×１０^６、５．６×１０^６、５．７×１０^６、５．８×１０^６、５．９×１０^６、６×１０^６、６．１×１０^６、６．２×１０^６、６．３×１０^６、６．４×１０^６、６．５×１０^６、６．６×１０^６、６．７×１０^６、６．８×１０^６、６．９×１０^６、７×１０^６、７．１×１０^６、７．２×１０^６、７．３×１０^６、７．４×１０^６、または７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．０×１０^６、１．１×１０^６、１．２×１０^６、１．３×１０^６、１．４×１０^６、１．５×１０^６、１．６×１０^６、１．７×１０^６、１．８×１０^６、１．９×１０^６、２×１０^６、２．１×１０^６、２．２×１０^６、２．３×１０^６、２．４×１０^６、２．５×１０^６、２．６×１０^６、２．７×１０^６、２．８×１０^６、２．９×１０^６、３×１０^６、３．１×１０^６、３．２×１０^６、３．３×１０^６、３．４×１０^６、３．５×１０^６、３．６×１０^６、３．７×１０^６、３．８×１０^６、３．９×１０^６、４×１０^６、４．１×１０^６、４．２×１０^６、４．３×１０^６、４．４×１０^６、または４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種され、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．６×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．７×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２、２．８×１０^６、２．９×１０^６、３×１０^６、３．１×１０^６、３．２×１０^６、３．３×１０^６、３．４×１０^６、３．５×１０^６、３．６×１０^６、３．７×１０^６、３．８×１０^６、３．９×１０^６、４×１０^６、４．１×１０^６、４．２×１０^６、４．３×１０^６、４．４×１０^６、４．５×１０^６、４．６×１０^６、４．７×１０^６、４．８×１０^６、４．９×１０^６、５×１０^６、５．１×１０^６、５．２×１０^６、５．３×１０^６、５．４×１０^６、５．５×１０^６、５．６×１０^６、５．７×１０^６、５．８×１０^６、５．９×１０^６、６×１０^６、６．１×１０^６、６．２×１０^６、６．３×１０^６、６．４×１０^６、６．５×１０^６、６．６×１０^６、６．７×１０^６、６．８×１０^６、６．９×１０^６、７×１０^６、７．１×１０^６、７．２×１０^６、７．３×１０^６、７．４×１０^６、または７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種され、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約１．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種され、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約６×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約３×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種され、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約４×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約５．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約２×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種され、急速な第２の拡張において外因的に供給されるＡＰＣは、正確にまたは約４×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で培養フラスコに播種される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＰＢＭＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２０：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＰＢＭＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＰＢＭＣの数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約９：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約８：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約７：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約６：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択される。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約２：１である。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数の、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数に対する比は、正確にまたは約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４：１、４．１：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１、または５：１である。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約１×１０^８、１．１×１０^８、１．２×１０^８、１．３×１０^８、１．４×１０^８、１．５×１０^８、１．６×１０^８、１．７×１０^８、１．８×１０^８、１．９×１０^８、２×１０^８、２．１×１０^８、２．２×１０^８、２．３×１０^８、２．４×１０^８、２．５×１０^８、２．６×１０^８、２．７×１０^８、２．８×１０^８、２．９×１０^８、３×１０^８、３．１×１０^８、３．２×１０^８、３．３×１０^８、３．４×１０^８、または３．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）であり、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約３．５×１０^８、３．６×１０^８、３．７×１０^８、３．８×１０^８、３．９×１０^８、４×１０^８、４．１×１０^８、４．２×１０^８、４．３×１０^８、４．４×１０^８、４．５×１０^８、４．６×１０^８、４．７×１０^８、４．８×１０^８、４．９×１０^８、５×１０^８、５．１×１０^８、５．２×１０^８、５．３×１０^８、５．４×１０^８、５．５×１０^８、５．６×１０^８、５．７×１０^８、５．８×１０^８、５．９×１０^８、６×１０^８、６．１×１０^８、６．２×１０^８、６．３×１０^８、６．４×１０^８、６．５×１０^８、６．６×１０^８、６．７×１０^８、６．８×１０^８、６．９×１０^８、７×１０^８、７．１×１０^８、７．２×１０^８、７．３×１０^８、７．４×１０^８、７．５×１０^８、７．６×１０^８、７．７×１０^８、７．８×１０^８、７．９×１０^８、８×１０^８、８．１×１０^８、８．２×１０^８、８．３×１０^８、８．４×１０^８、８．５×１０^８、８．６×１０^８、８．７×１０^８、８．８×１０^８、８．９×１０^８、９×１０^８、９．１×１０^８、９．２×１０^８、９．３×１０^８、９．４×１０^８、９．５×１０^８、９．６×１０^８、９．７×１０^８、９．８×１０^８、９．９×１０^８、または１×１０^９ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）である。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約１×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～正確にまたは約３．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択され、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約３．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～正確にまたは約１×１０^９ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約１．５×１０^８ＡＰＣ～約３×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択され、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、約４×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～約７．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約２×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～正確にまたは約２．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択され、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約４．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）～正確にまたは約５．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約２．５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）であり、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の数は、正確にまたは約５×１０^８ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）である。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目に添加されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）層の数は、急速な第２の拡張の７日目に添加されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）層の数のおよそ半分である。特定の実施形態では、本方法は、プライミングによる第１の拡張の０日目に抗原提示細胞層を第１のＴＩＬ集団に添加することと、７日目に抗原提示細胞を第２のＴＩＬ集団に添加することとを含み、０日目に添加される抗原提示細胞層の数は、７日目に添加される抗原提示細胞層の数のおよそ５０％である。

他の実施形態では、急速な第２の拡張の７日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）層の数は、プライミングによる第１の拡張の０日目に外因的に供給されるＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）層の数よりも多い。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約４細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約２細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約２細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、正確にまたは約１、２、または３細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こる。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：１０の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：８の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：７の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：６の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：５の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：４の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：３の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：２の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．２～正確にまたは約１：８の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．３～正確にまたは約１：７の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．４～正確にまたは約１：６の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．５～正確にまたは約１：５の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．６～正確にまたは約１：４の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．７～正確にまたは約１：３．５の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．８～正確にまたは約１：３の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第１の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：１．９～正確にまたは約１：２．５の範囲から選択される。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数の、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に対する比は、正確にまたは約１：２である。

他の実施形態では、プライミングによる第１の拡張の０日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第１の層の数に等しい第１の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、急速な第２の拡張の７日目は、ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の第２の層の数に等しい第２の平均厚さを有する層状ＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）の存在下で起こり、第１のＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）層の数の第２のＡＰＣ（例えば、ＰＢＭＣを含む）層の数に対する比は、約１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：７．１、１：７．２、１：７．３、１：７．４、１：７．５、１：７．６、１：７．７、１：７．８、１：７．９、１：８、１：８．１、１：８．２、１：８．３、１：８．４、１：８．５、１：８．６、１：８．７、１：８．８、１：８．９、１：９、１：９．１、１：９．２、１：９．３、１：９．４、１：９．５、１：９．６、１：９．７、１：９．８、１：９．９、または１：１０から選択される。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張におけるＡＰＣの数は、約１．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択され、急速な第２の拡張におけるＡＰＣの数は、約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張におけるＡＰＣの数は、約１．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択され、急速な第２の拡張におけるＡＰＣの数は、約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約６．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される。

いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張におけるＡＰＣの数は、約２．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約３．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択され、急速な第２の拡張におけるＡＰＣの数は、約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約５．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される。

任意選択的な細胞培地成分
抗ＣＤ３抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の拡張方法で使用される培養培地（ＲＥＰと称されるものを含む、例えば、図１０９及び１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）を参照）は、抗ＣＤ３抗体を含む。ＩＬ－２と組み合わせた抗ＣＤ３抗体は、ＴＩＬ集団におけるＴ細胞活性化及び細胞分裂を誘導する。この効果は、全長抗体、ならびにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が一般に好まれ、例えば、Ｔｓｏｕｋａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８５，１３５，１７１９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

当業者によって理解されるように、マウス、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌ抗体を含むが、これらに限定されない、様々な哺乳動物からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む、本発明での使用が見出されるいくつかの好適な抗ヒトＣＤ３抗体が存在する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体ムロモナブであるＯＫＴ３が使用される（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡから市販されている）。表１を参照されたい。

当業者によって理解されるように、マウス、ヒト、霊長類、ラット、及びイヌ抗体を含むが、これらに限定されない、様々な哺乳動物からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含む、本発明での使用が見出されるいくつかの好適な抗ヒトＣＤ３抗体が存在する。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体ムロモナブであるＯＫＴ３が使用される（Ｏｒｔｈｏ－ＭｃＮｅｉｌ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪまたはＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡから市販されている）。

４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト
いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張及び／または急速な第２の拡張の細胞培養培地は、ＴＮＦＲＳＦアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストである。４－１ＢＢアゴニストは、当該技術分野で知られている任意の４－１ＢＢ結合分子であり得る。４－１ＢＢ結合分子は、ヒトまたは哺乳動物４－１ＢＢに結合することができるモノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。４－１ＢＢアゴニストまたは４－１ＢＢ結合分子は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖を含み得る。４－１ＢＢアゴニストまたは４－１ＢＢ結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語は、抗体（全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、及び抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片、上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片、ならびに４－１ＢＢに結合する抗体の操作された形態、例えば、ｓｃＦｖ分子も含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物に使用するための４－１ＢＢアゴニストには、抗４－１ＢＢ抗体、ヒト抗４－１ＢＢ抗体、マウス抗４－１ＢＢ抗体、哺乳動物抗４－１ＢＢ抗体、モノクローナル抗４－１ＢＢ抗体、ポリクローナル抗４－１ＢＢ抗体、キメラ抗４－１ＢＢ抗体、抗４－１ＢＢアドネクチン、抗４－１ＢＢドメイン抗体、一本鎖抗４－１ＢＢ断片、重鎖抗４－１ＢＢ断片、軽鎖抗４－１ＢＢ断片、抗４－１ＢＢ融合タンパク質、及びそれらの断片、誘導体、複合体、バリアント、またはバイオシミラーが含まれる。アゴニスト抗４－１ＢＢ抗体は、強力な免疫応答を誘導することが知られている。Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１３，８，ｅ６９６７７。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、アゴニスト、抗４－１ＢＢヒト化、または完全ヒトモノクローナル抗体（すなわち、単一の細胞株に由来する抗体）である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ＥＵ－１０１（Ｅｕｔｉｌｅｘ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、ウトミルマブ、もしくはウレルマブ、またはそれらの断片、誘導体、複合体、バリアント、もしくはバイオシミラーである。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブもしくはウレルマブ、またはそれらの断片、誘導体、複合体、バリアント、もしくはバイオシミラーである。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストまたは４－１ＢＢ結合分子は、融合タンパク質である場合もある。いくつかの実施形態では、三量体または六量体４－１ＢＢアゴニスト（３つまたは６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体４－１ＢＢアゴニストは、典型的に２つのリガンド結合ドメインを有するアゴニストモノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（４－１ＢＢＬ）クラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１－Ｆｃを含み、かつ任意選択でこれらの融合タンパク質のうちの２つ以上をさらに結合する三量体（三価）または六量体（もしくは六価）またはそれ以上の融合タンパク質は、例えば、Ｇｉｅｆｆｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１３，１２，２７３５－４７に記載されている。

アゴニスト４－１ＢＢ抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導することが知られている。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、毒性を低減するのに十分な様式で４－１ＢＢ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞毒性（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）、例えば、ＮＫ細胞細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を抑制するアゴニスト４－１ＢＢモノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制するアゴニスト４－１ＢＢモノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を抑制するアゴニスト４－１ＢＢモノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制するアゴニスト４－１ＢＢモノクローナル抗体または融合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒト４－１ＢＢ（配列番号４０）に結合することを特徴とする。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ヒト４－１ＢＢ（配列番号４０）に結合する結合分子である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、マウス４－１ＢＢ（配列番号４１）に結合する結合分子である。４－１ＢＢアゴニストまたは結合分子が結合する４－１ＢＢ抗原のアミノ酸配列を表５に要約する。

いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス及び方法は、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約１００ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約９０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約８０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約７０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約６０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約５０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約４０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、またはヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約３０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する４－１ＢＢアゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約７．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約７．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約８×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約８．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約９×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約９．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、またはヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約１×１０^６１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する４－１ＢＢアゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス及び方法は、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．１×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．２×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．３×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．４×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．５×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．６×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．７×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．８×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２．９×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、またはヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約３×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス及び方法は、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約１０ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約９ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約８ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約７ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約６ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約５ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約４ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約３ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約２ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウス４－１ＢＢに約１ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、４－１ＢＢアゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ＰＦ－０５０８２５６６もしくはＭＯＲ－７４８０としても知られるウトミルマブ、またはその断片、誘導体、バリアント、もしくはバイオシミラーである。ウトミルマブは、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能である。ウトミルマブは、免疫グロブリンＧ２－ガンマ、抗［ホモサピエンスＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー９、４－１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ホモサピエンス（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウトミルマブのアミノ酸配列を表７に示す。ウトミルマブは、Ａｓｎ５９及びＡｓｎ２９２にグリコシル化部位、２２－９６位（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）、１４３－１９９位（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）、２５６－３１６位（Ｃ_Ｈ２）、及び３６２－４２０位（Ｃ_Ｈ３）に重鎖鎖内ジスルフィド架橋、２２’－８７’位（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）及び１３６’－１９５’位（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）に軽鎖鎖内ジスルフィド架橋、ＩｇＧ２Ａアイソフォーム２１８－２１８、２１９－２１９、２２２－２２２、及び２２５－２２５位、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム２１８－１３０、２１９－２１９、２２２－２２２、及び２２５－２２５位、ならびにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム２１９－１３０（２）、２２２－２２２、及び２２５－２２５位に鎖間重鎖－重鎖ジスルフィド架橋、ならびにＩｇＧ２Ａアイソフォーム１３０－２１３’（２）位、ＩｇＧ２Ａ／Ｂアイソフォーム２１８－２１３’位、及び１３０－２１３’位、ならびにＩｇＧ２Ｂアイソフォーム２１８－２１３’（２）位に鎖間重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウトミルマブならびにそのバリアント及び断片の調製及び特性は、米国特許第８，８２１，８６７号、同第８，３３７，８５０号、及び同第９，４６８，６７８号、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０３２４３３Ａ１（これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ウトミルマブの前臨床特徴は、Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．＆Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１２，６１，１７２１－３３に記載されている。様々な血液学的及び固形腫瘍適応症におけるウトミルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所のｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０２４４４７９３、ＮＣＴ０１３０７２６７、ＮＣＴ０２３１５０６６、及びＮＣＴ０２５５４８１２が含まれる。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号４２によって示される重鎖及び配列番号４３によって示される軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ、配列番号１１及び配列番号４３に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４２及び配列番号４３に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号４４に示される配列を含み、４－１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号４５に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ、配列番号４６、配列番号４７、及び配列番号４８に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５１に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ウトミルマブに関して薬物規制当局によって承認された４－１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照バイオ製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含む４－１ＢＢ抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウトミルマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出された４－１ＢＢアゴニスト抗体であり、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウトミルマブである。４－１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウトミルマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウトミルマブである。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ＢＭＳ－６６３５１３及び２０Ｈ４．９．ｈ４ａとしても知られるモノクローナル抗体ウレルマブ、またはそれらの断片、誘導体、バリアント、もしくはバイオシミラーである。ウレルマブは、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｉｎｃ．及びＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である。ウレルマブは、免疫グロブリンＧ４－カッパ、抗［ホモサピエンスＴＮＦＲＳＦ９（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９、４－１ＢＢ、Ｔ細胞抗原ＩＬＡ、ＣＤ１３７）］、ホモサピエンス（完全ヒト）モノクローナル抗体である。ウレルマブのアミノ酸配列を表７に示す。ウレルマブは、２９８位（及び２９８”）にＮ－グリコシル化部位、２２－９５位（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）、１４８－２０４位（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）、２６２－３２２位（Ｃ_Ｈ２）、及び３６８－４２６位（Ｃ_Ｈ３）（２２”－９５”、１４８”－２０４”、２６２”－３２２”、及び３６８”－４２６”位）に重鎖鎖内ジスルフィド架橋、２３’－８８’位（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）及び１３６’－１９６’位（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）（２３’’’－８８’’’及び１３６’’’－１９６’’’位）に軽鎖鎖内ジスルフィド架橋、２２７－２２７”位及び２３０－２３０”位に鎖間重鎖－重鎖ジスルフィド架橋ならびに１３５－２１６’及び１３５”－２１６’’’に鎖間重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。ウレルマブならびにそのバリアント及び断片の調製及び特性は、米国特許第７，２８８，６３８号及び同第８，９６２，８０４号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ウレルマブの前臨床及び臨床特徴は、Ｓｅｇａｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６に記載されており、ｈｔｔｐ：／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１６－１２７２で入手可能である。様々な血液学的及び固形腫瘍適応症におけるウレルマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所のｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０１７７５６３１、ＮＣＴ０２１１００８２、ＮＣＴ０２２５３９９２、及びＮＣＴ０１４７１２１０が含まれる。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、配列番号５２によって示される重鎖及び配列番号５３によって示される軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５２及び配列番号５３に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号５４に示される配列を含み、４－１ＢＢアゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号５５に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、各々が、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、それぞれ、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ウレルマブに関して薬物規制当局によって承認された４－１ＢＢアゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照バイオ製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含む４－１ＢＢ抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウレルマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出された４－１ＢＢアゴニスト抗体であり、４－１ＢＢアゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウレルマブである。４－１ＢＢアゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウレルマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ウレルマブである。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、１Ｄ８、３Ｅｌｏｒ、４Ｂ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３０９８０９）、Ｈ４－１ＢＢ－Ｍ１２７（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５２５３２）、ＢＢＫ２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＭＳ６２１ＰＡＢＸ）、１４５５０１（Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ５９１）、ＡＴＣＣ番号ＨＢ－１１２４８として寄託された細胞株によって産生され、米国特許第６，９７４，８６３号に開示される抗体、５Ｆ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ３１ １５０３）、Ｃ６５－４８５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ５５９４４６）、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００９５２４４号に開示される抗体、米国特許第７，２８８，６３８号に開示される抗体（例えば、２０Ｈ４．９－ＩｇＧｌ（ＢＭＳ－６６３０３１））、米国特許第６，８８７，６７３号に開示される抗体（例えば、４Ｅ９もしくはＢＭＳ－５５４２７１）、米国特許第７，２１４，４９３号に開示される抗体、米国特許第６，３０３，１２１号に開示される抗体、米国特許第６，５６９，９９７号に開示される抗体、米国特許第６，９０５，６８５号に開示される抗体（例えば、４Ｅ９もしくはＢＭＳ－５５４２７１）、米国特許第６，３６２，３２５号に開示される抗体（例えば、１Ｄ８もしくはＢＭＳ－４６９４９２、３Ｈ３もしくはＢＭＳ－４６９４９７、または３Ｅｌ）、米国特許第６，９７４，８６３号に開示される抗体（例えば、５３Ａ２）、米国特許第６，２１０，６６９号に開示される抗体（例えば、１Ｄ８、３Ｂ８、もしくは３Ｅｌ）、米国特許第５，９２８，８９３号に開示される抗体、米国特許第６，３０３，１２１号に開示される抗体、米国特許第６，５６９，９９７号に開示される抗体、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／１７７７８８号、同第ＷＯ２０１５／１１９９２３号、及び同第ＷＯ２０１０／０４２４３３号に開示される抗体、ならびにそれらの断片、誘導体、複合体、バリアント、またはバイオシミラーからなる群から選択され、前述の特許または特許出願公開の各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０２５５１６Ａ１号、同第ＷＯ２００９／００７１２０Ａ１号、同第ＷＯ２０１０／００３７６６Ａ１号、同第ＷＯ２０１０／０１００５１Ａ１号、及び同第ＷＯ２０１０／０７８９６６Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／００２７２１８Ａ１号、同第ＵＳ２０１５／０１２６７０９Ａ１号、同第ＵＳ２０１１／０１１１４９４Ａ１号、同第ＵＳ２０１５／０１１０７３４Ａ１号、及び同第ＵＳ２０１５／０１２６７１０Ａ１号、ならびに米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載される４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質であり、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、構造Ｉ－Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）もしくは構造Ｉ－Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示されるような４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質、またはそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、バリアント、もしくはバイオシミラーである（図１１０を参照）。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂにおいて、円筒は、個々のポリペプチド結合ドメインを指す。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂは、例えば、４－１ＢＢＬ（４－１ＢＢリガンド、ＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）、もしくは腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＳＦ９））または４－１ＢＢに結合する抗体に由来する３つの直線的に連結されたＴＮＦＲＳＦ結合ドメインを含み、これらが折り重なって三価タンパク質を形成し、その後、これがＩｇＧ１－Ｆｃ（Ｃ_Ｈ３及びＣ_Ｈ２ドメインを含む）によって第２の三価タンパク質に連結され、その後、これを使用して、三価タンパク質のうちの２つをジスルフィド結合（小さく長細い楕円）によって一緒に連結し、構造を安定化し、６つの受容体及びシグナル伝達タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインを一緒にして、シグナル伝達複合体を形成することができるアゴニストを提供する。円筒として示されるＴＮＦＲＳＦ結合ドメインは、例えば、親水性残基及び柔軟性のためのＧｌｙ及びＳｅｒ配列、ならびに溶解性のためのＧｌｕ及びＬｙｓを含み得るリンカーによって結合されたＶ_Ｈ鎖及びＶ_Ｌ鎖を含む、ｓｃＦｖドメインであり得る。ｄｅ Ｍａｒｃｏ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２０１１，１０，４４、Ａｈｍａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．＆Ｄｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２，９８０２５０、Ｍｏｎｎｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１３，２，１９３－２０８、または本明細書の他の場所に組み込まれている参照文献に記載されるものなどの任意のｓｃＦｖドメイン設計が使用され得る。この形態の融合タンパク質構造は、米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

図１１０に示される構造Ｉ－Ａの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、表８に見出される。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全な定常ドメイン（配列番号６２のアミノ酸１７～２３０）、完全なヒンジドメイン（配列番号６２のアミノ酸１～１６）、またはヒンジドメインの一部（例えば、配列番号６２のアミノ酸４～１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を結合するための好ましいリンカーは、追加のポリペプチドの融合に好適なリンカーを含む、配列番号６３～配列番号７２に示される実施形態から選択され得る。

図１１０に示される構造Ｉ－Ｂの他のポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、表９に見出される。Ｆｃ抗体断片が構造Ｉ－ＢにあるようなＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は、好ましくは、配列番号７３に示されるものであり、リンカー配列は、好ましくは、配列番号７４～配列番号７６に示される実施形態から選択される。

いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウレルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、ウトミルマブの可変重鎖及び可変軽鎖、表１０に記載の可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、前述の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ、ならびにそれらの断片、誘導体、コンジュゲート、バリアント、及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、４－１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号７７による配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、可溶性４－１ＢＢＬ配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、配列番号７８による配列を含む１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号４４及び配列番号４５に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって結合されている。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号５４及び配列番号５５に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって結合されている。いくつか実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－Ｂによる４－１ＢＢアゴニスト融合タンパク質は、各々が、表１０に示されるＶ_Ｈ配列及びＶ_Ｌ配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ配列及びＶ_Ｌ配列を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上の４－１ＢＢ結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって結合されている。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４－１ＢＢ結合ドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／またはＣ末端に追加のドメインをさらに含み、追加のドメインは、ＦａｂまたはＦｃ断片ドメインである。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性４－１ＢＢ結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性４－１ＢＢ結合ドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／またはＣ末端に追加のドメインをさらに含み、追加のドメインは、ＦａｂまたはＦｃ断片ドメインであり、可溶性４－１ＢＢドメインは各々、茎領域（三量体化に寄与し、細胞膜まで特定の距離を提供するが、４－１ＢＢ結合ドメインの一部分ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは独立して、３～８アミノ酸長を有する。

いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含む４－１ＢＢアゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは各々、茎領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは独立して、３～８アミノ酸長であり、各ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは、４－１ＢＢ結合ドメインである。

いくつか実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、前述のＶ_Ｌドメインのうちのいずれかに連結された前述のＶ_Ｈドメインのうちのいずれかを含む４－１ＢＢアゴニストｓｃＦｖ抗体である。

いくつか実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から市販されているＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ４－１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号７９０９７－２である。いくつかの実施形態では、４－１ＢＢアゴニストは、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）から市販されているＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ ４－１ＢＢアゴニスト抗体カタログ番号ＭＯＭ－１８１７９である。

ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニスト
いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲＳＦアゴニストは、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）アゴニストである。ＯＸ４０アゴニストは、当該技術分野で知られている任意のＯＸ４０結合分子であり得る。ＯＸ４０結合分子は、ヒトまたは哺乳動物ＯＸ４０に結合することができるモノクローナル抗体または融合タンパク質であり得る。ＯＸ４０アゴニストまたはＯＸ４０結合分子は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖を含み得る。ＯＸ４０アゴニストまたはＯＸ４０結合分子は、重鎖及び軽鎖の両方を有し得る。本明細書で使用される場合、結合分子という用語はまた、抗体（完全長抗体を含む）、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト、ヒト化またはキメラ抗体、及び抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生された断片、上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片、ならびにＯＸ４０に結合する操作された形態の抗体、例えば、ｓｃＦｖ分子を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、完全ヒト抗体である抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ヒト化抗体である抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物に使用するためのＯＸ４０アゴニストには、抗ＯＸ４０抗体、ヒト抗ＯＸ４０抗体、マウス抗ＯＸ４０抗体、哺乳動物抗ＯＸ４０抗体、モノクローナル抗ＯＸ４０抗体、ポリクローナル抗ＯＸ４０抗体、キメラ抗ＯＸ４０抗体、抗ＯＸ４０アドネクチン、抗ＯＸ４０ドメイン抗体、一本鎖抗ＯＸ４０断片、重鎖抗ＯＸ４０断片、軽鎖抗ＯＸ４０断片、抗ＯＸ４０融合タンパク質、及びそれらの断片、誘導体、複合体、バリアント、またはバイオシミラーが含まれる。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、アゴニスト、抗ＯＸ４０ヒト化、または完全ヒトモノクローナル抗体（すなわち、単一の細胞株に由来する抗体）である。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストまたはＯＸ４０結合分子は、融合タンパク質である場合もある。ＯＸ４０Ｌに融合されたＦｃドメインを含むＯＸ４０融合タンパク質は、例えば、Ｓａｄｕｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９，１８２，１４８１－８９に記載されている。いくつかの実施形態では、三量体または六量体ＯＸ４０アゴニスト（３つまたは６つのリガンド結合ドメインを有する）などの多量体ＯＸ４０アゴニストは、典型的に２つのリガンド結合ドメインを有するアゴニストモノクローナル抗体と比較して、優れた受容体（ＯＸ４０Ｌ）クラスター化及び内部細胞シグナル伝達複合体形成を誘導し得る。３つのＴＮＦＲＳＦ結合ドメイン及びＩｇＧ１－Ｆｃを含み、かつ任意選択でこれらの融合タンパク質のうちの２つ以上をさらに結合する三量体（三価）または六量体（もしくは六価）またはそれ以上の融合タンパク質は、例えば、Ｇｉｅｆｆｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２０１３，１２，２７３５－４７に記載されている。

アゴニストＯＸ４０抗体及び融合タンパク質は、強い免疫応答を誘導することが知られている。Ｃｕｒｔｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１３，７３，７１８９－９８。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、毒性を低減するのに十分な様式でＯＸ４０抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞毒性（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）、例えば、ＮＫ細胞細胞傷害性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を抑制するアゴニストＯＸ４０モノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）を抑制するアゴニストＯＸ４０モノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を抑制するアゴニストＯＸ４０モノクローナル抗体または融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｆｃ領域機能性を抑制するアゴニストＯＸ４０モノクローナル抗体または融合タンパク質である。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、高い親和性及びアゴニスト活性でヒトＯＸ４０（配列番号８５）に結合することを特徴とする。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ヒトＯＸ４０に結合する結合分子である（配列番号８５）。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、マウスＯＸ４０に結合する結合分子である（配列番号８６）。ＯＸ４０アゴニストまたは結合分子が結合するＯＸ４０抗原のアミノ酸配列を表１１に要約する。

いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約１００ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約９０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約８０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約７０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約６０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約５０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約４０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合する、またはヒトもしくはマウスＯＸ４０に約３０ｐＭ以下のＫ_Ｄで結合するＯＸ４０アゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約７．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約７．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約８×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約８．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約９×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約９．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、またはヒトもしくはマウスＯＸ４０に約１×１０^６１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合するＯＸ４０アゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．１×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．２×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．３×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．４×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．５×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．６×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．７×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．８×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２．９×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、またはヒトもしくはマウスＯＸ４０に約３×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、記載される組成物、プロセス、及び方法は、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約１０ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約９ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約８ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約７ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約６ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約５ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約４ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約３ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約２ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ヒトもしくはマウスＯＸ４０に約１ｎＭ以下のＩＣ_５０で結合する、ＯＸ４０アゴニストを含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＭＥＤＩ０５６２またはＭＥＤＩ－０５６２としても知られるタボリキシズマブである。タボリキシズマブは、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，Ｉｎｃ．の子会社であるＭｅｄＩｍｍｕｎｅから入手可能である。タボリキシズマブは、免疫グロブリンＧ１－カッパ、抗［ホモサピエンスＴＮＦＲＳＦ４（腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバー４、ＯＸ４０、ＣＤ１３４）］、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体である。タボリキシズマブのアミノ酸配列を表１２に示す。タボリキシズマブは、３０１及び３０１”位にＮ－グリコシル化部位（フコシル化複合二分岐ＣＨＯ型グリカンを有する）、２２－９５位（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）、１４８－２０４位（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）、２６５－３２５位（Ｃ_Ｈ２）、及び３７１－４２９位（Ｃ_Ｈ３）（及び２２”－９５”、１４８”－２０４”、２６５”－３２５”、及び３７１”－４２９”位）に重鎖鎖内ジスルフィド架橋、２３’－８８’位（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）及び１３４’－１９４’位（Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｌ）（及び２３’’’－８８’’’及び１３４’’’－１９４’’’位）に軽鎖鎖内ジスルフィド架橋、２３０－２３０”及び２３３－２３３”位に重鎖鎖内ジスルフィド架橋、ならびに２２４－２１４’及び２２４”－２１４’’’に鎖間重鎖－軽鎖ジスルフィド架橋を含む。様々な固形腫瘍適応症におけるタボリキシズマブの現在の臨床試験には、米国国立衛生研究所のｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子ＮＣＴ０２３１８３９４及びＮＣＴ０２７０５４８２が含まれる。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号８７によって示される重鎖及び配列番号８８によって示される軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８７及び配列番号８８に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号８９に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号９０に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖ抗体を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号９１、配列番号９２、及び配列番号９３に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号９４、配列番号９５、及び配列番号９６に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、タボリキシズマブに関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照バイオ製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、タボリキシズマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、タボリキシズマブである。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、タボリキシズマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、タボリキシズマブである。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能な完全ヒト抗体である１１Ｄ４である。１１Ｄ４の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号、同第８，２３６，９３０号、及び同第９，０２８，８２４号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。１１Ｄ４のアミノ酸配列を表１３に示す。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号９７によって示される重鎖及び配列番号９８によって示される軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９７及び配列番号９８に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号９９に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号１００に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号９９及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号１０１、配列番号１０２、及び配列番号１０３に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１０４、配列番号１０５、及び配列番号１０６に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、１１Ｄ４に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照バイオ製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、１１Ｄ４である。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、１１Ｄ４である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、１１Ｄ４である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、１１Ｄ４である。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．から入手可能な完全ヒト抗体である１８Ｄ８である。１８Ｄ８の調製及び特性は、米国特許第７，９６０，５１５号、同第８，２３６，９３０号、及び同第９，０２８，８２４号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。１８Ｄ８のアミノ酸配列を表１４に示す。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、配列番号１０７によって示される重鎖及び配列番号１０８によって示される軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号１０８に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１０７及び配列番号７８に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号１１７に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号１１８に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号１１９、配列番号１２０、及び配列番号１２１に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１２２、配列番号１２３、及び配列番号１２４に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、１８Ｄ８に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照バイオ製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、１８Ｄ８である。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、１８Ｄ８である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、１８Ｄ８である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、１８Ｄ８である。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ｐｌｃ．から入手可能なヒト化抗体であるＨｕ１１９－１２２である。Ｈｕ１１９－１２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２０１２／０２７３２８号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１１９－１２２のアミノ酸配列を表１５に示す。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号１１７に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号１１８に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１１７及び配列番号１１８に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号１１９、配列番号１２０、及び配列番号１２１に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１２２、配列番号１２３、及び配列番号１２４に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１１９－１２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照バイオ製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１１９－１２２である。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１１９－１２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１１９－１２２である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１１９－１２２である。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ｐｌｃ．から入手可能なヒト化抗体であるＨｕ１０６－２２２である。Ｈｕ１０６－２２２の調製及び特性は、米国特許第９，００６，３９９号及び同第９，１６３，０８５号、ならびに国際特許公開第ＷＯ２０１２／０２７３２８号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。Ｈｕ１０６－２２２のアミノ酸配列を表１６に示す。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６－２２２の重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号１２５に示される配列を含み、ＯＸ４０アゴニスト軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号１２６に示される配列、及びその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、それぞれ、配列番号１２７、配列番号１２８、及び配列番号１２９に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１３０、配列番号１３１、及び配列番号１３２に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、ならびにそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｈｕ１０６－２２２に関して薬物規制当局によって承認されたＯＸ４０アゴニストバイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーモノクローナル抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照バイオ製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含むＯＸ４０抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１０６－２２２である。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可されたまたは認可を得るために提出されたＯＸ４０アゴニスト抗体であり、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１０６－２２２である。ＯＸ４０アゴニスト抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合ＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１０６－２２２である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、Ｈｕ１０６－２２２である。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニスト抗体は、ＭＥＤＩ６４６９（９Ｂ１２とも称される）である。ＭＥＤＩ６４６９は、マウスモノクローナル抗体である。Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６，２９，５７５－５８５。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６，２９，５７５－５８５に記載されているように、Ｂｉｏｖｅｓｔ Ｉｎｃ．（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に寄託された９Ｂ１２ハイブリドーマによって産生された抗体であり、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９のＣＤＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＭＥＤＩ６４６９の重鎖可変領域配列及び／または軽鎖可変領域配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｌ１０６ ＢＤ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製品番号３４０４２０）である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製品番号３４０４２０）のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体Ｌ１０６（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製品番号３４０４２０）の重鎖可変領域配列及び／または軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＡＣＴ３５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２００７３）である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２００７３）のＣＤＲを含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、抗体ＡＣＴ３５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号２００７３）の重鎖可変領域配列及び／または軽鎖可変領域配列を含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ、ＢｉｏＸｃｅｌｌ Ｉｎｃ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）から市販されているマウスモノクローナル抗体抗ｍＣＤ１３４／ｍＯＸ４０（クローンＯＸ８６）である。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、国際特許出願公開第ＷＯ９５／１２６７３号、同第ＷＯ９５／２１９２５号、同第ＷＯ２００６／１２１８１０号、同第ＷＯ２０１２／０２７３２８号、同第ＷＯ２０１３／０２８２３１号、同第ＷＯ２０１３／０３８１９１号、及び同第ＷＯ２０１４／１４８８９５号、欧州特許出願第ＥＰ０６７２１４１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／１３６０３０号、同第ＵＳ２０１４／３７７２８４号、同第ＵＳ２０１５／１９０５０６号、及び同第ＵＳ２０１５／１３２２８８号（クローン２０Ｅ５及び１２Ｈ３を含む）、ならびに米国特許第７，５０４，１０１号、同第７，５５０，１４０号、同第７，６２２，４４４号、同第７，６９６，１７５号、同第７，９６０，５１５号、同第７，９６１，５１５号、同第８，１３３，９８３号、同第９，００６，３９９号、及び同第９，１６３，０８５号に記載されるＯＸ４０アゴニストから選択され、その各々の開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、構造Ｉ－Ａ（Ｃ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）もしくは構造Ｉ－Ｂ（Ｎ末端Ｆｃ抗体断片融合タンパク質）に示されるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質、またはそれらの断片、誘導体、複合体、バリアント、もしくはバイオシミラーである。構造Ｉ－Ａ及びＩ－Ｂの特性は、上記及び米国特許第９，３５９，４２０号、同第９，３４０，５９９号、同第８，９２１，５１９号、及び同第８，４５０，４６０号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。図１１０に示される構造Ｉ－Ａのポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、表９に見出される。Ｆｃドメインは、好ましくは、完全な定常ドメイン（配列番号６２のアミノ酸１７～２３０）、完全なヒンジドメイン（配列番号６２のアミノ酸１～１６）、またはヒンジドメインの一部（例えば、配列番号３１のアミノ酸４～１６）を含む。Ｃ末端Ｆｃ抗体を結合するための好ましいリンカーは、追加のポリペプチドの融合に好適なリンカーを含む、配列番号６２～配列番号７２に示される実施形態から選択され得る。同様に、図１１０に示される構造Ｉ－Ｂのポリペプチドドメインのアミノ酸配列は、表１０に見出される。Ｆｃ抗体断片が構造Ｉ－ＢにあるようなＴＮＲＦＳＦ融合タンパク質のＮ末端に融合される場合、Ｆｃモジュールの配列は、好ましくは、配列番号７３に示されるものであり、リンカー配列は、好ましくは、配列番号７４～配列番号７６に示される実施形態から選択される。

いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、タボリキシズマブの可変重鎖及び可変軽鎖、１１Ｄ４の可変重鎖及び可変軽鎖、１８Ｄ８の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１１９－１２２の可変重鎖及び可変軽鎖、Ｈｕ１０６－２２２の可変重鎖及び可変軽鎖、表１７に記載の可変重鎖及び可変軽鎖から選択される可変重鎖及び可変軽鎖、前述の可変重鎖及び可変軽鎖の任意の組み合わせ、ならびにそれらの断片、誘導体、複合体、バリアント、及びバイオシミラーからなる群から選択される１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１３３による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、可溶性ＯＸ４０Ｌ配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１３４による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、配列番号１３５による配列を含む１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含む。

いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号８９及び配列番号９０に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインは、リンカーによって結合されている。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号６８及び配列番号１００に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインは、リンカーによって結合されている。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号１０９及び配列番号１１０に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインは、リンカーによって結合されている。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号１２７及び配列番号１２８に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインは、リンカーによって結合されている。いくつかの実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、それぞれ、配列番号１２５及び配列番号１２６に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインは、リンカーによって結合されている。いくつか実施形態では、構造Ｉ－ＡまたはＩ－ＢによるＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質は、各々が、表１７に示されるＶ_Ｈ配列及びＶ_Ｌ配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ配列及びＶ_Ｌ配列を含むｓｃＦｖドメインである１つ以上のＯＸ４０結合ドメインを含み、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインはリンカーによって結合されている。

いくつか実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／またはＣ末端に追加のドメインをさらに含み、追加のドメインは、ＦａｂまたはＦｃ断片ドメインである。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＯＸ４０結合ドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＯＸ４０結合ドメインを含むＯＸ４０アゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、Ｎ末端及び／またはＣ末端に追加のドメインをさらに含み、追加のドメインは、ＦａｂまたはＦｃ断片ドメインであり、可溶性ＯＸ４０ドメインは各々、茎領域（三量体化に寄与し、細胞膜まである特定の距離を提供するが、ＯＸ４０結合ドメインの一部分ではない）を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは独立して、３～８アミノ酸長を有する。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、（ｉ）第１の可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｉ）第１のペプチドリンカー、（ｉｉｉ）第２の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメイン、（ｉｖ）第２のペプチドリンカー、及び（ｖ）第３の可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインを含むＯＸ４０アゴニスト一本鎖融合ポリペプチドであり、可溶性ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは各々、茎領域を欠き、第１及び第２のペプチドリンカーは独立して、３～８アミノ酸長であり、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインドメインは、ＯＸ４０結合ドメインである。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＭＥＤＩ６３８３である。ＭＥＤＩ６３８３は、ＯＸ４０アゴニスト融合タンパク質であり、米国特許第６，３１２，７００号に記載されているように調製することができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつか実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、前述のＶ_Ｌドメインのうちのいずれかに連結された前述のＶ_Ｈドメインのうちのいずれかを含むＯＸ４０アゴニストｓｃＦｖ抗体である。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹ，ＵＳＡから市販されているＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ ＯＸ４０アゴニストモノクローナル抗体ＭＯＭ－１８４５５である。

いくつかの実施形態では、ＯＸ４０アゴニストは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから市販されているＯＸ４０アゴニスト抗体クローンＢｅｒ－ＡＣＴ３５である。

任意選択的な細胞生存率分析
任意選択で、細胞生存率アッセイは、当該技術分野で知られている標準のアッセイを使用して、プライミングによる第１の拡張（初期バルク拡張と称されることもある）後に行われ得る。したがって、ある特定の実施形態では、方法は、プライミングによる第１の拡張後に細胞生存率アッセイを行うことを含む。例えば、死細胞を選択的に標識し、生存率の評価を可能にするトリパンブルー排除アッセイが、バルクＴＩＬの試料上で行われ得る。生存率の試験に使用する他のアッセイには、アラマーブルーアッセイ及びＭＴＴアッセイが含まれるが、これらに限定されない。

細胞数、生存率、フローサイトメトリー
いくつかの実施形態では、細胞数及び／または生存率が測定される。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６などであるが、これらに限定されないマーカー、ならびに本明細書に開示または記載される任意の他のマーカーの発現は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、例えば、ＢＤ Ｂｉｏ－ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から市販されているものであるが、これに限定されない抗体を用いたフローサイトメトリーによって測定され得る。細胞は、使い捨てのｃチップ血球計数器（ＶＷＲ，Ｂａｔａｖｉａ，ＩＬ）を使用して手動で計数することができ、生存率は、トリパンブルー染色を含むが、これに限定されない、当該技術分野で知られている任意の方法を使用して評価することができる。細胞生存率は、米国特許出願公開第２０１８／０２８２６９４号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に基づいてアッセイされ得る。細胞生存率は、米国特許公開第２０１８／０２８０４３６号または国際特許公開第ＷＯ／２０１８／０８１４７３号（いずれもあらゆる目的のためにそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に基づいてアッセイすることもできる。

いくつかの事例では、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察されるプロトコルを使用して直ちに凍結保存され得る。あるいは、以下で論じられるように、バルクＴＩＬ集団がＲＥＰに供されて、凍結保存され得る。同様に、遺伝子修飾ＴＩＬが療法に使用される場合、バルクまたはＲＥＰ ＴＩＬ集団が好適な治療のために遺伝子修飾に供され得る。

細胞培養
いくつかの実施形態では、上で考察され、図１０９及び１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に例示されたものを含む、ＴＩＬを拡張するための方法は、約５，０００ｍＬ～約２５，０００ｍＬの細胞培地、約５，０００ｍＬ～約１０，０００ｍＬの細胞培地、または約５，８００ｍＬ～約８，７００ｍＬの細胞培地を使用することを含み得る。いくつかの実施形態では、培地は、無血清培地である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張における培地は、無血清である。いくつかの実施形態では、第２の拡張における培地は、無血清である。いくつかの実施形態では、プライミングによる第１の拡張及び第２の拡張（急速な第２の拡張とも称される）における培地は、両方とも無血清である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの数を拡張することは、わずか１種類の細胞培養培地を使用する。任意の好適な細胞培養培地、例えば、ＡＩＭ－Ｖ細胞培地（Ｌ－グルタミン、５０μＭの硫酸ストレプトマイシン、及び１０μＭの硫酸ゲンタマイシン）細胞培養培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）が使用され得る。これに関して、本発明の方法は、ＴＩＬの数を拡張するために必要な培地の量及び培地の種類の数を有利に減少させる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの数を拡張することは、３日または４日に１回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内で細胞の数を拡張することは、細胞を拡張するために必要なフィード頻度を減少させることによって、細胞の数を拡張するために必要な手順を簡素化する。

いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培養培地は、濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞の数を拡張するために必要な手順を簡素化することができる。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を欠いている。

いくつかの実施形態では、方法の期間は、哺乳動物から腫瘍組織試料を取得することと、プライミングによる第１の拡張として約１～８日間、例えば約７日間、またはプライミングによる第１の拡張として約８日間にわたってＩＬ－２、１倍の抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養することと、ＴＩＬを第２のガス透過性容器に移し、ＩＬ－２、２倍の抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬの数を約７～９日間、例えば約７日間、約８日間、または約９日間にわたって拡張することと、を含む。

いくつかの実施形態では、方法の期間は、哺乳動物から腫瘍組織試料を取得することと、プライミングによる第１の拡張として約１～７日間、例えば約７日間にわたってＩＬ－２、１倍の抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養することと、ＴＩＬを第２のガス透過性容器に移し、ＩＬ－２、２倍の抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬの数を約７～１４日間、または約７～９日間、例えば約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、または約１１日間にわたって拡張することと、を含む。

いくつかの実施形態では、方法の期間は、哺乳動物から腫瘍組織試料を取得することと、プライミングによる第１の拡張として約１～７日間、例えば約７日間にわたってＩＬ－２、１Ｘ抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第１のガス透過性容器内で腫瘍組織試料を培養することと、ＴＩＬを第２のガス透過性容器に移し、ＩＬ－２、２Ｘ抗原提示フィーダー細胞、及びＯＫＴ－３を含む細胞培地を含有する第２のガス透過性容器内でＴＩＬの数を約７～１０日間、または約７～１１日間、例えば約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、または約１１日間にわたって拡張することと、を含む。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、ガス透過性容器内で拡張される。ガス透過性容器は、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７Ａ１号に記載されるものを含む、当該技術分野で知られている方法、組成物、及びデバイスを使用して、ＰＢＭＣを使用してＴＩＬを拡張するために使用されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７Ａ１号に記載される任意のガス透過性透過性容器（複数可）は、本発明の容器の１つ以上の成分、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７Ａ１号に記載されるガス透過性表面（複数可能）を提供するように構成されていてもよく、またはそこに記載される任意の容器中のガス透過性表面（複数可）において、これを本発明の容器内に提供されるガス透過性表面（複数可）のうちの１つ以上として利用または組み込まれてもよいことが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、ガス透過性バッグ内で拡張される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｘｕｒｉ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｗ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などのガス透過性バッグ内のＴＩＬを拡張する細胞拡張システムを使用して拡張される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｘｕｒｉ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｗ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）としても知られるＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍなどのガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡張する細胞拡張システムを使用して拡張される。いくつかの実施形態では、細胞拡張システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、及び約１０Ｌからなる群から選択される体積を有するガス透過性細胞バッグを含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを拡張するために使用されるガス透過性容器またはガス透過性バッグは、細胞培養デバイス３００（例えば、図１３０Ａ～１４４Ｂに示されるような）である。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、Ｇ－ＲＥＸフラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇから市販されている）内で拡張され得る。かかる実施形態は、細胞集団が約５×１０^５細胞／ｃｍ^２～１０×１０^６及び３０×１０^６細胞／ｃｍ^２まで拡張するのを可能にする。いくつかの実施形態では、これは、フィードなしである。いくつかの実施形態では、これは、培地がＧ－ＲＥＸフラスコ内の約１０ｃｍの高さに存在する限り、フィードなしである。いくつかの実施形態では、これは、フィードなしであるが、１つ以上のサイトカインの追加を伴う。いくつかの実施形態では、サイトカインを培地と混合する必要なしに、サイトカインがボーラスとして追加され得る。かかる容器、デバイス、及び方法は、当該技術分野で知られており、ＴＩＬを拡張するために使用されており、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第ＷＯ２０１４／２１００３６Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０１１５６１７Ａ１号、国際公開第ＷＯ２０１３／１８８４２７Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／０１３６２２８Ａ１号、米国特許第ＵＳ８，８０９，０５０Ｂ２号、国際公開第ＷＯ２０１１／０７２０８８Ａ２号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／０２０８２１６Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１２／０２４４１３３Ａ１号、国際公開第ＷＯ２０１２／１２９２０１Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３／０１０２０７５Ａ１号、米国特許第ＵＳ８，９５６，８６０Ｂ２号、国際公開第ＷＯ２０１３／１７３８３５Ａ１号、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０１７５９６６Ａ１号に記載されるものを含み、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。かかるプロセスも、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２，３５：２８３－２９２に記載されている。

ＴＩＬにおける遺伝子の任意選択的なノックダウンまたはノックアウト
いくつかの実施形態では、本発明の拡張ＴＩＬは、タンパク質発現を一過的に変化させるために、各々本明細書で提供されるように、閉鎖滅菌製造プロセス中を含む、拡張ステップ前、拡張ステップ中、または拡張ステップ後にさらに操作される。いくつかの実施形態では、一過的に変化したタンパク質発現は、一過性の遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、本発明の拡張ＴＩＬは、ＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過的に変化させることができる転写因子（ＴＦ）及び／または他の分子で処理される。いくつかの実施形態では、タンパク質発現を一過的に変化させることができるＴＦ及び／または他の分子は、腫瘍抗原の発現の変化及び／またはＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する。

ある特定の実施形態では、方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、及び／または第３のＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のタンパク質の発現の促進または１つ以上のタンパク質の発現の阻害、ならびに一組のタンパク質の促進及び別の組のタンパク質の阻害の両方の組み合わせの同時発生のために、リボ核酸（ＲＮＡ）挿入、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または低分子（もしくは短）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のＴＩＬ集団への挿入などのヌクレオチド挿入による遺伝子編集を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の拡張ＴＩＬは、タンパク質発現の一過性の変化を受ける。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるようなステップＡから取得されたＴＩＬ集団を含む、例えば、第１の拡張前のバルクＴＩＬ集団において起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように、例えば、ステップＢで拡張されたＴＩＬ集団におけるものを含む、第１の拡張中に起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図１に示されるように、ステップＢから取得され、ステップＣに含まれるＴＩＬ集団である、例えば、第１の拡張と第２の拡張との間の移行中のＴＩＬ集団（例えば、本明細書に記載の第２のＴＩＬ集団）を含む、第１の拡張後に起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図１に示されるように、例えば、ステップＣから取得され、ステップＤでのその拡張前のＴＩＬ集団を含む、第２の拡張前のバルクＴＩＬ集団において起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図１に示されるように、例えば、ステップＤで拡張されたＴＩＬ集団（例えば、第３のＴＩＬ集団）を含む、第２の拡張中に起こる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、図１に示されるように、例えば、ステップＤでの拡張から取得されたＴＩＬ集団を含む、第２の拡張後に起こる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過的に変化させる方法は、エレクトロポレーションステップを含む。エレクトロポレーション法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｔｓｏｎｇ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９１，６０，２９７－３０６及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７Ａ１号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過的に変化させる方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング、及びエンドサイトーシス）は、当該技術分野で知られており、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７３，５２，４５６－４６７、Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７９，７６，１３７３－１３７６、及びＣｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｒｅａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，７，２７４５－２７５２、ならびに米国特許第５，５９３，８７５号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過的に変化させる方法は、リポソームトランスフェクションステップを含む。リポソームトランスフェクション法、例えば、カチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を用いる方法は、当該技術分野において既知であり、Ｒｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９１，１０，５２０－５２５及びＦｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，７４１３－７４１７、ならびに米国特許第５，２７９，８３３号、同第５，９０８，６３５号、同第６，０５６，９３８号、同第６，１１０，４９０号、同第６，５３４，４８４号、及び同第７，６８７，０７０号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団におけるタンパク質発現を一過的に変化させる方法は、米国特許第５，７６６，９０２号、同第６，０２５，３３７号、同第６，４１０，５１７号、同第６，４７５，９９４号、及び同第７，１８９，７０５号に記載されている方法を使用するトランスフェクションステップを含み、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、幹細胞メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増加をもたらす。ＴＳＣＭは、抗原を経験したセントラルメモリーＴ細胞の初期前駆細胞である。ＴＳＣＭは、一般に、幹細胞を定義する長期生存、自己再生、及び多分化能を示し、一般に、効果的なＴＩＬ製品の生成に望ましいものである。ＴＳＣＭは、養子細胞移植のマウスモデルにおいて他のＴ細胞サブセットと比較して増強された抗腫瘍活性を示している。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、高い割合のＴＳＣＭを含む組成を有するＴＩＬ集団をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＳＣＭパーセンテージの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＬ集団中のＴＳＣＭの少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、または１０倍の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＴＳＣＭを有するＴＩＬ集団をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のＴＳＣＭを有する治療的ＴＩＬ集団をもたらす。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、抗原を経験したＴ細胞の幼若化をもたらす。いくつかの実施形態では、幼若化には、例えば、増加した増殖、増加したＴ細胞活性化、及び／または増加した抗原認識が含まれる。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを保存するために、Ｔ細胞の大部分における発現を変化させる。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを変化させない。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを維持する。

いくつかの実施形態では、タンパク質の一過性の変化は、特定の遺伝子の発現の変化をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１（ＰＤＣＤ１またはＣＣ２７９とも称される）、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１、胸腺細胞選択関連高移動度群（ＨＭＧ）ボックス（ＴＯＸ）、アンキリンリピートドメイン１１（ＡＮＫＲＤ１１）、ＢＣＬ６コリプレッサー（ＢＣＯＲ）、及び／またはｃＡＭＰタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を含むが、これらに限定されない遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＴＬＡ－４、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＮＯＴＣＨ １／２ ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１、胸腺細胞選択関連高移動度群（ＨＭＧ）ボックス（ＴＯＸ）、アンキリンリピートドメイン１１（ＡＮＫＲＤ１１）、ＢＣＬ６コリプレッサー（ＢＣＯＲ）、及び／またはｃＡＭＰタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）からなる群から選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦＢＲ２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４／５を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＴＬＡ－４を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性変化は、ＣＩＳＨを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－１２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－１５を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ１／２ ＩＣＤを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＧＩＴを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＥＴ２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦβを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ５を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＳＣＲ３を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ８を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２２を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ１７を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性変化は、ＶＨＬを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤを標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性変化は、胸腺細胞選択関連高移動度群（ＨＭＧ）ボックス（ＴＯＸ）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、アンキリンリピートドメイン１１（ＡＮＫＲＤ１１）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性変化は、ＢＣＬ６コリプレッサー（ＢＣＯＲ）を標的とする。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を標的とする。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ケモカイン受容体の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、一過性タンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１－β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、及び／またはＣＣＬ１７を含むが、これらに限定されないリガンドを有する受容体を含む。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＢＬＢ、ＣＩＳＨ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＴＧＦβＲ２、及び／またはＴＧＦβの発現の低下及び／または減少をもたらす（例えば、ＴＧＦβ経路の遮断をもたらすことを含む）。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ－Ｂ）の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ－３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ－３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＧＩＴの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＥＴ２の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦβＲ２の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦβの発現の低下及び／または減少をもたらす。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、腫瘍部位へのＴＩＬの輸送または移動を改善するために、ケモカイン受容体の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、及び／またはＣＳＣＲ３からなる群から選択されるケモカイン受容体の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、インターロイキンの発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１からなる群から選択されるインターロイキンの発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ１／２ ＩＣＤの発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＶＨＬの発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤの発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１の発現の増加及び／または過剰発現をもたらす。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の発現の低下及び／または減少をもたらす。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される２つの分子の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ならびにＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つの分子の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、及びそれらの組み合わせの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ならびにＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、及びそれらの組み合わせのうちの１つの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＬＡＧ３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＣＩＳＨの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＣＢＬＢの発現の減少及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＴＩＭ３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１及びＴＥＴ２の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＴＬＡ－４及びＬＡＧ３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＴＬＡ－４及びＣＩＳＨの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＴＬＡ－４及びＣＢＬＢの発現の減少及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＴＬＡ－４及びＴＩＭ３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＴＬＡ－４及びＴＩＧＩＴの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＴＬＡ－４及びＴＥＴ２の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＩＳＨの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＢＬＢの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＴＩＧＩＴの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＴＥＴ２の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨ及びＴＩＭ３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨ及びＴＩＧＩＴの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨ及びＴＥＴ２の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢ及びＴＩＭ３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢ及びＴＩＧＩＴの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢ及びＴＥＴ２の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＰＤ－１の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３の発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＩＳＨの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＢＬＢの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＴＩＧＩＴの発現の低下及び／または減少をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＴＥＴ２の発現の低下及び／または減少をもたらす。

いくつかの実施形態では、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルス法によって、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、または採取されたＴＩＬ集団に挿入される（例えば、接着分子の発現が増加する）。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現の低下及び／または減少、ならびにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、及びそれらの組み合わせの発現の増加及び／または増強をもたらす。いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される分子の発現の低下及び／または減少、ならびにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、及びそれらの組み合わせの発現の増加及び／または増強をもたらす。

いくつかの実施形態では、発現が約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９０％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９９％減少する。

いくつかの実施形態では、発現が約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％、約９０％、または約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９０％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９５％増加する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９９％増加する。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＬにおけるタンパク質発現を一過的に変化させることができる転写因子（ＴＦ）及び／または他の分子でのＴＩＬの処理によって誘導される。いくつかの実施形態では、ＳＱＺベクターを含まないマイクロ流体プラットフォームが、タンパク質発現を一過的に変化させることができる転写因子（ＴＦ）及び／または他の分子の細胞内送達のために用いられる。かかる方法は、転写因子を含むタンパク質を、Ｔ細胞を含む様々な初代ヒト細胞に送達する能力を示す（これらは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１９／００９３０７３Ａ１号、同第ＵＳ２０１８／０２０１８８９Ａ１号、及び同第ＵＳ２０１９／００１７０７２Ａ１号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）。かかる方法は、国際特許公開第ＷＯ２０１３／０５９３４３Ａ１号、同第ＷＯ２０１７／００８０６３Ａ１号、及び同第ＷＯ２０１７／１２３６６３Ａ１号に記載されており、ＴＩＬ集団を、転写因子（ＴＦ）及び／または一過性タンパク質発現を誘導することができる他の分子に曝露するために本発明で用いることができ、上述のＴＦ、及び／または一過性タンパク質発現を誘導することができる他の分子は、腫瘍抗原の増加した発現、及び／またはＴＩＬ集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供し、したがって、ＴＩＬ集団の再プログラミングをもたらし、再プログラミングされていないＴＩＬ集団と比較して、再プログラミングされたＴＩＬ集団の治療的有効性の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、再プログラミングは、本明細書に記載されるように、ＴＩＬ開始集団またはＴＩＬ前集団（すなわち、再プログラミング前の）集団と比較して、エフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞の亜集団の増加をもたらす。

いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）には、ＴＣＦ－１、ＮＯＴＣＨ１／２ ＩＣＤ、及び／またはＭＹＢが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、ＴＣＦ－１である。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、ＮＯＴＣＨ１／２ ＩＣＤである。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、ＭＹＢである。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、さらなるＴＩＬ再プログラミングを誘導するために、市販のＫＮＯＣＫＯＵＴ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）などの誘導多能性幹細胞培養物（ｉＰＳＣ）とともに投与される。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、さらなるＴＩＬ再プログラミングを誘導するために、ｉＰＳＣカクテルとともに投与される。いくつかの実施形態では、転写因子（ＴＦ）は、ｉＰＳＣカクテルなしで投与される。いくつかの実施形態では、再プログラミングは、ＴＳＣＭのパーセンテージの増加をもたらす。いくつかの実施形態では、再プログラミングは、ＴＳＣＭのパーセンテージの約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％ＴＳＣＭの増加をもたらす。

いくつかの実施形態では、上記のようにタンパク質発現を一過的に変化させる方法は、ＴＩＬの集団を遺伝子修飾する方法と組み合わせられてもよく、１つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定した組み込みステップを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾するステップを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、及び／または第３のＴＩＬ集団を遺伝子修飾することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、レトロウイルス形質導入ステップを含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、レンチウイルス形質導入ステップを含む。レンチウイルス形質導入系は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｌｅｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６，１０３，１７３７２－７７、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，１５，８７１－７５、Ｄｕｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９８，７２，８４６３－７１、及び米国特許第６，６２７，４４２号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入ステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入系は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｃｅｐｋｏ ａｎｄ Ｐｅａｒ，Ｃｕｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６，９．９．１－９．９．１６に記載されており、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入ステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入系は、当該技術分野で知られており、トランスポザーゼが、ＤＮＡ発現ベクターとしてまたは発現可能なＲＮＡもしくはタンパク質として提供される系を含み、これにより、トランスポザーゼ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡ尾部を含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポザーゼの長期発現がトランスジェニック細胞で起こらないようになる。ＳＢ１０、ＳＢ１１、及びＳＢ１００ｘなどのサケ科型Ｔｅｌ様トランスポザーゼ（ＳＢまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ）を含む好適なトランスポゾン媒介遺伝子導入系、ならびに増加した酵素活性を有する操作された酵素は、例えば、Ｈａｃｋｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０，１８，６７４－８３及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬ中のタンパク質発現の一過性変化は、短干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られることもある、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、一般に１９～２５塩基対長の二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において使用され、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現に干渉する。

いくつかの実施形態では、タンパク質発現の一過性変化は、発現の低下である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬにおけるタンパク質発現の一過性の変化は、高パーセンテージの２’－ＯＨ置換（典型的にはフッ素または－ＯＣＨ_３）を有する化学的に合成された非対称ｓｉＲＮＡ二重鎖である自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄＲＮＡ）によって誘導され、これはテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用してその３’末端でコレステロールに複合された、２０ヌクレオチドアンチセンス（ガイド）鎖及び１３～１５塩基センス（パッセンジャー）鎖を含む。短干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られることもある、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、一般に１９～２５塩基対長の二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において使用され、相補的なヌクレオチド配列を有する特定の遺伝子の発現に干渉する。ｓｄＲＮＡは、共有結合及び疎水的に修飾されたＲＮＡｉ化合物であり、細胞に侵入するために送達ビヒクルを必要としない。ｓｄＲＮＡは、一般に、最小限の二本鎖領域を有する非対称の化学修飾された核酸分子である。ｓｄＲＮＡ分子は、典型的に一本鎖領域及び二本鎖領域を含み、分子の一本鎖領域及び二本鎖領域の両方に様々な化学修飾を含み得る。加えて、ｓｄＲＮＡ分子は、本明細書に記載されているように、従来の高度なステロール型分子などの疎水性コンジュゲートに結合することができる。ｓｄＲＮＡ及びかかるｓｄＲＮＡを作製するための関連方法は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／０３０４８７３Ａ１号、同第ＵＳ２０１９／０２１１３３７Ａ１号、同第ＵＳ２００９／０１３１３６０Ａ１号、及び同第ＵＳ２０１９／００４８３４１Ａ１号、ならびに米国特許第１０，６３３，６５４号及び同第１０，９１３，９４８Ｂ２号（これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）にも広く記載されている。ｓｄＲＮＡ構造、化学、標的化位置、配列の好みなどを最適化するために、ｓｄＲＮＡ効力予測用のアルゴリズムが開発及び利用されている。これらの分析に基づいて、機能的なｓｄＲＮＡ配列は、一般に、１μＭの濃度で７０％を超える発現の減少を有すると定義されており、確率は４０％を超える。

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、一般に、ＲＮＡの相補鎖の対、一般にセンス（パッセンジャー）鎖及びアンチセンス（ガイド）鎖を含む任意の分子を定義するために使用することができ、一本鎖オーバーハング領域を含み得る。ｓｉＲＮＡとは対照的に、ｄｓＲＮＡという用語は、一般に、ダイサーを含む切断酵素系の作用によりより大きいｄｓＲＮＡ分子から放出されるｓｉＲＮＡ分子の配列を含む前駆体分子を指す。

いくつかの実施形態では、方法は、ＣＣＲを発現するように修飾されたＴＩＬを含むＴＩＬ集団におけるタンパク質発現の一過性変化を含み、例えば、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用して２０ヌクレオチドアンチセンス（ガイド）鎖及び３’末端でコレステロールにコンジュゲートされた１３～１５塩基センス（パッセンジャー）鎖を含む、高いパーセンテージの２’－ＯＨ置換（典型的にはフッ素または－ＯＣＨ_３）を有する化学的に合成された非対称ｓｉＲＮＡ二本鎖である、自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄＲＮＡ）の使用を含む。ｓｉＲＮＡ及びｓｄＲＮＡを使用する方法は、Ｋｈｖｏｒｏｖａ ａｎｄ Ｗａｔｔｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７，３５，２３８－２４８、Ｂｙｒｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｃｕｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３，２９，８５５－８６４、及びＬｉｇｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８，２６，１４８２－９３（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡの送達は、エレクトロポレーションまたは細胞膜破壊（スクイーズまたはＳＱＺ法など）を使用して達成される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、エレクトロポレーション、ＳＱＺ、または他の方法を使用せず、代わりに、ＴＩＬ集団が培地中１μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１～３日の期間を使用して達成される。特定の実施形態では、本方法は、ＴＩＬ集団を培地中１μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度のｓｄＲＮＡに１～３日間曝露することを含む、ＴＩＬ集団へのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡの送達を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中１０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１～３日の期間を使用して達成される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１～３日の期間を使用して達成される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ～５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１～３日の期間を使用して達成される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ～５０μＭ／１０，０００ＴＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１～３日の期間を使用して達成され、ｓｄＲＮＡへの曝露は、培地に新鮮なｓｄＲＮＡを添加することによって２、３、４、または５回行われる。他の好適なプロセスは、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１１／００３９９１４Ａ１号、同第ＵＳ２０１３／０１３１１４１Ａ１号、及び同第ＵＳ２０１３／０１３１１４２Ａ１号、ならびに米国特許第９，０８０，１７１号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、製造中にＴＩＬ集団に挿入される。いくつかの実施形態では、ｓｄＲＮＡは、ＮＯＴＣＨ１／２ ＩＣＤ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４ ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＴＧＦＢＲ２、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ＢＡＦＦ ＢＲ３、ＣＩＳＨ、及び／またはＣＢＬＢに干渉するＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、発現の減少は、例えば、フローサイトメトリー及び／またはｑＰＣＲによって評価される、遺伝子サイレンシングのパーセンテージに基づいて決定される。いくつかの実施形態では、発現が約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％、約９０％、または約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８０％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約８５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９０％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９５％減少する。いくつかの実施形態では、発現が少なくとも約９９％減少する。

ｓｉＲＮＡの化学修飾に基づく自己送達可能なＲＮＡｉ技術を本発明の方法とともに用いて、本明細書に記載されるように、ｓｄＲＮＡをＴＩＬに首尾よく送達することができる。非対称ｓｉＲＮＡ構造及び疎水性リガンドとの骨格修飾の組み合わせ（例えば、Ｌｉｇｔｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８，２６，１４８２－９３及び米国特許出願公開第２０１６／０３０４８７３ Ａ１（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照）は、ｓｄＲＮＡのヌクレアーゼ安定性を利用して、培養培地に単純に添加することによって、追加の製剤及び方法なしに、ｓｄＲＮＡが培養された哺乳類細胞に浸透することを可能にする。この安定性により、単に培地中のｓｄＲＮＡの活性濃度を維持することによって、標的遺伝子活性の一定レベルのＲＮＡｉを介した減少を支援することができる。理論に拘束されることはないが、ｓｄＲＮＡの骨格安定化は、非分裂細胞で数ヶ月間続く可能性のある遺伝子発現効果の延長された低減を提供する。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの９５％を超えるトランスフェクション効率及び様々な特定のｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡによる標的の発現の減少が起こる。いくつかの実施形態では、いくつかの未修飾リボース残基を含むｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＲＮＡｉ効果の効力及び／または寿命を増加させるために、完全に修飾された配列で置き換えられた。いくつかの実施形態では、発現効果の減少は、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、５日間、６日間、７日間、または８日間以上維持される。いくつかの実施形態では、発現効果の減少は、ＴＩＬのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡ処理後１０日以上で減少する。いくつかの実施形態では、標的発現の発現の７０％を超える減少が維持される。いくつかの実施形態では、標的発現の発現の７０％を超える減少が維持されるＴＩＬ。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路における発現の減少により、ＴＩＬがより強力なインビボ効果を示すことが可能になり、これは、いくつかの実施形態では、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路の抑制効果の回避に起因する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡによるＰＤ－１の発現の減少は、ＴＩＬ拡張の増加をもたらす。

いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の７０％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の７５％の減少を示す。
いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の８０％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の８５％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９０％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９５％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９９％の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ～約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。いくつかの実施形態では、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の減少を示す。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチド剤は、療法剤の安定性及び／または有効性を増加させ、かつ治療される細胞または組織へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達をもたらすための１つ以上の修飾を含む。かかる修飾には、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－フルロ修飾、ジホスホロチオエート修飾、２’Ｆ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾、及び／または２’デオキシヌクレオチドが含まれ得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ステロール、コレステロール、ビタミンＤ、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン、及び／またはフェニルを含む１つ以上の疎水性修飾を含むように修飾される。いくつかの実施形態では、化学修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート、２’－Ｏ－メチル、２’デオキシ、疎水性修飾及びホスホロチオエートの組み合わせである。いくつかの実施形態では、糖が修飾され得、修飾された糖には、Ｄ－リボース、２’－Ｏ－アルキル（２’－Ｏ－メチル及び２’－０－エチルを含む）、すなわち、２’－アルコキシ、２’－アミノ、２’－Ｓ－アルキル、２’－ハロ（２’－フルオロを含む）、Ｔ－メトキシエトキシ、２’－アリルオキシ（－ＯＣＨ_２ＣＨ＝ＣＨ_２）、２’－プロパルギル、２’－プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル、及びシアノなどが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、糖部分は、ヘキソースであり得、Ａｕｇｕｓｔｙｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９２，１８，４７１１（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようにオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。

いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖であり、すなわち、分子のいずれかの末端にも一本鎖配列が突出しておらず、すなわち、平滑末端である。いくつかの実施形態では、個々の核酸分子は、異なる長さであり得る。言い換えれば、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖ではない。例えば、２つの別個の核酸分子が使用される場合、アンチセンス配列を含むそれらの分子の一方、例えば、第１の分子は、それにハイブリダイズする（分子の一部分を一本鎖のままにする）第２の分子よりも長い可能性がある。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子が使用される場合、いずれかの末端の分子の一部分は、一本鎖のままであり得る。

いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ミスマッチ及び／またはループもしくはバルジを含むが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖である。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖である。他の実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０％～９５％にわたって二本鎖である。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６％～９８％にわたって二本鎖である。いくつかの実施形態では、本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくともまたは最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のミスマッチを含む。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第５，８４９，９０２号（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように３’または５’結合を修飾することによって、ヌクレアーゼから実質的に保護され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、「ブロッキング基」を含めることによって耐性にすることができる。本明細書で使用される場合、「ブロッキング基」という用語は、合成のための保護基またはカップリング基のいずれかとして（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_３）、グリコール（－０－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－）ホスフェート（ＰＯ_３ ^２”）、リン酸水素、もしくはホスホロアミダイト）、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに結合され得る置換基（例えば、ＯＨ基以外）を指す。「ブロッキング基」は、修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造を含む、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端を保護する「末端ブロッキング基」または「エキソヌクレアーゼブロッキング基」も含み得る。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡ内の隣接するポリヌクレオチドの少なくとも一部分は、代替の結合、例えば、ホスホロチオエート結合によって結合されている。

いくつかの実施形態では、化学修飾は、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡの細胞取り込みの少なくとも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００パーセントの増強をもたらし得る。いくつかの実施形態では、Ｃ残基またはＵ残基の少なくとも一方が疎水性修飾を含む。いくつかの実施形態では、複数のＣ及びＵが疎水性修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ及びＵの少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％が疎水性修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃ及びＵのすべてが疎水性修飾を含む。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡ分子は、プロトン化可能なアミンの組み込みにより増強されたエンドソーム放出を示す。いくつかの実施形態では、プロトン化可能なアミンは、センス鎖（ＲＩＳＣ負荷後に廃棄される分子の一部分）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡ化合物は、二重鎖領域（１０～１５塩基長の効率的なＲＩＳＣ侵入に必要）及び４～１２ヌクレオチド長の一本鎖領域を１３ヌクレオチド二重鎖とともに含む非対称化合物を含む。いくつかの実施形態では、６ヌクレオチドの一本鎖領域が用いられる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡの一本鎖領域は、２～１２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート修飾と称される）を含む。いくつかの実施形態では、６～８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が用いられる。いくつかの実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡ化合物は、安定性を提供し、かつＲＩＳＣ侵入と互換性がある固有の化学修飾パターンを含む。ガイド鎖は、例えば、ＲＩＳＣ侵入に干渉することなく安定性を確証する任意の化学修飾によって修飾することもできる。いくつかの実施形態では、ガイド鎖における化学修飾パターンは、２’Ｆが修飾され、かつ５’末端がリン酸化されたＣ及びＵヌクレオチドの大部分を含む。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％が修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が修飾されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡのヌクレオチドの１００％が修飾されている。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡ分子は、最小の二本鎖領域を有する。いくつかの実施形態では、二本鎖である分子の領域は、８～１５ヌクレオチド長の範囲である。いくつかの実施形態では、二本鎖である分子の領域は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、１３ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に１００％の相補性が存在する場合もあれば、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に１つ以上の不一致が存在する場合もある。いくつかの実施形態では、二本鎖分子の一端で、分子は、平滑末端であるか、または１ヌクレオチドのオーバーハングを有するかのいずれかである。分子の一本鎖領域は、いくつかの実施形態では、４～１２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一本鎖領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、一本鎖領域は、４ヌクレオチド長未満または１２ヌクレオチド長超であることもできる。ある特定の実施形態では、一本鎖領域は、６または７ヌクレオチド長である。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡ分子は、増加した安定性を有する。いくつかの事例では、化学修飾されたｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡ分子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間以上、または２４時間超（任意の中間値を含む）の培地中での半減期を有する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、１２時間以上の培地中での半減期を有する。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、効力の増加及び／または毒性の低減のために最適化されている。いくつかの実施形態では、ガイド鎖及び／またはパッセンジャー鎖のヌクレオチド長、及び／またはガイド鎖及び／またはパッセンジャー鎖におけるホスホロチオエート修飾の数が、いくつかの態様では、ＲＮＡ分子の効力に影響を与え得る一方で、２’－フルオロ（２’Ｆ）修飾の２’－０－メチル（２’ＯＭｅ）修飾での置き換えは、いくつかの態様では、分子の毒性に影響を与え得る。いくつかの実施形態では、分子の２’Ｆ含有量の減少は、分子の毒性を低減すると予測される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子におけるホスホロチオエート修飾の数は、細胞への分子の取り込み、例えば、細胞への分子の受動的取り込みの効率に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、２’Ｆ修飾を有しないが、それにもかかわらず、細胞取り込み及び組織浸透における同等の有効性を特徴とする。

いくつかの実施形態では、ガイド鎖は、およそ１８～１９ヌクレオチド長であり、およそ２～１４個のリン酸修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、リン酸修飾された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、または１４個超のヌクレオチドを含み得る。ガイド鎖は、ＲＩＳＣの侵入に干渉することなく増加した安定性を付与する１つ以上の修飾を含み得る。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドなどのリン酸修飾ヌクレオチドは、３’末端にあるか、５’末端にあるか、またはガイド鎖全体に広がっている可能性がある。いくつかの実施形態では、ガイド鎖の３’末端１０ヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含む。ガイド鎖は、分子全体に位置し得る２’Ｆ及び／または２’ＯＭｅ修飾も含み得る。いくつかの実施形態では、ガイド鎖の１位のヌクレオチド（ガイド鎖の最も５’側のヌクレオチド）は、２’ＯＭｅ修飾及び／またはリン酸化されている。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾されていてもよい。例えば、１９ｎｔガイド鎖の２～１０位（または異なる長さのガイド鎖における対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾されていてもよい。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾されている場合もある。例えば、１９ｎｔガイド鎖の１１～１８位（または異なる長さのガイド鎖における対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、ガイド鎖の最も３’側の末端のヌクレオチドは修飾されていない。ある特定の実施形態では、ガイド鎖内のＣ及びＵの大部分は２’Ｆ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の実施形態では、１位及び１１～１８位のＣまたはＵは２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の実施形態では、位置１及び位置１１～１８のＣｓまたはＵｓは２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されており、２～１０位のＣまたはＵは２’Ｆ修飾されている。

自己送達可能なＲＮＡｉ技術は、追加の製剤または技法を必要とすることなくＲＮＡｉ剤（ｓｉＲＮＡ、ｓｄＲＮＡ、または他のＲＮＡｉ剤のいずれか）で細胞を直接トランスフェクトする方法を提供する。トランスフェクションが困難な細胞株をトランスフェクトする能力、高いインビボ活性、及び使用の単純さは、従来のｓｉＲＮＡベースの技法に優る重大な機能的利点を提示する組成物及び方法の特徴であり、したがって、ｓｄＲＮＡ法は、本発明のＴＩＬにおける標的遺伝子の発現を減少させる方法に関連するいくつかの実施形態で用いられる。ｓｄＲＮＡ法により、化学合成された化合物をエクスビボ及びインビボの両方で広範囲の一次細胞及び組織に直接送達することが可能になる。本明細書における本発明のいくつかの実施形態に記載のｓｄＲＮＡは、Ａｄｖｉｒｎａ ＬＬＣ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。

ｓｉＲＮＡ及びｓｄＲＮＡは、疎水的に修飾されたｓｉＲＮＡ－アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド構造として形成されてもよく、例えば、Ｂｙｒｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．，２０１３，２９，８５５－８６４（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、滅菌エレクトロポレーションを使用して本明細書に記載のＴＩＬに送達され得る。ある特定の実施形態では、方法は、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達するためにＴＩＬ集団の滅菌エレクトロポレーションを含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、膜貫通送達システムと組み合わせて細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、この膜貫通送達システムは、脂質、ウイルスベクターなどを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド剤は、自己送達ＲＮＡｉ剤であり、いかなる送達剤も必要としない。特定の実施形態では、方法は、ＴＩＬの集団にｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達するための膜貫通送達システムの使用を含む。

オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド組成物は、本明細書に記載のＴＩＬと接触し（例えば、接触させられ、本明細書では投与または送達されるとも称される）、ＴＩＬによって取り込まれる（ＴＩＬによる受動的取り込みを含む）。ｓｄＲＮＡは、第１の拡張中（例えば、ステップＢ）、第１の拡張後（例えば、ステップＣ中）、第２の拡張前または拡張中（例えば、ステップＤの前またはステップＤ中）、ステップＤ後及びステップＥにおける採取前、ステップＦにおける採取中または採取後、ステップＦにおける最終製剤化及び／または注入バッグへの移行前またはその最中、ならびにステップＦにおける任意選択的な凍結保存ステップ前に、本明細書に記載のＴＩＬに添加され得る。さらに、ｓｄＲＮＡは、ステップＦにおける任意の凍結保存ステップから解凍した後に添加され得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＩＳＨ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の１つ以上のｓｄＲＮＡ標的遺伝子が、１００ｎＭ～２０ｍＭ、２００ｎＭ～１０ｍＭ、５００ｎｍ～１ｍＭ、１μＭ～１００μＭ、及び１μＭ～１００μＭからなる群から選択される濃度でＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＩＳＨ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の１つ以上のｓｄＲＮＡ標的遺伝子は、０．１μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地、または１０μＭ ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ／１００μＬ培地からなる群から選択される量でＴＩＬ及び他の薬剤を含む細胞培養培地に添加され得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＣＩＳＨ、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の１つ以上のｓｄＲＮＡ標的遺伝子は、ＲＥＰ前段階またはＲＥＰ段階中に１日２回、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、または７日毎にＴＩＬ培養物に添加され得る。

ｓｄＲＮＡを含む本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、例えば、細胞培養培地にｓｄＲＮＡを高濃度で溶解し、かつ受動的取り込みが起こるのに十分な時間を許容することによって、拡張プロセス中に本明細書に記載のＴＩＬと接触することができる。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、ＴＩＬ集団を、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド組成物と接触させることを含む。ある特定の実施形態では、この方法は、オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｄＲＮＡを細胞培養培地に溶解することと、細胞培養培地をＴＩＬ集団と接触させることとを含む。ＴＩＬは、本明細書に記載の第１の集団、第２の集団、及び／または第３の集団であり得る。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの細胞への送達は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセロールもしくはデキストラン、エレクトロポレーションを含む好適な技術分野で認識される方法によって、またはトランスフェクションによって、例えば、当該技術分野で知られている方法、例えば、米国特許第４，８９７，３５５号、同第５，４５９，１２７号、同第５，６３１，２３７号、同第５，９５５，３６５号、同第５，９７６，５６７号、同第１０，０８７，４６４号、及び同第１０，１５５，９４５号、ならびにＢｅｒｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９３，２１，３５６７（それらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用して、カチオン性、アニオン性、もしくは中性脂質組成物またはリポソームを使用して増強され得る。

いくつかの実施形態では、１つを超えるｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡが、標的遺伝子の発現を減少させるために使用されるいくつかの実施形態では、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２及び／またはＣＩＳＨを標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡのうちの１つ以上が一緒に使用される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、１つを超える遺伝子標的の発現を減少させるために、ＴＩＭ－３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２及び／またはＣＩＳＨのうちの１つ以上とともに使用される。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ３ ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、両方の標的の遺伝子発現を減少させるために、ＣＩＳＨを標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、本明細書におけるＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３、及び／またはＣＩＳＨのうちの１つ以上を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、Ａｄｖｉｒｎａ ＬＬＣ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ，ＵＳＡ）または複数の他のベンダーから市販されている。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＥＴ２、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とし、別のｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１、ならびにＬＡＧ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３のうちの１つ、及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＴＬＡ－４を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＧＩＴを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＥＴ２を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＴＬＡ－４を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＧＩＴを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＥＴ２を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＴＬＡ－４を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＧＩＴを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＥＴ２を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＴＬＡ－４を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＧＩＴを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＥＴ２を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＰＤ－１を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＩＳＨを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＢＬＢを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＴＬＡ－４を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＧＩＴを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＥＴ２を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＴＬＡ－４を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＧＩＴを標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＣＴＬＡ－４を標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＥＴ２を標的とする。いくつかの実施形態では、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＩＧＩＴを標的とし、１つのｓｉＲＮＡまたはｓｄＲＮＡは、ＴＥＴ２を標的とする。

本明細書で考察されたように、本発明の実施形態は、それらの治療効果を増強するために遺伝子編集を介して遺伝子修飾された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を提供する。本発明の実施形態は、１つ以上のタンパク質の発現の促進及び１つ以上のタンパク質の発現の阻害の両方、ならびにそれらの組み合わせのために、ＴＩＬ集団へのヌクレオチド挿入（ＲＮＡまたはＤＮＡ）による遺伝子編集を包含する。本発明の実施形態は、ＴＩＬを治療用集団に拡張するための方法も提供し、方法は、ＴＩＬを遺伝子編集することを含む。ＴＩＬ集団を遺伝子修飾するために使用され得るいくつかの遺伝子編集技術が存在し、それらは本発明による使用に好適である。かかる方法は、以下に記載の方法、ならびに本明細書の他の場所に記載のウイルス及びトランスポゾン方法を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを遺伝子修飾してＣＣＲを発現させる方法はまた、かかる遺伝子の安定したノックアウトまたはかかる遺伝子の一過性ノックダウンのいずれかを介して遺伝子の発現を抑制する修飾を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のタンパク質の産生のための遺伝子の安定な組み込みのステップを含む、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、レトロウイルス形質導入ステップを含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、レンチウイルス形質導入ステップを含む。レンチウイルス形質導入系は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｌｅｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６，１０３，１７３７２－７７、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７，１５，８７１－７５、Ｄｕｌｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９８，７２，８４６３－７１、及び米国特許第６，６２７，４４２号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入ステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入系は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｃｅｐｋｏ ａｎｄ Ｐｅａｒ，Ｃｕｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６，９．９．１－９．９．１６に記載されており、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子導入ステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子導入系は、当該技術分野で知られており、トランスポザーゼが、ＤＮＡ発現ベクターとしてまたは発現可能なＲＮＡもしくはタンパク質として提供される系を含み、これにより、トランスポザーゼ、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡ尾部を含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポザーゼの長期発現がトランスジェニック細胞で起こらないようになる。ＳＢ１０、ＳＢ１１、及びＳＢ１００ｘなどのサケ科型Ｔｅｌ様トランスポザーゼ（ＳＢまたはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ）を含む好適なトランスポゾン媒介遺伝子導入系、ならびに増加した酵素活性を有する操作された酵素は、例えば、Ｈａｃｋｅｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０，１８，６７４－８３及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、この方法は、本明細書に記載の第１の集団、第２の集団、及び／または第３の集団におけるＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、１つ以上のタンパク質の産生または阻害（例えば、サイレンシング）のために遺伝子の安定した組み込みのステップを含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、エレクトロポレーションステップを含む。エレクトロポレーション法は、当該技術分野で知られており、例えば、Ｔｓｏｎｇ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９１，６０，２９７－３０６及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７Ａ１号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第５，０１９，０３４号、同第５，１２８，２５７号、同第５，１３７，８１７号、同第５，１７３，１５８号、同第５，２３２，８５６号、同第５，２７３，５２５号、同第５，３０４，１２０号、同第５，３１８，５１４号、同第６，０１０，６１３号、及び同第６，０７８，４９０号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどの当該技術分野で知られている他のエレクトロポレーション法が使用され得る。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、滅菌エレクトロポレーション法である。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、パルスエレクトロポレーション法である。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一オペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列は、以下の特徴のうちの１つ、２つ、または３つを有する：（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる、（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる、及び（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一オペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一オペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬの定義及び制御された永続的または一時的変更を変える、操作する、または引き起こすステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つの単一オペレーターが制御する、独立してプログラムされたＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なる。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬをパルス電場で処理して、ＴＩＬにおける細孔形成を誘導するステップを含むパルスエレクトロポレーション法であり、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列をＴＩＬに適用するステップを含み、少なくとも３つのＤＣ電気パルス列は、以下の特徴のうちの１つ、２つ、または３つを有する：（１）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス振幅が互いに異なる、（２）少なくとも３つのパルスのうちの少なくとも２つのパルス幅が互いに異なる、及び（３）少なくとも３つのパルスのうちの２つの第１のセットの第１のパルス間隔が、少なくとも３つのパルスのうちの２つの第２のセットの第２のパルス間隔とは異なり、これにより、誘導された細孔が比較的長期間にわたって持続され、ＴＩＬの生存率が維持される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング、及びエンドサイトーシス）は、当該技術分野で知られており、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７３，５２，４５６－４６７、Ｗｉｇｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９７９，７６，１３７３－１３７６、及びＣｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｒｅａ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７，７，２７４５－２７５２、ならびに米国特許第５，５９３，８７５号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、リポソームトランスフェクションステップを含む。リポソームトランスフェクション法、例えば、カチオン性脂質Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－ｎ，ｎ，ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスホチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を用いる方法は、当該技術分野において既知であり、Ｒｏｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９１，１０，５２０－５２５及びＦｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，７４１３－７４１７、ならびに米国特許第５，２７９，８３３号、同第５，９０８，６３５号、同第６，０５６，９３８号、同第６，１１０，４９０号、同第６，５３４，４８４号、及び同第７，６８７，０７０号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団を遺伝子修飾する方法は、米国特許第５，７６６，９０２号、同第６，０２５，３３７号、同第６，４１０，５１７号、同第６，４７５，９９４号、及び同第７，１８９，７０５号に記載の方法を使用するトランスフェクションステップを含み、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＴＩＬは、本明細書に記載のＴＩＬの第１の集団、第２の集団、及び／または第３の集団であり得る。

いくつかの実施形態によれば、遺伝子編集プロセスは、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子での二本鎖または一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能なヌクレアーゼの使用を含み得る。かかるプログラム可能なヌクレアーゼは、特定のゲノム遺伝子座に切断を導入することによって正確なゲノム編集を可能にし、すなわち、ゲノム内の特定のＤＮＡ配列の認識に依存して、ヌクレアーゼドメインをこの位置に標的し、標的配列での二本鎖切断の生成を媒介する。ＤＮＡの二本鎖切断は、その後、内因性修復機構を切断部位に動員して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同指向修復（ＨＤＲ）のいずれかによるゲノム編集を媒介する。したがって、切断の修復は、標的遺伝子産物を破壊する（例えば、サイレンス、抑制、または増強する）挿入／欠失変異の導入をもたらす可能性がある。

部位特異的ゲノム編集を可能にするために開発されたヌクレアーゼの主要なクラスには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が含まれる。これらのヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ認識のモードに基づいて大きく２つのカテゴリーに分類され得、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、タンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して特定のＤＮＡ結合を達成するが、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲシステムは、標的ＤＮＡと直接塩基対を形成する短いＲＮＡガイド分子によって、かつタンパク質－ＤＮＡ相互作用によって特定のＤＮＡ配列を標的とする。例えば、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２を参照されたい。

本発明のＴＩＬ拡張法に従って使用され得る遺伝子編集法の非限定的な例には、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、及びＺＦＮ法が含まれ、これらは以下でより詳細に説明される。ある実施形態によれば、ＴＩＬを治療的集団に拡張するための方法は、本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態（例えば、Ｇｅｎ２）に従って、または米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２９９６４４Ａ１号及び同第ＵＳ２０２０／０１２１７１９Ａ１号、ならびに米国特許第１０，９２５，９００号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように実行することができ、方法は、増強された治療効果を提供することができるＴＩＬを生成するために、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、またはＺＦＮ法のうちの１つ以上によって、ＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することをさらに含む。ある実施形態によれば、遺伝子編集されたＴＩＬは、インビトロでそれらを修飾されていないＴＩＬと比較することによって、例えば、修飾されていないＴＩＬと比較してインビトロでのエフェクター機能、サイトカインプロファイルなどを評価することによって、治療効果の改善について評価され得る。ある特定の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法、及び／またはＺＦＮ法を使用してＴＩＬ集団を遺伝子編集することを含む。

本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションは、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮシステム、及びＺＦＮシステムなどの遺伝子編集システムの送達のために使用される。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、フローエレクトロポレーションシステムである。本発明のいくつかの実施形態との使用に好適な、好適なフローエレクトロポレーションシステムの例は、市販のＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸシステムである。本発明との使用に好適であり得る、ＢＴＸ－Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓから入手可能なＡｇｉｌｅＰｕｌｓｅシステムもしくはＥＣＭ８３０、Ｃｅｌｌａｘｅｓｓ Ｅｌｅｋｔｒａ（Ｃｅｌｌｅｃｔｒｉｃｏｎ）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ／Ａｍａｘａ）、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ ＭＸｃｅｌｌ（ＢＩＯＲＡＤ）、ｉＰｏｒａｔｏｒ－９６（Ｐｒｉｍａｘ）、またはｓｉＰＯＲＴｅｒ９６（Ａｍｂｉｏｎ）などのいくつかの代替の市販エレクトロポレーション機器が存在する。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、ＴＩＬ拡張法の残りとともに、滅菌閉鎖系を形成する。本発明のいくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、本明細書に記載のパルスエレクトロポレーションシステムであり、ＴＩＬ拡張法の残りとともに、滅菌閉鎖系を形成する。

ＴＩＬを治療的集団に拡張するための方法は、本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態（例えば、Ｇｅｎ２）に従って、または米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２９９６４４Ａ１号及び同第ＵＳ２０２０／０１２１７１９Ａ１号、ならびに米国特許第１０，９２５，９００号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように実行することができ、方法は、ＣＲＩＳＰＲ法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することをさらに含む。特定の実施形態によれば、ＴＩＬ拡張プロセス中のＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部においてサイレンスまたは減少させる。あるいは、ＴＩＬ拡張プロセス中のＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部において増強させる。

ＣＲＩＳＰＲは、「ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート）」の略語である。遺伝子編集のためにＣＲＩＳＰＲシステムを使用する方法は、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ法とも称される。ＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を組み込み、かつ本発明に従って使用され得るＣＲＩＳＰＲシステムには、３つの型：Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型がある。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９によって例示される）は、最もよく特徴付けられているシステムのうちの１つである。

ＣＲＩＳＰＲ技術は、細菌及び古細菌（単細胞微生物のドメイン）の自然防御機構から適合された。これらの生物は、ＣＲＩＳＰＲ由来のＲＮＡ及びＣａｓ９を含む様々なＣａｓタンパク質を使用して、外来侵入物のＤＮＡを切り刻んで破壊することによって、ウイルス及び他の異物による攻撃を阻止する。ＣＲＩＳＰＲは、ヌクレオチド反復配列及びスペーサーの存在という２つの異なる特徴を有するＤＮＡの特殊な領域である。ヌクレオチドの反復配列は、ＣＲＩＳＰＲ領域全体に分布しており、外来ＤＮＡ（スペーサー）の短いセグメントが反復配列の間に散在している。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサーは、ＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座内に組み込まれ、転写され、短いＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に処理される。これらのｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニーリングし、Ｃａｓタンパク質による病原性ＤＮＡの配列特異的切断及びサイレンシングを指示する。Ｃａｓ９タンパク質による標的認識には、ｃｒＲＮＡ内の「シード」配列、及びｃｒＲＮＡ結合領域の上流にある保存されたジヌクレオチドを含むプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が必要である。これにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが再標的されて、ｃｒＲＮＡを再設計することにより、実質的にいずれのＤＮＡ配列も切断することができる。天然システムにおけるｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、遺伝子操作で使用するために、およそ１００ヌクレオチドの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に簡略化され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを発現するプラスミドと必要なｃｒＲＮＡ成分を同時送達することにより、ヒト細胞に直接運搬可能である。Ｃａｓタンパク質の異なるバリアント（例えば、Ｃｐｆ１などのＣａｓ９のオルソログ）を使用して、標的の制限を低減することができる。

ＣＲＩＳＰＲ法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによってサイレンスまたは阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ－３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＯＸ、ＳＯＣＳ１、ＡＮＫＲＤ１１、及びＢＣＯＲが含まれる。

ＣＲＩＳＰＲ法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによって増強され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれる。

ＣＲＩＳＰＲ法によって標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の例は、米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，９９３，２３３号、同第８，７９５，９６５号、同第８，７７１，９４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８６５，４０６号、同第８，９９９，６４１号、同第８，９４５，８３９号、同第８，９３２，８１４号、同第８，８７１，４４５号、同第８，９０６，６１６号、及び同第８，８９５，３０８号に記載されており、各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１を発現するためのプラスミドなどのＣＲＩＳＰＲ法を行うための資源は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔなどの企業から市販されている。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴＩＬ集団の遺伝子修飾は、米国特許第ＵＳ９７９０４９０号に記載されているＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用して行うことができ、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。

ＴＩＬを治療的集団に拡張するための方法は、本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態（例えば、Ｇｅｎ２）に従って、または米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２９９６４４Ａ１号及び同第ＵＳ２０２０／０１２１７１９Ａ１号、ならびに米国特許第１０，９２５，９００号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように実行することができ、方法は、ＴＡＬＥ法によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することをさらに含む。特定の実施形態によれば、ＴＩＬ拡張プロセス中のＴＡＬＥ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部分においてサイレンスまたは減少させる。あるいは、ＴＩＬ拡張プロセス中のＴＡＬＥ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部分において増強させる。

ＴＡＬＥは、転写活性化因子様エフェクタータンパク質を表し、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む。遺伝子編集のためにＴＡＬＥシステムを使用する方法は、本明細書ではＴＡＬＥ法とも称され得る。ＴＡＬＥは、植物病原菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属由来の天然に存在するタンパク質であり、各々単一の塩基対を認識する一連の３３～３５アミノ酸反復ドメインで構成されるＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥ特異性は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として知られる２つの超可変アミノ酸によって決定される。モジュラーＴＡＬＥ反復配列は、隣接するＤＮＡ配列を認識するために一緒に結合される。ＤＮＡ結合ドメイン内の特定のＲＶＤは、標的遺伝子座内の塩基を認識し、予測可能なＤＮＡ結合ドメインを組み立てるための構造的特徴を提供する。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、ＩＩＳ型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合して、標的可能なＴＡＬＥヌクレアーゼを作製する。部位特異的変異を誘導するために、１４～２０塩基対のスペーサー領域によって分離された２つの個々のＴＡＬＥＮアームがＦｏｋＩモノマーを密接に接近させて二量体化し、標的とされる二本鎖切断を産生する。

様々な組み立て方法を利用したいくつかの大規模な系統的研究により、ＴＡＬＥ反復配列を組み合わせて、実質的にすべてのユーザ定義配列を認識することができることが示されている。カスタム設計されたＴＡＬＥアレイも、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ，ＵＳＡ）、及びＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から市販されている。本発明での使用に好適なＴＡＬＥ法及びＴＡＬＥＮ法は、米国特許公開第ＵＳ２０１１／０２０１１１８ Ａ１号、同第ＵＳ２０１３／０１１７８６９ Ａ１号、同第ＵＳ２０１３／０３１５８８４ Ａ１号、同第ＵＳ２０１５／０２０３８７１ Ａ１号、及び同第ＵＳ２０１６／０１２０９０６ Ａ１号に記載されており、これらの各々の開示は参照により本明細書に組み込まれる。

ＴＡＬＥ法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによってサイレンスまたは阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ－３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＯＸ、ＳＯＣＳ１、ＡＮＫＲＤ１１、及びＢＣＯＲが含まれる。

ＴＡＬＥ法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによって増強され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれる。

ＴＡＬＥ法によって標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の例は、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。

ＴＩＬを治療的集団に拡張するための方法は、本明細書に記載の方法のいずれかの実施形態に従って、または米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／０２９９６４４Ａ１号及び同第ＵＳ２０２０／０１２１７１９Ａ１号、ならびに米国特許第１０，９２５，９００号（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように実行することができ、方法は、ジンクフィンガーまたはジンクフィンガーヌクレアーゼ法によってＴＩＬの少なくとも一部を遺伝子編集することをさらに含む。特定の実施形態によれば、ＴＩＬ拡張プロセス中のジンクフィンガー法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部においてサイレンスまたは減少させる。あるいは、ＴＩＬ拡張プロセス中のジンクフィンガー法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、治療的ＴＩＬ集団の少なくとも一部において増強させる。

個々のジンクフィンガーは、保存されたββα立体配置でおよそ３０個のアミノ酸を含む。αらせんの表面上のいくつかのアミノ酸は、典型的には、異なる選択性レベルでＤＮＡの主溝の３ｂｐと接触する。ジンクフィンガーは、２つのタンパク質ドメインを有する。第１のドメインは、ＤＮＡ結合ドメインであり、真核生物転写因子を含み、ジンクフィンガーを含む。第２のドメインは、ヌクレアーゼドメインであり、ＦｏｋＩ制限酵素を含み、ＤＮＡの触媒的切断を担っている。

個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３～６個の個々のジンクフィンガー反復配列を含み、各々９～１８塩基対を認識することができる。ジンクフィンガードメインが目的の標的部位に特異的である場合、合計１８塩基対を認識する３フィンガーＺＦＮの対でさえ、理論的には、哺乳動物ゲノムの単一遺伝子座を標的とすることができる。新たなジンクフィンガーアレイを生成するための１つの方法は、既知の特異性を有するより小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的なモジュラーアセンブリプロセスは、各々３塩基対のＤＮＡ配列を認識することができる３つの別個のジンクフィンガーを組み合わせて、９塩基対の標的部位を認識することができる３フィンガーアレイを生成することを含む。あるいは、オリゴマー化プールエンジニアリング（ＯＰＥＮ）などの選択ベースのアプローチを使用して、隣接するフィンガー間のコンテキスト依存的相互作用を考慮したランダム化ライブラリーから新たなジンクフィンガーアレイを選択することができる。操作されたジンクフィンガーは、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から市販されている。

ジンクフィンガー法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによってサイレンスまたは阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ－３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ－Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＴＥＴ２、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２、ＧＵＣＹ１Ｂ３、ＴＯＸ、ＳＯＣＳ１、ＡＮＫＲＤ１１、及びＢＣＯＲが含まれる。

ジンクフィンガー法によりＴＩＬを永久に遺伝子編集することによって増強され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１が含まれる。

ジンクフィンガー法によって標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の例は、米国特許第６，５３４，２６１号、同第６，６０７，８８２号、同第６，７４６，８３８号、同第６，７９４，１３６号、同第６，８２４，９７８号、同第６，８６６，９９７号、同第６，９３３，１１３号、同第６，９７９，５３９号、同第７，０１３，２１９号、同第７，０３０，２１５号、同第７，２２０，７１９号、同第７，２４１，５７３号、同第７，２４１，５７４号、同第７，５８５，８４９号、同第７，５９５，３７６号、同第６，９０３，１８５号、及び同第６，４７９，６２６号に記載されており、各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

ジンクフィンガー法によって標的遺伝子配列の発現を変化させるための、本発明の実施形態に従って使用され得るシステム、方法、及び組成物の他の例は、Ｂｅａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，２３ １３８０－１３９０に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、高親和性ＴＣＲ、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、もしくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原で標的とされるＴＣＲ、または腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソセリン）もしくは系統制限細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むが、これらに限定されない追加の機能を含むように任意選択で遺伝子操作される。特定の実施形態では、この方法は、高親和性ＴＣＲ、例えば、ＭＡＧＥ－１、ＨＥＲ２、もしくはＮＹ－ＥＳＯ－１などの腫瘍関連抗原で標的とされるＴＣＲ、または腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソセリン）もしくは系統制限細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むようにＴＩＬ集団を遺伝子操作することを含む。適切には、ＴＩＬ集団は、本明細書に記載の第１の集団、第２の集団及び／または第３の集団であり得る。

ＴＩＬ製造のための閉鎖系
本発明は、ＴＩＬ培養プロセス中に閉鎖系の使用を提供する。かかる閉鎖系は、微生物汚染の防止及び／または低減を可能にし、より少数のフラスコの使用を可能にし、コスト削減を可能にする。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、２つの容器を使用する。

かかる閉鎖系は当該技術分野でよく知られており、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｂｅｒ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｈｔｍ及びｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／ＧｕｉｄａｎｃｅＣｏｍｐｌｉａｎｃｅＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／Ｇｕｉｄａｎｃｅｓ／Ｂｌｏｏｄ／ｕｃｍ０７６７７９．ｈｔｍで見つけることができる。

滅菌接続装置（ＳＴＣＤ）は、互換性のある２本の管間の滅菌溶接をもたらす。この手順により、様々な容器と管径との滅菌接続が可能になる。いくつかの実施形態では、閉鎖系には、実施例に記載のルアーロック系及びヒートシール系が含まれる。いくつかの実施形態では、閉鎖系は、閉鎖系の無菌性及び閉鎖性を維持するために、滅菌条件下でシリンジを介してアクセスされる。いくつかの実施形態では、実施例に記載の閉鎖系が用いられる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、実施例において本明細書に記載される方法に従って、最終産物製剤化容器内で製剤化される。

いくつかの実施形態では、閉鎖系は、腫瘍断片が得られてから、ＴＩＬを患者に投与するかまたは凍結保存する準備が整うまで、１つの容器を使用する。いくつかの実施形態では、２つの容器が使用される場合、第１の容器は、密閉容器であり、ＴＩＬ集団が遠心分離され、第１の密閉容器を開かずに注入バッグに移される。いくつかの実施形態では、第１の容器は、密閉Ｇ容器である。いくつかの実施形態では、第１の容器は、細胞培養デバイス３００を含む。いくつかの実施形態では、２つの容器が使用される場合、注入バッグは、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌを含有する注入バッグである。閉鎖系または閉鎖ＴＩＬ細胞培養系は、腫瘍試料及び／または腫瘍断片が追加されると、系が外部からしっかりと密閉され、細菌、真菌、及び／またはいずれの他の微生物汚染も侵入しない閉鎖環境を形成することを特徴とする。

いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約５％～約１００％である。いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約５％～約９５％である。いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約５％～約９０％である。いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約１０％～約９０％である。いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約１５％～約８５％である。いくつかの実施形態では、微生物汚染の低減は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％である。

閉鎖系は、微生物汚染がない状態で、及び／または微生物汚染を大幅に低減して、ＴＩＬの成長を可能にする。

さらに、ＴＩＬ細胞培養環境のｐＨ、二酸化炭素分圧、及び酸素分圧は各々、細胞が培養されるにつれて変化する。したがって、細胞培養に適切な培地を循環させても、ＴＩＬ増殖に最適な環境として閉鎖環境を常に一定に維持する必要がある。この目的のために、閉鎖環境の培養液中のｐＨ、二酸化炭素分圧、及び酸素分圧の物理的要因がセンサーによって監視されること、そのシグナルが培養環境の入口に設置されたガス交換器を制御するために使用されること、及び閉鎖環境のガス分圧が細胞培養環境を最適化するように培養液の変化に応じてリアルタイムで調整されることが望ましい。いくつかの実施形態では、本発明は、閉鎖環境のｐＨ、二酸化炭素分圧、及び酸素分圧を測定する監視装置を備えたガス交換器を閉鎖環境の入口に組み込み、かつ監視装置からのシグナルに基づいてガス濃度を自動的に調整することによって細胞培養環境を最適化する閉鎖細胞培養系を提供する。

いくつかの実施形態では、閉鎖環境内の圧力は、連続的または断続的に制御される。すなわち、閉鎖環境内の圧力を、例えば、圧力維持装置によって変化させることができ、それ故に、空間が正圧状態でＴＩＬの成長に好適であることを確実にするか、または負圧状態で流体の浸出を促進し、ひいては細胞増殖を促進する。さらに、負圧を断続的に加えることにより、閉鎖環境内の体積の一時的な収縮によって、閉鎖環境内の循環液体を均一かつ効率的に置き換えることが可能である。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの増殖に最適な培養成分を置換または添加することができ、ＩＬ－２及び／またはＯＫＴ３などの因子、ならびに組み合わせを添加することができる。

ＴＩＬの任意選択的な凍結保存
バルクＴＩＬ集団（例えば、第２のＴＩＬ集団）または拡張されたＴＩＬ集団（例えば、第３のＴＩＬ集団）のいずれかを、任意選択で凍結保存することができる。いくつかの実施形態では、凍結保存は、治療的ＴＩＬ集団に起こる。いくつかの実施形態では、凍結保存は、第２の拡張後に採取されたＴＩＬに起こる。いくつかの実施形態では、凍結保存は、図１０９及び／または図１Ａ～Ｄ（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）の例示的なステップＦにおいてＴＩＬに起こる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、注入バッグ内で凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、注入バッグに入れる前に凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、凍結保存され、注入バッグに入っていない。いくつかの実施形態では、凍結保存は、凍結保存培地を使用して行われる。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する。これは、一般に、ＴＩＬ集団を凍結溶液、例えば、８５％補体不活性化ＡＢ血清及び１５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に入れることによって達成される。溶液中の細胞が極低温バイアルに入れられ、－８０°Ｃで２４時間保存され、任意選択で凍結保存のためにガス状窒素冷凍庫に移される。Ｓａｄｅｇｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ ２０１３，５２，９７８－９８６を参照されたい。

適切な場合、細胞が冷凍庫から取り出され、溶液のおよそ５分の４が解凍されるまで３７℃の水浴中で解凍される。細胞は、一般に、完全培地中に再懸濁され、任意で１回以上洗浄される。いくつかの実施形態では、解凍されたＴＩＬは、当該技術分野で知られているように計数され、生存率について評価され得る。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団は、ＣＳ１０凍結保存培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ １０、ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を使用して凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する凍結保存培地を使用して凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団は、１：１（体積：体積）比のＣＳ１０及び細胞培養培地を使用して凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団は、約１：１（体積：体積）比のＣＳ１０及び細胞培養培地を使用して凍結保存され、追加のＩＬ－２をさらに含む。

上で考察されたように、また図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に提供されるステップＡ～Ｅで例示されるように、凍結保存は、ＴＩＬ拡張プロセス全体の多くの時点で起こり得る。いくつかの実施形態では、第１の拡張後の拡張されたＴＩＬ集団（例えば、ステップＢに従って提供される、または図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）のステップＤによる１回以上の第２の拡張後の拡張されたＴＩＬ集団を凍結保存することができる。凍結保存は、一般に、ＴＩＬ集団を凍結溶液、例えば、８５％の補体不活性化ＡＢ血清及び１５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に入れることによって達成され得る。溶液中の細胞が極低温バイアルに入れられ、－８０°Ｃで２４時間保存され、任意選択で凍結保存のためにガス状窒素冷凍庫に移される。Ｓａｄｅｇｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ ２０１３，５２，９７８－９８６を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、５％ＤＭＳＯ中で凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、細胞培養培地＋５％ＤＭＳＯ中で凍結保存される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、実施例６に提供される方法に従って凍結保存される。

適切な場合、細胞が冷凍庫から取り出され、溶液のおよそ５分の４が解凍されるまで３７℃の水浴中で解凍される。細胞は、一般に、完全培地中に再懸濁され、任意で１回以上洗浄される。いくつかの実施形態では、解凍されたＴＩＬは、当該技術分野で知られているように計数され、生存率について評価され得る。

場合によっては、図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）からのステップＢのＴＩＬ集団は、以下に論じられるプロトコルを使用して、直ちに凍結保存され得る。あるいは、バルクＴＩＬ集団を、図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）からのステップＣ及びステップＤに供し、その後、図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）からのステップＤの後に凍結保存することができる。同様に、遺伝子修飾されたＴＩＬが療法に使用される場合、図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）からのステップＤのＴＩＬ集団を、好適な治療のために遺伝子修飾に供することができる。

拡張されたＴＩＬの表現型特徴
いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書及び実施例に記載されているものを含む、拡張後の多数の表現型マーカーの発現について分析される。いくつかの実施形態では、１つ以上の表現型マーカーの発現が調べられる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの表現型特徴は、図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）からのステップＢにおける第１の拡張後に分析される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの表現型特徴は、図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）からのステップＣにおける移行中に分析される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの表現型特徴は、図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）からのステップＣによる移行中、ならびに凍結保存後に分析される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの表現型特徴は、図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）からのステップＤによる第２の拡張後に分析される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの表現型特徴は、図１０９及び／または図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）からのステップＤによる２つ以上の拡張後に分析される。

いくつかの実施形態では、マーカーは、ＣＤ８及びＣＤ２８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ８の発現が調べられる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の発現が調べられる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８及び／またはＣＤ２８の発現は、他のプロセス（例えば、例えば図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に提供されるＧｅｎ３プロセス）と比較して、例えば図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に提供される２Ａプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生されたＴＩＬ上で、より高い。いくつかの実施形態では、ＣＤ８の発現は、他のプロセス（例えば、例えば図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に提供されるＧｅｎ３プロセス）と比較して、例えば図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に提供される２Ａプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生されたＴＩＬ上で、より高い。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８の発現は、他のプロセス（例えば、例えば図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に提供されるＧｅｎ３プロセス）と比較して、例えば図１（特に、例えば図１Ａ））に提供される２Ａプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生されたＴＩＬ上で、より高い。いくつかの実施形態では、高いＣＤ２８発現は、より若く、より持続的なＴＩＬ表現型を示す。いくつかの実施形態では、１つ以上の調節マーカーの発現が測定される。

いくつかの実施形態では、ＣＤ８及び／またはＣＤ２８に基づく第１のＴＩＬ集団、第２のＴＩＬ集団、第３のＴＩＬ集団、または採取されたＴＩＬ集団の選択は、本明細書に記載の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡張するための方法のいずれのステップ中にも行われない。

いくつかの実施形態では、セントラルメモリー細胞のパーセンテージは、他のプロセス（例えば、例えば図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に提供されるＧｅｎ３プロセス）と比較して、例えば図１（特に、例えば図１Ａ））に提供される２Ａプロセスと比較して、本発明のプロセスに従って産生されたＴＩＬ上で、より高い。いくつかの実施形態では、セントラルメモリー細胞のメモリーマーカーは、ＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬメモリーサブセットは、異なるメモリーサブセットに分類され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬは、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬは、セントラルメモリー（ＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋）ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬは、エフェクターメモリー（ＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－）ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋ＴＩＬは、ＲＡ＋エフェクターメモリー／エフェクター（ＴＥＭＲＡ／ＴＥＦＦ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋）ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋は、ＣＤ４＋集団と比較して、より高い％で存在する。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、グランザイムＢ、パーフォリン、及びグラニュライシンからなる群から選択されるもう１つのマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、グランザイムＢを発現する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、パーフォリンを発現する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、グラニュライシンを発現する。

いくつかの実施形態では、再刺激されたＴＩＬは、サイトカイン放出アッセイを使用して、サイトカイン放出についても評価され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）分泌について評価され得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、急速な第２の拡張ステップの後に、例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に提供されるようなステップＤの後に、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの健康は、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）分泌によって測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、活性なＴＩＬを示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能の別の尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７／４－１ＢＢに対する抗体で刺激されたＴＩＬの培地中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することによって測定され得る。これらの刺激されたＴＩＬからの培地中のＩＦＮ－γレベルは、ＩＦＮ－γ放出を測定することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、例えば図１（特に、例えば図１Ａ）に提供されるような２ＡプロセスのステップＤと比較して、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のＴＩＬに提供されるようなＧｅｎ３プロセスのステップＤにおけるＩＦＮ－γ産生の増加は、ステップＤのＴＩＬの細胞障害能の増加を示している。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍以上増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、３倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、４倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、５倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、エクスビボでのＴＩＬ中で測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば図１Ｂの方法を含む、本発明の方法によって産生されたＴＩＬを含むＴＩＬにおいてエクスビボで測定される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍、またはそれより多くのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１倍多いＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２倍多いＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３倍多いＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４倍多いＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５倍多いＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ～約１０００ｐｇ／ｍＬ、またはそれより多くのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも６５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも７５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも８５０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも９５０ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、またはそれより多くのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも６０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも７０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも８０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも９０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１５，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２５，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３５，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４５，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも２５０ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも３５０ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも４５０ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも５５０ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも６５０ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも７５０ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも８５０ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、少なくとも９５０ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、または少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも６００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも７００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも８００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも９００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも６０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも７０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも８０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも９０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１５，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２５，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３５，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４５，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞のＩＦＮ－γ分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。

Ｔリンパ球及びＢリンパ球の多様な抗原受容体は、限られた数であるが、多数の遺伝子セグメントの体細胞組換えによって産生される。これらの遺伝子セグメント：Ｖ（可変）、Ｄ（多様性）、Ｊ（接合）、及びＣ（一定）は、免疫グロブリン及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の結合特異性及び下流での適用を決定する。本発明は、Ｔ細胞レパートリー多様性を示し、かつ増加させるＴＩＬを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、新たに採取されたＴＩＬ、及び／または例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）において具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、新たに採取されたＴＩＬ及び／または図１（特に、例えば図１Ａ）に例示されるようにＧｅｎ２と称される方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、第１の拡張で取得されたＴＩＬは、Ｔ細胞レパートリー多様性の増加を示す。いくつかの実施形態では、多様性の増加は、免疫グロブリン多様性及び／またはＴ細胞受容体多様性の増加である。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン重鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、免疫グロブリンにあり、免疫グロブリン軽鎖にある。いくつかの実施形態では、多様性は、Ｔ細胞受容体にある。いくつかの実施形態では、多様性は、アルファ、ベータ、ガンマ、及びデルタ受容体からなる群から選択されるＴ細胞受容体のうちの１つにある。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及び／またはベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファの発現が増加する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベータの発現が増加する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲａｂ（すなわち、ＴＣＲα／β）の発現が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセス（例えば、Ｇｅｎ３プロセス）は、他のプロセス、例えば、試料内の固有のペプチドＣＤＲの数に基づくＧｅｎ２と称されるプロセスと比較して、より高いクローン多様性を示す（例えば、図１２～１４を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの活性化及び疲弊は、１つ以上のマーカーを調べることによって決定され得る。いくつかの実施形態では、活性化及び疲弊は、多色フローサイトメトリーを使用して決定され得る。いくつかの実施形態では、活性化及び疲弊のマーカーには、ＣＤ３、ＰＤ－１、２Ｂ４／ＣＤ２４４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＢＴＬＡ、ＫＬＲＧ、ＴＩＭ－３、ＣＤ１９４／ＣＣＲ４、ＣＤ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１８３、ＣＤ６９、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１０３、及び／またはＬＡＧ－３）からなる群から選択される１つ以上のマーカーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、活性化及び疲弊のマーカーには、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、及び／またはＴＩＭ－３からなる群から選択される１つ以上のマーカーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、活性化及び疲弊のマーカーには、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＬＡＧ－３、ＣＤ１０３＋／ＣＤ６９＋、ＣＤ１０３＋／ＣＤ６９－、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ及び／またはＴＩＭ－３からなる群から選択される１つ以上のマーカーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞マーカー（活性化及び疲弊マーカーを含む）は、Ｔ細胞の活性化、阻害、または機能を調べるために決定及び／または分析され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞マーカーには、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３、ＦｏｘＰ３、Ｔｉｍ－３、ＰＤ－１、ＣＤ１０３、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、Ｋｉ６７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ４５、ＣＤ４、及び／またはＣＤ５９からなる群から選択される１つ以上のマーカーが含まれ得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、３０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬまで、またはそれより多くのグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、５０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、７０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、９０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１１０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１３０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１５０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１７０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１９０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、３０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きい、またはそれより多くのグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、５０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、７０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、９０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１１０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１３０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１５０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１７０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１９０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、３０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬまで、またはそれより多くのグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、５０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、７０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、９０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１１０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１３０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１５０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１７０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１９０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、１８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、２８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きく、３０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きい、またはそれより多くのグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、５０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、７０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、９０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１１０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、


図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１３０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１５０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１７０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１９０００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２２００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２４００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２６００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２８００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００００ｐｇ／１０^６ＴＩＬより大きいＴＩＬグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、１０００ｐｇ／ｍＬより大きく、３０００００ｐｇ／ｍＬまで、またはそれより多くのグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１０００ｐｇ／ｍＬより大きく、２０００ｐｇ／ｍＬより大きく、３０００ｐｇ／ｍＬより大きく、４０００ｐｇ／ｍＬより大きく、５０００ｐｇ／ｍＬより大きく、６０００ｐｇ／ｍＬより大きく、７０００ｐｇ／ｍＬより大きく、８０００ｐｇ／ｍＬより大きく、９０００ｐｇ／ｍＬより大きく、１００００ｐｇ／ｍＬより大きく、２００００ｐｇ／ｍＬより大きく、３００００ｐｇ／ｍＬより大きく、４００００ｐｇ／ｍＬより大きく、５００００ｐｇ／ｍＬより大きく、６００００ｐｇ／ｍＬより大きく、７００００ｐｇ／ｍＬより大きく、８００００ｐｇ／ｍＬより大きく、９００００ｐｇ／ｍＬより大きく、１０００００ｐｇ／ｍＬより大きい、またはそれより多くのグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１０００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２０００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、４０００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、５０００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、６０００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、７０００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、８０００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、９０００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、４００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、５００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、６００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、７００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、８００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、９００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１０００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１２００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１４００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢを示すＴＩＬは、ＴＩＬ グランザイムＢ分泌であり、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１６００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、１８００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２０００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２２００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２４００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２６００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、２８００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、３０００００ｐｇ／ｍＬより大きいグランザイムＢ分泌を示すＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄを含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、本発明の拡張方法は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄに提供されるようなＴＩＬを含む、インビトロで増加したグランザイムＢ分泌を示す、拡張されたＴＩＬ集団を産生する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも１倍～５０倍以上増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、またはそれ以上増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも１倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも２倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも３倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも４倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも５倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも６倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも７倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも８倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも９倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも１０倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも２０倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも３０倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも４０倍増加する。いくつかの実施形態では、本発明の拡張されたＴＩＬ集団のグランザイムＢ分泌は、拡張されていないＴＩＬ集団と比較して、少なくとも５０倍増加する。

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍、またはそれより大きく低いレベルのＴＮＦ－α（すなわち、ＴＮＦ－アルファ）分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも１倍低いレベルのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも２倍低いレベルのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも３倍低いレベルのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも４倍低いレベルのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌と比較して、少なくとも５倍低いレベルのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、少なくとも２００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α（すなわち、ＴＮＦ－アルファ）分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも２０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも３０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも４０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも６０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも７０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも８０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。いくつかの実施形態では、少なくとも９０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞～約１０，０００ｐｇ／ｍＬ／５ｅ５細胞、またはそれより多くのＴＮＦ－α分泌が可能なＴＩＬは、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ及びグランザイムＢのレベルを測定して、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬの表現型特徴を決定する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αのレベルを測定して、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬの表現型特徴を決定する。いくつかの実施形態では、グランザイムＢ及びＴＮＦ－αのレベルを測定して、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬの表現型特徴を決定する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ及びＴＮＦ－αのレベルを測定して、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄの方法を含む、本発明の拡張方法によって産生されるＴＩＬの表現型特徴を決定する。

いくつかの実施形態では、表現型特性決定は、凍結保存後に調べられる。

追加のプロセスの実施形態
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行うことであって、プライミングによる第１の拡張を約１～７日間または約１～８日間行って第２のＴＩＬ集団を取得し、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、プライミングによる第１の拡張を行うことと、（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させて急速な第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生し、急速な第２の拡張を約１～１１日間または約１～１０日間行って第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団である、急速な第２の拡張を行うことと、（ｄ）ステップ（ｃ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間、または約２～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器より大きな第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移すことによって培養物のスケールアップを達成し、第２の容器内で、小規模培養からの第２のＴＩＬ集団が、より大規模な培養で約４～７日間、または約４～８日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養からのかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、第２の小規模培養で約４～７日間、または約４～８日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間、または約２～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳ容器または複数の細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約４～７日間、または約４～８日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約５～７日間の期間培養される。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行うことであって、プライミングによる第１の拡張が約１～８日間行われて第２のＴＩＬ集団が取得され、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、プライミングによる第１の拡張を行うことと、（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させることによって急速な第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、急速な第２の拡張が約１～８日間行われて第３のＴＩＬ集団が取得され、第３のＴＩＬ集団が治療的ＴＩＬ集団である、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）ステップ（ｃ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約２～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移すこととによって、培養のスケールアップを達成し、第２の容器内で、小規模培養からの第２のＴＩＬ集団が、より大規模な培養で約４～８日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約２～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養からのかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、第２の小規模培養で約４～６日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約２～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約４～６日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約４～５日間の期間培養される。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、（ａ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）ＩＬ－２及びＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行うことであって、プライミングによる第１の拡張が約１～７日間行われて第２のＴＩＬ集団が取得され、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、プライミングによる第１の拡張を行うことと、（ｃ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３及び外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地と接触させることによって急速な第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、急速な第２の拡張が約１～１１日間行われて第３のＴＩＬ集団が取得され、第３のＴＩＬ集団が治療的ＴＩＬ集団である、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）ステップ（ｃ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移すこととによって、培養のスケールアップを達成し、第２の容器内で、小規模培養からの第２のＴＩＬ集団が、より大規模な培養で約４～７日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養からのかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、第２の小規模培養で約４～７日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約４～７日間の期間培養される。いくつかの実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（１）第２のＴＩＬ集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（２）第１の小規模培養からの第２のＴＩＬ集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－ｇ５００ＭＣＳ容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第２のＴＩＬ集団の一部が、より大規模な培養で約５日間培養される。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団を、外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む培養培地と接触させることによって行われ、ステップ（ｃ）における培養培地中のＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）における培養培地中のＡＰＣの数よりも多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において培養培地に追加の外因性ＡＰＣが補充されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２０：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約９：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約８：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約７：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約６：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約１０：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約５：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約４：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約３：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．９：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．８：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．７：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．６：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．５：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．４：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．３：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．２：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．１：１の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４：１、４．１：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１、または５：１になるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、一次の第１の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約１×１０^８、１．１×１０^８、１．２×１０^８、１．３×１０^８、１．４×１０^８、１．５×１０^８、１．６×１０^８、１．７×１０^８、１．８×１０^８、１．９×１０^８、２×１０^８、２．１×１０^８、２．２×１０^８、２．３×１０^８、２．４×１０^８、２．５×１０^８、２．６×１０^８、２．７×１０^８、２．８×１０^８、２．９×１０^８、３×１０^８、３．１×１０^８、３．２×１０^８、３．３×１０^８、３．４×１０^８、または３．５×１０^８ＡＰＣであるように、かつ急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約３．５×１０^８、３．６×１０^８、３．７×１０^８、３．８×１０^８、３．９×１０^８、４×１０^８、４．１×１０^８、４．２×１０^８、４．３×１０^８、４．４×１０^８、４．５×１０^８、４．６×１０^８、４．７×１０^８、４．８×１０^８、４．９×１０^８、５×１０^８、５．１×１０^８、５．２×１０^８、５．３×１０^８、５．４×１０^８、５．５×１０^８、５．６×１０^８、５．７×１０^８、５．８×１０^８、５．９×１０^８、６×１０^８、６．１×１０^８、６．２×１０^８、６．３×１０^８、６．４×１０^８、６．５×１０^８、６．６×１０^８、６．７×１０^８、６．８×１０^８、６．９×１０^８、７×１０^８、７．１×１０^８、７．２×１０^８、７．３×１０^８、７．４×１０^８、７．５×１０^８、７．６×１０^８、７．７×１０^８、７．８×１０^８、７．９×１０^８、８×１０^８、８．１×１０^８、８．２×１０^８、８．３×１０^８、８．４×１０^８、８．５×１０^８、８．６×１０^８、８．７×１０^８、８．８×１０^８、８．９×１０^８、９×１０^８、９．１×１０^８、９．２×１０^８、９．３×１０^８、９．４×１０^８、９．５×１０^８、９．６×１０^８、９．７×１０^８、９．８×１０^８、９．９×１０^８、または１×１０^９ＡＰＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、一次の第１の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約１×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約３．５×１０^８ＡＰＣの範囲から選択され、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約３．５×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約１×１０^９ＡＰＣの範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、一次の第１の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約１．５×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約３×１０^８ＡＰＣの範囲から選択され、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約４×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約７．５×１０^８ＡＰＣの範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、一次の第１の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約２×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約２．５×１０^８ＡＰＣの範囲から選択され、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約４．５×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約５．５×１０^８ＡＰＣの範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、正確にまたは約２．５×１０^８ＡＰＣが一次の第１の拡張に添加され、正確にまたは約５×１０^８ＡＰＣが急速な第２の拡張に添加されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が複数の別個の容器に分配され、それらの別個の容器の各々の中で、第１のＴＩＬ集団がステップ（ａ）において取得され、第２のＴＩＬ集団がステップ（ｂ）において取得され、第３のＴＩＬ集団がステップ（ｃ）において取得され、ステップ（ｃ）における複数の容器からの治療的ＴＩＬ集団が合わされ、ステップ（ｄ）からの採取されたＴＩＬ集団を生成するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の腫瘍が複数の別個の容器に均等に分配されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が少なくとも２個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が２～２０個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が２～１５個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が２～１０個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が２～５個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の別個の容器が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の別個の容器を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、ステップ（ｂ）において第１のＴＩＬ集団に対して行われる各容器の場合、ステップ（ｃ）における急速な第２の拡張が、同じ容器内でかかる第１のＴＩＬ集団から産生された第２のＴＩＬ集団に対して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、別個の容器の各々が第１のガス透過性表面積を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が単一の容器に分配されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、単一の容器が第１のガス透過性表面積を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約２細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、プライミングによる第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で行われ、ステップ（ｃ）において、急速な第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を含む第２の容器内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２の容器が第１の容器よりも大きいように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約２細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、プライミングによる第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で行われ、ステップ（ｃ）において、急速な第２の拡張が、第１の容器内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約２細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において、ＡＰＣが、正確にまたは約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：１０の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：９の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：８の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：７の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：６の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：５の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：４の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：３の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：２の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．２～正確にまたは約１：８の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．３～正確にまたは約１：７の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．４～正確にまたは約１：６の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．５～正確にまたは約１：５の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．６～正確にまたは約１：４の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．７～正確にまたは約１：３．５の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．８～正確にまたは約１：３の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．９～正確にまたは約１：２．５の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：２の範囲から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、一次の第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、ステップ（ｃ）において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、ステップ（ｂ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、ステップ（ｃ）において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：７．１、１：７．２、１：７．３、１：７．４、１：７．５、１：７．６、１：７．７、１：７．８、１：７．９、１：８、１：８．１、１：８．２、１：８．３、１：８．４、１：８．５、１：８．６、１：８．７、１：８．８、１：８．９、１：９、１：９．１、１：９．２、１：９．３、１：９．４、１：９．５、１：９．６、１：９．７、１：９．８、１：９．９、または１：１０から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数の、第１のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数に対する比が、正確にまたは約１．５：１～正確にまたは約１００：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数の、第１のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数に対する比が、正確にまたは約５０：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数の、第１のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数に対する比が、正確にまたは約２５：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数の、第１のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数に対する比が、正確にまたは約２０：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数の、第１のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数に対する比が、正確にまたは約１０：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも正確にまたは約５０倍多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも正確にまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０倍多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第２の期間の開始の正確にまたは約２日後または正確にまたは約３日後に、細胞培養培地に追加のＩＬ－２が補充されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｄ）において採取されたＴＩＬ集団を凍結保存するステップをさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｄ）の後に、（ｅ）ステップ（ｄ）からの採取されたＴＩＬ集団を、任意選択でＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌを含有する注入バッグに移す追加のステップを行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｅ）において採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存するステップを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスが、採取されたＴＩＬ集団の、凍結保存培地に対する１：１の比を使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが放射線照射され、かつ同種異系であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において細胞培養物に添加されるＡＰＣの総数が２．５×１０^８であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において細胞培養物に添加されるＡＰＣの総数が５×１０^８であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ＡＰＣがＰＢＭＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが放射線照射され、かつ同種異系であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が人工抗原提示細胞であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｄ）における採取が膜ベースの細胞処理システムを使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｄ）における採取がＬＯＶＯ細胞処理システムを使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約１０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約１５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約２０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約２５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約３０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約３５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約４０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約４５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約５０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、複数の断片が１容器当たり正確にまたは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個の断片（複数可）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２７ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２０ｍｍ^３～正確にまたは約５０ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２１ｍｍ^３～正確にまたは約３０ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２２ｍｍ^３～正確にまたは約２９．５ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２３ｍｍ^３～正確にまたは約２９ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２４ｍｍ^３～正確にまたは約２８．５ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２５ｍｍ^３～正確にまたは約２８ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２６．５ｍｍ^３～正確にまたは約２７．５ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の断片が正確にまたは約３０～正確にまたは約６０個の断片を含み、正確にまたは約１３００ｍｍ^３～正確にまたは約１５００ｍｍ^３の総体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の断片が正確にまたは約５０個の断片を含み、正確にまたは約１３５０ｍｍ^３の総体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、複数の断片が正確にまたは約５０個の断片を含み、正確にまたは約１グラム～正確にまたは約１．５グラムの総質量を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、細胞培養培地がＧ容器またはＸｕｒｉ細胞バッグである容器内に提供されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、細胞培養培地中のＩＬ－２濃度が約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５０００ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、細胞培養培地中のＩＬ－２濃度が約６，０００ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、凍結保存培地がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、凍結保存培地が７％～１０％のＤＭＳＯを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）における第１の期間が正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日の期間内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第２の期間が正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、または１１日の期間内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）における第１の期間及びステップ（ｃ）における第２の期間が各々、正確にまたは約１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日の期間内に個別に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）における第１の期間及びステップ（ｃ）における第２の期間が各々、正確にまたは約５日、６日、または７日の期間内に個別に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）における第１の期間及びステップ（ｃ）における第２の期間が各々、正確にまたは約７日の期間内に個別に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１４日～正確にまたは約１８日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１５日～正確にまたは約１８日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１６日～正確にまたは約１８日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１７日～正確にまたは約１８日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１４日～正確にまたは約１７日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１５日～正確にまたは約１７日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１６日～正確にまたは約１７日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１４日～正確にまたは約１６日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１５日～正確にまたは約１６日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１４日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１５日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１６日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１７日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１８日で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１４日以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１５日以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１６日以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）～（ｄ）が合計で正確にまたは約１８日以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｄ）で採取された治療的ＴＩＬ集団が、ＴＩＬの治療上有効な投与量に十分なＴＩＬを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量に十分なＴＩＬの数が、正確にまたは約２．３×１０^１０～正確にまたは約１３．７×１０^１０であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍、またはそれより多くのインターフェロンガンマ産生を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍、またはそれより多くのインターフェロンガンマ産生を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）における第３のＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍、またはそれより多くのインターフェロンガンマ産生を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）の第３のＴＩＬ集団から取得されたエフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞が、ステップ（ｂ）の第２の細胞集団から取得されたエフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞と比較して増加したＣＤ８及びＣＤ２８発現を示すように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、方法に列挙された各容器が密閉容器であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、方法に列挙された各容器がＧ容器であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、方法に列挙された各容器がＧＲＥＸ－１０であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、方法に列挙された各容器がＧＲＥＸ－１００であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、方法に列挙された各容器がＧＲＥＸ－５００であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法によって作製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、治療的ＴＩＬ集団が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、治療的ＴＩＬ集団が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、治療的ＴＩＬ集団が、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、治療的ＴＩＬ集団が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せず、かつＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、治療的ＴＩＬ集団が、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、１７日間より長いプロセスによってプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、治療的ＴＩＬ集団が、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、１８日間より長いプロセスによってプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、治療的ＴＩＬ集団が、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、増加したインターフェロンガンマ産生を提供する、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、増加したポリクローン性を提供する、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、増加した有効性を提供する、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

他の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

他の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

他の実施形態では、本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

他の実施形態では、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

他の実施形態では、本発明は、ＡＰＣを添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

他の実施形態では、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

他の実施形態では、本発明は、ＡＰＣを添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

他の実施形態では、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ａ及び／または図１Ｂ及び／または図１Ｃ及び／または図１Ｄ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

他の実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物であるように修正された、上記の該当する前の段落のいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、腫瘍断片がコア生検であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、腫瘍断片が細針吸引物であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、腫瘍断片が小生検（例えば、パンチ生検を含む）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、腫瘍断片がコア針生検であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、（ｉ）本方法が、対象からの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）本方法が、プライミングによる第１の拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）本方法が、方法が、プライミングによる第１の拡張を約８日間行うことを含み、及び（ｉｖ）本方法が、急速な第２の拡張を約１１日間の期間行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日間で完了する。

他の実施形態では、本発明は、（ｉ）方法が、対象由来の腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から第１のＴＩＬ集団を得ることを含み、（ｉｉ）方法が、プライミングによる第１の拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）方法が、約８日間にわたってプライミングによる第１の拡張を行うことを含み、かつ（ｉｖ）方法が、第２のＴＩＬ集団の培養物を約５日間培養し、培養物を最大５つの継代培養物に分割し、かつ継代培養物を約６日間培養することによって、急速な第２の拡張を行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、最大５つの継代培養物が各々、第２のＴＩＬ集団の培養が急速な第２の拡張で開始される容器と同じサイズのまたはそれよりも大きい容器内で培養される。前述の実施形態のうちのいくつかでは、第２のＴＩＬ集団の培養物は、最大５つの継代培養物間で均等に分けられる。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日間で完了する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約２０個の細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個の細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の細針吸引物から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約２０個のコア針生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個のコア針生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア針生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア針生検から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１～約１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から得られるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、（ｉ）本方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）本方法が、プライミングによる第１の拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間の期間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）本方法が、第１のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で約８日間の期間培養することによってプライミングによる第１の拡張ステップを行い、第２のＴＩＬ集団を取得することを含み、かつ（ｉｖ）本方法が、第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを含む培養培地中で約１１日間の期間培養することによって第２の拡張ステップを行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日間で完了する。

他の実施形態では、本発明は、（ｉ）本方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）本方法が、プライミングによる第１の拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間の期間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）本方法が、第１のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で約８日間の期間培養することによってプライミングによる第１の拡張ステップを行い、第２のＴＩＬ集団を取得することを含み、かつ（ｉｖ）本方法が、第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを含む培養培地中で約５日間の期間培養することによって第２の拡張ステップを行うことと、培養物を最大５つの継代培養物に分割し、ＩＬ－２を含む培養培地中で各継代培養物を約６日間培養することとを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、最大５つの継代培養物が各々、第２のＴＩＬ集団の培養が急速な第２の拡張で開始される容器と同じサイズのまたはそれよりも大きい容器内で培養される。前述の実施形態のうちのいくつかでは、第２のＴＩＬ集団の培養物は、最大５つの継代培養物間で均等に分けられる。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日間で完了する。

他の実施形態では、本発明は、（ｉ）方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）方法が、プライミングによる第１の拡張ステップを行う前に、Ｇ－ＲＥＸ－１００Ｍフラスコ内の０．５ＬのＣＭ１培養培地中６０００ＩＵ ＩＬ－２／ｍＬを含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）方法が、６０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ－３、及び約１０^８個のフィーダー細胞を含む０．５ＬのＣＭ１培養培地を添加し、約８日間培養することによって、プライミングによる第１の拡張を行うことを含み、かつ（ｉｖ）方法が、（ａ）第２のＴＩＬ集団を、３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ－３、及び５×１０^９個のフィーダー細胞を有する５ＬのＣＭ２培養培地を含むＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳフラスコに移し、約５日間培養し、（ｂ）１０^９個のＴＩＬを、３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２を有する５ＬのＡＩＭ－Ｖ培地を含む最大５つのＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳフラスコの各々に移すことによって培養物を最大５つの継代培養物に分割し、継代培養物を約６日間培養することによって、急速な第２の拡張を行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日で完了する。

他の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を拡張する方法であって、（ａ）第１のＴ細胞集団を培養することによってドナーから取得された第１のＴ細胞集団のプライミングによる第１の拡張を行って成長をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化をプライミングすることと、（ｂ）ステップ（ａ）においてプライミングされた第１のＴ細胞集団の活性化が減衰し始めた後、第１のＴ細胞集団を培養することによって第１のＴ細胞集団の急速な第２の拡張を行って成長をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化を促進して第２のＴ細胞集団を取得することと、（ｃ）第２のＴ細胞集団を採取することと、を含む、Ｔ細胞を拡張する方法を提供する。他の実施形態では、急速な第２の拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養での第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移し、小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第２の容器内でのより大規模な培養で約４～７日間培養することとによって、培養のスケールアップを達成する。他の実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）第１の小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成し、各第２の容器内で、第１の小規模培養からのかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、第２の小規模培養で約４～７日間培養される。他の実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約４～７日間培養される。他の実施形態では、急速拡張ステップは、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約４日間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約５日間培養される。

他の実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約２～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養での第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりも大きい第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移し、小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第２の容器内でのより大規模な培養で約５～７日間の期間培養することとによって、培養のスケールアップを達成する。

他の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での第１の小規模培養で約２～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）第１の小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第１の容器とサイズが等しい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器に移して配分することとによって、培養のスケールアウトを達成するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供し、各第２の容器内で、第１の小規模培養からのかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、第２の小規模培養で約５～７日間の期間培養される。

他の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約２～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約５～７日間の期間培養される。

他の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約５～６日間の期間培養される。

他の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約５日間の期間培養される。

他の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約６日間の期間培養される。

他の実施形態では、本発明は、急速拡張のステップが、複数のステップに分けられて、（ａ）第１のＴ細胞集団を、第１の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ容器内での小規模培養で約３～４日間の期間培養することによって急速な第２の拡張を行うことと、その後、（ｂ）小規模培養からの第１のＴ細胞集団を、第１の容器よりもサイズが大きい２、３、または４個の第２の容器、例えば、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ容器または細胞培養デバイス３００に移して配分することとによって、培養のスケールアウト及びスケールアップを達成し、各第２の容器内で、小規模培養からのかかる第２の容器に移された第１のＴ細胞集団の一部が、より大規模な培養で約７日間の期間培養される。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）のプライミングによる第１の拡張が最大７日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大８日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大９日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大１０日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大１１日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が７日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大９日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が７日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大１０日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が７日または８日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大９日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が７日または８日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大１０日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が８日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大９日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）におけるプライミングによる第１の拡張が８日の期間中に行われ、かつステップ（ｂ）の急速な第２の拡張が最大８日の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団がＯＫＴ－３及びＩＬ－２を含む第１の培養培地中で培養されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１の培養培地が４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３及びＩＬ－２を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１の培養培地がＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１の培養培地が４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団がＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の培養培地中で培養されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２の培養培地が４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され（ここで、第１の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化される）、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養される（ここで、第２の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも多い）ように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され（ここで、第１の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化される）、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養される（ここで、第２の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも多い）ように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され（ここで、第１の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化される）、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養される（ここで、第２の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも多い）ように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＴ細胞集団が、第１のガス透過性表面を含む容器内の第１の培養培地中で培養され（ここで、第１の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化される）、ステップ（ｂ）において、第１のＴ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養される（ここで、第２の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団よりも多い）ように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数の、第１のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数に対する比が、約２：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数が約２．５×１０^８であり、第２のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数が約５×１０^８であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が、２層のＡＰＣの平均厚さで第１のガス透過性表面上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が、４～８層のＡＰＣから選択される平均厚さで第１のガス透過性表面上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において第１のガス透過性表面上に層状化されたＡＰＣの平均層数の、ステップ（ａ）において第１のガス透過性表面上に層状化されたＡＰＣの平均層数に対する比が、２：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が約１．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が約１．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が約２．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～約３．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約２．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約６．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約５．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約１．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約１．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約６．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約２．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約３．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約５．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲から選択される密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ａ）において、第１のＡＰＣ集団が正確にまたは約２．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で第１のガス透過性表面に播種され、ステップ（ｂ）において、第２のＡＰＣ集団が正確にまたは約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ＡＰＣが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが放射線照射され、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞が腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞が骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞が末梢血リンパ球（ＰＢＬ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団がドナーの全血からの分離によって取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団がドナーのアフェレーシス産物からの分離によって取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、Ｔ細胞表現型の正または負の選択によってドナーの全血またはアフェレーシス産物から分離されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞表現型がＣＤ３＋及びＣＤ４５＋であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団のプライミングによる第１の拡張を行う前に、Ｔ細胞がＮＫ細胞から分離されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。他の実施形態では、Ｔ細胞は、第１のＴ細胞集団からのＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の除去によって、第１のＴ細胞集団中のＮＫ細胞から分離される。他の実施形態では、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞画分を除去し、かつ陰性画分を回収するゲーティング戦略を使用して、第１のＴ細胞集団を細胞選別に供することによって、第１のＴ細胞集団から除去される。他の実施形態では、前述の方法は、高いＮＫ細胞パーセンテージを特徴とする第１のＴ細胞集団におけるＴ細胞の拡張のために利用される。他の実施形態では、前述の方法は、高いＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞パーセンテージを特徴とする第１のＴ細胞集団におけるＴ細胞の拡張のために利用される。他の実施形態では、前述の方法は、多数のＮＫ細胞の存在を特徴とする腫瘍組織におけるＴ細胞の拡張のために利用される。他の実施形態では、前述の方法は、多数のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞を特徴とする腫瘍組織におけるＴ細胞の拡張のために利用される。他の実施形態では、前述の方法は、多数のＮＫ細胞の存在を特徴とする腫瘍に罹患している患者から取得された腫瘍組織におけるＴ細胞の拡張のために利用される。他の実施形態では、前述の方法は、多数のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の存在を特徴とする腫瘍に罹患している患者から取得された腫瘍組織におけるＴ細胞の拡張のために利用される。他の実施形態では、前述の方法は、卵巣癌に罹患している患者から取得された腫瘍組織におけるＴ細胞の拡張のために利用される。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団からの正確にまたは約１×１０^７Ｔ細胞が容器内に播種されて、かかる容器内で一次の第１の拡張を開始するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が複数の容器に分配され、各容器内で、第１のＴ細胞集団からの正確にまたは約１×１０^７Ｔ細胞が播種されて、かかる容器内で一次の第１の拡張を開始するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ステップ（ｃ）において採取された第２のＴ細胞集団が治療的ＴＩＬ集団であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第１のＴ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、ｉ）ＩＬ－２を含む第１の細胞培養培地中で腫瘍試料を約３日間培養することによって対象における腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検、または針生検から取得された腫瘍試料から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容することと、（ｉｉ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、プライミングによる第１の拡張が第１のガス透過性表面積を含む容器内で行われ、プライミングによる第１の拡張が約７日または８日間の第１の期間行われて、第２のＴＩＬ集団が取得され、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の第２の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを補充することによって急速な第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｉｉ）において添加されるＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、急速な第２の拡張が約１１日間の第２の期間行われて、第３のＴＩＬ集団が取得され、第３のＴＩＬ集団が治療的ＴＩＬ集団であり、急速な第２の拡張が第２のガス透過性表面積を含む容器内で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から取得され治療的ＴＩＬ集団を採取することと、（ｖ）ステップ（ｉｖ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、（ｉ）ＩＬ－２を含む第１の細胞培養培地中で腫瘍試料を約３日間培養することによって対象における腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検、または針生検から取得された腫瘍試料から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容することと、（ｉｉ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、プライミングによる第１の拡張が約７日または８日間の第１の期間行われて、第２のＴＩＬ集団が取得され、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを含む第３の細胞培養培地と接触させることによって急速な第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、急速な第２の拡張が約１１日間の第２の期間行われて、第３のＴＩＬ集団が取得され、第３のＴＩＬ集団が治療的ＴＩＬ集団である、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２の期間の５日目の後に、培養物が２つ以上の継代培養物に分割され、各継代培養物に追加量の第３の培養培地が補充され、約６日間培養されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２の期間の５日目の後に、培養物が２つ以上の継代培養物に分割され、各継代培養物にＩＬ－２を含む第４の培養培地が補充され、約６日間培養されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、第２の期間の５日目の後に、培養物が最大５つの継代培養物に分割されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、方法におけるすべてのステップが約２２日間で完了するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞を拡張する方法であって、（ｉ）第１のＴ細胞集団を培養することによって、ドナーにおける腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検、または針生検から取得された腫瘍試料からの第１のＴ細胞集団のプライミングによる第１の拡張を行って成長をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化をプライミングすることと、（ｉｉ）ステップ（ａ）においてプライミングされた第１のＴ細胞集団の活性化が減衰し始めた後に、第１のＴ細胞集団を培養することによって第１のＴ細胞集団の急速な第２の拡張を行って成長をもたらし、第１のＴ細胞集団の活性化を促進して第２のＴ細胞集団を取得することと、（ｉｖ）第２のＴ細胞集団を採取することと、を含む、ＴＩＬ培養細胞を拡張する方法を提供する。いくつかの実施形態では、腫瘍試料は、複数のコア生検から得られる。いくつかの実施形態では、複数のコア生検は、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０個のコア生検からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞またはＴＩＬが腫瘍消化物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載される方法。いくつかの実施形態では、腫瘍消化物は、例えば、ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼであるが、これらに限定されない酵素培地中で腫瘍をインキュベートすること、続いて、機械的解離（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって生成される。いくつかの実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ（任意のブレンドまたはタイプのコラゲナーゼを含む）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）、ヒアルロニダーゼ、中性プロテアーゼ（ディスパーゼ）、キモトリプシン、キモパパイン、トリプシン、カゼイナーゼ、エラスターゼ、パパイン、プロテアーゼタイプＸＩＶ（プロナーゼ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（ ＤＮａｓｅ ）、トリプシン阻害剤、任意の他の解離酵素またはタンパク質分解酵素、及びこれらの任意の組み合わせ等の１つ以上の解離（消化）酵素を含むが、これらに限定されない腫瘍解離酵素混合物の中に配置される。他の実施形態では、腫瘍は、コラゲナーゼ（任意のブレンドまたはタイプのコラゲナーゼを含む）、中性プロテアーゼ（ディスパーゼ）及びデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ）を含む腫瘍解離酵素混合物中に配置される。

薬学的組成物、投与量、及び投薬レジメン
いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して拡張及び／または遺伝子修飾された（ＣＣＲを発現するように遺伝子修飾されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを含む）ＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬは、薬学的組成物として患者に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬ懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡張されたＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が含まれる。

任意の好適な用量のＴＩＬが投与され得る。いくつかの実施形態では、特にがんがＮＳＣＬＣまたは黒色腫である場合、約２．３×１０^１０～約１３．７×１０^１０のＴＩＬが投与され、平均約７．８×１０^１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、約１．２×１０^１０～約４．３×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約３×１０^１０～約１２×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約４×１０^１０～約１０×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約５×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約６×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約７×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約２．３×１０^１０～約１３．７×１０^１０である。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、特にがんが黒色腫である場合、約７．８×１０^１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、特にがんがＮＳＣＬＣである場合、約７．８×１０^１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約１．２×１０^１０～約４．３×１０^１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約３×１０^１０～約１２×１０^１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約４×１０^１０～約１０×１０^１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約５×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約６×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約７×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物で提供されるＴＩＬの数は、約１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、及び９×１０^１３である。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物で提供されるＴＩＬの数は、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７、１×１０^７～５×１０^７、５×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～５×１０^８、５×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～５×１０^９、５×１０^９～１×１０^１０、１×１０^１０～５×１０^１０、５×１０^１０～１×１０^１１、５×１０^１１～１×１０^１２、１×１０^１２～５×１０^１２、及び５×１０^１２～１×１０^１３の範囲内である。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、薬学的組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖより小さい。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖより大きい。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％、または約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの範囲内である。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの範囲内である。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、または０．０００１ｇ以下である。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、または１０ｇより大きい。

本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、治療される対象の性別及び年齢、治療される対象の体重、ならびに主治医の選好及び経験に依存するであろう。適切な場合、ＴＩＬの臨床的に確立された投与量が使用される場合もある。ＴＩＬの投与量などの本明細書の方法を使用して投与される薬学的組成物の量は、治療されるヒトまたは哺乳動物、障害または状態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質、及び処方医師の裁量に依存するであろう。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回用量で投与され得る。かかる投与は、注射、例えば、静脈内注射によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、複数回用量で投与され得る。投薬は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または６回超であり得る。投薬は、月１回、２週間に１回、週１回、または隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は、必要な限り継続することができる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、及び９×１０^１３である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７、１×１０^７～５×１０^７、５×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～５×１０^８、５×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～５×１０^９、５×１０^９～１×１０^１０、１×１０^１０～５×１０^１０、５×１０^１０～１×１０^１１、５×１０^１１～１×１０^１２、１×１０^１２～５×１０^１２、及び５×１０^１２～１×１０^１３の範囲内である。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、または約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ、または約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ、または約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。

ＴＩＬの有効量は、鼻腔内経路及び経皮経路を含む、同様の有用性を有する薬剤の認められた投与様式のうちのいずれかによって、動脈内注射によって、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植によって、または吸入によって、単回用量または複数回用量のいずれかで投与され得る。

他の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を含む注入バッグを提供する。

他の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団及び薬学的に許容される担体を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を含む注入バッグを提供する。

他の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団の凍結保存された調製物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団及び凍結保存培地を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、凍結保存培地がＤＭＳＯを含むように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、凍結保存培地が７～１０％のＤＭＳＯを含むように修正された、上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物の凍結保存された調製物を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して拡張されたＴＩＬは、薬学的組成物として患者に投与される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、滅菌緩衝液中のＴＩＬ懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡張されたＴＩＬは、当該技術分野で知られている任意の好適な経路によって投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、単回の動脈内または静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０～６０分続く。他の好適な投与経路には、腹腔内、髄腔内、及びリンパ内投与が含まれる。

任意の好適な用量のＴＩＬが投与され得る。いくつかの実施形態では、特にがんがＮＳＣＬＣである場合、約２．３×１０^１０～約１３．７×１０^１０のＴＩＬが投与され、平均は約７．８×１０^１０のＴＩＬである。いくつかの実施形態では、約１．２×１０^１０～約４．３×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約３×１０^１０～約１２×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約４×１０^１０～約１０×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約５×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約６×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、約７×１０^１０～約８×１０^１０のＴＩＬが投与される。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約２．３×１０^１０～約１３．７×１０^１０である。いくつかの実施形態では、特にがんがＮＳＣＬＣである場合、治療上有効な投与量は、約７．８×１０^１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約１．２×１０^１０～約４．３×１０^１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約３×１０^１０～約１２×１０^１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約４×１０^１０～約１０×１０^１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約５×１０^１０～約８×１０^１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約６×１０^１０～約８×１０^１０ＴＩＬである。いくつかの実施形態では、治療上有効な投与量は、約７×１０^１０～約８×１０^１０ＴＩＬである。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物で提供されるＴＩＬの数は、約１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、及び９×１０^１３である。いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物で提供されるＴＩＬの数は、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７、１×１０^７～５×１０^７、５×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～５×１０^８、５×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～５×１０^９、５×１０^９～１×１０^１０、１×１０^１０～５×１０^１０、５×１０^１０～１×１０^１１、５×１０^１１～１×１０^１２、１×１０^１２～５×１０^１２、及び５×１０^１２～１×１０^１３の範囲内である。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、薬学的組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖより小さい。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％、または０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖより大きい。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の約０．０００１％～約５０％、約０．００１％～約４０％、約０．０１％～約３０％、約０．０２％～約２９％、約０．０３％～約２８％、約０．０４％～約２７％、約０．０５％～約２６％、約０．０６％～約２５％、約０．０７％～約２４％、約０．０８％～約２３％、約０．０９％～約２２％、約０．１％～約２１％、約０．２％～約２０％、約０．３％～約１９％、約０．４％～約１８％、約０．５％～約１７％、約０．６％～約１６％、約０．７％～約１５％、約０．８％～約１４％、約０．９％～約１２％、または約１％～約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの範囲内である。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、薬学的組成物の約０．００１％～約１０％、約０．０１％～約５％、約０．０２％～約４．５％、約０．０３％～約４％、約０．０４％～約３．５％、約０．０５％～約３％、約０．０６％～約２．５％、約０．０７％～約２％、約０．０８％～約１．５％、約０．０９％～約１％、約０．１％～約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ、またはｖ／ｖの範囲内である。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、または０．０００１ｇ以下である。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、または１０ｇより大きい。

本発明の薬学的組成物中に提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、治療される対象の性別及び年齢、治療される対象の体重、ならびに主治医の選好及び経験に依存するであろう。適切な場合、ＴＩＬの臨床的に確立された投与量が使用される場合もある。ＴＩＬの投与量などの本明細書の方法を使用して投与される薬学的組成物の量は、治療されるヒトまたは哺乳動物、障害または状態の重症度、投与速度、医薬品有効成分の性質、及び処方医師の裁量に依存するであろう。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回用量で投与され得る。かかる投与は、注射、例えば、静脈内注射によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、複数回用量で投与され得る。投薬は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または６回超であり得る。投薬は、月１回、２週間に１回、週１回、または隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は、必要な限り継続することができる。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７、２×１０^７、３×１０^７、４×１０^７、５×１０^７、６×１０^７、７×１０^７、８×１０^７、９×１０^７、１×１０^８、２×１０^８、３×１０^８、４×１０^８、５×１０^８、６×１０^８、７×１０^８、８×１０^８、９×１０^８、１×１０^９、２×１０^９、３×１０^９、４×１０^９、５×１０^９、６×１０^９、７×１０^９、８×１０^９、９×１０^９、１×１０^１０、２×１０^１０、３×１０^１０、４×１０^１０、５×１０^１０、６×１０^１０、７×１０^１０、８×１０^１０、９×１０^１０、１×１０^１１、２×１０^１１、３×１０^１１、４×１０^１１、５×１０^１１、６×１０^１１、７×１０^１１、８×１０^１１、９×１０^１１、１×１０^１２、２×１０^１２、３×１０^１２、４×１０^１２、５×１０^１２、６×１０^１２、７×１０^１２、８×１０^１２、９×１０^１２、１×１０^１３、２×１０^１３、３×１０^１３、４×１０^１３、５×１０^１３、６×１０^１３、７×１０^１３、８×１０^１３、及び９×１０^１３である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７、１×１０^７～５×１０^７、５×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～５×１０^８、５×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～５×１０^９、５×１０^９～１×１０^１０、１×１０^１０～５×１０^１０、５×１０^１０～１×１０^１１、５×１０^１１～１×１０^１２、１×１０^１２～５×１０^１２、及び５×１０^１２～１×１０^１３の範囲内である。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ～約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ～約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ～約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ～約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ～約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ～約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ～約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ～約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ～約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ～約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、または約２．８５ｍｇ／ｋｇ～約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬの有効な投与量は、約１ｍｇ～約５００ｍｇ、約１０ｍｇ～約３００ｍｇ、約２０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約４５ｍｇ、約１０ｍｇ～約４０ｍｇ、約１５ｍｇ～約３５ｍｇ、約２０ｍｇ～約３０ｍｇ、約２３ｍｇ～約２８ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ～約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ～約１１０ｍｇ、または約９５ｍｇ～約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ～約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ～約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ～約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ～約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ～約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ～約２０５ｍｇ、または約１９８～約２０７ｍｇの範囲内である。

ＴＩＬの有効量は、鼻腔内経路及び経皮経路を含む、同様の有用性を有する薬剤の認められた投与様式のうちのいずれかによって、動脈内注射によって、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植によって、または吸入によって、単回用量または複数回用量のいずれかで投与され得る。

患者を治療する方法
治療方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。かかる方法は両方とも、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２，３５（３）：２８３－２９２によって当該技術分野で説明されている。治療方法の実施形態は、実施例を含む以下の節全体に記載されている。

本明細書に記載の方法に従って、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また例えば、図１及び／または図１０９に示されるように）産生される拡張ＴＩＬは、がんを有する患者の治療における特定の用途を見出す（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６，３４（２０）：２３８９－２３９、及び補充内容に記載される）。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、以前に記載されたように、転移性黒色腫の切除された沈着物から成長させた（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００３，２６：３３２－３４２を参照されたい）。新鮮な腫瘍は、滅菌条件下で解剖され得る。代表的な試料は、正式な病理学的分析のために収集され得る。２ｍｍ^３～３ｍｍ^３の単一断片が使用され得る。いくつかの実施形態では、患者当たり５、１０、１５、２０、２５、または３０個の試料が取得される。いくつかの実施形態では、患者当たり２０、２５、または３０個の試料が取得される。いくつかの実施形態では、患者当たり２０、２２、２４、２６、または２８個の試料が取得される。いくつかの実施形態では、患者当たり２４個の試料が取得される。試料は、２４ウェルプレートの個々のウェルに入れ、高用量ＩＬ－２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む成長培地中で維持し、腫瘍の破壊及び／またはＴＩＬの増殖をモニターすることができる。処理後に生細胞が残っている腫瘍は、本明細書に記載されるように、単一細胞懸濁液中に酵素的に消化され、凍結保存され得る。

いくつかの実施形態では、成功裏に成長したＴＩＬは、表現型分析（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６）のためにサンプリングされ、利用可能な場合、自己腫瘍に対して試験され得る。一晩の共培養によりインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）レベルが２００ｐｇ／ｍＬを超え、バックグラウンドの２倍になった場合、ＴＩＬは反応性があるとみなされ得る。（Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１０，３３：８４０－８４７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、自己反応性または十分な成長パターンの証拠を有する培養物は、急速拡張（ＲＥＰ）と称されることもある第２の拡張を含む、第２の拡張（例えば、図１及び／または図１０９のステップＤに従って提供される第２の拡張）のために選択され得る。いくつかの実施形態では、高い自己反応性（例えば、第２の拡張中の高い増殖）を有する拡張ＴＩＬが、追加の第２の拡張のために選択される。いくつかの実施形態では、高い自己反応性（例えば、図１及び／または図１０９のステップＤで提供されるような第２の拡張中の高い増殖）を有するＴＩＬが、図１及び／または図１０９のステップＤに従って、追加の第２の拡張のために選択される。

注入バッグＴＩＬの凍結保存試料の細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）のフローサイトメトリー（例えば、ＦｌｏｗＪｏ）、ならびに本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって分析され得る。血清サイトカインは、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ技術を使用することにより測定された。血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、１００ｐｇ／ｍＬを超え、かつ４ ３ベースラインレベルを超えると定義された。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法、例えば図１及び／または図１０９に例示される方法によって産生されるＴＩＬは、ＴＩＬの臨床的有効性の驚くべき改善を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法、例えば図１及び／または図１０９に例示される方法によって産生されるＴＩＬは、例えば、図１及び／または図１０９に例示されるもの以外の方法を含む、本明細書に記載されるもの以外の方法によって産生されるＴＩＬと比較して、増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるもの以外の方法は、プロセス１Ｃ及び／または第１世代（Ｇｅｎ１）と称される方法を含む。いくつかの実施形態では、増加した有効性は、ＤＣＲ、ＯＲＲ、及び／または他の臨床応答によって測定される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法、例えば図１に例示される方法によって産生されるＴＩＬは、例えば、図１及び／または図１０９に例示されるもの以外の方法を含む、本明細書に記載されるもの以外の方法によって産生されるＴＩＬと比較して、同様の応答時間及び安全性プロファイルを示す。

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＴＩＬで治療された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性なＴＩＬを示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能の別の尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、例えば、図１及び／または図１０９に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象のエクスビボでの血液、血清、またはＴＩＬ中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することによって測定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者における治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、ＩＦＮ－γが１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍以上増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、３倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、４倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば、図１及び／または図１０９に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象のエクスビボでのＴＩＬにおいて測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば図１及び／または図１０９に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象の血液において測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば、図１及び／または図１０９に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象のＴＩＬ血清において測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、がんの治療における治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。

いくつかの実施形態では、例えば図１に記載されるもの、いくつかの実施形態ではＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）を含む、本発明の方法によって調製されるＴＩＬは、治療有効性及び／または臨床的有効性の増加を示す。いくつかの実施形態では、ＴＩＬで治療された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性なＴＩＬを示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能の別の尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、例えば、図１及び／または図１０９に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象のエクスビボでの血液、血清、またはＴＩＬ中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することによって測定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者における治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、ＩＦＮ－γが１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍以上増加する。

いくつかの実施形態では、例えば図１及び／または図１０９に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されるＴＩＬは、例えばプロセス１Ｃ法と称される方法を含む、図１及び／または図１０９に例示されていないものを含む他の方法によって産生されるＴＩＬと比較して、増加したポリクローン性を示す。いくつかの実施形態では、有意に改善されたポリクローン性及び／または増加したポリクローン性は、治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性の増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬの投与に関する治療有効性を示すことができる。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１及び／または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０００倍増加する。

有効性の尺度には、当該技術分野で知られており、本明細書にも記載されている、疾患制御率（ＤＣＲ）及び全応答率（ＯＲＲ）が含まれ得る。

がんを治療する方法
本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患を治療するための方法で使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、成人患者または小児患者における、がんなどの過剰増殖性障害の治療に使用するためのものである。本明細書に記載の組成物及び方法は、本明細書及び以下の段落に記載される他の障害の治療にも使用され得る。

いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、がんである。いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、固形腫瘍がんである。いくつかの実施形態では、固形腫瘍癌は、肛門癌、膀胱癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌を含む）、骨癌、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）によって引き起こされるがん、中枢神経系関連癌（上衣腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、松果芽細胞腫、及び原始神経外胚腫瘍を含む）、子宮頸癌（扁平上皮細胞子宮頸癌、腺扁平上皮子宮頸癌、及び子宮頸部腺癌を含む）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、食道胃接合部癌、胃癌、胃腸癌、胃腸間質腫瘍、神経膠芽細胞腫、神経膠腫、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、下咽頭癌、喉頭癌、鼻咽頭癌、中咽頭癌、及び咽頭癌を含む）、腎癌、肝癌、肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌を含む）、黒色腫（ブドウ膜黒色腫、脈絡膜黒色腫、毛様体黒色腫、または虹彩黒色腫を含む）、中皮腫（悪性胸膜中皮腫を含む）、卵巣癌、膵臓癌（膵管腺癌を含む）、陰茎癌、直腸癌、腎癌、腎細胞癌、肉腫（ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、及び他の骨及び軟部組織の肉腫を含む）、甲状腺癌（未分化甲状腺癌を含む）、子宮癌、及び膣癌からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、血液学的悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、血液学的悪性腫瘍は、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のＣＣＲを発現するように修飾されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを使用して、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、血液学的悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のＣＣＲを発現するように修飾されたＭＩＬまたはＰＢＬを使用して、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、血液学的悪性腫瘍である。

いくつかの実施形態では、がんは、化学療法、放射線療法、または免疫療法を含む少なくとも１つの以前の療法による治療に対して再発するか、または不応性である、固形腫瘍がん及び血液学的悪性腫瘍を含む、前述のがんのうちの１つである。いくつかの実施形態では、がんは、化学療法、放射線療法、及び／または免疫療法を含む少なくとも２つの以前の療法による治療に対して再発するか、または不応性である、前述のがんのうちの１つである。いくつかの実施形態では、がんは、化学療法、放射線療法、及び／または免疫療法を含む少なくとも３つの以前の療法による治療に対して再発するか、または不応性である前述のがんのうちの１つである。

いくつかの実施形態では、がんは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）がんである。したがって、ＭＳＩ－Ｈ及びｄＭＭＲがん及び試験は、Ｋａｗａｋａｍｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｒｅａｔ．Ｏｐｔｉｏｎｓ Ｏｎｃｏｌ．２０１５，１６，３０に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のＣＣＲを発現するように修飾されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを使用して、がんを有する患者を治療する方法を含み、患者は、ヒトである。いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のＣＣＲを発現するように修飾されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを使用して、がんを有する患者を治療する方法を含み、患者は、非ヒトである。いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のＣＣＲを発現するように修飾されたＴＩＬ、ＭＩＬ、またはＰＢＬを使用して、がんを有する患者を治療する方法を含み、患者は、コンパニオンアニマルである。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、ＢＲＡＦ阻害剤及び／またはＭＥＫ阻害剤による治療に対して不応性である。いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物からなる群から選択されるＢＲＡＦ阻害剤による治療に対して不応性である。いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、ピマセルチニブ、レファメチニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物からなる群から選択されるＭＥＫ阻害剤による治療に対して不応性である。いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ソラフェニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物からなる群から選択されるＢＲＡＦ阻害剤、ならびにトラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、ピマセルチニブ、レファメチニブ、及びそれらの薬学的に許容される塩または溶媒和物からなる群から選択されるＭＥＫ阻害剤による治療に対して不応性である。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、小児癌である。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、がんは、ブドウ膜黒色腫である。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、ブドウ膜黒色腫は、脈絡膜黒色腫、毛様体黒色腫、または虹彩黒色腫である。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、小児癌は、神経芽腫である。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、小児癌は、肉腫である。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、肉腫は、骨肉腫である。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、肉腫は、軟部組織肉腫である。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、軟部組織肉腫は、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、または未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）である。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、小児癌は、中枢神経系（ＣＮＳ）関連がんである。いくつかの実施形態では、小児癌は、化学療法による治療に対して不応性である。いくつかの実施形態では、小児癌は、放射線療法による治療に対して不応性である。いくつかの実施形態では、小児癌は、ジヌツキシマブによる治療に対して不応性である。

いくつかの実施形態では、本発明は、がんを有する患者を治療する方法を含み、ＣＮＳ関連がんは、髄芽腫、松果芽腫、神経膠腫、上衣腫、または神経膠芽細胞腫である。

本明細書に記載の組成物及び方法は、がんを治療するための方法において使用することができ、がんは、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による治療に対して不応性であるか、または抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体による治療に対する前治療に対して耐性である。いくつかの実施形態では、患者は、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対する一次不応性患者である。いくつかの実施形態では、患者は、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対する事前の応答を示さない。いくつかの実施形態では、患者は、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対する事前の応答を示し、その後に患者のがんの進行が続く。いくつかの実施形態では、がんは、少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせた抗ＣＴＬＡ－４抗体及び／または抗ＰＤ－１もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体に対して不応性である。いくつかの実施形態では、以前の化学療法剤は、カルボプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、及び／またはシスプラチンである。いくつかの以前の実施形態では、化学療法剤（複数可）は、白金ダブレット化学療法剤である。いくつかの実施形態では、白金ダブレット療法は、シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択される第１の化学療法剤と、ビノレルビン、ゲムシタビン、及びタキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはナブ－パクリタキセルを含む）からなる群から選択される第２の化学療法剤と、を含む。いくつかの実施形態では、白金ダブレット化学療法剤は、ペメトレキセドと組み合わされている。

いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、ＰＤ－Ｌ１陰性であり、及び／または本明細書の他の場所に記載されるように、＜１％の腫瘍割合スコア（ＴＰＳ）でＰＤ－Ｌ１を発現するがんを有する患者からのものである。

いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１及び白金ダブレット療法を含む併用療法に対して不応性であり、白金ダブレット療法は、
ｉ）シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択される第１の化学療法剤と、
ｉｉ）ビノレルビン、ゲムシタビン、及びタキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはｎａｂ－パクリタキセルを含む）からなる群から選択される第２の化学療法剤と、を含む。

いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ペメトレキセド、及び白金ダブレット療法を含む併用療法に対して不応性であり、白金ダブレット療法は、
ｉ）シスプラチン及びカルボプラチンからなる群から選択される第１の化学療法剤と、
ｉｉ）ビノレルビン、ゲムシタビン、及びタキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはｎａｂ－パクリタキセルを含む）からなる群から選択される第２の化学療法剤と、を含む。

いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、抗ＰＤ－１抗体で治療されている。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体で処理されている。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ対象は、治療ナイーブである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、抗ＰＤ－１抗体で治療されていない。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療されていない。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、以前に化学療法剤で治療されている。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、以前に化学療法剤で治療されているが、もはや化学療法剤で治療されていない。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ患者は、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ナイーブである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ患者は、低いＰＤ－Ｌ１の発現を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ患者は、治療ナイーブのＮＳＣＬＣを有するか、または化学療法治療後であるが、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ナイーブである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ患者は、治療ナイーブであるか、または化学療法治療後であるが、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ナイーブであり、低いＰＤ－Ｌ１の発現を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ患者は、ベースラインで巨大腫瘤病変を有する。いくつかの実施形態では、対象は、ベースラインで巨大腫瘤病変を有し、低いＰＤ－Ｌ１の発現を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ患者は、検出可能なＰＤ－Ｌ１の発現を有しない。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ患者は、治療ナイーブであるか、または化学療法治療後であるが、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ナイーブであり、検出可能なＰＤ－Ｌ１の発現を有しない。いくつかの実施形態では、患者は、ベースラインで巨大腫瘤病変を有し、検出可能なＰＤ－Ｌ１の発現を有しない。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ患者は、治療ナイーブのＮＳＣＬＣまたは化学療法後（例えば、化学療法剤後）であるが、ＰＤ－Ｌ１の発現が低く、及び／またはベースラインで巨大腫瘤病変を有する抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ナイーブである。いくつかの実施形態では、最大腫瘍直径が横方向または冠状面のいずれかで測定された７ｃｍより大きい場合、巨大腫瘤病変が示される。いくつかの実施形態では、巨大腫瘤病変は、２０ｍｍ以上の短軸直径を有する腫れたリンパ節がある場合に示される。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、ＮＳＣＬＣの標準治療の治療薬を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１発現は、腫瘍割合スコアによって決定される。いくつかの実施形態では、不応性ＮＳＣＬＣ腫瘍を有する対象は、＜１％の腫瘍割合スコア（ＴＰＳ）を有する。いくつかの実施形態では、不応性ＮＳＣＬＣ腫瘍を有する対象は、≧１％ ＴＰＳを有する。いくつかの実施形態では、不応性ＮＳＣＬＣを有する対象は、抗ＰＤ－１及び／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体で以前に治療されており、腫瘍割合スコアは、該抗ＰＤ－１及び／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の前に決定された。いくつかの実施形態では、不応性ＮＳＣＬＣを有する対象は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体で以前に治療されており、腫瘍割合スコアは、該抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の前に決定された。

いくつかの実施形態では、例えば図１または図１０９に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されるＴＩＬは、例えばプロセス１Ｃ法と称される方法などの、図１または図１０９に例示されていないものを含む他の方法によって産生されるＴＩＬと比較して、増加したポリクローン性を示す。いくつかの実施形態では、有意に改善されたポリクローン性及び／または増加したポリクローン性は、がん治療に対する治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性の増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬの投与に関する治療有効性を示すことができる。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、例えば、図１または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１または図１０９に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書で提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０００倍増加する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１発現は、本明細書に記載の１つのさらなる試験方法を使用して、腫瘍割合スコアによって決定される。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ腫瘍を有する対象または患者は、＜１％の腫瘍割合スコア（ＴＰＳ）を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣ腫瘍は、≧１％ ＴＰＳを有する。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣを有する対象または患者は、抗ＰＤ－１及び／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体で以前に治療されており、腫瘍割合スコアは、抗ＰＤ－１及び／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の前に決定された。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣを有する対象または患者は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体で以前に治療されており、腫瘍割合スコアは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の前に決定された。いくつかの実施形態では、不応性または耐性ＮＳＣＬＣ腫瘍を有する対象または患者は、＜１％の腫瘍割合スコア（ＴＰＳ）を有する。いくつかの実施形態では、不応性または耐性ＮＳＣＬＣ腫瘍を有する対象または患者は、≧１％ ＴＰＳを有する。いくつかの実施形態では、不応性または耐性ＮＳＣＬＣを有する対象または患者は、抗ＰＤ－１及び／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体で以前に治療されており、腫瘍割合スコアは、抗ＰＤ－１及び／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の前に決定された。いくつかの実施形態では、不応性または耐性ＮＳＣＬＣを有する対象または患者は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体で以前に治療されており、腫瘍割合スコアは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体治療の前に決定された。

いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、１％未満（ＴＰＳ＜１％）のＰＤ－Ｌ１タンパク質についての任意の強度での部分的または完全な膜染色を示す、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１療法の前に採取された患者からの腫瘍割合スコア（ＴＰＳ）または生存腫瘍細胞のパーセンテージを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、＜５０％、＜４５％、＜４０％、＜３５％、＜３０％、＜２５％、＜２０％、＜１５％、＜１０％、＜９％、＜８％、＜７％、＜６％、＜５％、＜４％、＜３％、＜２％、＜１％、＜０．９％、＜０．８％、＜０．７％、＜０．６％、＜０．５％、＜０．４％、＜０．３％、＜０．２％、＜０．１％、＜０．０９％、＜０．０８％、＜０．０７％、＜０．０６％、＜０．０５％、＜０．０４％、＜０．０３％、＜０．０２％、及び＜０．０１％からなる群から選択されるＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．９％、約０．８％、約０．７％、約０．６％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、約０．１％、約０．０９％、約０．０８％、約０．０７％、約０．０６％、約０．０５％、約０．０４％、約０．０３％、約０．０２％，及び約０．０１％からなる群から選択されるＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、０％～１％のＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、０％～０．９％のＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、０％～０．８％のＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、０％～０．７％のＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、０％～０．６％のＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、０％～０．５％のＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、０％～０．４％のＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、０％～０．３％のＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、０％～０．２％のＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、０％～０．１％のＴＰＳを示すＮＳＣＬＣである。ＴＰＳは、当該技術分野で知られている方法、例えば、Ｈｉｒｓｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｏｎｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．２０１７：１２，２０８－２２２に記載される方法、あるいはペムブロリズマブまたは他の抗ＰＤ－１もしくは抗ＰＤ－Ｌ１療法による治療前のＴＰＳの決定に使用される方法によって測定され得る。米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認されたＴＰＳの測定のための方法を使用することもできる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、エクソソームＰＤ－Ｌ１である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、循環腫瘍細胞上に見出される。

いくつかの実施形態では、部分的な膜染色は、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上を含む。いくつかの実施形態では、完了した膜染色は、およそ１００％膜染色を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１の試験は、患者の血清中のＰＤ－Ｌ１のレベルを測定することを伴い得る。これらの実施形態では、患者の血清中のＰＤ－Ｌ１の測定は、腫瘍の不均一性の不確実性及び連続生検の患者の不快感を除去する。

いくつかの実施形態では、ベースラインまたは標準レベルと比較して、可溶性ＰＤ－Ｌ１の上昇は、ＮＳＣＬＣにおける予後の悪化と相関する。例えば、Ｏｋｕｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，２０１８，１９，４１０－４１７、Ｖｅｃｃｈｉａｒｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１８，９，１７５５４－１７５６３を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、エクソソームＰＤ－Ｌ１である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、循環腫瘍細胞上に発現される。

いくつかの実施形態では、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を必要とする対象または患者に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を投与することによって、ＮＳＣＬＣを治療する方法を提供し、対象または患者は、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１＜１％の所定の腫瘍割合スコア（ＴＰＳ）、
（ｂ）１％～４９％のＰＤ－Ｌ１のＴＰＳスコア、または
（ｃ）１つ以上のドライバー変異の所定の非存在のうちの少なくとも１つを有し、
（ｄ）ドライバー変異は、ＥＧＦＲ変異、ＥＧＦＲ挿入、ＥＧＦＲエクソン２０変異、ＫＲＡＳ変異、ＢＲＡＦ変異、ＡＬＫ変異、ｃ－ＲＯＳ変異（ＲＯＳ１変異）、ＲＯＳ１融合、ＲＥＴ変異、ＲＥＴ融合、ＥＲＢＢ２変異、ＥＲＢＢ２増幅、ＢＲＣＡ変異、ＭＡＰ２Ｋ１変異、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ変異、ＵＭＤ変異、ＮＲＡＳ変異、ＫＲＡＳ変異、ＮＦ１変異、ＭＥＴ変異、ＭＥＴスプライス及び／または変化したＭＥＴシグナル伝達、ＴＰ５３変異、ＣＲＥＢＢＰ変異、ＫＭＴ２Ｃ変異、ＫＭＴ２Ｄ変異、ＡＲＩＤ１Ａ変異、ＲＢ１変異、ＡＴＭ変異、ＳＥＴＤ２変異、ＦＬＴ３変異、ＰＴＰＮ１１変異、ＦＧＦＲ１変異、ＥＰ３００変異、ＭＹＣ変異、ＥＺＨ２変異、ＪＡＫ２変異、ＦＢＸＷ７変異、ＣＣＮＤ３変異、及びＧＮＡ１１変異からなる群から選択され、この方法は、
（ｅ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象または患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容することと、
（ｆ）第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に添加することと、
（ｇ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、系を開くことなく起こる、第１の拡張を行うことと、
（ｈ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１４日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２の拡張を行うことと、
（ｉ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｊ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｋ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｈ）治療上有効な投与量の第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｇ）の注入バッグから対象または患者に投与することと、を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を必要とする対象または患者に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を投与することによって、ＮＳＣＬＣを治療する方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－Ｌ１発現及び腫瘍割合スコア（ＴＰＳ）について患者の腫瘍を試験することと、
（ｂ）１つ以上のドライバー変異の所定の非存在について患者を試験することであって、ドライバー変異が、ＥＧＦＲ変異、ＥＧＦＲ挿入、ＥＧＦＲエクソン２０、ＫＲＡＳ変異、ＢＲＡＦ変異、ＡＬＫ変異、ｃ－ＲＯＳ変異（ＲＯＳ１変異）、ＲＯＳ１融合、ＲＥＴ変異、ＲＥＴ融合、ＥＲＢＢ２変異、ＥＲＢＢ２増幅、ＢＲＣＡ変異、ＭＡＰ２Ｋ１変異、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ変異、ＵＭＤ変異、ＮＲＡＳ変異、ＫＲＡＳ変異、ＮＦ１変異、ＭＥＴ変異、ＭＥＴスプライス及び／または変化したＭＥＴシグナル伝達、ＴＰ５３変異、ＣＲＥＢＢＰ変異、ＫＭＴ２Ｃ変異、ＫＭＴ２Ｄ変異、ＡＲＩＤ１Ａ変異、ＲＢ１変異、ＡＴＭ変異、ＳＥＴＤ２変異、ＦＬＴ３変異、ＰＴＰＮ１１変異、ＦＧＦＲ１変異、ＥＰ３００変異、ＭＹＣ変異、ＥＺＨ２変異、ＪＡＫ２変異、ＦＢＸＷ７変異、ＣＣＮＤ３変異、及びＧＮＡ１１変異からなる群から選択される、試験することと、
（ｃ）患者が、約１％～約４９％のＰＤ－Ｌ１のＴＰＳスコアを有していることを判定し、また患者がドライバー変異を有しないことを判定することと、
（ｄ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象または患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容することと、
（ｅ）第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に付加することと、
（ｆ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、第１の拡張を行うことと、
（ｇ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１４日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２の拡張を行うことと、
（ｈ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｉ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｊ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｋ）治療上有効な投与量の第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｇ）の注入バッグから対象または患者に投与することと、を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を必要とする対象または患者に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を投与することによって、ＮＳＣＬＣを治療する方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－Ｌ１発現及び腫瘍割合スコア（ＴＰＳ）について患者の腫瘍を試験することと、
（ｂ）１つ以上のドライバー変異の所定の非存在について患者を試験することであって、ドライバー変異が、ＥＧＦＲ変異、ＥＧＦＲ挿入、ＥＧＦＲエクソン２０、ＫＲＡＳ変異、ＢＲＡＦ変異、ＡＬＫ変異、ｃ－ＲＯＳ変異（ＲＯＳ１変異）、ＲＯＳ１融合、ＲＥＴ変異、ＲＥＴ融合、ＥＲＢＢ２変異、ＥＲＢＢ２増幅、ＢＲＣＡ変異、ＭＡＰ２Ｋ１変異、ＰＩＫ３ＣＡ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＰＴＥＮ変異、ＵＭＤ変異、ＮＲＡＳ変異、ＫＲＡＳ変異、ＮＦ１変異、ＭＥＴ変異、ＭＥＴスプライス及び／または変化したＭＥＴシグナル伝達、ＴＰ５３変異、ＣＲＥＢＢＰ変異、ＫＭＴ２Ｃ変異、ＫＭＴ２Ｄ変異、ＡＲＩＤ１Ａ変異、ＲＢ１変異、ＡＴＭ変異、ＳＥＴＤ２変異、ＦＬＴ３変異、ＰＴＰＮ１１変異、ＦＧＦＲ１変異、ＥＰ３００変異、ＭＹＣ変異、ＥＺＨ２変異、ＪＡＫ２変異、ＦＢＸＷ７変異、ＣＣＮＤ３変異、及びＧＮＡ１１変異からなる群から選択される、試験することと、
（ｃ）患者が、約１％未満のＰＤ－Ｌ１のＴＰＳスコアを有していることを判定し、また患者がドライバー変異を有しないことを判定することと、
（ｄ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象または患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容することと、
（ｅ）第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に添加することと、
（ｆ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、第１の拡張を行うことと、
（ｇ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１４日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２の拡張を行うことと、
（ｈ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｉ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｊ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｋ）治療上有効な投与量の第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｇ）の注入バッグから対象または患者に投与することと、を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を必要とする対象または患者に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を投与することによって、ＮＳＣＬＣを治療する方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－Ｌ１発現及び腫瘍割合スコア（ＴＰＳ）について患者の腫瘍を試験することと、
（ｂ）１つ以上のドライバー変異の非存在について患者を試験することであって、ドライバー変異が、ＥＧＦＲ変異、ＥＧＦＲ挿入、ＫＲＡＳ変異、ＢＲＡＦ変異、ＡＬＫ変異、ｃ－ＲＯＳ変異（ＲＯＳ１変異）、ＲＯＳ１融合、ＲＥＴ変異、またはＲＥＴ融合からなる群から選択される、試験することと、
（ｃ）患者が、約１％～約４９％のＰＤ－Ｌ１のＴＰＳスコアを有していることを判定し、また患者がドライバー変異を有しないことを判定することと、
（ｄ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象または患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容することと、
（ｅ）第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に添加することと、
（ｆ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、第１の拡張を行うことと、
（ｇ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１４日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２の拡張を行うことと、
（ｈ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｉ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｊ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｋ）治療上有効な投与量の第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｇ）の注入バッグから対象または患者に投与することと、を含む。

いくつかの実施形態では、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療を必要とする対象または患者に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を投与することによって、ＮＳＣＬＣを治療する方法を提供し、この方法は、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－Ｌ１発現及び腫瘍割合スコア（ＴＰＳ）について患者の腫瘍を試験することと、
（ｂ）１つ以上のドライバー変異の非存在について患者を試験することであって、ドライバー変異が、ＥＧＦＲ変異、ＥＧＦＲ挿入、ＫＲＡＳ変異、ＢＲＡＦ変異、ＡＬＫ変異、ｃ－ＲＯＳ変異（ＲＯＳ１変異）、ＲＯＳ１融合、ＲＥＴ変異、またはＲＥＴ融合からなる群から選択される、試験することと、
（ｃ）患者が、約１％未満のＰＤ－Ｌ１のＴＰＳスコアを有していることを判定し、また患者がドライバー変異を有しないことを判定することと、
（ｄ）対象から取得された腫瘍試料を複数の腫瘍断片に処理することによって、対象または患者から切除された腫瘍から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容することと、
（ｅ）第１のＴＩＬ集団を閉鎖系に添加することと、
（ｆ）ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、第１の拡張が、約３～１４日間行われて、第２のＴＩＬ集団を取得し、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、第１の拡張を行うことと、
（ｇ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）で補充することによって第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第２の拡張が、約７～１４日間行われて、第３のＴＩＬ集団を取得し、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を提供する密閉容器内で行われ、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、系を開くことなく起こる、第２の拡張を行うことと、
（ｈ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、系を開くことなく起こる、採取することと、
（ｉ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことであって、ステップ（ｅ）から（ｆ）への移行が、系を開くことなく起こる、移すことと、
（ｊ）凍結保存プロセスを使用して、ステップ（ｆ）からの採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存することと、
（ｋ）治療上有効な投与量の第３のＴＩＬ集団を、ステップ（ｇ）の注入バッグから対象または患者に投与することと、を含む。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の本明細書に記載のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団及びＴＩＬ組成物をそれぞれ投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与に続いて、２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間のフルダラビンを投与するステップを含むように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、対象にＴＩＬ細胞を投与した翌日に開始する、高用量のＩＬ－２レジメンで対象を治療するステップをさらに含むように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、許容範囲まで８時間毎に１５分間のボーラス静脈内注入として投与される６００，０００または７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが固形腫瘍であるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、ヒト乳頭癌ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、または腎細胞癌であるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、及び胃腸癌であるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫であるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんがＨＮＳＣＣであるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが子宮頸癌であるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんがＮＳＣＬＣであるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）であるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが胃腸癌であるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが超変異癌であるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが小児超変異癌であるように修正された、本明細書に記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の治療的ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法で使用するための、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法で使用するための、本明細書に記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団または本明細書に記載のＴＩＬ組成物を対象に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団または本明細書に記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与に続いて、２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間のフルダラビンを投与するステップを含むように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ＴＩＬ細胞を患者に投与した翌日から開始する、高用量ＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含むように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、許容範囲まで８時間毎に１５分間のボーラス静脈内注入として投与される６００，０００または７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが固形腫瘍であるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが、黒色腫、卵巣癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、トリプルネガティブ乳癌、ヒト乳頭癌ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、または腎細胞癌であるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、及び胃腸癌であるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫であるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんがＨＮＳＣＣであるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが子宮頸癌であるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんがＮＳＣＬＣであるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが、神経膠芽細胞腫であるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが胃腸癌であるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが超変異癌であるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが小児超変異癌であるように修正された、本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の治療的ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法における本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法における上記の前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンを患者に投与することと、次いで治療上有効な投与量の前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または治療上有効な投与量の本明細書に記載のＴＩＬ組成物を対象に投与することとを含む、患者においてがんを治療する方法における本明細書に記載の治療的ＴＩＬ集団または本明細書に記載のＴＩＬ組成物の使用を提供する。

ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１阻害剤との併用
いくつかの実施形態では、がんを有する患者に提供されるＴＩＬ療法は、ＴＩＬ単独の治療集団による治療を含んでもよく、またはＴＩＬ及び１つ以上のＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤を含む併用治療を含んでもよい。

プログラム死１（ＰＤ－１）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、活性化単球、及び樹状細胞によって発現される２８８アミノ酸の膜貫通免疫チェックポイント受容体タンパク質である。ＣＤ２７９としても知られるＰＤ－１は、ＣＤ２８ファミリーに属し、ヒトでは第２染色体上のＰｄｃｄ１遺伝子によってコードされる。ＰＤ－１は、１つの免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリードメイン、膜貫通領域、ならびに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞内ドメインからなる。ＰＤ－１とそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）は、Ｋｅｉｒ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，６７７－７０４に記載されるように、免疫寛容において重要な役割を果たすことが知られている。ＰＤ－１は、Ｔ細胞の免疫応答を負に調節する阻害シグナルを提供する。ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１またはＣＤ２７４としても知られる）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣまたはＣＤ２７３としても知られる）は、腫瘍細胞及び間質細胞上に発現され、ＰＤ－１を発現する活性化Ｔ細胞が遭遇する可能性があり、Ｔ細胞の免疫抑制につながる。ＰＤ－Ｌ１は、ヒト第９染色体上のＣｄ２７４遺伝子によってコードされる２９０アミノ酸の膜貫通タンパク質である。例えば、Ｔｏｐａｌｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１２，３６６，２４４３－５４に記載される最近の臨床研究で実証されているように、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、及び／またはＰＤ－Ｌ２阻害剤の使用による、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との間の相互作用をブロックすることで、免疫抵抗を克服することができる。ＰＤ－Ｌ１は、多くの腫瘍細胞株上で発現されるが、ＰＤ－Ｌ２は、主に樹状細胞及びいくつかの腫瘍株上で発現される。Ｔ細胞（活性化後にＰＤ－１を誘導的に発現する）に加えて、ＰＤ－１は、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、活性化単球、樹状細胞上でも発現される。

いくつかの実施形態では、ＴＩＬ及びＰＤ－１阻害剤は、ＮＳＣＬＣの治療のための併用療法または共療法として投与される。

いくつかの実施形態では、ＮＳＣＬＣは、前治療を受けていない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、フロントライン療法または初期療法として投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、本明細書に記載のＴＩＬと併用して、フロントライン療法または初期療法として投与される。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、当該技術分野で知られている任意のＰＤ－１阻害剤またはＰＤ－１遮断剤であり得る。特に、次の段落でより詳細に記載されるＰＤ－１阻害剤または遮断剤のうちの１つである。「阻害剤」、「アンタゴニスト」、及び「遮断剤」という用語は、本明細書では、ＰＤ－１阻害剤に関して互換的に使用される。誤解を避けるために、抗体であるＰＤ－１阻害剤への本明細書での言及は、化合物またはその抗原結合断片、バリアント、複合体、もしくはバイオシミラーを指し得る。誤解を避けるために、ＰＤ－１阻害剤への本明細書での言及はまた、小分子化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、水和物、共結晶、もしくはプロドラッグを指し得る。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、抗体（すなわち、抗ＰＤ－１抗体）、Ｆａｂ断片を含むその断片、またはその一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ＰＤ－１との結合について競合し、及び／またはＰＤ－１上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ－１との結合について競合し、及び／またはＰＤ－１上のエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ヒトＰＤ－１に約１００ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約９０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約８０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約７０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約６０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約５０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約４０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約３０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約２０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－１に約１０ｐＭ以下のＫＤで結合する、またはヒトＰＤ－１に約１ｐＭ以下のＫＤで結合するものである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ヒトＰＤ－１に約７．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約７．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約８×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約８．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約９×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約９．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、またはヒトＰＤ－１に約１×１０^６１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合するものである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ヒトＰＤ－１に約２×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．１×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．２×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．３×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．４×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．５×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．６×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、またはヒトＰＤ－１に約２．７×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．８×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．９×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、またはヒトＰＤ－１に約３×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合するものである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、または約１ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害するものである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．からＯＰＤＩＶＯとして市販されている）、またはそれらのバイオシミラー、抗原結合断片、複合体、もしくはバリアントである。ニボルマブは、ＰＤ－１受容体を遮断する完全ヒトＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、免疫グロブリンＧ４カッパ、抗（ヒトＣＤ２７４）抗体である。ニボルマブには、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）登録番号９４６４１４－９４－４が割り当てられており、５Ｃ４、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６、及びＯＮＯ－４５３８としても知られている。ニボルマブの調製及び特性は、米国特許第８，００８，４４９号及び国際特許公開第ＷＯ２００６／１２１１６８号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。様々な形態のがんにおけるニボルマブの臨床的安全性及び有効性は、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２０１４，２，８４６－５６、Ｐａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２０１４，６５，１８５－２０２、及びＷｅｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１３，３１，４３１１－４３１８に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ニボルマブのアミノ酸配列を表１８に示す。ニボルマブは、２２～９６、１４０～１９６、２５４～３１４、３６０～４１８、２２”～９６”、１４０”～１９６”、２５４”～３１４”、及び３６０”～４１８”に重鎖内ジスルフィド結合、２３’～８８’、１３４’～１９４’、２３’’’～８８’’’、及び１３４’’’～１９４’’’に軽鎖内ジスルフィド結合、１２７～２１４’、１２７”～２１４’’’に重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合、２１９～２１９”及び２２２～２２２”に重鎖－重鎖間ジスルフィド結合、２９０、２９０”にＮ－グリコシル化部位（Ｈ ＣＨ２ ８４．４）を有する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、配列番号１５８によって与えられる重鎖及び配列番号１５９によって与えられる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ、配列番号１５８及び配列番号１５９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１５８及び配列番号１５９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１５８及び配列番号１５９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１５８及び配列番号１５９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１５８及び配列番号１５９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号４６３及び配列番号１５９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号１６０に示される配列を含み、ＰＤ－１阻害剤軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号１６１に示される配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６０及び配列番号１６１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６０及び配列番号１６１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６０及び配列番号１６１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６０及び配列番号１６１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６０及び配列番号１６１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ、配列番号１６２、配列番号１６３、及び配列番号１６４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１６５、配列番号１６６、及び配列番号１６７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、及び／またはＰＤ－１上の同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－１バイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列と少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ参照医薬品または参照バイオ製品と比較して１つ以上の翻訳後修飾を含む抗ＰＤ－１抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、ニボルマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＰＤ－１抗体であり、抗ＰＤ－１抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、ニボルマブである。抗ＰＤ－１抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されている場合がある。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ニボルマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ニボルマブである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、約２００ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４８０ｍｇ、または約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ニボルマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、または６週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために投与され、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために投与され、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために投与され、約１ｍｇ／ｋｇ、続いてイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇを同じ日に３週間毎に４回、次いで２４０ｍｇを２週間毎、または４８０ｍｇを４週間毎に投与される。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、黒色腫のアジュバント治療のために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、黒色腫のアジュバント治療のために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、黒色腫のアジュバント治療のために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために、２週間毎に約３ｍｇ／ｋｇで、６週間毎に１ｍｇ／ｋｇのイピリムマブともに投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために、３週間毎に約３６０ｍｇで、６週間毎に１ｍｇ／ｋｇのイピリムマブ及び２サイクルのプラチナダブレット化学療法とともに投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇまたは４週間毎に４８０ｍｇ投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、小細胞肺癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、小細胞肺癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、悪性胸膜中皮腫を治療するために、３週間毎に約３６０ｍｇで、６週間毎に１ｍｇ／ｋｇのイピリムマブとともに投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、進行性腎細胞癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、進行性腎細胞癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、進行性腎細胞癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、進行性腎細胞癌を治療するために、約３ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ約１ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４回、次いで２４０ｍｇを２週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、進行性腎細胞癌を治療するために、約３ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ約１ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４回、次いで２４０ｍｇを２週間毎、４８０ｍｇを４週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、古典的なホジキンリンパ腫を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、古典的なホジキンリンパ腫を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、古典的なホジキンリンパ腫を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、頭頸部の再発性または転移性扁平上皮癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、頭頸部の再発性または転移性扁平上皮癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、頭頸部の再発性または転移性扁平上皮癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、局所進行性または転移性尿路上皮癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、局所進行性または転移性尿路上皮癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、成人及び小児患者における高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、成人及び４０ｋｇ以上の小児患者における２週間毎に約２４０ｍｇで高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、成人及び４０ｋｇ以上の小児患者における４週間毎に約４８０ｍｇで高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、４０ｋｇ未満の小児患者における２週間毎に約３ｍｇ／ｋｇで高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、成人及び４０ｋｇ以上の小児患者における高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために約３ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ１ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４回、次いで２４０ｍｇを２週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、成人及び４０ｋｇ以上の小児患者における高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために約３ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ１ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４回、次いで４８０ｍｇを４週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、肝細胞癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、肝細胞癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、肝細胞癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、肝細胞癌を治療するために、約１ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４回、次いで２４０ｍｇを２週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、肝細胞癌を治療するために、約１ｍｇ／ｋｇで投与され、続いて同じ日にイピリムマブ３ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４回、次いで４８０ｍｇを４週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ニボルマブは、食道扁平上皮癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、食道扁平上皮癌を治療するために、２週間毎に約２４０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブは、食道扁平上皮癌を治療するために、４週間毎に約４８０ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ニボルマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

他の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）からＫＥＹＴＲＵＤＡとして市販されている）、またはそれらの抗原結合断片、コンジュゲート、もしくはバリアントを含む。ペムブロリズマブには、ＣＡＳ登録番号１３７４８５３－９１－４が割り当てられており、ラムブロリズマブ、ＭＫ－３４７５、及びＳＣＨ－９００４７５としても知られている。ペムブロリズマブは、免疫グロブリンＧ４、抗（ヒトタンパク質ＰＤＣＤ１（プログラム細胞死１））（ヒト－ハツカネズミモノクローナル重鎖）、ヒト－ハツカネズミモノクローナル軽鎖、二量体構造を有するジスルフィドを有する。ペムブロリズマブの構造は、免疫グロブリンＧ４、抗（ヒトプログラム細胞死１）；ヒト化マウスモノクローナルκ軽鎖二量体（２２６－２２６”：２２９－２２９”）－ビスジスルフィドを有するヒト化マウスモノクローナル［２２８－Ｌ－プロリン（Ｈ１０－Ｓ＞Ｐ）］γ４重鎖（１３４－２１８’）－ジスルフィドとしても記載され得る。ペムブロリズマブの特性、使用、及び調製は、国際特許公開第ＷＯ２００８／１５６７１２Ａ１号、米国特許第８，３５４，５０９号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１０／０２６６６１７Ａ１号、同第ＵＳ２０１３／０１０８６５１Ａ１号、及び同第ＵＳ２０１３／０１０９８４３Ａ２に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。様々な形態のがんにおけるペムブロリズマブの臨床的安全性及び有効性は、Ｆｕｅｒｓｔ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｔｉｍｅｓ，２０１４，３６，３５－３６、Ｒｏｂｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２０１４，３８４，１１０９－１７、及びＴｈｏｍａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０１４，１４，１０６１－１０６４に記載されている。ペムブロリズマブのアミノ酸配列を表１９に示す。ペムブロリズマブは、ジスルフィド架橋：２２－９６、２２”－９６”、２３’－９２’、２３’’’－９２’’’、１３４－２１８’、１３４”－２１８’’’、１３８’－１９８’、１３８’’’－１９８’’’、１４７－２０３、１４７”－２０３”、２２６－２２６”、２２９－２２９”、２６１－３２１、２６１”－３２１”、３６７－４２５、及び３６７”－４２５”、ならびにグリコシル化部位（Ｎ）：Ａｓｎ－２９７及びＡｓｎ－２９７”を含む。ペムブロリズマブは、Ｆｃ領域に安定化Ｓ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４／カッパアイソタイプであり、この変異をＩｇＧ４ヒンジ領域に挿入すると、ＩｇＧ４抗体で典型的に観察される半分子の形成が防止される。ペムブロリズマブは、各重鎖のＦｃドメイン内のＡｓｎ２９７で不均一にグリコシル化されており、無傷の抗体の分子量はおよそ１４９ｋＤａになる。ペムブロリズマブの優性グリコフォームは、フコシル化アガラクト二分性グリカンフォーム（Ｇ０Ｆ）である。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、配列番号１６８によって与えられる重鎖及び配列番号１６９によって与えられる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１６８及び配列番号１６９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号１７０に示される配列を含み、ＰＤ－１阻害剤軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号１７１に示される配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７０及び配列番号１７１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７０及び配列番号１７１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７０及び配列番号１７１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７０及び配列番号１７１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７０及び配列番号１７１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、それぞれ、配列番号１７２、配列番号１７３、及び配列番号１７４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１７５、配列番号１７６、及び配列番号１７７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、及び／またはＰＤ－１上の同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－１バイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＰＤ－１抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、ペムブロリズマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＰＤ－１抗体であり、抗ＰＤ－１抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、ペムブロリズマブである。抗ＰＤ－１抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されている場合がある。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ペムブロリズマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ペムブロリズマブである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはそのバイオシミラーであり、ペムブロリズマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはそのバイオシミラーであり、ペムブロリズマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはそのバイオシミラーであり、ペムブロリズマブは、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはそのバイオシミラーであり、ニボルマブは、約２００ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４８０ｍｇ、または約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはそのバイオシミラーであり、ペムブロリズマブは、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、または６週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、黒色腫を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、黒色腫を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、黒色腫を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＮＳＣＬＣを治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＮＳＣＬＣを治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＮＳＣＬＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＳＣＬＣを治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＳＣＬＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＨＮＳＣＣを治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＨＮＳＣＣ治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、古典的なホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）または原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、古典的なホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）または原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）を治療するために、成人の場合、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、古典的なホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）または原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）を治療するために、小児の場合、３週間毎に約２ｍｇ／ｋｇ（最大２００ｍｇ）で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、尿路上皮癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、尿路上皮癌を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＭＳＩ－ＨまたはｄＭＭＲ癌を治療するために、成人の場合、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＭＳＩ－ＨまたはｄＭＭＲ癌を治療するために、小児の場合、３週間毎に約２ｍｇ／ｋｇ（最大２００ｍｇ）で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損結腸直腸癌（ｄＭＭＲ ＣＲＣを治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＭＳＩ－ＨまたはｄＭＭＲ ＣＲＣを治療するために、成人の場合、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、胃癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、胃癌を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、食道癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、食道癌を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、子宮頸癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、子宮頸癌を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、肝細胞癌（ＨＣＣ）を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＨＣＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）を治療するために、成人の場合、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＭＣＣを治療するために、成人の場合、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＭＣＣを治療するために、小児の場合、３週間毎に約２ｍｇ／ｋｇ（最大２００ｍｇ）で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、腎細胞癌（ＲＣＣ）を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＲＣＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで、１日２回の経口でのアキシチニブ５ｍｇとともに投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、子宮内膜癌を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、子宮内膜癌を治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで、ＭＳＩ－ＨまたはｄＭＭＲではない腫瘍の場合、１日１回の経口でのレンバチニブ２０ｍｇとともに投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、高腫瘍変異負荷（ＴＭＢ－Ｈ）癌を治療するために、成人の場合、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＴＭＢ－Ｈ癌を治療するために、成人の場合、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＴＭＢ－Ｈ癌を治療するために、小児の場合、３週間毎に約２ｍｇ／ｋｇ（最大２００ｍｇ）で投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、皮膚扁平上皮癌（ｃＳＣＣ）を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ｃＳＣＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を治療するために、３週間毎に約２００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブは、ＴＮＢＣを治療するために、６週間毎に約４００ｍｇで投与される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、患者または対象が成人である場合、すなわち、成人適応症の治療、及び６週間毎の４００ｍｇの追加の投薬レジメンが用いられ得る。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、３、４、または５日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブ投与は、ＩＬ－２投与後１、２、または３日で開始される。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、３、４、または５週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。いくつかの実施形態では、ペムブロリズマブはまた、切除前１、２、または３週間で（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）投与することができる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、抗ｍ－ＰＤ－１クローンＪ４３（カタログ番号ＢＥ００３３－２）及びＲＭＰ１－１４（カタログ番号ＢＥ０１４６）（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ ＵＳＡ）などの市販の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体である。いくつかの市販の抗ＰＤ－１抗体が、当業者に知られている。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，３５４，５０９号または米国特許出願公開第２０１０／０２６６６１７Ａ１号、同第２０１３／０１０８６５１Ａ１号、同第２０１３／０１０９８４３Ａ２号に開示されている抗体であり、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，２８７，８５６号、同第８，５８０，２４７号、及び同第８，１６８，７５７号、ならびに米国特許出願公開第２００９／００２８８５７Ａ１号、同第２０１０／０２８５０１３Ａ１号、同第２０１３／００２２６００Ａ１号、及び同第２０１１／０００８３６９Ａ１号に記載されている抗ＰＤ－１抗体であり、それらの教示は参照により本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，７３５，５５３ Ｂ１号に開示されている抗ＰＤ－１抗体であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、ＣＴ－０１１としても知られるピジリズマブであり、これは米国特許第８，６８６，１１９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、米国特許第８，９０７，０５３号、同第９，０９６，６４２号、及び同第９，０４４，４４２号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／００８７５８１号に記載されるものなどの小分子またはペプチドもしくはペプチド誘導体；米国特許出願公開第２０１５／００７３０２４号に記載されるものなどの１，２，４－オキサジアゾール化合物及び誘導体；米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／００７３０４２号に記載されるものなどの環状ペプチド模倣化合物及び誘導体；米国特許出願公開第ＵＳ２０１５／０１２５４９１号に記載されるものなどの環状化合物及び誘導体；国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０３３３０１号に記載されるものなどの１，３，４－オキサジアゾール及び１，３，４－チアジアゾール化合物ならびに誘導体；国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０３６９２７号及びＷＯ２０１５／０４４９０号に記載されるものなどのペプチド系化合物及び誘導体、または米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０２９４８９８号に記載されるものなどの大環状ペプチド系化合物及び誘導体であり得、各々の開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１阻害剤は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．から市販されているセミプリマブである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、当該技術分野で知られている任意のＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２阻害剤、アンタゴニスト、または遮断剤であり得る。特に、次の段落でより詳細に記載されるＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２阻害剤、アンタゴニスト、または遮断剤のうちの１つである。「阻害剤」、「アンタゴニスト」、及び「遮断剤」という用語は、本明細書では、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２阻害剤に関して交換可能に使用される。誤解を避けるために、抗体であるＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤への本明細書での言及は、化合物またはその抗原結合断片、バリアント、複合体、もしくはバイオシミラーを指し得る。誤解を避けるために、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤への本明細書での言及は、化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、水和物、共結晶、もしくはプロドラッグを指し得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物、プロセス、及び方法は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、小分子である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、抗体（すなわち、抗ＰＤ－１抗体）、Ｆａｂ断片を含むその断片、またはその一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２との結合について競合し、及び／またはＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２上のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２との結合について競合し、及び／またはＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２上のエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＰＤ－Ｌ１阻害剤は、化合物が、ＰＤ－Ｌ２受容体を含む他の受容体と結合または相互作用するよりも実質的に低い濃度でＰＤ－Ｌ１と結合または相互作用するという点で、ＰＤ－Ｌ１に対して選択的である。特定の実施形態では、化合物は、ＰＤ－Ｌ２受容体に対するより少なくとも約２倍高い濃度、約３倍高い濃度、約５倍高い濃度、約１０倍高い濃度、約２０倍高い濃度、約３０倍高い濃度、約５０倍高い濃度、約１００倍高い濃度、約２００倍高い濃度、約３００倍高い濃度、または約５００倍高い濃度である結合定数でＰＤ－Ｌ１受容体に結合する。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＰＤ－Ｌ２阻害剤は、化合物が、ＰＤ－Ｌ１受容体を含む他の受容体と結合または相互作用するよりも実質的に低い濃度でＰＤ－Ｌ２と結合または相互作用するという点で、ＰＤ－Ｌ２に対して選択的である。特定の実施形態では、化合物は、ＰＤ－Ｌ１受容体に対するより少なくとも約２倍高い濃度、約３倍高い濃度、約５倍高い濃度、約１０倍高い濃度、約２０倍高い濃度、約３０倍高い濃度、約５０倍高い濃度、約１００倍高い濃度、約２００倍高い濃度、約３００倍高い濃度、または約５００倍高い濃度である結合定数でＰＤ－Ｌ２受容体に結合する。

いかなる理論にも縛られることなく、腫瘍細胞はＰＤ－Ｌ１を発現し、Ｔ細胞はＰＤ－１を発現すると考えられている。しかしながら、腫瘍細胞によるＰＤ－Ｌ１の発現は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１の阻害剤または遮断剤の有効性には必要とされない。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現する。他の実施形態では、腫瘍細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現しない。いくつかの実施形態では、方法は、ＴＩＬと組み合わせて、本明細書に記載されるものなどのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１抗体の組み合わせを含むことができる。ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１抗体とＴＩＬとの組み合わせの投与は、同時または連続的であり得る。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約１００ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約９０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約８０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約７０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約６０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約５０ｐＭ以下のＫＤで結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約４０ｐＭ以下のＫＤで結合する、またはヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約３０ｐＭ以下のＫＤで結合するものである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約７．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約８×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約８．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約９×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約９．５×１０^５１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合する、またはヒトＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２に約１×１０^６１／Ｍ・ｓ以上のｋ_{ａｓｓｏｃ}で結合するものである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ヒトＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２に約２×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．１×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．２×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．３×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．４×１０^－５１／ｓ以下のｋｄｉｓｓｏｃで結合する、ヒトＰＤ－１に約２．５×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－１に約２．６×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、ヒトＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ１に約２．７×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合する、またはヒトＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２に約３×１０^－５１／ｓ以下のｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}で結合するものである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２阻害剤は、約１０ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約９ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約８ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約７ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約６ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約５ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約４ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約３ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、約２ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－１へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断もしくは阻害し、またはヒトＰＤ－１を遮断し、または約１ｎＭ以下のＩＣ５０でのヒトＰＤ－へのヒトＰＤ－Ｌ１もしくはヒトＰＤ－Ｌ２の結合を遮断するものである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＭＥＤＩ４７３６としても知られるデュルバルマブ（これは、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ ｐｌｃ．の子会社であるＭｅｄｉｍｍｕｎｅ，ＬＬＣ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から市販されている）、またはその抗原結合断片、複合体、もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許第８，７７９，１０８号または米国特許出願公開第２０１３／００３４５５９号に開示されている抗体であり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。デュルバルマブの臨床的有効性は、Ｐａｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２０１４，６５，１８５－２０２、Ｂｒａｈｍｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１４，３２，５ｓ（補足、要約８０２１）、及びＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｖ．，２０１４，４０，１０５６－６４に記載されている。デュルバルマブの調製及び特性は、米国特許第８，７７９，１０８号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。デュルバルマブのアミノ酸配列を表２０に示す。デュルバルマブモノクローナル抗体は、２２－９６、２２”－９６”、２３’－８９’、２３’’’－８９’’’、１３５’－１９５’、１３５’’’－１９５’’’、１４８－２０４、１４８”－２０４”、２１５’－２２４、２１５’’’－２２４’’’、２３０－２３０”、２３３－２３３”、２６５－３２５、２６５”－３２５”、３７１－４２９、及び３７１”－４２９’におけるジスルフィド結合、ならびにＡｓｎ－３０１及びＡｓｎ－３０１”におけるＮ－グリコシル化部位を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、配列番号１７８によって与えられる重鎖及び配列番号１７９によって与えられる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１７８及び配列番号１７９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、デュルバルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号１８０に示される配列を含み、ＰＤ－Ｌ１阻害剤軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号１８１に示される配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８０及び配列番号１８１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８０及び配列番号１８１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８０及び配列番号１８１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８０及び配列番号１８１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８０及び配列番号１８１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号１８２、配列番号１８３、及び配列番号１８４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１８５、配列番号１８６、及び配列番号１８７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、及び／またはＰＤ－Ｌ１上の同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、デュルバルマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－Ｌ１バイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、デュルバルマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、デュルバルマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されている場合がある。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、デュルバルマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、デュルバルマブである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ／ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏから市販されている）としても知られるアベルマブ、またはその抗原結合断片、複合体、もしくはバリアントである。アベルマブの調製及び特性は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３４１９１７Ａ１号に記載されており、その開示は参照により本明細書に具体的に組み込まれる。アベルマブのアミノ酸配列を表２１に示す。アベルマブは、２２～９６、１４７～２０３、２６４～３２４、３７０～４２８、２２”～９６”、１４７”～２０３”、２６４”～３２４”、及び３７０”～４２８”における重鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３～Ｃ１０４）、２２’～９０’、１３８’～１９７’、２２’’’～９０’’’、ａｎｄ １３８’’’～１９７’’’における軽鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３～Ｃ１０４）、２２３～２１５’及び２２３”～２１５”における重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合（ｈ５～ＣＬ１２６）、２２９～２２９”及び２３２～２３２”における重鎖－重鎖間ジスルフィド結合（ｈ１１、ｈ１４）、３００、３００”におけるＮ－グリコシル化部位（Ｈ ＣＨ２ Ｎ８４．４）、フコシル化複合体二分性ＣＨＯ型グリカン、及び４５０及び４５０’におけるＨ ＣＨＳ Ｋ２ Ｃ末端リジンクリッピングを有する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、配列番号１８８によって与えられる重鎖及び配列番号１８９によって与えられる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１８８及び配列番号１８９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アベルマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号１９０に示される配列を含み、ＰＤ－Ｌ１阻害剤軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号１９１に示される配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９０及び配列番号１９１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９０及び配列番号１９１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９０及び配列番号１９１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９０及び配列番号１９１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９０及び配列番号１９１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号１９２、配列番号１９３、及び配列番号１９４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号１９５、配列番号１９６、及び配列番号１９７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、及び／またはＰＤ－Ｌ１上の同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アベルマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－Ｌ１バイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品は、アベルマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、アベルマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されている場合がある。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、アベルマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、アベルマブである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＭＰＤＬ３２８０ＡまたはＲＧ７４４６としても知られるアテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＡＧ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の子会社であるＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．からＴＥＣＥＮＴＲＩＱとして市販されている）、またはその抗原結合断片、複合体、もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許第８，２１７，１４９号に開示されている抗体であり、その開示は参照により本明細書に具体的に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６Ａ１号、同第２０１３／００４５２００Ａ１号、同第２０１３／００４５２０１Ａ１号、同第２０１３／００４５２０２Ａ１号、または同第２０１４／００６５１３５Ａ１号に開示されている抗体であり、その開示は参照により本明細書に具体的に組み込まれる。アテゾリズマブの調製及び特性は、米国特許第８，２１７，１４９号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。アテゾリズマブのアミノ酸配列を表２２に示す。アテゾリズマブは、２２～９６、１４５～２０１、２６２～３２２、３６８～４２６、２２”～９６”、１４５”～２０１”、２６２”～３２２”、及び３６８”～４２６”に重鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３～Ｃ１０４）、２３’～８８’、１３４’～１９４’、２３’’’～８８’’’、及び１３４’’’～１９４’’’に軽鎖内ジスルフィド結合（Ｃ２３～Ｃ１０４）、２２１～２１４’及び２２１”～２１４’’’に重鎖－軽鎖間ジスルフィド結合（ｈ５～ＣＬ１２６）、２２７～２２７”及び２３０～２３０”に重鎖－重鎖間ジスルフィド結合（ｈ１１、ｈ１４）、及び２９８及び２９８’にＮ－グリコシル化部位（Ｈ ＣＨ２ Ｎ８４．４＞Ａ）を有する。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、配列番号１９８によって与えられる重鎖及び配列番号１９９によって与えられる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号１９８及び配列番号１９９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号２００に示される配列を含み、ＰＤ－Ｌ１阻害剤軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号２０１に示される配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２００及び配列番号２０１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２００及び配列番号２０１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２００及び配列番号２０１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２００及び配列番号２０１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２００及び配列番号２０１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、それぞれ、配列番号２０２、配列番号２０３、及び配列番号２０４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号２０５、配列番号２０６、及び配列番号２０７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、及び／またはＰＤ－Ｌ１上の同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＰＤ－Ｌ１バイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品はアテゾリズマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、アテゾリズマブである。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可されている場合がある。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、アテゾリズマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、アテゾリズマブである。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３４１９１７Ａ１号に記載されている抗体を含み、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１への結合についてこれらの抗体のうちのいずれかと競合する抗体も含まれる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＢＭＳ－９３５５５９としても知られるＭＤＸ－１１０５であり、これは米国特許第７，９４３，７４３号に開示されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９４３，７４３号に開示されている抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択される。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＩＮＶＩＶＯＭＡＢ抗ｍ－ＰＤ－Ｌ１クローン１０Ｆ．９Ｇ２（カタログ番号ＢＥ０１０１、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ，ＵＳＡ）などの市販のモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ ＥＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ（ＭＩＨ１）などの市販のモノクローナル抗体である。いくつかの市販の抗ＰＤ－Ｌ１抗体が、当業者に知られている。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ２阻害剤は、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ ２４Ｆ．１０Ｃ１２マウスＩｇＧ２ａ、カッパアイソタイプ（カタログ番号３２９６０２ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＩＧＭＡ抗ＰＤ－Ｌ２抗体（カタログ番号ＳＡＢ３５００３９５，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、または当業者に知られている他の市販のＰＤ－Ｌ２抗体などの市販のモノクローナル抗体である。

ＣＴＬＡ－４阻害剤との併用
いくつかの実施形態では、がんを有する患者に提供されるＴＩＬ療法は、ＴＩＬ単独の治療集団による治療を含んでもよく、またはＴＩＬ及び１つ以上のＣＴＬＡ－４阻害剤を含む併用治療を含んでもよい。

細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、ヘルパーＴ細胞の表面で発現する。ＣＴＬＡ－４は、ＣＤ２８依存性Ｔ細胞活性化の負の制御因子であり、適応免疫応答のチェックポイントとして機能する。Ｔ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８と同様に、ＣＴＬＡ－４結合抗原は、細胞上でＣＤ８０及びＣＤ８６を提示する。ＣＴＬＡ－４は抑制シグナルをＴ細胞に伝達し、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。ヒトＣＴＬＡ－４に対するヒト抗体は、ウイルス感染及び細菌感染を治療または予防すること、ならびにがんを治療するためのものなど、多くの疾患状態における免疫刺激調節因子として記載されている（ＷＯ０１／１４４２４及びＷＯ００／３７５０４）。イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）及びトレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６）を含むが、これらに限定されない、様々な種類の固形腫瘍の治療のためのいくつかの完全ヒト抗ヒトＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、臨床試験で研究されている。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、当技術分野で知られている任意のＣＴＬＡ－４阻害剤またはＣＴＬＡ－４遮断剤であり得る。特に、次の段落でより詳細に記載されるＣＴＬＡ－４阻害剤または遮断剤のうちの１つである。「阻害剤」、「アンタゴニスト」、及び「遮断剤」という用語は、本明細書では、ＣＴＬＡ－４阻害剤に関して互換的に使用される。誤解を避けるために、抗体であるＣＴＬＡ－４阻害剤への本明細書での言及は、化合物またはその抗原結合断片、バリアント、複合体、もしくはバイオシミラーを指し得る。誤解を避けるために、ＣＴＬＡ－４阻害剤への本明細書での言及はまた、小分子化合物またはその薬学的に許容される塩、エステル、溶媒和物、水和物、共結晶、もしくはプロドラッグを指し得る。

本発明の方法で使用するための好適なＣＴＬＡ－４阻害剤には、抗ＣＴＬＡ－４抗体、ヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体、マウス抗ＣＴＬＡ－４抗体、哺乳動物抗ＣＴＬＡ－４抗体、ヒト化抗ＣＴＬＡ－４抗体、モノクローナル抗ＣＴＬＡ－４抗体、ポリクローナル抗ＣＴＬＡ－４抗体、キメラ抗ＣＴＬＡ－４抗体、ＭＤＸ－０１０（イピリムマブ）、トレメリムマブ、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ－４アドネクチン、抗ＣＴＬＡ－４ドメイン抗体、一本鎖抗ＣＴＬＡ－４断片、重鎖抗ＣＴＬＡ－４断片、軽鎖抗ＣＴＬＡ－４断片、共刺激経路を刺激するＣＴＬＡ－４の阻害剤、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／０１４４２４号に開示される抗体、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０３５６０７号に開示される抗体、米国特許出願公開第２００５／０２０１９９４号に開示される抗体、ならびに付与された欧州特許第ＥＰ １２１２４２２ Ｂ１号に開示された抗体が含まれるが、これらに限定されず、各々の開示が参照により本明細書に組み込まれる。さらなるＣＴＬＡ－４抗体は、米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第６，０５１，２２７号、及び同第６，９８４，７２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号及び同第ＷＯ００／３７５０４号、ならびに米国公開第２００２／００３９５８１号及び同第２００２／０８６０１４号に記載されており、各々の開示が参照により本明細書に組み込まれる。本発明の方法で使用することができる他の抗ＣＴＬＡ－４抗体には、例えば、ＷＯ９８／４２７５２、米国特許第６，６８２，７３６号及び同第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（１７）：１００６７－１００７１（１９９８）、Ｃａｍａｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（２００４）（抗体ＣＰ－６７５２０６）、Ｍｏｋｙｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５８：５３０１－５３０４（１９９８）、ならびに米国特許第５，９７７，３１８号、同第６，６８２，７３６号、同第７，１０９，００３号、及び同第７，１３２，２８１号に開示されるものが含まれ、これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

さらなるＣＴＬＡ－４阻害剤には、ＣＤ２８抗原がその同族リガンドと結合する能力を妨害すること、ＣＴＬＡ－４がその同族リガンドと結合する能力を阻害すること、共刺激経路を介してＴ細胞応答を増強すること、Ｂ７がＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ－４と結合する能力を破壊すること、Ｂ７が共刺激経路を活性化する能力を破壊すること、ＣＤ８０がＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ－４と結合する能力を破壊すること、ＣＤ８０が共刺激経路を活性化する能力を破壊すること、ＣＤ８６がＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ－４と結合する能力を破壊すること、ＣＤ８６が共刺激経路を活性化する能力を破壊すること、及び共刺激経路を一般に活性化されることから破壊することが可能である任意の阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。これには、共刺激経路の他のメンバーのなかでもＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４の小分子阻害剤、共刺激経路の他のメンバーのなかでもＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４に対する抗体、共刺激経路の他のメンバーのなかでもＣ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４に指向するアンチセンス分子、共刺激経路の他のメンバーのなかでもＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４に指向するアドネクチン、他のＣＴＬＡ－４阻害剤のなかでも共刺激経路の他のメンバーのなかでもＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ－４のＲＮＡｉ阻害剤（一本鎖及び二本鎖の両方）が必ず含まれる。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、約１０^－６Ｍ以下、１０^－７Ｍ以下、１０^－８Ｍ以下、１０^－９Ｍ以下、１０^－１０Ｍ以下、１０^－１１Ｍ以下、１０^－１２Ｍ以下、例えば、１０^－１３Ｍ～１０^－１６Ｍ、またはエンドポイントとして前述の値のうちの任意の２つを有する任意の範囲内のＫ_ｄでＣＴＬＡ－４に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、同じアッセイを使用して比較した場合、イピリムマブのＫｄの１０倍以下のＫｄでＣＴＬＡ－４と結合する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、同じアッセイを使用して比較した場合、イピリムマブとほぼ同じかまたはそれ以下（例えば、最大１０倍低いか、または最大１００倍低い）のＫｄでＣＴＬＡ－４と結合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４結合のＣＴＬＡ－４阻害剤による阻害のＩＣ５０値は、同じアッセイを使用して比較した場合、それぞれＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４結合のイピリムマブ媒介阻害より１０倍以下で大きい。いくつかの実施形態では、ＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４結合のＣＴＬＡ－４阻害剤による阻害のＩＣ５０値は、同じアッセイを使用して比較した場合、それぞれＣＤ８０またはＣＤ８６とのＣＴＬＡ－４結合のイピリムマブ媒介性阻害とほぼ同じかまたはそれ以下（例えば、最大１０倍低い、または最大１００倍低い）である。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、好適な対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％、例えば、５０％～７５％、７５％～９０％、または９０％～１００％の間でＣＴＬＡ－４の発現を阻害する、及び／または生物学的活性を減少させるのに十分な量で使用される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４経路阻害剤は、好適な対照と比較して、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％、例えば、５０％～７５％、７５％～９０％、または９０％～１００％の間でＣＴＬＡ－４のＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方との結合を減少させることにより、ＣＴＬＡ－４の生物学的活性を減少させるのに十分な量で使用される。対象となる薬剤の効果を評価または定量化する状況下における好適な対照は、典型的には、対象となる薬剤、例えば、ＣＴＬＡ－４経路阻害剤に曝露されていないか、または治療されていない（または僅かな量に曝露されているか、または治療されている）同等の生物学的システム（例えば、細胞または対象）である。いくつかの実施形態では、生物学的システムは、それ自体の対照として機能し得る（例えば、生物学的システムは、薬剤への曝露または治療の前に評価され得、曝露または治療が開始または終了した後の状態と比較され得る。いくつかの実施形態では、歴史的対照が使用され得る。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏ．からＹｅｒｖｏｙとして市販されている）、またはそのバイオシミラー、抗原結合断片、複合体、もしくはバリアントである。当該技術分野で知られているように、イピリムマブは、機能的ヒトレパートリーを生成するための重鎖及び軽鎖をコードするヒト遺伝子を有するトランスジェニックマウスに由来する完全ヒトＩｇＧ １κ抗体である、抗ＣＴＬＡ－４抗体を指す。イピリムマブは、そのＣＡＳ登録番号４７７２０２－００－９及びＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号で参照することもでき、その全体がすべての目的で参照により本明細書に組み込まれる。それは抗体１０ＤＩとして開示されている。具体的には、イピリムマブは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域（配列番号２１１を含む軽鎖可変領域を有し、配列番号２１０を含む重鎖可変領域を有する）を含む。イピリムマブの薬学的組成物は、イピリムマブ及び１つ以上の希釈剤、ビヒクル及び／または賦形剤を含有するすべての薬学的に許容される組成物を含む。イピリムマブを含有する薬学的組成物の例は、国際特許出願公開第ＷＯ２００７／６７９５９号に記載されている。イピリムマブは、静脈内（ＩＶ）投与され得る。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、配列番号２０８によって与えられる重鎖及び配列番号２０９によって与えられる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２０８及び配列番号２０９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖のＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号２１０に示される配列を含み、ＣＴＬＡ－４阻害剤軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号２１１に示される配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１０及び配列番号２１１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１０及び配列番号２１１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１０及び配列番号２１１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１０及び配列番号２１１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１０及び配列番号２１１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２１２、配列番号２１３、及び配列番号２１４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号２１５、配列番号２１６、及び配列番号２１７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、及び／またはＣＴＬＡ－４上の同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブに関して薬物規制当局によって承認されたＣＴＬＡ－４バイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＣＴＬＡ－４抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品はイピリムマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。イピリムマブのアミノ酸配列を表２３に示す。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＣＴＬＡ－４抗体であり、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、イピリムマブである。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、イピリムマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、イピリムマブである。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはそのバイオシミラーであり、イピリムマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはそのバイオシミラーであり、イピリムマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはそのバイオシミラーであり、イピリムマブは、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはそのバイオシミラーであり、イピリムマブは、約２００ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４８０ｍｇ、または約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、イピリムマブまたはそのバイオシミラーであり、イピリムマブは、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、または６週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、イピリムマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、切除不能または転移性黒色腫を治療するために、３週間毎に約 ｍｇ／ｋｇで最大４用量投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、イピリムマブは、黒色腫のアジュバント治療のために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、黒色腫のアジュバント治療のために、３週間毎に約１０ｍｇ／ｋｇで４回投与され、その後１２週間毎に１０ｍｇ／ｋｇで最大３年間投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、イピリムマブは、進行性腎細胞癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、進行性腎細胞癌を治療するために、約１ｍｇ／ｋｇで投与され、すぐ後に続いて同じ日にニボルマブ３ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４回投与される。いくつかの実施形態では、４用量の組み合わせを完了した後、ニボルマブは、進行性腎細胞癌及び／または腎細胞癌の標準的な投薬レジメンに従って単剤として投与され得る。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、イピリムマブは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌を治療するために、３０分間にわたって約１ｍｇ／ｋｇを静脈内投与され、すぐ後に続いて同じ日に３０分間にわたってニボルマブ約３ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４回投与される。いくつかの実施形態では、４用量の組み合わせを完了した後、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復機能欠損（ｄＭＭＲ）転移性結腸直腸癌の標準的な投薬レジメンに従って推奨されるように、ニボルマブを単剤として投与する。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、イピリムマブは、肝細胞癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、肝細胞癌を治療するために、３０分間にわたって約３ｍｇ／ｋｇを静脈内投与され、すぐ後に続いて同じ日に３０分間にわたってニボルマブ約１ｍｇ／ｋｇを３週間毎に４回投与される。いくつかの実施形態では、４用量の組み合わせを完了した後、肝細胞癌の標準的な投薬レジメンに従って、ニボルマブを単剤として投与する。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、イピリムマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために、６週間毎に約１ｍｇ／ｋｇで、２週間毎に３ｍｇ／ｋｇのニボルマブとともに投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、転移性非小細胞肺癌を治療するために、６週間毎に約１ｍｇ／ｋｇで、３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブ及び２サイクルのプラチナダブレット化学療法とともに投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、イピリムマブは、悪性胸膜中皮腫を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブは、悪性胸膜中皮腫を治療するために、６週間毎に約１ｍｇ／ｋｇで、３週間毎に３６０ｍｇのニボルマブとともに投与される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、イピリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

トレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６としても知られる）は、完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であり、ＣＡＳ番号７４５０１３－５９－６を有する。トレメリムマブは、米国特許第６，６８２，７３６号（参照により本明細書に組み込まれる）において抗体１１．２．１として開示されている。トレメリムマブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を、それぞれ表２１８及び２１９に示す。トレメリムマブは、黒色腫及び乳癌を含む種々の腫瘍の治療のための臨床試験において研究されており、トレメリムマブは、０．０１及び１５ｍｇ／ｋｇの用量範囲で４週間または１２週間毎に単回用量または複数回用量として静脈内投与される。本発明によって提供されるレジメンでは、トレメリムマブは、局所的に、特に皮内または皮下に投与される。皮内または皮下投与されるトレメリムマブの有効量は、典型的には、人当たり５～２００ｍｇ／用量の範囲である。いくつかの実施形態では、トレメリムマブの有効量は、用量当たり人当たり１０～１５０ｍｇ／用量の範囲である。いくつかの特定の実施形態では、トレメリムマブの有効量は、人当たり約１０、２５、３７．５、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｍｇ／用量である。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、配列番号２１８によって与えられる重鎖及び配列番号２１９によって与えられる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２１８及び配列番号２１９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブの重鎖及び軽鎖のＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号２２０に示される配列を含み、ＣＴＬＡ－４阻害剤軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号２２１に示される配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２０及び配列番号２２１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２０及び配列番号２２１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２０及び配列番号２２１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２０及び配列番号２２１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２０及び配列番号２２１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２２２、配列番号２２３、及び配列番号２２４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号２２５、配列番号２２６、及び配列番号２２７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、及び／またはＣＴＬＡ－４上の同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブに関して薬物規制当局によって承認された抗ＣＴＬＡ－４バイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＣＴＬＡ－４抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品はトレメリムマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。トレメリムマブのアミノ酸配列を表２４に示す。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＣＴＬＡ－４抗体であり、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、トレメリムマブである。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、トレメリムマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、トレメリムマブである。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブまたはそのバイオシミラーであり、トレメリムマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブまたはそのバイオシミラーであり、トレメリムマブは、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約３．５ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約４．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約５．５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約６．５ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約７．５ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約８．５ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約９．５ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブまたはそのバイオシミラーであり、トレメリムマブは、約２００ｍｇ～約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブまたはそのバイオシミラーであり、トレメリムマブは、約２００ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４８０ｍｇ、または約５００ｍｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、トレメリムマブまたはそのバイオシミラーであり、トレメリムマブは、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、または６週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、３、４、または５週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。いくつかの実施形態では、トレメリムマブ投与は、切除前１、２、または３週間に（すなわち、対象または患者から腫瘍試料を取得する前に）開始される。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、Ａｇｅｎｕｓからのザリフレリマブ、またはそのバイオシミラー、抗原結合断片、複合体、もしくはバリアントである。ザリフレリマブは、完全ヒトモノクローナル抗体である。ザリフレリマブには、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）登録番号２１４８３２１－６９－９が割り当てられており、ＡＧＥＮ１８８４としても知られている。ザリフレリマブの調製及び特性は、米国特許第１０，１４４，７７９号及び米国特許出願公開第ＵＳ２０２０／００２４３５０ Ａ１号に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、配列番号２２８によって与えられる重鎖及び配列番号２２９によって与えられる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列を有する重鎖及び軽鎖、またはそれらの抗原結合断片、Ｆａｂ断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、バリアント、もしくは複合体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列と少なくとも９９％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列と少なくとも９８％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列と少なくとも９７％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列と少なくとも９６％同一である重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２２８及び配列番号２２９に示される配列と少なくとも９５％同一である重鎖及び軽鎖を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ザリフレリマブの重鎖及び軽鎖のＣＤＲまたは可変領域（ＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号２３０に示される配列を含み、ＣＴＬＡ－４阻害剤軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号２３１に示される配列、またはその保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２３０及び配列番号２３１に示される配列と少なくとも９９％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２３０及び配列番号２３１に示される配列と少なくとも９８％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２３０及び配列番号２３１に示される配列と少なくとも９７％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２３０及び配列番号２３１に示される配列と少なくとも９６％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、各々が、それぞれ、配列番号２３０及び配列番号２３１に示される配列と少なくとも９５％同一であるＶ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域を含む。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、それぞれ、配列番号２３１、配列番号２３３、及び配列番号２３４に示される配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、それぞれ、配列番号２３５、配列番号２３６、及び配列番号２３７に示される配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン、またはそれらの保存的アミノ酸置換と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、前述の抗体のうちのいずれかと結合するために競合し、及び／またはＣＴＬＡ－４上の同じエピトープに結合する。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ザリフレリマブに関して薬物規制当局によって承認されたＣＴＬＡ－４バイオシミラーモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、参照医薬品または参照バイオ製品のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の配列同一性、例えば、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照医薬品または参照バイオ製品と比較して、１つ以上の翻訳後修飾を含む、ＣＴＬＡ－４抗体を含み、参照医薬品または参照バイオ製品はザリフレリマブである。いくつかの実施形態では、１つ以上の翻訳後修飾は、グリコシル化、酸化、脱アミド化、及び切断のうちの１つ以上から選択される。ザリフレリマブのアミノ酸配列を表２５に示す。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、認可された、または認可のために提出された抗ＣＴＬＡ－４抗体であり、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、参照医薬品または参照バイオ製品の製剤とは異なる製剤で提供され、参照医薬品または参照バイオ製品は、ザリフレリマブである。抗ＣＴＬＡ－４抗体は、米国ＦＤＡ及び／または欧州連合のＥＭＡなどの薬物規制当局によって認可され得る。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ザリフレリマブである。いくつかの実施形態では、バイオシミラーは、１つ以上の賦形剤をさらに含む組成物として提供され、１つ以上の賦形剤は、参照医薬品または参照バイオ製品に含まれる賦形剤と同じまたは異なるものであり、参照医薬品または参照バイオ製品は、ザリフレリマブである。

さらなる抗ＣＴＬＡ－４抗体の例には、ＡＧＥＮ１１８１、ＢＭＳ－９８６２１８、ＢＣＤ－１４５、ＯＮＣ－３９２、ＣＳ１００２、ＲＥＧＮ４６５９、及びＡＤＧ１１６が含まれるが、これらに限定されず、これらは当業者に即知である。

いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、以下の特許公開のうちのいずれかに開示される抗ＣＴＬＡ－４抗体である：ＵＳ２０１９／００４８０９６Ａ１、ＵＳ２０２０／０２２３９０７、ＵＳ２０１９／０２０１３３４、ＵＳ２０１９／０２０１３３４、ＵＳ２００５／０２０１９９４、ＥＰ１２１２４２２Ｂ１、ＷＯ２０１８／２０４７６０、ＷＯ２０１８／２０４７６０、ＷＯ２００１／０１４４２４、ＷＯ２００４／０３５６０７、ＷＯ２００３／０８６４５９、ＷＯ２０１２／１２０１２５、ＷＯ２０００／０３７５０４、ＷＯ２００９／１００１４０、ＷＯ２００６／０９６４９、ＷＯ２００５０９２３８０、ＷＯ２００７／１２３７３７、ＷＯ２００６／０２９２１９、ＷＯ２０１０／０９７９５９７、ＷＯ２００６／１２１６８、ａｎｄＷＯ１９９７０２０５７４（これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる）。さらなるＣＴＬＡ－４抗体は、米国特許第５，８１１，０９７号、同第５，８５５，８８７号、同第６，０５１，２２７号、及び同第６，９８４，７２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号及び同第ＷＯ００／３７５０４号、ならびに米国公開第２００２／００３９５８１号及び同第２００２／０８６０１４号、及び／または米国特許第５，９７７，３１８号、同第６，６８２，７３６号、同第７，１０９，００３号、及び同第７，１３２，２８１号に記載されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、例えば、ＷＯ９８／４２７５２、米国特許第６，６８２，７３６号及び同第６，２０７，１５６号、Ｈｕｒｗｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１００６７－１００７１（１９９８）、Ｃａｍａｃｈｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００４，２２，１４５（Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２５０５（２００４）（抗体ＣＰ－６７５２０６）、またはＭｏｋｙｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９９８，５８，５３０１－５３０４（１９９８）に開示されているものであり、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ＷＯ１９９６／０４０９１５（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＣＴＬＡ－４リガンドである。

いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、ＣＴＬＡ－４発現の核酸阻害剤である。例えば、抗ＣＴＬＡ－４ ＲＮＡｉ分子は、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９／０３２６１９号及び同第ＷＯ２００１／０２９０５８号、米国公開第２００３／００５１２６３号、同第２００３／００５５０２０号、同第２００３／００５６２３５号、同第２００４／２６５８３９号、同第２００５／０１００９１３号、同第２００６／００２４７９８号、同第２００８／００５０３４２号、同第２００８／００８１３７３号、同第２００８／０２４８５７６号、及び同第２００８／０５５４４３号、及び／または米国特許第６，５０６，５５９号、同第７，２８２，５６４号、同第７，５３８，０９５号、及び同第７，５６０，４３８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される分子の形態を取り得る。いくつかの事例では、抗ＣＴＬＡ－４ ＲＮＡｉ分子は、欧州特許第ＥＰ１３０９７２６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される二本鎖ＲＮＡｉ分子の形態を取る。いくつかの事例では、抗ＣＴＬＡ－４ ＲＮＡｉ分子は、米国特許第７，０５６，７０４号及び同第７，０７８，１９６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される二本鎖ＲＮＡｉ分子の形態を取る。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４阻害剤は、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０８１０２１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるアプタマーである。

他の実施形態では、本発明の抗ＣＴＬＡ－４ ＲＮＡｉ分子は、米国特許第５，８９８，０３１号、同第６，１０７，０９４号、同第７，４３２，２４９号、及び同第７，４３２，２５０号、ならびに欧州出願第ＥＰ０９２８２９０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＲＮＡ分子である。

患者のリンパ球枯渇プレコンディショニング
いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、患者は、本開示によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前治療される。いくつかの実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的化学療法で前治療された患者のがんの治療に使用するためのＴＩＬ集団を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ集団は、注入による投与用である。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ^２／日で５日間（ＴＩＬ注入の２７日前～２３日前）である。いくつかの実施形態では、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的許容範囲まで８時間毎に７２０，０００ＩＵ／ｋｇで静脈内的にＩＬ－２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮとして市販されている、アルデスロイキン）の静脈内注入を受ける。特定の実施形態では、ＴＩＬ集団は、ＩＬ－２と組み合わせてがんを治療する際に使用するためのものであり、ＩＬ－２は、ＴＩＬ集団の後に投与される。

実験的発見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、制御性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって治療有効性を増強する上で重要な役割を果たすことを示す。したがって、本発明のいくつかの実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に、患者に対してリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制コンディショニング」と称されることもある）を利用する。

一般に、リンパ球枯渇は、フルダラビンまたはシクロホスファミド（マホスファミドと称される活性形態）及びそれらの組み合わせの投与を使用して達成される。かかる方法は、Ｇａｓｓｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１１，６０，７５－８５、Ｍｕｒａｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｏｎｃｏｌ．，２００６，３，６６８－６８１、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００８，２６，５２３３－５２３９、及びＤｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００５，２３，２３４６－２３５７に記載されており、これらはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのフルダラビン濃度で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、１μｇ／ｍＬのフルダラビン濃度で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以上投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、または４５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間投与される。いくつかの実施形態では、フルダラビン治療は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４～５日間投与される。

いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの活性形態であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により、０．５μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの濃度で取得される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドの活性形態であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により、１μｇ／ｍＬの濃度で取得される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以上投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ^２／日、１５０ｍｇ／ｍ^２／日、１７５ｍｇ／ｍ^２／日、２００ｍｇ／ｍ^２／日、２２５ｍｇ／ｍ^２／日、２５０ｍｇ／ｍ^２／日、２７５ｍｇ／ｍ^２／日、または３００ｍｇ／ｍ^２／日の投与量で投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、静脈内（すなわち、ｉ．ｖ．）投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２～７日間投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、２５０ｍｇ／ｍ^２／日で４～５日間ｉ．ｖ．投与される。いくつかの実施形態では、シクロホスファミド治療は、２５０ｍｇ／ｍ^２／日で４日間ｉ．ｖ．投与される。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、患者にフルダラビンとシクロホスファミドを一緒に投与することによって行われる。いくつかの実施形態では、フルダラビンは、２５ｍｇ／ｍ^２／日でｉ．ｖ．投与され、シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ^２／日で４日間にわたってｉ．ｖ投与される。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間投与することによって行われる。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを約５０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを約５０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを約４０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約２０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを約４０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、フルダラビンを約１５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間投与することによって行われ、シクロホスファミド及びフルダラビンは、両方とも最初の２日間に投与され、リンパ球枯渇は合計５日間で行われる。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇が、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で３日間投与することによって行われる。

いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、メスナとともに投与される。いくつかの実施形態では、メスナは、１５ｍｇ／ｋｇで投与される。メスナが注入されるいくつかの実施形態では、連続的に注入される場合、メスナは、約２時間にわたってシクロホスファミドを注入することができ（－５日目及び／または－４日目）、次いで、各シクロホスファミド用量と同時に開始する２４時間にわたって残りの２２時間で３ｍｇ／ｋｇ／時間の速度で注入することができる。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、第３のＴＩＬ集団を患者に投与した翌日から開始するＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含む。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、第３のＴＩＬ集団を患者に投与したのと同じ日に開始するＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含む。

いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇は、５日間のプレコンディショニング治療を含む。いくつかの実施形態では、該日は、－５日から－１日、または０日から４日として示される。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）にシクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）に静脈内シクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－４日目（すなわち、０日目及び１日目）に６０ｍｇ／ｋｇの静脈内シクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、シクロホスファミドは、メスナとともに投与される。いくつかの実施形態では、レジメンは、フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、２５ｍｇ／ｍ^２の静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－１日目（すなわち、０～４日目）に２５ｍｇ／ｍ^２の静脈内フルダラビンをさらに含む。いくつかの実施形態では、レジメンは、－５日目及び－１日目（すなわち、０～４日目）に２５ｍｇ／ｍ^２の静脈内フルダラビンをさらに含む。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で３日間投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で３日間投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で１日間投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で３日間投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドを６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で、フルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間投与し、続いてフルダラビンを２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で３日間投与するステップを含む。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表２６に従って投与される。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表２７に従って投与される。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表２８に従って投与される。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表２９に従って投与される。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表３０に従って投与される。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表３１に従って投与される。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表３２に従って投与される。

いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンは、表３３に従って投与される。

いくつかの実施形態では、骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンの前述の実施形態で使用されるＴＩＬ注入は、本明細書に記載の任意のＴＩＬ組成物であり得、また本明細書に記載されるようなＩＬ－２レジメンの追加及び併用療法（ＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤など）の投与であり得る。

ＩＬ－２レジメン
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、高用量ＩＬ－２レジメンを含み、高用量ＩＬ－２レジメンは、治療的ＴＩＬ集団の治療有効分量を投与した翌日から静脈内投与されるアルデスロイキンまたはそのバイオシミラーもしくはバリアントを含み、アルデスロイキンまたはそのバイオシミラーもしくはバリアントは、許容範囲まで８時間毎に最大１４用量にわたって、０．０３７ｍｇ／ｋｇまたは０．０４４ｍｇ／ｋｇ ＩＵ／ｋｇ（患者の体重）の用量で１５分のボーラス静脈内注入を使用して投与される。９日間の休止後、このスケジュールは、さらに１４用量、合計最大２８用量にわたって繰り返され得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、１、２、３、４、５、または６用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、最大６用量の最大投与量で投与される。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、デクレッシェンドＩＬ－２レジメンを含む。デクレッシェンドＩＬ－２レジメンは、Ｏ’Ｄａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９９９，１７，２７５２－６１、及びＥｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ２０００，８８，１７０３－９に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、デクレッシェンドＩＬ－２レジメンは、６時間にわたって静脈内投与される１８×１０^６ＩＵ／ｍ^２アルデスロイキン、またはそのバイオシミラーもしくはバリアント、続いて１２時間にわたって静脈内投与される１８×１０^６ＩＵ／ｍ^２、続いて２４時間にわたって静脈内投与される１８×１０^６ＩＵ／ｍ^２、続いて７２時間かけて静脈内投与される４．５×１０^６ＩＵ／ｍ^２を含む。この治療サイクルは、２８日毎に最大４サイクル繰り返され得る。いくつかの実施形態では、デクレッシェンドＩＬ－２レジメンは、１日目の１８，０００，０００ＩＵ／ｍ^２、２日目の９，０００，０００ＩＵ／ｍ^２、３日目及び４日目の４，５００，０００ＩＵ／ｍ^２を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、低用量ＩＬ－２レジメンを含む。Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ－Ｖｉｌｌａｒ ａｎｄ Ｈａｆｌｅｒ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０００，１９，６６５－６７３、Ｈａｒｔｅｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１３，１，２９５－３０５、及びＲｏｓｅｎｚｗａｉｇ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．２０１９，７８，２０９－２１７（それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている低用量ＩＬ－２レジメンを含む、当該技術分野で知られている任意の低用量ＩＬ－２レジメンを使用することができる。いくつかの実施形態では、低用量ＩＬ－２レジメンは、１ｍ^２当たり１８×１０^６ＩＵのアルデスロイキン、またはそのバイオシミラーもしくはバリアントを２４時間当たり５日間の連続的注入として、その後ＩＬ－２療法なしで２～６日間、その後任意選択でアルデスロイキンまたはそのバイオシミラーもしくはバリアントを静脈内にさらに５日間、２４時間当たり１ｍ^２当たり１８×１０^６ＩＵの連続的注入として、その後任意選択でＩＬ－２療法なしで３週間投与することを含み、その後追加のサイクルが投与され得る。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、最大６用量の最大投与量で投与される。いくつかの実施形態では、高用量ＩＬ－２レジメンは、小児の使用に適合される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に６００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に５００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に４００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に５００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に３００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に２００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。いくつかの実施形態では、最大６用量まで、８～１２時間毎に１００，０００国際単位（ＩＵ）／ｋｇのアルデスロイキンの用量が使用される。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４、または２１日毎にペグ化ＩＬ－２を投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４、または２１日毎に、ベンペガルデスロイキン、またはその断片、バリアント、もしくはバイオシミラーを投与することを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４、または２１日毎に、ＴＨＯＲ－７０７、またはその断片、バリアント、もしくはバイオシミラーを投与することを含む。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、ＴＩＬの投与後に、ネムバロイキンアルファ、またはその断片、バリアント、もしくはバイオシミラーの投与を含む。特定の実施形態では、患者にネムバロイキンを１日、２日、４日、６日、７日、１４日または２１日毎に、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で投与される。

いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、抗体骨格に移植されたＩＬ－２断片の投与を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、ＩＬ－２低親和性受容体と結合する抗体－サイトカイン移植タンパク質の投与を含む。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）と、Ｖ_ＨまたはＶ_ＬのＣＤＲに移植されたＩＬ－２分子またはその断片と、を含み、抗体サイトカイン移植タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させる。いくつかの実施形態では、抗体サイトカイン移植タンパク質は、相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）と、Ｖ_ＨまたはＶ_ＬのＣＤＲに移植されたＩＬ－２分子またはその断片と、を含み、ＩＬ－２分子は、ムテインであり、抗体サイトカイン移植タンパク質は、制御性Ｔ細胞よりもＴエフェクター細胞を優先的に拡張させる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２レジメンは、０．１０ｍｇ／日～５０ｍｇ／日の用量で、１、２、４、６、７、１４または２１日毎に、配列番号２９及び配列番号３８からなる群から選択される重鎖と、配列番号３７及び配列番号３９からなる群から選択される軽鎖と、を含む抗体、またはその断片、バリアント、もしくはバイオシミラーを投与することを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体サイトカイン移植タンパク質は、アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））または同等の分子などであるがこれらに限定されない野生型ＩＬ－２分子よりも長い血清半減期を有する。

いくつかの実施形態では、骨髄破壊的リンパ球枯渇レジメンの前述の実施形態で使用されるＴＩＬ注入は、本明細書に記載の任意のＴＩＬ組成物であってもよく、また、ＴＩＬ注入の代わりにＭＩＬ及びＰＢＬの注入、ならびに本明細書に記載のＩＬ－２レジメンの追加及び併用療法（ＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１阻害剤及び／またはＣＴＬＡ－４阻害剤など）の投与も含み得る。

いくつかの実施形態の追加の要素
１．デバイスの実施形態の追加の要素
いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスであって、細胞を培養するための第１のガス透過性表面、細胞を培養するための第２のガス透過性表面、及び少なくとも第１のガス透過性表面から第２のガス透過性表面まで延在する１つ以上の側壁を有するデバイス本体と、ふるいであって、第１のガス透過性表面と第２のガス透過性表面との間でデバイス本体内に配置され、それによって、デバイスを、（ｉ）第１のガス透過性表面、１つ以上の側壁、及びふるいによって画定される第１の区画、及び（ｉｉ）第２のガス透過性表面、１つ以上の側壁、及びふるいによって画定される第２の区画に分離する、ふるいと、第１の区画と流体連通しているアクセスポートと、を備え、第２のガス透過性表面の断面積が、第１のガス透過性表面の断面積よりも大きい、組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が実質的に平行であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、外部環境と気体連通したエアフィルタをさらに備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第１の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成されたフレームをさらに備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、フレームが、平面に対して第２の方向であって、ふるいが、平面と第１のガス透過性表面との間で第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第２の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、フレームが、平面に対して第３の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる第３の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、第２の区画と流体連通した細胞採取出口をさらに備え、細胞採取出口が、第３の方向での組織培養デバイスの重心と平面との間に配置されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、組織培養デバイスを第１の方向、第２の方向、及び第３の方向に向けるように構成され、寸法決定される組織培養デバイス位置コントローラをさらに備え、第１の方向で、第１のガス透過性表面が、固定された平面及び第２のガス透過性表面に対して平行に、かつ固定された平面の上に、かつ第２のガス透過性表面の下に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、第２の方向で、ふるいが、平面と第１のガス透過性表面との間の第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、第３の方向で、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、第２の区画と流体連通した培地入口をさらに備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、第２の区画と流体連通した廃棄出口をさらに備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、第２の区画と流体連通した細胞採取出口をさらに備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ふるいが、約３００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ふるいが、約３００ミクロン、約２００ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、約４０ミクロン、約３０ミクロン、または約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ふるいが、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ふるいが、腫瘍断片が第１の区画から第２の区画へと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が第１の区画から第２の区画へと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のガス透過性表面の断面積が、前記第１のガス透過性表面の断面積よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きいように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の区画の体積が、少なくとも約５０ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の区画の体積が、少なくとも約１００ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の区画の体積の、第１の区画の体積に対する比が、少なくとも約２：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のガス透過性表面とふるいとの間の距離が、少なくとも約５ｃｍであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のガス透過性表面とふるいとの間の距離が、少なくとも約５ｃｍであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、アクセスポートを備えるネック部分をさらに備え、ネック部分が、第１のガス透過性表面とふるいとの間に配置されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ふるいが、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体がふるいを介して通過するのを防止するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスであって、第１の細胞培養容器であって、第１の細胞培養容器の第１の区画と流体連通している第１のアクセスポートを備え、第１の区画が、第１の内部体積及び細胞を培養するための第１のガス透過性表面によって少なくとも部分的に画定される、第１の細胞培養容器と、第２の細胞培養容器であって、第１の区画に流体的に接続された第２の区画を含み、第２の区画が、細胞を培養するための第２のガス透過性表面によって少なくとも部分的に画定され、第２の区画が、制限された体積及び拡張された体積で構成可能であり、制限された体積が、第２の区画内の第２のガス透過性表面の第１の利用可能な表面積に曝露された流体を保持するように構成され、拡張された体積が、第２の区画内の第２のガス透過性表面の第２の利用可能な表面積に曝露された流体を保持するように構成され、第１の利用可能な表面積が、第２の利用可能な表面積よりも小さい、第２の細胞培養容器と、を備える、組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、第１の細胞培養容器と第２の細胞培養容器との間の流体接続へのアクセスを提供するために第１の細胞培養容器内に配置された第２のアクセスポートと、第２のアクセスポートを横切って配置されたふるいと、をさらに備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ふるいが、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体がふるいを介して通過するのを防止するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、第２の細胞培養デバイスに連結された制限手段をさらに備え、制限手段が、第２の区画を制限された体積に制限する第１の構成と、拡張された体積に対応する第２の構成と、を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、制限手段が、１つ以上のクランプを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上のクランプが、第２の区画の内部体積を制限された体積から拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、第２の区画の内部体積における漸増が、第２のガス透過性表面の領域における第１の利用可能な表面積から第２の利用可能な表面積までの漸増に対応するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、制限手段が、制限された体積の位置から、拡張された全体積の位置へと移行可能な障壁を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、障壁がトレイ摺動蓋を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の細胞培養デバイスが、可撓性側壁と、可撓性側壁を支持するように構成された基部と、を備え、障壁が、摺動する構成で基部に連結されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、トレイ摺動蓋が、第２の区画の内部体積を制限された体積から拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、第２の区画の内部体積における漸増が、第２のガス透過性表面の領域における第１の利用可能な表面積から第２の利用可能な表面積までの漸増に対応するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、障壁が、１つ以上の調整可能なスペーサーを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、障壁が、第２の区画の内部体積を制限された体積から拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、第２の区画の内部体積における漸増が、第２のガス透過性表面の領域における第１の利用可能な表面積から第２の利用可能な表面積までの漸増に対応するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の利用可能な表面積の、制限された体積に対する第１の比が、第２の利用可能な表面積の、拡張された体積に対する第２の比と実質的に同一であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のガス透過性表面が、第２の細胞培養容器の表面全体を覆うように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の細胞培養容器が、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第１の方向で、基部によって支持されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、基部が、トレイ及びフレームのうちの少なくとも１つを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、基部が、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる第２の方向で、第２の細胞培養容器を支持するように構成されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、第２の区画と流体連通した採取出口をさらに備え、採取出口が、第２の細胞培養容器の表面に沿って配置されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のガス透過性表面が、第１の断面積を有し、第２のガス透過性表面は、第２の断面積を有し、第２の断面積が、第１の断面積よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きいように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の内部体積が、少なくとも約５０ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の区画の制限された体積が、少なくとも約１００ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、制限された体積が、第１の内部体積よりも少なくとも約２倍大きいように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを提供する。

２．いくつかの実施形態の追加の詳細
いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、プライミングによる第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第１の期間及び第２の期間に分割された急速な第２の拡張を行うことであって、第１の期間中に、急速な第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、急速な第２の拡張を行うことと、（ｅ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過することであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、濾過することと、（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において急速な第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、急速な第２の拡張の第２の期間が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われ、ここで、ステップ（ｄ）、ステップ（ｅ）、及びステップ（ｆ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することことと、（ｇ）ステップ（ｆ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｈ）ステップ（ｇ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、第１のアクセスポートを介して組織培養デバイスの第１の区画に添加することと、（ｃ）細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第２のＴＩＬ集団の急速な第２の拡張を行うことであって、急速な第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間行われ、本方法が、（Ｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第１のガス透過性表面上で急速な第２の拡張の第１の期間を行うことと、（ＩＩ）急速な第２の拡張の第１の期間の後にＴＩＬを数えあげることと、（ＩＩＩ）１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することと、（ＩＶ）第２のＴＩＬ集団を第２の区画に移すことと、（Ｖ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２のガス透過性表面の使用可能な部分上で急速な第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することと、をさらに含み、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、ステップ（ｄ）（ＩＶ）からステップ（ｄ）（Ｖ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、急速な第２の拡張を行うことと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップ（ｂ）において、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団を、外因性抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む培養培地と接触させることによって行われ、急速な第２の拡張における培養培地中のＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張における培養培地中のＡＰＣの数より大きいように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、培養培地に追加の外因性ＡＰＣが補充されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２０：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約１０：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約９：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約８：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約７：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約６：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約５：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約４：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約３：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．９：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．８：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．７：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．６：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．５：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．４：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．３：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．２：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２．１：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１～正確にまたは約２：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約１０：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約５：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約４：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約３：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．９：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．８：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．７：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．６：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．５：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．４：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．３：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．２：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１～正確にまたは約２．１：１の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約２：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数の、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数に対する比が、正確にまたは約１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、３．１：１、３．２：１、３．３：１、３．４：１、３．５：１、３．６：１、３．７：１、３．８：１、３．９：１、４：１、４．１：１、４．２：１、４．３：１、４．４：１、４．５：１、４．６：１、４．７：１、４．８：１、４．９：１、または５：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約１×１０^８、１．１×１０^８、１．２×１０^８、１．３×１０^８、１．４×１０^８、１．５×１０^８、１．６×１０^８、１．７×１０^８、１．８×１０^８、１．９×１０^８、２×１０^８、２．１×１０^８、２．２×１０^８、２．３×１０^８、２．４×１０^８、２．５×１０^８、２．６×１０^８、２．７×１０^８、２．８×１０^８、２．９×１０^８、３×１０^８、３．１×１０^８、３．２×１０^８、３．３×１０^８、３．４×１０^８、または３．５×１０^８ＡＰＣであるように、かつ急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約３．５×１０^８、３．６×１０^８、３．７×１０^８、３．８×１０^８、３．９×１０^８、４×１０^８、４．１×１０^８、４．２×１０^８、４．３×１０^８、４．４×１０^８、４．５×１０^８、４．６×１０^８、４．７×１０^８、４．８×１０^８、４．９×１０^８、５×１０^８、５．１×１０^８、５．２×１０^８、５．３×１０^８、５．４×１０^８、５．５×１０^８、５．６×１０^８、５．７×１０^８、５．８×１０^８、５．９×１０^８、６×１０^８、６．１×１０^８、６．２×１０^８、６．３×１０^８、６．４×１０^８、６．５×１０^８、６．６×１０^８、６．７×１０^８、６．８×１０^８、６．９×１０^８、７×１０^８、７．１×１０^８、７．２×１０^８、７．３×１０^８、７．４×１０^８、７．５×１０^８、７．６×１０^８、７．７×１０^８、７．８×１０^８、７．９×１０^８、８×１０^８、８．１×１０^８、８．２×１０^８、８．３×１０^８、８．４×１０^８、８．５×１０^８、８．６×１０^８、８．７×１０^８、８．８×１０^８、８．９×１０^８、９×１０^８、９．１×１０^８、９．２×１０^８、９．３×１０^８、９．４×１０^８、９．５×１０^８、９．６×１０^８、９．７×１０^８、９．８×１０^８、９．９×１０^８、または１×１０^９ＡＰＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約１×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約３．５×１０^８ＡＰＣの範囲であり、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約３．５×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約１×１０^９ＡＰＣの範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約１．５×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約３×１０^８ＡＰＣの範囲であり、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約４×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約７．５×１０^８ＡＰＣの範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約２×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約２．５×１０^８ＡＰＣの範囲であり、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、正確にまたは約４．５×１０^８ＡＰＣ～正確にまたは約５．５×１０^８ＡＰＣの範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、正確にまたは約２．５×１０^８ＡＰＣがプライミングによる第１の拡張に添加され、正確にまたは約５×１０^８ＡＰＣが急速な第２の拡張に添加されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片または腫瘍消化物が、複数の組織培養デバイスに分配され、その別個の組織培養デバイスの各々において、第１のＴＩＬ集団が、ステップ（ａ）において取得され、第２のＴＩＬ集団が、プライミングによる第１の拡張において取得され、第３のＴＩＬ集団が、急速な第２の拡張において取得され、複数の組織培養デバイスにおいて第３のＴＩＬ集団から取得された治療的ＴＩＬ集団を合わせ、採取されたＴＩＬ集団を得るように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片または腫瘍消化物が、複数の別個の組織培養デバイスに均等に分配されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の別個の組織培養デバイスが少なくとも２個の別個の組織培養デバイスを備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の別個の組織培養デバイスが、２～２０個の別個の組織培養デバイスを備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の別個の組織培養デバイスが、２～１５個の別個の組織培養デバイスを備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の別個の組織培養デバイスが２～１０個の別個の組織培養デバイスを備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の別個の組織培養デバイスが、２～５個の別個の組織培養デバイスを備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の別個の組織培養デバイスが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の別個の組織培養デバイスを備えるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団に対して行われる各容器の場合、急速な第２の拡張が、同じ容器内でかかる第１のＴＩＬ集団から産生された第２のＴＩＬ集団に対して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約２細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で行われ、急速な第２の拡張が、第２のガス透過性表面積を含む第２の容器内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の容器が第１の容器よりも大きいように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約２細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さで第２のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のガス透過性表面積を含む第１の容器内で行われ、急速な第２の拡張が、第１の容器内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約１細胞層～正確にまたは約３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約１．５細胞層～正確にまたは約２．５細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約２細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約３細胞層～正確にまたは約１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約４細胞層～正確にまたは約８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約３、４、５、６、７、８、９、または１０細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において、ＡＰＣが、正確にまたは約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８細胞層の平均厚さで第１のガス透過性表面積上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：１０の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：９の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｂ）において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：８の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：７の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：６の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：５の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：４の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：３の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１～正確にまたは約１：２の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．２～正確にまたは約１：８の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．３～正確にまたは約１：７の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．４～正確にまたは約１：６の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．５～正確にまたは約１：５の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．６～正確にまたは約１：４の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．７～正確にまたは約１：３．５の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．８～正確にまたは約１：３の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．９～正確にまたは約１：２．５の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：２の範囲であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張が、第１のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、プライミングによる第１の拡張において添加されるＡＰＣの数よりも多く、プライミングによる第１の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数の、急速な第２の拡張において層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、正確にまたは約１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、１：４、１：４．１、１：４．２、１：４．３、１：４．４、１：４．５、１：４．６、１：４．７、１：４．８、１：４．９、１：５、１：５．１、１：５．２、１：５．３、１：５．４、１：５．５、１：５．６、１：５．７、１：５．８、１：５．９、１：６、１：６．１、１：６．２、１：６．３、１：６．４、１：６．５、１：６．６、１：６．７、１：６．８、１：６．９、１：７、１：７．１、１：７．２、１：７．３、１：７．４、１：７．５、１：７．６、１：７．７、１：７．８、１：７．９、１：８、１：８．１、１：８．２、１：８．３、１：８．４、１：８．５、１：８．６、１：８．７、１：８．８、１：８．９、１：９、１：９．１、１：９．２、１：９．３、１：９．４、１：９．５、１：９．６、１：９．７、１：９．８、１：９．９、または１：１０から選択されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数の、第１のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数に対する比が、正確にまたは約１．５：１～正確にまたは約１００：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数の、第１のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数に対する比が、正確にまたは約５０：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数の、第１のＴＩＬ集団中のＴＩＬの数に対する比が、正確にまたは約２５：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数の、第１のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数に対する比が、正確にまたは約２０：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数の、第１のＴＩＬ集団におけるＴＩＬの数に対する比が、正確にまたは約１０：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも正確にまたは約５０倍多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも正確にまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０倍多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張の開始の正確にまたは約２日または正確にまたは約３日後に、細胞培養培地に追加のＩＬ－２が補充されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスを使用して、採取されたＴＩＬ集団を凍結保存するステップをさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第３のＴＩＬ集団を採取するステップの後に、採取されたＴＩＬ集団を、任意選択でＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌを含有する注入バッグに移す追加のステップを行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスを使用して、採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結保存するステップを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスが、採取されたＴＩＬ集団の、凍結保存培地に対する１：１の比を使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが、放射線照射されており、同種異系であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において細胞培養物に添加されるＡＰＣの総数が２．５×１０^８であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において細胞培養物に添加されるＡＰＣの総数が５×１０^８であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＰＣがＰＢＭＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが、放射線照射されており、同種異系であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が、人工抗原提示細胞であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取するステップが、膜ベースの細胞処理システムを使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップにおける採取が、ＬＯＶＯ細胞処理システムを使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、プライミングによる第１の拡張において、１容器当たり正確にまたは約５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、プライミングによる第１の拡張において、１容器当たり正確にまたは約１０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、プライミングによる第１の拡張において、１容器当たり正確にまたは約１５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、プライミングによる第１の拡張において、１容器当たり正確にまたは約２０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、プライミングによる第１の拡張において、１容器当たり正確にまたは約２５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、プライミングによる第１の拡張において、１容器当たり正確にまたは約３０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、プライミングによる第１の拡張において、１容器当たり正確にまたは約３５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、プライミングによる第１の拡張において、１容器当たり正確にまたは約４０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、プライミングによる第１の拡張において、１容器当たり正確にまたは約４５～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、プライミングによる第１の拡張において、１容器当たり正確にまたは約５０～正確にまたは約６０個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、プライミングによる第１の拡張において、腫瘍断片が１容器当たり正確にまたは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０個の断片（複数可）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２７ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２０ｍｍ^３～正確にまたは約５０ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２１ｍｍ^３～正確にまたは約３０ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２２ｍｍ^３～正確にまたは約２９．５ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２３ｍｍ^３～正確にまたは約２９ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２４ｍｍ^３～正確にまたは約２８．５ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２５ｍｍ^３～正確にまたは約２８ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２６．５ｍｍ^３～正確にまたは約２７．５ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、各断片が正確にまたは約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が正確にまたは約３０～正確にまたは約６０個の断片を含み、正確にまたは約１３００ｍｍ^３～正確にまたは約１５００ｍｍ^３の総体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が正確にまたは約５０個の断片を含み、正確にまたは約１３５０ｍｍ^３の総体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が正確にまたは約５０個の断片を含み、正確にまたは約１グラム～正確にまたは約１．５グラムの総質量を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、細胞培養培地がＸｕｒｉ細胞バッグである容器内に提供されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、細胞培養培地中のＩＬ－２濃度が約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５０００ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、細胞培養培地中のＩＬ－２濃度が約６，０００ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存培地が、７％～１０％のＤＭＳＯを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１４日間～正確にまたは約１８日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１５日間～正確にまたは約１８日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１６日間～正確にまたは約１８日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１７日間～正確にまたは約１８日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１４日間～正確にまたは約１７日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１５日間～正確にまたは約１７日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１６日間～正確にまたは約１７日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１４日間～正確にまたは約１６日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１５日間～正確にまたは約１６日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１４日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１５日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１６日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１７日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１８日間で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１４日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１５日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１６日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１７日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが合計で正確にまたは約１８日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取ステップにおいて採取された治療的ＴＩＬ集団が、治療上有効な投与量のＴＩＬに十分なＴＩＬを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量に十分なＴＩＬの数が、正確にまたは約２．３×１０^１０～正確にまたは約１３．７×１０^１０であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において産生された第３のＴＩＬ集団が、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において産生された第３のＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍、またはそれより多くのインターフェロンガンマ産生を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において産生された第３のＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍、またはそれより多くのインターフェロンガンマ産生を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において産生された第３のＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍～５倍、またはそれより多くのインターフェロンガンマ産生を提供するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、急速な第２の拡張において産生された第３のＴＩＬ集団から取得されたエフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞が、プライミングによる第１の拡張から産生された第２の細胞集団から取得されたエフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞と比較して、増加したＣＤ８及びＣＤ２８発現を示すように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法によって作製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、治療的ＴＩＬ集団が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、治療的ＴＩＬ集団が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、治療的ＴＩＬ集団が、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、治療的ＴＩＬ集団が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せず、かつＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、１６日間より長いプロセスによってプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、治療的ＴＩＬ集団が、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、１７日間より長いプロセスによってプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、治療的ＴＩＬ集団が、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍組織から調製された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団であって、１８日間より長いプロセスによってプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、治療的ＴＩＬ集団が、増加した有効性、増加したインターフェロンガンマ産生、及び／または増加したポリクローン性を提供する、治療的集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、増加したインターフェロンガンマ産生を提供する、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、増加したポリクローン性を提供する、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載された治療的ＴＩＬ集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、増加した有効性を提供する、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載された治療的ＴＩＬ集団を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

いくつかの実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

いくつかの実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１６日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１７日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、治療的ＴＩＬ集団が、１８日間より長いプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＰＣを添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも２倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＰＣを添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも１倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＯＫＴ３を添加せずにＴＩＬの第１の拡張が行われるプロセスによって調製されたＴＩＬと比較して、少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生が可能である腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の治療的集団を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に示されるように）、本明細書に記載の拡張プロセスに起因する少なくとも３倍多いインターフェロンガンマ産生を可能にする。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が、小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物であるように修正された、上記の該当する前の段落のいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片がコア生検であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が細針吸引物であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片が小生検（例えば、パンチ生検を含む）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍断片がコア針生検であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）本方法が、対象からの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）本方法が、プライミングによる第１の拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間の期間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）本方法が、プライミングによる第１の拡張を約８日間の期間行うことを含み、及び（ｉｖ）本方法が、急速な第２の拡張を約１１日間の期間行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日間で完了する。

いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）本方法が、対象からの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）本方法が、第１の拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間の期間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）本方法が、第１の拡張を約８日間の期間行うことを含み、及び（ｉｖ）本方法が、第１の区画において第２のＴＩＬ集団の培養物を約５日間培養することによって第２の拡張の第１の期間を行い、第２の区画の第２のガス透過性表面の使用可能な領域が、第１の区画の第１のガス透過性表面の使用可能な領域よりも少なくとも５倍大きいように第２の区画を構成し、第２の細胞集団を第１の区画から第２の区画へと移し、第２の区画において第２のＴＩＬ集団の培養物を約６日間培養することによって第２の拡張の第２の期間を行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日間で完了する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検、または細針吸引物から取得されように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象由来の腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ集団が、対象からの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）本方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）本方法が、第１の拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間の期間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）本方法が、第１のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で約８日間の期間培養することによって第１の拡張ステップを行い、第２のＴＩＬ集団を取得することを含み、かつ（ｉｖ）本方法が、第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを含む培養培地中で約１１日間の期間培養することによって第２の拡張ステップを行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日間で完了する。

いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）本方法が、対象からの腫瘍組織の１～約１０個のコア生検から第１のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｉ）本方法が、第１の拡張ステップを行う前に、ＩＬ－２を含む細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を約３日間の期間培養するステップを行うことを含み、（ｉｉｉ）本方法が、第１の区画において、第１のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で約８日間の期間培養することによって第１の拡張ステップを行い、第２のＴＩＬ集団を取得することを含み、（ｉｖ）本方法が、第１の区画において、第２のＴＩＬ集団の培養物を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを含む培養培地中で約５日間培養することによって第２の拡張の第１の期間を行い、第２の区画の第２のガス透過性表面の使用可能な領域が、第１の区画中の第１のガス透過性表面の領域よりも少なくとも５倍大きいように第２の区画を構成し、第２の細胞集団を第１の区画から第２の区画へと移し、第２の区画において第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２を含む培養培地中で約６日間培養することによって第２の拡張の第２の期間を行うことを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。前述の実施形態のうちのいくつかでは、方法のこれらのステップは、約２２日間で完了する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、最大７日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、最大８日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、最大９日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、最大１０日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、最大１１日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が７日間の期間中に行われ、第２の拡張が最大９日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が７日間の期間中に行われ、第２の拡張が最大１０日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が７日間または８日間の期間中に行われ、第２の拡張が最大９日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が７日間または８日間の期間中に行われ、第２の拡張が最大１０日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が８日間の期間中に行われ、第２の拡張が最大９日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が８日間の期間中に行われ、第２の拡張が最大８日間の期間中に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＴＩＬ細胞集団がＯＫＴ－３及びＩＬ－２を含む第１の培養培地中で培養されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張における培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３及びＩＬ－２を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張における培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張における培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張において、第２のＴＩＬ細胞集団が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む培養培地中で培養されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明は、第２の拡張における培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＴＩＬ細胞集団が、第１のガス透過性表面を備える容器内の第１の培養培地中で培養され、第１の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴＩＬ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２の拡張において、第２のＴＩＬ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養され、第２の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴＩＬ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団より多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＴＩＬ細胞集団が、第１のガス透過性表面を備える容器内の第１の培養培地中で培養され、第１の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴＩＬ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２の拡張において、第２のＴＩＬ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養され、第２の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴＩＬ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団より多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＴＩＬ細胞集団が、第１のガス透過性表面を備える容器内の第１の培養培地中で培養され、第１の培養培地が、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴＩＬ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２の拡張において、第２のＴＩＬ細胞集団が、容器内の第２の培養培地中で培養され、第２の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴＩＬ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団より多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＴＩＬ細胞集団が、第１のガス透過性表面を備える容器内の第１の培養培地中で培養され、第１の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第１の抗原提示細胞（ＡＰＣ）集団を含み、第１のＡＰＣ集団が、第１のＴＩＬ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第１のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２の拡張において、第２のＴＩＬ細胞集団が、容器中の第２の培養培地中で培養され、第２の培養培地が、４－１ＢＢアゴニスト、ＯＫＴ－３、ＩＬ－２及び第２のＡＰＣ集団を含み、第２のＡＰＣ集団が、第１のＴ細胞集団のドナーに対して外因性であり、第２のＡＰＣ集団が、第１のガス透過性表面上に層状化され、第２のＡＰＣ集団が、第１のＡＰＣ集団より多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数の、第１のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数に対する比が、約２：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数が約２．５×１０^８であり、第２のＡＰＣ集団中のＡＰＣの数が約５×１０^８であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＡＰＣ集団が、２層のＡＰＣの平均厚さで第１のガス透過性表面上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張において、第２のＡＰＣ集団が、４～８層のＡＰＣの範囲の平均厚さで第１のガス透過性表面上に層状化されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張において第１のガス透過性表面上に層状化されたＡＰＣの総の平均数の、第１の拡張において第１のガス透過性表面上に層状化されたＡＰＣの層の平均数に対する比が、２：１であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＡＰＣ集団が、正確にまたは約１．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面上に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＡＰＣ集団が、正確にまたは約１．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面上に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＡＰＣ集団が、正確にまたは約２．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約３．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面上に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＡＰＣ集団が、正確にまたは約２．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で第１のガス透過性表面上に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約６．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約５．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で第１のガス透過性表面上に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＡＰＣ集団が、正確にまたは約１．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約４．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面上に播種され、第２の拡張において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約２．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約７．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＡＰＣ集団が、正確にまたは約１．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面上に播種され、第２の拡張において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約３．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約６．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＡＰＣ集団が、正確にまたは約２．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約３．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面上に播種され、第２の拡張において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２～正確にまたは約５．５×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の範囲の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張において、第１のＡＰＣ集団が、正確にまたは約２．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で第１のガス透過性表面上に播種され、第２の拡張において、第２のＡＰＣ集団が、正確にまたは約４．０×１０^６ＡＰＣ／ｃｍ^２の密度で第１のガス透過性表面に播種されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＡＰＣが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが放射線照射され、第１のＴＩＬ細胞集団のドナーに対して外因性であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団がドナーの全血からの分離によって取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団がドナーのアフェレーシス産物からの分離によって取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、Ｔ細胞表現型の正または負の選択によってドナーの全血またはアフェレーシス産物から分離されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、Ｔ細胞表現型がＣＤ３＋及びＣＤ４５＋であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団のプライミングによる第１の拡張を行う前に、ＴＩＬ細胞がＮＫ細胞から分離されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ細胞は、第１のＴＩＬ細胞集団からのＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の除去によって、第１のＴＩＬ細胞集団中のＮＫ細胞から分離される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞画分を除去し、かつ陰性画分を回収するゲーティング戦略を使用して、第１のＴＩＬ細胞集団を細胞選別に供することによって、第１のＴＩＬ細胞集団から除去される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、高いＮＫ細胞パーセンテージを特徴とする第１のＴＩＬ細胞集団におけるＴＩＬ細胞の拡張のために利用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、高いＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞パーセンテージを特徴とする第１のＴＩＬ細胞集団におけるＴＩＬ細胞の拡張のために利用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、多数のＮＫ細胞の存在を特徴とする腫瘍組織におけるＴＩＬ細胞の拡張のために利用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、多数のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞を特徴とする腫瘍組織におけるＴＩＬ細胞の拡張のために利用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、多数のＮＫ細胞の存在を特徴とする腫瘍に罹患している患者から取得された腫瘍組織におけるＴＩＬ細胞の拡張のために利用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、多数のＣＤ３－ＣＤ５６＋細胞の存在を特徴とする腫瘍に罹患している患者から取得された腫瘍組織におけるＴＩＬ細胞の拡張のために利用される。いくつかの実施形態では、前述の方法は、卵巣癌に罹患している患者から取得された腫瘍組織におけるＴＩＬ細胞の拡張のために利用される。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団からの正確にまたは約１×１０^７ＴＩＬ細胞が容器内に播種されて、かかる容器内での第１の拡張培養を開始するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が複数の組織培養デバイスに分配され、各組織培養デバイスの各第１の容器において、第１のＴＩＬ細胞集団からの正確にまたは約１×１０^７ＴＩＬ細胞が播種されて、かかる容器内での第１の拡張培養を開始するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取された第３のＴＩＬ細胞集団が治療的ＴＩＬ集団であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）、コア生検、コア針生検または細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の細針吸引物から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の小生検（例えば、パンチ生検を含む）から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１つ以上のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～２０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１～１０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１のＴＩＬ細胞集団が、ドナーからの腫瘍組織の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のコア針生検から取得されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、ｉ）ＩＬ－２を含む第１の細胞培養培地中で腫瘍試料を約３日間培養することによって対象における腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検、または針生検から取得された腫瘍試料から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容することと、（ｉｉ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、プライミングによる第１の拡張が第１のガス透過性表面積を含む容器内で行われ、プライミングによる第１の拡張が約７日または８日間の第１の期間行われて、第２のＴＩＬ集団が取得され、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団の第２の細胞培養倍地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを補充することによって急速な第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、急速な第２の拡張において添加されるＡＰＣの数が、ステップ（ｉｉ）において添加されるＡＰＣの数の少なくとも２倍であり、急速な第２の拡張が約１１日間の第２の期間行われて、第３のＴＩＬ集団が取得され、第３のＴＩＬ集団が治療的ＴＩＬ集団であり、急速な第２の拡張が第２のガス透過性表面積を含む容器内で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から取得され治療的ＴＩＬ集団を採取することと、（ｖ）ステップ（ｉｖ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張するための方法であって、（ｉ）ＩＬ－２を含む第１の細胞培養倍地中で腫瘍試料を約３日間培養することによって対象における腫瘍の１つ以上の小生検、コア生検、または針生検から取得された腫瘍試料から第１のＴＩＬ集団を取得及び／または受容することと、（ｉｉ）ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む第２の細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによってプライミングによる第１の拡張を行い、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、プライミングによる第１の拡張が約７日または８日間の第１の期間行われて、第２のＴＩＬ集団が取得され、第２のＴＩＬ集団は第１のＴＩＬ集団よりも数が多い、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｉｉ）第２のＴＩＬ集団を、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及びＡＰＣを含む第３の細胞培養培地と接触させることによって急速な第２の拡張を行い、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、急速な第２の拡張が約１１日間の第２の期間行われて、第３のＴＩＬ集団が取得され、第３のＴＩＬ集団が治療的ＴＩＬ集団である、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間に分割され、第２の拡張の第１の期間が、第２の拡張の５日目までに行われ、第２の拡張の５日目の後に、第２の区画が、第１の区画中の第１のガス透過性表面の使用可能な領域よりも少なくとも２倍以上大きい第２のガス透過性表面の使用可能な領域を提供する体積に構成され、第２の拡張の第２の期間が、第２のＴＩＬ集団に追加の量の培養培地を補充し、約６日間培養することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張の５日目の後に、第２の拡張の第２の期間が、第２のＴＩＬ集団に、ＩＬ－２を含む培養培地を補充し、約６日間培養することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張の５日目の後に、第２の区画が、第１の区画中の第１のガス透過性表面の使用可能な領域よりも少なくとも５倍大きい第２のガス透過性表面の使用可能な領域を提供する体積に構成されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、方法におけるすべてのステップが約２２日間で完了するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過することであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、濾過することと、（ｅ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われ、ここで、ステップ（ｄ）及びステップ（ｅ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｆ）ステップ（ｅ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｇ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うことであって、第１の期間中に、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張を行うことと、（ｅ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過することであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、濾過することと、（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われ、ここで、ステップ（ｄ）、ステップ（ｅ）、及びステップ（ｆ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｇ）ステップ（ｆ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｈ）ステップ（ｇ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過することであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、濾過することと、（ｅ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うことであって、第１の期間中に、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の細胞培養培地、ＡＰＣ及びＩＬ－２を補充し、第２の区画において第２の拡張の第１の期間、第２のＴＩＬ集団を培養することによって、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張を行うことと、（ｆ）使用済み細胞培養培地を第２の区画から除去することと、（ｇ）ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地を第２の区画に導入することと、（ｈ）第２のＴＩＬ集団を、第２の区画において第２の拡張の第２の期間培養して、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の期間中に、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｄ）、ステップ（ｅ）、ステップ（ｆ）、ステップ（ｇ）及びステップ（ｈ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｉ）ステップ（ｈ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｈ）からステップ（ｉ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｊ）ステップ（ｉ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地が、第２のＴＩＬ集団の第２の細胞培養培地にＩＬ－２またはＯＫＴ－３のうちの少なくとも１つを添加することを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本方法が、組織培養デバイス位置コントローラを使用して、組織培養デバイスを、第１の方向、第２の方向、及び第３の方向に向けることをさらに含み、第１の方向で、第１のガス透過性表面が、固定された平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、ふるいが、第１のガス透過性表面の上にあり、第２の方向で、第２のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、ふるいが、第１のガス透過性表面の下にあり、第３の方向で、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、ＩＬ－２を含み、及び任意選択でＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で行われ、第２のＴＩＬ集団を産生するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団を取得するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも５０倍多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張の第１の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、第２の拡張の第２の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２を補充することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、第１のアクセスポートを介して組織培養デバイスの第１の区画に添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）１つ以上の制限手段を使用して、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することと、（ｅ）第２のＴＩＬ集団を第２の区画に移すことであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離する、移すことと、（ｆ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｇ）ステップ（ｆ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｈ）ステップ（ｇ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、第１のアクセスポートを介して組織培養デバイスの第１の区画に添加することと、（ｃ）細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第２のＴＩＬ集団の第２の拡張を行うことであって、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間行われ、本方法が、（Ｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第１のガス透過性表面上で第２の拡張の第１の期間を行うことと、（ＩＩ）第１の期間の後にＴＩＬを数えあげることと、（ＩＩＩ）１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することと、（ＩＶ）第２のＴＩＬ集団を第２の区画に移すことと、（Ｖ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２のガス透過性表面の使用可能な部分上で第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することと、をさらに含み、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、ステップ（ｄ）（ＩＶ）からステップ（ｄ）（Ｖ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２の拡張を行うことと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、第１のアクセスポートを介して組織培養デバイスの第１の区画に添加することと、（ｃ）細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）第２のＴＩＬ集団の第２の拡張を行うことであって、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間行われ、本方法が、（Ｉ）第１の拡張の後にＴＩＬの第１の数えあげを行うことと、（ＩＩ）１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの第１の数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することと、（ＩＩＩ）第２のＴＩＬ集団を第２の区画に移すことと、（ＩＶ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加の細胞培養培地、ＡＰＣ及びＩＬ－２を補充することによって、第１の透過性表面の第１の使用可能な部分上で第２の拡張の第１の期間を行うことと、（Ｖ）第１の期間の後にＴＩＬの第２の数えあげを行うことと、（ＶＩ）１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの第２の数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その第２の使用可能な部分に構成することと、（ＶＩＩ）第２の区画中に位置する廃棄出口から使用済み細胞培養培地を除去することと、（ＶＩＩＩ）ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地を、第２の区画中に位置する入口を介して導入することと、（ＩＸ）第２のガス透過性表面の第２の使用可能な部分上で第２の拡張の第２の期間、第２のＴＩＬ集団を培養して、第３のＴＩＬ集団を産生することと、をさらに含み、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行、及びステップ（ｄ）（Ｉ）からステップ（ｄ）（ＩＸ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、第２の拡張を行うことと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、組織培養デバイスを開くことなく行われる、採取することと、（ｆ）ステップ（ｅ）からの採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、（１）組織培養デバイスの第１の培養容器が、外部環境へのアクセスを提供するために配置された第３のアクセスポートと、第３のアクセスポートを横切って配置された第２のふるいと、をさらに備え、第２のふるいが、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体が第２のふるいを介して通過するのを防止し、（２）腫瘍断片が、第１のアクセスポートを介して第１の区画に添加され、（３）第１の拡張が、第１のステップ及び第２のステップに分割され、本方法が、ＩＬ－２を含有する細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張の第１のステップを行って、腫瘍断片から出るＴＩＬ及び腫瘍断片中に残存するＴＩＬを生成することをさらに含み、（４）腫瘍断片から出たＴＩＬを含む培養培地を、第３のアクセスポートを介して外部環境へと通過させることによって、腫瘍断片中に残存したＴＩＬを、ステップ（３）において腫瘍断片から出たＴＩＬから分離しつつ、第３のアクセスポートを横切って配置された第２のふるいが、腫瘍断片が第３のアクセスポートへと通過するのを遮断し、腫瘍断片中に残存したＴＩＬを、第１の区画中に保持させ、（５）腫瘍断片が、任意選択で消化され、腫瘍消化物を産生し、（６）第１の拡張の第２のステップが、腫瘍断片または腫瘍消化物中に残存するＴＩＬの細胞培養培地を補充して、第２のＴＩＬ集団を産生することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本方法が、組織培養デバイス位置コントローラを使用して、組織培養デバイスを、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第１の方向に、ならびに平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる第２の方向に向けることをさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、ＩＬ－２を含み、及び任意選択でＯＫＴ－３を含む細胞培養培地中で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む細胞培養培地中で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、約３～１４日間行われ、第２のＴＩＬ集団を取得するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２のＴＩＬ集団が、第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも５０倍多いように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張の第１の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、第２の拡張の第２の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、約７～１４日間行われ、第３のＴＩＬ集団を取得するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本方法が、凍結保存プロセスを使用して、採取されたＴＩＬ集団を含む注入バッグを凍結乾燥するステップをさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存プロセスが、採取されたＴＩＬ集団の、凍結保存培地に対する１：１の比を使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが、放射線照射されており、同種異系であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＰＢＭＣが、第２の拡張の９～１４日目のいずれかで細胞培養物に添加されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、抗原提示細胞が、人工抗原提示細胞であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取が、膜ベースの細胞処理システムを使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取が、ＬＯＶＯ細胞処理システムを使用して行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が、約４～約５０個の断片を含み、各断片が、約２７ｍｍ^３の体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が、約３０～約６０個の断片を含み、約１３００ｍｍ^３～約１５００ｍｍ^３の総体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が、約５０個の断片を含み、約１３５０ｍｍ^３の総体積を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が、約５０個の断片を含み、約１グラム～約１．５グラムの総質量を有するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、複数の腫瘍断片が、約４個の断片を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張における細胞培養培地が、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－２１をさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＩＬ－２濃度が、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＩＬ－１５濃度が、約５００ＩＵ／ｍＬ～約１００ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＩＬ－２１濃度が、約２０ＩＵ／ｍＬ～約０．５ＩＵ／ｍＬであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、注入バッグが、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌを含有する注入バッグであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、凍結保存培地が、７％～１０％のＤＭＳＯを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張及び第２の拡張が、各々１０日間、１１日間、または１２日間の期間内に個別に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張及び第２の拡張が、各々１１日間の期間内に個別に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１０日間～約２２日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約２０日間～約２２日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１５日間～約２０日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１０日間～約２０日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１０日間～約１５日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、２２日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、２０日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、１５日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、１０日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべて及び凍結保存が、２２日間以下で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２日間の期間内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１８日間～約２１日間の期間内に行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、約１１日間の期間内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、約１１日間の期間内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、約７または８日間の期間内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張の第１の期間が、約３または４日間以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張の第２の期間が、約５または６日間以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第１の拡張が、約７または８日間の期間内で行われ、第２の拡張の第１の期間が、約３または４日間以内で行われ、第２の拡張の第２の期間が、約５または６日間以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ステップのすべてが、約１６または１７日間以内で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取ステップにおいて採取された治療的ＴＩＬ集団が、治療上有効な投与量のＴＩＬに十分なＴＩＬを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、採取ステップにおいて採取された治療的ＴＩＬ集団が、約２．３×１０^１０～約１３．７×１０^１０個である治療上有効な投与量のＴＩＬを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間に分割され、第１の期間中に、第２の拡張が、第２の区画の制限された体積中で行われ、第２の期間中に、第２の拡張が、第２の区画の拡張された体積中で行われるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間に分割され、第２のＴＩＬ集団に、第１の期間中に、抗原提示細胞が補充され、系を開くことなく第２の期間中に追加の培養培地及びＩＬ－２が補充されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間に分割され、第２のＴＩＬ集団に、第１の期間中にＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充され、系を開くことなく第２の期間中に追加の培養培地及びＩＬ－２が補充されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、開放系と比較して、微生物汚染のリスクが低下するように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、注入バッグ中のＴＩＬが、患者に注入されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本方法が、１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することをさらに含み、構成することが、第２の細胞培養容器の少なくとも一部分を広げることを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本方法が、１つ以上の制限手段を使用して、ＴＩＬの数えあげに基づき、第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することをさらに含み、構成することが、第２の細胞培養容器の内側表面が、構成の前に画定された内側表面よりも大きな体積を画定し、異なる構成で１つ以上の制限手段を用いて画定することができる内側表面よりも小さな体積を画定するように、細胞培養デバイスに１つ以上の制限手段を適用することを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、バイオリアクターシステムであって、（ａ）上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスと、（ｂ）組織培養デバイスの第１の区画及び第２の区画の一方または両方に流体的に接続された新鮮培地容器と、（ｃ）組織培養デバイスの第２の区画に流体的に接続された廃棄培地容器と、（ｄ）１つ以上のポンプであって、（ｉ）新鮮培地容器から、組織培養デバイスの第１の区画及び第２の区画の一方または両方へと、新鮮培地を圧送し、（ｉｉ）第２の区画から廃棄材料容器へと廃棄培地を圧送し、及び／または（ｉｉｉ）第２の区画から注入バッグへと細胞を圧送するように構成された、１つ以上のポンプと、を備える、バイオリアクターシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、バイオリアクターシステムであって、（ａ）上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスと、（ｂ）組織培養デバイスの第１の区画及び第２の区画の一方または両方に流体的に接続された新鮮培地容器と、（ｄ）１つ以上のポンプであって、（ｉ）新鮮培地容器から、組織培養デバイスの第１の区画及び第２の区画の一方または両方へと、新鮮培地を圧送し、及び／または（ｉｉ）第２の区画から、細胞を細胞培養廃棄材料から濾過し、濾過した細胞を残存物容器に、細胞培養廃棄材料を廃棄材料容器に堆積させるように構成されたインラインタンジェンシャルフロー濾過デバイスに細胞を圧送するように構成された、１つ以上のポンプと、を備える、バイオリアクターシステムを提供する。

別の実施形態では、本発明は、１つ以上のポンプが、吸引、圧力差、または強制空気を介して作用する材料を移動させるように構成されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のバイオリアクターシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、インキュベーター内に配置されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のバイオリアクターシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、組織培養デバイスが、組織培養デバイスの撹拌を行うように少なくとも二次元で移動するように構成された基部によるものであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のバイオリアクターシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、新鮮培地容器、廃棄材料容器、及び１つ以上のポンプのうちの１つ以上が、インキュベーターの外側に配置されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のバイオリアクターシステムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、第１の壁と第２の壁との間に画定された内部空間と、内部空間の第１のチャンバと第２のチャンバとの間に配置されたダイアフラムと、を有する、細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、ダイアフラムは、内部空間の遠位端から境界まで延在する第１のセクションであって、第１のセクションが、液体が第１のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを防止するために液体不透過性である、第１のセクションと、境界から内部空間の近位端に向かって延在する第２のセクションであって、第２のセクションが、液体が第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にするために液体透過性である、第２のセクションと、を備える。いくつかの実施形態では、ダイアフラムの第１のセクション及び第１の壁は、細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに所定の体積までの液体を保持するように構成される、第１のチャンバ中のウェルを画定し、所定の体積は、第１のチャンバの最大充填体積未満である。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞培養デバイスであって、細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、内部空間の近位端が、内部空間の遠位端の上に垂直に位置決めされる、細胞培養デバイスを提供する。さらなる実施形態では、第１のチャンバは、第１の壁とダイアフラムとの間に配置され、第２のチャンバは、第２の壁とダイアフラムとの間に配置される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞培養デバイスであって、細胞培養デバイスが、第１のチャンバに流体的に接続された少なくとも１つの入口ポートと、ウェルに流体的に接続された第１の出口ポートと、第２のチャンバに流体的に接続された第２の出口ポートと、をさらに有する、細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの入口ポート、第１の出口ポート、及び第２の出口ポートの各々は、液体がそれらを介して通過することを可能にする開放構成と、液体がそれらを介して通過することを防止する閉鎖構成と、を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの入口ポートは、内部空間の近位端に、またはそれに近接して位置決めされ、第１の出口ポート及び第２の出口ポートは、内部空間の遠位端に、またはそれに近接して位置決めされる。

いくつかの実施形態では、本開示は、第１の壁及び／または第２の壁が、ガス透過性材料を含む、上述の細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、第１の壁及び／または第２の壁は、可撓性材料を含む。いくつかの実施形態では、第１の壁及び／または第２の壁は、剛性材料を含む。いくつかの実施形態では、第１の壁の内側表面は、細胞（例えば、ＴＩＬ）を培養するために構成された領域を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、ダイアフラムの第２のセクションが、５μｍ未満である孔径を有するふるいを備える、上述の細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、ダイアフラムは、可撓性である。他の実施形態では、ダイアフラムは、剛性である。

いくつかの実施形態では、本開示は、ダイアフラムが、内部空間の遠位端から内部空間の近位端まで延在する、上述の細胞培養デバイスを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、ダイアフラムが、内部空間の近位端から空間的に離れている近位縁部で終端する、上述の細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、ダイアフラムは、内部空間の遠位端から近位縁部まで延在する。いくつかの実施形態では、近位縁部は、第２の壁に取り付けられている。いくつかの実施形態では、ダイアフラムは、遠位端と近位端との間の距離の半分未満まで延在する。いくつかの実施形態では、ダイアフラムの第２のセクションは、境界から近位縁部まで延在する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞培養デバイスであって、細胞培養デバイスが、所定の体積を超える過剰量の液体が第１のチャンバに導入された場合に、過剰量の液体の少なくとも一部分が、細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバまで流れることを可能にするように構成されている、細胞培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、第１のチャンバの最大充填体積の、所定の体積に対する比は、約１．５～約１５である。

いくつかの実施形態では、本開示は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の少なくとも１つの細胞培養デバイスを備える細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞処理システムは、細胞をインビトロで培養するために構成された１つ以上の容器であって、１つ以上の容器が、細胞培養デバイスの内部空間に流体的に接続される、１つ以上の容器と、をさらに備えていてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の容器は、１つ以上の培養フラスコ、１つ以上の培養バッグ、及び／または１つ以上の培養プレートを含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、インキュベーターをさらに備える、上述の細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイス及び１つ以上の容器は、所定の大気条件で（例えば、３７℃及び５％ＣＯ２で）インキュベーター内に封入されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のような細胞処理システムであって、細胞培養デバイスの第１の壁及び第２の壁が、可撓性であり、細胞処理システムが、第１の壁及び第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて細胞培養デバイスの内部空間中を液体が流れるのを防止するように構成される１つ以上の解放可能な固定具をさらに備える、細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具の場所は、細胞培養デバイスの入口ポートとダイアフラムとの間にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、クランプ、クリップ、ストラップ、弾性バンド、タイ、及び／または磁気固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、細胞培養デバイスに沿った所定の場所にそれぞれ位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、細胞培養デバイス上の第１の位置から細胞培養デバイス上の第２の位置まで摺動するように構成される摺動固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、摺動固定具とダイアフラムとの間に位置決めされた固定位置固定具をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞培養デバイスが、水平方向から垂直方向まで回転可能である、上述の細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスが水平方向にあるときに、ダイアフラムは、第１のチャンバの上に垂直に位置決めされ、第２のチャンバは、ダイアフラムの上に垂直に位置決めされる。いくつかの実施形態では、細胞処理システムは、細胞培養デバイスを水平方向から垂直方向まで回転させるように構成された可動プラットフォームを備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞培養デバイスの第１の壁が、ガス透過性である、上述の細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞処理システムは、ガス透過性トレイをさらに備え、細胞培養デバイスは、細胞培養デバイスの第１の壁がガス透過性トレイに対して入れられるように、ガス透過性トレイ上に配置される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞処理システムであって、細胞培養デバイスの第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスと、細胞培養デバイスの第２のチャンバに流体的に接続された透過物収集デバイスと、をさらに備える、細胞処理システムを提供する。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞懸濁液を濃縮する方法であって、本方法が、上記の前段落のうちのいずれかに従って記載される組織培養デバイスの第１のチャンバに、液体中に懸濁された細胞を含む細胞懸濁液を導入することであって、細胞懸濁液が、細胞培養デバイスのウェル中に保持することができる所定の体積の液体よりも大きい初期体積を有する、導入することと、細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、細胞懸濁液の液体の一部分が、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、細胞懸濁液の体積を、初期体積から低下させることと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、初期体積の細胞懸濁液を第１のチャンバに導入する前に、細胞培養デバイスを垂直方向に向けることを含む。他の実施形態では、本方法は、初期体積の細胞懸濁液を第１のチャンバに導入した後に、細胞培養デバイスを垂直方向に向けることを含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞懸濁液を濃縮する方法であって、細胞懸濁液の細胞が、細胞培養デバイスの第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを防止する、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞懸濁液の体積が、初期体積から最終体積まで低下する、上述の細胞懸濁液を濃縮する方法を提供する。いくつかの実施形態では、最終体積は、ウェル中に保持することができる液体の所定の体積とほぼ等しい。いくつかの実施形態では、初期体積の、最終体積に対する比が、約１．５～約１５である。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞懸濁液の体積が最終体積まで低下した後に、細胞培養デバイスの第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することは、第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに細胞懸濁液を移すことを含む。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞懸濁液を濃縮する方法であって、細胞培養デバイスの第１のチャンバに細胞懸濁液を導入することが、細胞培養デバイスの内部空間に流体的に接続される１つ以上の容器から細胞培養デバイスに細胞懸濁液を移すことを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の容器は、１つ以上の培養フラスコ、１つ以上の培養バッグ、及び／または１つ以上の培養プレートを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の容器及び細胞培養デバイスは、所定の大気条件で（例えば、３７℃及び５％ＣＯ２で）、インキュベーター内に封入されている。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞を拡張する方法であって、本方法が、上記の前段落のうちのいずれかに従って記載される組織培養デバイスの内部空間に、初期量の細胞を播種することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、ＴＩＬを含む。いくつかの実施形態では、細胞を拡張する方法は、細胞培養デバイスが水平方向にある間に、細胞培養デバイスの第１の壁の内部表面上で細胞培養培地中の細胞を培養して、拡張された量の細胞を産生することと、拡張された量の細胞を、細胞培養培地に懸濁させて、初期体積を有する細胞懸濁液を形成することと、細胞培養デバイスを水平方向から垂直方向まで回転させることであって、細胞懸濁液が、細胞培養デバイスの第１のチャンバを少なくとも部分的に充填する、回転させることと、細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、細胞懸濁液の体積を、初期体積から低下させることと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスの第１の壁は、ガス透過性である。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を拡張する方法であって、細胞培養培地が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞のうちの１つ以上を含有する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、約４日間～約１１日間の期間にわたって培養される。いくつかの実施形態では、初期量の細胞は、１０６～１０９個の細胞を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を拡張する方法であって、１つ以上の容器中の第１の細胞集団を拡張して、第２の細胞集団を産生することをさらに含み、初期量の細胞が、第２の細胞集団の少なくとも一部分である、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を拡張する方法であって、細胞培養デバイスの第１の壁及び第２の壁が、可撓性であり、本方法が、１つ以上の解放可能な固定具を適用して、第１の壁及び第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて細胞培養デバイスの内部空間中を細胞及び／または細胞培養培地が流れるのを防止することをさらに含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具を適用することは、初期量の細胞を細胞培養デバイスの内部空間に播種する前に行われる。いくつかの実施形態では、細胞は、内部空間の近位端と１つ以上の解放可能な固定具の場所との間に配置される第１の壁の内側表面の領域上で培養される。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、内部空間の近位端とダイアフラムとの間の細胞培養デバイスに沿って所定の場所に各々位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む。いくつかの実施形態では、細胞を拡張する方法は、所定の順序で複数の解放可能な固定具を解放して、細胞を培養するために利用可能である第１の壁の内側表面の領域を徐々に増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の解放可能な固定具は、細胞懸濁液の体積を低下させる前に解放される。いくつかの実施形態では、複数の解放可能な固定具は、細胞培養デバイスを水平方向から垂直方向に回転させる前に解放される。

いくつかの実施形態では、拡張された量の細胞を細胞培養培地に懸濁させて、細胞懸濁液を形成するステップを行う前に、細胞を拡張する方法は、１つ以上の固定具を解放するステップと、細胞培養デバイスの第１の出口ポートを開放し、内部空間中の細胞培養培地の流体レベルが、内部空間中の第１の出口ポートの位置にほぼ等しくなるまで、使用済み細胞培養培地を第１の出口ポートを介して排出させるステップと、細胞培養デバイスの入口ポートを開放し、ＩＬ－２が補充され、任意選択でＯＫＴ－３が補充された追加の細胞培養培地を内部空間に供給するステップと、細胞を培養して、拡張された量の細胞よりも多い量の細胞を産生するステップと、を行うことをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスが水平方向に位置決めされるとき、内部空間中の入口ポートの位置が、第１の出口ポートの位置より上に垂直に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２が補充され、任意選択でＯＫＴ－３が補充された追加の細胞培養培地中で約４～約８日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－２が補充され、任意選択でＯＫＴ－３が補充された追加の細胞培養培地中で約５～約７日間培養される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を拡張する方法であって、細胞懸濁液の体積を低下させている間、または低下させた後に、液体を細胞培養デバイスの第２のチャンバから除去することをさらに含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液の体積は、初期体積から最終体積まで低下する。いくつかの実施形態では、最終体積は、細胞培養デバイスのウェル中に保持することができる液体の所定の体積とほぼ等しい。いくつかの実施形態では、初期体積の、最終体積に対する比が、約１．５～約１５である。いくつかの実施形態では、細胞を拡張する方法は、細胞懸濁液の体積が最終体積まで低下した後に、細胞培養デバイスの第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することは、第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに細胞懸濁液を移すことを含む。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞を培養するためのシステムであって、本システムが、ａ）組織培養デバイスであって、細胞を培養するための第１のガス透過性表面、細胞を培養するための第２のガス透過性表面、及び少なくとも第１のガス透過性表面から第２のガス透過性表面まで延在する１つ以上の側壁を有するデバイス本体と、ふるいであって、第１のガス透過性表面と第２のガス透過性表面との間でデバイス本体内に配置され、それによって、デバイス本体を、（ｉ）第１のガス透過性表面、１つ以上の側壁、及びふるいによって画定される第１の区画、及び（ｉｉ）第２のガス透過性表面、１つ以上の側壁、及びふるいによって画定される第２の区画に分離する、ふるいと、第１の区画と流体連通しているアクセスポートと、第２の区画と流体連通した細胞採取出口と、を備える、組織培養デバイスと、ｂ）上記の前段落のうちのいずれかに記載の少なくとも１つの細胞培養デバイスと、を備える、システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスは、細胞培養デバイスの第１のチャンバと流体連通した入口ポートを備え、入口ポートは、組織培養デバイスの第２の区画と流体連通した細胞採取出口に流体的に接続している。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスは、垂直方向にある。

いくつかの実施形態では、本開示は、第２のガス透過性表面の断面積が、第１のガス透過性表面の断面積よりも大きい、上述の細胞を培養するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面の断面積は、第１のガス透過性表面の断面積よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい。いくつかの実施形態では、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面は、実質的に平行である。

いくつかの実施形態では、本開示は、組織培養デバイスが、外部環境と気体連通したエアフィルタをさらに備える、上述の細胞を培養するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画と流体連通した培地入口をさらに備える。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第２の区画と流体連通した廃棄出口をさらに備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を培養するためのシステムであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面が、平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第１の方向に組織培養デバイスを支持するように構成されたフレームをさらに備える、システムを提供する。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスが第１の方向にあるときに、第２のガス透過性表面は、第１のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる。いくつかの実施形態では、フレームは、平面に対して第２の方向であって、ふるいが、平面と第１のガス透過性表面との間で第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる第２の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成される。いくつかの実施形態では、フレームは、平面に対して第３の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる第３の方向で、組織培養デバイスを支持するように構成される。いくつかの実施形態では、細胞採取出口は、第３の方向での組織培養デバイスの重心と平面との間に配置される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を培養するためのシステムであって、組織培養デバイスが、組織培養デバイスを第１の方向、第２の方向、及び第３の方向に向けるように構成され、寸法決定される組織培養デバイス位置コントローラをさらに備え、第１の方向で、第１のガス透過性表面が、固定された平面及び第２のガス透過性表面に対して平行に、かつ固定された平面の上に、かつ第２のガス透過性表面の下に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、第２の方向で、ふるいが、平面と第１のガス透過性表面との間の第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、第３の方向で、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる、システムを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を培養するためのシステムであって、ふるいが、腫瘍断片が第１の区画から第２の区画へと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が第１の区画から第２の区画へと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成される、システムを提供する。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン、約２００ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、約４０ミクロン、約３０ミクロン、または約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体がふるいを介して通過するのを防止するように構成される。

いくつかの実施形態では、本開示は、第２の区画の体積が、少なくとも約１００ｍＬである、上述の細胞を培養するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、第２の区画の体積の、第１の区画の体積に対する比は、少なくとも約２：１である。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を培養するためのシステムであって、デバイス本体が、アクセスポートを備えるネック部分をさらに備え、ネック部分が、第１のガス透過性表面とふるいとの間に配置される、システムを提供する。いくつかの実施形態では、第１のガス透過性表面とふるいとの間の距離は、少なくとも約５ｃｍである。いくつかの実施形態では、第２のガス透過性表面とふるいとの間の距離は、少なくとも約５ｃｍである。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の細胞を培養するためのシステムであって、細胞培養デバイスが、ウェルと流体連通した第１の出口ポートと、第２のチャンバと流体連通した第２の出口ポートと、を備える、システムを提供する。いくつかの実施形態では、細胞を培養するためのシステムは、第１の出口ポートに流体的に接続された残存物収集デバイス、及び／または第２の出口ポートに流体的に接続された透過物収集デバイスをさらに備える。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える。いくつかの実施形態では、細胞を培養するためのシステムは、細胞培養デバイスの細胞採取出口を細胞培養デバイスの入口ポートに接続するチューブをさらに備える。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、細胞培養デバイスよりも垂直に高く位置決めされ、細胞懸濁液が、組織培養デバイスの細胞採取出口から細胞培養デバイスの入口ポートまで重力によって運ばれることを可能にする。

いくつかの実施形態では、本開示は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の細胞を培養するためのシステムを使用して、ＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することと、（ｄ）（１）以下のステップ：（ｉ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過し、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、（ｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、ここで、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、あるいは（２）以下のステップ：（ｉｉｉ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うステップであって、第１の期間中に、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張を行うステップ、（ｉｖ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過し、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、及び（ｖ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張の第２の期間が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、ここで、ステップ（ｉｉｉ）、ステップ（ｉｖ）、及びステップ（ｖ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、のうちのいずれかを行うことと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療的ＴＩＬ集団を採取することは、（３）細胞培養培地に治療的ＴＩＬ集団を懸濁させ、第２の区画において初期体積を有する細胞懸濁液を形成する、懸濁させるステップと、（４）細胞採取出口を介して第２の区画から細胞培養デバイスの入口ポートに細胞懸濁液を移すステップと、（５）細胞懸濁液を細胞培養デバイスの第１のチャンバに導入するステップと、（６）細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、細胞懸濁液の体積を、初期体積から低下させるステップと、を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の細胞を培養するためのシステムを使用して、ＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、アクセスポートを介して、組織培養デバイスの第１の区画に添加することであって、組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、第１のガス透過性表面、第２のガス透過性表面、及びふるいが、平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる第１の方向にある、添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２のＴＩＬ集団を産生することことと、（ｄ）（１）以下のステップ：（ｉ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過し、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、（ｉｉ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであっ、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、ここで、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、あるいは（２）以下のステップ：（ｉｉｉ）組織培養デバイスを、平面に対して第２の方向であって、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面が、第１の方向に対して反転した位置にある第２の方向に回転させることによって、第２のＴＩＬ集団をふるいを介して第２の区画に濾過し、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、第２の区画中の第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、（ｉｖ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うステップであって、第１の期間中に、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第２の拡張を行うステップ、及び（ｖ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって、第２の区画において第２の拡張の第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、第２の拡張が、組織培養デバイスの第２のガス透過性表面上で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、ここで、ステップ（ｉｉｉ）、ステップ（ｉｖ）、及びステップ（ｖ）が、組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、のうちのいずれかを行うことと、（ｅ）ステップ（ｄ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、採取することは、（３）細胞培養培地に治療的ＴＩＬ集団を懸濁させ、第２の区画において初期体積を有する細胞懸濁液を形成する、懸濁させるステップと、（４）細胞採取出口を介して第２の区画から細胞培養デバイスの入口ポートに細胞懸濁液を移すステップと、（５）細胞懸濁液を細胞培養デバイスの第１のチャンバに導入するステップと、（６）細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、細胞懸濁液の体積を、初期体積から低下させるステップと、を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、細胞懸濁液を第１のチャンバに導入する前に、細胞培養デバイスを垂直方向に向けることをさらに含む、方法を提供する。他の実施形態では、本方法は、細胞懸濁液を第１のチャンバに導入した後に、細胞培養デバイスを垂直方向に向けることを含む。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液の細胞が、第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを防止する。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを拡張する方法は、細胞培養培地を細胞培養デバイスの第２のチャンバから除去することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞懸濁液の体積が、初期体積から最終体積まで低下する、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法を提供する。いくつかの実施形態では、最終体積は、細胞培養デバイスのウェル中に保持することができる液体の所定の体積とほぼ等しい。いくつかの実施形態では、初期体積の、最終体積に対する比が、約１．５～約１５である。いくつかの実施形態では、ＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法は、細胞懸濁液の体積が最終体積まで低下した後に、細胞培養デバイスの第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することは、第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに細胞懸濁液を移すことを含む。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、ステップ（ｅ）が、細胞培養培地に治療的ＴＩＬ集団を懸濁させる前に、第２の区画と流体連通した廃棄出口を介して第２の区画から細胞培養培地の一部分を除去することをさらに含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養培地の一部分を除去することは、組織培養デバイスが第２の方向にある間に、廃棄出口の場所に基づいて細胞培養培地を所定のレベルまで排出させることを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｅ）は、第２の区画から細胞培養デバイスの入口ポートに細胞懸濁液を移す前に、組織培養デバイスを平面に対して第３の方向に回転させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスが第３の方向にあるときに、第１のガス透過性表面及び第２のガス透過性表面は、平面に対して平行ではない角度で位置決めされる。いくつかの実施形態では、組織培養デバイスが第３の方向にある間に、細胞懸濁液は、第２の区画から細胞培養デバイスの入口ポートに重力によって移される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、ステップ（ｄ）（１）において、第２の拡張が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、ステップ（ｄ）（２）において、第２の拡張の第１の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、第２の拡張の第２の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２を補充することによって行われる、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、ステップ（ｄ）（２）において、第２の拡張の第１の期間が、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、第２の拡張の第２の期間を開始する前に、細胞培養培地の少なくとも一部分が、第２の区画から除去され、ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地が、第２の区画に導入され、第３のＴＩＬ集団が、第２の拡張の第２の期間培養される、方法を提供する。

さらなる実施形態では、本開示は、組織培養デバイスであって、第１の細胞培養容器であって、第１の細胞培養容器の第１の区画と流体連通している第１のアクセスポートを備え、第１の区画が、第１の内部体積及び細胞を培養するための第１のガス透過性表面によって少なくとも部分的に画定される、第１の細胞培養容器と、上記の前段落のうちのいずれかに記載の少なくとも１つの細胞培養デバイスと、を備える、組織培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスの内部空間は、第１の区画に流体的に接続され、細胞培養デバイスの第１の壁の内側表面は、細胞を培養するために構成された第２のガス透過性表面を備える。

いくつかの実施形態では、組織培養デバイスは、第１の細胞培養容器と細胞培養デバイスとの間の流体接続へのアクセスを提供するために第１の細胞培養容器内に配置された第２のアクセスポートを備える。いくつかの実施形態では、ふるいは、第２のアクセスポートを横切って配置される。いくつかの実施形態では、ふるいは、腫瘍断片が第１の区画から細胞培養デバイスへと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が第１の区画から細胞培養デバイスへと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成される。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン、約２００ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、約４０ミクロン、約３０ミクロン、または約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。いくつかの実施形態では、ふるいは、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の組織培養デバイスであって、細胞培養デバイスの第１の壁及び第２の壁が、可撓性であり、組織培養デバイスが、第１の壁及び第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて細胞培養デバイスの内部空間中を液体が流れるのを防止するように構成される１つ以上の解放可能な固定具をさらに備える、組織培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具の場所は、細胞培養デバイスの入口ポートとダイアフラムとの間にある。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、クランプ、クリップ、ストラップ、弾性バンド、タイ、及び／または磁気固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、細胞培養デバイスに沿った所定の場所にそれぞれ位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、細胞培養デバイス上の第１の位置から細胞培養デバイス上の第２の位置まで摺動するように構成される摺動固定具を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、摺動固定具とダイアフラムとの間に位置決めされた固定位置固定具をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞培養デバイスが、水平方向から垂直方向まで回転可能である、上述の組織培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、細胞培養デバイスが水平方向にあるときに、ダイアフラムは、第１のチャンバの上に垂直に位置決めされ、第２のチャンバは、ダイアフラムの上に垂直に位置決めされる。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述の組織培養デバイスであって、細胞培養デバイスの第１のチャンバが、残存物収集デバイスに流体的に接続され、細胞培養デバイスの第２のチャンバが、透過物収集デバイスに流体的に接続される、組織培養デバイスを提供する。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、（例えば、細胞洗浄のために構成された）ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える。

さらなる実施形態では、本開示は、上記の前段落のうちのいずれかに記載の組織培養デバイスを使用して、ＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法であって、（ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、（ｂ）腫瘍断片または消化物を、第１のアクセスポートを介して組織培養デバイスの第１の区画に添加することと、（ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、第１の拡張が、組織培養デバイスの第１のガス透過性表面上で行われる、第２のＴＩＬ集団を産生すると、（ｄ）第２のＴＩＬ集団を細胞培養デバイスの内部空間に移すことであって、それによって、第１の区画中の腫瘍断片または消化物の嵩高い破片を、細胞培養デバイス中の第２のＴＩＬ集団から分離する、移すことと、（ｅ）第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、細胞培養デバイスが水平方向にある間に、第２の拡張が、第２のガス透過性表面上で行われる、第３のＴＩＬ集団を産生することと、（ｆ）ステップ（ｅ）から取得された治療的ＴＩＬ集団を採取することと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行は、組織培養デバイスを開くことなく行われ、及び／またはステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行は、組織培養デバイスを開くことなく行われ、及び／またはステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行は、組織培養デバイスを開くことなく行われ、及び／またはステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、組織培養デバイスを開くことなく行われる。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行、ステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行、及びステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行は、組織培養デバイスを開くことなく行われる。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法であって、ステップ（ｆ）において治療的ＴＩＬ集団を採取することは、（１）細胞培養培地に治療的ＴＩＬ集団を懸濁させ、初期体積を有する細胞懸濁液を形成する、懸濁させるステップと、（２）細胞培養デバイスを水平方向から垂直方向まで回転させるステップであって、細胞懸濁液が、細胞培養デバイスの第１のチャンバを少なくとも部分的に充填する、回転させるステップと、（３）細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに、細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、ダイアフラムの第２のセクションを介して第１のチャンバから第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、細胞懸濁液の体積を、初期体積から低下させるステップと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法であって、細胞培養デバイスの第１の壁及び第２の壁が、可撓性であり、本方法が、１つ以上の解放可能な固定具を適用して、第１の壁及び第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて細胞培養デバイスの内部空間中をＴＩＬ及び／または細胞培養培地が流れるのを防止することも含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具を適用することは、上述の方法ステップ（ａ）～（ｄ）のうちのいずれか１つの前に行われる。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、内部空間の近位端と１つ以上の解放可能な固定具の場所との間に配置される第２のガス透過性表面上で行われる。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、内部空間の近位端とダイアフラムとの間の細胞培養デバイスに沿って所定の場所に各々位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、所定の順序で複数の解放可能な固定具を解放して、第２の拡張中にＴＩＬを拡張するために利用可能である第２のガス透過性表面の領域を増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、少なくとも第１の期間及び第２の期間行われ、複数の解放可能な固定具のうちの第１のものは、第１の期間の後に解放され、複数の解放可能な固定具のうちの第２のものは、第２の期間の後に解放される。いくつかの実施形態では、第２の拡張の第１の期間は、第２のＴＩＬ集団の細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、複数の解放可能な固定具のうちの第１のものが解放される前に、第２の拡張の第１の期間からの細胞培養培地の少なくとも一部分は、細胞培養デバイスの内部空間から除去され、複数の解放可能な固定具のうちの第１のものが解放された後に、ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地は、細胞培養デバイスの内部空間に導入され、第３のＴＩＬ集団が、第２の拡張の第２の期間培養される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法であって、１つ以上の解放可能な固定具が、細胞培養デバイス上の第１の位置から細胞培養デバイス上の第２の位置まで摺動するように構成される摺動固定具を含み、第２の拡張中にＴＩＬを拡張するために利用可能である第２のガス透過性表面の領域を増加させる、方法を提供する。いくつかの実施形態では、第２の拡張は、少なくとも第１の期間及び第２の期間行われ、摺動固定具は、第１の期間の後に第１の位置から第２の位置まで摺動し、第２の期間は、摺動固定具が第２の位置まで摺動した後に行われる。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具は、摺動固定具とダイアフラムとの間に位置決めされた固定位置固定具をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能なファスナーの各々は、細胞懸濁液の体積を低下させる前に解放される。いくつかの実施形態では、１つ以上の解放可能な固定具の各々は、細胞培養デバイスを水平方向から垂直方向に回転させる前に解放される。

いくつかの実施形態では、本開示は、上述のＴＩＬを治療的ＴＩＬ集団に拡張するさらなる方法であって、本方法が、細胞懸濁液の体積を低下させている間、または低下させた後に、液体を細胞培養デバイスの第２のチャンバから除去することも含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞懸濁液の体積は、初期体積から最終体積まで低下する。いくつかの実施形態では、最終体積は、ウェル中に保持することができる液体の所定の体積とほぼ等しい。いくつかの実施形態では、初期体積の、最終体積に対する比が、約１．５～約１５である。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞懸濁液の体積が最終体積まで低下した後に、細胞培養デバイスの第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のチャンバから細胞懸濁液を除去することは、第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに細胞懸濁液を移すことを含む。いくつかの実施形態では、残存物収集デバイスは、ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える。

患者を治療する追加の方法
治療方法は、最初のＴＩＬ収集及びＴＩＬの培養から始まる。かかる方法は両方とも、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２，３５（３）：２８３－２９２によって当該技術分野で説明されている。治療方法の実施形態は、以下のセクション全体に記載されている。

本明細書に記載の方法に従って、例えば、上記のステップＡ～Ｆに記載されるように、または上記のステップＡ～Ｆに従って（また例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃに示されるように）産生される拡張ＴＩＬは、がんを有する患者の治療における特定の用途を見出す（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６， ３４（２０）：２３８９－２３９、及び補充内容に記載される）。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、以前に記載されたように、転移性黒色腫の切除された沈着物から成長させた（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｕｄｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２００３，２６：３３２－３４２を参照されたい）。新鮮な腫瘍は、滅菌条件下で解剖され得る。代表的な試料は、正式な病理学的分析のために収集され得る。２ｍｍ^３～３ｍｍ^３の単一断片が使用され得る。いくつかの実施形態では、患者当たり５、１０、１５、２０、２５、または３０個の試料が取得される。いくつかの実施形態では、患者当たり２０、２５、または３０個の試料が取得される。いくつかの実施形態では、患者当たり２０、２２、２４、２６、または２８個の試料が取得される。いくつかの実施形態では、患者当たり２４個の試料が取得される。試料は、２４ウェルプレートの個々のウェルに入れ、高用量ＩＬ－２（６，０００ＩＵ／ｍＬ）を含む成長培地中で維持し、腫瘍の破壊及び／またはＴＩＬの増殖をモニターすることができる。処理後に生細胞が残っている腫瘍は、本明細書に記載されるように、単一細胞懸濁液中に酵素的に消化され、凍結保存され得る。

いくつかの実施形態では、成功裏に成長したＴＩＬは、表現型分析（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ５６）のためにサンプリングされ、利用可能な場合、自己腫瘍に対して試験され得る。一晩の共培養によりインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）レベルが２００ｐｇ／ｍＬを超え、バックグラウンドの２倍になった場合、ＴＩＬは反応性があるとみなされ得る。（Ｇｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１０，３３：８４０－８４７、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、自己反応性または十分な成長パターンの証拠を有する培養物は、急速拡張（ＲＥＰ）と称されることもある第２の拡張を含む、第２の拡張（例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＤに従って提供される第２の拡張）のために選択され得る。いくつかの実施形態では、高い自己反応性（例えば、第２の拡張中の高い増殖）を有する拡張ＴＩＬが、追加の第２の拡張のために選択される。いくつかの実施形態では、高い自己反応性（例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＤで提供されるような第２の拡張中の高い増殖）を有するＴＩＬが、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＤに従う追加の第２の拡張のために選択される。

いくつかの実施形態では、患者は、ＡＣＴ（養子細胞移植）に直接移動されず、例えば、いくつかの実施形態では、腫瘍採取及び／または第１の拡張後、細胞はすぐには利用されない。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、凍結保存され、患者への投与の２日前に解凍され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、凍結保存され、患者への投与の１日前に解凍され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、凍結保存され、患者への投与の直前に解凍され得る。

注入バッグＴＩＬの凍結保存試料の細胞表現型は、表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＣＲ７、及びＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）のフローサイトメトリー（例えば、ＦｌｏｗＪｏ）、ならびに本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって分析され得る。血清サイトカインは、標準的な酵素結合免疫吸着アッセイ技術を使用することにより測定され得る。血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、１００ｐｇ／ｍＬを超えると定義することができ、血清ＩＦＮ－ｇのベースラインレベルよりも少なくとも４倍、または少なくとも３倍、または少なくとも２倍、または少なくとも１倍高い。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、１０００ｐｇ／ｍＬを超えると定義することができる。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、２００ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、２５０ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、３００ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、３５０ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、４００ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、４５０ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、５００ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、５５０ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、６００ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、６５０ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、７００ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、７５０ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、８００ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、８５０ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、９００ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、９５０ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。いくつかの実施形態では、血清ＩＦＮ－ｇの上昇は、１０００ｐｇ／ｍＬを超えると定義される。

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に例示される方法によって産生されるＴＩＬは、ＴＩＬの臨床的有効性の驚くべき改善を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法、例えば図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に例示される方法によって産生されるＴＩＬは、本明細書に記載されるもの以外の方法、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に例示されるもの以外の方法によって産生されるＴＩＬと比較して、増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるもの以外の方法は、プロセス１Ｃ及び／または第１世代（Ｇｅｎ １）と称される方法を含む。いくつかの実施形態では、増加した有効性は、ＤＣＲ、ＯＲＲ、及び／または他の臨床応答によって測定される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に例示される方法によって産生されるＴＩＬＳは、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に例示されるもの以外の方法、例えば、Ｇｅｎ １プロセスを含む本明細書に記載されるもの以外の方法によって産生されるＴＩＬと比較して、同様の応答時間及び安全性プロファイルを示す。

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＴＩＬで治療された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性なＴＩＬを示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能の別の尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象のエクスビボでの血液、血清、またはＴＩＬ中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することによって測定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者における治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍、またはそれより多く増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、３倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、４倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象のエクスビボでのＴＩＬにおいて測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象の血液において測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象のエクスビボでのＴＩＬ血清において測定される。

いくつかの実施形態では、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬは、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に例示されないもの、例えば、プロセス１Ｃ法と称される方法を含む他の方法によって産生されるＴＩＬと比較して、増加したポリクローン性を示す。いくつかの実施形態では、有意に改善されたポリクローン性及び／または増加したポリクローン性は、治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性の増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬの投与に関する治療有効性を示すことができる。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０００倍増加する。

有効性の尺度には、当該技術分野で知られており、本明細書にも記載されている、疾患制御率（ＤＣＲ）及び全応答率（ＯＲＲ）が含まれ得る。

がん及び他の疾患を治療する方法
本明細書に記載の組成物及び方法は、疾患を治療するための方法で使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、過剰増殖性障害の治療に使用するためのものである。本明細書に記載の組成物及び方法は、本明細書及び以下の段落に記載される他の障害の治療にも使用され得る。

いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、がんである。いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、固形腫瘍がんである。いくつかの実施形態では、固形腫瘍がんは、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、胃腸癌、黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭腫ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、腎癌、及び腎細胞癌からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、血液学的悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、固形腫瘍がんは、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫からなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、がんは、超変異癌表現型である。超変異癌は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ，１７１：１０４２－１０５６（２０１７）、参照により全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる）に広範囲に記載される。いくつかの実施形態では、超変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり９～１０個の変異を含む。いくつかの実施形態では、小児超変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり９．９１個の変異を含む。いくつかの実施形態では、成人超変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり９個の変異を含む。いくつかの実施形態では、増強された超変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１０～１００個の変異を含む。いくつかの実施形態では、増強された小児超変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１０～１００個の変異を含む。いくつかの実施形態では、増強された成人超変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１０～１００個の変異を含む。いくつかの実施形態では、超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１００個を超える変異を含む。いくつかの実施形態では、小児超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１００個を超える変異を含む。いくつかの実施形態では、成人超高頻度変異腫瘍は、１メガベース（Ｍｂ）当たり１００個を超える変異を含む。

いくつかの実施形態では、超変異腫瘍は、複製修復経路に変異を有する。いくつかの実施形態では、超変異腫瘍は、複製修復関連ＤＮＡポリメラーゼに変異を有する。いくつかの実施形態では、超変異腫瘍は、マイクロサテライト不安定性を有する。いくつかの実施形態では、超高頻度変異腫瘍は、複製修復関連ＤＮＡポリメラーゼに変異を有し、マイクロサテライト不安定性を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍における超変異は、免疫チェックポイント阻害剤への応答と相関している。いくつかの実施形態では、超変異腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤での治療に耐性である。いくつかの実施形態では、超変異腫瘍は、本発明のＴＩＬを使用して治療され得る。いくつかの実施形態では、腫瘍における超変異は、環境要因（外因性曝露）によって引き起こされる。例えば、紫外線光は、悪性黒色腫における多数の変異の主な原因であり得る（例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ｇ．Ｐ．，Ｙｏｕ，Ｙ．Ｈ．、及びＢｅｓａｒａｔｉｎｉａ，Ａ．（２００５）．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．５７１，１９－３１、Ｓａｇｅ，Ｅ．（１９９３）．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．５７，１６３－１７４を参照されたい）。いくつかの実施形態では、腫瘍における超変異は、直接的な変異原曝露に起因する、肺腫瘍及び喉頭腫瘍、ならびに他の腫瘍の場合、タバコの煙中の６０を超える発がん物質によって引き起こされ得る（例えば、Ｐｌｅａｓａｎｃｅ，Ｅ．Ｄ．，Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｏ’Ｍｅａｒａ，Ｓ．，ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｅｙｎｅｒｔ，Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｅａｒｅ，Ｄ．，Ｌａｕ，Ｋ．Ｗ．，Ｇｒｅｅｎｍａｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｎａｔｕｒｅ ４６３，１８４－１９０を参照されたい）。いくつかの実施形態では、腫瘍における超変異は、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーメンバーの調節不全によって引き起こされ、これは、広範囲のがんにおいてＣからＴへの移行のレベルの増加を引き起こすことが示されている（例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．Ａ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｍ．Ｓ．，Ｋｌｉｍｃｚａｋ，Ｌ．Ｊ．，Ｇｒｉｍｍ，Ｓ．Ａ．，Ｆａｒｇｏ，Ｄ．，Ｓｔｏｊａｎｏｖ，Ｐ．，Ｋｉｅｚｕｎ，Ａ．，Ｋｒｙｕｋｏｖ，Ｇ．Ｖ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｓａｋｓｅｎａ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４５，９７０－９７６を参照されたい）。いくつかの実施形態では、腫瘍における超変異は、主要な複製酵素Ｐｏｌ３及びＰｏｌｄ１によって行われる校正を損なう変異によるＤＮＡ複製修復欠陥によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、腫瘍における超変異は、結腸直腸癌、子宮内膜癌、及び他のがんにおける超変異に関連するＤＮＡミスマッチ修復の欠陥によって引き起こされる（例えば、Ｋａｎｄｏｔｈ，Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｎ．，Ｃｈｅｒｎｉａｃｋ，Ａ．Ｄ．，Ａｋｂａｎｉ，Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｓｈｅｎ，Ｈ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ａ．Ｇ．，Ｐａｓｈｔａｎ，Ｉ．，Ｓｈｅｎ，Ｒ．，Ｂｅｎｚ，Ｃ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．；（２０１３）．Ｎａｔｕｒｅ ４９７，６７－７３．、Ｍｕｚｎｙ，Ｄ．Ｍ．，Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ，Ｍ．Ｎ．，Ｃｈａｎｇ，Ｋ．，Ｄｉｎｈ，Ｈ．Ｈ．，Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ａ．，Ｆｏｗｌｅｒ，Ｇ．，Ｋｏｖａｒ，Ｃ．Ｌ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｌ．Ｒ．，Ｍｏｒｇａｎ，Ｍ．Ｂ．，Ｎｅｗｓｈａｍ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．；（２０１２）．Ｎａｔｕｒｅ ４８７，３３０－３３７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ複製修復変異は、構成的または二対立遺伝子ミスマッチ修復欠損症（ＣＭＭＲＤ）、リンチ症候群、及びポリメラーゼ校正関連ポリポーシス（ＰＰＡＰ）などのがん好発症候群にも見られる。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、がんは、超変異癌である。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、がんは、増強された超変異癌である。いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、がんは、超高頻度変異癌である。

いくつかの実施形態では、本発明は、ＴＩＬ集団でがんを治療する方法を含み、患者は、本開示によるＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前治療される。いくつかの実施形態では、骨髄非破壊的化学療法は、シクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日で２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）、ならびにフルダラビン２５ｍｇ／ｍ^２／日で５日間（ＴＩＬ注入の２７日前～２３日前）である。いくつかの実施形態では、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は、生理学的許容範囲まで８時間毎に７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ－２の静脈内注入を受ける。

示される疾患または障害の治療、予防、及び／または管理における本明細書に記載の化合物及び化合物の組み合わせの有効性は、ヒト疾患の治療のためのガイダンスを提供する当技術分野で知られている様々なモデルを使用して試験され得る。例えば、卵巣癌の治療の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Ｍｕｌｌａｎｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２０１２，１５３，１５８５－９２、及びＦｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｖａｒｉａｎ Ｒｅｓ．２００９，２，１２に記載されている。膵臓癌の治療の有効性を決定するためのモデルは、Ｈｅｒｒｅｒｏｓ－Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１２，１８，１２８６－１２９４に記載されている。乳癌の治療の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Ｆａｎｔｏｚｚｉ，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６，８，２１２に記載されている。黒色腫の治療の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Ｄａｍｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｒｅｓ．２０１０，２３，８５３－８５９に記載されている。例えば、肺癌の治療の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Ｍｅｕｗｉｓｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００５，１９，６４３－６６４に記載されている。肺癌の治療の有効性を決定するためのモデルは、例えば、Ｋｉｍ， Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｏｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ．２００９，２，５５－６０、及びＳａｎｏ，Ｈｅａｄ Ｎｅｃｋ Ｏｎｃｏｌ．２００９，１，３２に記載されている。

いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）は、過剰増殖性障害治療の治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＴＩＬで治療された対象の血液中のＩＦＮ－γは、活性なＴＩＬを示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ産生の効力アッセイが用いられる。ＩＦＮ－γ産生は、細胞傷害能の別の尺度である。ＩＦＮ－γ産生は、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬで治療された対象の血液中のサイトカインＩＦＮ－γのレベルを決定することによって測定することができる。いくつかの実施形態では、本方法によって取得されたＴＩＬは、例示された図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）及び本明細書全体に例示されるように、Ｇｅｎ３プロセスと称される方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された対象と比較して、本方法のＴＩＬで治療された対象の血液中の増加したＩＦＮ－γを提供する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γの増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者における治療有効性を示す。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍、２倍、３倍、４倍、または５倍、またはそれより多く増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、３倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、４倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γ分泌は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５倍増加する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキットを使用して測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者由来のエクスビボでのＴＩＬ中で測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者由来の血液中で測定される。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－γは、本発明の方法によって産生されたＴＩＬで治療された患者由来の血清中で測定される。

いくつかの実施形態では、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に記載されるものを含む、本発明の方法によって調製されたＴＩＬは、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に例示されないもの、例えば、プロセス１Ｃ法と称される方法を含む他の方法によって産生されるＴＩＬと比較して、増加したポリクローン性を示す。いくつかの実施形態では、有意に改善されたポリクローン性及び／または増加したポリクローン性は、がん治療に対する治療有効性及び／または増加した臨床的有効性を示す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、Ｔ細胞レパートリーの多様性を指す。いくつかの実施形態では、ポリクローン性の増加は、本発明の方法によって産生されたＴＩＬの投与に関する治療有効性を示すことができる。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬと比較して、１倍、２倍、１０倍、１００倍、５００倍、または１０００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、２倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、５００倍増加する。いくつかの実施形態では、ポリクローン性は、未治療の患者と比較して、及び／または例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に具体化されるもの以外の方法を含む、本明細書に提供されるもの以外の方法を使用して調製されたＴＩＬで治療された患者と比較して、１０００倍増加する。

同時投与の方法
いくつかの実施形態では、例えば、図１（特に、例えば図１Ｂ及び／または図１Ｃ）のステップＡ～Ｆに記載される方法に由来するＴＩＬを含む、本明細書に記載されるように産生されたＴＩＬは、以下に記載される抗体などの１つ以上の免疫チェックポイント調節因子と組み合わせて投与され得る。例えば、ＰＤ－１を標的とし、本発明のＴＩＬとともに同時投与され得る抗体としては、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ラムブロリズマブ、ＭＫ０３４７５またはＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、ヒト化抗ＰＤ－１抗体ＪＳ００１（ＳｈａｎｇＨａｉ ＪｕｎＳｈｉ）、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ，Ｉｎｃ．）、ピジリズマブ（抗ＰＤ－１ ｍＡｂ ＣＴ－０１１、Ｍｅｄｉｖａｔｉｏｎ）、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体ＢＧＢ－Ａ３１７（ＢｅｉＧｅｎｅ）、及び／または抗ＰＤ－１抗体ＳＨＲ－１２１０（ＳｈａｎｇＨａｉ ＨｅｎｇＲｕｉ）、ヒトモノクローナル抗体ＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ヒトモノクローナル抗体ＭＤＸ－１１０６（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、及び／またはヒト化抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４抗体ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１抗体は、クローン：ＲＭＰ１－１４（ラットＩｇＧ）－ＢｉｏＸｃｅｌｌカタログ番号ＢＰ０１４６に由来する。本明細書に記載のステップＡ～Ｆに従って産生されたＴＩＬとの同時投与方法における使用に好適な他の好適な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，００８，４４９号に開示される抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１との相互作用を阻害し、それにより免疫活性を増加させる。ＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激する当該技術分野で知られているいずれの抗体も、本明細書に記載のステップＡ～Ｆに従って産生されたＴＩＬとの同時投与方法における使用に好適である。例えば、ＰＤ－Ｌ１を標的とし、かつ臨床試験中である抗体には、ＢＭＳ－９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）及びＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が含まれる。ＰＤ－Ｌ１を標的とする他の好適な抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９４３，７４３号に開示されている。ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用を破壊し、かつ抗腫瘍免疫応答を刺激するいずれの抗体も、本明細書に記載のステップＡ～Ｆに従って産生されたＴＩＬとの同時投与方法における使用に好適であることが当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態では、ステップＡ～Ｆに従って産生されたＴＩＬの組み合わせを投与された対象は、患者が抗ＰＤ－１抗体単独の投与に不応性であるがん型を有する場合、抗ＰＤ－１抗体と同時投与される。いくつかの実施形態では、患者が難治性黒色腫を有する場合、患者は、ＴＩＬを抗ＰＤ－１と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、患者が非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する場合、患者は、ＴＩＬを抗ＰＤ－１と組み合わせて投与される。

養子細胞移植
養子細胞移植（ＡＣＴ）は、免疫療法の効果的な形態であり、抗腫瘍活性を有する免疫細胞のがん患者への移植を伴う。ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球のインビトロでの特定、これらの細胞のインビトロでの大きな数への拡張、及びがんを有する宿主へのそれらの注入を含む治療アプローチである。養子移植に使用されるリンパ球は、切除された腫瘍（腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬ）の間質に由来し得る。ＡＣＴのためのＴＩＬは、本明細書に記載されるように調製され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、例えば、図１（特に、例えば、図１Ｂ及び／または図１Ｃ）に記載の方法に従って調製される。それらは、抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作されている場合、混合リンパ球腫瘍細胞培養物（ＭＬＴＣ）が豊富である場合、または自己抗原提示細胞及び腫瘍由来ペプチドを使用してクローン化される場合、血液に由来し得るか、またはそれらからのものであってもよい。リンパ球が、注入されるがんを有する宿主に由来するＡＣＴは、自己ＡＣＴと呼ばれる。米国公開第２０１１／００５２５３０号は、主に転移性黒色腫に罹患している患者の治療のために、がんの退縮を促進するための養子細胞療法を行うための方法に関するものであり、これらの方法について参照によりその全体が組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、本明細書に記載されるように投与され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬは、単回用量で投与され得る。かかる投与は、注射、例えば、静脈内注射によるものであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＬ及び／または細胞傷害性リンパ球は、複数回用量で投与され得る。投薬は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または６回より多くてもよい。投薬は、月１回、２週間に１回、週１回、または隔日に１回であり得る。ＴＩＬ及び／または細胞傷害性リンパ球の投与は、必要な限り継続することができる。

追加の治療方法
他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団、または治療上有効な投与量の、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されているように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与に続いて、２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間のフルダラビンを投与するステップを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、対象にＴＩＬ細胞を投与した翌日に開始する、高用量のＩＬ－２レジメンで対象を治療するステップをさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、許容範囲まで８時間毎に１５分間のボーラス静脈内注入として投与される６００，０００または７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが固形腫瘍であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭癌ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、または腎細胞癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、及び胃腸癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんがＨＮＳＣＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが子宮頸癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんがＮＳＣＬＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが胃腸癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが超変異癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが小児超変異癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のがんを有する対象を治療するための方法を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の治療的ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法で使用するための、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、がんを有する対象を治療するための方法で使用するための、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を対象に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与に続いて、２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間のフルダラビンを投与するステップを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ＴＩＬ細胞を患者に投与した翌日から開始する、高用量ＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、許容範囲まで８時間毎に１５分間のボーラス静脈内注入として投与される６００，０００または７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが固形腫瘍であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭癌ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、または腎細胞癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、及び胃腸癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんがＨＮＳＣＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが子宮頸癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんがＮＳＣＬＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが胃腸癌であるように修正された、記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが超変異癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが小児超変異癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の治療的ＴＩＬ集団を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法における上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与することを含む、対象におけるがんを治療する方法における上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンを対象に投与することと、次いで治療上有効な投与量の、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団または治療上有効な投与量の、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物を対象に投与することとを含む、対象におけるがんを治療する方法における上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団、または上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、治療上有効な投与量の治療的ＴＩＬ集団または治療上有効な投与量のＴＩＬ組成物を対象に投与する前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが対象に投与されるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、骨髄非破壊的リンパ球枯渇レジメンが、６０ｍｇ／ｍ^２／日の用量で２日間のシクロホスファミドの投与に続いて、２５ｍｇ／ｍ^２／日の用量で５日間のフルダラビンを投与するステップを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、ＴＩＬ細胞を患者に投与した翌日から開始する、高用量ＩＬ－２レジメンで患者を治療するステップをさらに含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団の使用、または上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載のＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、高用量ＩＬ－２レジメンが、許容範囲まで８時間毎に１５分間のボーラス静脈内注入として投与される６００，０００または７２０，０００ＩＵ／ｋｇを含むように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが固形腫瘍であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、膀胱癌、乳癌、ヒト乳頭癌ウイルスによって引き起こされるがん、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）を含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、胃腸癌、腎癌、または腎細胞癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、ＮＳＣＬＣ、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）、及び胃腸癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが黒色腫であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんがＨＮＳＣＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが子宮頸癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんがＮＳＣＬＣであるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが神経膠芽細胞腫（ＧＢＭを含む）であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが胃腸癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが超変異癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

他の実施形態では、本発明は、がんが小児超変異癌であるように修正された、上記の該当する前段落のうちのいずれかに記載の治療的ＴＩＬ集団またはＴＩＬ組成物の使用を提供する。

本明細書に包含される実施形態は、ここで以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書に包含される本開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。

実施例１：ＲＥＰ前プロセス及びＲＥＰプロセスのための培地の調製
この実施例は、様々な固体腫瘍に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の培養を含むプロトコルで使用するための組織培養培地の調製手順を説明する。この培地を、本出願及び実施例に記載のＴＩＬのうちのいずれかの調製に使用することができる。

ＣＭ１の調製。以下の試薬を冷蔵から取り出し、３７℃の水浴（ＲＰＭＩ１６４０、ヒトＡＢ血清、２００ｍＭ Ｌ－グルタミン）中で温めた。ろ過される容量に適した０．２μｍフィルターユニットの上部に各成分を添加することによって、以下の表３４に従ってＣＭ１培地を調製した。４℃で保存する。

使用日に、３７℃の水浴中で必要量のＣＭ１を事前に温め、６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を添加した。

表３５に従って、必要に応じて追加の補充を行ってもよい。

ＣＭ２の調製
調製したＣＭ１を冷蔵庫から取り出すか、新鮮なＣＭ１を調製する。ＡＩＭ－Ｖ（登録商標）を冷蔵庫から取り出し、調製したＣＭ１を滅菌培地ボトル内で等体積のＡＩＭ－Ｖ（登録商標）と混合することによって、必要な量のＣＭ２を調製した。使用日に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２をＣＭ２培地に追加した。使用日に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む十分な量のＣＭ２を作製した。ＣＭ２培地ボトルにその名前、調製者のイニシャル、濾過／調製日、２週間の有効期限をラベル付けし、組織培養に必要になるまで４℃で保存した。

ＣＭ３の調製
使用が必要になった日にＣＭ３を調製した。ＣＭ３は、ＡＩＭ－Ｖ（登録商標）培地と同じであり、使用日に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した。ＩＬ－２ストック溶液をＡＩＭ－Ｖのボトルまたはバッグに直接追加することによって、実験のニーズに十分な量のＣＭ３を調製した。穏やかに振盪することによって十分に混合した。ボトルに、ＡＩＭ－Ｖに追加した直後に「３０００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２」とラベル付けする。過剰なＣＭ３が存在する場合は、培地名、調製者のイニシャル、培地を調製した日、及びその有効期限（調製後７日）でラベル付けしたボトル内で４℃で保管した。４℃で７日間保管した後、ＩＬ－２を補充した培地を廃棄した。

ＣＭ４の調製
ＣＭ４は、ＣＭ３と同じであり、２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（最終濃度）を追加で補充した。１ＬのＣＭ３毎に、１０ｍＬの２００ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）を添加する。ＩＬ－２ストック溶液及びＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）ストック溶液をＡＩＭ－Ｖのボトルまたはバッグに直接添加することによって、実験のニーズに十分な量のＣＭ４を調製した。穏やかに振盪することによって十分に混合した。ボトルに、ＡＩＭ－Ｖに添加した直後に「３０００ ＩＬ／ｍＬ ＩＬ－２及びＧｌｕｔａＭＡＸ」とラベル付けした。過剰なＣＭ４が存在する場合、培地名、「ＧｌｕｔａＭＡＸ」、及びその有効期限（調製後７日）をラベル付けしたボトル内で４℃で保管した。４℃で７日間より長く保管した後、ＩＬ－２を補充した培地を廃棄した。

実施例２：ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１サイトカインカクテルの使用
この実施例は、本明細書の実施例のいずれかのＴＩＬプロセスと組み合わせた、追加のＴ細胞成長因子として機能するＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１サイトカインの使用を説明する。

本明細書に記載のプロセスを使用して、ＴＩＬは、培養の開始時に、実験の一方のアームにおいてＩＬ－２の存在下で腫瘍から、及びもう一方のアームではＩＬ－２の代わりにＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１の組み合わせから成長させることができる。ＲＥＰ前の完了時に、培養物を、拡張、表現型、機能（ＣＤ１０７ａ＋及びＩＦＮ－γ）、及びにＴＣＲ Ｖβレパートリーについて評価した。ＩＬ－１５及びＩＬ－２１は、本明細書の他の場所及びＳａｎｔｅｇｏｅｔｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２０１３，１１，３７に記載されている。

結果は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１処理条件でのＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋細胞の両方で、ＩＬ－２のみの条件と比較して、増強したＴＩＬ拡張（＞２０％）が観察できることを示し得る。ＩＬ－２単独培養物と比較して、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１で処理した培養物から取得されたＴＩＬには、歪んだＴＣＲ Ｖβレパートリーを伴う主にＣＤ８^＋集団への歪みがあった。ＩＦＮ－γ及びＣＤ１０７ａは、ＩＬ－２のみで処理されたＴＩＬと比較して、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１で処理されたＴＩＬで上昇した。

実施例３：ガンマ線照射末梢単核細胞の個々のロットを適格性確認する
この実施例は、本明細書に記載の例示的な方法において同種異系フィーダー細胞として使用するためのガンマ線照射末梢単核細胞（ＰＢＭＣ、単核細胞またはＭＮＣとしても知られる）の個々のロットを適格性確認するための簡略化された手順を説明する。

照射された各ＭＮＣフィーダーロットは、個々のドナーから調製した。各ロットまたはドナーは、精製された抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体及びインターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下でＲＥＰ内のＴＩＬを拡張する能力について個々にスクリーニングした。さらに、フィーダー細胞の各ロットを、ＴＩＬを添加せずに試験し、受けたガンマ線の線量がそれらを複製不全にするのに十分であることを確認した。

ＴＩＬのＲＥＰには、ガンマ線を照射し、成長を停止させたＭＮＣフィーダー細胞が必要である。フィーダーＭＮＣの膜受容体は、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）抗体に結合し、ＲＥＰフラスコ内のＴＩＬに架橋し、ＴＩＬを刺激して拡張させる。フィーダーロットは、個々のドナーから採取した全血の白血球アフェレーシスから調製した。白血球アフェレーシス産物を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ上で遠心分離し、洗浄し、照射し、ＧＭＰ条件下で凍結保存した。

ＴＩＬ療法を受けた患者には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こす可能性があるため、生存可能なフィーダー細胞を注入しないことが重要である。したがって、フィーダー細胞は、細胞にガンマ線を照射することによって成長を停止させ、再培養時に二本鎖ＤＮＡ切断が起こり、ＭＮＣ細胞の細胞生存性が喪失する。

フィーダーロットを、２つの基準：１）共培養でＴＩＬを１００倍超拡張する能力、及び２）複製不全で評価した。

フィーダーロットを、直立したＴ２５組織培養フラスコ内で成長した２つの主要なＲＥＰ前 ＴＩＬ株を利用して、ｍｉｎｉ－ＲＥＰ形式で試験した。各ＴＩＬ株は、ＲＥＰでの活性化に応答して増殖する能力が独特であるため、フィーダーロットを、２つの異なるＴＩＬ株に対して試験した。対照として、上記の基準を満たすことが歴史的に示されている多くの照射されたＭＮＣフィーダー細胞を、試験ロットと並行して実行した。

１回の実験で試験されたすべてのロットが同等の試験を受けることを保証するために、すべての条件及びすべてのフィーダーロットを試験するために、同じＲＥＰ前 ＴＩＬ株の十分なストックが利用可能であった。

試験したフィーダー細胞の各ロットに、合計６つのＴ２５フラスコがあった：ＲＥＰ前ＴＩＬ株＃１（２フラスコ）、ＲＥＰ前ＴＩＬ株＃２（２フラスコ）、及びフィーダー対照（２フラスコ）。ＴＩＬ株番号１及び番号２を含むフラスコは、フィーダーロットがＴＩＬを拡張する能力を評価した。フィーダー対照フラスコは、フィーダーロットの複製不全を評価した。

Ａ．実験プロトコル
－２／３日目、ＴＩＬ株の解凍ＣＭ２培地を調製し、ＣＭ２を３７℃の水浴中で温める。３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した４０ｍＬのＣＭ２を調製する。使用まで保温する。ＩＬ－２を含まない２０ｍＬの予熱したＣＭ２を、使用したＴＩＬ株の名前がラベル付けされた２本の５０ｍＬコニカルチューブの各々に入れる。ＬＮ２ストレージから２つの指定されたＲＥＰ前 ＴＩＬ株を取り出し、バイアルを組織培養室に移した。少量の氷が残るまで、３７℃の水浴内の密封されたジッパーストレージバッグ内にバイアルを入れて解凍した。

無菌トランスファーピペットを使用して、各バイアルの内容物を、調製した、ラベル付けされた５０ｍＬのコニカルチューブ中の２０ｍＬのＣＭ２に直ちに移した。細胞を洗浄し、４００×ＣＦで５分間遠心分離するために、ＩＬ－２なしのＣＭ２を使用して４０ｍＬにＱＳ。上清を吸引し、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で補充された５ｍＬの温かいＣＭ２に再懸濁した。

自動セルカウンターを使用して細胞を計数するために、少量のアリコート（２０μＬ）を重複して取り出した。計数を記録した。計数しながら、ＴＩＬ細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブを、加湿した３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターに入れ、ガス交換を可能にするためにキャップを緩めた。細胞濃度を決定し、ＴＩＬを、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充したＣＭ２中で１×１０^６細胞／ｍＬに希釈した。

ｍｉｎｉ－ＲＥＰの０日目まで、加湿した３７℃のインキュベーターで必要な数のウェルにおいて、２４ウェル組織培養プレートの１ウェル当たり２ｍＬで培養した。混乱及び潜在的な相互汚染を避けるために、別々の２４ウェル組織培養プレートで異なるＴＩＬ株を培養した。

０日目、Ｍｉｎｉ－ＲＥＰを開始する試験されるフィーダーロットの数に十分なＣＭ２培地を調製した。（例えば、一度に４つのフィーダーロットを試験するために、８００ｍＬのＣＭ２培地を調製した）。上記で調製したＣＭ２の一部を等分し、それに、細胞の培養のために３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した。（例えば、一度に４つのフィーダーロットを試験するために、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む５００ｍＬのＣＭ２培地を調製する）。

相互汚染を防ぐために各ＴＩＬ株を別々に操作し、ＴＩＬ培養物を入れた２４ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、ＢＳＣに移した。

無菌トランスファーピペットまたは１００～１０００μＬピペッター及びチップを使用して、約１ｍＬの培地を、使用されるＴＩＬの各ウェルから取り出し、２４ウェル組織培養プレートの未使用のウェルに入れる。

新鮮な無菌トランスファーピペットまたは１００～１０００μＬピペッター及びチップを使用して、残りの培地をウェル内のＴＩＬと混合して細胞を再懸濁し、次いで細胞懸濁液を、ＴＩＬロット名のラベルが付いた５０ｍＬコニカルチューブに移し、容量を記録した。

予備の培地でウェルを洗浄し、その容量を同じ５０ｍＬコニカルチューブに移した。細胞を４００×ＣＦで回転させて、細胞ペレットを収集する。培地上清を吸引除去し、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含有する２～５ｍＬのＣＭ２培地に細胞ペレットを再懸濁し（採取したウェルの数及びペレットのサイズに基づいて使用される容量）、容量は、１．３×１０^６細胞／ｍＬを超える濃度を保証するのに十分である必要がある。

血清学的ピペットを使用して、細胞懸濁液を十分に混合し、容量を記録した。自動セルカウンターを使用して細胞を計数するために、２００μＬを取り出した。カウントしながら、ＴＩＬ細胞を含む５０ｍＬのコニカルチューブを、加湿した５％ ＣＯ_２、３７℃インキュベーターに入れ、ガス交換を可能にするためにキャップを緩めた。計数を記録した。

ＴＩＬ細胞を含有する５０ｍＬのコニカルチューブをインキュベーターから取り出し、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で補充された温かいＣＭ２中、１．３×１０^６細胞／ｍＬの濃度でそれらの細胞を再懸濁した。キャップを緩めた状態で、５０ｍＬのコニカルチューブをインキュベーターに戻した。

第２のＴＩＬ株について、上記のステップを繰り返した。

ＴＩＬを実験用のＴ２５フラスコに入れる直前に、ＴＩＬを、以下の通り１：１０に希釈して１．３×１０^５細胞／ｍＬの最終濃度にした。

ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＣＤ３ピュア（ＯＫＴ３）作用溶液を調製するＯＫＴ３のストック溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を４℃の冷蔵庫から取り出し、ＢＳＣに入れた。ｍｉｎｉ－ＲＥＰの培地では、最終濃度３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３を使用した。

実験の各Ｔ２５フラスコ内の２０ｍＬに対して６００ｎｇのＯＫＴ３が必要であり、これは、２０ｍＬ毎に６０μＬの１０μｇ／ｍＬ溶液、または各フィーダーロットについて試験した６つのフラスコすべてで３６０μＬに相当する。

試験した各フィーダーロットについて、４００μＬの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３を、１０μｇ／ｍＬの作業濃度で作製した（例えば、４つのフィーダーロットを一度に試験する場合、１６００μＬの１：１００希釈の１ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３：１６μＬの１ｍｇ／ｍＬ ＯＫＴ３＋３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１．５８４ｍＬのＣＭ２培地を作製する）。

Ｔ２５フラスコを調製するフィーダー細胞を調製する前に、各フラスコにラベルを付け、フラスコにＣＭ２培地を充填した。フラスコを３７℃の加湿した５％ ＣＯ_２インキュベーターに入れ、残りの成分を添加するのを待つ間、培地を保温した。一旦フィーダー細胞が調製されると、各フラスコ内のＣＭ２に成分が添加される。

さらなる情報を表３６に提供する。

フィーダー細胞を調製する。このプロトコルについて試験されたロット当たり７８×１０^６フィーダー細胞の最小値が必要であった。ＳＤＢＢによって凍結された各１ｍＬバイアルは、凍結時に１００×１０^６個の生細胞を有していた。液体Ｎ_２ストレージからの解凍時の５０％の回収率を仮定すると、ロット当たり少なくとも２つの１ｍＬバイアルのフィーダー細胞を解凍して、各ＲＥＰに推定１００×１０^６個の生細胞を与えることが推奨された。あるいは、１．８ｍＬバイアルで供給された場合、１つのバイアルだけで十分なフィーダー細胞が提供された。

フィーダー細胞を解凍する前に、試験される各フィーダーロットにＩＬ－２を含まないおよそ５０ｍＬのＣＭ２を予熱した。指定されたフィーダーロットバイアルをＬＮ２ストレージから取り出し、ジッパーストレージバッグに入れ、氷上に置いた。３７℃の水浴に浸すことによって、閉じたジッパーストレージバッグ内のバイアルを解凍した。バイアルをジッパーバッグから取り出し、７０％ ＥｔＯＨでスプレーまたはワイプし、ＢＳＣに移した。

トランスファーピペットを使用して、フィーダーバイアルの内容物を、５０ｍＬのコニカルチューブ中の３０ｍＬの温かいＣＭ２に直ちに移した。バイアルを少量のＣＭ２で洗浄して、バイアル内の残留細胞を除去し、４００×ＣＦで５分間遠心分離した。上清を吸引し、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を加えた４ｍＬの温かいＣＭ２に再懸濁した。自動セルカウンターを使用して細胞を計数するために、２００μＬを取り出した。計数を記録した。

３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を加えた温かいＣＭ２中、１．３×１０^７細胞／ｍＬで細胞を再懸濁した。ＴＩＬ細胞を１．３×１０^６細胞／ｍＬから１．３×１０^５細胞／ｍＬに希釈した。

共培養物を準備する。ＴＩＬ細胞を１．３×１０^６細胞／ｍＬから１．３×１０^５細胞／ｍＬに希釈した。４．５ｍＬのＣＭ２培地を１５ｍＬのコニカルチューブに添加した。インキュベーターからＴＩＬ細胞を取り出し、１０ｍＬの血清ピペットを使用して十分に再懸濁した。１．３×１０^６細胞／ｍＬのＴＩＬ懸濁液から０．５ｍＬの細胞を取り出し、１５ｍＬのコニカルチューブ中の４．５ｍＬの培地に添加した。ＴＩＬストックバイアルをインキュベーターに戻した。よく混ぜた。第２のＴＩＬ株に対して繰り返した。

単一フィーダーロット用に予熱した培地を入れたフラスコを、インキュベーターからＢＳＣに移した。１ｍＬのピペットチップで数回上下にピペッティングすることによってフィーダー細胞を混合し、そのフィーダーロットの各フラスコに１ｍＬ（１．３×１０^７細胞）を移した。６０μＬのＯＫＴ３作用ストック（１０μｇ／ｍＬ）を各フラスコに追加した。２つの対照フラスコをインキュベーターに戻した。

各ＴＩＬロットの１ｍＬ（１．３×１０^５）を、対応するラベルの付いたＴ２５フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、直立させてインキュベートした。５日目まで乱さなかった。試験したすべてのフィーダーロットについて、この手順を繰り返した。

５日目、培地変更３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＭ２を調製した。各フラスコに１０ｍＬが必要である。１０ｍＬピペットを使用して、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１０ｍＬの温かいＣＭ２を各フラスコに移した。フラスコをインキュベーターに戻し、７日目まで直立させてインキュベートした。試験したすべてのフィーダーロットについて繰り返した。

７日目、採取インキュベーターからフラスコを取り出し、ＢＳＣに移し、フラスコの底部の細胞層を乱さないように注意する。フラスコの底部で成長する細胞を乱すことなく、各試験フラスコから１０ｍＬの培地を取り出し、対照フラスコの各々から１５ｍＬの培地を取り出した。

１０ｍＬの血清ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、よく混合して細胞の塊をすべて破壊した。ピペッティングすることによって細胞懸濁液を完全に混合した後、細胞計数のために２００μＬを取り出した。自動セルカウンター装置とともに適切な標準操作手順を使用して、ＴＩＬを計数した。７日目に計数を記録した。試験したすべてのフィーダーロットについて、この手順を繰り返した。

フィーダー対照フラスコは、複製不全について評価し、ＴＩＬを含むフラスコは、０日目からの倍率拡張について評価した。

７日目、フィーダー対照フラスコの１４日目までの継続フィーダー対照フラスコの７日目の計数を完了した後、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む１５ｍＬの新鮮なＣＭ２培地を対照フラスコの各々に追加した。対照フラスコをインキュベーターに戻し、１４日目まで直立位置でインキュベートした。

１４日目、フィーダー対照フラスコの長期非増殖インキュベーターからフラスコを取り出し、ＢＳＣに移し、フラスコの底部の細胞層を乱さないように注意した。フラスコの底部で成長する細胞を乱すことなく、各対照フラスコからおよそ１７ｍＬの培地を取り出した。５ｍＬの血清ピペットを使用して、残りの培地に細胞を再懸濁し、よく混合して細胞の塊をすべて破壊した。各フラスコについて、容量を記録した。

ピペッティングすることによって細胞懸濁液を完全に混合した後、細胞計数のために２００μＬを取り出した。ＴＩＬは、自動セルカウンター装置と併せて適切な標準操作手順を使用して計数し、計数を記録した。試験したすべてのフィーダーロットについて、この手順を繰り返した。

Ｂ．結果及び承認基準プロトコル
結果ガンマ線照射の線量は、フィーダー細胞を複製不全にするのに十分であった。すべてのロットは、評価基準を満たすことが予想され、また０日目と比較して、ＲＥＰ培養の７日目に残っているフィーダー細胞の総有効数の低減を示した。すべてのフィーダーロットは、ＲＥＰ培養の７日目までのＴＩＬ成長の１００倍拡張の評価基準を満たすことが予想された。フィーダー対照フラスコの１４日目の計数は、７日目に見られた非増殖傾向を継続すると予想された。

承認基準フィーダー細胞の各ロットについて試験された各複製ＴＩＬ株について、以下の承認基準が満たされた。承認基準は、以下の表３７に示すように、２倍であった。

３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下で培養した場合に、ＭＮＣフィーダー細胞の複製を不全にするのに十分な放射線量を評価した。複製不全は、ＲＥＰの７日目及び１４日目の自動細胞計数によって決定された総生細胞数（ＴＶＣ）によって評価した。

承認基準は、「成長なし」であり、これは、ＲＥＰの０日目に培養された最初の生細胞数から７日目及び１４日目に総生細胞数が増加していないことを意味する。

フィーダー細胞がＴＩＬ拡張をサポートする能力を評価した。ＴＩＬ成長は、ＲＥＰの０日目の培養開始からＲＥＰの７日目までの生細胞の倍率拡張の観点から測定された。自動細胞計数によって評価されるように、７日目に、ＴＩＬ培養物は最低１００倍の拡張を達成した（すなわち、ＲＥＰの０日目に培養された生ＴＩＬ細胞の総数の１００倍超）。

承認基準を満たさないＭＮＣフィーダーロットの偶発性試験ＭＮＣフィーダーロットが上で概説された承認基準のうちのいずれかを満たさなかった場合は、以下のステップを実行してロットを再試験し、単純な実験者エラーを原因として除外する。

ロットの衛星試験バイアルが２つ以上残っている場合は、ロットを再試験した。ロットの衛星試験バイアルが１つ残っているか、まったく残っていない場合、上記の承認基準に従ってロットは失敗であった。

適格となるには、問題のロット及び対照ロットが、上記の承認基準を達成する必要があった。これらの基準を満たすと、ロットは使用のために放出される。

実施例４：ＩＬ－２ストック溶液の調製
この実施例は、精製されて凍結乾燥された組換えヒトインターロイキン－２を、ｒｈＩＬ－２の使用を含むものを含む、本出願及び実施例に記載されるものすべてを含む、さらなる組織培養プロトコルでの使用に好適なストック試料に溶解するプロセスを説明する。

手順。０．２％酢酸溶液（ＨＡｃ）を調製した。２９ｍＬの滅菌水を、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。５０ｍＬのコニカルチューブに１ｍＬの１Ｎ酢酸を添加した。チューブを２～３回反転させながら十分に混合した。Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターを使用した濾過によってＨＡｃ溶液を滅菌した。

ＰＢＳ中の１％ ＨＳＡを調製する。４ｍＬの２５％ＨＳＡストック溶液を、１５０ｍＬの滅菌フィルターユニット内の９６ｍＬのＰＢＳに添加した。溶液を濾過した。４℃で保管した。調製したｒｈＩＬ－２の各バイアルについて、フォームに記入する。

ｒｈＩＬ－２ストック溶液を調製した（最終濃度６×１０^６ＩＵ／ｍＬ）。ｒｈＩＬ－２の各ロットは異なり、必要な情報は、以下のような製造業者の分析証明書（ＣＯＡ）に見出された：１）バイアル当たりのｒｈＩＬ－２の質量（ｍｇ）、２）ｒｈＩＬ－２の比活性（ＩＵ／ｍｇ）、及び３）推奨０．２％ ＨＡｃ再構成体積（ｍＬ）。

以下の等式を使用して、ｒｈＩＬ－２ロットに必要な１％ＨＳＡの体積を計算した。

例えば、ｒｈＩＬ－２ロット１０２００１２１（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）のＣＯＡによれば、１ｍｇバイアルの比活性は、２５×１０^６ＩＵ／ｍｇである。ｒｈＩＬ－２を２ｍＬの０．２％ＨＡｃ中で再構成することが推奨される。

ＩＬ－２バイアルのゴム栓をアルコールワイプで拭いた。３ｍＬシリンジに取り付けた１６Ｇ針を使用して、推奨体積の０．２％ＨＡｃをバイアルに注入した。針を抜くときに栓が外れないように注意した。バイアルを３回反転させ、すべての粉末が溶解するまで回転させた。栓を慎重に取り外し、アルコールワイプ上に置いた。計算した体積の１％ＨＳＡをバイアルに追加した。

ｒｈＩＬ－２溶液の保管。短期保管（７２時間未満）の場合、４℃でバイアルを保管した。長期保管（７２時間超）の場合、バイアルをより小さい体積に等分し、使用の準備が整うまで－２０℃でクライオバイアル内で保管した。凍結／解凍サイクルを回避した。調製日から６ヶ月後に有効期限が切れた。Ｒｈ－ＩＬ－２ラベルに、ベンダー及びカタログ番号、ロット番号、有効期限、オペレーターのイニシャル、濃度、ならびにアリコート体積を含めた。

実施例５：凍結保存プロセス
この実施例では、ＣｒｙｏＭｅｄ制御速度冷凍庫、モデル７４５４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、本明細書に記載の手順で調製したＴＩＬの凍結保存プロセス方法について説明する。

使用した機器は以下の通りであった：アルミニウムカセットホルダーラック（ＣＳ７５０フリーザーバッグに対応）、７５０ｍＬバッグ用凍結保存カセット、低圧（２２ｐｓｉ）液体窒素タンク、冷蔵庫、熱電対センサー（バッグ用リボンタイプ）、及びＣｒｙｏＳｔｏｒｅ ＣＳ７５０冷凍バッグ（ＯｒｉＧｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。

凍結プロセスは、核形成から－２０℃まで０．５℃の速度、及び－８０℃の終了温度まで毎分１℃の冷却速度を提供する。プログラムパラメータは、以下の通りである：ステップ１－４℃で待つ、ステップ２：－４℃まで１．０℃／分（試料温度）、ステップ３：－４５℃まで２０．０℃／分（チャンバ温度）、ステップ４：－１０．０℃まで１０．０℃／分（チャンバ温度）、ステップ５：－２０℃まで０．５℃／分（チャンバ温度）、及びステップ６：－８０℃まで１．０℃／分（試料温度）。

実施例６：合成培地を用いた腫瘍拡張プロセス
上記で開示されるプロセスは、ＣＭ１培地及びＣＭ２培地を、合成培地（例えば、ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、例えば、ＤＭ１及びＤＭ２を含む）で置き換えることによって行われ得る。

実施例７：凍結保存ＴＩＬ細胞療法の例示的ＧＥＮ２産生
この実施例は、Ｉｏｖａｎｃｅ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．のｃＧＭＰ製造を説明する。現在の適正組織基準及び現在の適正製造基準に従った、Ｇ－ＲＥＸフラスコ内のＴＩＬ細胞療法プロセス。この実施例は、現在の適正組織基準及び現在の適正製造基準に従った、Ｇ－ＲＥＸフラスコ内のＴＩＬ細胞療法プロセスの例示的なｃＧＭＰ製造を説明する。

０日目のＣＭ１培地の調製ＢＳＣ内で、試薬をＲＰＭＩ１６４０培地ボトルに追加した。ボトル当たり追加された以下の試薬を追加した：不活化ヒトＡＢ血清（１００．０ｍＬ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（１０．０ｍＬ）、硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ（１．０ｍＬ）、２－メルカプトエタノール（１．０ｍＬ）を加熱する

ＢＳＣから不要な材料を取り出した。ＢＳＣから培地試薬を抜き取り、配合された洗浄培地の調製のために硫酸ゲンタマイシン及びＨＢＳＳをＢＳＣの中に残した。

ＩＬ－２アリコートを解凍した。すべての氷が融解するまで、１つの１．１ｍＬのＩＬ－２アリコート（６×１０^６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍した。ＩＬ－２：ロット番号及び有効期限を記録した。

ＩＬ－２ストック溶液を培地に移した。ＢＳＣ内で、１．０ｍＬのＩＬ－２ストック溶液を、調製されたＣＭ１の０日目培地ボトルに移した。ＣＭ１の０日目培地１ボトル及びＩＬ－２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）１．０ｍＬを追加した。

Ｇ－ＲＥＸ１００ＭＣＳをＢＳＣの中に通過させた。無菌的にＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳ（Ｗ３０１３１３０）をＢＳＣの中に通過させた。

すべての完全なＣＭ１の０日目培地をＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳフラスコにポンプで注入した。組織断片円錐形またはＧＲｅｘ１００ＭＣＳ。

０日目の腫瘍洗浄培地の調製ＢＳＣ内で、５．０ｍＬのゲンタマイシン（Ｗ３００９８３２またはＷ３０１２７３５）を１本の５００ｍＬのＨＢＳＳ培地（Ｗ３０１３１２８）ボトルに追加した。ボトル当たりの追加：ＨＢＳＳ（５００．０ｍＬ）、硫酸ゲンタマイシン、５０ｍｇ／ｍＬ（５．０ｍＬ）。１Ｌの０．２２ミクロンフィルターユニット（Ｗ１２１８８１０）をとおして調製されたゲンタマイシンを含有するＨＢＳＳを濾過した。

０日目の腫瘍処理腫瘍検体を取得し、即時に処理のために２～８℃における部屋に移した。腫瘍洗浄培地を等分した。腫瘍洗浄１は、８インチ鉗子（Ｗ３００９７７１）を使用して行う。腫瘍を検体ボトルから取り出し、調製した「洗浄１」皿に移す。この後、腫瘍洗浄２及び腫瘍洗浄３が続く。腫瘍を測定し、評価した。腫瘍領域全体の３０％未満が壊死及び／または脂肪組織であることが観察されたかどうかを評価した。該当する場合、クリーンアップ解剖を行う。腫瘍が大きく、外部の組織の３０％未満が壊死／脂肪性であることが観察された場合、メス及び／または鉗子の組み合わせを使用して、腫瘍の内側構造を温存しながら壊死／脂肪組織を除去することによって、「クリーンアップ解剖」を行った。腫瘍を切除した。メス及び／または鉗子の組み合わせを使用して、腫瘍検体を均等で適切なサイズの断片（最大６つの中間断片）に切断した。中間腫瘍断片を移した。腫瘍断片を、およそ３×３×３ｍｍのサイズの小片に切除した。乾燥を防止するために中間断片を保存した。中間断片の解剖を繰り返した。収集された切片の数を決定した。望ましい組織が残っている場合、「好ましい中間断片」６ウェルプレートから追加の好ましい腫瘍片を選択し、最大５０片のために液滴を充填した。

コニカルチューブを準備した。腫瘍片を５０ｍＬのコニカルチューブに移した。Ｇ－ＲＥＸ１００ＭＣＳのためのＢＳＣを準備した。インキュベーターからＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳを取り出した。無菌的にＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳフラスコをＢＳＣの中に通過させた。腫瘍断片をＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳフラスコに追加した。切片を均等に分配した。

以下のパラメータにおいてＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳをインキュベートした：Ｇ－ＲＥＸフラスコをインキュベートした：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ_２パーセンテージ：５．０±１．５ ％ＣＯ_２．計算：培養の時間、下限＝培養の時間＋２５２時間、上限＝培養の時間＋２７６時間。

プロセスが完了した後、いずれの残りの温められた培地も廃棄し、ＩＬ－２のアリコートを解凍した。

１１日目－培地の調製インキュベーターを監視した。インキュベーターパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５ ％ＣＯ２．

３本の１０００ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地（Ｗ３０１３１１２）ボトル及び３本の１０００ｍＬのＡＩＭ－Ｖ（Ｗ３００９５０１）ボトルを、インキュベーター内で３０分間以上温めた。インキュベーターからＲＰＭＩ１６４０培地を取り出した。ＲＰＭＩ１６４０培地を調製した。培地を濾過した。３つのＩＬ－２の１．１ｍＬのアリコート（６×１０６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）を解凍した。インキュベーターからＡＩＭ－Ｖ培地を取り出した。ＩＬ－２をＡＩＭ－Ｖに追加した。１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒバッグ及びリピータポンプ移送セットを、ＢＳＣの中に無菌的に移した。

１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒ培地バッグを準備した。Ｂａｘａポンプを準備した。１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒ培地バッグを準備した。培地を１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒにポンプで注入した。Ｌａｂｔａｉｎｅｒバッグからポンプマティックを取り出した。

培地を混合した。バッグを穏やかにマッサージして混合した。試料計画に従って培地を試料採取した。２０．０ｍＬの培地を取り出し、５０ｍＬのコニカルチューブに入れた。細胞計数希釈管を準備した。ＢＳＣに、「細胞計数希釈液用」及びロット番号でラベル付けされた４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地を、４本の１５ｍＬコニカルチューブに追加した。試薬をＢＳＣから２～８℃に移した。１Ｌ移送パックを準備した。（プロセス注記５．１１に従って）ＢＳＣ溶接の外側で、「完全なＣＭ２の１１日目培地」バッグに取り付けられた移送セットへの１Ｌ移送パックを準備した。フィーダー細胞移送パックを準備した。完全なＣＭ２の１１日目培地をインキュベートした。

１１日目－ＴＩＬ採取前処理表。インキュベーターパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ_２パーセンテージ：５．０±１．５ ％ ＣＯ_２．インキュベーターからＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳを取り出した。３００ｍＬ移送パックを準備した。移送パックをＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳに溶接した。

ＴＩＬ採取及びＴＩＬ採取の開始のためにフラスコを準備する。ＴＩＬが採取された。ＧａｔｈｅＲｅｘを使用して、血液フィルターを介して細胞懸濁液を３００ｍＬの移送パックに移した。付着した細胞について膜を点検した。

フラスコ膜をすすいだ。Ｇ－ＲＥＸ１００ＭＣＳ上のクランプを閉じた。すべてのクランプが閉じられていることを確実にした。ＴＩＬ及び「上清」移送パックを熱融着した。ＴＩＬ懸濁液の体積を計算した。試料採取のために上清移送パックを準備した。

Ｂａｃ－Ｔ試料を引き出した。ＢＳＣ内で、１Ｌ「上清」移送パックからおよそ２０．０ｍＬの上清を引き上げ、無菌５０ｍＬコニカルチューブに分注する。

試料計画に従ってＢａｃＴを接種した。適切なサイズのシリンジを使用して調製されたＢａｃＴとラベル付けされた５０ｍＬコニカルから１．０ｍＬの試料を取り出し、嫌気性ボトルに接種した。

ＴＩＬをインキュベートした。必要とされるまで、ＴＩＬ移送パックをインキュベーターに入れた。細胞計数及び計算を行った。行われた細胞計数の生細胞濃度及び生存率の平均を決定した。生存率÷２。生細胞濃度÷２。計数の上限及び下限を決定した。下限：生細胞濃度の平均×０．９。上限：生細胞濃度の平均×１．１。許容限界内の両方の計数を確認した。行われた４つすべての計数から平均生細胞濃度を決定した。

ＴＩＬ懸濁液の調整された体積：細胞計数試料を取り出した後のＴＩＬ懸濁液の調整された体積を計算する。総ＴＩＬ細胞体積（Ａ）。取り出された細胞計数試料の体積（４．０ｍＬ）（Ｂ）調整された総ＴＩＬ細胞体積Ｃ＝Ａ－Ｂ。

総生ＴＩＬ細胞を計算した。平均生細胞濃度＊：総体積、総生細胞：Ｃ＝Ａ ｘ Ｂ．

フローサイトメトリーのための計算：総生ＴＩＬ細胞数が、４．０×１０^７個以上であった場合、フローサイトメトリー試料のために１．０×１０^７個の細胞を取得するための体積を計算した。

フローサイトメトリーに必要とされる総生細胞：１．０×１０^７個の細胞。フローサイトメトリーに必要とされる細胞の体積：生細胞濃度を１．０×１０^７個の細胞Ａで割ったもの。

２．０×１０^８個の生細胞に等しいＴＩＬ懸濁液の体積を計算した。必要に応じて、取り出すＴＩＬ細胞の過剰体積を計算し、過剰なＴＩＬを取り出し、必要に応じてＴＩＬをインキュベーターに入れた。必要に応じて、取り出された全過剰ＴＩＬを計算した。

凍結のための標的細胞濃度が１．０×１０^８細胞／ｍＬである過剰なＴＩＬ細胞に追加するＣＳ－１０培地の量を計算した。必要に応じて、過剰なＴＩＬを遠心分離した。コニカルチューブを観察し、ＣＳ－１０を追加した。

バイアルを充填した。１．０ｍＬの細胞懸濁液を、適切なサイズの凍結バイアルに等分した。残留体積を適切なサイズのクライオバイアルに等分した。体積が≦０．５ｍＬである場合、体積が０．５ｍＬになるまでＣＳ１０をバイアルに追加する。

凍結保存のための１×１０^７個の細胞を取得するために必要とされる細胞の体積を計算した。凍結保存のために試料を取り出した。ＴＩＬをインキュベーターに入れた。

試料の凍結保存コニカルチューブを観察し、ＣＳ－１０をゆっくりと追加し、追加された０．５ｍＬのＣＳ１０の体積を記録した。

１１日目－フィーダー細胞フィーダー細胞を取得した。ＬＮ２冷凍庫から少なくとも２つの異なるロット番号を伴うフィーダー細胞の３つのバッグを取得した。解凍する準備が整うまで、細胞をドライアイス上で保管した。水浴またはｃｒｙｏｔｈｅｒｍを準備した。３７．０±２．０℃の水浴またはｃｙｔｏｔｈｅｒｍにおいて約３～５分間、または氷が消滅するまで、フィーダー細胞を解凍した。インキュベーターから培地を取り出した。解凍されたフィーダー細胞をプールした。フィーダー細胞を移送パックに追加した。シリンジから移送パックにフィーダー細胞を分注した。プールされたフィーダー細胞を混合し、移送パックをラベル付けした。

移送パック内のフィーダー細胞懸濁液の総体積を計算した。細胞計数試料を取り出した。各試料に別個の３ｍＬシリンジを使用して、不要注入ポートを使用してフィーダー細胞懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞計数試料を引き出した。各試料をラベル付けされたクライオバイアルに等分した。細胞計数を行い、増倍率を決定し、プロトコルを選択し、増倍率を入力した。行われた細胞計数の生細胞濃度及び生存率の平均を決定した。計数の上限及び下限を決定し、限界内で確認した。

フィーダー細胞懸濁液の調整された体積。細胞計数試料を取り出した後のフィーダー細胞懸濁液の調整された体積を計算した。総生フィーダー細胞を計算した。必要に応じて追加のフィーダー細胞を取得した。必要に応じて追加のフィーダー細胞を解凍した。第４のフィーダー細胞バッグをジップトップバッグに入れ、３７．０±２．０℃の水浴またはｃｙｔｏｔｈｅｒｍ内で約３～５分間解凍し、追加のフィーダー細胞をプールした。体積を測定した。シリンジ内のフィーダー細胞の体積を測定し、以下に記録した（Ｂ）。フィーダー細胞の新しい総体積を計算した。フィーダー細胞を移送パックに追加した。

必要に応じて希釈液を調製し、４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地を４本の１５ｍＬコニカルチューブに追加した。細胞計数を準備した。各試料に対して別個の３ｍＬシリンジを使用して、不要注入ポートを使用して、フィーダー細胞懸濁液移送パックから４×１．０ｍＬの細胞計数試料を取り出した。細胞計数及び計算を行った。行われた４つすべての計数から平均生細胞濃度を決定した。フィーダー細胞懸濁液の体積を調整し、細胞計数試料を取り出した後のフィーダー細胞懸濁液の調整された体積を計算した。４．０ｍＬを差し引いた総フィーダー細胞体積が取り出された。５×１０^９個の生フィーダー細胞を取得するために必要とされたフィーダー細胞懸濁液の体積を計算した。過剰なフィーダー細胞体積を計算した。取り出す過剰なフィーダー細胞の体積を計算した。過剰なフィーダー細胞を取り出した。

１．０ｍＬシリンジ及び１６Ｇ針を使用して、０．１５ｍＬのＯＫＴ３を引き上げ、ＯＫＴ３を追加した。フィーダー細胞懸濁液移送パックを熱融着した。

１１日目 Ｇ－ＲＥＸ充填及びシード設定Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ。「完全なＣＭ２の１１日目培地」をインキュベーターから取り出し、培地をＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳにポンプで注入した。４．５Ｌの培地をＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳにポンプで注入し、フラスコ上にマークされたラインまで充填した。必要に応じてフラスコを熱融着し、インキュベートした。フィーダー細胞の懸濁液移送パックを、Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳに溶接した。フィーダー細胞をＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳに追加した。熱融着した。ＴＩＬ懸濁液移送パックをフラスコに溶接した。ＴＩＬをＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳに追加した。熱融着した。Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳを３７．０±２．０℃でインキュベートした。ＣＯ２パーセンテージ：５．０±１．５ ％ＣＯ２。

インキュベーション時間帯を計算した。１６日目にインキュベーターからＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳを取り出すための適切な時間を決定するための計算を行った。下限：インキュベーションの時間＋１０８時間。上限：インキュベーションの時間＋１３２時間。

１１日目 過剰ＴＩＬ凍結保存該当：過剰ＴＩＬバイアルを凍結させた。凍結前にＣＲＦが設定されていることを検証した。凍結保存を行った。バイアルを速度制御された冷凍庫から適切な保管場所に移した。凍結の完了時に、バイアルをＣＲＦから適切な保管容器に移した。バイアルを適切な保管場所に移した。ＬＮ２における保管場所を記録した。

１６日目 培地の調製ＡＩＭ－Ｖ培地を事前に温めた。培地バッグ１、２、及び３について培地が温められた時間を計算した。すべてのバッグが１２～２４時間の持続時間にわたって温められていることを確実にした。上清用の１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒを設定した。ルアーコネクタを使用して、流体ポンプ移送セットのより大きな直径の端部を１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒバッグのメス型ポートのうちの１つに取り付けた。上清用の１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒを設定し、ラベル付けした。上清用の１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒを設定した。ＢＳＣから取り出す前に、すべてのクランプが閉じられていることを確実にした。注記：上清バッグは、培地調製と同時に行われ得るＴＩＬ採取中に使用された。

ＩＬ－２を解凍した。すべての氷が融解するまで、ＣＴＳ ＡＩＭ Ｖ培地の１バッグ当たりＩＬ－２（６×１０^６ＩＵ／ｍＬ）（ＢＲ７１４２４）の５×１．１ｍＬアリコートを解凍した。１００．０ｍＬのＧｌｕｔａＭａｘ（商標）を等分した。ＩＬ－２をＧｌｕｔａＭａｘ（商標）に追加した。配合用のＣＴＳ ＡＩＭ Ｖ培地バッグを準備した。配合用のＣＴＳ ＡＩＭ Ｖ培地バッグを準備した。ステージＢａｘａポンプ。培地を配合することを準備した。ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）＋ＩＬ－２をバッグにポンプで注入した。パラメータを監視した：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ_２パーセンテージ：５．０±１．５％ ＣＯ_２．完全なＣＭ４の１６日目培地を温めた。希釈液を調製した。

１６日目 ＲＥＰ分割。インキュベーターパラメータを監視した：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ_２パーセンテージ：５．０±１．５ ％ＣＯ_２．インキュベーターからＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳを取り出した。１Ｌの移送パックを準備し、ＴＩＬ懸濁液としてラベル付けし、１Ｌの重量を量った。

Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳの減容約４．５Ｌの培養上清をＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳから１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒに移した。

ＴＩＬ採取用のフラスコを準備した。上清を取り出した後に、赤色ラインへのすべてのクランプを閉じた。

ＴＩＬ採取の開始。フラスコを激しく叩き、培地を旋回させて細胞を解放し、すべての細胞が引き離されていることを確実にする。

ＴＩＬ採取。ＴＩＬ懸濁液移送パックにつながるすべてのクランプを解放した。ＧａｔｈｅＲｅｘを使用して、細胞懸濁液をＴＩＬ懸濁液移送パックの中に移した。注記：すべての細胞及び培地が収集されるまで、傾斜した縁を必ず維持すること。付着した細胞について膜を点検した。フラスコ膜をすすいだ。Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳ上のクランプを閉じた。ＴＩＬを含む移送パックを熱融着した。上清を含む１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒを熱融着した。細胞懸濁液を伴う移送パックの重量を記録し、細胞懸濁液を計算した。試料を取り出すための移送パックを準備した。細胞上清から試験試料を取り出した。

無菌性及びＢａｃＴ試験サンプリング。調製したＢａｃＴラベル付けされた１５ｍＬのコニカルから１．０ｍＬの試料を取り出した。細胞計数試料を取り出した。ＢＳＣ内で、各試料に別個の３ｍＬシリンジを使用して、「ＴＩＬ懸濁液」移送パックから４×１．０ｍＬの細胞計数試料を取り出した。

マイコプラズマ試料を取り出した。３ｍＬシリンジを使用して、ＴＩＬ懸濁液移送パックから１．０ｍＬを取り出し、調製された「マイコプラズマ希釈液」とラベル付けされた１５ｍＬコニカルチューブに入れた。

播種用の移送パックを準備した。ＴＩＬをインキュベーターに入れた。細胞懸濁液をＢＳＣから取り出し、必要とされるまでインキュベーターに入れた。細胞計数及び計算を行った。最初に、０．５ｍＬの細胞懸濁液を調製された４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地に追加することによって、細胞計数試料を希釈し、１：１０希釈液を生じた。行われた細胞計数の生細胞濃度及び生存率の平均を決定した。計数の上限及び下限を決定した。注記：希釈は、細胞の期待濃度に基づいて調整され得る。行われた４つすべての計数から平均生細胞濃度を決定した。ＴＩＬ懸濁液の調整された体積。細胞計数試料を取り出した後のＴＩＬ懸濁液の調整された体積を計算した。５．０ｍＬを差し引いた総ＴＩＬ細胞体積が試験のために取り出された。

総生ＴＩＬ細胞を計算した。播種するフラスコの総数を計算した。注記：播種するＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳフラスコの最大数は５であった。播種するフラスコの計算された数が５つを超えた場合、５つのみが利用可能な細胞懸濁液の体積全体を使用して播種された。

二次培養用のフラスコの数を計算した。準備されたバッグに加えて必要とされる培地バッグの数を計算した。計算されたように必要とされる２つのＧ－ＲＥＸ－５００Ｍフラスコ毎に「ＣＭ４の１６日目培地」の１つの１０Ｌバッグを準備した。追加の培地が調製され、温められている間に、続けて第１のＧＲＥＸ－５００Ｍフラスコ（複数可）を播種した。計算された数の決定された追加の培地バッグを調製し、温めた。Ｇ－ＲＥＸ５００ＭＣＳを充填した。培地をポンプで注入するように準備し、４．５Ｌの培地をＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳにポンプで注入した。熱融着した。充填を繰り返した。フラスコをインキュベートした。新しいＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳフラスコに追加するＴＩＬ懸濁液の標的体積を計算した。フラスコの計算された数が５つを超える場合、５つのみが細胞懸濁液の体積全体を使用して播種されるであろう。播種用のフラスコを準備した。インキュベーターからＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳを取り出した。ポンプで注入するためのＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳを準備した。大型フィルターラインを除くすべてのクランプを閉じた。インキュベーターからＴＩＬを取り出した。播種用の細胞懸濁液を調製した。（プロセス注記５．１１に従って）「ＴＩＬ懸濁液」移送パックをポンプ入口ラインに滅菌溶接した。ＴＩＬ懸濁液バッグを秤の上に置いた。

フラスコにＴＩＬ懸濁液を播種した。計算されたＴＩＬ懸濁液の体積をフラスコにポンプで注入した。熱融着した。残りのフラスコを充填した。

インキュベーターを監視した。インキュベーターパラメータ：温度ＬＥＤディスプレイ：３７．０±２．０℃、ＣＯ_２パーセンテージ：５．０±１．５ ％ ＣＯ_２．フラスコをインキュベートした。

２２日目にインキュベーターからＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳを取り出す時間範囲を決定した。

２２日目 洗浄緩衝液の調製１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒバッグを準備した。ＢＳＣ内で、ルアー接続を介して４インチ血漿移送セットを１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒバッグに取り付けた。１０ＬのＬａｂｔａｉｎｅｒバッグを準備した。ＢＳＣから外に移す前に、すべてのクランプを閉じた。注記：採取される２つのＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳフラスコ毎に、１つの１０Ｌ Ｌａｂｔａｉｎｅｒバッグを準備した。Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅを３０００ｍＬバッグにポンプで注入し、ポンプを反転させてバッグの位置を操作することによって、３０００ｍＬのＯｒｉｇｅｎバッグから空気を除去した。ヒトアルブミン２５％を３０００ｍＬのバッグに追加した。１２０．０ｍＬの最終体積のヒトアルブミン２５％を取得する。

ＩＬ－２希釈液を調製した。１０ｍＬシリンジを使用して、ＬＯＶＯ洗浄緩衝液バッグ上の無針注入ポートを使用して、５．０ｍＬのＬＯＶＯ洗浄緩衝液を取り出した。ＬＯＶＯ洗浄緩衝液を５０ｍＬのコニカルチューブに分注した。

等分されたＣＲＦブランクバッグＬＯＶＯ洗浄緩衝液。１００ｍＬのシリンジを使用して、無針注入ポートから７０．０ｍＬのＬＯＶＯ洗浄緩衝液を引き上げた。

すべての氷が融解するまで、１つの１．１ｍＬのＩＬ－２（６×１０６ＩＵ／ｍＬ））を解凍した。５０μＬのＩＬ－２ストック（６×１０^６ＩＵ／ｍＬ）を「ＩＬ－２希釈液」とラベル付けされた５０ｍＬのコニカルチューブに追加した。

凍結保存調製。５つのクライオカセットを２～８℃に置き、最終製品の凍結保存のためにそれらを前調整した。

細胞計数希釈液を調製した。ＢＳＣ内で、ロット番号及び「細胞計数希釈液用」でラベル付けされた４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地を、４本の別個の１５ｍＬコニカルチューブに追加した。細胞計数を準備した。４つのクライオバイアルをバイアル番号（１～４）でラベル付けした。使用されるＢＳＣの下でバイアルを保存した。

２２日目 ＴＩＬ採取インキュベーターを監視した。インキュベーターパラメータ温度ＬＥＤディスプレイ：３７±２．０℃、ＣＯ２パーセンテージ：５％±１．５％．インキュベーターからＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳフラスコを取り外した。ＴＩＬ収集バッグを準備し、ラベル付けした。余分な接続を密封した。減容：約４．５Ｌの上清をＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳから上清バッグに移した。

ＴＩＬ採取用のフラスコを準備した。ＴＩＬの収集を開始した。フラスコを激しく叩き、培地旋回させて細胞を解放した。すべての細胞が引き離されていることを確実にした。ＴＩＬの収集を開始した。ＴＩＬ懸濁液収集バッグにつながるすべてのクランプを解放した。ＴＩＬ採取。ＧａｔｈｅＲｅｘを使用して、ＴＩＬ懸濁液を３０００ｍＬの収集バッグに移した。付着した細胞について膜を点検した。フラスコ膜をすすいだ。Ｇ－Ｒｅｘ５００ＭＣＳ上のクランプを閉じ、すべてのクランプが閉じていることを確実にした。細胞懸濁液をＬＯＶＯソースバッグの中に移した。すべてのクランプを閉じた。熱融着した。４×１．０ｍＬの細胞計数試料を取り出した。

細胞計数を行った。ＮＣ－２００及びプロセス注記５．１４を利用して、細胞計数及び計算を行った。最初に、０．５ｍＬの細胞懸濁液を調製された４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖ培地に追加することによって、細胞計数試料を希釈した。これは、１：１０希釈液を生じた。行われた細胞計数の平均生存率、生細胞濃度、及び総有核細胞濃度を決定した。計数の上限及び下限を決定した。行われた細胞計数の平均生存率、生細胞濃度、及び総有核細胞濃度を決定した。ＬＯＶＯソースバッグの重量を量った。総生ＴＩＬ細胞を計算した。総有核細胞を計算した。

マイコプラズマ希釈液を調製した。ルアー試料ポートを介して１つの上清バッグから１０．０ｍＬを取り出し、１５ｍＬコニカルに入れた。

「ＴＩＬ Ｇ－ＲＥＸ採取」プロトコルを行い、最終製品の標的体積を決定した。使い捨てキットを装填した。濾液バッグを取り出した。濾液容量を入力した。濾液容器をベンチトップの上に置いた。ＰｌａｓｍａＬｙｔｅを取り付けた。ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが取り付けられていることを検証し、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが動いていることを観察した。ソース容器をチューブに取り付け、ソース容器が取り付けられていることを検証した。ＰｌａｓｍａＬｙｔｅが動いていることを確認した。

最終製剤及び充填標的体積／バッグの計算。ブランクバッグを配合するためのＣＳ－１０及びＬＯＶＯ洗浄緩衝液の体積を計算した。ＣＲＦブランクを調製した。

最終製品に追加するＩＬ－２の体積を計算した。所望される最終ＩＬ－２濃度（ＩＵ／ｍＬ）－３００ＩＵ／ｍＬ。ＩＬ－２作業ストック：６ × １０^４ ＩＵ／ｍＬ．接続装置を組み立てた。４Ｓ－４Ｍ６０をＣＣ２細胞接続に滅菌溶接した。ＣＳ７５０クライオバッグを準備したハーネスに滅菌溶接した。ＣＳ－１０バッグを４Ｓ－４Ｍ６０のスパイクに溶接した。ＩＬ－２とともにＴＩＬ調製した。適切なサイズのシリンジを使用して、「ＩＬ－２ ６×１０^４」アリコートから決定されたＩＬ－２の量を取り出した。配合されたＴＩＬバッグをラベル付けした。配合されたＴＩＬバッグを装置に追加した。ＣＳ１０を追加した。シリンジを交換した。約１０ｍＬの空気を１００ｍＬのシリンジに引き込み、装置上の６０ｍＬシリンジを交換した。ＣＳ１０を追加した。ＣＳ－７５０バッグを準備した。細胞を分注した。

最終製品バッグから空気を除去し、保持液を得た。最後の最終製品バッグが充填されると、すべてのクランプを閉じた。１０ｍＬの空気を新しい１００ｍＬシリンジに引き込み、装置のシリンジを交換する。保持液を５０ｍＬコニカルチューブに分注し、管を「保持液」及びロット番号としてラベル付けした。各バッグについて空気除去ステップを繰り返した。

目視検査を含み、凍結保存のための最終製品を調製した。凍結保存までクライオバッグを低温パック上で、または２～８℃で保持した。

細胞計数試料を取り出した。適切なサイズのピペットを使用して、２．０ｍＬの保持液を取り出し、細胞計数に使用されるように１５ｍＬコニカルチューブに入れる。細胞計数及び計算を行った。注記：１つだけの試料を適切な希釈に希釈し、希釈が十分であることを検証した。追加の試料を適切な希釈倍率に希釈し、計数を進めた。行われた細胞計数の生細胞濃度及び生存率の平均を決定した。計数の上限及び下限を決定した。注記：希釈は、細胞の期待濃度に基づいて調整され得る。生細胞濃度及び生存率の平均を決定した。計数の上限及び下限を決定した。ＩＦＮ－γを計算した。最終製品バッグを熱融着した。

以下の例示的試料計画に従って試料をラベル付けし、収集した。

無菌性及びＢａｃＴ試験。試験試料採取。ＢＳＣ内で、適切なサイズのシリンジを使用して収集された保持細胞懸濁液から１．０ｍＬの試料を取り出し、嫌気性ボトルに接種する。好気性ボトルについて上記を繰り返す。

最終製品の凍結保存制御速度冷凍庫（ＣＲＦ）を準備した。ＣＲＦが設定されていることを検証した。ＣＲＦプローブを設定した。最終製品及び試料をＣＲＦに入れた。４℃±１．５℃に達し、ＣＲＦ実行を進めるために必要な時間を決定した。ＣＲＦが完了し、保管された。実行の完了後にＣＲＦを停止させた。カセット及びバイアルをＣＲＦから取り出した。保存のためにカセット及びバイアルを蒸気相ＬＮ２に移した。保管場所を記録した。

最終医薬品の後処理及び分析には、以下の試験が含まれた：（２２日目）フローサイトメトリーによる２２日目ＲＥＰのＣＤ３＋細胞の決定、（２２日目）グラム染色法（ＧＭＰ）、（２２日目）ゲルクロットＬＡＬアッセイ（ＧＭＰ）による細菌内毒素試験、（１６日目）ＢａｃＴ滅菌アッセイ（ＧＭＰ）、（１６日目）ＴＤ－ＰＣＲによるマイコプラズマＤＮＡ検出（ＧＭＰ）、許容される外観属性、（２２日目）ＢａｃＴ滅菌アッセイ（ＧＭＰ）（２２日目）、（２２日目）ＩＦＮ－ガンマアッセイ。本明細書に記載の他の効力アッセイもまた、ＴＩＬ製品を分析するために用いられる。

実施例８：ＧＥＮ３拡張プラットフォームの例示的な実施形態
０日目
腫瘍洗浄培地を調製した。培地を開始前に温めた。５ｍＬのゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）を５００ｍＬボトルのＨＢＳＳに添加した。５ｍＬの腫瘍洗浄培地を、ＯＫＴ３希釈に使用する１５ｍＬのコニカルチューブに添加した。フィーダー細胞バッグを調製した。フィーダー細胞をフィーダー細胞バッグに無菌で移し、使用するまで３７℃で保管するか、または凍結させた。３７℃の場合、フィーダー細胞をカウントした。凍結した場合は、解凍した後、フィーダー細胞をカウントした。

フィーダー細胞濃度の最適範囲は、５×１０^４～５×１０^６細胞／ｍＬである。４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖを含む４つのコニカルチューブを準備した。各細胞計数について０．５ｍＬの細胞画分を追加した。総生フィーダー細胞数が１×１０^９細胞以上であった場合、進んでフィーダー細胞濃度を調整した。フィーダー細胞の体積を計算し、第１のフィーダー細胞バッグから取り出して、１×１０^９細胞を第２のフィーダー細胞バッグに添加した。

ｐ１０００マイクロピペットを使用して、９００μＬの腫瘍洗浄培地をＯＫＴ３アリコート（１００μＬ）に移した。シリンジ及び滅菌技法を使用して、０．６ｍＬのＯＫＴ３を吸引し、第２のフィーダー細胞バッグに添加した。培地体積を全体積２Ｌに調整した。第２のフィーダー細胞バッグをインキュベーターに移した。

ＯＫＴ３製剤の詳細：ＯＫＴ３は、１００μＬアリコート中のバイアル（１ｍｇ／ｍＬ）からの元のストック濃度でアリコートされ、凍結されてもよい。１ｍＬバイアル当たり約１０×アリコート。－８０℃で保管した。０日目：１５μｇ／フラスコ、すなわち５００ｍＬ中３０ｎｇ／ｍＬ～６０μＬ最大約１アリコート。

５ｍＬの腫瘍洗浄培地を、過剰腫瘍片とラベル付けした６ウェルプレートのすべてのウェルに添加した。解剖中に腫瘍を水和状態に保持する際に、腫瘍洗浄培地をさらなる使用のために利用可能にした。５０ｍＬの腫瘍洗浄培地を、各１００ｍｍペトリ皿に追加した。

解剖皿のふたの下の定規を参照として使用して、腫瘍を２７ｍｍ^３断片（３×３×３ｍｍ）に解剖した。６０個の断片に達するまで中間断片を解剖した。生成した最終断片の数に応じて、最終断片の総数を計数し、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳフラスコを調製した（一般に、１フラスコ当たり６０個の断片）。

断片チューブ１～断片チューブ４とラベル付けしたコニカルチューブ内に好ましい組織断片を保持した。起源とする断片チューブの数に応じて、フィーダー細胞懸濁液を播種するＧ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳフラスコの数を計算した。

フィーダー細胞バッグをインキュベーターから取り出し、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳを播種する。Ｄ０（０日目）とラベル付けする。

Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ中の培養物への腫瘍断片の追加滅菌条件下で、腫瘍断片培養物（Ｄ０）１とラベル付けしたＧ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ及び断片チューブとラベル付けした５０ｍＬのコニカルチューブのキャップを緩めた。開いた断片チューブ１を回転させ、同時にＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳのキャップをわずかに持ち上げた。断片を含む培地を、回転している間にＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳに追加した。Ｇ－ＲＥＸ１００ＭＣＳに移送された断片の数を記録した。

断片がＧＲＥＸフラスコの底に配置された時点で、７ｍＬの培地を吸引し、７つの１ｍＬアリコートを作製した（拡張された特徴付け用に５ｍＬ、滅菌試料用に２ｍＬ）。拡張された特徴付け用の５つのアリコート（最終断片培養上清）を、必要になるまで－２０℃で保管した。

１本の嫌気性ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトル及び１本の好気性ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトルに各々１ｍＬの最終断片培養上清を接種した。サンプリングしたフラスコ毎に繰り返す。

７日目～８日目
フィーダー細胞バッグを調製した。凍結時に３７℃の水浴中で３～５分間フィーダーバッグを解凍した。凍結している場合、フィーダー細胞を計数した。フィーダー細胞濃度の最適範囲は、５×１０^４～５×１０^６細胞／ｍＬである。４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖを含む４つのコニカルチューブを準備した。各細胞計数について０．５ｍＬの細胞画分を新しいクライオバイアル管に追加した。試料を十分に混合し、細胞計数を続けた。

総生フィーダー細胞数が２×１０^９細胞以上であった場合、次のステップに進んでフィーダー細胞濃度を調整した。フィーダー細胞の体積を計算し、第１のフィーダー細胞バッグから取り出して、２×１０^９細胞を第２のフィーダー細胞バッグに追加した。

ｐ１０００マイクロピペットを使用して、９００μＬのＨＢＳＳを１００μＬのＯＫＴ３アリコートに移す。上下に３回ピペッティングして混合する。２つのアリコートを調製した。

ＯＫＴ３製剤の詳細：ＯＫＴ３は、１００μＬアリコート中のバイアル（１ｍｇ／ｍＬ）からの元のストック濃度でアリコートされ、凍結されてもよい。１ｍＬバイアル当たり約１０×アリコート。－８０℃で保管した。７日目／８日目：３０μｇ／フラスコ、すなわち５００ｍＬ中６０ｎｇ／ｍＬ～１２０μｌ最大約２アリコート。

シリンジ及び滅菌技法を使用して、０．６ｍＬのＯＫＴ３を吸引し、フィーダー細胞バッグに添加して、すべて添加されたことを確認した。培地量を合計２Ｌに調整した。第２のＯＫＴ３アリコートで繰り返し、フィーダー細胞バッグに追加した。第２のフィーダー細胞バッグをインキュベーターに移した。

フィーダー細胞懸濁液を含むＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳフラスコの準備。０日目に生成されたＧ－ＲＥＸフラスコの数に従って処理するためにＧ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳフラスコの数を記録した。Ｇ－ＲＥＸフラスコをインキュベーターから取り出し、第２のフィーダー細胞バッグをインキュベーターから取り出した。

フィーダー細胞懸濁液を添加する前の上清の除去：１本の１０ｍＬシリンジをＧ－ＲＥＸ１００フラスコに接続し、５ｍＬの培地を引き上げた。５つの１ｍＬアリコート（拡張された特徴付け用に５ｍＬ）を作製し、治験依頼者からの要求があるまで、拡張された特徴付け用に５つのアリコート（最終断片培養上清）を－２０℃で保管した。各Ｇ－ＲＥＸ１００フラスコにラベル付けし、繰り返した。
フラスコの数に応じた、特徴付け用の５～２０×１ｍＬ試料：
・５ｍＬ＝１フラスコ
・１０ｍＬ＝２フラスコ
・１５ｍＬ＝３フラスコ
・２０ｍＬ＝４フラスコ
フィーダー細胞をＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳに播種し続け、Ｇ－ＲＥＸ１００ＭＣＳフラスコ毎に繰り返した。無菌移送法を使用して、各Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳフラスコに重量で５００ｍＬの第２のフィーダー細胞バッグを重力移送し（１ｇ＝１ｍＬと想定）、量を記録した。７日目培養とラベル付けし、Ｇ－ＲＥＸ１００フラスコ毎に繰り返した。Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳフラスコをインキュベーターに移した。

１０～１１日目
第１のＧ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳフラスコを取り出し、滅菌条件を使用して、１０ｍＬシリンジを使用して７ｍＬの前処理培養上清を取り出した。７つの１ｍＬアリコートを作製した（拡張された特徴付け用に５ｍＬ、滅菌試料用に２ｍＬ）。

フラスコを注意深く混合し、新たな１０ｍＬシリンジを使用して１０ｍＬの上清を取り出し、Ｄ１０／１１マイコプラズマ上清とラベル付けした１５ｍＬのチューブに移す。

フラスコを注意深く混合し、新しい注射器を使用して、処理されるフラスコの数に応じて以下の量を除去した。
・１フラスコ＝４０ｍＬ
・２フラスコ＝２０ｍＬ／フラスコ
・３フラスコ＝１３．３ｍＬ／フラスコ
・４フラスコ＝１０ｍＬ／フラスコ

合計４０ｍＬをすべてのフラスコから取り出し、「１０／１１日目ＱＣ試料」とラベル付けした５０ｍＬのコニカルチューブにプールし、必要になるまでインキュベーター内で保管すべきである。細胞計数を行い、細胞を割り当てた。

必要になるまで－２０℃以下で拡張された特徴付けのために５つのアリコート（前処理培養上清）を保管した。１本の嫌気性ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトル及び１本の好気性ＢａｃＴ／Ａｌｅｒｔボトルに各々１ｍＬの前処理培養上清を接種した。

細胞懸濁液をＧ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳに移し、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳ毎に繰り返した。滅菌条件を使用して、各Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳの内容物をＧ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳに移し、一度に約１００ｍＬの液体移送を監視した。Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳの容量が５００ｍＬに低減したとき、移送を停止した。

移送ステップ中、１０ｍＬシリンジを使用し、Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳからシリンジに１０ｍＬの細胞懸濁液を引き上げた。培養中のフラスコの数に従って指示に従った。１つのフラスコのみの場合：２つのシリンジを使用して合計２０ｍＬを取り出した。フラスコが２つの場合：１フラスコ当たり１０ｍＬを取り出した。フラスコが３つの場合：１フラスコ当たり７ｍＬを取り出した。フラスコが４つの場合：１フラスコ当たり５ｍＬを取り出した。細胞懸濁液を１本の一般的な５０ｍＬのコニカルチューブに移した。細胞計数ステップ及びＱＣ試料までインキュベーター内で保管する。ＱＣに必要な細胞の総数は、約２０ｅ６細胞であった：４×０．５ｍＬの細胞数（細胞数を最初に希釈しなかった）。

アッセイに必要な細胞の量は、以下の通りである。
１．本明細書に記載されるものなどの効力アッセイ、またはＩＦＮ－γもしくはグランザイムＢアッセイのための最小１０×１０^６細胞
２である。マイコプラズマのための１×１０^６細胞
３．ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋のためのフローサイトメトリーのための５×１０^６細胞

Ｇ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳフラスコをインキュベーターに移した。

ＱＣ試料を調製した。この実施形態のアッセイには少なくとも１５×１０^８細胞が必要であった。アッセイは、細胞数及び生存率、マイコプラズマ（１×１０^６細胞／平均生存濃度）、フロー（５×１０^６細胞／平均生存濃度）及びＩＦＮ－ｇアッセイ（５×１０^６細胞～１×１０^６細胞を含み、８～１０×１０^６細胞が、ＩＦＮ－γアッセイに必要である。

１０×１０^６細胞／ｍＬで凍結保存のための細胞画分の体積を計算し、調製するバイアルの数を計算した。

１６～１７日目
洗浄緩衝液の調製（１％ ＨＳＡ Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ）。ＨＳＡ及びＰｌａｓｍａｌｙｔｅを５Ｌバッグに移して、ＬＯＶＯ洗浄緩衝液を作製した。滅菌条件を使用して、総体積１２５ｍＬの２５％ＨＳＡを５Ｌバッグに移した。１０ｍＬまたは４０ｍＬの洗浄緩衝液を取り出し、「ＩＬ－２ ６×１０^４ＩＵ／ｍＬ」チューブに移した（ＩＬ－２を事前に調製した場合は１０ｍＬ、ＩＬ－２を新たに調製した場合は４０ｍＬ）。

Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ＋１％ ＨＳＡに添加する再構成ＩＬ－２の体積を計算した：再構成ＩＬ－２の体積＝（ＩＬ－２の最終濃度×最終体積）／ＩＬ－２の比活性（標準アッセイに基づく）。ＩＬ－２の最終濃度は、６×１０^４ＩＵ／ｍＬであった。最終体積は、４０ｍＬであった。

再構成ＩＬ－２に必要なＩＬ－２の計算された初期体積を取り出し、「ＩＬ－２ ６×１０^４ＩＵ／ｍＬ」チューブに移した。事前に調製したアリコートから１００μＬのＩＬ－２ ６×１０^６ＩＵ／ｍＬを、１０ｍＬのＬＯＶＯ洗浄緩衝液を含有する「ＩＬ－２ ６×１０^４ＩＵ／ｍＬ」とラベル付けしたチューブに追加した。

約４５００ｍＬの上清をＧ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳフラスコから取り出した。残りの上清を回転させ、細胞を細胞収集プールバッグに移した。すべてのＧ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳフラスコで繰り返した。

６０ｍＬの上清を除去し、マイコプラズマ検出を含む品質管理アッセイのために上清チューブに添加した。＋２～８℃で保管した。

細胞収集細胞を計数した。４．５ｍＬのＡＩＭ－Ｖを含む４つの１５ｍＬコニカルチューブを準備する。これらは、事前に準備してもよい。最適な範囲は、５×１０^４～５×１０^６細胞／ｍＬである。（１：１０希釈が推奨された）。１：１０希釈の場合、事前に調製した４５００μＬのＡＩＭ Ｖに、５００μＬのＣＦを追加する。希釈倍率を記録した。

ＴＣ（総細胞）ＬＯＶＯ前（生＋死）を計算した＝
平均総細胞
濃度（ＴＣ濃度ＬＯＶＯ前）
（生＋死）
Ｘ
ソースバッグの体積

ＴＶＣ（総生細胞）ＬＯＶＯ前（生）を計算した＝
平均総生細胞
濃度（ＴＶＣ ＬＯＶＯ前）
（生）
Ｘ
ＬＯＶＯソースバッグの体積

総細胞（ＴＣ）数が５×１０^９超であった場合、５×１０^８細胞を取り出して、ＭＤＡ保持試料として凍結保存する。５×１０^８÷平均ＴＣ濃度（ステップ１４．４４）＝取り出す体積

総細胞（ＴＣ）数が≦５×１０^９以下であった場合、４×１０^６細胞を取り出して、ＭＤＡ保持試料として凍結保存する。４×１０^６÷平均ＴＣ濃度＝取り出す体積。

総細胞数が決定された場合、取り出す細胞の数は、１５０×１０^９生細胞の保持を可能にすべきである。ＴＶＣ ＬＯＶＯ前５×１０^８もしくは４×１０^６を確認するか、または該当なしである。取り出す細胞の体積量を計算した。

バッグに残っている残りの総細胞を計算した。ＴＣ（総細胞）ＬＯＶＯ前を計算した。［平均総細胞濃度×残りの体積＝残りのＴＣ ＬＯＶＯ前］を計算した。

残存する細胞の総数に従って、表４１の対応するプロセスを選択する。

使用したプロセスに対応して添加するＩＬ－２の体積を選択する。次のように計算された体積：保持体積×２×３００ＩＵ／ｍＬ＝必要とされるＩＬ－２のＩＵ。必要なＩＬ－２のＩＵ／６×１０^４ＩＵ／ｍＬ＝ＬＯＶＯ後バッグに追加するＩＬ－２の体積。添加したすべての体積を記録した。さらなる分析のために試料をクライオバイアル内に得た。

細胞製品を十分に混合した。該当する場合、凍結保存を含むさらなる処理のためにすべてのバッグを密封した。

取得されたクライオバイアル試料に対して、内毒素、ＩＦＮ－γ、無菌性、及び必要に応じて他のアッセイを行った。

実施例９：ＧＥＮ２及びＧＥＮ３の例示的なプロセス
この実施例は、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３のプロセスを示す。Ｇｅｎ２プロセス及びＧｅｎ３プロセスのＴＩＬは、一般に腫瘍の外科的切除によって個々の患者から得られ、その後、エクスビボで拡張された自己ＴＩＬで構成されている。Ｇｅｎ３プロセスのプライミングによる第１の拡張ステップは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）及びモノクローナル抗体ＯＫＴ３の存在下での細胞培養であり、放射線照射された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の足場上のＴ細胞共受容体ＣＤ３を標的とする。

Ｇｅｎ２ ＴＩＬ製品の製造は、２つの相からなる：１）急速拡張前（ＲＥＰ前）及び２）急速拡張プロトコル（ＲＥＰ）。ＲＥＰ前中に、切除腫瘍を、各寸法２～３ｍｍの５０個以下の断片に切断し、血清含有培養培地（１０％ＨｕＳＡＢを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）及び６，０００ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）で、１１日間の期間培養した。１１日目にＴＩＬを採取し、大規模二次ＲＥＰ拡張に導入した。ＲＥＰは、５日間の３０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を補充した５Ｌ体積のＣＭ２中の１５０μｇのモノクローナル抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を装填した５×１０^９個の放射線照射された同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞の共培養におけるＲＥＰ前由来の２００×１０^６個以下の生細胞の活性化からなる。１６日目に、培養物の体積を９０％低下させ、細胞画分を１フラスコ当たり１×１０^９個以上の生リンパ球で複数のＧ－ＲＥＸ－５００フラスコに分割し、ＣＭ４で５Ｌにする。ＴＩＬをさらに６日間インキュベートする。ＲＥＰを２２日目に採取し、洗浄し、製剤化し、凍結保存した後に、注入のために臨床現場に－１５０℃で発送する。

Ｇｅｎ３ ＴＩＬ製品の製造は、３つの相からなる：１）プライミングによる第１の拡張プロトコル、２）急速な第２の拡張プロトコル（急速拡張相またはＲＥＰとも称される）、及び３）継代培養分割。プライミングによる第１の拡張ＴＩＬ増殖を行うために、切除した腫瘍を各寸法２～３ｍｍの１２０個以下の断片に切断した。プライミングによる第１の拡張の０日目に、ＯＫＴ－３を装填したおよそ２．５×１０^８個の放射線照射された同種異系ＰＢＭＣフィーダー細胞のフィーダー層を、３つの１００ＭＣＳ容器の各々内のおよそ１００ｃｍ^２の表面積上に確立した。腫瘍断片を、各々が５００ｍＬの血清含有ＣＭ１培養培地及び６，０００ＩＵ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２）及び１５ｕｇのＯＫＴ－３を含む３つの１００ＭＣＳ容器に分布し、その中で７日間培養した。７日目に、ＯＫＴ－３を負荷したおよそ５×１０^８個の同種異系の照射されたＰＢＭＣフィーダー細胞の追加のフィーダー細胞層を、３つの１００ＭＣＳ容器の各々において腫瘍断片化培養相に組み込み、５００ｍＬのＣＭ２培養培地及び６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び３０μｇのＯＫＴ－３で培養することによってＲＥＰを開始した。ＲＥＰの開始を、１００ＭＣＳ容器へのＯＫＴ３を装填したフィーダー細胞の閉鎖系流体移送を使用して、同じ容器内のプライミングによる第１の拡張培養物全体を活性化することによって増強した。Ｇｅｎ３の場合、ＴＩＬのスケールアップまたは分割に、細胞培養物全体を閉鎖系流体移送によってより大きい容器にスケーリングし、移し（１００Ｍフラスコから５００Ｍフラスコに）、追加の４ＬのＣＭ４培地を添加するプロセスステップを含めた。ＲＥＰ細胞を１６日目に採取し、洗浄し、製剤化し、凍結保存した後に、注入のために臨床現場に－１５０℃で発送した。

全体として、Ｇｅｎ３プロセスは、より短く、よりスケーラブルであり、かつ簡単に修正可能な拡張プラットフォームであり、堅牢な製造及びプロセス比較可能性に適するように適応する。

０日目に、両方のプロセスについて、腫瘍を３回洗浄し、断片をランダム化し、２つのプールに分けた（プロセス毎に１つのプール）。Ｇｅｎ２プロセスの場合、断片を、６，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を含有する１ＬのＣＭ１培地を含む１つのＧＲＥＸ１００ＭＣＳフラスコに移した。Ｇｅｎ３プロセスでは、断片を、６，０００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ－２、１５ｕｇのＯＫＴ－３及び２．５×１０^８個のフィーダー細胞を含有する５００ｍＬのＣＭ１を含む１つのＧ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳフラスコに移した。Ｒｅｐ開始日のＴＩＬの播種は、各プロセスに従って異なる日に起こった。Ｇ－ＲＥＸ Ｇ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳフラスコを９０％体積低下させたＧｅｎ２プロセスの場合、収集した細胞懸濁液を新たなＧ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳに移して、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）＋５×１０^９フィーダー細胞及びＯＫＴ－３（３０ｎｇ／ｍＬ）を含有するＣＭ２培地中で１１日目にＲＥＰを開始した。細胞が拡張し、プロトコルに従って１６日目にＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を有するＣＭ４培地を含む複数のＧ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳフラスコに分割した。その後、培養物を採取し、プロトコルに従って２２日目に凍結保存した。Ｇｅｎ３プロセスの場合、ＲＥＰの開始は７日目に起こり、同じＧ－ＲＥＸ－１００ＭＣＳをＲＥＰの開始に使用した。簡潔には、ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍＬ）及び５×１０^８個のフィーダー細胞を３０ｕｇのＯＫＴ－３とともに含有する５００ｍＬのＣＭ２培地を各フラスコに添加した。９～１１日目に、培養をスケールアップした。Ｇ－ＲＥＸ１００Ｍの全体積（１Ｌ）をＧ－ＲＥＸ－５００ＭＣＳに移し、ＩＬ－２（３０００ＩＵ／ｍＬ）を含有する４ＬのＣＭ４を添加した。フラスコを５日間インキュベートした。培養物を採取し、１６日目に凍結保存した。

比較には、２つの肺腫瘍（Ｌ４０５４及びＬ４０５５）と１つの黒色腫腫瘍（Ｍ１０８５Ｔ）の３つの異なる腫瘍を含めた。

Ｌ４０５４及びＬ４０５５の場合、ＣＭ１培地（培養培地１）、ＣＭ２培地（培養培地２）、及びＣＭ４培地（培養培地４）を事前に調製し、４℃で保持した。ＣＭ１培地及びＣＭ２培地を、培地を濾過した場合の細胞増殖と培地を濾過しなかった場合の細胞増殖を比較するために、濾過せずに調製した。

Ｌ４０５５腫瘍の場合、ＲＥＰの開始及びスケールアップ時に、培地を事前に３７℃で最大２４時間温めた。

結果達成された生細胞の総数について、Ｇｅｎ３の結果はＧｅｎ２の３０％以内であった。Ｇｅｎ３最終製品は、再刺激後により高いＩＮＦ－γ産生を示した。Ｇｅｎ３最終製品は、存在する固有の全ＣＤＲ３配列によって測定される、増加したクローン多様性を示した。Ｇｅｎ３最終製品は、より長い平均テロメア長を示した。

Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスでのＲＥＰ前及びＲＥＰ拡張は、上記の手順に従った。各腫瘍について、２つのプールに同数の断片を含めた。腫瘍のサイズが小さいため、１フラスコ当たりの最大断片数は達成されなかった。総ＲＥＰ前細胞（ＴＶＣ）を採取し、Ｇｅｎ２プロセスの場合は１１日目に、Ｇｅｎ３プロセスの場合は７日目に計数した。２つのＲＥＰ前群を比較するために、細胞数を培養物中に提供された断片の数で割り、１断片当たりの平均生細胞を計算した。以下の表５１に示されるように、Ｇｅｎ２プロセスは、Ｇｅｎ３プロセスと比較して、１断片当たりより多くの細胞を一貫して成長させた。ＲＥＰ前ＴＶＣを７で割り、その後、１１を掛けて計算した、１１日目にＧｅｎ３プロセスで予想されるＴＶＣ数の外挿計算。

Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの場合、ＴＶＣをプロセス条件毎に計数し、生細胞パーセントをプロセス日毎に生成した。採取時に、２２日目（Ｇｅｎ２）及び１６日目（Ｇｅｎ３）の細胞を収集し、ＴＶＣ数を確立した。その後、ＴＶＣを０日目に提供された断片の数で割り、１断片当たりの平均生細胞を計算した。倍率拡張を、採取したＴＶＣをＲＥＰ開始ＴＶＣで割ることによって計算した。表５２に示されるように、Ｇｅｎ２とＧｅｎ３を比較すると、倍率拡張はＬ４０５４の場合では同様であり、Ｌ４０５５の場合、倍率拡張はＧｅｎ２プロセスの方が高かった。具体的には、この場合、培地をＲＥＰ開始日の前に２４温めた。Ｍ１０８５Ｔの場合のＧｅｎ３でもより高い倍率拡張が観察された。ＲＥＰ ＴＶＣを１６で割り、その後、２２を掛けて計算した、２２日目にＧｅｎ３プロセスで予想されるＴＶＣ数の外挿計算。

表５３：ＴＩＬ最終製品の生存率％：採取時に、最終ＴＩＬ ＲＥＰ製品を生存率％の放出基準と比較した。Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのすべての条件は、７０％の生存率基準を超えており、プロセス及び腫瘍間で同等であった。

採取時に、最終ＴＩＬ ＲＥＰ製品を生存率％の放出基準と比較した。Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのすべての条件は、７０％の生存率基準を超えており、プロセス及び腫瘍間で同等であった。

１フラスコ当たりの断片の数が最大必要数未満であったため、採取日の推定細胞数を腫瘍毎に計算した。推定は、臨床腫瘍が０日目に２つまたは３つのフラスコに播種するのに十分な大きさであるという予想に基づいた。

免疫表現型決定－ＴＩＬ最終製品の表現型マーカー比較。３つの腫瘍Ｌ４０５４、Ｌ４０５５、及びＭ１０８５Ｔは、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの両方でＴＩＬ拡張を受けた。採取時に、ＲＥＰ ＴＩＬ最終製品をフローサイトメトリー分析にかけ、純度、分化、及びメモリーマーカーを試験した。すべての条件で、ＴＣＲ ａ／ｂ＋細胞パーセンテージは９０％超であった。

Ｇｅｎ３プロセスから採取したＴＩＬは、Ｇｅｎ２プロセスから採取したＴＩＬと比較して、より高いＣＤ８及びＣＤ２８発現を示した。Ｇｅｎ２プロセスは、より高いＣＤ４＋パーセンテージを示した。

Ｇｅｎ３プロセスから採取したＴＩＬは、Ｇｅｎ２プロセス由来のＴＩＬと比較して、セントラルメモリー区画でより高い発現を示した。

活性化及び疲弊マーカーを２つの腫瘍Ｌ４０５４及びＬ４０５５由来のＴＩＬで分析して、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３ ＴＩＬ拡張プロセス由来の最終ＴＩＬ製品を比較した。活性化及び疲弊マーカーは、Ｇｅｎ２プロセスとＧｅｎ３プロセスとの間で同等であった。

再刺激時のインターフェロンガンマ分泌採取日、Ｇｅｎ２の場合は２２日目、Ｇｅｎ３の場合は１６日目に、ＴＩＬは、Ｌ４０５４及びＬ４０５５の場合、コーティングした抗ＣＤ３プレートで一晩再刺激を受けた。Ｍ１０８５Ｔでの再刺激は、抗ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ１３７ビーズを使用して行った。すべての条件で再刺激の２４時間後に上清を収集し、上清を凍結させた。ＥＬＩＳＡによるＩＦＮγ分析を、同じＥＬＩＳＡプレートを使用して両方のプロセス由来の上清で同時に評価した。分析した３つの腫瘍で、Ｇｅｎ３プロセス由来のＩＦＮγのより高い産生が観察された。

培養培地中のＩＬ－２レベルの測定Ｇｅｎ２プロセスとＧｅｎ３プロセスとの間のＩＬ－２消費量を比較するために、腫瘍Ｌ４０５４及びＬ４０５５で、ＲＥＰの開始時、スケールアップ時、及び採取日に細胞上清を収集した。細胞培養上清中のＩＬ－２の量を、Ｒ＆Ｄ製の定量化ＥＬＩＳＡキットによって測定した。一般的な傾向は、Ｇｅｎ２プロセスと比較して、Ｇｅｎ３プロセスではＩＬ－２濃度が高いままであることを示す。これは、プロセス全体を通して培地のキャリーオーバーと相まってＧｅｎ３のＲＥＰ開始時のＩＬ－２濃度がより高い（６０００ＩＵ／ｍＬ）ことに起因する可能性がある。

代謝基質及び代謝物分析Ｄ－グルコース及びＬ－グルタミンなどの代謝基質のレベルを、全培地消費量の代わりに測定した。乳酸及びアンモニアなどのそれらの相互代謝物を測定した。グルコースは、ＡＴＰの形態でエネルギーを産生するためにミトコンドリアによって利用される培地中の単糖である。グルコースが酸化されると、乳酸が産生される（乳酸塩は乳酸のエステルである）。乳酸塩は、細胞の指数関数的成長期中に強く産生される。高レベルの乳酸塩は、細胞培養プロセスに悪影響を及ぼす。

Ｌ４０５４及びＬ４０５５の使用済み培地を、Ｇｅｎ２プロセス及びＧｅｎ３プロセスの両方で、ＲＥＰ開始時、スケールアップ時、及び採取日に収集した。使用済み培地の収集は、Ｇｅｎ２の場合は１１日目、１６日目、及び２２日目、Ｇｅｎ３の場合は７日目、１１日目、及び１６日目であった。上清を、グルコース、乳酸、グルタミン、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、及びアンモニアの濃度についてＣＥＤＥＸバイオアナライザーで分析した。

Ｌ－グルタミンは、細胞培養培地製剤に必要な不安定な必須アミノ酸である。グルタミンにはアミンが含まれており、このアミド構造基は、窒素を細胞に輸送して送達することができる。Ｌ－グルタミンが酸化すると、細胞によって有毒なアンモニア副産物が産生される。Ｌ－グルタミンの分解に対抗するために、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスの培地に、水溶液中でより安定しており、かつ自発的に分解しないＧｌｕｔａＭａｘ（商標）を補充した。２つの腫瘍株では、Ｇｅｎ３アームは、プロセス中のＬ－グルタミン及びＧｌｕｔａＭａｘ（商標）の減少、ならびにＲＥＰ全体でアンモニアの増加を示した。Ｇｅｎ２アームでは、Ｌ－グルタミン及びＧｌｕｔａＭａｘ（商標）の濃度が一定であり、アンモニア産生のわずかな増加が観察された。Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３のプロセスは、アンモニアについて採取日に同等であり、Ｌ－グルタミン分解にわずかな違いが見られた。

テロメアは、Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨによって繰り返される。Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨ技術を使用して、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスでのＬ４０５４及びＬ４０５５のテロメア反復の平均長を測定した。相対テロメア長（ＲＴＬ）の決定を、ＤＡＫＯ製のフローサイトメトリー分析用Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ＰＮＡキット／ＦＩＴＣを使用して計算した。Ｇｅｎ３は、Ｇｅｎ２と同等のテロメア長を示した。

ＣＤ３分析各プロセスで生成された細胞製品のクローン多様性を決定するために、Ｌ４０５４及びＬ４０５５の採取したＴＩＬ最終製品をサンプリングし、Ｔ細胞受容体のＣＤＲ３部分の配列決定によるクローン多様性分析についてアッセイした。

表５５は、採取したＴＩＬ細胞製品のＬ４０５４における共有される固有のＣＤＲ３配列パーセンテージに関するＧｅｎ２とＧｅｎ３との比較を示す。１９９個の配列がＧｅｎ３最終製品とＧｅｎ２最終製品との間で共有され、Ｇｅｎ３最終製品と共有されるＧｅｎ２由来の固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の９７．０７％に相当する。

表５６は、採取したＴＩＬ細胞製品のＬ４０５５における共有される固有のＣＤＲ３配列パーセンテージに関するＧｅｎ２とＧｅｎ３との比較を示す。１８３３個の配列がＧｅｎ３最終製品とＧｅｎ２最終製品との間で共有され、Ｇｅｎ３最終製品と共有されるＧｅｎ２由来の固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の９９．４５％に相当する。

ＣＭ１及びＣＭ２培地は、濾過せずに事前に調製し、腫瘍Ｌ４０５５の場合、Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスで使用するまで４℃で保持した。

Ｇｅｎ２及びＧｅｎ３プロセスのＲＥＰ開始日に、腫瘍Ｌ４０５５の場合、培地を３７℃で事前に２４時間温めた。

これらのプロセスで収集した上清中にＬＤＨは測定されなかった。

Ｍ１０８５Ｔ ＴＩＬ細胞計数を、Ｋ２ ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ細胞カウンターを使用して実行した。

腫瘍Ｍ１０８５Ｔでは、代謝分析用の上清、活性化及び疲弊マーカー分析用のＴＩＬ製品、テロメア長、及びＣＤ３－ＴＣＲｖｂ分析などの試料は入手できなかった。

結論この実施例では、３つの独立したドナー腫瘍組織を、機能的品質属性に加えて、拡張された表現型特徴付け、ならびにＧｅｎ２プロセス及びＧｅｎ３プロセス間の培地消費に関して比較する。

Ｇｅｎ２とＧｅｎ３のＲＥＰ前及びＲＥＰ拡張比較を、生成された全生細胞及び全有核細胞集団の生存率に関して評価した。採取日のＴＶＣ細胞用量は、Ｇｅｎ２（２２日）とＧｅｎ３（１６日）との間で同等ではなかった。Ｇｅｎ３細胞用量は、採取時に収集した全生細胞の約４０％であり、Ｇｅｎ２よりも低かった。

ＲＥＰ前採取は、７日目ではなく１１日目に起こり、ＲＥＰ採取は、１６日目ではなく２２日目に起こると仮定して、Ｇｅｎ３プロセスの外挿細胞数を計算した。どちらの場合も、Ｇｅｎ３は、Ｇｅｎ２プロセスと比較してＴＶＣの数値が近いことを示し、初期活性化により、ＴＩＬの成長が増強したことを示す。

Ｇｅｎ３プロセスでの追加フラスコ（２つまたは３つ）の外挿値の場合、処理される腫瘍サイズがより大きいと仮定し、記載されるようにプロセス毎に必要な最大断片数に到達する。２２日目のＧｅｎ２プロセスと比較して、Ｇｅｎ３プロセスの１６日目の採取時にＴＶＣで同様の用量に到達可能であり得ることが観察された。この観察は重要であり、培養物の早期活性化がＴＩＬ処理時間を短縮したことを示す。

Ｇｅｎ２とＧｅｎ３のＲＥＰ前及びＲＥＰ拡張比較を、生成された全生細胞及び全有核細胞集団の生存率に関して評価した。採取日のＴＶＣ細胞用量は、Ｇｅｎ２（２２日）とＧｅｎ３（１６日）との間で同等ではなかった。Ｇｅｎ３細胞用量は、採取時に収集した全生細胞の約４０％であり、Ｇｅｎ２よりも低かった。

表現型特徴付けに関して、Ｇｅｎ２プロセスと比較してＧｅｎ３プロセスでの３つの腫瘍でより高いＣＤ８＋及びＣＤ２８＋発現が観察された。

Ｇｅｎ３プロセスは、Ｇｅｎ２プロセスと比較してわずかに高いセントラルメモリー区画を示した。

Ｇｅｎ２プロセス及びＧｅｎ３プロセスは、Ｇｅｎ３プロセスの持続期間がより短いにもかかわらず、同等の活性化及び疲弊マーカーを示した。

ＩＦＮガンマ（ＩＦＮγ）産生は、分析した３つの腫瘍において、Ｇｅｎ２と比較してＧｅｎ３最終製品において３倍高かった。このデータは、Ｇｅｎ３プロセスがＧｅｎ２プロセスと比較して高機能でより強力なＴＩＬ製品を生成したことを示し、Ｇｅｎ３でのＣＤ８及びＣＤ２８発現がより高いことに起因する可能性がある。表現型特徴付けは、Ｇｅｎ２プロセスと比較して３つの腫瘍でＣＤ８＋、ＣＤ２８＋発現へのＧｅｎ３の肯定的な傾向を示唆した。

Ｇｅｎ２とＧｅｎ３との間のＴＩＬ最終製品のテロメア長は同等であった。

グルコース及び乳酸塩レベルは、Ｇｅｎ２最終製品とＧｅｎ３最終製品との間で同等であり、プロセス日毎に体積低下除去が実行されなかったこと、及びＧｅｎ２と比較してプロセスにおける培地全体の体積が少ないことに起因して、Ｇｅｎ３プロセスの培地の栄養素レベルが影響されなかったことを示唆する。

全体として、Ｇｅｎ３プロセスは、Ｇｅｎ２プロセスと比較してほぼ２倍の処理時間の短縮を示し、これにより、Ｇｅｎ３プロセスによって拡張されたＴＩＬ製品の売上原価（ＣＯＧ）の有意な削減がもたらされるであろう。

ＩＬ－２消費は、Ｇｅｎ２プロセスでのＩＬ－２消費の一般的な傾向を示しており、Ｇｅｎ３プロセスでは、古い培地が除去されなかったため、ＩＬ－２が高かった。

Ｇｅｎ３プロセスは、ＣＤＲ３ ＴＣＲａｂ配列分析によって測定されたより高いクローン多様性を示した。

Ｇｅｎ３プロセスを使用して、ＲＥＰ前の０日目のフィーダー及びＯＫＴ－３の追加により、ＴＩＬの初期活性化が可能になり、ＴＩＬ成長が可能になった。

表５７は、現在のＧｅｎ２プロセスと比較したＧｅｎ３プロセスの様々な実施形態及び成果を説明する。

実施例１０：例示的なＧＥＮ３プロセス（ＧＥＮ３．１とも称される）
この実施例は、「ＴＩＬ拡張のためのＧｅｎ２プロセスとＧｅｎ３プロセスとの間の比較可能性」に関するさらなる研究について説明する。Ｇｅｎ３プロセスを、表現型及び機能プロファイルを維持しながら、最終総生細胞（ＴＶＣ）出力を増やすことを目的として、プロセスの初期に活性化ステップを含むように修正した。以下に記載されるように、Ｇｅｎ３実施形態をさらなる実施形態として修正し、本明細書におけるこの実施例ではＧｅｎ３．１と称する。

いくつかの実施形態では、Ｇｅｎ３．１ ＴＩＬ製造プロセスは、以下の４つのオペレーター介入を有する。
１．腫瘍断片の単離及び活性化：プロセスの０日目に腫瘍を解剖し、最終断片を各々約３×３ｍｍ（合計で最大２４０個の断片）を生成し、１～４つのＧ－ＲＥＸ１００ＭＣＳフラスコ内で培養した。各フラスコは、最大６０個の断片、６，０００ＩＵのｒｈＩＬ－２、１５μｇのＯＫＴ３、及び２．５×１０^８個の放射線照射した同種異系単核細胞を補充した５００ｍＬのＣＭ１またはＤＭ１培地を含んだ。培養物を３７℃で６～８日間インキュベートした。
２．ＴＩＬ培養再活性化：７～８日目に、いずれの場合も６，０００ＩＵのｒｈＩＬ－２、３０μｇのＯＫＴ３、及び５×１０^８個の放射線照射した同種異系単核細胞を補充したＣＭ２またはＤＭ１培地をゆっくり添加することによって、培養物を補充した。フラスコの底にある既存の細胞を乱さないように注意した。培養物を３７℃で３～４日間インキュベートした。
３．培養のスケールアップ：１０～１１日目に生じる。培養のスケールアップ中に、Ｇ－ＲＥＸ１００ＭＣＳの全内容物を、いずれの場合も３，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した４ＬのＣＭ４またはＤＭ２を含むＧ－ＲＥＸ５００ＭＣＳフラスコに移した。採取するまでフラスコを３７℃で５～６日間インキュベートした。
４．採取／洗浄／製剤化：１６～１７日目に、フラスコを体積低下させ、プールする。細胞を濃縮し、１％ＨＳＡを含有するＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ ｐＨ７．４で洗浄した。洗浄した細胞懸濁液を、ＣｒｙｏＳｔｏｒ１０と１：１の比で配合し、３００ＩＵ／ｍＬの最終濃度までｒｈＩＬ－２を補充した。

ＤＰを制御された速度の凍結で凍結保存し、気相液体窒素中で保管した。＊完全標準ＴＩＬ培地１、２、または４（ＣＭ１、ＣＭ２、ＣＭ４）は、上記のように、合成培地（ＤＭ１またはＤＭ２）と称されるＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞無血清拡張培地の代用となり得た。

プロセスの説明０日目に、腫瘍を３回洗浄し、その後、３×３×３の最終断片に断片化した。全腫瘍を断片化した時点で、最終断片を均等にランダム化し、３つのプールに分割した。１つのランダム化断片プールを各群に導入し、３つの実験マトリックス毎に同じ数の断片を添加した。

全ＴＩＬ拡張プロセスにわたって、腫瘍Ｌ４０６３拡張を標準培地で行い、腫瘍Ｌ４０６４拡張を合成培地（ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ）で行った。培地の成分を本明細書に記載する。

ＣＭ１完全培地１：２ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、１０％ヒトＡＢ血清、ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）、２－メルカプトエタノール（５５ｕＭ）を補充したＲＰＭＩ＋グルタミン。６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終培地製剤

ＣＭ２完全培地２：５０％ ＣＭ１培地＋５０％ ＡＩＭ－Ｖ培地。６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終培地製剤

ＣＭ４完全培地４：ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）（２ｍＭ）を補充したＡＩＭ－Ｖ。３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終培地製剤

ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２６ｍＬ／Ｌ）を補充したＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ。

ＤＭ１：ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２６ｍＬ／Ｌ）、及びＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（３％）をＧｌｕｔａＭａｘ（２ｍＭ）とともに補充したＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ。６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終製剤。

ＤＭ２：ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２６ｍＬ／Ｌ）、及びＣＴＳ（商標）Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（３％）をＧｌｕｔａＭａｘ（２ｍＭ）とともに補充したＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ。３，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を補充した最終製剤。

使用したすべてのタイプの培地、すなわち、完全培地（ＣＭ）及び合成培地（ＤＭ）を事前に調製し、使用前日まで４℃で保持し、プロセス日前に事前に最長２４時間にわたってインキュベーター内で３７℃で温めた。

ＴＩＬ培養再活性化は、両方の腫瘍で７日目に起こった。スケールアップは、Ｌ４０６３では１０日目、Ｌ４０６４では１１日目に起こった。両方の培養物を採取し、１６日目に凍結保存した。

達成した結果Ｇｅｎ３．０プロセス及びＧｅｎ３．１プロセスの細胞数及び生存率％を決定した。すべての条件下での拡張は、この実施例に説明される詳細に従った。

腫瘍毎に、断片を同数の３つのプールに分割した。腫瘍のサイズが小さいため、１フラスコ当たりの断片の最大数は達成されなかった。３つの異なるプロセスについて、総生細胞及び細胞生存率を条件毎に評価した。細胞数を、７日目の再活性化のＴＶＣ、１０日目（Ｌ４０６４）または１１日目（Ｌ４０６３）のスケールアップのＴＶＣ、及び１６／１７日目の採取時のＴＶＣとして決定した。

７日目及び１０／１１日目の細胞数をＦＩＯで測定した。倍率拡張を、１６／１７日目の採取時のＴＶＣを７日目の再活性化日のＴＶＣで割ることによって計算した。３つの群を比較するために、採取日のＴＶＣを、０日目の培養物中に添加した断片の数で割って、１断片当たりの生細胞の平均を計算した。

Ｌ４０６３及びＬ４０６４について、細胞数及び生存率アッセイを行った。Ｇｅｎ３．１－試験プロセスは、両方の腫瘍でＧｅｎ３．０プロセスよりも多くの１断片当たりの細胞数をもたらした。

総生細胞数及び倍率拡張、プロセス中の生存率％再活性化時に、スケールアップして採取し、すべての条件で生存率％を行った。１６／１７日目の採取日に、最終ＴＶＣを生存率％の放出基準と比較した。評価したすべての条件は、７０％の生存率基準を超え、プロセス及び腫瘍全体で同等であった。

免疫表現型決定－ＴＩＬ最終製品の表現型特徴付け。最終製品をフローサイトメトリー分析にかけ、純度、分化、及びメモリーマーカーを試験した。集団の割合は、すべての条件で、ＴＣＲα／β細胞、ＣＤ４＋細胞、及びＣＤ８＋細胞で一貫していた。

ＲＥＰ ＴＩＬの拡張表現型分析を行った。ＴＩＬ製品は、両方の腫瘍でＧｅｎ３．０と比較してＧｅｎ３．１条件でより高いＣＤ４＋細胞パーセンテージを示し、両方の条件でＧｅｎ３．１条件と比較してＧｅｎ３．０でより高いＣＤ８＋集団由来のＣＤ２８＋細胞パーセンテージを示した。

Ｇｅｎ３．０プロセス及びＧｅｎ３．１プロセスから採取したＴＩＬは、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞でのＣＤ２７及びＣＤ５６発現、ならびにＣＤ４＋ゲート細胞集団での同等のＣＤ２８発現と同等の表現型マーカーを示した。ＴＩＬ最終製品のメモリーマーカーの比較：

１６日目に採取したＴＩＬの凍結試料を分析のために染色した。ＴＩＬメモリーステータスは、Ｇｅｎ３．０プロセスとＧｅｎ３．１プロセスとの間で同等であった。ＴＩＬ最終製品の活性化及び疲弊マーカーの比較：

活性化及び疲弊マーカーは、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞上でゲートされたＧｅｎ３．０プロセスとＧｅｎ３．１プロセスとの間で同等であった。

再刺激時のインターフェロンガンマ分泌採取したＴＩＬは、Ｌ４０６３及びＬ４０６４用のコーティングされた抗ＣＤ３プレートで一晩再刺激を受けた。Ｇｅｎ３．０プロセスと比較して、分析した２つの腫瘍で、より高いＧｅｎ３．１プロセスからのＩＦＮγ産生が観察された。

培養培地中のＩＬ－２レベルの測定すべての条件及びプロセス間のＩＬ－２消費レベルを比較するために、細胞上清を、７日目の再活性化の開始時、１０日目（Ｌ４０６４）／１１日目（Ｌ４０６３）のスケールアップ時、及び１６／１７日目の採取及び凍結時に収集した。その後、上清を解凍し、分析した。細胞培養上清中のＩＬ－２の量を、製造業者のプロトコルによって測定した。

全体的なＧｅｎ３プロセス及びＧｅｎ３．１プロセスは、同じ培地条件で評価した全プロセス中のＩＬ－２消費に関して同等であった。Ｌ４０６３及びＬ４０６４用に収集した使用済み培地のＩＬ－２濃度（ｐｇ／ｍＬ）分析。

代謝物分析使用済み培地の上清を、Ｌ４０６３及びＬ４０６４について、すべての条件で、７日目の再活性化の開始時、１０日目（Ｌ４０６４）または１１日目（Ｌ４０６３）のスケールアップ時、及び１６／１７日目の採取時に、Ｌ４０６３及びＬ４０６４から収集した。上清をＣＥＤＥＸバイオアナライザーでグルコース、乳酸塩、グルタミン、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、及びアンモニアの濃度について分析した。

合成培地は、完全培地（２ｇ／Ｌ）と比較してより高いグルコース濃度４．５ｇ／Ｌを有する。全体として、グルコースの濃度及び消費量は、各培地タイプ内でＧｅｎ３．０プロセス及びＧｅｎ３．１プロセスにおいて同等であった。

乳酸塩の増加が観察され、乳酸塩の増加は、Ｇｅｎ３．０条件とＧｅｎ３．１条件との間、及び再活性化拡張に使用した２つの培地（完全培地と合成培地）間で同等であった。

いくつかの事例では、標準基礎培地は、２ｍＭのＬ－グルタミンを含有し、培養条件下でＬ－グルタミンのＬ－グルタミン酸塩及びアンモニアへの自然分解を補うために、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ（商標）で補充された。

いくつかの事例では、使用した合成（無血清）培地は、基礎培地にＬ－グルタミンを含有せず、最終濃度が２ｍＭになるまでＧｌｕｔａＭａｘ（商標）のみで補充された。ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）は、Ｌ－アラニンとＬ－グルタミンのジペプチドであり、水溶液中でＬ－グルタミンよりも安定しており、グルタミン酸塩及びアンモニアに自発的に分解しない。代わりに、ジペプチドは、個々のアミノ酸に徐々に解離し、それにより、より低いが十分な濃度のＬ－グルタミンを維持して、強力な細胞成長を維持する。

いくつかの事例では、グルタミン濃度及びＧｌｕｔａＭａｘ（商標）濃度は、スケールアップ日にわずかに減少したが、採取日には再活性化日と比較して同様またはより近いレベルへの増加を示した。Ｌ４０６４の場合、グルタミン濃度及びＧｌｕｔａＭａｘ（商標）濃度は、全プロセス中、異なる条件間で同様の速度でわずかな分解を示した。

アンモニア濃度は、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘを含有する合成培地中で成長させた試料よりも、２ｍＭのグルタミン＋２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘを含有する標準培地中で成長させた試料で高かった。さらに、予想通り、培養の過程にわたってアンモニアの段階的増加または蓄積があった。３つの異なる試験条件間でアンモニア濃度に差はなかった。

Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨによるテロメア反復：Ｆｌｏｗ－ＦＩＳＨ技術を使用して、Ｇｅｎ３プロセス及びＧｅｎ３．１プロセス下でのＬ４０６３及びＬ４０６４のテロメア反復の平均長を測定した。相対テロメア長（ＲＴＬ）の決定を、ＤＡＫＯ製のフローサイトメトリー分析用Ｔｅｌｏｍｅｒｅ ＰＮＡキット／ＦＩＴＣを使用して計算した。テロメアアッセイを行った。試料のテロメア長を、対照細胞株（１３０１白血病）と比較した。対照細胞株は、長くて安定したテロメアを有する四倍体細胞株であり、相対テロメア長の計算を可能にする。両方の腫瘍で評価したＧｅｎ３プロセス及びＧｅｎ３．１プロセスは、同等のテロメア長を示した。

ＴＣＲ Ｖβレパートリー分析
各プロセスで生成された細胞製品のクローン多様性を決定するために、ＴＩＬ最終製品をＴ細胞受容体のＣＤＲ３部分の配列決定によるクローン多様性分析のためにアッセイした。

３つのパラメータを３つの条件間で比較した。
・固有のＣＤＲ３（ｕＣＤＲ３）の多様性指数
・ｕＣＤＲ３共有％
・ｕＣＤＲ３の上位８０％の場合：
○共有されるｕＣＤＲ３コピーの％を比較する
○固有のクロノタイプの頻度を比較する

対照及びＧｅｎ３．１試験、ＴＩＬで採取した細胞製品で共有される固有のＣＤＲ３配列パーセンテージ：９７５個の配列がＧｅｎ３試験最終産物とＧｅｎ３．１試験最終産物との間で共有され、Ｇｅｎ３．１と共有されるＧｅｎ３からの固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の８８％に相当する。

対照及びＧｅｎ３．１試験、ＴＩＬで採取した細胞製品で共有される固有のＣＤＲ３配列パーセンテージ：２１６３個の配列がＧｅｎ３試験最終製品とＧｅｎ３．１試験最終製品との間で共有され、Ｇｅｎ３．１と共有されるＧｅｎ３由来の固有のＣＤＲ３配列の上位８０％の８７％に相当する。

異なるプロセスについて、１６日目の採取時に収集した１×１０^６個の細胞から特定された固有のＣＤ３配列の数。Ｇｅｎ３．１試験条件は、試料内の固有のペプチドＣＤＲの数に基づいて、Ｇｅｎ３．０と比較してわずかに高いクローン多様性を示した。

シャノンエントロピー多様性指数は、比較のための信頼性の高い一般的なメトリックであり、両方の腫瘍に対するＧｅｎ３．１条件は、Ｇｅｎ３プロセスよりもわずかに高い多様性を示し、Ｇｅｎ３．１試験条件のＴＣＲ ＶβレパートリーがＧｅｎ３．０プロセスよりもポリクローナルであることを示唆する。

加えて、Ｇｅｎ３．１試験条件のＴＣＲ Ｖβレパートリーは、腫瘍Ｌ４０６３及びＬ４０６４の両方でＧｅｎ３．０プロセスの対応するレパートリーと８７％を超える重複を示した。

再活性化日のＧｅｎ３．１試験Ｌ４０６４の使用済み培地のＩＬ－２濃度の値は、期待値を下回った（Ｇｅｎ３．１対照及びＧｅｎ３．０条件と同様であった）。

低い値はピペッティングエラーに起因した可能性があったが、最小限の試料しか採取できなかったため、アッセイを繰り返すことができなかった。

結論０日目のフィーダー及びＯＫＴ－３を含むＧｅｎ３．１試験条件は、Ｇｅｎ３．０及びＧｅｎ３．１対照と比較して、１６日目の採取時の細胞用量のＴＶＣがより高いことを示した。Ｇｅｎ３．１試験条件のＴＶＣ最終製品は、Ｇｅｎ３．０よりも約２．５倍高かった。

試験した腫瘍試料の両方について、０日目にＯＫＴ－３及びフィーダーを添加したＧｅｎ３．１試験条件は、採取時にフラスコの最大容量に達した。これらの条件下で、０日目に最大４つのフラスコを開始した場合、最終細胞用量は、８０～１００×１０^９ＴＩＬである可能性があった。

最終ＴＩＬ製品の純度、疲弊、活性化、及びメモリーマーカーを含む表現型特徴付けなどのすべての品質属性が、Ｇｅｎ３．１試験とＧｅｎ３．０プロセスとの間で維持された。

最終ＴＩＬ製品のＩＦＮ－γ産生は、分析した２つの腫瘍において、Ｇｅｎ３．０と比較して、０日目にフィーダー及びＯＫＴ－３を添加したＧｅｎ３．１で３倍高く、Ｇｅｎ３．１プロセスが強力なＴＩＬ製品を生成したことを示唆する。

試験条件にわたって、グルコースまたは乳酸塩レベルに差異は観察されなかった。培地条件にわたって、Ｇｅｎ３．０プロセスとＧｅｎ３．１プロセスとの間でグルタミン及びアンモニアに差異は観察されなかった。培地上の低レベルのグルタミンは、細胞増殖を制限しておらず、培地へのＧｌｕｔａＭａｘ（商標）のみの添加が、細胞を増殖させるのに必要な栄養素を与えるのに十分であることを示唆する。

１１日目及び１０日目のスケールアップは、それぞれ、プロセスの採取日に到達した細胞数に関して大きな差異を示さず、代謝物の消費量は、全プロセスにわたって両方の場合で同等であった。この観察結果は、Ｇｅｎ３．０最適化プロセスが処理日に柔軟性を有し、それにより、製造スケジュールの柔軟性を促進することができることを示唆している。

０日目にフィーダー及びＯＫＴ－３を添加したＧｅｎ３．１プロセスは、Ｇｅｎ３．０と比較して、ＣＤＲ３ ＴＣＲａｂ配列分析によって測定されたより高いクローン多様性を示した。

図９２は、Ｇｅｎ３プロセス（Ｇｅｎ３最適化プロセス）の実施形態を説明する。標準培地及びＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ無血清培地を、Ｇｅｎ３最適化プロセスＴＩＬ拡張に使用することができる。ＣＴＳ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒの場合、培地のＧｌｕｔａＭａｘ（商標）を最終濃度４ｍＭに増加させるために無血清培地が推奨される。

Claims (346)

1. 組織培養デバイスであって、
   細胞を培養するための第１のガス透過性表面、細胞を培養するための第２のガス透過性表面、及び少なくとも前記第１のガス透過性表面から前記第２のガス透過性表面まで延在する１つ以上の側壁を有するデバイス本体と、
   ふるいであって、前記第１のガス透過性表面と前記第２のガス透過性表面との間で前記デバイス本体内に配置され、それによって、前記デバイスを、
   （ｉ）前記第１のガス透過性表面、前記１つ以上の側壁、及び前記ふるいによって画定される第１の区画、及び
   （ｉｉ）前記第２のガス透過性表面、前記１つ以上の側壁、及び前記ふるいによって画定される第２の区画に分離する、前記ふるいと、
   前記第１の区画と流体連通しているアクセスポートと、を備え、
   前記第２のガス透過性表面の断面積が、前記第１のガス透過性表面の断面積よりも大きい、前記組織培養デバイス。
2. 前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、実質的に平行である、請求項１に記載の組織培養デバイス。
3. 外部環境と気体連通したエアフィルタをさらに備える、請求項１または２に記載の組織培養デバイス。
4. 平面に対して第１の方向であって、前記第１のガス透過性表面が、前記平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる前記第１の方向で、前記組織培養デバイスを支持するように構成されたフレームをさらに備える、請求項１～３のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
5. 前記第１の方向で、前記第２のガス透過性表面が、前記第１のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる、請求項４に記載の組織培養デバイス。
6. 前記フレームが、前記平面に対して第２の方向であって、前記ふるいが、前記平面と前記第１のガス透過性表面との間で前記第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる前記第２の方向で、前記組織培養デバイスを支持するように構成される、請求項４または５に記載の組織培養デバイス。
7. 前記フレームが、前記平面に対して第３の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行ではない角度で位置決めされる前記第３の方向で、前記組織培養デバイスを支持するように構成される、請求項４～６のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
8. 前記第２の区画と流体連通した細胞採取出口をさらに備え、前記細胞採取出口が、前記第３の方向での前記組織培養デバイスの重心と前記平面との間に配置される、請求項７に記載の組織培養デバイス。
9. 前記組織培養デバイスを第１の方向、第２の方向、及び第３の方向に向けるように構成され、寸法決定される組織培養デバイス位置コントローラをさらに備え、前記第１の方向で、前記第１のガス透過性表面が、固定された平面及び前記第２のガス透過性表面に対して平行に、かつ前記固定された平面の上かつ前記第２のガス透過性表面の下に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、前記第２の方向で、前記ふるいが、前記平面と前記第１のガス透過性表面との間で前記第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、前記第３の方向で、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行ではない角度で位置決めされる、請求項１～８のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
10. 前記第２の区画と流体連通した培地入口をさらに備える、請求項１～９のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
11. 前記第２の区画と流体連通した廃棄出口をさらに備える、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
12. 前記第２の区画と流体連通した細胞採取出口をさらに備える、請求項１～６のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
13. 前記ふるいが、約３００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
14. 前記ふるいが、約３００ミクロン、約２００ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、約４０ミクロン、約３０ミクロン、または約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
15. 前記ふるいが、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
16. 前記ふるいが、腫瘍断片が前記第１の区画から前記第２の区画へと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が前記第１の区画から前記第２の区画へと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
17. 前記第２のガス透過性表面の断面積が、前記第１のガス透過性表面の断面積よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
18. 前記第１の区画の体積が、少なくとも約５０ｍＬである、請求項１～１７のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
19. 前記第２の区画の体積が、少なくとも約１００ｍＬである、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
20. 前記第２の区画の体積の、前記第１の区画の体積に対する比が、少なくとも約２：１である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
21. 前記第１のガス透過性表面と前記ふるいとの間の距離が、少なくとも約５ｃｍである、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
22. 前記第２のガス透過性表面と前記ふるいとの間の距離が、少なくとも約５ｃｍである、請求項１～２１のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
23. 前記デバイス本体が、前記アクセスポートを備えるネック部分をさらに備え、前記ネック部分が、前記第１のガス透過性表面と前記ふるいとの間に配置される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
24. 前記ふるいが、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体が前記ふるいを介して通過するのを防止する、請求項２３に記載の組織培養デバイス。
25. 請求項１～２４のいずれか１項に記載のデバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、
    （ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、前記患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、
    （ｂ）前記腫瘍断片または前記消化物を、前記アクセスポートを介して、前記組織培養デバイスの前記第１の区画に添加することであって、前記組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、前記第１のガス透過性表面、前記第２のガス透過性表面、及び前記ふるいが、前記平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる前記第１の方向にある、前記添加することと、
    （ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｄ）
    （１）以下のステップ：
    （ｘ）前記組織培養デバイスを、前記平面に対して第２の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記第１の方向に対して反転した位置にある前記第２の方向に回転させることによって、前記第２のＴＩＬ集団を前記ふるいを介して前記第２の区画に濾過し、それによって、前記第１の区画中の前記腫瘍断片または前記消化物の嵩高い破片を、前記第２の区画中の前記第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、及び
    （ｙ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、
    ここで、ステップ（ｘ）及びステップ（ｙ）が、前記組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、あるいは
    （２）以下のステップ：
    （ｐ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うステップであって、前記第１の期間中に、前記第２の拡張が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって、前記組織培養デバイスの前記第１のガス透過性表面上で行われる、前記第２の拡張を行うステップ、
    （ｑ）前記組織培養デバイスを、前記平面に対して第２の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記第１の方向に対して反転した位置にある前記第２の方向に回転させることによって、前記第２のＴＩＬ集団を前記ふるいを介して前記第２の区画に濾過し、それによって、前記第１の区画中の前記腫瘍断片または前記消化物の嵩高い破片を、前記第２の区画中の前記第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、及び
    （ｒ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって、前記第２の区画において前記第２の拡張の前記第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、
    ここで、ステップ（ｐ）、ステップ（ｑ）、及びステップ（ｒ）が、前記組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、のうちのいずれかを行うことと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）から取得された前記治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、前記採取することと、
    （ｆ）ステップ（ｅ）からの前記採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、前記方法。
26. 請求項１～２４のいずれか１項に記載のデバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、
    （ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、前記患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、
    （ｂ）前記腫瘍断片または前記消化物を、前記アクセスポートを介して、前記組織培養デバイスの前記第１の区画に添加することであって、前記組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、前記第１のガス透過性表面、前記第２のガス透過性表面、及び前記ふるいが、前記平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる前記第１の方向にある、前記添加することと、
    （ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
    （ｄ）
    （１）以下のステップ：
    （ｘ）前記組織培養デバイスを、前記平面に対して第２の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記第１の方向に対して反転した位置にある前記第２の方向に回転させることによって、前記第２のＴＩＬ集団を前記ふるいを介して前記第２の区画に濾過し、それによって、前記第１の区画中の前記腫瘍断片または前記消化物の嵩高い破片を、前記第２の区画中の前記第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、及び
    （ｙ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、
    ここで、ステップ（ｘ）及びステップ（ｙ）が、前記組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、あるいは
    （２）以下のステップ：
    （ｐ）前記組織培養デバイスを、前記平面に対して第２の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記第１の方向に対して反転した位置にある前記第２の方向に回転させることによって、前記第２のＴＩＬ集団を前記ふるいを介して前記第２の区画に濾過し、それによって、前記第１の区画中の前記腫瘍断片または前記消化物の嵩高い破片を、前記第２の区画中の前記第２のＴＩＬ集団から分離するしステップ、
    （ｑ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うステップであって、前記第１の期間中に、前記第２の拡張が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって、前記第２の区画において、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第２の拡張を行うステップ、及び
    （ｒ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって、前記第２の区画において前記第２の拡張の前記第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、
    ここで、ステップ（ｐ）、ステップ（ｑ）、及びステップ（ｒ）が、前記組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、のうちのいずれかを行うことと、
    （ｅ）ステップ（ｄ）から取得された前記治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、前記採取することと、
    （ｆ）ステップ（ｅ）からの前記採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、前記方法。
27. 前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することが、前記第２のＴＩＬ集団の第２の細胞培養培地にＩＬ－２またはＯＫＴ－３のうちの少なくとも１つを添加することを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
28. 組織培養デバイス位置コントローラを使用して、前記組織培養デバイスを、第１の方向、第２の方向、及び第３の方向に向けることをさらに含み、前記第１の方向で、前記第１のガス透過性表面が、固定された平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、前記ふるいが、前記第１のガス透過性表面の上にあり、前記第２の方向で、前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、前記ふるいが、前記第１のガス透過性表面の下にあり、前記第３の方向で、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行ではない角度で位置決めされる、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記第１の拡張が、ＩＬ－２を含み、及び任意選択でＯＫＴ－３を含む前記細胞培養培地中で行われ、前記第２のＴＩＬ集団を産生する、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記第１の拡張が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む前記細胞培養培地中で行われる、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記第１の拡張が、約３～１４日間行われ、前記第２のＴＩＬ集団を取得する、請求項２５～３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記第２のＴＩＬ集団が、前記第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも５０倍多い、請求項２５～３１のいずれか１項に記載の方法。
33. ステップ（ｄ）（１）において、前記第２の拡張が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、前記第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われる、請求項２５～３２のいずれか１項に記載の方法。
34. ステップ（ｄ）（２）において、前記第２の拡張の前記第１の期間が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、前記第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、前記第２の拡張の前記第２の期間が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２を補充することによって行われる、請求項２５～３２のいずれか１項に記載の方法。
35. ステップ（ｄ）（２）において、前記第２の拡張の前記第１の期間が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、前記第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、前記第２の拡張の前記第２の期間を開始する前に、前記細胞培養培地の少なくとも一部分が、前記第２の区画から除去され、ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地が、前記第２の区画に導入され、前記第３のＴＩＬ集団が、前記第２の拡張の前記第２の期間培養される、請求項２６～３２のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記第２の拡張が、約７～１４日間行われ、前記第３のＴＩＬ集団を取得する、請求項２５～３５のいずれか１項に記載の方法。
37. 凍結乾燥プロセスを使用して、ステップ（ｆ）において前記採取されたＴＩＬ集団を含む前記注入バッグを凍結乾燥するステップをさらに含む、請求項２５～３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 前記凍結保存プロセスが、採取されたＴＩＬ集団の、凍結保存培地に対する１：１の比を使用して行われる、請求項３７に記載の方法。
39. 前記抗原提示細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３３～３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 前記ＰＢＭＣが、放射線照射されており、同種異系である、請求項３９に記載の方法。
41. 前記ＰＢＭＣが、ステップ（ｄ）の９～１４日目のいずれかで細胞培養物に添加される、請求項３９に記載の方法。
42. 前記抗原提示細胞が、人工抗原提示細胞である、請求項３２～３８のいずれか１項に記載の方法。
43. ステップ（ｅ）における前記採取が、膜ベースの細胞処理システムを使用して行われる、請求項２５～４２のいずれか１項に記載の方法。
44. ステップ（ｅ）における前記採取が、ＬＯＶＯ細胞処理システムを使用して行われる、請求項２５～４２のいずれか１項に記載の方法。
45. 前記複数の腫瘍断片が、約４～約５０個の断片を含み、各断片が、約２７ｍｍ^３の体積を有する、請求項２５～４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 前記複数の腫瘍断片が、約３０～約６０個の断片を含み、約１３００ｍｍ^３～約１５００ｍｍ^３の総体積を有する、請求項２５～４５のいずれか１項に記載の方法。
47. 前記複数の腫瘍断片が、約５０個の断片を含み、約１３５０ｍｍ^３の総体積を有する、請求項４６に記載の方法。
48. 前記複数の腫瘍断片が、約５０個の断片を含み、約１グラム～約１．５グラムの総質量を有する、請求項２５～４７のいずれか１項に記載の方法。
49. 前記複数の腫瘍断片が、約４個の断片を含む、請求項２５～４８のいずれか１項に記載の方法。
50. ステップ（ｄ）における前記細胞培養培地が、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－２１をさらに含む、請求項２５～４９のいずれか１項に記載の方法。
51. 前記ＩＬ－２濃度が、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬである、請求項２５～５０のいずれか１項に記載の方法。
52. 前記ＩＬ－１５濃度が、約５００ＩＵ／ｍＬ～約１００ＩＵ／ｍＬである、請求項５０に記載の方法。
53. 前記ＩＬ－２１濃度が、約２０ＩＵ／ｍＬ～約０．５ＩＵ／ｍＬである、請求項５０に記載の方法。
54. ステップ（ｆ）における前記注入バッグが、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌを含有する注入バッグである、請求項２５～５３のいずれか１項に記載の方法。
55. 前記凍結保存培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項３８に記載の方法。
56. 前記凍結保存培地が、７％～１０％のＤＭＳＯを含む、請求項５５に記載の方法。
57. ステップ（ｃ）における前記第１の拡張及びステップ（ｄ）における前記第２の拡張が、各々１０日間、１１日間、または１２日間の期間内に個別に行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
58. ステップ（ｃ）における前記第１の拡張及びステップ（ｄ）における前記第２の拡張が、各々１１日間の期間内に個別に行われる、請求項５７に記載の方法。
59. ステップ（ａ）～（ｆ）が、約１０日間～約２２日間の期間内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
60. ステップ（ａ）～（ｆ）が、約２０日間～約２２日間の期間内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
61. ステップ（ａ）～（ｆ）が、約１５日間～約２０日間の期間内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
62. ステップ（ａ）～（ｆ）が、約１０日間～約２０日間の期間内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
63. ステップ（ａ）～（ｆ）が、約１０日間～約１５日間の期間内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
64. ステップ（ａ）～（ｆ）が、２２日間以下で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
65. ステップ（ａ）～（ｆ）が、２０日間以下で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
66. ステップ（ａ）～（ｆ）が、１５日間以下で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
67. ステップ（ａ）～（ｆ）が、１０日間以下で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
68. ステップ（ａ）～（ｆ）及び凍結保存が、２２日間以下で行われる、請求項３５～５６のいずれか１項に記載の方法。
69. ステップ（ａ）～（ｆ）が、約１６または１７日間以内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
70. ステップ（ａ）～（ｆ）が、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２日間の期間内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
71. ステップ（ａ）～（ｆ）が、約１８日間～約２１日間の期間内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
72. 前記第１の拡張が、約１１日間の期間内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
73. 前記第２の拡張が、約１１日間の期間内で行われる、請求項６８に記載の方法。
74. 前記第１の拡張が、約７または８日間の期間内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
75. 前記第２の拡張の前記第１の期間が、約３または４日間以内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
76. 前記第２の拡張の前記第２の期間が、約５または６日間以内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
77. 前記第１の拡張が、約７または８日間の期間内で行われ、前記第２の拡張の前記第１の期間が、約３または４日間以内で行われ、前記第２の拡張の前記第２の期間が、約５または６日間以内で行われる、請求項２５～５６のいずれか１項に記載の方法。
78. ステップ（ａ）～（ｆ）が、約１６または１７日間以内で行われる、請求項７７に記載の方法。
79. ステップ（ｅ）において採取された前記治療的ＴＩＬ集団が、治療上有効な投与量の前記ＴＩＬに十分なＴＩＬを含む、請求項２５～７８のいずれか１項に記載の方法。
80. 治療上有効な投与量に十分なＴＩＬの数が、約２．３×１０^１０～約１３．７×１０^１０個である、請求項７９に記載の方法。
81. ステップ（ｄ）（１）において、前記第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間に分割され、前記第２のＴＩＬ集団に、前記第１の期間中にＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充され、系を開くことなく前記第２の期間中に追加の培養培地及びＩＬ－２が補充される、請求項２５または２６に記載の方法。
82. ステップ（ｄ）における前記第３のＴＩＬ集団が、対象に投与されると、増加した有効性、増加したインターフェロン－ガンマ産生、増加したポリクローン性、増加した平均ＩＰ－１０、及び／または増加した平均ＭＣＰ－１を提供する、請求項２５～８１のいずれか１項に記載の方法。
83. ステップ（ｄ）における前記第３のＴＩＬ集団が、対象に投与されると、少なくとも５倍以上のインターフェロン－ガンマ産生を提供する、請求項２５～８２のいずれか１項に記載の方法。
84. ステップ（ｄ）における前記第３のＴＩＬ集団が、前記第２のＴＩＬ集団と比較して、エフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞の増加した亜集団を含む治療的ＴＩＬ集団であり、前記治療的ＴＩＬ集団中の前記エフェクターＴ細胞及び／または前記セントラルメモリーＴ細胞が、前記第２の細胞集団から取得されたエフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞と比較して、ＣＤ２７＋を発現すること、ＣＤ２８＋を発現すること、より長いテロメア、増加したＣＤ５７発現、及び減少したＣＤ５６発現からなる群から選択される１つ以上の特徴を示す、請求項２５～８３のいずれか１項に記載の方法。
85. 前記第３のＴＩＬ集団から取得された前記エフェクターＴ細胞及び／または前記セントラルメモリーＴ細胞が、前記第２の細胞集団から取得されたエフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞と比較して、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現を示す、請求項８４に記載の方法。
86. 開放系と比較して、微生物汚染のリスクが低下する、請求項２５～８５のいずれか１項に記載の方法。
87. ステップ（ｆ）からの前記ＴＩＬが、患者に注入される、請求項２５～８６のいずれか１項に記載の方法。
88. 組織培養デバイスであって、
    第１の細胞培養容器であって、前記第１の細胞培養容器の第１の区画と流体連通している第１のアクセスポートを備え、前記第１の区画が、第１の内部体積及び細胞を培養するための第１のガス透過性表面によって少なくとも部分的に画定される、前記第１の細胞培養容器と、
    第２の細胞培養容器であって、前記第１の区画に流体的に接続された第２の区画を含み、前記第２の区画が、細胞を培養するための第２のガス透過性表面によって少なくとも部分的に画定され、前記第２の区画が、制限された体積及び拡張された体積で構成可能であり、前記制限された体積が、前記第２の区画内の前記第２のガス透過性表面の第１の利用可能な表面積に曝露された流体を保持するように構成され、前記拡張された体積が、前記第２の区画内の前記第２のガス透過性表面の第２の利用可能な表面積に曝露された流体を保持するように構成され、前記第１の利用可能な表面積が、前記第２の利用可能な表面積よりも小さい、前記第２の細胞培養容器と、を備える、前記組織培養デバイス。
89. 前記第１の細胞培養容器と前記第２の細胞培養容器との間の流体接続へのアクセスを提供するために前記第１の細胞培養容器内に配置された第２のアクセスポートと、前記第２のアクセスポートを横切って配置された第１のふるいと、をさらに備える、請求項８８に記載の組織培養デバイス。
90. 前記第１のふるいが、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体が前記第１のふるいを介して通過するのを防止する、請求項８９に記載の組織培養デバイス。
91. 前記第２の細胞培養デバイスに連結された制限手段をさらに備え、前記制限手段が、前記第２の区画を前記制限された体積に制限する第１の構成と、前記拡張された体積に対応する第２の構成と、を有する、請求項８８～９０のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
92. 前記制限手段が、１つ以上のクランプを含む、請求項９１に記載の組織培養デバイス。
93. 前記１つ以上のクランプが、前記第２の区画の内部体積を前記制限された体積から前記拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、前記第２の区画の前記内部体積における前記漸増が、前記第２のガス透過性表面の領域における前記第１の利用可能な表面積から前記第２の利用可能な表面積までの漸増に対応する、請求項９２に記載の組織培養デバイス。
94. 前記制限手段が、制限された体積の位置から、拡張された全体積の位置へと移行可能な障壁を含む、請求項９１に記載の組織培養デバイス。
95. 前記障壁が、トレイ摺動蓋を含む、請求項９４に記載の組織培養デバイス。
96. 前記第２の細胞培養デバイスが、可撓性側壁と、前記可撓性側壁を支持するように構成された基部と、を備え、前記障壁が、摺動する構成で前記基部に連結される、請求項９４または９５に記載の組織培養デバイス。
97. 前記トレイ摺動蓋が、前記第２の区画の内部体積において前記制限された体積から前記拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、前記第２の区画の前記内部体積における前記漸増が、前記第２のガス透過性表面の領域における前記第１の利用可能な表面積から前記第２の利用可能な表面積までの漸増に対応する、請求項９５または９６に記載の組織培養デバイス。
98. 前記障壁が、１つ以上の調節可能なスペーサーを含む、請求項９４に記載の組織培養デバイス。
99. 前記障壁が、前記第２の区画の内部体積において前記制限された体積から前記拡張された体積まで漸増させることを可能にするように構成され、前記第２の区画の前記内部体積における前記漸増が、前記第２のガス透過性表面の領域における前記第１の利用可能な表面積から前記第２の利用可能な表面積までの漸増に対応する、請求項９８に記載の組織培養デバイス。
100. 前記第１の利用可能な表面積の、前記制限された体積に対する第１の比が、前記第２の利用可能な表面積の、前記拡張された体積に対する第２の比と実質的に同一である、請求項８８～９９のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
101. 前記第２のガス透過性表面が、前記第２の細胞培養容器の表面全体を覆う、請求項８８～１００のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
102. 前記第２の細胞培養容器が、平面に対して第１の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる前記第１の方向で、基部によって支持される、請求項８８～１０１のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
103. 前記基部が、トレイ及びフレームのうちの少なくとも１つを含む、請求項１０２に記載の組織培養デバイス。
104. 前記基部が、前記平面に対して第２の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行ではない角度で位置決めされる前記第２の方向で、前記第２の細胞培養容器を支持するように構成される、請求項１０２に記載の組織培養デバイス。
105. 前記第２の区画と流体連通した採取出口をさらに備え、前記採取出口が、前記第２の細胞培養容器の表面に沿って配置される、請求項８８～１０４のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
106. 前記第１のガス透過性表面が、第１の断面積を有し、前記第２のガス透過性表面が、第２の断面積を有し、前記第２の断面積が、前記第１の断面積よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい、請求項８８～１０５のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
107. 前記第１の内部体積が、少なくとも約５０ｍＬである、請求項８８～１０６のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
108. 前記第２の区画の前記制限された体積が、少なくとも約１００ｍＬである、請求項８８～１０７のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
109. 前記制限された体積が、前記第１の内部体積よりも少なくとも約２倍大きい、請求項８８～１０８のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
110. 請求項８８～１０９のいずれか１項に記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、
     （ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、前記患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、
     （ｂ）前記腫瘍断片または前記消化物を、前記第１のアクセスポートを介して前記組織培養デバイスの前記第１の区画に添加することと、
     （ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
     （ｄ）前記１つ以上の制限手段を使用して、前記第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することと、
     （ｅ）前記第２のＴＩＬ集団を前記第２の区画に移すことであって、それによって、前記第１の区画中の前記腫瘍断片または前記消化物の嵩高い破片を、前記第２の区画中の前記第２のＴＩＬ集団から分離する、前記移すことと、
     （ｆ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生することと、
     （ｇ）ステップ（ｆ）から取得された前記治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｆ）からステップ（ｇ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、前記採取することと、
     （ｈ）ステップ（ｇ）からの前記採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、前記方法。
111. 請求項８８～１０９のいずれか１項に記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、
     （ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、前記患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、
     （ｂ）前記腫瘍断片または前記消化物を、前記第１のアクセスポートを介して前記組織培養デバイスの前記第１の区画に添加することと、
     （ｃ）細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第１のガス透過性表面上で行われ、ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
     （ｄ）前記第２のＴＩＬ集団の第２の拡張を行うことであって、前記第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間行われ、前記方法が、（Ｉ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって、前記第１のガス透過性表面上で前記第２の拡張の前記第１の期間を行うことと、（ＩＩ）前記第１の期間の後に前記ＴＩＬを数えあげることと、（ＩＩＩ）前記１つ以上の制限手段を使用して、前記ＴＩＬの数えあげに基づき、前記第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することと、（ＩＶ）前記第２のＴＩＬ集団を前記第２の区画に移すことと、（Ｖ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって、前記第２のガス透過性表面の前記使用可能な部分上で前記第２の拡張の前記第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することと、をさらに含み、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、ステップ（ｄ）（ＩＶ）からステップ（ｄ）（Ｖ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、前記第２の拡張を行うことと、
     （ｅ）ステップ（ｄ）から取得された前記治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、ステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、前記採取することと、
     （ｆ）ステップ（ｅ）からの前記採取されたＴＩＬ集団を注入バッグに移すことと、を含む、前記方法。
112. 組織培養デバイス位置コントローラを使用して、前記組織培養デバイスを、平面に対して第１の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる前記第１の方向に、ならびに前記平面に対して第２の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行ではない角度で位置決めされる前記第２の方向に向けることをさらに含む、請求項１１０または１１１に記載の方法。
113. 前記第１の拡張が、ＩＬ－２を含み、及び任意選択でＯＫＴ－３を含む前記細胞培養培地中で行われる、請求項１１０～１１２のいずれか１項に記載の方法。
114. 前記第１の拡張が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む前記細胞培養培地中で行われる、請求項１１０～１１２のいずれか１項に記載の方法。
115. 前記第１の拡張が、約３～１４日間行われ、前記第２のＴＩＬ集団を取得する、請求項１１０～１１４のいずれか１項に記載の方法。
116. 前記第２のＴＩＬ集団が、前記第１のＴＩＬ集団よりも数が少なくとも５０倍多い、請求項１１０～１１５のいずれか１項に記載の方法。
117. ステップ（ｆ）において、前記第２の拡張が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われる、請求項１１０～１１６のいずれか１項に記載の方法。
118. ステップ（ｆ）において、前記第２の拡張の前記第１の期間が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充することによって行われ、前記第２の拡張の前記第２の期間が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２を補充することによって行われる、請求項１１１に記載の方法。
119. 前記第１の拡張が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む前記細胞培養培地中で行われる、請求項１１８に記載の方法。
120. 前記第２の拡張が、約７～１４日間行われ、前記第３のＴＩＬ集団を取得する、請求項１１０～１１９のいずれか１項に記載の方法。
121. 凍結乾燥プロセスを使用して、ステップ（ｇ）において前記採取されたＴＩＬ集団を含む前記注入バッグを凍結乾燥するステップをさらに含む、請求項１１０～１２０のいずれか１項に記載の方法。
122. 前記凍結保存プロセスが、採取されたＴＩＬ集団の、凍結保存培地に対する１：１の比を使用して行われる、請求項１２１に記載の方法。
123. 前記抗原提示細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項１１７または１１９に記載の方法。
124. 前記ＰＢＭＣが、放射線照射されており、同種異系である、請求項１２３に記載の方法。
125. 前記ＰＢＭＣが、ステップ（ｆ）の９～１４日目のいずれかで細胞培養物に添加される、請求項１２３または１２４に記載の方法。
126. 前記抗原提示細胞が、人工抗原提示細胞である、請求項１１７または１１９に記載の方法。
127. ステップ（ｇ）における前記採取が、膜ベースの細胞処理システムを使用して行われる、請求項１１０～１２６のいずれか１項に記載の方法。
128. ステップ（ｇ）における前記採取が、ＬＯＶＯ細胞処理システムを使用して行われる、請求項１１０～１２６のいずれか１項に記載の方法。
129. 前記複数の腫瘍断片が、約４～約５０個の断片を含み、各断片が、約２７ｍｍ^３の体積を有する、請求項１１０～１２８のいずれか１項に記載の方法。
130. 前記複数の腫瘍断片が、約３０～約６０個の断片を含み、約１３００ｍｍ^３～約１５００ｍｍ^３の総体積を有する、請求項１１０～１２８のいずれか１項に記載の方法。
131. 前記複数の腫瘍断片が、約５０個の断片を含み、約１３５０ｍｍ^３の総体積を有する、請求項１３０に記載の方法。
132. 前記複数の腫瘍断片が、約５０個の断片を含み、約１グラム～約１．５グラムの総質量を有する、請求項１１０～１２８のいずれか１項に記載の方法。
133. 前記複数の腫瘍断片が、約４個の断片を含む、請求項１１０～１２８のいずれか１項に記載の方法。
134. 前記第２の拡張ステップにおける前記細胞培養培地が、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－２１をさらに含む、請求項１１０～１３３のいずれか１項に記載の方法。
135. 前記ＩＬ－２濃度が、約１０，０００ＩＵ／ｍＬ～約５，０００ＩＵ／ｍＬである、請求項１３４に記載の方法。
136. 前記ＩＬ－１５濃度が、約５００ＩＵ／ｍＬ～約１００ＩＵ／ｍＬである、請求項１３４に記載の方法。
137. 前記ＩＬ－２１濃度が、約２０ＩＵ／ｍＬ～約０．５ＩＵ／ｍＬである、請求項１３４に記載の方法。
138. ステップ（ｈ）における前記注入バッグが、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌを含有する注入バッグである、請求項１１０～１３７のいずれか１項に記載の方法。
139. 前記凍結保存培地が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む、請求項１２２に記載の方法。
140. 前記凍結保存培地が、７％～１０％のＤＭＳＯを含む、請求項１３９に記載の方法。
141. ステップ（ｃ）における前記第１の拡張及びステップ（ｆ）における前記第２の拡張が、各々１０日間、１１日間、または１２日間の期間内に個別に行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
142. ステップ（ｃ）における前記第１の拡張及びステップ（ｆ）における前記第２の拡張が、各々１１日間の期間内に個別に行われる、請求項１４１に記載の方法。
143. 前記ステップのすべてが、約１０日間～約２２日間の期間内に行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
144. 前記ステップのすべてが、約２０日間～約２２日間の期間内に行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
145. 前記のすべてが、約１５日間～約２０日間の期間内に行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
146. 前記ステップのすべてが、約１０日間～約２０日間の期間内に行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
147. 前記ステップのすべてが、約１０日間～約１５日間の期間内に行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
148. 前記ステップのすべてが、２２日間以下で行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
149. 前記ステップのすべてが、２０日間以下で行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
150. 前記ステップのすべてが、１５日間以下で行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
151. 前記ステップのすべてが、１０日間以下で行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
152. （１）前記組織培養デバイスの前記第１の培養容器が、外部環境へのアクセスを提供するために配置された第３のアクセスポートと、前記第３のアクセスポートを横切って配置された第２のふるいと、をさらに備え、前記第２のふるいが、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体が前記第２のふるいを介して通過するのを防止し、（２）前記腫瘍断片が、前記第１のアクセスポートを介して前記第１の区画に添加され、（３）ステップ（ｃ）における前記第１の拡張が、
     （ｉ）（１）ＩＬ－２を含有する細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養して、前記腫瘍断片から出るＴＩＬ及び前記腫瘍断片中に残存するＴＩＬを産生するステップ、
     （２）ステップ（ｉ）（１）において、前記腫瘍断片から出たＴＩＬを含む前記培養培地を、前記第３のアクセスポートを介して前記外部環境へと通すことによって、前記腫瘍断片中に残存したＴＩＬを、前記腫瘍断片から出たＴＩＬから分離するステップであって、前記第２のふるいが、腫瘍断片が前記第３のアクセスポートへと通過するのを遮断し、前記腫瘍断片中に残存したＴＩＬを、前記第１の区画中に保持させる、前記分離するステップ、及び
     （３）任意選択で、前記腫瘍断片を消化して、腫瘍消化物を産生するステップ、ならびに
     （ｉｉ）前記腫瘍断片または腫瘍消化物中に残存する前記ＴＩＬの細胞培養培地を補充して、前記第２のＴＩＬ集団を産生するステップに分割される、請求項１１０または１１１に記載の方法。
153. ステップ（ａ）～（ｈ）が、約１６または１７日間以内で行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
154. ステップ（ａ）～（ｈ）が、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２日間の期間内で行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
155. ステップ（ａ）～（ｈ）が、約１８日間～約２１日間の期間内で行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
156. 前記第１の拡張が、約１１日間の期間内で行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
157. 前記第２の拡張が、約１１日間の期間内で行われる、請求項１５６に記載の方法。
158. 前記第１の拡張が、約７または８日間の期間内で行われる、請求項１１０～１４０のいずれか１項に記載の方法。
159. 前記第２の拡張の前記第１の期間が、約３または４日間以内で行われる、請求項１１１に記載の方法。
160. 前記第２の拡張の前記第２の期間が、約５または６日間以内で行われる、請求項１１１または１５９に記載の方法。
161. 前記第１の拡張が、約７または８日間の期間内で行われ、前記第２の拡張の前記第１の期間が、約３または４日間以内で行われ、前記第２の拡張の前記第２の期間が、約５または６日間以内で行われる、請求項１１１に記載の方法。
162. ステップ（ａ）～（ｈ）が、約１６または１７日間以内で行われる、請求項１６１に記載の方法。
163. ステップ（ｇ）において採取された前記治療的ＴＩＬ集団が、治療上有効な投与量の前記ＴＩＬに十分なＴＩＬを含む、請求項１１０～１６２のいずれか１項に記載の方法。
164. 治療上有効な投与量に十分なＴＩＬの数が、約２．３×１０^１０～約１３．７×１０^１０個である、請求項１６３に記載の方法。
165. ステップ（ｆ）において、前記第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間に分割され、前記第１の期間中に、前記第２の拡張が、前記第２の区画の前記制限された体積中で行われ、前記第２の期間中に、前記第２の拡張が、前記第２の区画の前記拡張された体積中で行われる、請求項１１０に記載の方法。
166. ステップ（ｆ）において、前記第２の拡張が、第１の期間及び第２の期間に分割され、前記第２のＴＩＬ集団に、前記第１の期間中に、抗原提示細胞が補充され、系を開くことなく前記第２の期間中に追加の培養培地及びＩＬ－２が補充される、請求項１１７に記載の方法。
167. 前記第１の期間が、約５日間である、請求項１６５または１６６に記載の方法。
168. 前記第２の期間が、約６日間である、請求項１６５～１６７のいずれか１項に記載の方法。
169. 前記第１の拡張が、約１１日間の期間内で行われる、請求項１６５～１６８のいずれか１項に記載の方法。
170. ステップ（ａ）～（ｈ）が、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２日間の期間内で行われる、請求項１６５～１６８のいずれか１項に記載の方法。
171. ステップ（ｆ）における前記第３のＴＩＬ集団が、対象に投与されると、増加した有効性、増加したインターフェロン－ガンマ産生、増加したポリクローン性、増加した平均ＩＰ－１０、及び／または増加した平均ＭＣＰ－１を提供する、請求項１１０～１７０のいずれか１項に記載の方法。
172. ステップ（ｆ）における前記第３のＴＩＬ集団が、対象に投与されると、少なくとも５倍以上のインターフェロン－ガンマ産生を提供する、請求項１１０～１７１のいずれか１項に記載の方法。
173. ステップ（ｆ）における前記第３のＴＩＬ集団が、前記第２のＴＩＬ集団と比較して、エフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞の増加した亜集団を含む治療的ＴＩＬ集団であり、前記治療的ＴＩＬ集団中の前記エフェクターＴ細胞及び／または前記セントラルメモリーＴ細胞が、前記第２の細胞集団から取得されたエフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞と比較して、ＣＤ２７＋を発現すること、ＣＤ２８＋を発現すること、より長いテロメア、増加したＣＤ５７発現、及び減少したＣＤ５６発現からなる群から選択される１つ以上の特徴を示す、請求項１１０～１７２のいずれか１項に記載の方法。
174. 前記第３のＴＩＬ集団から取得された前記エフェクターＴ細胞及び／または前記セントラルメモリーＴ細胞が、前記第２の細胞集団から取得されたエフェクターＴ細胞及び／またはセントラルメモリーＴ細胞と比較して、増加したＣＤ５７発現及び減少したＣＤ５６発現を示す、請求項１７３に記載の方法。
175. 開放系と比較して、微生物汚染のリスクが低下する、請求項１１０～１７４のいずれか１項に記載の方法。
176. ステップ（ｈ）からの前記ＴＩＬが、患者に注入される、請求項１１０～１７５のいずれか１項に記載の方法。
177. 前記１つ以上の制限手段を使用して、前記ＴＩＬの数えあげに基づき、前記第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することが、前記第２の細胞培養容器の少なくとも一部分を広げることを含む、請求項１１０～１７６のいずれか１項に記載の方法。
178. 前記１つ以上の制限手段を使用して、前記ＴＩＬの数えあげに基づき、前記第２のガス透過性表面を、その使用可能な部分に構成することが、前記第２の細胞培養容器の内側表面が、前記構成の前に画定された前記内側表面よりも大きな体積を画定し、異なる構成で前記１つ以上の制限手段を用いて画定することができる前記内側表面よりも小さな体積を画定するように、前記細胞培養デバイスに前記１つ以上の制限手段を適用することを含む、請求項１１０～１７７のいずれか１項に記載の方法。
179. バイオリアクターシステムであって、
     請求項１～２４のいずれか１項に記載の組織培養デバイスと、
     前記組織培養デバイスの前記第１の区画及び前記第２の区画の一方または両方に流体的に接続された新鮮培地容器と、
     前記組織培養デバイスの前記第２の区画に流体的に接続された廃棄培地容器と、
     １つ以上のポンプであって、
     （ｉ）前記新鮮培地容器から、前記組織培養デバイスの前記第１の区画及び前記第２の区画の一方または両方へと、新鮮培地を圧送し、
     （ｉｉ）前記第２の区画から前記廃棄材料容器へと廃棄培地を圧送し、及び／または
     （ｉｉｉ）前記第２の区画から注入バッグへと細胞を圧送するように構成された、前記１つ以上のポンプと、を備える、前記バイオリアクターシステム。
180. バイオリアクターシステムであって、
     請求項８８～１０９のいずれか１項に記載の組織培養デバイスと、
     前記組織培養デバイスの前記第１の区画及び前記第２の区画の一方または両方に流体的に接続された新鮮培地容器と、
     １つ以上のポンプであって、
     （ｉ）前記新鮮培地容器から、前記組織培養デバイスの前記第１の区画及び前記第２の区画の一方または両方へと、新鮮培地を圧送し、及び／または
     （ｉｉｉ）前記第２の区画から、細胞を細胞培養廃棄材料から濾過し、濾過した細胞を残存物容器に、細胞培養廃棄材料を廃棄材料容器に堆積させるように構成されたインラインタンジェンシャルフロー濾過デバイスに細胞を圧送するように構成された、前記１つ以上のポンプと、を備える、前記バイオリアクターシステム。
181. 前記１つ以上のポンプが、吸引、圧力差、または強制空気を介して作用する材料を移動させるように構成される、請求項１７９または１８０に記載のバイオリアクター。
182. 前記組織培養デバイスが、インキュベーター内に配置される、請求項１７９～１８１のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
183. 前記組織培養デバイスが、前記組織培養デバイスの撹拌を行うように少なくとも二次元で移動するように構成された基部によるものである、請求項１７９～１８２のいずれか１項に記載のバイオリアクター。
184. 前記新鮮培地容器、前記廃棄材料容器、及び前記１つ以上のポンプのうちの１つ以上が、前記インキュベーターの外側に配置される、請求項１８２または１８３に記載のバイオリアクター。
185. 細胞培養デバイスであって、
     第１の壁と第２の壁との間に画定された内部空間と、
     前記内部空間の第１のチャンバと第２のチャンバとの間に配置されたダイアフラムであって、前記ダイアフラムが、
     前記内部空間の遠位端から境界まで延在する第１のセクションであって、前記第１のセクションが、液体が前記第１のセクションを介して前記第１のチャンバから前記第２のチャンバへと通過することを防止するために液体不透過性である、前記第１のセクションと、
     前記境界から前記内部空間の近位端に向かって延在する第２のセクションであって、前記第２のセクションが、液体が前記第２のセクションを介して前記第１のチャンバから前記第２のチャンバへと通過することを可能にするために液体透過性である、前記第２のセクションと、を備え、
     前記ダイアフラムの前記第１のセクション及び前記第１の壁が、前記細胞培養デバイスが垂直方向にあるときに所定の体積までの液体を保持するように構成される、前記第１のチャンバ中のウェルを画定し、前記所定の体積が、前記第１のチャンバの最大充填体積未満である、前記細胞培養デバイス。
186. 前記細胞培養デバイスが前記垂直方向にあるときに、前記内部空間の前記近位端が、前記内部空間の前記遠位端の上に垂直に位置決めされる、請求項１８５に記載の細胞培養デバイス。
187. 前記第１のチャンバが、前記第１の壁と前記ダイアフラムとの間に配置され、前記第２のチャンバが、前記第２の壁と前記ダイアフラムとの間に配置される、請求項１８５または１８６に記載の細胞培養デバイス。
188. 前記第１のチャンバに流体的に接続された少なくとも１つの入口ポートと、前記ウェルに流体的に接続された第１の出口ポートと、前記第２のチャンバに流体的に接続された第２の出口ポートと、をさらに備える、請求項１８５～１８７のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
189. 前記少なくとも１つの入口ポート、前記第１の出口ポート、及び前記第２の出口ポートの各々が、液体がそれらを介して通過することを可能にする開放構成と、液体がそれらを介して通過することを防止する閉鎖構成と、を含む、請求項１８８に記載の細胞培養デバイス。
190. 前記少なくとも１つの入口ポートが、前記内部空間の前記近位端に、またはそれに近接して位置決めされ、前記第１の出口ポート及び前記第２の出口ポートが、前記内部空間の前記遠位端に、またはそれに近接して位置決めされる、請求項１８８または１８９に記載の細胞培養デバイス。
191. 前記第１の壁及び／または前記第２の壁が、ガス透過性材料を含む、請求項１８５～１９０のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
192. 前記第１の壁及び／または前記第２の壁が、可撓性材料を含む、請求項１８５～１９１のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
193. 前記第１の壁及び／または前記第２の壁が、剛性材料を含む、請求項１８５～１９１のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
194. 前記第１の壁の内側表面が、細胞を培養するために構成された領域を含む、請求項１８５～１９３のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
195. 前記ダイアフラムの前記第２のセクションが、５μｍ未満である孔径を有するふるいを備える、請求項１８５～１９４のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
196. 前記ダイアフラムが、前記内部空間の前記遠位端から前記内部空間の前記近位端まで延在する、請求項１８５～１９５のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
197. 前記ダイアフラムが、前記内部空間の前記近位端から空間的に離れている近位縁部で終端し、前記ダイアフラムが、前記内部空間の前記遠位端から前記近位縁部まで延在する、請求項１８５～１９５のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
198. 前記近位縁部が、前記第２の壁に取り付けられている、請求項１９７に記載の細胞培養デバイス。
199. 前記ダイアフラムが、前記遠位端と前記近位端との間の距離の半分未満まで延在する、請求項１９７または１９８に記載の細胞培養デバイス。
200. 前記第２のセクションが、前記境界から前記近位縁部まで延在する、請求項１９７～１９９のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
201. 前記ダイアフラムが、可撓性である、請求項１８５～２００のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
202. 前記ダイアフラムが、剛性である、請求項１８５～２００のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
203. 前記細胞培養デバイスが、前記所定の体積を超える過剰量の液体が前記第１のチャンバに導入された場合に、前記過剰量の液体の少なくとも一部分が、前記細胞培養デバイスが前記垂直方向にあるときに、前記ダイアフラムの前記第２のセクションを介して前記第１のチャンバから前記第２のチャンバまで流れることを可能にするように構成されている、請求項１８５～２０２のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
204. 前記第１のチャンバの前記最大充填体積の、前記所定の体積に対する比が、約１．５～約１５である、請求項１８５～２０３のいずれか１項に記載の細胞培養デバイス。
205. 細胞処理システムであって、
     請求項１８５～２０４のいずれか１項に記載の細胞培養デバイスと、
     細胞をインビトロで培養するために構成された１つ以上の容器であって、前記１つ以上の容器が、前記細胞培養デバイスの前記内部空間に流体的に接続される、前記１つ以上の容器と、を備える、前記細胞処理システム。
206. 前記１つ以上の容器が、１つ以上の培養フラスコ、１つ以上の培養バッグ、及び／または１つ以上の培養プレートを含む、請求項２０５に記載の細胞処理システム。
207. インキュベーターをさらに備え、前記細胞培養デバイス及び前記１つ以上の容器が、所定の大気条件で前記インキュベーター内に封入されている、請求項２０５または２０６に記載の細胞処理システム。
208. 前記細胞培養デバイスの前記第１の壁及び前記第２の壁が、可撓性であり、前記細胞処理システムが、前記第１の壁及び前記第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて前記細胞培養デバイスの前記内部空間中を液体が流れるのを防止するように構成される前記１つ以上の解放可能な固定具をさらに備える、請求項２０５～２０７のいずれか１項に記載の細胞処理システム。
209. 前記１つ以上の解放可能な固定具の前記場所が、前記細胞培養デバイスの入口ポートと前記ダイアフラムとの間にある、請求項２０８に記載の細胞処理システム。
210. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、クランプ、クリップ、ストラップ、弾性バンド、タイ、及び／または磁気固定具を含む、請求項２０８または２０９に記載の細胞処理システム。
211. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、前記細胞培養デバイスに沿った所定の場所にそれぞれ位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む、請求項２０８～２０９のいずれか１項に記載の細胞処理システム。
212. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、前記細胞培養デバイス上の第１の位置から前記細胞培養デバイス上の第２の位置まで摺動するように構成される摺動固定具を含む、請求項２０８～２１１のいずれか１項に記載の細胞処理システム。
213. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、前記摺動固定具と前記ダイアフラムとの間に位置決めされた固定位置固定具をさらに含む、請求項２１２に記載の細胞処理システム。
214. 前記細胞培養デバイスが、水平方向から前記垂直方向まで回転可能である、請求項２０５～２１３のいずれか１項に記載の細胞処理システム。
215. 前記水平方向で、前記ダイアフラムが、前記第１のチャンバの上に垂直に位置決めされ、前記第２のチャンバが、前記ダイアフラムの上に垂直に位置決めされる、請求項２１４に記載の細胞処理システム。
216. 前記細胞培養デバイスを前記水平方向から前記垂直方向まで回転させるように構成された可動プラットフォームをさらに備える、請求項２１５に記載の細胞処理システム。
217. 前記細胞培養デバイスの前記第１の壁が、ガス透過性である、請求項２０５～２１６のいずれか１項に記載の細胞処理システム。
218. ガス透過性トレイをさらに備え、前記細胞培養デバイスが、前記細胞培養デバイスの前記第１の壁が前記ガス透過性トレイに対して入れられるように、前記ガス透過性トレイ上に配置される、請求項２０５～２１７のいずれか１項に記載の細胞処理システム。
219. 前記第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスと、前記第２のチャンバに流体的に接続された透過物収集デバイスと、をさらに備える、請求項２０５～２１８のいずれか１項に記載の細胞処理システム。
220. 前記残存物収集デバイスが、ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える、請求項２１９に記載の細胞処理システム。
221. 細胞懸濁液を濃縮する方法であって、前記方法が、
     請求項１８５～２０４のいずれか１項に記載の組織培養デバイスの第１のチャンバに、液体中に懸濁された細胞を含む細胞懸濁液を導入することであって、前記細胞懸濁液が、前記細胞培養デバイスの前記ウェル中に保持することができる前記所定の体積の液体よりも大きい初期体積を有する、前記導入することと、
     前記細胞培養デバイスが前記垂直方向にあるときに、前記細胞懸濁液の液体の一部分が、前記ダイアフラムの前記第２のセクションを介して前記第１のチャンバから前記第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、前記細胞懸濁液の体積を、前記初期体積から低下させることと、を含む、前記方法。
222. 前記初期体積の前記細胞懸濁液を前記第１のチャンバに導入する前に、前記細胞培養デバイスを前記垂直方向に向けることをさらに含む、請求項２２１に記載の方法。
223. 前記初期体積の前記細胞懸濁液を前記第１のチャンバに導入した後に、前記細胞培養デバイスを前記垂直方向に向けることをさらに含む、請求項２２１に記載の方法。
224. 前記細胞懸濁液の前記細胞が、前記第１のチャンバから前記第２のチャンバへと通過することを防止する、請求項２２１～２２３のいずれか１項に記載の方法。
225. 前記液体を前記細胞培養デバイスの前記第２のチャンバから除去することをさらに含む、請求項２２１～２２４のいずれか１項に記載の方法。
226. 前記細胞懸濁液の体積が、前記初期体積から最終体積まで低下する、請求項２２１～２２５のいずれか１項に記載の方法。
227. 前記最終体積が、前記ウェル中に保持することができる液体の前記所定の体積とほぼ等しい、請求項２２６に記載の方法。
228. 前記初期体積の、前記最終体積に対する比が、約１．５～約１５である、請求項２２６または２２７に記載の方法。
229. 前記細胞懸濁液の体積が前記最終体積まで低下した後に、前記細胞培養デバイスの前記第１のチャンバから前記細胞懸濁液を除去することをさらに含む、請求項２２６～２２８のいずれか１項に記載の方法。
230. 前記第１のチャンバから前記細胞懸濁液を除去することが、前記第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに前記細胞懸濁液を移すことを含む、請求項２２９に記載の方法。
231. 前記残存物収集デバイスが、ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える、請求項２３０に記載の方法。
232. 前記細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、請求項２２１～２３１のいずれか１項に記載の方法。
233. 前記細胞培養デバイスの前記第１のチャンバに前記細胞懸濁液を導入することが、前記細胞培養デバイスの前記内部空間に流体的に接続される１つ以上の容器から前記細胞培養デバイスに前記細胞懸濁液を移すことを含む、請求項２２１～２３２のいずれか１項に記載の方法。
234. 前記１つ以上の容器が、１つ以上の培養フラスコ、１つ以上の培養バッグ、及び／または１つ以上の培養プレートを含む、請求項２３３に記載の方法。
235. 前記１つ以上の容器及び前記細胞培養デバイスが、所定の大気条件でインキュベーター内に封入されている、請求項２３３または２３４に記載の方法。
236. 細胞を拡張する方法であって、
     請求項１８５～２０４のいずれか１項に記載の組織培養デバイスの前記内部空間に、初期量の細胞を播種することと、
     前記細胞培養デバイスが水平方向にある間に、前記細胞培養デバイスの前記第１の壁の内部表面上で細胞培養培地中の細胞を培養して、拡張された量の細胞を産生することと、
     前記拡張された量の細胞を、前記細胞培養培地に懸濁させて、初期体積を有する細胞懸濁液を形成することと、
     前記細胞培養デバイスを前記水平方向から前記垂直方向まで回転させることであって、前記細胞懸濁液が、前記細胞培養デバイスの前記第１のチャンバを少なくとも部分的に充填する、前記回転させることと、
     前記細胞培養デバイスが前記垂直方向にあるときに、前記細胞懸濁液の前記細胞培養培地の一部分が、前記ダイアフラムの前記第２のセクションを介して前記第１のチャンバから前記第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、前記細胞懸濁液の体積を、前記初期体積から低下させることと、を含む、前記方法。
237. １つ以上の容器中の第１の細胞集団を拡張して、第２の細胞集団を産生することをさらに含み、前記初期量の細胞が、前記第２の細胞集団の一部分である、請求項２３６に記載の方法。
238. 前記細胞培養デバイスの前記第１の壁及び前記第２の壁が、可撓性であり、前記方法が、１つ以上の解放可能な固定具を適用して、前記第１の壁及び前記第２の壁を一緒に圧縮し、前記１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて前記細胞培養デバイスの前記内部空間中を細胞及び／または細胞培養培地が流れるのを防止することをさらに含む、請求項２３６または２３７に記載の方法。
239. 前記１つ以上の解放可能な固定具を適用することが、前記初期量の細胞を前記細胞培養デバイスの前記内部空間に播種する前に行われる、請求項２３８に記載の方法。
240. 前記細胞が、前記内部空間の前記近位端と前記１つ以上の解放可能な固定具の場所との間に配置される前記第１の壁の前記内側表面の領域上で培養される、請求項２３８または２３９に記載の方法。
241. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、前記内部空間の前記近位端と前記ダイアフラムとの間の前記細胞培養デバイスに沿って所定の場所に各々位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む、請求項２４０に記載の方法。
242. 所定の順序で前記複数の解放可能な固定具を解放して、前記細胞を培養するために利用可能である前記第１の壁の前記内側表面の領域を徐々に増加させることをさらに含む、請求項２４１に記載の方法。
243. 前記複数の解放可能な固定具が、前記細胞懸濁液の体積を低下させる前に解放される、請求項２４２に記載の方法。
244. 前記複数の解放可能な固定具が、前記細胞培養デバイスを前記水平方向から前記垂直方向に回転させる前に解放される、請求項２４３に記載の方法。
245. 前記細胞懸濁液の体積を低下させている間、または低下させた後に、前記液体を前記細胞培養デバイスの前記第２のチャンバから除去することをさらに含む、請求項２３６～２４４のいずれか１項に記載の方法。
246. 前記細胞懸濁液の体積が、前記初期体積から最終体積まで低下する、請求項２３６～２４５のいずれか１項に記載の方法。
247. 前記最終体積が、前記ウェル中に保持することができる液体の前記所定の体積とほぼ等しい、請求項２４６に記載の方法。
248. 前記初期体積の、前記最終体積に対する比が、約１．５～約１５である、請求項２４６または２４７に記載の方法。
249. 前記細胞懸濁液の体積が前記最終体積まで低下した後に、前記細胞培養デバイスの前記第１のチャンバから前記細胞懸濁液を除去することをさらに含む、請求項２４６～２４８のいずれか１項に記載の方法。
250. 前記第１のチャンバから前記細胞懸濁液を除去することが、前記第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに前記細胞懸濁液を移すことを含む、請求項２４９に記載の方法。
251. 前記残存物収集デバイスが、ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える、請求項２５０に記載の方法。
252. 前記細胞が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む、請求項２３６～２５１のいずれか１項に記載の方法。
253. 前記細胞培養培地が、ＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示フィーダー細胞のうちの１つ以上を含有する、請求項２３６～２５２のいずれか１項に記載の方法。
254. 前記細胞が、約４日間～約１１日間の期間にわたって培養される、請求項２３６～２５３のいずれか１項に記載の方法。
255. 前記初期量の細胞が、１０^６～１０^９個の細胞を含む、請求項２３６～２５４のいずれか１項に記載の方法。
256. 前記拡張された量の細胞を前記細胞培養培地に懸濁させて、前記細胞懸濁液を形成するステップを行う前に、前記方法が、
     前記１つ以上の解放可能な固定具を解放するステップと、
     前記細胞培養デバイスの第１の出口ポートを開放し、前記内部空間中の前記細胞培養培地の流体レベルが、前記内部空間中の前記第１の出口ポートの位置にほぼ等しくなるまで、使用済み細胞培養培地を前記第１の出口ポートを介して排出させるステップと、
     前記細胞培養デバイスの入口ポートを開放し、ＩＬ－２が補充され、任意選択でＯＫＴ－３が補充された追加の細胞培養培地を前記内部空間に供給するステップと、
     前記細胞を培養して、前記拡張された量の細胞よりも多い量の細胞を産生するステップと、を行うことをさらに含む、請求項２３８～２４４のいずれか１項に記載の方法。
257. 前記細胞培養デバイスが前記水平方向に位置決めされるとき、前記内部空間中の前記入口ポートの位置が、前記第１の出口ポートの位置より上に垂直に位置する、請求項２５６に記載の方法。
258. 前記細胞が、ＩＬ－２が補充され、任意選択でＯＫＴ－３が補充された前記追加の細胞培養培地中で約４～約８日間培養される、請求項２５６または２５７に記載の方法。
259. 前記細胞が、ＩＬ－２が補充され、任意選択でＯＫＴ－３が補充された前記追加の細胞培養培地中で約５～約７日間培養される、請求項２５８に記載の方法。
260. 前記細胞培養デバイスの前記第１の壁が、ガス透過性である、請求項２３６～２５９のいずれか１項に記載の方法。
261. 細胞を培養するためのシステムであって、前記システムが、
     組織培養デバイスであって、
     細胞を培養するための第１のガス透過性表面、細胞を培養するための第２のガス透過性表面、及び少なくとも前記第１のガス透過性表面から前記第２のガス透過性表面まで延在する１つ以上の側壁を有するデバイス本体と、
     ふるいであって、前記第１のガス透過性表面と前記第２のガス透過性表面との間で前記デバイス本体内に配置され、それによって、前記デバイス本体を、
     （ｉ）前記第１のガス透過性表面、前記１つ以上の側壁、及び前記ふるいによって画定される第１の区画、及び
     （ｉｉ）前記第２のガス透過性表面、前記１つ以上の側壁、及び前記ふるいによって画定される第２の区画に分離する、前記ふるいと、
     前記第１の区画と流体連通しているアクセスポートと、
     前記第２の区画と流体連通した細胞採取出口と、を備える、前記組織培養デバイスと、
     請求項１８５～２０４のいずれか１項に記載の組織培養デバイスであって、前記細胞培養デバイスが、前記細胞培養デバイスの前記第１のチャンバと流体連通した入口ポートを備え、前記入口ポートが、前記組織培養デバイスの前記第２の区画と流体連通した前記細胞採取出口に流体的に接続している、前記組織培養デバイスと、を備える、前記システム。
262. 前記第２のガス透過性表面の断面積が、前記第１のガス透過性表面の断面積よりも大きい、請求項２６１に記載のシステム。
263. 前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、実質的に平行である、請求項２６１または２６２に記載のシステム。
264. 外部環境と気体連通したエアフィルタをさらに備える、請求項２６１～２６３のいずれか１項に記載のシステム。
265. 平面に対して第１の方向であって、前記第１のガス透過性表面が、前記平面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる前記第１の方向で、前記組織培養デバイスを支持するように構成されたフレームをさらに備える、請求項２６１～２６４のいずれか１項に記載のシステム。
266. 前記第１の方向で、前記第２のガス透過性表面が、前記第１のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる、請求項２６５に記載のシステム。
267. 前記フレームが、前記平面に対して第２の方向であって、前記ふるいが、前記平面と前記第１のガス透過性表面との間で前記第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされる前記第２の方向で、前記組織培養デバイスを支持するように構成される、請求項２６５または２６６に記載のシステム。
268. 前記フレームが、前記平面に対して第３の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行ではない角度で位置決めされる前記第３の方向で、前記組織培養デバイスを支持するように構成される、請求項２６５～２６７のいずれか１項に記載のシステム。
269. 前記細胞採取出口が、前記第３の方向での前記組織培養デバイスの重心と前記平面との間に配置される、請求項２６８に記載のシステム。
270. 前記組織培養デバイスを第１の方向、第２の方向、及び第３の方向に向けるように構成され、寸法決定される組織培養デバイス位置コントローラをさらに備え、前記第１の方向で、前記第１のガス透過性表面が、固定された平面及び前記第２のガス透過性表面に対して平行に、かつ前記固定された平面の上かつ前記第２のガス透過性表面の下に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、前記第２の方向で、前記ふるいが、前記平面と前記第１のガス透過性表面との間で前記第２のガス透過性表面に対して平行に、かつその上に空間をあけられて実質的に水平に位置決めされ、前記第３の方向で、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行ではない角度で位置決めされる、請求項２６１～２６９のいずれか１項に記載のシステム。
271. 前記第２の区画と流体連通した培地入口をさらに備える、請求項２６１～２７０のいずれか１項に記載のシステム。
272. 前記第２の区画と流体連通した廃棄出口をさらに備える、請求項２６１～２７１のいずれか１項に記載のシステム。
273. 前記ふるいが、約３００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含む、請求項２６１～２７２のいずれか１項に記載のシステム。
274. 前記ふるいが、約３００ミクロン、約２００ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、約４０ミクロン、約３０ミクロン、または約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む、請求項２６１～２７２のいずれか１項に記載のシステム。
275. 前記ふるいが、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む、請求項２６１～２７２のいずれか１項に記載のシステム。
276. 前記ふるいが、腫瘍断片が前記第１の区画から前記第２の区画へと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が前記第１の区画から前記第２の区画へと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成される、請求項２６１～２７５のいずれか１項に記載のシステム。
277. 前記第２のガス透過性表面の断面積が、前記第１のガス透過性表面の断面積よりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍大きい、請求項２６１～２７６のいずれか１項に記載のシステム。
278. 前記第２の区画の体積が、少なくとも約１００ｍＬである、請求項２６１～２７７のいずれか１項に記載のシステム。
279. 前記第２の区画の体積の、前記第１の区画の体積に対する比が、少なくとも約２：１である、請求項２６１～２７８のいずれか１項に記載のシステム。
280. 前記第１のガス透過性表面と前記ふるいとの間の距離が、少なくとも約５ｃｍである、請求項２６１～２７９のいずれか１項に記載のシステム。
281. 前記第２のガス透過性表面と前記ふるいとの間の距離が、少なくとも約５ｃｍである、請求項２６１～２８０のいずれか１項に記載のシステム。
282. 前記デバイス本体が、前記アクセスポートを備えるネック部分をさらに備え、前記ネック部分が、前記第１のガス透過性表面と前記ふるいとの間に配置される、請求項２６１～２８１のいずれか１項に記載のシステム。
283. 前記ふるいが、約３０ミクロンより大きな平均直径を有する任意の物体が前記ふるいを介して通過するのを防止する、請求項２６１～２８２のいずれか１項に記載のシステム。
284. 前記細胞培養デバイスが、前記垂直方向にある、請求項２６１～２８３のいずれか１項に記載のシステム。
285. 前記細胞培養デバイスが、前記ウェルと流体連通した第１の出口ポートと、前記第２のチャンバと流体連通した第２の出口ポートと、をさらに備える、請求項２６１～２８４のいずれか１項に記載のシステム。
286. 前記第１の出口ポートに流体的に接続された残存物収集デバイス、及び／または前記第２の出口ポートに流体的に接続された透過物収集デバイスをさらに備える、請求項２８５に記載のシステム。
287. 前記残存物収集デバイスが、ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える、請求項２８６に記載の方法。
288. 前記組織培養デバイスの前記細胞採取出口を前記細胞培養デバイスの前記入口ポートに接続するチューブをさらに備える、請求項２６１～２８７のいずれか１項に記載のシステム。
289. 前記組織培養デバイスが、前記細胞培養デバイスよりも垂直に高く位置決めされ、細胞懸濁液が、前記組織培養デバイスの前記細胞採取出口から前記細胞培養デバイスの前記入口ポートまで重力によって運ばれることを可能にする、請求項２６１～２８８のいずれか１項に記載のシステム。
290. 請求項２６１～２８９のいずれか１項に記載のシステムを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、
     （ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、前記患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、
     （ｂ）前記腫瘍断片または前記消化物を、前記アクセスポートを介して、前記組織培養デバイスの前記第１の区画に添加することであって、前記組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、前記第１のガス透過性表面、前記第２のガス透過性表面、及び前記ふるいが、前記平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる前記第１の方向にある、前記添加することと、
     （ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第１のガス透過性表面上で行われる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
     （ｄ）
     （１）以下のステップ：
     （ｉ）前記組織培養デバイスを、前記平面に対して第２の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記第１の方向に対して反転した位置にある前記第２の方向に回転させることによって、前記第２のＴＩＬ集団を前記ふるいを介して前記第２の区画に濾過し、それによって、前記第１の区画中の前記腫瘍断片または前記消化物の嵩高い破片を、前記第２の区画中の前記第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、及び
     （ｉｉ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、
     ここで、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）が、前記組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、あるいは
     （２）以下のステップ：
     （ｉｉｉ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うステップであって、前記第１の期間中に、前記第２の拡張が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって、前記組織培養デバイスの前記第１のガス透過性表面上で行われる、前記第２の拡張を行うステップ、
     （ｉｖ）前記組織培養デバイスを、前記平面に対して第２の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記第１の方向に対して反転した位置にある前記第２の方向に回転させることによって、前記第２のＴＩＬ集団を前記ふるいを介して前記第２の区画に濾過し、それによって、前記第１の区画中の前記腫瘍断片または前記消化物の嵩高い破片を、前記第２の区画中の前記第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、及び
     （ｖ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって、前記第２の区画において前記第２の拡張の前記第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、
     ここで、ステップ（ｉｉｉ）、ステップ（ｉｖ）、及びステップ（ｖ）が、前記組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、のうちのいずれかを行うことと、
     （ｅ）ステップ（ｄ）から取得された前記治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、採取することが、
     （３）前記細胞培養培地に前記治療的ＴＩＬ集団を懸濁させるステップであって、前記第２の区画において初期体積を有する細胞懸濁液を形成する、前記懸濁させるステップと、
     （４）前記細胞採取出口を介して前記第２の区画から前記細胞培養デバイスの前記入口ポートに前記細胞懸濁液を移すステップと、
     （５）前記細胞懸濁液を前記細胞培養デバイスの前記第１のチャンバに導入するステップと、
     （６）前記細胞培養デバイスが前記垂直方向にあるときに、前記細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、前記ダイアフラムの前記第２のセクションを介して前記第１のチャンバから前記第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、前記細胞懸濁液の体積を、前記初期体積から低下させるステップと、を含む、前記採取することと、を含む、前記方法。
291. 請求項２６１～２８９のいずれか１項に記載のシステムを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、
     （ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、前記患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、
     （ｂ）前記腫瘍断片または前記消化物を、前記アクセスポートを介して、前記組織培養デバイスの前記第１の区画に添加することであって、前記組織培養デバイスが、平面に対して第１の方向であって、前記第１のガス透過性表面、前記第２のガス透過性表面、及び前記ふるいが、前記平面に対して平行に、実質的に水平に位置決めされる前記第１の方向にある、前記添加することと、
     （ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第１のガス透過性表面上で行われる、前記第２のＴＩＬ集団を産生することと、
     （ｄ）
     （１）以下のステップ：
     （ｉ）前記組織培養デバイスを、前記平面に対して第２の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記第１の方向に対して反転した位置にある前記第２の方向に回転させることによって、前記第２のＴＩＬ集団を前記ふるいを介して前記第２の区画に濾過し、それによって、前記第１の区画中の前記腫瘍断片または前記消化物の嵩高い破片を、前記第２の区画中の前記第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、及び
     （ｉｉ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、
     ここで、ステップ（ｉ）及びステップ（ｉｉ）が、前記組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、あるいは
     （２）以下のステップ：
     （ｉｉｉ）前記組織培養デバイスを、前記平面に対して第２の方向であって、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記第１の方向に対して反転した位置にある前記第２の方向に回転させることによって、前記第２のＴＩＬ集団を前記ふるいを介して前記第２の区画に濾過し、それによって、前記第１の区画中の前記腫瘍断片または前記消化物の嵩高い破片を、前記第２の区画中の前記第２のＴＩＬ集団から分離するステップ、
     （ｉｖ）第１の期間及び第２の期間に分割された第２の拡張を行うステップであって、前記第１の期間中に、前記第２の拡張が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって、前記第２の区画において、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第２の拡張を行うステップ、及び
     （ｖ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって、前記第２の区画において前記第２の拡張の前記第２の期間を行って、第３のＴＩＬ集団を産生するステップであって、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記第２の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生するステップ、
     ここで、ステップ（ｉｉｉ）、ステップ（ｉｖ）、及びステップ（ｖ）が、前記組織培養デバイスを開くことなく順に行われる、ステップ、のうちのいずれかを行うことと、
     （ｅ）ステップ（ｄ）から取得された前記治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、採取することが、
     （３）前記細胞培養培地に前記治療的ＴＩＬ集団を懸濁させるステップであって、前記第２の区画において初期体積を有する細胞懸濁液を形成する、前記懸濁させるステップと、
     （４）前記細胞採取出口を介して前記第２の区画から前記細胞培養デバイスの前記入口ポートに前記細胞懸濁液を移すステップと、
     （５）前記細胞懸濁液を前記細胞培養デバイスの前記第１のチャンバに導入するステップと、
     （６）前記細胞培養デバイスが前記垂直方向にあるときに、前記細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、前記ダイアフラムの前記第２のセクションを介して前記第１のチャンバから前記第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、前記細胞懸濁液の体積を、前記初期体積から低下させるステップと、を含む、前記採取することと、を含む、前記方法。
292. 前記細胞懸濁液を前記第１のチャンバに導入する前に、前記細胞培養デバイスを前記垂直方向に向けることをさらに含む、請求項２９０または２９１に記載の方法。
293. 前記細胞懸濁液を前記第１のチャンバに導入した後に、前記細胞培養デバイスを前記垂直方向に向けることをさらに含む、請求項２９０または２９１に記載の方法。
294. 前記細胞懸濁液の前記細胞が、前記第１のチャンバから前記第２のチャンバへと通過することを防止する、請求項２９０～２９３のいずれか１項に記載の方法。
295. 前記細胞培養培地を前記細胞培養デバイスの前記第２のチャンバから除去することをさらに含む、請求項２９０～２９４のいずれか１項に記載の方法。
296. 前記細胞懸濁液の体積が、前記初期体積から最終体積まで低下する、請求項２９０～２９５のいずれか１項に記載の方法。
297. 前記最終体積が、前記ウェル中に保持することができる液体の前記所定の体積とほぼ等しい、請求項２９６に記載の方法。
298. 前記初期体積の、前記最終体積に対する比が、約１．５～約１５である、請求項２９６または２９７に記載の方法。
299. 前記細胞懸濁液の体積が前記最終体積まで低下した後に、前記細胞培養デバイスの前記第１のチャンバから前記細胞懸濁液を除去することをさらに含む、請求項２９６～２９８のいずれか１項に記載の方法。
300. 前記第１のチャンバから前記細胞懸濁液を除去することが、前記第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに前記細胞懸濁液を移すことを含む、請求項２９９に記載の方法。
301. 前記残存物収集デバイスが、ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える、請求項３００に記載の方法。
302. ステップ（ｅ）が、前記細胞培養培地に前記治療的ＴＩＬ集団を懸濁させる前に、前記第２の区画と流体連通した廃棄出口を介して前記第２の区画から前記細胞培養培地の一部分を除去することをさらに含む、請求項２９０～３０１のいずれか１項に記載の方法。
303. 前記細胞培養培地の一部分を除去することが、前記組織培養デバイスが前記第２の方向にある間に、前記廃棄出口の場所に基づいて前記細胞培養培地を所定のレベルまで排出させることを含む、請求項３０２に記載の方法。
304. ステップ（ｅ）が、前記第２の区画から前記細胞培養デバイスの前記入口ポートに前記細胞懸濁液を移す前に、前記組織培養デバイスを前記平面に対して第３の方向に回転させることをさらに含む、請求項２９０～３０３のいずれか１項に記載の方法。
305. 前記第３の方向で、前記第１のガス透過性表面及び前記第２のガス透過性表面が、前記平面に対して平行ではない角度で位置決めされる、請求項３０４に記載の方法。
306. 前記組織培養デバイスが前記第３の方向にある間に、前記細胞懸濁液が、前記第２の区画から前記細胞培養デバイスの前記入口ポートに重力によって移される、請求項３０４に記載の方法。
307. ステップ（ｄ）（１）において、前記第２の拡張が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２、任意選択でＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、前記第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われる、請求項２９０～３０６のいずれか１項に記載の方法。
308. ステップ（ｄ）（２）において、前記第２の拡張の前記第１の期間が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、前記第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、前記第２の拡張の前記第２の期間が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２を補充することによって行われる、請求項２９０～３０６のいずれか１項に記載の方法。
309. ステップ（ｄ）（２）において、前記第２の拡張の前記第１の期間が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、前記第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、前記第２の拡張の前記第２の期間を開始する前に、前記細胞培養培地の少なくとも一部分が、前記第２の区画から除去され、ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地が、前記第２の区画に導入され、前記第３のＴＩＬ集団が、前記第２の拡張の前記第２の期間培養される、請求項２９０～３０６のいずれか１項に記載の方法。
310. 組織培養デバイスであって、
     第１の細胞培養容器であって、前記第１の細胞培養容器の第１の区画と流体連通している第１のアクセスポートを備え、前記第１の区画が、第１の内部体積及び細胞を培養するための第１のガス透過性表面によって少なくとも部分的に画定される、前記第１の細胞培養容器と、
     請求項１８５～２０４のいずれか１項に記載の組織培養デバイスであって、前記細胞培養デバイスの前記内部空間が、前記第１の区画に流体的に接続され、前記細胞培養デバイスの前記第１の壁の内側表面が、細胞を培養するために構成された第２のガス透過性表面を備える、前記細胞培養デバイスと、を備える、前記組織培養デバイス。
311. 前記第１の細胞培養容器と前記細胞培養デバイスとの間の流体接続へのアクセスを提供するために前記第１の細胞培養容器内に配置された第２のアクセスポートと、前記第２のアクセスポートを横切って配置されたふるいと、をさらに備える、請求項３１０に記載の組織培養デバイス。
312. 前記細胞培養デバイスの前記第１の壁及び前記第２の壁が、可撓性であり、前記組織培養デバイスが、前記第１の壁及び前記第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて前記細胞培養デバイスの前記内部空間中を液体が流れるのを防止するように構成される１つ以上の解放可能な固定具をさらに備える、請求項３１０または３１１に記載の組織培養デバイス。
313. 前記１つ以上の解放可能な固定具の場所が、前記細胞培養デバイスの入口ポートと前記ダイアフラムとの間にある、請求項３１２に記載の組織培養デバイス。
314. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、クランプ、クリップ、ストラップ、弾性バンド、タイ、及び／または磁気固定具を含む、請求項３１２または３１３に記載の組織培養デバイス。
315. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、前記細胞培養デバイスに沿った所定の場所にそれぞれ位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む、請求項３１２～３１４のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
316. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、前記細胞培養デバイス上の第１の位置から前記細胞培養デバイス上の第２の位置まで摺動するように構成される摺動固定具を含む、請求項３１２～３１５のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
317. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、前記摺動固定具と前記ダイアフラムとの間に位置決めされた固定位置固定具をさらに含む、請求項３１６に記載の組織培養デバイス。
318. 前記細胞培養デバイスが、水平方向から前記垂直方向まで回転可能である、請求項３１０～３１７のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
319. 前記水平方向で、前記ダイアフラムが、前記第１のチャンバの上に垂直に位置決めされ、前記第２のチャンバが、前記ダイアフラムの上に垂直に位置決めされる、請求項３１８に記載の組織培養デバイス。
320. 前記第１のチャンバが、残存物収集デバイスに流体的に接続され、前記第２のチャンバが、透過物収集デバイスに流体的に接続される、請求項３１０～３１９のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
321. 前記残存物収集デバイスが、ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える、請求項３２０に記載の組織培養デバイス。
322. 前記ふるいが、約３００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約７５ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約４０ミクロン未満の平均孔径を有する細孔を含む、請求項３１１～３２１のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
323. 前記ふるいが、約３００ミクロン、約２００ミクロン、約１００ミクロン、約７５ミクロン、約５０ミクロン、約４０ミクロン、約３０ミクロン、または約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む、請求項３１１～３２１のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
324. 前記ふるいが、約３００ミクロン～約２００ミクロン、約２００ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約７５ミクロン、約７５ミクロン～約５０ミクロン、約５０ミクロン～約４０ミクロン、約４０ミクロン～約３０ミクロン、または約３０ミクロン～約２５ミクロンの平均孔径を有する細孔を含む、請求項３１１～３２１のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
325. 前記ふるいが、腫瘍断片が前記第１の区画から前記細胞培養デバイスへと通過することを実質的に防止し、培地及び／または細胞が第１の区画から前記細胞培養デバイスへと流れることを実質的に可能にするようにサイズ決定され、構成される、請求項３１１～３２４のいずれか１項に記載の組織培養デバイス。
326. 請求項３１０～３２５のいずれか１項に記載の組織培養デバイスを使用して、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を治療的ＴＩＬ集団に拡張する方法であって、
     （ａ）患者から取得された腫瘍試料を、複数の腫瘍断片またはその消化物へと処理することによって、前記患者から切除された腫瘍からの第１のＴＩＬ集団を取得することと、
     （ｂ）前記腫瘍断片または前記消化物を、前記第１のアクセスポートを介して前記組織培養デバイスの前記第１の区画に添加することと、
     （ｃ）ＩＬ－２が補充され、及び任意選択でＯＫＴ－３及び／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）が補充された細胞培養培地中で前記第１のＴＩＬ集団を培養することによって第１の拡張を行って、第２のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第１の拡張が、前記組織培養デバイスの前記第１のガス透過性表面上で行われる、前記第２のＴＩＬ集団を産生すると、
     （ｄ）前記第２のＴＩＬ集団を前記細胞培養デバイスの前記内部空間に移すことであって、それによって、前記第１の区画中の前記腫瘍断片または前記消化物の嵩高い破片を、前記細胞培養デバイス中の前記第２のＴＩＬ集団から分離する、前記移すことと、
     （ｅ）前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地を補充することによって第２の拡張を行って、第３のＴＩＬ集団を産生することであって、前記第３のＴＩＬ集団が、治療的ＴＩＬ集団であり、前記細胞培養デバイスが水平方向にある間に、前記第２の拡張が、前記第２のガス透過性表面上で行われる、前記第３のＴＩＬ集団を産生することと、
     （ｆ）ステップ（ｅ）から取得された前記治療的ＴＩＬ集団を採取することであって、治療的ＴＩＬ集団を採取することが、
     （１）前記細胞培養培地に前記治療的ＴＩＬ集団を懸濁させるステップであって、初期体積を有する細胞懸濁液を形成する、前記懸濁させるステップと、
     （２）前記細胞培養デバイスを前記水平方向から前記垂直方向まで回転させるステップであって、前記細胞懸濁液が、前記細胞培養デバイスの前記第１のチャンバを少なくとも部分的に充填する、前記回転させるステップと、
     （３）前記細胞培養デバイスが前記垂直方向にあるときに、前記細胞懸濁液の細胞培養培地の一部分が、前記ダイアフラムの前記第２のセクションを介して前記第１のチャンバから前記第２のチャンバへと通過することを可能にすることによって、前記細胞懸濁液の体積を、前記初期体積から低下させるステップと、を含む、前記採取することと、を含む、前記方法。
327. 前記細胞培養デバイスの前記第１の壁及び前記第２の壁が、可撓性であり、前記方法が、１つ以上の解放可能な固定具を適用して、前記第１の壁及び前記第２の壁を一緒に圧縮し、１つ以上の解放可能な固定具の場所を超えて前記細胞培養デバイスの前記内部空間中をＴＩＬ及び／または細胞培養培地が流れるのを防止することをさらに含む、請求項３２６に記載の方法。
328. 前記１つ以上の解放可能な固定具を適用することが、ステップ（ａ）～（ｄ）のうちのいずれか１つの前に行われる、請求項３２７に記載の方法。
329. 前記第２の拡張が、前記内部空間の前記近位端と前記１つ以上の解放可能な固定具の場所との間に配置される前記第２のガス透過性表面上で行われる、請求項３２７または３２８に記載の方法。
330. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、前記内部空間の前記近位端と前記ダイアフラムとの間の前記細胞培養デバイスに沿って所定の場所に各々位置決めされる複数の解放可能な固定具を含む、請求項３２９に記載の方法。
331. 所定の順序で前記複数の解放可能な固定具を解放して、前記第２の拡張中に前記ＴＩＬを拡張するために利用可能である前記第２のガス透過性表面の領域を増加させることをさらに含む、請求項３３０に記載の方法。
332. 前記第２の拡張が、少なくとも第１の期間及び第２の期間行われ、前記複数の解放可能な固定具のうちの第１のものが、前記第１の期間の後に解放され、前記複数の解放可能な固定具のうちの第２のものが、前記第２の期間の後に解放される、請求項３２９または３３０に記載の方法。
333. 前記第２の拡張の前記第１の期間が、前記第２のＴＩＬ集団の前記細胞培養培地に追加のＩＬ－２、ＯＫＴ－３、及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）を補充して、第３のＴＩＬ集団を産生することによって行われ、前記複数の解放可能な固定具のうちの前記第１のものが解放される前に、前記第２の拡張の前記第１の期間からの前記細胞培養培地の少なくとも一部分が、前記細胞培養デバイスの前記内部空間から除去され、前記複数の解放可能な固定具のうちの前記第１のものが解放された後に、ＩＬ－２が補充された追加の細胞培養培地が、前記細胞培養デバイスの前記内部空間に導入され、前記第３のＴＩＬ集団が、前記第２の拡張の前記第２の期間培養される、請求項３３２に記載の方法。
334. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、前記細胞培養デバイス上の第１の位置から前記細胞培養デバイス上の第２の位置まで摺動するように構成される摺動固定具を含み、前記第２の拡張中に前記ＴＩＬを拡張するために利用可能である前記第２のガス透過性表面の領域を増加させる、請求項３２９に記載の方法。
335. 前記第２の拡張が、少なくとも第１の期間及び第２の期間行われ、前記摺動固定具が、前記第１の期間の後に前記第１の位置から前記第２の位置まで摺動し、前記第２の期間が、前記摺動固定具が前記第２の位置まで摺動した後に行われる、請求項３３４に記載の方法。
336. 前記１つ以上の解放可能な固定具が、前記摺動固定具と前記ダイアフラムとの間に位置決めされた固定位置固定具をさらに含む、請求項３３５に記載の方法。
337. 前記１つ以上の解放可能な固定具の各々が、前記細胞懸濁液の体積を低下させる前に解放される、請求項３２７～３３６のいずれか１項に記載の方法。
338. 前記１つ以上の解放可能な固定具の各々が、前記細胞培養デバイスを前記水平方向から前記垂直方向に回転させる前に解放される、請求項３３７に記載の方法。
339. 前記細胞懸濁液の体積を低下させている間、または低下させた後に、前記液体を前記細胞培養デバイスの前記第２のチャンバから除去することをさらに含む、請求項３２６～３３８のいずれか１項に記載の方法。
340. 前記細胞懸濁液の体積が、前記初期体積から最終体積まで低下する、請求項３２６～３３９のいずれか１項に記載の方法。
341. 前記最終体積が、前記ウェル中に保持することができる液体の前記所定の体積とほぼ等しい、請求項３４０に記載の方法。
342. 前記初期体積の、前記最終体積に対する比が、約１．５～約１５である、請求項３４０または３４１に記載の方法。
343. 前記細胞懸濁液の体積が前記最終体積まで低下した後に、前記細胞培養デバイスの前記第１のチャンバから前記細胞懸濁液を除去することをさらに含む、請求項３４０～３４２のいずれか１項に記載の方法。
344. 前記第１のチャンバから前記細胞懸濁液を除去することが、前記第１のチャンバに流体的に接続された残存物収集デバイスに前記細胞懸濁液を移すことを含む、請求項３４３に記載の方法。
345. 前記残存物収集デバイスが、ＬＯＶＯ細胞処理システムの１つ以上の成分を備える、請求項３４４に記載の方法。
346. ステップ（ｂ）からステップ（ｃ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われ、及び／またはステップ（ｃ）からステップ（ｄ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われ、及び／またはステップ（ｄ）からステップ（ｅ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われ、及び／またはステップ（ｅ）からステップ（ｆ）への移行が、前記組織培養デバイスを開くことなく行われる、請求項３２６～３４５のいずれか１項に記載の方法。

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