TW201312117A - 用以診斷與漿液相關之腫瘤細胞的症狀及特性的方法及試劑 - Google Patents

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Abstract

一種診斷或鑑別診斷特徵為哺乳動物對象之肋膜液中存有癌細胞之癌症之方法，該方法包括將受試對象之肋膜液樣本與連結配體之膠體磁性粒子接觸，而該配體係與癌細胞上決定基結合，但不以超過基線閥值與肋膜液中其他細胞和非細胞組份結合；將肋膜液-磁性粒子混合物置於磁場，若肋膜液中存有癌細胞，則產生富含配體-連結磁性粒子-結合癌細胞之細胞餾份；及就肋膜液中的癌細胞數分析該富集的餾份。在特定方面，此方法係涉及，例如藉由稀釋未處理的肋膜液製備用於上述方法步驟之肋膜液。在特定方面，係將從受試對象抽取的肋膜液於24小時內用於此診斷方法。此方法可有利的呈現鑑別惡性胸膜積液之診斷程序。存在肋膜液中之腫瘤細胞可用細胞和分子標記來定性，用以測定預後和預測因素。

Description

用以診斷與漿液相關之腫瘤細胞的症狀及特性的方法及試劑
一種診斷或鑑別診斷特徵為哺乳動物對象之肋膜液中存有癌細胞之方法，該方法包括將受試對象之肋膜液樣本與連結配體之膠體磁性粒子接觸，而該配體係與癌細胞上決定基結合，但不以超過基線閥值與肋膜液中其他細胞和非細胞組份結合；將肋膜液-磁性粒子混合物置於磁場，若肋膜液中存有癌細胞，則產生富含配體-連結磁性粒子-結合癌細胞之細胞餾份；及就肋膜液中的癌細胞數分析該富集的餾份。在特定方面，此方法係涉及，例如藉由稀釋未處理的肋膜液製備用於上述方法步驟之肋膜液。在特定方面，係將從受試對象抽取的肋膜液於24小時內用於此診斷方法。此方法可有利的呈現鑑別惡性胸膜積液之診斷程序。存在肋膜液中之腫瘤細胞可用細胞和分子標記來定性，用以測定預後和預測因素。
正常的肋膜液為含少數白血球、各種蛋白質和水，位於壁層和臟層肋膜間之漿液薄膜(亦即，襯在肺和胸腔間或肋膜腔的膜)。肋膜積液為肋膜腔中液體不正常蓄積，在美國每年大約發生於130萬人中。肋膜積液有許多原因(參見Hooper,C等人，2010 Thorax,Vol.65(Suppl 2)：ii4-ii17)。例如，心衰竭或肝硬化可能造成血管內壓力和血液蛋白的量之間不平衡，造成液體蓄積，例如濾出液(transudate)。肋膜受傷或發炎可能造 成液體聚積，例如滲出液(exudate)。滲液之原因包括感染性疾病、出血性病症或創傷、發炎性肺疾病(例如石棉沉著症)、類肉瘤病或自體免疫病症、癌症、心繞道手術、心或肺移植和胰臟炎。然而，肋膜積液最常見的三個因素為感染、心衰竭和惡性腫瘤。
除了肺癌，例如非小細胞肺癌(NSCLC)或小細胞肺癌(SCLC)，其中，肋膜積液可能為淋巴瘤、間皮瘤和源自其他器官之轉移性癌症的癥狀。事實上任何惡性腫瘤可轉移至肋膜腔，但最常見的惡性肋膜積液之來源為肺癌、乳癌、卵巢癌、胃腸癌症、淋巴瘤和間皮瘤。
目前，當病患具有組合性癥狀時則進行肋膜液分析，雖然某些肋膜積液為無癥狀的。滲出液一般係以物理特徵來鑑定，例如澄清液體、蛋白或白蛋白量降低及細胞數非常低。一旦鑑定為濾出液，則不再做進一步試驗；僅進行追蹤，因為此等肋膜積液通常並非由惡性腫瘤所致。滲出液一般係以物理特徵來鑑定，例如，因存有淋巴涉入、微生物存在或白血球或紅血球數目增加所造成之乳狀、混濁或略紅的外觀。區別濾出液和滲出液之最重要的試驗為高的總蛋白量和高的LDH量(Light,RW,2002 N.Engl.J.Med.,Vol.346(25)：1971-1977)。對乳酸、澱粉酶、三酸甘油酯和腫瘤標記進行試驗亦可能為有用的。
典型地，惡性肋膜積液(MPE)之診斷係如下所概述來進行(亦參見上文所引述之Light 2002和Hooper,2010， 其係以引用的方式併入本文中)。取得肋膜液並送至細胞實驗室進行評估。在實驗室中，將一代表份之樣本離心並製造許多細胞製備物(若可能，包括細胞塊)和染色供診斷評估。將這些含有數千個細胞之玻片以顯微鏡評估。由細胞病理學家尋找特定的惡性腫瘤特徵(亦即大的、異常細胞核特性等)。若觀察到足夠的細胞具有這些異常特性，則診斷為惡性腫瘤。偶爾會使用免疫細胞化學染色。
以細胞學為基礎之確立診斷的敏感性係隨細胞類型和惡性腫瘤之階段而變，且預估約60%(參見，例如上文所引述之Hooper 2010)。在實質的案例數目中，就肋膜積亦不能做確立的細胞學和癥狀學診斷。確立診斷之障礙包括腫瘤帶有相當「平凡的」細胞核特性，與反應性間皮細胞之型態學特性重疊，或在試驗當時肋膜液中存有低數目的腫瘤細胞。由於無法偵測的腫瘤細胞數或錯失腫瘤細胞之細胞學鑑定，一般而言，不進行免疫細胞化學染色。使用特定腫瘤標記之免疫細胞化學染色(例如，電化學發光分析)已證明並非有用的診斷(上文所引述之Hooper,2010；及Porcel等人，2004 Chest,126：1757-63)。
因為肋膜積液有許多可能的原因，若細胞學為陰性的，則病患一般係在臨床上就癥狀之進程來追蹤。若細胞學為陰性但臨床上高度懷疑為惡性腫瘤，例如含高的蛋白和LDH量之未確診積液(漏出性積液)，則可能追蹤病 患或可能進行重複胸腔穿刺術，接著於稍後的時間重複細胞學和免疫細胞化學分析，或針刺肋膜切片、胸腔鏡肋膜切片或手術肋膜切片。
這些診斷選擇讓病患置於未確立診斷、疾病惡化及/或切片過程缺失之危險中。當直接觀察之肋膜切片(胸腔鏡)具有敏感性和95-100%之診斷準確性之同時，其伴隨包括需要全身麻醉、一些罹病率(亦即感染和疼痛)和死亡率風險以及費用高之缺點。
文中所述之方法係提供目前診斷與過多的漿液例如肋膜液有關之症狀的有利替代方法。這些方法可鑑定肋膜積液中的惡性細胞，並因而增加診斷的敏感性和目前照護標準之準確性。其亦可提供獲得活體外生長之個別化腫瘤的來源物質及/或使用臨床上有關的細胞和分子標記定性。
在一方面，係提供一診斷或鑑別診斷特徵為在哺乳動物對象之肋膜液中存有癌細胞之癌症之方法。在一方面，此方法包括使用Veridex LLC之CellSearch®技術分析來自哺乳動物對象樣本之肋膜液。例如，將該對象之肋膜液樣本與連結一配體(例如捕捉抗體)的膠體磁性粒子混合，而該配體係與癌細胞上的決定基結合。在一方面，此第一配體/捕捉抗體僅表現在癌細胞中或之上。在一方面，此配體不以超過基線閥值與表現在肋膜液中非癌細胞之其他細胞或非細胞組份結合。將所生成的肋 膜液-磁性粒子混合物置於磁場中，(若肋膜液樣本中存有任何癌細胞)產生富含磁性粒子-結合癌細胞之細胞餾份。在一實施例中，然後將富集的餾份就肋膜液中之配體陽性細胞的數目做分析。此配體陽性細胞之數目，若在基線閥值以上，即顯示肋膜液中存有惡性細胞。藉由鑑定癌細胞之數目大於肋膜液中基線閥值，提供癌症之診斷或鑑別診斷。
在一方面，用於此診斷方法中之配體(例如捕捉抗體)係鑑別細胞決定基，例如EpCAM，且其為一抗-EpCAM抗體。在另一方面，用於此診斷方法中之配體係鑑別癌細胞決定基，例如L1CAM，且其為一抗-L1CAM抗體。在另一方面，用於此診斷方法中之配體係鑑別癌細胞決定基，例如Claudin 4，且其為一抗-Claudin 4抗體。在一實施例中，診斷惡性肋膜積液之基線閥值係大於約100個配體陽性細胞/每ml的肋膜液。在其他的實施例中，診斷惡性肋膜積液之基線閥值係大於約500個配體陽性細胞/每ml的肋膜液。在其他的實施例中，診斷惡性肋膜積液之基線閥值係大於約1000個配體陽性細胞/每3.5 ml的肋膜液。在另一方面，亦藉由將EPCAM+細胞染色做為另外的腫瘤標記，例如使用標記之「第二抗體」，例如細胞角蛋白(Cytokeratin)、Claudin 4、存活素(survivin)或端粒酶(telomerase)，來增進此方法之專一性，用以鑑定存在肋膜液中之癌細胞。又在其他方面，亦可藉由使用第二抗體來增進使用另外捕捉配體，例如 L1CAM或Claudin4之此方法的專一性。
在另外方面，該方法係使用癌細胞-類型專一性配體，且該方法可用於鑑定存在肋膜液中之癌細胞類型。在一實施例中，第一配體(例如捕捉抗體)為間皮瘤細胞上細胞決定基之抗體，例如該配體為一抗-間皮素抗體，且該癌症係辨識為間皮瘤。在另一方面，該方法係使用癌細胞-類型專一性配體，例如乳癌細胞上細胞決定基之抗體，例如Her2/neu，可用於鑑定存在肋膜液中之癌細胞類型為乳癌。在另一面，該方法係使用使用癌細胞類型專一性配體，例如肺癌細胞上細胞決定基之抗體，例如抗-gp160，可用於鑑定存在肋膜液中之癌細胞類型為肺癌。
又在其他的方面，癌細胞類型專一性配體係用作為第二抗體。在另外方面，這些更專一的第二抗體係使用癌細胞決定基EPCAM、L1CAM或Claudin4之「捕捉」抗體，用於文中所述的方法中。
在另一方面，此方法係涉及富集大量的肋膜液細胞，提供一獨特的腫瘤物質來源，通常其為能培養，供形態學、表型和分子定性之肋膜積液腫瘤細胞(「PETC」)的量。PETC之細胞和分子定性能將廣泛的生物學、研究和臨床使用供評估、鑑定和個別分類，其可幫助病患之個人化治療的臨床管理並監控其癌症。目前，已於原發腫瘤之細胞上進行腫瘤定性和分類。然而，在某些MPE中，起源之組織和原發腫瘤之位置仍未知。特別是就肺 癌的情況，原發處通常無法得知且不能切片，或細針抽吸無法提供足量的物質進行適當的腫瘤評估。最後，就轉移性癌症之情況，由起源的原發種瘤組織得來的資料在肋膜積液出現的時間可能已數月至數年之久，且不再具有如癌症動態之疾病代表性。富集大量PETC數目之能力可在MPE出現的時間定出腫瘤特性。某些癌症治療例如乳癌之荷爾蒙治療或賀癌平(herceptin)，或肺癌中之EGFR或ALK抑制劑皆係以病患腫瘤之基因型和表現型特性為基礎。PETC作為此重要特性之腫瘤物質來源，對於患有MPE之病患可更早及更有效地引導治療選擇。
在另一方面，此方法係經修改，在使用上述步驟之前，提供肋膜液樣本特定的製備性步驟，例如稀釋。
在另一方面，此方法係使用使用標記混合物來鑑別所有非腫瘤細胞，例如CD45，及鑑定非腫瘤細胞之其他抗體或其組合。
在另一方面，此方法係使用使用預後和預測標記來定性PETC，其包括(但不限於)EGFR、ER、Ki67、PR、Her2/nu、BCL2、M30、Cox-2、PTEN、IGF-1R、AKT、PARP、CMET、P53、P27、CEA、AR、PSMA及PSA等。
在另一方面，此方法係使用DNA和RNA標記從漏出液中其他非腫瘤細胞之富集的PETC，供腫瘤細胞之專一性分子定性。
在另一方面，此方法富集PETC用於基因中之突變分析，該基因包括(但不限於)EGFR、BRAF、ARAF、K-ras 和P-53。
在另一方面，此方法藉由螢光原位雜交(FISH)列舉出PETC並偵測異倍性、基因增幅(EGFR)、刪除(PTEN,P53)和易位(亦即EML4/ALK)。
在另一方面，此方法分離出活的腫瘤細胞供活體外培養，以便於研究藥物動力學(對藥物治療之反應)、測定腫瘤的起源組織、定出個體腫瘤細胞對抗藥性標記之特性、鑑別和定性出抗藥性之細胞族群、表現型或分子的分子表現、突變分析和對新療法之可能的反應，及進行其他使用，例如找出基因印記。
本發明之其他方面和優點係進一步描述於下列其較佳實例之詳細說明中。
本發明之詳細說明
一種診斷或鑑別診斷特徵為在哺乳動物對象之肋膜液或漿液中存有癌細胞之癌症之方法，所欲地係包括包含將該對象之漿液的生物樣本與連結配體之膠體磁性粒子接觸，而該配體係與癌細胞上的決定基結合之步驟。選擇用於此方法之配體或捕捉抗體不以超過基線閥值與漿液中的其他細胞(非惡性)和非細胞組份結合。然後將漿液-磁性粒子混合物置於磁場，產生富含磁性粒子結合漿液細胞之細胞餾份。然後分析此富集的餾份，偵測漿液中配體-結合(或配體陽性)細胞，以及其他視需要之資料。此配體陽性細胞之數目，若超過基線閥值，則係表示漿液中存有惡性細胞。依照所選擇的配體(例如捕捉抗 體)，藉由鑑定漿液中配體陽性細胞之數目大於所選的配體之基線閥值，提供癌症之診斷或鑑別診斷。如文中所用，術語「漿液」包括(但不限於)肋膜液(例如肋膜滲出液和肋膜濾出液)、腹水液諸如此類。本發明之示例性漿液為肋膜液。
文中所述的診斷方法容許較低的侵入性，更快速測定肋膜液之病因。這些診斷方法藉由降低重複的胸腔穿刺和肋膜切片程序之需求，亦可顯著地減少整體的健康照護成本，並對細胞學診斷未確立之病患提供更快速、更敏感的診斷資訊。與習用的診斷方法結合，這些方法能更快速的診斷並可更快速的施予治療，使惡性疾病有更好的預後。這些方法可預防可能發生在未知、未確立或不正確的最初診斷之常規的追蹤期間疾病或另外的癥狀和併發症進一步惡化。
在其各種實施例中，此方法係使用設計用來鑑定血液中非常罕見的循環腫瘤細胞(CTC)之Veridex LLC CellSearch®系統的特定方法步驟和裝置。例如，在血液樣本中，一般使用上皮細胞決定基EpCAM之配體的CellSearch®方法受試對象，血液中EpCAM陽性細胞之基線閥值非常低，例如約1個細胞/7.5ml。在此技術已使用於偵測血液樣本中各種癌症之CTC的同時(參見，例如Shaffer DR等人，2007,Clin Cancer Research,13：2023)，發明者了解並無建議將此分析技術用於協助癌症診斷，更何況是惡性肋膜積液之診斷。漿液之組成 和細胞/非細胞組份有很大的差異，例如肋膜液和腹水，和血液以及肋膜腔或腹腔和血管系統之結構上許多差異。例如，因為肺係以上皮細胞作為內襯，肋膜液中EpCAM-陽性細胞之「基線」數目預期比1個/ml大很多。
A. CellSearch ® 系統
CellSearch循環腫瘤細胞系統(Veridex LLC)為使用利用免疫磁性標定和自動化數位顯微鏡之組合來鑑定及列舉血液樣本中稀少的CTC數目之分析和裝置。免液磁性標定係使用「磁鐵流體(ferrofluid)」來進行，其為奈粒子帶有被塗覆上由所欲的細胞族群所表現的抗原決定基專一性配體之聚合物層所包圍之磁核，例如上皮細胞黏附分子(EpCAM)之抗體。磁鐵流體-抗體接合物與上皮細胞上的抗原決定基結合，然後其可以磁性與樣本的剩餘物分離。然後將細胞以三種細胞染劑染色，幫助區分上皮細胞與汙染的白血球和非專一性碎片。所用的染色劑為：4’-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，其係用於將細胞和染色，幫助辨識活細胞；藻紅蛋白(pycoerythrin)(PE)-標定的細胞角蛋白(cytokeratin)(CK)抗體(CK 8、18和19)係辨識上皮細胞；及別藻藍蛋白(allophycocyanin)(APC)-標定的CD45抗體結合污染的白血球。使用自動化螢光數位顯微鏡，分析細胞是否有CTC存在。以DAPI+、CK+、CD45-染色之表型為基準，使CTC顯現。
使用CellSearch系統分析周圍血液之臨床研究已 顯示，在基線或治療終了時病患存有5 CTC，係與比所有其他組病患較短的中位數無惡化存活和總存活相關聯。<5 CTC之病患在各時間點具有最長的中位數無惡化存活和總存活。此外，在基線時5 CTC之病患，其在治療終了時降至<5 CTC，則比CTC數維持在5之病患具有較長的中位數無惡化存活和總存活。參見，例如Cristofanilli M等人，2004 N Engl J Med,351(8)：781-791，其係以引用的方式併入本文中。
使用CellSearch系統之方法係描述於美國專利第6,365,362號；第6,623,982號；第7,282,350號；第5,993,665號；第6,790,366號；和第6,645,731號；及以其為基礎的專利申請案中。可用於施行CellSearch系統之裝置說明可參見美國專利第5,985,153號；第6,861,259號；第6,660,159號；第6,890,426號；第6,136,182及以其為基礎的專利申請案中。各上述專利其描述CellSearch系統不同方面之全文係以引述的方式併入本文中。
B.樣本及其製備
用於文中所述方法中之樣本係由哺乳動物對象或病患來提供。該對象或病患包括哺乳動物，例如人類、獸醫或農用動物、家畜或寵物，及一般用於臨床研究之動物，包括非人類靈長類、狗和小鼠。較佳地，這些方法之對象為人類。在文中所述方法之一方面，經歷此診斷法之對象為惡性腫瘤或惡性肋膜積液無癥狀者。在另一 方面，經歷此診斷法之對象係顯現惡性腫瘤或惡性肋膜液之臨床癥狀，或病史。又在其他實施例中，該對象的肋膜液樣本已經歷臨床和細胞學研究，及視需要細胞化學分析，結果診斷為無可偵測的惡性腫瘤或未知病因之肋膜積液。
在一實施例中，術語「生物樣本」或「樣本」係指任何疑似含有異常、惡性細胞之肋膜液或肋膜積液。此等細胞可能衍生自原發性或轉移性肺癌，例如NSCLC或SCLC。另外，此等細胞可能為源自於另外器官，例如乳房、卵巢、大腸或前列腺之續發性轉移癌細胞。在一方面，最適合用於文中所述之方法的樣本為肋膜滲出液。在一方面，用於文中所述之方法的樣本為肋膜濾出液。其他生物樣本可包括其他含惡性細胞之漿液，包括來自腹腔之腹水液或胰囊腫液。腹水液和肋膜液涉及非常類似的化學系統；腹部和肺二者在相同的惡性腫瘤事件中於肋膜腔和腹腔皆具有間質細胞株和液體形式。當在下列揭示文中以肋膜腔為示例時，使用腹水或其他囊腫液進行相同的方法可能得到類似的結果。
在一實施例中，肋膜液係以直接從病患中移出，未處理的形式用於此方法。在一實施例中，該未處理的肋膜液在接觸步驟前係置於標準的血液收集試管中，例如EDTA或Heparin試管。在一實施例中，該未處理的肋膜液在接觸步驟前係置於標準的CellSave®試管(Veridex)中。又在另一實施例中，係在從病患收集樣本後立即置 於CellSave試管中，以避免癌細胞降低，若將未處理肋膜液留置，即使在4℃，其可能在24小時內大量發生癌細胞降低。在另一實施例中，樣本係在從病患中移出後1小時、5小時、10小時、15小時或至高24小時內置於適當的收集試管中。
在此方法之其他實施例中，來自所選的對象之樣本可在與CellSearch粒子接觸前經處理。在一實施例中，稀釋度為1：10肋膜液對稀釋劑。在另外的實施例中，稀釋度為1：9肋膜液對稀釋劑。在另外的實施例中，稀釋度為1：8肋膜液對稀釋劑。在另外的實施例中，稀釋度為1：5肋膜液對稀釋劑。在另外的實施例中，稀釋度為1：2肋膜液對稀釋劑。在另一實施例中，稀釋度為1：1肋膜液對稀釋劑。較佳的稀釋劑包括食鹽水、磷酸緩衝食鹽水、另外的緩衝液或生理上可接受的稀釋劑。在一實施例中，稀釋的肋膜液在與如文中所述的磁性粒子接觸前，係置於CellSave試管中。又在另外的實施例中，樣本係在從病患中收集及稀釋後，立即置於CellSave試管中，以避免癌細胞降低，若將未處理肋膜液留置，即使在4℃，其可能在24-48小時內大量發生癌細胞降低。在另一實施例中，樣本係在從病患中移出及稀釋後1小時、5小時、10小時、15小時、24小時、36小時，至高48小時內置於適當的收集試管中。
又在另外的實施例中，此等樣本係在本方法接觸步驟之前以習用的方法濃縮。此肋膜液之前處理較佳的係 在其中肋膜液必須低溫保藏運送至進行此方法之實驗室或供之後分析(亦即，收集後24-48小時之後)之情況下進行。在此一實施例中，用於接觸步驟之肋膜液樣本係在從受試對象抽取肋膜液樣本後，藉由離心並將離心液或團塊再懸浮於緩衝液中所製備。又在另外的實施例中，係將肋膜液樣本多次離心和再懸浮，例如下列實例中所說明，之後將其低溫保藏供運送或日後的分析。
在另外的實施例中，此等樣本係在本方法接觸步驟之前使用過濾方法濃縮。在此一實施例中，用於接觸步驟之肋膜液樣本係藉由將液體經由一含已知及基本上孔徑一致，能讓肋膜液通過濾膜但保留腫瘤細胞的過濾器過濾所製備。在此一實施例中，濾膜中孔洞之直徑可為至少4 μM。又在另外的實施例中，孔徑可為5 μM或更大，及在其他實施例中，為6、7、8、9或10 μM任一。過濾後，可將被濾膜保留的腫瘤細胞沖出濾膜至一適合的生理上可接受緩衝液中。然後可將於此法濃縮之細胞用於本方法之接觸步驟。
在另外的實施例中，將樣本，例如未處理的肋膜液、稀釋的肋膜液或再懸浮的細胞團塊與溶離試劑接觸，該溶離試劑係差別性溶離存在樣本中之無核的紅血球。在其中肋膜液含有大量RBC數目之情況下，此步驟所欲地係在樣本與磁性粒子接觸之前進行。適合的溶離試劑包括單一溶離試劑或溶離試劑和驟冷試劑，或溶離劑、驟冷試劑和固定試劑。適合的溶離系統為市售並包括下文 實例1中所用的BD Pharm LyseTM系統(Becton Dickenson)。其他的溶離系統包括VersalyseTM系統、FACSlyseTM系統(Becton Dickenson)、ImmunoprepTM系統或Erythrolyse II系統(Beckman Coulter,Inc.)或氯化銨系統。溶離試劑可隨有效溶離肋膜液中紅血球之主要需求，及癌細胞和WBC上抗原決定基之保守性而不同。除了使用使用單一試劑溶離外，可用於文中所述方法之溶離系統可包括二級試劑，例如在此方法之其餘的步驟期間，驟冷或延遲溶離試劑效應之試劑，例如StabilyseTM試劑(Beckman Coulter,Inc.)。依照選擇的溶離試劑或此方法之較佳施行，亦可使用使用習用的固定試劑。
又在另外的實施例中，肋膜液樣本，如文中所述未處理、稀釋或多次離心或經處理，係在與文中所述之膠體粒子接觸前，於約-140℃之溫度下低溫保藏。
C.診斷分法之實施例
上述之通用方法的各種實施例可用於惡性肋膜積液之診斷。
通用診斷方法，如上述，係使用下列步驟：收集肋膜液、將受試對象的肋膜液樣本與連結第一配體之膠體磁性粒子接觸，而該第一配體係與癌細胞上決定基結合，但不以超過基線閥值與肋膜液中其他細胞和非細胞組份結合；將肋膜液-磁性粒子混合物置於磁場，若肋膜液中存有癌細胞，則產生富含配體-連結磁性粒子-結合 癌細胞之細胞餾份；分析此富集的餾份肋膜液中癌細胞之數目；及藉由鑑定配體陽性細胞之數目大於肋膜液中基線閥值，提供癌症之鑑別診斷。在一替代方法中，係藉由鑑定配體陽性細胞之數目低於肋膜液中基線閥值，提供惡性腫瘤之診斷。
在文中所述的方法之一實施例中，此診斷方法包括就惡性腫瘤之臨床指標或惡性肋膜液進行哺乳動物對象之臨床評估。此等癥狀或指標包括(但不限於)胸痛、咳嗽、呼吸困難、疲勞和發炎。在一實施例中，臨床評估係在此方法之一般評估步驟前進行。
在另外的實施中，診斷方法包括在藉由此方法之接觸、執行和分析步驟分析肋膜液之前，進行肋膜液之細胞學或免疫細胞學或細胞化學檢驗是否有異常細胞存在。在此實施例中，肋膜液之分析係提供配體-陽性細胞之診斷數目，若其超過基線值，便可確定為惡性腫瘤之細胞學診斷。另外，此分析可能否定無惡性腫瘤之細胞學診斷或不確立診斷和著重在肋膜細胞之另外的細胞學檢驗。因此，診斷方法可包括另外的細胞學步驟或另外的外科診斷步驟，例如切片。或者，若配體-陽性細胞之數目遠低於基線值，則細胞學診斷可確定且診斷方法可能不需要另外的步驟，或可包括偵測感染或其中一項肋膜液非惡性原因之其他步驟。
在另外的實施例中，診斷方法係涉及藉由此方法之接觸、執行和分析步驟分析肋膜液之後，進行肋膜液之 細胞學或免疫細胞學或細胞化學檢驗是否有異常細胞存在。在此實施例中，肋膜液之分析係提供配體-陽性細胞之診斷數目，若其超過基線值，即顯示需要肋膜液細胞之進一步的細胞學檢驗，以癌症專一性試劑鑑定或確認癌症的根源。因此，診斷方法可包括額外的細胞學步驟或指示可使用另外的外科步驟診斷，例如切片。另一種選擇，若配體-陽性細胞之數目遠低於基線值，則此診斷方法可僅指示額外的步驟用以偵測感染或其中一項肋膜液非惡性原因。
又在另外的實施例中，如上所論述，若肋膜液未低溫保藏時，與膠體粒子之接觸步驟係在從受試對象抽取肋膜液樣本的24小時內進行。又在另外的實施例中，如上所論述，與膠體粒子之接觸步驟係在從受試對象抽取肋膜液樣本的30小時內進行。又在另外的實施例中，如上所論述，與膠體粒子之接觸步驟係在從受試對象抽取肋膜液樣本的48小時內進行。在後二個例子中，在特定的實施例中，在接觸步驟之前，樣本係經低溫保藏並以習用的方法重建。
在一實施例中，受試對象肋膜液樣本與連結第一配體(例如捕捉抗體)之膠體磁性粒子(而該第一配體係與癌細胞上決定基結合)的接觸步驟，係使用(a)不會與肋膜液中之其他細胞和非細胞組份結合，或(b)不會以超過基線閥值與肋膜液中其他細胞和非細胞組份結合；或(c)僅與特定的癌細胞以超過基線閥值結合；或(d)以可區別 的數目與不同的癌細胞類型結合之配體。例如，所用的配體可為與表現在癌細胞，且並非在非癌細胞上之決定基結合的配體。在另外的實施例中，所用的配體僅與特定細胞類型，例如上皮細胞癌之癌細胞結合。在另外的實施例中，所用的配體僅與衍生自特定器官之癌細胞，例如乳癌細胞，但非來自其他正常細胞或來自不同來源之癌細胞，例如肺癌細胞結合。又在另外的實施例中，配體係以明顯不同的濃度/數目與一癌細胞類型結合，例如與乳癌細胞結合之數目比肺癌細胞多很多，藉此得以藉由分析步驟中所產生的數目來鑑定癌症類型。
在一實施例中，第一配體為能與癌細胞上的決定基結合之單株抗體或其片段。「片段」係指所選的抗體之Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2片段。同樣地包括適合抗體之互補決定區(CDR)的單鏈可變抗體片段或重組結構可用做用於這些方法中之第一配體。又其他的配體係描述於文中所論述的專利公開案中。
在一實施例中，第一配體為對至少一種癌細胞決定基專一之單株抗體或其片段。在一實施例中，如公開案和下文實例3中所述，第一配體為專一性與上皮細胞黏附分子(EpCAM)結合之單株抗體或其有用的片段。EpCAM受體並不存在於肋膜積液中之WBC上，但廣泛地表現在各種癌上。然而，EpCAM配體並非表現在非-上皮癌症或血液起源之癌細胞上。例如，EpCAM不存在於間皮瘤癌細胞、白血病、淋巴瘤或多發性骨髓瘤上。當在此方法 中配體係使用抗-EpCAM時，其可能不容易鑑別可能的EpCAM陰性腎細胞或胸腺細胞癌。然而，當以下文之實例鑑別時，抗-EpCAM抗體則顯著地與NSCLC、卵巢癌和乳癌結合。參見，例如表3之數據。
在本方法之另外的實施例中，第一配體及/或捕捉抗體係與在高度惡性細胞，例如LICAM上上調之另外的細胞專一性決定基結合。參見，例如Katayama等人，1997,Cell Structure and Function 22：511-516；Hai等人，2012 Clin Cancer Res,18：1914-1924；及Tischler等人，2011,Molecul.Cancer,10：127。在另外的實施例中，第一配體或捕捉抗體係與癌細胞決定基Claudin 4結合。
為了改善這些方法之專一性，係使用額外的其他配體(例如第二配體及/或第二抗體)藉由染色來確定惡性腫瘤或非惡性腫瘤。在一實施例中，此等第二配體/抗體係與表現在非癌症或良性細胞，例如WBC上之決定基或抗原結合。在另外的實施例中，若與此等第二抗體結合的決定基為腫瘤專一性決定基，則此第二抗體之結合可確認細胞為惡性的。若與此等第二抗體結合的決定基僅表現或主要在良性細胞上，則於文中所述的方法中使用第二抗體來排除細胞為非惡性的。在一實施例中，此等第二抗體包括存活素、端粒酶或Claudin 4之抗體(若EpCAM或L1CAM為捕捉抗體)。在此方法之另外的實施例中及依照肋膜液中癌細胞的類型，第一配體或第二配體 為專一性與肺癌細胞或一種肺癌細胞類型結合之配體。
在另外的實施例中，第一配體或第二配體係與獨特或至少差別性表現在不同肺癌間之癌細胞決定基結合。此等第一抗體/捕捉抗體或第二抗體可由許多已知的抗體中選出。依照配體是否與主要表現在癌細胞上之決定基結合，這些配體可用作捕捉抗體或第二抗體。憑藉已公開的資訊，熟習本項技術者可容易地決定哪一種抗體可用作捕捉抗體或第二抗體。例如，在一實施例中，可用做診斷非小細胞肺癌(NSCLC)配體之抗體包括與EGFR突變結合之抗體，包括抗-delE746-A750和抗-L858R。在另外的實施例中，用於這些方法中配體可為IgG2Ak抗體，例如703D4和704A1。又在另外的實施例中，第一配體為可用於診斷小細胞肺癌(SCLC)之抗體，包括，例如抗NCAM抗原之SEN7抗體(參見，例如WO1994/006929)。又在其他的實施例中，第一配體為抗TTF1、腫瘤胚胎抗原、mMET、MUC1或表皮生長因子受體之抗體。在表1中仍有其他用作第一(捕捉)配體或第二配體之可能的抗體並為本領域熟習本項技術者所知。參見，例如列於Dennis,JL等人，2005 Clin.Cancer Res.11：3766-3772中之抗體和抗原。
在另外的實施例中，第一配體或第二配體為診斷間皮瘤之抗體。在本方法之一實施例中，因此，第一配體或第二配體為與鈣網膜蛋白(calretinin)結合之抗體。在本方法之另外的實施例中，因此，第一配體或第二配 體為抗腫瘤1(WT1)或抗BG8，或抗CD15或間皮素之抗體。
又在另外的實施例中，其中存在肋膜液中之癌細胞為乳房、卵巢、前列腺或大腸或其他器官之轉移的癌細胞，第一配體或第二配體包括這些細胞之不同專一性之抗體。例如，第一配體或第二配體可為對乳癌細胞專一之單株抗體F36/22或其片段(參見，例如美國專利第5,652,114號)。在另外的實施例中，第一配體或第二配體可為針對大腸直腸癌細胞上表位之單株抗體(參見，例如美國專利第5,459,043號)。在另外的實施例中，第一配體或第二配體可為與雌激素受體結合之之單株抗體或其片段。在另外的實施例中，第一配體或第二配體可為與Her2/nu結合之單株抗體或其片段。在另外的實施例中，第一配體或第二配體可為與前列腺專一性抗原結合之單株抗體或其片段。然而其他實施例可使用細胞決定基或抗原之抗體或其片段：CA15.3、CEA、CA125、癌-睪丸抗原、CDX2、CK20、GCDFP-15、ER、溶菌酶(lysozyme)及CK7。仍有其他可用於本發明之抗體和細胞決定基已為本領域熟習本項技術者所知並可容易選擇用以鑑別特定的癌症。參見，例如於表1及於例如Dennis,JL等人，2005 Clin.Cancer Res.11：3766-3772中所列的抗體和抗原。
又在另外的實施例中，此方法在接觸步驟中可包括一種以上的第一(捕捉)及/或第二配體，其中各第一或第二配體為(例如CellSearch技術中之「標定試劑」)針對 相同癌細胞或癌細胞類型上不同決定基之不同的抗體。在另外的實施例中，係各使用針對相同癌細胞類型上不同決定基之不同的第一/捕捉或第二配體，重複此方法之接觸、執行和分析步驟。此方法之另外的實施例係使用使用差別性表現在不同癌細胞類型之第一或第二配體或一系列或一組第一或第二配體。在另外的實施例中，係各使用針對不同癌細胞類型上不同決定基之不同的「第一」及/或第二配體，重複此方法之接觸、執行和分析步驟。參見，例如文中所參照之公開案。因此，與相同癌細胞類型或群體上不同決定基結合之不同抗體的組合可用於代替與癌細胞群體上一決定基結合之單一抗體。
依照所用的配體及如CellSearch技術刊物中所示，所用的下個步驟係將肋膜液-磁性粒子混合物置於磁場中，若肋膜液中存有癌細胞，則產生富含磁性-粒子-結合癌細胞之細胞餾份。
在特定的實施例中，依照肋膜液樣本中之細胞內容物和碎片，在分析前，此方法亦使用從富集餾份純化或分離非癌細胞、無核細胞、細胞碎片和未結合物質之步驟。此純化步驟可包括或可接著視需要於富集餾份中加入對存在於肋膜液中非癌細胞，例如WBC上之抗原專一性的第二配體。在另外的實施例中，此方法可藉由於富集餾份中加入對於正常存在於肋膜液中之蛋白上的抗原具專一性的第二配體。其他能區別富集餾份中非癌細胞與其他細胞或細胞碎片之試劑仍可加至樣本或富集餾份 中，而得以將不需要的組份從富集餾份中分離。
在一實施例中，此第二配體可包括專一性與存在於肋膜液中之白血球結合之單株抗體或片段，其中為抗-CD45。對白細胞獨特性或差別性表現在白細胞和非白細胞上之其他抗體可選自本項技術中針對此目的之已知抗體。在另外的實施例中，第二抗體包括癌細胞上不同決定基之抗體，例如標定試劑，其係用於CellSearch系統，與例如上皮癌細胞類型之胞內細胞角蛋白，或與已知存在相同癌細胞類型之另外的配體結合(參見，例如表1和文中所引述的文件中之決定基)。表1為可用於文中所述的方法中用作配體/標定劑，及其細胞決定基之示例抗體的列表。
又在純化或分離步驟之另一實施例中，係使用細胞專一性染劑，例如DAPI，將細胞和染色用以區分活細胞和細胞碎片。此等可如CellSearch技術公開案和專利中之教導來選擇。因此，這些另外的配體和試劑幫助區分富集餾份中癌細胞和WBC，其他非癌細胞和細胞碎片，並得以將這些肋膜液組份從富集餾份中移出。這些另外的配體和試劑亦可幫助區分癌細胞的類型。
如上文和實例中所述，用於CellSearch系統供血液分析之常見的配體和試劑可用於存在或轉移至肋膜腔於肋膜積液中特定上皮細胞癌之肋膜液分析。在此方法之施行中，係將肋膜液樣本與塗覆抗-EpCAM抗體的膠體金屬粒子接觸，其係結合和鑑別為上皮癌細胞之細胞。如上所揭示，塗覆抗-EpCAM抗體粒子可以塗覆抗-L1CAM抗體粒子及/或塗覆抗-Claudin 4-抗體粒子替代或增補。亦將樣本-粒子混合物與染劑DAPI接觸，其係將完整細胞而非細胞碎片染色。亦將樣本-粒子混合物與抗-細胞角蛋白(CK)抗體接觸，其亦鑑別大部分上皮細胞，亦即 包括上皮癌細胞。進一步將樣本-粒子混合物與抗白細胞抗體，例如抗-CD45接觸，與肋膜液中的WBC結合而得以將其排除為白細胞。各抗體配體，如CellSearch技術和描述彼等之專利(其係以引用的方式併入本文)中所述，可與適合的標記結合。
然後分析富集的餾份，視需要純化肋膜液之其他組份，用以偵測藉由與配體/標籤/染劑結合之適當表型為特徵的細胞數目。如文中實例3之示例，上皮癌細胞例如NSCLC、乳癌、卵巢癌係計算或列舉以表型為特徵之癌細胞作為示例：EpCAM+、DAPI+ CK+ CD45-。此分析係使用習用的免疫流式細胞技術或其他細胞分析和CellSearch專利及公開案中所驗證的列舉技術來進行。在一實施例中，列舉此分析或此方法之癌細胞係涉及偵測或鑑別或測量超過基線閥值之第一配體-結合癌細胞數目。用於鑑別所選的配體、標定試劑和染劑之基線閥值例行上可藉由此法於正常肋膜液中使用相同試劑來測定。
在一實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，基線閥值範圍為每ml正常肋膜液介於從約100至超過1000個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在一實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，基線閥值範圍為每3.5 ml正常肋膜液介於從約100至超過1000個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均 基線閥值為每ml正常肋膜液約200個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均基線閥值為每ml正常肋膜液約300個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均基線閥值為每ml正常肋膜液約400個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均基線閥值為每ml正常肋膜液約500個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均基線閥值為每ml正常肋膜液約600個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均基線閥值為每ml正常肋膜液約700個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均基線閥值為每ml正常肋膜液約800個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均基線閥值為每ml正常肋膜液約900個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均基線閥值為每ml正常肋膜液超過1000個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均基線閥值為每ml正常 肋膜液超過1100個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。在另外的實施例中，當此法係使用抗-EpCAM作為第一配體時，其平均的基線閥值為每3.5 ml正常肋膜液超過1100個EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-細胞數。
此高的EpCAM+基線閥值，令人驚訝的，此法可用於肋膜液中，因為肋膜的內襯為上皮細胞，並應可預期具有高的EpCAM+細胞數。然而，如實例3，圖2和下表2A、2B及3中所示，使用抗-EpCAM作為第一/捕捉配體之文中所述方法，產生有助於含上皮癌細胞之肋膜積液中更精確鑑別診斷惡性腫瘤之結果。實例3中所述的方法比實例2中細胞學評估提供肋膜積液更敏感的癌症偵測，且當使用100 CTC/ml肋膜液的基線截取值時，在二位乳癌病患中得到相反的結果。這些結果驗證了本方法之診斷或協助肋膜積液之癌症鑑別診斷的價值。
以類似的方式，其中配體、標定劑和染劑係與實例3中作為示例者不同，且其中此等試劑能區分癌細胞種類，例如肺癌，各不同配體之基線閥值係類似地計算及決定診斷值。
又在另一實施例中，這些用於分析肋膜液中癌細胞數目之診斷法的所有步驟可於受試對象患病期間的不同時間點，或受試對象癌症治療期間或之前重複，提供得以精確診斷或預後之資訊。當與適合肋膜液之其他習用的診斷方法組合時，由此法所提供的診斷資訊可能為最有用的。例如，此方法可與其他的診斷步驟結合，例如 將受試對象之肋膜液樣本與測量該樣本中蛋白或白蛋白含量之診斷試劑接觸。
又在另外的實施例中，另外的診斷方法步驟可包括於分離自肋膜液的癌細胞上進行染色體或螢光原位雜交(FISH)分析，用以測定此等是否具有與贅瘤起源相符的染色體異常。
在另外的實施例中，可如實例5，從來自肋膜液富含的癌細胞分析核酸。有或無特定的分子標記或細胞學標記存在可提供有關病患診斷或預後資訊，或可幫助定出富含的腫瘤細胞群體之特性。另外，肋膜積液腫瘤細胞之核酸分析可用做搜索工具，用以鑑定可用於管理病患或符合的臨床試驗候選人之標記。
如文中所用，術語「細胞學標記」係指在分析時可被偵測出，為完整細胞之部分或片段之標記。偵測此等細胞學之法包括(但不限於)免疫-螢光顯微鏡、免疫細胞化學、流式細胞技術、FISH和免疫-螢光定量。分子標記為衍生自富集的PETC之物質，其係於樣本均質或細胞或細胞碎片之次細胞組份純化後加以偵測。此等標記包括(但不限於)DNA、RNA、微RNA、蛋白、碳水化合物和脂質。此等標記可用包括(但不限於)PCR、RT-PCR、微陣列、ELISA、西方墨點和南方墨點之方法來偵測。
這些方法在其中受試對象正在進行癌症治療及其中此方法能測定治療或預後效用之情況下特別有用。這些方法可用於其中在受試對象肋膜液樣本之非決定性的細 胞學或免疫細胞化學檢驗後，以受試對象之肋膜積液測定未知病因之情況下。這些方法亦可能有效用於(尤其是)肺癌、淋巴瘤、間皮瘤、轉移乳癌、轉移卵巢癌和轉移前列腺癌之診斷。
D.方法之實施例
此等方法之各種實施例因此係包括下列。
一種診斷或鑑別診斷特徵為哺乳動物對象之肋膜液或漿液中存有癌細胞之癌症之方法，係包括：a)將該對象之肋膜液或漿液與連結第一配體之膠體磁性粒子接觸，而該配體係與癌細胞上決定基結合，但不以超過基線閥值與肋膜液或漿液中其他細胞和非細胞組份結合；及b)將肋膜液-磁性粒子混合物或漿液-磁性粒子混合物置於磁場，若肋膜液或漿液中存有此細胞，則產生富含配體-連結磁性粒子-結合細胞之細胞餾份。在一實施例中，此方法進一步包括c)就肋膜液或漿液中之配體-連結磁性粒子-結合細胞的數目，分析富集的餾份；及d)藉由鑑定配體-連結磁性粒子-結合細胞之數目大於肋膜液或漿液中基線閥值，提供癌症之鑑別診斷。
又在另外的實施例中，此方法係涉及進行一或多個另外的步驟，其包括：使用細胞學或分子標記定出富集的細胞餾份之特性；培養此富集的細胞餾份；及使用細胞學或分子標記定出富集的細胞餾份之特性。又在另外的實施例中，此方法包括分析此培養的富集餾份；及對培養的富集細胞餾份進行藥物動力學研究之另外的步 驟。
在一實施例中，此肋膜液為肋膜積液。
此方法亦可包括此等如在藉由接觸、執行和分析步驟分析肋膜液或漿液之前或之後，進行肋膜液或漿液之細胞學或免疫細胞學檢驗是否有異常細胞存在之步驟。此方法亦包括在該接觸步驟前稀釋肋膜液或漿液。肋膜液或漿液可用稀釋劑以1：10之比率稀釋。此方法之接觸步驟係在從受試對象抽取肋膜液樣本或漿液樣本之24小時內進行。
本發明另外的實施例係包括一或多個另外的步驟，其包括：於肋膜液或漿液-磁性粒子混合物中加入對表現在癌細胞或非癌細胞中之第二抗原專一性的第二配體，或能辨別富集的餾份中非癌細胞與其他細胞或細胞碎片之試劑；於肋膜液或漿液-磁性粒子混合物中加入與癌細胞之第二細胞決定基結合之標定試劑；於肋膜液或漿液-磁性粒子混合物中加入辨別活細胞和細胞碎片之細胞專一性染劑；及/或在分析前，從富集的餾份純化非癌細胞、無核細胞、細胞碎片和未結合的物質。在一實施例中，第二抗體可與存在細胞表面或表現在所指細胞內的細胞決定基結合。
在此方法之特定方面，第一配體為對至少一種癌細胞決定基專一之單株抗體或其片段。在其他方面，第二配體係專一性與肋膜液中的白血球結合，或與癌細胞上之專一性腫瘤標記結合，以增進專一性或鑑別存在肋膜 液或漿液中之癌細胞。在其他方面，至少一種第一配體、第二配體或標定試劑係專一性與肺癌細胞或如癌細胞結合。在此方法的某些實施例中，第一配體係專一性與上皮細胞黏附分子(EpCAM)結合；或第一配體係專一性與L1細胞黏附分子(L1CAM)結合，或第一配體係專一性與Claudin 4結合。在另外的實施例中，其中第一配體係專一性與EpCAM或L1CAM結合，而第二配體係專一性與Claudin 4結合。
在特定的實施例中，基線閥值為約1100個EpCAM+細胞/3.5 ml的肋膜液。在其他的實施例中，EPCAM+細胞係以一或多個另外的專一性腫瘤標記染色，例如細胞角蛋白、Claudin 4、存活素及/或端粒酶。
在其他的實施例中，此方法包括一或多個步驟，其包括：就由下列組成之群中選出的臨床癥狀，對哺乳動物對象進行臨床評估：胸痛、咳嗽、呼吸困難、疲勞和發炎；將來自受試對象之肋膜液或漿液樣本與診斷試劑接觸，測量該樣本中蛋白或白蛋白之量；及重複該前述步驟，於受試對象患病期間的不同時間點，或受試對象治療癌症之前或期間，進行肋膜液或漿液中癌細胞數目之分析。在特定的實施例中，該受試對象係正在進行癌症治療且該方法能測定治療或預後之功效。在特定的實施例中，肋膜積液係在接觸步驟前，於受試對象肋膜液樣本之非決定性的細胞學或免疫細胞化學檢驗後，經測定為未知病因。
在此方法之其他的實施例中，另外的步驟係由下列選出：在接觸步驟前，將漿液或肋膜液樣本經由包括基本上大小一致之孔洞的過濾器過濾；使用預後和預測標記分析富集的細胞餾份；使用基因突變分析來分析富集的細胞餾份；及/或將富集的細胞餾份進行螢光原位雜交。預後和預測標記係由下列組成之群中選出：EGFR、ER、Ki67、PR、Her2/nu、BCL2、M30、Cox-2、PTEN、IGF-1R、AKT、PARP、CMET、P53、P27、CEA、AR、PSMA和PSA。或者，該等基因係由下列組成之群中選出：EGFR、BRAF、ARAF、K-ras和P53。
診斷或鑑別診斷特徵為哺乳動物對象之肋膜液或漿液中存有癌細胞之另外的方法，包括下列步驟：a)將該對象之肋膜液或漿液樣本以包括已知基本上孔徑一致之孔洞的過濾器過濾，用以富集肋膜積液腫瘤細胞(PETC)；b)分析過濾的PETC數目；及c)藉由鑑定過濾的PETC數目大於肋膜液或漿液中基線閥值，提供癌症之鑑別診斷。在其他的實施例中，此方法包括一或多個步驟，其包括：使用預後和預測標記分析富集的細胞餾份；使用基因突變分析來分析富集的細胞餾份；及/或將富集的細胞餾份進行螢光原位雜交。預後和預測標記係由下列組成之群中選出：EGFR、ER、Ki67、PR、Her2/nu、BCL2、M30、Cox-2、PTEN、IGF-1R、AKT、PARP、CMET、P53、P27、CEA、AR、PSMA和PSA。或者，該等基因係由下列組成之群中選出：EGFR、BRAF、ARAF、K-ras和P53。
E.實例
下列實例並非限制文中所述之實施例的範圍。熟習本項技術者應了解，下列實例可作修改，其係希望涵蓋在本發明之精神和範圍內。
實例1：肋膜液樣本 I.收集
肋膜液樣本通常係以無菌50 cc注射器或無菌尿液收集容器收集供細胞學檢驗，若在以實例2之細胞學方法檢驗前希望儲存或運送，則可進一步以步驟II和III處理。
就實例3之CellSearch分析，如上述，抽出未處理的肋膜液。將未處理的液體，視需要以無菌緩衝液簡單稀釋1：10，轉置於CellSave®試管。
將於任一情況下收集的液體標上樣本編號和診斷(若有的話)。最適當，液體係於取出30分鐘內轉交給試驗室進行處理。所有的過程應於生物安全櫃中無菌進行。肋膜液樣本係於24小時內進行實例3之分析。
II.在實例3之方法前，視需要離心和收取上清液供細胞學檢驗或儲存
A.將所有收集的樣品轉置於50cc的離心試管。
B.將此物質以~1,500 rpm離心10分鐘。
C.將約50 ml的上清液轉置於新的50 ml離心試管，收取上清液。
D.將步驟IIC之上清液以2200 rpm離心10分鐘(此高速旋轉將細胞碎片形成團塊)。
E.將10支1.8 ml低溫保存管(cryotube)標上樣本ID、製備日期和樣本類型(「PF上清液」)。
F.將高速旋轉得來的上清液轉置於新的50 ml試管。
G.將一等份1 ml上清液置入低溫保存管中。
H.將所收取的上清液等份儲存於-80℃。
III.步驟IIB之細胞團塊的再懸浮
A.使用真空吸引器，小心不要攪動細胞團塊，小心地移出和丟棄剩餘的上清液。
B.將細胞團塊以含0.5% FBS之無菌PBS再懸浮於50 ml的試管中，使得最終的體積為~20 ml。
C.以1500 rpm離心5分鐘，並移出上清液。
D.將10X解離緩衝液之儲存液(BD Pharm LyseTM，型號# 555899,10X濃縮溶液)以1：10於無菌水中稀釋。於細胞團塊中加入約細胞團塊10倍體積之1X解離緩衝液，並將試管置於迴轉式振盪器上輕度震盪15分鐘。若需要，延長解離步驟。
E.以1500 rpm離心5分鐘，將上清液丟棄，並以5 ml的無菌PBS(含0.5% FBS)再懸浮。
F.移出一小等份並計算細胞數目。
G.將2 x 106細胞轉置於4 ml的PBS(含0.5% FBS)-參見步驟4。
H.將1 cc的再懸浮細胞團塊轉置於新的無菌離心試管中 並加入6 cc的無菌PBS。
將此細胞懸浮液如實例2中所述以習用的細胞學顯微鏡檢驗評估。
實例2：細胞學檢驗 I.製備樣本
A.將實例1步驟III項目I之剩餘的細胞懸浮液以1500 rpm另再離心5分鐘。
B.移出上清液並準備加入冷凍培養基。
C.將團塊再懸浮於4 cc的冷凍培養基中。
D.標籤應包含樣本編號、樣本收集日期和樣本為肋膜液之指標。
E.於含異丙醇之Nalgene「Mr.Frosty」冷凍容器中儲存在-80℃至隔夜。屆時將低溫保存管轉置於-140℃。
II.使用CytoSpin ® 裝置之細胞學分析
A.將2 x 106個細胞轉置於4 ml的PBS(含0.5% FBS)中。
B.將塗片預先加上標籤。
C.製備配有紙墊之塗片並將光析管置於金屬支架。
D.將200 μl的此懸浮液裝入各光析管中。
E.以750 rpm旋轉10 min。
F.在無損傷新鮮的細胞離心塗片下，小心地拆下光析管及紙墊。
G.以直接刻線或永久性標記標示細胞離心之細胞周圍的區域。
H.繼續進行立刻固定或乾燥。將未固定的細胞離心塗片 於室溫下存放最多2天。或者，將未固定的細胞離心塗片於-20℃冷凍庫中存放數星期。
將生成的固定細胞以顯微鏡檢驗是否有指出腫瘤細胞或不成熟血液細胞之異常細胞存在。此分析類型所產生的初步診斷係記錄於下表1之第3欄中。
實例3：使用CELLSEARCH®系統之分析
CellSearch®循環腫瘤細胞系統(Veridex LLC)係用於辨識和計算肋膜液中循環的腫瘤細胞數目。分析過程係如Mayo Medical Laboratories Communique,Volume 36,No.1(Jan/Feb 2011)中所述，其係以引用的方式併入本文，並簡短概述如下。
A.將7.5 ml未處理和未稀釋的肋膜液置於CellSave試管中(Veridex LLC)。
B.移出PBS，並將細胞組份與新的緩衝液混合成所需的稀釋度，及然後加入磁鐵流體(ferrofluid)。磁鐵流體係由帶有被塗覆以上皮細胞黏附分子為標靶之抗體(EbCAM)聚合物層所包圍之磁核的奈粒子所組成。磁鐵流體/抗體複合物係專一性與細胞組份之上皮細胞連結。
C.將含有磁鐵流體/抗體複合物之試管置於磁性光析管中培養，其係將結合磁鐵流體的上皮細胞吸引至試管的各側。吸出剩餘的液體和未結合的細胞並移出磁鐵。然後將結合的細胞再懸浮於緩衝液中，產生上皮-富集的液體。
D.將三(3)細胞染劑加到上皮-富集的液體中用以幫助區分上皮細胞與白血球和非特定細胞碎片：i. 4’-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)係用於將細胞核染色，用以幫助鑑別活細胞；ii.藻紅蛋白(PE)-標定的細胞角蛋白(CK)抗體(CK 8、18和19)係辨識上皮細胞；及iii.別藻藍蛋白(APC)-標定的CD45抗體係與汙染的白血球結合。
E.將液體置於MagNest®(Veridex)細胞顯示裝置，其係將經磁性標定的上皮細胞吸引磁頭表面。將磁頭置於CellTracks®分析儀(Veridex)並使用螢光顯微鏡分析。掃描磁頭表面得到經上述三種試劑染色之細胞影像。
F.以表型為基準於影像中鑑別存在肋膜液樣本中之任何上皮癌細胞(例如EpCAM+和CK+)：EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-。DAPI染色陽性係辨別活性細胞與細胞碎片；CK染色陽性係辨別上皮細胞與其他細胞。無CD45染色係顯示細胞並非白血球。EpCAM+細胞係顯示惡性上皮癌細胞。所有其他的染色組合與癌細胞並不相關。
下表2A和2B係概括此方法之初步結果，其係以臨床診斷收到的肋膜積液隱匿二組病患之肋膜液樣本(其可為一或多個細胞學、臨床症狀學及/或切片結果之組合)。然後將這些病患樣本使用如目前測量血液中CTC中所用的相同配體和標定試劑，使用CellSearch系統(例 如鑑別細胞表型為EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-)進行文中所述方法之細胞分析。表2A和2B之第二和第三欄係顯示隱匿樣本之診斷。表2A和2B之第五欄係顯示此方法之癌細胞數目。第四欄係顯示細胞學試驗室之結果。以受試對象ID #來辨別小組，在表2A為CTCPF編號而在表2B中為UPCC編號。
下表3A和3B係概括此方法之最新的初步結果，其係以臨床診斷收到的肋膜積液隱蔽二組病患之肋膜液樣本(其可為一或多個細胞學、臨床症狀學及/或切片結果之組合)時。然後將這些病患樣本使用如目前測量血液中CTC中所用的相同配體和標定試劑，使用CellSearch系統(例如鑑別細胞表型為EpCAM+，DAPI+ CK+ CD45-)進行文中所述方法之細胞分析。表3A和3B之第二和第三欄係顯示隱蔽樣本之診斷。表3A和3B之第五欄係顯示此方法之癌細胞數目。第四欄係顯示細胞學試驗室之結果。以受試對象ID#來辨別小組，在表3A為CTCPF編號而在表3B中為UPCC編號。
對於非惡性腫瘤之實例，例如CHF、藥物反應、肝性肋膜積液、肺移植和放射線照射後，這些細胞數目結果(表3B第4欄)遠低於1100個細胞/3.5 ml肋膜積液基線閥值，平均數目為141。對於非上皮細胞癌病患的樣本(間皮瘤，和可能地腎細胞和胸腺細胞)，和血液癌症、多發性骨髓瘤(咸信所幼的癌細胞未帶有EpCAM決定基)，各病患的細胞數通常係在基線1100個以下，且平均為181個。對於上皮性惡性腫瘤每3.5 ml之平均細胞數為1,845。圖1B係顯示此數據。
試驗的診斷準確性係依照所選的閥值而定。此閥值能由本領域熟習本項技術者如額外的數據所示快速地決定。閥值越高產生低敏感性之越高的專一性。從目前所收集的數據(表3A和3B)，此項可於如圖1C所示之接受者操作曲線和下表4所示看出。
並非所有的癌症病患具有非常高的量。許多病患具有超過100個細胞/ml PF之細胞數。目前懷疑病患中低腫瘤細胞數可能是喪失CK決定基，或化療降低肋膜液中腫瘤細胞數，或晚期癌症其中腫瘤細胞已經歷上皮-間質細胞轉化，並喪失EpCAM+決定基。另外，對於顯示高平均細胞數之樣本(參見表4)，目前理論為，不像測定血液樣本中的CTC，較高的細胞數並非一定表示癌症的惡化期。
如2A和2B所示，對於CTCPF-019和UPPCC-23510-011之病患，細胞學評估驗證了這些病患的肋膜液樣本對惡性腫瘤為陰性。實例3所述之方法提供一個比實例2之細胞學評估更敏感的偵測，當使用100 CTC/3.5 ml肋膜液之基線截取值時，在二位病患中得到相反的結果。這些結果驗證了本方法於肋膜積液中診斷 和協助鑑別診斷癌症之價值。
下表5係概括由表3B之UPCC組之診斷所分類，每3.5 ml肋膜液之平均腫瘤細胞數(CTC)。圖1A之圖形係說明根據病因以散點圖代表之各受試對象每3.5 ml的CTC數之數據，且本圖支持原始數據。
如上所述在上表之數據中，實例3所述之方法提供更準確和敏感的偵測並為實例2之細胞學評估不確定或不正確的病患提供惡性腫瘤診斷。
亦收集使用第二染色標記(Claudin 4)降低背景染色量之初步數據。此緊密的蛋白-相關Claudin4(CL4)已顯示係以上皮來源之惡性細胞(但並非以間質細胞)存在。在PF細胞學中，從這些惡性來源中鑑別反應性間質細胞可能有困難。然後於約80位病患中將EPCAM+/細胞角蛋白+/CD45-/DAPI+之細胞以Claudin 4染色。染色之背景量明顯降低。良性疾病之中位數為0個細胞/3.5ml，惡性非上皮腫瘤為2個細胞/3.5 ml，而惡性上皮腫瘤為783個細胞/3.5 ml。圖1D和1E係顯示對照診斷之細胞數分布。
實例4：使用CELLSEARCH®系統定性腫瘤細胞
在此實例中，係列舉出腫瘤細胞並以各種生物標記來定性。CellTracks®分析儀II為4色顯微鏡，其使用3色計算出腫瘤細胞及以相關的生物標記定性腫瘤細胞的第4色亦可使用。此實例所試驗的生物標記為Ki67、EGFR、Muc1、Ki67、CD44、CEA、CD146、β連環蛋白(beta-catenin)、間皮素和細胞角蛋白5、6及7。CellSearch®循環腫瘤細胞系統(Veridex LLC)係用於鑑別和列舉肋膜液中循環的腫瘤細胞。除了與螢光染劑接合之相關的生物標記係用作CellTracks® AutoPrep系統上之標記試劑外，用於腫瘤細胞定性之樣本製備係與實例3中相同。
表6係顯示以病患樣本編號PF23501-44、-49、-51、-57、-61、-62、-63、-67、-75和02501-053所鑑定， 各種標記在不同病患之癌細胞上的表現。標記表現隨各病患而不同並顯示各病患之特性。此實例係顯示從肋膜液分離出的腫瘤細胞可經定性供治療評估和個人化治療選擇。
實例5：用於核酸分析之腫瘤細胞分離
於此實例中，係以CellTracks AutoPrep系統，使用CellSearch CTC Profile套組從肋膜積液分離癌細胞。Profile套組係藉由肋膜液中大部分的白血球和其他血液細胞形成團塊，藉此將背景減至最小，而富集腫瘤細胞。CellSearch CTC Profile套組含有僅供分離腫瘤細胞之試劑，且不含有任何染色試劑或如實例3中所論述滲透細胞。
A.將7.5 ml未處理和未稀釋的肋膜液置於CellSave試管(Veridex LLC)或EDTA試管。
B.移出PBS，並將細胞組份與新的緩衝液混合至所需的稀釋度，及然後加入磁鐵流體。磁鐵流體係由帶有被塗覆以上皮細胞黏附分子為標靶之抗體(EpCAM)聚合物層所包圍之磁核的奈粒子所組成。磁鐵流體/抗體複合物係專一性與細胞組份之上皮細胞黏附。將含有磁鐵流體/抗體複合物之試管置於磁性光析管中培養，其係將結合磁鐵流體的上皮細胞吸引至試管的各側。吸出剩餘的液體和未結合的細胞並移出磁鐵。然後將結合的細胞再懸浮於緩衝液中，產生上皮-富集的液體。
C.富集後，從PETC分離出核酸部分，使用適合分析物和本領域熟習本項技術者已知的技術用於下游分析。可分離的核酸部分包括(不限於)總RNA、微RNA和DNA。
D.然後將分離的核酸使用適合相關分析物之技術加以分 析。下游分析之方法包括(不限於)PCR、RT-PCR、全基因體增幅、全轉錄體增幅、DNA定序、RNA定序、突變分析、SNP偵測、微陣列分析和甲基化狀態確認。
實例6：以螢光原位雜交定性肋膜腫瘤細胞
螢光原位雜交(FISH)為用於鑑別基因體突變，例如異倍體、易位、基因增幅及/或刪除之技術。腫瘤突變狀態之定性對於預測對治療處理之反應很有用，提供有關病患預後資訊，使病患對治療臨床試驗滿意。此實例係描述如何於PETC細胞上進行FISH。術語FISH希望與CISH(顯色原位雜交)交換使用。
A.使用如實例3和4中所述之CellSearch®技術，富集細胞並掃描，隨後繼續進行FISH。
B.藉由加入甲醇/乙酸固色劑，將細胞固定在蕊心之玻璃表面，及隨後風乾。此方法將大多數的PETC細胞位置保留在蕊心內的。樣本可於-20℃儲存數年。
C.將標定雜交探針施予樣本。將樣本和探針於80℃共變性5分鐘，然後於42℃使其雜交至隔夜。在此實例中，對染色體1、7、8和17之著絲點專一性之衛星列舉探針(satellite enumeration probe)係分別以Platinum BrightTM 647、Platinum BrightTM 550、Platinum BrightTM 505和Platinum BrightTM 415螢光標定。Platinum BrightTM套組係得自荷蘭阿姆斯特丹Kreatech公司。雜交後，使用嚴密的清洗來移除非專一性雜交，並以DAPI將樣本對比染色。
D.使用經特定軟體修飾過之CellTracks®儀器，40x物鏡及適合的濾鏡讓用於FISH探針上的螢光色劑顯現，得到PETC影像。將CellSearch掃描之檔案數據用於進行蕊心校正並重新配置於CellSearch掃描中所鑑別出的PETC。得到各腫瘤細胞各螢光色劑之五個z-堆疊所製備的組合影像
圖2A-2G係顯示，如上述，於相同PETC上連續的免疫染色和FISH結果。
實例7：大規模研究
上述的原始數據顯示，就敏感性和專一性而言此方法具有很大的診斷潛力。為了測定此方法之性能，係從150位受試對象(皆為自願者)收集肋膜液，其包括良性積液和各種惡性的肋膜積液。根據上述實例所概述之方法，從實驗室收到的各病患樣本抽取7.5 ml的肋膜液(其中各案例係收集超過50 cc)並置於CellSave試管中。 以實例3中所述之相同技術分析此等試管。
收集與積液有關的臨床資訊，包括化學分析結果、細胞學結果和其他切片。若在收集液體當時未進行診斷，則會追蹤者些受試對象長達12個月或直到進行診斷。
雖然已收集全部150個樣本，但有相當大量的病患仍進行臨床追蹤。待所有的數據收集後，使用標準統計法計算此試驗之性能。在一實施例中，此方法係經包括另外的步驟修改，例如以抗「泛-惡性」蛋白，例如Claudin 4、存活素或端粒酶之第二抗體免疫染色。而另外的方法步驟包括於分離自肋膜液之癌細胞上進行染色體或螢光原位雜交(FISH)，用以測定這些細胞是否具有符合贅瘤性來源之染色體異常。
所有列於此說明書中和2011年7月28日申請的美國臨時專利申請案第61/512,576號中之文件係以引用的方式併入本文中。當使用「包括(comprising)」詞語呈現說明書之各種實施例或申請專利範圍時，在各種情況下，一相關的實施例可能係使用「組成(consisting of)」或「基本上組成」詞語。應注意術語「一(a或an)」係指一或多種(個)，例如「一試劑」請了解係代表一或多種試劑。因此，「一」、「一或多種」和「至少一種」在文中係交換使用。當本發明以參照特定的實施例描述之同時，請了解，在不悖離本發明之精神下可做修改。此等修改希望係落在所附的申請專利範圍內。
圖1A為使用CellSearch®系統於來自UPCC群體病患樣本之3.5毫升肋膜液中所偵測的腫瘤細胞(CK+/CD45-)數目對肋膜積液病因，良性(亦即鬱血性心衰竭或VHF，末期腎疾病或ESRD，放射性胸膜炎，乳糜胸)和惡性(淋巴瘤、間皮瘤、乳癌、非小細胞肺癌或NSCLC、鱗狀細胞肺癌或SCLC、卵巢癌和腎細胞癌)之診斷作圖之圖形。各+代表不同病患的肋膜液樣本。每3.5 ml肋膜液約1100個細胞之截取值得到100%專一性。
圖1B係顯示根據組織類型，例如良性、惡性、非上皮性和惡性上皮性，每3.5 ml肋膜液之CD+/CD45-細胞數目的圖形。
圖1C係顯示如實例中所論述用於診斷惡性肋膜積液之CellSearch®法的特性曲線圖，以敏感性對專一性作圖，其中ROC曲線下的面積=0.8662。結果係概述如下：
圖1D為使用CellSearch®系統於來自UPCC群體病患樣本之3.5毫升肋膜液中所偵測的腫瘤細胞(CK+/Claudin+/CD45-)數目對肋膜積液病因之診斷，根據如圖1A中所述之組織類型，例如良性、惡性、非上皮性和惡性上皮性作圖之圖形。各+代表不同病患的肋膜液樣本。
圖1E係顯示根據組織類型，例如良性、惡性、非上皮性和惡性上皮性，每3.5 ml肋膜液之CD+/Claudin+/CD45-細胞數目的圖形。
圖2A-2G係顯示在固定和與衛星計數(Satellite Enumeration)(SE)探針雜交後，後續PETC之免疫染色和相同的PETC之彩色FISH影像的照片。
圖2A係顯示以細胞角蛋白(Cytokeratin)染色之PETC影像。
圖2B係顯示以CD45染色之PETC影像。
圖2C係顯示以DAPI染色之PETC影像。在影像中心之大的細胞角蛋白+/DAPI+為PETC。箭頭係指出CD45+白血球之位置。
圖2D係顯示在固定和與染色體1的著絲點結合之SE探針(SE-1)雜交後的FISH影像。
圖2E係顯示在固定和與染色體7的著絲點結合之SE探針(SE-7)雜交後的FISH影像。
圖2F係顯示在固定和與染色體8的著絲點結合之SE探針(SE-8)雜交後的FISH影像。圖2G係顯示在固定和與染色體17的著絲點結合之SE探針(SE-17)雜交後的FISH影像。DAPI對比染色顯示為灰色。所有四種染色體之複寫數係參見PETC中。白血球上(箭頭)之FISH訊號可用作雜交對照。

Claims (31)

  1. 一種診斷或鑑別診斷特徵為哺乳動物對象之肋膜液或漿液中存有癌細胞之癌症之方法，該方法係包括：a)將該對象之肋膜液或漿液與連結第一配體之膠體磁性粒子接觸，而該配體係與癌細胞上決定基結合，但不以超過基線閥值與肋膜液或漿液中其他細胞和非細胞組份結合；及b)將肋膜液-磁性粒子混合物或漿液-磁性粒子混合物置於磁場中，若肋膜液或漿液中存有此細胞，則產生富含配體-連結磁性粒子-結合細胞之細胞餾份。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，進一步係包括：c)分析肋膜液或漿液中富集的餾份之配體-連結磁性粒子-結合細胞的數目；及d)藉由鑑定配體-連結磁性粒子-結合細胞之數目大於肋膜液或漿液中基線閥值，而提供癌症之鑑別診斷。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該肋膜液為肋膜積液。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之方法，進一步係包括在藉由接觸、執行和分析步驟分析肋膜液或漿液之前或之後，進行肋膜液或漿液之細胞學或免疫細胞學檢驗是否有異常細胞存在。
  5. 如申請專利範圍第1-4項任一項中之方法，進一步包括在該接觸步驟之前稀釋肋膜液或漿液。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該肋膜液或漿液 係用稀釋劑以1：10之比率稀釋。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該接觸步驟係在從受試對象抽取肋膜液樣本或漿液樣本之24小時內進行。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之方法，進一步係包括一或多個另外的步驟，其包括：於肋膜液或漿液-磁性粒子混合物中加入對表現在癌細胞或非癌細胞中之第二抗原專一性的第二配體，或能辨別富集餾份中非癌細胞與其他細胞或細胞碎片的試劑；於肋膜液或漿液-磁性粒子混合物中加入與癌細胞之第二細胞決定基結合的標定試劑；於肋膜液或漿液-磁性粒子混合物中加入辨別活細胞與細胞碎片的細胞專一性染劑；或在分析前，從富集的餾份純化非癌細胞、無核細胞、細胞碎片和未結合的物質。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一配體為對至少一種癌細胞決定基專一的單株抗體或其片段。
  10. 如申請專利範圍第8項之方法，另外其中該第二配體係專一性與肋膜液中的白血球結合，或與癌細胞上之專一性腫瘤標記結合，以增進專一性或鑑別存在於肋膜液或漿液中的癌細胞。
  11. 如申請專利範圍第8項之方法，其中至少一種第一配體、第二配體或標定試劑係專一性地與肺癌細胞或乳 癌細胞結合。
  12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該癌症係由下列組成之群中選出：肺癌、淋巴瘤、間皮瘤、轉移乳癌、轉移卵巢癌和轉移的前列腺癌。
  13. 如申請專利範圍第1-12項中任一項之方法，其中該第一配體係專一性地與上皮細胞黏附分子(EpCAM)結合。
  14. 如申請專利範圍第1-12項中任一項之方法，其中該第一配體係專一性地與L1細胞黏附分子(L1CAM)結合。
  15. 如申請專利範圍第1-12項中任一項之方法，其中該第一配體係專一性地與Claudin 4結合。
  16. 如申請專利範圍第8項之方法，其中該第一配體係專一性地與EpCAM或L1CAM結合，而該第二配體係專一性地與Claudin 4結合。
  17. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該基線閥值為約1100個EpCAM+細胞/3.5 ml的肋膜液。
  18. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該EPCAM+細胞係以一或多種另外的專一性腫瘤標記染色。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該另外的專一性腫瘤標記為細胞角蛋白、Claudin 4、存活素或端粒酶之一。
  20. 如申請專利範圍第1或2項之方法，進一步係包括一或多個步驟，其包括： 對由下列組成之群中選出的臨床癥狀，進行哺乳動物對象之臨床評估：胸痛、咳嗽、呼吸困難、疲勞和發炎；將來自該對象之肋膜液或漿液樣本與診斷試劑接觸，測量該樣本中蛋白或白蛋白之量；及重複該申請專利範圍第1項之步驟(a)和(b)，於受試對象患病期間的不同時間點，或受試對象治療癌症之前或期間，分析肋膜液或漿液中的癌細胞數目。
  21. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該對象係正在進行癌症治療且其中該方法能測定治療或預後的功效。
  22. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在接觸步驟前，該肋膜積液係於該對象肋膜液樣本之非決定性的細胞學或免疫細胞化學檢驗後，被確定為未知病因。
  23. 如申請專利範圍第1或2項之方法，係包括一或多個步驟，其包括：在接觸步驟前，將漿液或肋膜液樣本經由包括基本上大小一致之孔洞的過濾器過濾；利用預後和預測標記分析富集的細胞餾份；利用基因之突變分析來分析富集的細胞餾份；及將富集的細胞餾份進行螢光原位雜交。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該預後和預測標記係由下列組成之群中選出：EGFR、ER、Ki67、PR、Her2/nu、BCL2、M30、Cox-2、PTEN、IGF-1R、AKT、PARP、CMET、P53、P27、CEA、AR、PSMA和PSA。
  25. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該等基因係由下列組成之群中選出：EGFR、BRAF、ARAF、K-ras和P53。
  26. 如申請專利範圍第1或2項之方法，進一步係包括進行一或多個另外的步驟，其包括：使用細胞學或分子標記定出富集的細胞餾份之特性；培養此富集的細胞餾份；及使用細胞學或分子標記定出富集的細胞餾份之特性。
  27. 如申請專利範圍第26項之方法，進一步包括一或多個步驟，其包括：分析此培養的富集餾份；及於培養的富集細胞餾份進行藥物動力學研究。
  28. 一種診斷或鑑別診斷特徵為哺乳動物對象之肋膜液或漿液中存有癌細胞之方法，該方法包括：a)將該對象之肋膜液或漿液樣本以包括已知基本上孔徑一致之孔洞的過濾器過濾，用以富集肋膜積液腫瘤細胞(PETC)；b)分析此過濾的PETC數目；及c)藉由鑑定過濾的PETC數目大於肋膜液或漿液中基線閥值，提供癌症之鑑別診斷。
  29. 如申請專利範圍第28項之方法，係包括一或多個步驟，其包括：使用預後和預測標記分析富集的細胞餾份；使用基因之突變分析來分析富集的細胞餾份；及 將富集的細胞餾份進行螢光原位雜交。
  30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該預後和預測標記係由下列組成之群中選出：EGFR、ER、Ki67、PR、Her2/nu、BCL2、M30、Cox-2、PTEN、IGF-1R、AKT、PARP、CMET、P53、P27、CEA、AR、PSMA和PSA。
  31. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該等基因係由下列組成之群中選出：EGFR、BRAF、ARAF、K-ras和P53。
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Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6238856B2 (ja) * 2014-08-25 2017-11-29 シスメックス株式会社 尿中異型細胞の分析方法、尿分析装置および体液中異型細胞の分析方法
WO2017054075A1 (en) * 2015-09-28 2017-04-06 The Governing Council Of The University Of Toronto Device for magnetic profiling of particles in a flow
US10696961B2 (en) 2017-12-01 2020-06-30 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Magnetic cell isolation techniques
JP7350741B2 (ja) * 2017-12-01 2023-09-26 グローバル・ライフ・サイエンシズ・ソリューションズ・ユーエスエー・エルエルシー 細胞濃縮および単離のための方法
WO2021119470A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 University Of Miami Materials and methods for extracellular vesicle detection
JP2023524639A (ja) 2020-04-22 2023-06-13 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 患者特異的免疫療法用細胞の製造調整システム及び調整方法
JP2023524108A (ja) 2020-05-04 2023-06-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択
US20230172987A1 (en) 2020-05-04 2023-06-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
CA3195019A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Maria Fardis Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
US20240131064A1 (en) 2020-12-11 2024-04-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with braf inhibitors and/or mek inhibitors
WO2022133149A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
JP2023554395A (ja) 2020-12-17 2023-12-27 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド Ｃｔｌａ－４及びｐｄ－１阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法による治療
JP2024501845A (ja) 2020-12-31 2024-01-16 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球の自動化された産生のためのデバイス及びプロセス
TW202300014A (zh) 2021-03-05 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 腫瘤儲存及細胞培養組成物
CA3212439A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Michelle SIMPSON-ABELSON Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils
IL306072A (en) 2021-03-25 2023-11-01 Iovance Biotherapeutics Inc Methods and preparations for T-cell coculture potency assays and use with cellular therapy products
KR20240037185A (ko) 2021-04-19 2024-03-21 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. 키메라 공동자극 수용체, 케모카인 수용체, 및 세포 면역치료에서의 이의 용도
EP4340850A1 (en) 2021-05-17 2024-03-27 Iovance Biotherapeutics, Inc. Pd-1 gene-edited tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
WO2023009716A1 (en) 2021-07-28 2023-02-02 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors
TW202328439A (zh) 2021-09-09 2023-07-16 美商艾歐凡斯生物治療公司 使用ｐｄ－１ ｔａｌｅｎ基因減弱生成ｔｉｌ產物之方法
CA3232700A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Rafael CUBAS Expansion processes and agents for tumor infiltrating lymphocytes
US20230187042A1 (en) 2021-10-27 2023-06-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023147486A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2023201369A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment
WO2024011114A1 (en) 2022-07-06 2024-01-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Devices and processes for automated production of tumor infiltrating lymphocytes
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024098027A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd103 selection
WO2024112571A2 (en) 2022-11-21 2024-05-30 Iovance Biotherapeutics, Inc. Two-dimensional processes for the expansion of tumor infiltrating lymphocytes and therapies therefrom

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4939240A (en) 1983-03-04 1990-07-03 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies to human breast carcinoma cells and their use in diagnosis and therapy
JPH0763389B2 (ja) * 1986-10-28 1995-07-12 協和醗酵工業株式会社 抗ヒト中皮細胞単クローン性抗体
DE69029270T2 (de) 1989-09-15 1997-03-27 Genetic Systems Corp HYBRIDOMA CT43, DAS EIN ANTIKöRPER GEGEN EIN MUCINEPITOP VON DARMKREBS ERZEUGT
DE69306803T2 (de) 1992-09-17 1997-05-15 Merck Patent Gmbh Kleinzelliger lungenkarzinom-spezifischer antikörper und antigenen
NO180658C (no) * 1994-03-10 1997-05-21 Oeystein Fodstad Fremgangsmåte og anordning for deteksjon av spesifikke målceller i spesialiserte eller blandede cellepopulasjoner og opplösninger som inneholder blandede cellepopulasjoner
US6136182A (en) 1996-06-07 2000-10-24 Immunivest Corporation Magnetic devices and sample chambers for examination and manipulation of cells
US5985153A (en) 1996-06-07 1999-11-16 Immunivest Corporation Magnetic separation apparatus and methods employing an internal magnetic capture gradient and an external transport force
US6790366B2 (en) 1996-06-07 2004-09-14 Immunivest Corporation Magnetic separation apparatus and methods
US6660159B1 (en) 1996-06-07 2003-12-09 Immunivest Corporation Magnetic separation apparatus and methods
US6890426B2 (en) 1996-06-07 2005-05-10 Immunivest Corporation Magnetic separation apparatus and methods
AU760560B2 (en) 1998-02-12 2003-05-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
US7282350B2 (en) 1998-02-12 2007-10-16 Immunivest Corporation Labeled cell sets for use as functional controls in rare cell detection assays
US6623982B1 (en) 1999-07-12 2003-09-23 Immunivest Corporation Increased separation efficiency via controlled aggregation of magnetic nanoparticles
EP1360471B1 (en) 2001-02-12 2006-09-20 Immunivest Corporation Cartridge for containing a specimen sample for optical analysis
CA2457894C (en) * 2001-08-23 2014-07-08 Immunivest Corporation Analysis of circulating tumor cells, fragments, and debris
GB2395270B (en) * 2002-11-14 2006-08-16 Univ Nottingham Tumour marker proteins and uses thereof
EP2336779B1 (en) * 2004-02-19 2013-07-31 Yale University Kit for the identification of ovarian cancer protein biomarkers using proteomic techniques
CA2512295A1 (en) * 2004-07-16 2006-01-16 Stemcell Technologies Inc. Magnetic target entity separation method
JP5086241B2 (ja) * 2005-04-21 2012-11-28 カリフォルニア インスティチュート オブ テクノロジー パリレンメンブレンフィルターの使用
US7846743B2 (en) * 2005-04-21 2010-12-07 California Institute Of Technology Uses of parylene membrane filters
FR2896881B1 (fr) * 2006-01-31 2008-04-18 Biomerieux Sa Procede de dosage du prongf pour le diagnostic in vitro du cancer du sein et utilisation du prongf en therapie
CA2661669C (en) * 2006-08-23 2017-02-14 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology A pharmaceutical composition for treating cholangiocarcinoma, a method for inhibiting growth or invasion of cholangiocarcinoma and a method for treating cholangniocarcinoma
EP2037265A1 (en) * 2007-09-17 2009-03-18 Adnagen AG Solid phase cell isolation and/or enrichment method
JP2012524521A (ja) * 2009-03-06 2012-10-18 トライパス イメージング インコーポレイテッド グリコデリンモノクローナル抗体および卵巣癌の検出におけるその使用のための方法

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