CN112946270B - 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒 - Google Patents

用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112946270B
CN112946270B CN202110117855.2A CN202110117855A CN112946270B CN 112946270 B CN112946270 B CN 112946270B CN 202110117855 A CN202110117855 A CN 202110117855A CN 112946270 B CN112946270 B CN 112946270B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
marker
ptprc
dapi
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110117855.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112946270A (zh
Inventor
昌晓红
程洪艳
崔恒
李艺
祝洪澜
王建六
叶雪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Angke Future Medical Equipment Co ltd
Peking University Peoples Hospital
Original Assignee
Beijing Angke Future Medical Equipment Co ltd
Peking University Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Angke Future Medical Equipment Co ltd, Peking University Peoples Hospital filed Critical Beijing Angke Future Medical Equipment Co ltd
Priority to CN202110117855.2A priority Critical patent/CN112946270B/zh
Publication of CN112946270A publication Critical patent/CN112946270A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112946270B publication Critical patent/CN112946270B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds

Abstract

本发明公开用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒。本发明包括利用试剂从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定标志细胞的步骤，其中，标志细胞为DAPI+/PTPRC‑/PECAM1+/CEP8≠2和/或DAPI+/PTPRC‑/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2细胞。本发明能够有效区分良性肿瘤与恶性肿瘤，与传统的基于瘤标的方法相比，本发明的方法诊断价值更高。

Description

用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及诊断领域，具体地涉及用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒。
背景技术
生物机体内在各种因子的刺激下使细胞分裂活跃，细胞数量增多，产生各种疾病，称之为异常增生或异常增殖，包括良性的肿瘤和恶化后的癌症或恶性异常增殖。因此异常增殖的早期诊断对于异常增生的尽早及时干预至关重要。例如，卵巢癌(OC)属于一种恶性异常增殖，是第二大最常见的妇科癌症，其死亡人数比其他任何妇科恶性肿瘤都要多。由于缺乏有效的早期诊断方法，超过70％的病例被诊断为晚期。尽管进行了最佳的细胞减灭术和标准的铂类化学疗法，大多数患者仍无法治愈，70％以上的患者会在2-3年内复发。这些因素加在一起，导致5年生存率低于30％。早期诊断的困难和容易转移是死亡的主要原因。探索用于OC诊断和复发监测的生物标志物对于提高OC患者的存活率具有重要意义。
循环肿瘤血管内皮细胞被认为在PECAM1阳性的循环内皮细胞中的具有非整倍体核型的细胞，最新的研究表明，其可能在肿瘤新生血管和转移中起重要作用(LinPP.Aneuploid circulating tumor-derived endothelial cell(CTEC):a novelversatile player in tumor neovascularization and cancer metastasis.Cells2020；9:1539)。另外有研究表明，循环肿瘤血管内皮细胞可以作为潜在的肿瘤标志物，用于抗血管生成药物和某些肿瘤的免疫治疗效果的监测(Zhang L,Zhang X,Liu Y,et al.PD-L1(+)aneuploid circulating tumor endothelial cells exhibit resistance to thecheckpoint blockade immunotherapy in advanced NSCLC patients.Cancer Lett2020；469:355-366)。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
鉴于现有技术中的现状，本发明在深入研究后发现通过在从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定特定类型的细胞作为标志细胞可以有效地诊断体内恶性实体肿瘤。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，其包括利用试剂从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定标志细胞的步骤，其中，所述标志细胞为DAPI+/PTPRC-/PECAM1+，且8号染色体为异倍体的细胞和/或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+，且8号染色体为二倍体的细胞。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，通过CEP8检测8号染色体是否为异倍体。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述标志细胞的染色体为四倍体。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述试剂包括DAPI、抗PTPRC抗体和抗PECAM1抗体，和可选的抗肿瘤标志分子抗体。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述恶性实体肿瘤为卵巢癌。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述标志细胞为5μm以下。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，包括以下步骤：
(1)向富集液相中加入抗原修复缓冲液和染色混合液进行结合反应，离心后去上清得到细胞液，所述染色混合液包含DAPI、抗PTPRC抗体和抗PECAM1抗体，且各抗体分别偶联不同的荧光基团；
(2)向所述细胞液加入固定液混匀后，涂布于载玻片，干燥后加入包含CEP8探针的显色试剂进行杂交，得到检测标本；
(3)在荧光显微镜下通过颜色选择PECAM1+、DAPI+、PTPRC-且染色体为二倍体的细胞，和/或选择PECAM1+、DAPI+、PTPRC-、肿瘤抗原阳性且染色体为异倍体的细胞作为候选细胞。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，进一步包括确认候选细胞大小的步骤。更优选，进一步包括选择5微米以下小细胞且染色体为四倍体的细胞作为标志细胞的步骤。
在某些实施方案中，本发明的标志细胞包括第一标志细胞和第二标志细胞，其中第一标志细胞为DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2或DAPI+/PTPR C-/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2细胞，或其亚类，例如其中的四倍体小细胞亚类；第二标志细胞为DAPI+/PTPRC-/PECAM1-且染色体为异倍体的细胞，优选染色体为三倍体和四倍体。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述富集液相通过包括下述步骤的方法得到：
取从受试者采集的外周血进行离心，弃上清后，加入清洗液混匀后，经密度梯度分离得到三层液体，取最上层和中间层液体混合，然后加入与磁珠结合的白细胞抗体，经磁分离后得到富集液相。
根据本发明所述的用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法，优选地，所述恶性实体肿瘤为卵巢癌，且当每5-7ml外周血中存在1个以上的标志细胞时，将受试者诊断为患有卵巢癌或受试者患卵巢癌的风险高，当每5-7ml外周血中存在小于1个标志细胞时，将受试者诊断为未患有卵巢癌或受试者患卵巢癌的风险低。
本发明的第二方面，提供一种体内恶性实体肿瘤的预后方法，其包括利用试剂从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定标志细胞的步骤，其中，所述标志细胞为DAPI+/PTPRC-/PECAM1+，且8号染色体为异倍体的细胞和/或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+，且8号染色体为二倍体的细胞。
根据本发明第二方面所述的预后方法，优选地，包括在第一样本和第二样本中分别测量标志细胞数量的步骤。其中第一样本对应于在施用药物前的第一时间点采集的受试者的富集液相，第二样本对应于在施用药物后的第二时间点采集的受试者的富集液相。优选地，进一步包括当第二样本中标志细胞的数量小于第一样本中标志细胞的数量时，表明预后效果好。反之，当第二样本中标志细胞的数量大于第一样本中标志细胞的数量时，表明预后不良。
本发明的第三方面，提供一种用于诊断体内恶性实体肿瘤的试剂盒，其包含用于显示细胞表面或细胞内存在PTPRC和PECAM1的试剂、DAPI试剂和用于显示细胞染色体为异倍体的试剂，可选的进一步包含用于显示肿瘤标志物分子的试剂。
本发明的方法能够有效地诊断恶性实体肿瘤。与传统的基于瘤标的方法相比，本发明的方法诊断价值更高。
附图说明
图1为从卵巢癌外周血鉴定的候选细胞的图像。
图2为候选细胞在良性和恶性卵巢癌组间的差异分布。
图3为候选细胞不同倍体亚类的候选细胞的图像(SE-iFISH)。
图4-5为候选细胞不同倍体亚类在良性和恶性卵巢癌组间的差异分析(图4为散点图；图5为饼图，左侧的图标依次表示单倍体、三倍体、四倍体和五倍体)。
图6为候选细胞不同大小细胞亚类的图像(SE-iFISH)。
图7-8为不同大小细胞亚类的候选细胞在良性和恶性卵巢癌组间的差异分析(图7为散点图；图8为饼图)。
图9-11为不同大小的候选细胞的非整倍性分析(图9、10分别为大、小细胞亚类的候选细胞在良性和恶性卵巢癌组间的倍性分布的散点图；图11为不同倍性的染色体在不同大小的候选细胞中的比例，n表示检测到的细胞数，数据是以平均值±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图12为候选细胞的ROC曲线。
图13为根据倍性和细胞大小分类的各亚组的ROC曲线。
图14为候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)动态变化的相关性。
图15为候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用在良性和恶性卵巢癌组中的总和。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于数量的百分数。
发明人发现在外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中，通过选择特定的抗原作为指标得到一组候选细胞。经进一步研究后发现直接将这些候选细胞作为指标并不能用于诊断实体肿瘤，但是当进一步进行选择，特别是选择其中的四倍体小细胞时可以有效地将恶性实体肿瘤与良性肿瘤区别开来。另外，本发明的方法更多的利用了直径5微米以下的细胞，这些小直径细胞对于诊断同样具有重要价值。而传统的从外周血分离循环肿瘤血管内皮细胞的方法不可避免地排除了部分小直径细胞。这对于细胞数量本身极少的循环肿瘤血管内皮细胞的检测而言是极为不利的。
本发明的“恶性实体肿瘤”是指体内细胞过度分裂产生的一类疾病的总称，其实例不特别限定，包括但不限于卵巢癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌和宫颈癌等。本发明优选妇科癌症，特别是卵巢癌。
本发明的“标志细胞”是指可用作疾病诊断或判断依据或指标的细胞。本发明的标志细胞属于一类特定的循环肿瘤血管内皮细胞，其特别是指源自外周血的DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TM S+/CEP8＝2细胞，即DAPI染色阳性，PTPRC为阴性和PECAM1为阳性的细胞或其亚类。在某些实施方案中，将染色体异常，特别是8号染色体为异倍体的细胞作为本发明的标志细胞。在某些实施方案中，本发明的标志细胞不仅存在染色体异倍体，而还需要染色体特别是8号染色体为多倍体，优选4倍体。需要说明的是，本发明的标记细胞大小同样不限定，可以是任意直径大小的细胞，只要其通过被DAPI染色阳性即可。在某些实施方案中，本发明的标志细胞特别地包含5微米直径以下的细胞，且此类直径的细胞占标志细胞总量的30％以上，优选35％以上。
在另外的实施方案中，本发明的标志细胞还可以使用上述标志细胞与另一标志细胞联用以用作疾病诊断或判断依据或指标的细胞，在这种情况下，本发明的本发明的标志细胞包括第一标志细胞和第二标志细胞。第一标志细胞为前述的DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2细胞；第二标志细胞DAPI+/PTPRC-/PECAM1-细胞，且第二标志细胞的染色体为异倍体，优选染色体为三倍体和四倍体。
本发明的“富集液相”是指从外周血中去除占血液大部分的红细胞和白细胞后得到的候选细胞富集的混合液。由于是从外周血中仅去除作为杂质的红细胞和白细胞，而对于目标细胞并无损失。因此本发明的富集液相，也称作差相富集液相。富集液相的制备可通过已知方式进行。下文示例性说明了其制备过程。
本发明中，表示细胞数量或个数的数值一般为自然数，例如1、2、3、4、5等。在数量统计的情况下，例如多次计数或测量并统计平均值时，细胞数量可以用小数表示，例如1.5个，1.8个等。
本发明的第一方面，提供用于诊断机体内细胞异常增殖的方法，有时简称为“本发明的诊断方法”，其包括利用试剂从外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中鉴定标志细胞的步骤。
本发明中，只要是能够显示标志细胞存在或其状态，则对于试剂不特别限定。试剂可以是一种试剂，也可以是多种试剂的组合。一般而言，本发明的试剂包括能够显示选自PECAM1和PTPRC组成的组的指示剂、DAPI和能够显示细胞染色体是否为异倍体的试剂。优选地，指示剂可包括能够显示颜色的部分和能够特异性与标志细胞内或标志细胞表面的特定成分结合的部分。优选地，两种部分之间通过例如共价健方式结合。能够显示颜色的部分可以是已知的着色剂、颜料、染料或荧光剂等。能够特异性与标志细胞内或标志细胞表面的特定成分结合的部分包括能够与核酸结合的物质，例如DNA探针或核酸的其他互补片段，还包括抗体、受体或配体，或者它们的修饰物或衍生物。
本发明的抗体包括多抗、单抗、嵌合抗体、纳米抗体、人源化抗体或者完全人类抗体。本发明的抗体还可以是单链抗体。本发明中，抗体的修饰物包括化学修饰物以及抗体和其他材料的偶联物。其中，化学修饰物的实例包括但不限于抗体的乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、交联环化、二硫键化、脱甲基化、共价交联、半胱氨酸化、焦谷氨酸化、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解和磷酸化等。其中，偶联物的实例包括但不限于与纳米高分子材料、磁珠等的偶联物。
在某些实施方案中，本发明的试剂包括抗体和与之偶联的可检测基团，例如荧光基团。本发明中，多种试剂的情况下，优选地，每种试剂的可检测基团不同。
在某些实施方案中，本发明的试剂还进一步包括用于显示肿瘤标记物的试剂。此类试剂可使用本领域已知的试剂，例如各种瘤标抗体，其实例包括但不限于针对CA125、HE4、PDL-1、methothelin、Kallikrein、osteopontin、claudin、TP53、c-myc、Bcl2、Bcl6、IgH、HER-2、MUC1、Folate Receptor、E-cadherin、N-cadherin、EpCAM、cytokeratin、vimentin、CD44、CD133、CD24、CD117的抗体等。本发明可以使用上述瘤标抗体中的一种或多种的组合。
本发明中，鉴定标志细胞的方法不特别限定，优选包括实施免疫荧光染色的步骤和染色体荧光原位杂交的步骤。在示例性实施方案中，本发明的鉴定包括以下步骤：
(1)向所述富集液相中加入抗原修复缓冲液和染色混合液进行结合反应，离心后去上清得到细胞液，所述染色混合液包含DAPI、抗PTPRC抗体和抗PECAM1抗体，且各抗体分别偶联不同的荧光基团；
(2)向所述细胞液加入固定液混匀后，涂布于载玻片，干燥后加入包含CEP8探针的显色试剂进行杂交，得到检测标本；
(3)在荧光显微镜下通过颜色选择PECAM1+、DAPI+、PTPRC，染色体为二倍体或异倍体的细胞，将选择的细胞作为用于诊断的标志细胞。
可选地，本发明进一步包括(4)从外周血得到富集液相的步骤。
本发明中优选通过差相富集来进行富集。差相富集完全不依赖于肿瘤细胞表面标志物(如EpCAM)的表达，应用偶联抗人白细胞表面抗原的特殊单克隆抗体组合群的免疫磁微粒及用于分离血源性细胞的特殊离心介质快速高效去除肿瘤病人血液中的红细胞、白细胞及血浆蛋白，从而有效富集血液标本中的循环血管内皮细胞等。获取的肿瘤细胞既没有被磁珠所包裹，亦没有与任何抗肿瘤细胞表面标志物的抗体相结合，从而避免了激活细胞内的信号传导通路。与其它常规方法相比，差相富集方法中红细胞的去除避免了低渗裂解法的使用，从而对富集的肿瘤细胞的损伤降至最低，使得获取的靶细胞维持良好的自然状态及细胞形态。另外，采用差相富集方法还可避免基于细胞大小，例如微流控技术进行细胞筛选时遗漏大量小细胞的不足，特别是能够避免例如直径小于5μm以下的有效细胞的损失。
在示例性实施方案中，本发明的富集液相制备包括以下步骤：取从受试者采集的外周血进行离心，弃上清后，加入清洗液混匀后，经密度梯度分离得到三层液体，取最上层和中间层液体混合，然后加入与磁珠结合的白细胞抗体，经磁分离后得到富集液相。
本发明的诊断方法中，只要包括鉴定本发明所述的标志细胞的步骤，即在本发明的范围内。在优选的实施方案中，除了上述鉴定步骤之外，本发明的诊断方法还进一步包括判断步骤。
本发明中，判断步骤一般包括基于预先设定的阀值(本文中有时也称为“阈值”)来对鉴定步骤的结果进行分类，并由此确认诊断结果。本发明的阀值可以是标志细胞的数量。由于本发明的标志细胞为特定的循环肿瘤血管内皮细胞，在外周血中其含量极少。因此一般而言以5-7ml外周血，特别是6ml外周血内所检测到的标志细胞的数量作为标准。在示例性实施方案中，本发明的阀值一般为2个/6ml外周血以上，优选3个/6ml外周血以上。需要说明的是，本发明的标志细胞还可以进一步细化为不同亚类或亚组。在以标志细胞的亚类作为指标时，本发明的阀值的选择通常会不同。例如，当仅基于4倍体标志细胞进行判断时，此时的阀值为1个/6ml外周血以上，优选2个/6ml外周血以上。
本发明的第二方面，提供用于诊断机体内细胞异常增殖的试剂盒，其一般包含用于显示细胞表面或细胞内含有选自PTPRC和PECAM1的试剂、DAPI和用于显示细胞染色体为异倍体的试剂。可选地，本发明的试剂盒进一步包含用于显示肿瘤标志物的试剂。
实施例
一、患者及样本
招募的对象为2018年5月至2020年8月在北京大学人民医院收治的56名妇女。术前从高度怀疑为恶性肿瘤或明确诊断但未接受治疗的患者中收集外周血。术后病理证实了20例新诊断的原发性OC和36例卵巢良性肿瘤。根据赫尔辛基宣言，从所有患者获得书面知情同意书。该研究得到北京大学人民医院伦理委员会的批准，并根据赫尔辛基宣言的原则进行。
二、候选细胞的差相富集
将6ml外周血收集到装有ACD抗凝剂的试管中(Becton Dickinson，FranklinLakes，NJ，美国)，然后在室温下离心(200×g)15分钟以分离血浆。弃去棕红色沉淀物上方的上清液，将血细胞沉淀物用6ml CRC缓冲液稀释，然后在50mL离心管中轻轻加入3mL样品密度分离液中，然后以450×g离心7分钟。将含有WBCs和高于RBCs的肿瘤细胞的溶液收集到50ml试管中，然后，将300μL涂有抗白细胞单克隆抗体(抗PTPRC等)的磁珠添加到样品中，并在室温下摇动30分钟。使用50ml大小的磁选机(Cytelligen)去除与WBCs结合的免疫磁珠，然后洗涤非血源性细胞(包括肿瘤细胞和内皮细胞)并富集剩余的100μL CRC液体。样品适用于后续分析。
三、免疫染色和荧光原位杂交(iFISH)
向100μL富集的细胞溶液中加入2μL抗原修复缓冲液，轻轻混合并摇匀，然后在室温下静置10分钟。随后通过与淋巴细胞的荧光标记单克隆抗体(抗PTPRC-Alexa594)、内皮细胞的荧光标记单克隆抗体(抗PECAM1-Cy5)和OC肿瘤标志物(TM)的荧光标记单克隆抗体(抗CA125-Cy7、抗HE4-Alexa488)在室温下以1：200稀释孵育20分钟。将染色的细胞样品用CRC洗涤液洗涤并离心(500×g)5分钟，然后弃去上清液，剩下100μL。等体积的组织固定剂将这些细胞固定过夜。将样品包被在载玻片上，并用CEP 8探针进行原位杂交(美国AbbottMolecular，美国)。杂交条件是在76℃变性10min，在37℃杂交3h。借助于缓冲液，将盖玻片缓慢除去。清洁的载玻片用吹风机干燥。洗涤后，将样品用含有DAPI的固定介质(蓝色)固定。使用荧光显微镜收集鉴定出的肿瘤细胞的图像。
本发明标志细胞的判断标准：DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2或DAP I+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2。具体地，PTPRC：染色阴性，与白细胞最明显的区别是没围绕细胞核的鲜明红色光环。CEP8：1体、3体、4体、≥5体。信号在红色或橙色通道下均很清晰。PECAM1：信号阳性，因PECAM1与血小板结合，因此绿光下有成簇点状染色，背景高低因人而异。DAPI：蓝色，圆或椭圆形。
四、数据处理
所有统计分析均使用SPSS 24.0版本(24.0版本；美国纽约IBM公司)和GraphPadPrism 7(GraphPad Software，美国加利福尼亚州拉荷亚)。使用单向方差分析(ANOVA)和非配对t检验对两组之间的差异进行统计学分析，与三组独立数据之间的差异相同。使用Fisher精确检验法检测循环肿瘤血管内皮细胞阳性与临床病理特征的相关性。通过非参数受试者工作特性(ROC)曲线分析确定循环肿瘤血管内皮细胞的阈值，并使用最大的尤登指数(灵敏度+特异性-1)来确定临界值。分类数据以百分位数表示。使用人相关性分析来确定相关性。P值<0.05被认为具有统计学意义。
五、结果
CA125和HE4作为肿瘤标志物(TM)都已被证明在OC的临床诊断中具有重要价值。无论CA125阳性还是HE4阳性或双重阳性都被认为是TM阳性。本发明中选择以下标准的细胞作为候选细胞(本文有时简称为CTEC)，被表征为TM阳性且染色体为二倍体、没有PTPRC表达但有PECAM1表达的有核细胞，或者染色体为异倍体、没有PTPRC表达但有PECAM1表达的有核细胞。更具体地说，候选细胞被定义为：DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2和/或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2细胞(图1)。
1、在OC和对照组中候选细胞计数的分布
比较20例OC患者与36例诊断为卵巢良性肿瘤的候选细胞的计数。在OC组和良性组循环肿瘤候选细胞计数分别为180(平均9.0/6ml)和169(平均4.69/6ml)。尽管OC组中CTEC的计数高于良性组，但两组之间无统计学意义(P＝0.1652)(图2)。
2、候选细胞的CA125和HE4表达特征及Chr8异倍性
通过免疫荧光染色鉴定CA125和HE4在候选细胞的细胞膜和细胞质上的表达。通过荧光原位杂交检测候选细胞中Chr8的倍性。结果显示在表1中。在4例OC患者中检测到CA125阳性者6例(6/20，30.0％)，占少数(26/180，14.4％)。HE4阳性5例(5/20)，占25.0％，总计数11例(11/180)，占6.1％。
表1 20例卵巢癌患者中循环肿瘤血管内皮细胞的CA125和HE4表达特征及Chr8异倍性
Figure BDA0002920998820000121
无论是OC患者的阳性检出率，还是CA125+或HE4+候选细胞的总计数比例均较低。但是，在80％(16/20)的OC患者中发现具有Chr8非整倍性的候选细胞。此外，180个候选细胞均为非整倍体，TMs+候选细胞为二倍体。总的来说，TMs阳性候选细胞的数量不足，本研究中候选细胞的主要特征是Chr8非整倍体。
3、候选细胞的非整倍性亚型分析
在我们的研究中，大多数候选细胞表现出不同的Chr8非整倍性亚型，即单倍体、三倍体、四倍体和五倍体以上。图3显示了示例性候选细胞的图像。
由于在我们的研究中几乎未检测到单倍体候选细胞，因此未分析数据。整倍体候选细胞的分布如图4所示。图5显示了每个倍性的比例。其中，在良性肿瘤中单倍体占6.5％，三倍体占9.47％，四倍体占9.47％，五倍体及以上占74.56％；在卵巢癌中单倍体占1.11％，三倍体占9.44％，四倍体占8.89％，五倍体及以上占80.56％。整体上，五倍体及以上的候选细胞在良性或恶性肿瘤组中均占优势。
4、不同大小候选细胞的分布
候选细胞中小细胞(≤5μm)和大细胞(>5μm)的鉴定如图6所示。图7显示了OC组和良性组中小细胞和大细胞循环肿瘤血管内皮细胞的分布。图8显示良性组中小、大候选细胞分别为14.79％(25/169)和85.21％(144/169)，卵巢癌组中小、大候选细胞分别为14.44％和85.56％。癌组和良性组中循环肿瘤血管内皮细胞均以大细胞为主。
5、不同大小循环肿瘤血管内皮细胞的非整倍性分析
为了进一步了解循环肿瘤血管内皮细胞的各种亚型的重要性，将细胞大小、Chr8倍性和疾病都考虑在内，图9和图10显示了良性或OC组中小或大候选细胞的分布，四倍体细胞在小细胞之间有显著差异(P＝0.0003)。
图11显示了在良性或癌症组中不同大小的非整倍体细胞的比例。无论是良性患者还是癌症患者，三倍体细胞均是小细胞中的最高亚组，而五倍体以上细胞则是大细胞中的最高亚组。
6、候选细胞计数的临床价值
为了将OC患者与非恶性肿瘤区分开绘制了ROC曲线(如图12所示)，根据非整倍性或通过本发明的SE-iFISH方法测量的细胞大小确定候选细胞的灵敏度和特异性。根据约登指数选择最佳的临界值，具体阈值为1.5，AUC为0.616，灵敏度为80％，特异性为41.57％。
为了寻求更好的指标，接下来，用同样的方法确定了候选细胞亚类的阀值和灵敏度和特异性。结果表明，四倍体小细胞循环肿瘤血管内皮细胞阈值为0.5，AUC为0.675，灵敏度为35％，特异性为100％。根据倍性和细胞大小分类的各亚组的ROC曲线如图13所示，同时，这些指标在良性组和恶性组的分布差异有统计学意义。所选循环肿瘤血管内皮细胞亚组具有良好的临床诊断价值。
7、候选细胞+循环肿瘤细胞(CTC)计数的临床价值
本发明进一步探究了所选候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用的临床价值。在联用的情况下，本发明的标志细胞包括第一标志细胞和第二标志细胞。第一标志细胞为本发明的DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/CEP8≠2或DAPI+/PTPRC-/PECAM1+/TMS+/CEP8＝2细胞；第二标志细胞DAPI+/PTPRC-/PECAM1-细胞，且其染色体为异倍体。
候选细胞的差相富集、荧光原位杂交和数据处理按照前述方法进行，具体实验结果如下：
7.1循环肿瘤血管内皮细胞与循环肿瘤细胞(CTC)相关性研究
首先，确认了候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)的计数之间是否有关联。其相关性研究结果见图14所示，候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)之间存在中等相关性(r＝0.442，P＝0.001)，为了确定候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)组合的效用，我们计算了不同组中候选细胞和循环肿瘤细胞(CTC)的总和。结果如图15所示。
7.2候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用的临床价值
在对候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用的临床价值的研究中，根据约登指数选择最佳的临界值，最终阈值为11.5，AUC为0.65，灵敏度为60％，特异性为72.22％。
进一步地，候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用的ROC曲线如图12所示。这些指标在良性组和恶性组的分布差异有统计学意义。所选候选细胞与循环肿瘤细胞(CTC)联用具有潜在的临床诊断价值。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims (2)

1.用于检测DAPI+/PTPRC-/PECAM1+且8号染色体为四倍体直径5µm以下的标志细胞的试剂在制备通过下述方法区分体内卵巢癌良性和恶性的试剂盒中的用途，其特征在于，所述方法包括：
向从卵巢癌患者的外周血中去除红细胞和白细胞得到的富集液相中加入抗原修复缓冲液，轻轻混合并摇匀，然后在室温下静置，随后通过与淋巴细胞的荧光标记单克隆抗体即抗PTPRC-Alexa594抗体、内皮细胞的荧光标记单克隆抗体即抗PECAM1-Cy5抗体和OC肿瘤标志物的荧光标记单克隆抗体即抗CA125-Cy7抗体和抗HE4-Alexa488抗体在室温下以1：200稀释孵育，将染色的细胞样品用CRC洗涤液洗涤，离心后去上清得到细胞液，使用等体积的组织固定剂将这些细胞固定过夜，将样品包被在载玻片上，并用CEP8探针进行原位杂交，杂交条件是在76℃变性10min，在37℃杂交3h，将盖玻片缓慢除去，使清洁的载玻片干燥，洗涤后，将样品用含有DAPI的固定介质固定，在荧光显微镜下通过颜色选择PECAM1+、DAPI+、PTPRC-且染色体为四倍体的细胞作为候选细胞；
所述试剂由DAPI、抗PTPRC抗体、抗PECAM1抗体和用于显示细胞染色体为异倍体的CEP8试剂组成。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述富集液相通过包括下述步骤的方法得到：
取从卵巢癌受试者采集的外周血进行离心，弃上清后，加入清洗液混匀后，经密度梯度分离得到三层液体，取最上层和中间层液体混合，然后加入与磁珠结合的白细胞抗体，经磁分离后得到富集液相。
CN202110117855.2A 2021-01-28 2021-01-28 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒 Active CN112946270B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110117855.2A CN112946270B (zh) 2021-01-28 2021-01-28 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110117855.2A CN112946270B (zh) 2021-01-28 2021-01-28 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112946270A CN112946270A (zh) 2021-06-11
CN112946270B true CN112946270B (zh) 2023-03-17

Family

ID=76238577

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110117855.2A Active CN112946270B (zh) 2021-01-28 2021-01-28 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112946270B (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109439732B (zh) * 2018-12-25 2024-04-12 迈迪速能医学技术（天津）有限公司 一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨卓 ; 张玉娟 ; 陈倩 ; 付静轩 ; 崔巍 ; .循环肿瘤细胞检测及其特性.2013,4(2),全文. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112946270A (zh) 2021-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zigeuner et al. Isolation of circulating cancer cells from whole blood by immunomagnetic cell enrichment and unenriched immunocytochemistry in vitro
EP2807485B1 (en) Methods for detecting 5t4-positive circulating tumor cells and methods of diagnosis of 5t4-positive cancer in a mammalian subject
JP6485759B2 (ja) 末梢循環腫瘍細胞単位の悪性度の検出方法及びそのキット
Balic et al. Micrometastasis: detection methods and clinical importance
US20120309018A1 (en) Cancer detection markers
JP2014521958A (ja) 胸腔内液若しくは漿液と関連する腫瘍細胞の特徴づけによる癌の診断方法
US11701657B2 (en) Column-based device for retrieval of rare cells based on size, and uses thereof
Lei et al. Combined detection of aneuploid circulating tumor‐derived endothelial cells and circulating tumor cells may improve diagnosis of early stage non‐small‐cell lung cancer
CN109439732B (zh) 一种用于三维无创肿瘤早筛的试剂盒
WO2017126634A1 (ja) 希少細胞を用いて癌患者の予後を予測する方法
Weihrauch et al. Immunomagnetic enrichment and detection of isolated tumor cells in bone marrow of patients with epithelial malignancies
CN112946270B (zh) 用于诊断体内恶性实体肿瘤的方法和试剂盒
JP6936231B2 (ja) 転移性去勢抵抗性前立腺癌（ｍＣＲＰＣ）患者における治療選択のためのバイオマーカーとしてのアンドロゲン受容体バリアント７
JP4590109B2 (ja) 細胞の単一パラメータ及び複数パラメーター表現型解析のための生成物と方法
Lopez-Munoz et al. Markers of circulating breast cancer cells
Yokohama et al. TCL1A gene involvement in T-cell prolymphocytic leukemia in Japanese patients
CN112946271A (zh) 用于诊断受试者体内恶性异常增生的方法和试剂盒
Mayado et al. Detection of circulating tumor cells in blood of pancreatic ductal adenocarcinoma patients
Belov et al. Surface profiling of extracellular vesicles from plasma or ascites fluid using DotScan antibody microarrays
US8574922B2 (en) Targeted cell separation and enumeration device and the use thereof
Auwal et al. Clinical significance of genomic sequencing of circulating tumour cells (CTCs) in cancer
JP2020512813A (ja) がんのスクリーニング、診断、治療、及び再発における巨細胞の核酸の特徴付けの使用方法
Xie et al. Detection of circulating rare cells benefitted the diagnosis of malignant solitary pulmonary nodules
RU2815709C1 (ru) Способ детекции внеклеточной днк в цельной периферической крови с использованием проточной цитометрии
Jiang et al. Enrichment and detection of circulating tumor cells in peripheral blood

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant