JPH0763389B2 - 抗ヒト中皮細胞単クローン性抗体 - Google Patents
抗ヒト中皮細胞単クローン性抗体Info
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- JPH0763389B2 JPH0763389B2 JP61256142A JP25614286A JPH0763389B2 JP H0763389 B2 JPH0763389 B2 JP H0763389B2 JP 61256142 A JP61256142 A JP 61256142A JP 25614286 A JP25614286 A JP 25614286A JP H0763389 B2 JPH0763389 B2 JP H0763389B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2474/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by detection mode or means of detection
- G01N2474/20—Immunohistochemistry assay
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト中皮細胞に特異的に反応する単クローン
性抗体およびその製造に関するものであり、臨床診断
（肺癌の喀痰細胞診、胸水細胞診および各種腹部腫瘍の
腹水細胞診）に利用できる。
性抗体およびその製造に関するものであり、臨床診断
（肺癌の喀痰細胞診、胸水細胞診および各種腹部腫瘍の
腹水細胞診）に利用できる。
従来技術 肺癌では喀痰中や胸水中に、多くの腹部腫瘍で腹水中に
癌細胞が剥落してくることが知られている。従って喀痰
中や胸・腹水中の腫瘍細胞を見い出すことが、腫瘍の診
断上重要である。腫瘍細胞の検出判別は、通常病理の専
門医によって行われるが、喀痰，胸・腹水中には、多く
の種類の正常細胞が含まれており、特に中皮細胞やマク
ロファージは、腫瘍細胞との識別が難しいとされてい
る。
癌細胞が剥落してくることが知られている。従って喀痰
中や胸・腹水中の腫瘍細胞を見い出すことが、腫瘍の診
断上重要である。腫瘍細胞の検出判別は、通常病理の専
門医によって行われるが、喀痰，胸・腹水中には、多く
の種類の正常細胞が含まれており、特に中皮細胞やマク
ロファージは、腫瘍細胞との識別が難しいとされてい
る。
最近、ハイブリドーマ技術を用いて、多くの腫瘍細胞に
特異的な単クローン性抗体が作製され、細胞診への応用
も試みられている。しかし、それらの中には、マクロフ
ァージや中皮細胞とも反応するものもあり、また、ある
特定の腫瘍細胞とのみしか反応しないものも多いので単
クローン性抗体を用いても、腫瘍の細胞診は容易ではな
い。中でも、腫瘍細胞と中皮細胞の識別は、病理専門医
でも難しいと言われている。
特異的な単クローン性抗体が作製され、細胞診への応用
も試みられている。しかし、それらの中には、マクロフ
ァージや中皮細胞とも反応するものもあり、また、ある
特定の腫瘍細胞とのみしか反応しないものも多いので単
クローン性抗体を用いても、腫瘍の細胞診は容易ではな
い。中でも、腫瘍細胞と中皮細胞の識別は、病理専門医
でも難しいと言われている。
従って、腫瘍細胞とは反応せず、中皮細胞に特異的に反
応する抗体があれば、腫瘍の細胞診に有用である。現在
まで、中皮細胞特異的な抗血清さらには単クローン性抗
体については全く知られていない。
応する抗体があれば、腫瘍の細胞診に有用である。現在
まで、中皮細胞特異的な抗血清さらには単クローン性抗
体については全く知られていない。
本発明が解決すべき問題点 本発明者らは、ヒト中皮細胞で免疫したマウスの脾細胞
とマウス骨髄腫細胞株を融合させハイブリドーマを作製
し、中皮細胞と特異的に反応し、各種のヒト腫瘍細胞株
と反応しない単クローン性抗体を生産するハイブリドー
マを選択した。それらのハイブリドーマの生産する単ク
ローン性抗体を用い各種癌患者由来の喀痰、胸・腹水細
胞診を実施し、臨床病理上大きな意義があることを見い
出し本願発明を完成するに到った。
とマウス骨髄腫細胞株を融合させハイブリドーマを作製
し、中皮細胞と特異的に反応し、各種のヒト腫瘍細胞株
と反応しない単クローン性抗体を生産するハイブリドー
マを選択した。それらのハイブリドーマの生産する単ク
ローン性抗体を用い各種癌患者由来の喀痰、胸・腹水細
胞診を実施し、臨床病理上大きな意義があることを見い
出し本願発明を完成するに到った。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明はヒト中皮細胞と特異的に反応し、その他のヒト
正常細胞およびヒト腫瘍細胞と反応せず、IgGクラスに
属する単クローン性抗体を提供する。
正常細胞およびヒト腫瘍細胞と反応せず、IgGクラスに
属する単クローン性抗体を提供する。
本発明の単クローン性抗体は、ヒト中皮細胞で免疫した
マウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞株を融合させて、ハ
イブリドーマを作製し、ヒト中皮細胞と反応する単クロ
ーン性抗体を生産するハイブリドーマを選択し、該ハイ
ブリドーマを培地中に培養するかマウスに投与して腹水
化し、該培養物または腹水より採取することによってえ
られる。
マウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞株を融合させて、ハ
イブリドーマを作製し、ヒト中皮細胞と反応する単クロ
ーン性抗体を生産するハイブリドーマを選択し、該ハイ
ブリドーマを培地中に培養するかマウスに投与して腹水
化し、該培養物または腹水より採取することによってえ
られる。
本発明単クローン性抗体の具体例としては、ハイブリド
ーマ細胞株KM−277が生産するKM−277があげられる。
ーマ細胞株KM−277が生産するKM−277があげられる。
ハイブリドーマ細胞株KM−277は1986年10月23日付で英
国European Collection of Animal Cell CultureにECAC
C No.86102303として寄託してある。
国European Collection of Animal Cell CultureにECAC
C No.86102303として寄託してある。
以下に本発明単クローン性抗体の製造方を詳細に説明す
る。
る。
（１） 動物の免疫と抗体産生細胞の調製 ３〜10週令、望ましくは８週令のマウスにヒト中皮細胞
を免疫して、免疫マウスの脾、リンパ節、末梢血中の抗
体産生細胞を調製する。免疫の方法は、動物の皮下ある
いは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例
えば、フロイドの完全アジュバンド（Complete Freun
d′s Adjuvant）、または水酸化アルミニウムゲルと百
日咳菌ワクチンなど〕とともに、ヒト中皮細胞（５×10
5〜５×106cells/匹）を投与する。以後、１〜２週間お
きに、抗原を２〜５回投与する。各免疫後３〜７日目に
眼底静脈叢より採血し、その抗血清がヒト中皮細胞と反
応することを以下に示す酵素免疫細胞染色法により調べ
る。
を免疫して、免疫マウスの脾、リンパ節、末梢血中の抗
体産生細胞を調製する。免疫の方法は、動物の皮下ある
いは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例
えば、フロイドの完全アジュバンド（Complete Freun
d′s Adjuvant）、または水酸化アルミニウムゲルと百
日咳菌ワクチンなど〕とともに、ヒト中皮細胞（５×10
5〜５×106cells/匹）を投与する。以後、１〜２週間お
きに、抗原を２〜５回投与する。各免疫後３〜７日目に
眼底静脈叢より採血し、その抗血清がヒト中皮細胞と反
応することを以下に示す酵素免疫細胞染色法により調べ
る。
酵素免疫細胞染色法： 卵白アルブミンでコートした12穴マイクロタイタースラ
イドグラス（Flow Lab.CAT No.60−412−05）の各穴に
１×107細胞/ml−PBS（リン酸二ナトリウム1.83g,リン
酸一カリウム0.21g,食塩7.65g,蒸留水１,pH7.2）の中
皮細胞懸濁液を５μずつ落とし、冷風で５〜10分間乾
燥させる。次いで、−20〜−30℃の冷アセトンを加え10
分間固定した後、２〜３分乾燥させ、３％H2O2−メタノ
ール溶液に30分間浸し、内在性のペルオキシダーゼを失
活させる。次いでPBSでよく洗浄後、第１抗体（抗血清
や単クローン性抗体、１〜20μg/ml）を20μずつ各穴
にのせ、室温で30分〜２時間反応させ、PBSでよく洗浄
する。第２抗体として、ビチオン化ウサギ抗マウスイム
ノグロブリン（10μg/ml）を20μずつ各穴にのせ室温
で30分間放置後、PBSでよく洗浄し、アビジン−ビチオ
ン−ペルオキシダーゼコンプレックス（ABC試薬、ベク
ター社）を加え室温で30分間反応させ、再びPBSでよく
洗浄する。ペルオキシダーゼの基質液であるジマイノベ
ンジジン（diaminobenzidine）をのせて発色させた後、
検鏡する。尚、ABC試薬以下は、ベクター社の推薦する
方法による。中皮細胞の代りに、各種腫瘍細胞、正常細
胞を標的細胞とする場合も、最初にスライドグラスに固
定する細胞を変える他は、全く同様に行う。
イドグラス（Flow Lab.CAT No.60−412−05）の各穴に
１×107細胞/ml−PBS（リン酸二ナトリウム1.83g,リン
酸一カリウム0.21g,食塩7.65g,蒸留水１,pH7.2）の中
皮細胞懸濁液を５μずつ落とし、冷風で５〜10分間乾
燥させる。次いで、−20〜−30℃の冷アセトンを加え10
分間固定した後、２〜３分乾燥させ、３％H2O2−メタノ
ール溶液に30分間浸し、内在性のペルオキシダーゼを失
活させる。次いでPBSでよく洗浄後、第１抗体（抗血清
や単クローン性抗体、１〜20μg/ml）を20μずつ各穴
にのせ、室温で30分〜２時間反応させ、PBSでよく洗浄
する。第２抗体として、ビチオン化ウサギ抗マウスイム
ノグロブリン（10μg/ml）を20μずつ各穴にのせ室温
で30分間放置後、PBSでよく洗浄し、アビジン−ビチオ
ン−ペルオキシダーゼコンプレックス（ABC試薬、ベク
ター社）を加え室温で30分間反応させ、再びPBSでよく
洗浄する。ペルオキシダーゼの基質液であるジマイノベ
ンジジン（diaminobenzidine）をのせて発色させた後、
検鏡する。尚、ABC試薬以下は、ベクター社の推薦する
方法による。中皮細胞の代りに、各種腫瘍細胞、正常細
胞を標的細胞とする場合も、最初にスライドグラスに固
定する細胞を変える他は、全く同様に行う。
細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の３〜４日前に、ヒト中皮細胞を５×105〜５×106細胞
／匹腹腔内投与し、脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
の３〜４日前に、ヒト中皮細胞を５×105〜５×106細胞
／匹腹腔内投与し、脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。
すなわち、脾臓をMEM（日水製薬社製）中で細断し、ピ
ンセットでほぐし、1200rpm、５分間遠心分離にかけ、
上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.6
5）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、MEMで３回洗浄
して融合用脾細胞として提供する。
ンセットでほぐし、1200rpm、５分間遠心分離にかけ、
上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.6
5）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、MEMで３回洗浄
して融合用脾細胞として提供する。
（２） 骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。たとえば８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c
由来）骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1（P3−U1）〔カレン
ト・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アンド・
イムノロジイ−１（Current Topics in Microbiology a
nd Immunology−１）〕〔ヨーロピアン・ジャーナル・
オブ・イムノロジイ（European J.Immunology）６,511
−519（1976）、SP2/0−Ag14（SP−２）〔ネイチャー
（Nature）276,269−270（1979）〕、P3−X63−Ag8653
（653）〔ジャーナル・オブ・イムノロジイ（J.Immunol
ogy）123,1548−1550（1979）〕、P3−X63−Ag8（X63）
〔ネイチャー（Nature）256,495−497（1975）〕などが
用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地
〔PRMI−1640培地にグルタミン（1.5mM）,2−メルカプ
トエタノール（５×10-5M），ジェンタマイシン（10μg
/ml）および牛胎児血清（FCS）（CSL社製）（10％）を
加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（15μg/m
l）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日
前に正常培地に継代し、融合当日２×107以上の細胞数
を確保する。
用する。たとえば８−アザグアニン耐性マウス（BALB/c
由来）骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1（P3−U1）〔カレン
ト・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アンド・
イムノロジイ−１（Current Topics in Microbiology a
nd Immunology−１）〕〔ヨーロピアン・ジャーナル・
オブ・イムノロジイ（European J.Immunology）６,511
−519（1976）、SP2/0−Ag14（SP−２）〔ネイチャー
（Nature）276,269−270（1979）〕、P3−X63−Ag8653
（653）〔ジャーナル・オブ・イムノロジイ（J.Immunol
ogy）123,1548−1550（1979）〕、P3−X63−Ag8（X63）
〔ネイチャー（Nature）256,495−497（1975）〕などが
用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地
〔PRMI−1640培地にグルタミン（1.5mM）,2−メルカプ
トエタノール（５×10-5M），ジェンタマイシン（10μg
/ml）および牛胎児血清（FCS）（CSL社製）（10％）を
加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（15μg/m
l）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日
前に正常培地に継代し、融合当日２×107以上の細胞数
を確保する。
（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をMEM培地またはPBSでよく洗浄し、細胞数が、抗
体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜10:1になるよう混合し、
遠心分離（1,200rpm 5分）した後、上清を捨て、沈澱し
た細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら、37℃で、ポ
リエチレングライコール−1,000（PEG−1,000）2g,MEM2
mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1ml/10
3抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にMEM1〜2mlを数回
加えた後、MEMを加えた全量が50mlになるようにする。
遠心分離（900rpm5分）後、上清を捨て、ゆるやかに細
胞をほぐした後、正常培地（RPMI−1640,FCS10％）100m
lを加え、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるや
かに細胞を懸濁する。
腫細胞をMEM培地またはPBSでよく洗浄し、細胞数が、抗
体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜10:1になるよう混合し、
遠心分離（1,200rpm 5分）した後、上清を捨て、沈澱し
た細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら、37℃で、ポ
リエチレングライコール−1,000（PEG−1,000）2g,MEM2
mlおよびジメチルスルホキシド0.7mlの混液0.2〜1ml/10
3抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にMEM1〜2mlを数回
加えた後、MEMを加えた全量が50mlになるようにする。
遠心分離（900rpm5分）後、上清を捨て、ゆるやかに細
胞をほぐした後、正常培地（RPMI−1640,FCS10％）100m
lを加え、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるや
かに細胞を懸濁する。
この懸濁液を24穴培養用プレートに1ml/穴ずつ分注し、
５％CO2インキュベーター中、37℃で24時間培養する。
培養プレートに1ml/穴のHAT培地〔正常培地にヒポキサ
ンチン（10-4M），チミジン（1.5×10-5M）およびアミ
ノプテリン（４×10-7M）を加えた培地〕を加え、さら
に24時間培養する。以後２日間、24時間毎に、培養上清
1mlを捨て、新たに同量のHAT培地を加え、CO2インキュ
ベーター中、37℃で10〜14日間培養する。
５％CO2インキュベーター中、37℃で24時間培養する。
培養プレートに1ml/穴のHAT培地〔正常培地にヒポキサ
ンチン（10-4M），チミジン（1.5×10-5M）およびアミ
ノプテリン（４×10-7M）を加えた培地〕を加え、さら
に24時間培養する。以後２日間、24時間毎に、培養上清
1mlを捨て、新たに同量のHAT培地を加え、CO2インキュ
ベーター中、37℃で10〜14日間培養する。
コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、状清1mlを捨て、HT培地（HAT培地からアミノプテ
リンを除いた培地）を同量加え、以後２日間24時間毎に
HT培地への変換を行う。
いて、状清1mlを捨て、HT培地（HAT培地からアミノプテ
リンを除いた培地）を同量加え、以後２日間24時間毎に
HT培地への変換を行う。
HT培地で３〜４日間培養液後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫細胞染色法により、ヒト中皮細胞に対する
抗体価を測定する。このとき同様の方法で、ヒト正常細
胞、腫瘍細胞などとの反応製も測定し、ヒト中皮細胞に
特異的に反応するものを選択する。
記の酵素免疫細胞染色法により、ヒト中皮細胞に対する
抗体価を測定する。このとき同様の方法で、ヒト正常細
胞、腫瘍細胞などとの反応製も測定し、ヒト中皮細胞に
特異的に反応するものを選択する。
限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し、安定し
てヒト中皮細胞に強い抗体価の認められたものを抗ヒト
中皮細胞単クローン性抗体産生ハイブリドーマ株として
選択する。
てヒト中皮細胞に強い抗体価の認められたものを抗ヒト
中皮細胞単クローン性抗体産生ハイブリドーマ株として
選択する。
（４）単クローン性抗体の調製 プリスタン処理〔2,6,10,14−テトラメチルペンタデカ
ン（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、２週間飼育す
る〕した８〜10週令のBALB/c雌マウスに、（３）で得ら
れた抗ヒト中皮細胞単クローン性抗体産生ハイブリドー
マ細胞２〜４×106細胞／匹を腹腔内注射する。10〜21
日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹
水を採取し、遠心分離（3,000rpm5分）して固形分を除
去する。上澄液を50％硫酸アンモニウムにて塩析し、0.
04Mリン酸緩衝液（0.03M NaClを含む）で透析後、DE52
（Whatman社）のカラムに通塔し、IgG画分を集め、精製
単クローン性抗体とする。
ン（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、２週間飼育す
る〕した８〜10週令のBALB/c雌マウスに、（３）で得ら
れた抗ヒト中皮細胞単クローン性抗体産生ハイブリドー
マ細胞２〜４×106細胞／匹を腹腔内注射する。10〜21
日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹
水を採取し、遠心分離（3,000rpm5分）して固形分を除
去する。上澄液を50％硫酸アンモニウムにて塩析し、0.
04Mリン酸緩衝液（0.03M NaClを含む）で透析後、DE52
（Whatman社）のカラムに通塔し、IgG画分を集め、精製
単クローン性抗体とする。
抗体のイソタイプの決定は、オクタロニイ（Ouchterlon
y）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門、生物化学
実験法15、学会出版センター刊、p.74 1981年）によっ
て行う。
y）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門、生物化学
実験法15、学会出版センター刊、p.74 1981年）によっ
て行う。
蛋白量の定量は、フォーリン法および280nmでの吸光度
〔1.4（OD280）≒イムノグロブリン1mgl/ml〕より算出
する。
〔1.4（OD280）≒イムノグロブリン1mgl/ml〕より算出
する。
本発明の単クローン性抗体は、前記酵素免疫細胞染色法
などにより肺癌の喀痰細胞診、胸水細胞診、各種腹部腫
瘍の腹水細胞診などに利用することができる。
などにより肺癌の喀痰細胞診、胸水細胞診、各種腹部腫
瘍の腹水細胞診などに利用することができる。
以下本発明の実施例を示す。
実施例1. （１） 抗体産生細胞の調製 ８週令BALB/cマウスにヒト中皮細胞２×106/匹を水酸化
アルミニウムゲル2mg/匹，百日咳菌死菌ワクチン１×10
9/匹とともに腹腔内投与した。以後１〜２週おきに、ヒ
ト中皮細胞２×106/匹で３〜５回免疫した。これら免疫
処理したマウスのうち、その抗血清が、ヒト中皮細胞と
強く反応したマウスを免疫マウスとして、そのマウスよ
り、脾細胞を調製して、細胞融合に供した。
アルミニウムゲル2mg/匹，百日咳菌死菌ワクチン１×10
9/匹とともに腹腔内投与した。以後１〜２週おきに、ヒ
ト中皮細胞２×106/匹で３〜５回免疫した。これら免疫
処理したマウスのうち、その抗血清が、ヒト中皮細胞と
強く反応したマウスを免疫マウスとして、そのマウスよ
り、脾細胞を調製して、細胞融合に供した。
（２） マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3−U1を正常
培地で培養し、細胞融合時に２×107以上の細胞を絵、
細胞融合に親株として供した。
培地で培養し、細胞融合時に２×107以上の細胞を絵、
細胞融合に親株として供した。
（３） ハイブリドーマの作製 （１）と（２）で得られた脾細胞と骨髄腫細胞とを5:1
の割合で用い、前述した方式で融合させ、HAT培地で37
℃、14日間CO25％下で培養して、融合細胞を選択し、HT
培地に変えてさらに培養し、抗中皮細胞に対する抗体価
の測定をして、活性な穴を選び、さらに正常培地に変
え、２回クローニングを繰り返して、種々の測定法によ
り、ヒト正常細胞や腫瘍細胞あるいは他の癌に全く反応
せず、中皮細胞に反応する単クローン性抗体を生産する
ハイブリドーマ株KM−277を選択した。
の割合で用い、前述した方式で融合させ、HAT培地で37
℃、14日間CO25％下で培養して、融合細胞を選択し、HT
培地に変えてさらに培養し、抗中皮細胞に対する抗体価
の測定をして、活性な穴を選び、さらに正常培地に変
え、２回クローニングを繰り返して、種々の測定法によ
り、ヒト正常細胞や腫瘍細胞あるいは他の癌に全く反応
せず、中皮細胞に反応する単クローン性抗体を生産する
ハイブリドーマ株KM−277を選択した。
（４） 単クローン性抗体の調製 プリスタン処理した８週令 BALB/c雌マウスに（３）で
得られたハイブリドーマ株KM−277を４×106細胞／匹腹
腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌
化する。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜
10ml/匹）し、遠心分離（3,00rpm,5分）して固形分を除
去した。40％硫酸アンモニウムにて塩析し、0.04Mリン
酸緩衝液（0.03M NaClを含む）で透析後、DE52（Whatm
an社製）（ベットボリュウム50ml）のカラムに流速20
〜、0ml/hrで通塔し、IgG画分を集め、精製単クローン
性抗体とした。
得られたハイブリドーマ株KM−277を４×106細胞／匹腹
腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌
化する。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（５〜
10ml/匹）し、遠心分離（3,00rpm,5分）して固形分を除
去した。40％硫酸アンモニウムにて塩析し、0.04Mリン
酸緩衝液（0.03M NaClを含む）で透析後、DE52（Whatm
an社製）（ベットボリュウム50ml）のカラムに流速20
〜、0ml/hrで通塔し、IgG画分を集め、精製単クローン
性抗体とした。
（５） KM−277の特異性 このようにして得られたKM−277のヒト中皮細胞、ヒト
末梢リンパ球（PBL）、各種腫瘍細胞に対する反応性を
酵素免疫細胞染色法でしらべた。その結果を第１表に示
す。
末梢リンパ球（PBL）、各種腫瘍細胞に対する反応性を
酵素免疫細胞染色法でしらべた。その結果を第１表に示
す。
第１表より、明らかなように、KM−277は、ヒト中皮細
胞と極めて特異的に反応し、その他のヒト正常細胞や各
種ヒトの腫瘍細胞株とは全く反応しなかった。
胞と極めて特異的に反応し、その他のヒト正常細胞や各
種ヒトの腫瘍細胞株とは全く反応しなかった。
実施例2. 次に３例の肺癌患者喀痰および胸水、ならびに４例の胃
癌患者腹水中の細胞をKM−277を用いる酵素免疫細胞染
色法で染色したところ、塗布標本（スメア）中の中皮細
胞のみが染色され、癌細胞はいずれの検体においても全
く染色されず、スメア中の中皮細胞と癌細胞の識別が可
能であった。
癌患者腹水中の細胞をKM−277を用いる酵素免疫細胞染
色法で染色したところ、塗布標本（スメア）中の中皮細
胞のみが染色され、癌細胞はいずれの検体においても全
く染色されず、スメア中の中皮細胞と癌細胞の識別が可
能であった。
発明の効果 本発明によれば、肺癌の喀痰細胞診、胸水細胞診および
各種腹部腫瘍の腹水細胞診に応用可能な抗ヒト中皮細胞
単クローン性抗体が提供される。
各種腹部腫瘍の腹水細胞診に応用可能な抗ヒト中皮細胞
単クローン性抗体が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｃａｎｃｅｒ （Ｐｈｉｌａ），43 （６），2288−2296（1979) Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉ ｓ．，123（４ ｐａｒｔ２），61（1981) Ｌａｎｃｅｔ，２，512−515（Ｓｅｐｔ ｅｍｂｅｒ ４，1982) Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，38（３ ｐａｒｔ １），912（1979) Ｎａｔｕｒｅ，256，495−497（1975)
Claims (1)
- 【請求項１】ヒト中皮細胞で免疫したマウスの脾細胞と
マウス骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマ
細胞株KM−277（ECACC No.86102303）によって生産さ
れ、以下の性質を有する単クローン性抗体。 免疫グロブリンクラス:IgG 中皮細胞と反応する。 ヒト末梢リンパ球（PBL）、骨髄腫細胞、Ｔ細胞白血
病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、膵癌細胞、悪性黒色腫細
胞と反応しない。 胎児肺細胞、胎児皮膚細胞と反応しない。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61256142A JPH0763389B2 (ja) | 1986-10-28 | 1986-10-28 | 抗ヒト中皮細胞単クローン性抗体 |
| US07/112,149 US4894327A (en) | 1986-10-28 | 1987-10-26 | Anti-human mesothelial cell monoclonal antibody |
| CA000550380A CA1284625C (en) | 1986-10-28 | 1987-10-27 | Anti-human mesothelial cell monoclonal antibody |
| EP87309526A EP0266188B1 (en) | 1986-10-28 | 1987-10-28 | Anti-human mesothelial cell monoclonal antibody |
| DE8787309526T DE3785637T2 (de) | 1986-10-28 | 1987-10-28 | Monoklonale antikoerper gegen menschliche mesotheliale zellen. |
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|---|---|---|---|
| JP61256142A JPH0763389B2 (ja) | 1986-10-28 | 1986-10-28 | 抗ヒト中皮細胞単クローン性抗体 |
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|---|---|
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| JPH0763389B2 true JPH0763389B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=17288485
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61256142A Expired - Fee Related JPH0763389B2 (ja) | 1986-10-28 | 1986-10-28 | 抗ヒト中皮細胞単クローン性抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0266188B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0763389B2 (ja) |
| CA (1) | CA1284625C (ja) |
| DE (1) | DE3785637T2 (ja) |
Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
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| DE4114131C2 (de) * | 1991-04-30 | 1994-04-07 | Bernhard Dr Koch | Die Azur B - Eosin - APAAP Färbung, ein Verfahren zur simultanen hämatologischen und immunologischen Charakterisierung von Zellen |
| WO2013016600A2 (en) * | 2011-07-28 | 2013-01-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods and reagents for diagnosing conditions and characterization of tumor cells associated with serous fluids |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1986
- 1986-10-28 JP JP61256142A patent/JPH0763389B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-10-26 US US07/112,149 patent/US4894327A/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-27 CA CA000550380A patent/CA1284625C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-10-28 DE DE8787309526T patent/DE3785637T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-10-28 EP EP87309526A patent/EP0266188B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (5)
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|---|
| Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．，１２３（４ｐａｒｔ２），６１（１９８１） |
| Ｃａｎｃｅｒ（Ｐｈｉｌａ），４３（６），２２８８−２２９６（１９７９） |
| Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．，３８（３ｐａｒｔ１），９１２（１９７９） |
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| Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５） |
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| Publication number | Publication date |
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| EP0266188B1 (en) | 1993-04-28 |
| DE3785637T2 (de) | 1993-09-09 |
| JPS63109793A (ja) | 1988-05-14 |
| EP0266188A3 (en) | 1990-04-25 |
| US4894327A (en) | 1990-01-16 |
| EP0266188A2 (en) | 1988-05-04 |
| DE3785637D1 (de) | 1993-06-03 |
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|---|---|---|---|
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