DE4114131C2 - Die Azur B - Eosin - APAAP Färbung, ein Verfahren zur simultanen hämatologischen und immunologischen Charakterisierung von Zellen - Google Patents

Description

Bei der konventionellen hämatologischen Zytodiagnostik zählt die Romanowsky-Giemsa Färbung unter Verwendung der Substanzen Azur B und Eosin zu den häufig eingesetzten Färbemethoden, wobei die bei dem Färbeprozeß auftretenden Farbnuancen eine differenzierte Untergliederung der hämatologischen Zellen erlauben (Wittekind, Histochem J (1983) 15: 1029-1047). Eine weitere Möglichkeit zur Klassifizierung hämatologisch relevanter Zellen besteht in der Anwendung immunologischer Techniken. Hierbei werden als Detektionssysteme u. a. Enzyme wie zum Beispiel die Alkalische Phosphatase eingesetzt, wobei zur Verstärkung des Detektionssystems der Komplex Alkalische Phosphatase - Anti Alkalische Phosphatase (APAAP) verwandt wird (Erber et al., Lancet 1986 i: 761-765). Zur Visualisierung der Enzymaktivität werden unterschiedliche Substrate benutzt. Durch die im Rahmen des Färbeprozesses auftretenden artifiziellen Veränderungen können die Zellen dabei nicht immer sicher identifiziert werden.

Eine simultane Anwendung der gebräuchlichen Azur B - Eosin Standardfärbung mit einer immunzytologischen Methode ist daher erstrebenswert, um so die konventionelle hämatologische Klassifizierung um immunologische Markerprofile zu erweitern.

Probleme ergeben sich hierbei durch die Notwendigkeit ausreichender Farbunterschiede zwischen den Färbeergebnissen der Azur B - Eosin Färbung und dem Farbprodukt der Substrate für das eingesetzte Detektionsenzym. Bei der Azur B - Eosin - APAAP Methode werden die Substrate Naphthol-AS-GR-Phosphat und Variaminblausalz B benutzt, welche einen grünen Farbniederschlag ergeben (Frickhofen et al., J Clin Pathol (1985) 38: 671-676).

Die Vorteile der Azur B - Eosin - APAAP Methode liegen darin, daß eine simulierte Durchführung beider Zellcharakterisierungssysteme eine Zuordnung der schon seit Jahrzehnten definierten hämatologischen Merkmale zu den in neuerer Zeit festgestellten immunologischen Markerprofilen erlaubt. Durch diese Methode lassen sich konventionell hämatologisch definierte Zellen des peripheren Blutes und des Knochenmarkes immunologisch klassifizieren, auch wenn die zu untersuchende Zellpopulation nur zu einem geringen Prozentsatz in einem Zellausstrich vertreten ist. Weiterhin ergibt sich die Möglichkeit, Bindungsstudien monoklonaler Antikörper noch unbekannter Spezifität durchzuführen, wobei deren Bindungsmuster an Zellen des peripheren Blutes und des Knochenmarkes bestimmt werden kann.

Eine weitere Ausgestaltung der Methode ist dadurch gegeben, daß an Stelle eines unmarkierten Primär- oder Sekundärantikörpers auch biotinylierte Primär- oder Sekundärantikörper eingesetzt werden können, wobei sich in diesem Fall zusätzlich das Detektionssystem Avidin-Alkalische Phosphatase oder Streptavidin-Alkalische Phosphatase einsetzen läßt.

Die Methode wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels näher dargestellt, wobei die Anwendung der Azur B - Eosin - APAAP Methode zur Charakterisierung von Plasmazellen eines Patienten mit Plasmozytom unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers anti CD38 (Jackson et al., Clin Exp Immunol (1988) 72: 351-356) beschrieben wird.

Beispiel

Nach Lufttrocknung über 12 bis 24 Stunden werden Knochenmarkausstriche für 90 Sekunden in Methanol/Azeton (50 : 50) fixiert und anschließend mit Wasser gespült. Im ersten Schritt wird der monoklonale Antikörper anti CD 38 (Dianova, Hamburg), verdünnt mit H₂O (1 : 25) für 45 Min. aufgetragen. Nach Spülung in Wasser erfolgt im zweiten Schritt die 45minütige Inkubation mit dem Sekundärantikörper Kaninchen anti Maus Immunglobulin G (Dako, Hamburg) verdünnt 1 : 25 mit humanem Serum : H₂O (2 : 8). Nach ausgiebiger Waschung mit Wasser erfolgt drittens die Inkubation mit dem Detektionssystem Alkalische Phosphatase- anti Alkalische Phosphatase (APAAP) (Deko), verdünnt 1 : 50 (wie oben) für erneut 45 Minuten. Zur Verstärkung des Detektionssystems werden die Schritte 2 und 3 wiederholt. Nach gründlicher Spülung mit Wasser erfolgt die Romanowsky - Giemsa Färbung über 20 Minuten unter Verwendung der Substanzen Azur B - Eosin (Azur B - Eosin Stammlösung in 0,03 M Hepes Puffer pH 6,5, 4 : 100, Serva, Heidelberg). Anschließend erfolgt die Darstellung der Antikörperbindung über die Reaktion der Alkalischen Phosphatase unter Verwendung der Substrate Naphthol-AS-GR-Phosphat (Sigma, Deisenhofen) und Variaminblausalz B (Merck, Darmstadt) (jeweils 0,5 mg/ml gelöst in Hepes Puffer 0,03 M pH 8,5 unter Zusatz von 1 M Levamisole (Sigma)) über eine Zeitdauer von 20 Minuten. An den Stellen der Antikörperbindung ergibt die Enzymaktivität einen grünen Niederschlag. Nach Spülung in Wasser erfolgt erneut eine Färbung mit Azur B - Eosin über 10 bis 20 Minuten.

Die Auswertung erfolgt mikroskopisch. Plasmazellen weisen einen grünen Niederschlag an der Zelloberfläche auf. Der Zellkern der Plasmazellen zeigt eine rötlich-purpurne Farbe, das Zytoplasma erscheint bläulich tingiert.

Claims (4)

1. Verfahren zur simultanen konventionell hämatologisch und immunologischen Zellanalyse, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen des peripheren Blutes, des Knochenmarkes sowie aus Punktionsmaterial simultan unter Verwendung der Farbstoffe Azur B und Eosin sowie unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität gegen Zellantigene charakterisiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Primärantikörper mit Hilfe von Sekundärantikörpern unter Verwendung des Detektionssystems Alkalische Phosphatase erfaßt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten Primärantikörper alternativ über das System Biotin und Avidin bzw. Streptavidin unter Verwendung des Detektionssystems Alkalische Phosphatase erfaßt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrate für die Alkalische Phosphatase die Substanzen Naphthol-AS-GR-Phosphat und Variaminblausalz B eingesetzt werden.