CN114480552A - 对神经细胞进行活细胞检验的方法以及药物筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对神经细胞进行活细胞检验的方法以及药物筛选方法。根据本申请的对神经细胞进行活细胞检验的方法包括：利用DPBS溶液，将神经细胞进行清洗；利用Hoechst，对神经细胞进行细胞核染色；利用DPBS溶液，对经过细胞核染色的神经细胞进行清洗；利用钙黄绿素，对神经细胞进行细胞质染色，以便得到核质着色的神经细胞；采用高内涵分析系统，对核质着色的神经细胞进行神经细胞分析，以便确定神经细胞的活细胞特征。根据本申请的实施例，能够极大的缩短染色的时间周期，能够更好地反映活细胞的实时状态，通过高内涵分析平台，也能够更精确地识别细胞数量和形态。利用钙黄绿素，对神经细胞进行细胞质染色，以便得到核质着色的神经细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及对神经细胞进行活细胞检验的方法以及药物筛选方法。
背景技术
目前，并未有简便的手段能够实现，神经细胞的活细胞检验。传统的免疫荧光染色方法并不能精确地区分损伤神经细胞与正常细胞的某些活细胞特征，例如平均轴突长度、平均属兔长度和平均分支数等。
因此，目前对于神经细胞的活细胞检验方法仍有待改进。
发明内容
本申请是基于发明人对下列问题和事实的发现而提出的：
本申请的发明人在对神经损伤进行研究的过程中，意外发现，通过对神经细胞的染色方法和高内涵分析的参数进行优化，能够有效地对神经细胞进行活细胞检验，并且能够有效地获得相关神经细胞的某些活细胞特征的细微变化，例如平均轴突长度、平均属兔长度和平均分支数等。
由此，本申请提出了一种能够有效地对神经细胞进行活细胞检验的方法及其应用。
在本申请的第一方面，本申请提出了一种对神经细胞进行活细胞检验的方法，根据本申请的实施例，该方法包括：(1)利用DPBS溶液，将神经细胞进行清洗，以便去除死细胞；(2)利用Hoechst，对所述神经细胞进行细胞核染色；(3)利用DPBS溶液，对经过细胞核染色的所述神经细胞进行清洗；(4)利用钙黄绿素，对所述神经细胞进行细胞质染色，以便得到核质着色的神经细胞；(5)采用高内涵分析系统，对所述核质着色的神经细胞进行神经细胞分析，以便确定所述神经细胞的活细胞特征。
根据本申请的实施例，通过采用上述方法，与传统的免疫荧光染色相比，能够极大的缩短染色的时间周期，并且能够更好地反映活细胞的实时状态，通过高内涵分析平台，也能够更精确地识别细胞数量和形态。利用钙黄绿素，对所述神经细胞进行细胞质染色，以便得到核质着色的神经细胞
根据本申请的实施例，在染色过程中，利用Hoechst，对所述神经细胞进行细胞核染色大约孵育5～15分钟，例如大约10分钟。利用钙黄绿素，对所述神经细胞进行细胞质染色，以便得到核质着色的神经细胞大约孵育5～15分钟，例如大约10分钟。另外，在染色过程中，草根
根据本申请的实施例，所述活细胞特征包括选自平均轴突长度、平均分支数、平均树突长度的至少之一。
根据本申请的实施例，所述神经细胞设置在多孔板中，例如96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、4孔板等。由此，可以在相同条件下设置多个重复孔，减少一次试验导致的误差，提高试验的成功率。
根据本申请的实施例，所述高内涵分析系统，在所述多孔板的每个孔中拍摄至少40个视野，例如49个视野。
根据本申请的实施例，所述神经细胞为SH－SY5Y细胞。
根据本申请的实施例，所述神经细胞经过冈田酸处理。
在本申请的第二方面，本申请提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防神经损伤，根据本申请的实施例，所述方法包括：利用冈田酸处理SH－SY5Y细胞，得到神经细胞损伤模型；利用候选试剂对所述神经细胞损伤模型进行处理；并且在所述处理前后，分别通过前面所述的方法，确定所述神经细胞损伤模型的活细胞特征；根据所述处理前后，所述活细胞特征的差异，确定所述候选试剂是否可以用于治疗或者预防所述神经损伤。
如前所述，根据本申请第一方面的方法，能够有效地获取神经细胞的活细胞特征，由此通过这些活细胞特征的改善，可以有效地判断候选试剂能够用于修复损伤细胞。
本发明所使用的术语“治疗”或者任何疾病或病症，在其中一些实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一些实施方案中，“治疗”指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为患者所察觉的身体参数。在另一些实施方案中，“治疗”指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数)或上述两方面调节疾病或病症。在另一些实施方案中，“治疗”指预防或延迟疾病或病症的发作、发生或恶化。
根据本申请的实施例，所述候选试剂为间充质干细胞亚群。本领域技术人员可以通过采用至少一个表面分子对间充质干细胞进行分群，并分别检验各类亚群是否能够有效地获得治疗或者修复效果。
根据本申请的实施例，所述神经细胞损伤包括树突轴突缩短、胞体肿胀和细胞分支数减少的至少之一。
根据本申请的实施例，所述神经损伤与tau蛋白过度磷酸化有关。
根据本申请的实施例，相比于传统荧光拍摄，本申请的活细胞检验手段除了具备普通荧光显微镜和共聚焦显微镜都具有的荧光高倍数成像功能以外，还能够实现下列效果的至少之一：
避免人工拍摄导致的系统误差，保证数据科学可靠性；
通过接种孔板增加重复孔，减少一次实验导致的误差，增加实验成功率；和
单次实验拍摄获得图像，后续还可以调出进行重新分析，弥补了活细胞染色需要尽快上机的实验需求。
附图说明
图1和图2显示了采用传统免疫荧光标记方法，观察OA损伤处理前后的SH－SY5Y细胞的形态学变化和特征统计结果。
图3和图4显示了采用本发明改良后的方法，观察OA损伤处理前后的SH－SY5Y细胞的形态学变化和特征统计结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1构建神经损伤模型
在该实施例中，发明人采用冈田酸对人神经母细胞瘤细胞系SH－SY5Y进行处理，得到了模拟神经元损伤的体外模型。
具体的，对人神经母细胞瘤细胞系SH－SY5Y进行处理的过程包括：
1、细胞培养：利用多孔板，将SH－SY5Y细胞用含10％胎牛血清蛋白(Gibco，10099141，USA)的高糖培养基(Gibco，D6429，USA)培养于37℃，5％CO2培养箱中；
2、诱导：镜下观察细胞状态良好，采用DPBS缓冲液清洗两遍后，每孔20nM加入冈田酸(Sigma，O8010，USA)，37℃损伤24h。
采用传统免疫荧光拍摄方法，对实施例1中构建的神经损伤模型进行检验，结果如图1所示，经过OA损伤神经细胞后，细胞tau蛋白过度磷酸化，骨架蛋白稳定性降低，神经细胞树突轴突缩短，胞体肿胀，细胞分支数减少，说明模型建立成功。
检验对照例
在本实施例中，采用传统免疫荧光拍摄方法，对神经损伤细胞模型进行检验。
在本实施例中，采用传统免疫荧光拍摄方法，对实施例1中构建的神经损伤模型进行检验，结果如图1所示，统计结果如图2所示，可以看出，如图1所示，可见胞体塌陷、部分细胞彻底崩解凋亡，树突缩短、断裂用Tubulin(FITC)和鬼笔环肽分别标记细胞微管微丝，发现损伤后的细胞内骨架排列紊乱，有神经纤维灯丝样缠结，这与神经元损伤的病理改变类似。然而，采用传统免疫荧光拍摄方法，发现正如图2所示的，SH－SY5Y和冈田酸OA组之间虽然有趋势，但是在平均轴突长度，平均分支数，平均树突长度上并无统计学意义。
具体的，传统免疫荧光拍摄方法包括下列步骤(以24孔板为例)：
固定破膜：细胞清洗3次，去除死细胞及杂质。每孔加入500ul的4％多聚甲醛4℃放置20分钟。每孔500ul0.1％Triton，室温孵育20min清洗2次。
封闭：10％驴血清每孔300ul，室温孵育30分钟，弃去封闭液。
一抗：每孔加入200ul(1：1000)10％驴血清稀释的α－Tubulin(CST，3873S，USA)，至4℃过夜后清洗3次。
二抗：10％驴血清稀释1：400的驴抗鼠488二抗(Invitrogen，USA)与1：400的鬼笔环肽抗体(Invitrogen，R415，USA)，每孔共200ul，室温避光孵育1小时后，清洗3次。
标核：1：500的DAPI每孔加入300ul，室温孵育20分钟，清洗3次。
检验例改良的活细胞染色高内涵分析方法
在该检验例中，采用本发明的细胞检验方法，对神经细胞进行活细胞检验，部分结果展示在图3和4中。可以看出，在活细胞状态下对神经细胞直接进行染色，极大地缩短的染色时间并且可以更精准的识别神经纤维，并且经过HCA分析后发现每组之间在平均轴突长度，平均分支数，平均树突长度上均具有统计学意义。以上实验结果均说明，经过优化后的模型分析方法可实现对体外损伤模型的更精准定量。
具体的，染色和检验方法包括以下步骤：
3－1：活细胞染色
取实施例1中所得到的神经细胞损伤模型，使用DPBS清洗2次去除死细胞，每孔500ul－1ml加入Hoechst 33342染料(Solarbio，C0030，China)室温避光孵育10分钟，后使用DPBS轻柔清洗两遍，加入1：1000稀释的钙黄绿素(Sigma，17783，USA)以着色胞质，室温避光孵育30分钟(此步骤为了避免Hoechst表达过强因此先染胞核后染胞质)。相比于传统免疫荧光染色，不仅极大缩短了染色周期，并且因其为活细胞染色能更好的反应细胞实时状态，并且能被高内涵更精准的识别细胞数量及形态。
3－2：高内涵具体参数优化：
采用PE公司的高内涵分析系统中的神经分析版块，并对平台的相关参数进行优化：
Input Image：选择高内涵仪器拍摄的图像
Find Nuclei：通道选择“DAPI”→识别方法选择“A”→最终被识别区域命名为“Nuclei”；
Select Cell Region：选择细胞区域为“Nuclei”→识别方法选择“Resize Region[％]”并将区域类型设置为“Nucleus Region”调整外边界为“－20％”，内边界为“100％”→最终被识别区域命名为“Nucleus Region”；
Find Cytoplasm：通道选择“DAPI”→识别核选项选择“Nuclei”→识别方法选择“F”→最终被识别区域命名为“Nucle iSelected”；
Select population：设置细胞区域为“Nuclei”→识别方法为“Common Filters”，并且勾选清楚边界物体选项已排除无关干扰→最终被识别区域命名为“NucleiSelected”；
Find Neurites：通道选择“DAPI”→设置细胞区域为“NucleiSelected”→区域选择“Nucleus”→识别方法选择“CSIRO Neurite Analyse 2”→最终被识别区域命名为“Nucle iSegments”；
Define Results：方法选择“List of Outputs”，其中细胞区域“Nuclei”需要应用于“Individua lSelected Planes”，并点击“Nucle iSelected”勾选“Number of Objects”并且应用于“Individua lSelected Nuclei”，下一步根据实验目的勾选需要导出的数据，根据SH－SY5Y模型的特征和以及实验目的，发明人选择参数为：“Maximum NeuriteLength－Sum per Well”；“Number of Extremities－Sum per Well”；“Number ofSegments－Sumper Well”；“Tota lNeurite Length－Sumper Well”；选择每孔拍摄49个视野。
Output：导出TEXT格式文本，获得参数需要除“Number of Objects”，随后用GraphPad进行统计分析。
药物筛选实施例
在本实施例，采用候选制剂分别对实施例1中构建的神经损伤模型进行修复处理，并基于检验实施例中构建的能够有效地对神经损伤细胞模型进行特征表征的手段，对修复处理的结果进行量化处理，以便选择能够治疗神经损伤的药物。
准备候选制剂：在本实施例中，通过采用流式细胞仪，对人脐带间充质干细胞进行分选，得到CD140a(+)间充质干细胞和CD140a(－)间充质干细胞。
分别采用CD140a(+)间充质干细胞和CD140a(－)间充质干细胞对实施例1中得到的神经元损伤体外模型进行处理，并按照检验例的方法，观察添加CD140a(+)间充质干细胞的修复效果。结果显示，CD140a(+)间充质干细胞能够促进细胞树突增长，恢复了神经细胞长梭形的特征，而CD140a(－)间充质干细胞对损伤的神经细胞的修复效果并不明显。发明人还对每个细胞的平均树突长度、平均轴突长度和平均分支数进行统计分析，CD140a(+)与OA损伤组相比均具有统计学意义(＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001)。因此该实验结果表明了CD140a(+)间充质干细胞有修复神经损伤的功能。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种对神经细胞进行活细胞检验的方法，其特征在于，包括：
(1)利用DPBS溶液，将神经细胞进行清洗，以便去除死细胞；
(2)利用Hoechst，对所述神经细胞进行细胞核染色；
(3)利用DPBS溶液，对经过细胞核染色的所述神经细胞进行清洗；
(4)利用钙黄绿素，对所述神经细胞进行细胞质染色，以便得到核质着色的神经细胞；
(5)采用高内涵分析系统，对所述核质着色的神经细胞进行神经细胞分析，以便确定所述神经细胞的活细胞特征。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活细胞特征包括选自平均轴突长度、平均分支数、平均树突长度的至少之一。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经细胞设置在多孔板中。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高内涵分析系统，在所述多孔板的每个孔中拍摄至少40个视野，例如49个视野。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经细胞为SH－SY5Y细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述神经细胞经过冈田酸处理。
7.一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗或者预防神经损伤，其特征在于，所述方法包括：
利用冈田酸处理SH－SY5Y细胞，得到神经细胞损伤模型；
利用候选试剂对所述神经细胞损伤模型进行处理；
并且在所述处理前后，分别通过权利要求1～6任一项所述的方法，确定所述神经细胞损伤模型的活细胞特征；
根据所述处理前后，所述活细胞特征的差异，确定所述候选试剂是否可以用于治疗或者预防所述神经损伤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述候选试剂为间充质干细胞亚群。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述神经细胞损伤包括树突轴突缩短、胞体肿胀和细胞分支数减少的至少之一。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述神经损伤与tau蛋白过度磷酸化有关。
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