CN113447334A - 一种循环神经细胞的检测方法、试剂盒和应用 - Google Patents
一种循环神经细胞的检测方法、试剂盒和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种循环神经细胞的检测方法、试剂盒和应用，涉及生物细胞鉴定技术领域，基于葡萄糖代谢性标志物2‑NBDG、白细胞经典标志物CD45对微孔阵列芯片上的细胞进行染色，借助显微成像系统，实现循环神经细胞的快速识别，其中2‑NBDG+/CD45‑的神经细胞被认为是具有活性的循环神经细胞。进行循环神经细胞检测的试剂盒包括荧光标记的葡萄糖代谢性标志物2‑NBDG。该方法应用于人外周血中循环神经细胞的检测和实时监测。本发明在不依赖于神经元细胞胞内经典抗原表达的情况下，实现循环神经细胞的快速识别，而且不破坏循环神经细胞的活性，可进行后续的单细胞基因组测序及体外培养等用途，以获得全面的生物信息。
Description
技术领域
本发明涉及生物细胞鉴定技术领域，尤其涉及一种循环神经细胞的检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)是一个可以调节循环系统与脑实质之间的物质交换的动态网络，同时还能维持中枢神经系统(Central Neural System，CNS)的体内平衡。中枢神经系统疾病主要包括脑卒中(Stroke)、神经退行性疾病(Neurodegenerativediseases)、脑肿瘤(Brain tumor)、脑损伤(Brain injury)及年龄相关的认知功能障碍(Cognitive dysfunction)等均存在血脑屏障功能障碍。中枢神经系统疾病(Centralnervous system diseases)被越来越多地认为是全世界死亡和残疾的主要原因。《2016年全球疾病、伤害和危险因素负担》研究表明，神经系统疾病负担最重，而且这种负担正在增加。中国是世界上人口最多的国家，也是世界上老年人口最庞大的国家，据不完全统计目前中国65岁以上的老年人口已超过1.77亿，同时也是神经系统疾病患者最多的国家，中枢神经系统疾病是一个日益严重的全球性健康问题，严重威胁着人类健康和生活质量，并给家庭和社会带来巨大负担(11)。目前，针对血脑屏障损伤相关中枢神经系统疾病的诊断方法主要依赖于临床检查和神经影像学的诊断，在很大程度上依赖于医疗体系。血脑屏障功能障碍相关中枢神经系统疾病作为全球发病率和死亡率的主要因素，目前仍缺乏有效量化检测其发生和发展的有效的细胞层面的生物标志物。
快速准确的诊断中枢神经系统疾病的亚型对于患者的正确治疗是非常重要的。目前针对于血脑屏障渗透性的诊断方法主要依赖于神经影像学的诊断和临床检查。其中神经影像学的诊断主要是基于计算机断层扫描技术(Computed Tomography,CT)、计算机体层摄影血管造影(Computed Tomography Angiography,CTA)、磁共振成像(Magnetic ResonanceImaging,MRI)、正电子发射断层扫描(Positron Emission Tomography,PET)等影像学方法，这些方法均需依赖于医疗体系才能进行相应的检测。在诊断过程中由于BBB通透性增加涉及造影剂的一些诊断方法，当造影剂从外围注射后可以进入脑实质，对大脑带来进一步的影响。
急性损伤(例如，头部外伤、脑卒中和癫痫持续状态)发生时，会引起血脑屏障通透性升高或功能障碍升高，更重要的是血脑屏障功能障碍会因为炎症等因素而存在于中枢神经系统疾病的整个进展过程中(例如，神经退行性疾病、癫痫发生和多发性硬化症等)。目前外周血代表了检测和定量脑源性蛋白质、核酸(循环游离DNA)和microRNA的合适基质。当血脑屏障出现功能障碍及发生脑损伤时，外周血中神经元特异性烯醇化酶(neuron-specificenolase,NSE)、泛素羧基末端水解酶同工酶L1(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolaseisoenzyme L1,UHCL-1)、神经微丝蛋白L(neurofilament protein-L,NFL)、Tau蛋白(microtubule-associated protein tau)、中枢神经特异性蛋白S100β、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、血小板衍生生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor beta,PDGFRβ)等蛋白浓度会出现不同程度的升高，这些蛋白质在外周血中的表达情况反映了血脑屏障通透性和神经胶质细胞及神经元细胞损伤情况。通常，外周生物标志物蛋白质或核酸存在于脑间质液中，或由神经血管细胞释放到间质或血管周间隙，通过渗漏的BBB或通过脑脊液(cerebrospinal fluid,CSF)-血液交换到达外周血。然而，外周血中生物标志物的半衰期可能会影响其在急性和长期环境下作为诊断标准的有效性。
循环细胞是指循环系统流经器官组织时，由器官或组织释放到循环系统中并随着循环系统在体液中进行循环的细胞，其可以充当分子生物标志物(例如蛋白质、microRNA、循环游离DNA)，提供有关健康和疾病的重要信息。循环细胞在健康人中会比较稀少或者不存在，但是在患者身体中相对而言数量比较多，在一定程度上这些循环细胞可以作为理想的生物标志物用于无创诊断、预后和治疗指导等。近年来，从患病组织和器官脱落进入到外周血中的非血细胞接二连三的被鉴定出来。一个突出的例子是从原发肿瘤部位脱落的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)，进入血管系统并在其他部位转移。CTC可以代表起源肿瘤的分子特征，CTC的检测与分析被认为是一种非侵入性的实时“液体活检”。除恶性细胞外，患有良性肿瘤或炎性疾病的患者还存在循环内皮细胞(circulatingepithelial cells，CEC)。由于急性心肌梗死(myocardial infarction，MI)引发的持续性内皮损伤，通常在血管内皮的内皮细胞会释放到血液中形成循环内皮细胞，CEC水平升高被认为是MI相关动脉斑块破裂的诊断指标。循环胎儿细胞(Circulating fetal cells，CFC)是另一种临床上重要的循环细胞类型，因为它们拥有整个胎儿基因组并为遗传疾病提供无创的产前检测。
在最近的一项研究中，在啮齿动物模型和缺血性脑卒中患者中均观察到选择性神经元丢失。神经元丢失这一现象同样也发生在神经退行性疾病中，包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化症和多发性硬化症。中枢神经系统疾病伴随着血脑屏障的破坏和神经元的丢失，这为我们前期研究发现提供了充分的证据。当发生脑部损伤(例如缺血性脑卒中)时，血脑屏障被破坏此时神经细胞会脱离大脑穿过BBB进入到外周血中，同时神经细胞逐渐失去其原始的神经样形态形成循环神经细胞(CirculatingNeural Cells，CNCs)。在脑卒中发生发展过程中循环神经细胞的数目在MCAO小鼠建模3d时释放达到最高值，之后释放的数目降低，这与MCAO建模后小鼠在2-3d时出现恶化一般在第3d时脑损伤达到最严重时期，之后转入康复期是一致的。同时我们也发现，MCAO小鼠建模同一时间点，脑损伤严重组CNC的释放数量明显高于轻微组并且有明显的统计学意义，由此我们推断NeuN+/CD45-/DAPI+表型的CNC可以作为预测血脑屏障损伤相关中枢神经系统疾病发生发展的细胞层面的生物学指标。
目前针对CNCs的检测分析，主要是基于免疫荧光染色来识别，NeuN是神经元细胞的经典生物标志物、CD45是白细胞的生物标志物、DAPI是细胞核的标志物，基于NeuN+/CD45-/DAPI+这一表型来识别CNCs。NeuN主要在神经元细胞的细胞核和细胞质中表达，进行免疫荧光染色时，需要经过固定、破膜打孔，这些实验操作对细胞活性带来严重影响，不利于CNCs分离鉴定后的体外培养及转录组的检测分析。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种临床取样简单、可以进行实时监测、特异性高的活性循环神经细胞的鉴定检测方法。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种临床取样简单、可以进行实时监测、特异性高的活性循环神经细胞的鉴定检测方法和试剂盒。提供一种快速、准确的检测伴随有血脑屏障损伤的中枢神经系统疾病患者血液或脑脊液样本中游离的稀有神经细胞的方法和装置。基于循环神经细胞的数目、分子特征可以更好的监测中枢神经系统疾病的发生、发展及预后分析，同时可以追溯循环神经细胞的组织来源，更好的判断中枢神经系统损伤的部位。
为实现上述目的，本发明提供了一种采用葡萄糖代谢性标志物及神经细胞经典标志物来识别鉴定循环神经细胞的方法和检测试剂盒，可以简单、快速有效地鉴定出有活性的循环神经细胞，实现大量细胞的快速检测，提升检测的准确性，同时采用神经元细胞特有的经典标志物NeuN与CD45、DAPI的免疫荧光染色联合检测，使得检测的特异性更高；另外对葡萄糖摄取与CD45的检测并不影响细胞活性，能够后续的单细胞基因组测序及体外培养等用途。细胞采用可寻址的方式排列能够方便的找到循环神经细胞。本发明基于神经细胞高葡萄糖摄取且细胞表面不表达白细胞共同抗原CD45这一普遍特征，在不依赖于神经元细胞胞内经典抗原表达的情况下，借助一种可寻址的微孔阵列芯片作为检测平台，外周血进行检测分析。
本发明基于神经细胞高葡萄糖摄取且细胞表面不表达白细胞共同抗原CD45这一普遍特征，在不依赖于神经元细胞胞内经典抗原表达的情况下，借助一种可寻址的微孔阵列芯片作为检测平台，对伴随有血脑屏障损伤的中枢神经系统损伤患者以脑卒中为例，对其外周血进行检测分析。基于葡萄糖代谢性标志物2-NBDG、白细胞经典标志物CD45对可寻址微孔阵列芯片上的细胞进行染色，借助高内涵显微镜或激光显微共聚焦等荧光成像系统，实现循环神经细胞的快速识别，其中2-NBDG+/CD45-的神经细胞被认为是具有活性的循环神经细胞。
一种循环神经细胞的检测方法，包括以下步骤：
步骤1、富集目标细胞：外周血进行细胞富集后，加入到可寻址微孔阵列芯片的微孔内，得到富集细胞；
步骤2、筛选细胞：在可寻址微孔阵列芯片上对步骤1得到的富集细胞进行荧光标记的第一抗体物质染色，第一抗体物质为白细胞共同抗原CD45和葡萄糖代谢性标志物2-NBDG，并进行第一次细胞清洗及成像，得到第一成像细胞；筛选出表达葡萄糖代谢性标志物2-NBDG而不表达白细胞共同抗原CD45的细胞，即2-NBDG+/CD45-的细胞，为具有活性的循环神经细胞。
进一步地，一种循环神经细胞的检测方法，还包括以下步骤以下步骤作为检测循环神经细胞的验证方法，筛选出表达循环神经细胞的检测抗体、不表达白细胞共同抗原CD45且呈细胞核染色阳性的细胞为循环神经细胞，用以验证上述步骤2获得的的循环神经细胞：
步骤3、在第一次细胞清洗及成像后的可寻址微孔阵列芯片上对第一成像细胞进行荧光标记的第二抗体物质染色，第二抗体物质为白细胞共同抗原CD45和循环神经细胞的检测抗体，第二次细胞清洗及成像，得到第二成像细胞；筛选出表达循环神经细胞的检测抗体且细胞表面不表达白细胞共同抗原CD45的第一细胞；
步骤4、排除非细胞杂质：在进行荧光标记的第二抗体物质染色中使用循环神经细胞的检测抗体染色的同时、之前或之后对第一成像细胞使用细胞核染料对第一次细胞清洗及成像后的可寻址微孔阵列芯片的微孔内的富集细胞进行染色细胞固定、破膜打孔和染色；得到含有循环神经细胞的可寻址微孔阵列芯片；
步骤5、显微成像分析；借助显微成像系统对步骤4得到的含有循环神经细胞的可寻址微孔阵列芯片进行扫描成像，其中呈细胞核染色阳性且属于第一细胞的可寻址微孔中的细胞为循环神经细胞，用来验证上述步骤2得到的具有活性的循环神经细胞。
进一步地，上述步骤1包括密度梯度离心法或免疫磁珠法，其中密度梯度离心法的步骤为：
步骤1.1、将外周血与循环肿瘤细胞(CTC)富集的抗体室温孵育20分钟，得到第一孵育液；CTC富集的抗体包含CD36抗体；
步骤1.2、将含有2％胎牛血清(FBS)的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)缓冲液加入到步骤1.1获得的第一孵育液中，充分混匀，得到混合液；
步骤1.3、将淋巴细胞分离液通过离心管中间的小孔加入到第一离心管的底部，第一离心管为密度梯度离心管；
步骤1.4、将步骤1.2获得的混合液沿着管壁转移到步骤1.3中的密度梯度离心管中；并在配平的前提下，1200g离心，得到第一离心液；
步骤1.5、将步骤1.4获得的第一离心液中的上层液体转移到第二离心管中，并在配平的前提下，600g离心，得到第二离心液；
步骤1.6、步骤1.5获得的第二离心液中，弃上清，并加入红细胞裂解液，室温孵育，并300g离心，得到第三离心液；
步骤1.7、步骤1.6获得的第三离心液中，弃上清，将下层液体重悬并转移到预先用3％BSA封闭的可寻址微孔阵列芯片中，下层液体含有细胞；
免疫磁珠法的步骤为：在外周血中加入10倍体积的红细胞裂解液，室温避光裂解后，300g离心5分钟；离心后弃上清，加入5毫升HBSS缓冲液重悬细胞后，300g离心5分钟；离心后弃上清，加入1毫升HBSS缓冲液重悬细胞后，取少量细胞悬液进行细胞计数；基于细胞计数按照相应比例加入CD45-APC抗体，充分混匀后，避光室温孵育1小时；进行连续两次重复离心和重悬处理，具体为：300g离心5分钟，弃上清，加入5毫升HBSS缓冲液重悬后，300g离心5分钟，再弃上清，加入5毫升HBSS缓冲液重悬；之后加入0.2毫升HBSS缓冲液重悬，得到细胞悬液；按照一定比例加入修饰有CD45抗体的免疫磁球入细胞悬液，并充分混匀，避光孵育15分钟；孵育结束后，加入0.8毫升HBSS缓冲液充分混匀后，放置在磁力架上静置10分钟，待所有结合有免疫磁球的细胞被吸附在磁力架一侧后，将含后候选细胞的细胞悬液吸取到一个新的离心管中；300g离心5分钟，吸弃900微升上清后，将剩余100微升含有细胞的液体重悬并转移到预先用3％BSA封闭的可寻址微孔阵列芯片中。
进一步地，步骤3中循环神经细胞的检测抗体包括神经元特异性核蛋白NeuN，葡萄糖代谢性标志物包括2-NBDG，步骤4中细胞核染料包括4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或者Hoechst系列染料。
进一步地，步骤2中荧光标记的第一抗体物质包括由荧光素或量子点直接标记的第一抗体物质，或者由非标记的一抗与荧光素或量子点标记的二抗形成的第一组合；步骤3中荧光标记的第二抗体物质包括由荧光素或量子点直接标记的第二抗体物质，或者由非标记的一抗与荧光素或量子点标记的二抗形成的第二组合。
进一步地，步骤2还包括：
步骤2.1、在可寻址微孔阵列芯片上对步骤1获得的细胞进行CD45-APC室温避光孵育1小时，并用磷酸盐缓冲液(PBS)充分清洗，得到孵育细胞；
步骤2.2、通过应用无葡萄糖DMEM，短暂剥夺可寻址微孔阵列芯片上的步骤2.1获得的孵育细胞10分钟的葡萄糖的摄取，得到无葡萄糖摄取细胞，然后在细胞培养箱中将无葡萄糖摄取细胞暴露于0.4mM 2-NBDG 15分钟，得到暴露细胞；将暴露细胞用冷PBS彻底洗涤后，得到第一洗涤细胞；显微成像系统扫描可寻址微孔阵列芯片，并用荧光色CY5和荧光色FITC对可寻址微孔中的所有第一洗涤细胞进行了成像；其中荧光色CY5对CD45染色，荧光色FITC对2-NBDG染色；
进一步地，步骤3还包括：
步骤3.1、在第一次细胞清洗及成像后的可寻址微孔阵列芯片上对第一成像细胞使用细胞固定试剂固定、细破膜和封闭，室温孵育；然后通过在4℃下与抗NeuN的一抗孵育过夜，之后在室温下与荧光色PE偶联的二抗和荧光色APC偶联的抗CD45孵育2h，得到第二孵育液；细胞破膜和封闭步骤为：使用细胞破膜破膜打孔获得通透性后，将由封闭试剂涂在可寻址微孔阵列芯片上封闭；抗NeuN的一抗为Abcam，荧光色PE偶联的二抗为Invitrogen，与荧光色APC偶联的抗CD45为BD；
步骤3.2、将步骤3.1获得的第二孵育液用PBS彻底洗涤后，得到第二洗涤细胞；显微成像系统扫描封闭后的可寻址微孔阵列芯片，并用荧光色CY5和荧光色PE对可寻址微孔中的所有第二洗涤细胞进行明场成像，得到第二成像细胞；其中荧光色CY5对CD45染色，荧光色PE对NeuN染色。
进一步地，步骤3.1还包括：细胞固定试剂为4％多聚甲醛(PFA)，反应时间为10分钟；细胞破膜试剂为0.5％Triton X-100，封闭试剂为5％羊血清(NGS)，细胞破膜和封闭步骤具体为：0.3％Triton-100、5％羊血清(NGS)、0.05％吐温20(Tween-20)的缓冲液对细胞固定后的孵育细胞室温孵育1小时；或者0.3％Triton-100对细胞固定后的孵育细胞室温孵育15分钟，130微升磷酸盐缓冲液冲洗3-5次后，5％羊血清(NGS)、0.05％吐温20(Tween-20)的缓冲液室温孵育1小时；Abcam抗体按1:1000稀释。
进一步地，可寻址微孔阵列芯片可以以微孔阵列芯片或玻璃片代替；可寻址微孔阵列芯片、微孔阵列芯片或玻璃片用于将含有目标细胞的细胞悬液以单细胞的形式铺展开；可寻址微孔阵列芯片包括多个可容纳细胞并可被寻址的微孔；显微成像系统包括高内涵显微镜或激光共聚焦显微镜；高内涵显微镜包括ImageXpress Micro XLS宽视野高内涵筛选系统(Molecular Devices)。
进一步地，步骤3还包括：在可寻址微孔阵列芯片上对步骤2得到的第一细胞进行固定、破膜打孔、封闭、4℃过夜孵育一抗(NeuN)和吸弃抗体，并用PBS充分清洗，加入二抗、CD45-APC、DAPI充分混匀后加在可寻址微孔阵列芯片上并避光孵育2小时，PBS充分清洗。
进一步地，步骤4中染色的步骤包括破膜打孔后的可寻址微孔阵列芯片上第二成像细胞加入抗NeuN一抗，4℃下孵育过夜，并用PBS充分清洗，然后加入与荧光色PE偶联的二抗(Invitrogen)和荧光色APC偶联的抗CD45和DAPI充分混匀后，加在可寻址微孔阵列芯片上并避光孵育2小时，PBS充分清洗。
本发明还提供一种采用葡萄糖代谢性标志物及神经细胞经典标志物来识别鉴定循环神经细胞的方法的检测试剂盒。试剂盒包括：CTC富集的CD36抗体，2％FBS的HBSS缓冲液，淋巴细胞分离液，红细胞裂解液，细胞破膜封闭液，荧光标记的葡萄糖代谢性标志物2-NBDG，荧光标记的神经元特异性抗体，荧光标记的白细胞经典标志物抗体，细胞核荧光染料，可寻址微孔阵列芯片，包含循环神经细胞标志物的标准品和包含阳性对照和阴性对照的质控品。
进一步地，该检测试剂盒从外周血样本中分离、鉴定循环神经细胞，包括NeuN荧光标记抗体物质、白细胞CD45荧光标记抗体物质、细胞核染色剂及可寻址微孔阵列芯片；荧光标记的NeuN抗体可以选择FITC标记的NeuN抗体，荧光标记的CD45抗体可以选择APC标记的CD45抗体，细胞核染色剂可以选择4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，但不限于此；可寻址微孔阵列芯片包括多个可容纳细胞并可被寻址的微孔，以精确地定位和获取目标细胞。
本发明还提供一种采用葡萄糖代谢性标志物及神经细胞经典标志物来识别鉴定循环神经细胞的方法应用，其应用于人外周血中循环神经细胞的检测和实时监测。
进一步地，本发明的检测方法可应用于检测的样品种类不限于脑卒中患者的外周血，亦可为所有中枢神经系统疾病的患者的外周血。
进一步地，本发明的检测方法应用于快速、准确的鉴定血液或其他体液如脑脊液样本中游离的稀有神经细胞，且该方法不影响后续对CNC的体外培养及测序分析。
在本发明的较佳实施方式中，详细说明采用本发明的检测方法的密度梯度离心法进行外周血中循环神经细胞的分离及鉴定；
在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明采用本发明的检测方法的免疫磁珠法进行外周血中循环神经细胞的分离及鉴定；
在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明采用本发明的检测方法的密度梯度离心法进行外周血中循环神经细胞的分离及鉴定；
在本发明的另一较佳实施方式中，详细说明采用本发明的检测方法进行外周血中循环神经细胞的分离及鉴定后，不影响细胞活性，进行后续的单细胞转录组实验。
本发明的检测方法和试剂盒是快速、准确的检测伴随有血脑屏障损伤的中枢神经系统疾病患者血液或脑脊液样本中游离的稀有神经细胞的方法和装置；基于循环神经细胞的数目、分子特征可以更好的监测中枢神经系统疾病的发生、发展及预后分析，同时可以追溯循环神经细胞的组织来源，更好的判断中枢神经系统损伤的部位。具有如下技术效果：
1.基于外周血中循环神经细胞的检测分析，可以在细胞层面上监测神经系统疾病的发生与发展及预后监测等，其精确度要高于脑部神经成像。
2.循环神经细胞的细胞数目在一定程度上可以揭示神经系统疾病损伤程度。
3.同时循环神经细胞也可以提供蛋白层面及核酸层面的分子信息，其所提供的生物学信息远远高于外周血中蛋白和核酸的检测。
4.本发明不破坏循环神经细胞的活性，所以可以继续培养并检测该循环神经细胞的蛋白或者核酸等其他生物信息；在一定程度上可以追溯到大脑损伤的部位，其精确度要远远高于脑部神经成像。
5.细胞层面的生物标志物，基于循环神经细胞的数目可以用于监测脑卒中及中枢神经系统疾病患者的预后。
6.临床取样简单。只需要采集患者的外周血便可以分离出循环神经细胞，并对循环神经细胞进行检测分析，基于所检测到的细胞数目便可用于临床预后的监测。
7.可以进行实时监测。在临床监测的不同时间点，可以随时采集患者的血样进行检测分析，实现实时监测的效果。
8.特异性高。基于神经细胞高葡萄糖摄取且细胞表面不表达白细胞共同抗原CD45这一普遍特征，在不依赖于神经元细胞胞内经典抗原表达的情况下，实现循环神经细胞的快速识别，其中2-NBDG+/CD45-的细胞被认为是具有活性的循环神经细胞；同时采用神经元细胞特有的标志物如NeuN、白细胞的标志物CD45及细胞核的标志物DAPI，所检测的细胞中CD45-/NeuN+/DAPI+的细胞认为是循环神经细胞，用以验证2-NBDG+/CD45-的细胞。因为神经元特有的经典的标志物，检测的特异性高。采用神经元细胞特有的经典标志物NeuN与CD45、DAPI的免疫荧光染色联合检测，使得检测的特异性更高。
9.本发明提供了一种采用葡萄糖代谢性标志物及神经细胞经典标志物来识别鉴定循环神经细胞的方法和检测试剂盒，对葡萄糖摄取与CD45的检测并不影响细胞活性，能够后续的单细胞基因组测序及体外培养等用途。细胞采用可寻址的方式排列能够方便的找到循环神经细胞。
10.价格更低廉。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例1中采用本发明的检测方法的密度梯度离心法进行中枢神经系统疾病外周血中循环神经细胞的分离及鉴定流程图；
图2是本发明的一个较佳实施例1中样本细胞悬液所加载的可寻址微孔阵列芯片的342号编号区域的2-NBDG-FITC/CD45-APC免疫荧光染色的图像；
图3本发明的一个较佳实施例的1中样本细胞悬液所加载的可寻址微孔阵列芯片的342号编号区域的免疫荧光成像的图像；
图4是本发明的一个较佳实施例3中本发明所采用可寻址微孔阵列芯片的检测平台的图像；
图5是本发明的一个较佳实施例3样本中CD45-/2-NBDG+/NeuN+的细胞、CD45-/2-NBDG-/NeuN+的细胞和CD45+/2-NBDG-/NeuN-的细胞图像；
图6是本发明的一个较佳实施例3样本中235编号区域内具有代表性的2-NBDG-FITC+/CD45-APC-的细胞的免疫荧光染色的图及其放大的图；
图7是本发明的一个较佳实施例3样本中部分目标细胞的细胞转录组数据分析的；
图8是本发明的一个较佳实施例4中采用本发明的检测方法进行外周血中循环神经细胞的分离及鉴定后，不影响细胞活性，进行后续的单细胞转录组实验流程图；
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1：采用密度梯度离心法对中枢神经系统疾病外周血进行循环神经细胞的分离及鉴定
如图1所示，对外周血中循环神经细胞的分离及鉴定方法主要包括以下具体步骤：
a)对外周血样本密度梯度离心：将患者外周血样本加入相应抗体孵育后进行密度梯度离心。
b)细胞富集后芯片上落孔：将密度梯度离心后的含有目的细胞的细胞悬液层加载到可寻址微孔阵列芯片上。
c)芯片上CD45/2-NBDG染色。如图2所示，实施例1中样本细胞悬液所加载的可寻址微孔阵列芯片的342号编号区域的明场下的图像，表示2-NBDG-FITC/CD45-APC染色后的图像。
d)芯片上细胞清洗及成像，确定2-NBDG阳性且CD45阴性的细胞为循环神经细胞。
e)细胞固定、破膜、染色：对芯片上的细胞进行固定、破膜后进行染色处理以鉴定循环神经细胞，其中染色剂一定浓度的荧光标记的神经元特异性抗体NeuN抗体物质或者NeuN的一抗和标记有荧光标记物的二抗及针对于白细胞的抗体CD45和细胞核的染料DAPI等。
f)显微成像分析：对染色后的细胞进行充分清洗后进行荧光分析，确定2-NBDG阳性、NeuN阳性、CD45阴性且DAPI阳性的细胞为循环神经细胞，用以验证步骤d)所确定的循环神经细胞。
在本实施例中，其中NeuN阳性的阈值为样本中所有或部分细胞NeuN信号值的平均值加上五倍的标准差。
如附图3所示实施例1样本细胞悬液所加载的可寻址微孔阵列芯片的342号编号区域的明场下的图像，其中最上面两排细胞NeuN-FITC阳性、CD45-APC阴性、DAPI阳性，是循环神经细胞。最下面一排细胞NeuN-FITC阴性、CD45-APC阳性、DAPI阳性，是外周血中的白细胞；其中，图2和图3是同一个样本中的342号编号区域，先进行2-NBDG-FITC/CD45-APC的免疫荧光染色，成像后再进行图5中的的工作NeuN-TRITC/DAPI/CD45-APC的免疫衣荧光染色，因为2-NBDG和NeuN呈现共染的现象，说明2-NBDG可以作为识别具有活性的循环神经细胞的生物标志物。
实施例2：采用免疫磁珠法对中枢神经系统疾病外周血进行循环神经细胞的分离及鉴定
由于外周血中血细胞含量较高，一般情况下需要裂红处理及对目的细胞进行富集后再进行检测，选择采用免疫磁珠法进行循环神经细胞的分离及鉴定，具体步骤如下：
1)裂解红细胞：用红血胞裂解液将患者外周血中的红细胞进行裂解。
2)负性筛选：裂红后的细胞悬液中加入修饰有CD45的免疫磁珠，充分孵育后借助磁力架进行筛选。
3)细胞悬液加到芯片上：负性筛选后，维持离心管在磁力架上的位置将离心管中的细胞悬液抽取后加载到可寻址微孔阵列芯片上。
4)芯片上细胞进行CD45/2-NBDG染色。
5)芯片上细胞清洗及成像，确定2-NBDG阳性且CD45阴性的细胞为循环神经细胞。
6)细胞固定、破膜、染色：对芯片上的细胞进行进行固定、破膜后进行染色处理以鉴定循环神经细胞，其中染色剂一定浓度的荧光标记的神经元特异性抗体NeuN抗体物质或者NeuN的一抗和标记有荧光标记物的二抗及针对于白细胞的抗体CD45和细胞核的染料DAPI等。
7)清洗、成像：对染色后的细胞进行充分清洗后进行荧光分析确定NeuN阳性、CD45阴性且DAPI阳性的细胞，判定为循环神经细胞用以验证步骤5)所确定的循环神经细胞。
实施例3：采用本发明的检测方法的密度梯度离心法进行外周血中循环神经细胞的分离及鉴定，鉴定分析脑卒中患者外周血中循环神经细胞用于监测脑卒中患者的临床预后。
本实施例采用一具体循环神经细胞的检测试剂盒和上述鉴定方法进行具体的循环神经细胞的全过程检测与分析结果，以说明本发明的有效性和优越性。包括以下具体步骤：
1.将5毫升人外周血与75微升CTC富集的抗体(其中包含CD36抗体)室温孵育20分钟。
2.将15毫升含有2％胎牛血清(FBS)的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)加入到1中的血液中充分混匀。
3.将15毫升淋巴细胞分离液通过离心管中间的小孔加入到离心管的底部。
4.2中充分混匀的患者血液沿着管壁转移到3中的密度梯度离心管中，最好不要扰动管底的淋巴细胞分离液。
5.在配平的前提下，1200g离心20分钟。
6.离心后，将上层液体转移到15毫升离心管中，在配平的前提下，600g离心8分钟。
7.离心后弃上请，加入0.5毫升红细胞裂解液，室温孵育5分钟。
8.300g离心5分钟，弃400微升上清后，将剩余100微升含有细胞的液体重悬并转移到预先用3％BSA封闭的可寻址微孔阵列芯片中，本实施例中可寻址微孔阵列芯片共包含400个编号区域，共包含约3万个可寻址的微孔用于容纳细胞并给细胞定位，其中每个微孔的直径为30微米，使细胞均匀分布于芯片并沉入芯片微孔中。如图4所示，本发明所采用可寻址微孔阵列芯片的检测平台，其中图中(A)部分为微孔阵列芯片的实物图，其中含有112,000个直径和高度分别为30微米和20微米的微孔；(B)部分为一台计算机高速荧光显微镜扫描的整个微孔芯片，其中包含400个区域；(C)部分为B中一个区域的放大图；比例尺＝30微米；(C)部分中可见样品呈单细胞分散状态。芯片上CD45/2-NBDG染色，芯片上细胞清洗及成像，筛选出明亮的细胞。
9.芯片上细胞进行CD45/2-NBDG染色。
10.芯片上细胞清洗及成像。
11.芯片上加入400微升的4％多聚甲醛(PFA)室温固定30分钟，400微升磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗芯片3-5次。
12.取400微升的含有0.3％Triton-100、5％羊血清(NGS)、0.05％吐温20(Tween-20)的缓冲液对PFA固定过的细胞进行破膜、封闭，室温下孵育1小时，400微升磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗芯片3-5次。
11.芯片上加入NeuN抗体的一抗，4度过夜孵育后，440微升磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗新品3-5次。
12.将400微升标记有荧光素FITC的二抗、CD45-APC、DAPI的溶液加入到芯片上，室温避光孵育2小时，400微升磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗芯片3-5次。
13.借助高内涵显微镜或激光共聚焦显微镜等显微成像系统对含有循环神经细胞的可寻址微孔阵列芯片进行扫描成像，其中2-NBDG+/NeuN+/CD45-/DAPI+的细胞被定义为循环神经细胞。
如图5所示，实施例3样本中CD45-/2-NBDG+/NeuN+的细胞、CD45-/2-NBDG-/NeuN+的细胞和CD45+/2-NBDG-/NeuN-的细胞图像，左图表示检测平台上白细胞共同抗原CD45和葡萄糖代谢性标志物2-NBDG，显微成像系统细胞成像结果，其中第一列的三个小单元图表示待检测的3个单细胞，第二列的三个小单元图表示其白细胞共同抗原CD45的成像结果，第三列的三个小单元图表示其葡萄糖代谢性标志物2-NBDG的成像结果；第一行第一列的细胞不表达白细胞共同抗原CD45，仅表达葡萄糖代谢性标志物2-NBDG，初步判断为循环神经细胞；左图检测平台上的细胞进行进行染色细胞固定、破膜打孔以及白细胞共同抗原CD45、循环神经细胞的检测抗体NeuN-PE和细胞核染料DAPI免疫染色，并显微成像系统细胞成像，得到右图，其中右图第一行三个小图单元，显示该细胞不表达白细胞共同抗原CD45，细胞核染料阳性，表达循环神经细胞的检测抗体NeuN，即CD45-/NeuN+/DAPI+，其中细胞核染料阳性，排除非细胞物质的可能，表达循环神经细胞的检测抗体NeuN，确认是细胞而且是神经细胞，再加上左图已经证明其表达葡萄糖代谢性标志物2-NBDG，而左图和右图都证实其不表达白细胞共同抗原CD45，则最终确认第一行第一列的细胞为具有活性的循环神经细胞，表示为CD45-/2-NBDG+/NeuN+；同理第一行第二列的细胞为CD45-/2-NBDG-/NeuN+，没有活性的循环神经细胞；第一行第三列的的细胞为CD45+/2-NBDG-/NeuN-，不是循环神经细胞。
图6展示了实施例3样本中235编号区域内的具有代表性的2-NBDG-FITC+/CD45-APC-的细胞，及细胞放大的图，此细胞不表达白细胞共同抗原，仅表达葡萄糖代谢性标志物2-NBDG，记作2-NBDG-FITC+/CD45-APC-，是具有活性的循环神经细胞。
如图7所示，给出了实施例3样本中所挑取的目的细胞的单细胞转录组检测分析的数据。
实施例4：采用本发明的检测方法进行外周血中循环神经细胞的分离及鉴定后，不影响细胞活性，进行后续的单细胞转录组实验。
如图8所示，对外周血样本细胞富集后芯片上落孔后，芯片上CD45/2-NBDG染色。
芯片上细胞清洗及成像，细胞采用可寻址的方式排列能够方便的找到循环神经细胞，即CD45-/2-NBDG+细胞，进行显微操作，挑取CD45-/2-NBDG+细胞进行转录组实验，进而获取其蛋白层面及核酸层面的分子信息，挖掘其带有的生物学信息。本实施例说明对葡萄糖摄取与CD45的检测并不影响细胞活性，能够后续的单细胞基因组测序及体外培养等用途。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种循环神经细胞的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、富集目标细胞：外周血进行细胞富集后，加入到可寻址微孔阵列芯片的微孔内，得到富集细胞；
步骤2、筛选细胞：在所述可寻址微孔阵列芯片上对步骤1得到的富集细胞进行荧光标记的第一抗体物质染色，所述第一抗体物质为白细胞共同抗原CD45和葡萄糖代谢性标志物2-NBDG，并进行第一次细胞清洗及成像，得到第一成像细胞；筛选出表达所述葡萄糖代谢性标志物2-NBDG而不表达所述白细胞共同抗原CD45的细胞，即2-NBDG+/CD45-的细胞，为具有活性的所述循环神经细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1包括密度梯度离心法或免疫磁珠法，其中所述密度梯度离心法的步骤为：
步骤1.1、将所述外周血与循环肿瘤细胞(CTC)富集的抗体室温孵育20分钟，得到第一孵育液；所述CTC富集的抗体包含CD36抗体；
步骤1.2、将含有2％胎牛血清(FBS)的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)缓冲液加入到步骤1.1获得的第一孵育液中，充分混匀，得到混合液；
步骤1.3、将淋巴细胞分离液通过第一离心管中间的小孔加入到所述第一离心管的底部，所述第一离心管为密度梯度离心管；
步骤1.4、将步骤1.2获得的混合液沿着管壁转移到步骤1.3中的所述密度梯度离心管中；并在配平的前提下，1200g离心，得到第一离心液；
步骤1.5、将步骤1.4获得的第一离心液中的上层液体转移到第二离心管中，并在配平的前提下，600g离心，得到第二离心液；
步骤1.6、步骤1.5获得的第二离心液中，弃上清，并加入红细胞裂解液，室温孵育，并300g离心，得到第三离心液；
步骤1.7、步骤1.6获得的第三离心液中，弃所述上清，将下层液体重悬并转移到预先用3％BSA封闭的所述可寻址微孔阵列芯片中，所述下层液体含有细胞；
所述免疫磁珠法的步骤为：在所述外周血中加入10倍体积的所述红细胞裂解液，室温避光裂解后，300g离心5分钟；离心后弃所述上清，加入5毫升所述HBSS缓冲液重悬细胞后，300g离心5分钟；离心后弃所述上清，加入1毫升所述HBSS缓冲液重悬细胞后，取少量细胞悬液进行细胞计数；基于所述细胞计数按照相应比例加入CD45-别藻蓝蛋白(Allophycocyanin,APC)抗体，充分混匀后，避光室温孵育1小时；进行连续两次重复离心和重悬处理，具体为：300g离心5分钟，弃上清，加入5毫升所述HBSS缓冲液重悬后，300g离心5分钟，再弃所述上清，加入5毫升所述HBSS缓冲液重悬；之后加入0.2毫升所述HBSS缓冲液重悬，得到细胞悬液；按照一定比例加入修饰有CD45抗体的免疫磁球入所述细胞悬液，并充分混匀，避光孵育15分钟；孵育结束后，加入0.8毫升所述HBSS缓冲液充分混匀后，放置在磁力架上静置10分钟，待所有结合有所述免疫磁球的细胞被吸附在所述磁力架一侧后，将含后候选细胞的所述细胞悬液吸取到一个新的离心管中；300g离心5分钟，吸弃900微升所述上清后，将剩余100微升含有细胞的液体重悬并转移到预先用3％所述BSA封闭的所述可寻址微孔阵列芯片中；
所述步骤2中所述荧光标记的第一抗体物质包括由荧光素或量子点直接标记的所述第一抗体物质，或者由非标记的一抗与所述荧光素或量子点标记的二抗形成的第一组合。
3.如权利要1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2还包括：
步骤2.1、在所述可寻址微孔阵列芯片上对所述步骤1获得的所述富集细胞进行所述CD45-APC室温避光孵育1小时，并用磷酸盐缓冲液(PBS)充分清洗，得到孵育细胞；
步骤2.2、通过应用无葡萄糖达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(dulbecco\'smodified eagle\'s medium，DMEM)，短暂剥夺所述可寻址微孔阵列芯片上的步骤2.1获得的孵育细胞10分钟的葡萄糖的摄取，得到无葡萄糖摄取细胞，然后在细胞培养箱中将所述无葡萄糖摄取细胞暴露于0.4mM所述2-NBDG 15分钟，得到暴露细胞；将所述暴露细胞用冷所述PBS彻底洗涤后，得到所述第一洗涤细胞；显微成像系统扫描所述可寻址微孔阵列芯片，并用荧光色CY5和荧光色FITC对所述可寻址微孔中的所有所述第一洗涤细胞进行了成像，得到所述第一成像细胞；其中所述荧光色CY5对所述CD45染色，所述荧光色FITC对所述2-NBDG染色。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤作为检测所述循环神经细胞的验证方法：
步骤3、在第一次细胞清洗及成像后的所述可寻址微孔阵列芯片上对所述第一成像细胞进行荧光标记的第二抗体物质染色，所述第二抗体物质为所述白细胞共同抗原CD45和所述循环神经细胞的检测抗体，第二次细胞清洗及成像，得到第二成像细胞；筛选出表达所述循环神经细胞的检测抗体且不表达所述白细胞共同抗原CD45的第一细胞；
步骤4、排除非细胞杂质：在进行所述荧光标记的第二抗体物质染色中使用所述循环神经细胞的检测抗体染色的同时、之前或之后使用细胞核染料对所述第一成像细胞进行染色细胞固定、破膜打孔和染色；得到含有所述循环神经细胞的所述可寻址微孔阵列芯片；
步骤5、显微成像分析；借助所述显微成像系统对步骤4得到的含有所述循环神经细胞的所述可寻址微孔阵列芯片进行扫描成像，其中呈细胞核染色阳性且属于所述第一细胞的所述可寻址微孔中的细胞为所述循环神经细胞，用来验证所述步骤2得到的所述具有活性的所述循环神经细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3中所述循环神经细胞的检测抗体包括神经元特异性核蛋白NeuN；所述荧光标记的第二抗体物质包括由所述荧光素或量子点直接标记的所述第二抗体物质，或者由所述非标记的一抗与所述荧光素或量子点标记的所述二抗形成的第二组合；所述步骤4中所述细胞核染料包括4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或者Hoechst系列染料。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤3还包括：；
步骤3.1、在所述第一次细胞清洗及成像后的所述可寻址微孔阵列芯片上对所述第一成像细胞使用细胞固定试剂固定、细破膜和封闭，室温孵育；然后通过在4℃下与抗NeuN的一抗孵育过夜，之后在室温下与荧光色PE偶联的二抗和荧光色APC偶联的抗所述CD45孵育2h，得到第二孵育液；所述细胞破膜和封闭步骤为：使用细胞破膜破膜打孔获得通透性后，将由封闭试剂涂在所述可寻址微孔阵列芯片上封闭；所述抗NeuN的一抗为Abcam，所述荧光色PE偶联的二抗为Invitrogen，所述与APC偶联的抗所述CD45为BD；
步骤3.2、将步骤3.1获得的第二孵育液用所述PBS彻底洗涤后，得到第二洗涤细胞；所述显微成像系统扫描封闭后的所述可寻址微孔阵列芯片，并用所述荧光色CY5和所述荧光色PE对所述可寻址微孔中的所有所述第二洗涤细胞进行荧光成像，得到所述第二成像细胞；其中所述荧光色CY5对所述CD45染色，所述荧光色PE对所述NeuN染色；
所述步骤4中所述染色的步骤包括破膜打孔后的所述可寻址微孔阵列芯片上所述第二成像细胞加入所述抗NeuN一抗，4℃下孵育过夜，并用所述PBS充分清洗，然后加入所述与所述荧光色PE偶联的二抗(Invitrogen)和所述APC偶联的抗所述CD45和所述DAPI充分混匀后，加在所述可寻址微孔阵列芯片上并避光孵育2小时，所述PBS充分清洗。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3.1还包括：所述细胞固定试剂为4％多聚甲醛(PFA)，反应时间为10分钟；所述细胞破膜试剂为0.5％Triton X-100，所述封闭试剂为5％羊血清(NGS)，所述细胞破膜和封闭步骤具体为：0.3％Triton-100、5％羊血清(NGS)、0.05％吐温20(Tween-20)的缓冲液对细胞固定后的所述孵育细胞室温孵育1小时；或者所述0.3％Triton-100对所述细胞固定后的所述孵育细胞室温孵育15分钟，130微升所述磷酸盐缓冲液冲洗3-5次后，所述5％羊血清(NGS)、所述0.05％吐温20(Tween-20)的缓冲液室温孵育1小时；所述AbcamAbcam抗体按1:1000稀释。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述可寻址微孔阵列芯片可以以微孔阵列芯片或玻璃片代替；所述可寻址微孔阵列芯片、所述微孔阵列芯片或所述玻璃片用于将含有目标细胞的细胞悬液以单细胞的形式铺展开；所述可寻址微孔阵列芯片包括多个可容纳细胞并可被寻址的所述微孔；所述显微成像系统包括高内涵显微镜或激光共聚焦显微镜；所述高内涵显微镜包括ImageXpress Micro XLS宽视野高内涵筛选系统(MolecularDevices)。
9.一种应用权利要求1-8任一项所述的方法进行循环神经细胞检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：CTC富集的CD36抗体，2％FBS的HBSS缓冲液，淋巴细胞分离液，红细胞裂解液，细胞破膜封闭液，荧光标记的葡萄糖代谢性标志物2-NBDG，荧光标记的神经元特异性抗体，荧光标记的白细胞经典标志物抗体，细胞核荧光染料，微孔阵列芯片，包含所述循环神经细胞标志物的标准品和包含阳性对照和阴性对照的质控品。
10.如权利要求1-8任一项所述的方法应用于人外周血中循环神经细胞的检测和实时监测。
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|---|---|---|---|---|
| CN114480552A (zh) * | 2021-12-17 | 2022-05-13 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 对神经细胞进行活细胞检验的方法以及药物筛选方法 |
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