CN105985999A - 建立用于评估神经功能的分析模块的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种建立用于评估神经功能的分析模块的方法,其步骤包括先利用一荧光显微影像系统撷取具有多个荧光标定的培养细胞以进行影像分析,其中培养细胞包含神经细胞及非神经细胞；依据细胞核的面积大小与荧光强弱,选取表现轴、树突荧光标定的神经细胞,排除非神经细胞,并计算神经细胞体的面积大小,及轴突、树突的长度与分支数目,以确认神经细胞的轴、树突生长情形；以及根据轴、树突荧光标定范围,计算神经细胞上突触(synaptic puncta)荧光标定的数目,以确认神经细胞生长情形,借以评估神经功能。本发明可进一步用作筛选药物的平台,以快速检测药物对神经细胞是否具有保护或毒杀作用。
Description
技术领域
本发明有关于一种建立用于评估神经功能的分析模块的方法,尤其指一套可快速且具代表性分析神经生长功能的方法,包括使用足以代表神经生长的重要标记,搭配最佳化的影像分析流程与程式指令；据此,本方法不仅可快速评估早期神经生长与神经网络形成的情形,也可作为筛选药物的平台,以快速检测药物对神经功能的影响。
背景技术
随着癌症治疗的进步,病患的存活率得以逐渐提升,由于病患的余命延长,使得化疗药物的副作用受到重视,尤其化疗药物副作用中,神经病变(neuropathy)对于生活品质影响最大。因此,在接受化疗药物之前,如何有效测试或筛选药物对遭受化疗的神经细胞是否具有毒杀性(neurotoxicity),已成为相关领域研发重点。
在检测药物是否具有细胞毒性的方法中,常会搭配使用高涵量分析(high-contentanalysis,HCA)以了解药物对于细胞型态的影响为何。高涵量分析技术已广泛地被使用于生技领域如癌症、免疫、心血管和神经研究,并且搭配高通量分析(High-throughputscreening)自动化取得多孔盘内细胞荧光影像和影像分析功能,使得实验得以大规模及快速的进行,并可提供多种定量信息。然,目前使用分子标记搭配高通量分析以检测神经功能的方法尚存在许多问题；举例而言,Huang Y等人揭示一种体外高涵量神经元筛选(high content neuron-based screening)以探讨神经细胞型态的计算架构,其采用神经元类型Ⅲβ-微管蛋白(TUJ1)为分子标记以研究神经元的机制(J Neurosci Methods.2010Jul 15；190(2):299-309)；Harrill JA等人揭示一种利用高涵量影像分析来检测化学物对于原代大鼠皮层神经细胞轴树突生长情形的影响,其利用微管蛋白(βIII tubulin)染色区域(全部)扣除微管相关蛋白2(MAP2)染色区域(树突)之后,剩下的区域代表轴突的方式,分析神经细胞的生长情形(Neurotoxicology.2013Jan；34:61-73)；Nieland TJ等人则利用MAP2、突触后密度蛋白95-突触蛋白1(Psd95-Syn1),以及突触后蛋白-突触蛋白1(Gphn-Syn1)鉴定神经突触生成情形(PLoS One.2014Mar 14；9(3):e91744)；上述的方法仅借由神经细胞轴树突生长(outgrowth)或突触生成(synaptogenesis)单一方式,无法全面地判定神经功能好坏；若同时观察神经细胞的轴、树突生长以及突触生成,则需使用多种分子标记,因此过程相当繁琐且耗时。
再者,使用何种神经细胞进行药物测试,也会影响分析程序及时间；例如使用商品化的神经细胞株虽然较好培养,但为了刺激神经细胞分化,必需额外添加药物刺激,因此可能影响待测药物的作用。反观初代培养细胞(Primary culture cells)可自然分化,故使用初代培养细胞可解决额外添加药物的问题,但相较于使用细胞株,初代细胞培养较不容易,且如何取得最佳的分化时间点以进行药物测试,仍须进一步探讨。
因此,若能筛选出几个具代表性的分子标记,并发展一套完整的功能评估系统,作为评估早期神经生长与神经网络形成的标的,在省时与完整评估之间取得良好平衡,将可快速、大量及准确地评估神经细胞存活状况及侦测神经功能的变化。
发明内容
目前,发明人即是鉴于现有评估神经功能变化的方法于实际实施使用时仍具有多处缺失,于是乃借由其丰富专业知识及多年的实务经验所辅佐,而加以改善,并据此研创出本发明。
本发明主要目的为提供一种建立用于评估神经功能的分析模块的方法,其指一套快速且具代表性分析神经生长功能的方法,包括使用足以代表神经生长的重要标记,搭配最佳化的影像分析流程与程式；据此,本方法也可进一步用作筛选药物的平台,以快速检测药物对神经细胞是否具有保护或毒杀作用。
为了达到上述实施目的,本发明一种建立用于评估神经功能的分析模块的方法,其包括步骤一:利用一荧光显微影像系统撷取一具有多个荧光标定(包含赫斯特(Hoechst)染剂以标记细胞核)的培养细胞以进行影像分析,其中培养细胞包含神经细胞；步骤二:依据细胞核的面积大小与荧光强弱,选取表现轴、树突荧光标定的神经细胞,排除非神经细胞,并计算神经细胞体的面积大小,及轴突、树突的长度与分支数目,以确认神经细胞的轴、树突生长情形,其中轴、树突荧光标定可选自微管相关蛋白2(MAP2)抗体或神经元类型Ⅲβ-微管蛋白(TUJ1),而突触荧光标定选自突触蛋白(Synaptophysin)抗体或突触后密度蛋白95(PSD95)；以及步骤三:根据步骤二的轴、树突荧光标定范围,计算神经细胞上突触(synaptic puncta)荧光标定的数目,以确认神经细胞生长情形,借以评估神经功能。
于本发明的一实施例中,培养细胞由下列步骤制得,步骤一:取一出生后0～1天的幼鼠大脑皮质组织,加入一第一培养基(可例如为不含血清的DMEM/F12培养基)打散大脑皮质组织,以形成一混合液；步骤二:过滤混合液,并以离心方式获得一细胞沉淀液；以及步骤三:将细胞沉淀液培养于一第二培养基内9～12天(最佳为10天),以制备出培养细胞；其中,第二培养基包含A培养基(A medium)、L-麸酰胺酸(L-glutamin)、添加剂(Supplement),以及青霉素-链霉素(Penicillin/Streptomycin)。
本发明提供一种建立用于评估神经功能的分析模块的方法,可进一步用作筛选药物的平台,以快速检测药物对神经细胞是否具有保护或毒杀作用；相较于目前以评估神经细胞存活状况为主的方法,更能确切侦测神经功能的变化；在省时、大量与完整评估之间取得良好平衡,故可应用于任何神经相关药物的高通量筛选与检测中,以快速及准确地评估药物对神经系统的作用。
附图说明
图1为本发明建立用于评估神经功能的分析模块的方法的步骤流程图；
图2为神经细胞示意图；
图3为不同培养天数的神经细胞代表图；
图4为不同培养天数对于神经细胞数量的影响；
图5为不同培养天数对于神经细胞生长情形的影响；
图6为不同培养天数对于突触数量的影响；
图7为不同化疗药物处理对于神经细胞数量的影响；
图8为不同化疗药物处理对于突触数量的影响；
图9为不同化疗药物处理对于轴树突长度的影响。
符号说明：
(S1)步骤一
(S2)步骤二
(S3)步骤三
具体实施方式
本发明的目的及其结构功能上的优点,将依据以下附图所示的结构,配合具体实施例予以说明,以使审查员能对本发明有更深入且具体的了解。
首先,请参阅图1,本发明一种建立用于评估神经功能的分析模块的方法,其包括下列步骤:
步骤一(S1):利用一荧光显微影像系统撷取一具有多个荧光标定(包含赫斯特(Hoechst)染剂以标记细胞核)的培养细胞以进行影像分析,其中培养细胞包含神经细胞；
步骤二(S2):依据细胞核的面积大小与荧光强弱,选取表现轴、树突荧光标定的神经细胞,排除非神经细胞,并计算神经细胞体的面积大小,及轴突、树突的长度与分支数目,以确认神经细胞的轴、树突生长情形,其中轴、树突荧光标定可选自微管相关蛋白2(MAP2)抗体或神经元类型Ⅲβ-微管蛋白(TUJ1),而突触荧光标定选自突触蛋白(Synaptophysin)抗体或突触后密度蛋白95(PSD95)；以及
步骤三(S3):根据步骤二的轴、树突荧光标定范围,计算神经细胞上突触(synapticpuncta)荧光标定的数目,以确认神经细胞生长情形,以评估神经功能。其中,神经细胞示意图如图2所示。
上述步骤一所述“培养细胞”可例如但不限定由下列步骤制得,步骤一:取一幼鼠(最佳为出生后0～1天的小鼠(mouse)或大鼠(rat))的大脑皮质组织,加入一第一培养基(可例如为不含血清的DMEM/F12培养基)打散大脑皮质组织,以形成一混合液；步骤二:过滤混合液,并以离心方式获得一细胞沉淀液；以及步骤三:将细胞沉淀液培养于一第二培养基(可例如包含A培养基(A medium)、L-麸酰胺酸(L-glutamin)、添加剂(Supplement),以及青霉素-链霉素(Penicillin/Streptomycin))内9～12天(最佳为10天),以制备出培养细胞。
此外,通过下述具体实施例,可进一步证明本发明可实际应用的范围,但不意欲以任何形式限制本发明的范围。
实施例一:初代培养细胞并进行免疫荧光染色
相较于传统细胞株诱发分化的方法,通过神经细胞初代培养的方法,更接近神经细胞的状态,能评估早期神经网络的形成,且实验结果不受分化药物影响,故本发明较佳使用初代培养细胞。
(1)初代培养细胞
采取出生后0～1天的小鼠(B6mice pup)大脑皮质区(cortex),去除脑膜后利用不含血清的DMEM/F12培养基将组织打散,补足不含血清的DMEM/F12的体积至5mL,加入0.5mL 1X胰蛋白酶(trypsin)混匀,37℃水浴5分钟,使用70μm过滤膜浸润1mL胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)将杂质进行过滤,离心3,000rpm 10分钟,去除上清液,将沉淀下来的细胞加入须要量的培养基(培养基配制:A medium 500mL,L-glutamin 100X 1.3mL,Supplement 50X 10mL/vial,Penicillin/Streptomycin100X 2.5mL),进行神经细胞培养。
(2)使用透明薄底微量多孔黑盘进行神经细胞培养,培养前盘中每孔先加入70μL的多聚离胺酸(poly-D-lysine或poly-L-lysine)进行涂布(coating)动作,再于每孔种2.8×104的细胞进行培养；体外培养7、10、14、21天后,以4％聚甲醛(polyformaldehyde)固定细胞10分钟,利用PBS冲洗5分钟2次；加入1M甘胺酸(glycine)作用10分钟,再利用PBS冲洗5分钟2次；加入0.05％Triton X-100作用20分钟,利用PBS冲洗5分钟2次。接者,利用4％牛血清蛋白(BSA)阻断(blocking)1小时之后,加入一级抗体:(1)微管相关蛋白2抗体(MAP2antibody；MyBioSource；MBS502140)及(2)突触蛋白抗体(Anti-Synaptophysin antibody；Abcam；ab32127)进行染色12～16小时；利用PBST冲洗10分钟2次,并加入带有荧光标定的二级抗体,分别为Alexa Fluor 488(JacksonImmunoResearch；703-546-155)与Alexa Fluor 647(molecular probes；A31573),以及加入赫斯特染剂(Hoechst 33258)作用1小时,利用PBST冲洗10分钟2次,最后加入PBS,并进行荧光影像撷取及分析。
实施例二:影像撷取及影像分析
使用荧光显微影像系统撷取影像并进行上述培养细胞的影像分析,使用荧光波长DAPI、FITC及Cy5共3种,拍照完自动存取影像以进行分析。
为了准确分析神经功能,使用MetaXpress 3.1软件(网址ftp://ftp.meta.moleculardevices.com/pub/uic/software/MX31R13/HelpDocs/MetaXpress/MetaXpress_3_1_Analysis_Guide.pdf),标题为“Image Acquisition and Analysis Software(Analysis Guide)”中找到,该文献在此全部以引用的方式并入本文中)设计一分析模块。根据下列最佳化的影像分析指标(a)～(c)组合共32个步骤,进行自动化分析。
(a)定义神经细胞
由于培养细胞中包含神经细胞与神经胶质细胞(glial cell),因此需先依据Hoechst染剂标示的细胞核面积大小与荧光强弱,搭配MAP2抗体以选取真正的神经细胞；可例如使用MetaXpress 3.1软件中内建的选项依下述的顺序进行设定16个步骤:
1:Configure Count Nuclei Data Log()
2:Configure Count Nuclei Summary Log()
3:Overwrite"Nuclear_All"＝Count Nuclei(Src＝"DAPI")
4:Threshold Image([3:Count Nuclei],1,65535,Inclusive)
5:Create Regions Around Objects([3:Count Nuclei])
6:Transfer Regions([3:Count Nuclei],"DAPI",ALLREGIONS and CLEARSOURCEand CLEARDEST)
7:Preferences()
8:Threshold Image["DAPI",1,65535,Inclusive]
9:Integrated Morphometry–Load State("NeuriteNuclear test")
10:Integrated Morphometry–Measure("DAPI")
11:Integrated Morphometry–Create Objects Mask()
12:Untitled＝New(1392,1040,16,0)
13:Overwrite"Nuclear_IMA"＝[12:New]+"IMA Objects Mask"
14:Configure Neurite Outgrowth Data Log()
15:Configure Neurite Outgrowth Summary Log()
16:[None]＝Neurite Outgrowth(NeuriteSrc＝"FITC",NuclearSrc＝[13:Arithmetic],NuclearDest＝Overwrite"Nuclear_Neurite")。
因此,先将影像中所有细胞核全算入,再将所有细胞核依面积大小与荧光强弱区分,并区分细胞核与神经细胞标记MAP2有荧光重叠的细胞核,得到真正的神经细胞。
(b)分析神经细胞的轴、树突生长情形
选取表现微管相关蛋白2(MAP2)的神经细胞之后,计算神经细胞体的面积大小,及轴突、树突的长度与分支数目,以确认神经细胞的轴、树突生长情形；可例如使用MetaXpress 3.1软件中内建的选项依下述的顺序进行设定6个步骤:
17:Threshold Image([16:Neurite Outgrowth],1,65535,Inclusive)
18:Overwrite"NeuriteNuclear_Binary"＝Clip Image(16,[16:Neurite Outgrowth])
19:Overwrite"Add"＝"FITC"+[18:Clip Image]
20:Configure Neurite Outgrowth Data Log()
21:Configure Neurite Outgrowth Summary Log()
22:Overwrite"Neurite"＝Neurite Outgrowth(NeuriteSrc＝[19:Arithmetic],NuclearSrc＝[None],NuclearDest＝[None])
因此,可分析神经细胞体范围与自神经细胞延伸出来的轴、树突长度及分支数目。
(c)分析神经细胞突触生长情形
根据上述轴、树突荧光标定范围,计算表现突触蛋白(Synaptophysin)的突触(synaptic puncta)数目,以确认神经细胞生长情形；可例如使用MetaXpress 3.1软件中内建的选项依下述的顺序进行设定10个步骤:
23:Configure Cell Scoring Data Log()
24:Configure Cell Scoring Summary Log()
25:Overwrite"NeuronBinary"＝Cell Scoring(All nuclei＝[18:Clip Image],Positivemarker＝"FITC")
26:Threshold Image([25:Cell Scoring],1,65535,Inclusive)
27:Overwrite"Binary"＝Binarize([25:Cell Scoring]),1,65535
28:Overwrite"AND"＝"Cy5"AND[27:Binary Operations]
29:Configure Transfluor Data Log()
30:Configure Transfluor Summary Log()
31:[None]＝Transfluor(Pit/Vesicle Source＝[28:Arithmetic],NuclearSource＝[18:Clip Image])
32:Close All(NOQUERY)
因此,将神经细胞体及微管相关蛋白2(MAP2)标示的范围算入,可得到神经细胞范围内所含的突触(synaptic puncta)数量。
借由上述32个步骤,得以了解神经生长与神经网络形成的情形；举例而言,利用此模块进行分析,1孔3种荧光标定197个视野共591张影像,仅需2小时就能得到完整的结果。
请参阅图3,为小鼠大脑皮质神经细胞于体外(in vitro)培养7、10、14及21天(7～21DIV)的代表图,绿色标示处代表神经细胞体和树突(anti-MAP2)、红色标示处代表前突触(anti-synaptophysin),蓝色标示处代表细胞核(Hoechst)；图中的比例尺长度为50μm。
进一步利用如上述32个步骤进行分析,得到初代培养细胞的实验结果如图4～图6。检视图4,正常神经细胞在不同培养天数测得的神经细胞数量以培养10天最佳；检视图5,主分的长度、轴树突长度及小分支数量虽然于培养14天最佳,但图6显示,突触数量也如图4在培养10天最佳,培养14天突触数量下降；故,在快速取得神经细胞以进行后续分析的前提下,选择培养天数10天为最佳条件。
实施例三:检测化疗药物对于神经细胞的影响
(1)初代培养细胞
采取出生后0～1天的小鼠(B6mice pup)大脑皮质区(cortex),去除脑膜后利用不含血清的DMEM/F12培养基将组织打散,补足不含血清的DMEM/F12的体积至5mL,加入0.5mL 1X胰蛋白酶(trypsin)混匀,37℃水浴5分钟,使用70μm过滤膜浸润1mL胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)将杂质进行过滤,离心3,000rpm 10分钟,去除上清液,将沉淀下来的细胞加入须要量的培养基(培养基配制:A medium500mL,L-glutamin 100X 1.3mL,Supplement 50X 10mL/vial,Penicillin/Streptomycin 100X 2.5mL),进行神经细胞培养。
(2)使用透明薄底微量多孔黑盘进行神经细胞培养,培养前盘中每孔先加入70μL的多聚离胺酸(poly-D-lysine或poly-L-lysine)进行涂布(coating)动作,再于每孔种2.8×104的细胞进行培养；体外培养10天之后,加入如表一的化疗药物于细胞作用24小时,以4％聚甲醛(polyformaldehyde)固定细胞10分钟,利用PBS冲洗5分钟2次；加入1M甘胺酸(glycine)作用10分钟,再利用PBS冲洗5分钟2次；加入0.05％Triton X-100作用20分钟,利用PBS冲洗5分钟2次。利用4％牛血清蛋白(BSA)阻断(blocking)1小时,加入一级抗体:(1)微管相关蛋白2抗体(MAP2antibody；MyBioSource；MBS502140)及(2)突触蛋白抗体(Anti-Synaptophysin antibody；Abcam；ab32127)进行染色12～16小时；利用PBST冲洗10分钟2次,并加入带有荧光标定的二级抗体,分别为Alexa Fluor 488(Jackson ImmunoResearch；703-546-155)与Alexa Fluor 647(molecular probes；A31573),以及加入赫斯特染剂(Hoechst 33258)作用1小时,利用PBST冲洗10分钟2次,最后加入PBS,并进行荧光影像撷取及分析。
表一
(3)使用如实施例二的荧光显微影像系统及方法,撷取影像以进行上述培养细胞的影像分析,影像呈现放大200倍(200X),使用荧光波长DAPI、FITC及Cy5共3种,拍照完自动存取影像以进行分析。
请参阅图7～图9,分别代表不同化疗药物处理对于神经细胞数量、突触数量及轴树突长度的影响,各组皆与未投药控制组相比较(相对控制组％)。由结果可知,长春新碱Vincristine具有明显的神经细胞毒性(neurotoxicity)；与顺铂Cisplatin相比,佳铂帝Carboplatin具有较低神经细胞毒性；而拓朴异构酶抑制剂(Topoisomerase inhibitor)包括艾霉素Doxorubicin与微脂体艾霉素(),以及核苷类似物(nucleoside analogue)吉西他滨Gemcitabine的神经细胞毒性较低。
由于细胞培养及影像撷取之后,搭配使用高通量分析系统并利用本发明最佳化模块(32个步骤)分析神经细胞功能,可快速得到各种分析结果。本方法不仅可应用于任何神经相关的药物筛选与检测,例如药物对神经系统的毒性或保护效果,也可用于学术界探讨神经系统功能与信息传递的标的分子的探寻。
由上述的实施说明可知,本发明与现有技术相较之下,本发明具有以下优点:
1.本发明经过反复验证,筛选出几个代表性的分子标记作为评估早期神经生长与神经网络的形成,相较于目前以评估神经细胞存活状况为主的方法,更能确切侦测神经功能的变化。
2.本发明以影像与型态为基础的分析方法,将神经细胞生长与几项重要指标设计成一完整的功能评估模块,并排除不具鉴别力的指标,在省时、大量与完整评估之间取得良好平衡,故可应用于任何神经相关药物的高通量筛选与检测中,以快速及准确地评估药物对神经系统的作用。
Claims (8)
1.一种建立用于评估神经功能的分析模块的方法，其特征在于，所述建立用于评估神经功能的分析模块的方法包括下列步骤:
步骤一:利用一荧光显微影像系统撷取一具有多个荧光标定的培养细胞以进行该培养细胞的影像分析,其中该培养细胞包含神经细胞；
步骤二:依据细胞核的面积大小与荧光强弱,选取表现轴、树突荧光标定的神经细胞,排除非神经细胞,并计算神经细胞体的面积大小,及轴突、树突的长度与分支数目,以确认该神经细胞的轴、树突生长情形；以及
步骤三:根据该步骤二的轴、树突荧光标定范围,计算该神经细胞上突触荧光标定的数目,以确认该神经细胞生长情形。
2.如权利要求1所述的建立用于评估神经功能的分析模块的方法，其特征在于，多个荧光标定包含赫斯特染剂以标记细胞核。
3.如权利要求1所述的建立用于评估神经功能的分析模块的方法，其特征在于，该轴、树突荧光标定选自微管相关蛋白2抗体或神经元类型Ⅲβ-微管蛋白,而该突触荧光标定选自突触蛋白抗体或突触后密度蛋白95。
4.如权利要求1所述的建立用于评估神经功能的分析模块的方法，其特征在于，该培养细胞由下列步骤制得:
步骤一:取一幼鼠大脑皮质组织,加入一第一培养基打散该大脑皮质组织,以形成一混合液；
步骤二:过滤该混合液,并以离心方式获得一细胞沉淀液；以及
步骤三:将该细胞沉淀液培养于一第二培养基内9～12天,以制备出该培养细胞。
5.如权利要求4所述的建立用于评估神经功能的分析模块的方法，其特征在于，将该细胞沉淀液培养于该第二培养基内10天,以制备出该培养细胞。
6.如权利要求4所述的建立用于评估神经功能的分析模块的方法，其特征在于，该幼鼠出生后0～1天的小鼠或大鼠。
7.如权利要求4所述的建立用于评估神经功能的分析模块的方法，其特征在于，该第一培养基不含血清的DMEM/F12培养基。
8.如权利要求4所述的建立用于评估神经功能的分析模块的方法，其特征在于，该第二培养基包含培养基、L-麸酰胺酸、添加剂,以及青霉素-链霉素。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |