CN113583958A - 一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法 - Google Patents

一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113583958A
CN113583958A CN202110882880.XA CN202110882880A CN113583958A CN 113583958 A CN113583958 A CN 113583958A CN 202110882880 A CN202110882880 A CN 202110882880A CN 113583958 A CN113583958 A CN 113583958A
Authority
CN
China
Prior art keywords
neural stem
cell
stem cells
differentiation
gfap
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202110882880.XA
Other languages
English (en)
Inventor
秦建兵
金国华
李雯
张新化
田美玲
何辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nantong University
Original Assignee
Nantong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nantong University filed Critical Nantong University
Priority to CN202110882880.XA priority Critical patent/CN113583958A/zh
Publication of CN113583958A publication Critical patent/CN113583958A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Abstract

本发明提供一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，涉及细胞生物学研究技术领域，其技术特征在于：包含以下步骤：S1：使用尼式染料和GFAP免疫荧光染色联合标记神经干细胞诱导分化后的细胞悬液；S2：使用流式细胞术检测被诱导分化为神经元细胞的绝对数量及比例。通过应用尼式染料，标记时，尼式染料直接通过细胞膜进入到细胞内对神经元胞浆的尼式小体和神经核进行标记，染色简单易行，且结果特异性高，神经干细胞经体外诱导分化后，采用流式细胞术分析其诱导神经元的情况，可将神经元与胶质细胞群体完全明显的区分开来，数据分析的结果清晰可靠，实验方法简便易行。

Description

一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学研究技术领域，尤其涉及一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法。
背景技术
神经干细胞(neural stem cell，NSCs)是存在于中枢神经系统中，具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多向分化潜能。神经干细胞移植后，部分环路和功能的重建，是修复和代替受损脑组织的有效途径，已被广泛地用于神经退行性疾病（如老年性痴呆、帕金森氏病等）、中风、脊髓损伤及中枢神经系统遗传疾病等动物模型或临床的治疗研究，并且取得了较好的效果。在自然条件下，神经干细胞主要分化为星形胶质细胞，因此如何促进神经干细胞更多地向神经元分化则是研究者的兴趣所在，他们通过微环境和细胞因子等研究神经干细胞分化的机制，来研究如何诱导神经干细胞更多的向神经元或特定表型的神经元分化。
诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定目前有免疫荧光、westernblot、实时定量PCR及流式细胞术等等，大部分学者都采用免疫荧光染色后显微镜观察，图像处理计数来实现，但由于实验样本的量及图像处理统计的手段，容易导致实验的繁杂和误差的产生，因此寻找快速准确地计数神经干细胞诱导分化后的神经元和胶质细胞的数量及比例的方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中无法快速准确地计数神经干细胞诱导分化后的神经元和胶质细胞的数量及比例的技术问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，包含以下步骤：
S1：使用尼式染料和GFAP免疫荧光染色联合标记神经干细胞诱导分化后的细胞悬液；
S2：使用流式细胞术检测被诱导分化为神经元细胞的绝对数量及比例。
优选的，所述尼式染料为NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂。
优选的，所述GFAP为采用Alexa647荧光素偶联的GFAP。
优选的，所述S1中，先将细胞悬液固定破膜，然后使用GFAP孵育1小时，接着清洗两遍再添加尼式染料孵育10分钟。
优选的，所述尼式染料与细胞悬液的比例为1：300。
优选的，所述流式细胞术选用尼式信号的面积与GFAP信号的高度作为分析指标的散点图。
优选的，所述流式细胞术选用尼式信号的高度与GFAP信号的高度作为分析指标的散点图。
本申请提供的一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，通过应用尼式染料，标记时，尼式染料直接通过细胞膜进入到细胞内对神经元胞浆的尼式小体和神经核进行标记，染色简单易行，且结果特异性高，神经干细胞经体外诱导分化后，采用流式细胞术分析其诱导神经元的情况，可将神经元与胶质细胞群体完全明显的区分开来，数据分析的结果清晰可靠，实验方法简便易行。
附图说明
图1是大鼠脊髓纵向切片NeuN免疫组化及Nissl染色结果图，其中，A是使用尼氏染料染色的结果图，B是使用NeuN免疫荧光染色的结果图，C是使用Hoechest33342染色的结果图，D是上述三种染色重叠的结果图。
图2是大鼠神经杆细胞诱导分化后使用NeuN免疫组化及Nissl染色结果图，其中，A是使用尼氏染料染色的结果图，B是使用NeuN免疫荧光染色的结果图，C是使用Hoechest33342染色的结果图，D是上述三种染色重叠的结果图。
图3是大鼠神经干细胞诱导分化3天后细胞悬液滴片GFAP免疫组化及Nissl染色结果，其中A是尼式染料染色结果图，B是使用GFAP免疫荧光染色结果图；C是尼式染料与GFAP免疫荧光染色重叠的结果图。
图4是大鼠神经干细胞诱导分化3天后细胞悬液GFAP免疫组化及Nissl染色结果流式分析图，其中，A是收集分析细胞的散点图；B是Nissl染色单标记散点图；C是Nissl染色单标记直方图；D是GFAP及Nissl双标记散点图；E是Nissl染色单标记散点图；F是GFAP及Nissl双标记散点图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。
部分名词释义：
Alexa Fluor 647 是一种明亮的远红外荧光染料，其激发光谱非常适合于 594nm 或 633 nm 激光谱线。
DFAP：胶质纤维酸性蛋白
Nissl：尼式小体
NeuN：神经元核心抗原
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
对比例1：请参阅图1，图1是大鼠脊髓纵向切片NeuN免疫组化及Nissl染色结果图，图1中所用的尼式染料是NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂尼氏染料，从图1A中可以看出，尼式染料可以直接通过细胞膜进入到细胞内对神经细胞胞浆的尼式小体和神经核进行标记，染色简单且结果特异性高。并且结合Hoechest33342细胞核复染，可以观察到NeuN阴性的细胞（星形胶质细胞或少突胶质细胞）仅仅只有细胞核标记红色。
由此可见，NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂除了对大鼠脊髓中NeuN阳性神经元胞浆中的尼氏小体染成红色外，还能标记所有细胞的细胞核，结合Hoechest33342细胞核复染，可以观察到NeuN阴性的细胞仅仅只有细胞核标记红色，说明NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂可作为神经元的标记物。
对比例2：请参阅图2，图2为大鼠神经杆细胞诱导分化后使用NeuN免疫组化及Nissl染色结果图。图2中的尼式染料与图1中相同，均为NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂，可以通过图2A看出，NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂除了对诱导分化为NeuN阳性的神经元胞浆中的尼氏小体染成红色外，还能标记所有细胞的细胞核，并结合图2D可以看出，结合Hoechest33342细胞核复染，也可以观察到NeuN阴性的细胞仅仅只有细胞核标记红色。
由此可见，NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂除了对诱导分化为NeuN阳性的神经元胞浆中的尼氏小体染成红色外，还能标记所有细胞的细胞核，结合Hoechest33342细胞核复染，也可以观察到NeuN阴性的细胞仅仅只有细胞核标记红色。进一步证明NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂可作为神经干细胞体外诱导分化为神经元的标记物。
综上可以得出，可以使用尼式染料作为神经元的标记物。
一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，包含以下步骤：
S1：取用神经干细胞体外诱导分化3天的细胞悬液，使用尼式染料和GFAP免疫荧光染色联合标记神经干细胞诱导分化后的细胞悬液；
所述尼式染料用于作为神经元的标记物，应用过程中，尼式染料直接通过细胞膜进入细胞内对神经元胞浆的尼式小体和神经核进行标记，染色简单易行，且结果特异性高；在一实施方式中，所述尼式染料为NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂。
在一实施方式中，所述GFAP为采用Alexa647荧光素偶联的GFAP。
在一实施方式中，先将细胞悬液固定破膜，然后用Alexa647荧光素偶联的GFAP抗体（5µl，具体参照各厂商说明书）孵育1小时后，清洗两遍再加NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂（1：300）孵育10分钟。
S2：使用流式细胞术检测被诱导分化为神经元细胞的绝对数量及比例。
在一实施方式中，所述流式细胞术选用尼式信号的面积与GFAP信号的高度作为分析指标的散点图，用于检测其被诱导分化为神经元细胞的绝对数量及比例。在另一实施方式中，所述流式细胞术选用尼式信号的高度与GFAP信号的高度作为分析指标的散点图。
请参阅图3，大鼠神经干细胞诱导分化3天后的细胞悬液，其中：
A NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂尼氏染料标记，
B Alexa647荧光素偶联的GFAP免疫荧光标记，
C Alexa647荧光素偶联的GFAP与NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂尼氏染料双标记。
请参阅图3，神经干细胞经体外诱导分化3天后，GFAP阳性的星形胶质细胞胞浆呈蓝色信号，细胞核呈红色信号，而GFAP阴性的细胞可见胞浆和核均被标记了NeuroTrance640/660红色信号。
神经干细胞经体外诱导分化3d后，GFAP阳性的星形胶质细胞胞浆呈蓝色信号，核红色信号，而GFAP阴性的细胞可见胞浆和核均被标记了NeuroTrance640/660红色信号，进一步证明尼氏染色剂与GFAP联合应用可完全的将神经元与胶质细胞区分开来。
请参阅图4，通过对上述细胞进行流式细胞术分析，其中：
A使用尼式单标记荧光信号的高度和面积与前向散射光散点图（如图4B、E所示）、尼式单标记的直方图（如图4C所示）；
B使用尼式信号的高度和面积与GFAP信号的高度作为分析细胞的散点图，如图4D、F所示；
可以看出，神经干细胞经体外诱导分化3天后，使用尼氏单标记的散点图和直方图均可以看到尼式阳性细胞群与阴性细胞群靠的比较近，对分析结果的判断可能会因为圈门的差异带来认为的误差，而用尼式信号的高度和面积与GFAP信号的高度的两个散点图，均能够清晰地将神经干细胞诱导分化为神经元的细胞群体展示出来。
神经干细胞经体外诱导分化3d后，流式细胞分析结果用Nissl单标记荧光信号的高度或面积与前向散射光散点图（B、E），或Nissl单标记的直方图（C）均见Nissl阳性细胞群与阴性细胞靠的比较近，对分析结果的判断可因圈门的差异带来人为的误差。采用Nissl与GFAP两个荧光通道的散点图（D、F）分析，结果发现无论用Nissl信号的高度还是面积分析，均能完全清晰地将神经干细胞经诱导分化为神经元的细胞群体展示出来，两种方法对分析结果的差异性不大。
本申请所提供的一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，其通过应用尼式染料，标记时，尼式染料直接通过细胞膜进入到细胞内对神经元胞浆的尼式小体和神经核进行标记，染色简单易行，且结果特异性高，神经干细胞经体外诱导分化后，采用流式细胞术分析其诱导神经元的情况，通过尼式红色脉冲信号的面积或高度与GFAP紫色脉冲信号的高度作为分析指标散点图，可将神经元与胶质细胞群体完全明显的区分开来，数据分析的结果清晰可靠，实验方法简便易行。
需要注意的是，本发明中使用的各种试剂均是可以从市场上得到的，发明人在此不再赘述。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围。

Claims (7)

1.一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，其特征在于：包含以下步骤：
S1：使用尼式染料和GFAP免疫荧光染色联合标记神经干细胞诱导分化后的细胞悬液；
S2：使用流式细胞术检测被诱导分化为神经元细胞的绝对数量及比例。
2.根据权利要求1所述的诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，其特征在于：所述尼式染料为NeuroTrance640/660深红色荧光尼氏染色剂。
3.根据权利要求1所述的诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，其特征在于：所述GFAP为采用Alexa647荧光素偶联的GFAP。
4.根据权利要求1所述的诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，其特征在于：所述S1中，先将细胞悬液固定破膜，然后使用GFAP孵育1小时，接着清洗两遍再添加尼式染料孵育10分钟。
5.根据权利要求4所述的诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，其特征在于：所述尼式染料与细胞悬液的比例为1：300。
6.根据权利要求1所述的诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，其特征在于：所述流式细胞术选用尼式信号的面积与GFAP信号的高度作为分析指标的散点图。
7.根据权利要求1所述的诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法，其特征在于：所述流式细胞术选用尼式信号的高度与GFAP信号的高度作为分析指标的散点图。
CN202110882880.XA 2021-08-02 2021-08-02 一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法 Withdrawn CN113583958A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110882880.XA CN113583958A (zh) 2021-08-02 2021-08-02 一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110882880.XA CN113583958A (zh) 2021-08-02 2021-08-02 一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113583958A true CN113583958A (zh) 2021-11-02

Family

ID=78254217

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110882880.XA Withdrawn CN113583958A (zh) 2021-08-02 2021-08-02 一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113583958A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480552A (zh) * 2021-12-17 2022-05-13 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 对神经细胞进行活细胞检验的方法以及药物筛选方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105050609A (zh) * 2012-11-26 2015-11-11 吴淑芬 用于诱导细胞自噬的方法及组成物
US20190000887A1 (en) * 2013-03-15 2019-01-03 Avita International Ltd. Use of stem cells expressing mesenchymal and neuronal markers and compositions thereof to treat neurological disease
CN109364061A (zh) * 2018-10-30 2019-02-22 澳门大学 蒿甲醚在防治脑卒中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105050609A (zh) * 2012-11-26 2015-11-11 吴淑芬 用于诱导细胞自噬的方法及组成物
US20190000887A1 (en) * 2013-03-15 2019-01-03 Avita International Ltd. Use of stem cells expressing mesenchymal and neuronal markers and compositions thereof to treat neurological disease
CN109364061A (zh) * 2018-10-30 2019-02-22 澳门大学 蒿甲醚在防治脑卒中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王萍等: ""经流式细胞仪分选神经细胞技术方法的建立"", 《内蒙古医学杂志》 *
秦建兵等: ""应用Nissl/GFAP荧光标记流式细胞术检测神经干细胞分化的研究"", 《南京大学学报（医学版）》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480552A (zh) * 2021-12-17 2022-05-13 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 对神经细胞进行活细胞检验的方法以及药物筛选方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11624685B2 (en) Method and system for imaging and analysis of a biological specimen
Crouch et al. FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions
Belachew et al. Postnatal NG2 proteoglycan–expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons
Sotrel et al. Morphometric analysis of the prefrontal cortex in Huntington's disease
Zhang Defining glial cells during CNS development
Vercelli et al. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals
Seidenfaden et al. Glial conversion of SVZ-derived committed neuronal precursors after ectopic grafting into the adult brain
Fischer et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone
Kukekov et al. A nestin‐negative precursor cell from the adult mouse brain gives rise to neurons and glia
Siebzehnrubl et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells
CN104471073B (zh) 用于从衍生自多能干细胞的细胞培养物中分离神经元的细胞表面特征物
Xiong et al. Selective labeling of individual neurons in dense cultured networks with nanoparticle-enhanced photoporation
CN114630900A (zh) 用于研究皮质-纹状体-中脑神经通路的人细胞模型
CN113583958A (zh) 一种诱导神经干细胞分化后的细胞类型鉴定方法
Chaichana et al. Intra-operatively obtained human tissue: protocols and techniques for the study of neural stem cells
Elberger Distribution of transitory corpus callosum axons projecting to developing cat visual cortex revealed by DiI
Oglesby et al. Semi-automated, quantitative analysis of retinal ganglion cell morphology in mice selectively expressing yellow fluorescent protein
Miyashita et al. Differential modes of termination of amygdalothalamic and amygdalocortical projections in the monkey
US20030129747A1 (en) Method of isolating ependymal neural stem cells
Piltti et al. Computer-aided 2D and 3D quantification of human stem cell fate from in vitro samples using Volocity high performance image analysis software
CN105985999B (zh) 建立用于评估神经功能的分析模块的方法
CN113447334A (zh) 一种循环神经细胞的检测方法、试剂盒和应用
CN109716133A (zh) 人类耳祖细胞鉴定和分离
Poon et al. Somatic nuclear division in the sporidia of Ustilago violacea. II. Observations on living cells with phase-contrast and fluorescence microscopy
Badal et al. Live imaging and quantitative analysis of organelle transport in sensory neurons of Aplysia Californica

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20211102

WW01 Invention patent application withdrawn after publication