DE3852162T2 - Farbstoff produzierende Zusammensetzung, diagnostischer Testsatz und ihre Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung eines Ligands unter Verwendung eines Peroxidase-markierten Rezeptors. - Google Patents

Farbstoff produzierende Zusammensetzung, diagnostischer Testsatz und ihre Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung eines Ligands unter Verwendung eines Peroxidase-markierten Rezeptors.

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DE3852162T2 DE19883852162 DE3852162T DE3852162T2 DE 3852162 T2 DE3852162 T2 DE 3852162T2 DE 19883852162 DE19883852162 DE 19883852162 DE 3852162 T DE3852162 T DE 3852162T DE 3852162 T2 DE3852162 T2 DE 3852162T2
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine einen Farbstoff liefernde Zusammensetzung mit einem Imidazol-Leukofarbstoff, der einen Farbstoff in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer peroxidativen Substanz, wie beispielsweise Peroxidase liefert. Ferner betrifft die Erfindung einen Testkit, der diese Zusammensetzung enthält sowie ein Liganden- Bestimmungsverfahren unter Verwendung der den Farbstoff liefernden Zusammensetzung und einem mit Peroxidase markierten Rezeptor für den Liganden.
  • Es besteht ein fortgesetztes Bedürfnis in der medizinischen Praxis, der Forschung und bei diagnostischen Verfahren für eine rasche und genaue Bestimmung von biologischen Substanzen, die in biologischen Flüssigkeiten in niedrigen Konzentrationen vorkommen. Beispielsweise wurde das Vorhandensein von Arzneimitteln, Narkotika, Hormonen, Steroiden, Polypeptiden, Prostaglandinen sowie infektiösen Organismen in Blut, Urin, Speichel, vaginalen Abscheidungen, seminalen Flüssigkeiten und anderen biologischen Flüssigkeiten in genauer und rascher Weise für diagnostische Zwecke oder Behandlungszwecke bestimmt.
  • Um solche Bestimmungen durchführen zu können, sind verschiedene Verfahren zur Isolierung und zur Identifizierung von biologischen Substanzen entwickelt worden, bei denen spezielle Bindungsreaktionen zwischen der Substanz, die bestimmt werden soll (hier als ein "Ligand" bezeichnet) und Rezeptoren, die speziell mit dieser Substanz zu reagieren vermögen, angewandt werden. Verwendet wurden radioaktive, fluoreszierende Markierungen oder Enzymmarkierungen, um den anfallenden reaktiven Komplex zu bestimmen.
  • In den vergangenen Jahren hat die Verwendung von Enzymmarkierungen eine erhöhte Aufmerksamkeit erlangt, aufgrund verschiedener Vorteile gegenüber der Verwendung von radioaktiven und fluoreszierenden Markierungen. Zu Assays, die Enzymmarkierungen verwenden, gehören solche, die aus dem Stande der Technik bekannt sind als kompetitive Enzym-Immunoassays (EIA) sowie sowohl direkte als auch indirekte enzym-gebundene Immunosorbent-Assays (ELISA).
  • Ein anderer Typ eines Assays, der entwickelt wurde, ist bekannt als ein immunometrischer oder als ein "Sandwich"-Assay. Ein solcher Assay schließt eine "Sandwichbildung" des Liganden (wie beispielsweise eines Antigens) mit zwei oder mehr Rezeptormolekülen (wie beispielsweise Antikörpern) ein, die mit der Verbindung in einer nicht störenden Weise und an verschiedenen epitopischen Zentren einen Komplex bilden. In den meisten Sandwich-Assays wird ein oder werden mehrere der Rezeptormoleküle in geeigneter Weise auf einem unlöslichen Träger, wie beispielsweise kleinen Teilchen, Membranen, Platten oder ähnlichen Gegenständen immobilisiert und ein anderer Rezeptor wird in geeigneter Weise markiert, beispielsweise mit einem Enzym.
  • Peroxidase ist ein Enzym, das als Markierung in verschiedenen Assays verwendet wurde, einschließlich in spezifischen Bindungsassays von allen Typen. Peroxidase wirkt auf Wasserstoffperoxid als ein Substrat und kann verschiedene Chromogene oder Farbstoffliefernde Materialien oxydieren, unter Erzeugung einer bestimmbaren Spezies im Verhältnis zur Menge an vorhandener Peroxidase. Verschiedene Farbstoffe liefernde Materialien sind aus dem Stande der Technik bekannt, einschließlich Benzidin und Derivate hiervon.
  • Die WO 85/02018 beschreibt stabilisierte Indikatoren, bei denen ein in Wasser lösliches Polymer den Indikator in trockener Form in Gegenwart von Peroxid stabilisiert.
  • Es werden keine Imidazol-Indikatoren in Kombination mit Elektronenübertragungsmitteln beschrieben.
  • Trockene analytische Elemente die getrockene Schichten von farbbildenden Reagenzien in Wasser löslichen Bindemitteln enthalten, werden in der EP-A-0 256 562 beschrieben.
  • In der U.S.-Patentschrift 4 596 770 werden Tetraalkylbenzidine in N-Methylpyrrolidon als Farbstoffliefernde Zusammensetzung mit Peroxidase markierten Antikörpern in Immunoassays verwendet. Obgleich derartige Zusammensetzungen geeignet sein können, wenn sie unmittelbar nach ihrer Herstellung in einem Lösungsassay verwendet werden, hat sich doch gezeigt, daß die Verwendung von Tetraalkyl benzidinen im Falle bestimmter Assays, bei denen der Ligand in der Testflüssigkeit in geringen Konzentrationen vorliegt, zu einer unzureichenden Empfindlichkeit führt. Auch sind die Benzidinzusammensetzungen relativ instabil. Weiterhin müssen im Falle bestimmter Assays, die unter Verwendung von Filtermembranen durchgeführt werden, die Membranen vorbehandelt werden, da der Farbstoff, der aus Tetraalkylbenzidinen erhalten wird, beispielsweise Tetramethylbenzidin, in Wasser löslich ist und ansonsten durch die Membran gelangen würde.
  • Es wäre zweckmäßig, wenn eine stabilere Farbstoff liefernde Zusammensetzung zur Verfügung stünde, die zu einer Kit-Form für eine längere Aufbewahrung abgepackt werden könnte. Es wäre ferner wünschenswert, wenn eine empfindlichere diagnostische Methode bereitgestellt werden könnte, die zur Verwendung in verschiedenen Umgebungen verkauft werden könnte, einschließlich Arztpraxen und Verbraucher-Wohnungen oder Verbraucher-Häusern.
  • Die oben beschriebenen Probleme wurden gelöst mit einer einen Farbstoffliefernden Zusammensetzung mit einem wasserlöslichen oder in Wasser dispergierbaren Polymer,
  • wobei die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein Elektronenübertragungsmittel aufweist und einen Imidazol-Leukofarbstoff, der einen Farbstoff in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer peroxidativen Substanz zu liefern vermag,
  • wobei das Gewichtsverhältnis von Polymer zur Leukofarbstoff bei 10.000:1 bis 100:1 liegt und wobei das Polymer ein Vinylpyrrolidonpolymer, Acrylamidpolymer, Acrylsäure- oder Methacrylsäurepolymer, Polymethylenglykol oder Polyamin ist.
  • Mit dieser Erfindung wird ferner ein diagnostischer Test-Kit für die Bestimmung eines Analyten als Ergebnis der katalytischen Aktivität von Peroxidase bereitgestellt, wobei der Test-Kit aufweist:
  • (a) ein Substrat für Peroxidase, und
  • (b) die oben beschriebene einen Farbstoffliefernde Zusammensetzung.
  • Ferner wird ein Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einer wässrigen Flüssigkeit bereitgestellt, das umfaßt:
  • A. Das Kontaktieren einer Probe der Flüssigkeit mit einem mit Peroxidase markierten Rezeptor für den Liganden unter Bildung eines Reaktionsproduktes aus dem Liganden mit dem Rezeptor,
  • B. Das Kontaktieren der Flüssigkeitsprobe mit der oben beschriebenen den Farbstoffliefernden Zusammensetzung vor, gleichzeitig mit oder nach Durchführung der Kontaktstufe (A),
  • C. die Trennung des Reaktionsproduktes von nicht umgesetzten Materialien vor, gleichzeitig mit oder nach der Kontaktstufe (B), und
  • D. die Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit des Reaktionsproduktes.
  • Durch die vorliegenden Erfindung wird eine stark verbesserte einen Farbstoffliefernde Zusammensetzung bereitgestellt, die in vorteilhafter Weise verwendet werden kann, wo Peroxidase oder eine andere peroxidative Substanz in einem Assay beteiligt ist. Diese einen Farbstoffliefernde Zusammensetzung weist eine verbesserte Stabilität auf, aufgrund der Kombination eines besonderen in Wasser löslichen oder in Wasser dispergierbaren Polymeren mit einem Imidazol-Leukofarbstoff, der zu einem Farbstoff in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer peroxidativen Substanz, wie z.B. Peroxidase oxydiert wird.
  • Diese einen Farbstoffliefernde Zusammensetzung kann leicht in einem diagnostischen Test-Kit abgepackt werden, der transportiert und über längere Zeiträume aufbewahrt werden kann, ohne einen ins Gewicht fallenden Verlust an Empfindlichkeit. Sehr niedrige Konzentrationen von mit Peroxidase markierten spezifischen Bindungsverbindungen können mit dieser Erfindung festgestellt werden, aufgrund der hohen Empfindlichkeit der den Farbstoffliefernden Zusammensetzung.
  • Im Falle bevorzugter Ausführungsformen, bei denen der Assay unter Verwendung einer Filtermembran durchgeführt wird, beispielsweise in einer Wegwerf-Testvorrichtung, braucht die Membran nicht vorbehandelt zu werden, im Gegensatz zu dem Fall, in dem Tetramethylbenzidin als Material für die Farbstoffbildung verwendet wird. Uberraschenderweise erleichtert das in der Zusammensetzung dieser Erfindung verwendete Polymer die Aufbewahrung des Imidazol-Leukofarbstoffes in Lösung in der den Farbstoffliefernden Zusammensetzung und erleichtert die Immobilisierung des anfallenden Farbstoffes auf der Membran während des Assays.
  • Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eignet sich für die Erzeugung eines Farbstoffes in Gegenwart einer peroxidativen Substanz, wie z.B. Peroxidase und Wasserstoffperoxid. Die Zusammensetzung kann zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid oder Peroxidase oder einem beliebigen Analyten verwendet werden, der dazu fähig ist in einer oder mehreren Reaktionen Wasserstoffperoxid zu erzeugen. Beispielsweise kann die Zusammensetzung in vorteilhafter Weise eingesetzt werden in Assays für solche Analyten wie Glukose, Galaktose, Aminosäuren, Karnsäure, Triglyzeriden, Kreatinkinase (Gesamt oder Isoenzyme hiervon), Cholesterin und anderen bekannten Analyten, wo Peroxidase in einer Folge von Reaktionen verwendet wird, um eine bestimmbare Spezies als Folge des Vorhandenseins des Analyten zu bestimmen. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung dieser Erfindung in Assays verwendet, an denen spezifische Bindungsreaktionen beteiligt sind, wie beispielsweise Immuno- Assays, wie sie weiter unten genauer beschrieben werden.
  • Die Zusammensetzung enthält ein oder mehrere in Wasser lösliche oder dispergierbare Polymere wie Vinylpyrrolidonpolymere, Acrylamidpolymere, Acrylsäure- und Methacrylsäurepolymere, Polyethylenglykole und Polyamine. Diese Polymeren können entweder Homo- oder Copolymere sein. Zu repräsentativen Beispielen für geeignete Polymere gehören, ohne daß hierauf eine Beschränkung erfolgt Poly(acrylsäure), Poly(methacrylsäure), Poly(acrylsäure-co-methylacrylat) (Gew.-Verhältnis 90:10), Poly(acrylamid), Poly(acrylamid-co-acrylsäure) (Gew.- Verhältnis 50:50), Polyamine, wie z.B. Jene, die in den U.S.-Patentschriften 3 702 249 und 4 689 359 beschrieben werden. Besonders geeignete Polymere sind Vinylpyrrolidonpolymere, d.h. Homo- oder Copolymere, hergestellt aus Vinylpyrrolidon, wie z.B. Poly(vinylpyrrolidon), Poly(vinylpyrrolidon-co-acrylsäure) und Poly(vinylpyrrolidon-co- acrylamid). Diese Polymeren erleichtern die Aufbewahrung der Leukofarbstoffe in wässriger Lösung, wie auch die Immobilisierung des anfallenden Farbstoffes auf Substraten, wie z.B. Filtermembranen, ohne daß es notwendig ist, die Membran vorzubehandeln.
  • Die Polymeren können ferner geringere Mengen (d.h. weniger als 50 Mol-%) an anderen ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren enthalten, welche die Funktion der Erfindung oder den Leukofarbstoff nicht stören. Poly(vinylpyrrolidon) ist ein bevorzugtes Polymer.
  • Die Zusammensetzung dieser Erfindung enthält ferner ein oder mehrere Leukofarbstoffe, die einen Farbstoff in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer peroxidativen Substanz zu liefern vermögen. Der erhaltene Farbstoff ist im allgemeinen bestimmbar im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums (im allgemeinen von 400 bis 700 nm). Vorzugsweise wird der Farbstoff bei 500 bis 650 nm bestimmt.
  • Geeignete Imidazol-Leukofarbstoffe sind entweder Diarylimidazol- oder Triarylimidazol-Leukofarbstoffe. Viele geeignete Verbindungen sind aus dem Stande der Technik bekannt, einschließlich jener, die in der U.S.- Patentschrift 4 089 747 und den hierin zitierten Literaturstellen beschrieben werden, und die aus der E.P. Publikation 122 641 sowie der Japanischen Patentpublikation 58(1983)-045 557 bekannt sind.
  • Die Triarylimidazole mit der folgenden allgemeinen Formel sind besonders geeignet:
  • worin bedeuten: R¹, R² und R³ jeweils eine organische Gruppe der Art, daß mindestens eine van ihnen eine ortho- oder para-Hydroxy-substituierte Arylgruppe mit bis zu 18 Kohlenstoffatomen ist, wobei die anderen zwei Gruppen Arylgruppen sind, die derart ausgewählt sind, daß das Imidazol- Oxydationspotential zwischen -70 und +110 mV liegt, gemessen durch zyklische Voltametrie gegen eine Standard-Kalomel- Elektrode unter Verwendung einer Elektrode auf Kohlebasis. Die Messung von Oxydationspotentialen kann erfolgen nach üblichen elektrochemischen Methoden (siehe beispielsweise Sawyer und Mitarbeiter, Experimental Electrochemistry for Chemists, Verlag John Wiley & Sons, New York, 1974).
  • Der hier gebrauchte Ausdruck "Aryl" steht für aromatische Kohlenwasserstoffgruppen, wie beispielsweise Phenyl, Naphthyl oder Anthryl, Tolyl, Xylyl und andere substituierte aromatische Gruppen. Die Anzahl der Kohlenstoffatome bezieht sich auf die Gesamtanzahl an Kernkohlenstoffatomen, wie auch jenen in Substituenten. Mindestens eine der Gruppen R¹, R² und R³ weist einen Ortho- oder Para-Elektronen spendenden Substituenten, wie z.B. eine Alkyloxy-Gruppe (-OR) auf, worin R für eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht (z.B. Methyl, Ethyl, Isopropyl, t-Butyl, Hexyl, Chloromethyl oder Methoxymethyl), oder eine Dialkylaminogruppe, worin Alkyl die angegebene Definition hat. Die Gruppen R¹, R² und R³ können einen oder mehrere andere Substituenten aufweisen, die elektronisch mit dem Imidazolkern verträglich sind, derart, daß durch Oxydation ein geeigneter Farbstoff erhalten wird. Weitere Details bezüglich bevorzugter Triarylimidazolverbindungen sowie Verfahren zur Herstellung derselben finden sich in der U.S.-Patentschrift 4 089 747.
  • Besonders geeignete Triarylimidazol-Leukofarbstoffe sind:
  • 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol,
  • 2-(3,5-Dibromo-4-hydroxyphenyl)-4,5-diphenylimidazol,
  • 2-(3-Bromo-5-methoxy-4-hydroxyphenyl)-4,5-bis(4- methoxyphenyl)imidazol,
  • 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)imidazol,
  • 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy-3- methoxyphenyl)imidazol,
  • 2-(4-Hydroxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol und
  • 4,5-Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy)- 3,5-dimethoxyphenylimidazol.
  • Die Mengen an Leukofarbstoff und Polymer in der Zusammensetzung können weitestgehend variiert werden, in Abhängigkeit davon, wie die Zusammensetzung verwendet wird. Im allgemeinen liegt der Leukofarbstoff in einer Menge von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;³ und vorzugsweise von 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;&sup4; auf molarer Basis vor. Die Polymermenge hängt ab von der Menge an verwendetem Leukofarbstoff. Das Gewichtsverhältnis von Polymer zu Leukofarbstoff liegt bei 10.000:1 bis 100:1 d vorzugsweise bei 5.000:1 bis 500:1, um die oben beschriebenen Vorteile zu erzielen.
  • Die Komponenten der oben beschriebenen Zusammensetzung sind im Handel aus einer Anzahl von Quellen leicht zugänglich. Alternativ können sie unter Anwendung bekannter Ausgangsmaterialien und Verfahren hergestellt werden, wie sie beschrieben werden in der U.S.-Patentschrift 4 089 747 und anderen oben erwähnten Literaturstellen.
  • Die Zusammensetzung befindet sich im allgemeinen in einem wässrigen Medium, obgleich im Falle einer Ausführungsform geringere Mengen an mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln zugesetzt werden können, um die Leukofarbstoffe oder anderen hydrophoben Reagenzien zu lösen. Methanol oder andere Alkohole, Aceton oder Acetonitril eignen sich für diesen Zweck. Vorzugsweise wird der Leukofarbstoff direkt in einer wässrigen Lösung des Polymeren gelöst.
  • Die Zusammensetzungen können ferner andere Komponenten enthalten, die für einen speziellen Zweck benötigt werden. Beispielsweise kann die Zusammensetzung ferner entweder Wasserstoffperoxid oder eine peroxidative Substanz enthalten, jedoch nicht beide, da sonst der Leukofarbstoff vorzeitig oxydiert würde. Peroxidative Substanzen sind solche, die die Oxydation einer anderen Substanz mittels Wasserstoffperoxid oder anderen Peroxiden katalysieren. Zu derartigen Substanzen gehören, ohne daß hierauf eine Beschränkung erfolgt, natürliche und synthetische Peroxidasen, Cytochrome, Hämin, Formen des Hämoglobins, alkalisches Hämatin, Eisensulfocyanat, Eisentannat, Chromisalze und dergleichen. Peroxidase ist eine besonders geeignete peroxidative Substanz.
  • Die Zusammensetzung kann ferner eine spezifische Bindungsverbindung enthalten, die an eine peroxidative Substanz gebunden wird, wie beispielsweise eine mit einer Peroxidase markierte immunologisch reaktive Verbindung. Eine spezifische Bindungsverbindung ist eine chemische oder biologische Substanz, die spezifisch mit einer anderen Verbindung reagiert, wie z.B. Avidin mit Biotin oder ein Antikörper mit seinem entsprechenden Antigen. Diese Materialien werden weiter unten näher beschrieben.
  • Elektronenübertragsmittel, d.h. Verbindungen, welche die Übertragung von einem oder mehreren Elektronen zwischen Verbindungen im Falle von Oxydations-Reduktionsreaktionen erleichtern, sind in die Zusammesetzung ebenfalls eingeschlossen. Viele geeignete Elektronenübertragungsmittel sind aus dem Stande der Technik bekannt, wie z.B. Phenazinmethosulfat, Benzo- und Naphthochinone, wie sie in der U.S.-Patentschrift 4 746 607 beschrieben werden. Besonders geeignete Elektronenübertragungsmittel sind die Phenole und Aniline, die in der EP-A-0 252 747 beschrieben werden.
  • Eine bevorzugte Zusammensetzung dieser Erfindung ist auf einen pH-Wert von 6 bis 8 abgepuffert und enthält Wasserstoffperoxid, ein phenolisches Elektronenübertragungsmittel, Poly(vinylpyrrolidon) sowie einen Triarylimidazol-Leukofarbstoff, der ausgewählt ist aus der Liste von bevorzugten Farbstoffen wie oben beschrieben, wobei der Farbstoff 2-(4-Hydroxy-3,5-di-methoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol der am meisten bevorzugte Farbstoff ist.
  • Ein diagnostischer Test-Kit dieser Erfindung enthält die oben beschriebene Zusammensetzung wie auch ein oder mehrere andere Reagenzien, Testvorrichtungen oder Utensilien für die Durchführung eines Assays. Der Kit weist ferner ein Substrat für Peroxidase auf, d.h. ein geeignetes Peroxid, wie beispielsweise Wasserstoffperoxid.
  • Vorzugsweise enthält der Kit ferner ein Testgerät oder eine Testvorrichtung zur Durchführung eines Assays, wie z.B. eines Immunoassays. Ein solches Testgerät oder eine solche Testvorrichtung weist im allgemeinen ein in Wasser unlösliches Substrat auf mit einer oder mehreren Testzonen (wie z.B. Test-Behältnissen). Das Substrat wird aus einem in Wasser unlöslichen Material hergestellt, wie z.B. Glas, polymeren Materialien, zellulosischen Materialien und anderen Materialien, die aus dem Stande der Technik bekannt sind. Die Vorrichtung oder das Gerät kann ein Teströhrchen sein, eine Petrischale, Filterpapier oder ein Teststreifen mit den Zonen für die Reaktion. Die Vorrichtung oder das Gerät kann ferner eine Mikrotestplatte sein mit einer Vielzahl von vorgebildeten Testbehältnissen.
  • Der Kit kann ferner ein oder mehrere der folgenden Komponenten enthalten: ein in Wasser unlösliches trennungsspezifisches Bindungsreagenz, das eine andere Verbindung durch Reaktion, die für diese Verbindung spezifisch ist, unlöslich macht und sie von anderen Materialien abtrennt, mit Peroxidase markierte spezifische Bindungsverbindungen (wie z.B. mit Peroxidase markierte Antikörper), Waschlösungen, biotinylierte Antikörper, Pufferlösungen, Reagenzlösungen, Flaschen, Pipetten, Testgeräte, Vorfiltergeräte und andere Materialien, die dafür bekannt sind, in diagnostischen Kits verwendet zu werden, um Assays zu erleichern.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, bei dem ein bestimmbarer Komplex zwischen einem Liganden (einer Substanz, die bestimmt werden soll) und einem Rezeptor (einer Verbindung, die spezifisch mit dem Liganden reagiert) erhalten wird. In vorteilhafter Weise ist die Methode einfach und läßt sich in einer Arztpraxis oder in einem Verbraucherhaushalt unter Gewinnung unmittelbarer Ergebnisse durchführen. Der Test kann dazu angewandt werden, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines mono- oder multivalenten oder multideterminanten Liganden in einer wässrigen Flüssigkeit festzustellen, wie beispielsweise einer biologischen Flüssigkeit. Vorzugsweise wird die Erfindung angewandt, um einen multideterminanten Liganden, wie z.B. hCG zu bestimmen.
  • Ein monovalenter Ligand weist ein einzelnes epitopisches Zentrum für eine Komplexbildung auf. Ein multivalenter Ligand weist zwei oder mehrere epitopische Zentren für eine Komplexbildung mit einer Vielzahl des gleichen spezifischen Bindungsrezeptors auf. Ein multideterminanter Ligand weist zwei oder mehrere epitopische Zentren für die Komplexbildung mit einer Vielzahl von unterschiedlichen Rezeptoren auf.
  • Ganz speziell kann die vorliegende Erfindung dazu angewandt werden, um einen Liganden in wässrigen Flüssigkeiten zu bestimmen (qualitative oder quantitative Messung) wozu natürlich vorkommende oder auf synthetischem Wege erzeugte spezifische Bindungsrezeptoren gehören. Diese Bestimmung kann erfolgen dadurch, daß im wesentlichen das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Liganden festgestellt wird oder durch quantitative Bestimmung der Menge des Liganden. Insbesondere kann die Erfindung angewandt werden, um biologische Flüssigkeiten von Tieren, des Menschen oder von Pflanzen zu untersuchen, jedoch vorzugsweise die des Menschen. Zu derartigen Flüssigkeiten gehören, ohne daß eine Beschränkung hierauf beabsichtigt ist, ganzes Blut, Plasma, Serum, Lymphflüssigkeit, Gallenflüssigkeit, Urin, spinale Flüssigkeit, seminale Flüssigkeit, Tränenflüssigkeit, vaginale Abscheidungen, Sputum, Schweiß und dergleichen wie auch Stuhlproben. Es ist ferner möglich flüssige Präparate von menschlichem oder tierischem Gewebe zu analysieren, wie beispielsweise des skelettalenMuskels, des Herzens, der Niere, der Lungen, des Gehirns, des Knochenmarks, der Haut und dergleichen.
  • Der Ligand von Interesse kann eine immunologische Spezies sein, die (1) aus einer beliebigen Substanz besteht, die wenn sie mit einem immunokompetenten Wirt zusammengebracht wird zur Ausbildung eines spezifischen Antikörpers führt, der dazu befähigt ist, eine Bindung mit der Substanz einzugehen, oder (2) es handelt sich um den so erzeugten Antikörper, wobei der Ligand an der Antigen-Antikörperreaktion teilnimmt. Im Falle mancher Ausführungsformen wird Avidin, Biotin oder ein Avidin- oder Biotinderivat oder ein Enzym oder eine andere Markierung in geeigneter Weise an das Rezeptormolekül gebunden, das spezifisch mit dem Liganden reagiert.
  • Zu repräsentativen, erfindungsgemäß bestimmbaren Liganden gehören primäre Amine, Aminosäuren, Peptide, Polypeptide, Proteine, Lipoproteine, Glycoproteine, Arzneimittel, Haptene, Enzyme, Steroide, Lipide, Nukleinsäuren, Hormone, Vitamine, Polysaccharide, Glykolipide, Alkaloide, Organismen (Bakterien, Protozoen, Pilze, Viren, einschließlich Retroviren, Rickettsia und dergleichen) sowie Verbindungen hiervon, Blutkomponenten, Gewebe und Organ- Antigene sowie andere Materialien, die dem Fachmann bekannt sind. In manchen Fällen ist der Ligand ein Antikörper, der gegen ein Arzneimittel, Hormon, Antibiotikum oder eine andere Verbindung mit antigenen Eigenschaften gerichtet ist. Alternativ kann der Ligand ein antigenes Material sein. Im Falle einer weiteren anderen Ausführungsform ist die immunologische Spezies ein Antikörper, der gegen einen anderen Antikörper gerichtet ist (d.h. ein Anti-Antikörper). Verwendet werden können sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper und sie können aus ganzen Molekülen bestehen oder aus verschiedenen Fragmenten hiervon. Vorzugsweise werden in den Assays monoklonale Antikörper verwendet.
  • Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform eignet sich das Verfahren für die Bestimmung von hCG als einem frühen Indikator der Schwangerschaft. Im Falle dieser Ausführungsform werden ein oder mehrere unterschiedliche Antikörper für hCG in dem Testgerät immobilisiert, um Reagenzien bereitzustellen, für die Bildung eines Komplexes mit hCG an verschiedenen epitopischen Zentren.
  • Ganz allgemein wird das Verfahren dieser Erfindung durchgeführt durch Kontaktieren eines mit einer Peroxidase markierten Rezeptors für einen Liganden, der von Interesse ist, mit einer Probe der Flüssigkeit, von der erwartet wird, daß sie den Liganden enthält, der Art, daß ein Reaktionsprodukt von einem Liganden, der vorhanden ist und dem Rezeptor in der Testvorrichtung erzeugt wird. Im allgemeinen wird die flüssige Probe einer Testzone eines Testgerätes zugeführt oder in einem Testbehältnis plaziert, je nach der Konfiguration der Vorrichtung. Das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Reaktionsproduktes wird dann in geeigneter Weise nach Kontakt mit der einen Farbstoff liefernden Zusammensetzung gemäß dieser Erfindung ermittelt und nach Trennung des Reaktionsproduktes von nicht umgesetzten Materialien. Die Trennung kann erfolgen vor, nach oder gleichzeitig mit der farbstoffbildung.
  • Das Verfahren der Erfindung kann ein kompetitiver Bindungsimmunoassay sein unter Verwendung von sowohl markiertem als auch nicht markiertem Rezeptor. Es können entweder gebundene (d.h. komplexgebundene) oder ungebundene (d.h. nicht Komplex gebundene) Materialien bestimmt werden. Eine physikalische Trennung von gebundenen und ungebundenen Materialien kann falls erwünscht durchgeführt werden, unter Anwendung jeder geeigneten Trennungs technik.
  • Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Verfahren aus einem Verfahren, das aus dem Stande der Technik als immunometrisches Bestimmungsverfahren oder immunometrischer Assay bekannt ist.
  • Die Details derartiger Assays finden sich in der U.S.-Patentschrift 4 486 530. bin solcher Assay kann dazu angewandt werden, um multivalente oder multideterminante Liganden wie oben beschrieben zu bestimmen, d.h. solche mit zwei oder mehreren epitopischen Zentren für eine immunologische Reaktion mit zwei oder mehreren Rezeptormolekülen. Im Falle des Sandwich-Assays wird ein zweiter Rezeptor in Kontakt mit dem Liganden gebracht, und zwar entweder vor, gleichzeitig mit oder nach dem Kontakt des Liganden mit dem Testgerät (und infolgedessen Kontakt des Liganden mit dem ersten Rezeptor). Das Ergebnis besteht in der Bildung eines Komplexes aus den zwei ausgeprägten Rezeptoren mit dem Liganden. Vorzugsweise ist mindestens einer der Rezeptoren biotinyliert. In besonders vorteilhafter Weise ist der erste Rezeptor biotinyliert. Der erhaltene Komplex wird unlöslich gemacht, wenn das Avidin auf einer unlöslichen Phase und Biotin als Teil des ersten Rezeptors reagieren und der erhaltene unlöslich gemachte Komplex kann von nicht umgesetztem Material in der Testvorrichtung abgetrennt werden. Einer der Rezeptoren oder die unlösliche Phase kann in geeigneter Weise für die Bestimmung des unlöslich gemachten Komplexes markiert sein.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein Verfahren für die Bestimmung von hCG in einer wässrigen Flüssigkeit die folgenden Stufen:
  • A. Das Kontaktieren einer Probe der Flü.ssigkeit mit einer Testvorrichtung mit einem in Wasser unlöslichen Substrat mit einer oder mehreren Testzonen, wobei in mindestens einer der Testzonen ein biotinylierter Antikörper für hCG vorliegt unter Erzeugung eines Reaktionsproduktes von hCG mit dem biotinylierten Antikörper an einem ersten epitopischen Zentrum,
  • B. das Kontaktieren der Flüssigkeitsprobe vor, gleichzeitig mit oder nach Durchführung der Kontaktstufe (A) mit einem zweiten Antikörper für hCG, der markiert ist und der mit hCG an einem zweiten epitopischen Zentrum reagiert, unter Erzeugung eines Komplexes von hCG mit den ersten und zweiten Antikörpern,
  • C. das Kontaktieren des Komplexes mit einem unlöslich machenden trennungsspezifischen Reagenz mit einer unlöslichen Phase, an die Avidin gebunden ist, unter Bildung eines unlöslichen Komplexes durch Reaktion von Avidin mit Biotin,
  • D. das Kontaktieren des Komplexes vor, gleichzeitig mit oder nach der Kontaktstufe (C) mit der einen Farbstoff liefernden Zusammensetzung, die hier beschrieben wird, in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid,
  • E. die Trennung des erhaltenen markierten unlöslich gemachten Komplexes von nicht umgesetzten Materialien, und
  • F. die Bestimmung der Gegenwart oder der Abwesenheit des markierten, unlöslichen Komplexes durch Messung der Menge an Farbstoff, der mit dem Komplex assoziiert ist.
  • Dieses Verfahren läßt sich in einer Arztpraxis durchführen oder auch zu Hause, und zwar für eine frühe Bestimmung der Schwangerschaft durch Untersuchung von Urinproben.
  • Die folgenden Beispiele sind repräsentativ für das Verfahren dieser Erfindung und sollen den Bereich der Erfindung nicht beschränken.
    • Beispiel 1: Farbstoffliefernde Zusammensetzung, die sich für die Bestimmung von leutinisierendem Hormon eignet
  • Die folgende einen Farbstoffliefernde Zusammensetzung eignet sich zur Bestimmung von LH in der Praxis dieser Erfindung.
  • Eine Lösung von 4,5-Bis(4-methoxyphenyl)-2-(3,4- dimethoxy-4-hydroxy)imidazol-Leukofarbstoff in Methanol (15 mg/ml) wurde hergestellt. Eine Probe dieser Lösung (5 ml) wurde zu 500 ml einer Lösung zugegeben, die enthielt: Natriumdihydrogenphosphat (100 mmolar, pH-Wert 7), Polyvinylpyrrolidon (1%), Diethylentriaminpentaessigsäure-Chelat bildner (5 mmolar), Wasserstoffperoxid (5 mmolar) und 4'-Hydroxyacetanilid-Elektronenübertragungsmittel (5 mmolar), eingestellt auf einen pH-Wert von 7 unter Verwendung von Natriumhydroxid.
    • Beispiel 2: Farbstoffliefernde Zusammensetzung, die sich für die Bestimmung von hCG eignet
  • Die folgende Zusammensetzung wurde hergestellt und zur Bestimmung von hCG gemäß der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet.
  • Es wurde eine erste wässrige Lösung hergestellt mit Natriumdihydrogenphosphat (10 mmolar), Diethylentriaminpentaessigsäure-Chelatbildner (10 umolar) und 4'-Hydroxyacetanilid-Elektronenübertragungsmittel (5 mmolar). Diese Lösung wurde auf einen pH-Wert von 6,8 mit 10 molarer Natriumhydroxidlösung eingestellt.
  • Eine zweite wässrige Lösung wurde hergestellt mit 20% (w/w) Polyvinylpyrrolidon sowie 0,01% des Leukofarbstoffes des Beispieles 1.
  • Ein Gewichtsteil der zweiten Lösung wurde zu 19 Teilen der ersten Lösung zugegeben. Wasserstoffperoxid (30%, 9,7 molar) wurde zugegeben um eine Endkonzentration von 10 mmolar Wasserstoffperoxid einzustellen.
    • Beispiel 3: Assay von Urin für hCG Herstellung des unlöslich machenden Reagenz:
  • Die im folgenden angegebenen Lösungen wurden kontinuierlich in einen 1.365 ml fassenden Kessel gegeben, der deoxygeniertes Wasser bei 80ºC enthielt, wobei die Zugaben mit den angegebenen Geschwindigkeiten erfolgten:
  • Lösung 1: Styrol (739 g), m & p-(2-Chloroethylsulfonylmethyl)styrol (82 g) und 1-Dodecanthiol (8,2 g) bei 2,5 g/Min., über einen Zeitraum von 380 Minuten.
  • Lösung 2: Ammoniumpersulfat (19,7 g) und destilliertes, deoxygeniertes Wasser (1.152 g) bei einer Geschwindigkeit von 2,14 g/Min. über einen Zeitraum von 380 Minuten.
  • Lösung 3: Natriumpyrosulfit (9,9 g) und destilliertes Wasser (1.152 g) mit einer Geschwindigkeit von 2,27 g/Min. über einen Zeitraum von 380 Minuten.
  • Nach 380 Minuten wurde die Reaktion abgebrochen, unter Gewinnung von etwa 1.218 g Latex bei. einem Feststoffgehalt von 33,4%. Der Latex wurde drei Tage lang dialysiert, unter Gewinnung eines Latex mit einem Feststoffgehalt von 27,3% und einem pH-Wert von 5. Dieser Latex wurde auf einen Feststoffgehalt von 13,5% verdünnt. Eine NMR-Analyse bestätigte ein molares Verhältnis von 96:4 von Styrol zu dem zweiten Monomer. Die erhaltenen Latexteilchen hatten einen mittleren Durchmesser von etwa 0,67 um, ermittelt durch Transmissions-Elektronen-Mikroskopie.
  • Eine Probe (0,75 ml) des oben beschriebenen Latex wurde mit Boratpuffer (50 mmolar, pH-Wert 8,5) auf 20 ml verdünnt, worauf Avidin (5 mg) zugegeben wurde. Die erhaltene Suspension wurde durch Schütteln über Kopf bei 37ºC 18 Stunden lang bewegt, worauf zentrifugiert wurde. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und die Teilchen wurden einmal mit Puffer durch Zentrifugieren gewaschen und in 10 ml Boratpuffer resuspendiert. Eine Biotin-Bindungsanalyse (d.h. Titration mit Tritium markiertem Biotin) ergab, daß Avidin kovalent an die Teilchen gebunden war (7 x 10&sup6; molare Bindungszentren pro 0,3% Kügelchen Suspension) unter Bildung eines Reagenz der vorliegenden Erfindung.
  • Eine Testvorrichtung wurde dazu verwendet, um hCG in einer Urinprobe in folgender Weise zu bestimmen: Das Gerät enthielt drei Testbehältnisse mit jeweils einer Filtermembran aus einer handelsüblichen Nylonmembran, die mit succinyliertem Casein (1,07 g/m²) beschichtet worden war.
  • Ein negatives Vergleichs-Testbehältnis des Testgerätes enthielt MOPS-Puffer (2 mg) in einem Polyacrylamidbindemittel (60 ug). Der MOPS-Puffer bestand aus 3-(N-Morpholin)propansulfonsäure (pH-Wert 7,5). Das Testprobenbehältnis enthielt biotinylierte Anti-hCG-Antikörper (3 ug) die darin immobilisiert waren sowie eingeführtem MOPS-Puffer in einer separaten Stelle. Ein positives Vergleichs-Testbehältnis enthielt biotinylierte Anti-hCG-Antikörper (3 ug), MOPS-Puffer (2 mg) in einer separaten Position hierin sowie hCG (400 mI.E.).
  • Eine Urinprobe, vorgefiltert zum Zwecke der Entfernung von Verunreinigungen sowie mit einem Gehalt von etwa 50 ml.E./ml hCG wurde zu jedem Testbehältnis der Testvorrichtung zugegeben, worauf mit Peroxidase markierte Anti-hCG-Antikörper (40 ul einer 10&supmin;&sup9; molaren Lösung) zugegeben wurden. Nach einer Inkubationsdauer von einer Minute wurde das oben beschriebene unlöslich machende Reagenz zugegeben (40 ul einer 0,42%igen Dispersion), wobei die Zugabe zu jedem Testbehältnis erfolgte und die Flüssigkeit wurde im Falle eines jeden Testbehältnisses durch die Membran ablaufen gelassen.
  • Nach dem Waschen wurde eine Leukofarbstofflösung (40 ul) wie in Beispiel 2 beschrieben zu jedem Testbehältnis zugegeben. Nach zwei Minuten wurde die Farbe, die sich auf der Membran in jedem Testbehältnis gebildet hatte gemessen, unter Verwendung einer standardisierten Reflektionsvorrichtung sowie Verfahren, worauf die Werte in Durchlässigkeitsdichten umgerechnet wurden, unter Anwendung der Gleichung von Williams-Clapper. Die Menge an gemessenem Farbstoff war ein Anzeichen für die Menge an hCG in der getesteten Urinprobe.
    • Beispiel 4: Assay für leutiniszierendes Hormon (LH) Immobilisierung von Avidin auf Teilchen:
  • Eine Lösung (50 ml, 0,05 molar, pH-Wert 8,5) von Boratpuffer enthaltendem Thiomersal (0,01%) wurde in ein Zentrifugierungsröhrchen aus Polypropylen gebracht und es wurden 6 ml einer Lösung von Eiweiß-Avidin (6 mg), gelöst in 6 ml deionisiertem destilliertem Wasser zugegeben. Das Röhrchen wurde dann verschlossen und kräftig geschüttelt, worauf 1,35 ml einer Dispersion (15,5% Feststoffe) von Poly- [styrol-co-m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl)styrol] (molares Verhältnis 95,5:4,5)-Kügelchen (mittlere Größe 2,54 Mikroiiieter) zugegeben wurden und das Röhrchen 24 Stunden lang über Kopf in Rotation versetzt wurde.
  • Die Polymer-Kügelchen mit kovalent gebundenem Avidin wurden gewaschen mit Glyzinpuffer (0,1 molar, pH-Wert 8,5) enthaltendem 0,01%igem Thiomersal, und dann in Glyzinpuffer (0,1 molar) resuspendiert, der 0,01% Thiomersal enthielt, unter Erzeugung einer Dispersion mit einem unlöslichen trennungsspezifischen Bindungsreagenz (0,3% Feststoffe).
    • Assay für LH:
  • Eine Testvorrichtung mit drei Testbehältnissen entsprechend derjenigen wie sie in Beispiel 3 beschrieben wurde, mit einer 5 um Nylon-Filtermembran in jedem Testbehältnis, die mit Casein vorbehandelt worden war, wurde in diesem Assay verwendet. In diesem Assay wurden ferner verwendet:
  • ein biotinylierter Antikörper für LH (0,044 mg/ml in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung), hergestellt ähnlich wie der biotinylierte Antikörper für hCG wie oben beschrieben, ein mit Meerrettich-Peroxidase markierter Antikörper für LH (0,0015 mg/ml in einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung, enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin), sowie das oben beschriebene Reagenz mit Avidin auf Kügelchen (0,9% Feststoffe, pH-Wert 8,5).
  • In diesem Assay wurden mehrere Urinproben getestet:
  • (a) Eine Probe, die am 13. Tag eines weiblichen menstrualen Zyklus entnommen wurde mit 18 mI.E. LH/ml, und
  • (b) eine Probe, die am 14. Tage des weiblichen menstrualen Zyklus entnommen wurde, mit 64 mI.E. LH/ml.
  • Beide dieser Proben stammten von der gleichen Person und der LH-Gehalt wurde bestimmt mittels eines LH-Radioimmunoassay-Kits, erhältlich von der Firma Diagnostic Products Corporation.
  • Eine Mischung der Urinprobe (a) (200 ml), des mit Peroxidase markierten Antikörpers (35 ml) und des biotinylierten Antikörpers (10 ml) wurde hergestellt und bei Raumtemperatur 2 Minuten lang inkubiert. Das unlöslich gemachte Avidin- Reagenz (40 ml) wurde dann zu der Mischung zugegeben und die Inkubierung wurde weitere 5 Minuten lang fortgesetzt. Die Mischung wurde dann in eines der Testbehältnisse der Testvorrichtung überführt und Flüssigkeit und nicht umgesetzte Materialien wurden ablaufen gelassen, wobei der unlöslich gemachte Komplex, der sich während der Inkubation auf der Filtermembran gebildet hatte, zurückblieb. Das zurückgebliebene unlöslich gemachte Produkt wurde dann zweimal mit einer Phosphat abgepufferten Salzlösung (125 ml) gewaschen, die enthielt 0,1% TWEEN 20 als oberflächenaktivem Mittel, (ein Polyoxyethylensorbitanmonolaurat), von neue filtriert und dann kontraktiert mit der einen Farbstoffliefernden Zusammensetzung von Beispiel 1 (560 ul).
  • Die Urinprobe (b) wurde in entsprechender Weise untersucht, unter Verwendung eines zweiten Testbehältnisses der gleichen Testvorrichtung.
  • In beiden Testbehältnissen war eine Farbe auf der Filtermembran innerhalb von 5 Minuten erkennbar. Der Farbton in dem ersten Testbehältnis war hell pink, wohingegen der Farbton in dem zweiten Testbehältnis kräftig rot war.
    • Beispiel 5: ELISA-Bestimmung von Streptokokkus-A- Antigen nach Extraktion mit Zitronensäure
  • Ein Isolat von Streptokokkus A (20 ul), erhalten aus einem örtlichen Hospital wurde behandelt, um Antigen zu extrahieren, und zwar eine Minute lang bei 25ºC unter Verwendung einer Lösung von Natriumnitrit (8 molar, 120 ul) sowie Zitronensäure (1,2 molar, 10 ul). Die Extraktionslösung wurde dann neutralisiert unter Verwendung von 120 ul einer Lösung von 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurepuffer (2 molar) und Ethylendiamintetraessigsäure (25 mmolar, pH-Wert 7,5).
  • Eine Nylonmembran, die in eine Wegwerf-Vorrichtung eingesetzt worden war, wurde mit succinyliertem Casein (1,07 g/m²) beschichtet.
  • Eine IgG-Fraktion von Kaninchen-Antiserum für Streptokokkus A (Bacto Streptokokkus Antiserum, Group A Lot 12672-50, von der Firma Difco Labs) wurde durch Ausfällung mit 45%iger gesättigter Ammoniumsulfatlösung und anschließende Dialyse zur Entfernung des überschüssigen Salzes gereinigt. Die gereinigte IgG-Fraktion wurde dann auf Poly[styrol-co-m & p-(2-chloroethylsulfonylmethyl). styrol) Kügelchen (molares Verhältnis 90:10) immobilisiert, unter Gewinnung einer Dispersion des Reagenz (0,3% Feststoffe) in einem 0,05 molaren Glycinpuffer (pH-Wert 8,5), enthaltend 0,01% Thimerosal als Schutzmittel.
  • Die gereinigte IgG-Fraktion wurde ferner bezüglich Meerrettich-Peroxidase konjugiert, unter Verwendung von Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat, und zwar nach einem Verfahren, ähnlich der Methode von Voshitake und Mitarbeitern (Eur.J.Biochem.101, 395-399, 1979), worauf verdünnt wurde, unter Gewinnung einer Lösung des Konjugates, enthaltend 9 ug/ml IgG in 0,1% Casein.
  • Die Kügelchen-Suspension (40 ul) wurde in die Wegwerf Vorrichtung eingebracht, worauf der Antigen-Extrakt (40 ul), 0,1% Casein (120 ul) und Konjugat (20 ul) zugegeben wurden. Die Mischung wurde zur Inkubierung auf der Membran zwei Minuten bei 25ºC stehengelassen. Dann wurde die Membran mit einer mit Phosphat abgepufferten Salzlösung (320 ul) gewaschen, worauf eine einen Farbstoffliefernde Zusammensetzung zugegeben wurde mit dem Leukofarbstoff 2-(4-Hydroxy- 3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol (0,005 Gew.-%), Natriumphosphat (5 mmolar, pH-Wert 6,8), Polyvinylpyrrolidon (1%), Wasserstoffperoxid (10 mmolar), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mmolar) und Diethylentriaminpentaessigsäure (10 mmalar). Nach 3 Minuten und einer weiteren Wäsche wurde der Farbstoff auf der Membran durch Reflektion ermittelt. Die Ablesungen wurden in DT Werte überführt, unter Anwendung der Gleichung von Williams- Clapper. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle unten dargestellt als die Mittelwerte von 2 oder 3 Versuchen im Falle einer jeden Konzentration (koloniebildende Einheiten, CFU) von Antigen. TABELLE CFU STREPTOKOKKUS DER GRUPPE A Keine Zellen (Hintergrund)

Claims (10)

1. Farbstoffliefernde Zusammensetzung mit einem wasserlöslichen oder -dispergierbaren Polymer,
dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Elektronenübertragungsmittel und einen Imidazol-Leucofarbstoff, der einen Farbstoff in Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einer peroxidativen Substanz zu erzeugen vermag, enthält,
wobei das Gew.-Verhältnis von Polymer zu Leucofarbstoff bei 10000:1 bis 100:1 liegt, und wobei das Polymer ein Vinylpyrrolidonpolymer, Acrylamidpolymer, Acrylsäure- oder Methacrylsäurepolymer, Polyethylenglykol oder ein Polyamin ist.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, in der das Elektronenübertragungsmittel eine phenolische Verbindung ist.
3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, abgepuffert auf einen pH-Wert von 6 bis 8.
4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der der Leucofarbstoff ein Triarylimidazol ist.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der das Polymer ein Vinylpyrrolidonhomo- oder -copolymer ist.
6. Diagnostischer Testkit für die Bestimmung eines Analyten als Ergebnis der katalytischen Aktivität von Peroxidase, wobei der Kit enthält:
(a) ein Substrat für Peroxidase, und
(b) eine einen Farbstoffliefernde Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
7. Kit nach Anspruch 6, weiter enthaltend ein Testgerät mit einem wasserunlöslichen Substrat mit einer oder mehreren Testzonen.
8. Kit nach einem der Ansprüche 6 oder 7, weiter enthaltend eine mit Peroxidase markierte spezifische Bindungs-Verbindung.
9. Verfahren zur Bestimmung eines Liganden in einer wäßrigen Flüssigkeit, bei dem man:
A. eine Probe einer Flüssigkeit mit einem mit Peroxidase markierten Rezeptor für den Liganden in Kontakt bringt unter Erzeugung eines Reaktionsproduktes aus dem Liganden und dem Rezeptor, bei dem man
B. vor, gleichzeitig mit oder nach der Kontaktierungsstufe (A) die flüssige Probe mit einer einen Farbstoffliefernden Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kontakt bringt, bei dem man
C. vor, gleichzeitig mit oder nach der Kontaktierungsstufe (B) das Reaktionsprodukt von nicht umgesetzten Materialien trennt, und bei dem
D. das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Reaktionsproduktes bestimmt.
10. Verfahren nach Anspruch 9 für die Bestimmung von hCG in einer Urinprobe, bei dem der mit Peroxidase markierte Rezeptor ein mit Peroxidase markierter Antikörper bezüglich hCG ist.
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