DE69113872T2

DE69113872T2 - Biologisch aktive Reagenzien aus Carboxylgruppenhaltigen Polymerisaten, analytisches Element und Verfahren zur Verwendung.

Info

Publication number: DE69113872T2
Application number: DE69113872T
Authority: DE
Inventors: Susan Jean Danielson; John Bruce Findlay; Fred Terry Oakes; Marsha Denise Bale Oenick; Ignazio S Ponticello; Richard Calvin Sutton; Harold Chester Warren
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1990-06-18
Filing date: 1991-06-10
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2011-06-11
Also published as: US5147777A; DE69113872D1; JPH0717697B2; KR920001202A; IE912079A1; ATE129347T1; EP0462644B1; FI912960A0; JPH04339808A; CA2043089A1; EP0462644A1; FI912960A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft biologisch aktive Reagenzien, die unter Verwendung polymerer Teilchen hergestellt werden. Sie betrifft ebenfalls analytische Elemente, die solche Reagenzien enthalten, und Immunoassays und spezifisch bindende analytische Verfahren, bei denen sie verwendet werden. Darüber hinaus betrifft sie ein analytisches Reinigungsverfahren, bei dem die Reagenzien verwendet werden. Diese Erfindung kann für verschiedene klinische, diagnostische, medizinische und Forschungszwecke verwendet werden.
Es besteht ein ständiges Bedürfnis in der medizinischen Praxis und in der Forschung und in analytischen und diagnostischen Verfahren nach raschen und genauen Bestimmungen chemischer und biologischer Substanzen, die in verschiedenen Flüssigkeiten, wie beispielsweise biologischen Flüssigkeiten, vorliegen. Das Vorliegen von Arzneistoffen, Narkotika, Hormonen, Steroiden, Polypeptiden, Metaboliten, Toxinen, Viren, Mikroorganismen oder Nukleinsäuren in menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeiten oder Geweben muß beispielsweise für eine wirksame Untersuchung, Diagnose oder Behandlung rasch und genau festgestellt werden.
In den letzten etwa zwanzig Jahren ist eine große Anzahl analytischer Verfahren zum Nachweis der zuvor angegebenen Substanzen entwickelt worden. Im allgemeinen ist der Stand der Technik in einem solchen Maße fortgeschritten, daß analytische und diagnostische Verfahren äußerst zuverlässig geworden sind und zur Automatisierung geeignet sind oder zur Verwendung in Testkits, die in Arztpraxen oder zu Hause ohne weiteres angewendet werden können. Die meisten dieser Verfahren beruhen auf dem, was im Stand der Technik als "spezifisch bindende" Reaktionen bekannt ist, bei denen eine unbekannte Substanz, die nachzuweisen ist (bekannt als "Ligand") spezifisch und bevorzugt mit einem entsprechenden "Rezeptor"-Molekül reagiert. Die am besten bekannten spezifisch bindenden Reaktionen finden zwischen immunologischen Reaktionspartnern statt, wie Antikörpern und Antigenen (Fremdsubstanzen, die immunologische Antworten hervorrufen), es sind aber auch andere spezifisch bindende Reaktionen (wie beispielsweise zwischen Avidin und Biotin und einem Zucker mit einem Lectin) gut bekannt.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, bei denen spezifisch bindende Reaktionen verwendet werden, erfordern im allgemeinen, daß einer oder mehrere oder beide Reaktanten auf einem festen Substrat einer beliebigen Art immobilisiert sind, so daß nicht umgesetzte (im allgemeinen wasserlösliche) Materialien dann von dem wasserunlöslichen Reaktionsprodukt (oftmals als "Komplex" bezeichnet) abgetrennt werden können. Darüber hinaus können solche immobilisierten Reaktanten in der Affinitätschromatographie verwendet werden, um ein gewünschtes biologisch aktives Material aus einem Gemisch solcher Materialien zu entfernen.
Biologisch aktive Substanzen sind auf diese Weise vorteilhafterweise auf teilchenförmigen Substraten immobilisiert worden, wie polymeren Teilchen, tierischen oder menschlichen Erythrozyten, Bakterienzellen und anderen festen, aus dem Stand der Technik bekannten Materialien. Beispielsweise sind Trägerpartikel, die aus epoxygruppenhaltigen Monomeren hergestellt sind, in der US-A-4,415,700 beschrieben. Wenn polymere Teilchen als Trägersubstrate verwendet worden sind, sind biologisch aktive Substanzen durch reaktive Gruppen auf der Teilchenoberfläche gebunden worden, wobei diese Gruppen entweder von der Polymerzusammensetzung oder von Linkergruppen, die an die Teilchen gebunden sind, bereitgestellt werden. In der US-A-4,401,765 sind eine Reihe reaktiver Gruppen auf polymeren Teilchen beschrieben.
Verschiedene Verbesserungen des Stands der Technik sind diesbezüglich in der EP-A-0 323 692 und der EP-A-0 308 235 beschrieben. Diese Anmeldungen beschreiben verschiedene Mittel, um biologisch aktive Substanzen an polymere Teilchen zu binden, die verschiedene reaktive Oberflächengruppen aufweisen, einschließlich Oberflächencarboxygruppen, beispielsweise Gruppen, die durch Acryl- und Methacrylsäuren bereitgestellt werden.
Carboxylierte Latexpartikel sind ebenfalls zum Herstellen diagnostischer Reagenzien verwendet worden, wie in der US- A-4,181,636 angegeben ist. Die beschriebenen Teilchen werden unter Verwendung eines carboxylhaltigen Monomers hergestellt, wie Acrylsäure, Methacrylsäure, Itakonsäure, Akonitsäure, Fumarsäure oder Maleinsäure. Ähnliche Teilchen sind in der US-A-3,857,931, der US-A-4,138,383 und der US-A-4,264,766 beschrieben.
Zwei im Handel erhältliche Monomere, 3-Acrylamido- 3-methylbutansäure und 2-Acrylamido-2-hydroxyessigsäure, sind polymerisiert worden, um Polymere zu bilden. Diese Monomere sind üblicherweise wasserlöslich und mit oleophilen Monomeren schwierig zu copolymerisieren und werden nicht ohne weiteres unter Bildung monodisperser Teilchen polymerisiert.
Die Modifizierung der Proteinadsorption auf polymeren Oberflächen ist ein gemeinsames Ziel für viele Forscher geworden, die versuchen, Polymertechnologie in der Biotechnologie auf in vivo- und in vitro-Anwendungen anzuwenden. Die unerwünschte Proteinadsorption war ein ständiges Problem. Beispielsweise ist die nicht-spezifische Adsorption ein Hauptproblem bei der Verwendung von Polymeren für die Affinitätschromatographie zur Reinigung von Proteinen.
Die Modifizierung von Polymeroberflächen weist viele Formen auf, einschließlich materieller Überzüge, Propfcopolymerisation chemischer Behandlungen und Plasmagasentladungsbehandlung. Die hydrophile Natur der Polymeroberfläche war Gegenstand beträchtlicher Debatten und Untersuchungen, da eine Zunahme der Hydrophilie die Adsorption einiger Proteine vermindert, die von anderen jedoch nicht. Wie in dem zuvor zitierten stand der Technik angegeben ist, hat die Verwendung reaktiver Seitenketten in der Technik ebenfalls beträchtliche Aufmerksamkeit erhalten.
In der Technik besteht das Bedürfnis, neue biologische Reagenzien zu finden, die gegenüber Standardreagenzien, die aus carboxyhaltigen Standardpolymeren hergestellt sind, eine Verbesserung aufweisen. Derartige Reagenzien wären besonders brauchbar, wenn sie biologische Materialien zur Verwendung in der Forschung und verschiedenen analytischen und diagnostischen Verfahren gebunden aufweisen.
Die mit bekannten Reagenzien angemerkten Probleme werden mit einem biologisch aktiven Reagenz überwunden, das umfaßt:
(I) ein wasserunlösliches Teilchen, das, zumindest an seiner Oberfläche, aus einem Copolymer mit wiederkehrenden Einheiten zusammengesetzt ist, die abgeleitet sind von:
(a) 60 bis 99,8 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter, polymerisierbarer, oleophiler Monomerer, die dem Copolymer Hydrophobie verleihen,
(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter, polymerisierbarer Monomerer mit reaktiven Carboxygruppen oder einem Salz davon, und
(c) 0 bis 15 Molprozent eines oder mehrerer zusätzlicher ethylenisch ungesättigter, polymerisierbarer anderer Monomerer als der in den vorherigen Kategorien (a) und (b) angegebenen, und
(II) eine biologisch aktive Substanz, die durch die reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist,
wobei das Reagenz dadurch gekennzeichnet ist, daß Monomer (b), das eine reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon aufweist, dargestellt ist durch die Struktur:
CH&sub2;= -L- -O-M
in der R gleich Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, N gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linkergruppe ist, die in der Linkerkette 8 bis 50 Atome, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen, ist.
Diese Erfindung stellt auch ein analytisches Element bereit, das ein Substrat mit einer oder mehreren Reaktionszonen umfaßt,
wobei das Element dadurch gekennzeichnet ist, daß es in mindestens einer der Zonen ein biologisch aktives Reagenz, wie es zuvor beschrieben wurde, enthält.
Darüber hinaus umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung eines spezifisch bindenden Liganden:
A. Das Bilden eines wasserunlöslichen, spezifisch bindenden Komplexes eines spezifisch bindenden, interessierenden Liganden oder eines Rezeptors dafür, mit einem Reagenz, das umfaßt:
(I) ein wasserunlösliches Teilchen, das, zumindest an seiner Oberfläche, aus einem Copolymer mit wiederkehrenden Einheiten zusammengesetzt ist, die abgeleitet sind von:
(a) 60 bis 99,8 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter, polymerisierbarer, oleophiler Monomerer, die dem Copolymer Hydrophobie verleihen,
(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter, polymerisierbarer Monomerer, die eine reaktive Carboxygruppe aufweisen, oder ein Salz davon, und durch die Struktur dargestellt werden:
CH&sub2;= -L- -O-M
in der R gleich Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linkergruppe ist, die in der Linkerkette 8 bis 50 Atome, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen, aufweist, und
(c) 0 bis 15 Molprozent eines oder mehrerer zusätzlicher ethylenisch ungesättigter, polymerisierbarer anderer Monomerer als der in den vorherigen Kategorien (a) und (b) angegebenen, und
(II) eine biologisch aktive Substanz, die durch die reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist, wobei die Substanz mit dem Liganden oder einem Rezeptor dafür spezifisch reagiert, und
B. Nachweisen des Vorliegens des Komplexes als eine Indikation für das Vorliegen oder die Menge des Liganden in der Probe.
Die Erfindung stellt auch einen Test zum Bestimmen eines spezifisch bindenden Liganden bereit, umfassend:
Nachweisen des Vorliegens oder der Menge eines wasserunlöslichen, spezifisch bindenden Komplexes, der zwischen einem interessierenden Liganden und einem Rezeptor dafür gebildet wird, wobei der Rezeptor als eine Komponente eines Reagenzes bereitgestellt wird, das umfaßt:
(I) ein wasserunlösliches Teilchen, das, zumindest auf seiner Oberfläche, aus einem zuvor beschriebenen Copolymer zusammengesetzt ist, und
(II) daß der Rezeptor für den Liganden durch die reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist.
Darüber hinaus umfaßt ein Immunoassay, bei dem Antikörper oder Antigene zum Nachweis des Vorliegens oder der Menge eines Liganden in einer Probe verwendet werden, die Zugabe eines immunologischen Reaktionspartners, der mit dem Liganden oder mit einem Rezeptor dafür spezifisch reagiert,
wobei der immunologische Reaktionspartner eine Komponente eines Reagenzes ist, das umfaßt:
(I) ein wasserunlösliches Teilchen, das, zumindest an seiner Oberfläche, aus einem Copolymer wie zuvor beschrieben zusammengesetzt ist, und
(II) der immunologische Reaktionspartner durch die reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist.
Ein erfindungsgemäßes analytisches Trennungsverfahren umfaßt:
A. Leiten einer Probe, die ein Gemisch aus biologisch aktiven Substanzen enthält, über ein Affinitätschromatographiereagenz, das umfaßt:
(I) ein wasserunlösliches Teilchen, das, zumindest an seiner Oberfläche, aus einem Copolymer wie zuvor beschrieben zusammengesetzt ist, und
(II) eine spezifisch bindende Substanz, die durch die reaktive Carboxygruppe an das Teilchen kovalent gebunden ist, wobei die spezifisch bindende Substanz für eine oder mehrere vorbestimmte, biologisch aktive Substanzen in dem Probengemisch aus biologisch aktiven Substanzen spezifisch ist, um einen Komplex aus dem Reagenz mit den vorbestimmten Substanzen zu bilden, und
B. Sammeln der einen oder mehreren komplexierten vorbestimmten Substanzen oder der einen oder mehreren in dem Eluent verbleibenden Substanzen.
Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien bereit, die in einer Vielzahl von analytischen, diagnostischen und Reinigungsverfahren brauchbar sind. Diese Reagenzien sind Verbesserungen gegenüber bekannten Reagenzien, die unter Verwendung von carboxyhaltigen Standardpolymeren hergestellt werden.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die Verwendung bestimmter Polymere erhalten, die eine Carboxygruppe aufweisen, die von der Copolymeroberfläche in einer ausreichenden Länge herausragt, um verbesserte Ergebnisse bei der Bindung biologisch aktiver Substanzen und ihrer nachfolgenden Verwendung zu ermöglichen. Daher weist die in der zuvor angegebenen Struktur als "L" bezeichnete organische Gruppe eine kritische Länge von 8 bis 50 Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen auf.
Die herausragenden hydrophilen Carboxygruppen auf den Monomeren, die zum Herstellen der Copolymere verwendet werden, bieten gegenüber aus dem Stand der Technik bekannten Monomeren, die kürzere Carboxygruppen aufweisen, bestimmte Vorteile. Während der Emulsionspolymerisation weisen die verbesserten Monomere eine geringere Tendenz auf, in der wäßrigen Phase als Lösungspolymere (oder wasserlösliche Polymere) zu polymerisieren. Auf diese Weise werden die verbesserten Monomere einfacher und vollständiger in wasserunlösliche Latexpartikel eingebaut und erleichtern dadurch das Binden von Proteinen oder anderen biologischen Verbindungen. Aus Acrylsäure hergestellte Latices enthalten unerwünschtes lösliches Polymer in der wäßrigen Phase, die für einige Verwendungen unter beträchtlichen Kosten entfernt werden müssen. Die hier beschriebenen verbesserten Monomere bilden weniger wasserlösliches Polymer.
Darüber hinaus sind die Reaktivitätsverhältnisse der bei der Durchführung dieser Erfindung verwendeten bevorzugten Monomere, d. h. derjenigen, die aromatische Gruppen als Teil von L (wie Styrolderivate) aufweisen, günstiger als bei bekannten carboxyhaltigen Monomeren für die Polymerisation mit aromatischen Comonomeren, wie Styrol und Styrolderivaten. Darüber hinaus ermöglichen es die verlängerten Linkergruppen den Carboxygruppen, leichter durch Carbodiimide oder andere Aktivierungsagentien aktiviert zu werden, wenn biologische Verbindungen an die Teilchen gebunden werden.
Die erfindungsgemäßen Copolymere weisen als eine wesentliche Komponente wiederkehrende Einheiten auf, die abgeleitet sind von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren, die die folgende Struktur aufweisen:
CH&sub2;= -L- -O-M
in der R gleich Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linkergruppe ist, die in der Linkerkette 8 bis 50 Kohlenstoff-, Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatome aufweist. Es kann, falls gewünscht, ein Monomerengemisch verwendet werden, obwohl vorzugsweise lediglich ein solches Monomer zur Herstellung eines jeden Copolymeren verwendet wird.
Insbesondere ist in der zuvor angegebenen Struktur R gleich Wasserstoff, Halogen (wie Chlor oder Brom) oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (wie Methyl, Ethyl, Isopropyl und n-Propyl). Bevorzugterweise ist R gleich Wasserstoff oder Methyl.
Ebenso ist M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion (wie Lithium, Natrium und Kalium) oder ein Ammoniumion (wie Ammonium, Tetramethylammonium und Tetraethylammonium). Vorzugsweise ist M gleich Wasserstoff oder ein Alkalimetallion, und bevorzugter ist es Wasserstoff oder Natrium.
L ist eine organische Linkergruppe, die in der Kette 8 bis 50 Atome einer Kombination aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- oder Schwefelatomen aufweist. Die Verknüpfung umfaßt zwei oder mehr divalente Kohlenwasserstoffgruppen, wie Alkylen, Arylen, Alkylenarylen, Arylenalkylen und ähnliche Gruppen, die mit den genannten Heteroatomen oder mit Gruppen, die Heteroatome enthalten, wie Carbonyl, Sulfonyl, Imino und anderen aus dem Stand der Technik bekannten, verbunden sind oder diese als Endgruppen aufweisen. Solche Kohlenwasserstoffgruppen können von 1 (wie Methylen) bis zu 12 Kohlenstoffatomen aufweisen und können verzweigt, linear oder cyclisch, mit einer oder mehreren Alkylgruppen (vorzugsweise von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl, Isopropyl, Hexyl und Octyl), Alkoxy (vorzugsweise von 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie Methoxy, Ethoxy, Propoxy, t-Butoxy und Octyloxy), Cycloalkyl (vorzugweise von 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Cyclobutyl, Cyclohexyl und Cyclopentyl), Aryl (vorzugweise von 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie Phenyl, Tolyl, Xylyl, Naphthyl, 4-Methoxyphenyl und Chlorphenyl) substituiert sein oder unsubstituiert sein. Solche Gruppen sind für den Fachmann der präparativen Chemie nicht schwierig zu gestalten oder zu synthetisieren.
Vorzugsweise umfaßt L zwei oder mehr Alkylen- oder Arylenalkylengruppen, die mit einer Oxy-, Thio-, Imino (-NR¹-), Carbonyloxy- (-COO-), Carbonylimino- (-CONR¹-), Ureylen- (-NR¹CONR¹-) oder Sulfonyliminogruppe (-SO&sub2;NR¹-) verbunden sein oder diese als Endgruppe aufweisen, wobei jedes R¹ in den genannten Gruppen unabhängig voneinander Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (wie Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-Butyl, Hexyl, Benzyl und 2,4-Dimethylpentyl), Cycloalkyl mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen im Rückgrat (wie Cyclopentyl, Cyclohexyl und 1,3-Dimethylcyclohexyl) oder Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen im Rückgrat (wie Phenyl, Xylyl, p-Chlorphenyl, Naphthyl und Anthryl) ist.
Repräsentative L-Gruppen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt:
p-Phenylenmethylenoxycarbonyltrimethylen, Carbonyloxyethylenoxycarbonyltrimethylen, Carbonyloxyethylenureylenpentamethylen, Carbonylpenta(oxyethylen)oxycarbonyltrimethylen, Carbonyldeca(oxyethylen)oxycarbonyltrimethylen, p-Phenylenmethylenthioethylenoxycarbonyltrimethylen, Carbonyloxyethyleniminocarbonyltrimethylen, Carbonyloxytetramethylenoxycarbonyltetramethylen, p-Phenylenmethyleniminocarbonyltrimethylen, p-Phenylenmethyleniminocarbonyltrimethylen, p-Phenylen(methyl)iminoethylenoxycarbonyltrimethylen, p-Phenylenmethylenthioethylen, p-Phenylenmethylenthioethyleniminocarbonylmethylenoxymethylen, p-Phenylenmethylenthioethyleniminocarbonylmethylenthiomethylen, p-Phenylenmethylenthioethyleniminocarbonyltrimethylen, Phenylenmethylenthio-1-carboxyethylen, Phenylenmethylenthiophenylen, Phenylenmethylenthioethylenoxyethylenthiomethylenoxycarbonylethylen, Phenylenmethylenoxyphenylenmethylenthioethylen, Phenylenmethylenthioethylenoxyethylenthioethylenoxycarbonylethylen, Phenylenmethylenoxyphenylenmethylenthiophenylenmethylenthiotrimethylen und Phenylenmethylenthioethylenoxyethylenthioethylenoxycarbonylphenylen.
Repräsentative Monomere, die durch die zuvor angegebene Struktur beschrieben werden, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Mono-m-& p-vinylbenzylglutarat, Mono-p- vinylbenzylglutarat, Mono-2-methacryloyloxyethylglutarat, 2-(4-Carboxybutyramido)ethylmethacrylat, 2-[N'-(5-Carboxypentyl)ureido]ethylmethacrylat, Mono-methacryloylpenta(oxyethylen)glutarat, Mono-(4-acryloyloxybutyl)glutarat, 4-(4-Carboxybutyramido)styrol, Mono-methacryloyldeca(oxyethylen)glutarat, Mono-2-(p-vinylbenzylthio)ethylglutarat, Mono-2-(m- & p-vinylbenzylthio)ethylglutarat, 4-(4-Carboxybutyramidomethyl)styrol, Mono-2-[N-methyl-N-(4-vinylbenzyl)amino]ethylglutarat, 3-(p-Vinylbenzylthio)propionsäure, 4-[2-(4-Carboxybutyramido)ethylthiomethyl]styrol, 4-[2-(Carboxymethoxyacetamido)ethylthiomethyl]styrol, 4-[2-Carboxymethylthioacetamido)ethylthiomethyl]styrol, Mono-2-(4-vinylbenzylthio)ethylsuccinat, 4-[2-Carboxymethoxyacetoxy)ethylthiomethyl]styrol, Mono-4-vinylbenzylsuccinat, 2-(4-Vinylbenzylthio)bernsteinsäure, 2-(4-Vinylbenzylthio)benzoesäure, Mono-2-[2-(4-vinylbenzylthio)ethoxy]ethylthiomethylmalonat, Mono-methacryloylpenta(oxyethylen)phthalat, Mono-methacryloyldeca(oxyethylen)phthalat, Mono-2-{2-[2-(4-vinylbenzylthio)-ethoxy]ethylthio}ethylsuccinat, Mono-2-{2-[2-(4-vinylbenzylthio)ethoxy]ethylthio}ethylphthalat, 3-[4-(4-Vinylbenzyloxy)benzylthio]propionsäure und 4-{-[4-(4-Vinylbenzyloxy)benzylthio]benzylthio}buttersäure.
Das am meisten bevorzugte Monomer ist 3-(p-Vinylbenzylthio)propionsäure.
Die zuvor beschriebenen Monomere werden üblicherweise mit einem oder mehreren zusätzlichen ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren copolymerisiert.
Die oleophilen Monomere, die zuvor als Monomere (a) bezeichnet wurden, sind brauchbar, um dem erhaltenen Copolymer Hydrophobie oder wasserunlösliche Eigenschaften zu verleihen. Falls gewünscht, kann ein Gemisch solcher Monomerer verwendet werden. Solche Monomeren umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Vinylaromaten (z. B. Styrol und Styrolderivate, wie 4-Vinyltoluol, α-Methylstyrol, 2,5-Dimethylstyrol, 4-t- Butylstyrol und 2-Chlorstyrol), Acryl- und Methacrylsäureester und -amide (z. B. Methylacrylat, Methylmethacrylat, n- Butylacrylat, 2-Ethylhexylmethacrylat, Benzylacrylat und N-Phenylacrylamid), Butadien, Acrylnitril, Vinylacetat, Vinylbenzylacetat, Vinylbromid, Vinylidenchlorid und quervernetzbare Monomere mit zwei oder mehr polymerisierbaren Gruppen. Brauchbare quervernetzbare Monomere umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Divinylbenzol, Allylacrylat und -di- und -triacrylate und Methacrylate (wie 2,2- Dimethyl-1,3-propylendiacrylat, 1,4-Cyclohexylendimethylendimethacrylat, Ethylendiacrylat, Ethylendimethacrylat, Propylendiacrylat, Propylendimethacrylat, Ethylidyntrimethacrylat) und andere, die dem Fachmann der Polymerchemie ohne weiteres ersichtlich sind.
Darüber hinaus können andere ethylenisch ungesättigte, polymerisierbare Monomere (c) als die zuvor für die Monomere (a) oder (b) beschriebenen copolymerisiert werden, um gewünschte Eigenschaften zu erhalten. Solche Monomere umfassen beispielsweise anionische Monomere, die Sulfonsäuregruppen oder Salze davon umfassen, einschließlich 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure, 3-Methacryloyloxypropan-1-sulfonsäure, p-Styrolsulfonsäure und Salze davon und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Ebenso in der Monomerengruppe (c) enthalten sind nicht-ionische hydrophile Monomere wie Acrylamid, Methacrylamid, N-Isopropylacrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat, 2-Hydroxyethylmethacrylat, N-Vinyl-2- pyrrolidon und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Darüber hinaus können Monomere mit aktiven Methylengruppen, wie 2-Acetoacetoxyethylmethacrylat, und kationische Monomere, wie N,N,N-Trimethyl-N-vinylbenzylammoniumchlorid und 3-Hydroxyethyl-1-vinylimidazoliumchlorid, verwendet werden, sowie viele andere, die zu zahlreich sind, um sie hier aufzuführen. Ein Polymerchemie-Fachmann wäre unter Verwendung der hier dargestellten Lehre in der Lage, ohne weiteres brauchbare Polymere aus Hunderten von verfügbaren oder herstellbaren Monomeren zu bilden.
Üblicherweise sind die erfindungsgemäßen Copolymere zusammengesetzt aus wiederkehrenden Einheiten, die abgeleitet sind von 60 bis 99,8 Mol-% (a), 0,2 bis 40 Mol-% (b) und 0 bis 15 Mol-% (c). Bevorzugte Copolymere sind aus 85 bis 99,5 Mol-% (a), 0,5 bis 15 Mol-% (b) und 0 bis 10 Mol-% (c) hergestellt.
Die erfindungsgemäßen Copolymere werden unter Verwendung von Standardemulsions- oder -suspensionspolymerisierungstechniken hergestellt, wie sie beispielsweise von Sorenson und anderen in Preparative Methods of Polymer Science, 2. Ausgabe (1968), Wiley and Sons, New York, und Stevens, Polymer Chemistry, An Introduction, Addison Wesley Publishing Co., London, 1975, beschrieben sind, und bestimmte bevorzugte Bedingungen sind in der EP-A-0 466 220 diskutiert.
Die hier beschriebenen Copolymere werden in Teilchenform verwendet, um die erfindungsgemäßen Reagenzien herzustellen. Die durchschnittliche Teilchengröße kann je nach Verwendung des Reagenzes stark variieren. Üblicherweise beträgt sie von 0,01 bis 20 µm, und vorzugsweise von 0,1 bis 10 µm.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien weisen ein oder mehrere biologisch aktive Substanzen auf, die durch die reaktiven Carboxygruppen auf der äußeren Oberfläche der Teilchen an die polymeren Teilchen kovalent gebunden sind. Der hier verwendete Begriff "biologisch aktive Substanz" soll jede organische Verbindung umfassen, die in einem lebenden Organismus gefunden wird oder die bei der Diagnose, der Behandlung oder dem Genetic Engineering von zellulärem Material oder lebenden Organismen brauchbar sind und die zur Wechselwirkung mit anderem biologischem oder chemischem Material in der Lage ist. Solche Substanzen können in biologischen Flüssigkeiten natürlich vorkommen oder nicht. Solche Materialien müssen in der Lage sein, durch die reaktiven Carboxygruppen mittels eines geeigneten Aktivierungsagens, wie im folgenden beschrieben ist, an die Teilchen zu binden. Üblicherweise bedeutet dies somit, daß die biologisch aktive Substanz eine für die Reaktion verfügbare Amino- oder Sulfhydrylgruppe aufweist.
Je nach der beabsichtigten Verwendung des Reagenzes können die biologisch aktiven Substanzen aus einer großen Anzahl natürlich vorkommender oder synthetisch hergestellter Materialien sein, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, Amine, Enzyme, Aminosäuren, Peptide, Polypeptide, Proteine (einschließlich Antikörper, C-reaktives Protein und Avidin und seine Derivate), Lipoproteine, Glycoproteine, Hormone, Arzneistoffe (z. B. Digoxin, Phenytoin, Phenobarbital, Thyroxin, Triiodothyronin, Gentamicin, Carbamazepin und Theophyllin), Steroide, Vitamine, Polysaccharide, Glycolipide, Alkaloide, Mikroorganismen, Viren, Protozoen, Pilze, Parasiten, Rickettsia, Schimmel, Blutkomponenten, Gewebe- und Organkomponenten, Pharmazeutika, Haptene, Lectine, Toxine, Nukleinsäuren (einschließlich Oligonukleotide, sowohl einzel- als auch doppelsträngig), antigenes Material (einschließlich Proteine und Kohlenhydrate), Biotin oder Derivate davon und Komponenten eines jeden der gerade aufgeführten Materialien, und andere, die dem Fachmann bekannt sind.
Besonders brauchbare erfindungsgemäße Reagenzien sind diejenigen, bei denen die biologisch aktive Substanz ein für einen interessierenden Liganden spezifisches Rezeptormolekül ist. Auf diese Weise kann eine spezifisch bindende Reaktion, an der das Reagenz beteiligt ist, für verschiedene Verfahren verwendet werden (im folgenden ausführlicher beschrieben). Beispiele für Ligand-Rezeptor-Komplexe (d. h. Reaktion des Liganden und des Rezeptors) umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Antikörper-Antigen-, Antikörper-Hapten-, Avidin-Biotin-, Zucker-Lectin-, Gelatine-Fibronectin- und ProteinA-IgG- Komplexe. Im Rahmen dieser Erfindung werden auch komplementäre Nukleinsäuren (d. h. ein hybridisiertes Produkt aus komplementären Strängen) als spezifisch bindende Materialien angesehen. Solche komplementären Nukleinsäuren (einschließlich Oligonukleotiden mit mindestens 2 Basen) brauchen nicht bei jedem Basenpaar komplementär sein, noch muß an jeder Position in der Nukleinsäuresequenz eine passende Base vorliegen. D. h., einer der Stränge kann länger sein als der andere, oder ein Strang kann eine Mehrzahl von Oligonukleotiden aufweisen, die bei verschiedenen Sequenzen dazu komplementär sind.
Sehr brauchbare biologisch aktive Substanzen sind die in der Technik als immunologisch reaktive Arten bekannten, die umfassen: (1) jede Substanz, die, wenn sie einem immunkompetenten Wirt angeboten wird, zur Produktion eines spezifischen Antikörpers führt, der in der Lage ist, mit dieser Substanz zu binden, oder (2) den so erzeugten Antikörper, der an einer immunologischen Reaktion teilnimmt. Die immunologischen Spezies können daher ein antigenes Material oder ein Antikörper (einschließlich anti-Antikörper) sein. Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper sind brauchbar, und sie können ganze Moleküle oder verschiedene Fragmente davon sein, solange sie mindestens eine reaktive Stelle für die Reaktion mit den reaktiven Carboxygruppen auf den Teilchen aufweisen.
Besonders brauchbare biologisch aktive Substanzen umfassen Antikörper, die gegen Streptococcus A, einen mit periodontalen Erkrankungen verbundenen Mikroorganismus, Carbamazepin, Thyroxin, menschliches Choriongonadotropin, Phenobarbital, Phenytoin, Digoxin oder ein C-reaktives Protein gerichtet sind.
In bestimmten Ausführungsformen ist die immunologische Spezies ein Enzym, das eine reaktive Gruppe für eine Bindung aufweist. Typische Enzyme umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase, Urease, β-Galactosidase, Aspartataminotransaminase, Alaninaminotransaminase, Lactatdehydrogenase, Creatinphosphokinase, Gammaglutamyltransferase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase und saure Prostataphosphatase.
In anderen Ausführungsformen, wie beispielsweise für kompetitiv bindende Tests zur Bestimmung von Arzneistoffen oder einer Schwangerschaft, ist die biologisch aktive Substanz ein gegen menschliches Choriongonadotropin, Phenobarbital, Phenytoin oder Digoxin gerichteter Antikörper.
Falls gewünscht, kann die biologisch aktive Substanz modifiziert oder chemisch verändert werden, um reaktive Gruppen für eine Bindung bereitzustellen, einschließlich der Bereitstellung einer Linkergruppe zur Bindung. Aus dem Stand der Technik ist bereits eine recht umfangreiche Technologie für derartige chemische Modifikationen oder für die Verwendung von Linkergrupppen bekannt, einschließlich der Lehren in Literaturstellen wie der US-A-4,914,210 und der WO-A-89/2932, die beide die Modifikation von Oligonukleotiden betreffen, der US- A-4,719,182, Erlanger und andere, J. Biol. Chem., 234, 1090 (1959), Wiston und andere, Biochim. Biophys. Acta, 612, S. 40 - 49 (1980) und Borzini und andere, J. Immunol. Methods, 44, S. 323 - 332 (1981).
Die biologisch aktiven Substanzen sind mittels aktivierender Agentien an die hier beschriebenen Teilchen der Copolymere gebunden. Diese aktivierenden Agentien sind Verbindungen, die in der Lage sind, die Carboxygruppen in eine Zwischenverbindung umzuwandeln (wie einen Ester), die mit der verfügbaren Amin- oder Sulfhydrylgruppe der Substanz reagiert.
Brauchbare aktivierende Agentien umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat, Chlorformiat, die gut bekannten wasserlöslichen Carbodiimide, die beispielsweise in der US-A-4,181,636 beschrieben sind, Dikationether, Carbamoyloniumverbindungen und andere, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind.
Besonders brauchbare wasserlösliche Carbodiimide umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, 1-Cyclohexyl-3- [2-morpholinyl-(4)-ethyl]carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid.
Andere brauchbare aktivierende Agentien sind Dikationether, wie die in der EP-A-0 411 711 beschriebenen. Zu solchen Verbindungen gehören auch Bis(tetramethylformamidinium)etherditriflat und Bis(1-methyl-2-pyridinium)etherditriflat.
Bevorzugte Aktivierungsmittel sind die Carbamoyloniumverbindungen, die besonders ausführlich in der EP-A-0 308 235 beschrieben sind. Brauchbare Carbamoyloniumverbindungen umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, 1-(4-Morpholinocarbonyl)-4-(2-sulfoethyl)pyridiniumhydroxid, inneres Salz, 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyrdiniumchlorid und 1-(4-Morpholinocarbonyl)pyridiniumchlorid. Die am meisten bevorzugte Verbindung zum Herstellen der meisten erfindungsgemäßen Reagentien ist 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyridiniumchlorid.
Das Verfahren zum Binden einer biologisch aktiven Substanz an polymere Teilchen, um die erfindungsgemäßen Reagenzien herzustellen, ist üblicherweise wie folgt.
Die übliche Vorgehensweise zum Herstellen der erfindungsgemäßen Reagenzien geschieht in zwei Schritten. Der erste Schritt umfaßt das In-Kontakt-Bringen einer wäßrigen Suspension (oder Latex) der polymeren Teilchen mit einem Aktivierungsmittel, um reaktive Zwischenstufen bzw. Zwischenverbindungen (z. B. Ester oder gemischte Anhydride) zu bilden, die an die Teilchen anstelle der ursprünglichen Carboxygruppen gebunden sind. Dieser Schritt wird bei einem geeigneten pH durchgeführt, wobei geeignete Säuren oder Puffer verwendet werden. Für die Carbamoyloniumverbindungen und Dikationether beträgt der pH üblicherweise weniger als 6 (vorzugsweise 3,5 bis 6). Für Carbodiimide beträgt der pH üblicherweise 4,5 bis 7. Die Menge des bei der Herstellung verwendeten Aktivierungsmittels beträgt üblicherweise mindestens einen zweifachen Überschuß der stöchiometrischen Konzentration der gesamten Carboxylgruppen in den polymeren Teilchen, die optimalen Mengen können jedoch ohne weiteres durch Routineuntersuchungen mit. Hilfe der hier angegebenen und der aus dem Stand der Technik bekannten Lehre bestimmt werden. Beispielsweise beträgt für die Carbamoyloniumverbindungen der EP-A-0 308 235 das Molverhältnis der Verbindung zu den Carboxygruppen auf den Teilchen 1 : 1 bis 200 : 1 und vorzugsweise 100 : 1 bis 10 : 1. Für bevorzugte Carbamoylonium-Aktivierungsmittel, wie 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyridiniumchlorid, beträgt das Molverhältnis von Verbindung zu Carboxylgruppen 1 : 1 bis 200 : 1 und vorzugsweise 2 : 1 bis 100 : 1. Für Dikationether beträgt dieses Verhältnis üblicherweise 10 : 1 bis 1000 : 1 und vorzugsweise 50 : 1 bis 400 : 1.
In dem Reaktionsgemisch beträgt der prozentuale Anteil der Teilchen bei der Herstellung des Reagenzes im allgemeinen 0,01 bis 10 % und vorzugsweise 0,1 bis 5 %. Die Menge an biologisch aktiver Substanz wird üblicherweise durch ein Gewichtsverhältnis von Substanz zu Copolymer von 0,0005 : 1 bis 0,5 : 1 und vorzugsweise von 0,005 : 1 bis 0,1 : 1 angegeben. Es sollte jedoch davon ausgegangen werden, daß nicht die gesamte Substanz an die Teilchen kovalent gebunden wird. Tatsächlich kann eine geringe Menge adsorbiert werden, und etwas kann überhaupt nicht gebunden werden. Der Fachmann kann ohne weiteres Tests durchführen, um die Substanzmenge zu bestimmen, die an die Teilchen gebunden ist.
Das Mischen der biologisch aktiven Substanz und der Teilchen wird bei einer Temperatur von 20 bis 37 ºC für 2 bis 30 Stunden durchgeführt. Die Zeitdauer variiert je nach Temperatur, Aktivierungsmittel, biologisch aktiver Substanz und gewünschtem Beladungsgrad. Es kann jeder geeignete Puffer verwendet werden, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure ist jedoch bevorzugt.
Einzelheiten typischer Verfahren zur Herstellung verschiedener Reagenzien sind in den folgenden Beispielen angegeben.
Es ist erwünscht, daß die biologisch aktive Substanz in dem Reagenz in einer Menge von 0,0025 bis 30 % und vorzugsweise von 0,005 bis 10 %, bezogen auf das Gewicht der Polymerteilchen, vorliegt. Wie zuvor angemerkt, kann möglicherweise nicht die gesamte mit den Teilchen gemischte Substanz gebunden werden. Daher wird üblicherweise mehr Substanz mit den Teilchen gemischt als tatsächlich kovalent gebunden wird.
Nukleinsäurereagenzien zur Hybridisierung oder andere Tests, bei denen wasserunlöslich gemachte Nukleinsäuren verwendet werden, können mittels carboxylierter polymerer Teilchen hergestellt werden, die durch die Struktur dargestellt werden:
CH&sub2;= -L- -O-M
in der R gleich Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linkergruppe ist, die in der Linkerkette 8 bis 50 Atome, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen, aufweist, wie weiter zuvor definiert worden ist.
Die Nukleinsäurereagenzien werden vorteilhafterweise auf ähnliche Weise wie die anderen zuvor beschriebenen Reagenzien mittels eines Aktivierungsmittels hergestellt, insbesondere jedoch liegen die polymeren Teilchen, die eine durchschnittliche Teilchengröße von 0,01 bis 20 µm aufweisen, in der Suspension in einer Menge von mindestens 5 % Feststoffe, und vorzugsweise 8 % bis 25 % Feststoffe, vor. Der Vorteil dieses Merkmals ist, daß damit ein Reagenz gebildet wird, das in einem Test für DNA des Cytomegalievirus ein sehr viel höheres Signal gibt. Die speziellen Details der Herstellung dieser Reagenzien sind im folgenden Beispiel 15 beschrieben.
Noch allgemeiner umfaßt das Verfahren jedoch:
A. Das In-Kontakt-Bringen von (1) einer wäßrigen Suspension carboxylierter polymerer Teilchen mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 0,01 bis 20 µm, wobei die Teilchen darin zu mindestens 5 % Feststoffen vorliegen, mit (2) einem Aktivierungsmittel, um intermediäre, reaktive Polymerteilchen zu bilden, die intermediäre reaktive Gruppen aufweisen, und
B. In-Kontakt-Bringen der in Schritt A gebildeten intermediären, reaktiven Polymerteilchen mit einem Oligonukleotid, das eine reaktive Amin- oder Sulfhydrylgruppe aufweist, die mit den intermediären reaktiven Gruppen unter Bildung einer kovalenten Bindung bzw. Verknüpfung zwischen den Teilchen und dem Oligonukleotid reagiert.
Wenn das Oligonukleotid die erforderlichen reaktiven Amin- oder Sulfhydrylgruppen nicht aufweist, können sie mittels bekannter Verfahren und Reaktanten, wie beispielsweise in der US-A-4,914,210 beschrieben, zugefügt werden.
In den erfindungsgemäßen analytischen und diagnostischen Verfahren können die Reagenzien zum Nachweis eines beliebigen spezifisch bindenden Liganden, für den ein Rezeptormolekül vorliegt, verwendet werden. Die biologisch aktive Substanz in einem erfindungsgemäßen Reagenz kann mit dem Liganden oder seinem Rezeptor spezifisch reagieren. Der Nachweis des Liganden kann in Lösung oder in trockener Form (im folgenden beschrieben) durchgeführt werden, wobei Testproben wäßriger Flüssigkeiten (wie biologischer Flüssigkeiten) oder Lösungen aus Gewebe- oder zellulären Materialien verwendet werden, und sie können quantitativ oder qualitativ oder beides sein. Insbesondere kann die Erfindung zum Testen biologischer Flüssigkeiten von Tieren, Menschen oder Pflanzen verwendet werden, vorzugsweise jedoch Flüssigkeiten von Menschen, einschließlich Vollblut, Seren, Plasma, Lymphe, Galle, Urin, spinale Flüssigkeit, Sputum, Tränenflüssigkeit, Schweiß, Abstrichproben, Gewebekulturen, Stuhlausscheidungen, zelluläre Flüssigkeiten, Vaginalsekrete und Samen. Es ist ebenfalls möglich, Flüssigkeitszubereitungen von menschlichem oder tierischem Gewebe zu testen, wie beispielsweise Skelettmuskeln, Herz, Niere, Lungen, Gehirn, Knochenmark oder Haut.
Der Ligand kann ein Arzneistoff, Hapten, Hormon, ein antigenes Material (Lipopolysaccharid oder Protein) oder Antikörper mit einem oder mehreren Stellen zur Komplexbildung mit einem oder mehreren derselben oder verschiedener Rezeptormoleküle sein. In erfindungsgemäßen Immunoassays kann der Ligand ein Arzneistoff (wie beispielsweise Digoxin, Phenytoin und Carbamazepin), ein Hormon (wie beispielsweise Thyroid- stimulierendes Hormon, menschliches Choriongonadotropin, leutinisierendes Hormon und Thyroxin), eine retrovirale Komponente oder ein Antikörper gegen das Retrovirus (wie beispielsweise eine HIV-I-Komponente oder ihr Antikörper), bakterielle infektiöse Agentien oder Komponenten davon oder Antikörper dagegen (wie Streptococcus A-Antigen, Chlamydien- oder Gonokokkenantigen oder -antikörper), Viren oder Komponenten davon (wie Hepatitis, Cytomegalievirus oder Herpesantigen) oder Antikörper dagegen, krebserzeugende Agentien oder C-reaktives Protein sein. Der Ligand kann auch Biotin oder ein Derivat davon sein, und der Rezeptor ist Avidin oder ein Derivat davon.
In anderen Ausführungsformen kann der Ligand eine Nukleinsäure (normalerweise in einzelsträngiger Form) sein, deren Menge oder Vorliegen mittels einer komplementären einzelsträngigen Nukleinsäure als dem Rezeptormolekül nachgewiesen wird. Es gibt viele verschiedene Testformen zum Nachweis von Nukleinsäure, die dem Fachmann alle ohne weiteres ersichtlich sind. Der Nachweis von HIV-I-DNA, β-Globin-DNA oder Cytomegalievirus-DNA ist bei der Durchführung dieser Erfindung von besonderem Interesse.
Allgemein umfaßt ein Verfahren zur Bestimmung eines spezifisch bindenden Liganden:
A. Das Bilden eines wasserunlöslichen, spezifisch bindenden Komplexes aus einem interessierenden, spezifisch bindenden Liganden oder einem Rezeptor davon, mit einem Reagenz, umfassend:
(I) ein wasserunlösliches, nicht poröses Teilchen, wie zuvor beschrieben, und
(II) eine biologisch aktive Substanz, die durch reaktive Gruppen an das Teilchen kovalent gebunden ist, wobei die Substanz mit dem Liganden oder einem Rezeptor dafür spezifisch reagiert, und
B. Das Nachweisen des Vorliegens des Komplexes als eine Indikation für das Vorliegen oder das Nicht-Vorliegen des Liganden in der Probe.
In einer Ausführungsform kann das Reagenz in kompetitiv bindenden Tests zur Bestimmung eines spezifisch bindenden Liganden verwendet werden. Im allgemeinen umfaßt ein derartiger Test:
A. das In-Kontakt-Bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie einen wasserlöslichen, spezifisch bindenden Liganden enthält, mit einem wasserlöslichen Rezeptor dafür und mit einem Reagenz wie zuvor beschrieben,
um einen spezifisch bindenden Komplex (a) zwischen dem Rezeptor und dem Liganden zu bilden und einen spezifisch bindenden Komplex (b) zwischen dem Rezeptor und dem wasserunlöslichen Reagenz zu bilden, und
B. nach Abtrennen der Komplexe (a) und (b) Nachweisen des Vorliegens beider Komplexe als eine Indikation für das Vorliegen oder die Menge des Liganden in der Probe.
Solche kompetitiv bindenden Tests können in Lösung durchgeführt werden. Ein Test in Lösung ist ein Test, bei dem die Reagenzien in einer Suspension aus dem Reagenz und einer Testprobe, von der angenommen wird, daß sie den interessierenden Liganden enthält, verwendet werden. In dem Test können gebundene (d. h. komplexierte) oder ungebundene (d. h. nicht komplexierte) Materialien bestimmt werden. Die physikalische Trennung von gebundenen und nicht gebundenen Materialien kann, falls gewünscht, mit Hilfe einer beliebigen geeigneten Abtrenntechnik durchgeführt werden. Bei der Verwendung analytischer Elemente (im folgenden beschrieben) können entweder vertikale oder horizontale Trennungen eingesetzt werden. Gebundene Liganden können mittels Lichtstreuung, Turbidimetrie, radiometrischer oder spektrophotometrischer Techniken, die in der Technik bekannt sind, bestimmt werden.
In einem kompetitiv bindenden Test liegt das Reagenz üblicherweise in einer Konzentration vor, die von der Menge der immunologischen Spezies (d. h. dem Rezeptor) auf den polymeren Teilchen und dem interessierenden Liganden abhängt. Ein Ligandanalog (ein Ligand, der nachweisbar markiert ist) wird ebenfalls verwendet, so daß Ligand und Ligandanalog um eine bekannte Menge an Rezeptor, der für die Reaktion verfügbar ist, konkurrieren. Der Test wird üblicherweise durchgeführt, indem das Reagenz, das Ligandanalog und die Testprobe in einem geeigneten Gefäß körperlich in Kontakt gebracht und gemischt werden, so daß Komplexbildung eintritt. Zur Förderung der Komplexbildung kann inkubiert werden, oder es können beliebige chemische oder biologische Reaktionen (wie beispielsweise Farbstoffbildung), die zum Nachweis der Komplexe benötigt werden, eingesetzt werden.
Insbesondere ist der Ligand eine immunologische Spezies, und die Reaktion des Liganden und des Rezeptors dafür bildet einen immunologischen Komplex, der nachweisbar ist, wenn wasserlösliche (nicht komplexierte) Materialien von dem Komplex entfernt sind (z. B. durch Filtration oder Zentrifugation), um das Vorliegen oder das Nicht-Vorliegen der Spezies in der Probe anzuzeigen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können ebenfalls mittels trockener analytischer Elemente durchgeführt werden. Das einfachste Element kann aus einem absorbierenden, flüssigkeitsdurchlässigen Substrat zusammengesetzt sein, z. B. einem dünnen Blatt eines selbsttragenden absorbierenden oder saugfähigen Materials, wie beispielsweise einem Filterpapier oder einem Papierstreifen. Dieses Substrat weist eine oder mehrere Reaktionszonen für chemische, biologische oder spezifisch bindende Reaktionen, die darin stattfinden, auf. Das erfindungsgemäße Reagenz liegt in mindestens einer dieser Zonen vor. Andere Zonen nach Wahl können andere Reagenzien enthalten, wie beispielsweise Farbstoffe, farbstoffbildende Verbindungen, Radikalfänger, Antioxidantien, Enzymsubstrate oder Puffer und andere Materialien, die dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind. Solche Elemente sind in der Technik als Teststreifen, analytische Elemente, Objektträger oder Meßstäbchen bekannt.
Absorbierende Materialien, die bei der Herstellung der Elemente brauchbar sind, können Cellulosematerialien (wie beispielsweise poröse Papiere), poröse polymere Filme, Matten aus Glasfasern, gewebte oder nicht gewebte Stoffe und andere Materialien, die dem Fachmann bekannt sind, umfassen. Bevorzugte Substrate sind poröse Ausbreitschichten, wie sie beispielsweise in der US-A-3,992,158, der US-A-4,258,001, der US-A-4,292,272 und der US-A-4,430,436 beschrieben sind.
Bevorzugte Elemente können eine oder mehrere aufeinander geschichtete, flüssigkeitsdurchlässige Schichten umfassen, die sämtliche auf einem nicht-porösen, flüssigkeitsundurchlässigen Träger (der transparent sein kann oder nicht) aufeinandergeschichtet sind, der aus einem geeigneten Polymeren, Cellulose- oder metallischen Material zusammengesetzt ist. Die Schichten können für verschiedene Zwecke verwendet werden, wie beispielsweise für Reaktionszonen, sog. Subbingzonen, Reagenzzonen, Sperrzonen, Strahlung blockierende Zonen und andere, die in der Technik gut bekannt sind. Wo dies gewünscht ist, können Reagenzien und Puffer sich zwischen den Schichten für die gewünschten Reaktionen zum Durchführen des Tests bewegen, um ein nachweisbares Produkt zu bilden und die Trennung von gebundenen und ungebundenen Materialien durchzuführen. Andere Komponenten analytischer Schichten sind beispielsweise in der US-A-4,042,335, der US-A-4,132,528, der US-A-4,144,306, der US-A-4,670,381 und der EP-A-0 253 581 beschrieben.
Obwohl es bevorzugt ist, daß das erfindungsgemäße Reagenz in ein Anwendungselement eingebracht wird, ist dies nicht entscheidend, da das Reagenz zu dem Element zum Zeitpunkt des Tests zusammen mit der Testprobe gegeben werden kann. Vorzugsweise befinden sich jedoch das Ligandanalog und das erfindungsgemäße Reagenz (das den geeigneten Rezeptor enthält) innerhalb des Elements in verschiedenen Zonen, so daß sie nicht vorzeitig einen Komplex bilden.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfaßt ein analytisches Element einen nicht porösen Träger, auf dem, in der Reihenfolge und dem Fluidkontakt, aufgebracht sind
eine Reagenzschicht, die ein oder mehrere Reagenzien enthält, um ein nachweisbares Signal in dem Test zu erzeugen,
eine wasserlösliche Schicht, die ein nachweisbar markiertes Analog eines interessierenden Liganden enthält, und
eine poröse Ausbreitschicht, die das erfindungsgemäße Reagenz, zusammengesetzt aus einem Rezeptor (z. B. einem Antikörper) für den interessierenden Liganden, enthält.
In einer anderen Ausführungsform weist das Element einen Träger und ein oder mehrere Reagenzschichten, und ein oder mehrere poröse Ausbreitschichten auf, wobei das hier beschriebene Reagenz in einer der Ausbreitschichten, vorzugsweise in der obersten Schicht, vorliegt.
Vorzugsweise ist das Ligandanalog mit einem Enzym markiert, wie beispielsweise einem der im folgenden beschriebenen, der Ligand ist ein antigenes Material, Hormon, Hapten oder Arzneistoff, und der Rezeptor ist der entsprechende Antikörper. Solche Elemente sind besonders brauchbar für die Bestimmung von Carbamazepin, Thyroxin, Phenobarbital, Phenytoin oder Digoxin. Am meisten bevorzugt sind sie zur Bestimmung von Phenobarbital, Phenytoin oder Digoxin brauchbar.
Je nach Testverfahren kann eine Vielzahl verschiedener Elemente gemäß dieser Erfindung hergestellt werden. Sie können in vielfältigen Formen gestaltet sein, einschließlich länglicher Bänder jeder beliebigen gewünschten Breite, Blätter, Objektträger oder Chips.
Der erfindungsgemäße Test in Lösung oder der Trockentest kann manuell oder automatisch durchgeführt werden. Üblicherweise erfolgt bei der Verwendung trockener Elemente die Bestimmung des Analyten, indem man das Element von einer Vorratsrolle, einem Chippaket oder einer anderen Quelle entnimmt und körperlich mit einem Exemplar einer Testprobe in Kontakt bringt, so daß die Probe und die Reagenzien in dem Element in einer oder mehreren Testzonen gemischt werden. Ein solcher Kontakt kann auf beliebige geeignete Weise erreicht werden, z. B. durch Tauchen oder Eintauchen des Elements in die Probe oder vorzugsweise durch Aufbringen eines Tropfens der Probe mit einer geeigneten Verteilungsvorrichtung auf das Element. Waschflüssigkeiten können in dem Test ebenfalls verwendet werden, wie beispielsweise in der US-A-4,517,288 beschrieben ist.
Testergebnisse werden üblicherweise durch Messen nachweisbarer spektrophotometrischer Änderungen in dem Element, entweder visuell oder mit geeigneter Nachweisvorrichtung, bestimmt.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung sind die in der Technik als Agglutinationstests bekannten Tests, wobei ein Ligand mit dem erfindungsgemäßen Reagenz unter Bildung einer nachweisbaren Agglutination oder Verklumpung der Teilchen komplexiert wird. Die erhaltene Agglutination kann auf vielfältige Weise nachgewiesen werden, beispielsweise visuell oder mittels einer geeigneten Vorrichtung zum Nachweis von Streulicht. Typische Agglutinationstechniken sind beispielsweise in der US-A-4,419,453, der US-A-4,808,524, der US-A-4,828,978 und der US-A-4,847,199 beschrieben.
Agglutinationstests werden vorzugsweise mittels erfindungsgemäßer Reagenzien durchgeführt, die auf irgendeine Weise nachweisbar markiert sind, wie beispielsweise mit einem Radioisotop in dem Teilchen oder in der daran gebundenen biologisch aktiven Substanz, oder mit einem mit dem Teilchen verbundenen kolorimetrischen oder fluorometrischen Farbstoff. Am meisten bevorzugt befindet sich ein Farbstoff im Inneren des Teilchens, d. h. weg von seiner Oberfläche, damit er die Bindung einer biologisch aktiven Substanz oder deren Komplexierung nicht beeinträchtigt. Solche Teilchen können Kern-Mantel-Teilchen sein, die den Farbstoff in einem Kernpolymer aufweisen, während das Mantelcopolymer farbstofffrei ist. Dieses Merkmal und Verfahren zur Herstellung solcher Teilchen sind ausführlicher in der US-A-4,808,524 und in der EP-A-0 280 556 beschrieben. In Kern-Mantel-Polymerteilchen weist das Mantelcopolymer eine Zusammensetzung wie die hier beschriebene auf (d. h., es weist die notwendigen reaktiven Carboxygruppen auf), das Kernpolymer kann jedoch davon verschieden sein und braucht keine reaktiven Gruppen aufweisen.
Ein Verfahren zur Bestimmung einer immunologischen Spezies umfaßt:
A. Das In-Kontakt-Bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie eine immunologische Spezies enthält, mit einem erfindungsgemäßen Reagenz, das einen Rezeptor für die Spezies aufweist, um einen wasserunlöslichen immunologischen Komplex der Spezies mit dem Rezeptor zu bilden, und
B. nach Abtrennen von unkomplexiertem Material von dem Komplex, Nachweisen des Vorliegens des Komplexes als einem Indikator für das Vorliegen oder für die Menge der immunologischen Spezies in der Probe.
Die immunologische Spezies kann ein antigenes Material und der Rezeptor ein Antikörper dafür sein. Alternativ kann die immunologische Spezies ein Antikörper sein und der Rezeptor ein dafür spezifisches Antigenmaterial sein. Die immunologische Spezies kann auch ein Antikörper und der Rezeptor ein dafür spezifischer Antikörper sein.
In einer noch anderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Reagenz in immunometrischen Tests (oftmals als "Sandwich"-Tests bezeichnet) verwendet werden. In solchen Tests ist der interessierende Ligand mit zwei oder mehreren Rezeptormolekülen (die gleich oder verschieden sein können) komplexiert, von denen eines unlöslich gemacht ist oder unlöslich gemacht werden kann (wie beispielsweise durch eine Avidin-Biotin- Bindung) und das andere wasserlöslich ist und geeignet markiert ist (wie beispielsweise mit einem Radioisotop, Enzym, einer chemilumineszierenden Gruppe oder anderen in der Technik bekannten Markern). Ein Sandwichtest für einen Liganden wie menschliches Choriongonadotropin (hCG) kann beispielsweise mit einem erfindungsgemäßen Reagenz, das Antikörper gegen das Hormon aufweist, in Kombination mit enzymmarkierten Antikörpern gegen hCG, die an anderen Epitopstellen als die Reagenzantikörper komplexieren, durchgeführt werden. Der erhaltene Sandwichkomplex ist unlöslich, nachweisbar und von nicht- komplexierten Materialien abtrennbar (beispielsweise mit einer mikroporösen Filtrationsmembran). In einer bevorzugten Ausführungsform weist das erfindungsgemäße Reagenz einen Rezeptor für den interessierenden Liganden auf und ist auf der Membran immobilisiert. Sandwichtests sind in der Technik gut bekannt, einschließlich der GB-A-2,074,727 und der US-A-4,486,530 und den darin angegebenen Literaturstellen.
In den Sandwichtests wird vorzugsweise, entweder vor, gleichzeitig mit oder nachfolgend auf die Bildung des wasserunlöslichen Komplexes mit dem erfindungsgemäßen Reagenz, der interessierende Ligand mit einer spezifisch damit reagierenden wasserlöslichen, spezifisch bindenden Komponente umgesetzt.
Andere Liganden, die in erfindungsgemäßen Sandwichtests nachgewiesen werden können, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Streptokokkenantigene, Antigene, die aus mit periodontalen Erkrankungen verbundenen Mikroorganismen extrahiert wurden, Hepatitisantigene, HIV-I- und andere retrovirale Antigene.
In einer Ausführungsform des Sandwichtests wird das erfindungsgemäße Reagenz mit dem interessierenden Liganden direkt umgesetzt, z. B. wenn der Ligand ein Antigen ist und das Reagenz Antikörper dagegen umfaßt. In einer anderen Ausführungsform wird das Reagenz jedoch mit dem Liganden indirekt komplexiert, d. h. durch eine intermediäre Linkergruppe. Ein Beispiel dafür ist in der US-A-4,870,007 angegeben, wobei die Komplexbildung durch eine Avidin- Biotin-Bindung erfolgt.
Eine andere Ausführungsform dieser Erfindung ist als ein Hybridisierungstest bekannt, bei dem eine Targetnukleinsäure mittels komplementärer Sonden nachgewiesen wird, von denen eine geeignet markiert ist und die andere immobilisiert ist oder immobilisiert werden kann. Das Reagenz dieser Erfindung kann als eine immobilisierte Sonde (auch als Fängersonde bekannt) in solchen Tests verwendet werden. Beispiele für Hybridisierungstests sind beispielsweise in der US-A-4,358,535 und der US-A-4,486,539 angegeben. Diese Reagenzien können auch als Fängersonden verwendet werden, nach der in der Technik bekannten Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion, und sind beispielsweise ausführlicher in der US-A-4,683,195, der US-A-4,683,202 und der EP-A-0 370 694 beschrieben. Eine amplifizierte Nukleinsäure wird durch Hybridisierung mit dem erfindungsgemäßen Reagenz immobilisiert.
Insbesondere umfaßt ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure:
A. das Bilden eines wasserunlöslichen Hybridisierungsprodukts zwischen einer interessierenden Nukleinsäure und einem erfindungsgemäßen Reagenz, das ein Oligonukleotid aufweist, das durch die reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist, wobei das Oligonukleotid zu der interessierenden Nukleinsäure im wesentlichen komplementär ist, und
B. das Nachweisen des Vorliegens des Hybridisierungsprodukts als eine Indikation für das Vorliegen oder die Menge der interessierenden Nukleinsäure.
In bevorzugten Hybridisierungstests wird die interessierende Nukleinsäure mittels Polymerase-Kettenreaktion (aus dem Stand der Technik bekannt) mit geeigneten Reagenzien (z. B. DNA- Polymerase, dNTP's, Primer) amplifiziert, bevor sie mit dem erfindungsgemäßen Reagenz eingefangen wird. HIV-I-DNA, DNA des Cytomegalievirus und β-Globin-DNA werden ohne weiteres mittels Amplifikation und Nachweis gemäß dieser Erfindung bestimmt. In einer Ausführungsform ist einer der Primer biotinyliert, und der Nachweis der amplifizierten Nukleinsäure wird mittels eines Konjugates aus Avidin und einem Enzym erreicht. Das hybridisierte Produkt kann mittels des Reagenzes eingefangen werden, das auf einem beliebig gearteten Substrat gebunden sein kann oder sich auf diesem befinden kann, einschließlich einem mikroporösen Substrat, wie einer Membran oder einem Kompartiment eines in sich abgeschlossenen Testbeutels.
Die Analyse-, Sandwich- und Hybridisierungstests der Erfindung können mittels geeigneter Vorrichtungen und Vorgehensweisen durchgeführt werden, wobei komplexiertes oder hybridisiertes Produkt eingefangen wird oder durch Filtration, Zentrifugation oder andere Mittel von unkomplexierten Materialien abgetrennt wird. Vorzugsweise werden solche Tests mittels Einweg-Testvorrichtungen durchgeführt, die mikroporöse Filtrationsmembranen enthalten (z. B. die, die von Pall Corp. im Handel erhältlich sind). Typische Testvorrichtungen sind in der US- A-3,825,410, der US-A-3,970,429 und der US-A-4,446,232 dargestellt.
Das erfindungsgemäße Analyse-Abtrennverfahren kann zum Isolieren von einem oder mehreren interessierenden Analyten aus einem Gemisch biologischer Materialien verwendet werden. Das erfindungsgemäße Reagenz (oder mehrere Reagenzien mit verschiedenen, an die Teilchen gebundenen Substanzen) wird daher üblicherweise in eine Säule gegeben, durch die eine Flüssigkeit gegossen wird, die das Gemisch biologischer Materialien enthält, wobei es dem Reagenz ermöglicht wird, aus der Flüssigkeit diejenigen Materialien zu extrahieren, die man isolieren möchte. Dies kann hilfreich sein bei der Reinigung von Nukleinsäuren, Enzymen, Kohlenhydraten, Proteinen, Lipiden, Vitaminen, Steroiden, Antikörpern, Peptiden oder Hormonen. Dieses Verfahren ist auch als Affinitätschromatographie bekannt.
Affinitätschromatographie kann auch dazu verwendet werden, verdünnte Lösungen von Proteinen aufzukonzentrieren, um denaturierte Formen von gereinigten Proteinen zu entfernen, und es kann bei der Abtrennung und Wiederauflösung von Protein- und Peptidkomponenten, die aus speziellen chemischen Modifikationen stammen, verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Reagenz kann für jedes der beschriebenen Verfahren als ein einzelnes Material vorgesehen sein, oder es kann in einem analytischen Element, wie zuvor beschrieben, vorgesehen sein oder wiederum in Kombination mit anderen Reagenzien, Testvorrichtungen und Zubehör in einem diagnostischen Testkit. Für das Reinigungsverfahren kann das Reagenz auch in einer Affinitätschromatographiesäule vorgesehen werden.
Insbesondere umfaßt ein Kit für einen Hybridisierungstest ein erfindungsgemäßes Reagenz, das ein zu der interessierenden Nukleinsäure komplementäres Oligonukleotid aufweist und ein oder mehrere andere Reagenzien (z. B. markierte Sonden oder Polymerase-Kettenreaktionsreagenzien), Lösungen (beispielsweise Wasch- oder Extraktionslösungen) oder Gegenstände (wie beispielsweise Pipetten, Filter, Testvorrichtungen oder Testbehälter), die für den Test benötigt werden.
In einer anderen Ausführungsform enthält ein Kit, der für die Bestimmung eines Liganden brauchbar ist (z. B. ein Immunoassay, Sandwichassay oder diagnostischer Test oder kompetitiver bindender Test), das erfindungsgemäße Reagenz und separat verpackt ein oder mehrere andere Reagenzien, Lösungen oder Gegenstände, die für einen solchen Test benötigt werden (wie beispielsweise Ligandanalog, markierter Rezeptor, farbstoffbildende Zusammensetzungen, Substrate, Waschlösungen, Filter, Testvorrichtungen, Extraktionsreagenzien und andere in der Technik bekannte).
In dem erfindungsgemäßen analytischen Reinigungsverfahren fängt das Reagenz in der Chromatographiesäule ein oder mehrere der Substanzen in dem Substanzengemisch, das durch die Säule geleitet wird.
In einer Ausführungsform werden die vorbestimmten Substanzen durch das Reagenz eingefangen bzw. festgehalten, das ursprüngliche Elutionsmittel wird verworfen, und die festgehaltenen Substanzen werden von der Säule entfernt, wobei ein Solvens verwendet wird, das die Bindungseigenschaften der Substanzen verändert, so daß sie aus dem Komplex gelöst werden können. Derartige Solventien umfassen Puffer, die den pH ändern, Salzlösungen, die die ionische Natur des Komplexes ändern, oder Lösungen, die eine zweite Spezies enthalten, die spezifisch mit dem Reagenz bindet und die festgehaltene Substanz ersetzt.
Alternativ werden die vorbestimmten, durch das Reagenz eingefangenen Substanzen verworfen, und andere chemische oder biologische Materialien, die in dem ursprünglichen Elutionsmittel verbleiben, werden gesammelt.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung lediglich veranschaulichen, ihren Umfang jedoch nicht einschränken. Sämtliche Prozentangaben sind Gewichtsprozent, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 1: Reagenzien mit markiertem Rindergammaglobulin

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung mehrerer erfindungsgemäßer Reagenzien mit einem an die polymeren Teilchen gebundenen, radioaktiv markierten Protein. Zwei verschiedene Aktivierungsmittel werden zur Herstellung der Reagenzien verwendet. Die Reagenzien wurden mit einem auf ähnliche Weise hergestellten Kontrollreagenz, wobei ein nicht erfindungsgemäßes Copolymer verwendet wurde, verglichen.
Die Copolymere waren:
Test A: Poly(styrol-co-Mono-2-methacryloyloxyethylglutarat) (Molverhältnis 97,84 : 2,16),
Test B: Poly(styrol-co-Mono-m & p-vinylbenzylglutarat) (Molverhältnis 97,8 : 2,2),
Test C: Poly[styrol-co-Monomethacryloylpenta(oxyethylen)glutarat] (Molverhältnis 98,7 : 1,3)
Kontrolle: Poly(styrol-co-Acrylsäure) (Molverhältnis 95 : 5).
Das Protein wurde an die Carboxygruppen dieser Polymere gebunden, wobei eine der Carbamoyloniumverbindungen verwendet wurde: (a) 1-(4-Morpholinocarbonyl)-4-(2-sulfoethyl)pyridiniumhydroxid, inneres Salz, oder (b) 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyridiniumchlorid als Aktivierungsmittel. Sämtliche Polymere wurden unter denselben Bedingungen behandelt. Die fertigen Dispersionen umfaßten 1 % ³H-Rindergammaglobulin pro Gramm polymerer Teilchen, 0,3 mg Protein pro 30 mg Trockengewicht der Teilchen in 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (0,1 molar, pH 5,5). Die Menge an Aktivierungsmittel betrug 16,6 mg von (a) oder 9,6 mg von (b) pro Röhrchen.
Diese Dispersionen wurden hergestellt, indem die Teilchensuspensionen (30 mg Trockengewicht) in große "Microfuge"-Röhrchen gegeben wurden und jedes mittels des angegebenen Puffers auf ein Volumen von 1,5 ml gebracht wurde. Die erhaltenen Suspensionen wurden 15 Minuten lang bei 14 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Es wurde Puffer (1 ml, 0,1 molar) zugegeben, anschließend eine Lösung (300 µl) des Aktivierungsmittels zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Lösung des Aktivierungsmittels (a) wurde durch Auflösen von 199 mg in 3,6 ml eines 0,1 molaren Puffers hergestellt, und die Lösung des Aktivierungsmittels (b) wurde durch Auflösen von 115 mg in 3,6 ml 0,1 molarem Puffer hergestellt. Die Röhrchen wurden dann mit einer Kappe versehen und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang einer sog. end-over-end-Rotation unterzogen. Eine Lösung (30 µl) des markierten Proteins (10 mg/ml) wurde zu jedem Röhrchen zugegeben und anschließend 4 Stunden lang bei Raumtemperatur einer end-over-end-Rotation unterzogen.
Die Reaktion des Proteins mit den Carboxygruppen auf den Teilchen wurde durch Zugabe von Rinderserumalbumin (250 µl, 100 mg Protein/ml) zu jedem Röhrchen gelöscht bzw. gequencht. Die Röhrchen wurden dann erneut weitere 16 Stunden lang bei Raumtemperatur rotiert, und jedes Reaktionsgemisch (250 µl) wurde zur Bestimmung des gesamten markierten Proteins entnommen.
Eine Probe (500 µl) eines jeden Reaktionsgemischs wurde ebenfalls entnommen und mit Puffer (400 µl, 0,1 molar) und Natriumdodecylsulfat (100 µl einer 10 %-igen Lösung in entionisiertem destilliertem Wasser) behandelt. Die erhaltenen Gemische wurden vermischt, indem 16 Stunden lang bei 37 ºC auf einer Rotationsscheibe, die in einem 45º-Winkel montiert war, gedreht wurde (durch Behandlung mit Surfactant wurde adsorbiertes, jedoch nicht kovalent gebundenes Protein von den Teilchen entfernt). Die Reaktionsgemische wurden zentrifugiert, und Aliquote (jeweils 500 µl) wurden entnommen, um die Menge an freiem markierten Protein zu bestimmen.
Das gesamte an die Teilchen gebundene ³H-Rindergammaglobulin, die an die Teilchen kovalent gebundene Menge ³H-Rindergammaglobulin und das Verhältnis von kovalent gebundenen/insgesamt gebundenen Teilchen ist in der folgenden Tabelle I angegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäß hergestellten Reagenzien Antikörper zur Verwendung in Immunoassays auf akeptable Weise binden. TABELLE I Test Aktivierungsmittel Insgesamt gebunden % Kovalent gebunden % Verhältnis Kontrolle

Beispiel 2: Reagenz mit anti-Thyroxin-Antikörpern

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines erfindungsgemäßen Reagenzes, das Antikörpermoleküle gegen Thyroxin aufweist, die an die polymeren Teilchen kovalent gebunden sind.
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde dazu verwendet, monoklonale anti-Thyroxin-Antikörper (erhältlich von Cambridge/Ventrex Laboratories, Inc.) an dieselben Copolymere zu binden, mit der Ausnahme, daß die Antikörperlösung (130 µl, 2,3 mg Protein/ml) anstelle von markiertem Rindergammaglobulin verwendet wurde. Es wurden beide Aktivierungsmittel (a) und (b) zur Herstellung der Reagenzien verwendet. Die Reaktion wurde gelöscht, die Reaktionsgemische wurden zentrifugiert, die Überstände dekantiert und die Teilchen in phosphatgepufferter Salzlösung (1 ml, pH 7,4) resuspendiert. Dieser Schritt wurde viermal wiederholt, und beim letzten Mal wurden die Feststoffe in phosphatgepufferter Salzlösung (1,8 ml) resuspendiert, und es wurde Merthiolat-Konservierungsmittel (0,02 %) zugegeben.
Die relativen Mengen an aktivem Antikörper in den erhaltenen Dispersionen wurden in einem Test bestimmt, bei dem serielle Verdünnungen der Reagenzdispersionen mit einer festen Konzentration eines enzymmarkierten Analogs von Thyroxin und alkalischer Phosphatase gemischt wurden (hergestellt wie bei Ito und anderen in Clin. Chem., 30 (10), S. 1682 - 1685, 1984, beschrieben). Die Verdünnungen wurden etwa eine Stunde lang bei konstanter Bewegung bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Salzlösung, die Rinderserumalbumin enthielt (1 %) inkubiert. Die nach Zentrifugation in Lösung verbleibende Menge an markiertem Analog wurde bestimmt und die Konzentration von Thyroxinbindungsstellen, die erforderlich ist, um 50 % des Analogs zu binden, wurde berechnet. Die Ergebnisse sind wie folgt in Tabelle II zusammengefaßt. Diese Daten zeigen, daß die erfindungsgemäßen Reagenzien das markierte Analog bei beträchtlich niedrigerer (3 - 5 Mal) Konzentration binden als das Kontrollreagenz, und zwar bei jedem Aktivierungsmittel. TABELLE II Theoretische Thyroxinbindungsstellen, wenn 50 % Marker gebunden ist (nmolar) Mittel Test Kontrolle

Beispiel 3: Reagenz mit an die Teilchen kovalent gebundenem Oligonukleotid

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines erfindungsgemäßen Reagenzes mit einem Oligonukleotid (oder einer Nukleinsäure), das zu einer interessierenden Nukleinsäure komplementär ist.
Eine Probe (50 mg, 0,379 ml einer 13,18 %-igen Suspension) von Teilchen aus Poly(styrol-co-mono-m- & p-vinylbenzylglutarat) (Molverhältnis 97,8 : 2,2) wurden zu 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (5 ml, 0,1 molar, pH 6) zugegeben. Die erhaltene Suspension wurde bei 3200 UpM zentrifugiert, um die Polymerteilchen zu pelletisieren. Nachdem der Überstand abdekantiert war, wurden die Teilchen in Puffer (5 ml) in einem Zentrifugenröhrchen resuspendiert. Dazu wurde das Aktivierungsmittel, N-[3-(Dimethylamino)propyl]-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (18,8 mg) zugegeben, anschließend ein Oligonukleotid (optische Dichte 0,625, 1,875 nmol), das die folgende, zu β-Globin-DNA komplementäre Sequenz (SEQ. ID No.: 1) aufwies:
5'-X-CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C-3'
in der A, C, G und T die Standarddarstellungen für Adenin-, Cytosin-, Guanin- und Thyrosinbasen in der Nukleinsäuresequenz sind und X für einen Tetraethylenglycolamin-Linker steht, der die Struktur aufweist:
und gemäß der Lehre der US-A-4,914,210 gebunden wurde. Das Röhrchen wurde mit einer Kappe versehen und 18 Stunden lang bei Raumtemperatur einer end-over-end-Rotation unterzogen.
Die Suspension wurde dann bei 3200 UpM zentrifugiert, der Überstand abdekantiert und die Feststoffe in Glycin (0,1 molar, pH 8,5), das Merthiolat (0,01 %) enthielt, resuspendiert. Dieses Waschverfahren wurde zweimal wiederholt. Die endgültige Suspension enthielt 0,87 % Feststoffe des Reagenzes, wie mittels spektrophotometrischer Lichtstreuung bestimmt wurde.

Beispiel 4: Reagenz mit Antikörpern gegen menschliches Choriongonadotropin

Dieses Beispiel ist ähnlich Beispiel 2. Es veranschaulicht die Herstellung eines in einem Immunoassay brauchbaren Reagenzes.
Eine Probe (10 mg, 65,8 µl einer 15,2 %-igen Suspension) von polymeren Teilchen wie in Beispiel 3 beschrieben wurde zu 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (1 ml, 0,1 molar, pH 6) zugegeben. Die erhaltene Suspension wurde bei 3200 UpM zentrifugiert, um die Polymerteilchen zu pelletisieren. Nachdem der Überstand abdekantiert war, wurden die Teilchen in Puffer (1 ml) in einem Zentrifugenröhrchen resuspendiert. Dazu wurde das Aktivierungsmittel, N-[3-(Dimethylamino)propyl]-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid) (3,76 mg) zugegeben. Das Röhrchen wurde mit einer Kappe versehen und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur einer end-over-end-Rotation unterzogen. Affinitätsgereinigte Ziegenantikörper gegen die β-Untereinheit von menschlichem Choriongonadotropin (hCG) (0,123 mg, OEM Concepts, Toms River, N.J.) wurden zu dem Röhrchen zugegeben, und es wurde nochmals 18 Stunden lang rotiert. Die Suspension wurde bei 3200 UpM zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in Glycin (0,1 molar, pH 8,5), das Merthiolat (0,01 %) enthielt, resuspendiert. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, um ein erfindungsgemäßes Reagenz bereitzustellen, das Antikörper aufweist, die an die Teilchen kovalent gebunden sind.

Beispiele 5 - 7: Reagenzien mit Antikörper gegen Phenobarbital, Phenytoin und Digoxin

Diese Beispiele veranschaulichen die Herstellung von erfindungsgemäßen Reagenzien, die sowohl in kompetitiv bindenden Tests in Lösung als auch in trockenen kompetitiv bindenden Tests brauchbar sind.
Es wurden in Beispiel 1 verwendete Suspensionen polymerer Teilchen verwendet [Tests A - C und die Kontrolle (mit der Ausnahme, daß die Polymerteilchen der Kontrolle ein Molverhältnis von 96,65 : 3,35 aufwiesen)]. Das verwendete Aktivierungsmittel war 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyridiniumchlorid. Sämtliche Teilchen wurden entsprechend behandelt. Die fertigen Dispersionen umfaßten Antikörper (anti-Phenytoin für Beispiel 5, anti-Phenobarbital für Beispiel 6 und anti-Digoxin für Beispiel 7), 0,3 mg Protein pro 30 mg Trockengewicht der Teilchen in 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (0,1 molar, pH 5,5) und Aktivierungsmittel (1,5 mmol Agens/g Teilchen, d. h. 0,045 mmol).
Diese Dispersionen wurden hergestellt, indem Suspensionen der Teilchen (30 mg Trockengewicht) in große "Microfuge"-Röhrchen gegeben wurden, und jedes wurde mittels des genannten Puffers auf ein Volumen von 1,5 ml gebracht. Die erhaltenen Suspensionen wurden 15 Minuten lang bei 13 000 UpM zentrifugiert und die Überstände wurden verworfen. Puffer (1 ml, 0,1 molar) wurde zu jedem Röhrchen zugegeben, anschließend wurde das Aktivierungsmittel (0,3 ml einer 0,15 molaren Lösung in Puffer) zugegeben. Die Röhrchen wurden dann mit Kappen versehen und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang einer end-over- end-Rotation unterzogen. Eine Lösung der Antikörper wurde zu den jeweiligen Röhrchen zugegeben: 0,07 ml anti-Phenytoin (4,3 mg/ml), 0,115 ml anti-Phenobarbital (2,6 mg/ml) und 0,196 ml anti-Digoxin (1,53 mg/ml), jeweils insgesamt 0,3 mg Antikörper, gefolgt von einer 4-stündigen end-over-end-Rotation bei Raumtemperatur.
Die Reaktionen der Antikörper mit den aktivierten Teilchen wurden durch Zugabe von Rinderserumalbumin (300 µl, 100 mg Protein pro ml) zu jedem Röhrchen gelöscht. Die Röhrchen wurden dann nochmals weitere 16 Stunden lang bei Raumtemperatur rotiert, zentrifugiert und die Überstände für spätere ELISA-Analyse entnommen, die Teilchen in phosphatgepufferter Salzlösung (1 ml, pH 7,4) resuspendiert. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt, und schließlich wurde in phosphatgepufferter Salzlösung (1,8 ml), die Merthiolat (0,02 %) enthielt, resuspendiert.
Die Überstände aus den Reaktionsgemischen wurden für die Antikörper-Gesamtkonzentration mittels ELISA analysiert. Die Menge an an die Teilchen kovalent gebundenem Antikörper wurde aus den Ergebnissen der ELISA-Tests berechnet.
Die relativen Mengen an aktivem Antikörper in den Zubereitungen wurden in einem Test bestimmt, in dem serielle Verdünnungen der Reagenzien mit festen Konzentrationen der Konjugate gemischt wurden: mit alkalischer Phosphatase markiertes Phenytoin, mit alkalischer Phosphatase markiertes Phenobarbital oder mit Meerrettichperoxidase markiertes Digoxin, die sämtliche mittels bekannter Verfahren hergestellt wurden, wie von Erlanger und anderen, J. Biol. Chem., 234, 1090 (1959), beschrieben wurde. Die Reaktion zwischen den verdünnten Reagenzdispersionen und den enzymmarkierten Analogen wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei konstanter Bewegung in phosphatgepufferter Salzlösung, die 0,1 oder 1 % Rinderserumalbumin enthielt, inkubiert. Die Menge an enzymmarkiertem Analog, das nach Zentrifugation in den Überständen verblieb, wurde bestimmt, und die Konzentration an Antikörperbindungsstellen, die erforderlich sind, um 50 % des enzymmarkierten Analogs zu binden, wurde berechnet. Die Ergebnisse sind wie folgt in Tabelle III zusammengefaßt: TABELLE III Theoretische Bindungsstellen, um 50 % markiertes Analog zu binden (nmolar) Test Phenytoin Phenobarbital Digoxin Beispiel Kontrolle
Die Ergebnisse zeigen, daß jedes der Reagenzien der Beispiele 5 und 6 eine höhere Aktivität aufweist als derselbe, als Teil der Kontrolle immobilisierte Antikörper, da sie weniger Reagenz benötigten, um 50 % der Bindungsstellen zu binden. In Beispiel 7 zeigte das Phenobarbitalreagenz eine bessere Aktivität als die Kontrolle, die beiden anderen Reagenzien wiesen jedoch geringfügig weniger Aktivität auf als die Kontrolle.

Beispiele 8 - 9: Reagenzien mit iodierten Proteinen

Diese Beispiele zeigen die Herstellung von erfindungsgemäßen Reagenzien, die an polymere Teilchen kovalent gebundenes iodiertes Rindergammaglobulin aufweisen.
Sämtliche Teilchen wurden gleich behandelt, die fertigen Reaktionsdispersionen enthielten ¹²&sup5;I-Rindergammaglobulin (0,3 mg), polymere Teilchen (30 mg Trockengewicht), 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyridiniumchlorid als Aktivierungsmittel (0,5 mmol/g Teilchen) in 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (0,1 molar, pH 5,5).
Es wurden die in Test B (Beispiel 8), Test C (Beispiel 9) und in der Kontrolle des vorherigen Beispiels 1 angegebenen polymeren Teilchen verwendet. Aliquote der Teilchendispersionen wurden in 2 ml "Microfuge"-Röhrchen gegeben, und es wurde Puffer (0,1 molar) bis zu einem Gesamtvolumen von 1,5 ml zugegeben. Die Dispersionen wurden 10 Minuten lang bei 13 000 UpM zentrifugiert, und die Überstände wurden verworfen. Die Beads wurden in dem Puffer (1 ml) und dem Aktivierungsmittel (0,3 ml, 0,15 molar) redispergiert. Die Röhrchen wurden mit Kappen versehen und 10 Minuten lang einer end-over-end- Rotation unterzogen. Es wurde eine Lösung des iodierten Proteins zugegeben, um insgesamt 0,3 mg in jeder Tube zu erhalten, und ein Satz der Reaktionsgemische wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden lang einer end-over-end-Rotation unterzogen, während der andere Satz bei Raumtemperatur 52 Stunden lang einer end-over-end-Rotation unterzogen wurde. Die Reaktionsgemische wurden zentrifugiert, die Überstände entnommen und auf Radioaktivität untersucht. Die erhaltenen Reagenzien wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (1 ml) resuspendiert, zentrifugiert, in Natriumdodecylsulfat (1 %) resuspendiert und auf Radioaktivität untersucht, um die Gesamtmenge an an die Teilchen gebundenem iodierten Protein zu bestimmen.
Die Teilchen wurden dann 16 Stunden lang in Natriumdodecylsulfat (1 %) bei Raumtemperatur inkubiert, während sie end- over-end geschüttelt wurden, um adsorbiertes Protein zu entfernen, kovalent gebundenes Protein jedoch gebunden zu lassen. Die Reagenzien wurden pelletisiert, die Überstände entnommen und auf Radioaktivität untersucht, dann in Natriumdodecylsulfat (1 %) resuspendiert. Die Reagenzien wurden nochmals zentrifugiert, die Überstände verworfen und die Reagenzien auf Radioaktivität untersucht.
Der prozentuale Anteil an iodiertem Protein, das an die Teilchen kovalent gebunden ist, ist für jedes Reagenz in der folgenden Tabelle IV angegeben. TABELLE IV % Kovalent gebunden Test Stunden Beispiel Kontrolle
Diese Ergebnisse zeigen, daß die in Beispiel 8 verwendeten polymeren Teilchen mit dem Protein rascher reagieren als die Teilchen der Kontrolle, so daß für eine vollständige Reaktion von Protein mit den Teilchen weniger Zeit benötigt wird. Dies stellt einen Fertigungsvorteil dar. Es stellt auch dadurch einen Vorteil dar, daß aufgrund der kürzeren Reaktionszeiten die Wahrscheinlichkeit, daß Antikörper, die bei den für die Bindung notwendigen Bedingungen empfindlich sind, bei diesen Bedingungen desaktiviert werden, geringer ist. Nach 6-stündiger Reaktion erhält man mit den Teilchen von Beispiel 9 keine so guten Ergebnisse wie mit der Kontrolle, dieses Beispiel zeigt jedoch, daß es immer noch ein brauchbares Reagenz ist. Längere Reaktionszeiten des Proteins mit den Carboxygruppen des Teilchens führen zu einer vollständigen Bindung sämtlicher Teilchen. Dies zeigt, daß verschiedene Polymere und Proteine unterschiedliche Reaktionsbedingungen erforderlich machen, um gewünschte Reagenzien herzustellen, wie dem Fachmann ohne weiteres verständlich ist.

Beispiel 10: Herstellung von Reagenzien mit Oligonukleotiden für Cytomegalievirus-DNA

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung von Reagenzien, die ein Oligonukleotid aufweisen, das an hier beschriebene carboxyhaltige Copolymere kovalent gebunden ist. Das Oligonukleotid ist auf eine Nukleinsäuresequenz von Cytomegalievirus-DNA gerichtet.
Das hier verwendete Oligonukleotid wurde mittels einer Biosearch 8650-DNA-Synthesevorrichtung synthetisiert, wobei das in der US-A-4,725,677 beschriebene Phosphoramidit- Verfahren verwendet wurde, und zwar mit einigen Modifikationen im Aktivator (Activator Gold erhältlich von Beckman), einem zusätzlichen wäßrigen Waschschritt (vor der Oxidation) und 1-Methylimidazol als einem Capping-Reagenz anstelle von 4-(N,N-Dimethylamino)pyridin. Die Reagenzien, die zum Derivatisieren des Oligonukleotids verwendet wurden, um Linker und Spacer anzufügen, sind in der US-A-4,914,210 bechrieben. Die Oligonukleotidreagenzien wurden entweder mit (1) einem einzelnen Aminolinker am 3'-Ende (als LB09 bezeichnet) oder (2) mit einem Aminolinker und zwei Tetraethylenglycol-Spacern am 3'-Ende (als LB08 bezeichnet) gebildet. Die Oligonukleotidsequenz (SEQ. ID No.: 2) lautet mit Basenstandardbezeichnung (A, C, G und T) wie folgt:
5'-TCACCCCCAG AGTCCCCTGT ACCC-X-3'
in der für LB08 X für einen Aminlinker steht, der mit zwei Tetraethylenglycol-Spacereinheiten verbunden ist, und für LB09 X für denselben Aminlinker ohne die Spacereinheiten steht, der die Struktur aufweist: Thymidin
Das 5'-Ende der gereinigten, entblockten Oligonukleotide wurde mittels Kinase mit δ³²P-ATP mit ³²P markiert. LB08 und LB09 [jeweils 2,0 OD (260 nm) Einheiten in 20 µl] wurden markiert und in den Tests direkt verwendet. Die LB08- und LB09-Oligonukleotide (2 µl) wurden zugegeben, um Beadproben wie hier beschrieben zu aktivieren.
Die in diesem Beispiel verwendeten polymeren Teilchen waren wie folgt:
Polymer A Polystyrol-co-mono-2-methacryloyloxyethylglutarat) (Molverhältnis 97,8 : 2,2).
Polymer B Poly[styrol-co-mono-m- & p-(60 : 40)-vinylbenzylglutarat] (Molverhältnis 97,7 : 2,2).
Polymer C Poly[styrol-co-monomethacryloylpenta(oxyethylen)glutarat] (Molverhältnis 98,7 : 1,3).
Polymer D Poly[styrol-co-monomethacryloyldeca(oxyethylen)glutarat] (Molverhältnis 98,3 : 1,7).
Polymer E Poly[styrol-co-mono-2-(m- & p (60 : 40)vinylbenzylthio)ethylglutarat] (Molverhältnis 98,3 : 1,7).
Polymer F Poly(styrol-co-mono-p-vinylbenzylglutarat) (Molverhältnis 97,2 : 2,2).
Polymer G Poly[styrol-co-mono-2-(p-vinylbenzylthio)ethylglutarat] (Molverhältnis 98,3 : 1,7).
Polymer H Poly[styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure (Molverhältnis 97,6 : 2,4).
Kontrolle A Poly(styrol-co-acrylsäure) (Molverhältnis 97,5 : 2,5).
Kontrolle B Poly(styrol-co-3-acrylamido-3-methylbutansäure) (Molverhältnis 96,9 : 3,1).
Die Teilchen wurden als wäßrige Latexdispersionen bereitgestellt, die die in der folgenden Tabelle V angegebenen prozentualen Mengen an Feststoffen aufweisen. Die Bindung der Oligonukleotide wurde durch Verwendung eines der beiden Aktivierungsmittel erreicht: (a) N-(3-(N,N-Dimethylamino)propyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (entweder 100 µl einer Lösung von 170 mg/1,35 ml für Tests 1 - 6 oder 100 µl einer Lösung von 538 mg/ml für Tests 7 - 16) und (b) 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyridiniumchlorid (100 µl einer Lösung von 538 mg/ml). Das Aktivierungsmittel wurde zu einer Probe einer jeden Dispersion zugegeben und entweder 10 Minuten lang (Tests 1 - 6) oder 25 Minuten lang (Tests 7 - 16) umgesetzt.
Die erhaltenen aktivierten polymeren Teilchen wurden dann mit jedem markierten Oligonukleotid (LB08 oder LB09, 2,0 µl) behandelt, und man ließ Tests 1 - 6 nach dem Mischen eine Stunde lang reagieren, während man die Tests 7 - 16 nach dem Mischen 2,5 Stunden lang reagieren ließ. Die gebundenen Oligonukleotide wurden dann durch Zentrifugieren (2 Minuten) abgetrennt, und die Überstände wurden zur Bestimmung der Radioaktivität abdekantiert. Die erhaltenen Reagenzien wurden dreimal mit Wasser gewaschen, resuspendiert und zentrifugiert. Dann wurde die Radioaktivität der vereinigten Überstände eines jeden Tests und der resuspendierten Reagenzien bestimmt, und die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V angegeben.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Menge (%) an an die Teilchen kovalent gebundenem Oligonukleotid für die erfindungsgemäßen Reagenzien im Vergleich zu den Kontrollreagenzien verbessert ist. Einige Tests zeigten eine sehr viel größere Verbesserung als andere, während einige Reagenzien mit bestimmten Aktivierungsmitteln Verbesserungen aufwiesen und mit anderen nicht. Diese Daten helfen dem Fachmann, ein wesentlich verbessertes Reagenz für den Nachweis von Cytomegalievirus-DNA zu finden. TABELLE V Test Oligonukleotid Aktivierungsmittel Copolymer Beadgröße (µm) % Feststoffe % kovalent gebundenes Oligonukleotid Kontrolle TABELLE V (Fortsetzung) Test Oligonukleotid Aktivierungsmittel Copolymer Beadgröße (µm) % Feststoffe % kovalent gebundenes Oligonukleotid TABELLE V (Fortsetzung) Test Oligonukleotid Aktivierungsmittel Copolymer Beadgröße (µm) % Feststoffe % kovalent gebundenes Oligonukleotid Kontrolle

Beispiel 11: Test für menschliches Choriongonadotropin

Dieses Beispiel demonstriert die Durchführung der vorliegenden Erfindung zuin Nachweis von hCG mittels eines erfindungsgemäßen Reagenzes.

Materialien:

Es wurden Surecell -Einweg-Testvorrichtungen verwendet, die mikroporöse Membranen LoProdyne (5 µm, Pall Corp.) enthielten, die jeweils mit nicht-ionischem Surfactant Fluorad FC 135 (3M, 0,05 g/m²) beschichtet waren.
Ein erfindungsgemäßes Reagenz wurde hergestellt, indem affinitätsgereinigte Ziege-anti-hCG-alphapolyklonale Antikörper (OEM Concepts, Toms River, N.J.) an Teilchen von Poly[styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure] (Molverhältnis 97,6 : 2,4) kovalent gebunden wurden, wobei 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyridiniumchlorid) als das Aktivierungsmittel verwendet wurde. Bei der Bindung der Antikörper wurde auf folgende Weise vorgegangen:
Eine Suspension aus polymeren Teilchen (3 % Feststoffe) wurde mit dem Aktivierungsmittel (0,1 molar) in 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer in einem "Microfuge"-Röhrchen gemischt. Das Röhrchen wurde mit einer Kappe versehen und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang einer end-over-end-Rotation unterzogen. Eine Lösung (810 µl) der polyklonalen Antikörper (13,2 mg/ml) wurde zu dem Röhrchen zugegeben, und anschließend wurde 18 Stunden lang bei Raumtemperatur end-over-end rotiert. Das erhaltene Reagenz wies etwa 99 % der theoretischen Antikörper an die polymeren Teilchen kovalent gebunden auf.
Eine Zusammensetzung (2 µl), die das Reagenz (0,9 %), Polyacrylamid (5 %), Uvitex -Farbstoff (0,01 %) und Thimerosal-Konservierungsmittel (0,01 %) in Glycinpuffer (0,1 molar, pH 8,5) umfaßte, wurde auf einem begrenzten Bereich der Membran in einer der Testplattenvertiefungen (als Probenvertiefung bezeichnet) aufgetragen.
Ziegengammaglobulin wurde an denselben Teilchentyp kovalent gebunden, wobei dasselbe Verfahren verwendet wurde, und das erhaltene Reagenz wurde auf die Membran einer anderen Testvertiefung (als die Vertiefung der negativen Kontrolle bezeichnet) aufgebracht. Eine dritte Testvertiefung (als die Vertiefung der positiven Kontrolle bezeichnet) enthielt anti-hCG-Antikörper, die an denselben Teilchentyp kovalent gebunden waren, und hCG-Antigen, das vorher an die Antikörper gebunden war.
Die Testlösung enthielt hCG (50 mI.U./ml) in einer Lösung aus phosphatgepufferter Salzlösung (150 mmolares Natriumchlorid, 50 mmolares Natriumphosphat, pH 6,2), Rinderserumalbumin (0,7 %) und Merthiolat (0,01 %).
Es wurde ein Konjugat aus monoklonalen anti-hCG-Antikörpern (Cambridge Medical Diagnostics) und Meerrettichperoxidase (Miles) hergestellt, wobei die von Yoshitake und anderen, Eur. J. Biochem., 101, 395 (1979), beschriebenen Verfahren verwendet wurden. Dieses Konjugat wurde mit Medix Peroxidase-Verdünnung (Medix Biotech, Inc., Foster City, California) gemischt, die amphoteres Surfactant Lonzaine C (0,1 %, Lonza Corp.) enthielt. Die endgültige Konjugatkonzentration betrug 3,38 µg/ml.
Eine Waschlösung wurde aus Natriumphosphat (0,1 molar, pH 7,2), Natriumdecylsulfat (100 mmolar, 2,7 %), Natriumchlorid (0,3 molar) und Thimerosal (0,01 %) hergestellt.
Eine farbstoffbildende Zusammensetzung umfaßte 2-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol-Leukofarbstoff (0,005 %), Poly(vinylpyrrolidon) (1 %), Natriumphosphatpuffer (5 mmolar, pH 6,8), Diethylentriaminpentaessigsäure (10 µmolar), 4-Hydroxyacetanilid (2 mmolar) und Wasserstoffperoxid (10 mmolar).

Testverfahren:

Die Testlösung (150 µl), die hCG (50 mI.U./ml) enthielt, wurde zu den drei Testvertiefungen der Testvorrichtung gegeben, und man ließ die Flüssigkeiten durch die Membranen laufen. Die gepufferte Zusammensetzung, die markierten Antikörper (1 Tropfen, etwa 40 µl) enthielt, wurde zu jeder Testvertiefung zugegeben, und man ließ sie durchlaufen. Die Testvertiefungen wurden zweimal gewaschen (jedesmal mit 300 µl) und durchlaufen gelassen. Die farbstoffbildende Zusammensetzung (50 µl) wurde dann zu jeder Testvertiefung zugegeben und durchlaufen gelassen. Nach einer Inkubation für weniger als 1 Minute bei Raumtemperatur wurde die Farbstoffdichte auf den Membranen gegenüber einer Farbkarte für Farbstoffdichte bestimmt, wobei 10 für die höchste Dichte steht. Die Bereiche in den Testvertiefungen um die aufgetragenen Zusammensetzungen herum wurden als Hintergrund bewertet. Der Test wurde dreimal durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI als in den spezifischen Testvertiefungen visuell bestimmte Farbstoffdichten für jeden der drei Tests angegeben: TABELLE VI Negative Kontrolle Vertiefung Probenvertiefung Vertiefung der Positiven Kontrolle Test Hintergrund
Diese Daten zeigen, daß in drei separaten Tests bei Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenzes ohne weiteres eine sehr niedrige Konzentration von hCG (50 mI.U.) mit einem Hintergrund von 0 nachgewiesen werden kann.
Zum Vergleich wurde das vorherige Beispiel wiederholt, wobei jedoch ein Kontrollreagenz verwendet wurde, das mit polyklonalen Antikörpern hergestellt wurde, die an Teilchen gebunden waren, die auf ähnliche Weise aus Poly[styrol-co-m- & p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)styrol] (Molverhältnis 95,5 : 4,5) hergestellt wurden (vergleiche die Lehre der EP-A-0 323 692, veröffentlicht am 12. Juli 1989). Die Antikörper wurden gebunden, indem eine Suspension der Teilchen der Kontrolle (3 % Feststoffe) mit Boratpuffer (0,1 molar, pH 8,5) in einem "Microfuge"-Röhrchen gemischt wurde. Eine Lösung (810 µl) der polyklonalen Antikörper (13,2 mg/ml) wurde zu dem Röhrchen zugegeben und anschließend 18 Stunden lang bei Raumtemperatur einer end-over-end-Rotation unterzogen. Das erhaltene Reagenz wies etwa 99 % der theoretischen Antikörper an die Teilchen kovalent gebunden auf.
Die Testlösungen, die hCG, Konjugatzusammensetzung, Waschlösung und farbstoffbildende Zusammensetzung enthielten, waren dieselben wie zuvor beschrieben.
Die Ergebnisse des Kontrolltests, bei dem das zuvor beschriebene Verfahren verwendet wurde, waren wie folgt: Durch die niedrige Konzentration (50 mI. U./ml) an hCG wurde weniger Farbstoffbildung erzeugt und ein vernachlässigbarer Hintergrund erzeugt. Da der Test in weniger als zwei Minuten durchgeführt wurde, betrug das Farbstoffsignal für acht verschiedene Tests im Durchschnitt lediglich 1,9, was beträchtlich niedriger ist als die Ergebnisse, die mit der vorliegenden Erfindung erhalten werden (Tabelle VI).

Beispiel 12: Reagenz und Test zum Nachweis von HIV-I-DNA

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung mehrerer erfindungsgemäßer Reagenzien, die an polymere Teilchen kovalent gebundene Oligonukleotide aufweisen, und deren Verwendung in Nukleinsäuretests zum Nachweis von HIV-I-DNA, β-Globin-DNA oder von beiden. Die Verfahren werden mittels analytischer Verfahren und Vorrichtungen durchgeführt, wobei die Reagenzien auf mikroporösen Membranen LoProdyne (Pall Corp., 5 µm) immobilisiert werden.

Materialien:

Es wurden folgende Polymere zur Herstellung von Bestimmungsreagenzien verwendet:
Kontrolle Poly(styrol-co-acrylsäure) (Molverhältnis: 97,5 : 2,5).
Polymer A Poly(styrol-co-mono-m- & p-(60 : 40)-vinylbenzylglutarat) (Molverhältnis 97,84 : 2,16).
Polymer B Poly[styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure] (Molverhältnis 97,59 : 2,41).
Polymer C Poly[styrol-co-mono-2-(4-vinylbenzylthio)ethylsuccinat] (Molverhältnis 98,17 : 1,83).
Polymer D Poly(styrol-co-mono-4-vinylbenzylsuccinat) (Molverhältnis 97,71 : 2,29).
Das Oligonukleotid, das zum Herstellen des Reagenzes verwendet wurde, ist zu einem Teil der HIV-I-DNA in der gag-Region komplementär und weist die folgende Nukleinsäuresequenz (SEQ. ID No.: 3) auf:
5'-X-ATTAAATAAA ATAGTAAGAA T-3'
in der X für eine Aminogruppe steht, die durch einen Ethylenglycolspacer gemäß US-A-4,914,210 an das Oligonukleotid gebunden ist.
Teilchensuspensionen eines jeden Polymers wurden mit 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure-Puffer (0,1 molar, pH 6) gewaschen. Proben (30 µg) der Teilchen wurden in dem Puffer (1 ml) suspendiert und mit dem Oligonukleotid (0,0288 ml, 57,3 OD/ml gereinigtes Wasser, 1,65 OD Einheiten) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (0,15 ml einer 100 mg/ml Pufferlösung) gemischt. Die erhaltenen Gemische wurden bei Raumtemperatur 15 Stunden lang einer end-over-end-Rotation unterzogen und zentrifugiert. Die Reagenzien wurden dreimal mit gereinigtem Wasser gewaschen und in gereinigtem Wasser bei einem Feststoffgehalt von 0,9 % resuspendiert.
Die erhaltenen Reagenzien wurden auf separaten mikroporösen Membranen LoProdyne , die in Testvertiefungen von Surecell -Einweg-Testvorrichtungen vorlagen, aufgebracht, und zwar in definierten Regionen von weniger als 2 mm² im Durchmesser, und man ließ sie etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen. Die erhaltenen diagnostischen Testelemente wurden dann in den im folgenden beschriebenen Tests verwendet.
Primer, die bei der Amplifikation von HIV-I-DNA verwendet wurden, wiesen die folgenden Nukleinsäuresequenzen auf (SEQ. ID No.: 4 bzw. 5):
5'-X TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3' und
5'-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3'
in denen X für einen Biotintetraethylenglycolester-Spacer steht, der gemäß US-A-4,914,210 hergestellt und gebunden wurde.
Die bei der Amplifikation von β-Globin-DNA verwendeten Primer wiesen die folgenden Nukleinsäuresequenzen auf (SEQ. ID No. 6 bzw. 7):
5'-X-CAACTTCATC CACGTTCACC-3' und
5'-ACACAACTGT GTTCACTAGC-3'
in der X für einen Biotinaminolinker steht, der gemäß US-4,914,210 hergestellt und gebunden wurde.
Sämtliche in diesem Beispiel (und in sämtlichen anderen Beispielen dieser Anmeldung) verwendeten Primer und Oligonukleotide wurden mittels Phosphoramidit-Standardchemie hergestellt, mit Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt und mittels Standardsequenzierverfahren charakterisiert.
DNA-Polymerase wurde aus Thermus aquaticus gemäß den in der US-A-4,889,818 beschriebenen Verfahren isoliert (1 Einheit entspricht 10 mmol in das Primerextensionsprodukt in 30 Minuten bei 37 ºC eingebautes dNTP).
Ein Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat wurde von Zymed Labs (San Francisco) erhalten und mit einer phosphatgepufferten Salzlösung, die Kasein (0,5 %), 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurepuffer (100 mmolar, pH 7,5) und Konservierungsmittel (0,01 %) enthielt, auf 1 : 4000 verdünnt. Die endgültige Konjugatkonzentration betrug 312 ng/ml. Die phosphatgepufferte Salzlösung enthielt Natriumphosphat (25 mmolar, pH 7,3) und Natriumchlorid (75 mmolar).
Eine farbstoffbildende Zusammensetzung umfaßte 2-(4-Hydroxy- 3-methoxyphenyl)-4,5-bis-(4-methoxyphenyl)imidazol-Leukofarbstoff (0,005 %), Poly(vinylpyrrolidon) (1 %), Natriumphosphatpuffer (5 mmolar, pH 6,8), Diethylentriaminpentaessigsäure (10 µmolar), 4'-Hydroxyacetanilid (5 mmolar) und Wasserstoffperoxid (10 mmolar).

Test:

Das Verfahren zum Nachweis von HIV-I wurde auf folgende Weise durchgeführt.
Es wurde eine HIV-I-Target-DNA aus der HUT-Zellinie isoliert, die eine einzelne integrierte Kopie des viralen HIV-Genoms enthält, die von Dr. Bernie Poiesz der Syracuse University erhalten wurde.
Eine β-Globin-Target-DNA wurde aus menschlichen Plazentazellen isoliert.
Es wurden drei Targetproben amplifiziert und Nachweisverfahren unterzogen:
Probe A: enthielt HIV-I-Target-DNA, β-Globin-Target-DNA und lediglich die Primer für die HIV-I-Target-DNA.
Probe B: enthielt β-Globin-Target-DNA und nur Primer dafür.
Probe C: enthielt sowohl Targets als auch Primer für beide Targets.
Mischungen für die Polymerase-Kettenreaktion zum Amplifizieren der Target-HIV-I-DNA enthielten Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (10 mmolar, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar), Gelatine (10 µg), die zuvor angegebenen geeigneten Primer (jeweils 100 pmolar), dNTP's (jeweils 1,5 mmolar), die zuvor angegebene DNA-Polymerase (7,5 Einheiten) und das Target: entweder β-Globin-DNA (1 µg) oder HIV-I-DNA (etwa 10&supmin;¹&sup6; molar). Das Gesamtvolumen eines jeden Gemischs betrug 100 µl.
Jedes Reaktionsgemisch wurde in ein Propylen-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, Primerextensionsprodukte wurden gebildet und die Amplifikation der Targetnukleinsäure wurde mittels der folgenden 30 Thermalzyklen durchgeführt:
70 ºC, erhöhen auf 95 ºC 1 Minute
95 ºC 0,5 Minuten
95 ºC, senken auf 55 ºC 1,25 Minuten
55 ºC 0,5 Minuten
55 ºC, erhöhen auf 70 ºC 0,75 Minuten und
70 ºC 1 Minute.
Nach der Amplifikation wurden Aliquote (5 µl) eines jeden Reaktionsgemisches zu einer Lösung (95 µl) zugegeben, die Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (10 mmolar, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar) und Gelatine (1 µg/10 ml Lösung) enthielt, mittels Wärme denaturiert (5 Minuten bei 95 ºC) und zu den zuvor beschriebenen Surecell -Testvorrichtungen, in denen Reagenz immobilisiert ist, zugegeben (etwa 95 µl eines jeden Gemischs in jeder Testvertiefung).
Jede Testvertiefung wurde mit Band verschlossen, und die Vorrichtungen wurden 5 Minuten lang bei 42 ºC inkubiert, um die amplifizierte Target-HIV-I-DNA mit dem in den Testvertiefungen immobilisierten, wasserunlöslichen Reagenz zu hybridisieren. Das Verschlußband wurde von jeder Testvertiefung entfernt, und anschließend wurde mit einer gepufferten Lösung (250 µl), die Phosphatpuffer (20 mmolar, pH 7,4), Natriumchlorid (300 mmolar) und Ethylendiamintetraessigsäure (2 mmolar) enthielt, bei 55 ºC gewaschen.
Das Peroxidasekonjugat (50 µl, 15,6 ng) wurde zu jeder Testvertiefung zugegeben, und die Testvorrichtungen wurden 2 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde ein zweiter Waschschritt (250 µl) mit der zuvor angegebenen gepufferten Lösung durchgeführt. Die farbstoffbildende Zusammensetzung (100 µl) wurde dann zu jeder Testvertiefung zugegeben, und anschließend wurde bei Raumtemperatur weitere 2 Minuten inkubiert. Die Farbstoffbildung wurde durch Zugabe von Natriumazid (100 µl einer 0,1 %-igen Lösung) gestoppt, und der erhaltene rote Farbstoff in den Testvertiefungen wurde visuell bewertet. Jeder Test wurde zweimal durchgeführt.
Die Ergebnisse der Farbstoffbildung wurden auf einer Skala von 0 bis 10 eingestuft, wobei 10 für die höchste Farbstoffdichte steht. In der folgenden Tabelle VII sind beide Ablesewerte für jedes Reagenz und jede Probe angegeben. TABELLE VII Farbstoffdichte Reagenz Probe A (nur HIV-I-DNA) Probe B (nur β-Globin-DNA) Probe C (HIV-I- + β-Globin-DNA) Kontrolle Polymer
Diesen Ergebnissen läßt sich entnehmen, daß das erfindungsgemäße Reagenz erfolgreich als Sonde für den Nachweis amplifizierter HIV-I-DNA verwendet wurde. Die β-Globin-Target-DNA wurde jedoch selbst nach ihrer Amplifikation nicht in einem zufriedenstellenden Ausmaß nachgewiesen, da kein Fängerreagenz verwendet wurde, das ein zu β-Globin-DNA komplementäres Oligonukleotid aufweist. Die Hintergrund-Farbstoffdichten (Probe B) waren ausreichend niedrig.

Beispiel 13: Reagenz und Tests zum Nachweis von HIV-I-DNA und β-Globin-DNA

Dieses Beispiel wurde auf ähnliche Weise wie Beispiel 12 durchgeführt, mit der Ausnahme, daß zum Herstellen des Reagenzes für den Nachweis der HIV-I-DNA ein anderes Oligonukleotid verwendet wurde, und β-Globin-DNA wurde ebenfalls nach Amplifikation der Targetnukleinsäure nachgewiesen, wobei ein Reagenz verwendet wurde, das ein zur β-Globin-DNA komplementäres Oligonukleotid aufweist.
Das Reagenz zum Nachweis von von HIV-I-DNA wurde mittels eines Oligonukleotids hergestellt, das die folgende Sequenz (SEQ. ID No.: 8) aufweist:
5'-X-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C-3'
in der X eine Aminogruppe ist, die mit einem Spacer an das Oligonukleotid gebunden ist, wobei das in der US-A-4,914,210 beschriebene Verfahren verwendet wurde.
Das Reagenz zum Nachweis von β-Globin-DNA wurde mittels eines Oligonukleotids hergestellt, das die folgende Sequenz (SEQ. ID No. 9) aufweist:
5'-X-CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C-3'
in der X eine Aminogruppe ist, die mittels des in der US- A-4,914,210 beschriebenen Verfahrens an das Oligonukleotid gebunden wurde.
Drei Targetproben wurden amplifiziert und Nachweisverfahren unterzogen, wobei das HIV-I-DNA-Reagenz und das β-Globin- DNA-Reagenz verwendet wurde:
Probe A: enthielt HIV-I-Target-DNA, β-Globin-Target-DNA und lediglich die Primer für die HIV-I-Target-DNA.
Probe B: enthielt β-Globin-Target-DNA und nur Primer für diese.
Probe C: enthielt beide Targets und Primer für beide Targets.
Die Amplifikation wurde wie in Beispiel 12 beschrieben durchgeführt, und die erhaltenen Farbstoffdichten wurden wie darin gezeigt bewertet. Die Testergebnisse für jedes Reagenz und jede Testprobe sind in der folgenden Tabelle I angegeben. TABELLE VIII Reagenz Farbstoffdichte Polymer Oligonukleotid* Probe A (nur HIV-I-DNA) Probe B (nur β-Globin-DNA) Probe C (beide DNA's) * Oligonukleotid komplementär zu angegebenem Target +NT: Kein Test, da die Hintergrunddichte 5,0 betrug. Bei allen anderen betrug der Hintergrund weniger als 1,0.

Beispiel 14: Test für HIV-I-DNA in einem Polymerbeutel

Dieses Beispiel ist ähnlich wie Beispiel 12, mit der Ausnahme, daß HIV-I-DNA mittels eines formulierten Behälters nachgewiesen wird, der zur Aufnahme von Reagenzien für den Test geeignet ist.

Materialien:

Ein Behälter für den Test wurde aus zwei Blatt heißsiegelbarem Film Scotchpak 241 (3M Corp.), einem Laminat von Polyethylen auf Poly(ethylenterephthalat), hergestellt. Die Polyethylenseite des Films diente als ein wärmeaktiviertes Adhäsiv. Auf einem der Blätter wurde ein Fließkanal gebildet, indem es auf eine Form mit einer Nut gelegt wurde, bei einer Temperatur unterhalb des Schmelzpunkts des Polyethylens erwärmt wurde und der Film, während er wärmerelaxiert war, mechanisch in die Nut hinein gereckt wurde, um einen Kanal zu bilden. Das mit einem Kanal versehene Stück wurde dann mit einem zweiten Stück wärmesiegelbarem Film Scotchpak 241 ausgelegt, auf dem ein erfindungsgemäßes Reagenz (im folgenden beschrieben) in einer bestimmten Region immobilisiert war. Dieses Auslegen wurde so durchgeführt, daß die Polyethylenoberflächen der beiden Filme einander gegenüberlagen. Die beiden Filme wurden dann entlang beider Seitenränder des Kanals heißversiegelt, so daß entlang dieser Seiten keine Undichtigkeit auftrat.
Der erhaltene "Nachweiskanal" wurde verwendet, um eine "Flow-by"-Testform zu simulieren. Jeder Nachweiskanal wies eine Einlaßöffnung zum Einführen der Probe auf, ein darin immobilisiertes erfindungsgemäßes Reagenz und eine Auslaßöffnung, die den Austritt der Flüssigkeiten aus dem Kanal ermöglichte, so daß sie aufgefangen werden konnten. Flüssige Reagenzien wurden in den Kanal gepreßt, damit sie mit dem immobilisierten Reagenz in Kontakt kamen, bevor sie den Kanal verließen.
Die in diesem Beispiel verwendeten Reagenzien wurden mittels der Polymere B, C und D von Beispiel 12 und unter Verwendung des Verfahrens dieses Beispieles hergestellt. Die erhaltenen Reagenzien (2 µl einer 0,9 %-igen Suspension) wurden für einzelne Beutel auf einem definierten Bereich (etwa 2 mm Durchmesser) des Nachweiskanals wie zuvor beschrieben angebracht (die Kanalgröße betrug etwa 19 mm auf 8 mm) und bei Raumtemperatur trocknen gelassen.
Die HIV-I-Target-DNA und die Primer waren dieselben wie die in Beispiel 12 verwendeten. Das Reaktionsgemisch für die Polymerase-Kettenreaktion war dasselbe, mit der Ausnahme, daß Gelatine mit 0,01 % vorlag und die Primer jeweils 1 µmolar vorlagen.

Test:

Eine Lösung, die die HIV-I-Target-DNA (10&supmin;¹&sup6; molar) enthielt, wurde mittels Polymerasekettenblistern auf einem Standard- Thermocycler und dem Polymerase-Kettenreaktionsgemisch (100 µl) 30 - 33 Zyklen lang gemäß folgendem Protokoll amplifiziert:
Inkubation bei 94 ºC 4 Sekunden und
Inkubation bei 65 ºC 30 Sekunden.
Eine Probe (200 µl) einer Verdünnung von 5 : 95 des erhaltenen amplifizierten Reaktionsgemischs in einer Pufferlösung [die Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (10 mmolar, pH 8,3), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar) und Gelatine (0,01 %) enthielt] wurde in einem Röhrchen 5 Minuten lang bei 95 ºC erhitzt, um die doppelsträngigen Targets zu denaturieren. Die erhitzte Lösung wurde in eine Spritze überführt und auf solche Weise in jeden Nachweiskanal injiziert, daß eine gleichmäßige Bedeckung der immobilisierten Reagenzien in den Kanälen gewährleistet wurde. Jeder Kanal wurde dann 5 Minuten lang bei 42 ºC inkubiert, um das Reagenz an die einzelsträngige HIV-I-Targetnukleinsäure zu hybridisieren. Die Flüssigkeit wurde aus den Nachweiskanälen entfernt, indem die Flüssigkeit mit Luft herausgedrückt wurde, und die Flüssigkeit wurde mit einer Spritze aufgefangen.
Es wurde in jeden Nachweiskanal eine vorerwärmte (55 ºC) Waschlösung injiziert. Diese Lösung umfaßte eine Pufferlösung (400 µl), die Natriumdihydrogenphosphat (10 mmolar, pH 7,4), Natriumchlorid (150 mmolar), Ethylendiamintetraessigsäure (1 mmolar) und Natriumdecylsulfat (1 %) umfaßte. Die Waschlösung wurde entfernt, und das Streptavidin-Meerrettichperoxidase- Konjugat von Beispiel 12 (200 µl) wurde dann in jeden Nachweiskanal injiziert und bei Raumtemperatur 2 Minuten lang inkubiert. Die Flüssigkeit wurde entfernt, und eine zweite Waschflüssigkeit (400 µl) wurde eingeführt und entfernt. Die farbstoffbildende Zusammensetzung von Beispiel 12 (200 µl) wurde dann in jeden Kanal eingeführt und bei Raumtemperatur 1 - 2 Minuten lang inkubiert und entfernt. Schließlich wurde eine Lösung aus Natriumazid (200 µl einer 0,1 %-igen Lösung) eingeführt, um die Farbstoffbildung zu stoppen, und entfernt.
Der erhaltene Farbstoff, der sich in jedem Kanal gebildet hatte, wurde auf einer Skala von 0 bis 10 visuell eingestuft, wobei 10 die höchste Farbstoffdichte bedeutet. Die Ergebnisse der Ablesungen sind für den Durchschnitt von drei separaten Tests für jedes Reagenz in der folgenden Tabelle IX angegeben. TABELLE IX Reagenz Farbstoffdichte Polymer
Es wurden ähnliche Versuche erfolgreich durchgeführt, wobei der Behälter, in dem der Farbstoff gebildet wurde, ein in sich geschlossenes Gefäß (oder Beutel) war, das für sämtliche für den Test benötigten Reagenzien und Lösungen Kompartimente aufwies und für die Reaktion ein separates Kompartiment aufwies. Derartige in sich geschlossene Gefäße sind ausführlicher in der EP-A-0 381 501 beschrieben.

Beispiel 15: Herstellungen von Reagenzien, die zum Nachweis von DNA des Cytomegalievirus brauchbar sind

Diese Erfindung beschreibt ein neues Verfahren zum Herstellen von Hybridisierungsreagenzien, die in Hybridisierungs- oder Polymerase-Kettenreaktionstests verwendet werden können. Die Reagenzien sind beim Nachweis von DNA des Cytomegalievirus brauchbar.

Materialien:

Es wurden polymere Teilchen, die aus Poly[styrol-co-3- (p-vinylbenzylthio)propionsäure] (Molverhältnis 97,6 : 2,4, 1,4 µm durchschnittlicher Durchmesser) zusammengesetzt waren, zur Herstellung der Reagenzien verwendet.
Das Aktivierungsmittel war 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimid-Hydrochlorid, und der Puffer war 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (0,1 molar, pH 6).
Die verwendeten Oligonukleotide weisen die folgenden Sequenzen auf, wobei die Basen mittels Standardbezeichnungen angegeben werden:
SEQ. ID NO.: 10 5'-GGTGTCACCC CCAGAGTCCC CTGTACCCGC-3'
SEQ. ID NO.: 11 5'-GACACAGTGT CCTCCCGCTC CTCCTGAGCA-3'
SEQ. ID NO.: 12 5'-GTGGAAGGCG GCTCGCTGGA AGCCGGTCGT-3'
SEQ. ID NO.: 13 5'-GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG-3'
Die Oligonukleotide wurden durch das 3'-Ende an die Teilchen gebunden, wobei die folgende Linkergruppe verwendet wurde: Thymidin Oligonukleotid

Reagenzherstellung

Eine Suspension der polymeren Teilchen (etwa 12 - 16 % Feststoffe) wurde zentrifugiert (5000 UpM), und das erhaltene Pellet wurde zu 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (500 µl, 0,1 molar, pH 6) zugegeben und nochmals etwa 7 Minuten lang zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde wiederholt, und schließlich wurden die Teilchen in Puffer resuspendiert (etwa 12 % Feststoffe).
Vier Röhrchen, die die angegebene Teilchensuspension enthielten, wurden durch Zugabe der zuvor angegebenen Suspension (380 µl) zu dem Puffer (120 µl) hergestellt. Eine Lösung (100 µl) des Aktivierungsmittels (125 mg in 500 µl nanoreinem Wasser) wurde zu jedem Röhrchen zugegeben, und die erhaltenen Gemische wurden durch manuelle end-over-end-Rotation etwa 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gemischt, um aktivierte polymere Teilchen zu bilden.
Eine Lösung (2 OD) eines jeden Oligonukleotids wurde zu verschiedenen Röhrchen in folgenden Volumina zugegeben: 48,3 µl der SEQ. ID No.: 10, 37,7 µl der SEQ. ID No.: 11, 45,4 µl der SEQ. ID No.: 12 und 32,3 µl der SEQ. ID No.: 13. Jedes Röhrchen enthielt 600 µl aktivierte Teilchen. Die Röhrchen wurden dann bei Raumtemperatur etwa 18 Stunden lang einer end-over-end-Rotation unterzogen, um die Oligonukleotide an die aktivierten Teilchen kovalent zu binden.
Die Reaktionsgemische wurden dann zentrifugiert und die Pellets in nanoreinem Wasser (500 µl) resuspendiert und nochmals zentrifugiert. Die Behandlung mit dem Wasser und der Zentrifugation wurde zweimal wiederholt, und das fertige Pellet wurde in nanoreinem Wasser (600 µl) resuspendiert, um eine Suspension des Reagenzes (etwa 12 % Feststoffe) herzustellen. Diese Suspension wurde für die Verwendung in einem Test auf etwa 1 % Feststoffe verdünnt. Die Konzentrationen wurden durch Verdünnung und Vergleich mit einer Verdünnungsstandardkurve spektrophotometrisch bestimmt.

Beispiel 16: Test für DNA des Cytomegalievirus

Test A für DNA des Cytomegalievirus wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen, in Beispiel 15 hergestellten Reagenzien durchgeführt, wobei 12 %-ige Suspensionen von polymeren Teilchen verwendet wurden. Er wurde mit Test B verglichen, der mit erfindungsgemäßen Reagenzien durchgeführt wurde, die jedoch mittels eines Verfahrens des Standes der Technik hergestellt waren, bei dem etwa 1 - 3 %-ige Suspensionen der polymeren Teilchen verwendet wurden.

Materialien und Verfahren:

Die nachzuweisende Target-DNA war ein 200 Nukleotid-Segment der späten Antigenregion (LA-Region) und ein 265 Nukleotid- Segment der sogenannten Major Immediate Early-Region (MIE- Region) des Stammes CMV Towne (ATCC VR 977).
Die zum Nachweis der LA-Region verwendeten Oligonukleotide wiesen die folgenden Sequenzen auf (SEQ. ID No.: 14 bzw. 15):
5'-GTCGAAGGCG GCTCGCTGGA AGCCGGTCGT-3' und
5'-GAACCGAGGC CGGCTCACCT CTATGTTGG-3'.
Die zum Nachweis der LA-Region verwendeten Primer wiesen die folgenden Sequenzen auf (SEQ. ID No.: 16 bzw. 17):
5'-CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT-3' und
5'-GTCGCCTGCG CCAGGTGCTT CG-3'.
Die zum Nachweis der MIE-Region verwendeten Oligonukleotide wiesen die folgenden Sequenzen auf (SEQ. ID No.: 18 bzw. 19):
5'-GGTGTCACCC CCAGAGTCCC CTGTACCCGC-3' und
5'-GACACAGTGT CCTCCCGCTC CTCCTGAGCA-3'.
Die Primer für die MIE-Region wiesen die folgenden Sequenzen auf (SEQ. ID No.: 20 bzw. 21):
5'-CAGCACCATC CTCCTCTTCC TCTGG-3' und
5'-GAGGCTATTG TAGCCTACAC TTTGG-3'.
Die Oligonukleotide wurden wie in Beispiel 15 beschrieben an die polymeren Teilchen gebunden, wobei etwa 12 %-ige Suspensionen der Teilchen verwendet wurden, um die erfindungsgemäßen Reagenzien (oder Sonden) für Test A herzustellen. Die Oligonukleotide wurden an die polymeren Teilchen gebunden, wobei 1 - 3 %-ige Suspensionen der Teilchen verwendet wurden, um Reagenzien (oder Sonden) für Test B herzustellen.
Die Reagenzien für Test A für die LA-Region wurden gemischt (1 µl einer 0,5 %-igen Suspension eines jeden Reagenzes) und auf einen definierten Bereich der Membran (5 µm mikroporöse Membran LoProdyne , Pall Corp.) in den Testvertiefungen eines Satzes von Surecell -Testvorrichtungen (Eastman Kodak Co.) aufgetupft. Die Reagenzien für Test A für die MIE-Region wurden auf ähnliche Weise gemischt und auf einen zweiten definierten Bereich derselben Membranen in denselben Vorrichtungen aufgetupft. Die aufgetragenen Reagenzien ließ man etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur trocknen.
Die Reagenzien für Test B (hergestellt nach Verfahren des Stands der Technik) für die LA-Region wurden gemischt und wie zuvor beschrieben in einem zweiten Satz von Testvorrichtungen aufgetupft. Die Reagenzien für Test B für die MIE-Region wurden gemischt und auf einen zweiten definierten Bereich derselben Membranen aufgetupft.
Ein Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Konjugat wurde von Zymed Labs (San Francisco) erhalten und wurde mit einer phosphatgepufferten Salzlösung, die Casein (0,5 %), 3-(N-Morpholino)propansulfonsäurepuffer (100 mmolar, pH 7,5) und Konservierungsmittel (0,01 %) enthielt, auf 1 : 8000 verdünnt. Die endgültige Konjugatkonzentration betrug 156 ng/ml. Die phosphatgepufferte Salzlösung enthielt Natriumphosphat (25 mmolar, pH 7,3) und Natriumchlorid (75 mmolar).
Eine farbstoffbildende Zusammensetzung, die 2-(4-Hydroxy- 3,5-dimethoxyphenol)-4,5-bis(4-methoxyphenyl)imidazol enthielt, wurde wie folgt hergestellt:
Fester Leukofarbstoff (für eine 0,1 %-ige Lösung) wurde in einer Lösung von 20 %-igem Poly(vinylpyrrolidon) in Natriumphosphatpuffer (5 mmolar) aufgelöst. Diese Lösung wurde dann zu einer Lösung zugegeben, die Wasserstoffperoxid (10 mmolar), 4'-Hydroxyacetanilid als Elektronenagens (5 mmolar) und Diethylentriaminpentaessigsäure als Chelatbildner (10 µmolar) in Natriumphosphatpuffer enthielt, wobei man eine Endkonzentration von 1 % Poly(vinylpyrrolidon) und 0,005 % Leukofarbstoff erhielt.
DNA-Polymerase, die nach dem in der EP-A-0 0258 017 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde (1 Einheit entspricht 10 mMolen in das Primerextensionsprodukt in 30 Minuten bei 37 ºC eingebauten dNTP), wurde von Cetus Corp. erhalten.

Test:

Zu Pufferlösungen, die Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (10 mmolar, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar) und Gelatine (10 µg) enthielten, wurden die zuvor beschriebenen Primer (jeweils 40 pMole), dNTP's (jeweils 1,5 molar) und die zuvor beschriebene Polymerase (7,5 Einheiten) zugegeben. Zusätzlich wurden die zuvor beschriebenen Targets der Towne-Stämme zugegeben. Das gesamte Volumen betrug 100 µl.
Jede zuvor beschriebene Lösung wurde in ein Polypropylen- "Microfuge"-Röhrchen gegeben, Primerextensionsprodukte wurden gebildet und die Amplifikation durchgeführt, wobei 33 aufeinanderfolgende Thermalzyklen wie folgt verwendet wurden:
66 ºC ansteigend auf 92,5 ºC 35 Sekunden
92,5 ºC 1 Minute
92,5 ºC senken auf 66 ºC 45 Sekunden
66 ºC 1 Minute
Nach der Amplifikation wurden Aliquote (5 µl) eines jeden Gemischs zu einer Lösung (95 µl) von Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (10 mmolar, pH 8) zugegeben, der Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar) und Gelatine (1 µg/10 ml Lösung) enthielt, hitzedenaturiert (5 Minuten bei 95 ºC), dann zu den Testvertiefungen der zuvor beschriebenen Surecell -Testvorrichtungen zugegeben (etwa 95 µl einer jeden Lösung in den einzelnen Vertiefungen).
Die Testvorrichtungen wurden 5 Minuten lang bei 42 ºC inkubiert, um die amplifizierte Target-DNA an die jeweiligen Reagenzien (oder Gensonden), die in den Testvertiefungen immobilisiert waren, zu hybridisieren. Die hybridisierten Produkte wurden mit einer gepufferten Lösung (250 µl) gewaschen, die Phosphatpuffer (10 mmolar, pH 7,4), Natriumchlorid (150 mmolar), Ethylendiamintetraessigsäure (1 mmolar) und Natriumdecylsulfat (1 %) bei 55 ºC enthielt.
Das zuvor beschriebene Peroxidase-markierte Avidinkonjugat (50 µl, 7,8 ng) wurde zu jeder Testvertiefung zugegeben, und die Vorrichtungen wurden bei Raumtemperatur 2 Minuten lang inkubiert. Ein zweiter Waschschritt (250 µl) wurde durchgeführt, wobei die zuvor angegebene Pufferlösung verwendet wurde. Die Leukofarbstofflösung (100 µl) wurde zu jeder Testvertiefung zugegeben und anschließend 2 Minuten lang bei Raumtemperatur nochmals inkubiert. Die Bildung des Farbstoffs wurde durch die Zugabe von Natriumazid (100 µl einer 0,1 %-igen Lösung) gequencht, und die erhaltenen Farbstoffsignale auf den Membranen wurden bewertet.
Die Menge an Farbstoff in jeder Testvorrichtung wurde gegen eine Farbskala mit den Werten 0 bis 10 visuell bewertet, wobei 10 für die höchste Farbstoffdichte steht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle X für vier separate Tests für jeden der Tests A und B angegeben. TABELLE X Farbstoffdichte-Ablesungen LA-Region MIE-Region Test

Beispiel 17: Vergleichsbeispiel der Reagenzien

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von verschiedenen erfindungsgemäßen Reagenzien und den Vergleich mit Reagenzien, die mit nicht zu dieser Erfindung gehörenden Polymeren hergestellt wurden.
Die zur Herstellung der Reagenzien verwendeten Teilchen waren aus den folgenden Copolymeren zusammengesetzt:
Test A: Poly(styrol-co-mono-m- & p-vinylbenzylglutarat) (Molverhältnis 97,84 : 2,16),
Test B: Poly(styrol-co-mono-p-vinylbenzylglutarat-codivinylbenzol) (Molverhältnis 97,01 : 2,16 : 0,83),
Test C: Poly(styrol-co-mono-2-methacryloyloxyethylglutarat) (Molverhältnis 97,84 : 2,16),
Test D: Poly(styrol-co-mono-2-methacryloyloxyethylglutarat-co-divinylbenzol) (Molverhältnis 97,01 : 2,16 : 0,83),
Test E: Poly[styrol-co-monomethacryloylpenta(oxyethylen)glutarat] (Molverhältnis 98,7 : 1,3),
Test F: Poly[styrol-co-monomethacryloyldeca(oxyethylen)glutarat] (Molverhältnis 99,2 : 0,8),
Test G: Poly[styrol-co-mono-2-(m- & p-vinylbenzylthio)ethylglutarat] (Molverhältnis 98,3 : 1,7),
Test H: Poly[styrol-co-mono-2-(p-vinylbenzylthio)ethylglutarat] (Molverhältnis 98,25 : 1,75),
Test I: Poly[styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure] (Molverhältnis 97,59 : 2,41),
Test J: Poly[styrol-co-mono-2-(4-vinylbenzylthio)ethylsuccinat] (Molverhältnis 98,17 : 1,83),
Test K: Poly{styrol-co-4-[2-(carboxymethoxyacetoxy)ethylthiomethyl]-styrol} (Molverhältnis 98,26 : 1,74),
Test L: Poly(styrol-co-mono-4-vinylbenzylsuccinat) (Molverhältnis 97,71 : 2,29),
Test M: Poly[styrol-co-mono-methacryloylpenta(oxyethylen)phthalat] (Molverhältnis 98,81 : 1,19),
Kontrolle A: Poly(styrol-co-acrylsäure) (Molverhältnis 95 : 5) und
Kontrolle B: Poly(styrol-co-3-acrylamido-3-methylbutansäure (Molverhältnis 96,9 : 3,1).
Proteine wurden an die polymeren Teilchen gebunden, wobei 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyridiniumchlorid als das Aktivierungsmittel verwendet wurde. Sämtliche Teilchen wurden unter denselben Bedingungen behandelt. Die fertigen Dispersionen umfaßten Antikörper (entweder verriebenes Rindergammaglobulin wie im vorherigen Beispiel 1 oder Thyroxinantikörper wie im vorherigen Beispiel 2) in einer Menge von 1,7 mg/m² Polymeroberfläche in 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer (0,1 molar, pH 5,5) und Aktivierungsmittel (1,5 mmol Agens/g Teilchen oder 0,045 mmol).
Diese Dispersionen wurden durch Zugabe von Teilchensuspensionen (30 mg Trockengewicht) zu großen "Microfuge"-Röhrchen hergestellt, und jedes wurde mit dem angegebenen Puffer auf ein Volumen von 1,5 ml gebracht. Die erhaltenen Suspensionen wurden 15 Minuten lang bei 13 000 UpM zenrifugiert, und die Überstände wurden verworfen. Zu jedem Röhrchen wurde Puffer (1 ml, 0,1 molar) zugegeben, und anschließend wurde das Aktivierungsmittel (0,3 ml einer 0,15 molaren Lösung in Puffer) zugegeben. Die Röhrchen wurden dann mit einer Kappe versehen und bei Raumtemperatur 10 Minuten lang einer end- over-end-Rotation unterzogen, um aktivierte polymere Teilchen zu erhalten.
Eine Lösung des jeweiligen Proteins wurde zu den jeweiligen Röhrchen zugegeben, die aktivierte polymere Teilchen enthielten, um eine Endkonzentration der Polymerteilchen von 1,7 mg/m² zu erhalten. Zu bestimmten Röhrchen wurde verriebenes Rindergammaglobulin zugegeben, während zu anderen Röhrchen monoklonale Thyroxinantikörper (Cambridge/Ventrex) zugegeben wurden. Zu sämtlichen Röhrchen wurde dann Puffer zugegeben, um ein Endvolumen von 1,5 ml zu erreichen. Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur 24 Stunden lang einer end-over- end-Rotation unterzogen, um das Protein mit den aktivierten Teilchen reagieren zu lassen.
Die Reaktion der Antikörper mit den Teilchen wurde durch Zugabe von Rinderserumalbumin (250 µl, 100 mg Protein/ml) zu jedem Röhrchen gequencht. Die Röhrchen wurden dann nochmals weitere 16 Stunden lang bei Raumtemperatur rotiert.
Die Reagenzien, an die ³H-Rindergammaglobulin gebunden war, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, um die Gesamtmenge an gebundenem Protein sowie die kovalent gebundene Menge zu bestimmen.
Die Reagenzien mit gebundenen Thyroxinantikörpern wurden gewaschen, und die relativen Mengen an aktivem Antikörper in den erhaltenen Dispersionen wurden wie in Beispiel 2 beschrieben bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XI zusammengefaßt. Die Ergebnisse zeigen, daß das verriebene Rindergammaglobulin in den meisten erfindungsgemäßen Reagenzien sehr gut kovalent gebunden wurde. Die Reagenzien der Tests E und F banden das Protein nicht so gut kovalent wie die anderen Reagenzien. Wurde jedoch eine funktionelle aromatische Carboxygruppe zu dem Ende der Linkergruppe zugegeben (wie für das Reagenz in Test M), war die Menge an kovalent gebundenem Protein wesentlich höher.
Die Reagenzien mit gebundenen Antikörpern zeigten eine 3 - 20 mal höhere Aktivität als die Reagenzien in den Kontrollen, wie sich der letzten Spalte von Tabelle XI entnehmen läßt. TABELLE XI Test Insgesamt gebunden % Kovalent gebunden % Kovalent: Gesamtverhältnis Theoretische Thyroxin-Bindungsstellen bei 50 % gebundenem Marker (nmolar) Kontrolle

Beispiel 18: Immunoassay für Thyroxin unter Verwendung eines trockenen analytischen Elements

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines erfindungsgemäßen trockenen analytischen Elements und seine Verwendung in einem kompetitiven Immunoassay zur Bestimmung des Hormons Thyroxin in einer Flüssigkeitsprobe. Beide erfindungsgemäßen Reagenzien werden in den Tests mit einem Kontrollreagenz verglichen.
Zwei gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 hergestellte Reagenzien wurden in diesem Test verwendet. Ein Kontrollreagenz wurde mittels des in der EP-A-0 280 556 beschriebenen Verfahrens hergestellt. Das verwendete Aktivierungsmittel war 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyridiniumchlorid. Die Reagenzien wurden in Bariumsulfat-Standardausbreitschichten der Elemente mit zwei Konzentrationen eingebaut: entweder 25 mg Polymer/m² Schichtoberfläche oder 50 mg Polymer/m² Schichtoberfläche.
Die zur Herstellung der Reagenzien verwendeten Copolymere waren:
Test A Poly(styrol-co-mono-m- & p-vinylbenzylglutarat) (Molverhältnis 97,84 : 2,16),
Test B Poly(styrol-co-mono-2-methacryloyloxyethylglutarat) (Molverhältnis 97,84 : 2,16) und
Kontrolle Ein Kern/Mantel-Polymerteilchen mit einem Kern aus Poly(styrol-co-ethylendimethacrylat) (Molverhältnis 99 : 1) und einem Mantel aus Poly[styrol-co-m- & p-(2-chlorethylsulfonylmethyl)styrol-co-ethylendimethacrylat] (Molverhältnis 94,5 : 4,5:1).
Die Struktur des in dem Test verwendeten Elements war wie folgt: Beschichtungsgrad (g/m²) Ausbreitschicht Subbingschicht Gelatineschicht Bariumsulfat Reagenz mit Thyroxinantikörpern Celluloseacetat Estane -Polyurethan (B. F. Goodrich) Surfactant Triton X-405 (Rohm und Haas) Poly(N-isopropylacrylamid) Gelatine Triethanolamin (pH 7,5) Rinderserumalbumin Surfactant Triton X-100 (Rohm und Haas) Magnesiumchlorid Zinkchlorid Gehärtete Gelatine Poly(ethylenterephthalat)Träger
Eine Reihe von Thyroxin-Standardlösungen unterschiedlicher Konzentrationen von 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;¹&sup0; molar wurden in dem im folgenden beschriebenen Puffer aus einer 1 x 10&supmin;³ molaren Thyroxin-Vorratslösung in Dimethylsulfoxid hergestellt. Der Puffer bestand aus phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,4), Rinderserumalbumin (1 %) und 8-Anilin-1-naphtalinsulfonsäure (8,7 x 10&supmin;&sup4; molar). Eine Lösung von alkalischer Phosphatase markiertem Thyroxin wurde mit einer Konzentration von 2,0 x 10&supmin;&sup8; molar hergestellt. Die markierten Analoga wurden mittels des von Ito und anderen, Clin. Chem., 30 (10), S. 1682 - 1685 (1984), beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Thyroxinstandarts und die markierten Analoglösungen wurden 1 : 1 gemischt, so daß die Endkonzentration des markierten Analogs 1,0 x 10&supmin;&sup8; molar war.
Aliquote (10 µl) dieses Gemischs wurden auf die Ausbreitschicht des Elements getupft. Nach 5-minütiger Inkubation bei 37 ºC wurde eine Waschlösung (10 µl), die p-Nitrophenylphosphat (15 mmolar) enthielt, zu dem Element zugegeben, um nicht-komplexiertes, markiertes Analog aus jedem in der Ausbreitschicht gebildeten Komplex zu entfernen. Nach einminütiger Inkubation wurde die Änderung in der Reflexionsdichte (ΔDR) bei 37 ºC und 400 nm in der Mitte des Elements 30 Sekunden lang gemessen, wobei ein Standardspektrophotometer verwendet wurde.
Die Testergebnisse für die beiden Thyroxinkonzentrationen sind in der folgenden Tabelle XII angegeben. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Thyroxinantikörper, der auf zwei erfindungsgemäßen Reagenzien in dem Element immobilisiert ist, gegenüber dem Kontrollreagenz verbesserte Ergebnisse aufweist. Insbesondere zeigen die erfindungsgemäßen Reagenzien eine "höhere Reaktionsgeschwindigkeit", wenn die Thyroxinkonzentration niedrig ist. Die Reagenzien zeigen daher eine hohe Bindungsreaktivität gegen das markierte Analog und bieten einen größeren Arbeitsbereich für den Test. Der Arbeitsbereich ist hier als die Differenz in den Geschwindigkeiten bei 10&supmin;¹&sup0; und 10&supmin;&sup5; molarem Thyroxin definiert. TABELLE XII Geschwindigkeit (ΔDR /Min.) Test Antikörperbeschichtungsgrad (g/m²) 10&supmin;¹&sup0; molar 10&supmin;&sup5; molar Arbeitsbereich Kontrolle

Beispiel 19: Test für Thyroxin in einem trockenen Element

Dieses Beispiel veranschaulicht die Durchführung der Erfindung zum Nachweis von Thyroxin in einem trockenen analytischen Element, wobei ein kompetitiv bindender Test und ein mit Meerrettichperoxidase markiertes Konjugat verwendet werden.
Es wurden zwei Thyroxinantikörper verwendet: (a) wurde von BiosPacific (Klon 035-A2206A) erhalten, und (b) wurde von Beckman Instruments (# 684823) erhalten. Sie wurden an Teilchen aus Poly[styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure] (Molverhältnis 97,59 : 2,41) kovalent gebunden, wobei das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren und 1-(1-Pyrrolidinylcarbonyl)pyridiniumchlorid als ein Aktivierungsmittel verwendet wurden. Die erhaltenen Reagenzien wurden in eine Ausbreitschicht des im folgenden veranschaulichten analytischen Elements eingebaut. Beschichtungsgrad (g/m²) Ausbreitschicht Gelatineschicht Reagenz (1,4 µm Teilchen) Teilchen aus Poly[m- & p- vinyltoluol (64 : 36)-comethacrylsäure) (Gewichtsverhältnis 98 : 2) (30 µm) 3,4-Bis (4-dimethylaminophenyl)-2-(3,5-dimethoxy- 4-hydroxyphenyl)imidazol 3-(4-Morpholino)propansulfonsäurepuffer Surfactant Zonyl FSN (DuPont) Xanthangummi (Kelzan von Kelco) 5,5-Dimethyl-1,3-cyclohexandion Poly(methylacrylat-co-natrium- 2-acrylamido-2-methylpropansulfonat-co-2-acetoacetoxyethylmethacrylat) (Gewichtsverhältnis 90 : 4 : 6) Gehärtete Gelatine Kaliumphosphat Surfactant Triton X-100 (Rohm und Haas) 4'-Hydroxyacetanilid Poly(ethylen-Terephthalat)Träger
Es wurde eine Reihe von Thyroxin-Standardlösungen aus einer 10&supmin;³ molaren Vorratslösung (in Dimethylsulfoxid) in dem im folgenden beschriebenen Puffer hergestellt, um Konzentrationen variierend von 10&supmin;&sup5; bis 10&supmin;¹&sup0; molar zu erhalten. Der Puffer bestand aus 3-(4-Morpholino)propansulfonsäurepuffer (0,2 molar, pH 7), 4-Hydroxyacetanilid (0,01 molar), 8-Anilinnaphthalin-1-sulfonsäure (8,7 x 10&supmin;&sup4; molar) und Rindergammaglobulin (0,1 %). Eine Meerrettichperoxidase-markierte Thyroxinanaloglösung wurde mit einer Konzentration von 2 x 10&supmin;&sup9; molar hergestellt. Das Analog wurde mittels des von Kunst und anderen, Clin. Chem., 34 (9), S. 1830 - 1833 (1988), beschriebenen Verfahrens hergestellt.
Das Analog und die Standardlösungen wurden 1 : 1 gemischt, so daß die Endkonzentration des Analogs 10&supmin;&sup9; molar war. Die Kontrollösung, die kein Thyroxin enthielt, wurde ebenfalls getestet.
Aliquote (10 µl) der Gemische wurden auf die Ausbreitschicht des Elements aufgetupft. Nach 5-minütiger Inkubation bei 37 ºC wurde eine Wasserstoffperoxid enthaltene Waschlösung (10 µl) zugegeben, um nicht-komplexiertes Analog aus dem Komplex in der Mitte des Elements zu waschen. Nach 40 Sekunden Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Änderung der Reflexionsdichte (ΔDR) 30 Sekunden lang in der Mitte des Elements bei 37 ºC und 680 nm gemessen, wobei ein Standardspektrophotometer verwendet wurde. Die Williams- Clapper-Transformation (J. Opt. Soc. Am., 43, 595, 1953) wurde zum Umrechnen der Reflexionsdichten in Transmissionswerte (ΔDT) verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XIII angegeben. Sie zeigen wesentliche Änderungen in der Geschwindigkeit in dem gewünschten Thyroxin-Konzentrationsbereich, wenn die beiden erfindungsgemäßen Reagenzien verwendet wurden. TABELLE XIII Geschwindigkeit (ΔDT /Min.) Thyroxinkonzentration (molar) Reagenz Kontrolle

SEQUENZPROTOKOLL

SEQ. ID NO: 1
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 31 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sondenoligonukleotid
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C
SEQ. ID NO: 2
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 24 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sondenoligonukleotid
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
TCACCCCCAG AGTCCCCTGT ACCC
SEQ. ID NO: 3
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 21 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sondenoligonukleotid, das zu einem Teil der gag-Region der HIV-I-DNA komplementär ist
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
ATTAAATAAA ATAGTAAGAA T
SEQ. ID NO: 4
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 31 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Primer zur Amplifikation und komplementär zu einem Teil der gag-Region von HIV-I-DNA
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC
SEQ. ID NO: 5
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 28 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Primer zur Amplifikation und komplementär zu einem Teil der gag-Region von HIV-I-DNA
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT
SEQ. ID NO: 6
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 20 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Primer zur Amplifikation von β-Globin-DNA
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
CAACTTCATC CACGTTCACC
SEQ. ID NO: 7
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 20 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Primer zur Amplifikation von β-Globin-DNA
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
ACACAACTGT GTTCACTAGC
SEQ. ID NO: 8
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 41 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Gensonde komplementär zu HIV-I-DNA
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C
SEQ. ID NO: 9
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 31 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sonde komplementär zu β-Globin-DNA
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT C
SEQ. ID NO: 10
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 30 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sonde komplementär zu DNA des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
GGTGTCACCC CCAGAGTCCC CTGTACCCGC
SEQ. ID NO: 11
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 30 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sonde komplementär zu DNA des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
GACACAGTGT CCTCCCGCTC CTCCTGAGCA
SEQ. ID NO: 12
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 30 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sonde komplementär zu DNA des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
GTGGAAGGCG GCTCGCTGGA AGCCGGTCGT
SEQ. ID NO: 13
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 30 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sonde komplementär zu DNA des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
GAACCGAGGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG
SEQ. ID NO: 14
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 30 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sonde komplementär zu einem Teil der späten Antigenregion des Towne-Stammes (ATCC VR 977) des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
GTCGAAGGCG GCTCGCTGGA AGCCGGTCGT
SEQ. ID NO: 15
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 29 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sonde komplementär zu einem Teil der späten Antigenregion des Towne-Stammes (ATCC VR 977) des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
GAACCGAGG CCGGCTCACC TCTATGTTGG
SEQ. ID NO: 16
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 25 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Primer zur Amplifikation und komplementär zu einem Teil der späten Antigenregion des Towne-Stammes (ATCC VR 977) des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
CACCACGCAG CGGCCCTTGA TGTTT
SEQ. ID NO: 17
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 22 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Primer zur Amplifikation und komplementär zu einem Teil der späten Antigenregion des Towne-Stammes (ATCC VR 977) des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
GTCGCCTGCG CCAGGTGCTT CG
SEQ. ID NO: 18
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 30 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sonde komplementär zu einem Teil der major immediate early-Region des Towne-Stammes (ATCC VR 977) des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
GGTGTCACCC CCAGAGTCCC CTGTACCCGC
SEQ. ID NO: 19
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 30 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Sonde komplementär zu einem Teil der major immediate early-Region des Towne-Stammes (ATCC VR 977) des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
GACACAGTGTCCTCCCGCTC CTCCTGAGCA
SEQ. ID NO: 20
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 25 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Primer zur Amplifikation und komplementär zu einem Teil der major immediate early- Region des Towne-Stammes (ATCC VR 977) des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
CAGCACCATC CTCCTCTTCC TCTGG
SEQ. ID NO: 21
ART DER SEQUENZ: Nukleotid
LÄNGE DER SEQUENZ: 25 Nukleotide
STRANGFORM: Einzelstrang
TOPOLOGIE: linear
ART DES MOLEKÜLS: Primer zur Amplifikation und komplementär zu einem Teil der major immediate early- Region des Towne-Stammes (ATCC VR 977) des Cytomegalievirus
UNMITTELBARE HERKUNFT: synthetisch hergestellt
GAGGCTATTG TAGCCTACAC TTTGG

Claims

1. Biologisch aktives Reagenz, umfassend:

(I) ein wasserunlösliches Teilchen, das zumindest an seiner Oberfläche zusammengesetzt ist aus einem Copolymer mit wiederkehrenden Einheiten, die abgeleitet sind von:

(a) 60 bis 99,8 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer oleophiler Monomerer, die dem Copolymer Hydrophobie verleihen,

(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättiger polymerisierbarer Monomerer mit einer reaktiven Carboxygruppe, oder einem Salz davon, und

(c) 0 bis 15 Molprozent eines oder mehrerer zusätzlicher ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer anderer Monomerer als der in den vorherigen Kategorien (a) und (b) angegebenen, und

(II) eine biologisch aktive Substanz, die durch eine reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon kovalent an das Teilchen gebunden ist,

wobei das Reagenz dadurch gekennzeichnet ist, daß das Monomer (b), das die reaktive Carboxygruppe aufweist, oder ein Salz davon, durch die Struktur dargestellt wird:

CH&sub2;= -L- -O-M

wobei R gleich Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linker-Gruppe ist, die in der Linkerkette 8 bis 50 Atome aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen.

2. Reagenz nach Anspruch 1, wobei die biologisch aktive Substanz ein Amin, ein Enzym, eine Aminosäure, ein Peptid, ein Polypeptid, ein Protein, ein Lipoprotein, ein Glycoprotein, ein Hormon, ein Arzneistoff, ein Steroid, ein Vitamin, ein Polysaccharid, ein Glycolipid, ein Alkaloid, ein Microorganismus, ein Virus, eine Protozoe, ein Pilz, ein Parasit, Rickettsia, Schimmel, eine Blutkomponente, eine Gewebe- oder Organkomponente, ein Pharmazeutikum, ein Hapten, Lectin, ein Toxin, eine Nucleinsäure, antigenes Material, Biotin oder ein Derivat davon oder eine Komponente von irgendeinem davon ist.

3. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die biologisch aktive Substanz ein Antikörper ist.

4. Reagenz nach Anspruch 3, wobei die biologisch aktive Substanz ein auf Streptococcus A, einen mit periodontalen Erkrankungen einhergehenden Mikroorganismus, Carbamazepin, Thyroxin, menschliches Choriongonadotropin, Phenobarbital, Phenytoin oder Digoxin gerichteter Antikörper ist.

5. Reagenz nach Anspruch 1, wobei die biologisch aktive Substanz ein Oligonucleotid ist.

6. Analytisches Element, umfassend ein fluid-permeables Substrat, das in sich eine oder mehrere Reaktionszonen aufweist und das in mindestens einer der Zonen ein biologisch aktives Reagenz enthält,

wobei das Element dadurch gekennzeichnet ist, daß das Reagenz umfaßt:

(I) ein wasserunlösliches Teilchen, zusammengesetzt aus, zumindest auf seiner Oberfläche, einem Copolymer mit wiederkehrenden Einheiten, die abgeleitet sind von:

(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer Monomerer, die eine reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon aufweisen, dargestellt durch die Struktur:

CH&sub2;= -L- -O-M

wobei R gleich Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linkergruppe ist, die in der Linkerkette 8 bis 50 Atome aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen, und

(II) eine biologisch aktive Substanz, die durch die reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist.

7. Element nach Anspruch 6, wobei die biologisch aktive Substanz ein Antikörper für Carbamazepin, Thyroxin, Phenobarbital, Phenytoin oder Digoxin ist.

8. Analytisches Element nach einem der Ansprüche 6 oder 7, das einen nichtporösen Träger umfaßt, und in der Reihenfolge und dem Fluidkontakt,

eine Reagenzschicht, die ein oder mehrere Reagenzien enthält, und

eine poröse Ausbreitschicht, die das biologisch aktive Reagenz enthält.

9. Verfahren zur Bestimmung eines spezifisch bindenden Liganden, umfassend:

A. Bilden eines wasserunlöslichen spezifisch bindenden Komplexes aus einem interessierenden spezifisch bindenden Liganden, oder einem Rezeptor dafür, mit einem Reagenz, das umfaßt:

(I) ein wasserunlösliches Teilchen, das zumindest auf seiner Oberfläche aus einem Copolymer mit wiederkehrenden Einheiten zusammengesetzt ist, die abgeleitet sind von:

(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer Monomerer, die eine reaktive Carboxygruppe aufweisen, oder einem Salz davon, und durch die Struktur dargestellt werden:

CH&sub2;= -L- -O-M

(c) 0 bis 15 Molprozent eines oder mehrerer zusätzlicher ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer anderer Monomere als der in den vorherigen Kategorien (a) und (b) angegebenen, und

(II) eine biologisch aktive Substanz, die durch die reaktive Carboxygruppe, oder einem Salz davon, an das Teilchen kovalent gebunden ist, wobei die Substanz mit entweder dem Liganden oder einem Rezeptor dafür spezifisch reagiert, und

B. Nachweisen des Vorliegens des Komplexes als eine Indikation für das Vorliegen oder die Menge des Liganden in der Probe.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Ligand ein Protein, ein Kohlenhydrat, ein Hapten, ein Hormon oder ein Arzneistoff ist und der Rezeptor ein Antikörper für das Protein, das Kohlenhydrat, das Hapten, das Hormon oder den Arzneistoff ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Ligand eine einzelsträngige Nucleinsäure ist und der Rezeptor ein zweites einzelsträngiges Oligonucleotid ist, das zu der Nucleinsäure im wesentlichen komplementär ist.

12. Kompetitiv bindender Test für die Bestimmung eines spezifisch bindenden Liganden, umfassend:

A. In-Kontakt-bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie einen wasserlöslichen spezifisch bindenden Liganden enthält, mit einem wasserlöslichen Rezeptor dafür und mit einem Reagenz, das umfaßt:

(a) 60 bis 99,8 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer oleophiler Monomere, die dem Copolymer Hydrophobie verleihen,

(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer Monomere, die eine reaktive Carboxygruppe aufweisen, oder einem Salz davon, und durch die Struktur dargestellt werden:

CH&sub2;= -L- -O-M

wobei R gleich Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linkergruppe ist, die in der Linkerkette 8 bis 50 Atome aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen, und

(II) Moleküle des Liganden, der durch die reaktive Carboxygruppe, oder ein Salz davon, an das Teilchen kovalent gebunden ist,

wobei ein spezifisch bindender Komplex (a) zwischen dem Rezeptor und dem Liganden gebildet wird und ein spezifisch bindender Komplex (b) zwischen dem Rezeptor und dem wasserunlöslichen Reagenz gebildet wird, und

B. nach dem Abtrennen der Komplexe (a) und (b) Nachweisen des Vorliegens eines Komplexes als Indikation für das Vorliegen oder die Menge des Liganden in der Probe.

13. Verfahren zur Bestimmung einer immunologischen Spezies, umfassend:

A. In-Kontakt-bringen einer Probe, von der angenommen wird, daß sie eine immunologische Spezies enthält, mit einem Reagenz, das umfaßt:

(I) ein wasserunlösliches Teilchen, das zumindest auf seiner Oberfläche zusammengesetzt ist aus einem Copolymer mit wiederkehrenden Einheiten, die abgeleitet sind von:

(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer Monomere, die eine reaktive Carboxygruppe aufweisen, oder ein Salz davon, und durch die Struktur dargestellt werden:

CH&sub2;= -L- -O-M

(II) ein Rezeptor für die Spezies, die durch die reaktive Carboxygruppe oder einem Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist,

wobei ein wasserunlöslicher immunologischer Komplex aus der Spezies mit dem Rezeptor gebildet wird, und

B. nach Abtrennen von nichtkomplexiertem Material von dem Komplex, Nachweisen des Vorliegens des Komplexes als Indikator für das Vorliegen oder die Menge der immunologischen Spezies in der Probe.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die nichtkomplexierten Materialien von dem immunologischen Komplex durch Filtration mit einer mikroporösen Membran abgetrennt werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, bei dem das Reagenz auf einer mikroporösen Filtrationsmembran immobilisiert ist.

16. Test zur Bestimmung eines spezifisch bindenden Liganden, umfassend:

Nachweisen des Vorliegens oder der Menge eines wasserunlöslichen spezifisch bindenden Komplexes, der zwischen einem interessierenden Liganden und einem Rezeptor dafür gebildet wird, wobei der Rezeptor als eine Komponente eines Reagenzes bereitgestellt wird, das umfaßt:

(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer Monomerer mit einer reaktiven Carboxygruppe oder einem Salz davon, und durch die Struktur dargestellt werden:

CH&sub2;= -L- -O-M

wobei R gleich Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linkergruppe mit 8 bis 50 Atomen in der Linkerkette ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen, und

(c) 0 bis 15 Molprozent eines oder mehrerer zusätzlicher ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer anderer Monomerer als die in den vorherigen Kategorien (a) und (b) angegebenen, und

(II) der Rezeptor für den Liganden durch die reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist.

17. Immunoassay, bei dem Antikörper oder Antigene zum Nachweis des Vorliegens oder der Menge eines Liganden in einer Probe verwendet werden,

wobei der Immunoassay die Zugabe eines immunologischen Reaktanten umfaßt, der mit dem Liganden oder mit einem Rezeptor dafür spezifisch reagiert,

wobei der immunologische Reaktant eine Komponente eines Reagenzes ist, das umfaßt:

(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer Monomerer mit einer reaktiven Carboxygruppe oder einem Salz davon, und die durch die Struktur dargestellt werden:

CH&sub2;= -L- -O-M

(II) der immunologische Reaktant durch die reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist.

18. Analytisches Abtrennungsverfahren, umfassend:

A. das Leiten einer Probe, die ein Gemisch von biologisch aktiven Substanzen enthält, über ein Affinitätschromatographiereagenz, das umfaßt:

CH&sub2;= -L- -O-M

(II) eine spezifisch bindende Substanz, die durch die reaktive Carboxygruppe an das Teilchen kovalent gebunden ist, wobei die spezifisch bindende Substanz für eine oder mehrere vorbestimmte biologisch aktive Substanzen in dem Probengemisch aus biologisch aktiven Substanzen spezifisch ist und wobei ein Komplex aus dem Reagenz mit den vorbestimmten Substanzen gebildet wird, und

B. Sammeln von entweder einer oder mehreren der komplexierten vorbestimmten Substanzen oder einer oder mehrerer der in dem Eluenten zurückbleibenden Substanzen.

19. Verfahren zum Nachweis einer Nucleinsäure, umfassend:

A. Bilden eines wasserunlöslichen Hybridisierungsprodukts zwischen einer interessierenden Nucleinsäure und einem Reagenz, das umfaßt:

(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer Monomere mit einer reaktiven Carboxygruppe, oder einem Salz davon, und die durch die Struktur dargestellt werden:

CH&sub2;= -L- -O-M

in der R gleich Wasserstoff, ein Halogen oder ein Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linkergruppe mit 8 bis 50 Atomen in der Linkerkette ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen, und

(II) ein Oligonucleotid, das durch die reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist, wobei das Oligonucleotid zu der interessierenden Nucleinsäure im wesentlichen komplementär ist, und

B. Nachweisen des Vorliegens des Hybridisierungsproduktes als eine Indikation für das Vorliegen oder die Menge der interessierenden Nucleinsäure.

20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem die interessierende Nucleinsäure vor dem Kontakt mit dem Reagenz mittels Polymerasekettenreaktion amplifiziert wird.

21. Kit für einen Hybridisierungstest für eine interessierende Nucleinsäure, umfassend:

a. ein Reagenz, das umfaßt:

(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer Monomerer mit einer reaktiven Carboxygruppe oder einem Salz davon, und

(c) 0 bis 15 Molprozent eines oder mehrerer zusätzlicher ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer anderer Monomerer, als die in den vorherigen Kategorien (a) und (b) angegebenen, und

(II) ein Oligonucleotid, das durch die reaktive Carboxygruppe oder einem Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist, wobei das Oligonucleotid zu der interessierenden Nucleinsäure im wesentlichen komplementär ist, und

b. separat verpackte, ein oder mehrere zusätzliche Reagenzien, Lösungen oder Zubehör, die für den Test benötigt werden,

wobei der Kit dadurch gekennzeichnet ist, daß das Monomer (b), das eine reaktive Carboxygruppe aufweist, oder ein Salz davon, durch die Struktur dargestellt wird:

CH&sub2;= -L- -O-M

in der R gleich Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linkergruppe mit 8 bis 50 Atomen in der Linkerkette ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen.

22. Kit für einen spezifisch bindenden Test zur Bestimmung eines interessierenden Liganden, umfassend:

a. ein Reagenz, das umfaßt:

(b) 0,2 bis 40 Molprozent eines oder mehrerer ethylenisch ungesättigter polymerisierbarer Monomerer mit einer reaktiven Carboxygruppe, oder einem Salz davon, und

(II) eine biologisch aktive Substanz, die durch die reaktive Carboxygruppe oder ein Salz davon an das Teilchen kovalent gebunden ist, wobei die Substanz entweder mit dem interessierenden Liganden oder einem Rezeptor dafür spezifisch reagiert, und

b. separat verpackte, eine oder mehrere zusätzliche Reagenzien, Lösungen oder Gegenstände, die für den Test benötigt werden,

CH&sub2;= -L- -O-M

wobei R gleich Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist, M gleich Wasserstoff, ein Alkalimetallion oder ein Ammoniumion ist und L eine organische Linkergruppe mit 8 bis 50 Atomen in der Linkerkette ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen.

23. Reagenz, Element, Verfahren, Test oder Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Copolymer wiederkehrende Einheiten aufweist, die abgeleitet sind von etwa 85 bis etwa 99,5 Molprozent des Monomeren (a), von etwa 0,5 bis etwa 15 Molprozent des Monomeren (b) und von 0 bis etwa 10 Molprozent des Monomeren (c).

24. Reagenz, Element, Verfahren, Test oder Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei R gleich Wasserstoff oder Methyl ist, M gleich Wasserstoff oder ein Alkalimetallion ist, und L zwei oder mehr Alkylen- oder Arylenalkylengruppen umfaßt, die mit einer Oxy-, Thio-, Imino-(-NR¹-), Carbonyloxy-(-COO-), Carbonylimino-(-CONR¹-), Ureylen- (-NR¹CONR¹-) oder Sulfonylimino-(-SO&sub2;NR¹-)gruppe verbunden sind oder eine solche Funktion endständig aufweisen, wobei jedes R¹ unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 4 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Aryl mit 6 bis 14 Kohlenstoffatomen ist.

25. Reagenz, Element, Verfahren, Test oder Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei Monomer (b) Mono-m-& p- Vinylbenzylglutarat, Mono-p-vinylbenzylglutarat, Mono-2- methacryloyloxyethylglutarat, 2-(4-Carboxybutyramido)ethylmethacrylat, 2-[N'-(5-Carboxypentyl)ureido]ethylmethacrylat, Mono-methacryloylpenta(oxyethylen)glutarat, Mono-(4-acryloyloxybutyl)glutarat, 4-(4-Carboxybutyramido)styrol, Mono-methacryloyldeca-(oxyethylen)glutarat, Mono-2-(p-vinylbenzylthio)-ethylglutarat, Mono-2-(m-& p-vinylbenzylthio)ethyl-glutarat, 4-(4-Carboxybutyramidomethyl)styrol, Mono-2-[N-methyl-N-(4-vinylbenzyl)amino]ethyl-glutarat, 3-(p-Vinylbenzylthio)propionsäure, 4-[2- (4-Carboxybutyramido)ethylthiomethyl]styrol, 4-[2-(Carboxymethoxyacetamido)ethylthiomethyl]styrol, 4-[2-(Carboxymethylthioacetamido)ethylthiomethyl]styrol, Mono-2- (4-vinylbenzylthio)ethylsuccinat, 4-[2-(Carboxymethoxyacetoxy)ethylthiomethyl]styrol, Mono-4-vinylbenzylsuccinat, 2-(4-Vinylbenzylthio)-bernsteinsäure, 2-(4-Vinylbenzylthio)benzoesäure, Mono-2-[2-(4-vinylbenzylthio)ethoxy]ethylthiomethyl-malonat, Mono-methacryloylpenta(oxyethylen)-phthalat, Mono-methacryloyldeca(oxyethylen)phthalat, Mono-2-{2-[2-(4-vinylbenzylthio)ethoxy]ethylthio}ethylsuccinat, Mono-2-{2-[2-(4-vinylbenzylthio)ethoxy]ethylthio}ethylphthalat, 3-[4-(4-Vinylbenzyloxy)benzylthio]-propionsäure oder 4-{4-[4-(4-Vinylbenzyloxy)benzylthio]benzylthio}buttersäure ist.