JPS63502875A - 粒子凝集を用いる核酸検出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 粒子凝集を用いる核酸検出 説明 技術分野 本発明は、リガンド定量法の分野に属し、と（に、核酸ハイプリダイぜ−ション による核酸配列の検出および定量に関する。

背景情報 核酸ハイブリダイゼーションは、サンプル中の核酸の検出および同定に用いられ る多くの方法の基礎である。ハイブリダイゼーションとは、−重鎖核酸（すなわ ち、ＤＮＡまたはＲＮＡ）がそれと相補的な鎖を認識し、それとの水素結合によ って二本鎖分子を形成する過程をいう。すなわち、−重鎖核酸は適当な条件下に 合体し、相補的塩基配列対および二本鎖／Ｓイブリッド分子を形成する。

核酸ハイブリダイゼーション定ｆＵ法（たとえば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−Ｒ ＮＡ）にお゛いては、サンプルＤＮＡまたはＲＮＡは固体支持体（たとえば硝酸 セルロース濾紙）に、単にそれを支持体罠付着させることによって固着゛させる 場合が多い。次に、標識プローブＤＮＡまたはＲＮＡを、相補的配列のハイブリ ダイゼーションが起こるのに適当な条件下に添加する。

プローブ配列に相補的な配列の存在は、結合（サンプル）ＤＮＡまたはＲＮＡへ の標識プローブの結合を検出することによって決定される。

固体支持体へのＤＮＡの固定は、−重鎖核酸の非特異的物理的吸着（たとえばニ トロセルロース濾紙への）および化学的結合（たとえば、アガロース／Ｂｅ１ｆ ｈａｒＯ田兜［Ｆ］ アミノエチ／ｌ／　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　、　５ｅｐｈａｄｅｘｅｓ■、　’４ 　／ＬＴ　Ｏ−スへの）によって達成できる。

核酸ハイブリダイゼーションによれば、サンプル中の核酸の検出および同定に、 きわめて感受性の高い、特異的なアプローチが提供される。しかしながら、現在 利用できる方法は、酵素もしくは放射性トレーサーで標識した核酸プローブ、時 間がかかる操作および／または複雑な装置を必要とする。現在では、核酸ハイブ リッドは、ＤＮＡ溶液の吸収の変化の観察：クロマトグツフィーもしくはヒドロ キシアパタイトを用いてハイブリダイズしたＤＮＡをハイブリダイズしていない ＤＮＡから物理的に単離したのち、ハイブリダイズしたＤＮＡを定量する；また はハイブリダイズしたＤＮＡのニトロセルロース上への捕獲によって分析される 。一般にこれらの方法では、核酸配列はその相補的配列とのみアニーリングする が、プローブが標識されていないとハイブリッド二本鎖分子の存在を検出できな いので、標識された核酸を必要とする。たとえば、核酸は、宿主細菌によりもし くはｉｎ　ｖｉｔｒｏ反応により合成されるリン酸基としてＤＮＡ分子中に導入 できるリン３２　（”Ｐ）を用いて放射能により標識されることが多い。放射能 で標識した核酸配列は広く使用されているが、放射性物質は使用者に危険をもた らすことがある。また、このような物質は通常、半減期が短く、したがって貯蔵 寿命が限られる。さらに、その検出には、高価な、複雑な装置が必要になる。

ヨーロッパ特許庁（ＥＰＯ）出願第０．１３０．５２３号には、ｐａｔｔａｇｕ ｐｔａと０ｒｏｔｈｅｒθが、核酸用の固体支持体と、相補的核酸プローブを記 載している。反応性の基を有する固体支持体；光化学的反応性挿入体化合物また は核酸を結合できる他のリガンド；および固体と核酸結合リガンドを化学的に連 結する２価ラジカルからなる固体支持体が記載されていて、これに核酸が照射に よって結合できる。光活性化すると、リガンドは核酸と化学的に結合する。と（ に、固体基質はヒドロキシル基を■するニトロセルロース濾紙を使用できる。こ れは二官能性試薬によりアミノ置換化合物に連結され、これが次に光化学的に核 酸に連結する。得られた固定化核酸は、結合されたＤＮＡを有する支持体を未知 サンプル（支持体上のＤＮＡと相補的な配列を含有する可能性がある）および検 出（標識）プローブと混合するハイブリダイゼーション定量法に有用である旨述 べられている。固体支持体について標識（たとえば放射能）の存在を調べると、 ハイブリダイゼーションが起こったかどうか（すなわち、相補的ＤＮＡが存在す るかどうか）がわかる。

ＫＰＯ出願第０，１６０，５１５号には、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａらにより、特定 の核酸配列のサンプル中における存在を検出するだめの、二重核酸ハイブリダイ ゼーション関連方法が記載されている。未知のＤＮＡをｆｉｒ？ンプルを、検出 すべき核酸配列の２個の重複しない部分に相補的な２種の核酸プローブと混合す る。−万のプローブは標識されていてサンプル中に可溶であり、他方のプローブ は固体支持体（たとえばニトロセルロース）に固定される。この混合物をハイブ リダイゼーション条件下に放置すると、サンプル中に両プローブに相補的な配列 を含む場合のみ、サンプル中のＤＮＡ＆Ｃよる両ゾローデへのハイブリダイゼー ションが起こる。

二重ハイブリダイゼーション生成物の分離（固体支持体の分離による）およびそ れに付着した標識の検出で、問題のＤＮＡ配列のサンプル中における存在の決定 方法が与えられると述べられている。

米国特許第４．４８６．５３９号には、ＲａｎｋｉとＢｏｄθｒ１ｕｎｄが、ウ ィルスまたは細菌の核酸の検出、同定に使用するためのキットが報告されている 。このキットが基砿とする１工程サンドウイツチノ）イブリダイゼーション操作 は、同定すべきミクローブのデノムからの、共通の配列をもたない２種の核酸フ ラグメントを必要とする。一方のフラグメントは固体担体（たと、１ばニトロセ ルロース濾紙）Ｋ固定し、他方は標識する。同定すべき核酸と固体担体上の核酸 の接触により、相補的塩基対のアニーリングを生じ、ハイブリッドが形成する。

第２の（標識）フラグメントを同定すべきフラグメントにアニーリングすると、 固体支持体上に形成したフラグメントの標識を生じ、したがってその検出および 定量が可能になる。

特許協力機構（ＰＣＴ）Ｗ０８４１０２７２１号には、ＫｏｈｎｅがＲＮＡを含 む細菌およびウィルスの検出および定量方法を記載している。サンプル中の核酸 と標識プローブ（検出すべき生物のＲＮＡと相補的な、放射能標識核酸配列）を ノ１イゾリダイゼーション条件下にインキュベートしたのち、標識プローブとの ハイブリダイゼーションの程度を測定する。この方法は、溶液円ハイブリダイゼ ーションまたは固定化核酸プローブとのハイブリダイゼーションＫｉ用である旨 記載されている。

現在のところ、サンプル中の核酸配列の存在を検出する方法であって、核酸ノ・ イブリダイゼーション技術の特異性を■するが、放射性物質、時間のかかる準備 工程および複雑な装置を必要としない方法力をめられている。

発明を実施する最良の様式 本発明の方法は、適用するのが有用なサンプルの種類およびサンプル中に検出で きる生物の種類の両者の意味においてきわめて広い適用を有する。任意の種類の 生物学的サンプル（たとえば血液および他の組織；尿；ならびにミルクのような 食品）の核酸含量が本発明を用いて定量できる。生物学的サンプル中における細 菌およびウィルスの存在は、粒子凝集を用いて検出できる。さらに、細菌は共通 の核酸配列のほかに同−稚内の株もしくはクラスに特異的な配列を有するので、 サンプル中のすべての細菌を共通の核酸配列を用いて検出することも、また特異 的な細菌をその株またはクラスに独特の核酸配列を用いて検出することもできる 。

発明の開示 本発明は、懸垂可能な固体支持体たとえばラテックス粒子に固定した核酸セグメ ントと浴液中の相補的核酸セグメントがハイブリダイズして、粒子凝集を起こす ことの発見に基づくものである。ＤＮＡでもＲＮＡでもよい核酸セグメントが粒 子凝集を開始する（すなわち、凝集する粒子を生じるン。

本明細書に記載した発明は、生物学的サンプル中の核酸、ならびに核酸が結合し た粒子を検出、同定および／または定量する方法である。核酸は直接粒子表面に 結合してもよいし、またスペーサー分子を介して付着し、これが粒子表面に共有 結合もしくは成層されていてもよい。本発明の方法においては、核酸配列は、サ ンプル中の検出されるべき核酸配列と相補的な核酸配列が結合した不活性粒子の 凝集を作成するため、またはこのような粒子の凝集を妨害するためのいずれにも 使用できる。

すなわち、サンプルが固体支持体に付着した核酸配列と相補的な核酸配列を含有 する場合には、ハイブリダイゼーションが起こり、粒子凝集を生じる。別法とし て、凝集の阻害をサンプル中における問題の核酸の存在の検出に使用することも できる。この場合、固体支持体に、２種の異なる核酸配列（たとえば十と−）を 固定させる。すなわち、一部の固体支持体粒子は（十）鎖が、他方には（−）鎖 が固定されている。サンプルが固定された配列のいずれかと相補的な核酸を含有 すれば、固体支持体の凝集が阻害される。いずれの場合も、凝集の程度は可視的 にまたは本技術分野において公知の他の方法により検出できる。凝集の程度は、 相補的核酸配列のノ・イブリダイゼーションの程度を示し、したがってサンプル 中の核酸配列の存在を示すことになる。

この発見の結果、生物学的サンプル（たとえば、体液、組織、食品）やその池の サンプル中の問題の核酸を、操作に高度の熟練を要しない技術および装置を用い て、検出、同定、定量および／または単離することが可能になった。本明細書に 記載されたような溶液中または懸濁液中ハイブリダイゼーションの使用にヨル重 要な特徴は、反応体がたとえば大粒子や濾紙膜上などに固定されておらず、その 結果、反応性（ハイブリダイゼーション可能な）部位がより容易に相互に拡散で きるので、ハイブリダイゼーションがより急速に起こることである。問題の核酸 配列の検出（たとえば感染症の診断、食品中の細菌汚染の検出）に際して得られ る迅速性と特異性が、本発明の重要な利点である。

さらに、反応混合物についてハイブリダイゼーションの評価を行う前に、結合相 と非結合相の分離を必要としない。ハイブリダイゼーションを実施する他の方法 では、結合相と非結合相の分離を要する。また、核酸のハイブリダイゼーション は著しく特異的で、核酸配列は相補的配列としかハイブリダイズしないので、本 発明の粒子凝集法は生物学的サンプル中に見出される多数の配列の中から問題の 核酸配列を選択するきわめて信頼性の高い手段を提供する。検出すべき核酸配列 は、細菌またはウィルス種のすべてのメンバーに特徴的または共通のものであっ てもよい。この場合は、すきる。これはたとえば、食品中の全細菌の検出（たと えばミルクサンプル中に存在する細菌の完全平板計数ンにと（に有用である。ま た、食品中の検出すべき核酸配列が与えられた株またはクラスのメンバーに特異 的なものであってもよい。

発明の詳細な説明 本発明の方法によれば、核酸配列が固定される粒子の凝集を用いたサンプル中の 核酸の検出は直接または間接的に実施できる。

第１図にその１例を示す直接法においては、問題の核酸配列と相補的な核酸配列 はラテックス粒子に固定され、適当に処理したサンプル（核酸配列をハイブリダ イゼーション可能にする本技術分野において公知の方法で予め処理したサンプル ）と接触させる。

結合した核酸とサンプル中の核酸のハイブリダイゼーシヨンにより粒子凝集を生 じる。サンプル中に問題の配列が存在しなければ、凝集は起こらない。たとえば 、核酸配列ＡＢＣを有する第１のセットのラテックス粒子と核酸配列ＤＫＦを有 する第２のセットのラテックス粒子を含有する溶液を、ＡＢＣおよびＤＥＦに相 補的な核酸配列（Ａ’　Ｂ’　Ｏ’　Ｄ’　Ｅ’　？’と表示）を含有するサン プルと接触させると、相補的な配列のハイブリダイゼーションが起こる。そして 、粒子凝集を生じる。

サンプルが相補的な配列を含まないならば、ノ・イプリ第２図にその例を示す間 接法においては、問題の核酸セグメントのサンプル中における存在が相補的核酸 配列をもつ粒子の凝集を阻害する。核酸をもつラテックス粒子２種類を使用する 。たとえば、ＤＮＡ鎖Ｃ十と表示）をもつラテックス粒子と（＋）鎖に相補的な りＮＡ鎖（−と表示）をもつ他のラテックス粒子を、特定のＤＩＩＪＡ配列の存 在について分析すべきサンプルと接触させる。一部のラテックス粒子に固定され たＤＮＡ鎖はサンプル中の検出すべきＤＮＡと相補的である。試映サンプル（た とえば血液）が間頂のＤＮＡ配列なざんでいると、その配列はその相補体（ラテ ックス粒子に結合している）とハイブリダイズし、（＋）および（−）ＤＮＡセ グメントが結合している粒子のハイブリダイゼーションを妨害する。したがって 、粒子の凝集は阻害または防止され、凝集のないことがめるＤＮＡのサンプル中 の存在を指示する。

核酸セグメント プローブとして使用するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ） は固体支持体に固定させるか、またはサンプルＤＮＡ−粒子複合体と接触させる 溶液中に含有させる。それは問題の遺伝子でも核酸配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ） でもよい。たとえばそれ哄全細菌に存在するリボンームＲ／ＮＡ配列に相補的な 配列（総括的）でも、単一種の細菌に特徴的なりポンームＲＮＡ配列に相補的な 配列（特異的）のいずれでもよい。総括的なりボンーム核酸をプローブとして使 用した場合は、任意の細菌からのＲＮＡｆｆ：含むサンプルとの接触でハイブリ ダイゼーションおよび粒子の凝集を生じる。特異的リボン−ムシローブは特異的 な群の細菌からのＲＮＡが存在した場合にのみ凝集する。生物が死亡するとＲＮ Ａは急速に分解するので、生存している細胞だけが検出される。第１の場合、サ ンプル中のすべての生菌が検出されるが、第２の場合は、選ばれたプローブに相 補的なＲＮＡを有する１種の生菌のみが検出される。この方法はたとえば、予め 処理して細菌ＲＮ　Ａを遊離させたミルクサンプル中の生菌の検出に使用でき、 現在酪農工業で用いられている標準平板計数の単純、迅速、特異的な別法を与え る。例１に詳細に述べるように、任意の一本鎖ＤＮＡおよびその補体が固体支持 体に固定できる。この場合、第１のクローンが第１のＤＮＡ鎖（十と表示）を与 え、第２のクローンが第２の（または相補的な）ＤＮＡ鎖（−と表示）を与える 。たとえば、４部１遺伝子とβグロビン遺伝子をラテックス粒子に固定できる。

固体支持体に固定された核酸配列の長さはほとんど任意である。核酸が５個また はそれ以上の塩基対をも゛　てば、安定な結合またはハイブリッドを生成するこ とが明らかにされている。したがって、一般には、固体支持体に結合される核酸 配列の長さは、塩基５個またはそれ以上である。

固体支持体に固定してプローブとして使用する核酸配列は、単離されたＤＮＡま たはＲＮＡセグメントを、本技術分野において公知の方法に従いクローニングす ることによって得ることができる（たとえば、ｙａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ほか： 　ｙｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕ ａｌ、　Ｃ！ｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ。

１９８２参照）。たとえば、プローブとして使用する所望のＤＮＡフラグメント の製造には任意の制限酵素たとえばＥＣＯＲ工が使用できる。細菌ＤＮＡを、問 題のＤＮＡフラグメントのいずれかの側で、選ばれた部位で切断でき、生成した 問題のフラグメントを他のフラグメントから電気泳動により単離できる（すなわ ち精製される）。単離されたＤＮＡフラグメントをついで、プラスミドまたは細 菌性ウィルス（バクテリオファージ＞ＶＣ挿入し、続いて適当な細菌宿主細胞中 に挿入して増幅させることができる。プラスミド含有細胞の増殖に従い、プラス ミドも複製され、プローブとして使用されるＤＮＡフラグメントの多数のコピー が生成する。細胞を増殖させたのち、７％イブリッドプラスミドを単離し、精製 すると、ＤＮＡフラグメントの多数のコぎ−の単離が可能である。

固体支持体に固定すべき核酸配列はまた、合成によっても、天然に十分な量存在 するのであれば単に単離および精製によっても得ることができる。

核酸配列を適当に処理した生物学的サンプルから固体支持体に固定することもで きる。この場合、溶液中の核酸配列はサンプル中の問題の配列に相補的である。

すなわち、プローブ配列を溶液中に存在させる。

ＤＮＡまたはＲＮＡが固定される固体支持体は、ＲＮＡまたはＤＮＡが共有結合 して付着するか不可逆的に吸着できる不溶性の物質であればほとんど何でもよい 。すなわち、ＤＮＡまたはＲＮＡと反応できるか、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ を共有結合で連結できる物質を吸着できる材料であればよい。固体支持体として は、たとえば、ラテックス、木炭、コロイド状金、ベントナイトまたはガラスが 使用できる。さらに、シリカゾル、制御多孔ガラス、赤血球およびリポソームも 使用可能である。実際、核酸が付着できる任意の粒子が本発明の応用に際し使用 できる。核酸は反応性のアミン官能基、ならびに糖鎖中に末端リン酸基および反 応性ヒドロキシル基をもっている。さらにＲＮＡ中のリボースは、酸化により（ たとえば、Ｆｉｓｃｈｅｒの米国特許第４，２６４．７６６号のように過ヨウ素 酸で）部分的に切断すると反応性のアルデヒド機能を生じる。

核酸上のこれらの反応性の基は、ラテックスまたは他の粒子上の反応基と反応さ せることができる。

ガラスまたは他の粒子は、核酸やタンパク質と反応できる反応性官能基を形成し た誘導体に導くことができる（たとえばＷｅｅｔａ’ｌｌほか：米国特許第３， ６５２，７６１号；　ｘｏｓｔｅｒほか：　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ ｅｒｓ、　’ｌ　４　ニア４７．１９８３参照）。核酸はまた、そのままポリス チレンに連結させることができる（たとえば工ｔＯほか：　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅθ、、１０ニア５５．１９８２）。

固体支持体は特定の形状（コンフィギユレーション）をもつ必要はないが、球状 をしている場合が多い）。

それは懸濁条件に保持できるように十分小さいものでなければないが、一般にＤ ＮＡまたはＲＮＡゾローブの分子量に比べれば大きい粒子径を有するものである （たとえば５００ミクロン未満）。

プローブの固体支持体への結合 核酸配列はＤＮＡであれＲＮＡであれ、固体支持体に固定される。たとえば、共 有結合で結合させることができる。結合はＤＮＡまたはＲＮＡの縦方向に無作為 に、５′末端または３′末端で起こることができる。核酸配列はタンパク質また は他のスペーサー物質を介して固体支持体に結合させることもできる。以前から 、本技術分野においてはＤＮＡを固体支持体たとえばア、ｏ　−２（５ｅｐｈａ ｒｏｓｅ　”）　、アミ／　ｘ　ｆ　ｙ　−’５ｅｐｈａｒ。８８へＳθｐｈａ ｄｅｘθＢおよびセルロースに共有結合によって連結する目的でカルボジイミド カップリング反応が用いられてきた（　Ａ１１ｆｒｅ７．Ｖ、Ｏ，＆工ｎｏｕｅ 、　Ａ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＯｅｌｌＢｉｏｌＯｇ７．１８　：２５３〜２７ ０　、１９７８　）。

この反応では、ＤＮＡの５′末端におけるホスホリル基と固体マトリックス上の ヒドロキシル基の間にホスホジエステル結合を生じる。

本発明の一実施態様においては、固体支持体に結合する核酸配列は、そのフラグ メントの縦方向にラテックス粒子と連結する。共有結合による固定に使用できる 一方法を例１に詳細に記載する。この方法を用いてラテックス粒子に結合させた 核酸配列は、その縦方向に沿って無作為に共有結合で付着しているように思われ る。９’ｌＪ　１の方法は、Ｄｏｒｍａｎにより米国特許ｉ　４．０４５，３８ ４号に記載されているラテックスとタンパク質の間にアミド結合を形成させる方 法に基づくモノである。この操作は３工程で行われる。まず＼カルボキシル化ラ テックス粒子を活性化する。すなわち、水溶性のＮ−ヒドロキシ化合物（たとえ ばＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド）と 水溶性のカルボジイミド〔たとえば１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノ エチル）カルボジイミドメチル−ｐ−）ルエンスルホネー）（ＯＭＯ）］の反応 によりラテックス表面に活性エステルを形成させる。これらの物質を合し、攪拌 し、冷却する（たとえば約２°−５００）。その結果、ラテックス粒子のカルボ キシル基とヒドロキシベンゾトリアゾールのヒドロキシ窒素（ＮＯＨ２）基の間 に脱水結合が形成される。

次に、結合したヒドロキシベンゾ）　ＩＪアゾール誘導体を含む反応混合物を透 析によって精製する。この方法で、未変化反応体（たとえばカルボジイミドおよ び副生物ンは除去される。−重鎖ＤＮＡ（またはＲＮＡ）は、ラテックス−ヒド ロキシベンゾトリアゾール複合体を一本鎖ＤＮＡ（またはＲＮＡ　）と合し、配 合物を室温で攪拌（たとえば振盪）することにより、活性化ラテックス粒子に共 有結合させることができる。この操作での生成物は、−重鎖ＤＮＡがその縦方向 に沿つたものであることが明らかにされている。同様に、これはＲＮＡを用いて も行われる。

上述のように、核酸は、他の架橋分子に固着させ、この分子をラテックスに吸着 または共有結合させることにより、粒子に固着させることもできる。核酸は、多 くの公知反応のひとつによりポリサッカライドに共有結合サセルコトができる（ 　Ａ１１ｆｒｅ７．　Ｖ、　Ｇ、　＆工ｎｏｕｅ。

Ａ、：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂ１０１０ｇ７１１８　：　２５３ 〜２７０＋１９７８＞。ポリサッカライドは部分酸化すると反応性のアルデヒド 基を生じ、これがついで適当な反応基たとえばアミノ基を有する粒子（たとえば アミノ官能性ラテックス）と反応することができる。

ＤＮＡはタンパク質に多くの方法で（ＮｕｃＬＡｃｉｄｓｕｅｓ、、　１２　： 　３４３５．１９８４　）共有結合させることができ、ラテックスまたは他の粒 子に固着させた粒子はよく知られた技術で使用することができる。合成ポリマー も同様に使用できる（　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　。

本発明により、固体支持体に結合したＤＮＡ（またはＲＮＡ）プローブを用いて サンプル中の核酸を検出するのに使用できる方法には、数種ある。これらについ て、図面を参照しながら詳述する。

第２図に示すように、試験またはプローブＤＮＡまたはＲＮ　Ａ　（Ａ　Ｂ　Ｃ （＋）と表示）を固体支持体たとえばラテックス粒子に結合させ、プローブＤＮ ＡＫ相補的なりＮＡ（またはＲＮ　Ａ　）　（Ａ’Ｂ’Ｏ’（−）と表示）は他 のラテックス粒子に結合させることができる。未知核酸（たとえばリボソームＤ ＮＡ）を含有するサンプルを２種の核酸をもつ粒子の混合物とハイブリダイゼー ションを起こすのに適当な条件下で接触させると、サンプル核酸がプローブＤＮ Ａの配列と相補的である場合（たとえばＡ′Ｂ′０′）には、相補的核酸配列を もつ粒子の凝集が妨害される。すなわち、粒子凝集が阻害核酸の量に直接比例す る。サンプル中にわずかな相補的配列しか存在しない場合、サンプルがラテック ス粒子上の配列と相補的な配列を多数含有する場合より、粒子凝集の妨害の程直 は少なくなる。

本発明の方法の他の態様においては、第１図に示すように、プローブ核酸をすべ てのラテックス粒子に共有結合させる。サンプル中の相補的核酸配列の存在は、 ラテックス粒子の凝集により検出される。たとえば、１群のラテックス粒子はＡ ＢＣで表される核酸配列が結合されていて、他の群のラテックス粒子にはＤＥＦ で表される配列が結合されているとする。もしサンプル核酸がＡＥＯＤＥＦＫ対 して相補的な配列（たとえばＡ’Ｂ’Ｃ’Ｄ’Ｅ’Ｆ’）を官有すると、サンプ ル核酸Ａ′ゴｄは粒子上のＡＢＣと、サンプル核酸Ｄ’　ｐ！　？’は他の粒子 上のＤＥＦとハイブリダイゼーションを起こす。その結果、粒子の凝集も生じる ことになる。第３図に示すように、これは、丁ぺてのラテックス粒子が全配列（ ＡＢＯＤＫＦ）を結合していて、サンプル核酸が相補的配列（Ａ’Ｂ’　Ｏ’Ｄ ’に’　Ｆ′＞を有する場合にも起こる。

第４図に示すようにさらに別の態様では、プローブＤＮＡの固着に２種のサイズ の異なる粒子が使用できる。たとえば、プローブＤＮＡを大きい方の粒子に、そ の補体は小さい方の粒子に固着させる。サンプル中に相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ が存在すると、小粒子は大粒子に凝集せず、選ばれた孔径のフィルターを通過す る。サンプル中に相補的配列が存在しないと、プローブＤＮＡ（大粒子に結合） と小粒子に結合しているその補体とがハイブリダイズして、小粒子のフィルター 通過が妨害される。

未知またはサンプル核酸ＤＮＡまたはＲＮＡを活性化ラテックス粒子に固着させ る本発明の方法を使用することも可能である。この場合、溶解した特異的プロー ブをサンプルＤＮＡ−粒子複合体と接触させる。使用するプローブはその存在を 検出する目的で標識を付すことができる。サンプルＤＮＡまたはＲＮＡがプロー ブＤＮＡまたはＲＮＡと相補的である場合には、核酸のハイブリダイゼーション および粒子凝集が起こる。

−ターとしてのＤＮＡまたはＲＮＡ結合粒子の凝集ま共有結合したＤＮＡまたは ＲＮＡを有する粒子の凝集またを１重合の定量は、サンプルとプローブをハイブ リダイゼーシヨンが起こるのに適当な条件下で接触させたのち１存在する凝集の 程度を検出できる任意の方法によって実施される。たとえば、裸眼を用い（たと えば黒色または他の暗色の背景に対して視覚化する）、あるいは顕微鏡、比濁法 を用い可視的に実施できる。

さらに、サイズ閾値を有する粒子カウンターを用いて凝集／非凝集粒子を検出す ることもできる。本技術分野においてよく知られている選択計数技術は、与えら れたサイズ範囲の粒子数を数えることを可能にし、したがって定量的分析が実施 できる（たとえば、Ｃ０Ｔ、。

にａｍｂｉａｓｏほか：米国特許第４，１８４．８４９号参照）。

一定の孔径を有するフィルターの使用も可能である。

すなわち、孔径な非凝集粒子は通すが、凝集粒子の通過は妨害するように選択す る（たとえば、米国特許第４．４５９．３６１号、Ｍ、Ｌ、　０ｅｆｔｅｒ参照 ）。

濾過によって凝集粒子を非凝集粒子から分離すること（すなわち、相補的配列の ハイブリダイゼーションを検出すること）は可能であるが、このアプローチには 、存在する粒子数が可視的検出を可能にするだけ多くなければならないという限 界がある。しかしながら、公知の技術を用い、着色、光学密度および螢光のよう な性質を選択して粒子の可視性を増大させることもできる。粒子を酵素で標識し 、粒子表面に固着した酵素で色素生成変化を触媒させる（これにより粒子の検出 を助ける）こともできる。このような増幅技術は、問題の核酸配列がサンプル中 に低濃度にしか存在しないときとくに有用である。

次に本発明を、以下の実施例により、さらに特定の例について説明する。

一本鎖相補的ＤＮＡの製造には、以下の方法を使用した。ＤＮＡ配列（すなわち 、虹！遺伝子の部分）を、すでに報告されているプロトコールを用いてＭｌ　３ バクテリオフアージ中にクローニングした（　Ｈｕ、Ｎ、　＆Ｍｅｓｓｉｎｇ、 　Ｊ、：　Ｔｈｅ　ｉａｋｉｎｇ　ｏｆ　５ｔｒａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍ ｉ　３ｐｒｏｂｅｅ、Ｇｅｎｅ、　１７　：　２７１〜２７７、１９８２；Ｍｅ ｓｓｉｎｇ、　、Ｔ、　：　Ｎｅｗ　Ｍ　１３　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｃｌ ｏｎｉｎｇ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ−Ｒｅ−ｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｄ 　ＮＡＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　５４　：　２０〜７７、１９８１　）、配列が 逆方向にクローニングされた２種のクローンが単離された。これらのクローンの 一方によって産生されるバクテリオファージが、他のクローンのＤＮＡ分子に一 部相補的な一本鎖ＤＮＡ分子を含有する。市販のｈ（１３バクテリオフアーゾベ クター（Ａｍｅｒｅｈａｎ＋　）を使用し、クローニング、生育を行ってもよい 。単純化するために、Ｍ１６バクテリオフアージクローン（’（Ｄ　Ｎ　Ａの一 方を表示するのＫ　（＋）を、その相補的配列を言むクローン化ＤＮＡの表示に （−）を使用する。したがって、（＋）および（−）鎖は水素結合によってハイ ブリダイゼーションすることができる。他の方法にはＭａｎｉ　ａｔｉｓらの記 載に従って（Ｍａｎｉａｔｉｓほか：　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｏｌｏｎｉｎｇ　− Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ｏｒ　Ｌａ１）Ｏｒａｌｌ；ＯＦ２．１９３２）　、製造的電気泳動により相補 的ＤＮＡな単離する方法がある。

Ｂ、カルボキシル化ラテックスの活性化ＤＮＡと共有結合させる固体支持体とし て用いられるカルボキシル化ラテックスは、ＤＯｒｍａｎの米国特許第４．０４ ５，３８４号に記載された方法に基づく以下の方法に従って製造された。カルボ キシル基の活性化は、カルボキシル化ラテックスとＮ−１−ヒドロキシベンゾト リアゾールの、ＯＭＯの存在下における反応によって生じる。反応は次式で示す ことができる。

特定の列を示せば、Ｎヒドロキシベンゾトリアゾール溶液０．２−をカルボキシ ル化ラテックス（径１ミクロン、２．５％固体）１＋ｎｔＫ加えた（Ｎヒドロキ シベンゾトリアゾール溶液はＡｌｄｒｉｃｈのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾー ル９３１＋ｖをジメチルホルムアミド１．６−に溶解し、これを水で４−に希釈 した）。配合物を氷水浴中に置き、０．１−のｅＭｅ（ｃＭｃｌ　００ηの水２ ゴ溶液、０°Ｃ）を滴加した。混合物を冷却下に４時間ないし一夜攪拌した。

ラテックスの洗浄（反応の未反応生成物、たとえば上述の尿素等の除去）は、混 合物を一夜、０．１モル（Ｍ）食塩（Ｎａ（Ｊ）に対して４℃で透析することに より行った。さらに、Ｑ　−１Ｍ　ＮａＣＪ！−２ｍｌを透析袋に加えた。

混合物をＫｐｐｅｎａＯｒｆ管（各１−）中に取り、１０秒間超音波処理した。

これを遠心分離、水への再懸濁を３回くり返したのち、５０ｍＭリン酸塩緩衝液 （ｐＨ８，０）に再懸濁した。

ＤＮＡの改良ラテックスへの共有結合 ラテックス粒子に結合させるＤ　Ｎ　Ａは上述の透析粒子に７ＪＯえた。Ａにお いて調製したＤＮＡを加え、この間、粒子は氷水浴中または５℃で攪拌した。こ のとき、ｐ！−１８，０のリン酸塩緩衝液１づおよびＱ、ｉ　Ｍ　Ｎａα浴液リ アゾール溶液（上述のようにして調製）も加えて、反応の開始を助けた。混合物 のｐＨ（６−８）を、０．５Ｍ二二塩性性リン酸）　ＩＪウムを添加して入２に 上昇させた。混合物を５日間、約４℃で攪拌し、アジドを言む蒸留水で洗浄した 。

上述の方法に従って製造したラテックス粒子の評価な行った。丁なわち、ラテッ クス粒子をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中で回転沈降させ、６回０．１％ＳＤＳで洗浄 し、各回０．１％５ＤＳｉ−に再懸濁させた。顕微鏡で検査すると、大部分の粒 子がモノマーまたはダイマーであった。

Ｄ、　ラテックスに共有結合させた（十ン鎖と溶液中ラテックス粒子に結合した Ｃ十）鎖ＤＮＡへの（−）鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションを実施した。（十 ）鎖ＤＮＡが共有結合されているラテックス（２％固体）約ｏ、ｉ、ｎｔを６つ のチューブのそれぞれに取った。固体ラテックスを遠心分離してペレット化し、 ０．４Ｍリン酸す）　ＩＪウム（ｐＨ７，８）と以下のいずれか、＋ｌｌＤＮＡ なし く２）　（十）鎖ＤＮＡ（０，５μｇ）（３）　（−）鎖ＤＮＡ（［１，５μｇ ）を含む０．１％ＳＤＳ、５０μｍ中に再懸濁した。

６つのチューブを６０°Ｃで１０〜１２時間インキュベートした。インキュベー ション後、ラテックスを再びペレットにし、０．１％ＳＤＳに再＠濁した。約１ ０μｍをガラスの顕微鏡スライド上に置き、カバースリップ下、倍率１００倍で 、油浸下に顕微鏡検査を行った。検査結果は次のとおりであった。ｆｉ＋大部分 がモノマー、わずかにダイマー、（２）大部分がモノマー、わずかにダイマー、 （３）わずかにモノマー、４〜１０個のラテックス粒子が凝集した粒子多数。こ れらの結果は、溶液中の（−）鎖ＤＮＡが（＋）鎖ＤＮＡを共有結合したラテッ クスの凝集を生じさせたことを示している。

旦又 ラテックスプレバレージョンを０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液および以下のい ずれか、 （１）　変性ウシ胸腺Ｄ　Ｎ　Ａ　（１，５μｇ〕（２＞　（−）鎖ＤＮＡ（５ μｇ） （３）　（−）鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｑ、５μｇ）とウシ胸腺ＤＮＡ（１，５μｇン を含む０．１％ＳＤＳ、５０μＬ中に再懸濁するほかは例１と同様に操作した。

（１）大部分モノマー、わずかにダイマー、（２）大量の凝集、５０〜１００粒 子以上、肉眼でみることができる （３）わずかなモノマー、４〜６個のラテックス粒子を有する多くの凝集 これらの結果は、（１）非相補的ＤＮＡは共■結合した（＋）鎖ＤＮＡを胃する 粒子の凝集を起こさない、（２）浴液中の大量の（−）鎖ＤＮＡ（５μｇ）が多 数の可視性凝集を生じ、溶液中のわずかな（−）鎖ＤＮＡはわずかじか凝集を生 じない、（３）異種性の非相補的胸腺ＤＮＡは（＋）鎖ＤＮＡが共有結合したラ テックスの溶液中（−）鎖ＤＮＡによる凝集を妨害しない、ことを示している。

これらの両列から得られろ主要な結論は、上述の条件下に、溶液中ＤＮＡは、固 体支持体に固着させた相補的ＤＮＡとハイブリダイゼーションを起こすことがで き、ラテックスの凝集を生じる、とまとめることが共有結合させたＤＮＡを用い る生物学的サンプル中の核酸配列の検出 ＲＮＡをミルクサンプルから抽出し、結合させたリボソームＲＮＡ（ＶＲＮＡ） Ｋ％異的なプローブを有するラテックスの凝集を起こさせるのに使用することが できる。このようなプローブは、ミルク中に生じる生物のＶＲＮＡの配列に相補 的なりＮＡまたはＲＮＡである。この検出は次のようにして実施できる。

（１１ｘ−？ンミルク１ＱｄｌＣ，ＳＤＳを０．１％に、プロテナーゼＫを２０ ０μｇ／−に加える。

（２）６０°Ｃで一夜インキユベートする。

１３）液化平衡化フェノール１０−を加える。

（４）抽出し、遠心分離する。

（５）　水相を除きＤＮａｓｅを１００μｇ／−になるように加える。

（６）　工程（３）および（４）を（り返丁（７）水相を取り、インアミルアル コールとクロロホルムの１：２４容量／容量混合物１０−を７１０える。

（８）工程（４）をくり返す。

（９）　工程（７）および（８）をくり返す。

ｅｌｌ　水相を除き、Ｑ−１Ｍ　Ｈａ（Ｊとする。エチルアルコール２０−を加 える。

αυ　−２０℃に１０〜１２時間保つ。

αｚ　ｉｓ、ｏｏｏｇで遠心分離する。

ａ３　ゝ′ノット０・４Ｍリン酸塩緩衝液、０，１％ＳＤ８および９１ＪＩＢに 記載したよ５　ＶＣｒ　ＲＮ　Ａプローブが共有結合したラテックスを含む液５ ０μＬに再懸濁する。

０滲　６０℃で１０〜１２時間インキュベートする。

αつ　ラテックスを顕微鏡でまたは肉眼で観察する。

可視的（顕微鏡）による評価では、わずかな七ツマ−と、大部分が５〜１００個 の凝集したラテックス粒本発明による核酸プローブとハイブリダイゼーション定 量法は、あらゆる種類の生物学的サンプル中における問題の相補的核酸配列の検 出、定量および／または同定が重要な価値を督する分野に、様々な形で応用でき る。たとえば、遺伝子の構造および遺伝的性質の研究に際しての道具として研究 領域において有用である。さらに、感染体の検出および同定による臨床的背景の 確立、ならびに遺伝性疾患の分娩前診断に有用である。最後に、ＤＮＡプローブ は、癌の診断に（癌遺伝子の構造に関する情報を与えることにより）、組織の特 定に、獣医学的および植物学的診断に、また食品試験に（病原体の存在の試験に 、迅速、簡便な手段を与える）有用である。

均等性 本技術分野の熟練者であれば、本明細書に記載した特定の態様に対する多くの均 等方法または均等物を容易に認識することができ、また単なる定常的試験によっ て確認できることは明白である。このような均等方法、均等物は、以下の請求の 範囲に包含されるものである。

図面の簡単な説明 第１図は、サンプル中の核酸配列を検出する方法の一態様を示すブロックダイア グラムであり、この場合核酸配列は粒子に結合されろ。

第２図は、サンプル中の核酸配列を検出する方法の一態様を示すブロックダイア グラムであり、この場合、プローブ核酸配列は粒子状支持体物質に結合され、相 補的核酸配列は他の粒子に結合される。

第６図は、サンプル中の核酸配列を検出する方法の一態様を示すブロックダイア グラムであり、この場合、サンプル中の検出すべき核酸配列に相補的な核酸配列 が粒子に結合される。

第４図は、サンプル中の核酸配列を検出する方法の一態様を示すブロックダイア グ２ムであり、この場合、プローブ核酸配列は不活性支持体物質に結合され、相 補的な核酸配列は比較的サイズの小さく・不活性支持体物質に結合される。

第５図は、サンプル中の核酸配列を検出する方法の一態様を示すブロックダイア グラムであり、この場合、サンプル核酸配列は粒子に結合される。

Ｆ／６／ Ｆ／６２ Ｆ／６５ 手続補正書（睦） 昭和６２年１１月２ダ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）サンプル中における核酸配列の存否を測定するにあたり、サンプル中の存 否を決定しようとする配列と相補的な核酸配列が結合している粒子の凝集または 凝集阻害を検出する方法 （２）相補的な核酸配列は粒子に、または粒子の表面に吸着もしくは共有結合さ せた物質に共有結合させる請求の範囲第１項に記載の方法 （３）（ａ）生物学的サンプルを、生物学的サンプル中の存否を決定しようとす る核酸配列と相補的な核酸配列を共有結合させた粒子と接触させ、（ｂ）粒子の 凝集の程度を測定する工程からなる生物学的サンプル中の核酸配列の存否の測定 方法 （４）粒子に結合させた核酸配列と、その結合核酸配列と相補的なサンプル中の 核酸配列とのハイプリダイゼーシヨンを、その粒子の凝集の程度を検出すること にすつて検知するサンプル中の核酸配列の存在の測定方法 （５）粒子に結合させた核酸配列は、ラテックス粒子に共有結合されているか、 またはラテックス粒子の表面に吸着もしくは共有結合させた物質に共有結合され ている請求の範囲第４項に記載の方法 （６）（ａ）サンプル中の検出すべき核酸配列に相補的な核酸配列を、径約５０ ０ミクロン未満の粒子に共有結合させ、（ｂ）サンプル中に存在する核酸が相補 的な核酸配列とのハイプリダイゼーシヨンに利用できるようにするためサンプル を処理し、（ｃ）核酸配列が共有結合した粒子を処理サンプルと、相補的な核酸 配列のハイプリダイゼーシヨンに適当な条件下に接触させ、（α）粒子に結合し た核酸配列とサンプル中の相補的核酸配列のハイブリダイゼーシヨンを粒子の凝 集の程度の測定により検知する各工程からなるサンプル中の核酸配列の検出方法 （７）粒子はラテックス粒子である請求の範囲第６項に記載の方法 （８）（ａ）サンプルをコ検出すべき配列と相補的な核酸配列を結合させた粒子 および２（１）の粒子に結合させた配列と相補的な核酸配列を結合させた粒子と 、核酸のハイブリダイゼーシヨンが起こるのに適当な条件下に接触させ、（ｂ） 粒子の凝集の程度を測定下る工程からなるサンプル中の核酸配列の検出方法（９ ）核酸配列は粒子に共有結合させるか、または粒子の表面に吸着もしくは共有結 合させたスペーサー分子に共有結合させる請求の範囲第８項に記載の方法（１０ ）粒子はラテックス粒子である請求の範囲第９項に記載の方法 （１１）（ａ）サンプル中の検出すべき核酸配列に相補的な核酸配列を粒子に結 合させ、（ｂ）（ａ）の粒子に結合させた核酸配列と相補的な核酸配列を（ａ） の粒子よりサイズの小さい粒子に結合させ、（ｃ）（ａ）の粒子および（ｂ）の 粒子をサンプルと、相補的核酸配列がハイブリダイゼーシヨンを起こすのに適当 な条件下に接触させ、（ｄ）（ａ）の粒子の凝集の程度をゅ（ｂ）の粒子と一緒 に測定する工程からなるサンプル中の核酸配列の検出方法 （１２）溶液中の検出すべき核酸配列と相補的な核酸配列を結合させた粒子を使 用して改良した核酸プローブを使用する溶液中の核酸配列の検出方法（１３）検 出すべき核酸配列に相補的な核酸配列を結合させた粒子の凝集程度を検出するこ とにより改良した核酸プローブを使用する溶液中の核酸配列の検出方法（１４） サンプルからの核酸配列を結合させた粒子を、検出すべき核酸配列と相補的な核 酸配列と接触させ、（ｂ）粒子の凝集の程度を測定する工程からなるサンプル中 の核酸配列の検出方法 （１５）容器および検出すべき核酸配列と相補的な核酸配列を共有結合させたラ テックス粒子からなり、凝集の測定によってサンプル中の核酸配列を検出するた めのキット （１６）核酸配列が結合された粒子 （１７）核酸配列は粒子の表面に共有結合されているか、または粒子の表面に吸 着もしくは共有結合させたスペーサー材料に共有結合されている請求の範囲第１ ６項に記載の粒子 （１８）粒子は径約５００ミクロン未満のラテックス粒子である請求の範囲第１ ７項に記載の粒子（１９）核酸配列がラテックス粒子の表面に共有結合している かまたはラテックス粒子の表面に吸着もしくは共有結合させたスペーサー材料に 共有結合している核酸配列結合ラテックス粒子 （２０）径約５００ミクロン未満で、核酸配列がその表面に共有結合されている かまたはその表面に吸着された物質に共有結合されているラテックス粒子を用い て改良した核酸配列固着固体支持体発明の詳細な説明